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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-05
(54)【発明の名称】単為生殖一倍体誘導遺伝子ＤＭＰとその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220829BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20220829BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20220829BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20220829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220829BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/82 Z ZNA
A01H5/00 A
C12N15/29
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021570301
(86)(22)【出願日】2020-07-01
(85)【翻訳文提出日】2022-01-12
(86)【国際出願番号】 CN2020099680
(87)【国際公開番号】W WO2020239137
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】201910445082.3
(32)【優先日】2019-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521212269
【氏名又は名称】中国農業大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】陳紹江
(72)【発明者】
【氏名】鐘裕
(72)【発明者】
【氏名】劉晨旭
(72)【発明者】
【氏名】祁暁竜
(72)【発明者】
【氏名】李夢然
(72)【発明者】
【氏名】陳宝建
(72)【発明者】
【氏名】焦炎炎
(72)【発明者】
【氏名】劉宗凱
【テーマコード（参考）】
2B030
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B030AB04
2B030AD20
2B030CA14
2B030CB02
2B030CG05
4B065AA88X
4B065AA88Y
4B065AA89X
4B065AA89Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA53
(57)【要約】
本発明は、単為生殖一倍体誘導遺伝子ＤＭＰとその使用を提供し、シロイヌナズナから単為生殖一倍体誘導遺伝子ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９をクローニングし、双子葉植物を単為生殖方法により一倍体に誘導し産生できるようにする。本発明はさらに、単為生殖一倍体誘導能力も有するトマトＳ１ＤＭＰも提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物一倍体誘導系の調製方法であって：Ａ１）植物ゲノム中のＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングまたは抑制し、またはＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、植物一倍体誘導系を得ること；または
Ａ２）植物におけるＤＭＰタンパク質の活性を抑制し、植物一倍体誘導系を得ること；
であり；
前記植物は双子葉植物であり：
前記ＤＭＰタンパク質は以下のＢ１）またはＢ２）またはＢ３）またはＢ４）に示すタンパク質であって：
Ｂ１）は、アミノ酸配列は配列２または配列４または配列６で示されるタンパク質であり；
Ｂ２）は、配列２または配列４または配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られる融合タンパク質であり；
Ｂ３）は、配列２または配列４または配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加を経て得られる同じ機能を有するタンパク質であり；
Ｂ４）は、配列２または配列４または配列６で示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、同じ機能を有するタンパク質である、
方法。
【請求項2】
前記双子葉植物がシロイヌナズナである場合、前記ＤＭＰ遺伝子はＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子であり；前記ＤＭＰタンパク質はＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ９タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記双子葉植物がトマトである場合、前記ＤＭＰ遺伝子はＳ１ＤＭＰ遺伝子であり；前記ＤＭＰタンパク質はＳ１ＤＭＰタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＤＭＰ遺伝子は以下のＣ１）またはＣ２）またはＣ３）またはＣ４）に示す遺伝子であって：Ｃ１）は、配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり;
Ｃ２）は、Ｃ１）に記載されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ３）は、双子葉植物に由来し、かつＣ１）で記載されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ４）は、厳しい条件下でＣ１）またはＣ２）またはＣ３）で記載されたヌクレオチド配列とハイブリッドするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
前記ＤＭＰ遺伝子は次の機能を有する：双子葉植物におけるＤＭＰ遺伝子がサイレンシングまたは阻害またはノックアウトされると、前記双子葉植物は植物一倍体誘導系になる、ことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトする方法、または前記Ｓ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトする方法がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記双子葉植物がシロイヌナズナである場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列は、配列１の第９８－１１７位、配列３の第２９０－３０９位、配列３の第３６８－３８７位、および配列１の第５０９－５２８位であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記双子葉植物がトマトである場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列は配列５の７６－９５位および配列５の第２４７－２６６位であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記方法が、ＤＭＰ遺伝子突然変異体をスクリーニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記植物一倍体誘導系はシロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３４、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－６、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１１、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１９、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２４、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２５、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２８またはシロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３２であり；前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４－１１５位の間にあり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－６と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１３－１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、二本の染色体のいずれにも断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１１と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生していることのみであり、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間であり、もう一本の染色体に断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１９と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失された塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列３の第１６１－５６４位に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、他の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列３の第１５９－１６０位に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２５と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失された塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片ＣＧＴの挿入が発生し、該断片の挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列３の第１６１－１６２位に位置し、もう一つの染色体に一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列１の第１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３２と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、一本の染色体に断片欠失が発生することであり、該欠失された断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも塩基Ｃの欠失が発生し、該欠失された塩基は配列３の第１６１位に位置することを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか一項に記載の植物一倍体誘導系を自家受粉させることを含む、植物一倍体誘導系の製造方法。
【請求項11】
ＤＭＰ遺伝子突然変異体をスクリーニングすることをさらに含むことを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記植物一倍体誘導系はシロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３３、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３８、トマト突然変異株系ｓｌｄｍｐ－１または前記トマト突然変異株系ｓｌｄｍｐ－２であり；前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３３と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、二本の染色体にいずれも塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、二本の染色体にいずれも断片挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１４に示され、該断片の挿入位置が配列３の第５６１－５６２位の間に位置し；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子にのみあり、二本の染色体にいずれも断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列１の第１１５－１２７位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、二本の染色体の二つの位置にいずれも塩基Ｔと塩基Ｇの挿入が発生し、二つの位置はそれぞれ配列３の第１６０－１６１位の間と配列３の第５６２－５６３位の間に位置し；
前記トマト変異株ｓｌｄｍｐ－１と野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡの違いは、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子にのみあり、二本の染色体にいずれも一つの塩基Ｃの挿入が発生し、該挿入された塩基は配列５の第９２－９３位の間に位置し；
前記トマト変異株ｓｌｄｍｐ－２と野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡの違いは、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子において、二本の染色体にいずれも断片欠失が発生し、該欠失された断片が配列５の第９３－２４９位に位置することを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法で調製された植物一倍体誘導系またはその子孫を自家受粉するか、または雄親として他の植物材料とハイブリッドし、前記植物一倍体として自殖子孫またはハイブリッド子孫、すなわち植物一倍体を得；前記植物は双子葉植物である、植物一倍体の調製方法。
【請求項14】
前記自殖子孫または前記ハイブリッド子孫の単株に対して蛍光標識同定および／または一倍体性状同定および／または葉の倍数性同定および／または分子マーカー同定を行うことも含み、少なくとも一つの上記方法を選択して一倍体と同定された子孫単株は植物一倍体であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法で調製された植物一倍体誘導系。
【請求項16】
前記植物一倍体誘導系は前記植物一倍体誘導系に由来する細胞、組織および器官を含み、前記器官は、種子、葉、果実、花、茎および根を含むことを特徴とする、請求項１５に記載する植物一倍体誘導系。
【請求項17】
前記植物一倍体誘導系は前記植物一倍体誘導系に由来する繁殖材料を含み、前記繁殖材料は、花粉、子房、胚珠、胚芽、胚乳、卵細胞、切断、根、根端、胚軸、子葉、茎、葉、花、葯、種子、分裂細胞、プロトプラスト、および細胞組織培養による集団を含むことを特徴とする、請求項１５または１６に記載する植物一倍体誘導系。
【請求項18】
請求項１３または１４に記載する方法で調製された植物一倍体。
【請求項19】
前記植物一倍体は前記植物一倍体に由来する細胞、組織および器官を含み、前記器官は、種子、葉、果実、花、茎および根を含むことを特徴とする、請求項１８に記載する植物一倍体。
【請求項20】
前記植物一倍体は前記植物一倍体に由来する繁殖材料を含み、前記繁殖材料は花粉、子房、胚珠、胚芽、胚乳、卵細胞、根、根端、胚軸、子葉、茎、葉、花、葯、種子、分生細胞、プロトプラストおよび細胞組織培養による集団を含むことを特徴とする、請求項１８または１９に記載する植物一倍体。
【請求項21】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のシロイヌナズナ突然変異株系におけるＡｔＤＭＰ８遺伝子、または請求項１から１２のいずれか一項に記載のシロイヌナズナ突然変異株系におけるＡｔＤＭＰ９遺伝子、または請求項１から１２のいずれか一項に記載のトマト突然変異株系におけるＳ１ＤＭＰ遺伝子。
【請求項22】
以下のＤ１）－Ｄ５）いずれかの使用であって、Ｄ１）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法により調製された植物一倍体誘導系が植物一倍体の育成することにおける使用；
Ｄ２）植物ゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトし、またはＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ８タンパク質の活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体を育成することにおける使用；
Ｄ３）植物ゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトする物質、またはＳ１ＤＭＰタンパク質活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体の育成することにおける使用；
Ｄ４）ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはその関連生物材料および／またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加させるか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用；
Ｄ５）Ｓ１ＤＭＰタンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加させるか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用；であり、
前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質は以下のａ１）またはａ２）またはａ３）またはａ４）に示すタンパク質であって；
ａ１）は、アミノ酸配列が配列番号２で示されるタンパク質であり；
ａ２）は、配列２に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ａ３）は、配列２に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ａ４）は、配列２に示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質であり；
前記ＡｔＤＭＰ９タンパク質は以下のｂ１）またはｂ２）またはｂ３）またはｂ４）に示すタンパク質であって；
ｂ１）は、アミノ酸配列が配列番号４で示されるタンパク質であり；
ｂ２）は、配列４に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｂ３）は、配列４に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｂ４）は、配列４に示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質であり；
前記Ｓ１ＤＭＰタンパク質は以下のｃ１）またはｃ２）またはｃ３）またはｃ４）に示すタンパク質であり；
ｃ１）は、アミノ酸配列が配列番号６で示されるタンパク質であり；
ｃ２）は、配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｃ３）は、配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｃ４）は、配列６に示すアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である、
使用。
【請求項23】
前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質関連生物材料は下記ｄ１）からｄ１２）のいずれかであって；ｄ１）は、前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質または前記Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする核酸分子であり；
ｄ２）は、ｄ１）に記載の核酸分子を含む発現カセットであり；
ｄ３）は、ｄ１）に記載の核酸分子を含む組み換えベクターであり；
ｄ４）は、ｄ２）に記載の発現カセットを含む組み換えベクターであり；
ｄ５）は、ｄ１）に記載の核酸分子を含む組み換え微生物であり；
ｄ６）は、ｄ２）に記載の発現カセットを含む組み換え微生物であり；
ｄ７）は、ｄ３）に記載の組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ８）は、ｄ４）に記載の組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ９）は、ｄ１）に記載の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１０）は、ｄ２）に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１１）は、ｄ３）に記載の組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１２）は、ｄ４）に記載の組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株であることを特徴とする、請求項２２に記載する使用。
【請求項24】
ｄ１）に記載の核酸分子は以下の１）または２）または３）または４）に示す遺伝子であって：１）は、そのコード配列は配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
２）は、１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするＣＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
３）は、双子葉植物に由来し、かつ１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするＣＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
４）は、厳しい条件下で１）または２）または３）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリッドし、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするＣＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項２３に記載する使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ゲノム編集技術を主とする農業バイオテクノロジー分野および作物遺伝育種分野に関するものであり、具体的には植物雌親一倍体誘導系の調製方法とその使用に関し。特に、植物の雌親一倍体の生成の誘導における、遺伝子編集技術を用いて得られた単為生殖一倍体誘導遺伝子であるＤＭＰの突然変異体の植物一倍体誘導系としての使用に関する。
【背景技術】
【0002】
優良近交系の選育は作物が雑種優勢を利用し、優良ハイブリッド種を選育する基礎と鍵である。しかし、従来の育種方法では７～８世代で安定した近交系を得ることができることに対し、一倍体育種技術ではでは２世代（ＷｅｂｅｒＤＦ，２０１４）しか必要とせず、育種サイクルを大幅に短縮できました。現在、双子葉作物における一倍体の発生は主に花の薬のインビトロ培養に依存し、効率が低くかつ材料に対する遺伝子型依存性が高く、規模化の応用を実現しにくい。遺伝的に修飾されたセントロメア特有のヒストンＣＥＮＨ３（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｓｔｏｎｅ ３ ｖａｒｉａｎｔ）をシロイヌナズナｃｅｎｈ３突然変異体に導入すると一倍体の生成を誘導することができるが、この方式は誘導過程で大量の正倍数体（Ｒａｖｉ，Ｍ，ｅｔ ａｌ，２０１０）を産生する。
【0003】
現在、遺伝子編集技術の体系は非常に成熟して安定しているが、遺伝形質転換が材料と遺伝子型への依存の限界から、それ以上の作用を発揮することができない。遺伝子編集ベクターを形質転換しやすい受容体材料に導入し、さらに編集が必要なターゲットとハイブリッドすることによって編集（Ｌｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２０１７）が可能であり、バックグラウンドを回復するには長い時間の戻し交配が必要であり、かつ１００％にはならない。一倍体誘導と遺伝子編集技術を組み合わせて目標材料である一倍体の遺伝子を編集を実現し、ホモ接合を得る編集系を獲得し、一倍体と遺伝子編集技術の応用範囲を大幅に短縮・拡大した（Ｋｅｌｌｉｈｅｒ， Ｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９； Ｗａｎｇ， Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１９； Ｈｕ， Ｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。しかしながら、双子葉植物では、生物誘導による一倍体生成方式の欠如により、遺伝子編集技術と組み合わせることができない。
【発明の概要】
【0004】
本発明の目的は植物一倍体誘導系の調製方法を提供することである。
【0005】
本発明が提供する植物一倍体誘導系の調製方法は、以下のＡ１）またはＡ２）であって：
Ａ１）は、植物ゲノム中のＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングまたは抑制し、またはＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、植物一倍体誘導系を得ることであり；
Ａ２）は、植物におけるＤＭＰタンパク質の活性を抑制し、植物一倍体誘導系を得ることであり；
前記植物は双子葉植物であり；
前記ＤＭＰタンパク質は以下のＢ１）またはＢ２）またはＢ３）またはＢ４）に示すタンパク質であって：
Ｂ１）は、アミノ酸配列は配列２または配列４または配列６で示されるタンパク質であり；
Ｂ２）は、配列２または配列４または配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られる融合タンパク質であり；
Ｂ３）は、配列２または配列４または配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加を経て得られる同じ機能を有するタンパク質であり；
Ｂ４）は、配列２または配列４または配列６で示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、同じ機能を有するタンパク質であり；
前記ＤＭＰタンパク質は以下の機能を有する：双子葉植物におけるＤＭＰタンパク質活性が抑制されると、前記双子葉植物は植物一倍体誘導系になる。前記ＤＭＰタンパク質活性は、ＤＭＰタンパク質を発現させないまたはＤＭＰタンパク質不活性化するように抑制される。
Ａ１）は、植物ゲノム中のＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングまたは抑制し、またはＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、植物一倍体誘導系を得ることであり；
Ａ２）は、植物におけるＤＭＰタンパク質の活性を抑制し、植物一倍体誘導系を得ることであり；
前記植物は双子葉植物であり；
前記ＤＭＰタンパク質は以下のＢ１）またはＢ２）またはＢ３）またはＢ４）に示すタンパク質であって：
Ｂ１）は、アミノ酸配列は配列２または配列４または配列６で示されるタンパク質であり；
Ｂ２）は、配列２または配列４または配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られる融合タンパク質であり；
Ｂ３）は、配列２または配列４または配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加を経て得られる同じ機能を有するタンパク質であり；
Ｂ４）は、配列２または配列４または配列６で示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、同じ機能を有するタンパク質であり；
前記ＤＭＰタンパク質は以下の機能を有する：双子葉植物におけるＤＭＰタンパク質活性が抑制されると、前記双子葉植物は植物一倍体誘導系になる。前記ＤＭＰタンパク質活性は、ＤＭＰタンパク質を発現させないまたはＤＭＰタンパク質不活性化するように抑制される。
【0006】
上記Ｂ２）において、前記タグは、目的のタンパク質の発現、検出、トレースおよび／または精製を容易にするために、前記タグはＤＮＡのインビトロ組み換え技術を用いて、目的タンパク質と共に融合して発現されたポリペプチドまたはタンパク質を指す。前記タンパク質タグは、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ＭＢＰタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＧＳＴタグ、および／またはＳＵＭＯタグなどとすることができる。
【0007】
上記Ｂ３）において、前記一つまたは複数のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加が１０個以下のアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加である。
【0008】
上記Ｂ４）において、前記７５％または７５％以上の同一性は、８０％、８５％、９０％または９５％以上の同一性であることができる。
【0009】
上記植物一倍体誘導系の調製方法において、前記ＤＭＰ遺伝子は以下のＣ１）またはＣ２）またはＣ３）またはＣ４）に示す遺伝子であって：
Ｃ１）は、配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ２）は、Ｃ１）で限定されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ３）は、双子葉植物に由来し、かつＣ１）で限定されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ４）は、厳しい条件下でＣ１）またはＣ２）またはＣ３）で限定されたヌクレオチド配列とハイブリッドするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
前記ＤＭＰ遺伝子は以下の機能を有する：双子葉植物におけるＤＭＰ遺伝子がサイレンシングまたは阻害またはノックアウトされると、前記双子葉植物は植物一倍体誘導系になる。
Ｃ１）は、配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ２）は、Ｃ１）で限定されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ３）は、双子葉植物に由来し、かつＣ１）で限定されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有するｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
Ｃ４）は、厳しい条件下でＣ１）またはＣ２）またはＣ３）で限定されたヌクレオチド配列とハイブリッドするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
前記ＤＭＰ遺伝子は以下の機能を有する：双子葉植物におけるＤＭＰ遺伝子がサイレンシングまたは阻害またはノックアウトされると、前記双子葉植物は植物一倍体誘導系になる。
【0010】
ここで使用する用語「同一性」は、天然の核酸塩酸配列との配列類似性を指す。「同一性」は、本発明のコード配列２または配列４または配列６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のヌクレオチド配列と７５％以上、または８５％以上、または９０％以上、または９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。同一性は肉眼またはコンピュータソフトウェアで評価できる。コンピュータソフトウェアを使用して、二つ以上の配列間の同一性をパーセンテージ（％）で表すことができ、これを用いて関連する配列間の同一性を評価することができる。
【0011】
上記植物一倍体誘導系の調製方法において、前記植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＤＭＰ遺伝子をノックアウトする方法は、植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の発現量を低下させるか、または植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子が欠失突然変異もしくは挿入突然変異もしくは塩基置換を生じさせることである。
【0012】
さらに、前記双子葉植物がシロイヌナズナである場合、前記ＤＭＰ遺伝子はＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子であり；前記ＤＭＰタンパク質はＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ９タンパク質である。
【0013】
前記方法はシロイヌナズナゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトし、またはＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ８タンパク質の活性を抑制し、シロイヌナズナ一倍体の誘導系を得る。
【0014】
前記双子葉植物がトマトである場合、前記ＤＭＰ遺伝子はＳ１ＤＭＰ遺伝子である；前記ＤＭＰタンパク質はＳ１ＤＭＰタンパク質である；前記方法はトマトゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子をサイレンシングまたは抑制し、またはＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、またはＳ１ＤＭＰタンパク質の活性を抑制し、トマト一倍体の誘導系を得る。
【0015】
さらにまた、前記シロイヌナズナゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングまたは抑制し、またはＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトすることは、シロイヌナズナゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現量を低下させまたはシロイヌナズナゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の欠失突然変異または挿入突然変異または塩基置換を引き起こす。
【0016】
前記トマトゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子の発現および／また活性化をサイレンシングまたは抑制し、またはＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトすることは、トマトゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子発現を減少させるまたはトマトゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子の欠失突然変異または挿入突然変異または塩基置換を引き起こす。
【0017】
前記植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の発現量を低下させる方法はＲＮＡｉ干渉であってもよい。前記ＲＮＡｉ干渉は、ｍｉＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡ干渉、またはｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどのような二本鎖ＲＮＡ干渉であってもよい。
【0018】
前記植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の欠失突然変異または挿入突然変異または塩基置換を起こさせる方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＥＬＬＥＮまたはＴ－ＤＮＡ挿入もしくはＥＭＳによる突然変異誘発であってもよい。
【0019】
さらに、前記植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の欠失突然変異または挿入突然変異または塩基置換を起こさせる方法はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である。前記植物ゲノムにおけるＤＭＰ遺伝子の欠失突然変異または挿入突然変異または塩基置換を起こさせる方法は前記標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを植物に導入し、植物一倍体誘導系を得るステップを含む。
【0020】
本発明の具体的な実施形態において、前記双子葉植物がシロイヌナズナである場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列は、配列１の第９８－１１７位、配列３の第２９０－３０９位、配列３の第３６８－３８７位、および配列１の第５０９－５２８位である。前記する前記標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、配列７に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列９に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）および配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅの方法によりｐＩＣＳＬ４７２３ベクターに連結した組み換えベクターである。
【0021】
本発明の一つの具体的な実施例において、前記双子葉植物がトマトである場合、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列は配列５の第７６－９５位および配列５の第２４７－２６６位である。前記する前記標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、配列８に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列１１に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）、配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）および配列１２に示されるＤＮＡ分子（ＮｐｔＩＩ発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅの方法によってｐＩＣＳ４７２３ベクターに連結した組み換えベクターである。
【0022】
本発明のもう一つの目的は、上記植物一倍体誘導系を近交するステップを含む、植物一倍体誘導系の調製方法を提供することである。
【0023】
前記近交の回数は少なくとも１回であり、具体的に１回とすることが可能である。
【0024】
上記いずれかの前記植物一倍体誘導系の調製方法はさらにＤＭＰ遺伝子突然変異体をスクリーニングするステップを含む。前記ＤＭＰ遺伝子突然変異体はＤＭＰ遺伝子が突然変異した植物であり、前記ＤＭＰ遺伝子突然変異体はＤＭＰ遺伝子ヘテロ接合突然変異体またはＤＭＰ遺伝子ホモ接合突然変異体である。
【0025】
上記いずれかの前記植物一倍体誘導系の調製方法において、前記植物一倍体誘導系は具体的にシロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３４、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－６、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１１、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１９、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２４、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２８、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３２、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３３、シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３８、トマト突然変異株系ｓｌｄｍｐ－１または前記トマト突然変異株系ｓｌｄｍｐ－２であり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４－１１５位の間にあることであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－６と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１３－１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子では、二本の染色体にいずれも断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１１と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間であり、もう一本の染色体に断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１９と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６４位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置することである；他の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１５９－１６０位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２５と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片ＣＧＴの挿入が発生し、該断片の挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－１６２位に位置し、もう一つの染色体に一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列１の第１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３２と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４～１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも塩基Ｃの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列３の第１６１位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３３と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子であり、二本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子における二本の染色体にいずれも断片挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１４に示され、該断片の挿入位置が配列３の第５６１－５６２位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子の２本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－１２７位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子における二本の染色体の二つの位置にいずれも塩基Ｔと塩基Ｇの挿入が発生し、二つの位置はそれぞれ配列３の第１６０－１６１位の間と配列３の第５６２－５６３位の間に位置することであり；
前記トマト変異株ｓｌｄｍｐ－１と野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡの唯一の違いは、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子であり、その二本の染色体にいずれも一つの塩基Ｃの挿入が発生し、該挿入された塩基は配列５の第９２－９３位の間に位置することである。
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４－１１５位の間にあることであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－６と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１３－１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子では、二本の染色体にいずれも断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１１と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間であり、もう一本の染色体に断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１３に示され、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－１９と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６４位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２４と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置することである；他の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１５９－１６０位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２５と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片ＣＧＴの挿入が発生し、該断片の挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－１６２位に位置し、もう一つの染色体に一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－２８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列１の第１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３２と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置は配列１の第１１４～１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において二本の染色体にいずれも塩基Ｃの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列３の第１６１位に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ１－３３と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子であり、二本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子における二本の染色体にいずれも断片挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は配列１４に示され、該断片の挿入位置が配列３の第５６１－５６２位の間に位置することであり；
前記シロイヌナズナ突然変異株系Ｔ２－３８と野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡの唯一の違いは、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子の２本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－１２７位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子における二本の染色体の二つの位置にいずれも塩基Ｔと塩基Ｇの挿入が発生し、二つの位置はそれぞれ配列３の第１６０－１６１位の間と配列３の第５６２－５６３位の間に位置することであり；
前記トマト変異株ｓｌｄｍｐ－１と野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡの唯一の違いは、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子であり、その二本の染色体にいずれも一つの塩基Ｃの挿入が発生し、該挿入された塩基は配列５の第９２－９３位の間に位置することである。
【0026】
前記トマト変異株ｓｌｄｍｐ－２と野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡの違いは、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子における二本の染色体にいずれも断片欠失が発生し、該欠失断片が配列５の第９３－２４９位に位置することのみである。
【0027】
本発明のもう一つの目的は植物一倍体の調整方法を提供することである。
【0028】
本発明によって提供される植物一倍体の調整方法は以下のステップを含む：上記方法で調製された植物一倍体誘導系またはその後代を近交するか、または雄親として他の植物材料とハイブリッドし、自殖子孫またはハイブリッド子孫、即ち前記植物一倍体を得；前記植物は双子葉植物である。
【0029】
さらに、上記植物一倍体の調製方法はさらに以下のステップを含む：前記自殖子孫または前記ハイブリッド子孫の単株に対して蛍光標識同定および／または一倍体性状同定および／または葉倍性同定および／またはマーカー同定を行い、少なくとも一つの方法を選択して一倍体と同定された後代単株は植物一倍体である。
【0030】
さらに、前記蛍光標識同定方法は以下の方法で行うことができる：蛍光タンパク質発現エレメントを保有する上記植物一倍体誘導系を雄親として雌親とハイブリッドし、ハイブリッド後代を得て、ハイブリッド後代種子が蛍光シグナルを有するか否かを検出することにより、測定対象の種子が一倍体か二倍体かを判断する：測定対象の種子が無蛍光または弱蛍光である場合、該種子は一倍体または候補として一倍体である；測定対象の種子が強い蛍光を示す場合、該種子は二倍体または候補としてである。さらに、蛍光灯により測定対象の種子が蛍光を有するか否かを検出する。さらに、前記父本はプロモーターＡｔＯＬＥＯ １によって駆動されるＴａｇＲＦＰ蛍光タンパク質発現エレメントを保有するため、ハイブリッド後代種子が赤色蛍光を有するか否かに基づいてそれが一倍体か二倍体かを判断することができる。
【0031】
前記一倍体性状の同定方法は以下の方法に従って行うことができる：測定対象植物体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上に向く、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有すると、該植物体は一倍体または候補として一倍体である；測定対象植物体は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である等の特徴を有すると、該植物体は二倍体または候補として二倍体である。
【0032】
前記葉の倍数性同定方法は以下の方法に従って行うことができる：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体植物の葉を対照とする；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、かつ二倍体細胞核シグナルのピークを５０（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが２５付近に現れる）に設定する。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが２５付近に現れると、該植物体は一倍体または候補として一倍体である；測定対象植物のシグナルピークが５０付近に現れると、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じであれば、該植物は二倍体または候補として二倍体である。
【0033】
前記マーカー同定は以下の方法に従って行うことができる：雄親（目鵜親単倍体誘導系）と雌親との間の多型プライマーを用いてＰＣＲの増幅を行い、ＰＣＲの増幅産物に基づいて測定対象植物体が一倍体か二倍体かを判断する；測定対象植物体の増幅産物は雌親のバンド型のみを有し、父本のバンド型が存在しない場合、該植物体は一倍体または候補として一倍体である；測定対象植物体の増幅産物は雄親と雌親のヘテロ接合バンド型を有する場合、該植物体は二倍体または候補として二倍体である。
【0034】
上記方法により調製された植物一倍体誘導系および植物一倍体も本発明の保護範囲に属する。
【0035】
植物一倍体誘導系および植物一倍体は、植物一倍体誘導系および植物一倍体に由来する細胞、組織、器官、例えば、種子、葉、果実、茎、花、根が含むだけでなく、前記植物一倍体誘導系および植物一倍体に由来する繁殖材料、例えば、花粉、子房、胚珠、胚芽、胚乳、卵細胞、切断、根、根端、胚軸、子葉、茎、葉、花、葯、種子、分裂細胞、プロトプラスト、および細胞組織培養による集団も含む。
【0036】
上記方法における前記シロイヌナズナ突然変異株系におけるＡｔＤＭＰ８遺伝子、または前記シロイヌナズナ突然変異株系におけるＡｔＤＭＰ９遺伝子、または前記トマト突然変異株系におけるＳ１ＤＭＰ遺伝子も本発明の保護範囲に属する。
【0037】
以下Ｄ１）－Ｄ５）のいずれの使用も本発明の保護範囲に属する：
Ｄ１）は、上記方法で調製された植物一倍体誘導系が植物一倍体の育成することにおける使用であり；
Ｄ２）は、植物ゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し，またはＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトし、またはＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ８タンパク質の活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体を育成することにおける使用であり；
Ｄ３）は、植物ゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトする物質、またはＳ１ＤＭＰタンパク質活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体の育成することにおける使用であり；
Ｄ４）は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはその関連生物材料および／またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加するか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用であり；
Ｄ５）は、Ｓ１ＤＭＰタンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加するか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用である。
Ｄ１）は、上記方法で調製された植物一倍体誘導系が植物一倍体の育成することにおける使用であり；
Ｄ２）は、植物ゲノムにおけるＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し，またはＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトし、またはＡｔＤＭＰ８タンパク質および／またはＡｔＤＭＰ８タンパク質の活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体を育成することにおける使用であり；
Ｄ３）は、植物ゲノムにおけるＳ１ＤＭＰ遺伝子の発現および／または活性をサイレンシングしまたは抑制し、またはＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトする物質、またはＳ１ＤＭＰタンパク質活性を抑制する物質が植物一倍体誘導系または植物一倍体の育成することにおける使用であり；
Ｄ４）は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはその関連生物材料および／またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加するか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用であり；
Ｄ５）は、Ｓ１ＤＭＰタンパク質またはその関連生物材料が、植物一倍体誘導系の誘導率をコントロールし、または植物一倍体誘導系の誘導率を増加するか、または植物一倍体誘導系もしくは植物一倍体を育成することにおける使用である。
【0038】
上記いずれかの前記使用または方法において、前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質は以下のａ１）またはａ２）またはａ３）またはａ４）に示すタンパク質であって：
ａ１）は、アミノ酸配列が配列番号２で示されるタンパク質であり；
ａ２）は、配列２に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ａ３）は、配列２に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ａ４）は、配列２に示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
ａ１）は、アミノ酸配列が配列番号２で示されるタンパク質であり；
ａ２）は、配列２に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ａ３）は、配列２に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ａ４）は、配列２に示されるアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
【0039】
前記ＡｔＤＭＰ９タンパク質は以下のｂ１）またはｂ２）またはｂ３）またはｂ４）に示すタンパク質であって：
ｂ１）は、アミノ酸配列が配列番号４で示されるタンパク質であり；
ｂ２）は、配列４に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｂ３）は、配列４に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｂ４）は、配列４に示すアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
ｂ１）は、アミノ酸配列が配列番号４で示されるタンパク質であり；
ｂ２）は、配列４に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｂ３）は、配列４に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｂ４）は、配列４に示すアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
【0040】
前記Ｓ１ＤＭＰタンパク質は以下のｃ１）またはｃ２）またはｃ３）またはｃ４）に示すタンパク質であって：
ｃ１）は、アミノ酸配列が配列番号６で示されるタンパク質であり；
ｃ２）は、配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｃ３）は、配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｃ４）は、配列６に示すアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
ｃ１）は、アミノ酸配列が配列番号６で示されるタンパク質であり；
ｃ２）は、配列６に示されるタンパク質のＮ端および／またはＣ端にタグを連結して得られた融合タンパク質であり；
ｃ３）は、配列６に示されるアミノ酸配列を一つまたはいくつかのアミノ酸残基の置換および／または欠失および／または添加により得られた同じ機能を有するタンパク質であり；
ｃ４）は、配列６に示すアミノ酸配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するタンパク質である。
【0041】
前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質の関連生物材料は下記ｄ１）からｄ１２）のいずれかであって：
ｄ１）は、前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質または前記ＡｔＤＭＰ９タンパク質または前記Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする核酸分子であり；
ｄ２）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む発現カセットであり；
ｄ３）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む組み換えベクターであり；
ｄ４）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含む組み換えベクターであり；
ｄ５）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む組み換え微生物であり；
ｄ６）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含む組み換え微生物であり；
ｄ７）は、ｄ３）で定義される組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ８）は、ｄ４）で定義される組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ９）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１０）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１１）は、ｄ３）で定義される組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１２）は、ｄ４）で定義される組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株である。
ｄ１）は、前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質または前記ＡｔＤＭＰ９タンパク質または前記Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする核酸分子であり；
ｄ２）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む発現カセットであり；
ｄ３）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む組み換えベクターであり；
ｄ４）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含む組み換えベクターであり；
ｄ５）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含む組み換え微生物であり；
ｄ６）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含む組み換え微生物であり；
ｄ７）は、ｄ３）で定義される組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ８）は、ｄ４）で定義される組み換えベクターを含む組み換え微生物であり；
ｄ９）は、ｄ１）で定義される核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１０）は、ｄ２）で定義される発現カセットを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１１）は、ｄ３）で定義される組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株であり；
ｄ１２）は、ｄ４）で定義される組み換えベクターを含むトランスジェニック植物細胞株である。
【0042】
さらに、ｄ１）に記載する核酸分子は以下の１）または２）または３）または４）に示す遺伝子であって：
１）は、そのコード配列は配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
２）は、１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
３）は、双子葉植物に由来し、かつ１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
４）は、厳しい条件下で１）または２）または３）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリッドし、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子である。
１）は、そのコード配列は配列１または配列３または配列５に示されるｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
２）は、１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
３）は、双子葉植物に由来し、かつ１）で定義されたヌクレオチド配列と７５％または７５％以上の同一性を有し、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子であり；
４）は、厳しい条件下で１）または２）または３）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリッドし、かつ前記ＡｔＤＭＰ８タンパク質またはＡｔＤＭＰ９タンパク質またはＳ１ＤＭＰタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子である。
【0043】
そのうち、配列１はＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする核酸分子であり、配列３はＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする核酸分子であり、配列５はＳ１ＤＭＰタンパク質をコードする核酸分子である。
【0044】
さらに、前記ＡｔＤＭＰ８遺伝子および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトする物質または前記Ｓ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトする物質は上記する前記標的配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターである。
【0045】
上記いずれかに記載された使用または方法または植物において、前記植物は双子葉植物であって；前記双子葉植物は具体的にシロイヌナズナまたはトマトであってもよく；前記シロイヌナズナは具体的に野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ－０）またはｍｓ１であってもよく；前記トマトは具体的に野生型トマトＡＣまたはＭｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはトマトＡＣおよびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍのハイブリッドから得られるＦ１世代材料であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】シロイヌナズナ一倍体および二倍体の比較図である。矢印で指す植物体は一倍体である。
【図2】シロイヌナズナ一倍体および二倍体の薹立ち後の比較図である。
【図3】シロイヌナズナ一倍体および二倍体のフローサイトメトリー結果の比較図である。
【図5】シロイヌナズナ一倍体および二倍体のマーカーによる検証ゲル図である。Ｍは２Ｋマーカーであり、Ｉは雌親材料バンド型であり、ＩＩは父本材料バンド型であり、ＩＩＩは一倍体バンド型であり、ＩＶは二倍体バンド型である。
【図6】野生型トマトおよびｓｌｄｍｐ突然変異体の植物体と果実の比較図である。図６のａ、ｂはそれぞれ野生型トマトおよびｓｌｄｍｐ突然変異体植物体であり、ｃ、ｄはそれぞれ野生型トマトおよびｓｌｄｍｐ突然変異体の自家受粉果実である。
【図8】トマト一倍体および二倍体フローサイトメトリー結果の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【0047】
以下の実施例は、本発明のより良い理解を容易にするものであり、本発明を限定するものではない。下記の実施例における実験方法は、特に説明しない限り、いずれも従来の方法である。下記の実施例で使用した試験材料は、特に明記しない限り、いずれも通常の生化学試薬店から購入したものである。下記の実施例における定量試験は、いずれも三回の繰り返し実験を設け、結果は平均値を取る。
【0048】
下記実施例におけるｐＩＣＳＬ４７２３、ベクターは、文献「Ｃａｓｔｅｌ， Ｂ． ａｎｄ Ｌ． Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ． （２０１９）． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ＤＮＡ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ， １４（１）．」に記載されており、公衆は、中国農務大学から入手することができ、該試験材料は本発明の関連実験を繰り返すためだけに使用され、他の用途として使用することはできない。
【0049】
下記実施例における野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０およびｍｓ１はいずれも文献「Ｒｏｓｓｏ， Ｍ． Ｇ． ａｎｄ Ｙ． Ｌｉ， ｅｔ ａｌ． （２００３）． Ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｔ－ＤＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｉｚｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ （ＧＡＢＩ－Ｋａｔ） ｆｏｒ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ－ｂａｓｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５３ （１－２）： ２４７－５９．」に記載されており、公衆は中国農学大学から入手することができ、該生体材料は本発明の関連実験を繰り返すためだけに使用され、他の用途として使用することはできない。
【0050】
下記実施例における野生型トマトＡＣは、文献「Ｙｕａｎ， Ｇ． ａｎｄ Ｃ． Ｊｉａ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｏｎ ｄｒｏｕｇｈｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｕｎｄｅｒ ｗａｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ １２６ （２）： １０３－１０８．」に記載されており、公衆は中国農学大学から入手することができ、該生体材料は本発明の関連実験を繰り返すためだけに使用され、他の用途として使用することはできない。
【0051】
下記実施例中の野生型トマトＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍは文献「Ｓｕｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｓ． Ｕｃｈｉｉ， ｅｔ ａｌ． （２００６）． Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍ， ａ ｍｏｄｅｌ ｃｕｌｔｉｖａｒ ｆｏｒ ｔｏｍａｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ． Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４７ （３）： ４２６－４３１．」に記載されており、公衆は中国農学大学から入手することができ、該生体材料は本発明の関連実験を繰り返すためだけに使用され、他の用途として使用することはできない。
【0052】
本発明におけるＡｔＤＭＰ８遺伝子のＣＤＳ配列は配列表における配列１の第９５－８２６位に示すように、ＡｔＤＭＰ８遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列は配列２に示すようである。
【0053】
本発明におけるＡｔＤＭＰ９遺伝子のＣＤＳ配列は配列表における配列３の第１４１－８７５位に示され、ＡｔＤＭＰ９遺伝子にコードされたタンパク質のアミノ酸配列は配列４に示される。
【0054】
本発明におけるＳ１ＤＭＰ遺伝子のＣＤＳ配列は配列表における配列５の第１－６７８位に示され、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子にコードされたタンパク質のアミノ酸配列は配列６に示される。
【実施例】
【0055】
実施例１、ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトしたシロイヌナズナ突然変異体の調製およびその使用
一．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトする。
一．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトする。
【0056】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用してＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトし、ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体を得る。具体的なステップは以下のとおりである：
【0057】
１．ｓｇＲＮＡ配列の選択
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子にそれぞれ長さは２０ｂｐである標的部位配列を設けた。
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子にそれぞれ長さは２０ｂｐである標的部位配列を設けた。
【0058】
標的部位１は、配列１の第９８－１１位、配列３の第１４４－１６３位に位置しており、ｓｇＲＮＡの標的部位１配列はＧＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴである。
【0059】
標的部位２は、配列３の第２９０－３０９位に位置し、ｓｇＲＮＡ標的部位２配列はＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＧＣＡである。
【0060】
標的部位３は、配列３の第３６８－３８７位に位置し、ｓｇＲＮＡ標的部位３配列はＴＣＡＡＧＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＡである。
【0061】
標的部位４は、配列１の第５０９－５２８位、配列３の第５５８－５７７位に位置し、ｓｇＲＮＡ標的部位４配列はＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＡＣＧである。
【0062】
２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは配列７に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列９に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）および配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ方法によってｐＩＣＳＬ４７２３ベクターに連結した後に得られた組み換えベクター（ベクター構造図は図９ａに示す）である。配列７に示されるＤＮＡ分子は、標的部位１を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位４を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列の順次に含み、各ｓｇＲＮＡのコード配列の前には、ｓｇＲＮＡのコード配列の発現を開始するためのＡｔＵ ６－２６プロモーターが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは配列７に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列９に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）および配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ方法によってｐＩＣＳＬ４７２３ベクターに連結した後に得られた組み換えベクター（ベクター構造図は図９ａに示す）である。配列７に示されるＤＮＡ分子は、標的部位１を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位４を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列の順次に含み、各ｓｇＲＮＡのコード配列の前には、ｓｇＲＮＡのコード配列の発現を開始するためのＡｔＵ ６－２６プロモーターが含まれる。
【0063】
３．トランスジェニック植物体の獲得
ステップ２で得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをヒートショックによる形質転換によってアグロバクテリウムコンピテント細胞ＧＶ３１０１（アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞は北京奥森鼎信生物技術有限公司から購入され、公衆は購入することによって得ることができる）に転換し、組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を得た。
ステップ２で得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをヒートショックによる形質転換によってアグロバクテリウムコンピテント細胞ＧＶ３１０１（アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞は北京奥森鼎信生物技術有限公司から購入され、公衆は購入することによって得ることができる）に転換し、組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を得た。
【0064】
さらに、組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をアグロバクテリウムがシロイヌナズナ花序を感染する形質転換方法（組み換えアグロバクテリウムは２８°Ｃで増殖し、増殖後の菌液はシロイヌナズナ花序感染に用いた）を用いて野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０の花序に感染し、赤色蛍光スクリーニングを経た後、Ｔ１世代のトランスジェニックシロイヌナズナ植物体を得た。
【0065】
４．ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子に突然変異が発生するトランスジェニック植物体の同定。
【0066】
ステップ３で得られたＴ１世代のトランスジェニックシロイヌナズナ植物体の葉を採取し、かつゲノムＤＮＡをテンプレートとして抽出し、以下の二対のプライマーを用いてそれぞれＰＣＲ増幅を行い、異なる株系のＰＣＲ増幅産物を得た。
【0067】
ＡｔＤＭＰ８突然変異配列検出プライマーの配列は以下のとおりである：
ＤＭＰ８Ｆ１：ＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧ；
ＤＭＰ８Ｒ１：ＡＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＴＣＣＧ。
ＤＭＰ８Ｆ１：ＴＧＣＧＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧ；
ＤＭＰ８Ｒ１：ＡＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＴＣＣＧ。
【0068】
ＡｔＤＭＰ９突然変異配列検出プライマーの配列は以下のとおりである：
ＤＭＰ９Ｆ１：ＡＴＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧ；
ＤＭＰ９Ｒ２：ＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣ。
ＤＭＰ９Ｆ１：ＡＴＡＡＣＣＧＴＣＡＡＴＡＡＣＣＧＣＣＧ；
ＤＭＰ９Ｒ２：ＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＣ。
【0069】
異なる株系のＰＣＲ増幅産物をＳａｎｇｅｒシーケンシングし、かつシーケンシング結果を野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９とそれぞれアライメントした。以下の原理に従ってＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９のそれぞれの遺伝子型に対して同定した。
【0070】
標的部位配列から二重ピーク性特徴を有する配列であれば、該株系の遺伝子型はヘテロ接合遺伝子型（２本の相同染色体における１本の染色体上のＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子が突然変異し、かつもう１本の染色体上のＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子が突然変異しない）であり、該株系はＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナのヘテロ接合突然変異体株系であり；
標的部位配列から特異的なシングルピーク特徴を有する配列は、野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９の遺伝子配列と同じ場合、該株系の遺伝子型は野生型であり、即ちＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子配列に突然変異が発生しない；野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９の遺伝子配列と異なる場合、該株系の遺伝子型はホモ接合遺伝子型（２本の相同染色体上のＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子はいずれも突然変異する）であり、該株系はＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナホモ接合突然変異型株系である。
標的部位配列から特異的なシングルピーク特徴を有する配列は、野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９の遺伝子配列と同じ場合、該株系の遺伝子型は野生型であり、即ちＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子配列に突然変異が発生しない；野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９の遺伝子配列と異なる場合、該株系の遺伝子型はホモ接合遺伝子型（２本の相同染色体上のＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子はいずれも突然変異する）であり、該株系はＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナホモ接合突然変異型株系である。
【0071】
同定する結果を表１および２に示す（表１、２はそれぞれＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナのＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異状況である）：４１株のＴ１世代のトランスジェニックシロイヌナズナ植物体において、３３株のＴ１世代のトランスジェニック植物体のＡｔＤＭＰ８遺伝子に突然変異が発生し、そのうち２株のＡｔＤＭＰ８遺伝子にホモ接合突然変異が発生し、１７株のＡｔＤＭＰ８遺伝子に両対立遺伝子突然変異が発生した。２８株のＴ１世代トランスジェニック植物のＡｔＤＭＰ９遺伝子に突然変異が発生し、そのうち５株のＡｔＤＭＰ９遺伝子にホモ接合突然変異が発生し、７株のＡｔＤＭＰ９遺伝子に両対立遺伝子突然変異が発生した。ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９はいずれもホモ接合突然変異／両対立遺伝子突然変異が起きたのは１２株があった。表現型同定のために、フレームシフト突然変異（欠失は３の倍数ではない）を引き起こすホモ接合突然変異／両対立遺伝子突然変異の単株をさらに選択した。全部でＡｔＤＭＰ８ホモ接合突然変異／両対立遺伝子突然変異、ＡｔＤＭＰ９ホモ接合突然変異／両対立遺伝子突然変異、ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９ホモ接合突然変異／両対立遺伝子突然変異の両方の３種類である。
【0072】
得られたＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異株はＴ１－３４を有し、具体的な突然変異は以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異株Ｔ１－３４は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置した；もう一方の染色体には、配列番号１の第１１４－１１５位の間に位置する塩基Ｔの挿入が発生したことである。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異株Ｔ１－３４は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置した；もう一方の染色体には、配列番号１の第１１４－１１５位の間に位置する塩基Ｔの挿入が発生したことである。
【0073】
得られたＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重突然変異株はＴ１－６、Ｔ１－１１、Ｔ１－１９、Ｔ１－２４、Ｔ１－２５、Ｔ１－２８、Ｔ１－３２を有し、具体的な突然変異は以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重突然変異株系Ｔ１－６は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体が断片欠失を発生した、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列１の第１１３－１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子で断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は、ＧＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ（配列１３）であり、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することである。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重突然変異株系Ｔ１－６は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体が断片欠失を発生した、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列１の第１１３－１１４位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子で断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は、ＧＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ（配列１３）であり、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することである。
【0074】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代のトランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の二重突然変異株系Ｔ１－１１は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間であり、もう一本の染色体に断片の挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は、ＧＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣ（配列１３）であり、該断片の挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置することである。
【0075】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重変異株系Ｔ１－１９は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６４位に位置することである。
【0076】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の二重変異株系Ｔ１－２４は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体が断片欠失を発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に塩基Ｔの挿入が発生した、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列３の第１６１－５６０位に位置し、もう一本の染色体に断片欠失が発生した、該欠失の断片が配列３の第１５９－１６０位に位置することである。
【0077】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重変異株系Ｔ１－２５は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列１の第１１４位に位置し、もう一本の染色体に断片ＣＧＴの挿入が発生した、該断片の挿入位置が配列１の第１１４－１１５位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片欠失が発生し、該欠失の断片が配列３の第１６１－１６２位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することである。
【0078】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の二重変異株系Ｔ１－２８は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体が断片欠失を発生し、該欠失断片が配列１の第１１５－５１２位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ｔの欠失が発生し、該欠失の塩基は配列１の第１１４位に位置し、かつコードＡｔＤＭＰ９タンパク質に一つの塩基Ａの挿入が発生し、該塩基Ａの挿入位置は配列３の第１６０－１６１位の間に位置することである。
【0079】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子二重変異株系Ｔ１－３２は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、一本の染色体に断片の欠失が発生し、該欠失の断片が配列１の第１１５－５１１位に位置し、もう一本の染色体に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列１の第１１４－１１５位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に塩基Ｃの欠失が発生し、該欠失の塩基が配列３の第１６１位に位置することである。
【0080】
５．Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナの遺伝子型同定
ステップ４で得られたＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異型株系Ｔ１－１９、Ｔ１－３３とＴ１－３８を近交し、種子を収穫してから種まき、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナを得た。Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナのＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の遺伝子型を同定し、具体的な方法は以下のとおりである：Ｔ２世代のトランスジェニックシロイヌナズナのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、それぞれＡｔＤＭＰ８（ＤＭＰ８Ｆ１とＤＭＰ８Ｒ１）およびＡｔＤＭＰ９（ＤＭＰ９Ｆ１とＤＭＰ９Ｒ２）の突然変異配列を利用してプライマーを検出してステップ４における方法に従ってＴ２世代のトランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の遺伝子型を同定した。
ステップ４で得られたＴ１世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異型株系Ｔ１－１９、Ｔ１－３３とＴ１－３８を近交し、種子を収穫してから種まき、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナを得た。Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナのＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の遺伝子型を同定し、具体的な方法は以下のとおりである：Ｔ２世代のトランスジェニックシロイヌナズナのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、それぞれＡｔＤＭＰ８（ＤＭＰ８Ｆ１とＤＭＰ８Ｒ１）およびＡｔＤＭＰ９（ＤＭＰ９Ｆ１とＤＭＰ９Ｒ２）の突然変異配列を利用してプライマーを検出してステップ４における方法に従ってＴ２世代のトランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子の遺伝子型を同定した。
【0081】
得られたＴ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異ホモ接合型株系はＴ２－３３－１、Ｔ２－３３－２およびＴ２－３３－３を有し、この３つの株系の突然変異配列は同様であり、具体的な突然変異は以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異ホモ接合株系Ｔ２－３３－１、Ｔ２－３３－２およびＴ２－３３－３は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、断片置換が発生し、該断片置換が配列１の第１１５－５１１位に示した断片を、２０２ｂｐの大きさの断片に置き換えることである。２０２ｂｐの大きさの断片のヌクレオチド配列は具体的に以下のとおりである：ＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧ。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異ホモ接合株系Ｔ２－３３－１、Ｔ２－３３－２およびＴ２－３３－３は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子において、断片置換が発生し、該断片置換が配列１の第１１５－５１１位に示した断片を、２０２ｂｐの大きさの断片に置き換えることである。２０２ｂｐの大きさの断片のヌクレオチド配列は具体的に以下のとおりである：ＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＡＡＣＣＧＴＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＡＣＧＡＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＧＡＣＧ。
【0082】
得られたＴ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株系はＴ２－３３－４、Ｔ２－３３－５およびＴ２－３３－６を有し、この３つの株系の突然変異配列は同様であり、具体的な突然変異は以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株Ｔ２－３３－４、Ｔ２－３３－５およびＴ２－３３－６は、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に断片挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は具体的に以下のとおりであって：ＣＧＴＣＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＣＣＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＣＧＣＣＡＣＧＴＧ（配列１４）、該断片の挿入位置は、配列３の第５６１－５６２の間である。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株Ｔ２－３３－４、Ｔ２－３３－５およびＴ２－３３－６は、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｔの挿入が発生し、該塩基Ｔの挿入位置が配列３の第１６０－１６１位の間に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に断片挿入が発生し、該挿入された断片のヌクレオチド配列は具体的に以下のとおりであって：ＣＧＴＣＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＣＧＴＣＴＴＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＣＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＡＡＡＡＣＧＴＣＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＡＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＣＣＧＴＧＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＡＡＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＡＡＴＧＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＣＧＣＣＡＣＧＴＧ（配列１４）、該断片の挿入位置は、配列３の第５６１－５６２の間である。
【0083】
得られたＴ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株系はＴ２－１９、Ｔ２－３８－１およびＴ２－３８－２を有し、かつ各株系の突然変異タイプは以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株系Ｔ２－１９は、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子では断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列３の第１６１－５６４位に位置することである。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株系Ｔ２－１９は、ＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子に断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列１の第１１５－５１１位に位置し、かつＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子では断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列３の第１６１－５６４位に位置することである。
【0084】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型シロイヌナズナＣｏｌ－０のゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ２世代トランスジェニックシロイヌナズナＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異ホモ接合型株系Ｔ２－３８－１およびＴ２－３８－２は、ＡｔＤＭＰ８タンパク質をコードする遺伝子に断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列１の第１１５－１２７位に位置し、かつ塩基Ｔおよび塩基ＧがＡｔＤＭＰ９タンパク質をコードする遺伝子の２つの位置に挿入され、それぞれ配列３の第１６０－１６１位の間および配列３の５６２－５６３位の間に位置したことである。
【0085】
以上のＴ１およびＴ２世代トランスジェニックシロイヌナズナ突然変異株系を選択して下記一倍体誘導能力の分析実験に用いる。
【0086】
二．ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体が一倍体の誘導産生における使用。
（一）ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体の一倍体近交誘導能力の同定。
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子から得た３種類の突然変異体をそれぞれ近交して近交後代を獲得し、以下の方法により近交後代に対して一倍体の同定を行った（野生シロイヌナズナＣｏｌがホモ接合の近交系であるため、この背景でＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトして得られた突然変異体の近交後代が分子マーカーにより一倍体の同定ができない）：
（一）ＡｔＤＭＰ８および／またはＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体の一倍体近交誘導能力の同定。
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子から得た３種類の突然変異体をそれぞれ近交して近交後代を獲得し、以下の方法により近交後代に対して一倍体の同定を行った（野生シロイヌナズナＣｏｌがホモ接合の近交系であるため、この背景でＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子をノックアウトして得られた突然変異体の近交後代が分子マーカーにより一倍体の同定ができない）：
【0087】
１．植物体表現型同定
近交種子を栽培した後、単株の表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上沖、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である（図１、図２）。
近交種子を栽培した後、単株の表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上沖、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である（図１、図２）。
【0088】
２．フローサイトメトリー検出による葉の同定
上記ステップ１で得られた一倍体性状を表現する植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体シロイヌナズナ葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、かつ二倍体細胞核シグナルのピークを５０（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが２５付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが２５付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体と考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが５０付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じであると考えられ、該測定対象植物体は二倍体（図３）である。
上記ステップ１で得られた一倍体性状を表現する植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体シロイヌナズナ葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、かつ二倍体細胞核シグナルのピークを５０（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが２５付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが２５付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体と考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが５０付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じであると考えられ、該測定対象植物体は二倍体（図３）である。
【0089】
記同定結果を統計しかつ以下の公式に従って誘導率を計算する：誘導率（％）＝（一倍体株数／総株数）×１００。ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子が同時に突然変異した後、近交子孫において一倍体が得られることがわかる。
【0090】
（二）ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体の一倍体ハイブリッド誘導能力の同定
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子から得られた３種類の突然変異体をそれぞれシロイヌナズナｍｓ１材料とハイブリッドしてハイブリッド後代を獲得し、以下の方法によりハイブリッド後代における一倍体を同定した：
ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子から得られた３種類の突然変異体をそれぞれシロイヌナズナｍｓ１材料とハイブリッドしてハイブリッド後代を獲得し、以下の方法によりハイブリッド後代における一倍体を同定した：
【0091】
１．蛍光標識による同定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、プロモーターＡｔＯＬＥＯ１がＴａｇＲＦＰ （Ｅｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）を駆動する発現エレメントを保有している。プロモーターＡｔＯＬＥＯ１は、成熟した種子胚において特異的に発現するため、ＴａｇＲＦＰの蛍光シグナルを蛍光灯で観察することができる。そのため、該発現エレメントを保有する突然変異体を父本として他の蛍光を保有しない雌親材料とハイブリッドし、得られた種子において、二倍体種子の胚は父本のゲノムを有するため強い赤色蛍光を示したが、一倍体種子の胚は雌親由来のため無蛍光または弱蛍光を示した（図４）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、プロモーターＡｔＯＬＥＯ１がＴａｇＲＦＰ （Ｅｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）を駆動する発現エレメントを保有している。プロモーターＡｔＯＬＥＯ１は、成熟した種子胚において特異的に発現するため、ＴａｇＲＦＰの蛍光シグナルを蛍光灯で観察することができる。そのため、該発現エレメントを保有する突然変異体を父本として他の蛍光を保有しない雌親材料とハイブリッドし、得られた種子において、二倍体種子の胚は父本のゲノムを有するため強い赤色蛍光を示したが、一倍体種子の胚は雌親由来のため無蛍光または弱蛍光を示した（図４）。
【0092】
２．分子マーカーによる同定
上記ステップ１で同定された無蛍光および弱蛍光の種子をさらに植え、そのゲノムＤＮＡを抽出し、シロイヌナズナｍｓ１とＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体間多型プライマー０９２Ｂ０２－Ｆ（０９２Ｂ０２－Ｆ：ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＴＴＧＴＣＴＴ）、０９２Ｂ０２－Ｒ（０９２Ｂ０２－Ｒ：ＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＣＣ）とＬＢ－ｏ８４７４（ＬＢ－ｏ８４７４：ＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、そして、増幅産物に対してアガロースのバンド型検出を行い、測定対象単株の増幅産物の大きさが５００ｂｐで、１バンドとして現れた場合、該単株のバンドはシロイヌナズナｍｓ１バンド型でありと考え、父本材料のバンド型が存在しない場合、該単株は雌親一倍体である。測定対象単株の増幅産物の大きさは５００ｂｐおよび１０９４ｂｐで、２バンドとして現れた場合、該単株のバンドはシロイヌナズナｍｓ１およびトランスジェニックシロイヌナズナ突然変異株系ヘテロ接合バンド型であると考えられ、該単株は正常にハイブリッドした後代であり、二倍体である（図５）。
上記ステップ１で同定された無蛍光および弱蛍光の種子をさらに植え、そのゲノムＤＮＡを抽出し、シロイヌナズナｍｓ１とＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９遺伝子がノックアウトされたシロイヌナズナ突然変異体間多型プライマー０９２Ｂ０２－Ｆ（０９２Ｂ０２－Ｆ：ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＧＴＴＧＴＣＴＴ）、０９２Ｂ０２－Ｒ（０９２Ｂ０２－Ｒ：ＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＣＡＣＴＣＣＧＴＡＴＧＴＣＣ）とＬＢ－ｏ８４７４（ＬＢ－ｏ８４７４：ＡＴＡＡＴＡＡＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＴＴＴＴ）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、そして、増幅産物に対してアガロースのバンド型検出を行い、測定対象単株の増幅産物の大きさが５００ｂｐで、１バンドとして現れた場合、該単株のバンドはシロイヌナズナｍｓ１バンド型でありと考え、父本材料のバンド型が存在しない場合、該単株は雌親一倍体である。測定対象単株の増幅産物の大きさは５００ｂｐおよび１０９４ｂｐで、２バンドとして現れた場合、該単株のバンドはシロイヌナズナｍｓ１およびトランスジェニックシロイヌナズナ突然変異株系ヘテロ接合バンド型であると考えられ、該単株は正常にハイブリッドした後代であり、二倍体である（図５）。
【0093】
３．成熟植物体表現型の同定
上記ステップ１および２で同定された植物体に対してさらにその表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上に向く、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である。
上記ステップ１および２で同定された植物体に対してさらにその表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上に向く、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である。
【0094】
４．フローサイトメトリー検出による葉の同定
上記ステップ３で得られた一倍体性状を表現する植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体シロイヌナズナ葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、そして二倍体細胞核シグナルのピークを５０（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが２５付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが２５付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体であると考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが５０付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じである場合、該測定対象植物体は二倍体であると考えられる。
上記ステップ３で得られた一倍体性状を表現する植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体シロイヌナズナ葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、そして二倍体細胞核シグナルのピークを５０（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが２５付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが２５付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体であると考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが５０付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じである場合、該測定対象植物体は二倍体であると考えられる。
【0095】
上記同定結果を統計しかつ以下の公式に従って誘導率を計算した：誘導率（％）＝（雌親一倍体株数／総株数）×１００。ＡｔＤＭＰ８遺伝子突然変異、ＡｔＤＭＰ９遺伝子突然変異、およびＡｔＤＭＰ８とＡｔＤＭＰ９遺伝子の同時突然変異後に他の材料とハイブリッドすると、後代において雌親一倍体が得られることがわかる。
【0096】
実施例２、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子ノックアウトのトマト突然変異体の調製およびその使用
一．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＳ１ＤＭＰ遺伝子のノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてトマトのＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体を得た。具体的なステップは以下のとおりであって：
１．ｓｇＲＮＡ配列の選択
Ｓ１ＤＭＰ遺伝子に長さが２０ｂｐの標的部位配列を設計した。
一．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＳ１ＤＭＰ遺伝子のノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてトマトのＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトし、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体を得た。具体的なステップは以下のとおりであって：
１．ｓｇＲＮＡ配列の選択
Ｓ１ＤＭＰ遺伝子に長さが２０ｂｐの標的部位配列を設計した。
【0097】
標的部位１は配列５の第７６－９５９５位に位置し、ｓｇＲＮＡ標的部位１配列は、ＴＡＴＣＣＴＡＣＴＡＡＴＴＴＡＣＣＡＣＡである。
【0098】
標的部位２は配列５の第２４７－２６６位に位置し、ｓｇＲＮＡ標的部位２配列は、ＴＣＴＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＡである。
【0099】
２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの構築
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは配列８に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列１１に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）、配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）および配列１２に示されるＤＮＡ分子（ＮｐｔＩＩ発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅの方法によってｐＩＣＳＬ４７２３ベクターに連結した後に得られた組み換えベクター（ベクター構造図は図９ｂに示す）である。配列８に示されるＤＮＡ分子は、標的部位１を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列の順次に含み、各ｓｇＲＮＡのコード配列の前には、ｓｇＲＮＡのコード配列の発現を開始するためのＡｔＵ ６－２６プロモーターが含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは配列８に示されるＤＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ発現エレメント）、配列１１に示されるＤＮＡ分子（Ｃａｓ９発現エレメント）、配列１０に示されるＤＮＡ分子（蛍光タンパク質発現エレメント）および配列１２に示されるＤＮＡ分子（ＮｐｔＩＩ発現エレメント）をｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅの方法によってｐＩＣＳＬ４７２３ベクターに連結した後に得られた組み換えベクター（ベクター構造図は図９ｂに示す）である。配列８に示されるＤＮＡ分子は、標的部位１を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列、標的部位２を標的とするｓｇＲＮＡのコード配列の順次に含み、各ｓｇＲＮＡのコード配列の前には、ｓｇＲＮＡのコード配列の発現を開始するためのＡｔＵ ６－２６プロモーターが含まれる。
【0100】
３．トランスジェニック植物体の獲得
ステップ２で得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをヒートショックによる形質転換によってアグロバクテリウムコンピテント細胞ＧＶ３１０１（アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞は北京奥森鼎信生物技術有限公司から購入され、公衆は購入することによって得ることができる）に転換し、組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を得た。
ステップ２で得られたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターをヒートショックによる形質転換によってアグロバクテリウムコンピテント細胞ＧＶ３１０１（アグロバクテリウムＧＶ３１０１コンピテント細胞は北京奥森鼎信生物技術有限公司から購入され、公衆は購入することによって得ることができる）に転換し、組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を得た。
【0101】
さらに組み換え菌ＧＶ３１０１／ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をアグロバクテリウムでトマト子葉外植体を感染する方法（組み換えアグロバクテリウムを２８℃で増殖され、増殖された後の細菌溶液はトマト子葉外植体に用いられた）を用いて野生型トマトＡＣの子葉外植体を感染し、カナ耐性スクリーニングを経た後にＴ０世代トランスジェニックトマト植物体を得た。
【0102】
４．Ｓ１ＤＭＰ遺伝子に突然変異が発生したトランスジェニック植物体の同定
ステップ３で得られたＴ０世代トランスジェニックトマト植物体の葉を採取し、そしてゲノムＤＮＡをテンプレートとして抽出し、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、異なる株系のＰＣＲ増幅産物を得た。
ステップ３で得られたＴ０世代トランスジェニックトマト植物体の葉を採取し、そしてゲノムＤＮＡをテンプレートとして抽出し、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、異なる株系のＰＣＲ増幅産物を得た。
【0103】
Ｓ１ＤＭＰ遺伝子突然変異配列検出プライマーの配列は以下のとおりであって：
Ｓ１ＤＭＰＦ２：ＡＣＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＣＣ；
Ｓ１ＤＭＰＲ１：ＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＡＧ。
Ｓ１ＤＭＰＦ２：ＡＣＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣＣＣ；
Ｓ１ＤＭＰＲ１：ＴＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＡＧ。
【0104】
異なる株系のＰＣＲ増幅産物をＳａｎｇｅｒシーケンシングし、シークエンシング結果と野生型トマトＡＣのＳ１ＤＭＰ遺伝子と比較した。Ｓ１ＤＭＰの遺伝子型を以下の原理に従って同定した。
【0105】
標的部位配列から二重ピーク性特徴を有する配列であれば、該株系の遺伝子型はハイブリッド遺伝子型（２本の相同染色体における１本の染色体上のＳ１ＤＭＰ遺伝子が突然変異しており、かつもう１本の染色体上のＳ１ＤＭＰ遺伝子が突然変異していない）であり、該株系はＴ０世代トランスジェニックトマトヘテロ接合突然変異型株系であり；
標的部位配列から特異的なシングルピーク特徴を有する配列は、野生型トマトＡＣのＳ１ＤＭＰ遺伝子配列と同じ場合、該株の遺伝子型は野生型であり、即ちＳ１ＤＭＰ遺伝子配列に突然変異が発生しない；野生型トマトＡＣのＳ１ＤＭＰ遺伝子配列と異なる場合、該株系の遺伝子型はホモ接合型遺伝子型（２本の相同染色体上のＳ１ＤＭＰ遺伝子は突然変異した）であり、該株系はＴ０世代トランスジェニックトマトホモ接合突然変異型株系である。
標的部位配列から特異的なシングルピーク特徴を有する配列は、野生型トマトＡＣのＳ１ＤＭＰ遺伝子配列と同じ場合、該株の遺伝子型は野生型であり、即ちＳ１ＤＭＰ遺伝子配列に突然変異が発生しない；野生型トマトＡＣのＳ１ＤＭＰ遺伝子配列と異なる場合、該株系の遺伝子型はホモ接合型遺伝子型（２本の相同染色体上のＳ１ＤＭＰ遺伝子は突然変異した）であり、該株系はＴ０世代トランスジェニックトマトホモ接合突然変異型株系である。
【0106】
５．Ｔ１世代トランスジェニックトマトの遺伝子型同定
ステップ４で得られたＴ０世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異株Ｔ０－１２とＴ０－３４を近交させ、種子を収穫してから種まき、Ｔ１世代トランスジェニックトマトを得た。Ｔ１世代トランスジェニックトマトのＳ１ＤＭＰ遺伝子の遺伝子型を同定し、具体的な方法は以下のとおりである：Ｔ１世代のトランスジェニックトマトのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｓ１ＤＭＰ（Ｓ１ＤＭＰＦ２およびＳ１ＤＭＰＲ１）突然変異配列検出プライマーを使用して、ステップ４の方法に従ってＴ１世代のトランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子の遺伝子型を同定した。
ステップ４で得られたＴ０世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異株Ｔ０－１２とＴ０－３４を近交させ、種子を収穫してから種まき、Ｔ１世代トランスジェニックトマトを得た。Ｔ１世代トランスジェニックトマトのＳ１ＤＭＰ遺伝子の遺伝子型を同定し、具体的な方法は以下のとおりである：Ｔ１世代のトランスジェニックトマトのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｓ１ＤＭＰ（Ｓ１ＤＭＰＦ２およびＳ１ＤＭＰＲ１）突然変異配列検出プライマーを使用して、ステップ４の方法に従ってＴ１世代のトランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子の遺伝子型を同定した。
【0107】
最終的に得られたＴ１世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異ホモ接合型株はｓｌｄｍｐ－１およびｓｌｄｍｐ－２を有し、各株の突然変異タイプは以下のとおりであって：
シークエンシング同定により以下を示した：野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異ホモ接合型株系ｓｌｄｍｐ－１は、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｃの挿入が発生し、該挿入した塩基は配列５の第９２－９３の間位置する。
シークエンシング同定により以下を示した：野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡと比較し、Ｔ１世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異ホモ接合型株系ｓｌｄｍｐ－１は、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子に一つの塩基Ｃの挿入が発生し、該挿入した塩基は配列５の第９２－９３の間位置する。
【0108】
シークエンシング同定により以下を示した：野生型トマトＡＣのゲノムＤＮＡと比較して、Ｔ１世代トランスジェニックトマトＳ１ＤＭＰ遺伝子突然変異ホモ接合型株系ｓｌｄｍｐ－２は、Ｓ１ＤＭＰタンパク質をコードする遺伝子に断片の欠失が発生し、該断片の欠失が配列５の第９３－２４９位に位置する。
【0109】
二．Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体が一倍体の誘導産生における使用
（一）Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体の植物体表現および結実率の分析
野生型トマトＡＣおよびＡＣ背景でＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトしたトマト突然変異体植物体の表現に比較し、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされた後に植物体の成長に影響を与えないことがわかる（図６）。各トマトの近交果実当たりの種子数を統計すると、野生型の各近交果実では１個当たり平均で約７９．５個の種子が産生したが、一方、ｓｌｄｍｐ突然変異体では１７個しか産生せず、野生型より大幅に低い（表６）。Ｓ１ＤＭＰ遺伝子突然変異後に結実率の低下を引き起こすことを示し、ｓｌｄｍｐ突然変異体が一倍体誘導の能力を有することを示唆した。
（一）Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体の植物体表現および結実率の分析
野生型トマトＡＣおよびＡＣ背景でＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトしたトマト突然変異体植物体の表現に比較し、Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされた後に植物体の成長に影響を与えないことがわかる（図６）。各トマトの近交果実当たりの種子数を統計すると、野生型の各近交果実では１個当たり平均で約７９．５個の種子が産生したが、一方、ｓｌｄｍｐ突然変異体では１７個しか産生せず、野生型より大幅に低い（表６）。Ｓ１ＤＭＰ遺伝子突然変異後に結実率の低下を引き起こすことを示し、ｓｌｄｍｐ突然変異体が一倍体誘導の能力を有することを示唆した。
【0110】
（二）Ｓ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体の一倍体ハイブリッド誘導能力の同定
ｓｌｄｍｐ突然変異体をトマトＡＣおよびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍとハイブリッドし、得られたＦ１世代材料をハイブリッドしてハイブリッド後代を獲得し、以下の方法によりハイブリッド後代における一倍体を同定した：
ｓｌｄｍｐ突然変異体をトマトＡＣおよびＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍとハイブリッドし、得られたＦ１世代材料をハイブリッドしてハイブリッド後代を獲得し、以下の方法によりハイブリッド後代における一倍体を同定した：
【0111】
１．蛍光標識による同定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、プロモーターＡｔＯＬＥＯ１がＴａｇＲＦＰ（Ｅｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）を駆動する発現エレメントを保有している。プロモーターＡｔＯＬＥＯ１は、成熟した種子胚において特異的に発現したため、ＴａｇＲＦＰの蛍光シグナルを蛍光灯で観察することができる。そのため、該発現エレメントを保有した突然変異体を父本として他の蛍光を保有しない雌親材料とハイブリッドし、得られた種子において、二倍体種子の胚は父本のゲノムを有するため赤色蛍光を示したが、一倍体種子の胚は雌親由来のため無蛍光または弱蛍光を示した（図７）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、プロモーターＡｔＯＬＥＯ１がＴａｇＲＦＰ（Ｅｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）を駆動する発現エレメントを保有している。プロモーターＡｔＯＬＥＯ１は、成熟した種子胚において特異的に発現したため、ＴａｇＲＦＰの蛍光シグナルを蛍光灯で観察することができる。そのため、該発現エレメントを保有した突然変異体を父本として他の蛍光を保有しない雌親材料とハイブリッドし、得られた種子において、二倍体種子の胚は父本のゲノムを有するため赤色蛍光を示したが、一倍体種子の胚は雌親由来のため無蛍光または弱蛍光を示した（図７）。
【0112】
２．分子マーカーによる同定
上記ステップ１で同定された無蛍光の種子をさらに植え、そのゲノムＤＮＡを抽出し、トマトＡＣとＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍをハイブリッドして得られたＦ１世代およびＳ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体間多型プライマーＳ１ＤＭＰＦ２＋Ｓ１ＤＭＰＲ１を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、そして増幅産物に対してアガロースのバンド型検出またはシークエンシングを行い、測定対象の単株の増幅産物が１バンドまたはシークエンシング結果が単一ピーク図である場合、該単株のバンドは雌親バンド型であり、父本材料のバンド型が存在しない場合、該単株は雌親一倍体であると考えられる。測定対象単株の増幅産物が２バンドを示す場合、またはシークエンシングした結果がヘテロ接合体ピーク図である場合、該単株のバンドはトマトＡＣとＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍがハイブリッドして得られたＦ１世代およびＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトしたトマト突然変異体のハイブリッドバンド型であると考えられ、該単株は正常なハイブリッドの後代であり、二倍体である。
上記ステップ１で同定された無蛍光の種子をさらに植え、そのゲノムＤＮＡを抽出し、トマトＡＣとＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍをハイブリッドして得られたＦ１世代およびＳ１ＤＭＰ遺伝子がノックアウトされたトマト突然変異体間多型プライマーＳ１ＤＭＰＦ２＋Ｓ１ＤＭＰＲ１を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、そして増幅産物に対してアガロースのバンド型検出またはシークエンシングを行い、測定対象の単株の増幅産物が１バンドまたはシークエンシング結果が単一ピーク図である場合、該単株のバンドは雌親バンド型であり、父本材料のバンド型が存在しない場合、該単株は雌親一倍体であると考えられる。測定対象単株の増幅産物が２バンドを示す場合、またはシークエンシングした結果がヘテロ接合体ピーク図である場合、該単株のバンドはトマトＡＣとＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍがハイブリッドして得られたＦ１世代およびＳ１ＤＭＰ遺伝子をノックアウトしたトマト突然変異体のハイブリッドバンド型であると考えられ、該単株は正常なハイブリッドの後代であり、二倍体である。
【0113】
３．成熟植物体表現型の同定
上記ステップ１および２で同定された植物体に対してさらにその表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上に向く、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である。
上記ステップ１および２で同定された植物体に対してさらにその表現型を観察し、一倍体は植物体が低く、葉の幅が狭くて、しかも上に向く、株型がコンパクトで、雄性が不妊である等の特徴を有し、二倍体の表現型は植物体が高く、葉の幅が広く、散開し、育性が正常である。
【0114】
４．フローサイトメトリー検出葉の同定
上記ステップ３で得られた一倍体性状を表現している植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体トマト葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、かつ二倍体細胞核シグナルのピークを１００（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが５０付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが５０付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体と考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが１００付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じであると考えられ、該測定対象植物体は二倍体（図８）である。
上記ステップ３で得られた一倍体性状を表現している植物体に対してフローサイトメトリー検出を行い、具体的な方法は以下のとおりである：測定対象植物体の若い葉の細胞核を抽出し、二倍体トマト葉を対照とした；さらにフローサイトメーターを用いてシグナルを検出し、まず二倍体細胞核シグナルを検出し、かつ二倍体細胞核シグナルのピークを１００（二倍体細胞内の遺伝物質は一倍体細胞内の遺伝物質の二倍であるため、一倍体細胞核シグナルのピークが５０付近に現れる）に設定した。測定対象植物体の細胞核シグナルピークが５０付近に現れる場合、該測定対象植物体は一倍体植物体と考えられる。測定対象植物体のシグナルピークが１００付近に現れる場合、それが二倍体細胞核シグナル強度の濃縮位置と同じであると考えられ、該測定対象植物体は二倍体（図８）である。
【0115】
上記同定結果を統計しかつ以下の公式に従って誘導率を計算する：誘導率（％）＝（雌親一倍体株数／総株数）×１００。Ｓ１ＤＭＰ遺伝子の突然変異後に他の材料とハイブリッドし、ハイブリッドハイブリッド子孫において母系一倍体が得られた。
【産業上の利用可能性】
【0116】
本発明はシロイヌナズナから単為生殖一倍体誘導遺伝子ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９をクローニングする。実験は、ＡｔＤＭＰ８およびＡｔＤＭＰ９の突然変異が単為生殖一倍体誘導能力を生むことができることを示し、それは単為生殖方法による一倍体の誘導産生の適用を双子葉作物に拡張できるようになった。本発明はさらにトマトにおいて検証を行い、トマトにおいて同様にＳ１ＤＭＰの突然変異が単為生殖一倍体誘導能力を産生できること発見する。本発明は双子葉植物への一倍体育種技術の使用を広げることおよび単為生殖一倍体の生物学的メカニズムをあきらかにすることにとって重要な基礎を築く。現在育種業界における一倍体育種技術の幅広い適用を考慮して、本発明は非常に広い範囲の適用空間および市場の見通しを有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【国際調査報告】