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特表2022-538693タンパク質加水分解標的ウイルス、その生ワクチン及びその作製方法と用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-05
(54)【発明の名称】タンパク質加水分解標的ウイルス、その生ワクチン及びその作製方法と用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20220829BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220829BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20220829BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220829BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220829BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/21 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/245 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/187 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/15 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/235 20060101ALI20220829BHJP
A61K 39/13 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/22 20060101ALI20220829BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220829BHJP
【ＦＩ】
C12N15/57
C12N7/01 ZNA
C12N15/85 Z
C12N15/09 100
C12N5/10
C12N15/86 Z
A61K39/145
A61K39/21
A61K39/29
A61K39/12
A61K39/245
A61K39/155
A61K39/187
A61K39/215
A61K39/15
A61K39/235
A61K39/13
A61P31/12
A61P31/16
A61P31/18
A61P31/20
A61P31/22
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500529
(86)(22)【出願日】2020-07-03
(85)【翻訳文提出日】2022-03-02
(86)【国際出願番号】 CN2020100086
(87)【国際公開番号】W WO2021004389
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】201910603698.9
(32)【優先日】2019-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522004302
【氏名又は名称】司 龍龍
(71)【出願人】
【識別番号】522004313
【氏名又は名称】甄 兆裕
(71)【出願人】
【識別番号】522004324
【氏名又は名称】牛 四文
(74)【代理人】
【識別番号】100197642
【弁理士】
【氏名又は名称】南瀬 透
(74)【代理人】
【識別番号】100099508
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 久
(74)【代理人】
【識別番号】100182567
【弁理士】
【氏名又は名称】遠坂 啓太
(74)【代理人】
【識別番号】100219483
【弁理士】
【氏名又は名称】宇野 智也
(72)【発明者】
【氏名】司 龍龍
(72)【発明者】
【氏名】甄 兆裕
(72)【発明者】
【氏名】牛 四文
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C085AA03
4C085AA21
4C085BA51
4C085BA53
4C085BA55
4C085BA56
4C085BA57
4C085BA61
4C085BA69
4C085BA71
4C085BA77
4C085BA78
4C085BA87
4C085BA88
4C085BA89
4C085BA92
4C085DD21
4C085DD51
4C085EE01
(57)【要約】
１つ又は複数の異なるタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は選択的に切断可能な１つ又は複数の連結鎖を介して連結されるタンパク質加水分解標的ウイルスを提供する。タンパク質加水分解標的ウイルスをコードする核酸分子、タンパク質加水分解標的ウイルスを発現する核酸ベクター、タンパク質加水分解標的ウイルスの作製方法、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン、複製制御可能生ワクチンの作製、ウイルス感染を予防及び治療するための関連するワクチンと薬物の作製方法、タンパク質加水分解標的ウイルスを含むワクチン又は医薬組成物、及びタンパク質加水分解標的ウイルスを作製するシステムをさらに提供する。
【選択図】図１１
【選択図】図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は選択的に切断可能な１つ又は複数の連結鎖を介して連結される、タンパク質加水分解標的ウイルス。
【請求項2】
前記部位は、前記ウイルスタンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端であり、好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれ、
好ましくは、前記連結鎖は、選択的に切断可能な分子であり、より好ましくは、前記連結鎖は、選択的に切断可能なアミノ酸配列であり、
さらに好ましくは、前記連結鎖は、ＴＥＶプロテアーゼによって選択的に切断可能な分子、トロンビンに感受性の切断可能な分子、凝血因子Ｘａによって切断可能な分子、エンテロキナーゼによって切断可能な分子、３Ｃプロテアーゼによって切断可能な分子、ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断可能な分子、配列、細菌ゼラチン酵素ｇｅｌａｔｉｎａｓｅによって切断可能な分子から選ばれ、好ましくは、例えばＧＰＬＧＶ、及び自己切断型の連結鎖であり、
よりさらに好ましくは、前記自己切断型の連結鎖は２Ａ短鎖ペプチドであり、前記２Ａ短鎖ペプチドは、好ましくは豚テシオウイルスのＰ２Ａ、馬鼻炎ウイルスのＥ２Ａ、口蹄疫ウイルスのＦ２Ａ及び自己切断可能なＴ２Ａから選ばれ、
好ましくは、前記ＴＥＶプロテアーゼによって選択的に切断された連結鎖は、Ｅ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）という一般式Ｉで表される配列であり、
より好ましくは、前記連結鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１－１３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれ、
好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子と連結鎖との間には、柔軟性リンカーがさらに含まれ、
より好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子、連結鎖及び柔軟性リンカーは、柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子という連結方式を有し、
さらに好ましくは、前記柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８－１４９、１６７及び１６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれる、請求項１に記載のタンパク質加水分解標的ウイルス。
【請求項3】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、手足口ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、巨大細胞ウイルス、水痘－帯状ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ジカウイルスＺｉｋａ、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ハンタウイルス、新型腸管ウイルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳ウイルス、コレラウイルス、口蹄疫ウイルス、微小ウイルス、プリオン、天然痘ウイルス、タバコモザイクウイルス、アデノ関連ウイルス、細菌ウイルス、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトボカウイルス、コロナウイルス及び新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス又は新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、好ましくは、前記ウイルスは、修飾されたウイルスである、請求項１又は２に記載のタンパク質加水分解標的ウイルス。
【請求項4】
タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスであり、前記インフルエンザウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼによって特異的認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）であり、好ましくは、前記ウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ３Ｎ２又はＢ型インフルエンザウイルスであり、
より好ましくは、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰタンパク質の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が含まれ、
さらに好ましくは、インフルエンザウイルスのＰＡとＰＢ２には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＳ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、又は、
インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
好ましくは、前記タンパク質加水分解標的ウイルスは、タンパク質加水分解標的コロナウイルスであり、前記コロナウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼによって特異的認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）であり、
好ましくは、前記ウイルスは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、
より好ましくは、コロナウイルスのスパイクタンパク質、エンベロープ糖タンパク質、膜糖タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、非構造タンパク質１、非構造タンパク質２、非構造タンパク質３、非構造タンパク質４、非構造タンパク質５、非構造タンパク質６、非構造タンパク質７、非構造タンパク質８、非構造タンパク質９、非構造タンパク質１０、非構造タンパク質１１、非構造タンパク質１２、非構造タンパク質１３、非構造タンパク質１４、非構造タンパク質１５、非構造タンパク質１６、３ａタンパク質、３ｂタンパク質、６タンパク質、７ａタンパク質、７ｂタンパク質、８ａタンパク質、８ｂタンパク質、９ｂタンパク質、３Ｃ様プロテアーゼ、リーダータンパク質、２’－Ｏ－リボシルメチルトランスフェラーゼ、エンドヌクレアーゼ酵素、３’－～－５’エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ｏｒｆ１ａポリタンパク質、ＯＲＦ１０タンパク質、ＯＲＦ８タンパク質、ＯＲＦ７ａタンパク質、ＯＲＦ６タンパク質、ＯＲＦ３ａタンパク質の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
好ましくは、タンパク質加水分解標的ウイルスは、タンパク質加水分解標的ＨＩＶウイルスであり、前記ＨＩＶウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼによって特異的認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）であり、
好ましくは、前記ウイルスはＨＩＶウイルスであり、
また好ましくは、ＨＩＶウイルスのＧａｇポリタンパク質、ｐｏｌポリタンパク質、ｇｐ１６０、ＨＩＶ転写トランス活性化因子、ビリオンタンパク質発現調節タンパク質、Ｎｅｆ、レンチウイルスタンパク質Ｒ、ウイルス感染因子、ウイルスタンパク質Ｕ、マトリックスタンパク、カプシドタンパク質、スペーサーペプチド１、ヌクレオカプシドタンパク質、スペーサーペプチド２、Ｐ６、逆トランスクリプターゼ、リボヌクレアーゼＨ（Ｒｎａｓｅ Ｈ）、インテグラーゼ、ＨＩＶプロテアーゼ、ｇｐ１２０、ｇｐ４１タンパク質の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれる、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルス。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスをコードする核酸分子。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを発現する核酸ベクター。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを作製する方法であって、細胞系の構築：タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現可能な細胞系を構築するステップであって、
好ましくは、前記細胞系は哺乳動物細胞系であり、
より好ましくは、前記細胞系は、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ．２細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１／ＢＲＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＺＭ－ｂｌ細胞、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞、ＭＲＣ－５細胞及びＶＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＨＣＴ－８細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃａｃｏ２細胞から選ばれ、
よりさらに好ましくは、前記細胞系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系、ＭＤＣＫ細胞系から選ばれ、
好ましくは、前記細胞系は、任意のユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系であり、より好ましくは、前記細胞系は、Ｅ３リガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系であるステップ１）と、
部位選択：宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、ウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、導入されるタンパク質加水分解標的分子と連結鎖のウイルスタンパク質及び部位を決定するステップ２）と、
遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入するステップ３）と、
発現ベクターの構築：ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をベクターに操作可能に連結し、発現ベクターを得るステップであって、
好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドであるステップ４）と、
逆遺伝学技術を用いて、ステップ４）における発現ベクターとインフルエンザウイルスレスキュー用の他の発現ベクターをステップ１）で構築したタンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断を有する細胞系において、共トランスフェクトしてタンパク質加水分解標的ウイルスを得るステップ５）と、
任意に、前記タンパク質加水分解標的ウイルスを生産するために、このタンパク質加水分解標的ウイルスをステップ１）で得られた細胞系において複製させるステップ６）とを含み、
好ましくは、前記ウイルス作製過程において、プロテアソーム阻害剤を加え、より好ましくは、前記プロテアソーム阻害剤はＭＧ１３２、ＭＧ－３４１又はラクタシスチンであり、
又は、前記方法は、
部位選択：宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、ウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、導入されるタンパク質加水分解標的分子と連結鎖のウイルスタンパク質及び部位を決定するステップ[1]と、
遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入するステップ[2]と、
突然変異配列の発現ベクターの構築：ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をベクターに操作可能に連結し、発現ベクターを得るステップであって、
好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドであるステップ[3]と、
タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼの過剰発現ベクターを構築し、
タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定的に発現可能な細胞系を構築するステップ[4]と、
逆遺伝学技術を用いて、ステップ[3]で得られた発現ベクター、ウイルスレスキューに必要な他の発現ベクター及びステップ[4]で得られた発現ベクターを宿主細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションに成功した宿主細胞を培地で培養させ、タンパク質加水分解標的ウイルスを得るステップ[5]とを含む、方法。
【請求項8】
前記方法は、検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的ウイルスのステップ１）で得られた細胞系及び修飾されていない正常な宿主細胞における複製能力を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、ここで、ステップ１）で得られた細胞系において複製され、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能力が低下するか又は複製できない前記タンパク質加水分解標的ウイルスは修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスであるステップ７）をさらに含み、
任意に、前記方法は、
修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスを用いて、タンパク質加水分解標的ウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的ウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返すステップ８）をさらに含み、
任意に、得られたタンパク質加水分解標的ウイルスのステップ１）で得られた細胞系及び修飾されていない正常な宿主細胞における複製能力を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、ここで、ステップ１）で得られた細胞系において複製され、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能力が低下するか又は複製できない前記タンパク質加水分解標的ウイルスは修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記タンパク質加水分解標的ウイルスは、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスであり、細胞系の構築：ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを哺乳動物細胞系に安定形質導入して、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現可能な細胞系を構築するステップであって、
好ましくは、前記哺乳動物細胞系はＨＥＫ２９３Ｔ細胞系又はＭＤＣＫ細胞系である、ステップ１）と、
部位選択：宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、インフルエンザウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入する遺伝子断片及び部位を決定するために、インフルエンザウイルスの各タンパク質にタンパク質加水分解標的分子及び連結鎖ＴＥＶプロテアーゼ切断配列を導入した後のインフルエンザウイルスのタンパク質構造を予測解析するステップであって、
好ましくは、インフルエンザウイルスをコードする異なるタンパク質の遺伝子断片から挿入部位を１つ又は複数選択するステップ２）と、
遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたインフルエンザウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入するステップ３）と、
プラスミドの構築：ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をプラスミドに操作可能に連結し、コーディングプラスミドを得る、ステップ４）と、
逆遺伝学技術を用いて、ステップ４）で得られたプラスミド、及びインフルエンザウイルスレスキュー用の他のプラスミドをステップ１）で得られたＴＥＶｐを安定発現する細胞系において共トランスフェクトし、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスを得る、ステップ５）と、
任意に、このタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスを、ＴＥＶｐを安定発現する安定細胞系において生産するステップ６）とを含み、
好ましくは、前記方法は、
検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのＴＥＶｐに対する依存性及びそのパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの修飾に成功したか否かを決定するステップ７）をさらに含み、
任意に、前記方法は、
修飾に成功したタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスベクターを用いて、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返すステップであって、
好ましくは、得られたタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのＴＥＶｐに対する依存性及びそのパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、長期にわたる継代を経て、依然としてＴＥＶｐに対する依存性を維持するタンパク質加水分解標的ウイルスを保留して修飾に成功した候補物とするステップ８）をさらに含み、
任意に、前記方法は、
修飾に成功した候補物を選択し、生成物を精製するステップ９）と、
ステップ９）におけるタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスに対して安全性又は免疫原性検測を行うステップであって、野生型ウイルスに比べ、安全なインフルエンザウイルスは修飾に成功したインフルエンザウイルスであるステップ１０）とをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
弱毒化生ウイルス、複製能力のない生ウイルス、複製制御可能ウイルス、及びウイルス感染を予防及び治療するための関連するワクチンと薬物の作製方法であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを利用するステップ、又は請求項７～９のいずれか１項に記載の方法を用いてタンパク質加水分解標的ウイルスを作製するステップを含む、方法。
【請求項11】
請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを含むワクチン又は医薬組成物であって、好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン又は複製制御可能生ワクチンである、ワクチン又は医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを作製するシステムであって、前記システムは、タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現する細胞系を含み、
好ましくは、前記細胞系は、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現する細胞系であり、
より好ましくは、前記細胞系は、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系又はＭＤＣＫ細胞系であり、
よりさらに好ましくは、前記細胞系は、任意のユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系であり、好ましくは、前記細胞系は、Ｅ３リガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系であり、
さらに好ましくは、前記システムは、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質加水分解標的ウイルスを発現する核酸ベクターをさらに含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオテクノロジーの分野に属する。具体的には、本発明はタンパク質加水分解標的ウイルス及び用途に関する。本発明は前記ウイルスの作製方法をさらに提供する。
【背景技術】
【0002】
インフルエンザはインフルエンザウイルスにより引き起こされる急性呼吸器感染症であり、季節的に禽類、哺乳動物及び人類に感染する可能性がある。インフルエンザウイルスはまたＡ、Ｂ、Ｃという３つのタイプに分けることができ、そのうち、Ａ型（甲型とも呼ばれる）インフルエンザウイルスの爆発が最も頻繁である。甲型インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科に属し、そのゲノムが合計で８つの独立した一本鎖ＲＮＡ断片からなり、１０種類のタンパク質（血球凝集素タンパク（ＨＡ）、Ｍ１とＭ２に分けられるマトリックスタンパク質（Ｍ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）、ＮＳ１及びＮＥＰを含む非構造タンパク質（ＮＳ）、及びＰＢ１、ＰＢ２とＰＡという３種類のポリメラーゼ）をコードする。種別毎のタンパク質はインフルエンザウイルスに対して重要な生物学機能を持っている。甲型インフルエンザウイルスはその主要な表面抗原ＨＡとＮＡの抗原性の違いによって異なる亜型に分類される。現在、１８種類の亜型のＨＡタンパク質と１１種類の亜型のＮＡタンパク質が発見された。Ａ型インフルエンザウイルスの大規模な流行は極めて高い発病率と死亡率を引き起こすことができ、人類の健康を厳重に脅かしている（Ｗ．Ｈ．Ｏ．２００３；Ｃｏｌｅｍａｎ ２００７）。Ａ型インフルエンザウイルスは２０世紀に主に３回の大型インフルエンザ、即ち１９１８年のＨ１Ｎ１、１９５７年のＨ２Ｎ２及び１９６８年のＨ３Ｎ２を引き起こし、計約５０００万人が死亡した（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ ２００６；Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈｕｌｔｉｎ ｅｔ ａｌ．２００７）。２００９年の甲型インフルエンザもＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスにより引き起こされたものであり（Ｄａｗｏｏｄ，Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｚｉｍｍｅｒ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ ２００９）、その伝播が急速で、世界で注目を集めている。統計によると、世界ではインフルエンザによる死亡者が毎年平均３０～５０万人であった（Ｆｉｏｒｅ，Ｓｈａｙ ｅｔ ａｌ．２００７）。
【0003】
インフルエンザが発見されて以来、科学者たちはインフルエンザウイルスの予防管理に力を注いでいる。ワクチン接種は現在インフルエンザの予防、インフルエンザの伝播を制御するのに最も有利な手段である。１９３０年代末、インフルエンザウイルスワクチンがヒトで使用されるようになってきた。現在のインフルエンザウイルスワクチンは不活化ウイルスワクチン、弱毒化ウイルスワクチン、ＤＮＡワクチン、サブユニットワクチン、組換えウイルスベクターワクチン及びウイルス様粒子ワクチンに分けられる。
【0004】
現在応用されている不活化インフルエンザワクチンは三価ワクチンであり、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢ型インフルエンザウイルスワクチンを含む。長年の臨床応用にあたっては、インフルエンザ不活化ワクチンは非常に良い免疫効果と安全性があり、接種後に人体を刺激して相応な抗体を産生することができるようになるが、欠点は分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）の産生を刺激できないことである。また、インフルエンザウイルスはニワトリ胚に継代すると、抗原変異を誘発し、且つ大部分のニワトリ体内には様々なウイルスが所持されており、ワクチンはこれらのウイルスに汚染されているおそれがある。大量のワクチンを生産することが可能になるために、新たに流行した抗原変異株はニワトリ胚において効率的に複製しなければならない。ワクチンを作製するために用いられる野生型ウイルスが卵中で成長するにつれて、その免疫原性はある程度変化し、又は低下する。生産したワクチン株が現在の流行株とマッチングしなければ、免疫保護効果を失うことになる。近年、１つの重大な進展はニワトリ胚培養の代わりに哺乳動物細胞を利用することであった。哺乳動物細胞は主にＭＤＣＫ細胞とＶｅｒｏ細胞であり、外来因子汚染がなく、大規模生産が容易で、抗原安定などの利点がある。哺乳動物細胞によって培養されたインフルエンザワクチンは比較的良い免疫原性を有し、接種後の副作用は軽く、比較的安全である。研究段階において、良好な実験結果が得られたが、いくつかの問題はまだ解決策が見つからず、臨床においてまだ使用されていない。
【0005】
弱毒化生ワクチンは主に温度感受性ワクチン、再集合体ワクチン、低温適応弱毒インフルエンザ生ワクチン、逆遺伝学技術ワクチン及び複製欠損インフルエンザワクチンという５種類がある。現在研究開発に成功しているのは低温適応弱毒インフルエンザ生ワクチンである。このワクチンは毒性を低下させ、最適な適応温度で成長できるインフルエンザ毒株である。このウイルスは２５℃程度でしか複製できず、３７℃で継代できないため、その感染は上気道に限定されており、臨床的には明らかなインフルエンザ症状はない。弱毒株と現在の流行毒株を用いて遺伝子組換えを行うことによって、弱毒株断片と流行株のＨＡとＮＡ遺伝子を持つ組換えウイルスを得る。多くの研究により、低温適応毒株の生物学的性質は非常に良い安定性があることが証明された。弱毒化インフルエンザワクチンと不活化ワクチンの免疫後の抗体陽転率はいずれも５０％～７０％であり、インフルエンザの流行を効果的に抑制することができる。低温適応弱毒生ワクチンはロシアで使用されており、米国でも使用が許可される予定である。それは接種経路、免疫効果の面で不活化ワクチンより一定の優勢があり、例えば、鼻内噴霧又は点滴方式を介して免疫することができる。低温適応弱毒生ワクチンは上気道で複製し、粘膜のｓＩｇＡと全身の体液及び細胞免疫反応を誘導でき、不活化ワクチンより広く、持続性がより長い保護を産生する。しかし、低温適応弱毒生ワクチンは他のインフルエンザウイルスと遺伝子再集合をした後、有毒な再集合体株ウイルスを得ることができ、且つ二価又は三価低温適応弱毒生ワクチンにおいて、妨害現象が発生する可能性がある。
【0006】
理想的なワクチンは、[1]免疫原性が強い、[2]毒性反応が小さい、[3]遺伝学的に安定する、[4]流行期で流行株と一致する抗原性を迅速に獲得できる条件を備えるべきである。生ワクチンの不活化ワクチンに対する優勢及び生ワクチンの安全配慮に鑑み、哺乳動物細胞を用いて複製制御可能、遺伝安定、安全有効な新規インフルエンザウイルス生ワクチンを生産し、ワクチンの安全性と有効性を高めることは、インフルエンザワクチンの迅速な発展を促進する。
【0007】
ユビキチン－プロテアソーム系
タンパク質の分解は正常な細胞機能（例えば、増殖、分化、死亡）を維持するのに決定的に重要である。真核細胞内タンパク質の分解は主にリソソーム経路、特殊細胞器の加水分解システム、細胞膜表面加水分解システム、Ｃａｓｐａｓｅプロテアーゼシステム及び高度保存のユビキチン－プロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ、ＵＰＰ）がある。ユビキチン－プロテアソーム経路は細胞質と細胞核内でＡＴＰに依存し、リソソーム経路と違うタンパク質分解経路であり、細胞がストレスと非ストレス条件下で産生したタンパク質、特に半減期が短い機能タンパク質、癌遺伝子産物と変性、アロステリックタンパク質などを高効率且つ高度選択的に分解し、ストレス状態で細胞内の構造タンパク質も分解できる。このタンパク質加水分解経路の発見は細胞サイクル、細胞悪化転化研究の転換点と考えられ、非常に重要な細胞機能調節因子である。
タンパク質の分解は正常な細胞機能（例えば、増殖、分化、死亡）を維持するのに決定的に重要である。真核細胞内タンパク質の分解は主にリソソーム経路、特殊細胞器の加水分解システム、細胞膜表面加水分解システム、Ｃａｓｐａｓｅプロテアーゼシステム及び高度保存のユビキチン－プロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙ、ＵＰＰ）がある。ユビキチン－プロテアソーム経路は細胞質と細胞核内でＡＴＰに依存し、リソソーム経路と違うタンパク質分解経路であり、細胞がストレスと非ストレス条件下で産生したタンパク質、特に半減期が短い機能タンパク質、癌遺伝子産物と変性、アロステリックタンパク質などを高効率且つ高度選択的に分解し、ストレス状態で細胞内の構造タンパク質も分解できる。このタンパク質加水分解経路の発見は細胞サイクル、細胞悪化転化研究の転換点と考えられ、非常に重要な細胞機能調節因子である。
【0008】
ユビキチン－プロテアソーム系はユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）、ユビキチン活性化酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｅ１））、ユビキチン結合酵素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ（Ｅ２））、ユビキチンタンパク質リガーゼ（ｕｎｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅｓ（Ｅ３））及びプロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）からなる。ユビキチンは高度保存の、７６個のアミノ酸からなる小分子タンパク質であり、分子量が８．４５ｋである。細胞核から細胞質まで、生殖細胞から各種体細胞まで広く分布しており、増殖活発の腫瘍細胞と胚細胞において高発現している。標的タンパク質がタンパク質加水分解酵素複合体によって認識及び加水分解されることを容易にするために、ユビキチンＣ末端のグリシン（Ｇｌｙ）カルボキシル基はユビキチンリガーゼの協力下で、分解対象となる標的タンパク質のリジン（Ｌｙｓ）α又はεアミノ基と結合し、ポリユビキチン鎖を形成する。ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）はユビキチンの蛋白基質への結合を触媒する。ユビキチン経路が起動されると、ＡＴＰの参与下で、ユビキチンのグリシン残基のＣ末端がユビキチン結合酵素（Ｅ２）の活性部位であるシステイン（Ｃｙｓ）に結合し、次いで、ユビキチンが活性化される。ユビキチン結合酵素（Ｅ２）はユビキチンが活性化された後、活性化されたユビキチンをユビキチン結合酵素の活性化部位であるシステインの残基上に転移する。ユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）はユビキチンに媒介される基質タンパク質分解の選択性を決定する上で重要な役割を果たしている。Ｅ３は酵素基質に対して親和力を有し、且つＥ２に結合してユビキチンをＥ２から標的タンパク質に転移させる必要がある。ユビキチンが酵素基質に結合した後に、一般的に、１つのポリユビキチン鎖が形成される。この鎖において、各ユビキチンモノマーのＣ末端が、いずれもこの前のユビキチンの特定リジン残基に結合している。プロテアソームはユビキチンと基質タンパク質との結合体の分解を触媒する重要な酵素であり、２０Ｓプロテアソームと２６Ｓプロテアソームを含む。２０Ｓのαサブユニットは主に基質認識に用いられ、βサブユニットは主に基質分解に用いられる。２６Ｓプロテアソームの作用は遊離ペプチド、遊離ユビキチン、又は再利用可能なユビキチンの産生に関連する可能性がある。そのため、ユビキチン－プロテアソーム系の作用は、（１）ユビキチン分子と標的タンパク質との共有結合、（２）ポリユビキチン化されたタンパク質は２６Ｓタンパク質加水分解酵素複合体（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）によって分解され、同時にユビキチンが再活性化されるという連続的な２段階からなる。この過程の実現はＥ１、Ｅ２及びＥ３という３つの酵素の協力が必要であり、細胞膜、小胞体から核膜などまでを含む細胞全体の質膜システムを貫通している。ユビキチン－プロテアソーム経路は真核細胞内の重要なタンパク質制御システムであり、細胞サイクル過程の調節、細胞増殖と分化及びシグナル伝導などの様々な細胞生理過程に参与するため、細胞内のタンパク質ユビキチン化分解はタンパク質の重要な転写後修飾方式である。
【0009】
要約すれば、生物体内の細胞は適切なタンパク質レベルを維持するために努力しており、各時点でも幾千幾万のタンパク質を生成したり、分解したりする。タンパク質バランスを維持する重要な因子はユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）と呼ばれる低分子タンパク質である。前記ユビキチンがタンパク質にリンクされると、これらのタンパク質がプロテアソームに搬送されて分解されることになる。この原理を用いて、研究者がタンパク質分解誘導キメラ分子（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ、ＰＲＯＴＡＣｓ）技術に基づくタンパク質分解剤を開発した。即ち、研究者が２つの活性末端を有する低分子を設計し、１つの活性末端は標的タンパク質に結合することができ、もう１つの活性末端はＥ３ユビキチンリガーゼ（Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ）と呼ばれるタンパク質に結合することができる。このダブル機能低分子はユビキチンと標的タンパク質との結合を強制し、細胞のゴミ処理ステーションに搬送することができる。タンパク質が分解された後でも他のタンパク質を標的し続けることができ、それによって、不要なタンパク質のレベルを迅速に低下させる。
【0010】
しかし、現在、該技術をウイルス修飾に用いたという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｋａｔｈｌｅｅｎ Ｍ． Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔａｃｓ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｋｐ１-Ｃｕｌｌｉｎ-Ｆ ｂｏｘ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． ＰＮＡＳ（２００１）．
【非特許文献2】Ａｓｈｌｅｙ Ｒ． Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ： Ｅｎ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００８）．
【非特許文献3】Ｄｅｎｎｉｓ Ｌ． Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｓｍａｌｌ‐Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｅ３ Ｌｉｇａｓｅ ＶＨＬ ａｎｄ ＨＩＦ１α． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）．
【非特許文献4】Ｄａｎｉｅｌ Ｐ Ｂｏｎｄｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｂｙ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＲＯＴＡＣｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０１５）．
【非特許文献5】Ｇｅｏｒｇ Ｅ． Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）．
【非特許文献6】Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚｅｎｇｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＢＥＴ Ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＲＤ４． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）．
【非特許文献7】Ｄｅｎｎｉｓ Ｌ． Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ＨａｌｏＰＲＯＴＡＣＳ：Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＲＯＴＡＣｓ ｔｏ Ｉｎｄｕｃｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＨａｌｏＴａｇ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）．
【非特許文献8】Ｊｉｎｇ Ｌｕ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｊａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｅ３ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｅｒｅｂｌｏｎ ｔｏ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｔａｒｇｅｔ ＢＲＤ４． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）．
【非特許文献9】Ｙｏｎｇｈｕｉ Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． ＰＲＯＴＡＣ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＢＴＫ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｕｔａｔｅｄ ＢＴＫ Ｃ４８１Ｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１８）．
【非特許文献10】Ｙｏｎｇｈｕｉ Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ ＰＲＯＴＡＣｓ ｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２０１９）．
【非特許文献11】Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ． Ｆｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．ＮＥＪＭ（２０１４）．
【非特許文献12】Ｍａｒｉｅｌｌ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ＰＲＯｔｅｏｌｙｓｉｓ ＴＡｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒａｓ （ＰＲＯＴＡＣｓ）－Ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄｆｕｔｕｒｅ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１９））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は従来の技術の欠点に対して、タンパク質加水分解標的ウイルスを提供し、前記ウイルスは、ユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能な分子と、連結鎖（ｌｉｎｋｅｒ）とを含む。本発明は、前記ウイルスの作製方法及び前記ウイルスの用途をさらに提供する。
【0013】
本願において、用語「タンパク質加水分解標的分子（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」とは、ユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なポリペプチド、アミノ酸配列、タンパク質、又は他の分子の様々な分子である。出願人は、前記タンパク質加水分解標的分子のコーディングヌクレオチド配列をウイルスのゲノムに導入すると、このタンパク質加水分解標的分子がウイルスゲノムの複製につれて複製され、且つウイルスタンパク質の翻訳につれてウイルスタンパク質に融合発現されることができ、それによって、タンパク質加水分解標的分子によって部位特異的修飾されたウイルス、即ちタンパク質加水分解標的ウイルス、Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＯＴＡＣ ｖｉｒｕｓ、ＰＲＯＴＡＣウイルス）を得ることができることを見出した。
【0014】
ユビキチン－プロテアソーム系は宿主細胞に広く存在するため、ＰＲＯＴＡＣウイルスが製造プロセスで細胞内のユビキチン－プロテアソーム系によって分解されて生産効率が低下することを避けるために、発明者は、ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間に選択的に切断可能な連結鎖（ｌｉｎｋｅｒ）を導入し、この連結鎖が特定の人工的に修飾された細胞系内で切断されることができ、それによって、ウイルスタンパク質をタンパク質加水分解標的分子から分離し、ウイルスタンパク質はユビキチン化－プロテアソーム系によって分解されずに保留されるため、ＰＲＯＴＡＣウイルスはこの特定の人工的に修飾された細胞系内で効率的に複製、大量生産して作製することが可能になる。正常な細胞では、ユビキチン－プロテアソーム系はウイルスタンパク質と融合したタンパク質加水分解標的分子を認識することができ、それによって、ウイルスタンパク質を分解し、ウイルスの複製能力を減弱させ、甚だしきに至っては複製能力が完全に失われる。そのため、ＰＲＯＴＡＣウイルスは非常に高い安全性を有する。なお、ＰＲＯＴＡＣウイルスは、例えば、ウイルスタンパク質の特定の領域又は特定のアミノ酸にいくつかの免疫増強剤を導入することによって、性能が改善されたウイルスを得るようにさらに修飾されてもよく、それによって、免疫原性が増強されたＰＲＯＴＡＣウイルスを得る。
【0015】
本発明の別の目的は、インフルエンザウイルスが、タンパク質加水分解標的分子を切断するか、又は不活化することができる特定のウイルス生産系においてのみ複製できるように、条件付き切断可能なタンパク質加水分解標的分子のコーディングヌクレオチド配列をインフルエンザウイルスゲノムに導入することである。インフルエンザウイルスのこの特定のウイルス生産系に対する依存を用いて、このシステムでインフルエンザウイルスの大量作製を行うことができ、人体や動物などの正常な細胞にユビキチン－プロテアソーム経路が存在し、ウイルスタンパク質と融合発現するタンパク質加水分解標的分子を認識することができ、それによって、ウイルスタンパク質を分解することができるため、作製したインフルエンザウイルスは動物や人体で複製増殖できなくなり、ウイルスの安全性を増加させ、このインフルエンザウイルスを名実ともにインフルエンザウイルス生ワクチンにする。なお、動物や人体などのユビキチン－プロテアソーム系は様々なタンパク質加水分解標的分子を認識できるため、ウイルスタンパク質に異なるタイプ、異なる数量のタンパク質加水分解標的分子を導入することができる。選択的に切断可能な連結鎖（ｌｉｎｋｅｒ）も様々であるため、異なるタイプ、異なる数量の連結鎖を導入することにより、タンパク質加水分解標的分子の選択的切断を実現することができる。これらの異なるタイプと数量のタンパク質加水分解標的分子と連結鎖は任意に組み合わされてもよく、異なる複製効率、異なる弱毒化程度のウイルスワクチンの作製のために保証を提供することができ、これはインフルエンザウイルスワクチンの生産効率及び免疫原性にとって非常に重要である。
【0016】
このタンパク質加水分解標的ウイルスの原理は、（１）ウイルスタンパク質特異的部位に導入されたタンパク質加水分解標的分子が、正常な宿主細胞におけるユビキチン－プロテアソーム系によって認識されることができ、それによって、関連するウイルスタンパク質を分解、不活化させること、（２）ウイルスタンパク質特異的部位に導入されたタンパク質加水分解標的分子が、特異的なウイルス生産系において阻害されるか、又は連結鎖を介して選択的に切断され、ウイルスタンパク質から分離され、それによって、ウイルスタンパク質がユビキチン－プロテアソーム経路によって分解されることを回避又は減少させることができること、（３）ウイルスタンパク質特異的部位に導入されたタンパク質加水分解標的分子が、正常な宿主細胞において阻害され得ないか、又はタンパク質加水分解標的分子とウイルスタンパク質とを連結する連結鎖が正常な宿主細胞において切断され得ないことである。そのため、作製したウイルスは、動物や人体などの宿主細胞においてユビキチン－プロテアソーム経路によって認識、分解されることができるが、複製能力が低下し、甚だしきに至っては複製増殖能力が完全に失われ、ウイルスの安全性を増加させた。
【課題を解決するための手段】
【0017】
一態様によれば、本発明は、１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は選択的に切断可能な１つ又は複数の連結鎖を介して連結される、タンパク質加水分解標的ウイルスを提供する。
【0018】
好ましくは、前記部位は、タンパク質のＣ末端及び／又はＮ末端、即ち、前記ウイルスの遺伝子断片のＣ末端及び／又はＮ末端である。
【0019】
本発明に記載されたタンパク質加水分解標的ウイルスによれば、前記複数のタンパク質加水分解標的分子は、同じタンパク質加水分解標的分子であってもよいし、異なるタンパク質加水分解標的分子の組み合わせであってもよく、前記複数の連結鎖は、同じ連結鎖であってもよいし、異なる連結鎖の組み合わせであってもよい。
【0020】
好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１１０のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0021】
好ましくは、前記連結鎖は、任意の選択的に切断可能な分子から選ばれ、アミノ酸配列、例えばＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）によって選択的切断可能な分子、トロンビンに感受性の切断可能な分子（切断部位はＬＶＰＲ*ＧＳ、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１ ＬＥＡＧＣＫＮＦＦＰＲＳＦＴＳＣＧＳＬＥである）、凝血因子Ｘａによって切断可能な分子（切断部位はＩＤＧＲ*である）、エンテロキナーゼによって切断可能な分子（切断部位はＤＤＤＤＫ*である）、３Ｃプロテアーゼによって切断可能な分子（切断部位はＥＴＬＦＱ*ＧＰである）、ＳＵＭＯプロテアーゼによって切断可能な分子、配列、細菌ゼラチン酵素ｇｅｌａｔｉｎａｓｅによって切断可能な分子（例えば、ＧＰＬＧＶ）、自己切断型の連結鎖が好ましい。好ましくは、前記自己切断型の連結鎖は、２Ａ短鎖ペプチド、例えば豚テシオウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１）に由来するＰ２Ａ、馬鼻炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ）に由来するＥ２Ａ、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ ａｎｓ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）に由来するＦ２Ａ、自己切断可能なＴ２Ａなどから選ばれる。
【0022】
より好ましくは、前記連結鎖は、任意のＴＥＶｐによって認識且つ切断可能な配列Ｅ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）（切断はＱとＧとの間に、又はＱとＳとの間に、又はＱとＭとの間に発生し、Ｘaaは任意のアミノ酸であってもよいことを表す。ここでは、この配列はＴＥＶプロテアーゼ切断配列と呼ばれ、切断部位はＴＥＶプロテアーゼ切断部位、Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ、ＴＥＶｃｓと呼ばれる）であり、具体的には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２－１３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0023】
好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子と連結鎖との間には、柔軟性リンカーがさらに含まれ、
より好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子、連結鎖及び柔軟性リンカーは、柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子という連結方式を有し、
さらに好ましくは、前記柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８－１４９、１６７及び１６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれる。
より好ましくは、前記タンパク質加水分解標的分子、連結鎖及び柔軟性リンカーは、柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子という連結方式を有し、
さらに好ましくは、前記柔軟性リンカー－連結鎖－柔軟性リンカー－タンパク質加水分解標的分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８－１４９、１６７及び１６８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0024】
好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、手足口ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ＥＢウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、巨大細胞ウイルス、水痘－帯状ヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ジカウイルスＺｉｋａ、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ハンタウイルス、新型腸管ウイルス、風疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳ウイルス、コレラウイルス、口蹄疫ウイルス、微小ウイルス、プリオン、天然痘ウイルス、タバコモザイクウイルス、アデノ関連ウイルス、細菌ウイルス、ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、ヒトボカウイルス、コロナウイルス及び新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選ばれ、より好ましくは、前記ウイルスは、インフルエンザウイルス又は新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0025】
好ましくは、前記ウイルスは修飾されたか、又は複数の挿入修飾の組み合わせを含む修飾されたウイルスである。
【0026】
本発明の具体的な実施例によれば、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）を提供し、前記インフルエンザウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）によって特異的認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ）である。
【0027】
好ましくは、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰタンパク質の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が含まれ、即ち、インフルエンザウイルスゲノムのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ遺伝子断片の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列が含まれ、即ち、前記タンパク質加水分解標的分子と連結鎖は、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰタンパク質の１つ又は複数の相応な部位に部位特異的修飾される。
【0028】
好ましくは、インフルエンザウイルスのＰＡとＰＢ２には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＳ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、又は、
インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれる。
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質とＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、Ｍ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＳ１タンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、Ｍ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれ、又は、
インフルエンザウイルスのＮＳ１タンパク質、ＮＥＰタンパク質には、いずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれる。
【0029】
好ましくは、前記タンパク質加水分解標的ウイルスは、タンパク質加水分解標的コロナウイルスであり、前記コロナウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼによって特異的に認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）である。
【0030】
好ましくは、前記ウイルスは、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
【0031】
より好ましくは、コロナウイルスのスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ（Ｓ）ｐｒｏｔｅｉｎ）、エンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ（Ｅ）ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、膜糖タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍ）ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ（Ｎ）ｐｒｏｔｅｉｎ）、非構造タンパク質１（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ｎｓｐ１））、非構造タンパク質２、非構造タンパク質３、非構造タンパク質４、非構造タンパク質５、非構造タンパク質６、非構造タンパク質７、非構造タンパク質８、非構造タンパク質９、非構造タンパク質１０、非構造タンパク質１１、非構造タンパク質１２、非構造タンパク質１３、非構造タンパク質１４、非構造タンパク質１５、非構造タンパク質１６、３ａタンパク質、３ｂタンパク質、６タンパク質、７ａタンパク質、７ｂタンパク質、８ａタンパク質、８ｂタンパク質、９ｂタンパク質、３Ｃ様プロテアーゼ（３Ｃ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、リーダータンパク質（ｌｅａｄｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、２’－Ｏ－リボシルメチルトランスフェラーゼ（２’－Ｏ－ｒｉｂｏｓｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、エンドヌクレアーゼ酵素（ｅｎｄｏＲＮＡｓｅ）、３’－～－５’エキソヌクレアーゼ（３’－ｔｏ－５’ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、ヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ｏｒｆ１ａポリタンパク質（ｏｒｆ１ａ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ１０タンパク質（ＯＲＦ１０ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ８タンパク質（ＯＲＦ８ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ７ａ タンパク質（ＯＲＦ７ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ６タンパク質（ＯＲＦ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＯＲＦ３ａ タンパク質（ＯＲＦ３ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれる。
【0032】
好ましくは、タンパク質加水分解標的ウイルスは、タンパク質加水分解標的ＨＩＶウイルスであり、前記ＨＩＶウイルスは、その１つ又は複数の異なるウイルスタンパク質の部位にはユビキチン－プロテアソーム系によって認識可能なタンパク質加水分解標的分子が１つ又は複数含まれ、且つ前記ウイルスタンパク質とタンパク質加水分解標的分子との間は連結鎖を介して連結され、ここで、前記連結鎖はＴＥＶプロテアーゼによって特異的に認識且つ切断可能なＥ－Ｘaa－Ｘaa－Ｙ－Ｘaa－Ｑ－（Ｇ／Ｓ／Ｍ）である。
【0033】
好ましくは、前記ウイルスはＨＩＶウイルスである。
【0034】
また好ましくは、ＨＩＶウイルスのＧａｇポリタンパク質（Ｇａｇ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ｐｏｌポリタンパク質（ｐｏｌ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ）、ｇｐ１６０、ＨＩＶ転写トランス活性化因子（ＨＩＶ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ｔａｔ）、ビリオンタンパク質発現調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒｅｖ）、Ｎｅｆ（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ、Ｎｅｆ）、レンチウイルスタンパク質Ｒ（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒ、Ｖｐｒ）、ウイルス感染因子（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｆ）、ウイルスタンパク質Ｕ（ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕ、Ｖｐｕ）、マトリックスタンパク（ＭＡ、ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐ１７）、カプシドタンパク質（ＣＡ、ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐ２４）、スペーサーペプチド１（ＳＰ１、ｓｐａｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ １，ｐ２）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ、ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｐ７）、スペーサーペプチド２（ＳＰ２、ｓｐａｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ２，ｐ１）、Ｐ６、逆トランスクリプターゼ（ＲＴ、ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、リボヌクレアーゼＨ（Ｒｎａｓｅ Ｈ）、インテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ、ＩＮ）、ＨＩＶプロテアーゼ（ＨＩＶ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＰＲ）、ｇｐ１２０、ｇｐ４１タンパク質の１つ又は複数には、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖が１つ又は複数含まれる。
【0035】
本発明の１つの実施形態において、逆遺伝学技術を用いて、発明者は、既存のインフルエンザウイルスモデルの任意遺伝子を他の亜型又は毒株の遺伝子に置き換えることができ、又は既存のインフルエンザウイルスモデルを他の亜型又は毒株に置き換えることによって、他の亜型又は毒株のインフルエンザウイルスを作製し、その方法が任意の亜型又は毒株のインフルエンザウイルスに適用できるようにすることができ、また、作製されたウイルスはタンパク質加水分解標的分子を選択的に切断できる細胞株に大量に複製されるが、正常な宿主細胞においてユビキチン－プロテアソーム系によって認識・分解される。なお、この方法は他の亜型又は毒株に適用されてもよく、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ８、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ８、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ８、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ８Ｎ４、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ３、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１６Ｎ３、Ｈ１７Ｎ１０及びＨ１８Ｎ１１を含む。なお、逆遺伝学技術を用いて、多価インフルエンザウイルス、例えばＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ型インフルエンザウイルス表面抗原を含有する多価インフルエンザウイルスも作製することができる。より重要なことは、作製した変異型強毒と多価ウイルスが非常に高い安全性と有効性を有することである。
【0036】
本発明は、前記タンパク質加水分解標的ウイルスをコードする核酸分子をさらに提供する。
【0037】
本発明は、前記タンパク質加水分解標的ウイルスを発現する核酸ベクターをさらに提供する。
【0038】
別の態様によれば、本発明は、タンパク質加水分解標的ウイルスを作製する方法を提供し、前記方法は、以下のステップを含む。
【0039】
ステップ１）、細胞系の構築：タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現可能な細胞系を構築する。
【0040】
好ましくは、前記細胞系は哺乳動物細胞系である。
【0041】
より好ましくは、前記細胞系は、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ．２細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１／ＢＲＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｆ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＺＭ－ｂｌ細胞、Ｓｕｐ－Ｔ１細胞、ＭＲＣ－５細胞及びＶＭＫ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、ＨＣＴ－８細胞、Ｈｕｈ－７細胞、Ｃａｃｏ２細胞から選ばれ、
よりさらに好ましくは、前記細胞系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系又はＭＤＣＫ細胞系から選ばれ、
好ましくは、前記細胞系は、任意のユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系であり、より好ましくは、前記細胞系は、Ｅ３リガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系である。
よりさらに好ましくは、前記細胞系は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系又はＭＤＣＫ細胞系から選ばれ、
好ましくは、前記細胞系は、任意のユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系であり、より好ましくは、前記細胞系は、Ｅ３リガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系である。
【0042】
ステップ２）、部位選択：宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、ウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、導入されるタンパク質加水分解標的分子タイプ、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するウイルスタンパク質及び部位を決定する。
【0043】
ステップ３）、遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入する。
【0044】
ステップ４）、発現ベクターの構築：ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をベクターに操作可能に連結し、発現ベクターを得る。
【0045】
好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドである。
【0046】
ステップ５）、逆遺伝学技術を用いて、ステップ４）における発現ベクターとインフルエンザウイルスレスキュー用の他の発現ベクターをステップ１）で構築したタンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断を有する細胞系において、共トランスフェクトしてタンパク質加水分解標的ウイルスを得る。
【0047】
任意に、ステップ６）、前記タンパク質加水分解標的ウイルスを大規模に生産するために、このタンパク質加水分解標的ウイルスをステップ１）で得られた細胞系において複製させる。
【0048】
好ましくは、前記ウイルス作製過程において、プロテアソーム阻害剤を加え、より好ましくは、前記プロテアソーム阻害剤はＭＧ１３２、ＭＧ－３４１又はラクタシスチンである。
【0049】
又は、前記方法は、以下のステップを含む。
【0050】
ステップ[1]、部位選択：宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、ウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、導入されるタンパク質加水分解標的分子タイプ、タンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するウイルスタンパク質及び部位を決定する。
【0051】
ステップ[2]、遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入する。
【0052】
ステップ[3]、突然変異配列の発現ベクターの構築：ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をベクターに操作可能に連結し、発現ベクターを得る。
【0053】
好ましくは、前記発現ベクターはプラスミドである。
【0054】
ステップ[4]、タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼの過剰発現ベクターを構築し、
タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現可能な細胞系を構築する。
タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現可能な細胞系を構築する。
【0055】
ステップ[5]、逆遺伝学技術を用いて、ステップ[3]で得られた発現ベクター、ウイルスレスキューに必要な他の発現ベクター及びステップ[4]で得られた発現ベクターを宿主細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションに成功した宿主細胞を培地で培養させ、タンパク質加水分解標的ウイルスを得る。
【0056】
本発明の上記方法によれば、前記方法は、ステップ７）をさらに含み、
検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的ウイルスのステップ１）で得られた細胞系及び修飾されていない正常な宿主細胞における複製能力を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、ここで、ステップ１）で得られた細胞系において複製され、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能力が低下するか又は複製できない前記タンパク質加水分解標的ウイルスは修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスである。
検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的ウイルスのステップ１）で得られた細胞系及び修飾されていない正常な宿主細胞における複製能力を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、ここで、ステップ１）で得られた細胞系において複製され、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能力が低下するか又は複製できない前記タンパク質加水分解標的ウイルスは修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスである。
【0057】
任意に、前記方法は、ステップ８）をさらに含み、
修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスベクターを用いて、タンパク質加水分解標的ウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的ウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返す。
修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスベクターを用いて、タンパク質加水分解標的ウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的ウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返す。
【0058】
任意に、得られたタンパク質加水分解標的ウイルスのステップ１）で得られた細胞系及び修飾されていない正常な宿主細胞における複製能力を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、ここで、ステップ１）で得られた細胞系において複製され、修飾されていない正常な宿主細胞において複製能力が低下するか又は複製できない前記タンパク質加水分解標的ウイルスは修飾に成功したタンパク質加水分解標的ウイルスである。
【0059】
本発明の具体的な実施例によれば、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの作製及び大規模生産の方法を提供し、この方法は、以下のステップを含む。
【0060】
ステップ１）、細胞系の構築：ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを哺乳動物細胞系に安定形質導入して、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現可能な細胞系を構築する。
【0061】
好ましくは、前記哺乳動物細胞系はＨＥＫ２９３Ｔ細胞系とＭＤＣＫ細胞系であり、
構築した安定細胞系はＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐである。なお、本実施の形態では、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）及びその対応する切断可能な配列を研究対象とすることが好ましいが、当業者が理解するように、本発明の技術の原理は切断作用を有する他の任意の分子（タンパク質、ポリペプチド、核酸及び化学分子を含む）に拡張してもよい。
構築した安定細胞系はＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐである。なお、本実施の形態では、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）及びその対応する切断可能な配列を研究対象とすることが好ましいが、当業者が理解するように、本発明の技術の原理は切断作用を有する他の任意の分子（タンパク質、ポリペプチド、核酸及び化学分子を含む）に拡張してもよい。
【0062】
ステップ２）、部位選択：タンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入した遺伝子断片及び部位を決定するために、宿主体内のユビキチン－プロテアソーム体系の発現分布を統計解析することにより、インフルエンザウイルスに対してバイオインフォマティクスとタンパク質構造予測を行い、インフルエンザウイルスの各タンパク質にタンパク質加水分解標的分子及び連結鎖であるＴＥＶプロテアーゼ切断配列を導入した後のインフルエンザウイルスのタンパク質構造を予測解析する。
【0063】
好ましくは、インフルエンザウイルスをコードする異なるタンパク質の遺伝子断片から挿入部位を１つ又は複数選択する。
【0064】
ステップ３）、遺伝子突然変異：遺伝子工学の方法を用いて、決定されたインフルエンザウイルスタンパク質及び選択部位のコーディング遺伝子にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖をコードするヌクレオシド配列を導入する。
【0065】
ステップ４）、プラスミドの構築：
ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をプラスミドに操作可能に連結し、コーディングプラスミドを得る。
ステップ３）で得られた遺伝子突然変異後のウイルスタンパク質のコーディングヌクレオチド配列をプラスミドに操作可能に連結し、コーディングプラスミドを得る。
【0066】
ステップ５）、逆遺伝学技術を用いて、ステップ４）で得られたプラスミド、及びインフルエンザウイルスレスキュー用の他のプラスミドをステップ１）で得られたＴＥＶｐを安定発現する安定細胞において共トランスフェクトし、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスを得る。
【0067】
ここで、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのゲノムにタンパク質加水分解標的分子及びＴＥＶプロテアーゼ切断配列のコーディングヌクレオチド配列を導入することによって、対応するインフルエンザウイルスのタンパク質にタンパク質加水分解標的分子及びＴＥＶプロテアーゼ切断配列を導入して、タンパク質加水分解標的分子によって修飾されたインフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）を得る。
【0068】
好ましくは、トランスフェクションに成功した宿主細胞を０．５％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有するＤＭＥＭ培地で培養させることをさらに含み、
要約すれば、得られた突然変異配列発現ベクター及びウイルスレスキューに必要な他のプラスミド、及びＴＥＶｐを過剰発現するプラスミドを宿主細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションに成功した宿主細胞を０．５％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有するＤＭＥＭ培地で培養させる。
要約すれば、得られた突然変異配列発現ベクター及びウイルスレスキューに必要な他のプラスミド、及びＴＥＶｐを過剰発現するプラスミドを宿主細胞に共トランスフェクトし、トランスフェクションに成功した宿主細胞を０．５％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有するＤＭＥＭ培地で培養させる。
【0069】
任意に、ステップ６）、このタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスを、ＴＥＶｐを安定発現する安定細胞系において大規模生産させる。
【0070】
好ましくは、トランスフェクト化約４日後、又はパッケージングされたウイルスが４）における宿主細胞を完全に病変又は９０％以上病変させた後、上清を収集し、新たなＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞に感染させるために用いられ、培地は０．５％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ ＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有するＤＭＥＭ培地であり、感染４日後、又は感染したウイルスが４）における宿主細胞を完全に病変させた後、上清を収集して得る。
【0071】
好ましくは、前記方法は、ステップ７）をさらに含み、
検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのＴＥＶｐに対する依存性及びそのパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの修飾に成功したか否かを決定する。
検測：ステップ５）で得られたタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのＴＥＶｐに対する依存性及びそのパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの修飾に成功したか否かを決定する。
【0072】
具体的には、上清を遠心分離し、０．４５μｍ濾膜を通過して細胞砕片を除去し、パッケージング生成物に対してＴＥＶｐ依存性、及びパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性の検測を行い、ＴＥＶｐ依存性を維持する突然変異体を保留して修飾に成功した候補物に設定する。パッケージング生成物のＴＥＶｐ依存性とは、前記方法を用いてパッケージングされたウイルスがＴＥＶｐ高度発現の細胞系において複製増殖可能であるが、ＴＥＶｐを発現しない正常な細胞において複製能力が低下又は欠損することである。
【0073】
任意に、前記方法は、ステップ８）をさらに含み、
修飾に成功したタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスベクターを用いて、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返す。
修飾に成功したタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスベクターを用いて、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの複数のウイルスタンパク質上にいずれもタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を導入するか、又はタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのいずれか１つのウイルスタンパク質上にタンパク質加水分解標的分子と連結鎖を複数導入するようにステップ２）～５）を繰り返す。
【0074】
好ましくは、得られたタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスのＴＥＶｐに対する依存性及びそのパッケージング生成物の不活化のプロテアソーム経路に対する依存性を測定することにより、前記タンパク質加水分解標的ウイルスの修飾に成功したか否かを決定し、長期にわたる継代を経て、依然としてＴＥＶｐに対する依存性を維持するタンパク質加水分解標的ウイルスを保留して修飾に成功した候補物とする。
【0075】
任意に、前記方法は、
修飾に成功した候補物を選択し、生成物を精製するステップ９）と、
ステップ９）におけるタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスに対して安全性又は免疫原性検測を行うステップであって、野生型ウイルスに比べ、安全なインフルエンザウイルスは修飾に成功したインフルエンザウイルスであるステップ１０）とをさらに含む。
修飾に成功した候補物を選択し、生成物を精製するステップ９）と、
ステップ９）におけるタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスに対して安全性又は免疫原性検測を行うステップであって、野生型ウイルスに比べ、安全なインフルエンザウイルスは修飾に成功したインフルエンザウイルスであるステップ１０）とをさらに含む。
【0076】
本発明の１つの具体的な実施形態において、タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス遺伝子をベクター（例えば、ｐＨＨ２１プラスミド）に挿入することにより、上記ベクターを、インフルエンザウイルスレスキューに必要な他のベクターと共に、タンパク質加水分解標的分子を選択的に切断できる安定細胞系、好ましくＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐにトランスフェクトすると、ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスを得ることができる。このウイルスは、タンパク質加水分解標的分子を選択的に切断できる安定細胞系、好ましくＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ及び／又はＭＤＣＫ－ＴＥＶｐにおいて大量増殖作製する。
【0077】
本発明の１つの実施形態において、インフルエンザウイルスの生産効率を向上させ、及び将来の工業化生産を実現するために、発明者はＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現できる安定細胞系（好ましくＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ）を構築した。この哺乳動物安定細胞系は、従来のニワトリ胚繁殖ウイルスを用いることによる人体アレルギーなどの副作用を引き起こしやすいという欠点も解決することができる。生産効率をさらに向上させるために、ウイルス培地に適量のプロテアソーム阻害剤を加え、ユビキチン－プロテアソーム系のウイルスタンパク質に対する分解を抑制するために用いられてもよく、又はユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系、例えばＥ３ユビキチンリガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系を用いてもよい。
【0078】
本発明では、哺乳動物細胞から作製可能、条件付き切断可能なタンパク質加水分解標的分子をゲノム及び相応なタンパク質にそれぞれ導入する突然変異インフルエンザウイルス、即ちＰＲＯＴＡＣウイルスを提供する。好ましくは、前記ウイルスはＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９、Ｈ３Ｎ２又はＢ型インフルエンザウイルスである。
【0079】
上記ウイルスは、ＴＥＶｐを安定発現する哺乳動物安定細胞系（例えば２９３Ｔ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞など）から作製してもよい。生産効率をさらに向上させるために、ウイルス培地に適量のプロテアソーム阻害剤を加え、ユビキチン－プロテアソーム系のウイルスタンパク質に対する分解を抑制するために用いてもよく、又はユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系、例えばＥ３ユビキチンリガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系を用いてもよい。作製した突然変異インフルエンザウイルスは、非常に良い安全性と免疫活性を有する。
【0080】
ＴＥＶｐを安定発現する哺乳動物細胞細胞系を構築するために、発明者はピューロマイシン耐性のあるＴＥＶｐの発現遺伝子を担持するレンチウイルス過剰発現ベクターを構築し、ウイルスを介してＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞をそれぞれ形質導入し、ピューロマイシンスクリーニングを経て、ＴＥＶｐを安定発現する安定細胞株を得る。これらの安定細胞株をモノクローナル化し、モノクローナル培養を行い、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇとＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、ＴＥＶｐ発現量が最も高い安定細胞株を選別し、最終の安定細胞系であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞とＭＤＣＫ細胞である。
【0081】
中空繊維カラムとゲルクロマトグラフィー方法又はショ糖勾配密度遠心分離法により、精製された後の突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスを得ることができる。体内外実験により、ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスは優れた安全性と遺伝安定性を有し、そして不活化ウイルスに比べてもより良い免疫効果があることが初歩的に証明された。
【0082】
本発明は、弱毒化生ウイルス、複製能力のない生ウイルス、複製制御可能ウイルス、及びウイルス感染を予防及び治療するための関連するワクチンと薬物の作製方法をさらに提供し、前記方法は、上記タンパク質加水分解標的ウイルスを利用するステップ、又は上記方法を用いてタンパク質加水分解標的ウイルスを作製するステップを含む。
【0083】
本発明は、上記タンパク質加水分解標的ウイルスを含むワクチン又は医薬組成物をさらに提供し、
好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン又は複製制御可能生ワクチンである。
好ましくは、前記ワクチンは、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン又は複製制御可能生ワクチンである。
【0084】
本発明は、上記タンパク質加水分解標的ウイルスを作製するシステムをさらに提供し、前記システムは、タンパク質加水分解標的ウイルスの連結鎖に対する選択的切断作用を有するプロテアーゼを安定発現する細胞系を含み、好ましくは、前記細胞系は、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現する細胞系であり、より好ましくは、前記細胞系は、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを安定発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系又はＭＤＣＫ細胞系である。生産効率をさらに向上させるために、ウイルス培地に適量のプロテアソーム阻害剤を加え、ユビキチン－プロテアソーム系のウイルスタンパク質に対する分解を抑制するために用いてもよく、又はユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞系、例えばＥ３ユビキチンリガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系を用いてもよい。
【0085】
さらに好ましくは、前記システムは、上記タンパク質加水分解標的ウイルスを発現する核酸ベクターをさらに含む。
【0086】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明のタンパク質加水分解標的ウイルスの、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン、複製制御可能生ワクチンの作製、ウイルス感染を予防及び治療するための関連する薬物の作製における用途を提供する。
【0087】
本発明は、ワクチンをさらに提供し、前記組成物は、前記ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス、ＰＲＯＴＡＣ新型コロナウイルス又はＰＲＯＴＡＣ ＨＩＶウイルスを含有する。
【0088】
好ましくは、前記ワクチンは、補助剤及び他の補助材料を含有する。
【0089】
本発明は、前記ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス、ＰＲＯＴＡＣ新型コロナウイルス又はＰＲＯＴＡＣ ＨＩＶウイルス、及び医薬適合性のベクター、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物をさらに提供する。
【0090】
本発明は、前記ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス、ＰＲＯＴＡＣ新型コロナウイルス又はＰＲＯＴＡＣ ＨＩＶウイルスの、弱毒化生ワクチン、複製能力のない生ワクチン、複製制御可能生ワクチンの作製、ウイルス感染を予防及び治療するための関連する薬物の作製における用途をさらに提供する。
【0091】
本発明は、さらに、配列が以下に示されるＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）遺伝子を担持するレンチウイルスウイルスベクターを提供する。このベクターは、ウイルスにパッケージングされた後に、細胞に形質導入され、ピューロマイシンスクリーニングを用いて、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）を宿主細胞に統合することができる。前記ＴＥＶｐのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０に示される。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０：
ＭＧＥＳＬＦＫＧＰＲＤＹＮＰＩＳＳＴＩＣＨＬＴＮＥＳＤＧＨＴＴＳＬＹＧＩＧＦＧＰＦＩＩＴＮＫＨＬＦＲＲＮＮＧＴＬＬＶＱＳＬＨＧＶＦＫＶＫＮＴＴＴＬＱＱＨＬＩＤＧＲＤＭＩＩＩＲＭＰＫＤＦＰＰＦＰＱＫＬＫＦＲＥＰＱＲＥＥＲＩＣＬＶＴＴＮＦＱＴＫＳＭＳＳＭＶＳＤＴＳＣＴＦＰＳＳＤＧＩＦＷＫＨＷＩＱＴＫＤＧＱＣＧＳＰＬＶＳＴＲＤＧＦＩＶＧＩＨＳＡＳＮＦＴＮＴＮＮＹＦＴＳＶＰＫＮＦＭＥＬＬＴＮＱＥＡＱＱＷＶＳＧＷＲＬＮＡＤＳＶＬＷＧＧＨＫＶＦＭＶＫＰＥＥＰＦＱＰＶＫＥＡＴＱＬＭＮ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０：
ＭＧＥＳＬＦＫＧＰＲＤＹＮＰＩＳＳＴＩＣＨＬＴＮＥＳＤＧＨＴＴＳＬＹＧＩＧＦＧＰＦＩＩＴＮＫＨＬＦＲＲＮＮＧＴＬＬＶＱＳＬＨＧＶＦＫＶＫＮＴＴＴＬＱＱＨＬＩＤＧＲＤＭＩＩＩＲＭＰＫＤＦＰＰＦＰＱＫＬＫＦＲＥＰＱＲＥＥＲＩＣＬＶＴＴＮＦＱＴＫＳＭＳＳＭＶＳＤＴＳＣＴＦＰＳＳＤＧＩＦＷＫＨＷＩＱＴＫＤＧＱＣＧＳＰＬＶＳＴＲＤＧＦＩＶＧＩＨＳＡＳＮＦＴＮＴＮＮＹＦＴＳＶＰＫＮＦＭＥＬＬＴＮＱＥＡＱＱＷＶＳＧＷＲＬＮＡＤＳＶＬＷＧＧＨＫＶＦＭＶＫＰＥＥＰＦＱＰＶＫＥＡＴＱＬＭＮ
【0092】
本発明は、ＴＥＶｐを安定発現する哺乳動物安定細胞系ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ、ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐをさらに提供する。
【0093】
ここで、レンチウイルス形質導入により得られた安定細胞系ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐとＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐは、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ＴＥＶｐ）遺伝子を担持しており、この安定細胞系を用いて、ウイルスの任意の目標タンパク質の特異的部位にＴＥＶｐ切断配列をｌｉｎｋｅｒとするタンパク質加水分解標的分子を導入し、ＰＲＯＴＡＣウイルスの大規模作製を実現することができる。
【0094】
上記組成物、医薬組成物及びワクチンは、本発明の部位特異的突然変異による修飾のＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスの作製に基づいて、当技術分野の従来技術で作製されてもよく、それらはヒトと動物のインフルエンザウイルス感染を含むインフルエンザウイルス感染の予防又は治療のために用いられることができる。
【0095】
さらなる一態様によれば、本発明は、部位特異的突然変異、部位特異的修飾、複製制御可能なインフルエンザウイルス生ワクチンを提供し、上記部位特異的突然変異と部位特異的修飾は、インフルエンザウイルスの任意のタンパク質に、タンパク質分解（加水分解）を誘発する可能性のあるペプチド、アミノ酸配列又は他の分子を導入することであり、この導入された、タンパク質分解（加水分解）を誘発する可能性のあるペプチド、アミノ酸配列又は他の分子は、ウイルスの作製過程において、選択的に切断、抑制又は不活化されることができる。本発明は、部位特異的突然変異による修飾を経た部位を組み合わせて、複数の遺伝子断片上に、タンパク質分解（加水分解）を誘発する可能性のあるペプチド、アミノ酸配列又は他の分子を導入したインフルエンザウイルスを作製することにさらに関する。
【0096】
本発明は、インフルエンザウイルスの部位特異的突然変異、修飾方法をさらに提供し、前記方法は、タンパク質分解（加水分解）を誘発する可能性のある任意分子（ポリペプチド、アミノ酸配列、タンパク質、又は他の分子を含む）（Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を、零個、１つ又は複数の選択的に切断可能な連結鎖（ｌｉｎｋｅｒ、ポリペプチド、アミノ酸配列、タンパク質、又は他の分子を含む）を介して、インフルエンザウイルスの任意遺伝子（タンパク質）に導入することを含み、突然変異に修飾されたインフルエンザウイルスタンパク質が正常な宿主（細胞）において分解（加水分解）されることができ、ウイルス複製能力（活性）が低下し、甚だしきに至っては複製能力が完全に失われることを招く。
【0097】
本発明は、ウイルスタンパク質分解（加水分解）を選択的に抑制する方法をさらに提供し、前記方法は、ウイルスの作製の過程の高生産効率を保証するために、タンパク質分解（加水分解）を誘発する可能性のある分子を選択的に抑制又は不活化し、タンパク質分解分子とウイルスタンパク質との間の連結鎖を選択的に切断することを含む。ＰＲＯＴＡＣウイルスの生産効率をさらに向上させるために、ＰＲＯＴＡＣウイルス作製過程において適量のプロテアソーム阻害剤（例えば、ＭＧ１３２、ＭＧ－３４１、ラクタシスチンｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎなど）を加え、プロテアソームに媒介されるタンパク質分解を抑制するために用いてもよく、又はユビキチン－プロテアソーム系欠損の細胞、例えば相応なＥ３リガーゼノックアウト又はノックダウンの細胞系を用いてＰＲＯＴＡＣウイルスを作製してもよい。
【0098】
本発明はさらに、前記部位特異的突然変異による修飾又は複数部位結合のインフルエンザウイルスの応用、例えば、インフルエンザウイルス生ワクチン、弱毒化ワクチン、複製能力のないワクチン、インフルエンザウイルス強毒の安全モデルなどの用途を提供する。本発明の技術は、任意のウイルス修飾、作製、及び/又はその生ワクチン、弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、強毒の安全モデルなどの応用に幅広く応用されることができる。
【発明の効果】
【0099】
先行技術と比べて、本発明は次の利点を有する。
１）汎用性：全てのウイルスにタンパク質があり、分解目標のウイルスタンパク質に「切断可能なタンパク質加水分解標的分子」を導入するだけで、ウイルスの複製を制御することができる。従って、この技術は全てのウイルスワクチンの作製に用いられることができる。
１）汎用性：全てのウイルスにタンパク質があり、分解目標のウイルスタンパク質に「切断可能なタンパク質加水分解標的分子」を導入するだけで、ウイルスの複製を制御することができる。従って、この技術は全てのウイルスワクチンの作製に用いられることができる。
【0100】
２）選択可能なタンパク質加水分解標的分子は幾千幾万種類あり、これらの分子はこのウイルスワクチンを作製するために開発利用されることができる。従って、豊富な選択可能な予備資源を持つ。
【0101】
３）操作簡単：簡単なウイルスベクターの構築とウイルスの製造技術だけが必要であり、生産者はあまり多くのウイルス生物学的知識を必要とせずにこのようなワクチンを作製することができる。
【0102】
４）実験により、この技術は異なる不活化程度のワクチンを設計するために用いられることができ、安全な制御可能性を有することが証明された。
【0103】
５）実験により、これらのワクチンは良好な免疫原性を有することが証明された。
【図面の簡単な説明】
【0104】
次に、図面と結び付けて本発明の実施形態を詳細に説明する。
【図2B】図２Ｂは潜在的ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞に対してＲＴ－ＰＣＲ同定を行う電気泳動図である（Ｏ（ｏｌｄ）は第一バッチのＭＤＣＫ細胞を表し、Ｎ（ｎｅｗ）は第二バッチのＭＤＣＫ細胞を表し、矢印が示す細胞は標的遺伝子ＴＥＶｐのｍＲＮＡ発現レベルが比較的高い細胞である）。
【図4】図４は本発明の方法で作製したタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）のＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞系と正常な細胞系における感染２日後の複製力価の柱状グラフである。
【図5】図５は本発明の方法で作製した複数のタンパク質加水分解分子を含有するタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）のＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞系と正常な細胞系における感染後の複製力価の柱状グラフである。
【図6】図６は本発明の方法で作製したタンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）のＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞と正常な細胞系における複製能力を比較する柱状グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0105】
本発明をより良く理解するために、発明者は実施例と結び付けて具体的な試験を詳述及び説明し、ここで、前記実施例は説明のみのために用いられ、本発明の保護範囲を限定するものではない。いずれかの本発明と等価な変形又は実施形態も本発明に含まれる。
【実施例1】
【0106】
実施例１：ＴＥＶｐを安定的に発現可能な哺乳動物安定細胞系ＨＥＫ２９３－ＴＥＶｐ、ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐの構築
このＴＥＶｐを安定発現する哺乳動物細胞系は北京可瑞生物科技有限公司（ＣｏｒｒｅＧｅｎｅ）の協力を依頼して完成された。
このＴＥＶｐを安定発現する哺乳動物細胞系は北京可瑞生物科技有限公司（ＣｏｒｒｅＧｅｎｅ）の協力を依頼して完成された。
【0107】
（１）ＴＥＶｐ過剰発現レンチウイルスベクターの構築：
ＴＥＶｐ過剰発現レンチウイルスベクタークロマトグラムは図１に示される。前記レンチウイルスベクターはピューロマイシン耐性を有する。
ＴＥＶｐ過剰発現レンチウイルスベクタークロマトグラムは図１に示される。前記レンチウイルスベクターはピューロマイシン耐性を有する。
【0108】
（２）レンチウイルスのパッケージング、精製及び定量
[1]０日目細胞接種：２９３Ｔを１０ｃｍ／１５ｃｍ培養皿に接種し（接種数は予期されるウイルス量によって決定され、１×１０8／１５ｃｍ培養皿）、接種密度を制御し、翌日に８０％まで成長して融合した。
[1]０日目細胞接種：２９３Ｔを１０ｃｍ／１５ｃｍ培養皿に接種し（接種数は予期されるウイルス量によって決定され、１×１０8／１５ｃｍ培養皿）、接種密度を制御し、翌日に８０％まで成長して融合した。
【0109】
[2]１日目プラスミドトランスフェクト化：（１）で記載されたＴＥＶｐ過剰発現レンチウイルスベクター、ｐｓＰＡＸ２プラスミド（このプラスミドはａｄｄｇｅｎｅから獲得可能である）とｐＶＳＶＧプラスミド（このプラスミドはａｄｄｇｅｎｅから獲得可能である）を用いて、２９３Ｔ細胞を共トランスフェクトした。
【0110】
[3]２日目液交換：トランスフェクト化１８時間後、液を交換し（トランスフェクト化体系は毒性がある）、培地を完全に吸引除去し、新鮮な完全培地（１５ｃｍ培養皿）２０ｍＬを注意深く添加した。
【0111】
[4]ウイルス上清前処理：３、４と５日目にウイルス上清を収集した後、培養上清を５０ｍＬ遠心分離管に移し、最高回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離した。０．４５μｍフイルタを用いてウイルス上清をろ過し、殺菌後の２５０ｍＬ遠心分離ボトルを直接用いてウイルス上清を収集した。
【0112】
[5]高速遠心分離によるウイルスの精製：２０ｍＬ注射器を用いて１０％ショ糖溶液を遠心分離ボトル底部にゆっくり注入し、体積比４：１（ウイルス上清４部、ショ糖溶液１部）を保持し、４℃、１４０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。
【0113】
[6]ウイルス再懸濁：上清を捨て、きれいに吸引し、１００ｕｌ～１０００ｕｌ ＰＢＳを加え、吸引し、吹いて均一に混合した、
【0114】
[7]ウイルス上清分注、－８０℃冷凍保存、分注時に、３０ｕｌ程度の残量を単独で冷凍保存し、力価測定に用いられるものとした。
【0115】
[8]化学発光法（ＣＭＩＡ）を用いてレンチウイルス力価を測定し、ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ｐｕｒｏ－２Ａ－ＴＥＶｐ－８５３４ｂｐの力価が５．１２Ｅ＋７ＴＵ／ｍＬ、体積が１０００ｕｌ、総量が５．１２Ｅ＋７ＴＵであり、形質導入要求に達したことが確認された。
【0116】
（３）安定モノクローナル細胞系構築
[1]０日目細胞接種：：ＨＥＫ２９３Ｔ又はＭＤＣＫを１２／６ウェル板培養皿に接種し（接種数は予期されるウイルス量によって決定され、１×１０6／６ウェル板培養皿）、接種密度を制御し、翌日に２０～３０％まで成長して融合した。
[1]０日目細胞接種：：ＨＥＫ２９３Ｔ又はＭＤＣＫを１２／６ウェル板培養皿に接種し（接種数は予期されるウイルス量によって決定され、１×１０6／６ウェル板培養皿）、接種密度を制御し、翌日に２０～３０％まで成長して融合した。
【0117】
[2]１日目ウイルス解凍：－８０℃冷蔵庫からウイルスを取り出し、氷上で解凍させた。適切なｍｏｉ（ＭＯＩ＝１０）を用いて細胞を感染させた。
【0118】
[3]２日目ウイルス形質導入：適切なｍｏｉを用いて細胞を２４時間感染させた後、２μｇ／ｍＬ ｐｕｒｏ耐性培地に交換して耐性スクリーニングした。
【0119】
[4]７日程度持続的に耐性スクリーニングした（空白対照全数殺滅）。
【0120】
[5]生存細胞に対して消化・計数を行い、１００個／２００個の細胞を１枚の９６ウェル板に均一に分配した。（平均、各ウェルには１～２個の細胞がある）
【0121】
[6]３～５日にクローナル増殖が見え、モノクローナル細胞孔を選出して増殖させ、段階的に２４ウェル板、１２ウェル板に増殖させた。
【0122】
[7]モノクローナル同定：
同定プライマー
ＴＥＶｐ－Ｆ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１ ＴＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧ
ＴＥＶｐ－Ｒ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２ ＴＡＧＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＣ
断片サイズ：１４４ｂｐ
２９３ｔ－ＧＡＰＤＨ－ｅＦ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３ ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ
２９３ｔ－ＧＡＰＤＨ－ｅＲ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４ ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＴ
断片サイズ：１１４ｂｐ
同定プライマー
ＴＥＶｐ－Ｆ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１ ＴＣＡＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＴＧ
ＴＥＶｐ－Ｒ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２ ＴＡＧＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＣ
断片サイズ：１４４ｂｐ
２９３ｔ－ＧＡＰＤＨ－ｅＦ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５３ ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ
２９３ｔ－ＧＡＰＤＨ－ｅＲ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４ ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡＧＡＧＴ
断片サイズ：１１４ｂｐ
【0123】
好ましいモノクローナル細胞を消化し、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲを同定して、細胞にＴＥＶｐ統合かつ発現があるか否かを検証した。増殖条件は、次の表１に示すとおりである。
【0124】
［表１］
【0125】
結果は図２に示すとおりであり、図２Ａは潜在的ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ細胞に対してＲＴ－ＰＣＲ同定を行う電気泳動図である（矢印が示す細胞は標的遺伝子ＴＥＶｐのｍＲＮＡ発現レベルが比較的高い細胞である）。この検証作業は北京可瑞生物科技有限公司（ＣｏｒｒｅＧｅｎｅ）の協力を依頼して完成された。図２Ｂは潜在的ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞に対してＲＴ－ＰＣＲ同定を行う電気泳動図である（Ｏ（ｏｌｄ）は第一バッチのＭＤＣＫ細胞を表し、Ｎ（ｎｅｗ）は第二バッチのＭＤＣＫ細胞を表し、矢印が示す細胞は標的遺伝子ＴＥＶｐのｍＲＮＡ発現レベルが比較的高い細胞である）。この検証作業は北京可瑞生物科技有限公司（ＣｏｒｒｅＧｅｎｅ）の協力を依頼して完成された。
【0126】
[8]好ましいモノクローナル細胞系増殖培養
好ましくはＴＥＶｐ発現効率が高い細胞系を増殖させ、冷凍保存し、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ及びＭＤＣＫ－ＴＥＶｐと名付けた。
好ましくはＴＥＶｐ発現効率が高い細胞系を増殖させ、冷凍保存し、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ及びＭＤＣＫ－ＴＥＶｐと名付けた。
【0127】
結果は図３に示すとおりであり、抗－ＴＥＶｐの抗体を用いてＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞系に対してｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ検測を行い、結果から、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐとＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ安定細胞系において、ＴＥＶプロテアーゼＴＥＶｐを効率的に安定発現できることが分かった。なお、細胞を修飾することはウイルス生産効率の変化を引き起こさないので、細胞におけるＴＥＶｐの互換性が説明された。
【実施例2】
【0128】
実施例２：切断可能なタンパク質加水分解標的分子を含むインフルエンザウイルスＷＳＮの遺伝子ベクターの構築
（１）野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするプラスミドの獲得：
ｐｕｂｍｅｄによって公布されたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３の遺伝子配列ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ２、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ１、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＨＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＰ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋Ｍ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＳに基づいて、全遺伝子合成を経て、このインフルエンザウイルス各遺伝子断片の遺伝子を得た。そして、それをｐＨＨ２１、ｐＣＤＮＡ３（ｎｅｏ）、ｐｃＡＡＧＧＳ／ＭＣＳベクターにそれぞれ接続し（北京中科裕博生物技術有限公司から得られた）、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするプラスミドを得た。得られたプラスミドの名付け及び組成は、表２に示すとおりである。
（１）野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするプラスミドの獲得：
ｐｕｂｍｅｄによって公布されたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３の遺伝子配列ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ２、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＢ１、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＰＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＨＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＡ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＰ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋Ｍ、
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／？ｔｅｒｍ＝ＷＳＮ＋ＮＳに基づいて、全遺伝子合成を経て、このインフルエンザウイルス各遺伝子断片の遺伝子を得た。そして、それをｐＨＨ２１、ｐＣＤＮＡ３（ｎｅｏ）、ｐｃＡＡＧＧＳ／ＭＣＳベクターにそれぞれ接続し（北京中科裕博生物技術有限公司から得られた）、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするプラスミドを得た。得られたプラスミドの名付け及び組成は、表２に示すとおりである。
【0129】
［表２］
【0130】
（２）切断可能なタンパク質加水分解標的分子を導入したウイルスベクターの構築
発明者は、インフルエンザウイルスＷＳＮの各ウイルスタンパク質（ＰＡ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ）に対応する遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＴＥＶｐによって切断可能なタンパク質加水分解標的分子の遺伝子配列をそれぞれ導入し、且つ次のウイルスベクターを構築した。
発明者は、インフルエンザウイルスＷＳＮの各ウイルスタンパク質（ＰＡ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＥＰ）に対応する遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＴＥＶｐによって切断可能なタンパク質加水分解標的分子の遺伝子配列をそれぞれ導入し、且つ次のウイルスベクターを構築した。
【0131】
具体的には、前記ＴＥＶｐによって切断可能なタンパク質加水分解標的分子をウイルスのいずれか１つのタンパク質に導入する遺伝子配列及びその発現するアミノ酸配列は、以下のとおりであるが、以下の配列に限定されるものではない。使用したアミノ酸配列に対応する遺伝子配列をヒト化最適化し、そして目標タンパク質遺伝子のコーディング領域Ｃ端、終止コドンの前に挿入した。この作業は北京▲けい▼科生物科技有限公司の協力を依頼して完成され、且つ配列測定によって突然変異の構築に成功したことを検証した。ここで、
１）インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８に示される配列を導入し、即ち、そのＰＡタンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５に示されるヌクレオシド配列を導入し、ＰＡ－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１と名付けた（又はＰＡ－ＰＴＤ１と名付けた）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８
ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＡＬＡＰＹＩＰ、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５
ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴ ＣＴＧＴＡＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＴＴＣＣＡ、
１）インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８に示される配列を導入し、即ち、そのＰＡタンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５に示されるヌクレオシド配列を導入し、ＰＡ－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１と名付けた（又はＰＡ－ＰＴＤ１と名付けた）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８
ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＡＬＡＰＹＩＰ、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５
ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴ ＣＴＧＴＡＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＡ ＴＴＧ ＧＣＣ ＣＣＣ ＴＡＣ ＡＴＴＣＣＡ、
【0132】
２）同様に、インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８に示される配列を導入し、即ち、そのＰＡタンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５５に示されるヌクレオシド配列を導入し、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１と名付けた（又はＭ１－ＰＴＤ１と名付けた）。
【0133】
３）インフルエンザウイルスのＰＢ１タンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９に示される配列を導入し、即ち、そのＰＢ１タンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６に示されるヌクレオシド配列を導入し、ＰＢ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２としてマークした（又はＰＢ１－ＰＴＤ２と名付けた）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９
ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６ ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧＴＡＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９
ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６ ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧＴＡＣ ＴＴＣ ＣＡＡ ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴ ＣＧＣ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＧＧ ＣＴＣ ＧＡＴ ＴＣＣ ＡＴＧ
【0134】
４）インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９に示される配列を導入し、即ち、そのＰＢ２タンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６に示されるヌクレオシド配列を導入し、ＰＢ２－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２としてマークした（又はＰＢ２－ＰＴＤ２と名付けた）。
【0135】
５）インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９に示される配列を導入し、即ち、そのＭ１タンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５６に示されるヌクレオシド配列を導入し、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２としてマークした（又はＭ１－ＰＴＤ２と名付けた）。
【0136】
６）インフルエンザウイルスのＰＡタンパク質のＣ末端に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０に示される配列を導入し、即ち、そのＰＡタンパク質遺伝子コーディング領域のＣ末端、終止コドンの前に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７に示されるヌクレオシド配列を導入し、ＰＡ－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－３と名付けた（又はＰＡ－ＰＴＤ３と名付けた）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０：ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７ ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０：ＧＳＧＧＥＮＬＹＦＱＧＧＧＧＳＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７ ＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＴＣＡＡＴＧＴＧ
【0137】
７）ＰＡ－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１（ＰＡ－ＰＴＤ１）とＰＢ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２（ＰＢ１－ＰＴＤ２）とを組み合わせ、ＰＡとＰＢ１とにおいて１つの切断可能なタンパク質加水分解分子をそれぞれ担持するウイルスを構築した。
【0138】
さらに、発明者は以下のウイルスベクターを構築した。
【0139】
［表３］
［表３］
［表３］
【実施例3】
【0140】
実施例３：部位特異的突然変異による修飾後のＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスのレスキュー
正常なインフルエンザウイルスをレスキューする方法に従って、インフルエンザウイルスをレスキューするために用いられる１２個のプラスミドを安定細胞系に共トランスフェクトし、実施例２における部位特異的突然変異に修飾されたプラスミドを用いてこの１２個のプラスミドにおける相応なプラスミドを置換した。六ウェル板の各ウェルに対応して、プラスミドごとに０．２μｇを加えた。トランスフェクトされた後、細胞の病変状況を観察し、ウイルスをレスキューすることができ、且つＴＥＶｐに対して依存性を有する挿入部位、タンパク質加水分解標的分子、ＴＥＶｐによって切断可能な連結鎖ｌｉｎｋｅｒ、及びそれらの組み合わせをスクリーニングした。スクリーニングされた毒株は、タンパク質及び導入された切断可能なタンパク質加水分解標的分子に基づいて名付けられた。
正常なインフルエンザウイルスをレスキューする方法に従って、インフルエンザウイルスをレスキューするために用いられる１２個のプラスミドを安定細胞系に共トランスフェクトし、実施例２における部位特異的突然変異に修飾されたプラスミドを用いてこの１２個のプラスミドにおける相応なプラスミドを置換した。六ウェル板の各ウェルに対応して、プラスミドごとに０．２μｇを加えた。トランスフェクトされた後、細胞の病変状況を観察し、ウイルスをレスキューすることができ、且つＴＥＶｐに対して依存性を有する挿入部位、タンパク質加水分解標的分子、ＴＥＶｐによって切断可能な連結鎖ｌｉｎｋｅｒ、及びそれらの組み合わせをスクリーニングした。スクリーニングされた毒株は、タンパク質及び導入された切断可能なタンパク質加水分解標的分子に基づいて名付けられた。
【0141】
例証として、Ｂｅｎ３ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＡプラスミド上に切断可能なタンパク質加水分解標的分子ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を導入した後、このプラスミドとインフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドＢｅｎ１ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＢ２；Ｂｅｎ２ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＢ１；Ｂｅｎ４ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＨＡ；Ｂｅｎ５ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＰ；Ｂｅｎ６ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＡ；Ｂｅｎ７ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－Ｍ；Ｂｅｎ８ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＳ；Ｂｅｎ９ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＢ２；Ｂｅｎ１０ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＢ１；Ｂｅｎ１１ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＡ、Ｂｅｎ１３ ｐｃＡＧＧＳ／ＭＣＳ－ＮＰを、実施例１で構築した安定細胞系に共トランスフェクトすることによって、インフルエンザウイルスＰＡ遺伝子断片上にＴＥＶＣｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を導入した変異型インフルエンザウイルスをレスキューし、ＰＡ－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１と名付けた（又はＰＡ－ＰＴＤ１と名付けた）。Ｂｅｎ７ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－Ｍプラスミド上のＭ１タンパク質のコーディング領域Ｃ末端に切断可能なタンパク質加水分解標的分子ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を導入した後に、このプラスミドとインフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドＢｅｎ１ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＢ２；Ｂｅｎ２ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＢ１；Ｂｅｎ３ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＰＡ；Ｂｅｎ４ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＨＡ；Ｂｅｎ５ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＰ；Ｂｅｎ６ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＡ；Ｂｅｎ８ ｐＰｏｌＩ－ＷＳＮ－ＮＳ；Ｂｅｎ９ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＢ２；Ｂｅｎ１０ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＢ１；Ｂｅｎ１１ ｐｃＤＮＡ ３ （ｎｅｏ）－ＰＡ、Ｂｅｎ１３ ｐｃＡＧＧＳ／ＭＣＳ－ＮＰを、実施例１で構築した安定細胞系に共トランスフェクトすることによって、インフルエンザウイルスＭ１遺伝子断片上にＴＥＶＣｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を導入した突然変異型インフルエンザウイルスをレスキューし、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１と名付けた（又はＭ１－ＰＴＤ１と名付けた）。
【0142】
同様の方法で、他の部位に切断可能なタンパク質加水分解標的分子を導入した突然変異型インフルエンザウイルスを取得することができ、同じルールに従って名付ける。
【0143】
構築した全てのＰＲＯＴＡＣウイルスベクターに対して、細胞病変を誘発することができるか否かの基準に従って考察した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ及び／又はＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞病変を誘発することができれば、このＰＲＯＴＡＣウイルスレスキューに成功したことが説明され、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＥＶｐ及び／又はＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞病変を誘発することができなければ、このＰＲＯＴＡＣウイルスレスキューに失敗したことが説明される。一部の突然変異型インフルエンザウイルスのレスキュー状況を例として、表４と図４に示す。表４は、ＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞の病変を誘発することができるＰＲＯＴＡＣインフルエンザ毒株の一部をまとめたものである。図４には、一部の毒株がＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞及び正常ＭＤＣＫ細胞に接種された後（ＭＯＩ＝０．０１）、感染翌日に、検出された細胞上清におけるウイルス力価を示す。上記の結果で、インフルエンザウイルスの８つの遺伝子断片には、いずれも選択的に切断可能なタンパク質加水分解標的分子を導入することができ、ここで、ＰＡ、ＰＢ２、ＰＢ１、Ｍ１などは、いずれもＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスをレスキューすることができることが説明かされた。
【0144】
［表４］
【0145】
発明者は、上記突然変異部位、切断可能なタンパク質加水分解標的分子から、インフルエンザウイルスをレスキューする効率が高く、遺伝安定、且つ正常な宿主細胞において最終複製能力が著しく低下し、甚だしきに至っては完全に失われてしまう突然変異修飾を選択して組み合わせ、複数のタンパク質加水分解標的分子を含有するインフルエンザウイルスを作製し、そして、好ましい毒株をさらに選択し、それぞれＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１＋ＰＲＯＴＡＣ－２（又はＭ１－ＰＴＤ６）、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２＋ＰＲＯＴＡＣ－１（又はＭ１－ＰＴＤ５）、ＰＲＯＴＡＣ－Ｖ１（表４と図５）と名付けた。前記Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１＋ＰＲＯＴＡＣ－２は、ウイルスのＭ１タンパク質のＣ末端に直列のＰＲＯＴＡＣ－１とＰＲＯＴＡＣ－２を導入して作製された２種類のタンパク質加水分解標的分子を含有するＰＲＯＴＡＣ毒株であった。Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２＋ＰＲＯＴＡＣ－１は、ウイルスのＭ１タンパク質のＣ末端に直列のＰＲＯＴＡＣ－２とＰＲＯＴＡＣ－１を導入して作製された２種類のタンパク質加水分解標的分子を含有するＰＲＯＴＡＣ毒株であった。ＰＲＯＴＡＣ－Ｖ１は、ウイルスのＰＡタンパク質のＣ末端にＴＥＶｃｓ－ＰＲＯＴＡＣ－１を導入し、ウイルスのＰＢ１タンパク質のＣ末端にＴＥＶｃｓ－ＰＲＯＴＡＣ－２を導入して作製された２種類のタンパク質加水分解標的分子を含有するＰＲＯＴＡＣ毒株（表４）であり、さらに、図１１は本発明の方法によってタンパク質加水分解標的ウイルスを作製するフローチャートを提供した。
【実施例4】
【0146】
実施例４：部位特異的突然変異のインフルエンザウイルスの発現と精製
１）切断可能なタンパク質加水分解標的分子を含有するＰＲＯＴＡＣウイルスのレスキュー
実施例３のステップで部位特異的突然変異によって修飾された後のインフルエンザウイルスのレスキューで得られた突然変異型インフルエンザウイルスパッケージングプラスミドを、実施例１の安定細胞系に共トランスフェクトし、６時間後、新しい培地に交換し、培地には１％のＦＢＳと２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有し、そして、正常な細胞を対照とした。このレスキュー実験に用いた陽性対照は、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮであり、ウイルスをレスキューするプラスミドが異なる以外の条件は、突然変異型インフルエンザウイルスのレスキューと同じであった。トランスフェクト化完了後、細胞の状態を毎日観察し、ＴＥＶｐ安定細胞系に病変が発生したが、正常な細胞に病変が発生せず、又は病変が比較的少ない突然変異体を陽性突然変異体とした。野生型インフルエンザウイルスはＴＥＶｐ安定細胞系と正常な細胞系において、いずれも病変が発生した。
１）切断可能なタンパク質加水分解標的分子を含有するＰＲＯＴＡＣウイルスのレスキュー
実施例３のステップで部位特異的突然変異によって修飾された後のインフルエンザウイルスのレスキューで得られた突然変異型インフルエンザウイルスパッケージングプラスミドを、実施例１の安定細胞系に共トランスフェクトし、６時間後、新しい培地に交換し、培地には１％のＦＢＳと２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有し、そして、正常な細胞を対照とした。このレスキュー実験に用いた陽性対照は、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮであり、ウイルスをレスキューするプラスミドが異なる以外の条件は、突然変異型インフルエンザウイルスのレスキューと同じであった。トランスフェクト化完了後、細胞の状態を毎日観察し、ＴＥＶｐ安定細胞系に病変が発生したが、正常な細胞に病変が発生せず、又は病変が比較的少ない突然変異体を陽性突然変異体とした。野生型インフルエンザウイルスはＴＥＶｐ安定細胞系と正常な細胞系において、いずれも病変が発生した。
【0147】
２）ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスの精製
ａ．ステップ１）突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスをレスキューする安定細胞系が完全に病変した時、又はトランスフェクト化約４日後、細胞上清を収集し、５０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、新しい安定細胞系を用いて大量増殖させ、細胞完全病変又は増殖約４日後、細胞上清を収集し、０．４５μｍの濾膜で濾過した。
ｂ．ショ糖勾配勾配密度遠心分離の方法を用いてインフルエンザウイルスを精製した。具体的なステップは、１）のウイルス液を５０ｍＬ遠心分離管（高速専用）で、１０5ｇで２ｈ遠心分離し、沈殿物を１ｍＬＰＢＳで再懸濁した。
ｃ．ショ糖をＮＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解し、２０％ショ糖溶液を調製し、０．４５μｍ濾膜で濾過した。
ｄ．ステップ３）のショ糖を５０ｍＬ又は１５ｍＬ遠心分離管に加え、２）のＰＢＳ再懸濁液をショ糖溶液に滴下した。１１×１０4ｇ、２ｈ遠心分離した。
ｅ．沈殿物にＮＴＥ ｂｕｆｆｅｒを約１５ｍＬ加え、１１×１０4ｇ、２ｈ遠心分離を継続した。
ｆ．ステップ５）の沈殿物をＰＢＳで再懸濁した。
ａ．ステップ１）突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスをレスキューする安定細胞系が完全に病変した時、又はトランスフェクト化約４日後、細胞上清を収集し、５０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、新しい安定細胞系を用いて大量増殖させ、細胞完全病変又は増殖約４日後、細胞上清を収集し、０．４５μｍの濾膜で濾過した。
ｂ．ショ糖勾配勾配密度遠心分離の方法を用いてインフルエンザウイルスを精製した。具体的なステップは、１）のウイルス液を５０ｍＬ遠心分離管（高速専用）で、１０5ｇで２ｈ遠心分離し、沈殿物を１ｍＬＰＢＳで再懸濁した。
ｃ．ショ糖をＮＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解し、２０％ショ糖溶液を調製し、０．４５μｍ濾膜で濾過した。
ｄ．ステップ３）のショ糖を５０ｍＬ又は１５ｍＬ遠心分離管に加え、２）のＰＢＳ再懸濁液をショ糖溶液に滴下した。１１×１０4ｇ、２ｈ遠心分離した。
ｅ．沈殿物にＮＴＥ ｂｕｆｆｅｒを約１５ｍＬ加え、１１×１０4ｇ、２ｈ遠心分離を継続した。
ｆ．ステップ５）の沈殿物をＰＢＳで再懸濁した。
【実施例5】
【0148】
実施例５：タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルスの細胞レベルにおける安全性考察
発明者は、作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１＋ＰＲＯＴＡＣ－２、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２＋ＰＲＯＴＡＣ－１に対してＴＥＶｐタンパク質の依存性考察を行うことにより、ＰＲＯＴＡＣウイルスの安全性を検証した。長期にわたる継代培養を行うことにより、この突然変異型ウイルスにおける切断可能なタンパク質加水分解標的分子の安定性を考察した。
発明者は、作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１＋ＰＲＯＴＡＣ－２、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２＋ＰＲＯＴＡＣ－１に対してＴＥＶｐタンパク質の依存性考察を行うことにより、ＰＲＯＴＡＣウイルスの安全性を検証した。長期にわたる継代培養を行うことにより、この突然変異型ウイルスにおける切断可能なタンパク質加水分解標的分子の安定性を考察した。
【0149】
具体的な実験１：作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスをＭＯＩ＝０．０１の割合に従ってＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞と正常なＭＤＣＫ細胞に感染させ、３～４日後に上清を取って、ウイルスの力価を検出し、ＰＲＯＴＡＣウイルスのＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞におけるウイルス力価を１００％とし、ＰＲＯＴＡＣウイルスのＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞と正常なＭＤＣＫ細胞における相対ウイルス力価を比較すると、ウイルスの２種類の細胞における複製能力差別が分かった。
【0150】
具体的な実験２：新たに作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスをＭＯＩ＝０．０１の割合に従って新しい培地に接種して安定系細胞に感染させ、培地には１％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬのＴＰＣＫ－ｔｒｙｐｓｉｎを含有し、正常な細胞系を対照とした。ＴＥＶｐ安定細胞系が完全に病変した時、上清を取り出し、０．４５μｍの濾膜で濾過し、ＭＯＩ＝０．０１の割合に従って新しい培地に接種して安定系細胞に感染させ、同様に正常な細胞系を対照とした。このように繰り返して、長期にわたるウイルス継代を行った。導入されたタンパク質加水分解標的分子に突然変異が発生したか否かを遺伝子シーケンシングにより検出した。
【0151】
図６から分かるように、ＰＲＯＴＡＣウイルスはＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞において複製増殖可能であるが、正常なＭＤＣＫ細胞において複製能力が著しく低下し、甚だしきに至っては複製不可能になった。即ち、ＴＥＶｐに対する依存性があり、このウイルスが安全なものであることが説明された。図７から分かるように、長期にわたる継代を経て、突然変異型ＰＲＯＴＡＣウイルス毒株に導入されたタンパク質加水分解標的分子は突然変異しなかった。上記の結果から分かるように、インフルエンザウイルス遺伝子に導入された切断可能なタンパク質加水分解標的分子は安定に存在するものであり、さらに遺伝上で安定なものであった。
【実施例6】
【0152】
実施例６．タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス複製能力の減弱が細胞のプロテアソームによって制御されるか否かを考察する
発明者は、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１とＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２を代表的な毒株とし、設計したＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスの正常な細胞における複製能力の減弱が細胞内のユビキチン－プロテアソーム系によって媒介されるか否かを考察した。
発明者は、Ｍ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１とＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２を代表的な毒株とし、設計したＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルスの正常な細胞における複製能力の減弱が細胞内のユビキチン－プロテアソーム系によって媒介されるか否かを考察した。
【0153】
具体的な実験１：作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス又は野生型ウイルスを正常なＭＤＣＫ細胞（ＭＯＩ＝０．１）に感染させ、培地に１００ｎＭプロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２又は同じ希釈割合のＤＭＳＯを補充して対照とした。それぞれ感染後の２４時間と４８時間に、細胞サンプルを収集し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いてウイルスＭ１タンパク質レベルを検出した。
【0154】
具体的な実験２：作製した突然変異型ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス又は野生型ウイルスをＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞と正常なＭＤＣＫ細胞（ＭＯＩ＝０．０１）に感染させ、培地に異なる濃度（０、５０、又は１００ｎＭ）のプロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２又は同じ希釈割合のＤＭＳＯを補充して対照とした。感染後４８時間に、細胞を４％ＰＦＡで固定し、免疫蛍光実験を用いてウイルスＮＰタンパク質レベルを検出した。
【0155】
図８から分かるように、野生型ウイルスはＭＤＣＫ細胞に感染した後、大量に複製することができ、大量のウイルスタンパク質を産生した。これに対して、ＰＲＯＴＡＣウイルスのウイルスタンパク質Ｍ１上にタンパク質加水分解標的分子ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１又はＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－２を修飾した後、感染後４８時間後、ウイルスのＭ１タンパク質が分解され、一方、培地にプロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２を加えると、プロテアソームによって媒介されるウイルスタンパク質Ｍ１の分解が抑制された。この実験結果から分かるように、発明者が導入したタンパク質加水分解標的分子はウイルスタンパク質分解を媒介することができ、ＰＲＯＴＡＣウイルスの正常な細胞における複製能力の低下はプロテアソームによって媒介されるウイルスタンパク質の分解によることであり、発明者の原理と合致した。
【0156】
図９の免疫蛍光実験結果から分かるように、ＰＲＯＴＡＣウイルスはＭＤＣＫ－ＴＥＶｐ細胞に感染した後に、大量複製し、大量のウイルスタンパク質を合成することができる。ＰＲＯＴＡＣウイルスは正常なＭＤＣＫ細胞に感染した後、大量複製できないため、比較的少ないウイルスタンパク質ＮＰのシグナルを検出した。一方、細胞のプロテアソーム系が抑制されると、ウイルスタンパク質ＮＰのシグナルが増加し、プロテアソーム系が抑制されると、ウイルスの複製能力が増強されることが説明された。この結果は図８の結果と一致しており、さらに、タンパク質加水分解標的分子の導入が細胞のプロテアソームのウイルスタンパク質に対する分解を媒介して、ウイルスの複製能力をさらに抑制することができ、細胞のプロテアソーム系が抑制されると、ウイルスの複製能力が回復できることが証明された。
【0157】
上記結果から分かるように、ＰＲＯＴＡＣウイルスの複製能力の低下又は欠損は細胞のユビキチン－プロテアソーム系によって媒介されることであった。発明者のＰＲＯＴＡＣウイルスについての設計期待と合致した。
【実施例7】
【0158】
実施例７．タンパク質加水分解標的インフルエンザウイルス（ＰＲＯＴＡＣインフルエンザウイルス）の動物レベルにおける免疫原性と保護性の考察
本研究では、フェレットｆｅｒｒｅｔ（中国江蘇無錫Ｃａｙフェレット農場提供）を用いてＰＲＯＴＡＣウイルスの動物レベルにおける免疫原性と有効性を評価した。不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）（不活化インフルエンザウイルスワクチンは発明者が中国薬局方に提供した方法に従って同質性インフルエンザウイルス粒子を用いて作製したものであった）を対照とし、ＰＲＯＴＡＣウイルスの代表としてＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を選択し、ＰＲＯＴＡＣウイルスの免疫原性と保護性評価を行った。
本研究では、フェレットｆｅｒｒｅｔ（中国江蘇無錫Ｃａｙフェレット農場提供）を用いてＰＲＯＴＡＣウイルスの動物レベルにおける免疫原性と有効性を評価した。不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）（不活化インフルエンザウイルスワクチンは発明者が中国薬局方に提供した方法に従って同質性インフルエンザウイルス粒子を用いて作製したものであった）を対照とし、ＰＲＯＴＡＣウイルスの代表としてＭ１－ＴＥＶｃｓ＋ＰＲＯＴＡＣ－１を選択し、ＰＲＯＴＡＣウイルスの免疫原性と保護性評価を行った。
【0159】
具体的な実験：
１）４～６ヶ月齢の雌フェレット９匹を３群に分け、各群３匹とした。
２）ウイルスワクチン接種：第一群はＰＢＳを点鼻接種し、第二群は１０5 ＰＦＵ Ｍ１－ＴＥＶｃｓ－ＰＲＯＴＡＣ－１を点鼻接種し、第三群は同じ用量の不活化ウイルスを接種した。
３）接種三週間後、凝血抑制（ＨＩ）試験、中和性（ＮＴ）抗体検出のために、各群から血清を採取した。
４）接種三週間後、各群の動物に１０7ＰＦＵの野生型ウイルスＷＳＮを経鼻接種した。
５）野生型ウイルス接種３日後、その肺組織を採取し、プラーク実験によりウイルス含有量を測定した。
１）４～６ヶ月齢の雌フェレット９匹を３群に分け、各群３匹とした。
２）ウイルスワクチン接種：第一群はＰＢＳを点鼻接種し、第二群は１０5 ＰＦＵ Ｍ１－ＴＥＶｃｓ－ＰＲＯＴＡＣ－１を点鼻接種し、第三群は同じ用量の不活化ウイルスを接種した。
３）接種三週間後、凝血抑制（ＨＩ）試験、中和性（ＮＴ）抗体検出のために、各群から血清を採取した。
４）接種三週間後、各群の動物に１０7ＰＦＵの野生型ウイルスＷＳＮを経鼻接種した。
５）野生型ウイルス接種３日後、その肺組織を採取し、プラーク実験によりウイルス含有量を測定した。
【0160】
その結果は、図１０に示されるように、ＰＲＯＴＡＣウイルスは動物体内で高レベルの凝血抑制抗体力価（Ａ）と中和性抗体力価（Ｂ）を誘導することができる。ＰＲＯＴＡＣウイルスによって誘導される凝血抑制抗体と中和性抗体レベルは、不活化ワクチンによって誘導される抗体レベルよりかなり高い。ＰＲＯＴＡＣウイルスワクチンの接種は、動物の肺組織中の野生型ウイルス力価（Ｃ）を著しく減少させることができ、ＰＲＯＴＡＣウイルスワクチンにより提供される保護性は、不活化ワクチンよりも著しく優れる。
【0161】
以上の説明は、本発明のいくつかの実施形態に過ぎない。当業者であれば、本発明の前記原理から逸脱しない前提で様々な変形及び改良を行ってもよく、これらの変形及び改良も本発明の保護範囲に含まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】