▶ オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-06
(54)【発明の名称】皮膚脳相関を利用する神経変性疾患療法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220830BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220830BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220830BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220830BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20220830BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220830BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220830BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220830BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220830BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
A61K31/7088
A61K48/00
A61P25/00
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/14
A61P21/00
A61P35/00
A61P9/00
A61P9/10
A61K31/713
A61K31/7105
A61K45/00
A61K9/127
A61K35/76
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576648
(86)(22)【出願日】2020-07-02
(85)【翻訳文提出日】2022-02-22
(86)【国際出願番号】 US2020040721
(87)【国際公開番号】W WO2021003403
(87)【国際公開日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】62/869,788
(32)【優先日】2019-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514137997
【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ギャレゴ－ペレス，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】イギータ－カストロ，ナタリア
(72)【発明者】
【氏名】ローレンス，ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】コレア，ディエゴ アルザテ
【テーマコード（参考）】
2G045
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045AA25
2G045CB01
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045FB02
2G045FB03
4C076AA19
4C076CC01
4C076CC11
4C076CC27
4C076FF34
4C084AA13
4C084AA17
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4C084NA14
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4C084ZA94
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA24
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZA36
4C086ZA94
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4C087AA01
4C087CA12
4C087CA20
4C087MA24
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA15
4C087ZA16
4C087ZA36
4C087ZA94
4C087ZB26
(57)【要約】
本明細書に開示されるように、皮膚は、エクソソームの形態で脳にシグナルを送ることができ、これは、本明細書において「皮膚脳相関」と称される。したがって、対象における脳疾患、障害、または損傷を診断するための方法であって、対象からエクソソームを単離することと、疾患、障害、または損傷の１つ以上のバイオマーカーの存在についてエクソソームをアッセイすることとを含む方法が、本明細書に開示される。対象の皮膚を操作して治療用エクソソームを産生することを含む脳疾患、障害、または損傷を有する対象を治療する方法もまた開示される。皮膚で産生されたエクソソームを収集し、脳の１つ以上の疾患、障害、または損傷を治療することができる治療用カーゴをそれらに充填する方法もまた開示される。本明細書ではまた、皮膚からのエクソソーム放出を減少させて、脳への輸送を減少させる方法も開示される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における神経変性疾患を診断するための方法であって、前記対象からエクソソームを単離することと、前記エクソソームを、神経変性疾患の１つ以上のバイオマーカーの存在、または脳障害、疾患、もしくは損傷に関連する１つ以上の経路の調節異常についてアッセイすることと、を含む、方法。
【請求項2】
前記バイオマーカーが、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＭＡＰＫ１３、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記バイオマーカーが、ＡＰＰ、Ａβ、もしくはＴａｕ、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記バイオマーカーが、ＭＡＰＴ、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＫＡＰ５、ＡＱＰ１、ＡＲＣ、ＣＡＭＫ２Ａ、ＣＡＳＰ４、ＣＬＥＣ３Ｂ、ＦＡＡＨ、ＧＲＩＮ１、ＨＤＡＣ９、ＭＡＰ２Ｋ３、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ｂ、ＳＬＣ１６Ａ６、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ３０Ａ３、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ３９Ａ３、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記バイオマーカーが、Ａｂａｔ、Ａｄａｍｔｓ９、Ａｄｓｓ、Ａｋａｐ５、Ａｌｏｘ１２ｂ、Ａｎｋｒｄ５５、Ａｑｐ１、Ａｒｃ、Ａｓｂ２、Ａｔｐ６ｖ１ｂ２、Ｂａｔｆ、Ｃａｄｐｓ２、Ｃａｍｋ２ａ、Ｃａｓｐ４、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｄ１４、Ｃｄ９３、Ｃｅｓ１ｄ、Ｃｆｉ、Ｃｈｓｔ３、Ｃｌｅｃ３ｂ、Ｃｐｎｅ７、Ｃｐｔ１ｂ、Ｃｒｔｃ２、Ｃｘｃｌ１４、Ｄｈｃｒ２４、Ｄｓｃ２、Ｄｔｎａ、Ｄｕｓｐ１、Ｅｅｆ２ｋ、Ｅｌｏｖｌ６、Ｅｐｈａ２、Ｅｐｈａ４、Ｆ３、Ｆａａｈ、Ｆｂｘｏ２７、Ｆｂｘｗ９、Ｆｋｂｐ５、Ｆｎｄｃ５、Ｆｎｄｃ９、Ｇａｂｒａ３、Ｇｂａ、Ｇｃｎｔ２、Ｇｇｃｔ、Ｇｇｐｓ１、Ｇｒｉｎ１、Ｇｓｔｏ１、Ｈｄａｃ９、Ｈｍｏｘ１、Ｉｃａｍ１、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ３１ｒａ、Ｉｒｆ１、Ｉｔｓｎ２、Ｋｉｆ９、Ｌａｍａ５、Ｌｄｂ３、Ｌｅｐ、Ｌｏｒ、Ｌｒｒｃ３９、Ｍａｌａｔ１、Ｍａｐ２ｋ３、Ｍｆａｐ４、Ｍｆｎｇ、Ｍｙｂｐｃ２、Ｍｙｏ５ｂ、Ｍｙｏｔ、Ｎａｌｃｎ、Ｎａｐ１ｌ５、Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｎｈｌｒｃ１、Ｎｏｓ２、Ｏｇｎ、Ｐｃｌｏ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｐｅｃａｍ１、Ｐｅｒ２、Ｐｆｋｍ、Ｐｇｒ、Ｐｉｅｚｏ１、Ｐｉｋ３ｃｇ、Ｐｉｍ１、Ｐｌａｕｒ、Ｐｌｄ３、Ｐｌｋ２、Ｐｍｍ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒａｂ３ｃ、Ｒｂｆｏｘ１、Ｒｈｅｂｌ１、Ｒｎａｓｅ２ｂ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｓ１００ｂ、Ｓｅｌｐ、Ｓｌｃ１６ａ６、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ２５ａ４、Ｓｌｃ３０ａ３、Ｓｌｃ３８ａ２、Ｓｌｃ３９ａ３、Ｓｍｔｎ、Ｓｏｗａｈｃ、Ｓｐｏｎ２、Ｓｐｐ１、Ｓｔ３ｇａｌ３、Ｓｔｋ３６、Ｓｔｏｍｌ１、Ｓｔｘ１１、Ｔａｃｓｔｄ２、Ｔｂｌ１ｘ、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｔｅｐ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｍｅｍ１９８、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｔｏｂ２、Ｔｒｉｍ４５、Ｔｒｉｍ５４、Ｕｎｃ５ｄ、Ｖｉｐｒ１、Ｚｂｔｂ１６、およびＺｃ３ｈ１２ｃ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアルツハイマー病のバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記脳疾患が、神経変性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病（ＨＤ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記脳疾患が、脳がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記脳疾患が、脳卒中または虚血である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記脳損傷が、外傷性脳損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
脳疾患、障害または損傷を有する対象を治療するための方法であって、前記対象の皮膚細胞に治療用遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを細胞内送達して、前記治療用遺伝子またはその遺伝子発現産物を含む皮膚由来エクソソームを産生することを含む、方法。
【請求項12】
前記脳疾患が、神経変性疾患である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病（ＨＤ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記脳疾患が、脳腫瘍である、請求項１１に記載の方法。
【請求項15】
前記脳疾患が、脳卒中または虚血である、請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
前記脳損傷が、外傷性脳損傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項17】
前記治療用遺伝子が、血管新生因子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
前記血管新生因子が、Ｅｔｖ２、Ｆｌｉ１、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＤ、ｂＦＧＦ、Ｓｏｘ１７、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記治療用遺伝子が、神経原性因子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
前記神経原性因子が、Ａｓｃｌ１、Ａｓｃｌ２、Ａｓｃｌ３、Ａｓｃｌ５、Ｎｅｕｒｏｇ１、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｎｅｕｒｏｇ３、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｎｅｕｒｏｄ２、Ｎｅｕｒｏｄ４、Ｎｅｕｒｏｄ６、Ａｔｏｈ１、Ａｔｏｈ７、Ａｔｏｈ８、Ｍｙｆ５、Ｐｔｆ１ａ、Ｂｒｎ３ｃ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｂｒｎ１、Ｂｒｎ２、Ｂｒｎ４、Ｏｃｔ４、Ｏｃｔ６、Ｐｉｔ１、Ｂｒｎ５、Ｍｙｔ１ｌ、およびＮｕｒｒ１、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記治療用遺伝子が、ＡＰＰを阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４２２、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７１９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｆ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８５、およびｈｓａ－ｍｉＲ－６８１３－５ｐ、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記治療用遺伝子が、ＭＡＰＴを阻害するｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項24】
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２８－５ｐ、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３９７８、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記治療用遺伝子が、抗炎症性遺伝子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項26】
前記抗炎症性遺伝子が、ＰＰＡＲγ、Ｉｌ－１０、Ｉｌ－２７、Ｔｒｅｍ２、およびＩｋＢα、およびＳｉｒｔ１、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記治療用遺伝子が、炎症促進性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項28】
前記炎症促進性遺伝子が、Ｐ２Ｘ４Ｒ、ＴＬＲ４、ＣＸ３ＣＲ１、またはＩＬ－１βである、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
対象の神経疾患を治療するための方法であって、前記対象の皮膚に、前記皮膚からのエクソソーム放出を阻害して、脳への輸送を減少させる薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項30】
前記薬剤が、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤である、請求項２９に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２日に出願された米国仮出願第６２／８６９，７８８号の権益を主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年７月２日に出願された米国仮出願第６２／８６９，７８８号の権益を主張する。
【背景技術】
【0002】
アミロイド症は、特定の臓器または組織における全身的または局所的な凝集および沈着のいずれかをもたらす、タンパク質のβ形成シート原線維への毒性のミスフォールディングによって特徴付けられる一群の病態を指す（Ｍｅｒｌｉｎｉ，Ｇ．＆Ｂｅｌｌｏｔｔｉ，Ｖ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３ ３４９：５８３－５９６）。アミロイド沈着物を形成する多数のタンパク質およびペプチドは、いくつかの臓器を標的とする複数のヒト疾患と関連している（Ｃｈｉｔｉ，Ｆ．＆Ｄｏｂｓｏｎ，ＣＭ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１７ ８６：２７－６８）。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患は、いずれも、特徴的な病原性アミロイドタンパク質が脳内に凝集する局所アミロイド症とみなされる（Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ，Ｊ．－Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１０ ８５：１－１７）。
【0003】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶喪失ならびに認知機能および実行機能の進行性の障害を特徴とする神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な形態を構成し、現在世界中の５０００万人以上に影響を及ぼしている（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｅｍｅｎｔ．２０２０ ｄｏｉ：１０．１００２／ａｌｚ．１２０６８）。証拠の蓄積は、神経細胞の損失と、ＡＤの影響を受けた脳内のアミロイドβ（Ａβ）プラークおよびリン酸化Ｔａｕタングルによって形成される神経病理学的病変の蓄積との間の因果関係を確立する（Ｓｍａｌｌ，ＳＡ．＆Ｄｕｆｆ，Ｋ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００８ ６０：５３４－５４２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本明細書に開示されるように、皮膚は、エクソソームの形態でシグナルを脳に送ることができ、アルツハイマー病（ＡＤ）の対象の皮膚に由来するエクソソームは、この疾患の進行に影響を及ぼす可能性がある神経毒性カーゴを含む。これは、ＡＤにおけるパラダイムをシフトさせる概念であり、本明細書において「皮膚脳相関」（ＳＫＩＮ－ＢＲＡＩＮ ＡＸＩＳ）と称される。
【0005】
いくつかの実施形態では、皮膚に由来するエクソソームは、神経毒性カーゴを脳に累積的に運び、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患の発症および／または進行に寄与し得る（すなわち、皮膚脳相関）。
【課題を解決するための手段】
【0006】
したがって、対象における神経変性疾患を診断するための方法であって、対象からエクソソームを単離することと、１つ以上のバイオマーカーの存在についてエクソソームをアッセイすることとを含む方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、神経変性疾患に関連する１つ以上の経路の調節のためにエクソソームをアッセイすることを含む。例えば、本方法は、脳障害、疾患、または損傷に関連する任意の経路の調節異常についてアッセイすることを含み得る。
【0007】
さらに、本明細書に開示されるように、エクソソーム操作アプローチは、皮膚を脳への「窓」として使用して、脳のための治療戦略として使用することができる。いくつかの実施形態では、開示される組成物および方法は、治療用遺伝子またはカーゴを送達することによって、脳の任意の損傷、疾患、または障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、脳疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病（ＨＤ）などの神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、脳疾患は、原発性および続発性の脳がんを含む脳がんである。いくつかの実施形態では、脳の疾患または損傷は、脳卒中または虚血を含む。いくつかの実施形態では、脳損傷は外傷性脳損傷である。
【0008】
したがって、対象の皮膚を操作して治療用エクソソームを産生することを含む対象を治療する方法が本明細書に開示される。
【0009】
皮膚で産生されたエクソソームを収集し、脳の１つ以上の疾患、障害、または損傷を治療することができる、本明細書に記載されるもののような治療用カーゴをそれらに充填する方法もまた開示される。
【0010】
本明細書ではまた、皮膚からのエクソソーム放出を減少させて、脳への輸送を減少させる方法も開示される。例えば、いくつかの実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤ＧＷ４８６９を局所的におよび／または皮内注射を介して適用して、皮膚エクソソーム放出を低減することができる。
【0011】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明、および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】提案されている皮膚脳相関、ならびにエクソソームを介して神経毒性カーゴを脳に送達し、ＡＤの発達および／または進行に寄与するその役割を示す。
【図2A】エクソソームを標識するために、ＣＤ６３－ＧＦＰプラスミドを健康なマウスの皮膚に送達するために使用されるＴＮＴを示す。対照皮膚を、模擬／空のプラスミドでＴＮＴ処理した。
【図2B】皮膚ヘのＴＮＴの２４時間後に脳で検出されたＧＦＰシグナルを示しており（対照では非存在）、皮膚由来のエクソソームが循環に入り、脳に留まることができるらしいことを示唆する。
【図3A】ＡＤマウス対健康なマウスでのみ見られる、変異したヒト型のアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）ｍＲＮＡの相対的発現のｑＲＴ－ＰＣＲデータを示す。
【図3B】健康なマウスおよびＡＤマウス由来の皮膚由来エクソソームにおけるアミロイドβタンパク質の免疫ブロット分析を示し、ＡＤ下のみの存在を確認する。
【図4A-4C】皮膚ＥＶのＲＮＡ含有量に対する差次的発現およびＩＰＡオントロジー分析を示す。２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した３×Ｔｇ－ＡＤのＥＶにおける差次的遺伝子含有量を提示するボルケーノプロット（上）および差次的遺伝子含有量によって濃縮された正準経路（下）（図４Ａ）、１０週目と比較した２３週目におけるＢ６１２９ＳＦ２／Ｊおよび３×Ｔｇ－ＡＤ（図４Ｂ）、１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ、ならびに２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ（図４Ｃ）。正準経路分析の場合、青色のバーは経路下方調節を表し（ｚスコア＜０）、白色のバーは（ｚスコア＝０）を表し、灰色のバーは制御のパターンがないことを表す。
【図5A-5B】ヒトＡＰＰおよびＭＡＰＴのためのトランスジェニック遺伝子のｍＲＮＡを含む、３×Ｔｇ－ＡＤマウス由来の皮膚由来ＥＶを示す。Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊおよび３×Ｔｇ－ＡＤマウス由来の皮膚由来エクソソームの絶対ｑＰＣＲデータは、３×Ｔｇ－ＡＤのＥＶにおけるトランスジェニックヒトＡＰＰ（図５Ａ）およびヒトＭＡＰＴ（図５Ｂ）の存在を示す。
【図6A-6B】トランスジェニックｈＡＰＰ（図６Ａ）およびｈＭＡＰＴ（図６Ｂ）の発現を２４時間測定するために、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶに曝露された初代ニューロン培養物のｑＰＣＲデータを示す。トランスジェニックｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡは、３×Ｔｇ－ＡＤマウスおよび非存在および対照由来の皮膚由来ＥＶに曝露されたマウス初代胚性ニューロンに見出された。
【図7A-7C】ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して蛍光標識した３×Ｔｇ－ＡＤマウス由来の皮膚由来ＥＶの６０倍のデコンボリューション（図７Ａ）および共焦点画像（図７Ｂ）を示す。蛍光標識したＥＶを、マウスの初代ニューロン培養物、続いてニューロン特異的ＴＵＪ１を有するＩＣＣに曝露し、ＤＡＰＩで染色した。図７Ｃは得られた免疫蛍光データの定量化を示す図であり、ＴＵＪ１＋細胞の中およびその周辺で、ＴＵＪ１－よりも有意に高いレベルで標識されたＥＶを示す。
【図8A-8B】３×Ｔｇ－ＡＤ／Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶに曝露したマウス初代胚性ニューロン培養物の生細胞／死細胞生存率アッセイを示す。図８Ａは、ニューロンにおける生細胞／死細胞生存率アッセイの２０倍蛍光画像を示す。図８Ｂは、１平方ミリメートル当たりの死細胞の定量データを示す。
【図9A-9B】皮膚ＥＶのＲＮＡ含有量に対する差次的発現分析を示す。２３週目でＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した３×Ｔｇ－ＡＤのＥＶにおける差異的遺伝子含有量を提示するボルケーノプロットおよびヒートマッププロット（Ａ）２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤおよび１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ（Ｂ）１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊおよび１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤと比較した２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本開示がより詳細に記載される前に、本開示が記載される特定の実施形態に限定されず、そのため、当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。本開示の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを目的とするものではないことも理解されるべきである。
【0014】
一定の範囲の値が提供されるとき、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間、および、その述べられた範囲内の他の述べられた値または中間の値における、それぞれの中間の値は、その下限の単位の１０分の１まで本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、より小さな範囲に含まれ得、独立して本開示に包含される。述べられた範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方のいずれかを除外する範囲は、本開示に含まれる。
【0015】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の方法および物質はまた、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料はここに記載される。
【0016】
本明細書で引用されたすべての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、引用されて組み込まれることを具体的におよび個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日以前のその開示のためのものであり、本開示が、先行開示のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は実際の公開日とは異なる可能性があり、これらは独立して確認する必要があり得る。
【0017】
本開示を読む当業者には明らかなように、本明細書に記載され図示された個別の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のうちのいくつかの特徴から容易に分離または組み合わされ得る個別の構成要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能である任意の他の順序で実行され得る。
【0018】
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である、化学、生物学などの技法を用いる。
【0019】
以下の実施例は、当業者に、本明細書中開示および特許請求される方法およびプローブの使用をいかに実施するかの完全な開示および説明を提供するために示される。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定がない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、圧力は大気圧またはその付近である。標準温度および圧力は、２０℃および１気圧と定義されている。
【0020】
本開示の実施形態が詳細に説明される前に、本開示は、別段の指示がない限り、特定の材料、試薬、反応物質、製造プロセスなどに限定されないため、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことを理解されたい。また、本開示において、ステップが論理的に可能である場合、異なる順序で実行され得ることも可能である。
【0021】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の指示物を含むことに留意されなければならない。
【0022】
定義
「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは獣医の患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。
「対象」という用語は、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。したがって、対象は、ヒトまたは獣医の患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。
【0023】
「治療有効」という用語は、疾患または障害の１つ以上の原因または症状を改善するのに十分な量の組成物の使用量を指す。このような改善は、必ずしも除去ではなく、減少または変化を必要とするだけである。
【0024】
「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症もなくヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【0025】
「担体」という用語は、化合物または組成物と組み合わせた場合に、その意図される使用または目的のために、化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特徴を補助または促進する化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、担体は、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるように選択することができる。
【0026】
「治療」という用語は、疾患、病態、または障害を治癒、改善、安定化、または予防することを意図する患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病態、または障害の改善に特異的に向けられた治療を含み、因果的治療、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の原因の除去に向けられた治療も含む。加えて、この用語には、緩和的治療、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の発症を最小限に抑えるか、または部分的にもしくは完全に阻害することを目的とした治療、ならびに支持的治療、すなわち、関連する疾患、病態、または障害の改善を目的とした別の特定の療法を補完するために使用される治療が含まれる。
【0027】
「阻害する」という用語は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータの減少を指す。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去が含まれ得るが、これらに限定されない。これはまた、例えば、天然または対照のレベルと比較して、活性、応答、状態、または疾患の１０％の低減を含み得る。したがって、低減は、天然または対照のレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であり得る。
【0028】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、例えば、ペプチアイソスターなどによって互いに連結されたアミノ酸を指し、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外の修飾アミノ酸を含んでもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセス、または当該技術分野で周知の化学修飾技法のいずれかによって修飾することができる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチド内の任意の場所で生じ得る。同じ種類の修飾は、所与のポリペプチド内のいくつかの部位において同じ程度に、または異なる程度に存在し得る。また、所与のポリペプチドは、多くの種類の修飾を有することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、共有結合または環化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスフィチジルイノシトールの共有結合、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、システインまたはピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリル化、酸化、過酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびアルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１－１２（１９８３）を参照されたい）。
【0029】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸残基を表す略語、文字（ｌｅｔｔｅｒｓ）、文字（ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ）、または単語のリストを指す。本明細書で使用されるアミノ酸略号は、アミノ酸のための従来の１文字コードであり、以下のように表される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄアスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈヒスチジン；Ｉイソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミンまたはグルタミン酸。
【0030】
本明細書で使用される「核酸」という語句は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、一本鎖または二本鎖、センスまたはアンチセンスのいずれであっても、ワトソン－クリック塩基対形成による相補的核酸へのハイブリダイゼーションが可能である、天然に存在するかまたは合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含むことができる。特に、核酸は、非限定的に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は塩基部分、糖部分、およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合を生成するそれらのリン酸部分および糖部分を通じて結合され得る。「オリゴヌクレオチド」という用語はしばしば、一緒に連結された２つ以上のヌクレオチドを含む分子を指すために使用される。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、およびチミン－１－イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシン一リン酸）または５’－ＧＭＰ（５’－グアノシン一リン酸）であろう。
【0032】
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、および／またはリン酸部分に対する何らかの種類の修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は当該技術分野で周知であり、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２－アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸部分での修飾を含む。
【0033】
ヌクレオチド置換基は、ヌクレオチドと同様の機能性を有するが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド置換基はワトソン－クリックまたはフーグスティーンの様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド置換基は、適切な標的核酸と相互作用するときに、二重らせん型構造に適合することができる。
【0034】
「ベクター」または「構築物」という用語は、ベクター配列が連結された別の核酸を細胞に輸送することができる核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に好適な形態で（例えば、転写制御エレメントに連結された）遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を含む。プラスミドはベクターの一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むことが意図されている。
【0035】
「作動可能に連結された」という用語は、核酸と別の核酸配列との機能関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、ＤＮＡの転写制御エレメントへの作動可能な結合は、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指し、そのようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し、結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるようにする。
【0036】
本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｄに対する、所与のヌクレオチドまたはアミノ酸配列Ｃの配列同一性％（代替的に、所与の配列Ｄに対する（ｔｏ）、所与の配列Ｄに対する（ｗｉｔｈ）、または所与の配列Ｄに対する（ａｇａｉｎｓｔ）、特定の配列同一性％を有するか、または含む所与の配列Ｃと表現することができる）は、以下のように計算される：
分数Ｗ／Ｚの１００倍、
式中、Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムによって同一のマッチとしてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣからＤの配列同一性％は、ＤからＣの配列同一性％に等しくはならないことを理解されたい。配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野内の様々な方法で達成することができる。
分数Ｗ／Ｚの１００倍、
式中、Ｗは、そのプログラムのＣおよびＤのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムによって同一のマッチとしてスコア付けされたヌクレオチドまたはアミノ酸の数であり、Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さに等しくない場合、ＣからＤの配列同一性％は、ＤからＣの配列同一性％に等しくはならないことを理解されたい。配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野内の様々な方法で達成することができる。
【0037】
「特異的にハイブリダイゼーションする」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、高いストリンジェンシー条件下で、実質的に相補的な核酸（例えば、ｃ－ｍｅｔ核酸）を認識し、物理的に相互作用（つまり、塩基対）し、他の核酸と実質的に塩基対を認識しないことを意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、概して、プローブと標的配列との間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性がある場合にハイブリダイゼーションが生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％のホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性、剪断した担体ＤＮＡ（サーモン精子ＤＮＡなど）を含む溶液中で一晩インキュベーションし、続いて、ハイブリダイゼーション支持体を０．１ＸＳＳＣ中で約６５℃で洗浄することである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、特に第１１章に例示される。
【0039】
「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実行する、ベクターの非翻訳領域、すなわちエンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのようなエレメントは、その強度および特異性において変化し得る。
【0040】
「プロモーター」は、一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列（複数可）である。「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【0041】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位から不定の距離で機能し、転写単位に対して５’または３’のいずれかであり得るＤＮＡ配列を指す。さらに、エンハンサーは、イントロン内およびコード配列自体内にあり得る。それらは通常、１０～３００ｂｐの長さであり、シスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させるように機能する。また、エンハンサーは、プロモーターと同様に、転写の調節を媒介する応答エレメントをしばしば含む。エンハンサーは、発現の調節をしばしば決定する。
【0042】
「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と天然で連結されたものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって誘導されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近傍に配置されるものである。
【0043】
皮膚脳相関
アルツハイマー病（ＡＤ）特徴タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ａβペプチド、およびＴａｕは、神経系外の複数の組織で産生され、ＡＤが複数の臓器を含む全身疾患であり得ることを示唆する。神経系外では、アミロイド症は、身体の最大の器官である皮膚においても観察されており（Ｆｅｉｔｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａｓ Ｄｅｒｍｏ－Ｓｉｆｉｌｉｏｇｒａｆｉｃａｓ（Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）２００８ ９９：６４８－６５２）、ここでは、ＡβペプチドおよびＴａｕタンパク質の両方が産生され、アミロイド凝集体が形成される（Ａｋｅｒｍａｎ，ＳＣ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１９ ６９：４６３－４７８、Ｄｕｇｇｅｒ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１６ ５１：３４５－３５６）。さらに、Ａβペプチドおよびそのオリゴマーは、ＡＤ患者および健康な対象の脳および皮膚の血管の内皮に見出され（Ｋｕｃｈｅｒｙａｖｙｋｈ，ＬＹ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１８ １９）、皮膚生理学における変化は、一般に、ＡＤ患者において観察される（Ｓｃｈｒｅｍｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０ １９：９５３－９５７）。これらの変化は、代謝変化（Ｊｏｎｇ，ＹＪＩ．，ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００３ １７：２３１９－２３２１、Ｐａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２００９ １８：８２９－８４１、Ｐｉｔｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ２００５ ２６：８３３－８３８）、カルシウム代謝および増殖の変化（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８６ ８３：７９９９－８００１）、および血管機能の低下（Ｋａｌｍａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００２ １７：３７１－３７４）を含み、生理学的および病理学的機序を通じて接続された皮膚脳相関の存在を示す（Ｃｌｏｓ，ＡＬ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１２ ３：５）。
アルツハイマー病（ＡＤ）特徴タンパク質、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ａβペプチド、およびＴａｕは、神経系外の複数の組織で産生され、ＡＤが複数の臓器を含む全身疾患であり得ることを示唆する。神経系外では、アミロイド症は、身体の最大の器官である皮膚においても観察されており（Ｆｅｉｔｏ－Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａｓ Ｄｅｒｍｏ－Ｓｉｆｉｌｉｏｇｒａｆｉｃａｓ（Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）２００８ ９９：６４８－６５２）、ここでは、ＡβペプチドおよびＴａｕタンパク質の両方が産生され、アミロイド凝集体が形成される（Ａｋｅｒｍａｎ，ＳＣ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１９ ６９：４６３－４７８、Ｄｕｇｇｅｒ，Ｂ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２０１６ ５１：３４５－３５６）。さらに、Ａβペプチドおよびそのオリゴマーは、ＡＤ患者および健康な対象の脳および皮膚の血管の内皮に見出され（Ｋｕｃｈｅｒｙａｖｙｋｈ，ＬＹ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１８ １９）、皮膚生理学における変化は、一般に、ＡＤ患者において観察される（Ｓｃｈｒｅｍｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０ １９：９５３－９５７）。これらの変化は、代謝変化（Ｊｏｎｇ，ＹＪＩ．，ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００３ １７：２３１９－２３２１、Ｐａｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ．Ｄｉｓ．２００９ １８：８２９－８４１、Ｐｉｔｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ ２００５ ２６：８３３－８３８）、カルシウム代謝および増殖の変化（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８６ ８３：７９９９－８００１）、および血管機能の低下（Ｋａｌｍａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｅｒｉａｔｒ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００２ １７：３７１－３７４）を含み、生理学的および病理学的機序を通じて接続された皮膚脳相関の存在を示す（Ｃｌｏｓ，ＡＬ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１２ ３：５）。
【0044】
以前の所見は、末梢細胞で合成された循環Ａβペプチドが血液脳関門を通過し（Ｚｌｏｋｏｖｉｃ，ＢＶ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９４ ２０５：１４３１－１４３７）、Ａβ依存性神経病理を開始し、プリオン様機構を通じてニューロン障害を誘発する（Ｂｕ，Ｘ．－Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１８ ２３：１９４８－１９５６）ことを示す（Ｊｕｃｋｅｒ，Ｍ．＆Ｗａｌｋｅｒ，ＬＣ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ５０１：４５－５１）。さらに、別の一連の研究は、ＡＰＰプロセシングがエンドサイトーシス経路を介して細胞内で行われ（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６ １０３：１１１７２－１１１７７）、Ａβペプチドが、毒性のあるＡβペプチドのニューロンからニューロンへの伝達の可能な細胞外小胞内のカーゴとして放出されることを示す（Ｓａｒｄａｒ Ｓｉｎｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１８ １３６：４１－５６）。細胞外小胞（ＥＶ）は、最近、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などの機能的カーゴの輸送による細胞間通信の主要な実行者として現れた（Ｉｒａｃｉ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１６ １７：１７１）。ほとんどの細胞型は、ＥＶを放出し、皮膚においてＥＶを放出することは、細胞間のコミュニケーション、創傷治癒、および皮膚障害との関連で特徴付けられている（Ｔｅｒｌｅｃｋｉ－Ｚａｎｉｅｗｉｃｚ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１９ １３９：２４２５－２４３６．ｅ５）。ＡＤの３×Ｔｇ－ＡＤトリプルトランスジェニックマウスモデルからの皮膚由来ＥＶのトランスクリプトームの特徴付けが本明細書に開示され、ＡＰＰおよびＴａｕのｍＲＮＡの存在、ならびにこれらの分子が細胞取り込みを介してニューロンにいかに移行することができるかを確認する。
【0045】
したがって、本明細書に開示されるように、皮膚は、エクソソームの形態でシグナルを脳に送ることができ、アルツハイマー病（ＡＤ）の対象の皮膚に由来するエクソソームは、この疾患の進行に影響を及ぼす可能性がある神経毒性カーゴを含む。これは、ＡＤにおけるパラダイムをシフトさせる概念であり、本明細書において「皮膚脳相関」と称される。この現象を使用して、対象からの皮膚由来エクソソームをアッセイすることによって神経疾患を診断する方法、ならびに対象の脳に送達される治療用カーゴで皮膚由来エクソソームを改変することによって、神経疾患を有する対象を治療する方法が本明細書に開示される。
【0046】
診断
したがって、対象における神経変性疾患を診断するための方法であって、対象から皮膚由来のエクソソームを単離することと、１つ以上のバイオマーカーの存在についてエクソソームをアッセイすることとを含む方法が、本明細書に開示される。Ｉ
したがって、対象における神経変性疾患を診断するための方法であって、対象から皮膚由来のエクソソームを単離することと、１つ以上のバイオマーカーの存在についてエクソソームをアッセイすることとを含む方法が、本明細書に開示される。Ｉ
【0047】
したがって、対象における神経変性疾患を診断するための方法であって、対象から単離されたエクソソームを含み、１つ以上のバイオマーカーの存在についてエクソソームをアッセイすることを含む方法が、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＭＡＰＫ１３、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＡＰＰ（ＮＣ＿００００２１．９）、Ａβ、もしくはＴａｕ、またはそれらの組み合わせである。
【0048】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＭＡＰＴ（ＮＣ＿００００１７．１１）、ＡＤＡＭＴＳ９（ＮＣ＿０００００３．１２）、ＡＫＡＰ５（ＮＣ＿００００１４．９）、ＡＱＰ１（ＮＣ＿０００００７．１４）、ＡＲＣ（ＮＣ＿０００００８．１１）、ＣＡＭＫ２Ａ（ＮＣ＿０００００５．１０）、ＣＡＳＰ４（ＮＣ＿００００１１．１０）、ＣＬＥＣ３Ｂ（ＮＣ＿０００００３．１２）、ＦＡＡＨ（ＮＣ＿０００００１．１１）、ＧＲＩＮ１（ＮＣ＿０００００９．１２）、ＨＤＡＣ９（ＮＣ＿０００００７．１４）、ＭＡＰ２Ｋ３（ＮＣ＿００００１７．１１）、Ｓ１００Ａ８（ＮＣ＿０００００１．１１）、Ｓ１００Ａ９（ＮＣ＿０００００１．１１）、Ｓ１００Ｂ（ＮＣ＿００００２１．９）、ＳＬＣ１６Ａ６（ＮＣ＿００００１７．１１）、ＳＬＣ１Ａ３（ＮＣ＿０００００５．１０）、ＳＬＣ２５Ａ４（ＮＣ＿０００００４．１２）、ＳＬＣ３０Ａ３（ＮＣ＿０００００２．１２）、ＳＬＣ３８Ａ２（ＮＣ＿００００１２．１２）、ＳＬＣ３９Ａ３（ＮＣ＿００００１９．１０）、またはそれらの任意の組み合わせである。
【0049】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、Ｒｎ４５ｓ、Ｍｙｌｐｆ、Ｎｅｂ、Ｒｐｓ３ａ１、Ａｃｔａ１、Ａｔｐ２ａ１、Ｃｋｍ、Ｔｔｎ、Ｒｎｕ１１、Ｍｙｈ２、Ｘｉｒｐ２、Ｌａｒｓ２、Ｔｎｎｃ２、Ｄｐｔ、Ｅｎｏ３、Ｅｌｏｖｌ４、Ｄｅｓ、Ｎｒ１ｄ１、Ｔｐｍ２、Ｔｎｎｔ３、Ｊｐｈ２、Ｓｍｔｎｌ１、Ｆｂｎ１、Ｆｍｏｄ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｊ、Ｔｎｎｉ２、Ｃｍｙａ５、Ｈｓｐｂ６、Ｍａｌａｔ１、Ｓ１００ａ９、Ｓｌｃ２５ａ４、Ｔｒｄｎ、Ｈｆｅ２、Ｍｙｂｐｃ１、Ｃａｓｑ１、Ｒｙｒ１、Ｃａｒ３、Ｃｌｅｃ３ｂ、Ｇａｓ６、Ｆｂｘｏ４０、Ｓｌｃ３８ａ２、Ｍｙｏ１８ｂ、ＢＣ１００５３０、Ｌｏｒ、Ｋｄｍ６ｂ、Ｍｙｈ６、Ａｋｒ１ｅ１、Ｃａｃｎａ１ｓ、Ｏｇｎ、Ｓｐｏｎ２、Ｆｈｌ１、Ｉｃａｍ１、Ｍｙｏｃ、Ｒｎａｓｅ２ｂ、Ｍｂ、Ｍｘｄ１、Ｇｂｐ２ｂ、Ｄｈｃｒ２４、Ｍｙｂｐｈ、Ｉｇｆｂｐ６、Ａｌｐｋ３、Ｇｌｔｐ、Ｐａｑｒ７、Ｋｒｔ６ｂ、Ｎｒ１ｄ２、Ｄｋｋ２、Ｉｇｆｎ１、Ｈｙｄｉｎ、Ｇｍ１３１７７、Ｍｙｐｎ、Ｃｄｓｎ、Ｍｙｌ１、Ｃａｓｃ１、Ｄｂｐ、Ｃｌｃａ２、Ｔｃｅａ３、Ａｎｘａ３、Ｈｒｃ、Ｌ２ｈｇｄｈ、Ｓｐｐ１、Ａｒｉｄ５ｂ、Ｔｐｍ１、Ｐｃｆ１１、Ｓｃａｒｎａ２、Ｃｏｌ３ａ１、Ｐｔｔｇ１、Ａｓｂ２、Ｋｒｔ６ａ、Ｄｓｃ３、Ｔｒｉｍ５４、Ｂａｉａｐ３、２３１０００２Ｌ０９Ｒｉｋ、Ｔｇｆｂ２、Ｉｌ１ｂ、Ｃｉｌｐ、Ｐｆｋｍ、Ｃｄｒ１、Ｇｍ１３４８３、Ｓｃｎ１０ａ、Ｓｌｃ１７ａ７、Ｍｙｈ４、Ｃａｍｋ２ａ、Ｃｘｃｌ２、Ｐｃｌｏ、Ｍｔ１、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｃｎｔｎ２、Ｋｌｈｌ３１、Ｍｓｔｎ、Ｄｓｐ、Ｐｃｏｌｃｅ２、Ｆａｍ２０７ａ、Ｔｎｎｔ１、Ａｓｉｃ１、Ｔａｇａｐ、Ａｓｂ５、Ｆｘｙｄ２、Ｓｒｌ、Ｌｄｂ３、Ｒｙｒ３、Ｎｒａｐ、Ｍｙｂｐｃ２、Ｇｓｅ１、Ａｂｒａ、Ｉｌｄｒ１、Ｓｍｙｄ１、Ｈｍｏｘ１、Ｏｂｓｃｎ、Ｇｒｉｎ１、Ｓｔｋ３６、Ｓ１００ａ８、Ｚｆｐ５６０、Ｆｓｄ２、Ｐｏｌｑ、Ｔｈｂｓ４、Ｇｓｄｍａ、Ｋｒｔ８０、１－Ｍａｒ、Ｆｉｂｉｎ、Ｋｒｔ７、Ｐｉｋ３ｃｇ、Ｂｃａｎ、Ｆｌｎｃ、Ｎｄｕｆｖ２、Ｔａｃｓｔｄ２、Ｍｙｏｚ１、Ｚｘｄｂ、Ｉｌ１１ｒａ１、Ｎｅｕｒｌ１ａ、Ｒｂｆｏｘ１、Ｃｄｈ１、Ｆａｍ８３ｇ、Ｓｎｏｒａ２３、Ｐｌｅｔ１、Ｚｆｐ７９９、Ｔａｆ１５、Ｃｓｔｆ１、３４２５４０１Ｂ１９Ｒｉｋ、Ｌａｒｐ７、Ｓｌｆｎ４、Ｇｍ１３３７５、Ｐｐｐ１ｒ３ａ、Ｍｍｐ１５、Ａ１ｃｆ、Ｃｈｓｔ３、Ｆ６３０１１１Ｌ１０Ｒｉｋ、Ｇｂｐ１１、Ｇｍ６５８３、Ｌｒｇｕｋ、Ｍｃｉｄａｓ、Ｒｎｆ１８２、Ｓｙｔ２、Ｔｓｋｓ、Ｕｇｔ１ａ１、Ｍｇｍｅ１、Ｄｎａｈ８、Ｄｏｃｋ１０、Ｌａｍａ２、Ａｒｎｔｌ、Ｍｉｔｆ、Ｆｕｃａ２、Ｋｉｆ９、Ｍｙｌ２、Ａｄａｍｔｓ９、Ｊａｋ２、Ｆｎｄｃ５、Ｓ１００ｂ、Ｃｅｓ１ｄ、Ｐｙｇｍ、Ｄｎａｈ５、Ｎｃａｎ、Ｐｐｐ１ｒ３ｆ、Ｈｃａｒ２、Ｎｏｖ、Ｕｇｃｇ、Ａｒｃ、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｔｍｅｍ１８２、Ｄｄｈｄ１、Ａ１３００１０Ｊ１５Ｒｉｋ、Ｈｐｓ３、Ｒｌｉｍ、Ｈｄａｃ９、Ｎａｌｃｎ、Ｆｂｘｏ１７、Ｈｅｌｂ、Ｃｄ９３、Ｃｙｐ２ｂ２３、Ｇｄｐｄ３、Ｓｌｆｎ１０－ｐｓ、Ｔｒｉｍ７２、Ａｂａｔ、Ｎｕｐ３７、Ｚｃ３ｈ１２ｃ、Ｋａｔ２ｂ、Ａｇｐａｔ６、Ｖｍａ２１、Ｓｙｎ１、Ｐｉｔｒｍ１、Ｉｇｆｂｐ２、Ｐｖａｌｂ、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｈｉｓｔ１ｈ２ａｂ、Ａｃｔｎ３、Ｍｙｏ５ｂ、Ｄｓｃ１、Ｓｏｗａｈｃ、Ｓｐｔｂｎ２、Ｄｎａ２、Ｅｏｍｅｓ、Ｏｔｏｇ、Ｓｉｋｅ１、Ｕｓｈ１ｇ、Ｍｕｃ１９、Ｍｒｏｈ４、Ｒｂｍ４６、Ｒｉｍｂｐ３、Ｇｃｎｔ２、Ｍｙｈ７、Ｃｘｃｌ１４、Ｔｅｐ１、Ｍｙｏｍ２、Ｓｔｆａ３、Ｃｈｉｌ３、Ｓｅｍａ７ａ、Ｖｓｘ２、Ｎｆｋｂ１、Ｏｖｏｌ１、Ａｃｓｓ１、Ｚｆｐ７１９、Ｐｒｒ１２、Ｍｙｏｍ３、Ａｒｒｄｃ４、Ｈ１９、Ｄｍｐｋ、Ｓｉｋ１、Ｅｌｏｖｌ６、Ｇｓｐｔ２、Ｒａｄｉｌ、Ｍｆｎｇ、Ａｔｐ６ｖ１ｂ２、Ｅｔｖ３、Ｒｎａｓｅｋ、Ｓｃｈｉｐ１、Ｅｐｈａ２、２３１０００３Ｈ０１Ｒｉｋ、Ｓａａ３、Ｍｆａｐ４、Ｓｌｃ３８ａ３、Ｓｔｆａ１、Ｍｍｐ２５、Ｚｇｒｆ１、Ｅｐｈａ４、Ｍｄｍ２、Ｌｐｈｎ３、Ａｒｉｄ２、Ｍａｐ２ｋ３、Ｔｇｆｂｒ１、Ｃｋａｐ２、Ｒｉｌｐｌ１、Ｓｒｇｎ、Ｄｕｏｘ１、Ｃａｄｐｓ２、Ｗｄｒ８、Ｖａｖ２、Ｇｎａ１５、Ｔｅｆ、Ｉｆｉｔ３、Ｌｉｍｃｈ１、Ｍｍｐ１７、Ｒａｓｇｒｐ３、Ｂ３ｇｌｃｔ、Ｐｎｐｌａ１、Ｓｆｉ１、Ｍｇｌ２、Ｒａｄ９ａ、Ｒａｐ１ｇａｐ、Ｕｔｐ２３、Ｔｂｌ１ｘ、Ｗｄｒ６０、Ｃａｓｐ４、Ｒａｂ１１ｆｉｐ１、Ｒｂｍ２０、Ｐｔｐｎ９、Ｓｎｏｒａ６４、Ｎｒｉｐ１、Ｇｌｐ１ｒ、９５３００５１Ｇ０７Ｒｉｋ、Ｎｅｕｒｏｄ１、Ｓｈ３ｇｌ３、Ｔｅｘ１６、ＢＣ０６８１５７、Ｄｅｎｎｄ６ｂ、Ｓｅｔｍａｒ、Ｇｔｆ２ｉｒｄ２、Ｓｈａｎｋ３、Ｇｍ７１２０、Ａｔｐ８ｂ３、Ｓｈｉｓａ４、Ｓｑｌｅ、Ｋｌｈｌ４１、Ｔｍｅｍ１９８、１８１００１３Ｌ２４Ｒｉｋ、Ｓｌｃ１ａ３、Ｔｓｃ２２ｄ２、Ｅｍｐ２、Ｆ３、Ｈｍｇａ２－ｐｓ１、Ｘｉｒｐ１、Ｒａｂｌ２、Ｓｐｅｇ、Ｍｏｎ１ａ、Ｄｔｎａ、Ａｇａｐ３、Ｐｈａｃｔｒ４、Ｐｉｅｚｏ１、Ｓｐｔａ１、Ｆｏｘｐ２、Ａｔｐ２ｂ４、Ｃｒｔｃ２、Ｇｐｒ３４、Ｌａｍａ５、Ｃｄｈ５、Ｈｒｎｒ、Ｉｓｌｒ２、Ｐｌｋ２、Ｃｅｌｓｒ１、Ｓｎｏｒｄ１５ａ、Ｎｈｌｒｃ１、Ｓｔ３ｇａｌ３、Ｍａｐｋ１３、Ｓｃａｒｎａ１３、Ｃｃｌ４、Ｓｐｉｎｔ２、Ｊｐｘ、Ａｎｋｒｄ２６、Ｅｆｎａ１、Ｇｇｃｔ、Ｈ２－Ｔ２３、Ｍｙｏｔ、Ｐｃｃａ、Ｃａｃｎａ２ｄ２、Ｋｐｎａ７、Ｍｓｈ５、Ｂａｔｆ、Ｌｇａｌｓ４、Ｆｂｘｏ３０、Ｓｙｎｐｏ２、４９３０５６３Ｅ２２Ｒｉｋ、Ｃ７３００２７Ｈ１８Ｒｉｋ、Ｆｂｘｏ２７、Ｆｏｘａ２、Ｌｒｒｉｑ１、Ｎｐｙ６ｒ、Ｐｌｄ５、Ｐｔｈ２ｒ、Ｒａｂ３ｃ、Ｓｃｇｂ３ａ２、Ｓｌｃ１７ａ３、Ｓｌｃ６ａ７、Ｓｐａｔａ３１ｄ１ｄ、Ｓｒｒｍ４ｏｓ、Ｔｉｇｄ４、Ｔｍｃｏ５、Ｖｗａ７、Ｇｐｒ５６、Ａｄｓｓｌ１、Ｐａｒｄ６ｂ、Ｕｓｐ５３、Ｉｔｃｈ、Ｃｏｌ２４ａ１、Ｖｉｐｒ１、Ｇｍ１３１７８、Ｌｒｒｃ３９、Ｃｎｔｎａｐ１、Ｍｙｈ３、Ｓｌｆｎ９、Ｓｌｃ１６ａ６、４９３０４３１Ｐ０３Ｒｉｋ、９１３０２０４Ｌ０５Ｒｉｋ、Ｇｈｓｒ、Ｉｃｏｓ、Ｓｌｃ２６ａ３、Ｔｒａｐｐｃ３ｌ、Ｕｎｃ５ｄ、Ｐｉｍ１、Ａｇｔｒ１ａ、Ｔｉｅ１、Ｄａｎｃｒ、Ｐｈｋｂ、Ｕｂｌ３、Ｉｒｆ１、Ｓｍｔｎ、Ｐｌｋ３、Ｅｆｎｂ２、Ａｂｃａ８ｂ、Ｌｇａｌｓ６、Ｔｍｐｐｅ、Ｐｄｅ４ｄ、Ｃｌｅｃ２ｉ、Ｇｂａ、Ｂｒｗｄ１、Ｓｍｐｘ、Ｓｐｒｒ２ｈ、Ｆｅｒｍｔ１、Ｃｈｄ３ｏｓ、５－Ｍａｒ、Ｐｋｉａ、Ｓｐｏｃｋ２、Ｒｈｅｂｌ１、Ｃｏｌ２２ａ１、Ａｍｏｔ、Ｐｄｅ４ｂ、９０３０６２４Ｊ０２Ｒｉｋ、Ｐｅｃａｍ１、Ｇｓｔｏ１、Ｇａｄｌ１、Ｌｅｐ、Ｇａｂｒａ３、Ｋｄｍ２ｂ、Ｆｎｄｃ９、Ａｌｐｋ２、Ｐｔｇｓ２、Ｔｏｂ２、Ｃｃｄｃ６１、Ｆｇｆ１０、Ｓｃｎ４ａ、ＡＵ０１８０９１、Ｓｕｍｆ１、Ｍｉｒ６５１６、Ａｂｃａ１２、Ｓｄｒ１６ｃ５、Ｔｘｌｎｂ、Ｓｎｏｒｄ２２、Ｐａｌｍ３、Ｉｔｓｎ２、Ｐｍｍ１、Ｃｏｑ１０ｂ、Ａｇａ、Ｓｅｌｐ、Ｍｆａｐ５、Ｓｌｃ１６ａ１３、Ｇｔｆ２ｈ３、Ｚｓｗｉｍ４、Ｇｒｅｂ１、Ｇｎａ１２、Ｄｄｉｔ４ｌ、Ｃｕｅｄｃ２、Ｍｒｐｌ４４、Ｇｍ１５８００、Ｌｄｌｒａｄ１、Ｍｉｓｐ、Ｎｐｈｐ４、Ｃｄ１４、Ｐｆｋｆｂ１、Ｓｌｃ４１ａ３、Ｈｅｒｃ４、Ｃａｄｍ４、Ｓｃａｒｆ２、Ｃｋｍｔ２、Ｃ０３００３９Ｌ０３Ｒｉｋ、Ｆｋｂｐ５、Ｗｎｋ２、Ｈｍｃｅｓ、Ｚｂｔｂ９、Ｈｏｘｃ１０、Ｃｃｎｌ１、Ｃｌｄｎ４、Ｃｃｌ３、Ｅｅｆ２ｋ、Ｉｒｇ１、Ｃｐｎｅ７、Ａｑｐ１、Ａ９３００１３Ｆ１０Ｒｉｋ、Ｅｘｏ１、Ｃｓｆ３、Ｄｓｃ２、Ｔｒｐｍ５、Ｆｂｘｗ１７、Ｔｍｅｍ１５０ｂ、Ｇｇｐｓ１、Ｂｈｌｈｂ９、Ｈｓ１ｂｐ３、Ｆａｍ１０２ａ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｆｎｉｐ２、Ｚｆｐ６３７、Ｃｐｔ１ｂ、Ｉｌ３１ｒａ、Ｃ９２０００９Ｂ１８Ｒｉｋ、Ｋｌｋ７、Ｓｐ１４０、Ｒｎｆ１２２、Ａｄａｍｔｓ１７、Ｉｒｆ６、Ｐｏｄｘｌ、Ｋｌｂ、Ｄｕｓｐ１、Ｄｕｓ１ｌ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｐｇｒ、Ｓｎｏｒａ２６、Ｄ４３００１９Ｈ１６Ｒｉｋ、Ｆｂｘｌ１５、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｓｂｆ１、Ｃｃｄｃ７１ｌ、Ｓｌｃ３９ａ３、Ｃｏｌ４ａ４、Ｒａｓｌ１０ｂ、Ｓｓｐｏ、Ｔｍｆ１、Ｃ０３０００６Ｋ１１Ｒｉｋ、Ｆｕｎｄｃ２、Ｈｃｃｓ、Ｏｌｆｍｌ２ａ、Ｎｐｐｂ、Ｐｌａｕｒ、Ｐｌｄ３、Ｈｈｉｐｌ１、Ｄｕｓｐ１３、Ｇｐｒ１７１、Ｉｇｆ２ｂｐ３、Ｓｆｘｎ４、Ａｄｓｓ、Ｔｏｌｌｉｐ、Ｌｍｔｋ２、Ｓｅｌｅ、Ｎｕｐ６２、Ｄｕｓｐ５、Ｃｓｒｐ３、Ａｋａｐ５、Ｍｙｏ１ａ、Ｏｎｅｃｕｔ２、Ｃｌｅｃ１１ａ、Ｓｓｃ５ｄ、Ｆａａｈ、Ｐｅｒ２、Ｒｆｘａｐ、Ｚｆｐ１３１、Ｉｐｐｋ、Ｅｎｄｏｖ、Ｔｏｐ３ｂ、Ｓｚｔ２、Ｚｂｔｂ１６、Ａａｃｓ、ＢＣ０２４１３９、Ｓｔｘ１１、Ｓｔａｍｂｐｌ１、Ｐｃｄｈ１、Ｔｒｉｍ４５、Ｔｔｌｌ８、Ｉｌ２ｒｇ、Ｓｅｒｐｉｎａ３ｈ、Ｓｐｔｂｎ４、Ａｌｏｘ８、Ｌｍｏｄ３、Ａｒｆ２、Ｆｏｓｌ１、Ｙａｅ１ｄ１、Ｈ２－Ｑ４、Ｓｌｃ１６ａ１２、Ｓｔｏｍｌ１、Ｅｐｄｒ１、Ｂｃｌ９ｌ、Ｂｐｉｆｃ、Ｎｕａｋ１、Ｐｒｉｍｐｏｌ、Ａｂｃｂ１ｂ、Ａｂｃａ１７、Ａｂｃｃ６、Ｃｆｉ、Ｓｌｃ３０ａ３、Ｔｍｅｍ１５１ｂ、Ｍｙｌｋ２、Ｐｄｅ１２、Ｌｓｒ、Ｃ５３０００８Ｍ１７Ｒｉｋ、Ｎａｐ１ｌ５、Ｎｏｓ２、Ｐ４ｈａ３、Ｅ３３００３３Ｂ０４Ｒｉｋ、Ｍｙｏ５ｃ、４９３１４０６Ｐ１６Ｒｉｋ、Ｕｇｔ１ａ７ｃ、Ｄｅｄｄ２、Ｃａｃｎａ１ｂ、２８１０４１７Ｈ１３Ｒｉｋ、Ａｃｖｒ２ｂ、Ｈｂｅｇｆ、Ｆｂｘｗ９、Ｍｆａｐ３、ＡＩ６６１４５３、Ｆｄｘ１、Ａｎｋｒｄ５５、Ｉｍｐ３、Ｇｒｈｌ３、Ｍａｐ３ｋ１１、Ｈｄｃ、Ｄｅｎｎｄ３、Ｇｐｄ１ｌ、Ａｋａｐ１、Ｒ３ｈｃｃ１、Ｐｒｏｃｒ、Ａｄｈｆｅ１、３－Ｓｅｐ、ＡＹ５１２９１５、Ｃａｔｓｐｅｒｇ２、Ｃｎｇｂ３、Ｄｎａａｆ１、Ｆａｍ１３２ｂ、Ｆｂｘｗ１８、Ｆｕｏｍ、Ｇｍ５８７８、Ｏｐｒｌ１、Ｓｌｃ６ａ１３、Ｅｅｆ１ａ２、Ａｌｋｂｈ１、Ｃｃｄｃ１７５、Ｃｌｅｃ４ｇ、Ｋａｚａｌｄ１、Ｔｔｂｋ１、Ｓｎｏｒａ４４、Ａｃｏｔ６、Ｒａｌｇｄｓ、Ｎａａ３５、Ｇｉｐｃ１、Ｕｇｔ１ａ２、Ｕｇｔ１ａ５、Ｕｇｔ１ａ９、Ｆｃｅｒ２ａ、Ｇｐ４９ａ、Ｆｉｚ１、Ａｎｇｐｔｌ７、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｅｄｎ２、Ｆａｎｋ１、Ｆｇｆ６、Ｇｍ１３０３２、Ｋｂｔｂｄ８、Ｋｃｎｑ２、Ｍｒｇｐｒｘ２、Ｆｖ１、Ｒａｂ１ｂ、Ｒａｓｉｐ１、Ａｌｏｘ１２ｂ、またはこれらの任意の組み合わせであり、これらのバイオマーカーのうちのいずれかの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６１、６２、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６
０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４５６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６１、６６２、６６４、６６５、または６６６個を含む。
０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４５６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６１、６６２、６６４、６６５、または６６６個を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、アルツハイマー病に関与する遺伝子であり、例えば、Ａｂａｔ、Ａｄａｍｔｓ９、Ａｄｓｓ、Ａｋａｐ５、Ａｌｏｘ１２ｂ、Ａｎｋｒｄ５５、Ａｑｐ１、Ａｒｃ、Ａｓｂ２、Ａｔｐ６ｖ１ｂ２、Ｂａｔｆ、Ｃａｄｐｓ２、Ｃａｍｋ２ａ、Ｃａｓｐ４、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｄ１４、Ｃｄ９３、Ｃｅｓ１ｄ、Ｃｆｉ、Ｃｈｓｔ３、Ｃｌｅｃ３ｂ、Ｃｐｎｅ７、Ｃｐｔ１ｂ、Ｃｒｔｃ２、Ｃｘｃｌ１４、Ｄｈｃｒ２４、Ｄｓｃ２、Ｄｔｎａ、Ｄｕｓｐ１、Ｅｅｆ２ｋ、Ｅｌｏｖｌ６、Ｅｐｈａ２、Ｅｐｈａ４、Ｆ３、Ｆａａｈ、Ｆｂｘｏ２７、Ｆｂｘｗ９、Ｆｋｂｐ５、Ｆｎｄｃ５、Ｆｎｄｃ９、Ｇａｂｒａ３、Ｇｂａ、Ｇｃｎｔ２、Ｇｇｃｔ、Ｇｇｐｓ１、Ｇｒｉｎ１、Ｇｓｔｏ１、Ｈｄａｃ９、Ｈｍｏｘ１、Ｉｃａｍ１、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ６、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ３１ｒａ、Ｉｒｆ１、Ｉｔｓｎ２、Ｋｉｆ９、Ｌａｍａ５、Ｌｄｂ３、Ｌｅｐ、Ｌｏｒ、Ｌｒｒｃ３９、Ｍａｌａｔ１、Ｍａｐ２ｋ３、Ｍｆａｐ４、Ｍｆｎｇ、Ｍｙｂｐｃ２、Ｍｙｏ５ｂ、Ｍｙｏｔ、Ｎａｌｃｎ、Ｎａｐ１ｌ５、Ｎｆｋｂ１、Ｎｆｋｂｉｚ、Ｎｈｌｒｃ１、Ｎｏｓ２、Ｏｇｎ、Ｐｃｌｏ、Ｐｃｙｏｘ１ｌ、Ｐｅｃａｍ１、Ｐｅｒ２、Ｐｆｋｍ、Ｐｇｒ、Ｐｉｅｚｏ１、Ｐｉｋ３ｃｇ、Ｐｉｍ１、Ｐｌａｕｒ、Ｐｌｄ３、Ｐｌｋ２、Ｐｍｍ１、Ｐｔｇｓ２、Ｒａｂ３ｃ、Ｒｂｆｏｘ１、Ｒｈｅｂｌ１、Ｒｎａｓｅ２ｂ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９、Ｓ１００ｂ、Ｓｅｌｐ、Ｓｌｃ１６ａ６、Ｓｌｃ１ａ３、Ｓｌｃ２５ａ４、Ｓｌｃ３０ａ３、Ｓｌｃ３８ａ２、Ｓｌｃ３９ａ３、Ｓｍｔｎ、Ｓｏｗａｈｃ、Ｓｐｏｎ２、Ｓｐｐ１、Ｓｔ３ｇａｌ３、Ｓｔｋ３６、Ｓｔｏｍｌ１、Ｓｔｘ１１、Ｔａｃｓｔｄ２、Ｔｂｌ１ｘ、Ｔｃｆ７ｌ１、Ｔｅｐ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｆｂｒ１、Ｔｍｅｍ１９８、Ｔｎｆａｉｐ３、Ｔｏｂ２、Ｔｒｉｍ４５、Ｔｒｉｍ５４、Ｕｎｃ５ｄ、Ｖｉｐｒ１、Ｚｂｔｂ１６、Ｚｃ３ｈ１２ｃ、またはこれらの任意の組み合わせである。
【0051】
いくつかの実施形態では、この方法は、神経変性疾患に関連する１つ以上の経路の調節のためにエクソソームをアッセイすることを含む。例えば、本方法は、カルシウムシグナル伝達、ＨＭＧＢ１シグナル伝達、ＩＬ－６シグナル伝達、およびＩＬ－８シグナル伝達についてのアッセイを含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は、免疫応答および炎症応答に関連する１つ以上の経路の調節のためにエクソソームをアッセイすることを含む。例えば、本方法は、好中球の蓄積、骨髄系細胞の移動、ＩＬ－６およびＩＬ－８の活性、またはこれらの任意の組み合わせをアッセイすることを含み得る。
【0052】
例えば、本方法は、脳障害、疾患、または損傷に関連する任意の経路の調節異常についてアッセイすることを含み得る。例えば、経路は神経炎症シグナル伝達経路、ＧＰ６シグナル伝達経路、ナチュラルキラー細胞シグナル伝達、ＨＭＧＢ１シグナル伝達、ＩＬ－６シグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達、ＩＬＫシグナル伝達、脊椎動物の心臓形成を促進する因子、ＩＬ－８シグナル伝達、異物代謝ＡＨＲシグナル伝達経路、ＩＬ－１５産生、肝線維症シグナル伝達経路、異物代謝一般シグナル伝達経路、骨関節炎経路、ＬＸＲ／ＲＸＲ活性化、Ｉ型糖尿病シグナル伝達、ネトリンシグナル伝達、樹状細胞成熟、甲状腺ホルモン代謝ＩＩ（抱合および／または分解を介する）、メラトニン分解Ｉ、ニコチン分解ＩＩ、メラトニン分解のスーパーパスウェイ、ビタミンＣの抗酸化作用、ＴＲＥＭ１シグナル伝達、ニコチン分解ＩＩＩ、心臓肥大シグナル伝達（増強）、プロテインキナーゼＡシグナル伝達、ＨＩＦ１αシグナル伝達、マウス胚性幹細胞多能性、Ｇαｉシグナル伝達、レチノール生合成、インスリン分泌シグナル伝達経路、カルシウムシグナル伝達、ＨＯＴＡＩＲ調節経路、エンドセリン－１シグナル伝達、異物代謝ＰＸＲシグナル伝達経路、セマホリンニューロン反発シグナル伝達経路、膵臓腺がんシグナル伝達、セロトニン分解、急性期応答シグナル伝達、トール様受容体シグナル伝達、ｉＮＯＳシグナル伝達、シナプス形成シグナル伝達経路、気道細胞におけるＩＬ－１７Ａシグナル伝達、ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達、心臓肥大シグナル伝達、ＳＴＡＴ３経路、Ｔｈ２経路、エンドカンナビノイド神経シナプス経路、白血球血管外遊出シグナル伝達、内因性プロトロンビン活性化経路、Ｇα１２／１３シグナル伝達、ＰＥＤＦシグナル伝達、先天性免疫のＭＩＦ調節、ＩＬ－２３シグナル伝達経路、パキシリンシグナル伝達、ＥｒｂＢシグナル伝達、樹状細胞と天然キラー細胞との間のクロストーク、異物代謝ＣＡＲシグナル伝達経路、ホスホリパーゼＣシグナル伝達、ＣＤ４０シグナル伝達、Ｔリンパ球におけるＰＫＣθシグナル伝達、ＡＭＰＫシグナル伝達、増殖因子経路による上皮間葉転換の調節、ＲｈｏＡシグナル伝達、ＧＮＲＨシグナル伝達、結腸直腸がん転移シグナル伝達、アセトン分解Ｉ（メチルグリオキサールへの）、キサンチンおよびキサントシンサルベージ、グルタチオン媒介解毒、グアニンおよびグアノシンサルベージＩ、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）シグナル伝達、アデニンおよびアデノシンサルベージＩ、ヒスタミン生合成、酢酸塩のアセチルＣｏＡへの変換、関節炎におけるＩＬ－１７Ａの役割、ＶＤＲ／ＲＸＲ活性化、タイトジャンクションシグナル伝達、グルココルチコイド受容体シグナル伝達、甲状腺ホルモン生合成、上皮細胞におけるアルドステロンシグナル伝達、コレステロール生合成のスーパーパスウェイ、ＭＳＰ－ＲＯＮシグナル伝達経路、アデニンおよびアデノシンサルベージＩＩＩ、プリンヌクレオチドデノボ生合成ＩＩ、膀胱がんシグナル伝達、抗原提示経路、ホスホリパーゼ、ヒ酸解毒Ｉ（グルタレドキシン）、クレアチンリン酸生合成、コレステロール生合成Ｉ、メチルグリオキサール分解ＩＩＩ、全身性紅斑性ループスシグナル伝達、ＩＬ－１０シグナル伝達、Ｔｈ１およびＴｈ２活性化経路、エフリンＡシグナル伝達、プロスタノイド生合成、インフルエンザの病因における高サイトカイン血症／高ケモカイン血症の役割、カルシウム輸送Ｉ、ＩＬ－１７シグナル伝達、異物代謝シグナル伝達、エイコサノイドシグナル伝達、鉄ホメオスタシスシグナル伝達経路、アテローム性動脈硬化症シグナル伝達、トリアシルグリセロール分解、オンコスタチンＭシグナル伝達、ＩＬ－１７ＡおよびＩＬ－１７ＦによるマクロファージおよびＴヘルパー細胞におけるサイトカイン産生の差次的調節、ゲラニルゲラニル二リン酸生合成、サーカディアンリズムシグナル伝達、アデノシンヌクレオチド分解ＩＩ、エストロゲン媒介Ｓ相エントリー、視覚サイクル、アペリン心臓線維芽細胞シグナル伝達経路、ｃＡＭＰ媒介シグナル伝達、先天性免疫細胞と適応性免疫細胞との間のコミュニケーション、プリンリボヌクレオシドのリボース－１－リン酸への分解、ＧＡＢＡ受容体シグナル伝達、コレステロール生合成ＩＩＩ（デスモステロールを介する）、ヒスチジン分解ＶＩ、上皮接着結合シグナル伝達、顆粒球接着および透析、乾癬におけるＩＬ－１７Ａの役割、ジモステロール生合成、コリン生合成ＩＩＩ、ヘム分解、ブプロピオン分解、プリンヌクレオチド分解ＩＩ（好気性）、顆粒球接着および透析、エポキシスクアレン生合成、ファゴソーム成熟、ＩＬ－１７ＡおよびＩＬ－１７Ｆによる腸上皮細胞におけるサイトカイン産生の差次的調節、トランス，トランスファルネシル二リン酸生合成、がんにおける組織因子の役割、ＭＩＦを介したグルココルチコイド調節、アペリン脂肪細胞シグナル伝達経路、ＢＡＧ２シグナル伝達経路、ＤＮＡ障害誘発性１４－３－３σシグナル伝達、上皮間葉転換経路の調節、Ｌ－カルニチン生合成、エストロゲン生合成、ＲＡＲ活性化、コレステロール生合成ＩＩ（２４，２５－ジヒドロラノステロールを介する）、生殖細胞－セルトリ細胞接合部シグナル伝達、肝線維症／肝星状細胞活性化、４－アミノ酪酸分解Ｉ、ｅＮＯＳシグナル伝達、レチノエート生合成Ｉ、ＩＬ－７シグナル伝達経路、脂肪酸α－酸化、アレルギー性炎症性気道疾患におけるＩＬ－１７Ｆの役割、シルデナフィル（Ｖｉａｇｒａ）の細胞効果、移植片対宿主疾患のシグナル伝達、骨格筋細胞におけるｎＮＯＳシグナル伝達、アナンダミド分解、アペリン肝シグナル伝達経路、ビタミンＣ輸送、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【0053】
いくつかの態様では、方法は、イムノアッセイである。最も単純かつ直接的な意味でのイムノアッセイは、抗体と抗原との間の結合を含む結合アッセイである。多くの種類および形式のイムノアッセイが知られており、すべて、開示されるバイオマーカーを検出するのに好適である。イムノアッセイの例として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラジオイムノ沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）、イムノビーズ捕捉アッセイ、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、ゲルシフトアッセイ、フローサイトメトリー、タンパク質アレイ、多重ビーズアレイ、磁気捕捉、インビボイメージング、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、および光退色後の蛍光回復／局在化（ＦＲＡＰ／ＦＬＡＰ）が挙げられる。
【0054】
一般に、イムノアッセイは、目的の分子（開示されたバイオマーカーなど）を含むと疑われるサンプルを目的の分子に対する抗体と接触させること、または、場合によっては、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で、目的の分子に対する抗体（開示されたバイオマーカーへの抗体など）を抗体によって結合され得る分子と接触させることを含む。サンプルを目的の分子に対する抗体に接触させること、または免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするのに有効な条件下で十分な期間、目的の分子に対する抗体によって結合され得る分子と接触させることは、概して、単に分子または抗体とサンプルとを接触させ、抗体が、抗体が結合することができる任意の分子（例えば、抗原）と免疫複合体を形成する、すなわちと結合するのに十分な期間、混合物をインキュベートすることである。多くの形態のイムノアッセイにおいて、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロット、またはウエスタンブロットなどのサンプル－抗体組成物を洗浄して、任意の非特異的に結合した抗体種を除去し、一次免疫複合体内に特異的に結合した抗体のみを検出することを可能にすることができる。
【0055】
イムノアッセイは、サンプル中の目的の分子（開示されたバイオマーカーまたはそれらの抗体など）の量を検出または定量化するための方法を含むことができ、これらの方法は、一般に、結合プロセス中に形成される任意の免疫複合体の検出または定量化を含む。一般に、免疫複合体形成の検出は当該技術分野で周知であり、多数のアプローチを適用することによって達成することができる。これらの方法は、概して、任意の放射性、蛍光、生物学的もしくは酵素的タグ、または任意の他の既知の標識などの標識またはマーカーの検出に基づく。
【0056】
いくつかの態様では、本方法は、ｍＲＮＡバイオマーカーを検出することを含む。全ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡサンプル中の特定のｍＲＮＡの存在量を検出および決定するための、広く使用されているいくつかの手順が存在する。例えば、特異的ｍＲＮＡは、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）、インサイチュハイブリダイゼーション、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して検出することができる。いくつかの実施形態では、方法は、ｑＲＴ－ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、または分子ビーコンもしくは分子フレア／プローブとのインサイチュハイブリダイゼーションを含む。
【0057】
改変皮膚由来細胞外ビヒクル（ＥＶ）
皮膚由来エクソソームを、対象の脳に送達される治療用カーゴで改変することによって、神経学的疾患を有する対象を治療する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の皮膚を操作して、治療用エクソソームを産生することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、皮膚で産生されたエクソソームを収集することと、それらに治療用カーゴを充填することと、を含む。
皮膚由来エクソソームを、対象の脳に送達される治療用カーゴで改変することによって、神経学的疾患を有する対象を治療する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の皮膚を操作して、治療用エクソソームを産生することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、皮膚で産生されたエクソソームを収集することと、それらに治療用カーゴを充填することと、を含む。
【0058】
治療用ＥＶを生産するための皮膚細胞の操作
皮膚細胞に治療用遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを細胞内送達することを含む、皮膚細胞をＥＶ産生細胞にリプログラミングする方法もまた開示される。
皮膚細胞に治療用遺伝子をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを細胞内送達することを含む、皮膚細胞をＥＶ産生細胞にリプログラミングする方法もまた開示される。
【0059】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象の皮膚を、抗Ｔａｕ ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせをコードする発現ベクターでトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象の皮膚を、ｓｉＲＮＡ、またはグリア細胞活性を低下させるｍＲＮＡなどの１つ以上の抗炎症性遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフェクトすることを含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ｅｔｖ２（ＮＭ＿００１３００９７４．２、ＮＭ＿００１３０４５４９．２、ＮＭ＿０１４２０９．４）、Ｆｏｘｃ２（ＮＭ＿００５２５１．３）、Ｆｌｉ１（ＮＭ＿００１１６７６８１．２、ＮＭ＿００１２７１０１０．１、ＮＭ＿００１２７１０１２．１、ＮＭ＿００２０１７．５）、ＶＥＧＦＡ（ＮＭ＿００１０２５３６６．３、ＮＭ＿００１０２５３６７．３、ＮＭ＿００１０２５３６８．３、ＮＭ＿００１０２５３６９．３、ＮＭ＿００１０２５３７０．３ ＮＭ＿００１０３３７５６．３、ＮＭ＿００１１７１６２２．２、ＮＭ＿００１１７１６２３．１、ＮＭ＿００１１７１６２４．１、ＮＭ＿００１１７１６２５．１、ＮＭ＿００１１７１６２６．１、ＮＭ＿００１１７１６２７．１、ＮＭ＿００１１７１６２８．１、ＮＭ＿００１１７１６２９．１、ＮＭ＿００１１７１６３０．１、ＮＭ＿００１２０４３８４．１、ＮＭ＿００１２０４３８５．２、ＮＭ＿００１２８７０４４．２、ＮＭ＿００１３１７０１０．１、ＮＭ＿００３３７６．６）、ＶＥＧＦＢ（ＮＭ＿００３３７７．５、ＮＭ＿００１２４３７３３．２）、ＶＥＧＦＣ（ＮＭ＿００５４２９．５）、ＶＥＧＦＤ（ＮＭ＿００４４６９．５）、ｂＦＧＦ（ＮＭ＿００１３６１６６５．２、ＮＭ＿００２００６．５）、Ｓｏｘ１７（ＮＭ＿０２２４５４．４）、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４（ＮＭ＿００１３１４０５２．２、ＮＭ＿００４２３５．６）、またはこれらの任意の組み合わせなどの１つ以上の血管新生因子をコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクトすることを含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、この方法は、Ａｓｃｌ１（ＮＭ＿００４３１６．４）、Ａｓｃｌ２（ＮＭ＿００５１７０．３）、Ａｓｃｌ３（ＮＭ＿０２０６４６．２）、Ａｓｃｌ５（ＮＭ＿００１２７０６０１．１）、Ｎｅｕｒｏｇ１（ＮＭ＿００６１６１．３）、Ｎｅｕｒｏｇ２（ＮＭ＿０２４０１９．４）、Ｎｅｕｒｏｇ３（ＮＭ＿０２０９９９．４）、Ｎｅｕｒｏｄ１（ＮＭ＿００２５００．５）、Ｎｅｕｒｏｄ２（ＮＭ＿００６１６０．４）、Ｎｅｕｒｏｄ４（ＮＭ＿０２１１９１．３）、Ｎｅｕｒｏｄ６（ＮＭ＿０２２７２８．４）、Ａｔｏｈ１（ＮＭ＿００５１７２．２）、Ａｔｏｈ７（ＮＭ＿１４５１７８．４）、Ａｔｏｈ８（ＮＭ＿０３２８２７．７）、Ｍｙｆ５（ＮＭ＿００５５９３．３）、Ｐｔｆ１ａ（ＮＭ＿１７８１６１．３）、Ｂｒｎ３ｃ（ＮＭ＿００２７００．３）、Ｂｒｎ３ａ（ＮＭ＿００６２３７．４）、Ｂｒｎ３ｂ（ＮＭ＿００４５７５．３）、Ｂｒｎ１（ＮＭ＿００６２３６．３）、Ｂｒｎ２（ＮＭ＿００５６０４．４）、Ｂｒｎ４（ＮＭ＿０００３０７．５）、Ｏｃｔ４（ＮＭ＿００１１７３５３１．２）、Ｏｃｔ６（ＮＭ＿００２６９９．４）、Ｐｉｔ１（ＮＭ＿０００３０６．４）、Ｂｒｎ５（ＮＭ＿００１３３０４２２．２）、Ｍｙｔ１ｌ（ＮＭ＿００１３０３０５２．２）、Ｎｕｒｒ１（ＮＭ＿００６１８６．４）、またはこれらの組み合わせなどの１つ以上の神経原性因子をコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクトすることを含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、この方法は、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４２２、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８３５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７７２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７１９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｆ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１５ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６８１３－５ｐ、またはこれらの任意の組み合わせなどの、抗ＡＰＰのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクトすることを含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、この方法は、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－４７２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３９７８、またはこれらの任意の組み合わせなどの抗ＭＡＰＴのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクトすることを含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＰＰＡＲγ（ＮＭ＿００１３３０６１５．４、ＮＭ＿００１３５４６６６．３、ＮＭ＿００１３５４６６７．３、ＮＭ＿００１３５４６６８．２、ＮＭ＿００１３５４６６９．２、ＮＭ＿００１３５４６７０．２、ＮＭ＿００１３７４２６１．３、ＮＭ＿００１３７４２６２．３、ＮＭ＿００１３７４２６３．２、ＮＭ＿００１３７４２６４．２、ＮＭ＿００１３７４２６５．１、ＮＭ＿００１３７４２６６．１、ＮＭ＿００５０３７．７、ＮＭ＿０１５８６９．５、ＮＭ＿１３８７１１．６、ＮＭ＿１３８７１２．５）、Ｉｌ－１０（ＮＭ＿０００５７２．３、ＮＭ＿００１３８２６２４．１）、Ｉｌ－２７（ＮＭ＿１４５６５９．３）、Ｔｒｅｍ２（ＮＭ＿００１２７１８２１．２、ＮＭ＿０１８９６５．４）、ＩｋＢα（ＮＭ＿０２０５２９．３）、Ｓｉｒｔ１（ＮＭ＿００１１４２４９８．１、ＮＭ＿００１３１４０４９．１、ＮＭ＿０１２２３８．５）、またはそれらの任意の組み合わせなどの抗炎症性遺伝子をコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクションすることを含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、この方法は、炎症促進性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードする発現ベクターで対象の皮膚をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ－５ｐ、またはｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ－５ｐなどの抗Ｐ２Ｘ４ＲのｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８、またはｈｓａ－ｍｉＲ－３９２４などの抗ＴＬＲ４のｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２６１、またはｈｓａ－ｍｉＲ－１４７ｂ－５ｐなどの抗ＣＸ３ＣＲ１のｍｉＲＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６８８、またはｈｓａ－ｍｉＲ－４９５－３ｐなどの抗ＩＬ－１βのｍｉＲＮＡであり得る。
【0066】
いくつかの実施形態では、核酸配列は、非ウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態では、核酸配列は、発現制御配列に作動可能に連結されている。他の実施形態では、核酸は、２つ以上の発現制御配列に作動可能に連結されている。
【0067】
ウイルスおよび非ウイルス媒介技法を含む、様々な方法が当該技術分野で既知であり、細胞への核酸の導入に好適である。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性導入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性導入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタ媒介性導入（ナノ粒子）、カチオン性ポリマー媒介性導入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
いくつかの実施形態では、標的細胞をトランスフェクションした後、細胞は次いで、トランスフェクトされた遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）をＥＶにパックすることができ、これは次いで、他の皮膚細胞を誘導してＥＶ産生細胞を形成することができる。したがって、開示された治療用遺伝子を含むかまたは発現する細胞から産生された細胞外小胞で体細胞を曝露することを含む、皮膚細胞をＥＶ産生細胞にリプログラミングする方法も開示される。
【0069】
したがって、開示された治療用遺伝子をコードする１つ以上の核酸配列を含む外因性ポリヌクレオチドを発現するかまたは含む細胞から単離された細胞外小胞（ＥＶ）に皮膚細胞を曝露することを含む、皮膚細胞をＥＶ産生細胞にリプログラミングする方法が開示される。次いで、ドナー細胞によって分泌されたＥＶを培養培地から収集することができる。次いで、これらのＥＶを皮膚細胞に投与して、それらをインスリン産生細胞にリプログラミングすることができる。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は、皮膚細胞（例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、皮膚幹細胞）、脂肪細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、膵臓細胞（例えば、管状上皮細胞）、肝臓細胞（例えば、肝細胞）、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞）を含むが、これらに限定されない、ＥＶを産生することができる対象からの任意の細胞であり得る。
【0070】
神経学的疾患を治療するために使用することができる、インビトロおよびインビボの両方で皮膚細胞をＥＶ産生細胞にリプログラミングするための組成物および方法が本明細書に開示される。
【0071】
エクソソームおよび微小小胞体は、サイズおよび表面タンパク質マーカーを含む、それらの生物発生のプロセスおよび生物物理学的特性に基づいて異なるＥＶである。エクソソームは、４０～１５０ｎｍのサイズの均質な小さな粒子であり、それらは通常、エンドサイトーシスリサイクル経路に由来する。エンドサイトーシスでは、形質膜でエンドサイトーシス小胞が形成され、融合して初期のエンドソームを形成する。これらは成熟して後期エンドソームとなり、ここで管腔内小胞が出芽して小胞内腔となる。これらの多胞体は、リソソームと融合する代わりに、形質膜と直接融合し、エクソソームを細胞外空間に放出する。エクソソーム生体発生、タンパク質カーゴ選別、および放出は、輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ複合体）、ならびにＡｌｉｘおよびＴｓｇ１０１などの他の関連タンパク質を含む。対照的に、微小小胞体は、形質膜からの膜小胞の外向きの出芽および分裂を通じて直接産生され、したがって、それらの表面マーカーは、起源の膜の組成に大きく依存する。さらに、それらは、直径１５０～１０００ｎｍの範囲の、細胞外小胞のより大きく、より多様な集団を構成する傾向がある。しかしながら、両方のタイプの小胞は、機能的ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびタンパク質をレシピエント細胞に送達することが示されている。
【0072】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子ガン、そのような送達に好適な微小粒子またはナノ粒子、エレクトロポレーションによるトランスフェクション、三次元ナノチャネルエレクトロポレーション、組織ナノトランスフェクションデバイス、そのような送達に好適なリポソーム、または深層腫瘍組織ナノエレクトロインジェクションデバイスを介して、体細胞またはＥＶのためのドナー細胞に細胞内送達される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを使用することができる。しかしながら、他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス送達されない。
【0073】
エレクトロポレーションは、細胞膜の透過性を増加させるために電場を細胞に印加し、カーゴ（例えば、リプログラミング因子）を細胞に導入することを可能にする技法である。エレクトロポレーションは、細胞に外来ＤＮＡを導入するための一般的な技法である。
【0074】
組織ナノトランスフェクションは、配列されたナノチャネルを介して非常に強度の高い集束電場を印加することによって、細胞内へのカーゴ（例えば、リプログラミング因子）の直接細胞質送達を可能にし、これは、並列する組織細胞メンバーを良性的にナノポアリングし、カーゴを細胞内に電気泳動的に誘導する。
【0075】
ポリペプチドまたは機能的核酸を発現するために、ヌクレオチドコード配列を適切な発現ベクターに挿入し得る。したがって、本明細書に開示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターも開示され、核酸配列は発現制御配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸配列は、単一の発現制御配列に作動可能に連結されている。他の実施形態では、核酸配列は、２つ以上の別個の発現制御配列に作動可能に連結されている。
【0076】
遺伝子配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築する方法は、当該技術分野において周知である。これらの方法には、インビトロの組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびインビボの遺伝子組換えが含まれる。そのような技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されている。
【0077】
発現ベクターは、概して、挿入されたコード配列の翻訳および／または転写に必要な調節配列エレメントを含む。例えば、コード配列は好ましくはプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助する。
【0078】
バイオテクノロジーで使用されるプロモーターは、遺伝子発現の意図される制御のタイプに応じて異なるタイプである。これらは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的または発生段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および合成プロモーターに分けることができる。
【0079】
構成的プロモーターは、ほとんどすべての組織における発現を誘導し、環境因子および発生因子とは完全ではないにせよほとんど無関係である。それらの発現は通常、内因性因子によって条件付けられるものではないため、構成的プロモーターは通常、種全体、さらには界全体で活性である。構成的プロモーターの例として、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトβアクチン、およびＣＡＧが挙げられる。
【0080】
組織特異的または発生段階特異的プロモーターは、特定の組織または特定の発生段階における遺伝子の発現を誘導する。植物の場合、脈管系、光合成組織、塊茎、根、および他の植物性器官、または種子および他の生殖器官における遺伝子を発現するかまたは発現に影響を及ぼすプロモーターエレメントは、異種系（例えば、遠く関連する種、または他の界でさえも）に見出すことができるが、最大の特異性は、一般に、相同プロモーター（すなわち、同じ種、属、または科に由来する）で達成される。これはおそらく、転写因子の協調発現がプロモーターの活性の調節に必要であるためである。
【0081】
誘導性プロモーターの性能は、内因性因子ではなく、人為的に制御することができる環境条件および外部刺激によって条件付けられる。このグループ内には、光、酸素レベル、熱、寒さ、および傷害などの非生物学的因子によって調節されるプロモーターが存在する。これらの因子のいくつかは、実験環境の外で制御することが困難であるため、目的の生物に天然には見られない化合物に応答するプロモーターが特に興味深い。これらに沿って、抗生物質、銅、アルコール、ステロイド、および除草剤、とりわけ他の化合物に応答するプロモーターは、任意に、かつ他の生物学的または非生物学的因子とは無関係に、遺伝子活性の誘導を可能にするように適合および精密化されている。
【0082】
真核生物細胞生物学の研究のために最も一般的に使用される２つの誘導性発現系は、Ｔｅｔ－ＯｆｆおよびＴｅｔ－Ｏｎと名付けられる。Ｔｅｔ－Ｏｆｆ系は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細菌に見られる１つのタンパク質ＴｅｔＲ（テトラサイクリンリプレッサー）と、ヘルペス単純ウイルスに見られる別のタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインとを融合させることによって作製されるテトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）タンパク質を利用する。得られたｔＴＡタンパク質は、特定のＴｅｔＯオペレーター配列でＤＮＡに結合することができる。ほとんどのＴｅｔ－Ｏｆｆ系において、そのようなＴｅｔＯ配列のいくつかの反復は、ＣＭＶプロモーターなどの最小限のプロモーターの上流に配置される。最小限のプロモーターを有するいくつかのＴｅｔＯ配列の全体は、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）と呼ばれる。なぜなら、それは、そのプロモーターの下流の遺伝子（複数可）の発現の増加によってテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質ｔＴＡの結合に応答するからである。Ｔｅｔ－Ｏｆｆシステムでは、ＴＲＥ制御遺伝子の発現は、テトラサイクリンおよびその誘導体によって抑制され得る。それらはｔＴＡに結合し、ＴＲＥ配列に結合することができなくなり、それによってＴＲＥ制御遺伝子のトランス活性化を防止する。Ｔｅｔ－Ｏｎ系は、同様に機能するが、逆の方法で作動する。Ｔｅｔ－Ｏｆｆ系においては、ｔＴＡは、Ｔｅｔ－Ｏｎ系においてテトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのその誘導体の１つに結合していない場合にのみオペレーターに結合することができ、ｒｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリンに結合している場合にのみオペレーターに結合することができる。したがって、ドキシサイクリンの系への導入は、遺伝子産物の転写を開始する。Ｔｅｔ－Ｏｎ系は、その応答性が速いため、Ｔｅｔ－Ｏｆｆよりも好ましいことがある。
【0083】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、同じ発現制御配列に作動可能に連結されている。代替的に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、マルチ遺伝子またはポリシストロニックのメッセージを作成することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム走査モデルをバイパスし、内部部位で翻訳を開始することができる。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに結合させることができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、それぞれがＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを作成する。ＩＲＥＳエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子を、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現させ、単一のメッセージを転写することができる。
【0084】
発現制御配列に作動可能に連結された本明細書に開示される１つ以上のポリヌクレオチドを含む非ウイルスベクターが開示される。そのような非ウイルスベクターの例としては、オリゴヌクレオチド単独、または好適なタンパク質、多糖類、もしくは脂質製剤と組み合わせたものが挙げられる。非ウイルス法は、ウイルス法よりも特定の利点を提示し、単純な大規模生産および低い宿主免疫原性は、まさに２つである。以前は、低レベルのトランスフェクションおよび遺伝子の発現は、非ウイルス法を不利であるようにしてきたが、最近のベクター技術の進歩により、ウイルスと同様のトランスフェクション効率を有する分子および技法が得られた。
【0085】
好適な非ウイルスベクターの例としては、ｐＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰ－２ａ、ｐＣＭＶ６、ｐＭＡＸ、ｐＣＡＧ、ｐＡｄ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、およびｐＣＤＮＡ３．０が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
開示される組成物は、治療する上で、薬学的に許容される担体と組み合わせて使用することができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたは他の方法で望ましくない材料を意味し、すなわち、材料は、任意の望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、または材料が含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸またはベクターとともに対象に投与することができる。担体は、当業者に周知であるように、活性成分の任意の分解を最小限に抑え、対象における任意の有害な副作用を最小限に抑えるように当然に選択されるであろう。
【0087】
改変皮膚由来ＥＶ
皮膚で産生されたエクソソームを収集し、治療用カーゴを充填する方法もまた開示される。いくつかの実施形態では、開示されるＥＶは、細胞によってセレートされ得る任意の小胞であり得る。細胞は、アポトーシス体（１～５μｍ）、微小小胞体（サイズ１００～１０００ｎｍ）、およびエクソソーム（５０～１５０ｎｍ）として知られるエンドソーム起源の小胞を含む、幅広い直径および機能を有する細胞外小胞（ＥＶ）を分泌する。
皮膚で産生されたエクソソームを収集し、治療用カーゴを充填する方法もまた開示される。いくつかの実施形態では、開示されるＥＶは、細胞によってセレートされ得る任意の小胞であり得る。細胞は、アポトーシス体（１～５μｍ）、微小小胞体（サイズ１００～１０００ｎｍ）、およびエクソソーム（５０～１５０ｎｍ）として知られるエンドソーム起源の小胞を含む、幅広い直径および機能を有する細胞外小胞（ＥＶ）を分泌する。
【0088】
開示される細胞外小胞は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。例えば、開示される細胞外小胞は、細胞標的化リガンドをコードするｍＲＮＡを真核細胞内で発現することによって調製され得る。いくつかの実施形態では、細胞はまた、治療用カーゴをコードするｍＲＮＡを発現する。細胞標的化リガンドおよび治療用カーゴのためのｍＲＮＡは、開示されるＥＶを産生するのに好適な産生細胞にトランスフェクトされるベクターから発現され得る。細胞標的化リガンドおよび治療用カーゴのためのｍＲＮＡは、同じベクターから発現されてもよく（例えば、ベクターが細胞標的化リガンドのためのｍＲＮＡおよび別個のプロモーターからの治療用カーゴを発現する場合）、または細胞標的化リガンドおよび治療用カーゴのためのｍＲＮＡは、別個のベクターから発現されてもよい。細胞標的化リガンドおよび治療用カーゴのためのｍＲＮＡを発現させるためのベクター（複数可）は、開示される細胞外小胞を調製するために設計されたキットにパッケージングされ得る。
【0089】
好適な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して、製剤を等張性にする。薬学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは約７～約７．５である。さらなる担体としては、マトリックスが成形品の形態、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子である、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの持続放出製剤が挙げられる。当業者には、例えば、投与される組成物の投与経路および濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましい場合があることが明白であろう。
【0090】
医薬担体は、当業者に既知である。これらは、最も典型的に、滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨでの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬物の投与のための標準的な担体である。組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与される。
【0091】
医薬組成物は、選択される分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、表面活性剤などを含み得る。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの、１種以上の活性成分を含んでもよい。
【0092】
非経口的投与の製剤としては、滅菌した水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどもまた存在し得る。
【0093】
局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体、および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが、必要となるかまたは望ましい場合がある。
【0094】
経口投与のための組成物としては、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、小袋、または錠剤が挙げられる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい場合がある。
【0095】
組成物のうちのいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルアミンおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基類との反応によって形成される、薬学的に許容される酸付加塩または塩基付加塩として、投与される可能性があり得る。
【0096】
医薬組成物を含む、本明細書に開示される組成物は、局所治療または全身治療が所望されるかどうか、および治療される領域に応じて、多くの様式で投与され得る。例えば、開示される組成物は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。組成物は、局所鼻腔内投与または吸入剤による投与を含む、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、眼科的、膣内、直腸、鼻腔内、局所などに投与することができる。
【0097】
治療用カーゴ
開示される細胞外小胞には、治療剤が充填されてよく、ここで、細胞外小胞は、薬剤を標的細胞に送達する。好適な治療薬としては、治療剤（例えば、低分子薬）、治療用タンパク質、および治療用核酸（例えば、治療用ＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、開示される細胞外小胞は、治療用ＲＮＡ（本明細書において「カーゴＲＮＡ」とも称される）を含む。
開示される細胞外小胞には、治療剤が充填されてよく、ここで、細胞外小胞は、薬剤を標的細胞に送達する。好適な治療薬としては、治療剤（例えば、低分子薬）、治療用タンパク質、および治療用核酸（例えば、治療用ＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、開示される細胞外小胞は、治療用ＲＮＡ（本明細書において「カーゴＲＮＡ」とも称される）を含む。
【0098】
例えば、いくつかの実施形態では、細胞標的化モチーフを含む融合タンパク質はまた、細胞外小胞が細胞から分泌される前に、カーゴＲＮＡを細胞外小胞にパッケージングするためにカーゴＲＮＡに存在する１つ以上のＲＮＡモチーフに結合するＲＮＡドメイン（例えば、融合タンパク質の細胞質Ｃ末端）を含む。したがって、融合タンパク質は、「細胞標的化タンパク質」と「パッケージングタンパク質」の両方として機能し得る。いくつかの実施形態では、パッケージングタンパク質は、細胞外小胞充填タンパク質または「ＥＶ充填タンパク質」と称され得る。
【0099】
いくつかの実施形態では、カーゴＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、抗炎症剤はマイクロＲＮＡ１４６ａである。他のｍｉＲＮＡは、Ｍ１選好解糖代謝（例えば、ｍＲｒ９、ｍｉＲ１２７、およびｍｉＲ１５５）を担う主要分子の発現を調節することが報告されている。
【0100】
開示される細胞外小胞のカーゴＲＮＡは、任意の好適な長さであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴＲＮＡは、少なくとも約１０ｎｔ、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、５０００ｎｔ、またはそれ以上のヌクレオチド長を有し得る。他の実施形態では、カーゴＲＮＡは、約５０００ｎｔ、２０００ｎｔ、１０００ｎｔ、５００ｎｔ、２００ｎｔ、１００ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、または１０ｎｔ以下のヌクレオチド長を有し得る。さらにさらなる実施形態では、カーゴＲＮＡは、これらの想定されるヌクレオチド長の範囲内のヌクレオチド長、例えば、約１０ｎｔ～５０００ｎｔの範囲内のヌクレオチド長、または他の範囲内のヌクレオチド長を有し得る。開示される細胞外小胞のカーゴＲＮＡは、例えば、カーゴＲＮＡがｍＲＮＡまたは別の比較的長いＲＮＡを含む場合、比較的長くてもよい。
【0101】
いくつかの実施形態では、治療用カーゴは、ＥＶが細胞によって分泌された後にＥＶに充填される膜透過性の薬理学的化合物である。いくつかの実施形態では、カーゴは、標的腫瘍細胞のアポトーシスまたはピロプトーシスを引き起こし得る抗がん剤である。いくつかの実施形態では、抗がん剤は低分子薬物である。例えば、いくつかの実施形態では、カーゴはイブルチニブである。本明細書に記載される腫瘍標的ペプチドに結合させる抗がん剤または抗腫瘍剤のさらなる例としては、非限定的に、アクラルビシン、アルトレタミン、アミノプテリン、アムルビシン、アザシチジン、アザチオプリン、ベロテカン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルモフール、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、デシタビン、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、フルオロウラシル、ゲムシタビン、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、メクロレタミン、メルファン、メカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ネダプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピラルビシン、ピキサントロン、プロカルバジン、ピリメタミンラルチトレキセド、ルビテカン、サトラプラチン、ストレプトゾシン、チオグアニン、テトラニトレートトリプラチン、テニポシド、トポテカン、テガフール、トリメトプリム、ウラムスチン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、およびゾルビシンが挙げられる。
【0102】
ＥＶへの小型ＲＮＡの充填を達成するために、トランスフェクションに基づくアプローチが提案されている。他の報告は、細胞内の小型ＲＮＡのベクター誘導発現を使用して、ＥＶへの小型ＲＮＡ充填を達成することができることを示している。代替的に、ＥＶドナー細胞を小型ＲＮＡで直接トランスフェクトしてもよい。腫瘍細胞を化学療法薬とともにインキュベーションすることは、薬物をＥＶにパッケージングする別の方法でもある。薬物充填ＥＶの形成を刺激するために、細胞に紫外線を照射してアポトーシスを誘導する。膜融合性リポソームなどの代替的アプローチはまた、薬物をＥＶに充填することをもたらす。
【0103】
いくつかの実施形態では、治療用カーゴは、濃度勾配を介して拡散することによってＥＶに充填される。
【0104】
方法
また、本明細書では、神経学的疾患を治療するために開示されるＥＶを使用するための方法も企図される。例えば、開示される細胞外小胞は、治療用遺伝子またはカーゴを送達することによって、脳の任意の損傷、疾患、または障害のために使用され得る。いくつかの実施形態では、開示される細胞外小胞は、脊髄損傷、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、小脳または脊髄小脳変性症、脳および脊髄腫瘍、脳動脈瘤、てんかん、外傷性脳損傷、多発性硬化症、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、自閉症スペクトラム障害、脳性麻痺、慢性疼痛、レビー小体型認知症、偏頭痛、ニーマン・ピック病、前頭側頭型認知症、ＣＡＤＡＳＩＬ、脊髄小脳変性および萎縮、またはそれらの任意の組み合わせを治療するために使用され得る。
また、本明細書では、神経学的疾患を治療するために開示されるＥＶを使用するための方法も企図される。例えば、開示される細胞外小胞は、治療用遺伝子またはカーゴを送達することによって、脳の任意の損傷、疾患、または障害のために使用され得る。いくつかの実施形態では、開示される細胞外小胞は、脊髄損傷、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、運動失調症、小脳または脊髄小脳変性症、脳および脊髄腫瘍、脳動脈瘤、てんかん、外傷性脳損傷、多発性硬化症、パーキンソン病、脳卒中、ハンチントン病、自閉症スペクトラム障害、脳性麻痺、慢性疼痛、レビー小体型認知症、偏頭痛、ニーマン・ピック病、前頭側頭型認知症、ＣＡＤＡＳＩＬ、脊髄小脳変性および萎縮、またはそれらの任意の組み合わせを治療するために使用され得る。
【0105】
開示されるＥＶは、任意の好適な手段によって対象に投与することができる。ヒトまたは動物対象への投与は、非経口投与、筋肉内投与、脳内投与、血管内投与、皮下投与、または経皮投与から選択され得る。典型的には、送達方法は注射によるものである。好ましくは、注射は筋肉内または血管内（例えば、静脈内）である。医師は、特定の患者ごとに必要な投与経路を決定することができるであろう。
【0106】
ＥＶは、好ましくは、組成物として送達される。組成物は、非経口、筋肉内、脳内、血管内（静脈内を含む）、皮下、または経皮投与のために製剤化され得る。非経口投与用の組成物は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。ＥＶは、ＥＶに加えて、薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、および他の薬学的に許容される担体または賦形剤などを含み得る医薬組成物中で製剤化され得る。
【0107】
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内、または静脈内などの注射によって特徴付けられる。非経口投与の調製物としては、注射の準備ができている滅菌溶液、皮下錠剤を含む使用直前に溶媒と組み合わせる準備ができている凍結乾燥粉末などの滅菌乾燥可溶性製品、注射の準備ができている滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わせる準備ができている滅菌乾燥不溶性製品、滅菌エマルジョンが挙げられる。溶液は、水性または非水性のいずれであってもよい。
【0108】
静脈内投与する場合、好適な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および可溶化剤、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。非経口調製物で使用される薬学的に許容される担体としては、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、および他の薬学的に許容される物質が挙げられる。水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、デキストロースおよび乳酸化リンゲル注射が挙げられる。非水非経口ビヒクルとしては、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、およびピーナッツ油が挙げられる。静菌濃度または静真菌濃度での抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む複数用量の容器にパッケージングされた非経口調製物に添加しなければならない。等張剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝液としては、リン酸塩およびクエン酸塩が挙げられる。抗酸化剤としては、硫酸水素ナトリウムが挙げられる。局所麻酔薬としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤および分散剤としては、カルボキシメチルセルオースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。
【0109】
乳化剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬担体としては、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も挙げられる。薬学的に活性な化合物の濃度は、注射が所望の薬理学的効果をもたらす有効量をもたらすように調整される。正確な用量は、当該技術分野で既知の患者または動物の年齢、体重、および状態に依存する。
【0110】
単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアル、または針を備えたシリンジにパッケージングすることができる。非経口投与のためのすべての調製物は、当該技術分野で既知であり、かつ実施されるように、滅菌であるべきである。
【0111】
治療有効量の組成物を投与する。用量は、様々なパラメータ、特に、治療される患者の状態の重症度、年齢、および体重、投与経路、および必要なレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の患者に対して必要な投与経路および投与量を決定することができるであろう。最適な投与量は、個々の構築物の相対的効力に応じて変動し得、一般に、インビトロおよびインビボの動物モデルで有効であることが見出されるＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投与量は体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇである。典型的な１日用量は、特定の構築物の効力、治療される対象の年齢、体重および状態、疾患の重症度、ならびに投与頻度および投与経路に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．１～５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。投与が筋肉内注射または全身（静脈内または皮下）注射によるものであるかどうかに応じて、異なる用量の構築物が投与され得る。
【0112】
好ましくは、単回筋肉内注射の用量は、約５～２０μｇの範囲である。好ましくは、単回または複数回の全身注射の用量は、１０～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
【0113】
構築物のクリアランス（および任意の標的分子の分解）により、患者は、例えば１日に１回以上、週に１回、月に１回、または年に１回の繰り返し治療を受けなければならない場合がある。当業者は、測定された滞留時間および体液または組織中の構築物の濃度に基づいて、投与の繰り返し頻度を容易に推定することができる。治療成功後、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、構築物は、体重１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇの範囲の維持用量で、１日１回以上から２０年に１回までで投与される。
【0114】
本明細書ではまた、皮膚からのエクソソーム放出を減少させて、脳への輸送を減少させる方法も開示される。例えば、いくつかの実施形態では、中性スフィンゴミエリナーゼ阻害剤ＧＷ４８６９を局所的におよび／または皮内注射を介して適用して、皮膚エクソソーム放出を低減することができる。
【0115】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【実施例】
【0116】
実施例１：アルツハイマー病における皮膚脳相関。
本実施例は、皮膚細胞によって排出されるエクソソームがＡＤの発症および／または進行を遠隔的に調節することができる程度、ならびにエクソソーム操作アプローチがこの疾患に対する新規の治療戦略をもたらすことができるかどうかを評価することによって、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるパラダイムをシフトさせる可能性のある概念である、皮膚脳相関の役割を明らかにしようとする（図１）。したがって、提案される研究は、神経変性に対する非神経組織の貢献を定義すること、および介入のための新たな手段を指し得る疾患メカニズムを明らかにすることを含む、ＡＤ研究およびケアに高い関心を有するいくつかの重点分野を対象とする。ＡＤの生化学、遺伝学、および病理学を理解するために有意な進歩を遂げたが、発症または進行の基礎となる細胞および分子の事象の時間的配列には依然として大きな知識ギャップがある（Ｓｅｌｋｏｅ Ｄ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１４０（８）：６２７－６３８）。この実施例は、皮膚から発する遠隔的な合図を介して、ＡＤが引き起こされるか、悪化するか、または治療されるかどうかを初めて研究する。したがって、ここで提案されている作業は根本的に革新的であり、潜在的に変革的である。
本実施例は、皮膚細胞によって排出されるエクソソームがＡＤの発症および／または進行を遠隔的に調節することができる程度、ならびにエクソソーム操作アプローチがこの疾患に対する新規の治療戦略をもたらすことができるかどうかを評価することによって、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるパラダイムをシフトさせる可能性のある概念である、皮膚脳相関の役割を明らかにしようとする（図１）。したがって、提案される研究は、神経変性に対する非神経組織の貢献を定義すること、および介入のための新たな手段を指し得る疾患メカニズムを明らかにすることを含む、ＡＤ研究およびケアに高い関心を有するいくつかの重点分野を対象とする。ＡＤの生化学、遺伝学、および病理学を理解するために有意な進歩を遂げたが、発症または進行の基礎となる細胞および分子の事象の時間的配列には依然として大きな知識ギャップがある（Ｓｅｌｋｏｅ Ｄ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ，１４０（８）：６２７－６３８）。この実施例は、皮膚から発する遠隔的な合図を介して、ＡＤが引き起こされるか、悪化するか、または治療されるかどうかを初めて研究する。したがって、ここで提案されている作業は根本的に革新的であり、潜在的に変革的である。
【0117】
ＡＤは現在５８０万人以上のアメリカ人に影響を及ぼしている最も一般的な認知症の形態であり、２０５０年までに約１３８０万人に影響を及ぼすと予想されている（Ｇａｕｇｌｅｒ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＡＬＺＨＥＩＭＥＲＳ＆ＤＥＭＥＮＴＩＡ ２０１９，１５（３）：３２１－３８７））。ＡＤは、炎症反応によって部分的に媒介される、シナプスおよびニューロンの多大な損失に寄与し、最終的に精神能力の低下をもたらす、脳内のプラーク（すなわち、アミロイドβタンパク質またはＡβの凝集体）およびタングル（すなわち、ｔａｕタンパク質の凝集体）の蓄積によって駆動される（Ｓｍａｌｌ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００８，６０（４）：５３４－５４２）（Ｎａｖａｒｒｏ Ｇａｒｒｉｄｏ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８，１０：１４０、Ｍｕｋｈｉｎ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０１７，４７（５）：５０８－５１６））。興味深いことに、ＡＤ患者の皮膚は、ｔａｕおよびアミロイドの「堆積物」を抱えているとも報告されている（Ｂｌｏｏｍ ＧＳ．ＪＡＭＡ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１４，７１（４）：５０５－５０８、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌｅｙｖａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋ Ｄｉａｇｎ Ｓ ２０１５，６：００５－０１０．４１７２、Ｊｏｎｇ Ｙ－ＪＩ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ ｊｏｕｒｎａｌ ２００３，１７（１５）：２３１９－２３２１、Ｏｋａｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｍｅｎｔｉａ ａｎｄ Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １９９４，５（１）：５５－５６）。しかしながら、ＡＤの発達または進行におけるそのような堆積物について明確な機能的役割は確立されていない。皮膚がエクソソームの形態で脳にシグナルを送ることができることが健常マウスで発見され（図２）、ＡＤのマウスモデルの皮膚に由来するエクソソームは、この疾患の進行に影響を及ぼす可能性がある神経毒性のカーゴを含むことが分かった（図３）。エクソソームは、健常および病理学的条件の両方の下で細胞間のコミュニケーションを媒介するために重要な役割を果たす細胞由来の小胞である（Ｓ ＥＬＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１３，１２（５）：３４７－３５７、Ｒｉｃｋｌｅｆｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１６，７６（１０）：２８７６－２８８１、Ｈａｌｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２０１６，３６（３）：４１７－４２７）。以下のように仮定された：（１）皮膚に由来するエクソソームは、累積的に神経毒性のカーゴを脳に運び、ＡＤの発症および／または進行に寄与することができ（すなわち、皮膚脳相関）、かつ（２）エクソソーム操作アプローチは、皮膚を脳への「窓」として使用して、ＡＤに対する新規の治療戦略として潜在的に使用することができる。
【0118】
実施例２：アルツハイマー病の進行における皮膚からの細胞外小胞の特性評価。
結果
カルシウムシグナル伝達に関連するｍＲＮＡ発現および経路における３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶの同定された変化の差次的発現および経路分析
ＡＤの文脈内で皮膚由来ＥＶの神経変性ポテンシャルを特徴付けるために、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現の差異の広範な特性評価を、１０および２３週齢（ｎ＝３）で行った。これは、ＲＮＡ－ｓｅｑおよびその後の差次的発現分析の使用によって達成された。次いで、各比較からの差次的に発現された遺伝子を、対数変化倍率±１．５についてフィルタリングし、≦０．０５の調整されたｐ値を得た（図４）。特定の疾患および／または機能に関連する正準経路および遺伝子の変化を同定するために、得られた差次的に発現された遺伝子のリスト上で、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ）を行った（図４）。
結果
カルシウムシグナル伝達に関連するｍＲＮＡ発現および経路における３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶの同定された変化の差次的発現および経路分析
ＡＤの文脈内で皮膚由来ＥＶの神経変性ポテンシャルを特徴付けるために、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現の差異の広範な特性評価を、１０および２３週齢（ｎ＝３）で行った。これは、ＲＮＡ－ｓｅｑおよびその後の差次的発現分析の使用によって達成された。次いで、各比較からの差次的に発現された遺伝子を、対数変化倍率±１．５についてフィルタリングし、≦０．０５の調整されたｐ値を得た（図４）。特定の疾患および／または機能に関連する正準経路および遺伝子の変化を同定するために、得られた差次的に発現された遺伝子のリスト上で、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ）を行った（図４）。
【0119】
疾患遺伝子型の関数としての細胞外小胞ＲＮＡ含有量の差異
ＡＤ遺伝子型が皮膚由来ＥＶ内で生じるｍＲＮＡ発現の変化に与える影響を決定するために、１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊおよび２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの両方からの差次的発現結果を考慮した。２３週目と比較して、疾患進行の比較的早い時点での３×Ｔｇ－ＡＤと対照皮膚由来のＥＶとの間の差異を評価するために、この症例において１０週目の比較を検討した。これは、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較において見出される疾患進行とともに生じる変化と比較するための「ベースライン」を確立するために行われた。１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した３×Ｔｇ－ＡＤについては、９１個の遺伝子が上方調節され、７９個が下方調節された。疾患進行の後期段階でｍＲＮＡ発現の変化がどのように生じるかを評価するために、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較もここで考慮した。差次的発現結果は、この比較内で、２４０遺伝子の上方調節および４２６遺伝子の下方調節を明らかにした（表１）。経路に関して、カルシウムシグナル伝達は、この比較内で最大量の調節不全を示した（－ｌｏｇｐ値＝１１．２６１）（図１０Ａ、１０Ｂ）。さらに、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群内のカルシウムシグナル伝達経路の調節不全は、この研究におけるすべての比較群において見出される他の調節不全経路と比較して、最大の調節不全の大きさを表した。カルシウムシグナル伝達に関与する合計１０個の遺伝子が、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤマウスにおいて下方調節されることが見出された。このデータセット内で差次的に発現されることが見出されるすべての遺伝子のうち、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）（Ｌｏｇ２変化倍率＝６．１５５）の上方調節は、最大の大きさであることが見出された。この遺伝子の発現の変化は、特に、この上方調節がＡＤ脳内のアミロイドプラーク蓄積に関連するという事実を考慮すると、興味深い（Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１４ １２７：５０７－５２２）。この比較における他の調節不全経路には、アクチン細胞骨格シグナル伝達、プロテインキナーゼＡシグナル伝達、およびＲｈｏＡシグナル伝達が含まれた。
ＡＤ遺伝子型が皮膚由来ＥＶ内で生じるｍＲＮＡ発現の変化に与える影響を決定するために、１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊおよび２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの両方からの差次的発現結果を考慮した。２３週目と比較して、疾患進行の比較的早い時点での３×Ｔｇ－ＡＤと対照皮膚由来のＥＶとの間の差異を評価するために、この症例において１０週目の比較を検討した。これは、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較において見出される疾患進行とともに生じる変化と比較するための「ベースライン」を確立するために行われた。１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊと比較した３×Ｔｇ－ＡＤについては、９１個の遺伝子が上方調節され、７９個が下方調節された。疾患進行の後期段階でｍＲＮＡ発現の変化がどのように生じるかを評価するために、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較もここで考慮した。差次的発現結果は、この比較内で、２４０遺伝子の上方調節および４２６遺伝子の下方調節を明らかにした（表１）。経路に関して、カルシウムシグナル伝達は、この比較内で最大量の調節不全を示した（－ｌｏｇｐ値＝１１．２６１）（図１０Ａ、１０Ｂ）。さらに、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群内のカルシウムシグナル伝達経路の調節不全は、この研究におけるすべての比較群において見出される他の調節不全経路と比較して、最大の調節不全の大きさを表した。カルシウムシグナル伝達に関与する合計１０個の遺伝子が、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤマウスにおいて下方調節されることが見出された。このデータセット内で差次的に発現されることが見出されるすべての遺伝子のうち、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（Ｓ１００Ａ９）（Ｌｏｇ２変化倍率＝６．１５５）の上方調節は、最大の大きさであることが見出された。この遺伝子の発現の変化は、特に、この上方調節がＡＤ脳内のアミロイドプラーク蓄積に関連するという事実を考慮すると、興味深い（Ｗａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１４ １２７：５０７－５２２）。この比較における他の調節不全経路には、アクチン細胞骨格シグナル伝達、プロテインキナーゼＡシグナル伝達、およびＲｈｏＡシグナル伝達が含まれた。
【表1】
【0120】
年齢の関数としての細胞外小胞ＲＮＡ含有量の差異
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ、および２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊにおいて、差次的発現およびＩＰＡ分析を行い、ＡＤマウスおよび対照マウスの両方において年齢が有する影響を決定した。合計１５０個の上方調節遺伝子および１４３個の下方調節遺伝子が、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤの比較において見出された（図９Ｂ）。これらの遺伝子の経路分析は、肝線維症、ＧＰ６シグナル伝達、およびアペリン肝シグナル伝達を含むいくつかの経路の調節不全を明らかにした。２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較を行い、加齢のみによる発現の変化を評価した。その結果、９８個の遺伝子の上方調節、および９８個の他の遺伝子の下方調節が明らかになった（表２）。同定された上位の関連経路としては、非折り畳みタンパク質応答、ＲｈｏＡシグナル伝達、および副腎髄質シグナル伝達が挙げられる（図１０Ａ、１０Ｂ）。
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ、および２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊにおいて、差次的発現およびＩＰＡ分析を行い、ＡＤマウスおよび対照マウスの両方において年齢が有する影響を決定した。合計１５０個の上方調節遺伝子および１４３個の下方調節遺伝子が、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤの比較において見出された（図９Ｂ）。これらの遺伝子の経路分析は、肝線維症、ＧＰ６シグナル伝達、およびアペリン肝シグナル伝達を含むいくつかの経路の調節不全を明らかにした。２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較を行い、加齢のみによる発現の変化を評価した。その結果、９８個の遺伝子の上方調節、および９８個の他の遺伝子の下方調節が明らかになった（表２）。同定された上位の関連経路としては、非折り畳みタンパク質応答、ＲｈｏＡシグナル伝達、および副腎髄質シグナル伝達が挙げられる（図１０Ａ、１０Ｂ）。
【表2】
【0121】
年齢と遺伝子型との間の相互作用としての細胞外小胞ＲＮＡ含有量の差異：
２つの最終セットの差次的発現分析を行った。１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ、および２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ。皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現プロファイルに対する年齢および遺伝子型の両方の効果を評価するために、これらの比較を行った。１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの分析は、６７遺伝子の有意な上方調節および８９遺伝子の下方調節を示し、遺伝子は上方調節されなかった。これらの遺伝子に関与したいくつかの上位の経路としては、カルシウムシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達、およびカルシウム輸送Ｉが挙げられる。２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較の分析は、１２２遺伝子の上方調節および１３４遺伝子の下方調節を明らかにした。その後の経路分析では、ＧＰ６シグナル伝達、コルチコトロピン放出ホルモン、および肝線維症経路が、これらの差次的に発現された遺伝子に関連していることが示唆された。
２つの最終セットの差次的発現分析を行った。１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ、および２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ。皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現プロファイルに対する年齢および遺伝子型の両方の効果を評価するために、これらの比較を行った。１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの分析は、６７遺伝子の有意な上方調節および８９遺伝子の下方調節を示し、遺伝子は上方調節されなかった。これらの遺伝子に関与したいくつかの上位の経路としては、カルシウムシグナル伝達、アクチン細胞骨格シグナル伝達、およびカルシウム輸送Ｉが挙げられる。２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの比較の分析は、１２２遺伝子の上方調節および１３４遺伝子の下方調節を明らかにした。その後の経路分析では、ＧＰ６シグナル伝達、コルチコトロピン放出ホルモン、および肝線維症経路が、これらの差次的に発現された遺伝子に関連していることが示唆された。
【0122】
マウスモデル３×ｔｇＡＤ皮膚由来細胞外小胞は、トランスジェニックｈＡＰＰ／ｈＭＡＰＴのｍＲＮＡを含む
ＡＰＰに関連する遺伝子の変異および異常発現は、ＡＤなどのアミロイド症を含む神経変性障害の伝播に関与する十分に記録された因子である（Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＢ Ｒｅｐ．２０１０ ４３：７０４－７０９、Ｓｔｒａｎｇ，ＫＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９ ９９：９１２－９２８）。微小管関連タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）の変異は、ＡＤと直接的には関連しないが（Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）、それらは、前頭側頭型認知症に関与している（Ｓｔｒａｎｇ，ＫＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９ ９９：９１２－９２８、Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）。しかしながら、より重要なことに、これらの変異は、ＡＤに見られるものと同様のタウオパチーの発生に関与し、ＡＤのトランスジェニックモデルに見出すことができる（Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）。ここで、収集された皮膚由来ＥＶの可能性は、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対照マウスの両方から、アルツハイマー病の３×Ｔｇ－ＡＤマウスモデルにおいて発現されたヒトＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＡＰＰｓｗｅ）およびヒトＴａｕ Ｐ３０１Ｌ ＭＡＰＴ導入遺伝子を含むことを評価した（Ｏｄｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００３ ３９：４０９－４２１）。これらの導入遺伝子の存在を、様々な時点で収集された皮膚由来ＥＶにおけるｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡの発現を測定するための絶対ｑＰＣＲ（ｎ＝３）の使用によって特徴付けた（図５）。得られた遺伝子発現データは、ｈＡＰＰ（図５Ａ）およびｈＭＡＰＴ（図５Ｂ）の両方が、年齢マッチング対照と比較して、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶで有意に発現することを示し、このモデル内でのＡＤの進行と関連して、潜在的に神経毒性の遺伝的手がかりを保持することができることをさらに示す。
ＡＰＰに関連する遺伝子の変異および異常発現は、ＡＤなどのアミロイド症を含む神経変性障害の伝播に関与する十分に記録された因子である（Ｓｈｉｎ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＢ Ｒｅｐ．２０１０ ４３：７０４－７０９、Ｓｔｒａｎｇ，ＫＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９ ９９：９１２－９２８）。微小管関連タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）の変異は、ＡＤと直接的には関連しないが（Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）、それらは、前頭側頭型認知症に関与している（Ｓｔｒａｎｇ，ＫＨ．，ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９ ９９：９１２－９２８、Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）。しかしながら、より重要なことに、これらの変異は、ＡＤに見られるものと同様のタウオパチーの発生に関与し、ＡＤのトランスジェニックモデルに見出すことができる（Ｇｕｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３ ８：ｅ８０７０６）。ここで、収集された皮膚由来ＥＶの可能性は、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対照マウスの両方から、アルツハイマー病の３×Ｔｇ－ＡＤマウスモデルにおいて発現されたヒトＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＡＰＰｓｗｅ）およびヒトＴａｕ Ｐ３０１Ｌ ＭＡＰＴ導入遺伝子を含むことを評価した（Ｏｄｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００３ ３９：４０９－４２１）。これらの導入遺伝子の存在を、様々な時点で収集された皮膚由来ＥＶにおけるｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡの発現を測定するための絶対ｑＰＣＲ（ｎ＝３）の使用によって特徴付けた（図５）。得られた遺伝子発現データは、ｈＡＰＰ（図５Ａ）およびｈＭＡＰＴ（図５Ｂ）の両方が、年齢マッチング対照と比較して、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶで有意に発現することを示し、このモデル内でのＡＤの進行と関連して、潜在的に神経毒性の遺伝的手がかりを保持することができることをさらに示す。
【0123】
３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来細胞外小胞は、マウス初代胚性ニューロン培養物中のニューロンに神経毒性ｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡを移行させることができる
３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶが潜在的に神経毒性のある分子含有物を保有することが可能であることを示す結果に基づいて、これらのＥＶの神経毒性能力を直接進めて評価することにした。中枢神経系に由来するＥＶは、アルツハイマー病などの神経変性障害において役割を果たすこと（Ｓａｒｄａｒ Ｓｉｎｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１８ １３６：４１－５６）、およびエクソソームタンパク質がアミロイドプラーク内に見出されること（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６ １０３：１１１７２－１１１７７）が以前に示されており、皮膚などの末梢組織に由来するＥＶに関して、この病理学的可能性はまだ探求されていない。したがって、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶの神経毒性能力を、４つの異なるマウス初代ニューロン培養物の培養物を、１～３×１０９ＥＶ／μＬ粒子の濃度のＥＶに２４時間曝露した後、ｑＰＣＲ分析のためのＲＮＡ単離によって調べた。その後のｑＰＣＲ結果（ｎ＝４）は、トランスジェニックｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡが、対照と比較して、３×Ｔｇ－ＡＤのＥＶに曝露されたニューロンにおいて有意に発現されることを示す（図６Ａ、６Ｂ）。これらの所見は、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶが、トランスジェニックｍＲＮＡの送達を通じてニューロン標的の遺伝子発現プロファイルに影響を及ぼす可能性を有することを示す。この観察された活性は、ＡＰＰｓｗｅおよびＰ３０１Ｌ Ｔａｕ変異型導入遺伝子の発現に起因する神経毒性効果をもたらす可能性があり、これは次いでＡＤの発症および／または進行を前進させる可能性がある。
３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶが潜在的に神経毒性のある分子含有物を保有することが可能であることを示す結果に基づいて、これらのＥＶの神経毒性能力を直接進めて評価することにした。中枢神経系に由来するＥＶは、アルツハイマー病などの神経変性障害において役割を果たすこと（Ｓａｒｄａｒ Ｓｉｎｈａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．２０１８ １３６：４１－５６）、およびエクソソームタンパク質がアミロイドプラーク内に見出されること（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００６ １０３：１１１７２－１１１７７）が以前に示されており、皮膚などの末梢組織に由来するＥＶに関して、この病理学的可能性はまだ探求されていない。したがって、３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶの神経毒性能力を、４つの異なるマウス初代ニューロン培養物の培養物を、１～３×１０９ＥＶ／μＬ粒子の濃度のＥＶに２４時間曝露した後、ｑＰＣＲ分析のためのＲＮＡ単離によって調べた。その後のｑＰＣＲ結果（ｎ＝４）は、トランスジェニックｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡが、対照と比較して、３×Ｔｇ－ＡＤのＥＶに曝露されたニューロンにおいて有意に発現されることを示す（図６Ａ、６Ｂ）。これらの所見は、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶが、トランスジェニックｍＲＮＡの送達を通じてニューロン標的の遺伝子発現プロファイルに影響を及ぼす可能性を有することを示す。この観察された活性は、ＡＰＰｓｗｅおよびＰ３０１Ｌ Ｔａｕ変異型導入遺伝子の発現に起因する神経毒性効果をもたらす可能性があり、これは次いでＡＤの発症および／または進行を前進させる可能性がある。
【0124】
次に、初代神経細胞培養物に対する皮膚由来ＥＶの効果を評価した。１０週齢でＢ６１２ＳＦ２／Ｊおよび３×Ｔｇ－ＡＤから単離された皮膚由来の等量のＥＶ。まず、各実験群からのＥＶをＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）赤色蛍光標識で標識し、次いで２４時間にわたって８日間の初代ニューロン培養物に適用した（図７）。共焦点顕微鏡法による定性分析は、Ｔｕｊ１免疫染色によって同定された核周辺領域およびニューロン突起の両方を含む、ニューロンの細胞質中の蛍光粒子の存在を示す（図７Ａ、７Ｂ）。さらに、細胞取り込みの定量化は、蛍光標識ＥＶを取り込むニューロンのより高いパーセンテージを示す（図７Ｃ）。最後に、ＡＤマウスモデルに由来するＥＶの神経毒性効果を研究した（図８）。初代ニューロン培養物を３×Ｔｇ－ＡＤまたはＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ皮膚由来ＥＶ細胞に曝露した２４時間後、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄキットを用いた蛍光顕微鏡法により生存率を評価した（図８Ａ）。神経細胞生存率の定量化は、概して、非曝露対照培養物と比較した場合のＥＶの細胞毒性効果を示すが、２４時間後、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスに由来するＥＶ間に細胞毒性の差はない（図８Ｂ）。
【0125】
考察
皮膚および腸などの末梢器官および組織が、ＡＤおよびＰＤなどの神経変性障害の発症および進行において果たす役割は、最近になって理解され始めたばかりである。皮膚は、具体的にＡＤにおいて役割を果たすことが疑われており、診断および薬物送達の可能性のある手段としてさえ探求されているが、そのような関連性がどのように促進され得るかを詳細に説明する特定のメカニズムは同定されていない。ＡＤが進行するにつれて、皮膚由来ＥＶの遺伝子含有量を特徴付けることを目的とした実験の結果を通じて、Ｓ１００Ａ９（図４Ａ）などのＡＤ関連遺伝子の発現、ならびにＡＤの３×Ｔｇ－ＡＤモデルにおける病理を駆動する原因であるＡＰＰｓｗｅおよびＭＡＰＴ Ｐ３０１Ｌ変異遺伝子の発現（図５）における変化が同定された。
皮膚および腸などの末梢器官および組織が、ＡＤおよびＰＤなどの神経変性障害の発症および進行において果たす役割は、最近になって理解され始めたばかりである。皮膚は、具体的にＡＤにおいて役割を果たすことが疑われており、診断および薬物送達の可能性のある手段としてさえ探求されているが、そのような関連性がどのように促進され得るかを詳細に説明する特定のメカニズムは同定されていない。ＡＤが進行するにつれて、皮膚由来ＥＶの遺伝子含有量を特徴付けることを目的とした実験の結果を通じて、Ｓ１００Ａ９（図４Ａ）などのＡＤ関連遺伝子の発現、ならびにＡＤの３×Ｔｇ－ＡＤモデルにおける病理を駆動する原因であるＡＰＰｓｗｅおよびＭＡＰＴ Ｐ３０１Ｌ変異遺伝子の発現（図５）における変化が同定された。
【0126】
カルシウムシグナル伝達は、すべての比較群の中で、ＩＰＡによって同定された上位の調節不全の正準経路のうちの１つであった。この観察は、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤと２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊの間で差次的に発現した遺伝子の比較において見出されたが、１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤおよび１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群の比較においては見出されなかった。この観察は、カルシウムシグナル伝達に関与するｍＲＮＡ発現の変化が、３×Ｔｇ－ＡＤマウスで年齢とともに生じ、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ対照では見られないことを示唆する。カルシウムシグナル伝達の調節不全は、１０年以上にわたってＡＤなどの神経変性疾患において記録され、ＡＤの「カルシウム仮説」の発展をもたらした（Ｔｏｎｇ，ＢＣＫ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１８ １８６５：１７４５－１７６０；Ｐｏｐｕｇａｅｖａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８ ２９：１１７６－１１８８）。ニューロンにおけるカルシウム恒常性の調節不全がシナプス欠損を引き起こし、最終的にアミロイドベータおよびリン酸化ｔａｕ２９の蓄積をもたらすという証拠が増加している（Ｐｏｐｕｇａｅｖａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１８ ２９：１１７６－１１８８）。カルシウムシグナル伝達の中断に加えて、ミトコンドリア関連ＥＲ膜（ＭＡＭ）に特異的に関連するミトコンドリア機能不全は、ＡＤにおいても報告されている（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ １１：３１１）。ＩＰＡを通じて正準経路として同定されていないが、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群内のカルシウムシグナル伝達に関与する２つの遺伝子、ＡＴＰ２Ａ１およびＲＹＲ１もまた、ＭＡＭ機能と関連付けられる（Ｓｃｈｏｎ，ＥＡ．＆Ａｒｅａ－Ｇｏｍｅｚ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１３ ５５：２６－３６）。ＭＡＭ関連遺伝子は概してＡＤにおいて上方調節されるが、ＭＡＭ機能の撹乱は全体的に、ＡＤ病理の疑わしい構成要素であり、疾患がどのように引き起こされるかについての独自の仮説を表す（Ａｒｅａ－Ｇｏｍｅｚ，Ｅ．＆Ｓｃｈｏｎ，ＥＡ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２０１６ ３８：９０－９６）。
【0127】
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群比較における別の興味深い発見は、Ｓ１００Ａ９の堅牢な上方調節であった（Ｌｏｇ２変化倍率＝６．１５５）。Ｓ１００Ａ９は、カルシウム恒常性を含む多数の細胞内プロセスに関与することが知られているＳ１００タンパク質ファミリーのメンバーである（Ｃｒｉｓｔｏｖａｏ，ＪＳ．＆Ｇｏｍｅｓ，ＣＭ．ＳＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ １３：４６３）。前述のように、この比較における群間の観察された差異は、ＡＤ進行が生じるにつれて皮膚ＥＶに生じる遺伝子発現の変化についての洞察を提供する。したがって、Ｓ１００Ａ９が高度に上方調節されているという所見は、ＡＤの進行に伴う皮膚ＥＶの遺伝子プロファイルの重要な変化である可能性を示唆する。興味深いことに、この発現パターンは、関連するＴｇ２５７６ ＡＤマウスモデルの脳で見られる変化と一致する（Ｃｒｉｓｔｏｖａｏ，ＪＳ．＆Ｇｏｍｅｓ，ＣＭ．ＳＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ １３：４６３）。このモデルは、この研究において使用される３×Ｔｇ－ＡＤにおいて見出されるのと同じＡＰＰｓｗｅ変異を有するため、Ｔｇ２５７６マウスにおけるこの発見は特に関連する。さらに、ＴＧ２５７６マウスと交雑させたＳ１００Ａ９ ＫＯの使用を伴う研究は、記憶障害の改善と神経病理の減少を示した（Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４ ９：ｅ８８９２４）。マウスモデルに加えて、Ｓ１００Ａ９発現の上方調節がＡＤ患者の脳で観察され、ＡＤ経路に関与している（Ｃｒｉｓｔｏｖａｏ，ＪＳ．＆Ｇｏｍｅｓ，ＣＭ．ＳＮｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ １３：４６３）。これらの理由により、Ｓ１００Ａ９は、ＡＤの潜在的なバイオマーカーとして多くの注目を集めている（Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６ ７：３４－３９）。ＡＤ条件下での、皮膚由来ＥＶ内のＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡとタンパク質の両方の変化および効果のさらなる探索は、そのような目的について洞察力に富むことが証明され得る。ナトリウム結合中性アミノ酸輸送体２（ＳＬＣ３８Ａ２）の上方調節も、この比較群内で観察された。２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶにおけるＳＬＣ３８Ａ２の上方調節は、ＡＤ進行を伴うＳＬＣ３８Ａ２の上方調節の観察と一致する（Ｐａｔｅｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．Ｉｍｍｕｎ．２０１９ ８０：６４４－６５６）。Ｓｅｒｐｉｎａ３ｂ／Ｓｅｒｐｉｎａ３ｊの遺伝子は、同様に、２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群比較内で上方調節されることを見出した。２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ群においてはＳｅｒｐｉｎａ３ｂ／Ｓｅｒｐｉｎａ３ｊが下方調節されていることを見出され、完全に反対の結果を見た。この遺伝子が、対照において年齢とともに減少しながら、老化したＡＤマウスにおいて重度に発現しているという事実は、その発現がＡＤ状態に起因していることを示唆している。皮膚由来ＥＶ３×Ｔｇ－ＡＤマウスにおけるＳｅｒｐｉｎａ３ｂ／Ｓｅｒｐｉｎａ３ｊの上方調節のこの観察は、ＡＤを含む複数のプリオン病におけるｓｅｒｐｉｎａ３上方調節の以前の観察と一致している（Ｖａｎｎｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１７ ７：１５６３７）。
【0128】
皮膚由来ＥＶにおけるＡＤに関連するトランスジェニックｍＲＮＡの発現を測定することを目的とした絶対ｑＰＣＲ実験は、それらがＡＤにおいて役割を果たすことができるという概念をさらに支持する。ヒトＡＰＰｓｗｅおよびヒトＭＡＰＴ Ｐ３０１ＬのｍＲＮＡがＡＤ皮膚由来ＥＶに存在するという知見は、それらがＡＤの発症および進行を誘導することが可能であるという仮説を支持する。これは、最終的に、これらのＥＶが、そのトランスジェニックｍＲＮＡ内容物を標的組織に送達することが可能であり、これが、上記組織内の変異ＭＡＰＴおよびＡＰＰの局所タンパク質発現に影響を及ぼす可能性を示唆する。これは特に、３×Ｔｇ－ＡＤモデルの文脈内でのＡＤに関連しており、ＣＮＳ内でのＡＰＰｓｗｅおよびＭＡＰＴ Ｐ３０１Ｌの発現は、病理学の主要な構成要素である。
【0129】
加えて、ＡＤ皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡの効果を特徴付けるために、それらの神経毒性ポテンシャルを、初代ニューロンＥＶ曝露実験において直接評価した。ＡＤ皮膚ＥＶからｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴのｍＲＮＡを取り込むニューロンの能力が実証され、変異したＡＰＰおよびＭＡＰＴタンパク質の異常発現が起こり得る可能性が示唆され、これらはＣＮＳ内のβ－アミロイドおよびリン酸化Ｔａｕタンパク質のその後の蓄積を通じて疾患進行を誘導尾する可能性があった。初代ニューロンにおける標識ＥＶ取り込み実験の結果は、皮膚由来ＥＶ自体が実際にＴｕｊ１＋細胞によって取り込まれることが可能であり（図７Ａ、７Ｂ）、インビトロでＴｕｊ１－細胞よりも優先的に取り込まれることを示す証拠を提供することによって、この考えをさらに支持する（図７Ｃ）。総合すると、これらの観察は、皮膚由来のＥＶがニューロンと相互作用し、ＣＮＳ内のＡＤ関連遺伝子の発現に影響を及ぼし、最終的に疾患の発症および進行に寄与する可能性を強調する。最後に、ｑＲＴ－ＰＣＲおよび細胞取り込み実験によってここで観察された３×Ｔｇ－ＡＤマウスの皮膚ＥＶからの潜在的な神経毒性カーゴの導入にもかかわらず、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚ＥＶへの曝露後にニューロン毒性の増加は観察されず、これは短期間の曝露（２４時間）を行ったことに起因し得る（図８）。ＡＰＰおよびＴａｕの細胞毒性効果は、代謝処理、オリゴマー形成、およびタンパク質蓄積を可能にするためにさらなるインキュベーション時間を必要とする可能性がある。
【0130】
方法
動物研究
アルツハイマー病のトリプルトランスジェニックマウスモデル（３×Ｔｇ－ＡＤ）Ｂ６；１２９－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗｅ，ＴａｕＰ３０１Ｌ）１Ｌｆａ Ｐｓｅｎ１ｔｍ１Ｍｐｍ／Ｍｍｊａｘ（変異マウス資源＆研究センター在庫番号：３４８３０－ＪＡＸ）（Ｏｄｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００３ ３９：４０９－４２１）および対照系統Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ（在庫番号：１０１０４５）の交雑トリオをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。寄付した治験責任医師の勧告に基づき、分析には雌の動物のみを使用した。マウスを、一定の温度および湿度条件下で、１２／１２時間の明暗サイクル（午前６時に点灯）で、水および食物への自由なアクセスを有する群に収容した。動物を含むすべての実験は、オハイオ州立大学施設内動物飼育および使用委員会のガイドライン（プロトコール番号：２０１６Ａ００００００７４－Ｒ１）に従って実施した。
動物研究
アルツハイマー病のトリプルトランスジェニックマウスモデル（３×Ｔｇ－ＡＤ）Ｂ６；１２９－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗｅ，ＴａｕＰ３０１Ｌ）１Ｌｆａ Ｐｓｅｎ１ｔｍ１Ｍｐｍ／Ｍｍｊａｘ（変異マウス資源＆研究センター在庫番号：３４８３０－ＪＡＸ）（Ｏｄｄｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００３ ３９：４０９－４２１）および対照系統Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ（在庫番号：１０１０４５）の交雑トリオをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。寄付した治験責任医師の勧告に基づき、分析には雌の動物のみを使用した。マウスを、一定の温度および湿度条件下で、１２／１２時間の明暗サイクル（午前６時に点灯）で、水および食物への自由なアクセスを有する群に収容した。動物を含むすべての実験は、オハイオ州立大学施設内動物飼育および使用委員会のガイドライン（プロトコール番号：２０１６Ａ００００００７４－Ｒ１）に従って実施した。
【0131】
皮膚細胞外小胞単離
マウス皮膚由来のＥＶは、背側および腹側の直径１２ｍｍの皮膚生検から直接単離した。収集した組織を、外科用メスで約１ｍｍに粉砕し、マルチ組織解離キット１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－１１０－２０１）と組み合わせて、「ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９６－４２７）の「３７＿Ｍｕｌｔｉ Ｈ」プロトコールを使用して解離させた。次いで、得られた上清を除去し、２０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、均質なＥＶ濃度を確保するためにプールし、次いで、１／２体積の「細胞からの全エクソソーム単離キット」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４７８３５９）を、４℃での１２時間のインキュベーションの前に添加した。ＥＶサンプルを４度で１０，０００ｇの遠心分離で沈殿させ、その後、将来の使用まで－８０℃で保存した。ＥＶ濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｎｓ３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｎｌｙｔｉｃａｌ）を使用して測定した。
マウス皮膚由来のＥＶは、背側および腹側の直径１２ｍｍの皮膚生検から直接単離した。収集した組織を、外科用メスで約１ｍｍに粉砕し、マルチ組織解離キット１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－１１０－２０１）と組み合わせて、「ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０－０９６－４２７）の「３７＿Ｍｕｌｔｉ Ｈ」プロトコールを使用して解離させた。次いで、得られた上清を除去し、２０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、均質なＥＶ濃度を確保するためにプールし、次いで、１／２体積の「細胞からの全エクソソーム単離キット」（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４７８３５９）を、４℃での１２時間のインキュベーションの前に添加した。ＥＶサンプルを４度で１０，０００ｇの遠心分離で沈殿させ、その後、将来の使用まで－８０℃で保存した。ＥＶ濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ Ｎｓ３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｎｌｙｔｉｃａｌ）を使用して測定した。
【0132】
皮膚細胞外小胞の絶対リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を製造者の使用説明書に従って皮膚ＥＶペレットから全ＲＮＡを抽出した後、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号ＮＤ－２０００）を用いて得られた濃度を測定した。ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１１７５６５００）を使用して、２０ｕＬの逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを使用して、１０＾６コピー～１０＾２コピーの最終コピー数範囲で生成されたＡＰＰ６９５（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ番号１１４１９３）およびＴａｕＰ３０１Ｌ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ番号８７６３３）のプラスミドの標準曲線を用いた絶対定量法を使用して、ｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴの発現を測定した。前述のプラスミドを、ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩプラスミドＭｉｄｉ調製キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ番号ＤＧ４２００）を使用して単離した。単離されたプラスミド濃度の測定は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号ＮＤ－２０００）を使用して実施し、その後、プラスミドコピー数および標準曲線の希釈の計算を行った。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＴａｑｍａｎプライマーを使用して、以下を含む目的の遺伝子を増幅した：ｈＡＰＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）、ｍＡＰＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）、ｈＭＡＰＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１）、およびｍＭＡＰＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｍｍ００５２１９８８＿ｍ１）。すべてのリアルタイムＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ高速アドバンスドマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４－４４５－５７）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ａ２８５６７）を使用して、以下のサイクル設定で実行した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の４０サイクル。
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を製造者の使用説明書に従って皮膚ＥＶペレットから全ＲＮＡを抽出した後、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号ＮＤ－２０００）を用いて得られた濃度を測定した。ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１１７５６５００）を使用して、２０ｕＬの逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを使用して、１０＾６コピー～１０＾２コピーの最終コピー数範囲で生成されたＡＰＰ６９５（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ番号１１４１９３）およびＴａｕＰ３０１Ｌ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ番号８７６３３）のプラスミドの標準曲線を用いた絶対定量法を使用して、ｈＡＰＰおよびｈＭＡＰＴの発現を測定した。前述のプラスミドを、ＺｙｍｏＰＵＲＥ ＩＩプラスミドＭｉｄｉ調製キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ番号ＤＧ４２００）を使用して単離した。単離されたプラスミド濃度の測定は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号ＮＤ－２０００）を使用して実施し、その後、プラスミドコピー数および標準曲線の希釈の計算を行った。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＴａｑｍａｎプライマーを使用して、以下を含む目的の遺伝子を増幅した：ｈＡＰＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）、ｍＡＰＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）、ｈＭＡＰＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｈｓ００９０２１９４＿ｍ１）、およびｍＭＡＰＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｍｍ００５２１９８８＿ｍ１）。すべてのリアルタイムＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ高速アドバンスドマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４４－４４５－５７）およびＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ａ２８５６７）を使用して、以下のサイクル設定で実行した：９５℃で１０分間、続いて９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の４０サイクル。
【0133】
初代ニューロンの相対リアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ生成は、前述の技法および試薬を使用して行った。続いて、前述の試薬、プライマー、サーモサイクラー、およびサイクル設定を使用して、初代ニューロンに対してリアルタイムＰＣＲを行った。マウス１８ｓリボソームＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４３３１１８２）をハウスキーピング遺伝子として使用した。
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ生成は、前述の技法および試薬を使用して行った。続いて、前述の試薬、プライマー、サーモサイクラー、およびサイクル設定を使用して、初代ニューロンに対してリアルタイムＰＣＲを行った。マウス１８ｓリボソームＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号４３３１１８２）をハウスキーピング遺伝子として使用した。
【0134】
ＲＮＡ－ｓｅｑ
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を使用して、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスの皮膚に由来する細胞外小胞（ＥＶ）から全ＲＮＡを、前述の製造者の使用説明書に従って抽出した。Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を用いて、ＲＮＡ定量化、完全性、および品質評価を得た。ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ指向性ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ番号Ｅ７７６０Ｌ）およびＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ番号Ｅ７４９０）を製造者の使用説明書に従って使用して、サンプル当たり２００ｎｇの入力でライブラリーを生成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ＳＰ Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ１５０ｂｐフォーマットで配列決定を行った。
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を使用して、Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスの皮膚に由来する細胞外小胞（ＥＶ）から全ＲＮＡを、前述の製造者の使用説明書に従って抽出した。Ｑｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１５５９６０２６）を用いて、ＲＮＡ定量化、完全性、および品質評価を得た。ＩｌｌｕｍｉｎａのためのＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＩＩ指向性ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ番号Ｅ７７６０Ｌ）およびＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ番号Ｅ７４９０）を製造者の使用説明書に従って使用して、サンプル当たり２００ｎｇの入力でライブラリーを生成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ＳＰ Ｐａｉｒｅｄ－Ｅｎｄ１５０ｂｐフォーマットで配列決定を行った。
【0135】
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータ分析
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータを、Ｂａｓｅｐａｉｒソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｅｐａｉｒｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）を使用して、以下のステップを含むパイプラインを使用して分析した。デフォルトのパラメータを用いてＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１３ ２９：５－２１）を使用して、ＵＣＳＣゲノムアセンブリｈｇ１９に由来するトランスクリプトームに読み取り物を整列させた。各転写物の読み取り数を、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１４ ３０：９２３－９３０）を使用して測定した。ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，ＭＩ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１４ １５，５５０）を使用して差次的に発現した遺伝子を決定し、別段の記載がない限り、調整されたｐ値（複数仮説試験のために補正された）に対する０．０５のカットオフを使用して、リストおよびヒートマップを作成した。ｐ値を計算するために遺伝子置換を使用して、正規化された遺伝子発現数に対してＧＳＥＡを行った。
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータを、Ｂａｓｅｐａｉｒソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｅｐａｉｒｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）を使用して、以下のステップを含むパイプラインを使用して分析した。デフォルトのパラメータを用いてＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１３ ２９：５－２１）を使用して、ＵＣＳＣゲノムアセンブリｈｇ１９に由来するトランスクリプトームに読み取り物を整列させた。各転写物の読み取り数を、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ（Ｌｉａｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１４ ３０：９２３－９３０）を使用して測定した。ＤＥＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，ＭＩ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１４ １５，５５０）を使用して差次的に発現した遺伝子を決定し、別段の記載がない限り、調整されたｐ値（複数仮説試験のために補正された）に対する０．０５のカットオフを使用して、リストおよびヒートマップを作成した。ｐ値を計算するために遺伝子置換を使用して、正規化された遺伝子発現数に対してＧＳＥＡを行った。
【0136】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ）
差次的に発現した遺伝子の経路分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析ソフトウエア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。コア分析は、フィルタリングされた差次的発現データ（±０．５８ｌｏｇ２変化倍率および調整されたｐ値≦０．０５）を使用して行った。
差次的に発現した遺伝子の経路分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析ソフトウエア（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。コア分析は、フィルタリングされた差次的発現データ（±０．５８ｌｏｇ２変化倍率および調整されたｐ値≦０．０５）を使用して行った。
【0137】
初代神経細胞培養
１８．５日胚のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の皮質ニューロンを、いくつかの改変を含む、以前に報告されたプロトコール（Ａｌｚａｔｅ－Ｃｏｒｒｅａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２０ ２０５０：１４５－１５２）に従って調製した。解剖した皮質を、ニューロン組織解離キット－産後ニューロン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－０９４－８０２）を用いて解離し、ヒーターを備えた３７ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－０９６－４２７）で２０分間インキュベートした。解離した細胞をＰＢＳで調製した５％のＢＳＡに再懸濁し、ニューロンをニューロン単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－１１５－３８９）を使用して細胞懸濁液から単離した。単離されたニューロンを、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号３５０５００６１）および２％のＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１ニューロンサプリメント（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号０５７１１）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号２１１０３０４９）で構成されるニューロン培養培地に再懸濁した。ニューロンを、１３０×１０３細胞／ｃｍ２の密度でポリＤ－リジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ａ３８９０４０１）コーティングしたガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１２５４５８０）上に播種した。初代ニューロン培養物を、指定された時間皮膚由来のＥＶに曝露し、次いで、細胞生存率分析のために処理し、免疫細胞化学のために固定し、またはｑＰＣＲのために全ＲＮＡ抽出した。
１８．５日胚のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の皮質ニューロンを、いくつかの改変を含む、以前に報告されたプロトコール（Ａｌｚａｔｅ－Ｃｏｒｒｅａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０２０ ２０５０：１４５－１５２）に従って調製した。解剖した皮質を、ニューロン組織解離キット－産後ニューロン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－０９４－８０２）を用いて解離し、ヒーターを備えた３７ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－０９６－４２７）で２０分間インキュベートした。解離した細胞をＰＢＳで調製した５％のＢＳＡに再懸濁し、ニューロンをニューロン単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－１１５－３８９）を使用して細胞懸濁液から単離した。単離されたニューロンを、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号３５０５００６１）および２％のＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１ニューロンサプリメント（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号０５７１１）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号２１１０３０４９）で構成されるニューロン培養培地に再懸濁した。ニューロンを、１３０×１０３細胞／ｃｍ２の密度でポリＤ－リジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ａ３８９０４０１）コーティングしたガラスカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号１２５４５８０）上に播種した。初代ニューロン培養物を、指定された時間皮膚由来のＥＶに曝露し、次いで、細胞生存率分析のために処理し、免疫細胞化学のために固定し、またはｑＰＣＲのために全ＲＮＡ抽出した。
【0138】
細胞生存率
Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスの皮膚に由来するＥＶの細胞毒性を、哺乳動物細胞のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｌ３２２４）を製造者の使用説明書に従って評価した。簡潔に述べると、インビトロ日数（ＤＩＶ）７の初代ニューロン培養物を、１０週齢のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスからのＥＶに２４時間曝露した後、各ウェルを１～３×１０９ＥＶ／μＬ粒子に曝露した。曝露後２４時間、ニューロン培養物を滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、カルセインＡＭ（１ｕＭ）およびエチジウムホモダイマー－１（１ｕｍ）を含むＰＢＳ溶液で３７℃で２５分間インキュベートした。最後に、ＰＢＳを使用してガラスカバースリップを新たに取り付け、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ２０００顕微鏡を使用してマイクロフォトを撮影した。細胞生存率は、ＦＩＪＩ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、生細胞（カルセインＡＭ陽性）および死細胞（エチジウムホモダイマー－１陽性）のパーセンテージを定量化することによって決定した（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２ ９：６７６－６８２）。
Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスの皮膚に由来するＥＶの細胞毒性を、哺乳動物細胞のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存率／細胞毒性キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ番号Ｌ３２２４）を製造者の使用説明書に従って評価した。簡潔に述べると、インビトロ日数（ＤＩＶ）７の初代ニューロン培養物を、１０週齢のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊまたは３×Ｔｇ－ＡＤマウスからのＥＶに２４時間曝露した後、各ウェルを１～３×１０９ＥＶ／μＬ粒子に曝露した。曝露後２４時間、ニューロン培養物を滅菌ＰＢＳで１回洗浄した後、カルセインＡＭ（１ｕＭ）およびエチジウムホモダイマー－１（１ｕｍ）を含むＰＢＳ溶液で３７℃で２５分間インキュベートした。最後に、ＰＢＳを使用してガラスカバースリップを新たに取り付け、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ２０００顕微鏡を使用してマイクロフォトを撮影した。細胞生存率は、ＦＩＪＩ ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、生細胞（カルセインＡＭ陽性）および死細胞（エチジウムホモダイマー－１陽性）のパーセンテージを定量化することによって決定した（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２ ９：６７６－６８２）。
【0139】
標識細胞外小胞取り込み
提供されたプロトコールに従って、「ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット」（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ペレット化ＥＶを蛍光標識した。カバースリップに播種した８日後、初代ニューロン培養物を、１０％ホルマリン中で２４時間後に固定する前に、１／３の培地を、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶを１～３×１０９ＥＶ／μＬの濃度で含む培地と交換することによって、標識ＥＶに曝露した。ＰＢＳ－Ｔ中の５％正常ヤギ血清を９０分間使用して、免疫細胞化学前のブロッキングを行った。免疫細胞化学を、４℃で一晩インキュベートした１：２５０のＰＢＳ－Ｔ中のＴｕｊ１抗体（Ａｂｃａｍ １０７２１６）を使用して行った。その後、サンプルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔ中に１：２００の濃度の二次抗体（Ａｂｃａｍ １５０１７３、λ＝４８８）を添加し、最後にＰＢＳ中の１：１０，０００ＤＡＰＩを１分間添加した。次いで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ番号Ｈ－１７００）を使用して、カバースリップをスライド上に取り付けた。続いて、スライドを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ２００顕微鏡を使用して、免疫蛍光および共焦点顕微鏡で撮像した。
提供されたプロトコールに従って、「ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーキット」（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ペレット化ＥＶを蛍光標識した。カバースリップに播種した８日後、初代ニューロン培養物を、１０％ホルマリン中で２４時間後に固定する前に、１／３の培地を、３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶを１～３×１０９ＥＶ／μＬの濃度で含む培地と交換することによって、標識ＥＶに曝露した。ＰＢＳ－Ｔ中の５％正常ヤギ血清を９０分間使用して、免疫細胞化学前のブロッキングを行った。免疫細胞化学を、４℃で一晩インキュベートした１：２５０のＰＢＳ－Ｔ中のＴｕｊ１抗体（Ａｂｃａｍ １０７２１６）を使用して行った。その後、サンプルをＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔ中に１：２００の濃度の二次抗体（Ａｂｃａｍ １５０１７３、λ＝４８８）を添加し、最後にＰＢＳ中の１：１０，０００ＤＡＰＩを１分間添加した。次いで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ番号Ｈ－１７００）を使用して、カバースリップをスライド上に取り付けた。続いて、スライドを、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ２００顕微鏡を使用して、免疫蛍光および共焦点顕微鏡で撮像した。
【0140】
統計分析
統計分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン１４）およびＧｒａｐｈｐａｄ（バージョン８．４）を使用して実施した。３×Ｔｇ－ＡＤ（３～４０週間）および３×Ｔｇ－ＡＤ／Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ（２１日～２３週間）の皮膚由来ＥＶのｑＰＣＲデータを、それぞれ一元配置および二元配置の分散分析を使用して分析した。０．０５未満のｐ値を調整したデータは統計的に有意とみなされた。
統計分析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン１４）およびＧｒａｐｈｐａｄ（バージョン８．４）を使用して実施した。３×Ｔｇ－ＡＤ（３～４０週間）および３×Ｔｇ－ＡＤ／Ｂ６１２９ＳＦ２／Ｊ（２１日～２３週間）の皮膚由来ＥＶのｑＰＣＲデータを、それぞれ一元配置および二元配置の分散分析を使用して分析した。０．０５未満のｐ値を調整したデータは統計的に有意とみなされた。
【0141】
実施例３：アルツハイマー病の遺伝的バイオマーカーについて、皮膚由来の細胞外小胞のｍＲＮＡ含有量を評価する。
この実施例の目的は、１０週齢および２３週齢（ｎ＝３）のＡＤの３×Ｔｇ－ＡＤトリプルトランスジェニックマウスモデルおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対照から収集した皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現の差異を特徴付けるために、ＲＮＡ Ｓｅｑの使用を通じて、アルツハイマー病（ＡＤ）の潜在的なバイオマーカーを同定することであった。デフォルトのパラメータを用いてＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１３ ２９：１５－２１）を使用して、ＵＣＳＣゲノムアセンブリｍｍ１０に由来するトランスクリプトームに読み取り物を整列させた。続いて、以下を含む疾患および年齢の両方のいくつかの異なる比較群の差次的発現ＤｅＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１４ １５：５５０）分析を行った：
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（高齢マウスにおけるＡＤの影響）、
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ（ＡＤマウスにおける年齢の影響）、
１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（若いマウスにおけるＡＤの影響）、および
２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（対照マウスにおける年齢の影響）。
この実施例の目的は、１０週齢および２３週齢（ｎ＝３）のＡＤの３×Ｔｇ－ＡＤトリプルトランスジェニックマウスモデルおよびＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対照から収集した皮膚由来ＥＶにおけるｍＲＮＡ発現の差異を特徴付けるために、ＲＮＡ Ｓｅｑの使用を通じて、アルツハイマー病（ＡＤ）の潜在的なバイオマーカーを同定することであった。デフォルトのパラメータを用いてＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１３ ２９：１５－２１）を使用して、ＵＣＳＣゲノムアセンブリｍｍ１０に由来するトランスクリプトームに読み取り物を整列させた。続いて、以下を含む疾患および年齢の両方のいくつかの異なる比較群の差次的発現ＤｅＳｅｑ２（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２０１４ １５：５５０）分析を行った：
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（高齢マウスにおけるＡＤの影響）、
２３週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ（ＡＤマウスにおける年齢の影響）、
１０週目の３×Ｔｇ－ＡＤ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（若いマウスにおけるＡＤの影響）、および
２３週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ対１０週目のＢ６１２９ＳＦ２／Ｊ（対照マウスにおける年齢の影響）。
【0142】
その後、差次的発現結果をフィルタリングした（ｐ値≦０．０５、ｌｏｇ２変化倍率±１）。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙパスウェイ分析（ＩＰＡ、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、群間の重複、ならびにすべての群間の関連経路および機能を同定した。潜在的なバイオマーカーを同定するために、まず、群１（高齢マウスにおけるＡＤの影響）における差次的発現遺伝子のリストを調べ、３×Ｔｇ－ＡＤモデルにおいてこの時点で任意の差次的発現遺伝子バイオマーカーが検出可能である可能性が高いことを示し、その場合、認知障害およびＡＤの最初の症状は、早ければ５月齢（約２２週齢）で観察されている（Ｏｄｄｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ．２００３ ３９（３）：４０９－２１）。このリスト内の遺伝子だけで潜在的なバイオマーカーを含むことができるが、このリストを、群２との重複について（ＡＤマウスにおける年齢の影響）さらに比較して、ＡＤ進行の１０週目と２３週目の時点との間に、これらの遺伝子の発現の変化が検出され得るかどうかを確認した。これらの２つの群の間の共通遺伝子のリストを作成し、これは、対照と比較して２３週目で依然として検出可能なＡＤ進行の１０週目と２３週目との間の発現の変化を表す。これらの遺伝子がＡＤにおいて早期において、および正常な健康な老化において、いかに差次的に発現されたかを決定するために、この共通遺伝子のリストを、群１（若いマウスにおけるＡＤの影響）および群４（対照マウスにおける年齢の影響）の両方とそれぞれ比較した。
【0143】
結果
各群の差異発現分析により、各群間の遺伝子発現の以下の差異が明らかとなった。群１（２４０上方／４２６下方）、群２（１５０上方／１４３下方）、群３（９１上方／７９下方）、および群４（９８上方／９８下方）（図９）。各条件間の差次的に発現される遺伝子の完全なリストについては、補足文書３を参照されたい。全４つの群の経路分析は、インターロイキン－６（ＩＬ６）シグナル伝達、高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ１）シグナル伝達、およびインターロイキン－８（ＩＬ８）シグナル伝達を含む、ＡＤ状態の結果として生じたいくつかの経路の調節不全を明らかにした（図１０Ａ）。ＡＤサンプル中に見られる上位の調節不全疾患および機能経路のいくつかの例としては、骨髄細胞の移動および好中球の蓄積が挙げられる（図１０Ｂ）。
各群の差異発現分析により、各群間の遺伝子発現の以下の差異が明らかとなった。群１（２４０上方／４２６下方）、群２（１５０上方／１４３下方）、群３（９１上方／７９下方）、および群４（９８上方／９８下方）（図９）。各条件間の差次的に発現される遺伝子の完全なリストについては、補足文書３を参照されたい。全４つの群の経路分析は、インターロイキン－６（ＩＬ６）シグナル伝達、高移動度群ボックスタンパク質１（ＨＭＧＢ１）シグナル伝達、およびインターロイキン－８（ＩＬ８）シグナル伝達を含む、ＡＤ状態の結果として生じたいくつかの経路の調節不全を明らかにした（図１０Ａ）。ＡＤサンプル中に見られる上位の調節不全疾患および機能経路のいくつかの例としては、骨髄細胞の移動および好中球の蓄積が挙げられる（図１０Ｂ）。
【0144】
３×Ｔｇ－ＡＤにおける皮膚由来ＥＶは、疾患の進行に伴って変化するＡＤに関与することが知られている遺伝子および経路の差次的発現を示す。このうちの一つの顕著な例はＳ１００Ａ８であり、これは以前にＡＤ脳で上方調節されることが観察されている（Ｃｒｉｓｔｏｖａｏ，Ｊ．Ｓ．＆Ｇｏｍｅｓ，Ｃ．Ｍ．２０１９ Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：４６３）。さらに、脳におけるＳ１００Ａ８発現の上方調節は、３×Ｔｇ－ＡＤモデルと同じアミロイド前駆体タンパク質変異を発現するＴＧ２５７６マウス（Ｌｏｄｅｉｒｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ Ａ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１７ ７２（３）：３１９－３２８）におけるアミロイドプラーク形成に先行する。Ｓ１００Ａ８は、年齢／疾患進行の関数として３×Ｔｇ－ＡＤ皮膚由来ＥＶにおいて上方調節されることが見出されたが、対照マウスでは、それらの年齢が高くなるにつれて逆となることが観察された。これは、Ｓ１００Ａ８がＡＤの皮膚エクソソーム内で見出される潜在的なバイオマーカーである可能性があることを示し、その上方調節はＡＤに固有であり、老化に関連しない。しかしながら、興味深いことに、Ｓ１００Ａ８は、群４比較（若年マウスにおけるＡＤの効果）において下方調節されていることを見出し、これは、疾患進行の早い段階において、この遺伝子が皮膚ＥＶにおいて下方調節されている可能性を示唆している。さらに、ＡＤにも関与する関連遺伝子であるＳ１００Ａ９（Ｃｒｉｓｔｏｖａｏ，Ｊ．Ｓ．＆Ｇｏｍｅｓ，Ｃ．Ｍ．２０１９ Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：４６３）が、群１において上方調節されていることが見出されたが、群２においては見出されなかった。群１において上方調節されることが見出された別の興味深い遺伝子は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１３（ＭＡＰＫ１３）であった。ＭＡＰＫ１３は、ＡＤ神経原線維タングルに関連するｔａｕエピトープをリン酸化する主要なキナーゼとして同定されている（Ｃａｖａｌｌｉｎｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ ２８８（３２）：２３３３１－２３３４７）。加齢対照対若年対照の群４比較では、ＭＡＰＫ１３発現は逆の傾向を示し、下方調節された。群１および２の比較で見出されるいくつかの他の差次的に発現された遺伝子もまた、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（Ｄ’Ａｄｄａｒｉｏ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２ ７（６）：ｅ３９１８６）および活性調節細胞骨格関連タンパク質（Ｐｅｒｅｚ－Ｃｒｕｚ．，２０１１ ３１（１０）：３９２６－３４）などのＡＤに関連することが見出された。
【0145】
すべての群に対する経路分析は、カルシウムシグナル伝達（Ｔｏｎｇ ＢＣ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１８ １８６５（１１ Ｐｔ Ｂ）：１７４５－１７６０）、ＨＭＧＢ１シグナル伝達（Ｐａｕｄｅｌ，Ｙ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１８ １２）、ＩＬ－６（Ｃｏｊｏｃａｒｕ ＩＭ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｍ Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１１ ４９（１）：５５－５８）シグナル伝達、ならびにＩＬ－８シグナル伝達（Ｒｙｕ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ２０１５ １２：１４４）など、群１のＡＤの既知の成分に関連する経路の調節不全を関係があるとした（図１０Ａ）。ＩＰＡデータはまた、ＡＤに関連する好中球の蓄積、ならびにＩＬ－６およびＩＬ－８の活性を含む、免疫および炎症反応に関連する経路の増加を示唆した（Ｐａｒｋ Ｊ，ｅｔ ２０１９ １０：２２３１）（図１０Ｂ）。
【0146】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示された発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される資料は、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
【0147】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2A-B】
【図3A-B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A-B】
【図6A-B】
【図7A】
【図7B-C】
【図8A-B】
【図9A】
【図9B】
【図10A-B】
【国際調査報告】