(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-06
(54)【発明の名称】高容量分子検出
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20220830BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20220830BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z ZNA
G01N21/78 C
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576655
(86)(22)【出願日】2020-07-01
(85)【翻訳文提出日】2022-02-01
(86)【国際出願番号】 US2020040474
(87)【国際公開番号】W WO2021003258
(87)【国際公開日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】62/869,502
(32)【優先日】2019-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/925,197
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521559223
【氏名又は名称】ダヴィンチ バイオ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジャン、ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ホン、タオ
(72)【発明者】
【氏名】トン、ジィソン
【テーマコード（参考）】
2G043
2G054
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043EA01
2G043JA01
2G043JA03
2G043KA02
2G043LA01
2G043LA03
2G054AA06
2G054AA08
2G054AB05
2G054CA21
2G054CA22
2G054GA04
2G054GB02
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本開示は一般に、生体サンプルの高容量検出のための組成および方法に関する。複数の光標識、および、異なる比率の光標識を含み得るその組み合わせが、大量の標的分子、細胞または組織の検出を可能にするために使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
検査のために調製される生体サンプルであって、第１光標識に直接的または間接的に結合する第１標的分子と、
第２光標識に直接的または間接的に結合する第２標的分子と
を備え、前記第１標的分子および前記第２標的分子は、（ａ）前記第１光標識が前記第２光標識と同一である場合に、各々に結合する光標識の数が異なること、または、（ｂ）前記第１光標識と前記第２光標識との間で類似の色の強度が異なることに起因して、１または複数の色チャネルにおいて光学的に区別可能である、
生体サンプル。
【請求項2】
前記第１光標識は、前記第２光標識と同一であり、前記第１標的分子は更に、前記第１光標識および前記第２光標識と異なる第３光標識に結合する、請求項１に記載の生体サンプル。
【請求項3】
前記第１標的分子は、第１の数の前記第１光標識および前記第３光標識を含む第１プローブに結合される、請求項２に記載の生体サンプル。
【請求項4】
前記第２標的分子は、第２の数の前記第２光標識を含む第２プローブに結合し、前記第２の数は前記第１の数と異なる、請求項３に記載の生体サンプル。
【請求項5】
前記第２プローブは更に前記第３光標識を含む、請求項４に記載の生体サンプル。
【請求項6】
前記第１光標識および前記第２光標識は、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満または２０ｎｍ未満だけ離間するピーク発光波長を有する、請求項１に記載の生体サンプル。
【請求項7】
検査のために調製された生体サンプルであって、複数の異なる標的分子を備え、その各々は、１または複数の光標識に結合し、前記標的分子は、１または複数の色チャネルにおいて互いから光学的に区別可能であり、前記標的分子の少なくとも２つは、同一の光標識に結合するが、前記標的分子に結合する異なる前記光標識の異なる比率に起因して光学的に区別可能である、生体サンプル。
【請求項8】
前記比率は少なくとも２、２．３、３．５、５、８．１、１０、２０、５０または１００倍異なる、請求項７に記載の生体サンプル。
【請求項9】
前記少なくとも２つの標的分子の各々は、少なくとも３つの異なる光標識に結合する、請求項７に記載の生体サンプル。
【請求項10】
前記標的分子の各々は、１または複数のプローブに結合し、１つの標的分子に結合する前記プローブは、他の標的分子の各々に結合するプローブから光学的に区別可能である、請求項７に記載の生体サンプル。
【請求項11】
前記標的分子の各々は、１または複数のプローブに結合し、１つの標的分子に結合する前記プローブは、他の標的分子の各々に結合されるプローブから必ずしも光学的に区別可能でないが、標的分子に結合するすべてのプローブの組み合わせは、前記標的分子を他の標的分子から光学的に区別可能にする、請求項７に記載の生体サンプル。
【請求項12】
検査のために調製される生体サンプルであって、複数の異なる標的分子を備え、その各々は、１または複数の光標識に結合し、前記標的分子は、１または複数の色チャネルにおいて互いから光学的に区別可能であり、前記標的分子の少なくとも２つは、１つの共通の第１光標識に、ならびに、類似の色を有する第２光標識および第３光標識にそれぞれ結合するが、前記第２光標識および前記第３光標識が異なる強度を有することに起因して光学的に区別可能である、生体サンプル。
【請求項13】
前記少なくとも２つの標的分子は、異なる数の前記第１光標識に結合する、請求項１２に記載の生体サンプル。
【請求項14】
前記標的分子の各々は１または複数のプローブに結合し、１つの標的分子に結合する前記プローブは、他の標的分子の各々に結合されるプローブから光学的に区別可能である、請求項１２に記載の生体サンプル。
【請求項15】
前記第２光標識および前記第３光標識は、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満だけ離間するピーク発光波長を有する、請求項１２に記載の生体サンプル。
【請求項16】
少なくとも１つの前記標的分子は更に、消光分子またはシグナル増強分子に結合する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項17】
同一の標的分子に関連する同一の光標識の少なくとも２つは、シグナル消光を引き起こすのに十分近接する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項18】
各標的分子は１または複数の一次プローブに結合する、請求項１７に記載の生体サンプル。
【請求項19】
各光標識は標識プローブに関連する、請求項１８に記載の生体サンプル。
【請求項20】
各一次プローブは２以上の標識プローブに結合する、請求項１９に記載の生体サンプル。
【請求項21】
前記光標識は蛍光色素、蛍光タンパク質またはナノ粒子である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項22】
前記標的分子は、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ断片、ＤＮＡ分子またはＤＮＡ断片を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項23】
前記標的分子は、タンパク質、脂質、多糖、または粒子を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項24】
前記標的分子は、ＤＮＡ改変、ＲＮＡ改変、またはタンパク質改変を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項25】
前記標的分子は、細胞、組織に位置する、または、固形スカフォールドに付着する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の生体サンプル。
【請求項26】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の生体サンプルを調製するのに好適な光標識で標識されたプローブを含む、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または混合物。
【請求項27】
生体サンプルにおける２以上の標的分子を検出するための方法であって、請求項２６に記載の前記プローブを、標的分子を含むサンプルと混合する段階であって、前記プローブが前記標的分子に結合することが可能な条件下で混合し、異なる種類の標的分子が異なる組み合わせの光標識に関連し、標的分子の各々は、少なくとも２の色チャネルによって検出される、段階を備える方法。
【請求項28】
前記標的分子に関連する前記光標識に関連する異なる光学シグナルは、参照光学コードマップと照合され、前記異なる標的分子の検出を可能にする、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
参照強度コードマップから利用可能である強度比率コードの一部は、前記プローブを設計するために使用される、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
任意の２つの標的分子は空間的に少なくとも２５０ｎｍ離間される、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
各光標識はイメージングプローブに関連し、前記イメージングプローブは一次プローブに関連し、前記一次プローブは標的分子に付着する、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
各一次プローブは少なくとも２つの光標識に関連し、これらの光標識は、前記一次プローブの５'末端または３'末端のいずれかに付着するが、両方の末端に付着することはない、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
各一次プローブは少なくとも２つの光標識に関連し、これらの光標識は前記一次プローブの５'末端および３'末端の両方に付着する、請求項３１に記載の方法。
【請求項34】
各一次プローブの前記５'末端および前記３'末端は、異なる数の光標識を有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
各光標識はイメージングプローブに関連し、前記イメージングプローブは、１または複数の階層の仲介プローブに関連し、前記仲介プローブは一次プローブに関連し、前記一次プローブは標的分子に付着する、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
複数の同一または異なる種類のイメージングプローブが仲介プローブに関連する、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
少なくとも１つのイメージングプローブは、２以上の同一または異なる種類の光標識に関連する、請求項３１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１９年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６９，５０２号、および、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９２５，１９７号の利益を主張するものであり、その各々の内容の全体は参照によって本開示に組み込まれる。
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１９年７月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６９，５０２号、および、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９２５，１９７号の利益を主張するものであり、その各々の内容の全体は参照によって本開示に組み込まれる。
【0002】
蛍光ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、個別のＤＮＡ座位をｉｎ‐ｓｉｔｕで検出するための強力なツールである。それは、細胞遺伝学的解析などの臨床診断において広く使用されている。それは今でも、高感度（＞９８％）、高特異性（９８％）、幅広い範囲の数値および構造の両方の変化を検出する広いカバレッジ、ならびに、単一細胞レベルでの変化を検出する優れた能力に起因して、臨床におけるゲノム異常を検出するためのゴールドスタンダードとみなされている。このことは、次世代シーケンシングがゲノム解析のルーチンになるときに、一層顕著である。ＦＩＳＨは単一細胞レベルでのゲノムの変化を解析できるので、細胞遺伝学的解析に対して固有の利益をしばしば提供するが、現在のＦＩＳＨ技術は、長いハイブリダイゼーション時間（数時間から一晩）を必要とし、マルチプレックス機能を欠き、低いゲノム分解能（約１００ｋｂ）を有する。特に、その限定されたマルチプレックス機能は、顕微鏡検査のために利用可能な異なる蛍光色／チャネルの限られた数に起因する。また、その低いゲノム分解能は、悪いプローブ設計から生じ得る。そのような制限により、ＦＩＳＨは、全ゲノムレベルでの単一細胞の構造変動検出における使用に成功していない。
【0003】
ＤＮＡ解析については、マルチプレックスＦＩＳＨ（Ｍ‐ＦＩＳＨ）、ＣＯＢＲＡ－ＦＩＳＨ、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）などのマルチプレックスＤＮＡ ＦＩＳＨのために複数の方法が開発されてきた。これらの方法は主に２４色ヒト染色体可視化に使用されている。Ｍ‐ＦＩＳＨおよびＳＫＹの両方は、組み合わせ標識の方策を使用し得る。ＣＯＢＲＡ－ＦＩＳＨは、組み合わせ標識を比率標識と共にまとめる。染色体解析のために開発された比率標識は、各ＤＮＡ座位および染色体について、大量の二本鎖ＤＮＡプローブおよび蛍光色素分子（典型的には１０，０００－１００，０００）を利用し、非常に低いゲノム分解能（１０Ｍｂから１００Ｍｂ）を実現する。
【0004】
ＲＮＡ解析については、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑが、全トランスクリプトームレベルにおける単一細胞遺伝子発現プロファイルのために広く使用されている。しかしながら、この方法は、空間情報を提供できない、検出効率が低い、および、細胞捕捉効率が低いなど、著しい制限を有する。ｉｎ‐ｓｉｔｕ ＲＮＡ検出は、細胞損失無しで配列情報と空間情報とをシームレスに統合する最良の手段である。それは組織完全性を保護し、（１）固形組織および液状検体の両方から、単一細胞における局所化された遺伝子発現を視覚化する、（２）通常の組織アーキテクチャのコンテキストにおいて遺伝子調節を研究する、（３）トランスクリプトームレベルにおいて細胞不均一性を理解する、（４）珍しい細胞集団および病原体感染を検出するために使用され得る。
【0005】
多くのマルチプレックスｉｎ‐ｓｉｔｕ ＲＮＡ検出技術が開発されてきた。それらは主に３つのカテゴリ、すなわち、（１）ＦＩＳＳＥＱなどのｉｎ‐ｓｉｔｕシーケンシング方法、（２）ＳＴＡＲｍａｐなど、ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびｉｎ‐ｓｉｔｕシーケンシングを用いるハイブリッド手法、（３）ｓｅｑＦＩＳＨおよびＭＥＲＦＩＳＨなどのシーケンシャルＦＩＳＨ方法に分類され得る。
【0006】
ｉｎ‐ｓｉｔｕシーケンシングは最高のゲノム分解能（単一ヌクレオチド）を有するが、単一の実験を実行するのに数日から数週間を要する。さらに、低い検出効率（０．０１％～５％）、および、ローリングサイクル増幅の大きいドットサイズに起因して、細胞あたり約５００の遺伝子だけを検出でき、単一細胞において遺伝子発現を正確に定量化することは不可能である。ＳＴＡＲｍａｐは、ヒドロゲル－組織化学、標的化シグナル増幅、および、ｉｎ‐ｓｉｔｕシーケンシングを統合して、マルチプレックスＲＮＡ ｉｎ‐ｓｉｔｕ検出を実現するが、その検出効率はなお、ゴールドスタンダードである単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨほど高くない。単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨは、複数の短いＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用して、一度に１つのＲＮＡコピーを標的化して、高い検出特異性および感度（＞９０％）を実現する。
【0007】
マルチプレックスおよびシーケンシャルＦＩＳＨ技術は検出効率を改善した。その中の２つ、ｓｅｑＦＩＳＨおよびＭＥＲＦＩＳＨは、最高のパフォーマンスを有する。これら２つの方法は、両方とも、単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨに基づいて、＞９０％の検出効率を実現する。しかしながら、それらのターンアラウンドタイムは、完了に３～５日を必要とする、特に小さい遺伝子パネル（＜５００遺伝子）検出については十分に速くない。ラウンドあたりのマルチプレックス機能はなお、利用可能な蛍光色／チャネルによって制限される。
【0008】
ｉｎ‐ｓｉｔｕのマルチプレックスタンパク質検出についてはまた、ＣｏｄｅｘおよびＤＮＡ交換方法などの複数の方法も開発されてきた。しかしながら、これらの方法は、大きいタンパク質のパネル検出では時間がかかる。主な速度制限要因の１つはまた、顕微鏡に利用可能な限られた数の蛍光チャネルである。
【0009】
高容量および高スループットの細胞バーコーディングについては、異なる細胞集団を検出するために多色および多強度レベルが組み合わされてきた。蛍光細胞バーコーディング（ＦＣＢ）は、フローサイトメトリーによって２つの蛍光色素分子を用いて最大３６の細胞集団を区別するために開発され、３つの蛍光色素分子を用いて最大２１６の細胞集団を検出する能力を有する。しかしながら、ＦＣＢのプローブ標識方式は、ｉｎ‐ｓｉｔｕ分子検出および空間イメージングに拡張できない。
【発明の概要】
【0010】
様々な実施形態において、本開示は、ｉｎ‐ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ条件において、空間的に離間された複数の標的分子、粒子および細胞の高容量検出のための組成物および方法を提供する。分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質などを含み得るが、これらに限定されない。異なる色の色素の数の制限を克服するべく、本技術は、数が大きいがなお互いに光学的に見分けられる、異なる比率および強度の色素、またはより一般には光標識の組み合わせを採用する。本技術は更に、標識コーディング方式の設計、ならびに、シグナル検出および訂正のための方法を提供する。
【0011】
本開示の一実施形態によれば、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合された第１の複数のプローブ、ならびに、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合された第２の複数のプローブを含む、検査のために調製されたサンプルが提供され、各標的は、少なくとも２つの種類の光標識に関連し、（ａ）第１の複数のプローブには、少なくとも第１の種類の光標識が付着し、第２の複数のプローブには、少なくとも第２の種類の光標識が付着し、（ｂ）第１標的および第２標的分子は励起されると、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。
【0012】
また、一実施形態において、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージまたは混合物が提供され、それらは、各々が第１標的分子に結合し得る第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合し得る第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブとを備え、各標的は、少なくとも２種類の光標識に関連し、（ａ）第１の複数のプローブは、少なくともの第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、少なくとも第２の種類の光標識に付着し、（ｂ）第１標的および第２標的分子は、励起時に、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。
【0013】
更に別の実施形態において、サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法が提供され、方法は、プローブが標的に結合することが可能な条件下で、第１標的および第２標的を含むサンプルとプローブとを混合する段階を備え、標的に関連する異なる色または色強度が標的の検出を可能にする。
【0014】
別の実施形態は、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合された第１の複数のプローブ、ならびに、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合された第２の複数のプローブを備える、検査のために調製されたサンプルを提供し、プローブの各々は、１または複数の光標識に付着し、（ａ）少なくとも第１光標識は、第１標的および第２標的の両方に関連するが、第１標的および第２標的は、異なる数の第１光標識に関連し、（ｂ）第１標的および第２標的は、励起されると、光標識から放出される異なる色、色の異なる強度、または、それらの組み合わせに関連する。
【0015】
また、一実施形態においてにおいて、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または混合物が提供され、それらは、各々が第１標的分子に結合できる第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブとを備え、プローブの各々は、１または複数の光標識に付着し、標的生体分子に結合すると、（ａ）少なくとも第１光標識が第１標的および第２標的の両方に関連するが、第１標的および第２標的は、異なる数の第１光標識に関連し、（ｂ）第１および第２標的は、励起時に、光標識から放出された異なる色、異なる強度の色、または、それらの組み合わせに関連する。
【0016】
別の実施形態は、第１標的生体分子に直接的または間接的に結合された第１の複数のプローブ、ならびに、第２標的生体分子に直接的または間接的に結合された第２の複数のプローブを含む光プローブ検出サンプルを提供し、プローブの各々は、１または複数の光標識に付着し、（ａ）第１標的および第２標的は２つの異なる光標識に関連し、（ｂ）第１標的および第２標的は、同一の色の２つの異なる強度に関連する。
【0017】
更に別の実施形態において、本開示は、第１プローブおよび第２プローブを含むプローブセットを提供し、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、異なる強度の同一または重複する色スペクトラムを有する２の光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブは各々、第２光標識に更に付着し、第１プローブおよび第２プローブは光学的に区別可能である。いくつかの実施形態において、プローブは異なる結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、第１プローブおよび第２プローブは、生体サンプルにおける２つの標的分子に直接的または間接的に結合される。
【0018】
サンプルにおける２つの異なるプローブを検出する方法も提供され、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、同一または重複する色スペクトラムを有するが異なる強度を有する２つの光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブは各々、第２光標識に更に付着し、方法は、２つの共通の色チャネルを通じて第１プローブと第２プローブとを光学的に検出および区別する段階を備える。
【0019】
更に別の実施形態において、本開示は、第１プローブおよび第２プローブを含むプローブセットを提供し、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、同一または重複する色スペクトラムを有するが２または２より多くの共通の色チャネルにおいて異なる強度を有する第１光標識および第２光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブは光学的に区別可能である。いくつかの実施形態において、プローブは異なる結合特異性を有する。いくつかの実施形態において、第１プローブおよび第２プローブは、生体サンプルにおける２つの標的分子に直接的または間接的に結合される。
【0020】
サンプルにおける２つの異なるプローブを検出する方法も提供され、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、同一または重複する色スペクトラムを有するが２または２より多くの共通の色チャネルにおいて異なる強度を有する２つの光標識に付着し、方法は、２または２より多くの共通の色チャネルを通じて第１および第２プローブを光学的に検出および区別する段階を備える。
【0021】
別の実施形態において、検査のために調製される生体サンプルであって、第１光標識に直接的または間接的に結合する第１標的分子と、第２光標識に直接的または間接的に結合する第２標的分子とを備え、第１標的分子および第２標的分子は、（ａ）第１光標識が第２光標識と同一である場合に、各々に結合する光標識の数が異なること、または、（ｂ）第１光標識と第２光標識との間で類似の色の強度が異なることに起因して、１または複数の色チャネルにおいて光学的に区別可能である、生体サンプルが提供される。
【0022】
また、一実施形態において、検査のために調製された生体サンプルであって、複数の異なる標的分子を備え、その各々は、１または複数の光標識に結合し、標的分子は、１または複数の色チャネルにおいて互いから光学的に区別可能であり、標的分子の少なくとも２つは、同一の光標識に結合するが、標的分子に結合する異なる光標識の異なる比率に起因して光学的に区別可能である、生体サンプルが提供される。
【0023】
また、一実施形態において、検査のために調製される生体サンプルであって、複数の異なる標的分子を備え、その各々は、１または複数の光標識に結合し、標的分子は、１または複数の色チャネルにおいて互いから光学的に区別可能であり、標的分子の少なくとも２つは、１つの共通の第１光標識に、ならびに、類似の色を有する第２光標識および第３光標識にそれぞれ結合するが、第２光標識および第３光標識が異なる強度を有することに起因して光学的に区別可能である、生体サンプルが提供される。
【0024】
また、本開示のサンプルを調製するために好適な光標識で標識されたプローブを含む、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または混合物が提供される。なお更に、サンプルにおける２以上の標的分子を検出するための方法であって、開示に記載のプローブを、標的分子を含むサンプルと混合する段階であって、プローブが標的分子に結合することが可能な条件下で混合し、異なる種類の標的分子が異なる組み合わせの光標識に関連し、標的分子の各々は、少なくとも２の色チャネルによって検出される、段階を備える方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】２色および２強度レベルによって、８強度コードマトリクスのＨＣ－ｓｍＦＩＳＨの概略を提示する。（ａ）単一色素標識プローブのセット、または、プローブあたり複数の色素を有するプローブのいずれかによる、強度比率コーディングのためのプローブ標識方式の概略である。（ｂ）強度コーディングのための色チャネル方式。異なる色素が、異なる色チャネル（例えばＣｙ３およびＣｙ５色素）でイメージングされる。代替的に、重複する放出スペクトラム（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）を有する色素は、同一の色チャネルでイメージングされる。少なくとも２の色チャネルが強度コーディングに使用される。各長方形のバーは１の色チャネルを表す。（ｃ）８コードマトリクス（Ｎ＝２およびＭ＝２）の強度座標マップ。２強度レベル（０を除く）が各色チャネルにおいて使用される。各ドットは、オリゴＦＩＳＨスポットからの測定された強度比率を表す。（ｄ）ＦＩＳＨスポットの２次元（２Ｄ）強度分布から生成された参照強度コードマップ。境界を有する３つのクラスタは、スポットの密度分布を解析して３つの強度コードをここに表すことによって生成される。各強度コードは、不規則境界を有する。
【0026】
【図2】標識方式１を示す。（ａ）直接標識。（ｂ）間接標識。（ｃ）分岐ＤＮＡ増幅による間接標識。ここでは２の色チャネル、Ｃｙ３／６００およびＣｙ５／７００チャネルが使用される。強度コードの一桁目は、Ｃｙ３チャネルにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目は、Ｃｙ５チャネルにおける強度レベルを表す。
【0027】
【図3】標識方式２を示す。（ａ）直接標識。（ｂ）間接標識。（ｃ）分岐ＤＮＡ増幅による間接標識。ここでは２の色チャネル、Ｃｙ３／６００およびＣｙ５／７００チャネルが使用される。強度コードの一桁目はＣｙ３チャネルにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目はＣｙ５チャネルにおける強度レベルを表す。
【0028】
【図4】標識方式３を示す。（ａ）直接標識。（ｂ）間接標識。（ｃ）分岐ＤＮＡ増幅による間接標識。強度コードの一桁目はＣｙ３／６００チャネルにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目はＣｙ５／７００チャネルにおける強度レベルを表す。
【0029】
【図5】核酸ベース標的検出のための様々な強度コードを実現するためのローリングサイクル増幅による代替的なシグナル増幅手法を示す。（ａ）ローリングサイクル増幅のためのプローブ標識の異なるコンポーネントの例。（ｂ）様々な強度コードを有するイメージングプローブ。（ｃ）例として１つの標的を使用するシグナル増幅方式。各固有の標的は、標的固有プライマー、標的固有の識別子を有する標的固有のパドロックプローブによって標識される。標的固有の識別子は、ローリングサイクル増幅によって増幅される。最後に、色素の標的固有の組み合わせを有するイメージングプローブが、増幅された識別子とハイブリダイズされ、標的特異的な強度コーディングを実現する。イメージングプローブに異なる数および種類の色素を付着させることにより、様々な強度コードが取得され得る。
【0030】
【図6】非特異的結合のエラー訂正のための参照色素を追加することを示す。Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５４６、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５は強度コーディングに使用される。Ａｌｅｘａ４８８は、非特異的結合シグナルを除去するために参照色素として使用される。（ａ）標識方式２のために参照色素を追加する。（ｂ）標識方式３のために参照色素を追加する。ここでは３つ色チャネル、Ａｌｅｘａ４８８／５００チャネル、Ｃｙ３／６００およびＣｙ５／７００チャネルが使用される。５００チャネルは、強度コーディングのために使用されない。強度コードの一桁目はＣｙ３チャネルの強度レベルを表す。強度コードの二桁目はＣｙ５チャネルの強度レベルを表す。
【0031】
【図7】標識方式２および方式３のための区別された標識手法を示す。異なる色素は異なる一次プローブ（標的に直接結合されるプローブ）に関連する。（ａ）標識方式２のための区別された標識。（ｂ）標識方式３のための区別された標識。強度コードの一桁目はＣｙ３チャネルにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目はＣｙ５チャネルにおける強度レベルを表す。
【0032】
【図8】区別された標識のための交互の標識手法を示す。異なる標識に関連する一次プローブは、交互の手段で同一標的に結合するよう設計される。強度コードの一桁目はＣｙ３チャネルにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目はＣｙ５チャネルにおける強度レベルを表す。
【0033】
【図9】代替的標識方式３を示す。標的あたり１色素であるが、異なる標的は、少なくとも２の色チャネルにおける重複するスペクトラムを有する異なる色素に関連する。（ａ）標的標識方式あたり１色素。２の色チャネルで３つの色素によって３つの強度比率コードが生成される。（ｂ）重複するスペクトラムを有する３つの色素によって生成される異なる強度比率コードの３つのクラスタの説明。バックグラウンドおよび非特異的結合シグナルを除去するべく、各クラスタは、より低い強度の側で強度閾値によって切り取られている。強度コードの一桁目はチャネルＡにおける強度レベルを表す。強度コードの二桁目はチャネルＢにおける強度レベルを表す。
【0034】
【図10】Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００の重複する放出スペクトラムを示す。２の色チャネルは、Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００のための２つの強度比率を生成するために使用され得、その結果、これら２つの色素はこれらの２の色チャネルによって区別され得る。（ａ）２つ色素を２つの標的および２の色チャネルのペアと照合する。（ｂ）２の色チャネルにおけるＡｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００の重複するスペクトラム。チャネルＡ：６５０ｎｍ～７１０ｎｍ。チャネルＢ：７４５ｎｍ～８０５ｎｍ。
【0035】
【図11】消光による標識方式４を示す。強度レベルおよび強度の変動は、ＦＲＥＴ（ｄ－ｈ）、限定距離におけるより多くの同一色素の蓄積の自己消光（ｉ、ｊ、ｌ）およびクエンチャー（ｋ、ｍ）などの様々な消光設計によって微調整され得る。
【0036】
【図12】強度コーディングによるタンパク質標識を示す。（ａ）一次プローブとしての標的特異的オリゴ配列に付着したタンパク質標的。（ｂ）標識方式２によるタンパク質コーディングの説明。（ｃ）標識方式３によるタンパク質コーディングの説明。（ｄ）ローリングサイクル増幅による代替的なシグナル増幅。図１２の（ｄ）において、タンパク質などの標的は、標的固有オリゴヌクレオチドが付着した標的特異的抗体によって標識される。抗体は、ＨＡまたはＳＮＡＰタグのような小型エピトープなどの他の標的特異的リンカによって置き換えられ得る。標的固有識別子を有する標的固有パドロックプローブは、抗体上のオリゴとハイブリダイズされ、次にライゲーションによって環化される。標的固有識別子は、ローリングサイクル増幅によって増幅される。最後に、色素の標的固有の組み合わせを有するイメージングプローブが、増幅された識別子とハイブリダイズされ、標的特異的な強度コーディングを実現する。イメージングプローブに異なる数および種類の色素を付着させることにより、様々な強度コードが取得され得る。３つの強度コード（１：０、１：１、３：１）が図の左に示される。
【0037】
【図13】強度コーディングの異なる用途を示す。（ａ）異なる細胞タイプを検出する。異なる数は、別々の細胞マーカを有する異なる細胞タイプを表す。（ｂ）ガラススライドなどの固形スカフォールド上にランダムに分布するタンパク質を検出する。異なる種類のタンパク質が、光標識の異なる組み合わせに関連する。（ｃ）マイクロアレイ上の空間パターンと同時に複数の標的を検出する。異なる空間位置における異なる標的が、異なる強度比率でプログラムされたプローブでエンコードされる。
【0038】
【図14】オリゴＤＮＡプローブを用いた単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨの結果、および、２色強度コーディングのシミュレーションを示す。（ａ）画像はＨｅＬａ細胞におけるＴＦＲＣ ＲＮＡ ＦＩＳＨである。右の画像は、左の画像の選択領域からズームインされたものである。（ｂ）ＴＦＲＣ ＦＩＳＨスポットの強度分布。比率１：０は、単一Ｃｙ３標識ＴＦＲＣプローブによって検出された７９０のスポットからの実験結果である。比率２：０および３：０は、それぞれ、スポットあたり２倍の強度および３倍の強度を有する比率１：０に基づくシミュレーションデータである。比率２：０は、比率１：０と重複する４０％のスポットを有する。比率３：０は、比率１：０と重複する５％未満のスポットを有する。（ｃ～ｄ）８比率コーディング方式のための強度分布のシミュレーション結果を示す。（ｃ）第２強度レベルが第１強度レベルの２×（２倍）の強度を有するときのＮ＝２およびＭ＝２の８比率コーディング方式を示す。（ｄ）第２強度レベルが第１強度レベルの３倍の強度を有するときのＮ＝２およびＭ＝２の８比率コーディング方式を示す。
【0039】
【図15】標識方式３を用いた強度比率イメージングの結果を示す。（ａ）～（ｂ）Ｃｙ５（ａ）およびＣｙ３（ｂ）で標識されたテロメアの共焦点イメージングであり、ａおよびｂは、強度の同一の表示範囲においてレンダリングされる。（ｃ）～（ｄ）Ｃｙ５（ｃ）およびＡｌｅｘａ５３２（ｄ）で標識されたセントロメアの共焦点イメージングであり、ｃおよびｄは、強度の同一の表示範囲においてレンダリングされる。（ｅ）～（ｆ）異なる色素ペアを用いるテロメアおよびセントロメアプローブの強度分布。（ｅ）Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３、Ｃｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２、（ｆ）Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６。（ｅ）Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３はＣｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３と重複するが、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２から良く離間されている。（ｆ）Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３はＣｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０と重複するが、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６から大まかに区別可能である。（ｇ）異なる色素ペアについての、７００および６００の色チャネルの間の強度比率のヒストグラム。
【0040】
【図16】標識方式３を使用する強度コーディングによるＲＮＡ ＦＩＳＨの結果を示す。ＰＯＬＲ２ＡはＣｙ５．５およびＡ５４６で標識される。ＣＴＮＮＢ１はＣｙ５およびＣｙ３で標識される。（ａ）７００チャネルにおけるＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１共標識の画像。（ｂ）６００チャネルにおけるＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１共標識の画像。（ｃ）７００チャネルだけにおけるＣＴＮＮＢ１標識の画像。（ｄ）６００チャネルだけにおけるＣＴＮＮＢ１標識の画像。（ｅ）７００チャネルだけにおけるＰＯＬＲ２Ａ標識の画像。（ｆ）６００チャネルだけにおけるＰＯＬＲ２Ａ標識の画像。（ｇ）７００チャネルにおける一次プローブの標識を有しないネガティブコントロール。（ｈ）６００チャネルにおける一次プローブの標識を有しないネガティブコントロール。両方のＲＮＡ標的についてのアンプリファイアおよびイメージングプローブがネガティブコントロールに追加される。
【0041】
【図17】参照強度コードマップを使用してＦＩＳＨスポットに強度コードを割り当てる手段を示す。（ａ）ＣＴＮＮＢ１をＣｙ５およびＣｙ３で、ＰＯＬＲ２ＡをＣｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６で別個に標識することによって生成される参照強度コードマップ。境界は、各色素の組み合わせについてプロットされる。左上におけるクラスタは、Ｃｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６の共標識を用いるＰＯＬＲ２Ａの強度分布を表す。右下におけるクラスタは、Ｃｙ５およびＣｙ３の共標識を用いるＣＴＮＮＢ１の強度分布を表す。（ｂ）ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａの共標識を用いる細胞１の２Ｄ強度マップ。（ｃ）ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａの共標識を用いる細胞２の２Ｄ強度マップ。（ｄ）ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａの共標識を用いる細胞３の２Ｄ強度マップ。ＰＯＬＲ２Ａは、Ｃｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６で標識される。ＣＴＮＮＢ１は、Ｃｙ５およびＣｙ３で標識される。
【0042】
【図18】強度コーディングによる４ＲＮＡ共標識の結果を示す。（ａ）７００チャネルにおけるＭＥＦ細胞のマルチプレックス標識の画像。（ｂ）６００チャネルにおけるＭＥＦ細胞のマルチプレックス標識の画像。（ｃ）（ｄ）に示されるズームインエリアを有する（ａ）および（ｂ）の重複画像。（ｄ）（ｃ）において選択される領域のズームイン画像。異なる形状は、異なるＲＮＡコピーの位置を示し、ＨＯＸＢ１の各コピーは円で、ＰＯＬＲ２Ａは正方形で、ＴＦＲＣはひし形で、ＣＴＮＮＢ１は六線星形で示される。（ｅ）ドットの４つのクラスタが明確に互いに区別されるログスケールにおける２Ｄ強度分布マップ。
【0043】
【図19】一次組織における２つのＤＮＡ座位の強度比率に基づく分離の結果を示す（ａ～ｃ：マウス脳組織におけるテロメアおよびセントロメア座位、ｄ～ｆ：ヒトＰＢＭＣ細胞における染色体１反復座位（Ｃｈ１‐Ｒｅ）およびセントロメア座位）。（ａ）分解可能な強度比率分布に基づく強度比率の２つのクラスタの分離。（ｂ）～（ｃ）強度比率コード（ｂ）への（ｃ）におけるズームイン領域の割り当てに基づくテロメアおよびセントロメアの識別結果。（ｄ）分解可能な強度比率分布に基づく強度比率の２つのクラスタの分離。（ｅ）～（ｆ）強度比率コード（ｅ）への（ｆ）におけるズームイン領域の割り当てに基づくＣｈ１‐Ｒｅおよびセントロメアの識別結果。
【0044】
【図20】異なる強度でコーディングされたプローブによるＤＮＡ ＦＩＳＨの結果を示す。（ａ～ｂ）テロメアプローブ（一次プローブあたり１ Ｃｙ５および１０ Ｃｙ３）の２の色チャネルにおける画像。（ａ）Ｃｙ５／７００チャネル、（ｂ）Ｃｙ３／６００チャネル。（ｃ）１ Ｃｙ５：１０ Ｃｙ３の１つの強度比率で標識されたテロメアの２Ｄ強度分布。（ｄ）１ Ｃｙ５：２ Ｃｙ３の１つの強度比率で標識されたテロメアの２Ｄ強度分布。（ｅ）１ Ｃｙ５：３０ Ｃｙ３の１つの強度比率で標識されたテロメアの２Ｄ強度分布。（ｃ～ｅ）同一の基準線を共有する。
【発明を実施するための形態】
【0045】
本開示は、様々な実施形態において、分子、分子複合体、細胞、または組織などの高容量検出を実行するための組成物および方法を記載する。いくつかの実施形態において、高容量は、日常的に行われるものと比較して、互いから区別できるより多くの標識機構を使用することに起因し得る。そのような標識機構は、明細書において実証されるように、単一分子、または、２以上の分子の組み合わせであり得る。更に、標識機構間の違いは、異なる色もしくはスペクトル、異なる強度、またはその両方の問題であり得る。
Ａ 高容量単一分子ＦＩＳＨ（ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨ）
Ａ 高容量単一分子ＦＩＳＨ（ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨ）
【0046】
本技術の一実施形態は、「高容量単一分子ＦＩＳＨ」またはＨＣ－ｓｍＦＩＳＨにおいて示される。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨは、単一分子検出感度および高ゲノム分解能（＞２０ｎｔ）で、強度比率コーディング方式（または「強度コーディング」、「色彩比コーディング」または「スペクトル比率コーディング」と称される）を利用する。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨは、従来のＦＩＳＨ技術で実現され得るものより著しく多くのＲＮＡ種またはＤＮＡ座位の可視化を可能にする。従来のＦＩＳＨ技術において、同時に視覚化できるＲＮＡ種またはＤＮＡ座位の数は、使用される顕微鏡方法で利用可能な異なる蛍光色の数によって制限される。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨにより、大きいＤＮＡ／ＲＮＡパネル、更には全トランスクリプトームまたはゲノムをプロファイルすることができる。
【0047】
ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨは、１または複数の色チャネルからの強度比率（または色彩比とも称される）を強度コードとして使用し、ＲＮＡ種またはＤＮＡ座位を区別する。強度の変動に起因して、典型的には、２以上の色チャネルの間の強度比率はマルチプレックスバーコーディングに使用され、その結果、任意の２つの強度コード間で強度の重複が最小化され得る。理論上、利用可能な強度の組み合わせまたは強度比率の組み合わせの数は、オリゴプローブ標識方式によってプログラムされ得る。例えば、２色、および、色あたり２の強度レベルの標識方式は、８の強度の組み合わせ（１：０、２：０、０：１、０：２、１：１、１：２、２：１、２：２）を生成し、したがって、細胞内で最大８のＲＮＡ種またはＤＮＡ座位をエンコードできる。（図１）
【0048】
理想的には、同一のＲＮＡ種またはＤＮＡ座位からの個別のＦＩＳＨスポットは、同一の標識設計を有するプローブによって検出されるものと同一の強度の組み合わせまたは強度比率の組み合わせを有するはずである。実験的には、同一のＲＮＡ種またはＤＮＡ座位からの個別のＦＩＳＨスポットによって生成される強度値は、指定された強度コードから逸脱し得る。指定された組み合わせからの実験的な強度の組み合わせの各々の距離を比較することにより、各ＦＩＳＨスポットは、もっとも近い強度コードに割り当てられ得る（図１のｃ）。曖昧な強度値を有するＦＩＳＨスポット（２つの指定された比率の中央）については、破棄される。
【0049】
理論上、ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨの容量、すなわち、標識方式のプログラムされた比率の最大数、または、ＦＩＳＨのラウンドあたり検出されるＲＮＡ種もしくはＤＮＡ座位の最大数は、Ｐｍａｘ＝（Ｍ＋１）Ｎ－１の式によって予測される、蛍光色および強度レベルの数によって決定される。ここで、Ｐは、検出できるＲＮＡ種またはＤＮＡ座位などの異なる標的の数（すなわち、ＦＩＳＨのラウンドあたりのマルチプレックス機能）を表し、Ｍは、プローブ標識方式によって決定される、色あたりの強度レベルの数（ゼロを除く）を表し、Ｎは、顕微鏡から利用可能な蛍光色の数（すなわち色チャネル）を表す。したがって、色あたり２の強度レベル（第１強度レベル（または強度レベル１と呼ばれる）および第２強度レベル（または強度レベル２と呼ばれる）を含み、強度レベル０は含まれない）を有する２の蛍光色は、最大８のＲＮＡ種またはＤＮＡ座位をコードでき、色あたり３の強度レベルを有する４の色は、２５５のＲＮＡ種またはＤＮＡ座位をコードできる。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨ設計において、少なくとも１つの非ゼロ強度レベル（Ｍ≧１）を使用して、ハイブリダイゼーションおよびイメージングのラウンドあたり、著しく大きいコードサイズを生じさせ得る。
【0050】
強度コーディングについては、色チャネルの数は、各強度コードの桁の数を定義する。１の色チャネルだけがコードに使用される場合（１：０など）、１桁コードである。２の色チャネルがコードに使用される場合（１：２など）、コードは２桁コードである。
【0051】
ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨはしたがって、他のＦＩＳＨ技術と比較して、ＦＩＳＨのラウンドあたり１０～１００倍高いマルチプレックス機能を実現できる。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨの各ラウンドは、４～５の蛍光色を用いて数百のＲＮＡ遺伝子をイメージングし得る。
【0052】
単一細胞遺伝子発現解析のための大きいＲＮＡパネルをプロファイルするなどの実際の適用では、ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨは、強度コーディング方式をエラー訂正コードと組み合わせ得る。基本原理は、全体のコードスペースを疎に占有するコードのセットを設計することであり、その結果、わずか１の色チャネルのミスアライメントも検出および訂正され得る。例えば、Ｎ＝５およびＭ＝３については、Ｐｍａｘ＝１０２３であるが、Ｐ＝２００を選択する。ハイブリダイゼーション、イメージング、およびデハイブリダイゼーションの連続的なラウンドにわたるコーディングとの統合は、単純な方式で検出容量の更なる拡大を可能にする。
【0053】
組み合わせ比率コードの数は、Ｑｍａｘ＝（（Ｍ＋１）Ｎ）Ｋ－１の式によって予測され得る。ここで、Ｑは組み合わせ強度比率コードの総数を意味し、Ｍは強度レベル（ゼロは除く）を意味し、Ｎは色の数（すなわち色チャネル）を意味し、Ｋは連続的なラウンドの数を意味する。したがって、Ｍ＝３、Ｎ＝５、Ｑｍａｘ＝１０２３であるが、Ｑを２００に選択する場合、５色イメージングの３ラウンドは原理的に、ヒトまたはマウスのトランスクリプトーム全体（約２０，０００のタンパク質コーディング遺伝子）をカバーする組み合わせコードを生じさせ得る。遥かに小さいＰの値を有するＭＥＲＦＩＳＨおよびｓｅｑＦＩＳＨと比較して、ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨの高いマルチプレックス容量は、大きいサイズの組織の解析に特に有利である。なぜなら、解析のラウンドあたりの長いイメージング時間は、より少ないラウンドに都合が良いからである。
【0054】
強度コーディングを使用する最高のパフォーマンスのために、ここで強度コーディングを使用するとき、核酸標的の任意の２つのコピーは、イメージングシステムの光学分解能を超えて空間的に離間されるべきである。典型的には、従来の光学顕微鏡上で可視的光標識を使用するとき、この光学分解能は約２５０ｎｍである。しかしながら、高度な任意の光学イメージング方法により、この光学分解能は、１００ｎｍ未満、または更には２０ｎｍ未満に強化され得、その結果、同一の空間においてより多くの分子を検出でき、強度コーディングを用いてより高い検出効率を実現できる。
Ｂ 他の種類の標的のための高容量検出
Ｂ 他の種類の標的のための高容量検出
【0055】
ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨは、高容量検出技術の実装の例である。ＲＮＡおよびＤＮＡの他に、高容量検出技術はまた、タンパク質、炭水化物、脂質、複合体、細胞小器官、細胞、組織および微生物など、空間的に互いから離間する他の非核酸ベースの生体分子、粒子、細胞および組織サンプルを検出するために使用され得る。ここでの一般原理は、最初にプログラムされたオリゴヌクレオチドまたはペプチドで複数の標的をバーコーディングし（標的の各種類は固有のオリゴまたはペプチド配列でプログラムされる）、次に、ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨおよびハイブリダイゼーションベースのプローブのための強度コーディングプローブ標識方式を使用して、様々な標的に関連するプログラムされたオリゴまたはペプチドを検出する。オリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチド、またはＬＮＡなどの非天然ヌクレオチドから成り得る。ペプチドは天然アミノ酸または非天然アミノ酸から成り得る。代替的に、ハイブリッドオリゴヌクレオチドおよびペプチド配列が使用され得る。
【0056】
強度コーディングを使用する最高のパフォーマンスのために、ここで強度コーディングを使用するとき、非核酸標的の任意の２つのコピーは、イメージングシステムの光学分解能を超えて空間的に離間されるべきである。典型的には、空間分解能は２５０ｎｍ以上である。いくつかの場合において、分解能は、超分解能イメージングセットアップおよびアルゴリズムを用いることにより２０ｎｍもの低さになり得る。
Ｃ 高容量強度コーディングのための標識方式
Ｃ 高容量強度コーディングのための標識方式
【0057】
図２～図４に示される３つの基本的な標識方式は、標識方式１（図２）、標識方式２（図３）および標識方式３（図４）とそれぞれ名付けられる。基本的な標識方式の各々において、３つの基本的バリエーション、すなわち、直接標識（図２～図４のパネルａ）、シグナル増幅無しの間接標識（図２～図４のパネルｂ）、シグナル増幅を有する間接標識（図２～図４のパネルｃ）が更に実装され得る。標識方式１において、標的に関連する各光標識についての光標識の数に比例する標的結合プローブまたは一次プローブの数は、各色チャネルにおける強度レベルを定義する。標識方式２において、一次プローブの数ではなく、一次プローブに関連する光標識の数が強度レベルを定義する。標識方式３において、光標識またはプローブの数ではなく、標的に関連する色素の種類だけが各色チャネルにおける強度レベルを定義する。
【0058】
図２～図４に示されるように、水平方向に長い、太い実線の各々は検出のための標的を表す。標的は、分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物、脂質）、複合体（例えば、抗原抗体複合体、リガンド－レセプター複合体、プロトロンビナーゼ複合体）、細胞小器官、細胞、組織または微生物であり得る。
【0059】
各標的は、短い実線によって表される複数のプローブに直接的または間接的に結合される。複数の短い線は、標的に結合する複数のプローブを表す単一の長い線に結合し得る。図２～図４のパネルｃに示されるように、複数の短い線は、仲介プローブに結合する複数のプローブを表す単一の短い線に結合し得る。いくつかの実線は更に、光標識に付着したイメージングプローブを表す１または複数の中実形状（例えば、星形および正方形）に連結される。各形状は異なる光標識を表す。例えば、図２に示されるように、暗い星形は、明るい黄緑色の蛍光色素であるＣｙ３を表し、暗い正方形は、明るい遠赤色蛍光色素であるＣｙ５を表す。
【0060】
図２のパネルａに示されるように、各標的は多くの光標識（例えばＣｙ３および／またはＣｙ５）に関連する。第１行の標的（「２：０」と標識される）は、大２行の標的（「０：２」と標識される）から容易に区別可能であり得る。パネルａにおいて、第１行における標的は４のＣｙ３色素に関連し、Ｃｙ５色素に関連しない。第２行における標的はＣｙ３色素に関連せず、４のＣｙ５色素に関連する。したがって、第１標的は、顕微鏡下において、Ｃｙ３色チャネルにおける明るい黄緑色として現れ、第２標的は、Ｃｙ５色チャネルにおける明るい赤色として現れる。第３行の第３標的（「１：１」として標識される）は、２のＣｙ３色素および２のＣｙ５色素に関連する。したがって、第３標的は、Ｃｙ３およびＣｙ５両方のチャネルにおいて強いシグナルを示すが、その強度は、両方のチャネルにおける第１標的および第２標的より著しく弱い。我々が、第１強度レベルは各色チャネルにおける２の色素、および、各チャネルにおける第２強度レベル４の色素によって区別されると定義する場合、異なるチャネルにおける上の各標的の強度には、異なる強度のレベルが割り当てられ得る。したがって、各標的は、固有の強度コードでエンコードされる。例えば、第３標的は、両方のチャネルにおいて第１強度レベルを有し、その結果、強度コード１：１によって標識される。第１標的は、Ｃｙ３チャネルにおいて第２強度レベルを有し、Ｃｙ５チャネルにおいて強度を有さず、強度コード２：０が割り当てられる。第２標的は、Ｃｙ５チャネルにおいて第２強度レベルを有し、Ｃｙ３チャネルにおいて強度を有さず、強度コード０：２が割り当てられる。
【0061】
なお図２のパネルａにおいて、第４行および第５行における標的は、Ｃｙ３およびＣｙ５色素の両方に関連する。しかしながら、第４行における第４標的は、第５行における第５標的より少ないＣｙ３（２：４）および多くのＣｙ５（４：２）に関連する。第４標的には１：２の強度コードが割り当てられる。第５標的には２：１の強度コードが割り当てられる。したがって、それらは単に色によってではなく、色およびそれぞれの強度の組み合わせによって区別され得る。
【0062】
したがって、本開示のいくつかの実施形態によれば、検査のために調製されるサンプルが提供され、当該サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備える。いくつかの実施形態において、プローブの各々には、１または複数の光標識が付着し、少なくとも第１光標識は第１標的および第２標的の両方に関連するが、第１標的および第２標的は、異なる数の第１光標識に関連する。更に、いくつかの実施形態において、第１標的および第２標的は、励起されると、光標識から放出される異なる色、色の異なる強度、または、それらの組み合わせに関連し、第１標的および第２標的は光学的に区別され得る。
【0063】
明細書において使用される「プローブ」という用語は、検出可能な標識に連結される、または、検出可能な標識に間接的に連結するのに好適である分子または集合した分子の群を指す。プローブの非限定的な例は、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド、非天然オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、抗体、レセプター、リガンド、合成ポリマー（デンドリマーなど）、および様々な化合物を含む。典型的には、ハイブリダイゼーションに基づく核酸プローブ、または、ＰＮＡプローブなどのハイブリダイゼーションに基づくペプチドプローブが使用される。光標識に直接付着されたプローブは、「イメージングプローブ」と称される。イメージングプローブは、わずか１つの光標識に関連し得る。代替的に、イメージングプローブは、２以上の同一の種類の光標識に関連し得る。代替的に、イメージングプローブは、２以上の異なる種類の光標識に関連し得る。核酸標的の場合、標的に直接結合されるオリゴまたはペプチドプローブは、「一次プローブ」または「標的結合プローブ」と称される。非核酸標的の場合、標的に関連する第１プローブは、「一次プローブ」と称され、次に、更なる光プローブ（イメージングプローブおよび仲介プローブを含む）が、標的を検出するために、一連のハイブリダイゼーションを通じて第１プローブに関連する。
【0064】
「光標識」または単に「標識」という用語は、好適な励起時に、光学的手段によって検出可能なシグナルを放出できる分子または生物学的部分を指す。例として、蛍光色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５３２など）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなど）、色原体色素、量子ドットおよび他の種類のナノ粒子が含まれる。いくつかの実施形態において、光標識は反応性を有し、プローブなど別の分子に付着され得る。例として、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ルシファーイエロー、ＮＢＤ、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、レッド６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ－ ＦＬ、Ｇ－Ｄｙｅ１００、Ｇ－Ｄｙｅ２００、Ｇ－Ｄｙｅ３００、Ｇ－Ｄｙｅ４００、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘ－ローダミン、リサミンローダミンＢ、テキサスレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲートが含まれる。いくつかの実施形態において、光標識は、光変換可能なローダミンアミドなどの光変換可能な色素である。いくつかの実施形態において、光標識は、化学コンジュゲーションによってプローブに付着する。いくつかの実施形態において、光標識は、化学反応ではなく物理的会合のみによってプローブに付着する。いくつかの実施形態において、光標識は、物理的会合、また、化学反応の両方によってプローブに付着する。
【0065】
「色チャネル」、「色スペクトル」または単に「色」、「スペクトル」、「チャネル」という用語は、発光スペクトルのウィンドウ（例えば、６５０ｎｍ～７００ｎｍ）、励起スペクトルのウィンドウ（例えば６４０ｎｍまたは６３５～６４５ｎｍ）、または、これら２つの光特性の組み合わせを指す。代替的に、「色チャネル」または「チャネル」という用語は、これら２つの光特性のウィンドウを定義または選択するための光学コンポーネントの組み合わせを指し、例えば、これらのコンポーネントは、吸収フィルタ（例えば、６５０～７００ｎｍの発光バンドパスウィンドウを有するフィルタ）、励起フィルタ（例えば、６３５～６４５ｎｍの励起バンドパスウィンドウを有するフィルタ）、または、ダイクロイックミラー、吸収フィルタおよび励起フィルタを含む物理フィルタセットであり得るが、これに限定されない。疑似色によって仮想的にではなく物理的に実現される利用可能な色チャネルの数は、使用される顕微鏡システムによって限定される。典型的には、励起および発光波長ならびに対応する光学フィルタに基づく隣接するチャネル間のクロストーク無しで３～５の色チャネルが蛍光顕微鏡によって利用可能である。典型的には、本特許出願において、我々は、２～３のチャネルを使用して異なる光標識をイメージングする（Ｃｙ５／７００チャネルでＣｙ５、Ｃｙ５．５色素をイメージングし、Ｃｙ３／６００チャネルでＣｙ３、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５３２色素をイメージングし、Ａｌｅｘａ４８８／５００チャネルでＡｌｅｘａ４８８色素をイメージングする）。より具体的には、例のセクションにおいて、Ａｌｅｘａ４８８／５００チャネルは、５２５／５０ｍの吸収フィルタを備え、Ｃｙ３／６００チャネルは、６００／５０ｍの吸収フィルタを備え、Ｃｙ５／７００チャネルは、７００／７５ｍの吸収フィルタを備える。
【0066】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブ、および、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブを備える。第１光標識は第１標的に関連し、第２光標識は第２標的に関連し、第１標的に関連する第１光標識の数と、第２標的に関連する第１光標識の数とは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００だけ異なる。そのような違いは、（使用される光標識の数に基づく）異なる強度の同一の色（または類似の色）が互いから区別され得ることを確実にすることを助け得る。いくつかの実施形態において、２つの異なる種類の標的を検出するための光標識の数の違いは、２００、５００、１０００、２０００、５０００または１００００より大きくない。
【0067】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブ、および、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブを備える。第１光標識は第１標的に関連し、第２光標識は第２標的に関連し、第１標的に関連する第１光標識の数と、第２標的に関連する第１光標識の数との比率は少なくとも２である。いくつかの実施形態において、第１標的の関連する第１光標識の数と、第２標的に関連する第１光標識の数との比率は、少なくとも２．５、３、４、５、５．６、７、８または１０である。
【0068】
いくつかの実施形態において、プローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはペプチドである。いくつかの実施形態において、光標識は蛍光色素、色原体色素、蛍光タンパク質、量子ドット、または他の種類のナノ粒子である。いくつかの実施形態において、第１標的および第２標的は更に、プローブに付着する第２光標識に関連するが、異なる数の第２光標識に関連する。
【0069】
いくつかの実施形態において、プローブはキメラポリマーである。いくつかの実施形態において、キメラポリマーは、天然ポリマー（核酸またはタンパク質など）および合成ポリマーから成る。いくつかの実施形態において、プローブは合成ポリマーである。いくつかの実施形態において、プローブは一本鎖オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、プローブはペプチドである。いくつかの実施形態において、プローブはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。いくつかの実施形態において、プローブは、ペプチドにコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、プローブは、デンドリマーなどの他の合成ポリマーに付着するオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、プローブは、デンドリマーなどの他の合成ポリマーに付着するペプチドである。いくつかの実施形態において、プローブは、多鎖複合体の一部であり得る。
【0070】
いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、他のリン酸－糖主鎖を有する核酸様構造（例えば、ＬＮＡ、ＸＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、一本鎖プローブは、非リン酸－糖部分を含む主鎖（例えば、ペプチド核酸およびモルフォリノ）から成る。いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴプローブは、ヘアピンループなどの二次構造を含み得る。
【0071】
いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、１つのプローブだけを含む。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、異なる配列の少なくとも２つのプローブを含む。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、異なる配列の少なくとも４または１２のプローブを含む。
【0072】
いくつかの実施形態において、標的に関連する複数の一次プローブは、少なくとも１つのプローブから成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数の一次プローブは、異なる標的結合配列の少なくとも２つのプローブから成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数の一次プローブは、異なる配列の少なくとも５、１０、２０、３０または５０のプローブから成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数の一次プローブは、異なる配列の１００以下のプローブから成る。
【0073】
いくつかの実施形態において、第１標的および第２標的は更に、プローブに付着する第２光標識に関連するが、同一の数の第２光標識に関連する。いくつかの実施形態において、第１標的および第２標的は更に、プローブに付着する第２光標識に関連するが、異なる数の第２光標識に関連する。いくつかの実施形態において、第１標的は、プローブに付着する第３光標識に関連し、第２標的は、第３光標識に関連しない。
【0074】
いくつかの実施形態において、第１の複数のプローブの各々は単一の光標識に付着する。いくつかの実施形態において、第１の複数のプローブの少なくとも２つは、２つの異なる光標識に付着する。いくつかの実施形態において、第１の複数のプローブの少なくとも２つは、２より多くの異なる光標識に付着する。
【0075】
いくつかの実施形態において、第１の複数のプローブの各プローブは、２以上の異なる光標識に、または、２以上の異なる数の同一の光標識に付着する。いくつかの実施形態において、第１の複数のプローブの各プローブは、同一の色に関連する。
【0076】
いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、一次プローブだけから成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、２階層のプローブ、すなわち一次プローブおよびイメージングプローブ（または、二次プローブと名付けられる）から成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、２より多くの階層のプローブから成る。いくつかの実施形態において、標的に関連する複数のプローブは、４階層のプローブ、すなわち、一次プローブ、一次アンプリファイア（または一次増幅プローブと名付けられる）、二次アンプリファイア（または二次増幅プローブと名付けられる）およびイメージングプローブから成る。
【0077】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、各標的は少なくとも２つの光標識に関連し、第１光標識は第１標的に関連し、第２光標識は第２標的に関連し、第１光標識および第２光標識は、第１色チャネルにおいて重複するスペクトラムを有し、第３光標識は、第１標的および第２標的の両方に関連し、第２色チャネルによって検出され、第１標的および第２標的は励起時に２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、第４光標識は更に、第１標的および第２標的の両方に関連し、第１標的および第２標的は励起時に３の色チャネルとは異なる比率の信号強度に関連する。
【0078】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞、または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、各標的は少なくとも２つの光標識に関連し、第１光標識および第２光標識は第１標的に関連し、第３光標識および第４光標識は第２標的に関連し、第１光標識および第３光標識は第１色チャネルにおいて重複するスペクトラムを有し、第２光標識および第４光標識は、第２色チャネルにおいて重複するスペクトラムを有し、第１標的および第２標的は励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、第４光標識は更に、第１標的および第２標的の両方に関連し、第１標的および第２標的は励起時に３の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、第５光標識は更に、第１標的および第２標的の両方に関連し、第１標的および第２標的は励起時に３の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。
【0079】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、各標的は、１種類の光標識だけに関連し、第１光標識は第１標的に関連し、第２光標識は第２標的に関連し、第１光標識および第２光標識は第１色チャネルおよび第２第２色チャネルにおける重複するスペクトラムを有し、第１標的および第２標的は励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、第３光標識は更に、同一サンプルにおける第３標的に関連し、第３光標識は、第１色チャネルおよび第２色チャネルの同一の組み合わせにおける第１光標識および第２光標識との重複するスペクトラムを有し、第１標的、第２標的、第３標的は、励起時に、これら２の色チャネルからの３の異なる比率の信号強度に関連する。
【0080】
いくつかの実施形態において、複数のイメージングプローブの各プローブは、１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満だけ離間したピーク発光波長を有する２つの標識など、部分的または完全に重複する放出スペクトラムの２つの異なる光標識に付着する。いくつかの実施形態において、近い発光波長を有する２または２より多くの光標識の蛍光は、イメージングのために同一の色チャネルを通過する。いくつかの実施形態において、重複する放出スペクトラムを有する２または２より多くの光標識の蛍光は、イメージングのために、少なくとも２の色チャネルを連続的に、または同時に通過する。
【0081】
いくつかの実施形態において、第１の複数のイメージングプローブの各プローブは、第１光標識だけに付着し、第２の複数のイメージングプローブの各プローブは第２光標識だけに付着する。ここで、第１光標識および第２光標識は、部分的または完全に重複する励起または発光スペクトルを有する（１００ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満だけ離間したピーク発光波長を有する２つの標識など）。光標識の各種類は、少なくとも２の色チャネルによって検出され、強度比率を形成する。異なる光標識は、色チャネルの同一の組み合わせによって検出され、異なる強度比率を生成する。
１．標識方式１および標識方式２
１．標識方式１および標識方式２
【0082】
色チャネルにおける標的の標識方式１および方式２の強度レベルは両方とも、その色チャネルにおける標的に関連する色素の総数によって決定される。異なる色素は、異なる色チャネルと照合される。しかしながら、標識方式１において、標的に付着する各色素の数は、この標的上のこの色素に関連する標的結合プローブ（すなわち一次プローブ）の数に比例する。したがって、各色チャネルおよび選択された色素について、対応する色素に関連する標的結合プローブ（または一次プローブ）の数は強度レベルを定義するが、一次プローブに関連する色素の数は、強度レベルを定義しない。図２において、パネルａは、標識方式１を実装するもっとも単純な手段である直接標識を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、任意の他のハイブリダイゼーションに基づく仲介のプローブイメージングプローブ無しで直接付着する。パネルａにおいて、各標的は、各々が光標識に付着する複数のプローブに結合する。標識はレポータ標識と称される。色素が使用される場合、色素は「レポータ」色素と称される。各プローブは１つのレポータ標識だけに付着する。代替的に、各タイプの色素について、プローブあたりの色素の数が同一であり続ける限り、各プローブは、複数の同一タイプの色素とコンジュゲートし得る。図２のａにおける上から下への５つの標的から、Ｃｙ３色素に関連するプローブの数と、Ｃｙ５色素に関連するプローブの数との間の強度比率コードはそれぞれ、２：０、０：２、１：１、１：２および２：１である。
【0083】
図２のｂは、標識方式１を実装するための間接的ラベリング手法を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に、一次プローブがイメージングプローブに結合する。
【0084】
図２のｃは、標識方式１を実装するための分岐ＤＮＡ増幅手法と共に間接標識を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に、一次プローブが２階層のシグナル増幅プローブ（第１および二次増幅プローブ）に結合し、最後に二次増幅プローブがイメージングプローブに結合する。必要な場合、より多くの階層の増幅プローブが使用され得る。
【0085】
標識方式２は、異なる方式でこれら同一の比率を実現し得る。標識方式１と対照的に、強度レベルは、各色チャネルに使用される色素の数だけに比例し、標的あたりの標的結合プローブまたは一次プローブの数に関しない。異なる一次プローブは、同一の数および種類の色素に関連する。図３のパネルａは、標識方式２を実装するためのもっとも単純な手段である、任意の仲介プローブ無しの直接標識を示す。各標的は、同一の標的上の異なるプローブについて、同一のセットの光標識を有する多くのプローブに結合する。様々な強度レベルおよび比率コードが、各プローブ上の光標識の数および種類を変化させることによって実現される。例えば、第１標的上で、各プローブは２つのＣｙ３にコンジュゲートされるが、Ｃｙ５にコンジュゲートされず、２：０の強度コードに対応する。第５標的上で、各プローブは２つのＣｙ３および１つのＣｙ５にコンジュゲートされ、２：１の強度コードに対応する。
【0086】
図３のｂは、標識方式２を実装するための間接的ラベリング手法を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に、一次プローブがイメージングプローブに結合する。
【0087】
図３のｃは、標識方式２を実装する分岐ＤＮＡ増幅手法と共に間接標識を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に、一次プローブが２階層のシグナル増幅プローブ（第１および二次増幅プローブ）に結合し、最後に二次増幅プローブがイメージングプローブに結合する。必要な場合、より多くの階層の増幅プローブが使用され得る。
【0088】
光標識の相対強度および比率は、要件を満たすように容易に調節できる。例えば、１：２（赤色：緑色）の強度比率を実現するべく、１０の赤色色素を２０の緑色色素と混合し得る。異なる比率を実現するべく、１０の赤色色素を１５の緑色色素と混合し得る。しかしながら、下で更に記載されるように、光標識によって生じる強度の変動、異なる標的および位置間のプローブの結合の変動、ならびに、他の実験条件に起因する不正確な検出を低減または防止するために、色／強度ギャップは、異なる色／強度コード間で意図的に設計され得る。
【0089】
図２および図３に示される実装方式は異なる長所を有し得る。例えば、図２に示される方式は、特に図２のａおよび図２のｂに示される直接的および間接的ラベリング手法についてのプローブ設計または合成に関してより単純である。しかしながら、一次プローブが異なる親和性または効率性で標的に結合する場合、結合における均一性の欠如の結果として、設計と異なる色または強度を有する標的の標識がもたらされ得る。そのような違いは、１つの光標識を有するプローブだけに結合する、図２のａにおける第１標的についてはあまり重大でないことがあり得る。しかしながら、設計によって１：１の比率を有するべきである第３標的に対して、より著しい影響を有し得る。Ｃｙ５標識プローブの１つが標的への結合に失敗する場合、結果の比率は１：１ではなく２：１となる。図３に示される標識方式２は、そのような問題を回避し得る。なぜなら、標的に結合する各プローブは色素の同一の組み合わせを有するからである。したがって、プローブの一部が標的への結合に失敗した場合でも、結果の標識に対する影響は著しくないことがあり得る。少なくとも色彩比は一定である。例えば、図３のａ最後のサンプルにおいて、１つのプローブが標的への結合に失敗した場合、比率はなお２：１である。
【0090】
図２に示される標識方式１は、多くの一次プローブが検出に使用され得、異なる結合領域間の結合の変動が標的に対する多くのプローブの強度の変動に影響しない、長いＤＮＡまたはＲＮＡ配列のＦＩＳＨにより好適であり得ると想定される。他方、図３に示される標識方式２は、限られた数の一次プローブだけが検出に使用され得、異なる結合領域間の結合の変動が標的に対するプローブセットの強度の変動に著しく影響し得る、短いＤＮＡまたはＲＮＡ配列により好適であり得る。
【0091】
標識方式１および２は、サンプルにおける異なる標的を標識するために共に使用され得る。例えば、異なる長さの遺伝子転写物から成るＲＮＡパネルについては、より長い転写産物は、図２に示される標識コーディング方式で標識され得、より短い転写産物は、図３に示される標識コーディング方式で標識され得る。
２．標識方式３
２．標識方式３
【0092】
高容量検出を実現する更に別の手段は、重複する色スペクトルを有する異なる光標識を採用し、その結果、複数の強度レベルは同一の色チャネルを用いて取得され得る。これは図４、パネルａ～ｃに示され、「標識方式３」と称される。この方式において、より暗い光標識（例えば、黄色の蛍光色を有するＣｙ３）は、類似の色または重複するスペクトルを有する、より明るい標識（例えば、より一層明るい黄色蛍光色を有するＡｌｅｘａ５４６）と共に使用される。典型的には、それらのピーク発光波長は１００ｎｍ未満だけ離間する。代替的には、それらは５０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、１０ｎｍ未満または５ｎｍ未満だけ離間する。
【0093】
図４のａは、標識方式３を実装する直接標識手法を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的が、任意の他の仲介するハイブリダイゼーションに基づくプローブ無しで直接的にイメージングプローブに付着する。
【0094】
図４のｂは、標識方式３を実装するための間接的ラベリング手法を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に一次プローブがイメージングプローブに結合する。
【0095】
図４のｃは、標識方式３を実装するための分岐ＤＮＡ増幅手法と共に間接標識を示す。基本的に、核酸または他の種類の標的は、最初に一次プローブに付着し、次に、一次プローブが２階層のシグナル増幅プローブ（第１および二次増幅プローブ）に結合し、最後に二次増幅プローブがイメージングプローブに結合する。必要な場合、より多くの階層の増幅プローブを使用できる。
【0096】
Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６の色は、発光スペクトルに関して近い、または重複する。同一の色チャネルを用いて単独で使用され記録される場合、それらは区別が難しいことがあり得る。しかしながら、別の色チャネルからの１～２の他の光標識と組み合わせて使用されるとき、それらの違いは増強され、区別可能になる。これらの色素を正しい色チャネルの組み合わせと（例えば、１つのチャネルを６７０～７２０ｎｍの吸収フィルタに、他のチャネルを５８０～６２０ｎｍの吸収フィルタに）照合することによって、２つのチャネル間の異なる強度比率を実現できる（図１のｂおよび図４）。例えば、図４のａにおいて、第４標的上では明るいＣｙ５が暗いＣｙ３と組み合わされ、第５標的上では暗いＣｙ５．５が明るいＡｌｅｘａ５４６と組み合わされる。１の色チャネルを使用してＣｙ５およびＣｙ５．５を検出し、他の色チャネルを使用してＣｙ３およびＡｌｅｘａ５４６を検出することにより、これら２つの標識された標的は、２の色チャネル間の相対強度比率によって区別できる。典型的には、３～４の色素を使用して色素の２つのペアを形成し、Ｃｙ５‐Ｃｙ３およびＣｙ５‐Ａｌｅｘａ５４６、またはＣｙ５‐Ｃｙ３およびＣｙ５．５‐Ｃｙ３など、２つの異なる標的を標識する。異なる色素ペアは、異なる強度比率を生成するために同一の２の色チャネルによってイメージングされ得る。
【0097】
したがって、いくつかの実施形態において、検査のために調製されるサンプルが提供され、当該サンプルは、生体サンプルにおける第１標的生体分子に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的生体分子に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、プローブの各々は１または複数の光標識に付着し、（ａ）第１標的は第１光標識に関連し、第２標的は第２光標識に関連し、（ｂ）光標識のこれら２つの異なるタイプは同一または重複する色スペクトラムを有するが、異なる強度を有する。いくつかの実施形態において、光標識のこれら２つの異なるタイプは、少なくとも２倍、２．５、３、４、４．３または５倍異なる、色チャネルにおける異なる強度を有し得る。いくつかの実施形態において、光標識の２つの異なるタイプの異なる強度は、最大１０倍、８倍、７．５倍、６．３倍、５倍、または４倍だけ異なる。
【0098】
いくつかの実施形態において、第１標的および第２標的の両方は更に第３光標識に関連する。第１標的に関連する第１光標識および第３光標識を検出し、第１標的の第１強度比率が生成される。第２標的に関連する第２光標識および第３光標識を検出し、第２標的の第２強度比率が生成される。第１強度比率および第２強度比率を比較して、第１標的および第２標的が区別される。
【0099】
また、第１プローブおよび第２プローブを備えるプローブセットが提供され、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、同一または重複する色スペクトラムを有するが異なる強度を有する第１光標識および第２光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブの各々は更に、第３光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブは光学的に区別可能である。これらのプローブは、異なる標的分子を標的にするのに有用な異なる結合特異性を有し得る。
【0100】
異なるプローブを検出するとき、いくつかの実施形態において、光学的に区別可能なプローブは、強度の違いに起因して、少なくとも２の色チャネルにおける強度比率を比較することによって検出され得る。
【0101】
更に別の実施形態において、検査のために調製されるサンプルが提供され、当該サンプルは、生体サンプルにおける第１標的生体分子に直接的または間接的に結合された第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的生体分子に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、プローブの各々は、１または複数の光標識に付着し、（ａ）第１標的は第１光標識に関連し、第２標的は第２光標識に関連し、（ｂ）これらの２つの異なるタイプの光標識は同一または重複する色スペクトラムを有するが、異なる強度を有し、（ｃ）第１標的は更に第３光標識に関連し、第２標的は更に第４光標識に関連し、（ｄ）第３光標識および第４光標識は同一または重複する色スペクトラムを有するが異なる強度を有する。第１標的に関連する第１光標識および第３光標識を検出し、第１標的の第１強度比率が生成される。第２標的に関連する第２光標識および第４光標識を検出し、第２標的の第２強度比率が生成される。第１強度比率および第２強度比率を比較して、第１標的および第２標的が区別される。
【0102】
第１プローブおよび第２プローブを備えるプローブセットも提供され、第１プローブおよび第２プローブはまた、同一または重複する色スペクトラムを有するが異なる強度を有する第１光標識および第２光標識にそれぞれ付着し、第１プローブおよび第２プローブはそれぞれ、同一または重複する色スペクトラムを有するが異なる強度を有する第３光標識および第４光標識に付着し、第１プローブおよび第２プローブは光学的に区別可能である。これらのプローブは、異なる標的分子を標的にするのに有用な異なる結合特異性を有し得る。
３．間接標識およびシグナル増幅
３．間接標識およびシグナル増幅
【0103】
標識方式１－３を使用するとき、いくつかの実施形態において、図２～図４のパネルａに示されるように、標的は、光標識に付着されるプローブに直接結合する。代替的な設計において、図２～図４のパネルｂに示されるように、光標識は仲介プローブを用いて間接的に標的に結合し得る。図２のｂ、図３のｂおよび図４のｂにおいて、光標識を有しない一次プローブ（仲介プローブ）は最初に標的に結合し、光標識を有する二次プローブは一次プローブに結合し、複数の強度レベルおよび強度コードを実現する。いくつかの実施形態において、プローブが標的に既に結合した後に、光標識がプローブに付着する。
【0104】
いくつかの実施形態において、図３のパネルｂに示されるように、一次プローブはハイブリダイゼーション配列およびリードアウト配列から成る。ハイブリダイゼーション配列はＤＮＡおよびＲＮＡ上の標的配列と相補的である。色素標識された二次プローブに結合するためにリードアウト配列が使用される。１つの一次プローブは、最大２のリードアウトプローブに（一方が５'末端、他方が３'末端に）付着し得る。異なる数の色素および複数の異なる種類の色素を標識することにより、異なる強度コードが実現され得る。
【0105】
いくつかの実施形態において、架橋化学を通じて色素がオリゴプローブに付着する。ジスルフィド架橋、アジ化物、またはアルカリ基などの架橋がオリゴプローブに連結され、可逆的または非可逆的いずれかの部位特異的色素－オリゴのコンジュゲーションを容易にする。
【0106】
いくつかの実施形態において、シグナル増幅技術を通じて、標的分子に関連する一次プローブの後に仲介プローブが追加される。いくつかの実施形態において、１より多くの階層の仲介プローブが、一次プローブとイメージングプローブとの結合の間に追加される。いくつかの実施形態において、一次アンプリファイアおよび二次アンプリファイアが、一次プローブとイメージングプローブとの結合の間に追加される。
【0107】
いくつかの実施形態において、図２～図４のパネルｃに示されるように、分岐ＤＮＡ増幅技術が単一分子強度コーディングに使用される。パネルｃにおいて、１つの標的をより多くの光標識で標識するために、一次および二次プローブ（または一次アンプリファイアと名付けられる）だけでなく、三次プローブ（または二次アンプリファイアと名付けられる）が使用され、その結果、より高い信号強度が実現され得る。ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）、交換反応によるシグナル増幅（ＳＡＢＥＲ）など他のシグナル増幅技術も使用され得る。
【0108】
いくつかの実施形態において、信号強度は、平衡化または非平衡化分岐ＤＮＡ増幅によって増幅される。各一次プローブ（すなわち直接標的結合プローブ）は５'および３'末端の両方でアンプリファイアに関連し得る。平衡化分岐ＤＮＡ増幅については、図３のｃの第３標的（２：２において標識される）について示されるように、各一次プローブは、一次プローブの各末端において同一の数の色素に関連する。非平衡化分岐ＤＮＡ増幅については、図３のｃにおける第４標的および第５標的（１：２および２：１において標識される）について示されるように、各一次プローブは、一次プローブの５'および３'末端における色素の異なる数に関連する。
【0109】
いくつかの実施形態において、一次プローブは、５'および３'末端の両方におけるアンプリファイアに関連し、一次プローブは、５'および３'末端における異なる種類の色素に関連する。いくつかの実施形態において、一次プローブは、５'末端および３'末端の両方におけるアンプリファイアに関連し、一次プローブは、５'末端および３'末端における同一の種類の色素に関連する。
【0110】
いくつかの実施形態において、一次プローブとイメージングプローブとの結合の間に仲介プローブを追加するために酵素増幅方法が使用される。酵素増幅の一例はローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）である。図５において、標的固有識別プローブが最初に標的に付着し、次に、標的固有識別子を増幅するためにローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）によるシグナル増幅段階が追加され、最後に、異なる標的の識別情報を有する増幅プローブがイメージングプローブに関連する。これは、核酸および非核酸の両方の標識に使用され得る。
４．標識方式１～３の代替的な標識方式
４．標識方式１～３の代替的な標識方式
【0111】
いくつかの実施形態において、強度コーディングのためのレポータ色素を使用する以外に、参照色素が標識のために追加される。この手法は、明細書に記載され開示される標識方式のいずれかに適用され得る。参照色素は、強度コードを形成するために使用されない。むしろ、非特異的結合を特異的結合から区別するために使用される。この参照色素は、非特異的結合シグナルのエラー訂正のための強度コーディングについての色チャネルとは別個の色チャネルによってイメージングされる。強度コーディングされたレポータ色素および参照色素の共局在解析を行うことにより、参照色素についてのチャネルにおいてシグナルを有しない非特異的結合のＦＩＳＨドットが除去され得る。いくつかの実施形態において、各標的を標識するために、追加の複数の一次プローブに関連する参照色素が追加される（図６）。
【0112】
いくつかの実施形態において、標識方式２および標識方式３を使用するとき、区別された標識手法が使用される。換言すると、異なる光標識が、同一の標的についての一次プローブの異なるセットに関連する（図７）。
【0113】
いくつかの実施形態において、標的に対する異なる光標識に関連する異なる一次プローブが、交互の順序で標的に結合する。この手法により、割り当てられた強度コードの強度の変動に対する異なる標的領域間の様々な一次プローブの結合親和性の変動の影響を最小化できる。標識方式２を例にとると、図８のｂに示されるように、１：２の強度コードを有する第１ＲＮＡ標的（２の色チャネルがＣｙ３およびＣｙ５のオーダに従う）について、２つごとの一次プローブが、ＲＮＡ標的に沿ってグループを形成する。各グループは、１つのＣｙ３色素に関連する１つの一次プローブ、および、２つのＣｙ５色素に関連する１つの一次プローブを含む。図８のｂにおける２：１の強度コードを有する第２ＲＮＡ標的については、２つごとの一次プローブも、ＲＮＡ標的に沿ってグループを形成する。各グループは、２つのＣｙ３色素に関連する１つの一次プローブ、１つのＣｙ５色素に関連する１つの一次プローブを含む。
【0114】
いくつかの実施形態において、図９に示される代替的標識方式３が使用される。この代替的標識方式３において、標的を標識するために１つの光標識だけが使用される（図９）。異なる標的が、色チャネル（少なくとも２つ）の同一の組み合わせにおける重複する励起または発光スペクトルを有する異なる光標識で標識される。例えば、Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００がこの方式に使用され得る（図１０、例１０）。各光標識は、色チャネル（少なくとも２の色チャネル）の同一の組み合わせによってイメージングされ、異なる光標識は、これらのチャネルにおける標識の強度を比較することによって異なる強度比率を生成する。典型的には、標識のために、一本鎖ＤＮＡオリゴまたはＰＮＡなどのオリゴヌクレオチドまたはペプチドプローブに光標識が付着する。
【0115】
いくつかの実施形態において、代替的標識方式３を実現するために間接標識が使用される。いくつかの実施形態において、代替的標識方式３を実現するために間接標識およびシグナル増幅が組み合わされる。いくつかの実施形態において、代替的標識方式３を実現するために間接標識および分岐ＤＮＡシグナル増幅が組み合わされる。いくつかの実施形態において、代替的標識方式３を実現するべく、１つの一次プローブおよび１つのイメージングプローブが、標的を検出するために使用される。いくつかの実施形態において、少なくとも２または４の一次プローブが、第１標的および第１光標識に関連する。いくつかの実施形態において、少なくとも１２の一次プローブが、第１標的および第１光標識に関連する。いくつかの実施形態において、少なくとも２４の一次プローブが第１標的に関連する。
【0116】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの標的を検出するために、代替的標識方式３は、標識方式２または方式１と組み合わされる。例えば、標的ＡおよびＢを検出するべく、標的Ａの各コピーは１つの色素Ａによって標識され、標的Ｂの各コピーは２０の色素Ｂによって標識される。これら２つの色素は２の色チャネル、および、これら２つの標的についての生成された２つの異なる強度比率によって検出される。標的Ａは、２：１の強度コードによってエンコードされ、標的Ｂは、１：２の強度コードによってエンコードされる。
【0117】
いくつかの実施形態において、検査のための生体サンプルは、生体サンプルにおける第１標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子、細胞または組織に直接的または間接的に結合される第２の複数のプローブとを備え、各標的は、１種類の光標識だけに関連し、第１光標識は第１標的に関連し、第２光標識は第２標的に関連し、第１光標識および第２光標識は第１色チャネルおよび第２第２色チャネルにおける重複するスペクトラムを有し、第１標的および第２標的は励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、同一のサンプルにおいて、第１光標識および第２光標識は、第３色チャネルにおける重複するスペクトラムを有し、第１標的および第２標的は励起時に、３の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する。いくつかの実施形態において、同一のサンプルにおいて、第１標的に関連する第１光標識の数と、第２標的に関連する第２光標識の数との比率は少なくとも２である。いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識の数と、第２標的に関連する第２光標識の数との比率は、少なくとも４、４．５、６、７．２、８または１０である。
５．スパースコーディング
５．スパースコーディング
【0118】
いくつかの実施形態において、重複率（種割り当てのエラー率）を低減し、強度コーディングのスパース性を制御するために、可能なコードのエラーロバストなサブセットが実際の適用に選択されるべきである。例えば、Ｎ＝２、Ｍ＝２の場合、２：０、０：２、１：１、２：２のコードを除去することにより、２の色チャネルだけを有する４の異なる強度の組み合わせ（１：０、０：１、１：２、２：１）をなお残したまま、強度の重複が５％未満まで低減し得る（例１を参照）。
【0119】
いくつかの実施形態において、異なる強度の光標識が異なるプローブによって採用されるとき、近隣の強度レベルの差が閾値より上であることを確実にすることは、強度レベルが低く、または高くシフトするときに不正確な検出を低減する上で有用であり得る。不正確な検出は、限定的な検出能力、色収差、異なるプローブ結合効率、光標識の強度の変動、または、異なるプローブがそれらの標的に対する異なるアクセス性を有することの結果であり得るが、これらに限定されない。例えば、５つＣｙ３色素および１のＣｙ５色素に結合する標的ＤＮＡは、１のＣｙ３色素および１のＣｙ５色素に結合する別の標的ＤＮＡから容易に区別可能であり得るが、４のＣｙ３色素および１のＣｙ５色素に結合する更に別の標的ＤＮＡから容易に区別可能でないことがあり得る。
【0120】
いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識と、第２標的に関連する第１光標識との比率は、少なくとも２、２．５、３、３．４、４または５倍異なる。いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識と、第２標的に関連する第１光標識との強度比率は、少なくとも２、２．５、３、３．４、４または５倍異なる。
【0121】
いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識と、第２標的に関連する第１光標識との比率は、１００倍以下だけ異なる。いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識と、第２標的に関連する第１光標識との比率は、５０倍以下だけ異なる。いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識と、第２標的に関連する第１光標識との比率は、１０倍以下だけ異なる。
【0122】
いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識の数、および、第２標的に関連する第１光標識の数は、少なくとも２だけ異なる。換言すると、２つの異なる標的分子は、両方とも同一の光標識、ならびに、同一の数およびタイプの他の光標識に結合するとき、１つの光標識だけ異なることはない。そのような構成の１つの特定の例として、奇数の数の特定の光標識のだけが生体サンプルにおいて使用される。別の例において、偶数の数の光標識だけが使用される。
【0123】
いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識の数、および、第２標的に関連する第１光標識の数は、少なくとも１０、２０、４０、１００、５００または１０００だけ異なるが、これらに限定されない。
【0124】
いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識の数、および、第２標的に関連する第１光標識の数は、１０００、９８０、９００、８００、７５０、６２０、５００、４００、３００、２００、１２０、または、１０００未満の任意の他の整数未満だけ異なる。いくつかの実施形態において、第１標的に関連する第１光標識の数、および、第２標的に関連する第１光標識の数は、１００、９５、８０、７０、６５、５０、または、１００未満の任意の他の整数だけ異なる。
【0125】
いくつかの実施形態において、標識方式３を使用するとき、１００ｎｍ未満離間したピーク発光波長を有する２つの光標識は、２つの異なる標的に関連し、同一の色チャネルで検出される。しかしながら、スペクトルの重複を低減し、コーディングのスパース性を増加させるべく、第１光標識のピーク発光波長は、第２光標識のピーク発光波長から５ｎｍ以上離間する。代替的に、それらは、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、１８ｎｍ以上または２０ｎｍ以上離間する。
【0126】
いくつかの実施形態において、強度コーディング方式に使用される任意の２つの強度レベル（０を除く）の間の強度差（強度分布ヒストグラムのピーク、平均、または中間強度によって定義される）は、少なくとも２、２．５、３、３．４、４、４．６、または５倍だけ離間する。例えば、Ｍ＝３のコーディング方式では、レベル２の強度は、レベル１の２倍である。レベル３の強度は、レベル２の２倍、レベル１の４倍である。いくつかの実施形態において、強度コーディング方式に使用される任意の２つの強度レベル（０を除く）の間の強度差は、少なくとも３倍だけ離間する。例えば、Ｍ＝３のコーディング方式では、レベル２の強度は、レベル１の３倍である。レベル３の強度は、レベル２の３倍、レベル１の９倍である。２つの強度レベル間の差は、特定の倍に限定されない。倍の差はまた、整数に限定されず、３．５倍、５．２倍または１０．６倍などの小数であり得る。
６．複数の標識方式の組み合わせ
６．複数の標識方式の組み合わせ
【0127】
いくつかの実施形態において、隣接する強度コードの強度ギャップおよび検出精度を増加させるために、複数の標識方式が組み合わされる。いくつかの実施形態において、同時に標的パネルにおける異なる標的を標識するために、複数の標識方式が使用される。例えば、パネルにおける第１標的を検出するために標識方式１を使用し、同一パネルにおける第２標的を検出するために標識方式３を使用する。いくつかの実施形態において、同一の標的を標識するために複数の標識方式が組み合わされる。例えば、標識方式２および方式３を組み合わせてパネルにおける第１標的を検出し、標識方式１および方式３を組み合わせて同一パネルにおける第２標的を検出する。
【0128】
いくつかの実施形態において、２つの強度コードの分離をより良くするために標識方式２および方式３が組み合わされる。例えば、Ｃｙ５‐Ｃｙ３（一次プローブあたり１のＣｙ５色素および１のＣｙ３色素）およびＣｙ５．５‐Ａｌｅｘａ５４６（一次プローブあたり１のＣｙ５．５色素および１のＡｌｅｘａ５４６色素）の色素ペアだけを使用して２の標的を標識するのではなく、２Ｃｙ５‐Ｃｙ３（一次プローブあたり２のＣｙ５色素および１のＣｙ３色素）を使用して第１標的を標識し得、Ｃｙ５．５‐２Ａｌｅｘａ５４６（一次プローブあたり１のＣｙ５．５色素、および、２のＡｌｅｘａ５４６色素）を使用して第２標的を標識し得る。
【0129】
いくつかの実施形態において、少なくとも２つの標的を検出するために、区別された標識、および、標識方式３が組み合わされる。例えば、重複するスペクトラム（Ｃｙ５、Ｃｙ５．５は色チャネル１において重複する放出スペクトラムを有し、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５４６は、色チャネル２において重複する放出スペクトラムを有する）を有する４の色素を使用して、２つの標的ＡおよびＢを検出する。標的Ａを検出するためにＣｙ５およびＣｙ３が共に使用されるが、これら２つの色素は、一次プローブの２つの異なるセットに関連する。標的Ｂを検出するためにＣｙ３およびＡｌｅｘａ５４６が使用されるが、これら２つの色素は、一次プローブの２つの異なるセットに関連する。
【0130】
いくつかの実施形態において、天然の核酸との間の場合と比較して、天然の核酸に対するより高い結合親和性を有する、ＬＮＡ、ＰＮＡおよびゼノ核酸（ＸＮＡ）など、非天然の核酸および非核酸ベースの分子が、一次プローブ、増幅プローブ、イメージングプローブなどの異なる種類のプローブに使用され得る。そのような使用により、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的のゲノム分解能が増加し得る。換言すると、同一の標的に対して天然のオリゴヌクレオチドを使用する場合と比べて、プローブあたりより短い配列を有するより多くのプローブが、この手法を用いて設計され得る。この方策は上のすべての標識方式に当てはまる。
【0131】
いくつかの実施形態において、ＰＮＡおよび天然ヌクレオチドのハイブリッドなど、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド配列のハイブリッドがプローブとして使用される。
７．標識方式４
７．標識方式４
【0132】
単一分子レベルにおける強度レベルおよび分布を調節するための更に別の手段は、蛍光増感、または、蛍光消光を用いる。これは標識方式４と名付けられる。この方式は、強度の変動を調節する、または、新しい強度レベルを形成するために使用され得る。蛍光増感または消光は、レポータ色素を強度増強分子または消光化学基とコンジュゲートすることによって生じ得る。図１１に示されるように、ＢＨＱ（ブラックホールクエンチャー色素）のような消光化学基に色素を関連させ、別の色素に色素を関連させてＦＲＥＴ色素ペアを形成する（Ｃｙ３およびＣｙ５を共に連結するなど）、標的核酸配列に沿った隣接する色素の距離を短縮するなど、蛍光消光を誘導するために複数の手段が利用され得る。
【0133】
いくつかの実施形態において、標的に関連する少なくとも１つの光標識は、より多くの同一の光標識に付着する。いくつかの実施形態において、標的に関連する少なくとも１つの光標識は、ＦＲＥＴによって光標識を消光し得る異なる光標識に付着する。いくつかの実施形態において、標的に関連する少なくとも１つの光標識は、ＢＨＱのようなクエンチャー化学群に付着する。いくつかの実施形態において、標的に関連する同一の光標識の少なくとも２つは、１０以下のヌクレオチドだけ離間する。
【0134】
オリゴプローブの標識密度を増加させることにより、光学消光を誘導し得る。例えば、１００ｎｔのオリゴを５未満の光標識に関連させることは、消光を誘導しないことがあり得るが、光標識を５つより多くの光標識に増加させることは、蛍光色素分子消光を誘導する。いくつかの実施形態において、オリゴプローブは複数の光標識に関連し、プローブ配列は１００ｎｔごとに５より多くの光標識に関連する。いくつかの実施形態において、オリゴプローブは複数の光標識に関連し、その結果、１００ｎｔごとのプローブ配列は、６、８、１０または１５より多くの光標識に関連する。いくつかの実施形態において、オリゴプローブは複数の光標識に関連し、その結果、１００ｎｔごとのプローブ配列は、５０、６０、８０、または１００より多くの光標識に関連する。
【0135】
いくつかの実施形態において、標的を標識するために、標識方式４は他の標識方式と組み合わされる。いくつかの実施形態において、標的を検出するために、標識方式４および２が組み合わされる。いくつかの実施形態において、標的を検出するために、標識方式２、３および４が組み合わされる。
８．非核酸ベース標的の高容量検出
８．非核酸ベース標的の高容量検出
【0136】
高容量ｉｎ‐ｓｉｔｕ生体分子検出：ｉｎ‐ｓｉｔｕ ＲＮＡおよびＤＮＡ検出のために開発された強度コーディング技術は、タンパク質、脂質、糖分子、他の生体分子ｉｎ‐ｓｉｔｕ検出、エピゲノム改変、および、エピトランスクリプトーム改変などに拡張され得る。一般的な標識シナリオでは、最初に非核酸標的を標的特異的オリゴヌクレオチドまたはペプチド配列（ＰＮＡなど）に付着して強度バーコードを標的に割り当て、次に、ハイブリダイゼーションによって、強度コーディングされた検出プローブを標的特異的オリゴまたはペプチドに関連させる。標的特異的オリゴヌクレオチドまたはペプチドは、様々な種類のリンカまたは仲介分子を通じて標的分子に付着し得る。
【0137】
いくつかの実施形態において、異なる標的が、異なる種類の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、異なる標的が、異なる数および種類の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、少なくとも第１標的が、２または２より多くの一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、第１標的は２または２より多くの同一の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、第１標的は２または２より多くの異なる一次プローブに関連する。
９．高容量ｉｎ‐ｓｉｔｕタンパク質検出
９．高容量ｉｎ‐ｓｉｔｕタンパク質検出
【0138】
タンパク質標的を標識するための標識方式は、図１２に示され、下に記載される。一実施形態において、タンパク質は一次抗体によって認識される。一次抗体は、標的特異的一次オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）に付着する。異なる種類のタンパク質が、異なる標的の特異的一次オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸に関連する。次に、異なる強度比率コードを実現するべく、異なる標的特異的一次プローブを認識するために光プローブが追加され得る。個別のタンパク質を検出するために、ローリングサイクル増幅、分岐ＤＮＡ増幅などのシグナル増幅技術が、オリゴおよび抗体結合化学の上に更に追加され得、その結果、より高い強度レベルおよび様々な強度比率コードが実現され得る。
【0139】
いくつかの実施形態において、部位特異的標識を容易にするために、タンパク質は、ビオチン、ＧＦＰ、ＨＡタグ、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグなどの小さい、または大きい分子に付着し得る。異なるタンパク質は、異なる抗体によって認識される異なるエピトープを有する。異なる抗体が異なる標的特異的一次プローブに付着する。異なる強度比率コードを実現するために、異なる一次プローブは、異なる光プローブによって検出される。
【0140】
いくつかの実施形態において、異なるタンパク質標的は、異なる種類の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、異なるタンパク質標的は異なる数の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、少なくとも第１タンパク質標的は２または２より多くの一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、第１タンパク質標的は、２または２より多くの同一の一次プローブに関連する。いくつかの実施形態において、第１タンパク質標的は、２または２より多くの異なる一次プローブに関連する。
１０．後成的修飾の高容量ｉｎ‐ｓｉｔｕ検出
１０．後成的修飾の高容量ｉｎ‐ｓｉｔｕ検出
【0141】
後成的修飾とは、ＤＮＡまたはＲＮＡメチル化、ヒストン修飾など、ヌクレオチド配列の変更を伴わない、ゲノムに対する機能関連の変更を指す。強度コーディングを行うために、これらの修正は最初に、後成的修飾を認識してそれに結合するオリゴ付着抗体または任意のオリゴ付着分子を用いて検出され得る。次に、これらのオリゴは、一次プローブとして機能し異なる強度でコーディングされたプローブと更にハイブリダイズし、様々な強度比率コードを実現し得る。典型的には、分岐ＤＮＡ増幅、またはローリングサイクル増幅などのシグナル増幅技術が、オリゴ標識抗体と組み合わされて、様々な強度レベルおよび強度比率コードを実現する。
１１．高容量細胞検出
１１．高容量細胞検出
【0142】
強度比率コーディングによる高容量検出は、限られた数の色および限定された種類の光標識を有する複数の細胞集団を検出、区別、ソートするために使用され得る。当該シナリオでは、ＲＮＡおよびタンパク質などの細胞タイプ特異的バイオマーカを通じて異なる細胞タイプを標識する（図１３のａ）。異なる細胞マーカは、異なる強度でコーディングされた光プローブに関連する。例えば、ここで開発された強度比率コーディングは、４のタンパク質、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９、汎サイトケラチンを共に検出するために使用され得る。これら４の各タンパク質は細胞マーカである。したがって、少なくとも４の細胞タイプが、これら４のタンパク質の強度バーコーディングによって区別され得る。
１２．高容量ｉｎ－ｖｉｔｒｏ分子または粒子検出
１２．高容量ｉｎ－ｖｉｔｒｏ分子または粒子検出
【0143】
強度比率コーディングによる高容量検出は、単一分子または単一粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出および区別するために使用され得る。例えば、図１３のｂに示されるように、個別のタンパク質がガラス基板上にランダムかつ疎に捕捉されて、異なる強度比率コードを有するオリゴプローブによって検出され得る。代替的に、図１３のｃに示されるように、異なる種類の分子が、基板上に捕捉され得、整列されたパターンで、互いに空間的に離間され得る。次に、異なる位置における異なるグループの分子が、強度コーディングされた光プローブによって検出され得る。
Ｄ．光学セットアップ
Ｄ．光学セットアップ
【0144】
光学セットアップ：強度コーディングされたサンプルイメージングの場合、少なくとも２つの種類の計器、すなわち顕微鏡およびフローサイトメトリーが使用され得る。顕微鏡イメージングの場合、生体サンプルは典型的には、ガラススカフォールド上に付着し、ＣＣＤまたはカメラを有する顕微鏡によってイメージングされる。顕微鏡を通じた強度イメージングの最高のパフォーマンスのために、最良のシグナル対バックグラウンド比およびシグナル対ノイズ比率を有する高品質画像を実現するために、スピニングディスク共焦点顕微鏡.などのレーザ励起蛍光顕微鏡、および、ＥＭＣＣＤまたはｓＣＭＯＳカメラなどの高感度カメラが必要である。フローサイトメトリーの場合、サンプルは、強度バーコードプローブで標識され、次に、ＰＭＴによって検出される。しかし、いくつかの他のサンプルの場合、それらは、プレートリーダなど他の種類の計器によって検出される。
Ｅ．画像解析：正規化およびエラー訂正
１．強度正規化
Ｅ．画像解析：正規化およびエラー訂正
１．強度正規化
【0145】
この段階は、ＦＩＳＨスポットなどの光学スポットに関するすべての色チャネルの強度値を個別の強度比率に変換するために使用され得る。ＲＮＡ ＦＩＳＨを例にとると、ＲＮＡエンコードに使用される強度コードに応じて、異なる色チャネル間の各色チャネルまたは相対強度比率の絶対強度値が、ＦＩＳＨスポットの強度比率を計算するために使用され得る。例えば、１：１および２：２の２つの色コーディング方式を使用して２つのＲＮＡ種を標識する場合、各ＦＩＳＨスポットの強度比率を計算するために絶対強度値が使用される必要がある（例１を参照）。しかしながら、全コードスペクトルからのコードの一部だけが、任意の２つの強度コード間の強度重複を最小化するために使用される場合、異なるチャネル（少なくとも２の色チャネル）間の相対強度だけを使用して、強度比率を計算し得る（例１を参照）。
２．参照強度コードマップを使用するコード割当
２．参照強度コードマップを使用するコード割当
【0146】
上に記載されたように、スパースコーディングの使用は、近隣の強度間の好適な空間を残すことを助け、それにより、重複するシグナルを低減しエラーを低減し得る。それにもかかわらず、いくつかの実施形態において、シグナル読み取り精度を更に確実にするためにエラー訂正が採用され得る。
【0147】
いくつかの実施形態において、エラー訂正は、各強度コードの強度の変動（または強度比率の変動）の正確な測定、および、その対応するプローブ設計方式を必要とする。各強度コードの強度の変動は、厳密なプローブ配列設計、光標識の設計、関心のある標的、使用されるサンプル、染色およびイメージング条件など、複数の要因に関するプローブ標識方式の強度の変動によって決定される。すべての強度コードの強度の変動の参照マップは、参照サンプルを用いて測定され得る。そのような参照強度コードマップに基づき、強度コードの強度分布の境界、およびその標識方式が決定され得る（例４を参照）。任意の２つの強度コードの重複比率も、適宜決定され得る。
【0148】
強度の変動、および、強度コードの重複割合を測定する単純なシミュレーションが例１に示される。
コード割当およびスポット除去
コード割当およびスポット除去
【0149】
図１のｃに示されるように、理想的には、光学画像からの各ＦＩＳＨスポットまたは強度スポットは、強度座標マップにおける、スポットの測定された強度（または強度比率）と、予め決定された強度コードの中央強度（または強度比率）との距離に基づいて、もっとも近い強度コードに割り当てられる。２つの近く強度コードへの距離が等しいスポットは破棄される。
【0150】
強度距離を計算する式は以下の通りである。
【数1】
【0151】
式においてＤは、予め決定された強度コードの中央強度に対する、実験サンプルからの強度スポットの測定された強度の距離を表す。（ｘ１，ｙ１，ｚ１，...）は、特定の色チャネルにおける強度スポットの測定された強度を表す。（ｘ０，ｙ０，ｚ０，...）は、ここでは格子強度座標と名付けられる、特定の色チャネルにおける予め決定された強度コードの個別の強度を表す。３より多くの色を使用する強度コーディング方式の場合、ｘ、ｙおよびｚ以外の追加の変数が上の式の右側に追加され得る。
【0152】
Ｎ＝２およびＭ＝２（２つの色および２つの強度レベル）を例にとると、強度コードは１：２の強度を有する（色チャネル１における強度は１、色チャネル２における強度は２）。ｘ０＝１、ｙ０＝２は、２つの色または２次元の強度座標マップ上のこのコードの位置を表す。ＦＩＳＨスポットから測定された強度が１：１．７である場合、ｘ１＝１、ｙ１＝１．７である。周囲の４つの格子座標に対する距離を計算することにより、このＦＩＳＨスポットを１：２の強度コードに割り当てることができる。ＦＩＳＨスポットからの測定された強度が１：１．５である場合、ｘ１＝１、ｙ１＝１．５である。周囲の４つの格子座標への距離を計算することにより、格子座標（１，１）および（１，２）に対して等しい距離を有する。このＦＩＳＨスポットは、コード割当の曖昧性に起因して除去される。
【0153】
実際には、様々な要因がプローブ標識方式の強度分布を変更し得る。そのため、選択されたプローブ標識方式の強度分布および対応する強度コードは、強度座標マップにおいて不規則境界を有し得る（図１のｄ）。すべての強度スポットを正しい強度コードに割り当てるべく、すべての強度コードの境界は、参照サンプルを使用して実験的に決定される必要がある。実験サンプルと同様の参照サンプルにおける設計された強度コードおよび標識方式を用いて関心のある標的を標識することにより、各標識方式の強度分布およびその対応する強度コードは別々に測定され得る。次に、参照サンプルから生じるすべての強度スポットの密度分布に基づいて、境界が決定され得る。実験サンプルからの強度スポットの測定された強度を、参照サンプルを用いて決定された境界と比較することにより、強度が強度コードの境界に位置する場合に、このスポットには対応する強度コードが割り当てられ、そうでない場合、除去される。強度が２つの強度コードの２つの境界に位置する場合、このスポットは、割り当ての曖昧性に起因して除去される。
【0154】
強度コードの境界を決定する１つの手段は、下の式を使用して、強度座標マップにおける任意の２つの強度スポットの強度距離を測定することである。
当該式において、Ｄは、参照サンプルからの別のランダム強度スポットの測定された強度に対する、参照サンプルからのランダム強度スポットの測定された強度の距離を表す。（ｘ１，ｙ１，ｚ１，...）および（ｘ２，ｙ２，ｚ２，...）は、特定の色チャネルにおけるランダム強度スポットの測定された強度を表す。３より多くの色を使用する強度コーディング方式の場合、ｘ、ｙおよびｚ以外の追加の変数が上の式の右側に追加され得る。特定の範囲より下の強度距離を有する強度スポットは、共にグループ化され得、強度スポットのクラスタを形式し、したがって、クラスタ、すなわち強度コードの境界を生成する。
エラーロバスト強度コーディング
【数2】
エラーロバスト強度コーディング
【0155】
強度コーディングの場合、標識方式の予め決定された強度コードの中央位置に対する、実験的な強度比率の距離に基づくエラー訂正方式が使用される（図１のｃ）。具体的には、よりロバストな検出の場合、２つの隣接する格子座標に対する距離の差が、２つの色強度コーディングについて±０．０１など特定の範囲内にある場合、実験的な比率が曖昧性を有するとみなし、コード割当についての対応するＦＩＳＨスポットを破棄し得る。
【0156】
実際には、強度コーディングについてのエラー訂正方式は、参照サンプルにおける強度コードの強度分布に基づいて参照強度コードマップを生成する（例４）。実験サンプルからの強度スポットの強度を、参照強度コードマップにおけるすべての強度コードの強度境界と比較することにより、強度スポットは、正しい強度コードを割り当てられ得る、または、除去され得る。
【0157】
別のエラー訂正は、全体のコードスペースのスパース性を利用する。ＨＣ－ｓｍＦＩＳＨおよび強度コーディングによる高容量検出におけるエラーの１つの主要な原因は、２つの強度コード間の重複する強度であり、これにより、強度コードのミスアライメントがもたらされる。このエラーを解決するべく、２つの隣接する強度コード間の強度ギャップ、および、全体のコードスペースにおいて使用されるコードのスパース性を増加させるように、単に、利用可能な強度コードの一部を選択し得る。
Ｆ．強度コーディングのイメージング方式の概要
Ｆ．強度コーディングのイメージング方式の概要
【0158】
まとめると、本発明は、限られた数（この数はＮとして示される）の色チャネルおよび様々な光標識（異なる標識の数はＬとして示される）を使用して、利用可能な色チャネルの数より多い、多くの異なる標的（異なる標的の数はＰとして示される）を検出する方法を提供する。典型的は、検出される標的の数は、式Ｐ≧２Ｎ（Ｎ≧１）で示され得る。いくつかの実施形態において、我々は、色チャネルの数より多くの光標識を使用して、Ｐ種類の標的（Ｐ＞Ｎ、Ｌ＞Ｎ）を検出する。これは標識方式３に該当する。いくつかの実施形態において、我々は、色チャネルの数と同一の数の光標識を使用して、Ｐ種類の標的（Ｐ＞Ｎ、Ｌ＝Ｎ）を検出する。これは標識方式１および２に該当する。いくつかの実施形態において、我々は色チャネルの数に等しい数、または、より多くの光標識を使用して、Ｐ種類の標的（Ｐ＞Ｎ、Ｌ≧Ｎ）を検出する。これは、代替的標識方式３に該当する。ハイブリダイゼーションに基づくプローブに限定されない、ハイブリダイゼーションに基づくプローブアッセイは典型的には、ここでは様々な強度コーディング方式を実装するために使用される。
例
例
【0159】
以下の例は、開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示される技法は、開示の実践において良く機能するための技法を表したものであり、したがって、実践のための具体的なモードを構成するものとみなされ得ることが、当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に鑑み、開示される特定の実施形態において多くの変更が加えられ得る、開示の思想および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果をなお得ることができることを理解するはずである。
例１
単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨの強度の変動、および、２色のＨＣ－ｓｍＦＩＳＨのシミュレーション
例１
単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨの強度の変動、および、２色のＨＣ－ｓｍＦＩＳＨのシミュレーション
【0160】
単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨ：ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴＦＲＣ ｍＲＮＡプローブを使用する高速ＲＮＡ ＦＩＳＨがＨｅＬａ細胞において行われた。ＴＦＲＣプローブは、４８のオリゴプローブを含む。各プローブは２０ｎｔ長であり、５'末端において１つのＱｕａｓａｒ５７０色素で標識した。サンプルイメージングのために８ウェルガラス底培養チャンバ（Ｉｂｉｄｉ）が使用された。細胞は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ； Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において室温で５～１０分間固定され、次に、純メタノール（Ｓｉｇｍａ）で５～１０分間透過処理された。次に、サンプルは以下の段階、すなわち、（１）７５℃で１０分間、ドライバスにおける、８０％ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）および２×ＳＳＣ緩衝液における完全熱変性、（２）１０％ホルムアミド、２０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ、ＭＷ＞５００，０００）および２Ｘ ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファにおける、１０分間のハイブリダイゼーション時間での短いＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの追加、（３）２×ＳＳＣ緩衝液２～３回による洗浄、（３）サンプルのイメージングで処理された。プローブ濃度は、ハイブリダイゼーション中、１００ｎＭであった。
【0161】
イメージングセットアップ：蛍光画像は、Ｐｌａｎ ａｐｏ ＶＣ １００Ｘ １．４５ Ｎ．Ａ．油浸対物レンズを有する反転蛍光顕微鏡（Ｔｉ－Ｅ； Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ニューヨーク州）上で捕捉された。Ａｎｄｏｒ Ｂｏｒｅａｌｉｓ ＣＳＵ－Ｗ１スピニングディスク共焦点が顕微鏡本体の左ポートに連結された。ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５チャネルにおける蛍光励起および発光を生じさせるべく、４のレーザ（４０５、５６１、６４０ｎｍで１００ｍＷ、４８８ｎｍで１５０ｍＷ）が装備された。入射するレーザのために、ＣＳＵ－Ｗにおける内部ダイクロックが使用された。スピニングディスク共焦点イメージングのために、追加の励起フィルタは使用されなかった。４のレーザが使用され、４の吸収フィルタ（Ｃｈｒｏｍａ）と照合された（４０５ｎｍレーザと４５０／５０ｍの吸収フィルタ、４８８ｎｍレーザと５２５／５０ｍの吸収フィルタ、５６１ｎｍレーザと６００／５０ｍの吸収フィルタ、６４０ｎｍレーザと、７００／７５ｍの吸収フィルタ）。すべての吸収フィルタは、駆動フィルタホイール（Ｌａｍｂｄａ １０－Ｂ； Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， Ｎｏｖａｔｏ， カリフォルニア州）内に搭載された。サンプルのｘｙおよびｚ方向の並進を制御するために、駆動顕微鏡ステージ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ （ＡＳＩ）， Ｅｕｇｅｎｅ， オレゴン州）が使用された。蛍光像は、２００ｍｓの曝露時間で、ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ４．２ ｓＣＭＯＳカメラ）を用いて記録された。顕微鏡、光源、駆動ステージ、駆動フィルタホイール、およびカメラは、ソフトウェアＭｉｃｒｏ－Ｍａｎａｇｅｒ （ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏ－ｍａｎａｇｅｒ．ｏｒｇ）におけるカスタム構成を通じて制御された。
【0162】
画像解析：画像は最初に、ピクセルノイズおよび長波長画像変動を抑制する実空間バンドパスフィルタを用いて処理された。バンドパス画像は次に、蛍光スポットの中心の大まかな推測を提供するピクセルレベル精度で極大値を見つけるためにアルゴリズムが適用される。非特異的結合プローブから生じるバックグラウンド信号から蛍光スポットを区別するために、強度閾値はこの段階においてセットアップする必要があった。この段階において、我々は単に、蛍光スポットが無いエリアの平均強度の４倍の強度を有するスポットを選択した。選択された極大値は次に、ガウシアンフィッティングのアルゴリズムによって更にフィッティングされ、蛍光スポットの位置の強度、スポット数およびサブピクセル解像度を実現し、すべての合理的な蛍光スポットは１０ピクセル×１０ピクセルの領域に制限されると想定した。
【0163】
結果および考察：比率１：０は、単一のＱｕａｓａｒ５７０色素標識ＴＦＲＣプローブによって検出された７９０のスポットからの実験結果である。比率２：０および３：０は、スポットあたり、それぞれ２倍の強度および３倍の強度を有する、比率１；０に基づくシミュレーションデータである。比率２：０は、比率１：０と４０％のスポット重複を有する。比率３：０は、比率１：０と５％未満のスポット重複を有する。Ｑｕａｓａｒ５７０標識されたＴＦＲＣスポットの強度の変動は、スポット重複または識別失敗率５％未満で、２つの比率１：０および３．０を非常に良く分離することが可能であることを示す（図１４のｂ）。
【0164】
ここではＴＦＲＣ転写産物（ＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）についての単一のＱｕａｓａｒ５７０色素標識オリゴプローブの強度分布がシミュレーションに使用された。
【0165】
シミュレーションは以下のように行われた。
（１）我々は最初に、例４における単一色素標識ＴＦＲＣ ＲＮＡ分子の実験結果から強度の分布（光子の数）を取得し、ヒストグラム解析を行った。
（２）次に我々は、ヒストグラムに従って異なる数の光子の確率密度関数（ＰＤＦ）をフィッティングした。
（３）ＰＤＦに基づいて、我々は各比率についてデータセットをシミュレートすることができた。ＰＤＦはすべての値の確率を提供するので、我々のシミュレーションは、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）（Ｒ２０１６ａ）において乱数発生器を使用して、それらの確率に従って乱数を生成した。例えば、１：０の場合、我々は単に、ＰＤＦを使用して５００の値をシミュレートした。それは１：０データについての５００のドットのｘ値を提供した。
（４）強度比率１：１の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、段階２のＰＤＦからの５００の値をシミュレートして５００のドットのｘ値を提供し、次に、５００のドットのｙ値を提供するために同一のＰＤＦからの別の５００の値をシミュレートした。なぜなら、ドットのｘ値およびｙ値は独立であり、我々の現在のシミュレーションにおいて想定されるものと同一のＰＤＦに従うからである。
（５）強度比率１：２の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、段階２から取得されたＰＤＦおよび同一のＰＤＦの畳み込みを通じて、より高い強度レベル（ここでは２倍の強度）についてＰＤＦを計算した。次に、段階４で我々が行ったように、我々は強度比率１：２をシミュレートした。
（６）強度比率１：３の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、単一色素についての段階２からのＰＤＦ、および、２つの色素についての段階５からのＰＤＦの畳み込みを通じて、より高い強度レベル（ここでは３つの色素）についてのＰＤＦを計算した。次に、段階４において我々が行ったように、我々は強度比率１：３をシミュレートした。
（１）我々は最初に、例４における単一色素標識ＴＦＲＣ ＲＮＡ分子の実験結果から強度の分布（光子の数）を取得し、ヒストグラム解析を行った。
（２）次に我々は、ヒストグラムに従って異なる数の光子の確率密度関数（ＰＤＦ）をフィッティングした。
（３）ＰＤＦに基づいて、我々は各比率についてデータセットをシミュレートすることができた。ＰＤＦはすべての値の確率を提供するので、我々のシミュレーションは、Ｍａｔｌａｂ（登録商標）（Ｒ２０１６ａ）において乱数発生器を使用して、それらの確率に従って乱数を生成した。例えば、１：０の場合、我々は単に、ＰＤＦを使用して５００の値をシミュレートした。それは１：０データについての５００のドットのｘ値を提供した。
（４）強度比率１：１の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、段階２のＰＤＦからの５００の値をシミュレートして５００のドットのｘ値を提供し、次に、５００のドットのｙ値を提供するために同一のＰＤＦからの別の５００の値をシミュレートした。なぜなら、ドットのｘ値およびｙ値は独立であり、我々の現在のシミュレーションにおいて想定されるものと同一のＰＤＦに従うからである。
（５）強度比率１：２の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、段階２から取得されたＰＤＦおよび同一のＰＤＦの畳み込みを通じて、より高い強度レベル（ここでは２倍の強度）についてＰＤＦを計算した。次に、段階４で我々が行ったように、我々は強度比率１：２をシミュレートした。
（６）強度比率１：３の５００のドットをシミュレートするべく、我々は、単一色素についての段階２からのＰＤＦ、および、２つの色素についての段階５からのＰＤＦの畳み込みを通じて、より高い強度レベル（ここでは３つの色素）についてのＰＤＦを計算した。次に、段階４において我々が行ったように、我々は強度比率１：３をシミュレートした。
【0166】
図１４のｃは、ドットのシミュレーション結果が、２色および２強度レベル（Ｎ＝２およびＭ＝２）と重複することを示す。比率１：０、２：０、０：１、０：２は、中間の４の強度比率から非常に良く分離し得る。なぜなら、最初の４の比率の１の色チャネルはシグナルを有しないからである。中間の４の強度比率の間の重複割合は下の表に列挙される。１：１＆２：２、および、１：２＆２：１の重複割合は１０％未満である。これは、下の表において列挙されるように１０～７０％の間である他の４の組み合わせより著しく小さい。
【表1】
【0167】
図１４のｄは、ドットのシミュレーション結果が２色および２強度レベルと重複するが、第１強度レベルと第２強度レベルとの間により大きい強度ギャップがあることを示す。第２強度レベルは平均で、第１強度レベルの３倍の強度を有する。任意の２つの強度比率コードの重複割合は、１％未満であり、これは、下の表に列挙されるように、互い非常に良く離間していることを意味する。ＦＩＳＨイメージングの同一ラウンドにおいて、これら８のコードを８のＲＮＡ検出に使用する場合、９９％より多くのＦＩＳＨドットが正しいＲＮＡ種に正確に割り当てられるべきである。
【表2】
【0168】
上の結果に基づいて、任意の強度コード間の強度重複を最小化するべく、強度ギャップは十分に大きい必要がある。このようにして、単一分子検出効率が最大化され得る。
【0169】
しかしながら、遺伝子アクセス性は、異なるＤＮＡまたはＲＮＡ標的、ならびに、異なる種類の細胞および組織サンプル間で大きく変動するので、ＤＮＡ／ＲＮＡパネルに使用される強度コードの実際の重複率は、もっとも正確なコード割当および最高のＤＮＡ／ＲＮＡ検出効率のために実験によって確認される必要がある。
例２ 複数の色素で標識されたオリゴプローブの生成
例２ 複数の色素で標識されたオリゴプローブの生成
【0170】
同一の色または異なる色の複数の色素は、多色強度コーディングのために各オリゴプローブにコンジュゲートされ得る。オリゴあたり２の色素で標識するために、我々は短いオリゴ（典型的には２０～５０ｎｔ）および各オリゴヌクレオチドの両方の末端における終端標識を使用できる。３および４の色素で標識するために、我々は、より長いがなお１００ｎｔ以下であるオリゴプローブを使用して、オリゴあたり複数の色素のコンジュゲーションを可能にする。長いプローブの各々は、ハイブリダイゼーション配列およびリードアウト配列から成る。ハイブリダイゼーション配列は、２０～４０ｎｔの長さの天然ヌクレオチドである。リードアウト配列は典型的には、少なくとも１５ｎｔの長さである。隣接する色素間のエネルギー移送および消光を最小化するために、色素標識密度は、色素あたり１０ｎｔより大きいように制御される（通常は色素あたり約２０ｎｔ）。
【0171】
オリゴ色素コンジュゲーション：異なる強度レベルを実現するために、複数の異なる色素を同一のオリゴにコンジュゲートするための複数の手段、すなわち、（１）オリゴ合成中に異なる色素を有するヌクレオチド誘導体を組み込むこと、（２）オリゴ合成中に異なるエピトープを有するヌクレオチドを組み込み、次に、クリックケミストリーなどの直交標識化学によって色素をコンジュゲートすること、（３）（１）および（２）の組み合わせがある。加えて、ＫＲＥＡＴＥＣＨユニバーサルリンケージシステム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、同一の色の複数の色素が、予めプログラムされた配列を有するＤＮＡオリゴ上にコンジュゲートされ得る。したがって、１：２などの２色コーディングを実現するべく、我々は、各オリゴの５'または３'末端に１つの赤色色素を組み込み、ＫＲＥＡＴＥＣＨ標識方法を用いる内部標識および末端標識の両方を通じて２の緑色色素をコンジュゲートすることができる。代替的に、Ｃｙ５のような（Ｃｙ５．５と比較して）明るい色素、および、Ｃｙ３のような（Ａｌｅｘａ５４６と比較して）暗い色素をペアにして、その結果、オリゴあたり２の色素だけを使用して１：２の強度比率を実現できる。１：１：１：１などの３および４の色コーディングを実現するべく、２種類のクリックケミストリー（（１）アジ化物およびアルキン反応、（２）テトラジンおよびビニル反応）を使用して、最大４の異なる色素を同一のオリゴ上に標識することができる。
例３ 標識方式３およびＤＮＡ ＦＩＳＨを用いる強度コードのスクリーニング
例３ 標識方式３およびＤＮＡ ＦＩＳＨを用いる強度コードのスクリーニング
【0172】
この例では、マウス細胞における反復ＤＮＡ配列を使用して、標識方式３のための良い色素ペアをスクリーニングする。各色素ペアは、実験において別々にテストされる。
【0173】
マウスゲノムにおけるテロメアおよびセントロメアのそれぞれの領域のプローブ配列をＩＤＴに注文した。
テロメアプローブ、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３：ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ１、Ｃｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５．５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ２、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５３２で３'標識
セントロメアプローブ３、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５４６で３'標識
セントロメアプローブ４、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｔｔｏ５９０で３'標識
テロメアプローブ、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３：ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ１、Ｃｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５．５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ２、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５３２で３'標識
セントロメアプローブ３、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５４６で３'標識
セントロメアプローブ４、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｔｔｏ５９０で３'標識
【0174】
マウス胎児線維芽（ＭＥＦ）細胞に対するＤＮＡ ＦＩＳＨが、以下のように実行された。ＭＥＦ細胞は、＃１．５ガラス底８ウェルチャンバ上に播種され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンが添加されたＤＭＥＭにおいて少なくとも１２時間培養された。ＤＭＥＭ溶液を除去した後に、ＭＥＦ細胞は直ちに、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１０分間固定された。ＰＦＡを除去し、２Ｘ ＳＳＣで３回洗浄した後に、ＭＥＦ細胞は、７０％エタノールを用いて４℃で少なくとも１時間にわたって透過処理された。次に、エタノール溶液は除去され、８０％ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）、２Ｘ ＳＳＣにおける９０℃、１０分間の変性を受ける前に、ＭＥＦ細胞は２Ｘ ＳＳＣで３回洗浄された。変性溶液を除去した後に、ＭＥＦ細胞は、１０％ホルムアミド、２×塩化ナトリウムクエン酸、２０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ、ＭＷ＞５００，０００）、および、２００ｎＭ ＤＮＡプローブを含む２００μＬプローブ緩衝液において、３７℃で４時間インキュベートされた。ＤＮＡ座位の強度比率を検出するために、チャンバの各ウェルは、１種類のプローブだけを用いてインキュベートされた。ＭＥＦ細胞は次に、レーザ励起を用いたスピニングディスク共焦点顕微鏡上でのイメージングに進む前に、３７℃で２分間にわたって、２Ｘ ＳＳＣにおける１０％ホルムアミドで２回洗浄された。
【0175】
顕微鏡構成：光学フィルタを含むイメージングセットアップは、例１で使用されたものと同一であった。
【0176】
イメージング：重複する放出スペクトラムを有する複数の色素が同一のレーザで励起され、同一チャネルで同時にイメージングされた。基本的に、レーザ６４０ｎｍで励起されたすべての蛍光は、Ｃｙ５／７００のチャネルで記録された。レーザ５６１ｎｍで励起された蛍光はＣｙ３／６００のチャネルで記録された。
【0177】
画像解析：同一のＦＯＶからの３Ｄスキャン画像は最初にスタックされ、最大強度で投影された。この段階は、７００および６００チャネルの両方について行われた。両方のチャネルにおいてそのピーク強度および空間位置を取得するべく、最大強度投影図は、ガウス関数を用いてフィッティングされた。７００チャネルからのフィッティングスポットは次に、６００チャネルからのスポットと整列され、２つのチャネルにおいて３ピクセル以内に離間している場合、同一のテロメアまたはセントロメアスポットとみなされた。次に、スポットについてのこれらの２つのチャネルの強度比率を計算するべく、同一の蛍光スポットからの７００チャネルおよび６００チャネルの強度が選択された。次に、２Ｄ（７００および６００チャネル）強度比率分布マップは、すべての蛍光スポットの強度比率値を用いて形成された。７００および６００チャネルの両方に現れるスポットについて、我々は、７００チャネルからの強度をｘ軸として、６００チャネルからの強度をｙ軸としてプロットした。このマップにおいて、各ドットは、２の色チャネル上のＦＩＳＨスポットの強度比率を表す。
【0178】
結果および考察：我々は、色素ペア（下の表に列挙される）間の重複する比率を計算し、２Ｄ強度分布マップおよび１Ｄ強度比率ヒストグラム（図１５のｅ～ｇ）を形成した。図１５のｅに示されるように、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３およびＣｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２の色素ペアプローブによって標識されたＦＩＳＨスポットの２Ｄ強度分布は、互いに完全に離間する。更に、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３のＦＩＳＨスポットからの強度分布は、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６（図１５のｆ）から大まかに区別可能である。下の表に列挙されるように、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３からのドットの９．１４％はＣｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６と重複し、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６からのドットの２２．３５％はＴｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３と重複する。さらに、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３の強度分布は、Ｃｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３から部分的にだけ区別可能である。Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３からのドットの３４．１３％はＣｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３と重複し、Ｃｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３からのドットの８２．２８％はＴｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３と重複する。Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３の強度分布は、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０とほとんど区別可能でない。下の表に列挙されるように、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３からのドットの９０．８６％はＣｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０と重複し、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０からのドットの８５．１３％は、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３と重複する（図１５のｇ）。最後に、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２およびＣｅｎ－Ｃｙ５．５－Ｃｙ３の強度分布は、互いに完全に離間する。Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａｔｔｏ５９０およびＣｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６の強度分布は、下の表に列挙されるように、互いにわずかに重複する（約２％、図１５のｇ）。
例４ 培養細胞における標識方式３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【表3】
【0179】
我々は標識方式３を使用して、ここでは２の色チャネルを用いて、ＭＥＦ細胞における２のＲＮＡ標的（ＰＯＲＬ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１）を検出した。ＣＴＮＮＢ１は、Ｃｙ５およびＣｙ３の色素の組み合わせで標識された。ＰＯＬＲ２Ａは、Ｃｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６の色素の組み合わせで標識された。
【0180】
プローブ設計の一般原理：我々は、ここでは標識方式３を実現するために分岐ＤＮＡ増幅と共に間接標識を使用した。我々は各色素および各一次プローブについて５×５分岐ＤＮＡシグナル増幅を使用した。このようにして、各一次プローブは、５の反復を有する一次アンプリファイアに結合し、次に、各一次アンプリファイアは、５の二次アンプリファイアに結合し（各二次アンプリファイアは、５の反復を有した）、最後に、同一の一次プローブに関連するこれら５の二次アンプリファイアは、最大２５のイメージングプローブに結合した。
【0181】
プローブ設計の４階層（一次プローブ、一次アンプリファイア、二次アンプリファイア、イメージングプローブ）の詳細：我々は、各ＲＮＡ種について４８の一次プローブを設計した。各一次プローブは、標的ＲＮＡ配列に相補的である２０ｎｔ標的結合配列と、２０ｎｔ標的結合配列の５'末端および３'末端側の両方における２０ｎｔリードアウト配列とから成る。同一のＲＮＡ種についてのすべての一次プローブは、同一のリードアウト配列を含む。異なるＲＮＡ種の一次プローブは異なるリードアウト配列を有し、異なる種類のＲＮＡ標的間の架橋結合を回避するために、異なる一次アンプリファイアおよび二次アンプリファイアに関連する。２つのＲＮＡ種両方の各一次プローブは、一次アンプリファイアに結合された。各一次アンプリファイアは、対応する一次プローブ上のリードアウト配列と相補的である２０ｎｔ配列を有する。各一次アンプリファイアは、５の反復を有し、その結果、５の二次アンプリファイアに結合できる。各二次アンプリファイアは、対応する一次アンプリファイア上の反復に相補的である２０ｎｔ配列を有する。各二次アンプリファイアは、５の反復を有し、その結果、５のイメージングプローブに結合できる。このようにして、各蛍光色素について５×５の増幅が実現された。各イメージングプローブは、２０ｎｔ長であり、５'末端に蛍光色素を有する。２のイメージングプローブ、すなわち、１つのＣｙ５色素にコンジュゲートしたイメージングプローブ、および、１つのＣｙ３色素にコンジュゲートした別の１つがＣＴＮＮＢ１に使用された。２のイメージングプローブ、すなわち、１つのＣｙ５．５色素にコンジュゲートされたイメージングプローブ、および、１つのＡｌｅｘａ５４６色素にコンジュゲートされた別の１つがＰＯＬＲ２Ａに使用された。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブは、５'末端における最大２５のＣｙ５色素、および、３'末端における最大２５のＣｙ３色素に関連し得る。ＰＯＬＲ２Ａについての各一次プローブは、５'末端における最大２５のＣｙ５．５色素、および、３'末端における最大２５のＡｌｅｘａ５４６色素に関連する。したがって、理論上、すべてのプローブの結合効率が１００％である場合、合計で１２００の（４８Ｘ５Ｘ５）Ｃｙ５色素、１２００のＣｙ３色素が、ＣＴＮＮＢ１のＲＮＡコピーに関連し得る。すべてのプローブの結合効率が１００％である場合、合計１２００のＣｙ５．５色素、１２００のＡｌｅｘａ５４６色素が、ＣＴＮＮＢ１のＲＮＡコピーに関連する。しかしながら、不十分な結合に起因して、標的あたりの色素の総数は、強度コードの強度の変動を増加させたこの数より遥かに低いことがあり得る。
【0182】
一次プローブのための標的結合配列の設計：ＲＮＡ標的の配列は、ＮＣＢＩまたはＵＣＳＣなどのゲノムおよびトランスクリプトームデータベースから抽出された。標的結合配列は、４５～６５％の範囲内のＧＣ含有量を有する必要があった。高い冗長性を有する配列を除去するために、ＢＬＡＳＴクエリが種の全ゲノムおよびトランスクリプトームに対する各プローブ上で実行された。プローブ結合を容易にし、蛍光色素分子消光またはＦＲＥＴを最小化するために、最小プローブ間隔（ここでは２ｎｔより大きい）が追加および調節された。プローブ間隔とは、ＲＮＡ標的に沿ったプローブ結合部位間のヌクレオチドの最小数を指す。
【0183】
一次プローブのリードアウト配列、一次増幅プローブの配列、二次増幅プローブの配列、および、イメージングプローブの配列は、マウストランスクリプトームに対する最小の非特異的結合を有するように設計された。
【0184】
強度コード：上に記載されたオリゴプローブ設計を用いて、我々はＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａを検出するために２の強度コードを割り当てた。この実験では、Ｃｙ５は７００チャネルにおいてＣｙ５．５より約２倍明るく、Ａｌｅｘａ５４６は６００チャネルにおけるＣｙ３より約２倍明るいので、強度レベル１は、１２００のＣｙ３またはＣｙ５．５で標的を標識することとして定義され得、強度レベル２は、１２００のＡｌｅｘａ５４６または１２００のＣｙ５で標的を標識することとして定義され得る。したがって、ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａはそれぞれ、ここでのオリゴ設計を用いて２の強度コード（１：２）および（２：１）でエンコードされた。これら２つの強度コードにおいて、一桁目は６００チャネルにおける強度レベルを表し、二桁目は７００チャネルにおける強度レベルを表した。
【0185】
ＲＮＡ ＦＩＳＨが以下のように実行された。ＭＥＦ細胞は＃１．５ガラス底８ウェルチャンバ（Ｉｂｉｄｉ）上に播種され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンが添加されたＤＭＥＭにおいて少なくとも１２時間培養された。ＤＭＥＭ溶液を除去した後に、ＭＥＦ細胞は直ちに、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間固定された。ＰＦＡを除去し、２Ｘ ＳＳＣで３回洗浄した後に、ＭＥＦ細胞は、７０％エタノールを用いて４℃で少なくとも１時間にわたって透過処理された。次にエタノール溶液が除去され、ＭＥＦ細胞は、洗浄バッファ（１０％ホルムアミドおよび２Ｘ ＳＳＣ）に１０分間置かれる前に２Ｘ ＳＳＣで３回洗浄された。洗浄溶液を除去した後に、１０％ホルムアミド、２×塩化ナトリウムクエン酸、１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ、＞５００，０００）、および、複数の一次ＤＮＡオリゴプール（ＩＤＴ、各単一一次プローブについて１０ｎＭ）を含む２００μＬプローブ緩衝液を用いてＭＥＦ細胞が３７℃で一晩インキュベートされた。ＭＥＦ細胞における１～２のＲＮＡ種（ＰＯＲＬ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１）を検出するべく、チャンバの各ウェルは、１～２種類の一次プローブでインキュベートされた。一晩のインキュベーション後、ＭＥＦ細胞は、２Ｘ ＳＳＣにおける１０％ホルムアミドを用いて、３７℃で２分間、２回洗浄された。次に、細胞は、２００μＬハイブリダイゼーションバッファにおいて１０ｎＭ一次増幅プローブと共に、３７℃で１時間インキュベートされた。洗浄バッファにおいて５分間、２回洗浄した後に、ＭＥＦ細胞は次に、２００μＬハイブリダイゼーションバッファにおいて１０ｎＭ二次増幅プローブと共に、３７℃で１時間インキュベートされた。洗浄バッファにおいて５分間、２回洗浄した後に、ＭＥＦ細胞は次に、２００μＬハイブリダイゼーションバッファにおいて１００ｎＭイメージングプローブと共に、３７℃で１時間インキュベートされた。洗浄バッファにおける５分間の洗浄の最終ラウンドの後に、ＭＥＦ細胞は次に、レーザ励起（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｉ顕微鏡、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｗ１共焦点スキャナ、ｓＣＭＯＳカメラＡｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ４．２， １００ｘ油対物レンズ）を用いたスピニングディスク共焦点顕微鏡上でのイメージングに進む前に、０．００１ｍｇ／ｍＬ濃度のＤＡＰＩと共に１分間インキュベートされた。蛍光イメージングは、例１において使用された同一のセットアップ上で行われた。７００チャネル（７００／７５ｍの吸収フィルタを用いた６４０ｎｍレーザ励起）および６００チャネル（６００／５０ｍの吸収フィルタを用いた５６１ｎｍレーザ励起）の両方について、各視野（ＦＯＶ）が連続的に３Ｄスキャンされた。各蛍光画像は、２００ｍｓの曝露時間で捕捉された。
【0186】
単一のＦＩＳＨスポットの強度および位置は、ＤＮＡ ＦＩＳＨについて例３において使用されるものと同様に抽出された。非特異的結合シグナルおよびバックグラウンドをポジティブシグナルから分離するために、各ＲＮＡ ＦＩＳＨ画像について、強度閾値が注意深く選択され最適化された。２色素共標識を用いたＲＮＡスポットの２Ｄ強度分布については、両方のチャネルにおける閾値より上の強度を有するスポットだけが解析のために選択され、そうでない場合、スポットは除去された。
【0187】
参照強度コードマップのガイドによるスポット割り当て：
１．参照マップの生成：我々は、コーディングされた強度比率を用いてＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１を別個に染色およびイメージングした。次に、我々は、約１００の細胞の画像から、単一ＲＮＡ種標識のすべてのＦＩＳＨスポットの２Ｄ（７００チャネルおよび６００チャネル）強度分布を取得した。我々は、同一２Ｄ強度プロットにおいて、ＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１それぞれについて、２つの別個の強度クラスタを取得できた。
２．我々は次に、すべてのスポットの約９５％を含む各色素の組み合わせの各クラスタのもっとも高密度のエリアを見つけることを試みた。アルゴリズムは、２つの点の間の距離が２５ピクセル（ユーザによって定義され得、より疎に分布されたスポットを組み込むために増加され得る）より短い場合に、各点が近隣の点とクラスタ化するように機能した。各色素の組み合わせのもっとも高密度のエリアを表すスポットの新たに生成されたクラスタを用いて、我々は、各クラスタからのすべての点を包含する２Ｄ境界に適合する一連の点を選択することによって、各クラスタの境界を発見した。一連の点によって表されるこの境界は、混合標識された色素の組み合わせにおいて我々の特異的なシグナルエリアを定義するために、我々の次の段階で使用される。
３．参照マップから決定された各色素の組み合わせの境界を用いて、我々は、混合標識されたクラスタから、色素の組み合わせの境界によって包含されたスポットを選択した。境界に含まれる、または境界から排除されるスポットの数と、スポットの総数との間の比率を計算することによって、我々は、特異的結合および非特異的結合シグナルを定量化できた。
１．参照マップの生成：我々は、コーディングされた強度比率を用いてＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１を別個に染色およびイメージングした。次に、我々は、約１００の細胞の画像から、単一ＲＮＡ種標識のすべてのＦＩＳＨスポットの２Ｄ（７００チャネルおよび６００チャネル）強度分布を取得した。我々は、同一２Ｄ強度プロットにおいて、ＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１それぞれについて、２つの別個の強度クラスタを取得できた。
２．我々は次に、すべてのスポットの約９５％を含む各色素の組み合わせの各クラスタのもっとも高密度のエリアを見つけることを試みた。アルゴリズムは、２つの点の間の距離が２５ピクセル（ユーザによって定義され得、より疎に分布されたスポットを組み込むために増加され得る）より短い場合に、各点が近隣の点とクラスタ化するように機能した。各色素の組み合わせのもっとも高密度のエリアを表すスポットの新たに生成されたクラスタを用いて、我々は、各クラスタからのすべての点を包含する２Ｄ境界に適合する一連の点を選択することによって、各クラスタの境界を発見した。一連の点によって表されるこの境界は、混合標識された色素の組み合わせにおいて我々の特異的なシグナルエリアを定義するために、我々の次の段階で使用される。
３．参照マップから決定された各色素の組み合わせの境界を用いて、我々は、混合標識されたクラスタから、色素の組み合わせの境界によって包含されたスポットを選択した。境界に含まれる、または境界から排除されるスポットの数と、スポットの総数との間の比率を計算することによって、我々は、特異的結合および非特異的結合シグナルを定量化できた。
【0188】
結果および考察：ここで、図１６は、単一ＲＮＡ標識および２ＲＮＡ共標識の代表的な生画像を示す。２の色素の組み合わせ（Ｃｙ５＋Ｃｙ３、Ｃｙ５．５＋Ａ５４６）に関連する２の強度コードは、参照マップ上で互いからの離間に成功した。したがって、各強度コードの境界の決定に成功した。図１７の（ａ）は、指定された境界を有する２つの色素の組み合わせについての単一ＲＮＡ染色からの参照マップを示す。図１７の（ｂ）～（ｄ）は、別個に示される３の細胞を有する混合標識データへの参照マップの適用を示す。下の表は、各細胞の統計的結果を示す。スポットは、固有の色素の組み合わせ（すなわち強度コード）でエンコードされたＲＮＡ標的への割り当てに成功するか、または、曖昧性または非特異的結合に起因して破棄されるかのいずれかである。
【表4】
【0189】
ｍＲＮＡは典型的には、哺乳類細胞における単一コピーとして発現されるので、ここで開発された高容量ＦＩＳＨ方法によって検出できる。しかしながら、光学イメージングの限定された物理的分解能に起因して、この方法は、各ＲＮＡが、回折限界光学分解能（典型的には、発光波長の約半分）より大きい距離で互いから離間されるべきであることを必要とし、その結果、それらは正確に区別され得る。複数のｍＲＮＡが高レベルで発現される場合、それらは互いに重複し得、その結果、高容量ＦＩＳＨイメージングの検出精度は損なわれる。
例５：培養された細胞における標識方式２を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例５：培養された細胞における標識方式２を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0190】
我々は標識方式２を使用して、ここでは２の色チャネルを用いて、ＭＥＦ細胞における２のＲＮＡ標的（ＰＯＬＲ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１）を検出する。
【0191】
プローブ設計および合成：ここでは標識方式２を実現するために、我々は分岐ＤＮＡ増幅と共に間接標識を使用した。我々は、各ＲＮＡ種について、４８の一次プローブを設計した。それらは、例４において使用されたものと同一である。我々は、ＰＯＬＲ２Ａについて増幅を使用せず（または１Ｘ１）、ＣＴＮＮＢ１について非平衡化３×３増幅を使用した。ＰＯＬＲ２Ａの各一次プローブは、１つのイメージングプローブにハイブリダイズする２０ｎｔのリードアウト配列を有する。ＰＯＬＲ２Ａについての各イメージングプローブは、５'末端で１つのＣｙ５色素と、３'末端で１つのＣｙ３色素とコンジュゲートした。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブは、５'末端および３'末端の両方において１つの２０ｎｔリードアウト配列を有し、その結果、５'末端は、１つの一次アンプリファイアとハイブリダイズでき、３'末端は、Ｃｙ５色素に直接コンジュゲートする画像プローブとハイブリダイズできた。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブの３'末端は、シグナル増幅を有しなかった。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブの５'末端における一次アンプリファイアは、３の二次アンプリファイアとハイブリダイズするために３の反復（各反復の２０ｎｔ）を有する。ＣＴＮＮＢ１についての各二次アンプリファイアは、３のイメージングプローブとハイブリダイズするために３の反復（各反復の２０ｎｔ）を有する。ＣＴＮＮＢ１についての二次アンプリファイアとハイブリダイズする各イメージングプローブは、イメージングプローブの５'末端においてＣｙ３色素とコンジュゲートした。このようにして、ＰＯＬＲ２Ａについての各一次プローブは、１のＣｙ５および１のＣｙ３色素と間接的に関連した。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブは、１のＣｙ５および９のＣｙ３色素と間接的に関連し得る。
【0192】
強度コード：上に記載されたオリゴプローブ設計を用いて、我々は、ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａを検出するために２つの強度コードを割り当てた。ＣＴＮＮＢ１の各コピーは、４８のＣｙ５および４３２のＣｙ３に関連し、ＰＯＬＲ２Ａの各コピーは、４８のＣｙ５および４８のＣｙ３に関連した。強度レベル１は、４８のＣｙ３またはＣｙ５で標的を標識することとして定義され得、強度レベル２は、４３２（４８×３×３）のＣｙ３またはＣｙ５で標的を標識することとして定義され得る。ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａは、ここでのオリゴ設計を用いて、それぞれ２の強度コード（２：１）および（１：１）でエンコードされた。これら２つの強度コードにおいて、一桁目は６００チャネルにおける強度レベルを表し、二桁目は７００チャネルにおける強度レベルを表す。２：１の強度コードは、９：１の強度比率に対応する。１：１の強度コードは、１：１の強度比率に対応する。
【0193】
ＦＩＳＨ染色、イメージングおよび画像解析は例４と同一である。例４に記載されるものと同一のＦＩＳＨスポット割り当て方法を使用することにより、我々は、２Ｄ強度分布データを２のクラスタに分離し、したがって、２のＲＮＡ種、すなわち、ＣＴＮＮＢ１およびＰＯＬＲ２Ａを検出できた。
例６：培養細胞における標識方式２および３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例６：培養細胞における標識方式２および３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0194】
この例は、例４において２のＲＮＡ標的（ＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１）を検出する結果を改善するために我々が標識方式２および方式３をどのように組み合わせ得るかを示す。色チャネルを含む、例４と同一のセットアップがここで使用される。ＣＴＮＮＢ１はなお、Ｃｙ５およびＣｙ３の色素の組み合わせで標識される。ＰＯＬＲ２Ａはなお、Ｃｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６の色素の組み合わせで標識される。しかしながら、我々は、ＲＮＡ標的に関連する各色素の数を調節して、これら２つの色素の組み合わせの強度ギャップを増加させることができ、その結果、これら２つの色素の組み合わせによって生じる強度コードは、両方のＲＮＡ標的のより高い検出効率のために、より良く離間され得る。
【0195】
方策１：１つの標的に関連する色素の数を変更する。例えば、我々はなお、Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６のために５×５の分岐ＤＮＡ増幅を使用できるが、ＰＯＬＲ２Ａに関連するＣｙ５．５のために３×２だけの分岐ＤＮＡ増幅を使用し、その結果、このＲＮＡを有するＣｙ５．５色素の数は、７６％（１‐６／２５）低下する。このようにして、これら２つのＲＮＡ標的の共染色を行うとき、２Ｄ強度分布プロット（図１７のｂ）におけるＰＯＬＲ２Ａの強度クラスタは、左にシフトし、その結果、ＰＯＬＲ２ＡについてのクラスタとＣＴＮＮＢ１についてのクラスタとの間の強度ギャップは大きくなる。
【0196】
方策２：両方の標的に関連する色素の数を同時に変更する。例えば、我々はなおＣｙ５およびＡｌｅｘａ５４６のために５×５の分岐ＤＮＡ増幅を使用できるが、ＰＯＬＲ２Ａに関連するＣｙ５．５のために３×２だけの分岐ＤＮＡ増幅を使用し、ＣＴＮＮＢ１に関連するＣｙ３のために３×２だけの分岐ＤＮＡ増幅を使用し、その結果、ＰＯＬＲ２ＡについてのＣｙ５．５色素の数、および、ＣＴＮＮＢ１についてのＣｙ３色素の数は両方とも、７６％（１‐６／２５）低下する。このようにして、これら２つのＲＮＡ標的の共染色を行うとき、２Ｄ強度分布プロット（図１７のｂ）におけるＰＯＬＲ２Ａの強度クラスタは左にシフトし、一方で、同一のプロット（図１７のｂ）におけるＣＴＮＮＢ１の強度クラスタは下にシフトする。このようにして、ＰＯＬＲ２ＡについてのクラスタとＣＴＮＮＢ１についてのクラスタとの間の強度ギャップは、方策１で形成されるものより一層大きくなる。
例７：培養細胞における複数の標識方式を用いた４重ＲＮＡ検出
例７：培養細胞における複数の標識方式を用いた４重ＲＮＡ検出
【0197】
我々はこの例において、４重ＲＮＡ検出を実現するためにＮ＝２、Ｍ＝２を使用した。３の光標識、すなわち、Ｃｙ５、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６色素が使用された。ここでは、ＭＥＦ細胞における４のＲＮＡ種（ＨＯＸＢ１、ＴＦＲＣ、ＰＯＬＲ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１）を検出するために、分岐ＤＮＡシグナル増幅を有する間接標識が複数の標識方式と共に使用された。間接標識については、一次プローブ、すなわち、標的結合プローブは、最初に一次増幅プローブに結合し、次に二次増幅プローブに結合し、最後にイメージングプローブに結合する。
【0198】
オリゴプローブの設計
【0199】
一次プローブは、４０ｎｔまたは６０ｎｔ長のいずれかであり得る。これは、（１）２０ｎｔ標的結合配列、および、（２）例４に記載されるような標的結合配列の一方の末端または両方の末端における１または２の２０ｎｔリードアウト配列を含む。４８の一次プローブが、各ｍＲＮＡ標的に使用された。イメージングプローブ上の色素標識の異なる組み合わせ、または、異なる数のイメージングプローブ、または、これら２つの組み合わせが、異なる標的に対する異なる強度比率を実現するために使用された。各標的に対する一次プローブの設計は下に列挙される。
【表5】
【0200】
この例において、ＴＦＲＣおよびＨＯＸＢ１の各一次プローブは、２つの同一のリードアウト配列を有する（一方は５'末端、他方は３'末端）。ＰＯＬＲ２Ａについての各一次プローブは、２つの異なるリードアウト配列を有する（一方は５'末端、他方は３'末端）。ＣＴＮＮＢ１についての各一次プローブは、５'末端に１つのリードアウト配列だけを有する。
【0201】
この例において、４のＲＮＡ種すべてについての一次アンプリファイアは１３０ｎｔ長であり、これは、（１）標的結合プローブのリードアウト配列に結合する１の２０ｎｔ配列と、（２）対応する二次増幅プローブに結合する５反復の２０ｎｔ配列とを含む。反復間には２ｎｔの間隔がある。また、第１の反復と、リードアウト配列に結合する配列との間には２ｎｔの間隔がある。
【0202】
この例において、対応するイメージングプローブが二重標識されているか（イメージングプローブあたり２の色素標識）、または、単一標識されているか（イメージングプローブあたり１の色素標識）に基づいて二次増幅プローブの２つの異なる設計がある。単一標識イメージングプローブに結合する二次増幅プローブについては、（１）対応する一次増幅プローブに結合する１の２０ｎｔ配列、および、（２）対応するイメージングプローブに結合する５反復の２０ｎｔ配列を含む。また、第１の反復と、一次増幅プローブに結合する配列との間に２ｎｔの間隔がある。この第１の設計は、ここではＰＯＬＲ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＦＲＣに適用される。二重標識イメージングプローブに結合する二次増幅プローブについては、対応する二次増幅プローブは、（１）対応する一次増幅プローブに結合する１の２０ｎｔ配列と、（２）対応するイメージングプローブに結合する５反復の２０ｎｔ配列と、（３）任意の２反復間の２２ｎｔインサートとを含む。この第２設計は、ここではＨＯＸＢ１に適用される。
【0203】
この例において、イメージングプローブは、（１）５'または３'末端上の１の色素（プローブあたり１の色素）、または、（２）５'および３'末端両方上の１の色素（プローブあたり２の色素）のいずれかで標識される。４のＲＮＡ標的は各々、イメージングプローブの４タイプの標識に対応する、標識方式２および方式３における間接標識のそれ自体の実装を有する。これら４タイプのイメージングプローブの標識は以下に列挙される。
【表6】
【0204】
一次プローブについての標的認識配列の設計は、例４に記載されているものと同一のオリゴ設計の原理に従う。リードアウト配列の設計、一次増幅プローブの配列、二次増幅プローブの配列、および、イメージングプローブの配列は、また、例４に記載されるものと同一のオリゴ設計の原理に従う。
【0205】
この例において、我々は、４のＲＮＡ標的、すなわち、２：２、０：１、２：１、２：０を検出するために４の強度コードを使用した。この例において、各ｍＲＮＡ標的は、４８の標的結合プローブに結合する。したがって、この例において、各標的結合プローブのシグナルは、５×５＝２５または５×５×２＝５０のいずれかだけ増幅される。標的結合プローブの各セットの増幅は以下に列挙される。
【表7】
【0206】
強度レベル１は、１２００のＣｙ３またはＣｙ５（２５×４８＝１２００）で標的を標識することとして定義され、強度レベル２は、Ｃｙ３／６００チャネルについては１２００のＡｌｅｘａ５４６または２４００のＣｙ３で、または、Ｃｙ５／７００チャネルについては２４００のＣｙ５で標的を標識することとして定義される。
【0207】
各ｍＲＮＡについての強度比率コードは、下のように列挙される。２の強度レベル（１：２）が、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６についての６００蛍光チャネルにおいて使用され、２の強度レベル（１および２）がＣｙ５についての７００蛍光チャネルにおいて使用される。
【表8】
【0208】
オリゴプローブの合成：すべてのオリゴプローブはＩＤＴに注文された。
【0209】
ＦＩＳＨ染色およびイメージング処理は、例４に記載されるものと同様に実行された。イメージング解析については、すべてのＦＩＳＨスポットの２Ｄ強度分布は、ＤＮＡ ＦＩＳＨについての例３において使用されたものと同一の手法を用いて取得された。その後、これらのスポットは、参照強度コードマップを使用することなく、期待値最大化アルゴリズムを用いて２つのクラスタに分割された。２桁の強度比率でコーディングされた２のクラスタは、離間に成功した。これら２つのクラスタの各々は１のＲＮＡ種を表す。我々は、単一ＲＮＡ標識を用いたポジティブコントロールの強度分布に従って、上のクラスタをＰＯＬＲ２Ａに割り当て、下の他方をＨＯＸＢ１に割り当てた。
【0210】
結果および考察
【0211】
結果として生じる、ＭＥＦ細胞のマルチプレックス標識の７００および６００チャネルの共焦点画像は、それぞれ図１８のａおよび図１８のｂに示される。重複画像および１つのズームインエリアが図１８のｃおよび図１８のｄに示される。各ＲＮＡの位置を示すために、異なる形状が図１８のｄに示される。ＨＯＸＢ１は円で示され、ＰＯＬＲ２Ａは正方形で示され、ＴＦＲＣはひし形で示され、ＣＴＮＮＢ１は六線星形で示される。この細胞において、５４のＨＯＸＢ１スポット、１１７のＰＯＬＲ２Ａスポット、１５７のＣＴＮＮＢ１スポット、および１３６のＴＦＲＣスポットが検出される。これらは、強度コーディング無しの従来の単一分子ＲＮＡ ＦＩＳＨによって決定されるコピー数カウントに近い。
【0212】
ログスケールにおける対応する２Ｄ強度マップは、図１８のｅに示され、ドットの４のクラスタが互いから明確に区別される。この例におけるＨＯＸＢ１のプローブ設計を使用して、Ｃｙ３チャネルにおけるＨＯＸＢ１およびＰＯＬＲ２Ａの設計された強度レベルは同一であり、強度比率分布は互いから離間しないことがあり得る。しかしながら、図１８のｅにおける２Ｄ強度分布プロットによれば、２のクラスタの離間が成功する。ポジティブコントロールの結果と比較することにより、ＨＯＸＢ１の強度は、Ｃｙ３／６００チャネルにおけるＰＯＬＲ２Ａの強度より低い。我々は、上のクラスタをＰＯＬＲ２Ａに、下の他のものをＨＯＸＢ１に割り当てた。我々は、色素消光が、標識方式４の適用である、ここでのＣｙ３‐Ｃｙ５の色素ペア標識方式を用いるイメージングプローブについて存在し得ると結論付ける。これは更に、同一の細胞系列における同一の色素の組み合わせで、ＨＯＸＢ１単独を染色するポジティブコントロール結果によって確認される。したがって、ＨＯＸＢ１についての設計された強度コードは実際には、２：２ではなく１：１である。換言すると、この場合における２：２および１：１の強度コードは、互いに重複し、よく離間できない。
【0213】
ＣＴＮＮＢ１は、Ｃｙ５だけで標識され、７００チャネルだけに示されるので、７００および６００チャネルの両方に示されるＨＯＸＢ１およびＰＯＬＲ２Ａから目立つ。Ｃｙ３で標識され、６００チャネルだけに示されるＴＦＲＣに同様のルールが適用される。
【0214】
まとめると、標識方式２、方式３、および方式４の組み合わせを使用して、４の異なる標的を表す４の固有クラスタの識別が成功する。
例８：標識方式３および区別された標識を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例８：標識方式３および区別された標識を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0215】
我々はここで、標識方式３および区別された標識を組み合わせて、ここで２の色チャネルを用いてＭＥＦ細胞において２のＲＮＡ標的（ＰＯＬＲ２Ａ、ＭＴＯＲ）を検出する。
【0216】
我々は、ＰＯＬＲ２Ａを標識するために６０の一次プローブを、ＭＴＯＲのために６０の一次プローブを設計した。各一次プローブは４０ｎｔ長であり、その２０ｎｔは標的結合配列である。一次プローブの各標的結合配列は、５'末端において２０ｎｔリードアウト配列に連結された。例４と同様に、我々は、各一次プローブについて、５×５分岐ＤＮＡ増幅を使用した。したがって、各一次プローブは、最初に５反復を有する一次アンプリファイアに結合され、次に２５の二次アンプリファイアに結合され、最後に、色素で標識された２５のイメージングプローブに結合される。
【0217】
区別された標識：標識方式３を実装するべく、ＰＯＬＲ２Ａを標識するためにＣｙ５およびＣｙ３が組み合わされ、ＭＴＯＲを標識するためにＣｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６が組み合わされる。このようにして、ＰＯＬＲ２ＡおよびＭＴＯＲは２つの異なる強度比率で標識される。ＰＯＬＲ２Ａの一次プローブは、２のグループに離間した。３０のプローブが５'末端においてＣｙ５色素で、３０のプローブが５'末端においてＣｙ３色素で間接的に標識された。ＭＴＯＲについての一次プローブは、２のグループに離間した。３０のプローブが５'末端においてＣｙ５．５色素で、３０のプローブが５'末端においてＡｌｅｘａ５４６色素で間接的に標識された。したがって、我々は、７００チャネルにおいて部分的に重複する色素Ｃｙ５およびＣｙ５．５を、６００チャネルにおいて部分的に重複する色素Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６を使用して、これら２つのＲＮＡ種を検出した。これは、標識方式３の適用である。ＭＴＯＲ ＲＮＡの各コピーは、最大７５０（３０×５×５）のＣｙ５．５色素および７５０のＡｌｅｘａ５４６色素に関連するように設計された。ＰＯＬＲ２Ａの各コピーは、最大７５０（３０×５×５）のＣｙ５色素および７５０のＣｙ３色素に関連するように設計された。
【0218】
ＦＩＳＨ染色、イメージングおよび画像解析は、例４と同一である。この例における設計を用いて、ＰＯＬＲ２Ａは、２Ｄ強度分布プロット上のＭＴＯＲから良く分離するべきである。
例９ 標識方式１および方式３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例９ 標識方式１および方式３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0219】
我々はここで、標識方式１および方式３を組み合わせて、ここでは２の色チャネルを用いてＭＥＦ細胞において２のＲＮＡ標的（ＭＴＯＲ、ＣＴＮＮＢ１）を検出した。我々は、異なる数の一次プローブを使用して、これら２のＲＮＡ種を標識した。これは標識方式１の適用である。我々は、７００チャネルにおける部分的に重複する色素Ｃｙ５およびＣｙ５．５、および、６００チャネルにおける部分的に重複する色素Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５４６を使用して、これら２のＲＮＡ種を検出する。これは標識方式３の適用である。
【0220】
プローブ設計および合成：我々はここで、分岐ＤＮＡ増幅と共に間接標識を使用した。例４とは異なり、我々はＣＴＮＮＢ１についての２４の一次プローブ、および、ＭＴＯＲについての９６のプローブだけを設計した。ＲＮＡ標的についての一次プローブの数が異なる以外に、両方のＲＮＡについてのすべての他のプローブ設計は例４と同一であった。換言すると、ＭＴＯＲはＣｙ５およびＣｙ３によって標識された。ＣＴＮＮＢ１はなお、Ｃｙ５．５およびＡｌｅｘａ５４６によって標識された。各一次プローブは、５'末端における２５のＣｙ５色素、および、３'末端における２５のＣｙ３色素に関連するように５×５に増幅された。すべてのプローブハイブリダイゼーション効率が１００％である場合、ＭＴＯＲの各コピーは、最大２４００（９６×５×５）のＣｙ５および２４００のＣｙ３色素に関連し得、ＣＴＮＮＢ１の各コピーは、最大６００（２４×５×５）のＣｙ５．５および６００のＡｌｅｘａ５４６色素に関連し得る。
【0221】
ＦＩＳＨ染色、イメージング、および画像解析は、例４と同一である。我々は、２Ｄ強度分布プロット上でＰＯＬＲ２ＡがＣＴＮＮＢ１から非常に良く分離するべきであると予想した。例４におけるＰＯＬＲ２Ａの２Ｄ強度分布と比較して、ここでのＭＴＯＲは、より高い数の一次プローブに起因して、右上に向かってシフトするはずである。例４におけるＣＴＮＮＢ１の２Ｄ強度分布と比較して、ここでのＣＴＮＮＢ１は、より低い数の一次プローブに起因して、左下に向かってシフトするはずである。
例１０：代替的標識方式３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例１０：代替的標識方式３を用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0222】
我々はここで、代替的標識方式３を実現するために、標的手法あたり１の色素だけをどのように使用するかを実証する。
【0223】
我々は、それぞれ、Ａｌｅｘａ６４７を使用してＰＯＬＲ２Ａ ｍＲＮＡを標識し、Ａｌｅｘａ７００を使用してＣＴＮＮＢ１ ｍＲＮＡを標識し得る。これら２の色素は、図１０に示されるような重複する放出スペクトラムを有する。ＰＯＬＲ２Ａの各コピーは、５×５分岐ＤＮＡ増幅と共に、４８の一次プローブで標識される。ＣＴＮＮＢ１の各コピーは、５×５の分岐ＤＮＡ増幅と共に、４８の一次プローブで標識される。ＰＯＬＲ２Ａのイメージングプローブは、１のＡｌｅｘａ６４７色素で標識される。ＣＴＮＮＢ１のイメージングプローブは、１のＡｌｅｘａ７００色素で標識される。プローブ（一次プローブ、一次アンプリファイア、二次アンプリファイア、イメージングプローブを含む）の各階層についてのすべての配列設計は、例４において使用されるものと同一である。
【0224】
我々は、Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００の蛍光、６５０～７１０ｎｍ、７４５～８０５ｎｍを記録するために、２つの吸収フィルタをカスタマイズした。両方の色素は６３３ｎｍの同一のレーザ線によって励起される。６５０～７１０ｎｍの色チャネルにおいて、両方のＲＮＡ種について、標的あたり同一の数の色素を使用するとき、Ａｌｅｘａ６４７は、Ａｌｅｘａ７００より著しく高い強度を放出する。７４５～８０５ｎｍの色チャネルにおいて、Ａｌｅｘａ７００は、Ａｌｅｘａ６４７より高い強度を放出し得る。イメージングを行うとき、６３３ｎｍの同一の励起を使用し、上で記載された２つの吸収フィルタを用いて２の色チャネルにおける蛍光を連続的または同時に検出し、２つの色画像が記録される。このようにして、Ａｌｅｘａ６４７およびＡｌｅｘａ７００は、同一の２の色チャネル上で２つの異なる強度比率を生じさせ得、その結果、ＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１は区別され得る。各色素について色チャネルにおけるスペクトルエリアを計算することによって、我々は、６５０～７１０ｎｍおよび７４５～８０５ｎｍのチャネルにおけるＡｌｅｘａ６４７の強度比率は３：１であり（一桁目は、６５０～７１０ｎｍのチャネルにおける強度）、Ａｌｅｘａ７００の強度比率は１：２．８５である（一桁目は６５０～７１０ｎｍのチャネルにおける強度である）と推定する。したがって、ＰＯＬＲ２ＡおよびＣＴＮＮＢ１は、上で設計された２つのチャネルと共に、これら２つの色素によって区別され得る。これら２つの標的の強度クラスタがより良く離間し得るように、各標的の強度分布を更に調節するために、我々は、ＰＯＬＲ２Ａに関連するＡｌｅｘａ６４７の数、または、ＣＴＮＮＢ１に関連するＡｌｅｘａ７００の数、または、両方の数を調節し得る。さらに、我々は、フィルタ設計を変更して、より良いＲＮＡ検出効率のために２の色チャネル間で各色素の強度比率を調節し得る（例えば、吸収フィルタの発光ウィンドウを増加もしくは短縮する、または、吸収フィルタの光子伝達効率を変更する）。
【0225】
上で記載された色素標識および光学フィルタ以外に、プローブ設計、ＦＩＳＨ染色実験、イメージングおよび画像解析を含むすべての他のプロセスは、例４における同一の手法で行われ得る。
例１１：４の色チャネルを用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
例１１：４の色チャネルを用いたマルチプレックスＲＮＡ検出
【0226】
この例において、我々は、強度コーディングのために３の色チャネル（Ｎ＝３、Ｍ＝２）を使用し、非特異的結合のエラー訂正のために、別の１の色チャネルを使用することを計画する。強度コーディングについての３の色チャネルは、例１で使用されるものと同一である。それ以外に、我々は、Ｃｙ７色素を検出するために１つ多い色チャネルを追加する。ここではテストのために１２のマウスｍＲＮＡ遺伝子、ＴＦＲＣ、ＭＴＯＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＴＢＰ、ＴＯＰ１、ＰＲＤＭ４、ＢＲＡＣ１、ＰＯＬＲ２Ａ、ＳＴＡＴ３、ＮＯＴＣＨ１、ＷＮＴ１１が使用される。
【0227】
プローブ設計および色素標識：マウスＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースから取得され得る。各ＲＮＡについて、長さに応じて、我々は強度コーディングのために２４～４８の一次プローブを設計する。我々は、各ＲＮＡおよびエラー訂正のために、追加の２４～４８一次プローブを設計する。ここでは、強度コーディングのために６の色素、すなわち、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ５１４が使用される。Ｃｙ７色素は、非特異的結合のエラー訂正だけに使用され、強度コーディングには使用されない。分岐ＤＮＡ増幅はまた、各強度コードの強度レベルおよび変動を微調整するために組み合わされる。したがって、ＲＮＡ検出効率の最高のパフォーマンスを実現するべく、エラー訂正のための標識方式１、方式２、方式３、および代替的方式の組み合わせが統合される。
【0228】
強度コーディング：我々は、２の強度レベルおよび３の色を使用して１２のＲＮＡ種を検出する。１２の強度コードは、下の表に列挙されるように、より多くの桁を有するコードが、より長いＲＮＡ種に割り当てられるような方式で１２のＲＮＡに割り当てられる。例えば、より長いＲＮＡ ＰＯＬＲ２Ａを標識するために３桁コード１：１：２が割り当てられ、より短いＲＮＡ ＡＫＴ１を標識するために１桁コード１：０：０が割り当てられる。この表における各強度コードについて、一桁目はＣｙ５／７００チャネルであり、二桁目はＣｙ３／６００チャネルであり、三桁目はＡｌｅｘａ４８８／５００チャネルである。例えば、強度コード１：０：０は、第１色が強度レベル１を有するＣｙ５であり、他方、第２および第３色が強度を有しないことを表し、１：２：１は、第１色が強度レベル１を有するＣｙ５であり、第２色が強度レベル２を有するＣｙ３であり、第３色は強度レベル１を有するＡｔｔｏ４８８であることを表す。
【表9】
【0229】
セットアップおよびＦＩＳＨ実験：我々は、スピニングディスク共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｉ－Ｅ）およびＡｎｄｏｒ ｓＣＭＯＳカメラを使用して、プローブで染色されたＭＥＦ細胞をイメージングし得る。顕微鏡は、５のレーザおよび５の色チャネル、４５０／５０ｍの吸収フィルタを有する４０５ｎｍレーザ、５２５／５０ｍの吸収フィルタを有する４８８ｎｍレーザ、６００／５０ｍの吸収フィルタを有する５６１ｎｍレーザ、７００／７５ｍの吸収フィルタを有する６４０ｎｍレーザ、８１０／９０ｍの吸収フィルタを有する７５０ｎｍレーザと共に設置される。ＦＩＳＨ染色実験は、例４において使用されるのと同様に行われ得る。
【0230】
画像解析：単一分子強度分布は、例４において使用されるのと同様に解析され得る。
例１２：培養細胞における標識方式１を用いたマルチプレックスＤＮＡ検出
例１２：培養細胞における標識方式１を用いたマルチプレックスＤＮＡ検出
【0231】
方式１を実装するべく、我々は、２セットの一次プローブを設計した。これは、以下の領域、すなわち、Ｃｈｒ２１： １８６２７６８３－１８７２７６８３（合計で１００ｋｂ、ＳＩ１として示される）、および、Ｃｈｒ１９： ２９１２０００１－２９２２０００１（合計で１００ｋｂ、ＳＩ２として示される）から構築される。関心のある上のゲノム領域に相補的な４２ｎｔ標的配列が、１００ｋｂゲノム領域上でタイリングする１０００プローブを有するＳＩ１、および、１００ｋｂゲノム領域上でタイリングする１０００プローブを有するＳＩ２をカバーするように選択された。我々は次に、分岐ＤＮＡシグナル増幅のために、３'側の各一次プローブをリードアウト配列に隣接させた。我々は、両方の標的のすべての一次プローブについて、３×３の分岐ＤＮＡ増幅を使用した。増幅プローブは、各一次および二次アンプリファイアが増幅のために３の反復だけを含むことを除き、ＲＮＡ ＦＩＳＨについての例４と同様に設計された。加えて、ＳＩ１を標的とする１０００のプローブについて、それらのうち１００は、シグナル増幅によって間接的にＣｙ５色素で標識され、それらのうち９００は、シグナル増幅によって間接的にＣｙ３色素で標識される。ＳＩ２を標的とする１０００のプローブについては、それらのうち１００は、シグナル増幅によって間接的にＣｙ３色素で標識され、それらのうち９００は、シグナル増幅によって間接的にＣｙ５色素で標識される。
【0232】
強度コーディング：ここで、我々は、第１強度レベルを９００（１００×３×３）のＣｙ３またはＣｙ５色素として、第２強度レベルを８１００（９００×３×３）のＣｙ３またはＣｙ５色素として定義する。上のオリゴ設計に基づいて、ＳＩ１は、９：１（Ｃｙ３：Ｃｙ５）の設計された色素比率に対応して、２：１（６００チャネル：７００チャネル）の強度コードでコーディングされる。ＳＩ２は、１：９（Ｃｙ３：Ｃｙ５）の設計された色素比率に対応して、１：２（６００チャネル：７００チャネル）の強度コードでコーディングされる。
【0233】
ＦＩＳＨ実験、イメージングおよび画像解析：我々はここではＤＮＡ ＦＩＳＨのためにＨｅＬａ細胞を使用した。染色プロトコルは、一次プローブが標的に結合した後に、より多くの階層の仲介プローブが追加されたことの除き、例３と同一である。仲介プローブ結合のためのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、例３におけるイメージングプローブ結合と同一である。イメージング処理および画像解析は、例３と同様に行われ得る。
例１３ 一次組織における標識方式１および３を用いたマルチプレックスＤＮＡ検出
例１３ 一次組織における標識方式１および３を用いたマルチプレックスＤＮＡ検出
【0234】
我々はここで、マウス脳組織およびヒトＰＢＭＣ細胞において２のクロマチン座位（テロメアおよびセントロメア）を検出するためにプローブを設計した。我々は、セントロメアの反復配列を認識するために、テロメアおよび別のプローブの反復配列を認識するプローブを設計した。異なるマウスまたはヒト染色体上の異なるテロメアまたはセントロメア座位は、様々な数の反復単位を有するので、異なる数のテロメアまたはセントロメアプローブに結合し得る、これは、標識方式１の適用である。一方で、異なる蛍光強度と部分的に重複する色素はここで、これら２のＤＮＡセグメントを区別するために使用された。これは、標識方式３の適用である。
【0235】
マウス組織サンプルについて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの脳組織がここで使用された。典型的には、このマウス系統におけるテロメアの長さは、１０ｋｂ～５０ｋｂの間で変動する。そのため、原理的には、数百から数千のテロメア反復単位が各テロメア座位に存在し得る。異なる染色体のマウスセントロメアは１００ｋｂ～１Ｍｂの間で変動する。
【0236】
ヒト細胞の場合、テロメアの長さは１ｋｂ～１０ｋｂの間で変動する。異なる染色体間のヒトセントロメアは、０．５～１０Ｍｂｐの間で変動する。
【0237】
マウス組織におけるテロメアおよびセントロメア標識のためのプローブ：
マウスゲノムにおけるテロメアおよびセントロメアのそれぞれの領域のプローブ配列はＩＤＴに注文された。
テロメアプローブ、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３：ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５３２で３'標識
マウスゲノムにおけるテロメアおよびセントロメアのそれぞれの領域のプローブ配列はＩＤＴに注文された。
テロメアプローブ、Ｔｅｌ－Ｃｙ５－Ｃｙ３：ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識
セントロメアプローブ、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５３２：ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５３２で３'標識
【0238】
ヒト細胞における染色体１およびセントロメアの反復配列のためのプローブ：染色体１（Ｃｈ１‐Ｒｅ）上の反復ＤＮＡセグメントのための染色体１プローブＣｈｒ１－ＴＹＥ６６５－Ｃｙ３：ＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣ、ＴＹＥ６６５で５'標識、Ｃｙ３で３'標識；セントロメアプローブ、Ｃｅｎ－Ｃｙ５－Ａ５４６： ＡＴＴＣＧＴＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＡ、Ｃｙ５で５'標識、Ａｌｅｘａ５４６で３'標識。ハイブリダイゼーションバッファにおける各プローブの濃度は２００ｎＭであった。
【0239】
マウス脳組織上のＤＮＡ ＦＩＳＨは、以下のように実行された。マウス脳組織（Cell Biologicsに注文）のブロックは、ＯＣＴで埋没され、８μｍのセクションにクライオカットされた。セクションは、ポリリジン（ＰＬＬ、ＣｕｌｔｒｅＸ）でコーティングされた格子カバーガラス（格子状カバーガラスＧｒｉｄ５００、＃１．５Ｈ（１７０μｍ）Ｄ２６３ Ｓｃｈｏｔｔガラス、ｉｂｉｄｉ）上に付着された。組織セクションは、すぐに４％ＰＦＡを用いて、室温で１２分間固定された。固定組織は次に、２Ｘ ＳＳＣを用いて３回洗浄され、７０％エタノールを用いて少なくとも１時間にわたって室温で透過処理された。次にエタノール溶液は除去され、組織は、８０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣを用いて９０℃で１０分間の変性を受ける前に、２Ｘ ＳＳＣを用いて３回洗浄された。変性の後に、組織は、１０％ホルムアミド、２×塩化ナトリウムクエン酸、２０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ、＞５００，０００）および２００ｎＭ ＤＮＡプローブを含む２００μＬプローブ緩衝液と共に、３７℃で４時間インキュベートされた。ここでは、テロメアプローブおよびセントロメアプローブの両方が、２００ｎＭの濃度で使用された。組織は次に、例１６において使用された同一のセットアップ上のイメージングの前に、２Ｘ ＳＳＣにおける１０％ホルムアミドを用いて３７℃で２分間、２回洗浄された。各ＦＯＶは、すべてのシグナルをカバーするために３Ｄスキャンされ、各蛍光画像は、２００ｍｓの曝露時間で捕捉された。Ｃｙ５色素は、７００／７５ｍの吸収フィルタを用いて、７００の色チャネルでイメージングされ、Ｃｙ３およびＡｌｅｘａ５３２色素は、６００／５０ｍの吸収フィルタを用いて、６００の色チャネルでイメージングされた。
【0240】
ヒトＰＢＭＣ細胞に対するＤＮＡ ＦＩＳＨは、以下のように実行された。３：１（ｖ／ｖ）メタノールおよび酢酸溶液の組み合わせに固定された全血からヒトＰＢＭＣ細胞が単離された。その後、細胞は＃１．５ガラス底８ウェルチャンバ上に付着され、８０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣにおいて９０℃で１０分間にわたる変性を受ける前に、２Ｘ ＳＳＣを用いて３回洗浄された。変性溶液が除去され、血球は、１０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣ、２０％硫酸デキストラン、２００ｎＭ ＤＮＡプローブを含む２００μＬプローブ緩衝液と共に３７℃で１時間インキュベートされた。血球は次に、スピニングディスク共焦点顕微鏡上でのイメージングの前に、２Ｘ ＳＳＣにおける１０％ホルムアミドを用いて３７℃で２分間、２回洗浄された。これは例１６と同一である。各ＦＯＶは、すべてのシグナルをカバーするために３Ｄスキャンされ、各蛍光画像は、２００ｍｓの曝露時間で捕捉された。
【0241】
画像解析：マウスおよびヒト血球からのイメージングデータが同一の手法で解析された。同一のＦＯＶからの３Ｄスキャン画像が最初にスタックされ、最大強度で投影された。この段階は、７００および６００チャネルの両方について行われた。最大強度で投影された図は、７００および６００チャネル両方についてのそのピーク強度および２Ｄ位置を取得するために、ガウス関数でフィッティングされた。７００チャネルからのフィッティングされたドットは次に、６００チャネルからのドットと整列され、それらが３ピクセル以内に配置された場合、同一のテロメアまたはセントロメアのスポットからのものであるとみなされた。同一のスポットからの７００および６００チャネルの強度は次に、下流の解析のために選択された。次に、ドットの２のクラスタ間の明白な分離に従って分離線が引かれた。各スポットは次に、それらの強度比率分布に基づいて、テロメアまたはセントロメアのいずれかに割り当てられた。同一画像におけるテロメアおよびセントロメアは次に、上の割り当てに基づいて異なるように示された。
【0242】
マウス組織におけるＤＮＡ ＦＩＳＨについての結果および考察：例３において取得された各色素ペアの強度分布の特性に基づいて、我々は、テロメアおよびセントロメアを同時に検出するために、２の色素ペア、Ｃｙ５‐Ｃｙ３およびＣｙ５‐Ａ５３２プローブを選択して組み合わせた。各色素ペアからの強度ドットのクラスタは、予想されるように互いから離間した（図１９のａ）。ＤＮＡ ＦＩＳＨ画像における各テロメアおよびセントロメアスポットの識別は図１９のｂ～ｃに示された。
【0243】
ヒト細胞におけるＤＮＡ ＦＩＳＨについての結果および考察：例３において取得された各色素ペアの強度分布の特性に基づいて、我々は、２のＤＮＡ反復配列、Ｃｈ１‐Ｒｅおよびセントロメアを同時に標識するために、２の色素ペアＣｙ５‐Ａｌｅｘａ５４６およびＴＹＥ６６５‐Ｃｙ３を選択して組み合わせた。各色素ペアからの強度ドットのクラスタは、予想されるように互いから離間した（図１９のｄ）。１のＤＮＡ ＦＩＳＨ画像におけるＣｈ１‐Ｒｅおよびセントロメアスポットの識別は図１９のｅ～ｆに示される。図１９のｆにおいて、Ｃｈ１‐Ｒｅからの２のスポットを、強度比率コーディングによる他のセントロメアスポットのすべてから離間することに成功した。
例１４：培養細胞における標識方式２および方式４を用いたＤＮＡ ＦＩＳＨ
例１４：培養細胞における標識方式２および方式４を用いたＤＮＡ ＦＩＳＨ
【0244】
この例において、我々は、標識方式２および方式４が、同一標的の強度レベルを調節するためにどのように使用され得るかを実証する。プローブ：我々は、同一のテロメア標的について３の異なる強度比率を実現するために、３セットのオリゴプローブ、すなわち、１Ｃｙ５：２Ｃｙ３、１Ｃｙ５：１０Ｃｙ３、１Ｃｙ５：３０ Ｃｙ３を設計した。テロメアについてのプローブ配列はＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡである。プローブセット１は、一次プローブ、イメージングプローブを含む。プローブセット２は、一次プローブ、一次アンプリファイア、イメージングプローブを含む。プローブセット３は、一次プローブ、一次アンプリファイア、イメージングプローブを含む。３の一次プローブすべては、ヒトゲノムにおけるテロメアのそれぞれの領域について、同一の標的結合配列を共有した。これは、例１３において使用されるものと同一である。３の一次プローブはすべて、１のＣｙ５色素で内部的に標識された（標的結合配列の３'末端）。すべての一次プローブは、２の異なる２０ｎｔリードアウト配列を有した（一方が５'末端、他方が３'末端）。プローブセット１についての各一次プローブは、２０ｎｔの２のイメージングプローブに結合した（一方が５'末端、他方が３'末端）。プローブセット１についての各イメージングプローブは、プローブの３'末端において１のＣｙ３標識を有した。プローブセット２およびセット３についての一次プローブは、プローブセット１についての一次プローブと同一の配列を有した。プローブセット２およびセット３についての各一次プローブは、２の異なる一次アンプリファイアに結合した（一方が５'末端、他方が３'末端）。プローブセット２についての各一次アンプリファイアは、このセットについての一次プローブのリードアウト配列に相補的な２０ｎｔ配列、および、５のイメージングプローブに結合する２０ｎｔの５の反復を有した。プローブセット２についての各イメージングプローブは、２０ｎｔ配列を有し、３'末端においてＣｙ３色素で標識された。プローブセット３についての各一次アンプリファイアは、このセットについての一次プローブのリードアウト配列に相補的な２０ｎｔ配列、および、１５のイメージングプローブに結合する２０ｎｔの１５の反復を有した。プローブセット３についての各イメージングプローブは、２０ｎｔ配列を有し、３'末端においてＣｙ３色素で標識された。このようにして、プローブセット１についての各一次プローブは、１のＣｙ５および２のＣｙ３に関連し得る。プローブセット２についての各一次プローブは、１のＣｙ５および１０のＣｙ３に関連し得る。プローブセット３についての各一次プローブは、１のＣｙ５および３０のＣｙ３に関連し得る。
【0245】
ＤＮＡ ＦＩＳＨ実験：ＨｅＬａ細胞が、ポリリジン（ＰＬＬ、ＣｕｌｔｒｅＸ）でコーティングされたガラス底８ウェルチャンバ（＃１．５Ｈ（１７０μｍ） Ｄ ２６３ Ｓｃｈｏｔｔガラス、ｉｂｉｄｉ）に付着された。３の異なるセットのプローブで染色されるように、３バッチの細胞が３の異なるウェルに付着された。各ウェルにおいて、ＦＩＳＨ染色実験が以下の順序で行われた。細胞はすぐに、４％ＰＦＡを用いて、室温で５～１０分間固定された。固定細胞は次に、２Ｘ ＳＳＣを用いて３回洗浄され、７０％エタノールを用いて少なくとも１時間にわたって室温で透過処理された。次にエタノール溶液は除去され、細胞は、８０％ホルムアミド、２Ｘ ＳＳＣを用いて９０℃で１０分間の変性を受ける前に、２Ｘ ＳＳＣを用いて３回洗浄された。変性の後に、細胞は、１０％ホルムアミド、２×塩化ナトリウムクエン酸、２０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ、＞５００，０００）および２００ｎＭの一次プローブを含む２００μＬプローブ緩衝液と共に、３７℃で少なくとも４時間インキュベートされた。ＨｅＬａ細胞は、２Ｘ ＳＳＣにおける１０％ホルムアミドを用いて、３７℃で２分間、２回洗浄された。細胞は次に、２００μＬハイブリダイゼーションバッファにおける１０ｎＭ一次増幅プローブと共に、３７℃で１時間インキュベートされた（一次アンプリファイアが使用されない場合、この段階はスキップされた）。洗浄バッファにおいて５分間、２回洗浄した後に、ＨｅＬａ細胞は次に、２００μＬハイブリダイゼーションバッファにおいて１００ｎＭイメージングプローブと共に、３７℃で１時間インキュベートされた。洗浄バッファにおける５分間の洗浄の最終ラウンドの後に、細胞は次に、レーザ励起（Ｎｉｋｏｎ、Ｔｉ顕微鏡、Ｙｏｋｏｇａｗａ ＣＳＵ－Ｗ１共焦点スキャナ、ｓＣＭＯＳカメラＡｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ４．２， １００ｘ油対物レンズ）を用いたスピニングディスク共焦点顕微鏡上でのイメージングに進む前に、０．００１ｍｇ／ｍＬ濃度のＤＡＰＩと共に１分間インキュベートされた。蛍光イメージングは、例１において使用された同一のセットアップ上で行われた。７００チャネル（７００／７５ｍの吸収フィルタを用いた６４０ｎｍレーザ励起）および６００チャネル（６００／５０ｍの吸収フィルタを用いた５６１ｎｍレーザ励起）の両方について、各視野（ＦＯＶ）が連続的に３Ｄスキャンされた。各蛍光画像は、２００ｍｓの曝露時間で捕捉された。
【0246】
画像解析は、ＤＮＡ ＦＩＳＨについての例３において使用される同一の手法で行われた。
【0247】
結果および考察：図２０のｃ～ｅは、３のプログラム強度比率の強度分布の結果を示す。それらはすべて同一の基準線と比較される。図２０のｃを図２０のｄと比較すると、Ｃｙ３／６００チャネルにおける１Ｃｙ５：１０Ｃｙ３の比率を用いたテロメア染色の強度は大部分、基準線の上であり、１Ｃｙ５：２Ｃｙ３より高く、これは、標的あたりのＣｙ３色素の数を増加させることにより、Ｃｙ３／６００チャネルにおける強度が増加し得ることを示す。図２０のｅにおいて、１Ｃｙ５：３０Ｃｙ３の比率を用いたテロメア染色の強度は大部分、基準線よりに下であり、図２０のｃにおける１Ｃｙ５：１０Ｃｙ３より遥かに低く、これは、標的あたりの色素の数を増加させ過ぎると、非常に緊密に近づくときに色素が互いに消光する密集消光効果に起因して、Ｃｙ３／６００チャネルにおける強度が低下し得ることを示す。
例１５：細胞タイプ解析のためのマルチプレックスタンパク質検出
例１５：細胞タイプ解析のためのマルチプレックスタンパク質検出
【0248】
この例は、異なる細胞タイプを検出するために、強度コーディングをどのように使用して複数のタンパク質バイオマーカをバーコーディングするかを実証する（図１３のａ）。各タンパク質バイオマーカは、この例において１の細胞タイプを表す。この例において使用されるタンパク質標的は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９、汎サイトケラチンである。各タンパク質マーカは別々の細胞タイプを表す。
【0249】
タンパク質のマルチプレックス検出については、我々は、それぞれ４重のタンパク質検出を実現するために、（１）Ｃｙ５およびＣｙ３色素を用いたＮ＝２、Ｍ＝２（標識方式２）、ならびに、（２）Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ５４６、およびＣｙ５．５色素を用いたＮ＝２、Ｍ＝２（標識方式３）を使用し得る。各標識方式のために間接標識およびシグナル増幅が使用される。図１２のｂ～ｃに示されるそのような間接標識については、標的に直接連結する一次プローブ（すなわち標的結合プローブ）は最初に二次プローブに結合し、次に、一次増幅プローブおよび二次増幅プローブに関連する。色素標識イメージングプローブは、対応する二次増幅プローブに結合する。
【0250】
抗体－オリゴコンジュゲートの設計：図１２に示されるように、抗体－オリゴコンジュゲートは、抗体、一次プローブとして機能するオリゴ、および、抗体にオリゴを連結させコンジュゲートを形成するリンカから成る。
【0251】
抗体－オリゴコンジュゲートのための抗体：抗体－オリゴコンジュゲートを作製するために使用される、標的タンパク質に対する一次抗体はベンダに注文された。抗体はコンジュゲーション前に精製されるべきである。
【0252】
抗体－オリゴコンジュゲートのためのリンカの設計：リンカは、コンジュゲーションのための抗体を活性化するときに抗体に追加される化合物またはポリマーであり得る。リンカはまた、コンジュゲーションのためのオリゴを活性化するときにオリゴに追加される化合物またはポリマーであり得る。リンカはまた、オリゴが合成されるときにオリゴの一部であり得る。リンカの長さは柔軟であり得る。この例において、リンカは、抗体にコンジュゲートされるオリゴの一部として合成されるポリＴ（１０Ｔ'）である。
【0253】
抗体－オリゴコンジュゲートのためのバーコーディングオリゴの設計：特異性のために、抗体－オリゴコンジュゲーションのために使用されるオリゴは、研究の生物において見られない配列を含む。抗体の各タイプは、抗体のそのタイプに固有である配列を有するオリゴにコンジュゲートされ、抗体の標的のための強度バーコードとして機能する。オリゴは、抗体と、標的の各種類に固有のオリゴとの間のリンカとしてポリＴ配列（１０Ｔ'）を含む。コンジュゲーションのために、オリゴは、５'末端上にアミン基を有する。
【0254】
強度コーディングおよびシグナル増幅のためのオリゴプローブの設計：
【0255】
標識方式２および３における（増幅を用いた）間接標識についての一次プローブ、二次プローブ、一次増幅プローブ、二次増幅プローブ、およびイメージングプローブのオリゴ配列が、例４と同様の手段で設計され、その結果、それらは、標的種のＲＮＡトランスクリプトームおよびゲノムに対して最小の非特異的結合を有する。
【0256】
標識方式２および３の（増幅を用いた）間接標識において、すべての二次プローブは、（１）バーコーディング一次プローブの固有領域に結合する１の２０ｎｔ一次プローブ結合配列、または、標的結合オリゴ、および、（２）一桁強度コードのための一次プローブ結合配列の一方の末端上の１の２０ｎｔリードアウト配列、または、二桁強度コードのための一次プローブ結合配列の各末端上の１の２０ｎｔリードアウト配列を含む。図１２のｂおよび図１２のｃにおける各一次プローブは、すべての標的について１の二次プローブだけに結合するが、この例において、各一次プローブは、４の標的すべてについて６の二次プローブに結合する。標的を間接的に標識するために、イメージングプローブ（すべて２０ｎｔ）は、二次増幅プローブに結合した。各イメージングプローブは、１の色素だけで標識される。標識方式２における２の桁強度コードを有するＣＤ９およびＣＤ３４について、Ｃｙ５／７００およびＣｙ３／６００チャネルにおける色素を増幅するために非平衡化増幅が使用される。各標的および標識方式のためのプローブの増幅数および色素の選択が、下の表に列挙される。
【表10】
【0257】
上の表において使用されるプローブ設計および強度コードを用いて、標識方式２を使用する強度レベル１は、Ｃｙ３またはＣｙ５チャネルにおいて１２（６×２×１）のＣｙ３またはＣｙ５色素として定義された。標識方式２を使用する強度レベル２は、Ｃｙ３またはＣｙ５チャネルにおいて、９６（６×４×４）のＣｙ３またはＣｙ５色素として定義される。
【0258】
標識方式３における２の桁強度コードを有するＣＤ９およびＣＤ３４について、Ｃｙ５／７００およびＣｙ３／６００チャネルにおける色素を増幅するために平衡化増幅が使用される。各標的および標識方式のためのプローブの増幅数および色素の選択が、下の２の表に列挙される。
【表11】
【0259】
上の表において使用されたプローブ設計および強度コードを用いて、標識方式３を使用する強度レベル１は、Ｃｙ５またはＣｙ３チャネルにおける９６（６×４×４）のＣｙ５．５またはＣｙ３色素として定義された。標識方式３を使用する強度レベル２が、Ｃｙ５またはＣｙ３チャネルにおいて９６のＣｙ５またはＡｌｅｘａ５４６色素として定義された。
【0260】
オリゴプローブの合成：すべてのオリゴセットは、チューブまたはプレートのフォーマットでＩＤＴに注文された。
【0261】
抗体オリゴコンジュゲーション：コンジュゲーションプロセスは、３の主な段階、すなわち、抗体活性化、オリゴ活性化、抗体－オリゴコンジュゲーションから成る。
【0262】
抗体に対するオリゴのコンジュゲーションが抗体の抗原結合活性にどのように影響し得るかに応じて、オリゴは、アミン基、カルボキシル基、スルフヒドリル基へのコンジュゲーション（これに限定されない）などの複数の手段を通じて抗体にコンジュゲートされ得る。オリゴコンジュゲーションが抗体抗原相互作用を阻害しないように、または、それに対して最小の影響を有することを確実にするために、標的タンパク質上の特異的抗原に対する抗体の結合能がテストされる。この例において、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）とアジ化物との間の銅フリークリックケミストリーによって、抗体はオリゴにコンジュゲートされる。
【0263】
抗体活性化：この例において、オリゴは、抗体上のアミン基を通じて抗体にコンジュゲートされる。精製された抗体は、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度に調節された。無水ＤＭＳＯに溶解されたＤＢＣＯ－ＮＨＳエステルが、様々なモル過剰における精製された抗体に追加された。未反応および過剰のＤＢＣＯ－ＮＨＳがゲル濾過カラムによって除去される。
【0264】
オリゴ活性化（アジ化物修飾オリゴを作製する）：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解されるアミン修飾オリゴは、無水物に溶解された過剰な３‐アジドプロピオン酸スルホン酸ＮＨＳエステル（３ＡＡ－ＮＨＳ）と、２５℃で２時間混合された。過剰な３ＡＡ－ＮＨＳは、スピンカラムを使用してゲル濾過によって除去される。
【0265】
抗体－オリゴコンジュゲーション：過剰な活性化アジ化物オリゴは、ＤＢＣＯ抗体ＤＢＣＯ溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）と、微小遠心管において２５℃で１時間混合された。コンジュゲートは、コンジュゲートクリーンアップ試薬（Ａｂｃａｍ）および微小遠心管における遠心分離で精製された。
【0266】
タンパク質染色実験の例：新鮮なヒトの乳がん腫瘍組織スライドは、ベンダに注文され得る。染色のために、セクションが４％ＰＦＡ溶液において３０分間固定され、ＰＢＳで１５分間洗浄された。この段階で、任意選択で、ＰＢＳにおける１％Ｈ２Ｏ２を用いた穏やかな１時間のプリブリーチが適用され得る（ＴＳＡのため）。サンプルは、２％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含むＰＢＳで１時間ブロックされ、３回の緩衝液交換がある。ＤＮＡコンジュゲート一次抗体は、０．２μｇ／ｍｌ断片処理済みサケ精子ＤＮＡ、０．０５％硫酸デキストラン、任意で４ｍＭ ＥＤＴＡが添加されたブロッキング溶液において希釈され、サンプルと共に室温で１時間インキュベートされる。過剰な抗体は、２％ＢＳＡおよび０．１～０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含むＰＢＳを用いて室温で１５分間、３回洗浄し、ＰＢＳを用いて５分間、２回洗浄することによって除去される。結合した抗体は次に、ＰＢＳにおいて５ｍＭ ＢＳ（ＰＥＧ）５を用いて、室温で３０分間にわたって後固定され、その後、ＰＢＳおける１００ｍＭ ＮＨ４Ｃｌにおいて５分間消光され、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を有するＰＢＳを用いて、室温で１５分間洗浄された。二次プローブ、一次アンプリファイア、または二次アンプリファイアとのインキュベーションは、０．２ｍｇ／ｍｌ断片処理済みサケ精子ＤＮＡと共に、２×ＳＳＣにおける２０～３０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ－２０において、３７℃で連続的に１～２時間実行される。プローブは、１００ｎＭの最終濃度においてこのバッファに希釈される。マルチプレックスのために、シグナル増幅の同一の階層におけるすべてのプローブは、同時にインキュベートされる。プローブハイブリダイゼーションの各階層の後に、サンプルは、ＰＢＳにおける５０％ホルムアミドを用いて室温で５分間洗浄され、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を用いて、３７℃で各々１０分間、３回洗浄される。
【0267】
イメージングセットアップ、およびイメージング処理は、例１および２に記載されたものと同様に実行され得る。細胞のセグメンテーションは、ＩｍａｇｅＪを使用して手動で行われ得る。次に、強度比率解析のために、各細胞の染色領域におけるピクセルあたりの平均強度が抽出される。各細胞における未染色の領域は、強度比率解析について除外される。このようにして、各細胞は、７００および６００チャネルにおける染色領域の平均強度に従って強度比率が与えられ得る。次に、関心のあるすべての細胞の２Ｄ強度分布が、ＲＮＡ ＦＩＳＨについての例４と同様にプロットされ得る。参照強度コードマップに基づく割り当て強度コードの同一の手法がここでも使用され得る。
例１６：マイクロアレイを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏマルチプレックスタンパク質検出
例１６：マイクロアレイを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏマルチプレックスタンパク質検出
【0268】
この例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質検出のための高容量強度比率バーコーディングの適用を実証する。異なるタンパク質は、異なる空間位置においてガラススライド上に付着され、マイクロアレイを形式する。
【0269】
ここで、我々は、２の色チャネルおよび２の強度レベルを使用して、マイクロアレイ上で４のタンパク質、すなわちＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９、汎サイトケラチンを検出するためにテストを行った。我々は、例１５における標識方式３についての４×４分岐ＤＮＡ増幅および同一セットのプローブを使用して、シグナルを増幅し、これら４のタンパク質をエンコードする。異なるタンパク質が、強度コーディングされたオリゴプローブに結合するための一次プローブとして機能するタンパク質特異的オリゴとの抗体コンジュゲートによって検出された。４のイメージングプローブが４のタンパク質を検出するために使用された。汎サイトケラチンについてのイメージングプローブ１は、１：０の強度コードとしてＣｙ３色素だけを用いて標識され、ＣＤ４５についてのイメージングプローブ２は、０：２の強度コードとしてＣｙ５色素だけを用いて標識され、ＣＤ９についてのイメージングプローブ３は、１：２の強度コードとして、それぞれ、５'末端におけるＣｙ５および３'末端におけるＣｙ３色素を用いて標識され、ＣＤ３４についてのイメージングプローブ４は、２：１の強度コードとして、それぞれ、５'末端におけるＣｙ５．５色素および３'末端におけるＡｌｅｘａ５４６色素を用いて標識された。ここで、４の強度コードすべての一桁目は、Ｃｙ３／６００チャネルにおける強度レベルを、二桁目は、Ｃｙ５／７００チャネルにおける強度レベルを表す。
【0270】
アレイ調製およびタンパク質染色：これら４のタンパク質のための一次抗体は、空間的に離間するパターンで抗体に良く付着するための表面処理を受けて、ガラススライド上にスポット状に配置された。各スポットは、約１ｍｍのサイズであり、任意の２のスポットは２ｃｍ離間された。各タンパク質は１０のスポットを有した。そのため、４の異なるタンパク質を捕捉するために、合計で４０のスポットが形成された。精製されたタンパク質は、１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳバッファに溶解され、スポットが配置されたスライドを用いて、室温で少なくとも１時間インキュベートされた。次に、コーディングされたオリゴとコンジュゲートされた一次抗体は、スライドを用いて更に１時間インキュベートされ、過剰な抗体は、洗浄バッファを用いて室温で洗浄された。その後、強度コーディングされたプローブ（１００ｎＭ）の複数の階層は、捕捉されたタンパク質と共に、スライドを用いてインキュベートされた。プローブ標識の各階層は、室温で１時間続き、過剰なプローブは、洗浄バッファを用いて洗浄された。最後に、スライドは、２の色チャネル（Ｃｙ５／７００ｎｍチャネル、Ｃｙ３／６００ｎｍチャネル）を有するＰＭＴによってスキャンされた。７００チャネルは、６４０ｎｍレーザによって励起され、７００／７５ｍの吸収フィルタが設置された。６００チャネルは、５６１ｎｍレーザによって励起され、６００／５０ｍの吸収フィルタが設置された。
【0271】
画像解析：個別タンパク質スポットの平均強度が解析され、２Ｄ強度分布マップにプロットされた。次に、同様の強度比率を有するタンパク質スポットが共にクラスタ化された。ＲＮＡ ＦＩＳＨについての例４と同様に、各クラスタは、参照強度コードマップでフィッティングされ、次に、最良の強度コードが割り当てられた。このようにして、タンパク質の検出に成功した。
開示の態様
開示の態様
【0272】
態様１．
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第２の複数のプローブとを備え、プローブの各々は、１または複数の種類の光標識に付着し、（ａ）第１の種類の光標識は第１標的分子に関連し、（ｂ）第２の種類の光標識は第２標的分子に関連し、各標的は、少なくとも２種類の光標識に関連し、第１の複数のプローブは、少なくとも第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、少なくとも第２の種類の光標識に付着し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第２の複数のプローブとを備え、プローブの各々は、１または複数の種類の光標識に付着し、（ａ）第１の種類の光標識は第１標的分子に関連し、（ｂ）第２の種類の光標識は第２標的分子に関連し、各標的は、少なくとも２種類の光標識に関連し、第１の複数のプローブは、少なくとも第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、少なくとも第２の種類の光標識に付着し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
【0273】
態様２．
第１の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第２の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第１標的分子に関連する第１の種類の光標識の数と、第２の種類の光標識の数との比率と、第２標的分子に関連するこの比率とは、少なくとも２、２．３、３．５、５、８．１、１０，２０、５０または１００倍異なる、態様１のサンプル。
第１の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第２の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第１標的分子に関連する第１の種類の光標識の数と、第２の種類の光標識の数との比率と、第２標的分子に関連するこの比率とは、少なくとも２、２．３、３．５、５、８．１、１０，２０、５０または１００倍異なる、態様１のサンプル。
【0274】
態様３．
第１および第２の複数のプローブにおける各プローブは、１種類の光標識だけに関連し、第１標的についての第１の複数のプローブの数は、第２標的についての第２の複数のプローブの数と異なる、態様２のサンプル。
第１および第２の複数のプローブにおける各プローブは、１種類の光標識だけに関連し、第１標的についての第１の複数のプローブの数は、第２標的についての第２の複数のプローブの数と異なる、態様２のサンプル。
【0275】
態様４．
第１および第２の種類の光標識はそれぞれ、同一または部分的に重複する色スペクトルを有するが、第１色チャネルにおいて異なる強度を有し、第１標的は第３の種類の光標識に関連する、態様１および２のサンプル。
第１および第２の種類の光標識はそれぞれ、同一または部分的に重複する色スペクトルを有するが、第１色チャネルにおいて異なる強度を有し、第１標的は第３の種類の光標識に関連する、態様１および２のサンプル。
【0276】
態様５．
第２標的は第４の種類の光標識に関連し、第３および第４の種類の光標識はそれぞれ、同一または部分的に重複する色スペクトルを有するが、第２色チャネルにおいて、異なる強度を有する、態様４のサンプル。
第２標的は第４の種類の光標識に関連し、第３および第４の種類の光標識はそれぞれ、同一または部分的に重複する色スペクトルを有するが、第２色チャネルにおいて、異なる強度を有する、態様４のサンプル。
【0277】
態様６．
第１および第２の種類の光標識は異なる数である、態様４および５のサンプル。
第１および第２の種類の光標識は異なる数である、態様４および５のサンプル。
【0278】
態様７．
第１および第２の複数のプローブは異なる数である、態様６のサンプル。
第１および第２の複数のプローブは異なる数である、態様６のサンプル。
【0279】
態様８．
第３の複数のプローブは、生体サンプルにおける第１標的および第２標的分子の両方に直接的または間接的に結合し、第３の複数のプローブの各々は、第５の種類の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
第３の複数のプローブは、生体サンプルにおける第１標的および第２標的分子の両方に直接的または間接的に結合し、第３の複数のプローブの各々は、第５の種類の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0280】
態様９．
異なる種類の光標識は、同一の標的分子に関連する複数のプローブにおける異なるプローブ付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
異なる種類の光標識は、同一の標的分子に関連する複数のプローブにおける異なるプローブ付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0281】
態様１０．
異なる光標識に関連する異なるプローブは、交互の順序で標的分子に結合する、態様９のサンプル。
異なる光標識に関連する異なるプローブは、交互の順序で標的分子に結合する、態様９のサンプル。
【0282】
態様１１．
標的分子に関連する任意の複数のプローブは、少なくとも２のプローブを含む、前述の態様のいずれかのサンプル。
標的分子に関連する任意の複数のプローブは、少なくとも２のプローブを含む、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0283】
態様１２．
標的分子に関連する第１または第２の複数のプローブは少なくとも１２のプローブを有する、態様１１のサンプル。
標的分子に関連する第１または第２の複数のプローブは少なくとも１２のプローブを有する、態様１１のサンプル。
【0284】
態様１３．
第１または第２標的分子は、少なくとも３の異なる種類の光標識に関連し、少なくとも３の色チャネルによって検出される、前述の態様のいずれかのサンプル。
第１または第２標的分子は、少なくとも３の異なる種類の光標識に関連し、少なくとも３の色チャネルによって検出される、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0285】
態様１４．
複数のプローブにおける各プローブは、２以上の異なる種類の光標識、または、２以上の異なる数の同一の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
複数のプローブにおける各プローブは、２以上の異なる種類の光標識、または、２以上の異なる数の同一の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0286】
態様１５．
少なくとも１の光標識が消光またはシグナル増強分子に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
少なくとも１の光標識が消光またはシグナル増強分子に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0287】
態様１６．
少なくとも１の光標識が、より多くの同一の光標識に、または、第５の種類の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
少なくとも１の光標識が、より多くの同一の光標識に、または、第５の種類の光標識に付着する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0288】
態様１７．
同一の標的に関連する同一の光標識のうち少なくとも２つは、プローブ配列に沿って１０以下のヌクレオチドだけ離間する、前述の態様のいずれかのサンプル。
同一の標的に関連する同一の光標識のうち少なくとも２つは、プローブ配列に沿って１０以下のヌクレオチドだけ離間する、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0289】
態様１８．
光標識に付着した第１または第２の複数のプローブは、一次プローブを通じて標的分子に関連する、態様１から５のサンプル。
光標識に付着した第１または第２の複数のプローブは、一次プローブを通じて標的分子に関連する、態様１から５のサンプル。
【0290】
態様１９．
一次プローブが標的分子に関連した後に、第１または第２の複数のプローブは更に、少なくとも１の階層の仲介プローブに関連する、態様１８のサンプル。
一次プローブが標的分子に関連した後に、第１または第２の複数のプローブは更に、少なくとも１の階層の仲介プローブに関連する、態様１８のサンプル。
【0291】
態様２０．
一次プローブが標的分子に関連した後に、第１または第２の複数のプローブは更に、一次アンプリファイアおよび二次アンプリファイアに関連する、態様１９のサンプル。
一次プローブが標的分子に関連した後に、第１または第２の複数のプローブは更に、一次アンプリファイアおよび二次アンプリファイアに関連する、態様１９のサンプル。
【0292】
態様２１．
第１標的は第１および第２の種類の両方の光標識に関連し、標的上の各一次プローブは、第１および第２の種類の両方の光標識に関連する、態様１８から２０のサンプル。
第１標的は第１および第２の種類の両方の光標識に関連し、標的上の各一次プローブは、第１および第２の種類の両方の光標識に関連する、態様１８から２０のサンプル。
【0293】
態様２２．
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は、等しい数である、態様２１のサンプル。
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は、等しい数である、態様２１のサンプル。
【0294】
態様２３．
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は異なる数である、態様２２のサンプル。
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は異なる数である、態様２２のサンプル。
【0295】
態様２４．
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は、一次プローブの異なる末端（５'または３'末端のいずれか）において標識される、態様２２および２３のサンプル。
同一の一次プローブに関連する第１および第２の種類の光標識は、一次プローブの異なる末端（５'または３'末端のいずれか）において標識される、態様２２および２３のサンプル。
【0296】
態様２５．
第１標的分子は、第１および第２の種類の両方の光標識に関連し、それらは異なる数である、態様１８～２０のサンプル。
第１標的分子は、第１および第２の種類の両方の光標識に関連し、それらは異なる数である、態様１８～２０のサンプル。
【0297】
態様２６．
同一の標的分子を検出する異なる種類の光標識は異なる一次プローブに関連する、態様２５のサンプル。
同一の標的分子を検出する異なる種類の光標識は異なる一次プローブに関連する、態様２５のサンプル。
【0298】
態様２７．
第１の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第１標的分子についての第１光標識の数と、第２標的分子についての第１光標識の数との比率は、少なくとも２、２．５、３、３．３、４、４．２、５、８、８．９、または１０である、態様１８から２７のサンプル。
第１の種類の光標識は、第１標的および第２標的分子の両方に関連し、第１標的分子についての第１光標識の数と、第２標的分子についての第１光標識の数との比率は、少なくとも２、２．５、３、３．３、４、４．２、５、８、８．９、または１０である、態様１８から２７のサンプル。
【0299】
態様２８．
第１または第２の複数のプローブは、ローリングサイクル増幅など、酵素シグナル増幅によって一次プローブに関連する、態様１８および１９のサンプル。
第１または第２の複数のプローブは、ローリングサイクル増幅など、酵素シグナル増幅によって一次プローブに関連する、態様１８および１９のサンプル。
【0300】
態様２９．
プローブは一本鎖オリゴヌクレオチドまたはペプチドである、前述の態様のいずれかのサンプル。
プローブは一本鎖オリゴヌクレオチドまたはペプチドである、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0301】
態様３０．
光標識は蛍光色素、蛍光タンパク質、またはナノ粒子である、前述の態様のいずれかのサンプル。
光標識は蛍光色素、蛍光タンパク質、またはナノ粒子である、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0302】
態様３１．
標的分子は、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ断片、１００ｋｂ以下のＤＮＡ分子、または、１００ｋｂ以下のＤＮＡ断片を含む、前述の態様のいずれかのサンプル。
標的分子は、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ断片、１００ｋｂ以下のＤＮＡ分子、または、１００ｋｂ以下のＤＮＡ断片を含む、前述の態様のいずれかのサンプル。
【0303】
態様３２．
標的分子はタンパク質、脂質、多糖または粒子を含む、態様１から３１のいずれか１のサンプル。
標的分子はタンパク質、脂質、多糖または粒子を含む、態様１から３１のいずれか１のサンプル。
【0304】
態様３３．
標的分子はＤＮＡ改変、ＲＮＡ改変またはタンパク質改変を含む、態様１から３１のいずれか一項のサンプル。
標的分子はＤＮＡ改変、ＲＮＡ改変またはタンパク質改変を含む、態様１から３１のいずれか一項のサンプル。
【0305】
態様３４．
光標識に付着するプローブは、オリゴヌクレオチドまたはペプチドを通じて標的分子に関連する、態様３２および３３のいずれか１のサンプル。
光標識に付着するプローブは、オリゴヌクレオチドまたはペプチドを通じて標的分子に関連する、態様３２および３３のいずれか１のサンプル。
【0306】
態様３５．
標的分子は、細胞、組織に配置される、または、固形スカフォールド上に付着する、前述の態様のいずれかに記載のサンプル。
標的分子は、細胞、組織に配置される、または、固形スカフォールド上に付着する、前述の態様のいずれかに記載のサンプル。
【0307】
態様３６．
ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージまたは混合物であって、各々が第１標的分子に結合できる第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブを備え、第１の複数ののプローブは、少なくとも第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、少なくとも第２の種類の光標識に付着し、各標的は、少なくとも２種類の光標識に関連し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージまたは混合物。
ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージまたは混合物であって、各々が第１標的分子に結合できる第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブを備え、第１の複数ののプローブは、少なくとも第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、少なくとも第２の種類の光標識に付着し、各標的は、少なくとも２種類の光標識に関連し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２または２より多くの色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージまたは混合物。
【0308】
態様３７．
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様３６のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルと混合する段階を備え、異なる種類の標的分子は、異なる組み合わせの光標識に関連し、強度比率を形成するために、各標的は、少なくとも２の色チャネルによって検出され、異なる標的は異なる強度比率によって区別される、方法。
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様３６のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルと混合する段階を備え、異なる種類の標的分子は、異なる組み合わせの光標識に関連し、強度比率を形成するために、各標的は、少なくとも２の色チャネルによって検出され、異なる標的は異なる強度比率によって区別される、方法。
【0309】
態様３８．
標的分子に関連する異なる強度比率は、異なる種類の標的分子の検出を可能にする参照強度コードマップと照合される、態様３７のいずれか１の方法。
標的分子に関連する異なる強度比率は、異なる種類の標的分子の検出を可能にする参照強度コードマップと照合される、態様３７のいずれか１の方法。
【0310】
態様３９．
参照強度コードマップから利用可能な強度比率コードの一部は、プローブを設計するために使用される、態様３８のいずれか１の方法。
参照強度コードマップから利用可能な強度比率コードの一部は、プローブを設計するために使用される、態様３８のいずれか１の方法。
【0311】
態様４０．
検出する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードの分布と比較する段階を含む、態様３８および３９の方法。
検出する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードの分布と比較する段階を含む、態様３８および３９の方法。
【0312】
態様４１．
比較する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードに割り当てる段階を含む、態様４０の方法。
比較する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードに割り当てる段階を含む、態様４０の方法。
【0313】
態様４２．
指示された強度比率が、強度コードマップにおける任意の強度コードから、予め定められたカットオフ値より遠い場合、検出された強度比率が除去される、態様４１の方法。
指示された強度比率が、強度コードマップにおける任意の強度コードから、予め定められたカットオフ値より遠い場合、検出された強度比率が除去される、態様４１の方法。
【0314】
態様４３．
任意の２の標的分子が、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様３７から４２のいずれか１の方法。
任意の２の標的分子が、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様３７から４２のいずれか１の方法。
【0315】
態様４４．
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第２の種類の光標識に付着する第２の複数のプローブとを備え、第１の複数のプローブは、第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、第２の種類の光標識に付着し、異なる標的が、異なる種類の光標識に関連し、第１および第２の種類の光標識は、第１および第２色チャネルにおいて重複する励起または発光スペクトルを有し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第１の複数のプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第２の種類の光標識に付着する第２の複数のプローブとを備え、第１の複数のプローブは、第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、第２の種類の光標識に付着し、異なる標的が、異なる種類の光標識に関連し、第１および第２の種類の光標識は、第１および第２色チャネルにおいて重複する励起または発光スペクトルを有し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
【0316】
態様４５．
各プローブは一本鎖オリゴヌクレオチド、ペプチド、または、オリゴおよびペプチドのハイブリッドである、態様４４のサンプル。
各プローブは一本鎖オリゴヌクレオチド、ペプチド、または、オリゴおよびペプチドのハイブリッドである、態様４４のサンプル。
【0317】
態様４６．
第１標的分子に関連する第１光標識の数は、第２標的分子に関連する第１光標識の数と異なる、態様４４および４５のサンプル。
第１標的分子に関連する第１光標識の数は、第２標的分子に関連する第１光標識の数と異なる、態様４４および４５のサンプル。
【0318】
態様４７．
第１標的についての第１光標識、および、第２標的についての第２光標識は、異なる数の一次プローブに関連する、態様４５および４６のサンプル。
第１標的についての第１光標識、および、第２標的についての第２光標識は、異なる数の一次プローブに関連する、態様４５および４６のサンプル。
【0319】
態様４８．
各複数のプローブは、少なくとも２のプローブを含む、態様４５から４７のサンプル。
各複数のプローブは、少なくとも２のプローブを含む、態様４５から４７のサンプル。
【0320】
態様４９．
各複数のプローブは、少なくとも１２のプローブを含む、態様４８のサンプル。
各複数のプローブは、少なくとも１２のプローブを含む、態様４８のサンプル。
【0321】
態様５０．
任意の２の標的分子は、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様４４から４９のいずれか１のサンプル。
任意の２の標的分子は、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様４４から４９のいずれか１のサンプル。
【0322】
態様５１．
第２の種類の光標識に付着された第３の複数のプローブは、生体サンプルにおける第３の標的分子に直接的または間接的に結合され、第３光標識は第３標的に関連し、第３光標識は、第１および第２色チャネルの両方において第１光標識および第２光標識と重複するスペクトラムを有する、態様４４から５０のいずれか１のサンプル。
第２の種類の光標識に付着された第３の複数のプローブは、生体サンプルにおける第３の標的分子に直接的または間接的に結合され、第３光標識は第３標的に関連し、第３光標識は、第１および第２色チャネルの両方において第１光標識および第２光標識と重複するスペクトラムを有する、態様４４から５０のいずれか１のサンプル。
【0323】
態様５２．
第３の標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、態様５１のいずれか１のサンプル。
第３の標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、態様５１のいずれか１のサンプル。
【0324】
態様５３．
ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または、混合物であって、各々が第１標的分子に結合できる第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブとを備え、第１の複数のプローブは、第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、第２の種類の光標識に付着し、異なる標的が、異なる種類の光標識に関連し、第１および第２の種類の光標識は、第１および第２色チャネルにおける重複する励起または発光スペクトルを有し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または、混合物。
ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または、混合物であって、各々が第１標的分子に結合できる第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブおよび第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数のプローブ、または、第２の複数のプローブおよび第２の複数のプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする１または複数の仲介プローブとを備え、第１の複数のプローブは、第１の種類の光標識に付着し、第２の複数のプローブは、第２の種類の光標識に付着し、異なる標的が、異なる種類の光標識に関連し、第１および第２の種類の光標識は、第１および第２色チャネルにおける重複する励起または発光スペクトルを有し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、２の色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または、混合物。
【0325】
態様５４．
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様５３のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルと混合する段階であって、異なる種類の標的分子が異なる光標識に関連し、強度比率を形成するために、各標的は、少なくとも２の色チャネルによって検出され、異なる標的は異なる強度比率によって区別される、段階を備える方法。
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様５３のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルと混合する段階であって、異なる種類の標的分子が異なる光標識に関連し、強度比率を形成するために、各標的は、少なくとも２の色チャネルによって検出され、異なる標的は異なる強度比率によって区別される、段階を備える方法。
【0326】
態様５５．
異なる種類の標的分子の検出を可能にするために、標的分子に関連する異なる強度比率は、参照強度コードマップと照合される、態様５４のいずれか１の方法。
異なる種類の標的分子の検出を可能にするために、標的分子に関連する異なる強度比率は、参照強度コードマップと照合される、態様５４のいずれか１の方法。
【0327】
態様５６．
参照強度コードマップから利用可能な強度比率コードの一部は、プローブを設計するために使用される、態様５５のいずれか１の方法。
参照強度コードマップから利用可能な強度比率コードの一部は、プローブを設計するために使用される、態様５５のいずれか１の方法。
【0328】
態様５７．
検出する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードの分布と比較する段階を含む態様５４から５６のいずれか１の方法。
検出する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードの分布と比較する段階を含む態様５４から５６のいずれか１の方法。
【0329】
態様５８．
比較する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードに割り当てる段階を含む、態様５７の方法。
比較する段階は、検出された強度比率を、参照強度コードマップにおける強度コードに割り当てる段階を含む、態様５７の方法。
【0330】
態様５９．
指示された強度比率が、強度コードマップにおける任意の強度コードから、予め定められたカットオフ値より遠い場合、検出された強度比率は除去され、態様５８の方法。
指示された強度比率が、強度コードマップにおける任意の強度コードから、予め定められたカットオフ値より遠い場合、検出された強度比率は除去され、態様５８の方法。
【0331】
態様６０．
任意の２の標的分子は、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様５４から５９のいずれか１の方法。
任意の２の標的分子は、少なくとも２５０ｎｍだけ空間的に離間する、態様５４から５９のいずれか１の方法。
【0332】
態様６１．
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第１の複数のイメージングプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第２の複数のイメージングプローブとを備え、第１の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数と、第２の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数との比率は、２より多く、第１標的および第２標的分子は、励起時に、第１色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
検査のために調製されるサンプルであって、生体サンプルにおける第１標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第１の複数のイメージングプローブと、生体サンプルにおける第２標的分子に直接的または間接的に結合する第１の種類の光標識に付着する第２の複数のイメージングプローブとを備え、第１の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数と、第２の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数との比率は、２より多く、第１標的および第２標的分子は、励起時に、第１色チャネルからの異なる比率の信号強度に関連する、サンプル。
【0333】
態様６２．
第１の複数のイメージングプローブは更に、第１の複数の一次プローブに関連し、第１の複数の一次プローブは、第１標的分子に関連し、一次プローブの各プローブは、直接的または間接的に、１より多くの光標識に関連する、態様６１のサンプル。
第１の複数のイメージングプローブは更に、第１の複数の一次プローブに関連し、第１の複数の一次プローブは、第１標的分子に関連し、一次プローブの各プローブは、直接的または間接的に、１より多くの光標識に関連する、態様６１のサンプル。
【0334】
態様６３．
第１標的および第２標的分子は、少なくとも２０ｎｍ、１００ｎｍ、または２５０ｎｍだけ離間する、態様６１および６２のサンプル。
第１標的および第２標的分子は、少なくとも２０ｎｍ、１００ｎｍ、または２５０ｎｍだけ離間する、態様６１および６２のサンプル。
【0335】
態様６４．
第１の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数と、第２の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数との比率は、少なくとも３、４または５である、態様６１のサンプル。
第１の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数と、第２の複数のイメージングプローブに関連する光標識の数との比率は、少なくとも３、４または５である、態様６１のサンプル。
【0336】
態様６５．
各々が第１標的分子に結合し得る第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする第１の複数のプローブおよび１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数ののプローブ、または、第２の複数ののプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする第２の複数のプローブおよび１または複数の仲介プローブとを備え、第１および第２の複数のプローブは両方とも異なる数の第１の種類の光標識に付着し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、同一の色チャネルからの異なる信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または混合物。
各々が第１標的分子に結合し得る第１の複数のプローブ、または、第１の複数のプローブが第１標的分子に間接的に結合することを可能にする第１の複数のプローブおよび１または複数の仲介プローブと、各々が第２標的分子に結合できる第２の複数ののプローブ、または、第２の複数ののプローブが第２標的分子に間接的に結合することを可能にする第２の複数のプローブおよび１または複数の仲介プローブとを備え、第１および第２の複数のプローブは両方とも異なる数の第１の種類の光標識に付着し、第１標的および第２標的分子は、励起時に、同一の色チャネルからの異なる信号強度に関連する、ハイブリダイゼーションのためのプローブのキット、パッケージ、または混合物。
【0337】
態様６６．
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様６５のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルに混合する段階であって、異なる種類の標的分子は、異なる数の同一の種類の光標識に関連し、任意の２の標的分子は、少なくとも２０ｎｍだけ空間的に離間し、異なる種類の標的分子の検出を可能にするために、標的分子に関連する異なる強度は、参照強度コードマップと照合される、段階を備える方法。
サンプルにおける２以上の標的分子を検出する方法であって、プローブが標的分子に結合することを可能にする条件下で、態様６５のプローブを、第１標的および第２標的分子を含むサンプルに混合する段階であって、異なる種類の標的分子は、異なる数の同一の種類の光標識に関連し、任意の２の標的分子は、少なくとも２０ｎｍだけ空間的に離間し、異なる種類の標的分子の検出を可能にするために、標的分子に関連する異なる強度は、参照強度コードマップと照合される、段階を備える方法。
【0338】
別の定義がされている場合を除き、明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同一の意味を有する。
【0339】
本明細書に例として記載される発明は、明細書に具体的に開示されない任意の要素もしくは複数の要素、制限もしくは複数の制限無しで好適に実施され得る。したがって、例えば、「含む」、「備える」、「有する」などの用語は、限定なしで拡大的に読まれるべきである。加えて、本明細書において採用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および発現の使用には、示され記載される特徴またはその一部の任意の同等のものを排除する意図はなく、主張される発明の範囲内において様々な修正が可能であると認識される。
【0340】
したがって、本発明は、好適な実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されるが、開示される本明細書において具現化される発明の修正、改善、および変形が当業者によって行われてよく、そのような修正、改善、および変形は、本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。ここで提供される材料、方法および例は、好適な実施形態を表し、例示的であり、発明の範囲に対する限定の意図はない。
【0341】
本願発明は、本明細書において幅広く、および一般的に説明されてきた。包括的な開示内に属する、より狭い分類および下位概念のグループ分けのそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、除去された材料が本明細書において具体的に言及されているかどうかにかかわらず、種類からの任意の主題を除去する但し書きまたは消極的な限定を有する発明の一般的な説明を含む。
【0342】
加えて、発明の特徴または態様が、マーカッシュグループの観点でも記載されている場合、当業者は、発明がそれによって、マーカッシュグループの任意の個別のメンバ、または、メンバのサブグループの観点で記載されていることを認識する。
【0343】
本明細書において言及される、すべての公報、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照によって個々に組み込まれる場合と同一の程度で、参照によってその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が優先される。
【0344】
本開示は、上の実施形態と併せて説明されたが、上記の説明および例は、例示を意図としたものであり、本開示の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本開示の範囲における他の態様、特長、および修正は、本開示に関連する当業者にとって明らかであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】