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特表2022-538544甘草抽出物又はこれから分離された化合物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-05
(54)【発明の名称】甘草抽出物又はこれから分離された化合物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/484 20060101AFI20220829BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20220829BHJP
A61P 21/06 20060101ALI20220829BHJP
A61K 31/12 20060101ALI20220829BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20220829BHJP
C12N 5/077 20100101ALN20220829BHJP
【ＦＩ】
A61K36/484 ZNA
A61K31/353
A61P21/06
A61K31/12
A23L33/105
C12N5/077
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021575429
(86)(22)【出願日】2020-06-17
(85)【翻訳文提出日】2021-12-17
(86)【国際出願番号】 KR2020007826
(87)【国際公開番号】W WO2020256397
(87)【国際公開日】2020-12-24
(31)【優先権主張番号】10-2019-0072992
(32)【優先日】2019-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0073088
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0073089
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0073090
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0073091
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0073092
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517429259
【氏名又は名称】ネオ クレマー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】チェ，インホ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ウン ジュ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ソ－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ヨン－ホ
(72)【発明者】
【氏名】マ，ジン ヨル
(72)【発明者】
【氏名】チョ，ウォン－キョン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ヘ ジン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B065
4C086
4C088
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B018MD48
4B018ME14
4B018MF01
4B065AA93X
4B065AC12
4B065BB26
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA16
4C086MA52
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA94
4C088AB59
4C088AC11
4C088BA09
4C088CA05
4C088CA06
4C088MA02
4C088MA52
4C088MA66
4C088NA14
4C088ZA94
4C206AA01
4C206AA02
4C206CB19
4C206KA01
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA36
4C206MA72
4C206MA86
4C206NA14
4C206ZA94
(57)【要約】
本発明は、筋肉疾患予防又は治療用組成物に関し、より詳細には、甘草抽出物若しくはその分画物、又はこれから分離された化合物若しくはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物及び健康機能食品組成物を提供する。本発明に係る甘草抽出物又はその分画物、前記化合物又はその塩は、筋芽細胞を増殖させて筋管を形成させ、筋肉細胞への分化を促進させることができる。また、前記甘草抽出物又はその分画物、前記化合物又はその塩は、損傷した筋肉を再生させることに優れた効果を有するので、前記組成物を用いて様々な筋肉疾患を効果的に予防、改善又は治療可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項2】
前記甘草抽出物は、前記甘草を蒸留水に入れ、１１０～１２０℃で２～４時間加熱して抽出した熱水抽出物であることを特徴とする、請求項１に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項3】
前記分画物は、前記甘草抽出物を、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）及びｎ－ブタノール（ｎ－ｂｕｔｈａｎｏｌ）からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で分画したものであることを特徴とする、請求項２に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項4】
前記甘草抽出物又はその分画物は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋肉細胞への分化を促進させることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項5】
前記甘草抽出物又はその分画物は、損傷した筋肉を再生させることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項6】
前記甘草抽出物又はその分画物は、筋肉タンパク質分解又は筋肉委縮を抑制させることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記甘草抽出物又はその分画物は、筋肉分化関連因子であるＭＹＯＧ、ＭＹＯＤ、ＭＹＬ２及びＰａｘ７からなる群から選ばれる一つ以上の発現を増加させ、筋肉タンパク質分解関連因子であるＭＳＴＮ、ＭｕＲＦ１、Ａｔｒｏｇｉｎ １及びニトロチロシン（Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）からなる群から選ばれる一つ以上の発現を減少させることを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項8】
前記筋肉疾患は、筋委縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋肉病症（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）及び筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ）からなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項9】
甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する、筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物。
【請求項10】
下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。＜化学式１＞
【化1】
＜化学式２＞
【化2】
＜化学式３＞
【化3】
【請求項11】
前記化合物又はその塩は、甘草メタノール抽出物をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又は酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で分画した分画物から分離されたことを特徴とする、請求項１０に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項12】
前記化合物又はその塩は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋肉細胞への分化を促進させることを特徴とする、請求項１０に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項13】
前記化合物又はその塩は、損傷した筋肉を再生させることを特徴とする、請求項１０に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項14】
前記化合物又はその塩は、筋肉タンパク質分解又は筋肉委縮を抑制させることを特徴とする、請求項１０に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項15】
前記筋肉疾患は、筋委縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋肉病症（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）及び筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ）からなる群から選ばれる一つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物。
【請求項16】
下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する、筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物。＜化学式１＞
【化4】
＜化学式２＞
【化5】
＜化学式３＞
【化6】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、甘草抽出物又はこれから分離された化合物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
筋肉（ｍｕｓｃｌｅ）は、人体を構成する重要な要素であり、中胚葉の幹細胞で発現する組織である。筋肉は、人体の４０％程度を占めており、骨と靭帯に支えられて位置し、筋線維束からなって互いに動き、細胞の大きさを変化せて収縮を誘発する。筋肉は、骨格筋肉、心臓筋肉、内臓筋肉に区分されるが、それぞれの位置で力を生成し、動きを誘発し、骨、関節、内臓などの身体器官を保護する役割も担う。また、筋肉は、再生能力を有しており、筋肉が損傷を受けると、衛星細胞とその周辺環境によって変性された後、再び元来の収縮弛緩能力を有する筋肉に再生され得る。
【0003】
筋肉疾患は先天的な遺伝又は環境的な原因によって発生し、近年、高齢化社会及び寿命延長の傾向に伴い、筋減少に関連した疾患も増加している。人の筋肉は４０歳から毎年１％以上ずつ減少していき、８０歳になると最大筋肉量の５０％程度が減少し、老年の筋肉減少は、身体全般の機能を低下させる最も重要な原因として認識されている。このような筋肉疾患は、過去に比べて全世界的に増加の一途にある。
【0004】
しかしながら、筋肉疾患は、その原因が他の疾患に比べて様々であるため、正確な診断がし難く、その種類によって症状及び疾患の強度も様々であり、しかも、正確なメカニズムが明らかにされていない希少疾患の形態も多い。筋肉疾患はその症状が急激に進行し、筋肉疾患の患者は上記の疾患が進行するにつれてひとりでは日常生活が難しい程度に苦しんでいるが、根本的な関連疾患に対する治療剤は殆どないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、筋肉疾患治療に優れた効果を有する天然物の抽出物又はこれから分離された化合物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記の目的を達成するために、本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0007】
本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0008】
本発明は、下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0009】
＜化学式１＞
【0010】
【化1】
【0011】
＜化学式２＞
【0012】
【化2】
【0013】
＜化学式３＞
【0014】
【化3】
【0015】
また、本発明は、前記化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【0016】
本発明に係る甘草抽出物又はその分画物、これから分離された化合物又はその薬学的に許容可能な塩は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促進させる。また、損傷した筋肉を再生させることに優れた効果を有するので、本発明に係る前記甘草抽出物又はその分画物、これから分離された化合物又はその塩を有効成分として含有する薬学組成物又は健康機能食品組成物により、様々な筋肉疾患を効果的に予防、改善又は治療することができる。
【0017】
また、前記組成物は、天然物を利用するので、副作用が少なく、安全であるという長所を有する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明の一実施例に係る甘草抽出物又はその分画物製造方法を概略的に図式化したものである。
【図2】甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）の増殖及び分化の観察結果であって、ａは、甘草熱水抽出物の濃度による細胞増殖をＭＴＴ法で確認したイメージ及びグラフであり、ｂは、前記細胞表面にスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）を加えた後、甘草熱水抽出物の処理による変化を示すイメージであり、ｃは、筋芽細胞の筋肉細胞への分化の有無を確認できる融解指数（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）、ウェスタンブロット及び免疫染色法の結果である。
【図3】甘草熱水抽出物の摂取によるマウスの筋肉を分析した結果であって、ａは、マウスの体重及び筋肉減少率を示す表であり、ｂは、ウェスタンブロット結果であり、ｃは、ウェスタンブロットから出たバンドの強度を特定して数値化したグラフであり、ｄは、免疫染色法を用いたタンパク質発現変化を示すイメージである。
【図4】甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞増殖の有無の結果であって、ａは、筋芽細胞のＭＴＴ分析イメージ及びグラフであり、ｂは、前記細胞表面にスクラッチを加えた後、前記分画物処理による変化を示すイメージである。
【図5】甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の分化の観察結果であって、ａは、筋管形成イメージ及び融解指数を示すグラフであり、ｂ及びｃは、前記分画物処理による筋肉分化／筋肉委縮遺伝子及びタンパク質の発現変化を示すものである。
【図6】本発明の一実施例に係る酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）分画物から分離された最終単一物質の化学構造を示す。
【図7】最終単一物質の処理による筋芽細胞増殖及び分化の観察結果であって、ａは、本発明の一実施例によって分離された最終物質１０種の処理による細胞増殖変化を示すグラフであり、ｂは、筋管形成イメージ及び融解指数を示すグラフであり、ｃは、購買した最終物質３種の処理による細胞増殖変化を示すグラフであり、ｄは、筋管形成イメージ及び融解指数を示すグラフである。
【図8】購買した最終物質の中でリキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）をマウスに摂取させた後に筋肉の変化を分析した結果であって、ａは、体重、筋肉重さ及び筋肉減少率を示すグラフであり、ｂは、Ｈ＆Ｅ染色結果を示し、ｃは、筋肉の直径（μｍ）を測定して示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0020】
本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0021】
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｓｃｈｅｒ）は、双子葉植物のバラ目マメ科に属する薬用植物で、自然から採取又は栽培して得たものであってもよく、商業的に販売されているものを購入したものであってもよい。
【0022】
甘草は、根又は根茎をそのまま使用するか、又は周皮を除去して使用でき、好ましくは、甘草の乾燥根を使用することができる。
【0023】
本明細書において、“抽出物”とは、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分又は抽出物の形態を問わず、天然物の成分を抜き出すことにより得られた物質を意味し、天然物の成分を抜き出して得られた物質を抽出後に、個別の方法で加工又は処理して得ることができる物質のいずれをも含むことができる。
【0024】
前記甘草抽出物は、当該技術分野における通常の方法によって抽出されてよく、例えば、熱水抽出、超音波抽出法、濾過法、還流抽出法などがあり、それらは単独で行われてもよく、２種以上が併用して行われてもよい。
【0025】
本発明において、前記甘草抽出物は、水、Ｃ１～Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出されたものでよく、好ましくは、前記甘草を、甘草重量対比で１５～２５倍、より好ましくは２０倍の蒸留水に入れ、１１０～１２０℃、より好ましくは１１５℃で、２～４時間、より好ましくは３時間加熱して抽出した熱水抽出物でよいが、これに制限されるものではない。
【0026】
本発明において、前記甘草抽出物の分画物は、前記甘草抽出物、好ましくは前記甘草の熱水抽出物を、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）、酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）及びｎ－ブタノール（ｎ－ｂｕｔｈａｎｏｌ）からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で分画したものでよく、より好ましくは酢酸エチルで分画した、甘草熱水抽出物の酢酸エチル分画物でよい。
【0027】
本発明の一実施例によれば、前記甘草の熱水抽出物を蒸留水に懸濁させた後、ジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ－ブタノールに順に分配させ、それぞれの溶液を蒸発させてジクロロメタン分画物、酢酸エチル分画物、ｎ－ブタノール分画物を得た。
【0028】
本発明において、前記甘草抽出物又はその分画物は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促進させることができる。また、前記甘草抽出物又はその分画物は、筋肉タンパク質分解及び筋肉委縮を抑制し、損傷した筋肉を再生させることができる。
【0029】
前記甘草抽出物又はその分画物は、筋肉分化又は筋肉再生関連因子であるＭＹＯＧ、ＭＹＯＤ、ＭＹＬ２及びＰａｘ７からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又はタンパク質の発現を増加させることができ、筋肉タンパク質分解又は筋肉委縮関連因子であるＭＳＴＮ、ＭｕＲＦ１、Ａｔｒｏｇｉｎ １及びニトロチロシン（Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子又はタンパク質の発現を減少させることができる。
【0030】
ＭＹＯＤは、筋肉特異遺伝子の発現を開始させ、筋肉衛星細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｃｅｌｌｓ）が筋芽細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔ）に分化することを誘導する。ＭＹＯＤの活性によるミオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ，ＭＹＯＧ）発現の誘導は、筋芽細胞の結合（ｆｕｓｉｏｎ）に最も重要な要素であって、筋管細胞（ｍｙｏｔｕｂｅ）の形成に関与し、このような過程により形成された筋線維は束を成して最終的に筋肉を形成する。
【0031】
本発明は、下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0032】
＜化学式１＞
【0033】
【化4】
【0034】
＜化学式２＞
【0035】
【化5】
【0036】
＜化学式３＞
【0037】
【化6】
【0038】
前記化学式１～３の化合物は、甘草から分離された活性成分であり、好ましくは、前記化学式１はリキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）、前記化学式２はテトラヒドロキシメトキシカルコン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ ｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ）、前記化学式３は、リコカルコンＢ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｂ）であってよい。
【0039】
前記化合物又はその塩は、当業界における周知の方法で天然物から直接分離又は抽出される、化学的合成法によって製造される、又は市販中のものを選択して使用できるが、その方法又は物質は特に限定されない。
【0040】
本発明において、前記化合物又はその塩は、水、Ｃ１～Ｃ４のアルコール又はそれらの混合溶媒で抽出された甘草抽出物、好ましくは甘草メタノール抽出物を、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又は酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で分画した分画物から分離されたものでよく、好ましくは、前記甘草メタノール抽出物をジクロロメタン及び酢酸エチルに順に分配させて得た分画物から分離されたものでよいが、これに制限されるものではない。
【0041】
より好ましくは、前記化合物又はその塩は、前記甘草の乾燥根を１００％メタノールで還流抽出した甘草メタノール抽出物を蒸留水に懸濁させてジクロロメタンに分配させ、その水分画からジクロロメタンを除去した後、酢酸エチルに分配させて得た酢酸エチル分画物から分離されたものでよい。
【0042】
より詳細には、前記化学式１の化合物又はその塩は、酢酸エチル画分物のヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，５．５：１：０．１、３：１：０．１、ｖ／ｖ）、クロロホルム－アセトン－メタノール（ＣＨＣｌ３－Ａｃｅｔｏｎｅ－ＭｅＯＨ，３：１：０．１、ｖ／ｖ）、クロロホルム－メタノール－水（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，５：１：０．１、３：１：０．１、ｖ／ｖ）と共にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、５個の画分（Ｆｒ．Ｅ１～Ｅ５）を得、このうち、画分物Ｅ２をＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジを用いて、ＭＰＬＣによりメタノール－水（ＭｅＯＨ－Ｗａｔｅｒ，３４～７５％のＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）の勾配で分離し、１６個の画分物（Ｆｒ．Ｅ２Ａ～Ｅ２Ｐ）を得た後、このうち、画分物Ｅ２Ｃを、ヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，３：１：０．１、ｖ／ｖ）溶剤があるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分離したものでよいが、これに限定されるものではない。
【0043】
前記化学式２の化合物又はその塩は、前記酢酸エチル分画物から分離された５個の分画物（Ｆｒ．Ｅ１～Ｅ５）のうち分画物Ｅ３を、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジを用いて、ＭＰＬＣによりメタノール－水（ＭｅＯＨ－Ｗａｔｅｒ，３３～８０％ ＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）の勾配で１５個の分画物（Ｆｒ．Ｅ３Ａ～Ｅ３Ｏ）に分離した後、このうち、分画物Ｅ３Ｅを、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，２８～３６％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ、１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で分離したものでよいが、これに制限されるものではない。
【0044】
また、前記化学式３の化合物又はその塩は、前記１５個に分離された分画物（Ｆｒ．Ｅ３Ａ～Ｅ３Ｏ）のうち分画物Ｅ３Ｆを、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，２０－３４％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ、１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で５個の分画物（Ｆｒ．Ｅ３ＦＡ～Ｅ３ＦＥ）に分離し、このうち、分画物Ｅ３ＦＢを、ＴＬＣ（シリカゲル６０ Ｆ２５４、ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ、１：１：０．２、ｖ／ｖ）で分離して得たものでよいが、これに制限されるものではない。
【0045】
前記化合物は、それと同じ効能を有する範囲内で薬学的又は食品学的に許容可能な塩の形態で使用できる。
【0046】
本明細書において、“薬学的又は食品学的に許容可能な”とは、前記組成物に露出される細胞又はヒトに毒性がないことを意味する。
【0047】
前記塩は、薬学的又は食品学的に許容可能な塩基性塩又は酸性塩のいずれか一つの形態で使用することができる。塩基性塩は、有機塩基塩、無機塩基塩のいずれか一つの形態で使用することができ、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、セシウム塩、アミニウム塩、アンモニウム塩、トリエチルアミニウム塩及びピリジニウム塩からなる群から選ばれてよい。
【0048】
酸性塩は、遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。遊離酸としては無機酸及び有機酸を使用でき、無機酸としては、塩酸、臭素酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、二重リン酸、硝酸などを使用でき、有機酸としては、クエン酸、酢酸、マレイン酸、リンゴ酸、フマル酸、グルコール酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、カンファースルホン酸、シュウ酸、マロン酸、グルタル酸、酢酸、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、４－トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸、クエン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸などを使用できるが、これに制限されず、当業界で通常使用される様々な無機酸及び有機酸で形成されるいかなる塩も含まれてよい。
【0049】
また、前記化合物は、薬学的又は食品学的に許容される塩の他、通常の方法によって製造可能なあらゆる塩、水和物、溶媒和物、誘導体などをいずれも含むことができる。付加塩は、通常の方法で製造でき、水混和性有機溶媒、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、又はアセトニトリルなどに溶かして過量の有機塩基を加えたり或いは無機塩基の塩基水溶液を加えた後、沈殿又は結晶化させて製造できる。または、この混合物から溶媒や過量の塩基を蒸発後に乾燥させて付加塩を得るか、又は析出された塩を吸引濾過して製造できる。
【0050】
本発明において、前記化合物又はその塩は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促進させることができる。また、前記化合物又はその塩は、筋肉タンパク質分解と筋肉委縮を抑制し、損傷した筋肉を再生させることができる。
【0051】
本発明において、前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化などによる筋肉疾患であり、例えば、筋委縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋肉減少症（ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）、筋肉病症（ｍｙｏｐａｔｈｙ）、筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ）及び筋肉損傷（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｕｒｙ）からなる群から選ばれる一つ以上でよいが、これに制限されるものではない。
【0052】
本明細書において、“予防”とは、本発明に係る薬学組成物又は健康機能食品組成物の投与によって、筋肉疾患、又はその少なくとも一つの症状の発生を抑制させたり或いは発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。また、再発を予防又は防止するために、前記疾病が快方に向かっている対象の治療を含む。
【0053】
本明細書において、“治療”とは、本発明に係る薬学組成物の投与により、筋肉疾患、又はその少なくとも一つの症状を緩和、減少、又は消滅させるなど、その症状を好転させたり或いは有益に変更させるあらゆる行為を意味する。
【0054】
本明細書において、“薬学組成物”とは、特定の目的のために投与される組成物であり、本発明の目的上、筋肉疾患、又はその少なくとも一つの症状を予防したり又は治療するために投与されるものを意味する。
【0055】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的分野における通常の方法によって製造可能である。前記薬学組成物は、剤形によって薬学的に許容可能な適切な担体と配合されてよく、必要によって、賦形剤、希釈剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、結合剤、崩壊剤、溶剤などをさらに含んで製造されてもよい。前記適切な担体などは、本発明に係る甘草抽出物又はその分画物、これから分離された化合物又はその塩の活性及び特性を阻害しないものであり、投与形態及び剤形によって個別に選択されてよい。
【0056】
本発明に係る薬学組成物は、いかなる剤形で適用されてもよく、より詳細には、通常の方法によって経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の非経口型剤形にして使用可能である。
【0057】
前記経口型剤形のうち固形剤形は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ゲル剤、カプセル剤などの形態であり、少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、ゼラチンなどを混ぜて調製でき、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤なども含まれてよい。また、カプセル剤形では、前記言及した物質の他にも脂肪油のような液体担体をさらに含むことができる。
【0058】
前記経口型剤形のうち液状剤形は、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他にも、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてよい。
【0059】
前記非経口剤形は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれてよい。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてよい。これに制限されず、当該技術分野に知られた適宜の製剤をいずれも使用可能である。
【0060】
また、本発明に係る薬学組成物は、治療効能の増進のために、カルシウム又はビタミンなどをさらに添加してもよい。
【0061】
本発明に係る薬学組成物において、前記薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与可能である。
【0062】
本明細書において、“薬学的に有効な量”とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合であって、疾患を治療するのに十分である一方、副作用を起こさない程度の量を意味する。
【0063】
前記薬学組成物の有効容量レベルは、使用目的、患者の年齢、性別、体重及び健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、配合又は同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって個別に決定されてよい。例えば、一定ではないが、一般に、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１～１０ｍｇ／ｋｇを１日１回～数回投与できる。前記投与量はいかなる面にも本発明の範囲を限定するものではない。
【0064】
本発明に係る薬学組成物は、筋肉疾患が発生し得る任意の動物に投与でき、前記動物は、例えば、人を含む霊長類の他、牛、豚、馬、犬などの家畜などを含むことができる。
【0065】
本発明に係る薬学組成物は、製剤形態による適当な投与経路で投与でき、目的組織に到達できる限り、経口又は非経口の様々な経路で投与可能である。投与方法は、特に限定されず、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮膚塗布、呼吸器内吸入、子宮内硬膜又は脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅ－ｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射などの通常の方法で投与可能である。
【0066】
本発明に係る薬学組成物は、筋肉疾患の予防又は治療のために単独で使用されてもよく、手術又は他の薬物治療などと併せて使用されてもよい。
【0067】
本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0068】
好ましくは、前記甘草抽出物は甘草熱水抽出物でよく、前記甘草抽出物の分画物は甘草熱水抽出物の酢酸エチル分画物でよい。
【0069】
前記甘草抽出物又はその分画物は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促進させることができる。また、前記甘草抽出物又はその分画物は、筋肉タンパク質分解と筋肉委縮を抑制し、損傷した筋肉を再生させることができ、筋肉疾患の予防又は改善のための健康機能食品組成物として活用できる。
【0070】
これに相応する特徴は、上述した通りである。
【0071】
本発明は、下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する筋肉疾患予防又は改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0072】
＜化学式１＞
【0073】
【化7】
【0074】
＜化学式２＞
【0075】
【化8】
【0076】
＜化学式３＞
【0077】
【化9】
【0078】
好ましくは、前記化合物又はその塩は、甘草メタノール抽出物をジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）又は酢酸エチル（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で分画した分画物から分離されたものでよく、リキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）、テトラヒドロキシメトキシカルコン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ ｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ）、又はリコカルコンＢ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｂ）を含むことができる。
【0079】
前記化合物又はその塩は、筋芽細胞を増殖させ、筋管を形成させ、筋芽細胞の筋肉細胞への分化を促進させることができる。また、前記化合物又はその塩は、筋肉タンパク質分解と筋肉委縮を抑制し、損傷した筋肉を再生させることができ、筋肉疾患の予防又は改善のための健康機能食品組成物として活用できる。
【0080】
これに相応する特徴は、上述した通りである。
【0081】
本明細書において、“改善”とは、本発明に係る健康機能食品組成物の摂取により、筋肉疾患、又はその少なくとも一つの症状を緩和、減少、又は消滅させるなど、その症状を好転させたり或いは有益に変更させたりするあらゆる行為を意味する。
【0082】
本明細書において、“健康機能食品”とは、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して製造及び加工した食品を含み、栄養供給の他にも、本発明の目的上、筋肉疾患の予防、生体防御、免疫、回復などの生体調節機能を効率的に示すように加工された医学、医療効果の高い食品を意味する。
【0083】
本発明に係る健康機能食品は、筋肉疾患の予防又は改善を目的に、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ又は飲料などとして製造できる。前記健康機能食品が取り得る形態に制限はなく、前記薬学組成物と同じ方式で製剤化して機能性食品として用いられてもよく、或いは各種食品に添加されてもよい。
【0084】
前記健康機能食品は、通常の意味のいかなる食品も含むことができる。例えば、飲料及び各種ドリンク、果実及びその加工食品（果物缶詰め、ジャムなど）、魚類、肉類及びその加工食品（ハム、ベーコンなど）、パン類及び麺類、クッキー及びスナック類、乳製品（バター、チーズなど）などが可能であり、通常の意味でのいかなる機能性食品も含むことができる。また、動物のための飼料として用いられる食品も含むことができる。
【0085】
本発明に係る健康機能食品組成物は、当業界で一般に使用される食品学的に許容可能な食品添加剤（食品添加物）及び適切なその他補助成分をさらに含めて製造できる。食品添加物としての適合性は、別の規定がない限り、食品医薬品安全処に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などに基づき、当該品目に関する規格及び基準により判定できる。前記‘食品添加物公典’に収載された品目には、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カルシウム、ニコチン酸、桂皮酸などの化学的合成物；柿色素、結晶セルロース、コウリャン色素、グアーガムなどの天然添加物；Ｌ－グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類などを挙げることができる。
【0086】
前記その他補助成分は、例えば、香味剤、天然炭水化物、甘味剤、ビタミン、電解質、着色剤、ペクチン酸、アルギン酸、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤などをさらに含有できる。特に、前記天然炭水化物には、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールを使用することができ、甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤、又はサッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。
【0087】
本発明に係る健康機能食品に含まれている前記甘草抽出物又はその分画物、これから分離された化合物又はその塩の有効容量は、筋肉疾患予防又は改善などのその使用目的によって適宜調節されてよい。
【0088】
前記健康機能食品組成物は、食品を原料とし、一般薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないという長所があり、携帯性に優れるので、筋肉疾患予防又は改善のための補助剤として摂取可能である。
【0089】
本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋芽細胞増殖用試薬組成物を提供する。
【0090】
本発明は、甘草抽出物又はその分画物を有効成分として含有する筋芽細胞の筋肉細胞への分化促進用試薬組成物を提供する。
【0091】
本発明は、下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する筋芽細胞増殖用試薬組成物を提供する。
【0092】
＜化学式１＞
【0093】
【化10】
【0094】
＜化学式２＞
【0095】
【化11】
【0096】
＜化学式３＞
【0097】
【化12】
【0098】
本発明は、前記化合物又はその塩を有効成分として含有する筋芽細胞の筋肉細胞への分化促進用試薬組成物を提供する。
【0099】
また、本発明は、ヒト以外の動物に甘草抽出物又はその分画物を処理する段階を含む筋芽細胞増殖方法を提供する。
【0100】
本発明は、ヒト以外の動物に甘草抽出物又はその分画物を処理する段階を含む筋芽細胞の筋肉細胞への分化促進方法を提供する。
【0101】
本発明は、ヒト以外の動物に、下記化学式１～３のいずれか一つで表示される化合物又はその薬学的に許容可能な塩を処理する段階を含む筋芽細胞増殖方法を提供する。
【0102】
＜化学式１＞
【0103】
【化13】
【0104】
＜化学式２＞
【0105】
【化14】
【0106】
＜化学式３＞
【0107】
【化15】
【0108】
本発明は、ヒト以外の動物に前記化合物又はその塩を処理する段階を含む筋芽細胞の筋肉細胞への分化促進方法を提供する。
【0109】
これに相応する特徴は、上述した通りである。
［発明を実施するための形態］
［発明を実施するための形態］
【0110】
以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するためのものであり、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【0111】
＜実施例１＞甘草抽出物及び分画物の製造
１．材料準備
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｓｃｈｅｒ）の乾燥根は、クァンミョン薬草点で乾燥させたハブを購入した。全ての植物に対する標本は、韓国漢方医学研究所のＫＭ応用センター薬草銀行に保管されている。
１．材料準備
甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｓｃｈｅｒ）の乾燥根は、クァンミョン薬草点で乾燥させたハブを購入した。全ての植物に対する標本は、韓国漢方医学研究所のＫＭ応用センター薬草銀行に保管されている。
【0112】
２．甘草熱水抽出物の製造
甘草熱水抽出物を製造するために、乾燥甘草片（５０．０ｇ）を１，０００ｍＬ蒸留水に入れ、１１５℃で３時間加熱して抽出した。抽出後、標準試験体（ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｉｅｖｅｓ，１５０μｍ）を用いて濾過し凍結乾燥させた。凍結乾燥抽出物粉は、３次蒸留水に溶かした後、４℃に２４時間放置した。２４時間後、５０００ｇで５分間遠心分離後に上澄液を新しいチューブに移し、－２０℃に保管した。
甘草熱水抽出物を製造するために、乾燥甘草片（５０．０ｇ）を１，０００ｍＬ蒸留水に入れ、１１５℃で３時間加熱して抽出した。抽出後、標準試験体（ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｉｅｖｅｓ，１５０μｍ）を用いて濾過し凍結乾燥させた。凍結乾燥抽出物粉は、３次蒸留水に溶かした後、４℃に２４時間放置した。２４時間後、５０００ｇで５分間遠心分離後に上澄液を新しいチューブに移し、－２０℃に保管した。
【0113】
３．甘草熱水抽出物の分画物製造
図１は、本発明の一実施例に係る甘草抽出物又はその分画物製造方法を概略的に図式化したものである。
図１は、本発明の一実施例に係る甘草抽出物又はその分画物製造方法を概略的に図式化したものである。
【0114】
図１に示すように、前記実施例１の２番段階で製造された甘草熱水抽出物（１０．０ｇ）を蒸留水に懸濁させた後、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ，ＤＣＭ，ＣＨ２Ｃｌ２）、酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ Ａｃｅｔａｔｅ，ＥｔＯＡｃ又はＥＡ）、ｎ－ブタノール（Ｎ－Ｂｕｔａｎｏｌ，ＢｕＯＨ）に分配させた。次に、それぞれの溶液を４５℃で減圧下に蒸発させ、ジクロロメタン（９９．６ｍｇ）、酢酸エチル（３３３．０ｍｇ）、ｎ－ブタノール（１０３７．０ｍｇ）分画物をそれぞれ得た。
【0115】
４．最終物質抽出及び分離
４－１．抽出及び分離方法
１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ；ＴＭＳ）が使用された６００ＭＨｚでＢＲＵＫＥＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ６００を用いて記録された。中圧液体クロマトグラフィー（Ｍｅｄｉｕｍ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＭＰＬＣ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬ及びＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジがあるＩｓｏｌｅｒａ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行われた。カラムクロマトグラフィー（Ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、シリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，７０～２３０及び２３０～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＹＭＣ Ｃ１８樹脂及び薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）を用いてシリカゲル６０ Ｆ２５４及びＲＰ－１８ Ｆ２５４Ｓプレート（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した後、ＵＶ光（２５４及び３６５ｎｍ）で視角化し、１０％硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で染色した。
４－１．抽出及び分離方法
１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、内部標準としてテトラメチルシラン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ；ＴＭＳ）が使用された６００ＭＨｚでＢＲＵＫＥＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ ６００を用いて記録された。中圧液体クロマトグラフィー（Ｍｅｄｉｕｍ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＭＰＬＣ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬ及びＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジがあるＩｓｏｌｅｒａ Ｏｎｅ（Ｂｉｏｔａｇｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行われた。カラムクロマトグラフィー（Ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）は、シリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，７０～２３０及び２３０～４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＹＭＣ Ｃ１８樹脂及び薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＬＣ）を用いてシリカゲル６０ Ｆ２５４及びＲＰ－１８ Ｆ２５４Ｓプレート（０．２５ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄した後、ＵＶ光（２５４及び３６５ｎｍ）で視角化し、１０％硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で染色した。
【0116】
４－２．最終物質の抽出及び確認
図１のような順序で、まず、甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ，４．２ｋｇ）の乾燥根を、１００％メタノール（ＭｅＯＨ）で３回還流抽出した（それぞれ１５Ｌ）。メタノール抽出物（９５７．０ｇ）を蒸留水に懸濁させた後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に分配させた。その水分画からジクロロメタン溶液を除去した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に分配させた後、酢酸エチル溶液を４５℃で減圧下に蒸発させ、酢酸エチル分画物（１３７．０ｇ）を得た。
図１のような順序で、まず、甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ，４．２ｋｇ）の乾燥根を、１００％メタノール（ＭｅＯＨ）で３回還流抽出した（それぞれ１５Ｌ）。メタノール抽出物（９５７．０ｇ）を蒸留水に懸濁させた後、ジクロロメタン（ＤＣＭ）に分配させた。その水分画からジクロロメタン溶液を除去した後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に分配させた後、酢酸エチル溶液を４５℃で減圧下に蒸発させ、酢酸エチル分画物（１３７．０ｇ）を得た。
【0117】
前記酢酸エチル分画物を、ヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，５．５：１：０．１、３：１：０．１、ｖ／ｖ）、クロロホルム－アセトン－メタノール（ＣＨＣｌ３－Ａｃｅｔｏｎｅ－ＭｅＯＨ，３：１：０．１、ｖ／ｖ）、クロロホルム－メタノール－水（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，５：１：０．１、３：１：０．１、ｖ／ｖ）と共にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、５個の分画（Ｆｒ．Ｅ１～Ｅ５）と半結晶質固体（Ｓｅｍｉ－ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｓｏｌｉｄ，Ｆｒ．ＥＣ）を確保した。
【0118】
分画物Ｅ２（４．９ｇ）は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジを用いてＭＰＬＣによりメタノール－水（ＭｅＯＨ－Ｗａｔｅｒ，３４～７５％ ＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）の勾配で分離し、化合物１（２３．９ｍｇ）を含む１６分画（Ｆｒ．Ｅ２Ａ～Ｅ２Ｐ）を確保した。
【0119】
－ 化合物１（４－ヒドロキシ安息香酸、４－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）：白色粉末（Ｗｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）、Ｃ７Ｈ６Ｏ３；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.67 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-2, 6), 6.61 (2H, d, J = 7.2 Hz, H-3, 5). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 170.1 (C=O), 163.3 (C-4), 132.9 (C-2, 6), 122.7 (C-1), 116.0 (C-3, 5)。
【0120】
分画物Ｅ２Ｃ（２４３．５ｍｇ）は、ヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，３：１：０．１、ｖ／ｖ）溶剤があるシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分離して化合物２（１０８．５ｍｇ）を確保した。
【0121】
－ 化合物２（リキリチゲニン，Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）：無色針結晶体（Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ｎｅｅｄｌｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ）、Ｃ１５Ｈ１２Ｏ４；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.68 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 7.28 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-2´, 6´), 6.77 (2H, d, J = 7.8 Hz, H-3´, 5´), 6.45 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-6), 6.31 (1H, s, H-8), 5.32 (1H, d, J = 12.6 Hz, H-2), 3.00 (1H, t, J = 15.0 Hz, H-3a), 2.64 (1H, d, J = 16.8 Hz, H-3b). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 192.1 (C=O), 165.3 (C-7), 164.1 (C-9), 157.5 (C-4´), 129.9 (C-1´), 128.4 (C-5), 127.6 (C-2´, 6´), 114.9 (C-3´, 5´), 113.5 (C-10), 110.3 (C-6), 102.4 (C-8), 79.6 (C-2), 43.5 (C-3)。
【0122】
分画物Ｅ２Ｄ（４２０．３ｍｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１７～２５％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ、１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で隔離し、化合物３（５１．７ｍｇ）及び化合物４（１５．４ｍｇ）として確保された。
【0123】
－ 化合物３（（Ｒ）－（－）－ベスチトール，（Ｒ）－（－）－Ｖｅｓｔｉｔｏｌ）：無色結晶体（Ｃｏｌｏｒｌｅｓｓ ｃｒｙｓｔａｌｓ）、Ｃ１６Ｈ１６Ｏ４；1H NMR (600 MHz, Acetone-d6) δ 7.05 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-6´), 6.89 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-5), 6.50 (1H, s, H-3´), 6.42 (1H, d, J = 6.1 Hz, H-5´), 6.36 (1H, d, J = 5.7 Hz, H-6), 6.28 (1H, s, H-8), 4.23 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-2), 3.98 (1H, t, J = 9.5 Hz, H-2), 3.72 (3H, s, -OCH3), 3.47 (1H, m, H-3), 2.99 (1H, m, H-4), 2.82 (1H, d, J = 14.8 Hz, H-4). 13C NMR (600 MHz, Acetone-d6) δ 160.3 (C-4´), 157.4 (C-7), 156.6 (C-2´), 156.1 (C-9), 131.0 (C-5), 128.7 (C-6´), 120.9 (C-1´), 114.3 (C-10), 108.7 (C-6), 105.6 (C-5´), 103.6 (C-8), 102.4 (C-3´), 70.4 (C-2), 55.3 (-OCH3), 32.6 (C-3), 31.0 (C-4)。
【0124】
－ 化合物４（イソリキリチゲニン，Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）：黄色結晶体（Ｙｅｌｌｏｗ ｃｒｙｓｔａｌｓ）、Ｃ１５Ｈ１２Ｏ４；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.90 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6´), 7.73 (1H, d, J = 15.2 Hz, H-β), 7.56 (3H, s, H-2, 6, α), 6.79 (2H, d, J = 8.3 Hz, H-3, 5), 6.36 (1H, dd, J = 8.6, 1.6 Hz, H-5´), 6.24 (1H, s, H-3´). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 193.5 (C=O), 167.5 (C-4´), 166.3 (C-2´), 161.5 (C-4), 145.6 (C-β), 133.3 (C-6´), 131.8 (C-2, 6), 127.8 (C-1), 118.2 (C-α), 116.9 (C-3, 5), 114.7 (C-1´), 109.1 (C-5´), 103.8 (C- 3´)。
【0125】
分画物Ｅ２Ｆ（９５．１ｍｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによるヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１１～２２％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で分離し、化合物５（１１．２ｍｇ）として確保された。
【0126】
－ 化合物５（メジカルピン，Ｍｅｄｉｃａｒｐｉｎ）：白色非結晶粉末（Ｗｈｉｔｅ ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｐｏｗｄｅｒ）、Ｃ１６Ｈ１４Ｏ４；1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.39 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1), 7.13 (1H, d, J = 7.1 Hz, H-7), 6.55 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.45 (2H, s, H-8, -10), 6.42 (1H, s, H-4), 5.50 (1H, d, J = 5.8 Hz, H-11a), 4.24 (1H, d, J = 5.4 Hz, H-6eq), 3.77 (3H, s, -OCH3), 3.62 (1H, br t, J = 10.4 Hz, H-6ax), 3.54 (1H, d, J = 4.3 Hz, H-6a). 13C NMR (600 MHz, CDCl3) δ 161.2 (C-9), 160.7 (C-10a), 157.1 (C-3), 156.8 (C-4a), 132.3 (C-1), 124.9 (C-7), 119.2 (C-6b), 112.8 (C-11b), 109.9 (C-2), 106.5 (C-8), 103.8 (C-4), 97.0 (C-10), 78.6 (C-11a), 66.6 (C-6), 55.6 (-OCH3), 39.6 (C-6a)。
【0127】
分画物Ｅ３（４１．６ｇ）は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジを用いてＭＰＬＣによりメタノール－水（ＭｅＯＨ－Ｗａｔｅｒ，３３～８０％ ＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）の勾配で分離し、１５個の分画（Ｆｒ．Ｅ３Ａ～Ｅ３Ｏ）として確保された。分画物Ｅ３Ｅ（１４０．０ｍｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，２８～３６％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で隔離し、化合物６（３５．２ｍｇ）として確保された。
【0128】
－ 化合物６（テトラヒドロキシメトキシカルコン，Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ ｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ）：黄色針状（Ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｅｄｌｅｓ）、Ｃ１６Ｈ１４Ｏ６；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.89 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-β), 7.55 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-α), 7.48 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-2´), 7.45 (1H, s, H-6´), 7.14 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.82 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5´), 6.59 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-5), 3.78 (3H, s, -OCH3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 191.4 (C=O), 152.1 (C-4´), 150.7 (C-4), 149.9 (C-2), 146.5 (C-3´), 140.9 (C-3), 139.6 (C-β), 131.8 (C-1´), 123.4 (C-6´), 121.4 (C-1), 120.5 (C-α), 120.3 (C-6), 116.3 (C-2´), 115.9 (C-5´), 112.7 (C-5), 61.7 (-OCH3)。
【0129】
分画物Ｅ３Ｆ（４１０．０ｍｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりヘキサン－酢酸エチル－メタノール（ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，２０～３４％ ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で隔離し、５個の分画（Ｆｒ．Ｅ３ＦＡ～Ｅ３ＦＥ）として確保された。分画物Ｅ３ＦＢ（１７．５ｍｇ）は、ＴＬＣ（シリカゲル６０ Ｆ２５４，ｈｅｘａｎｅ－ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ，１：１：０．２、ｖ／ｖ）で分離し、化合物７（５．６ｍｇ）として確保された。
【0130】
－ 化合物７（リコカルコンＢ，Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｂ）：黄色針状（Ｙｅｌｌｏｗ ｎｅｅｄｌｅｓ）、Ｃ１６Ｈ１４Ｏ５；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.97 - 7.91 (3H, m, H-2´, 6´, β), 7.61 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-α), 7.19 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-6), 6.85 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-3´, 5´), 6.61 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-5), 3.81 (3H, s, -OCH3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 191.3 (C=O), 163.9 (C-4´), 151.0 (C-4), 149.9 (C-2), 141.0 (C-β), 139.7 (C-3), 132.2 (C-2´, 6´), 131.1 (C-1´), 121.3 (C-1), 120.4 (C-α), 120.3 (C-6), 116.4 (C-3´, 5´), 112.7 (C-5), 61.7 (-OCH3)。
【0131】
画分物Ｅ５（２０．４ｇ）は、ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ Ｃ１８カートリッジを用いてＭＰＬＣによりメタノール－水（ＭｅＯＨ－Ｗａｔｅｒ，２０～４４％ ＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）の勾配で隔離し、９個の画分（Ｆｒ．Ｅ５Ａ～Ｅ５Ｉ）として確保された。画分物Ｅ５Ｂ－Ｄは、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いたＭＰＬＣによるクロロホルム－メタノール－水（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，１２～２０％ ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ、１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配と結合して５個の画分（Ｆｒ．Ｅ５ＢＡ～Ｅ５ＢＥ）として確保された。画分物Ｅ５ＢＡは、半結晶質固体を得た後、メタノールで再分配して化合物８（９６９．０ｍｇ）として確保した。
【0132】
－ 化合物８（リキリチン，Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ）：白色粉末（Ｗｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）、Ｃ２１Ｈ２２Ｏ９；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7.65 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 7.44 (2H, s, H-2´, 6´), 7.06 (2H, s, H-3´, 5´), 6.51 (1H, s, H-6), 6.35 (1H, s, H-8), 4.88 (1H, s, H-1´), 3.68 (1H, s, H-6´), 3.10 - 3.50 (6H, m, H-2´, 3´, 4´, 5´, 6´, 3), 2.67 (1H, d, J = 15.2 Hz, H-3). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 190.4 (C=O), 165.1 (C-7), 163.5 (C-9), 157.9 (C-4´), 132.8 (C-1´), 128.8 (C-5), 128.4 (C-2´, 6´), 116.6 (C-3´, 5´), 114.0 (C-10), 111.0 (C-6), 103.0 (C-8), 100.7 (C-1´), 79.1 (C-2), 77.5 (C-5´), 77.0 (C-3´), 73.6 (C-2´), 70.1 (C-4´), 61.1 (C-6´), 43.6 (C-3)。
【0133】
分画物Ｅ５ＢＢ－Ｃは、クロロホルム－メタノール－水（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，７：１：０．０５、６：１：０．０５及びＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）溶媒と共に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて結合及び分離し、６個の分画（Ｆｒ．Ｅ５ＢＢＡ～Ｅ５ＢＢＦ）として確保された。分画物Ｅ５ＢＢＤ（２２０．０ｍｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣにより酢酸エチル－メタノール－水（ＥｔＯＡｃ－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，４～１０％ ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ、１：０．１、ｖ／ｖ）の勾配で隔離し、化合物９（１１３．５ｍｇ）として確保された。
【0134】
－ 化合物９（リキリチンアピオシド，Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ ａｐｉｏｓｉｄｅ）：黄色粉末（Ｙｅｌｌｏｗ ｐｏｗｄｅｒ）、Ｃ２６Ｈ３０Ｏ１３；1H NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 7.71 (1H, d, J = 8.3 Hz, H-5), 7.41 (2H, d, J = 6.9 Hz, H-2´, 6´), 7.09 (2H, s, H-3´, 5´), 6.48 (1H, d, J = 6.4 Hz, H-6), 6.34 (1H, s, H-8), 5.44 (1H, br s, H-1´), 5.40 (1H, s, H-2), 4.98 (1H, d, J = 7.0 Hz, H-1´), 3.01 (1H, t, J = 14.5 Hz, H-3), 2.70 (1H, t, J = 16.8 Hz, H-3). 13C NMR (600 MHz, MeOD-d4) δ 193.2 (C=O), 166.8 (C-7), 165.4 (C-9), 159.1 (C-4´), 134.3 (C-1´), 129.8 (C-5), 128.8 (C-2´, 6´), 117.5 (C-3´, 5´), 115.0 (C-10), 111.8 (C-6), 110.7 (C-1´), 103.8 (C-8), 100.7 (C-1´), 80.7 (C-3´), 80.7 (C-2), 78.6 (C-2´), 78.5 (C-3´), 78.0 (C-2´), 78.0 (C-5´), 75.4 (C-4´), 71.3 (C-4´), 66.0 (C-5´), 62.4 (C-6´), 44.9 (C-3)。
【0135】
分画物ＥＣ（３．０ｇ）は、ＳＮＡＰ ＫＰ－ＳＩＬカートリッジを用いてＭＰＬＣによりクロロホルム－メタノール－水（ＣＨＣｌ３－ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ，１２～１６％ ＭｅＯＨ－Ｈ２Ｏ、１：０．１、１００％アセトン、ｖ／ｖ）の勾配で分離し、１個の分画として確保された後、メタノールで再分散して化合物１０（２２．２ｍｇ）として確保された。
【0136】
－ 化合物１０（オノニン，Ｏｎｏｎｉｎ）：白色粉末（Ｗｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）、Ｃ２２Ｈ２２Ｏ９；1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (1H, s, H-2), 8.05 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5), 7.53 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-2´, 6´), 7.24 (1H, s, H-8), 7.15 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-6), 6.99 (2H, d, J = 7.6 Hz, H-3´, 5´), 5.12 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1´), 3.78 (3H, s, -OCH3), 3.73 (1H, m, C-6´), 3.19 - 3.48 (5H, m, H-2´, 3´, 4´, 5´, 6´). 13C NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 175.1 (C-4), 161.9 (C-7), 159.4 (C-4´), 157.5 (C-9), 154.1 (C-2), 130.5 (C-2´, 6´), 127.4 (C-5), 124.4 (C-1´), 123.8 (C-3), 118.9 (C-10), 116.0 (C-6), 114.0 (C-3´, 5´), 103.8 (C-8), 100.4 (C-1´), 77.6 (C-5´), 76.9 (C-3´), 735. (C-2´), 70.7 (C-4´), 61.0 (C-6´), 55.6 (-OCH3)。
【0137】
＜実験例１＞甘草抽出物、その分画物処理による筋芽細胞増殖、分化及び筋肉再生効果の確認
１．実験方法
１－１．Ｃ２Ｃ１２細胞培養及び甘草熱水抽出物、その分画物又は最終物質処理による増殖の観察
マウス筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｐ／Ｓ）が含まれたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）で培養した。
１．実験方法
１－１．Ｃ２Ｃ１２細胞培養及び甘草熱水抽出物、その分画物又は最終物質処理による増殖の観察
マウス筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ；Ｐ／Ｓ）が含まれたダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）で培養した。
【0138】
甘草の熱水抽出物、その分画物又は最終物質の効果を検証するために、Ｃ２Ｃ１２細胞（２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１２ウェル（ｗｅｌｌ）細胞培養皿に入れて２４時間間付着させた後、熱水抽出物（０、５０、１００、２００μｇ／ｍｌ）、その分画物（２５μｇ／ｍｌ）又は最終物質（０．５ｎｇ／ｍｌ）を１日間処理し、細胞の増殖を確認した。培地は、２日に１回ずつ入れ替え、細胞は３７℃で培養した。
【0139】
１－２．スクラッチ（Ｓｃｒａｔｃｈ）実験
Ｃ２Ｃ１２細胞が１００％成長した時に細胞表面にスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）を加え、熱水抽出物（５０μｇ／ｍｌ）又はその分画物（２５μｇ／ｍｌ）を処理して１日間培養後に細胞の回復程度を観察した。
Ｃ２Ｃ１２細胞が１００％成長した時に細胞表面にスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）を加え、熱水抽出物（５０μｇ／ｍｌ）又はその分画物（２５μｇ／ｍｌ）を処理して１日間培養後に細胞の回復程度を観察した。
【0140】
１－３．筋芽細胞の増殖の検証（ＭＴＴ法）
細胞の増殖を検証するために、細胞の培養培地を除去し、ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に溶解されたＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間放置した。反応液を除去し、１０００μｌのジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加した。紫色のホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ）をＤＭＳＯに完全に溶解させ、５４０ｎｍで吸光度を測定した。
細胞の増殖を検証するために、細胞の培養培地を除去し、ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に溶解されたＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間放置した。反応液を除去し、１０００μｌのジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）を各ウェルに添加した。紫色のホルマザン結晶（ｆｏｒｍａｚａｎ ｃｒｙｓｔａｌｓ）をＤＭＳＯに完全に溶解させ、５４０ｎｍで吸光度を測定した。
【0141】
１－４．甘草熱水抽出物、その分画物及び最終物質処理による分化の観察
分化処理誘導のために、細胞が約７０％以上成長した時に、２％ ＦＢＳと１％ Ｐ／Ｓを追加したＤＭＥＭ（分化培地）に入れ替え、熱水抽出物（１００μｇ／ｍｌ）、分画物（２５μｇ／ｍｌ）又は最終物質（０．２５ｎｇ／ｍｌ）を処理した後、２日又は４日間培養した。培地は、２日に１回ずつ入れ替え、細胞は３７℃で培養した。
分化処理誘導のために、細胞が約７０％以上成長した時に、２％ ＦＢＳと１％ Ｐ／Ｓを追加したＤＭＥＭ（分化培地）に入れ替え、熱水抽出物（１００μｇ／ｍｌ）、分画物（２５μｇ／ｍｌ）又は最終物質（０．２５ｎｇ／ｍｌ）を処理した後、２日又は４日間培養した。培地は、２日に１回ずつ入れ替え、細胞は３７℃で培養した。
【0142】
１－５．ギムザ染色（Ｇｉｅｍｓａ ｓｔａｉｎ）及び融解指数（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）
細胞の培地を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。洗浄後、１：１体積比のメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）：ＰＢＳ試薬を処理し、２分間固定した。さらに、２：１体積比のメタノール：ＰＢＳ試薬を添加し、２分間さらに固定した。２分後、０．０４％ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）試薬を添加して３０分間放置し、３０分後にＰＢＳで洗浄後に細胞の様子を顕微鏡で観察し、細胞の写真を３枚ずつ撮った（３００×）。撮った写真から、筋管細胞における融解（ｆｕｓｉｏｎ）した核の数を数え、総細胞の核の数を数えた後、融解した核の数を総細胞の核の数で割って％値を算出した。
細胞の培地を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。洗浄後、１：１体積比のメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）：ＰＢＳ試薬を処理し、２分間固定した。さらに、２：１体積比のメタノール：ＰＢＳ試薬を添加し、２分間さらに固定した。２分後、０．０４％ギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）試薬を添加して３０分間放置し、３０分後にＰＢＳで洗浄後に細胞の様子を顕微鏡で観察し、細胞の写真を３枚ずつ撮った（３００×）。撮った写真から、筋管細胞における融解（ｆｕｓｉｏｎ）した核の数を数え、総細胞の核の数を数えた後、融解した核の数を総細胞の核の数で割って％値を算出した。
【0143】
１－６．ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成
トリゾール（ＴＲＩｚｏｌＴＭ）試薬１ｍｌを添加した後、超高周波粉砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて細胞を粉砕した。粉砕したサンプルを遠心分離した後（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上澄液を新しいチューブに移し、クロロホルム２００μｌを入れ、室温に１０分間放置した。その後、遠心分離し（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、透明色の上澄液を得た。
トリゾール（ＴＲＩｚｏｌＴＭ）試薬１ｍｌを添加した後、超高周波粉砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて細胞を粉砕した。粉砕したサンプルを遠心分離した後（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、上澄液を新しいチューブに移し、クロロホルム２００μｌを入れ、室温に１０分間放置した。その後、遠心分離し（１２，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）、透明色の上澄液を得た。
【0144】
次に、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）５００μｌを入れて１０分間放置し、遠心分離してＲＮＡペレットを得た。ＲＮＡペレットに７０％エタノール（エタノール＋ジエチルピロカルボン酸（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ；ＤＥＰＣ）が処理された蒸留水）を添加して洗浄した後、完壁に除去して乾燥させた。乾燥した透明色のＲＮＡにＤＥＰＣの処理された蒸留水を入れ、－８０℃に保管した。全ＲＮＡ量は、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）で測定し、１．２％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）で１８ｓ、２８ｓバンドを確認した。ｃＤＮＡは、２μｇの全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）とランダムヘキサマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ）プライマー、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と共に合成した（２５℃：１０分、３７℃：１２０分、８５℃：５分）。
【0145】
１－７．遺伝子発現確認
遺伝子発現の確認のために、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行った。実時間遺伝子発現の観察のために、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）の蛍光物質を含むＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて遺伝子発現を分析した（７５００実時間ＰＣＲシステム）。ＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋから確保された塩基配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に従ってＰｒｉｍｅｒ ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）でデザインした。
遺伝子発現の確認のために、実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行った。実時間遺伝子発現の観察のために、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）の蛍光物質を含むＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて遺伝子発現を分析した（７５００実時間ＰＣＲシステム）。ＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋから確保された塩基配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に従ってＰｒｉｍｅｒ ３ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）でデザインした。
【0146】
ＰＣＲは、９５℃で１０分、さらに９５℃で３３秒、遺伝子プライマー温度（ｔｍ）によって３３秒、７２℃で３３秒間、４０回反応を行った。実時間ＰＣＲ分析から得られたｃ（ｔ）値の分析により、遺伝子発現値を分析した（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ２－△△Ｃｔ ｆｏｒｍｕｌａ）。処理していない細胞の遺伝子の発現値を１としたうえで、処理した細胞の遺伝子発現値を計算した。遺伝子ｃ（ｔ）値分析時に、平準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を用いた。
【0147】
前記ＰＣＲプライマーの配列は、下記表１の通りである。
【0148】
【表1】
【0149】
１－８．細胞組織免疫染色法（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
培養したＣ２Ｃ１２細胞の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄した細胞に４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，Ｓｉｇｍａ）を処理して１５分間細胞を固定した後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、０．２％トリップトン（ｔｉｐｔｏｎ）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）を入れて５分間放置した。再びＰＢＳを用いて洗浄し、エンハンサー溶液（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｏｌ．）を入れて３０分間放置した後、１次抗体（ＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ、ミオシン軽鎖２（ＭＹＬ２）、Ａｔｒｏｇｉｎ １、ＭｕＲＦ１、ニトロチロシン、ＭＳＴＮ、１：５０）を入れ、４℃で１４時間反応させた。抗体を除去し、ＰＢＳで１０分間３回洗浄した後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ又はマウスＳＦＸキット）と１時間培養した。培養後に抗体を除去し、ＰＢＳで１０分間洗浄した後、ＤＡＰ Ｉ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で核を染色し、蛍光顕微鏡を用いてタンパク質の発現を観察した。
培養したＣ２Ｃ１２細胞の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄した細胞に４％ホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，Ｓｉｇｍａ）を処理して１５分間細胞を固定した後、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、０．２％トリップトン（ｔｉｐｔｏｎ）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ）を入れて５分間放置した。再びＰＢＳを用いて洗浄し、エンハンサー溶液（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｓｏｌ．）を入れて３０分間放置した後、１次抗体（ＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ、ミオシン軽鎖２（ＭＹＬ２）、Ａｔｒｏｇｉｎ １、ＭｕＲＦ１、ニトロチロシン、ＭＳＴＮ、１：５０）を入れ、４℃で１４時間反応させた。抗体を除去し、ＰＢＳで１０分間３回洗浄した後、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ又はマウスＳＦＸキット）と１時間培養した。培養後に抗体を除去し、ＰＢＳで１０分間洗浄した後、ＤＡＰ Ｉ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で核を染色し、蛍光顕微鏡を用いてタンパク質の発現を観察した。
【0150】
１－９．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
培養したＣ２Ｃ１２細胞の培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞にＲＩＰＡバッファー（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ）とタンパク質分解酵素抑制剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を入れた後、細胞を溶解させてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質のうち４０μｇを８～１０％のアクリルアミドゲル（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に移した。これを、３％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）又はウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）で１時間室温でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。その後、１％脱脂乳又はＢＳＡに希釈した１次抗体（ＭＹＯＤ：１：５００、ＭＹＯＧ：１：４００、ＭＹＬ２：１：１０００、β－アクチン：１：１０００、ＭｕＲＦ１：１：５００、Ａｔｒｏｇｉｎ １：１：５００、ニトロチロシン：１：１００００、ＭＳＴＮ：１：５００、ＧＡＰＤＨ：１：１０００）を添加し、１６時間以上４℃で反応させた。１６時間後、ＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０が含まれたＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付着した２次抗体を室温で１時間反応させた。これをＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質を入れて現像した。
培養したＣ２Ｃ１２細胞の培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。洗浄した細胞にＲＩＰＡバッファー（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ）とタンパク質分解酵素抑制剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を入れた後、細胞を溶解させてタンパク質を抽出した。抽出したタンパク質のうち４０μｇを８～１０％のアクリルアミドゲル（Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）で電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレイン（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）に移した。これを、３％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）又はウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）で１時間室温でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。その後、１％脱脂乳又はＢＳＡに希釈した１次抗体（ＭＹＯＤ：１：５００、ＭＹＯＧ：１：４００、ＭＹＬ２：１：１０００、β－アクチン：１：１０００、ＭｕＲＦ１：１：５００、Ａｔｒｏｇｉｎ １：１：５００、ニトロチロシン：１：１００００、ＭＳＴＮ：１：５００、ＧＡＰＤＨ：１：１０００）を添加し、１６時間以上４℃で反応させた。１６時間後、ＴＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０が含まれたＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付着した２次抗体を室温で１時間反応させた。これをＴＢＳＴで３回洗浄し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質を入れて現像した。
【0151】
１－１０．組織免疫染色法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
パラフィン含有の筋肉組織にそれぞれキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）とエタノールでデパラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び水分を供給し、内因性過酸化酵素活動（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を中止させるために、０．３％ Ｈ２ＯＨ／メタノールで組織を浸した。その後、形態学観察のために、ヘマトキシリン／エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ）で染色するか、１％の正常ヤギ血清（Ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で非特異的抗体との反応を遮断するために、組織と１時間室温で反応させた後、１次抗体（１：５０）と１６時間以上４℃で反応させた。１６時間後、ＰＢＳに３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の付着した２次抗体（１：１００）を、室温で１時間反応させた。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を添加してタンパク質の発現を検出した後、顕微鏡で観察した。
パラフィン含有の筋肉組織にそれぞれキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）とエタノールでデパラフィン化（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）及び水分を供給し、内因性過酸化酵素活動（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を中止させるために、０．３％ Ｈ２ＯＨ／メタノールで組織を浸した。その後、形態学観察のために、ヘマトキシリン／エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ／ｅｏｓｉｎ）で染色するか、１％の正常ヤギ血清（Ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）で非特異的抗体との反応を遮断するために、組織と１時間室温で反応させた後、１次抗体（１：５０）と１６時間以上４℃で反応させた。１６時間後、ＰＢＳに３回洗浄し、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の付着した２次抗体（１：１００）を、室温で１時間反応させた。ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）を添加してタンパク質の発現を検出した後、顕微鏡で観察した。
【0152】
１－１１．甘草熱水抽出物食餌による筋肉再生効果の観察
甘草の熱水抽出物又は最終物質であるリキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）処理による筋肉再生効果を観察するために、マウスに対して甘草熱水抽出物又はリキリチゲニンを摂取させ、及びカルディオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ；ＣＴＸ）を筋肉に注入／非注入した後、筋肉の形態及び再生を観察した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに甘草熱水抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ）又はリキリチゲニン（１５ｍｇ／ｋｇ）を摂取させて１日後に、１００ｍＭのカルディオトキシンを腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ）筋肉に注入した。カルディオトキシン注入後、甘草熱水抽出物又はリキリチゲニンを毎日摂取させ、カルディオトキシン未注入又は注入７日後に筋肉組織をサンプリングした。カルディオトキシンを未注入又は注入７日後に確保した筋肉から、イメージＪ（ｉｍａｇｅ Ｊ）プログラムを用いて直径（μｍ）を測定した。
甘草の熱水抽出物又は最終物質であるリキリチゲニン（ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）処理による筋肉再生効果を観察するために、マウスに対して甘草熱水抽出物又はリキリチゲニンを摂取させ、及びカルディオトキシン（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ；ＣＴＸ）を筋肉に注入／非注入した後、筋肉の形態及び再生を観察した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに甘草熱水抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ）又はリキリチゲニン（１５ｍｇ／ｋｇ）を摂取させて１日後に、１００ｍＭのカルディオトキシンを腓腹筋（ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ）筋肉に注入した。カルディオトキシン注入後、甘草熱水抽出物又はリキリチゲニンを毎日摂取させ、カルディオトキシン未注入又は注入７日後に筋肉組織をサンプリングした。カルディオトキシンを未注入又は注入７日後に確保した筋肉から、イメージＪ（ｉｍａｇｅ Ｊ）プログラムを用いて直径（μｍ）を測定した。
【0153】
２．実験結果
２－１．甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞の増殖及び分化の確認
甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞の増殖を確認するために、Ｃ２Ｃ１２細胞に前記熱水抽出物０、５０、１００、２００μｇ／ｍｌを１日間処理した後、細胞の増殖をＭＴＴ法で分析した。
２－１．甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞の増殖及び分化の確認
甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞の増殖を確認するために、Ｃ２Ｃ１２細胞に前記熱水抽出物０、５０、１００、２００μｇ／ｍｌを１日間処理した後、細胞の増殖をＭＴＴ法で分析した。
【0154】
図２は、甘草熱水抽出物処理による筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）の増殖及び分化観察の結果であり、ここで、筋芽細胞の増殖程度は、何ら処理もしていない細胞の値を１００としたうえで、甘草熱水抽出物を処理した細胞の相対値を計算し、分化及び遺伝子発現程度は、何ら処理もしていない細胞の値を１としたうえで、甘草熱水抽出物を処理した細胞の相対値を計算して示した。これは、下記の実験にも同一に適用される。
【0155】
図２を参照すると、ａから、甘草熱水抽出物５０及び１００μｇ／ｍｌを細胞に処理したとき、前記抽出物を処理していない細胞に比べて約２０％程度細胞が増殖していることが確認できた。また、ｂイメージから、Ｃ２Ｃ１２細胞にスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）を加えた後、甘草熱水抽出物５０μｇ／ｍｌを１日間処理したとき、前記抽出物を処理していない細胞に比べて前記抽出物を処理した細胞の回復程度がより高いことが見られた。
【0156】
図２のｃを参照すると、甘草熱水抽出物処理によるＣ２Ｃ１２細胞の分化を確認するために、細胞に２％ ＦＢＳ分化培地を処理し、甘草熱水抽出物（１００μｇ／ｍｌ）を共に処理して４日間培養した結果、前記抽出物を処理した細胞から筋管形成が観察され、筋肉細胞に分化する際に高く発現するＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ、ＭＹＬ２などの遺伝子又はタンパク質の発現が増加することが見られた。また、タンパク質分解及び筋肉委縮に関連したＡｔｒｏｇｉｎ １、ＭｕＲＦ１遺伝子又はタンパク質の発現が減少することが見られた。
【0157】
２－２．甘草熱水抽出物処理による筋肉再生効果の確認
甘草熱水抽出物処理による筋肉再生効果を確認するために、マウスに甘草熱水抽出物を摂取させた後、カルディオトキシンをマウス筋肉に注入し、損傷した筋肉の再生程度を分析した。また、損傷のない筋肉からも、前記抽出物の効果を検証するために、甘草熱水抽出物を食べさせた後に関連タンパク質の発現を観察した。
甘草熱水抽出物処理による筋肉再生効果を確認するために、マウスに甘草熱水抽出物を摂取させた後、カルディオトキシンをマウス筋肉に注入し、損傷した筋肉の再生程度を分析した。また、損傷のない筋肉からも、前記抽出物の効果を検証するために、甘草熱水抽出物を食べさせた後に関連タンパク質の発現を観察した。
【0158】
図３は、甘草熱水抽出物の摂取によるマウス筋肉を分析した結果であり、これを参照すると、ａの表から、甘草熱水抽出物を摂取したマウスと摂取していないマウスとの間に体重の変化は殆どなかったが、摂取していないマウスに比べて前記抽出物を摂取したマウスの筋肉減少率が少ないことが見られた。
【0159】
図３のｂ、ｃ及びｄを参照すると、甘草熱水抽出物／カルディオトキシンを注入したマウスの筋肉において筋肉再生時に高く発現するタンパク質であるＰａｘ７、ＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ及びＭＹＬ２タンパク質の発現が、カルディオトキシンのみ注入したマウスに比べて増加し、また、筋肉分化抑制、タンパク質分解及び筋肉委縮に関連したＭＳＴＮ、ＭｕＲＦ１、Ａｔｒｏｇｉｎ １及びニトロチロシンタンパク質の発現が、甘草熱水抽出物／カルディオトキシンを注入したマウスの筋肉において、カルディオトキシンのみを注入したマウスに比べて減少することが見られた。ただし、筋肉損傷を与えていないマウスの筋肉では、甘草熱水抽出物の摂取によるタンパク質の発現の差異が観察されなかった。
【0160】
２－３．甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の増殖の確認
甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の増殖を確認するために、Ｃ２Ｃ１２細胞に分画５種（２５μｇ／ｍｌ）を１日間処理した後、細胞の増殖をＭＴＴ法で分析した。
甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の増殖を確認するために、Ｃ２Ｃ１２細胞に分画５種（２５μｇ／ｍｌ）を１日間処理した後、細胞の増殖をＭＴＴ法で分析した。
【0161】
図４は、甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞増殖の有無の結果を示すものであり、これを参照すると、甘草熱水抽出物（ＥＸ，１０％）を処理した細胞の他、甘草の酢酸エチル分画物（ＥｔＯＡｃ，１２％）又はｎ－ブタノール分画物（ＢｕＯＨ，１２％）を処理した細胞からも、前記抽出物又は前記分画物を処理していない細胞に比べて、細胞の増殖が増加することが見られた。ただし、ジクロロメタン（ＤＣＭ）分画物を処理した細胞では、処理していない細胞に比べて、細胞の増殖が減少したことが見られた（２７％）。
【0162】
また、細胞にスクラッチを加え、前記分画物を処理して１日間培養した結果、酢酸エチル分画物を処理した細胞において、処理していない細胞に比べて、細胞のスクラッチを加えた部位の回復力が高いことが見られた。
【0163】
２－４．甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の分化の確認
甘草抽出物の分画物処理によるＣ２Ｃ１２細胞の分化の確認のために、細胞に２％ ＦＢＳ分化培地を処理し、前記分画物（２５μｇ／ｍｌ）も共に処理して４日間培養した。
甘草抽出物の分画物処理によるＣ２Ｃ１２細胞の分化の確認のために、細胞に２％ ＦＢＳ分化培地を処理し、前記分画物（２５μｇ／ｍｌ）も共に処理して４日間培養した。
【0164】
図５は、甘草抽出物の分画物処理による筋芽細胞の分化観察結果であり、これを参照すると、甘草の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）分画物の処理によって筋管の形成が増加したことが確認できた。
【0165】
これに加え、筋肉分化に関連したＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ及びＭＹＬ２遺伝子とタンパク質の発現が増加し、また、タンパク質分解、筋肉委縮及び分化抑制に関連したＡｔｒｏｇｉｎ １、ＭｕＲＦ１及びＭＳＴＮ遺伝子の発現が減少したことが確認できた。また、ＭｕＲＦ１及びＭＳＴＮタンパク質の発現が減少したことが確認できた。
【0166】
甘草のｎ－ブタノール（ＢｕＯＨ）分画物を処理した場合にも、筋管の形成が増加したことが確認でき、これに加え、ＭＹＯＧ及びＭＹＬ２遺伝子とタンパク質の発現が増加し、Ａｔｒｏｇｉｎ １及びＭｕＲＦ１遺伝子の発現は減少した。甘草熱水抽出物（ＥＸ）を処理した場合にも、ＭＹＬ２遺伝子の発現が増加し、Ａｔｒｏｇｉｎ １及びＭｕＲＦ１遺伝子の発現が減少し、水（Ｈ２Ｏ）分画物を処理した場合には、ＭＹＯＧ遺伝子の発現が少し増加したが、その他関連遺伝子の発現には変化がなかった。
【0167】
２－５．最終単一物質処理による細胞の増殖の確認
図６は、本発明の一実施例に係る酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）分画物から分離された単一物質の化学構造を示す。前記分画物から、いくつかの段階の分画を経て１０種の最終物質を分離した後、構造分析を行った。
図６は、本発明の一実施例に係る酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）分画物から分離された単一物質の化学構造を示す。前記分画物から、いくつかの段階の分画を経て１０種の最終物質を分離した後、構造分析を行った。
【0168】
下記表２は、前記分離された１０種の最終物質及びその分析結果を示す。
【0169】
【表2】
【0170】
前記最終物質処理によるＣ２Ｃ１２細胞の増殖を観察するために、最終物質０．５ｎｇ／ｍｌを１日間処理し、細胞の増殖をＭＴＴ法で観察した。
【0171】
図７は、最終単一物質の処理による筋芽細胞増殖及び分化の観察結果であり、ａを参照すると、０．５ｎｇ／ｍｌのリキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ；１０％）、テトラヒドロキシメトキシカルコン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ；８％）又はリコカルコンＢ（Ｌｉｃｏｃｈａｌｃｏｎｅ Ｂ；１１％）の物質を処理した細胞において、前記物質を処理していない細胞に比べて、細胞の増殖が増加することが見られた。
【0172】
図７のｂを参照すると、筋管形成及び融解指数がリキリチゲニン（１３％）、テトラヒドロキシメトキシカルコン（２８％）又はリコカルコンＢ（１９％）処理によって増加することが見られ、ｃを参照すると、購入した純粋なリキリチゲニン（０．２５ｎｇ／ｍｌ、５％）、テトラヒドロキシメトキシカルコン（０．２５ｎｇ／ｍｌ、５％）又はリコカルコンＢ（１ｎｇ／ｍｌ、１１％）の物質を処理した細胞において、前記物質を処理していない細胞に比べて、細胞の増殖が増加することが見られた。また、ｄを参照すると、筋管形成及び融解指数がリキリチゲニン（２０％）、テトラヒドロキシメトキシカルコン（２３％）又はリコカルコンＢ（２０％）処理によって増加することが見られた。
【0173】
２－６．リキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）処理による筋肉再生効果の確認
リキリチゲニン処理による筋肉再生効果を確認するために、マウスにリキリチゲニンを摂取させた後、カルディオトキシンをマウス筋肉に注入して再生された筋肉の直径を測定し、損傷した筋肉の再生程度を観察した。
リキリチゲニン処理による筋肉再生効果を確認するために、マウスにリキリチゲニンを摂取させた後、カルディオトキシンをマウス筋肉に注入して再生された筋肉の直径を測定し、損傷した筋肉の再生程度を観察した。
【0174】
図８は、購買したリキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）をマウスに摂取させた後、筋肉の変化を分析した結果であり、これを参照すると、ａにおいて、リキリチゲニンを摂取したマウスと摂取していないマウスとの間に体重の変化及び筋重さは殆ど変化しなかったが、摂取していないマウスに比べて前記物質を摂取したマウスの筋肉減少率は少ないことが見られた。
【0175】
図８のｂ及びｃを参照すると、リキリチゲニンを摂取したマウスの筋肉直径が、摂取していないマウスに比べて、再生された筋肉の直径（摂取していないマウスの筋肉直径：７８±４μｍ、摂取したマウスの筋肉直径：９１±３μｍ）がより大きいことが確認された。カルディオトキシン未注入マウスの筋肉でも、摂取したマウスの筋肉直径が摂取していないマウスの筋肉直径（摂取していないマウス筋肉直径：１２４±４μｍ、摂取したマウス筋肉直径：１３９±４μｍ）に比べてより大きいことが確認された。
【0176】
以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述してきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施の態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は、明らかである。すなわち、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項及びそれらの等価物によって定義される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】