▶ クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフトの特許一覧
特表2022-538836がんを治療するためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞及びＮＫ細胞阻害剤の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-06
(54)【発明の名称】がんを治療するためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞及びＮＫ細胞阻害剤の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/17 20150101AFI20220830BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220830BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220830BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220830BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/675 20060101ALI20220830BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20220830BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220830BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220830BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20220830BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20220830BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220830BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220830BHJP
C07K 16/30 20060101ALN20220830BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20220830BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220830BHJP
【ＦＩ】
A61K35/17 Z
A61P35/00
A61K45/00
A61K39/395 N
A61P43/00 121
A61K31/675
A61K31/7076
A61K48/00
C12N5/10 ZNA
C07K19/00
C07K14/725
C12N15/12
C12N15/13
C07K16/30
C12N15/62 Z
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576680
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(85)【翻訳文提出日】2022-02-21
(86)【国際出願番号】 IB2020056085
(87)【国際公開番号】W WO2020261219
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/867,764
(32)【優先日】2019-06-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/951,732
(32)【優先日】2019-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518370079
【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン アレクサンダー テレット
(72)【発明者】
【氏名】ローレンス クレイン
(72)【発明者】
【氏名】エベリナ モラワ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE03
4C085GG02
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA35
4C086EA18
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB43
4C087BB65
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
対象における臨床転帰を改善するための方法であって、治療を必要とする対象に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞阻害剤（例えばダラツムマブ）を発現する遺伝子改変免疫細胞（例えばＴ細胞）の集団を投与することを含む、方法。遺伝子改変免疫細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、又はその両方を含み得る。本開示は、本方法で使用するための組成物も特徴とする。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に、有効量の改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を投与することを含み、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、前記対象は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を受けていたか又は受けており、それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項2】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に有効量のＮＫ細胞阻害剤を投与することを含み、前記対象は、有効量の改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を受けていたか又は受けており、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、それによって前記対象におけるＮＫ細胞の活性を減少させ、それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項3】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に有効量の：（ａ）有効量のＮＫ細胞阻害剤と、
（ｂ）有効量の改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団と、を投与することを含み、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項4】
前記改善された臨床転帰は、（ｉ）前記対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の減少、
（ｉｉ）前記対象における前記ＣＡＲ－Ｔ療法に対する臨床応答の増加であって、任意選択的に、前記ＣＡＲ－Ｔ療法のみと比較して、又は前記ＮＫ細胞阻害剤のみを含む療法と比較して増加する、増加、
（ｉｉｉ）前記対象における前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率の増加、及び
（ｉｖ）前記対象における前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解の低減であって、任意選択的に、前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解は、前記ＮＫ細胞阻害剤なしで前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を受けている対象と比較して、前記対象において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する、低減のうちの１つ以上を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
（ｉｉ）において、前記臨床応答の増加は加法的又は相乗的である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記対象はがん患者であり、前記改善された臨床転帰は、（ｉ）前記対象における腫瘍サイズ又は腫瘍細胞数の減少、及び
（ｉｉ）前記対象における抗腫瘍応答の増加のうちの１つ以上を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞による前記ＭＨＣクラスＩの発現が阻害される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、
（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、及び
（ｉｉｉ）前記ＣＡＲをコードする核酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＣＡＲは、腫瘍抗原に結合する抗原結合性フラグメントを含む外部ドメインを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞の数を減少させるか、前記ＮＫ細胞の活性を阻害するか、又はその両方を行う、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、前記ＮＫ細胞の数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、アポトーシス、又はこれらの任意の組み合わせによって前記ＮＫ細胞の数を減少させる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、小分子、モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗体は、ダラツムマブ、ＳＡＲ６５０９８４、若しくはＭＯＲ２０２、又はこれらの抗原結合性フラグメントである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記抗体は、ダラツムマブと同じエピトープに結合し、及び／又はＣＤ３８への結合に関してダラツムマブと競合する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記抗体は、ダラツムマブと同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記抗体は、ダラツムマブと同じ重鎖可変領域及び同じ軽鎖可変領域を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、内因性Ｔ細胞の数を有意に減少させない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＮＫ阻害剤は、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を活性化しない、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の投与と同時に投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、前記ＮＫ細胞阻害剤の投与よりも前に投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の投与よりも前に投与される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記方法は、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を投与する前の前条件付けレジメンを更に含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記前条件付けレジメンは、リンパ球枯渇レジメンを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、前記リンパ球枯渇レジメンから少なくとも４８時間後に投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、前記リンパ球枯渇レジメンから少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも６日後、又は少なくとも７日後に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、前記リンパ球枯渇レジメン後７日以内に投与される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項33】
前記リンパ球枯渇レジメンは、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、又は少なくとも４日間投与される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、前記リンパ球枯渇レジメン後４８時間～７日で投与され、前記リンパ球枯渇レジメンは、２～３日間投与される、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記対象に、前記ＮＫ細胞阻害剤の後続用量を投与することを更に含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＮＫ細胞阻害剤の前記後続用量は、前記対象におけるＮＫ細胞数が、前記ＮＫ細胞阻害剤を投与する前のＮＫ細胞数の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％まで回復した時に、前記対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１回以上の静脈注入によって投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、単回の静脈注入によって投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、２回以上の静脈注入によって投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、１回以上の静脈注入によって投与される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、１～２４ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるダラツムマブである、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、１６ｍｇ／ｋｇの単回用量注入として投与されるダラツムマブである、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項43】
前記ＮＫ細胞阻害剤は、８ｍｇ／ｋｇの分割用量注入として投与されるダラツムマブである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記分割用量は連続日で投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記リンパ球枯渇レジメンは、少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含む、請求項２９～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記少なくとも１つの化学療法剤は、シクロホスファミド、フルダラビン、又はこれらの組み合わせである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に、改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を投与することを含み、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含み、前記対象は、有効量の抗ＣＤ３８抗体を受けていたか又は受けており、それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項48】
対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に有効量の抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み、前記対象は、改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けていたか又は受けており、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含み、それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項49】
対象における臨床転帰を改善するための方法であって、前記対象に、（ａ）有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団であって、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含む、有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団と、
（ｂ）有効量の抗ＣＤ３８モノクローナル抗体と、を投与することを含み、
それによって前記対象における臨床転帰を改善する、方法。
【請求項50】
前記改善された臨床転帰は、（ｉ）前記対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の減少、
（ｉｉ）前記対象における前記ＣＡＲ－Ｔ療法に対する臨床応答の増加であって、任意選択的に、前記ＣＡＲ－Ｔ療法のみと比較してか、或いは前記ＮＫ細胞阻害剤のみを含む療法と比較して増加する、増加、
（ｉｉｉ）前記対象における前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率の増加、及び
（ｉｖ）前記対象における前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解の低減であって、任意選択的に、前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解は、前記ＮＫ細胞阻害剤なしで前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を受けている対象と比較して、前記対象において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少する、低減のうちの１つ以上を含む、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
（ｉｉ）において、前記臨床応答の増加は加法的又は相乗的である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記対象はがん患者であり、前記改善された臨床転帰は、（ｉ）前記対象における腫瘍サイズ又は腫瘍細胞数の減少、及び
（ｉｉ）前記対象における抗腫瘍応答の増加のうちの１つ以上を含む、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＢＣＭＡ、又はＣＤ７０に結合する抗原結合性フラグメントを含む外部ドメインを含む、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記抗原結合性フラグメントはＢＣＭＡに結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性フラグメントは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記抗ＢＣＭＡ抗原結合性フラグメントは、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗原結合性フラグメントである、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項57】
前記抗ＣＤ３８モノクローナル抗体は、ダラツムマブ、又はその抗原結合性フラグメントである、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
静脈注入で投与されるフルダラビンとシクロホスファミドとの組み合わせを含むリンパ球枯渇レジメンの投与を更に含む、請求項４７～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記対象は、前記リンパ球枯渇療法から少なくとも４８時間後であるが７日以内に、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する約１×１０7～３×１０8の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量を投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基対の挿入、欠失、及び／又は置換を含む、請求項４７～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の前記破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、非修飾Ｔ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子中に配列番号２６のヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、前記細胞の集団の０．５％未満が検出可能なレベルのＴＣＲを発現する、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記ＣＡＲをコードする前記核酸は、前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の内部に位置する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
がんの治療のために、有効量のＮＫ細胞阻害剤と組み合わせたＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための改変ヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、任意選択的に、前記改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞は、請求項１～３、７～１３、４７～４９、５３～５６、若しくは６０～６４のいずれか一項に記載されるとおりであり、及び／又は、任意選択的に、前記ＮＫ細胞阻害剤は、請求項１４～２４、若しくは５７のいずれか一項に記載されるとおりである、組成物。
【請求項66】
がんを治療するためにＣＡＲ Ｔ細胞療法を必要とする対象におけるがんを治療するためにＣＡＲ Ｔ細胞療法における請求項６５に記載の組成物の使用であって、第１の薬剤は、前記改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団を含み、前記第１の薬剤は、ＮＫ細胞阻害剤及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む第２の薬剤と組み合わせて投与される、使用。
【請求項67】
請求項６５に記載の組成物を含む第１の薬剤と、前記組成物を、請求項６５に記載のＮＫ細胞阻害剤を含む組成物を含む第２の薬剤及び任意選択的な薬学的に許容される担体と組み合わせてそれを必要とする対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット。
【請求項68】
請求項６５に記載の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、請求項６５に記載のＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、前記第１の組成物を、前記第２の組成物と組み合わせてそれを必要とする対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット。
【請求項69】
ＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための請求項６５に記載の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、請求項６５に記載のＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、前記第１の組成物を、前記第２の組成物と組み合わせてがんの治療のために対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２７日出願の米国仮特許出願第６２／８６７，７６４号明細書、及び２０１９年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／９５１，７３２号明細書の出願日の利益を主張する。各先行出願の全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年６月２７日出願の米国仮特許出願第６２／８６７，７６４号明細書、及び２０１９年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６２／９５１，７３２号明細書の出願日の利益を主張する。各先行出願の全容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ヒト悪性腫瘍を治療するために用いられる養子Ｔ細胞療法である。ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の長期寛解及び小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む驚異的な臨床的効果をもたらしてきたが、認可された生成物は自己由来であり、患者特異的な細胞の回収及び製造を必要とする。このため、一部の患者は治療を待つ間に疾患の進行又は死を経験している。破壊されたＭＨＣ－１複合体を含む同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、自己由来ＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する魅力的な既製（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）の選択肢を提示する。しかしながら、同種異系Ｔ細胞中の破壊されたＭＨＣクラスＩのために、ＣＡＲ Ｔ細胞は、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が媒介する免疫応答により、宿主免疫系による消失を受けやすくなる。したがって、改善されたＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は、少なくとも部分的には、代表的なＮＫ細胞阻害剤である抗ＣＤ３８抗体（ダラツムマブ）が、インビトロ及びインビボの両方でＮＫ細胞を成功裏に枯渇させたが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変Ｔ細胞の数を含むＴ細胞数には影響を及ぼさず、また、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化しなかったという、予想外の発見に基づく。更に、予想外にも、ダラツムマブの前処理により、ＮＫ細胞媒介性ＣＡＲ Ｔ細胞溶解が有意に減少し（例えば約５０％）、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞の生存度及び数が維持されることが見出された。更に、ダラツムマブとＣＡＲ－Ｔ細胞との併用療法は、ＮＫ細胞の存在下であっても、異種移植マウスモデルにおいて全身腫瘍組織量を減少させ、生存率を延長する上で相乗効果を示した。
【0004】
したがって、本開示の一態様は、臨床転帰を改善するための併用療法を特徴とし、併用療法は、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（「ＣＡＲ」及び「ＣＡＲ Ｔ細胞」）及びＮＫ細胞阻害剤（例えば、ダラツムマブ又はその機能的バリアントなどの抗ＣＤ３８抗体）を伴う。
【0005】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、対象に、有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を投与すること、を含み、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、対象は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を受けていたか又は受けており、それによって、対象における臨床転帰を改善する方法が本明細書で提供される。
【0006】
いくつかの例では、対象における臨床転帰を改善するための方法は、対象に、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を投与すること、を含み、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含み、対象は、有効量の抗ＣＤ３８抗体を受けていたか又は受けており、それによって、対象における臨床転帰を改善する。
【0007】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、対象に有効量のＮＫ細胞阻害剤を投与すること、を含み、対象は、有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を受けていたか又は受けており、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、それによって、対象におけるＮＫ細胞の活性を減少させ、それによって、対象における臨床転帰を改善する方法が本明細書で提供される。
【0008】
いくつかの例では、対象における臨床転帰を改善するための方法は、対象に有効量の抗ＣＤ３８抗体を投与することを含み、対象は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けていたか又は受けており、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含み、それによって、対象における臨床転帰を改善する。
【0009】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床転帰を改善するための方法であって、対象に、有効量の：（ａ）有効量のＮＫ細胞阻害剤と、（ｂ）有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団と、を投与すること含み、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＭＨＣクラスＩを含み、それによって、対象における臨床転帰を改善する、方法が本明細書で提供される。
【0010】
いくつかの例では、対象における臨床転帰を改善するための方法であって、対象に、（ａ）有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団であって、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含む、有効量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団と、（ｂ）有効量の抗ＣＤ３８モノクローナル抗体と、を投与することを含み、それによって、対象における臨床転帰を改善する、方法。
【0011】
本明細書に開示される方法のいずれにおいては、改善された臨床転帰は、（ｉ）対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の低下、（ｉｉ）対象におけるＣＡＲ－Ｔ療法に対する臨床応答の増加、（ｉｉｉ）対象における改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率の増加、及び（ｉｖ）対象における改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解の減少のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、対象はがん患者であり、改善された臨床転帰は、（ｉ）対象における腫瘍サイズ又は腫瘍細胞数の減少、及び（ｉｉ）対象における抗腫瘍応答の増加のうちの１つ以上を含む。
【0012】
いくつかの例では、対象におけるＣＡＲ－Ｔ療法に対する臨床応答（例えば抗腫瘍応答）は、ＣＡＲ－Ｔ療法のみと比較して増加し得る。或いは、対象におけるＣＡＲ－Ｔ療法に対する臨床応答は、ＮＫ細胞阻害剤のみを含む療法と比較して増加し得る。更に他の例では、臨床応答の増加は加法的であり得る。或いは、臨床応答の増加は相乗的であり得る。
【0013】
いくつかの例では、改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解は、ＮＫ細胞阻害剤なしで改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を受けている対象と比較して、対象において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少し得る。
【0014】
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＭＨＣクラスＩの発現は阻害される。いくつかの場合では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を含み得る。或いは、又は加えて、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、破壊されたＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子を含み得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、（ｉ）破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、（ｉｉ）破壊されたＢ２Ｍ遺伝子（例えば、本明細書に記載されるものとして）、及び（ｉｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸を含む。例えば、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基対の挿入、欠失、及び／又は置換を含み得る。特定の例では、改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の破壊されたＢ２Ｍ遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号１４の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み得る。或いは、又は加えて、改変ヒトＴ細胞は、非修飾Ｔ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子中に配列番号２９のヌクレオチド配列の欠失を含み得る。いくつかの場合では、ＣＡＲをコードする核酸は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子の内部に位置し得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＴ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し得る。或いは、又は加えて、細胞の集団の０．５％未満が検出可能なレベルのＴＣＲを発現する。更に、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現し得ない。
【0017】
いくつかの例では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍抗原に結合する抗原結合性フラグメントを含む外部ドメインを含むＣＡＲを発現する。例示的な腫瘍抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、及びＢＣＭＡが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの例では、腫瘍抗原はＣＤ１９であり、ＣＡＲにおける抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントは抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの場合では、抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントはヒト又はヒト化抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントである。いくつかの例では、腫瘍抗原はＢＣＭＡであり、ＣＡＲにおける抗ＢＣＭＡ抗原結合性フラグメントは抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの場合では、抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントはヒト又はヒト化抗ＢＣＭＡ抗原結合性フラグメントである。いくつかの例では、腫瘍抗原はＣＤ７０であり、ＣＡＲにおける抗ＣＤ７０抗原結合性フラグメントは抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの場合では、抗ＣＤ７０抗原結合性フラグメントはヒト又はヒト化抗ＣＤ７０抗原結合性フラグメントである。いくつかの例では、腫瘍抗原はＣＤ３３であり、ＣＡＲにおける抗ＣＤ３３抗原結合性フラグメントは抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの場合では、抗ＣＤ３３抗原結合性フラグメントはヒト又はヒト化抗ＣＤ３３抗原結合性フラグメントである。
【0018】
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞の数を減少させるか、ＮＫ細胞の活性を阻害するか、又はその両方を行い得る。いくつかの例では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞の数を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少させ得る。理論に束縛されるものではないが、ＮＫ細胞阻害剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、アポトーシス、又はこれらの任意の組み合わせによってＮＫ細胞の数を減少させる。
【0019】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、内因性Ｔ細胞の数を有意に減少させない。或いは、又は加えて、ＮＫ阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を有意に活性化しない。
【0020】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、小分子、モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体であり得る。例えば、ＮＫ細胞阻害剤は、ダラツムマブ、ＳＡＲ６５０９８４、若しくはＭＯＲ２０２、又はこれらの抗原結合性フラグメントであり得る。いくつかの場合では、ＮＫ細胞阻害剤は、ダラツムマブと同じエピトープに結合し、及び／又はＣＤ３８への結合に関してダラツムマブと競合する抗体である。特定の例では、抗体は、ダラツムマブと同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域を含み得る。例えば、抗体は、ダラツムマブと同じ重鎖可変領域及び同じ軽鎖可変領域を含み得る。
【0021】
本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の投与と同時に投与され得る。或いは、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ＮＫ細胞阻害剤の投与よりも前に投与される。その他の例では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の投与よりも前に投与される。
【0022】
本明細書に開示される方法のいずれも、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を投与する前の前条件付けレジメンを更に含み得る。こうした前条件付けレジメンは、リンパ球枯渇レジメンを含む。いくつかの例では、リンパ球枯渇レジメンは、少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含み得る。例としては、シクロホスファミド、フルダラビン、又はこれらの組み合わせが挙げられる。特定の例では、リンパ球枯渇レジメンは、静脈注入で投与されるフルダラビンとシクロホスファミドとの組み合わせを含み得る。
【0023】
いくつかの場合では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、リンパ球枯渇レジメンから少なくとも４８時間後に投与され得る。いくつかの例では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、リンパ球枯渇レジメンから少なくとも２日後、少なくとも３日後（例えば少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも６日後、又は少なくとも７日後）に投与され得る。いくつかの例では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、リンパ球枯渇レジメン後７日以内に投与され得る。
【0024】
いくつかの例では、リンパ球枯渇レジメンは、少なくとも１日間（例えば、少なくとも２日間、少なくとも３日間、又は少なくとも４日間）投与され得る。特定の例では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、リンパ球枯渇レジメン後４８時間～７日後で投与されてもよく、リンパ球枯渇レジメンは、２～３日間投与されてもよい。
【0025】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、１回以上の静脈注入によって投与され得る。いくつかの例では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、単回の静脈注入によって投与される。或いは、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、２回以上の静脈注入によって投与される。いくつかの例では、単一の容器が、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の用量を含む。他の例では、２つ以上の容器が、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団の用量を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、１回以上の静脈注入によって投与され得る。いくつかの例では、ＮＫ細胞阻害剤は、１～２４ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得るダラツムマブである。特定の例では、ＮＫ細胞阻害剤は、１６ｍｇ／ｋｇの単回用量注入として投与されるダラツムマブである。更なる例では、ＮＫ細胞阻害剤は、８ｍｇ／ｋｇの分割用量注入として投与されるダラツムマブである。分割用量は連続日で投与される。
【0027】
いくつかの場合では、本明細書に開示される方法のいずれも、対象にＮＫ細胞阻害剤の後続用量を投与することを含み得る。いくつかの例では、ＮＫ細胞阻害剤の後続用量は、対象におけるＮＫ細胞数が、ＮＫ細胞阻害剤を投与する前のＮＫ細胞数の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％まで回復した時に、対象に投与される。
【0028】
一例では、対象は、リンパ球枯渇療法から少なくとも４８時間後であるが７日以内に、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する約１×１０7～３×１０8の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量を投与される。
【0029】
更に、本開示は、がんを治療するために、これも本明細書に開示される有効量のＮＫ細胞阻害剤と組み合わせたＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための、本明細書に開示される改変ヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。本開示はまた、がんを治療するためにＣＡＲ Ｔ細胞療法を必要とする対象におけるがんを治療するためにＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための第１の薬剤を製造するための、本明細書に開示されるものとしての改変ヒトキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を含む組成物の使用を提供する。第１の薬剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団を含み、第１の薬剤は、ＮＫ細胞阻害剤及び任意選択的に薬学的に許容される担体を含む第２の薬剤と組み合わせて投与される。
【0030】
（ａ）本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む組成物を含む第１の薬剤と、組成物を、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を含む組成物を含む第２の薬剤及び任意選択的な薬学的に許容される担体と組み合わせてそれを必要とする対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット、
（ｂ）本明細書に開示される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、第１の組成物を、第２の組成物と組み合わせてそれを必要とする対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット、並びに
（ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための本明細書に開示される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、第１の組成物を、第２の組成物と組み合わせてがんの治療のために対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキットも、本開示の範囲内である。
（ｂ）本明細書に開示される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、第１の組成物を、第２の組成物と組み合わせてそれを必要とする対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキット、並びに
（ｃ）ＣＡＲ Ｔ細胞療法に使用するための本明細書に開示される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む第１の組成物と、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を含む第２の組成物と、第１の組成物を、第２の組成物と組み合わせてがんの治療のために対象に投与するための指示を含む添付文書と、を含むキットも、本開示の範囲内である。
【0031】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明に記載する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面、及びいくつかの実施形態の詳細な説明、並びに添付の特許請求の範囲からも明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0032】
下記の図面は本明細書の一部を形成し、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってより良好に理解され得る本開示の特定の態様を更に示すために含まれる。
【0033】
【図1A】ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットを提供する。図１Ａは、フローサイトメトリによって測定される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｂは、フローサイトメトリによって測定される抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｃは、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照染色細胞を用いてＣＤ３８＋細胞を測定するためのゲートを設定したことを示すフローサイトメトリを提供する。
【図1B】ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットを提供する。図１Ａは、フローサイトメトリによって測定される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｂは、フローサイトメトリによって測定される抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｃは、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照染色細胞を用いてＣＤ３８＋細胞を測定するためのゲートを設定したことを示すフローサイトメトリを提供する。
【図1C】ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットを提供する。図１Ａは、フローサイトメトリによって測定される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｂは、フローサイトメトリによって測定される抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ３８発現を示す。図１Ｃは、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照染色細胞を用いてＣＤ３８＋細胞を測定するためのゲートを設定したことを示すフローサイトメトリを提供する。
【図2A-2B】健康なドナー（ドナー３４６９）から回収し、培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図２Ａは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｂは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｃは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｄは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図2C-2D】健康なドナー（ドナー３４６９）から回収し、培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図２Ａは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｂは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｃは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図２Ｄは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図3A-3B】健康なドナー（ドナー３３８３）から回収し、培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図３Ａは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｂは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｃは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｄは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図3C-3D】健康なドナー（ドナー３３８３）から回収し、培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図３Ａは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｂは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｃは、培地のみで培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図３Ｄは、１０％の補体を追加した培地で培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図4A-4B】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかでの７２時間のインビトロ培養後に健康なドナー（ドナー３４６９）から回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図４Ａは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｂは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｃは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｄは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図4C-4D】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかでの７２時間のインビトロ培養後に健康なドナー（ドナー３４６９）から回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図４Ａは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｂは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｃは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図４Ｄは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図5A-5B】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかでの７２時間のインビトロ培養後に健康なドナー（ドナー３３８３）から回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図５Ａは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｂは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｃは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｄは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図5C-5D】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかでの７２時間のインビトロ培養後に健康なドナー（ドナー３３８３）から回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）上でのＣＤ３８発現を示すフローサイトメトリプロットである。図５Ａは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｂは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＴ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｃは、培地のみで７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。図５Ｄは、１０％の補体を追加した培地で７２時間培養したＰＢＭＣ由来のＮＫ細胞を発現するＣＤ３８の割合を示す。
【図6A】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかで培養してから９６時間後に健康なドナーから回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）に対するダラツムマブ（Ｄａｒａ）の効果を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。一部の細胞は、対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で処理した。図６Ａは、これらの処理後のＮＫ細胞の頻度を示す。図６Ｂは、これらの処理後のＮＫ細胞の数を示す。図６Ｃは、これらの処理後のＴ細胞の頻度を示す。図６Ｄは、これらの処理後のＴ細胞の数を示す。
【図6B】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかで培養してから９６時間後に健康なドナーから回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）に対するダラツムマブ（Ｄａｒａ）の効果を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。一部の細胞は、対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で処理した。図６Ａは、これらの処理後のＮＫ細胞の頻度を示す。図６Ｂは、これらの処理後のＮＫ細胞の数を示す。図６Ｃは、これらの処理後のＴ細胞の頻度を示す。図６Ｄは、これらの処理後のＴ細胞の数を示す。
【図6C】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかで培養してから９６時間後に健康なドナーから回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）に対するダラツムマブ（Ｄａｒａ）の効果を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。一部の細胞は、対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で処理した。図６Ａは、これらの処理後のＮＫ細胞の頻度を示す。図６Ｂは、これらの処理後のＮＫ細胞の数を示す。図６Ｃは、これらの処理後のＴ細胞の頻度を示す。図６Ｄは、これらの処理後のＴ細胞の数を示す。
【図6D】培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地のいずれかで培養してから９６時間後に健康なドナーから回収した正常な免疫細胞（ＰＢＭＣ）に対するダラツムマブ（Ｄａｒａ）の効果を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。一部の細胞は、対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で処理した。図６Ａは、これらの処理後のＮＫ細胞の頻度を示す。図６Ｂは、これらの処理後のＮＫ細胞の数を示す。図６Ｃは、これらの処理後のＴ細胞の頻度を示す。図６Ｄは、これらの処理後のＴ細胞の数を示す。
【図7A】１０％の補体を加え、又は加えずにダラツムマブ（Ｄａｒａ）又は対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で７２時間培養した後の、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度及び数を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。図７Ａは、これらの処理後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度を示す。図７Ｂは、これらの処理後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数を示す。
【図7B】１０％の補体を加え、又は加えずにダラツムマブ（Ｄａｒａ）又は対照アイソタイプｍＡｂ（Ｈｕ ＩｇＧ１ｋ）で７２時間培養した後の、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度及び数を示すグラフである。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの用量で使用した。図７Ａは、これらの処理後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の頻度を示す。図７Ｂは、これらの処理後の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数を示す。
【図8A】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ａは、処理を行わずに２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8B】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｂは、０．０１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8C】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｃは、０．１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8D】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｄは、１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8E】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｅは、２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8F】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｆは、０．０１μｇ／ｍＬのダラツムマブ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8G】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｇは、０．１μｇ／ｍＬのダラツムマブ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8H】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｈは、１μｇ／ｍＬのダラツムマブ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8I】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｉは、０．０１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8J】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｊは、０．１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8K】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｋは、１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋと２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8L】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｌは、０．０１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8M】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｍは、０．１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図8N】０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加した、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を測定するフローサイトメトリプロットである。対照アイソタイプｍＡｂ（ＩｇＧ１ｋ）で処理した後の、及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体を添加したＣＤ６９マーカーの発現も測定した。図８Ｎは、１μｇ／ｍＬのＩｇＧ１ｋ及び２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒト抗体と２４時間共培養した後の抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ６９発現を示す。
【図9A】ＮＫ細胞の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞溶解を示す図表を提供する。図９Ａは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂで前処理された正常なドナー由来の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と精製ＮＫ細胞との共培養物における、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞溶解の頻度を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図９Ｂは、図９Ａに記載されるＮＫ細胞との共培養の前の、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＣＲａ／ｂ及びβ２Ｍ発現のレベルを示すフローサイトメトリプロットである。
【図9B】ＮＫ細胞の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞溶解を示す図表を提供する。図９Ａは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂで前処理された正常なドナー由来の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞と精製ＮＫ細胞との共培養物における、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞溶解の頻度を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図９Ｂは、図９Ａに記載されるＮＫ細胞との共培養の前の、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＣＲａ／ｂ及びβ２Ｍ発現のレベルを示すフローサイトメトリプロットである。
【図10A】は、ダラツムマブの存在下又は不在下でのＮＫ細胞媒介ＣＡＲ Ｔ細胞溶解の図表を提供する。図１０Ａは、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後のＣＡＲ Ｔ細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞頻度を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図１０Ｂは、Ｂ２Ｍが欠乏した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞とダラツムマブで処理したＮＫ細胞との１：１比の共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。ＮＫ細胞は正常なドナー由来であり、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂで６０時間前処理された。図１０Ｃは、３：１比のダラツムマブで処理したＮＫ細胞と抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。
【図10B】は、ダラツムマブの存在下又は不在下でのＮＫ細胞媒介ＣＡＲ Ｔ細胞溶解の図表を提供する。図１０Ａは、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後のＣＡＲ Ｔ細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞頻度を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図１０Ｂは、Ｂ２Ｍが欠乏した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞とダラツムマブで処理したＮＫ細胞との１：１比の共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。ＮＫ細胞は正常なドナー由来であり、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂで６０時間前処理された。図１０Ｃは、３：１比のダラツムマブで処理したＮＫ細胞と抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。
【図10C】は、ダラツムマブの存在下又は不在下でのＮＫ細胞媒介ＣＡＲ Ｔ細胞溶解の図表を提供する。図１０Ａは、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブと２４時間共培養した後のＣＡＲ Ｔ細胞の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞頻度を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図１０Ｂは、Ｂ２Ｍが欠乏した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞とダラツムマブで処理したＮＫ細胞との１：１比の共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。ＮＫ細胞は正常なドナー由来であり、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬのダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂで６０時間前処理された。図１０Ｃは、３：１比のダラツムマブで処理したＮＫ細胞と抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞との共培養物におけるＮＫ媒介細胞溶解からの保護を示す。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。
【図11A】濃度０．０１、０．１、１、１０、１００、又は３００μｇ／ｍＬのダラツムマブのいずれかでＢ２Ｍを欠乏したＣＡＲ Ｔ細胞抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した後のＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞数を示すグラフである。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図１１Ａは、７２時間共培養した後のＮＫ細胞数を示す。図１１Ｂは、７２時間共培養した後のＴ細胞数を示す。
【図11B】濃度０．０１、０．１、１、１０、１００、又は３００μｇ／ｍＬのダラツムマブのいずれかでＢ２Ｍを欠乏したＣＡＲ Ｔ細胞抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した後のＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞数を示すグラフである。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。図１１Ａは、７２時間共培養した後のＮＫ細胞数を示す。図１１Ｂは、７２時間共培養した後のＴ細胞数を示す。
【図12】マウスあたり１００μｇのダラツムマブ及び／又はマウスあたり０．４×１０6のＮＫ細胞を注射されたマウスから回収された血液のフローサイトメトリによって測定されたＮＫ細胞数を示すグラフである。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。
【図13】０．５×１０6Ｎａｌｍ６細胞／マウスを静脈注射された免疫不全マウスの週１回の生物発光測定値を示すグラフであり、測定値は、ＮＫ細胞、ＰＢＳ、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）、ＩｇＧ１、及び／又は抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞（４×１０6細胞／マウス）によるマウスの別の静脈注射後に回収された。エラーバーは標準誤差（ＳＥＭ）を表し、ここではｎ＝３である。
【図14A】５×１０6ＭＭ．１Ｓ細胞／マウスを静脈注射され、ダラツムマブ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせで処理された免疫不全マウスの腫瘍容積及び生存率を示すグラフである。図１４Ａは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、低用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（０．８×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｂは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（２．４×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｃは、単体での、又はダラツムマブとの組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理されたマウスの２６日目における腫瘍容積を示すグラフである。
【図14B】５×１０6ＭＭ．１Ｓ細胞／マウスを静脈注射され、ダラツムマブ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせで処理された免疫不全マウスの腫瘍容積及び生存率を示すグラフである。図１４Ａは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、低用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（０．８×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｂは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（２．４×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｃは、単体での、又はダラツムマブとの組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理されたマウスの２６日目における腫瘍容積を示すグラフである。
【図14C】５×１０6ＭＭ．１Ｓ細胞／マウスを静脈注射され、ダラツムマブ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はこれらの組み合わせで処理された免疫不全マウスの腫瘍容積及び生存率を示すグラフである。図１４Ａは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、低用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（０．８×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｂは、単体での、又はダラツムマブ（１５ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（２．４×１０6ＣＡＲ+Ｔ細胞）で処理されたマウスの腫瘍容積（上）及び生存率（下）を示すグラフである。図１４Ｃは、単体での、又はダラツムマブとの組み合わせでの、高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理されたマウスの２６日目における腫瘍容積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
理論に束縛されるものではないが、破壊されたＭＨＣクラスＩを含むＣＡＲ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩが十分な細胞、すなわち自己細胞をＮＫ細胞が消失させることを防ぐ、必要なＭＨＣクラスＩ－ＮＫ ＫＩＲ受容体結合を提供することができないと考えられる。したがって、破壊されたＭＨＣクラスＩを含む同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＫ媒介免疫監視による消失を受けやすい。一例として抗ＣＤ３８モノクローナル抗体を用いるＮＫ細胞阻害剤の投与は、ＮＫ細胞数の減少をもたらしたことが発見された。続いて、ＮＫ細胞の枯渇が、宿主ＮＫ媒介細胞溶解から同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞を保護する。よって、ＣＡＲ Ｔ細胞療法とＮＫ細胞阻害剤との組み合わせは、既存のＣＡＲ Ｔ細胞療法を上回る改善を示す。
【0035】
ＰＢＭＣから単離されたＴ細胞も、細胞表面にＣＤ３８タンパク質を発現することが実証された。驚くべきことに、ＮＫ細胞を枯渇させた用量での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の添加は、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体で複数日培養した後であっても、Ｔ細胞数に影響を及ぼさなかった。ＮＫ細胞数を枯渇させた用量での抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の添加も、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を誘発しない。したがって、理論に束縛されるものではないが、抗ＣＤ３８モノクローナル抗体の治療はＮＫ細胞に特異的であり、望ましくない非特異的なＣＡＲ Ｔ細胞の活性化又は消失をもたらすことなくＮＫ細胞の減少を誘発するものと考えられる。抗ＣＤ３８モノクローナル抗体などのＮＫ細胞阻害剤の添加は、既存のＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する改善を示す。
【0036】
更に、抗ＣＤ３８抗体とＰＢＭＣとの共培養物に対する補体の添加は、ＮＫ細胞枯渇の規模に影響を及ぼさなかったため、ＮＫ細胞に対する抗ＣＤ３８抗体の効果は補体依存性ではなかったことも実証された。より重要なことに、補体の添加でＴ細胞の枯渇が起きることもなく、ＣＡＲ Ｔ細胞活性化状態が影響を受けることもなかった。したがって、理論に束縛されるものではないが、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と組み合わせた抗ＣＤ３８抗体などのＮＫ細胞阻害剤の投与は、ＣＡＲ Ｔ細胞の残存率及び効力を改善するものと考えられる。更に、動物モデルにおいて、抗ＣＤ３８抗体が、腫瘍抗原（例えばＣＤ１９又はＢＣＭＡ）を標的化するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を成功裏に向上させたことが観察された。理論に束縛されるものではないが、併用療法は、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の抗腫瘍活性を増加させることによって、対象における臨床応答を改善すると考えられる。
【0037】
本開示は、破壊された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含み、がんを治療するためにＮＫ細胞阻害剤と組み合わせて使用するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変Ｔ細胞の方法及び／又は組成物を提供する。いくつかの実施形態では、これらの改変Ｔ細胞は、対象による拒絶反応のリスクを減少させるために、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含まず、破壊されたＭＨＣクラスＩを含む。
【0038】
したがって、本開示の一態様は、臨床転帰を改善するための併用療法を特徴とし、併用療法は、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変Ｔ細胞（「ＣＡＲ」及び「ＣＡＲ Ｔ細胞」）及びＮＫ細胞阻害剤（例えば、ダラツムマブ又はその機能的バリアントなどの抗ＣＤ３８抗体）を伴う。
【0039】
Ｉ．遺伝子改変キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞（すなわち、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法は、当業者に既知であり、また、以下でより詳細に説明される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法とは、治療を必要とする対象におけるがんなどの標的疾患を治療するのに用いるための、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団（すなわち、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む組成物及び／又は方法を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、リンパ球枯渇レジメンを含み得る前条件付けレジメンを更に含み得る。代表的なリンパ球枯渇レジメンは、リンパ球枯渇レジメンの一部として化学療法薬を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、１用量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含み得る。その他の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ Ｔ細胞療法は、複数用量（例えば２用量又は３用量）の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞（すなわち、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞を作製する方法は、当業者に既知であり、また、以下でより詳細に説明される。ＣＡＲ Ｔ細胞療法とは、治療を必要とする対象におけるがんなどの標的疾患を治療するのに用いるための、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団（すなわち、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む組成物及び／又は方法を指す。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、リンパ球枯渇レジメンを含み得る前条件付けレジメンを更に含み得る。代表的なリンパ球枯渇レジメンは、リンパ球枯渇レジメンの一部として化学療法薬を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、１用量の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含み得る。その他の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ Ｔ細胞療法は、複数用量（例えば２用量又は３用量）の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を含み得る。
【0040】
遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、本明細書に開示されるヒトＣＡＲ－Ｔ細胞）は、目的の抗原（例えば、がん又は腫瘍抗原）に対する特異性を有するキメラ抗原受容体を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞は、１つ以上の標的遺伝子、例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子（例えば、Ｂ２Ｍ）及び／又はＴ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ）における更なる遺伝子編集を含み得る。
【0041】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞により発現された抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞用に設計されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又はその他の抗原結合フラグメント）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８～５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれている。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞により発現された抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞用に設計されており、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）又はその他の抗原結合フラグメント）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８～５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれている。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
【0042】
４つの世代のＣＡＲが存在し、その各々は、異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、抗体に由来するｓｃＦｖをヒンジ及び膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、追加のドメイン（例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳ）を組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメインを含む。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせを含み得る。ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に一般に由来する外部ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン並びにＣＤ３ζ及び／又は共刺激分子に由来する１つ（第一世代）、２つ（第二世代）又は３つ（第三世代）のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメインを含む（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。
【0043】
ＣＡＲは、典型的には、その機能特性が異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、係合される場合、Ｔ細胞の増殖を活性化し、及び誘導することになるが、アネルギーを引き起こし得る（身体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球寛容の直接的な誘導をもたらす）。リンパ球は、特定の抗原に応答できない場合、アネルギー性であるとみなされる。第二世代のＣＡＲにおける共刺激ドメインの付加は、修飾Ｔ細胞の複製能及び残存率を向上させた。同様の抗腫瘍効果は、インビトロでＣＤ２８又は４－１ＢＢ ＣＡＲと共に観察される。臨床試験は、これらの第二世代のＣＡＲの両方がインビボで実質的なＴ細胞増殖を誘発し得ることを示唆する。第三世代のＣＡＲは、効力を増強する複数のシグナル伝達ドメイン（共刺激）を組み合わせる。
【0044】
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、第一世代のＣＡＲである。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第二世代のＣＡＲである。更に他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第三世代のＣＡＲである。
【0045】
ＣＡＲは、いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖなどの抗体）、膜貫通ドメイン及び細胞質（内）ドメインを含む細胞外（外部）ドメインを含む。
【0046】
（ｉ）外部ドメイン
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、及びいくつかの実施形態では抗原結合ドメイン並びに任意選択的なシグナルペプチド、スペーサードメイン及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸塩及びリシンと共に親水性残基を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、及びいくつかの実施形態では抗原結合ドメイン並びに任意選択的なシグナルペプチド、スペーサードメイン及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸塩及びリシンと共に親水性残基を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンに富み、溶解性のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
【0047】
いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、ヒト化されている。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、完全ヒトである。更に他の実施形態では、ｓｃＦｖは、キメラ（例えば、マウス及びヒト配列）である。
【0048】
いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲの外部ドメインは、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、例えば配列番号５４（ＶＨ）及び配列番号５５（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。一例では、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖは、配列番号５０のアミノ酸配列を含み得る。
【0049】
いくつかの例では、本明細書に開示されるＣＡＲの外部ドメインは、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ、例えば配列番号８１（ＶＨ）及び配列番号８２（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。一例では、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖは、配列番号７８又は配列番号８０のアミノ酸配列を含み得る。
【0050】
他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲの外部ドメインは、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ、例えば配列番号８９（ＶＨ）及び配列番号９０（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。一例では、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、配列番号８８のアミノ酸配列を含み得る。
【0051】
更に他の例では、本明細書に開示されるＣＡＲの外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍｉｎ）は、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、例えば配列番号１１６（ＶＨ）及び配列番号１１７（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖであってもよい。一例では、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含み得る。
【0052】
本明細書に開示されるＣＡＲを構築するのに使用するためのｓｃＦｖ配列、例えばＣＡＲ標的化ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、又はＣＤ３３に関する更なる情報は、国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット、同第２０１９／２１５５００号パンフレット、及び同第２０２０／０９５１０７号パンフレットで見出すことができ、該当する各開示は、参照することにより本明細書で参照される目的及び主題に関して組み込まれる。
【0053】
シグナルペプチドは、ＣＡＲ結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、抗体（例えば、限定されないが、ＣＤ８）及びエピトープタグ（例えば、限定されないが、ＧＳＴ又はＦＬＡＧ）に由来し得る。シグナルペプチドの例として、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号３０）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号３１）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用され得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置するか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を妨げるように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペーサードメインがＣＡＲの他の領域に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用され得る。
【0055】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲコンストラクトのいずれかの外部ドメインは、がん又は腫瘍抗原を標的化する（例えば、これに特異的に結合する）。「がん抗原」及び「腫瘍抗原」という用語は、本明細書では互換的に用いられる。いくつかの実施形態では、腫瘍又はがん抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞より腫瘍細胞においてより高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を参照させる「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と呼ばれる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、大部分の腫瘍によって広範に発現される普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現された細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍又はがん抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞において排他的に発現される。代表的ながん抗原を下記に示す。
【0056】
ＣＤ１９
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ１９を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されている。表面抗原分類１９（ＣＤ１９）は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公的データベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列のコード化は、受入番号ＮＭ－００１１７８０９８で見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球白血病及び非ホジキンリンパ腫を含む大部分のＢ細胞系列がん上で発現される。それは、Ｂ細胞前駆体の早期のマーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７～１１６５（１９９７）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ１９を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で改変されている。表面抗原分類１９（ＣＤ１９）は、白血病前駆細胞上で検出可能な抗原決定基である。ヒト及びマウスのアミノ酸及び核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ及びＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公的データベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入番号Ｐ１５３９１として見出すことができ、ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列のコード化は、受入番号ＮＭ－００１１７８０９８で見出すことができる。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球白血病及び非ホジキンリンパ腫を含む大部分のＢ細胞系列がん上で発現される。それは、Ｂ細胞前駆体の早期のマーカーでもある。例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７～１１６５（１９９７）を参照されたい。
【0057】
そのため、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５４に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５５に記載されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号３９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号５０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％ ９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号３９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を含むＣＡＲは、配列番号４０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0059】
ＢＣＭＡ
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＢＣＭＡを標的化するように設計されたＣＡＲにより改変される。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは、形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットによって主に発現される。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞及び非ホジキンリンパ腫を含むＢ系列細胞によって選択的に発現され、したがって、ＢＣＭＡもまた、魅力的な治療標的である。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＢＣＭＡを標的化するように設計されたＣＡＲにより改変される。Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９）は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは、形質細胞及び成熟Ｂ細胞のサブセットによって主に発現される。ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞及び非ホジキンリンパ腫を含むＢ系列細胞によって選択的に発現され、したがって、ＢＣＭＡもまた、魅力的な治療標的である。
【0060】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように改変される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８７のヌクレオチド配列によってコードされる抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号８５の配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号８６の配列を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号８８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８８と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号９０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号８５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号８６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体を含むＣＡＲは、配列番号８６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0062】
ＣＤ３３
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３３を標的化するように設計されたＣＡＲにより改変される。Ｓｉｇｌｅｃ３としても知られるＣＤ３３は、シアル酸に結合することが知られる骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、がん細胞（例えば、急性骨髄性白血病）において発現されるため、ＣＤ３３は、これらの悪性腫瘍を標的化するための細胞表面マーカーとなると考えられる。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３３を標的化するように設計されたＣＡＲにより改変される。Ｓｉｇｌｅｃ３としても知られるＣＤ３３は、シアル酸に結合することが知られる骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、がん細胞（例えば、急性骨髄性白血病）において発現されるため、ＣＤ３３は、これらの悪性腫瘍を標的化するための細胞表面マーカーとなると考えられる。
【0063】
そのため、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１４のヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１１２のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号１１３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％ ９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１１２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％ ９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号１１５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0065】
ＣＤ７０
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ７０を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により改変されている。ＣＤ７０は、Ｔ細胞の増殖及び生存に関与する共刺激受容体であるＣＤ２７に対するリガンドとして最初に同定された。ＣＤ７０は、ウイルス感染中の流入領域リンパ節において少ないパーセンテージの活性化Ｔ細胞及び抗原提示細胞上においてのみ見出される。明細胞腎臓がん、乳癌、胃癌、卵巣がん、神経膠芽腫、及び血液悪性腫瘍などの固形がんを含むがこれらに限定されない多くのヒト腫瘍もまた、ＣＤ７０を発現する。正常組織におけるその限定的な発現パターン及び多くのがんにおける過剰発現のために、ＣＤ７０は、魅力的な治療標的である。
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ７０を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により改変されている。ＣＤ７０は、Ｔ細胞の増殖及び生存に関与する共刺激受容体であるＣＤ２７に対するリガンドとして最初に同定された。ＣＤ７０は、ウイルス感染中の流入領域リンパ節において少ないパーセンテージの活性化Ｔ細胞及び抗原提示細胞上においてのみ見出される。明細胞腎臓がん、乳癌、胃癌、卵巣がん、神経膠芽腫、及び血液悪性腫瘍などの固形がんを含むがこれらに限定されない多くのヒト腫瘍もまた、ＣＤ７０を発現する。正常組織におけるその限定的な発現パターン及び多くのがんにおける過剰発現のために、ＣＤ７０は、魅力的な治療標的である。
【0066】
そのため、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７７又は７９のヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７８又は８０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号７５のヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７７又は７９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号７８及び８０のアミノ酸配列をそれぞれコードするヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７８又は８０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号８１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。或いは、又は加えて、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号８２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号７５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号７６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体を含むＣＡＲは、配列番号７６と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0068】
（ｉｉ）膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが使用され得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが使用され得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。
【0069】
（ｉｉｉ）内部ドメイン
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３－ゼータであり、このＣＤ３－ゼータは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。例示的なＣＤ３－ゼータは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号３７のヌクレオチド配列によってコードされ得る。多くの場合、ＣＤ３－ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、そのため、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）と共に使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。そのため、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激分子由来である（例えば、配列番号３５のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号３６のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン）。その他の実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激分子由来であり得る（例えば、配列番号３３のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号３４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更にその他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３－ゼータであり、このＣＤ３－ゼータは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。これは、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。例示的なＣＤ３－ゼータは、配列番号３８のアミノ酸配列を含み、これは、配列番号３７のヌクレオチド配列によってコードされ得る。多くの場合、ＣＤ３－ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、そのため、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）と共に使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。そのため、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激分子由来である（例えば、配列番号３５のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号３６のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン）。その他の実施形態では、共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激分子由来であり得る（例えば、配列番号３３のヌクレオチド配列によってコードされ得る、配列番号３４のアミノ酸配列を含む共刺激ドメイン）。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更にその他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【0070】
（ｉｖ）例示的なＣＡＲコンストラクト
本明細書に開示される併用療法で使用するための遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞中で発現され得る多くの例示的なＣＡＲコンストラクトを下記で提供する。本開示で使用するためのＣＡＲコンストラクト、例えばＣＡＲ標的化ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、又はＣＤ３３に関する更なる情報は、国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット、同第２０１９／２１５５００号パンフレット、及び同第２０２０／０９５１０７号パンフレットで見出すことができ、該当する各開示は、参照することにより本明細書で参照される目的及び主題に関して組み込まれる。
本明細書に開示される併用療法で使用するための遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞中で発現され得る多くの例示的なＣＡＲコンストラクトを下記で提供する。本開示で使用するためのＣＡＲコンストラクト、例えばＣＡＲ標的化ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ７０、又はＣＤ３３に関する更なる情報は、国際公開第２０１９／０９７３０５号パンフレット、同第２０１９／２１５５００号パンフレット、及び同第２０２０／０９５１０７号パンフレットで見出すことができ、該当する各開示は、参照することにより本明細書で参照される目的及び主題に関して組み込まれる。
【0071】
抗ＣＤ１９ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書で抗ＣＤ１９ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＣＤ１９標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書で抗ＣＤ１９ＣＡＲ又は抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＣＤ１９標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、それぞれ配列番号５４及び５５に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む抗ＣＤ１９抗体（例えば抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号５４に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５５に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号５４に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５５に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号５４に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５５に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、配列番号５４に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号５５に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１２７、１２８及び１２９に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びにそれぞれ配列番号１２４、１２５及び１２６に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体（例えば、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１３０、１３１及び１２９に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びにそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号４９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである。
【0074】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）配列番号５０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号５４及び５５に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）配列番号４９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0078】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号５４及び５５に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ１９抗原結合性フラグメントを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ２８共刺激ドメイン及び配列番号３７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ３－ゼータ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１９ＣＡＲは、配列番号３９に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号４０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【0080】
抗ＣＤ３３ ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書でＣＤ３３ ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ、又は抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＣＤ３３標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書でＣＤ３３ ＣＡＲ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ、又は抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＣＤ３３標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ３３ ＣＡＲ中の抗ＣＤ３３抗体（例えば抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１１６及び１１７にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１１６に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１１７に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１１６に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１１７に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１１６に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１１７に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１１６に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号１１７に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１１８、１１９及び１２０に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１２１、１２２及び１２３に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体（例えば抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）は、配列番号１３２に記載の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号９４に記載の重鎖ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２０に記載の重鎖ＣＤＲ３配列、並びに、それぞれ配列番号１２１、１２２、及び１２３に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む（配列表を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号１１４に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。
【0083】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）配列番号１１３に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号１１６及び１１７に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号１１２に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ＣＡＲは、配列番号１１２に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号１１５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【0087】
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書でＢＣＭＡ ＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、本明細書でＢＣＭＡ ＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞とも称されるＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ中の抗ＢＣＭＡ抗体（例えば抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、配列番号８９及び９０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、配列番号８９に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号９０に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、配列番号８９に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号９０に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、配列番号８９に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号９０に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、配列番号８９に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号９０に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１０６、１０８及び１１０に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１０３、１０４及び１０５に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号１０７、１０９及び１１０に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号１０３、１０４及び１０５に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号８７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖである。
【0090】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）配列番号８８に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0092】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号８９及び９０に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号８６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号８５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、配列番号８５に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号８６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【0094】
抗ＣＤ７０ ＣＡＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ＣＤ７０ ＣＡＲ、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ又は抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞とも本明細書で呼ばれるＣＤ７０標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ＣＤ７０ ＣＡＲ、抗ＣＤ７０ ＣＡＲ又は抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞とも本明細書で呼ばれるＣＤ７０標的化ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８又は４１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ７０ ＣＡＲ中の抗ＣＤ７０抗体（例えば抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、配列番号８１及び８２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、配列番号８１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号８２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、配列番号８１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号８２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、配列番号８１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号８２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、配列番号８１に記載されるＶＨの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ２）、並びに配列番号８２に記載されるＶＬの３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含み、ＣＤＲは、ＡｂＭに従って決定される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば、抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号９７、９９及び１０１に記載される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号９１、９３及び９５に記載される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体（例えば抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖ）は、それぞれ配列番号９８、１００、及び１０２に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、並びに配列番号９２に記載の軽鎖ＣＤＲ１配列、ＬＡＳとして記載される軽鎖ＣＤＲ２配列、及び配列番号９６に記載の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む（下記の配列表を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７９に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７８に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０抗体は、配列番号７７に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖである。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）抗ＣＤ７０抗原結合ドメインを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）配列番号８０に記載されるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号７４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、（ｉ）それぞれ配列番号８１及び８２に記載されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び軽鎖領域を含む抗ＣＤ７０ ｓｃＦｖを含む外部ドメイン、（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｉｉｉ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む４１ＢＢ共刺激ドメイン及び配列番号３８に記載されるアミノ酸配列を含むＣＤ３－ゼータシグナル伝達ドメインを含む内部ドメインを含む。
【0100】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、配列番号７６に記載されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、配列番号７５に記載されるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７０ ＣＡＲは、配列番号７５に記載されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、また任意選択的に配列番号７６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【0101】
（ｖ）Ｔ細胞におけるキメラ抗原受容体の発現
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、当業者に既知の方法によって改変細胞に導入される。例えば、ＣＡＲは、ベクターによって改変された細胞に導入され得る。当該技術分野で既知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示される核酸又は発現ベクターのいずれかを免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマー系トランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子系トランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、又はリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、及びヌクレオフェクションが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、当業者に既知の方法によって改変細胞に導入される。例えば、ＣＡＲは、ベクターによって改変された細胞に導入され得る。当該技術分野で既知の様々な異なる方法を使用して、本明細書に開示される核酸又は発現ベクターのいずれかを免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸を細胞に導入するための方法の非限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、高度に分岐した有機化合物を使用するトランスフェクション、カチオン性ポリマーを使用するトランスフェクション、デンドリマー系トランスフェクション、光学的トランスフェクション、粒子系トランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、又はリポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を使用するトランスフェクション）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、セルスクイージング、ソノポレーション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、水力学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルストランスフェクション、及びヌクレオフェクションが挙げられる。
【0102】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、下記に記載されるように、ドナー鋳型として改変細胞に導入される。
【0103】
Ｂ．Ｔ細胞の遺伝子編集
いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞は、少なくとも１つの遺伝子編集、例えば破壊されたＭＨＣクラスＩを含む。例えば、改変Ｔ細胞は、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞は、例えば複数の遺伝子において複数の遺伝子編集を含む。例えば、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞は、少なくとも１つの遺伝子編集、例えば破壊されたＭＨＣクラスＩを含む。例えば、改変Ｔ細胞は、破壊されたβ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞は、例えば複数の遺伝子において複数の遺伝子編集を含む。例えば、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、又はこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。
【0104】
遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ以上のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介した遺伝子修飾を包含することを理解すべきである。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子とは、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体による、例えばフローサイトメトリによる）のタンパク質を（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出され得ない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。
【0105】
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態では、一定のパーセンテージの細胞が編集されており（例えば、β２Ｍ遺伝子が編集されており）、結果として特定の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定のパーセンテージの細胞がもたらされる細胞の集団である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団の少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は８５％）の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞である。いくつかの実施形態では、この集団の少なくとも５０％の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞であり得る。
【0106】
細胞においてゲノム欠失をもたらす（例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする）ためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集技術を使用する方法は、既知である（Ｂａｕｅｒ ＤＥ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１５；９５；ｅ５２１１８）。
【0107】
（ｉ）破壊されたＭＨＣクラスＩ
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法で使用するために、破壊された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む改変ヒトＴ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。本明細書では、「ＭＣＨクラスＩ」及び「ＭＨＣクラスＩ複合体」という用語は互換的に用いられる。ヒト内に４０個超存在するＨＬＡ遺伝子は、細胞表面上に発現しているか、又は補体系の成分である３つのクラスのＭＨＣタンパク質（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）をコードする。ＨＬＡ遺伝子は多種多様であり、数百の既知の対立遺伝子変異がある。この遺伝的多様性のために、高可変性のＭＨＣ分子の発現がもたらされる。ＭＨＣ分子は、その主な機能が、免疫細胞に対して提示するためにペプチド抗原を結合させることであるため免疫調節に不可欠な役割を果たす。構造的に異なるＭＨＣ分子は、タンパク質抗原に一意的に結合し、続くＭＨＣクラスＩによる抗原提示は、自己抗原に対する免疫応答（寛容を維持して自己免疫反応を回避する）と、外来抗原（感染又は悪性細胞に対する免疫攻撃を展開する）とのバランスを取る上で不可欠な工程である。例えば、Ｓｋｅｌｔｏｎ ＴＳ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｅｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１），１（２）：１５－２６；Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ＥＷ，Ｂｌｏｏｄ（２０１３），１２２（１１）：１８６２－１８７２を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法で使用するために、破壊された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を含む改変ヒトＴ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を提供する。本明細書では、「ＭＣＨクラスＩ」及び「ＭＨＣクラスＩ複合体」という用語は互換的に用いられる。ヒト内に４０個超存在するＨＬＡ遺伝子は、細胞表面上に発現しているか、又は補体系の成分である３つのクラスのＭＨＣタンパク質（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）をコードする。ＨＬＡ遺伝子は多種多様であり、数百の既知の対立遺伝子変異がある。この遺伝的多様性のために、高可変性のＭＨＣ分子の発現がもたらされる。ＭＨＣ分子は、その主な機能が、免疫細胞に対して提示するためにペプチド抗原を結合させることであるため免疫調節に不可欠な役割を果たす。構造的に異なるＭＨＣ分子は、タンパク質抗原に一意的に結合し、続くＭＨＣクラスＩによる抗原提示は、自己抗原に対する免疫応答（寛容を維持して自己免疫反応を回避する）と、外来抗原（感染又は悪性細胞に対する免疫攻撃を展開する）とのバランスを取る上で不可欠な工程である。例えば、Ｓｋｅｌｔｏｎ ＴＳ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｅｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１），１（２）：１５－２６；Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ＥＷ，Ｂｌｏｏｄ（２０１３），１２２（１１）：１８６２－１８７２を参照されたい。
【0108】
ＭＨＣクラスＩは、全ての有核細胞中に存在し、２つの成分（例えば、ＭＨＣクラスＩサブユニット）：第２のβ２－ミクログロブリン（β２Ｍ）ペプチドと非共有結合した、第１のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、及びＣ遺伝子によってコードされたアミノ酸配列（すなわち、α１、α２、及びα３）を含むα重鎖を含む。これらの２つの成分は固有のペプチド結合溝を形成し、この上で自己又は外来ペプチド抗原が結合して、ＭＨＣクラスＩを形成する。移植との関係においては、同種異系（ＨＬＡ不一致）ドナー由来のＭＨＣクラスＩは、異なる非自己ＭＨＣクラスＩを示し、これが免疫反応をトリガして、「外来侵入者」を拒絶する。
【0109】
レシピエント又は宿主Ｔ細胞による同種異系（非自己）ＭＨＣクラスＩの認識、及び続く同種異系（非自己）ＭＨＣクラスＩを含む細胞の消失を防ぐために、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩサブユニットを破壊又は消失させるように改変される。同種異系改変ＣＡＲ Ｔ細胞上のＭＨＣクラスＩサブユニットを破壊することで、外来ＭＨＣクラスＩと宿主免疫Ｔ細胞との係合によって生じる免疫活性化が回避される。更に、破壊されたＭＨＣクラスＩを含む改変ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己寛容を維持するために必要な、宿主ＮＫ細胞阻害剤の受容体（例えば、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ））との係合に失敗する。ＭＨＣクラスＩ：ＮＫ細胞受容体の相互作用がない場合は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞は、宿主／レシピエントＮＫ媒介性の消失を受けやすい。
【0110】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ媒介性の消失を減少させるための方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を受けている対象においてＮＫ細胞活性を減少させるための方法も提供する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は破壊されたＭＨＣクラスＩを含む。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞中のＭＨＣクラスＩの発現は阻害される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの阻害は、ＨＬＡ遺伝子の不活性化又は変異によるものである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの阻害は、β２Ｍ遺伝子の不活性化又は変異によるものである。
【0111】
いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩを含む細胞は、ＭＨＣクラスＩの機能の喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞を非同種異系反応性にし、及び同種異系間移植に適したものにする。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体は、宿主対移植片疾患のリスクを最小化する。
【0112】
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を用いた）を介した遺伝子修飾を包含する。遺伝子編集の方法は当該技術分野で既知であり、且つ本開示で提供される。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、この遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体による、例えば、フローサイトメトリによる）のタンパク質を、（例えば、細胞表面において）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と称され得る。例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子編集を有する細胞は、ＭＨＣクラスＩの１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用してＭＨＣクラスＩ複合体又はサブユニットが細胞表面で検出され得ない場合、ＭＨＣクラスＩノックアウト細胞とみなされ得る。
【0113】
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子とは、コードされたタンパク質のより少ないコピーをコードする遺伝子である。減少したレベルのタンパク質を発現する細胞は、ノックダウン細胞と称され得る。例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子編集を有する細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上で１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出されたＭＨＣクラスＩ分子が非修飾細胞と比較してより少ない発現を有する場合、ＭＨＣクラスＩノックダウン細胞とみなされ得る。
【0114】
いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩのサブユニットはα鎖である（例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩのサブユニットはβ２Ｍペプチドである。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩはβ２Ｍペプチドと会合したα鎖である。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩは、ペプチド結合溝内で結合したペプチド抗原を更に含む、β２Ｍペプチドと会合したα鎖である。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩは、β２Ｍ遺伝子中の変異（例えば、挿入、欠失、及び／又は置換）によって生じる。いくつかの実施形態では、破壊されたＭＨＣクラスＩは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及び／又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子中の変異（例えば、挿入、欠失、及び／又は置換）によって生じる。
【0115】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の約１０％未満が破壊されたＭＨＣクラスＩを発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の約５０％未満が破壊されたＭＨＣクラスＩを発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の約９０％、８０％、７０％、６０％、４０％、３０％、又は２０％未満が破壊されたＭＨＣクラスＩを発現する。
【0116】
（ｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この改変Ｔ細胞を非同種異系反応性にし、及び同種異系間移植に適したものにし）、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために消失される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、外因性配列（例えばキメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすること（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）によって生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子におけるゲノム欠失は、ｇＲＮＡ、及び／又は外因性配列（例えばキメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子へのノックイン（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）によって生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることにより生じる。
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この改変Ｔ細胞を非同種異系反応性にし、及び同種異系間移植に適したものにし）、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内因性ＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために消失される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、外因性配列（例えばキメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすること（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）によって生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子におけるゲノム欠失は、ｇＲＮＡ、及び／又は外因性配列（例えばキメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子へのノックイン（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）によって生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることにより生じる。
【0117】
本明細書で提供されるとおりに用いられてＴＲＡＣ遺伝子中にゲノム破壊を生成することのできる修飾及び非修飾ＴＲＡＣ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例としては、配列番号１８又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；アンサンブルＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。
【0118】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の集団の少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の集団の０．５％未満が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する。
【0119】
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、配列番号１～８から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＴＲＡＣ遺伝子中にインデルを生成する（「－」は欠失を示し、太字のヌクレオチドは挿入を示す）。下記の表１を参照されたい。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＲＡＣ遺伝子標的配列の欠失を含み、例えば、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列の欠失を含む。
【0120】
【表1】
【0121】
（ｉｉｉ）β２Ｍ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりその発現が破壊されると、宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が予防され、同種異系Ｔ細胞の残存率の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内因性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために消失される。
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によりその発現が破壊されると、宿主対治療用同種異系Ｔ細胞反応が予防され、同種異系Ｔ細胞の残存率の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、内因性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために消失される。
【0122】
本明細書で提供されるとおりに用いられてβ２Ｍ遺伝子中にゲノム破壊を生成することのできる修飾及び非修飾β２Ｍ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例としては、配列番号２０又は配列番号２１のヌクレオチド配列を含むものが挙げられる。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。
【0123】
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊する、β２Ｍ遺伝子におけるインデルがもたらされる。
【0124】
いくつかの実施形態では、細胞の集団の少なくとも５０％の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。例えば、集団の少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現し得ない。いくつかの実施形態では、集団の５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％又は９０％～１００％の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
【0125】
いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの５０％未満の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの３０％未満の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。例えば、細胞の集団のうちの５０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の集団のうちの４０％～３０％、４０％～２０％、４０％～１０％、４０％～５％、３０％～２０％、３０％～１０％、３０％～５％、２０％～１０％、２０％～５％、又は１０％～５％の改変Ｔ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。
【0126】
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、β２Ｍ遺伝子におけるインデルが生成される。いくつかの実施形態では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４から選択される少なくとも１つの配列を含み得る（「－」は欠失を示し、太字のヌクレオチドは挿入を示す）。下記の表２を参照されたい。
【0127】
【表2】
【0128】
（ｉｖ）遺伝子編集方法
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのＤＮＡ配列中に挿入され、欠失され、及び／又は置換される一種の遺伝子改変である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子中又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失及び／又は置換が可能になる。内因性の遺伝子の配列が、例えば、ヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換によって編集される時、影響を受けた配列を含む内因性の遺伝子は、配列変異のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。したがって、標的化された編集を使用して、内因性の遺伝子発現を破壊し得る。「標的化された組込み」は、挿入部位における内因性配列の欠失の有無に関わらず、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外因性配列を含むドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのＤＮＡ配列中に挿入され、欠失され、及び／又は置換される一種の遺伝子改変である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子中又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失及び／又は置換が可能になる。内因性の遺伝子の配列が、例えば、ヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換によって編集される時、影響を受けた配列を含む内因性の遺伝子は、配列変異のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。したがって、標的化された編集を使用して、内因性の遺伝子発現を破壊し得る。「標的化された組込み」は、挿入部位における内因性配列の欠失の有無に関わらず、１つ以上の外因性配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外因性配列を含むドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
【0129】
標的化された編集を、ヌクレアーゼ非依存的な手法又はヌクレアーゼ依存的な手法のいずれかを介して達成し得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集手法において、相同組み換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内因性配列に導入されることになる外因性ポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。この外因性ポリヌクレオチドは、この内因性配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
【0130】
或いは、ヌクレアーゼ依存的な手法は、特異的なレアカッティングヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）による二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入を介して比較的高い頻度を有して標的化された編集を達成できる。そのようなヌクレアーゼ依存的な標的化された編集は、ＤＮＡ修復機構（例えば、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端連結（ＮＨＥＪ））も利用する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、少数の内因性ヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす場合が多い。ＮＨＥＪに媒介される修復とは対照的に、修復は、相同組み換え修復（ＨＤＲ）によっても生じ得る。相同性アームの対に隣接する外因性の遺伝子材料を含むドナー鋳型が存在する場合、この外因性の遺伝子材料を、この外因性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすＨＤＲによりゲノムに導入し得る。
【0131】
特異的及び標的化されたＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムも、標的化された組込みのために使用され得る。
【0132】
ＺＦＮは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されているジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０個のアミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例として、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー及びＣ４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計／組成が合理的な基準（例えば、既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピューター処理されたアルゴリズムの適用）から主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたく；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの実験的なプロセスから主にもたらされる、天然に存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書及び同第７，９７２，８５４号明細書においてより詳細に説明されている。ＺＦＮの最も認知されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとの融合物である。
【0133】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合したヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体により、感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、これらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、且つこれらの転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、２アミノ酸残基からなる可変領域（ＲＶＤ）と呼ばれる選択反復位置で多型を含む、エフェクターにより可変の数の不完全な３４個のアミノ酸の反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書においてより詳細に説明されている。当技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認知された例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに対するＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
【0134】
本明細書に提供されるとおりの使用に好適な標的化ヌクレアーゼの更なる例としては、個別に使用されようと、組み合わせて使用されようと、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0135】
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例として、天然に存在するヌクレアーゼ及び組み換えヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼ及び同様のものが挙げられる。
【0136】
（ｖ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。これは、ＤＮＡ切断の標的化を、ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。これは、ＤＮＡ切断の標的化を、ＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依存する。
【0137】
ｃｒＲＮＡは、典型的には標的ＤＮＡ中の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’ ２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）が続く場合、ｃｒＲＮＡであるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含有するＤＮＡ配列にのみ結合する。
【0138】
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いで、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的ＤＮＡを切断し得る。
【0139】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
【0140】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の重要なステップは、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、下記の２つの主要なＤＮＡ修復経路：非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組み換え修復（ＨＤＲ）を使用する。
【0141】
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような改変は、典型的には＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲは、内因的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが修復オペラントとして利用される。
【0142】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９相同体が使用され得る。本明細書に記載されているように、野生型Ｃａｓ９が使用され得るか、又はＣａｓ９の修飾されたバージョンが使用され得る（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）ことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの）Ｃｐｆ１などの別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置換され得る。
【0143】
ガイドＲＮＡ
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導し得るゲノム標的化核酸を提供する。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導し得るゲノム標的化核酸を提供する。このゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡは、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
【0144】
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
【0145】
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。
【0146】
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの２つの鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
【0147】
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結してヘアピン構造を形成する。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。
【0148】
Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される）は、５’から３’の方向に、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
【0149】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含み得る（例えば配列番号１５～１７を参照されたい）。
【0150】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含み得ない。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個又は複数のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個のウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２個のウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３個のウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４個のウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５個のウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
【0151】
ｓｇＲＮＡは、非修飾であっても修飾されていてもよい。例えば、修飾ｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【0152】
例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ又は他のより小さいＲＮＡは、下記で説明されており且つ当技術分野で説明されているように、化学的手段により容易に合成され得る。化学合成方法が拡大し続けている一方、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの方法によるそのようなＲＮＡの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、一緒に連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。当技術分野で説明されているように、様々な種類のＲＮＡ改変（例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を減少させ、及び／又は他の特質を増強する改変）がＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的生成中又は後に導入され得る。
【0153】
スペーサー配列
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。
【0154】
「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接しており、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）により修飾された配列である。「標的核酸」は、下記の二重鎖分子である：一方の鎖は、標的配列を含み且つ「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、他方の相補鎖は、「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれる。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する標的配列の逆相補鎖にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。例えば、標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号２８）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１９）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。
【0155】
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。このスペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
【0156】
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はより多くのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はより多くのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を含む。例えば、
を含む配列においては、標的核酸は、Ｎに対応する配列を含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＰＡＭである。
【化1】
【0157】
本明細書に提供されるとおりに使用され得るＴＲＡＣ ｇＲＮＡの非限定的な例は、ＴＲＡＣ遺伝子中で配列番号２６を標的化する、配列番号１８～１９及び２２～２３のいずれか１つを含み得る。本明細書に提供されるとおりに使用され得るβ２Ｍ ｇＲＮＡの非限定的な例は、β２Ｍ遺伝子中で配列番号２７を標的化する、配列番号２０～２１及び２４～２５のいずれか１つを含み得る。下記の表３を参照されたい。米国特許出願公開第２０１８－０３２５９５５号明細書も参照されたい（参照により本明細書で参照される目的及び主題に関して組み込まれる）。
【0158】
【表3】
【0159】
ドナー鋳型
ＣＡＲをコードする核酸は、本明細書でドナー鋳型と称される（ドナーポリヌクレオチドとも称される）ものを含むベクター（例えばＡＡＶベクター）を用いてＴ細胞に送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接した、ＣＡＲをコードする核酸などの非相同配列を含み得る。代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
ＣＡＲをコードする核酸は、本明細書でドナー鋳型と称される（ドナーポリヌクレオチドとも称される）ものを含むベクター（例えばＡＡＶベクター）を用いてＴ細胞に送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接した、ＣＡＲをコードする核酸などの非相同配列を含み得る。代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
【0160】
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状の形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３’末端に付加され、及び／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが一方又は両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法として、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【0161】
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達され得る。
【0162】
ドナー鋳型は、いくつかの実施形態では、その発現が、組込み部位での内因性プロモーター（即ちこのドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーター）により駆動されるように挿入される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外因性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、配列番号４７の配列を含むＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターが使用されてもよい。
【0163】
更に、外因性配列はまた、転写又は翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。
【0164】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有し、任意選択的に配列番号７６のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ７０ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号７４のヌクレオチド配列を含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号８４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有し、任意選択的に配列番号８６のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号８４のヌクレオチド配列を含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有し、任意選択的に配列番号１１５のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１１１のヌクレオチド配列を含む。
【0167】
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９８％の同一性を有し、任意選択的に配列番号４０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。
【0168】
（ｖｉ）送達方法及びコンストラクト
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、及びその組み合わせを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、及びその組み合わせを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。
【0169】
従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入し得る。非ウイルスベクター送達系として、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系として、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスが挙げられる。
【0170】
核酸の非ウイルス送達の方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工ビリオン及び薬剤で増強されたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも核酸の送達に使用され得る。
【0171】
アデノ随伴ウイルス送達
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込み、したがってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写された場合にＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶに血清型を付与し、カプシドが主にどの標的器官に結合するかを決定し、そのため、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込み、したがってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写された場合にＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶに血清型を付与し、カプシドが主にどの標的器官に結合するかを決定し、そのため、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
【0172】
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型を選択することを考慮する場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
【0173】
（ｖｉｉ）相同組み換え修復（ＨＤＲ）
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組み換え修復（ＨＤＲ）により標的遺伝子座位に挿入される。標的座位でのＤＮＡの両方の鎖がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により切断される。次いで、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生させるために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組み換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近くの標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含み得るか、又はゲノム配列と異なる配列を含み得、そのため、配列編集が可能になる。
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組み換え修復（ＨＤＲ）により標的遺伝子座位に挿入される。標的座位でのＤＮＡの両方の鎖がＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により切断される。次いで、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生させるために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組み換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近くの標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含み得るか、又はゲノム配列と異なる配列を含み得、そのため、配列編集が可能になる。
【0174】
標的遺伝子は、対象での免疫応答と関連し得、ここで、標的遺伝子の少なくとも一部を永続的に欠失させることは、免疫応答を調節することになる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、標的遺伝子は、ＴＣＲα定常領域（ＴＲＡＣ）であり得る。ＴＲＡＣの破壊は、内因性ＴＣＲの機能喪失をもたらす。
【0175】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、セーフハーバー座位に存在する。
【0176】
Ｃ．遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかは、従来法及び／又は本明細書に開示される方法を用いて生成され得る。
本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかは、従来法及び／又は本明細書に開示される方法を用いて生成され得る。
【0177】
（ｉ）遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の生産
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、細胞のゲノムを修飾することによって生産される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子中の部位で二重鎖切断（ＤＳＢ）が誘導される。いくつかの実施形態では、ＤＳＢは、１つ以上の内因性のＤＮＡ修復経路を使用して修復される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路は、相同配列を必要としない（例えば、非相同末端連結経路又はＮＨＥＪ経路）。いくつかの実施形態では、修復経路は、相同配列を必要とする（例えば、相同組み換え経路又はＨＤＲ経路）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、細胞のゲノムを修飾することによって生産される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子中の部位で二重鎖切断（ＤＳＢ）が誘導される。いくつかの実施形態では、ＤＳＢは、１つ以上の内因性のＤＮＡ修復経路を使用して修復される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修復経路は、相同配列を必要としない（例えば、非相同末端連結経路又はＮＨＥＪ経路）。いくつかの実施形態では、修復経路は、相同配列を必要とする（例えば、相同組み換え経路又はＨＤＲ経路）。
【0178】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、エンドヌクレアーゼ、及び１つ以上の非コードＲＮＡとしてのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によりＤＳＢを誘導すること、並びにＨＤＲ及び本明細書に記載されるドナーポリヌクレオチド鋳型を使用してＤＳＢを修復することによって生成される。
【0179】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ＴＲＡＣである標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号１９に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号１８に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号１９に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡは、配列番号２６に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号１８に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡは、配列番号２６に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。
【0180】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２３に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２２に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号２３に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡは、配列番号２６に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号２２に記載される配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡは、配列番号２６に記載されるＴＲＡＣ配列を標的化する。
【0181】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍである標的遺伝子の配列に相補的なｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２１に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２０に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号２１に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡは、配列番号２７に記載されるＢ２Ｍ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号２０に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡは、配列番号２７に記載されるＢ２Ｍ配列を標的化する。
【0182】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２５に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡスペーサーを使用して生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２４に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを使用して生成される。いくつかの実施形態では、配列番号２５に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡは、配列番号２７に記載されるＢ２Ｍ配列を標的化する。いくつかの実施形態では、配列番号２４に記載される配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡは、配列番号２７に記載されるＢ２Ｍ配列を標的化する。
【0183】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号１９に記載の配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡ、及び配列番号２１に記載の配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを用いて生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２３に記載の配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡ、及び配列番号２５に記載の配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを用いて生成される。
【0184】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号１８に記載の配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡ、及び配列番号２０に記載の配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを用いて生成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、配列番号２２に記載の配列を含むＴＲＡＣ ｇＲＮＡ、及び配列番号２４に記載の配列を含むＢ２Ｍ ｇＲＮＡを用いて生成される。
【0185】
本明細書に提供されるｇＲＮＡ配列のいずれに対しても、明示的に修飾を示さないものは、非修飾配列、及び任意の好適な修飾を有する配列の両方を包含することが意図される。
【0186】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸である非相同配列を含むドナー鋳型を使用して生成される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＴＲＡＣである標的遺伝子における配列に対応する相同性アームで構成される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型の５’相同性アーム（左相同性アーム）は、配列番号４５に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型の３’相同性アームは、配列番号４６に記載される配列を含む。
【0187】
いくつかの実施形態では、外因性プロモーターは、配列番号４７に記載される配列を含むＥＦ１ａプロモーターである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号５８に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号７４に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号８４に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号１１１に記載される配列を含む。
【0188】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、及びドナー鋳型をコードするポリヌクレオチドは、従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子導入方法を使用して細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入される。
【0189】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はドナー鋳型などのポリヌクレオチドは、非ウイルスベクター送達系を使用して細胞に送達される。非ウイルスベクター送達系の例としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸、リポソーム、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又はポロキサマーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクター送達系を使用してポリヌクレオチドを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、又は薬剤で増強された取込みが挙げられる。
【0190】
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はドナー鋳型などのポリヌクレオチドは、ウイルスベクター送達系を使用して細胞に送達される。ウイルスベクター送達系の例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0191】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー鋳型は、１つ以上のポリヌクレオチドとして細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー鋳型は、ウイルス送達媒体によって送達される。いくつかの実施形態では、ウイルス送達媒体は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
【0192】
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ポリペプチドとして細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）と別々に細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、１つ以上のゲノム標的化ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）との複合体として細胞に送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼ又は予め複合体を形成したエンドヌクレアーゼは、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正に荷電したペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、又はＲＮＡー融合タンパク質複合体を含むが、これらに限定されない非ウイルス送達媒体によって送達される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼポリペプチド又は予め複合体を形成したエンドヌクレアーゼポリペプチドを細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、又は薬剤に増強された取込みが挙げられる。
【0193】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドは、１つ以上のｓｇＲＮＡと予め複合体を形成して、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）を形成する。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＡＡＶベクターを使用して製剤化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＲＮＰの細胞への送達は、細胞のエレクトロポレーションによって実施される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されるドナー鋳型は、エレクトロポレーションの前に送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されたドナー鋳型は、エレクトロポレーション中に送達される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターとして製剤化されたドナー鋳型は、エレクトロポレーション後に送達される。
【0194】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有する改変Ｔ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、ＴＲＡＣ遺伝子の発現の消失又は低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の発現の消失又は低減は、ＴＣＲの機能の喪失を伴う。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ機能の喪失は、同種異系間移植に好適な（すなわち、ＧｖＨＤを引き起こすリスクを最小化する）改変Ｔ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）ＣＡＲにおいてＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによって生成される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化し、及びＣＡＲにおいてＣＡＲ遺伝子にノックインするｇＲＮＡによって生成される。いくつかの実施形態では、ノックインＣＡＲは、ＤＳＢの部位を取り囲むＴＲＡＣの配列に対応する相同性アームを有するドナー鋳型によって提供される。
【0195】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して実施される遺伝子編集は、破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を有する改変Ｔ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子発現における破壊は、Ｂ２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、コードされる遺伝子産物の転写及び翻訳を破壊するか又は阻害するＢ２Ｍ遺伝子におけるインデルを生成する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現の消失又は低減をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現の消失又は低減は、ＭＨＣ Ｉ複合体の機能の喪失を伴う。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉ機能の喪失は、同種異系間移植に好適な（すなわち、宿主対同種異系Ｔ細胞応答のリスクを最小化する）改変Ｔ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ Ｉ機能の喪失は、同種異系レシピエントにおいて改変Ｔ細胞の残存率の増大をもたらす。
【0196】
（ｉｉ）遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の精製
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ７０、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団は、ゲノム編集の前又は後に活性化及び／又は増殖される。Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖に供される場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書で説明されているような方法を使用して、活性化されて増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化されて増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集後に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化されて増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集と同時に活性化されて増殖される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変ＣＡＲ Ｔ細胞（例えば抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ７０、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞）の集団は、ゲノム編集の前又は後に活性化及び／又は増殖される。Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖に供される場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書で説明されているような方法を使用して、活性化されて増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化されて増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集後に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化されて増殖される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集と同時に活性化されて増殖される。
【0197】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団から検出可能なレベルの関心の表面タンパク質（例えばＴＣＲ）を発現する細胞を実質的に除去するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、関心の細胞（例えばＴＣＲ＋細胞）の実質的な除去は、関心の細胞の０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、又は１０％未満の時に起こる。いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団から検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する細胞を実質的に除去するための方法を提供する。
【0198】
いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞の集団を単離するための方法であって、細胞の集団を提供することであって、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞が破壊されたＴＣＲ遺伝子及び破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、ことと、細胞の集団からＴＣＲ＋Ｔ細胞を除去することであって、それによって＜１．０％のＴＣＲ＋Ｔ細胞を含む細胞の集団を単離する、ことと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む細胞の単離された集団を調製するための方法であって、細胞の集団を提供することであって、改変ＣＡＲ－Ｔ細胞が破壊されたＴＣＲ遺伝子及び破壊されたＢ２Ｍ遺伝子を含む、ことと、細胞の集団からＴＣＲ＋Ｔ細胞を除去することであって、その結果、細胞の集団が＜１．０％のＴＣＲ＋Ｔ細胞を含む、ことと、を含む、方法を提供する。
【0199】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団を提供し、集団中の細胞の０．５％未満が検出可能なレベルのＴＣＲを発現する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ＣＡＲ Ｔ細胞を含む細胞の集団を提供し、集団中の細胞の０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、又は１０％未満が検出可能なレベルのＴＣＲを発現する。
【0200】
集団由来の細胞のサブセットの除去は、従来の細胞精製方法を用いて実施することができる。細胞選別方法の非限定的な例としては、蛍光活性化細胞選別法、免疫磁気分離法、クロマトグラフィー、及びマイクロ流体細胞選別法が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ発現細胞は、免疫磁気分離法によって、改変Ｔ細胞を含む細胞の集団から除去される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞を含む細胞の集団中のＴＣＲ発現細胞は、ＴＣＲを標的化するビオチン化抗体でラベリングされる。いくつかの実施形態では、ラベリングされた細胞は、抗ビオチン電磁ビーズを用いて、改変Ｔ細胞を含む細胞の集団から除去される。
【0201】
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞の特性決定
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、及びＣＡＲの表面タンパク質発現に関して評価される。いくつかの実施形態では、表面タンパク質発現は、当該技術分野で既知の方法を用いて、フローサイトメトリによって決定する。所望の細胞表面マーカー（例えば、抗体）を標的化し、及び蛍光性分子で標識された要素で細胞の集団をラベリングすることによって、フローサイトメトリを用いて、表面マーカーに陽性の集団の一部分、及び表面マーカー発現のレベルを定量化することができる。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の組成をフローサイトメトリによって評価して、細胞表面ＣＡＲ、細胞表面ＴＣＲ、及び細胞表面Ｂ２Ｍで細胞のパーセンテージを決定する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、ＴＣＲ、Ｂ２Ｍ、及びＣＡＲの表面タンパク質発現に関して評価される。いくつかの実施形態では、表面タンパク質発現は、当該技術分野で既知の方法を用いて、フローサイトメトリによって決定する。所望の細胞表面マーカー（例えば、抗体）を標的化し、及び蛍光性分子で標識された要素で細胞の集団をラベリングすることによって、フローサイトメトリを用いて、表面マーカーに陽性の集団の一部分、及び表面マーカー発現のレベルを定量化することができる。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の組成をフローサイトメトリによって評価して、細胞表面ＣＡＲ、細胞表面ＴＣＲ、及び細胞表面Ｂ２Ｍで細胞のパーセンテージを決定する。
【0202】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％（例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％）が、フローサイトメトリによって検出して検出可能なレベルのＣＡＲを発現する。
【0203】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％（例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％）が、フローサイトメトリによって検出して、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％（例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％）が、フローサイトメトリによって検出して、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、減少したレベルのＴＣＲ表面タンパク質又はＢ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％（例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％）が、フローサイトメトリによって検出して、検出可能なレベルのＣＡＲを発現し、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質又は減少したレベルのＢ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
【0204】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞を、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によってＣＡＲのゲノム組み込みに関して評価する。デジタルＰＣＲは、試料中のＤＮＡ濃度の定量化を可能にする。デジタルＰＣＲは、一部の画分がＰＣＲプローブのコピーを含有せず、その他の画分が１つ以上のＰＣＲプローブのコピーを含有するように、ＰＣＲ反応の混合物（例えば、核酸分子の試料、及びＰＣＲプローブのコピーを含有する）を分画することによって実施される。画分のＰＣＲ増幅が実施され、画分はＰＣＲ反応に関して分析される。１つ以上のプローブ及び１つ以上の標的ＤＮＡ分子を含有する画分は陽性のエンドポイントをもたらし、ＰＣＲプローブを含有しない画分は陰性のエンドポイントをもたらす。陽性反応の画分を、続いてポアソン分布に適合させて、非分画試料の所与の体積あたりの標的ＤＮＡ分子の絶対コピー数（すなわち、試料１マイクロリットルあたりのコピー）を決定する（Ｈｉｎｄｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．８３：８６０４－８６１０を参照されたい）。デジタルドロップレットＰＣＲは、核酸の試料が水－油エマルションを用いて液滴に分画されるデジタルＰＣＲの変形である。ＰＣＲ増幅は液滴上で集合的に実施し、ここでは液滴を分離し、各個々の液滴の分析を提供するために流体系を使用する。当業者の場合、コピー数差異分析を提供するか、又はゲノム編集の効率を評価するために、ｄｄＰＣＲを用いて試料中のＤＮＡの絶対的定量を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡを改変Ｔ細胞の組成物から抽出し、ｄｄＰＣＲを用いて、試料組成物あたりのＣＡＲコピーの絶対的定量を決定する。いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡを改変Ｔ細胞の組成物から抽出し、ｄｄＰＣＲを用いて、ＣＡＲ配列からＴＲＡＣ遺伝子座へのＨＤＲ効率を評価する。
【0205】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞のサイトカイン非依存性成長を評価する。改変Ｔ細胞は、刺激性サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７）の存在下でのみ成長することが予期される。サイトカインの不在下での成長は、腫瘍形成能の指標である。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、１つ以上の刺激性サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７）の存在下又は不在下のいずれかで、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、又は２０日間成長する。いくつかの実施形態では、増殖は、従来法（例えば、フローサイトメトリ、鏡検、光学的密度、代謝活性）を用いて、細胞係数及び生存度によって評価される。いくつかの実施形態では、増殖は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目に開始して評価される。いくつかの実施形態では、増殖は、１日毎、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、又は８日毎に評価される。いくつかの実施形態では、サイトカインの不在下での成長は、成長期間の終点で評価される。いくつかの実施形態では、サイトカインの不在下で成長しない改変Ｔ細胞は、腫瘍形成能に欠けるとして定義される。いくつかの実施形態では、成長しないことは、成長期間の開始点と成長期間の終点との間における、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、又は１．５倍未満の集団の増殖として定義される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて生産された改変Ｔ細胞は、培養から１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、又は２０日後に評価して、サイトカインの不在下で成長しないものとして定義される。いくつかの実施形態では、サイトカインの刺激、成長因子の刺激、又は抗原の刺激の不在下では、改変Ｔ細胞は増殖しない。
【0206】
Ｄ．遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞
本開示の遺伝子改変された（遺伝子編集された）ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己由来（「自己」）又は非自己由来（「非自己」、例えば同種異系、同系、又は異種）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「同種異系」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。いくつかの例では、Ｔ細胞は同種異系である。
本開示の遺伝子改変された（遺伝子編集された）ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己由来（「自己」）又は非自己由来（「非自己」、例えば同種異系、同系、又は異種）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「同種異系」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。いくつかの例では、Ｔ細胞は同種異系である。
【0207】
Ｔ細胞を、いくつかの供給源から得ることができ、この供給源として、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態では、Ｔ細胞を、遠心沈降（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）などの当業者に既知の任意の数の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。
【0208】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団が使用される。いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離後、細胞毒性及びヘルパーＴリンパ球の両方は、活性化、増殖及び／又は遺伝子修飾前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー及びエフェクターＴ細胞亜集団に分別され得る。
【0209】
下記の細胞表面マーカー：ＴＣＲａｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＣＨ－Ｉタンパク質及び／又はＭＣＨ－ＩＩタンパク質の１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団が陽性又は陰性選択手法によって更に単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４及び／又はＣＤ８からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団は、陽性又は陰性選択手法により更に単離される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の亜集団は、遺伝子改変前及び／又は遺伝子改変後に陽性又は陰性選択により単離され得る。
【0210】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されないマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に、最初に活性化されてインビトロで増殖するように刺激される。
【0211】
いくつかの実施形態では、ドナーＴ細胞の集団内のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞の量は、遺伝子編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集）後の疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）マーカー及び老化マーカー（例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＣＤ５７）の発現レベルを示す。いくつかの実施形態では、ドナーＴ細胞の集団は、少なくとも４０％、５０％、又は５０％のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４０％、５０％、又は６０％のＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ－Ｔ細胞を含むドナーＴ細胞上の疲弊マーカー又は老化マーカーの発現は、遺伝子編集後に有意に変化しない。
【0212】
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖に供される場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書で説明されているような方法を使用して、活性化及び増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日又は約１日、約２日、約３日若しくは約４日にわたり活性化及び増殖される。
【0213】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子編集組成物のＴ細胞への導入前に約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間又は約７２時間にわたり活性化及び増殖される。
【0214】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物がＴ細胞に導入されるのと同時に活性化される。
【0215】
Ｅ．医薬組成物
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるものなどの遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞の集団、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、遺伝子改変抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、遺伝子改変抗ＣＤ７０ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、又は遺伝子改変抗抗ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）などのＮＫ細胞阻害剤を含む医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、同じく本明細書に開示される、ヒト患者における臨床転帰を改善するための方法で用いることができる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示されるものなどの遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞の集団、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、遺伝子改変抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、遺伝子改変抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、遺伝子改変抗ＣＤ７０ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団、又は遺伝子改変抗抗ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）などのＮＫ細胞阻害剤を含む医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、同じく本明細書に開示される、ヒト患者における臨床転帰を改善するための方法で用いることができる。
【0216】
本明細書で使用する時、「薬学的に許容される」という用語は、正当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に相当する、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症を伴わない、対象の組織、器官、及び／又は体液と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。本明細書で使用する時、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを指す。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば酸付加塩又は塩基付加塩を含んでもよい。例えばＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ ６６：１－１９を参照されたい。
【0217】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される塩を更に含む。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、酸付加塩が挙げられる（無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸を含むポリペプチドの遊離アミノ基から形成される）。いくつかの実施形態では、遊離カルボキシル基で形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄）又は有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される）。
【0218】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、低温保存溶液（例えばＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｃ５５）中に懸濁させた遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む。本開示で使用するための低温保存溶液は、アデノシン、デキストロース、デキストラン－４０、ラクトビオン酸、スクロース、マンニトール、Ｎ－）２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）などの緩衝剤、１種以上の塩（例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸カリウム（ｐｏｓｔａｓｓｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）、リン酸カリウムなど）、１種以上の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、など）、又はこれらの組み合わせも含み得る。低温保存溶液の成分は、滅菌水（注射品質）に溶解させてもよい。低温保存溶液のいずれも、血清を実質的に含まなくてもよい（常法で検出できない）。
【0219】
場合によっては、低温保存溶液（例えば、血清を実質的に含まない）中に懸濁させた遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物を貯蔵バイアルに入れてもよい。
【0220】
任意選択的に本明細書に開示される低温保存溶液に懸濁させることのできる、本明細書に開示されるものなどの遺伝子改変ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む、本明細書に開示される医薬組成物のいずれも、将来の使用のために、例えば、細胞及び組織の貯蔵のために一般に適用される条件下で、Ｔ細胞の生存度及び生物活性に実質的な影響を及ぼさない環境中に貯蔵させてもよい。いくつかの例では、医薬組成物は、≦－１３５℃で液体窒素の蒸気相中に貯蔵することができる。細胞がかかる条件下で一定期間にわたり貯蔵された後で、外観、細胞計数、生存度、ＣＡＲ＋Ｔ細胞百分率、及び遺伝子編集＋Ｔ細胞百分率に関して有意な変化は観察されなかった。
【0221】
ＩＩ．ＮＫ細胞阻害剤
ＮＫ細胞は、先天免疫及び適応免疫の両方で、抗腫瘍及び抗ウイルス反応の媒介を含む重要な役割を果たす。ＮＫ細胞は、その細胞毒性機能を媒介するために事前感作又はプライミングを必要としないため、これらは、喪失した、又は機能していないＭＨＣクラスＩ（例えば、破壊されたＭＨＣクラスＩ、又は破壊されたＭＣＨクラスＩのサブユニット）を有するウイルス感染細胞及び悪性細胞に対する防御の最前線である。ＮＫ細胞は、抗体及び抗原プライミングを必要とすることなく「非自己」細胞を認識する。ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ特異性の阻害性受容体は、ＮＫ細胞の機能を負に調節する。ＮＫ細胞阻害性受容体とこれらのＭＨＣクラスＩリガンドとの係合により、ＮＫ細胞媒介性の溶解が点検される。ＭＨＣクラスＩによって破壊された細胞が、阻害性ＮＫ受容体（例えば、ＫＩＲ）との結合に失敗した場合、細胞は、ＮＫ細胞媒介性の溶解を受けやすくなる。この現象は、「自己認識の喪失」とも称される。例えば、Ｍａｌｍｂｅｒｇ ＫＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１７），６９：５４７－５５６；Ｃｒｕｚ－Ｍｕｎｏｚ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（２０１９），１０５：９５５－９７１を参照されたい。
ＮＫ細胞は、先天免疫及び適応免疫の両方で、抗腫瘍及び抗ウイルス反応の媒介を含む重要な役割を果たす。ＮＫ細胞は、その細胞毒性機能を媒介するために事前感作又はプライミングを必要としないため、これらは、喪失した、又は機能していないＭＨＣクラスＩ（例えば、破壊されたＭＨＣクラスＩ、又は破壊されたＭＣＨクラスＩのサブユニット）を有するウイルス感染細胞及び悪性細胞に対する防御の最前線である。ＮＫ細胞は、抗体及び抗原プライミングを必要とすることなく「非自己」細胞を認識する。ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ特異性の阻害性受容体は、ＮＫ細胞の機能を負に調節する。ＮＫ細胞阻害性受容体とこれらのＭＨＣクラスＩリガンドとの係合により、ＮＫ細胞媒介性の溶解が点検される。ＭＨＣクラスＩによって破壊された細胞が、阻害性ＮＫ受容体（例えば、ＫＩＲ）との結合に失敗した場合、細胞は、ＮＫ細胞媒介性の溶解を受けやすくなる。この現象は、「自己認識の喪失」とも称される。例えば、Ｍａｌｍｂｅｒｇ ＫＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１７），６９：５４７－５５６；Ｃｒｕｚ－Ｍｕｎｏｚ ＭＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．（２０１９），１０５：９５５－９７１を参照されたい。
【0222】
したがって、本明細書に記載される破壊されたＭＨＣクラスＩを含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞媒介性の溶解を受けて、そのために改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の残存率及びそれに続く効力を減少させやすい。
【0223】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞療法と併用して使用するためのＮＫ細胞阻害剤を提供する。
【0224】
本明細書に記載される方法で使用されるＮＫ細胞阻害剤は、直接的又は間接的のいずれかでＮＫ細胞の活性又は数をブロックし、抑制し、又は減少させる分子であり得る。「阻害剤」という用語は、いかなる生物学的作用の特定の機序も暗示せず、また、直接的又は間接的に関わらず、ＮＫ細胞との全ての可能な薬理学的、生理学的、及び生化学的相互作用を明示的に含み且つ包含するものとみなされる。本開示の目的において、「阻害剤」という用語が、これまでに特定された用語、表題、並びに機能状態及び機能特性を全て包含し、それによってＮＫ細胞自体、ＮＫ細胞の生物活性（細胞死滅を媒介するその能力が挙げられるがこれに限定されない）、又は生物活性の結果が、任意の有意な程度、例えば、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、若しくは５００％、又は１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、若しくは１０4倍で実質的に無効化、低減、又は中和されることが明白に理解されよう。
【0225】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞の絶対数を減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、末梢血単核細胞中のＮＫ細胞頻度を減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％減少する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象におけるＮＫ細胞の総数を、ＮＫ細胞阻害剤を受ける前の対象におけるＮＫ細胞の総数と比較して減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、血液１μＬあたり少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、又は１８０ＮＫ細胞まで減少する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、血液１μＬあたり２００ＮＫ細胞未満まで減少する。
【0226】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、内因性Ｔ細胞の数を有意に減少させない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞阻害剤治療前のＴ細胞数と比較して、内因性Ｔ細胞数を８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、又は１１０％のＴ細胞数に維持する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、内因性Ｔ細胞数を血液１μＬあたり約１５００Ｔ細胞に維持する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、内因性Ｔ細胞数を血液１μＬあたり約１２７５、１３５０、１４２５、１５００、１５７５、又は１６５０Ｔ細胞に維持する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の数を有意に減少させない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞阻害剤の不在下での改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の数と比較して、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞数を増加させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を有意に活性化させない。
【0227】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＴ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を、ＮＫ細胞阻害剤の不在下での改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解と比較して約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、インビボで改変ヒトＴ細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を減少させる。
【0228】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞活性を減少させる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞阻害剤を投与することによりＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象におけるＮＫ細胞活性を減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、アポトーシス、又はこれらの組み合わせを減少させる。
【0229】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を減少させる。ＮＫ細胞は、その細胞表面上にＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＣを発現する。Ｆｃ受容体は、抗体のＦｃ部分に結合する。一旦結合すると、Ｆｃ受容体は、免疫チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを伝達し、下流ＮＫ細胞の脱顆粒、サイトカイン分泌（例えば、ＩＦＮ－γ）、及び細胞溶解をもたらす。
【0230】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性の抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）を減少させる。ＡＤＣＰは、抗体のＦｃ部分がマクロファージ上でＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、又はＦｃγＲＩと係合すると発生する。マクロファージ上でのＦｃ受容体の係合は、標的細胞の細胞貪食作用をトリガし、その結果、マクロファージが標的細胞、例えば改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を取り込んで消失させる。
【0231】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を減少させる。細胞表面、例えばＮＫ細胞表面に結合した抗体は、古典的経路を介して補体の活性化をトリガする。補体の活性化は、細胞溶解、細胞貪食作用、走化作用、及び免疫細胞の活性化を誘起する。補体成分Ｃ１は、抗体のＦｃ部分を認識し、抗体結合時に活性化する。Ｃ１の活性化は、酵素活性化のカスケードをトリガし、これが蓄積して補体成分Ｃ３からＣ３ａ及びＣ３ｂへの開裂、及び活性化をもたらす。Ｃ３ｂは、細胞表面上でオプソニン化し、Ｃ５ｂ～Ｃ９成分の下流活性化をトリガして、標的細胞の膜上に膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成させ、膜破壊及び細胞溶解をもたらす。
【0232】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性アポトーシスを減少させる。ＮＫ細胞が受容体結合を介して標的細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を認識してこれに係合すると、免疫学的シナプス（ＩＳ）は、微小管形成を分極化させる細胞骨格再構築を介して形成され、ＮＫ溶解酵素の標的細胞への輸送及び放出を可能にする。例示的な溶解酵素としては、グランザイムＢ、パーフォリン、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、及びグラニュロシン（ｇｒａｎｕｌｏｓｙｎ）が挙げられる。セリンプロテアーゼであるグランザイムＢは、カスパーゼ８及びカスパーゼ３などのプロアポトーシス分子を直接開裂することによって、カスパーゼ依存性経路を介してアポトーシスをトリガする。グランザイムＢはまた、ミトコンドリアからシトクロムＣの放出を生じさせるプロアポトーシス分子であるＢｉｄを開裂させることによってアポトーシスを誘発する。溶解脱顆粒の他に、ＮＫ細胞上のＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＴＮＲ関連アポトーシス誘発性リガンド（ＴＲＡＩＬ）分子も、細胞死を誘発する。これらの受容体は、標的細胞上で死受容体ＴＲＡＩＬＲ及びＦａｓに結合してこれらを活性化し、カスパーゼ及びＩＬ１β変換酵素（ＩＣＥ）プロテアーゼを伴いプロアポトーシスのカスケードをトリガする。
【0233】
細胞溶解機能に加えて、ＮＫ細胞はまた炎症性及び免疫抑制性サイトカインの分泌を介してこれらの免疫調節機能を発揮する。標的細胞と接触すると、ＮＫ細胞はＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦなどを分泌する。これらのサイトカインは、Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及び好中球を活性化する。ＮＫ細胞は、更に、エフェクター細胞を活性化部位に誘引するケモカイン、例えば、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、リンホトキシン、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）も分泌する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞の免疫調節機能を減少させる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、炎症性サイトカインの分泌を減少させ、その結果、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の活性化誘発性細胞死が低減する。
【0234】
ＮＫ細胞の活性を判定するためのインビトロ及びインビボ実験は、当該技術分野において既知である。例示的なアッセイとしては、細胞溶解アッセイ、ＡＤＣＣアッセイ、サイトカイン分泌を判定するためのフローサイトメトリアッセイ、アポトーシス誘導、脱顆粒、ＣＤＣ又はＮＫ細胞増殖が挙げられる。例えば、Ｈｕａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１３），５７：２７７－２８８；欧州特許第２６５８８７１Ｂ１号明細書；Ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１）１８６：１８４０－８；欧州特許第１７２０９０７Ｂ１号明細書；米国特許第７，８２９，６７３号明細書、同第９，９４４，７１１号明細書を参照されたい。
【0235】
Ａ．例示的なＮＫ細胞阻害剤
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、小分子、モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、小分子、モノクローナル抗体、若しくはその抗原結合性フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はこれらの組み合わせである。
【0236】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は小分子である。例示的な小分子ＮＫ阻害剤は、ルキソリチニブ（Ｊａｋａｆｉ（登録商標））である。ルキソリチニブは、骨髄線維症の治療に用いられるヤヌスキナーゼ阻害剤である。ルキソリチニブは、タンパク質チロシンキナーゼＪＡＫ１及び２に結合してこれを阻害する。ルキソリチニブで治療された患者は、感染率の増加を示した。ルキソリチニブは、ＮＫ細胞の増殖、サイトカイン誘導性受容体発現、及びＮＫ細胞機能を減少させ、これとしては、例えば、死滅の減少、脱顆粒の減少、ＩＦＮ－γ産生の減少、及びサイトカインシグナル伝達の減少が挙げられる（Ｓｃｈｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１４），１２４（２１）：３１６９）。ルキソリチニブの構造、及びルキソリチニブを調製する方法は、例えば、米国特許第７，５９８，２５７号明細書、同第８，４１５，３６２号明細書、同第８，７２２，６９３号明細書、同第８，８８２，４８１号明細書、同第８，８２９，０１３号明細書、及び同第９，０７９，９１２号明細書に見出される。ＮＫ細胞の機能を阻害する更なる例示的な小分子免疫抑制薬は、Ｐｒａｄｉｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｕｎｏｌ．（２０１９），１０：５５６に記載されている。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ルキソリチニブ、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、タクロリムス（ＴＡＣ）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、エベロリムス、又はラパマイシンである。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤はポリペプチドである。ＨＬＡ－Ｇは、ヒト胎盤及び胸腺上皮細胞中に発現する非古典的なクラスＩ抗原である。胎盤上のＨＬＡ－Ｇ抗原の発現は、母体の免疫拒絶から胎児を保護する。Ｒｏｕａｓ－Ｆｒｅｉｓｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９７），９４：５２４９－５２５４。ＨＬＡ－Ｇ遺伝子は、或いは、スプライスされて、膜結合ＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、及びＨＬＡ－Ｇ４）及び可溶性ＨＬＡ－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６、及びＨＬＡ－Ｇ７）をコードするＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡを転写する。がん細胞上のＨＬＡ－Ｇ発現は、ＮＫ媒介性細胞溶解からＢ細胞リンパ腫を保護する。同様に、ＨＬＡ－Ｇ１及びＨＬＡ－Ｇ２イソ型をＫ５６２標的細胞にトランスフェクトすることで、ＮＫ様ＹＴ２Ｃ２Ｔ細胞白血病クローンにより媒介される細胞毒性が消滅した。細胞外ＨＬＡ－Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、又はＧ４をトランスフェクトした標的細胞も、細胞溶解アッセイでＮＫ細胞の細胞毒性活性を阻害した。例えば、欧州特許第１１８９６２７号明細書の実施例３を参照されたい。微小球に製剤化され、同種異系皮膚移植を受けるマウスに腹腔内投与されるβ２ＭスペーサーＨＬＡ－Ｇ５を含む組み換え融合ポリペプチドは、移植免疫寛容を改善することができた。例えば、欧州特許第２１８４２９７Ａ１号明細書を参照されたい。追加のＨＬＡ－Ｇ組み換えタンパク質も、組織拒絶に対する潜在的療法として試験した。例えば、Ｆａｖｉｅｒ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１１），６（７）：ｅ２１０１１；欧州特許第２２６４０６７Ａ１号明細書を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３、ＧＬＡ－Ｇ４、β２Ｍ－ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇアルファ１ドメイン－Ｆｃ、又はＨＬＡ－Ｇアルファ１である。
【0238】
いくつかの実施形態では、細胞は、追加のＭＨＣクラスＩ遺伝子編集を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＭＨＣクラスＩ遺伝子を含むように改変可能である。いくつかの実施形態では、細胞は、機能性タンパク質をコードする外因性遺伝子を含むように改変可能である。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性遺伝子、検出可能なレベル（例えば、抗体によって、例えば、フローサイトメトリによって）の、外因性遺伝子によってコードされたタンパク質を（例えば細胞表面に）発現するように改変可能である。検出可能なレベルの外因性タンパク質を発現する細胞は、ノックイン細胞と称され得る。例えば、ＭＨＣクラスＩ遺伝子編集を有する細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上の１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を使用してＭＨＣクラスＩ分子が細胞表面で検出される場合、ＭＨＣクラスＩノックイン細胞とみなされ得る。
【0239】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドとしては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞に送達するために脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）へと製剤化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、特定の細胞型に送達するためにコンジュゲートされる。例えば、肝細胞を標的化するため、三価Ｎ－アセチルガラクトサミン受容体（ＧａｌＮＡｃ）にコンジュゲートされるｓｉＲＮＡ。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＣｐＧヌクレオチドにコンジュゲートされ、ＣｐＧヌクレオチドは樹状細胞又はマクロファージ状の受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはベクター中で送達される。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクター又はＤＮＡ小環である。いくつかの実施形態では、ベクターは組み換えウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組み換えウイルスは、組み換えポックスウイルス、組み換えヘルペスウイルス、組み換えアデノウイルス、組み換えレンチウイルス、又は組み換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、及びこれらの組み合わせである。非限定的な例では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫＧ２Ｄ受容体を標的化するｓｈＲＮＡである。Ｈｕａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１３），５７：２７７－２８８。３つのマウスＮＫＧ２Ｄを標的化するｓｈＲＮＡを含有するプラスミドをマウスに注射すると、ＮＫ媒介性細胞溶解が減少する。別の実施形態では、ウイルス性肝炎を患う患者のＮＫ細胞中でカリウムチャネル四量体化ドメイン含有９（ＫＣＴＤ９）タンパク質は上昇する。Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８），１９：２０。ＫＣＴＤ９標的化ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドをマウス肝炎モデルに注射した結果、マウスの生存率が増加した。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤はＮＫＧ２Ｄ ｓｈＲＮＡ、又はＫＣＴＤ９ ｓｈＲＮＡである。
【0240】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤はモノクローナル抗体である。ＮＫ細胞の活性を減少させる抗体の非限定的な例は、オーストラリア国特許出願公開第２００５３２１０１７Ｂ２号明細書（抗ＮＫＧ２Ａ抗体）、米国特許出願公開第２００３００９５９６５Ａ１号明細書（ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に対する二価抗体）、米国特許第９，２１１，３２８号明細書（ＮＫＧ２Ｄに対する抗体）、及び米国特許第７，８２９，６７３号明細書（ＣＤ３８に対する抗体）に開示される。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体に対する二価抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、又は抗ＣＤ３８抗体である。
【0241】
Ｂ．ＣＤ３８に結合する抗体（抗ＣＤ３８抗体）
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法で使用するための、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性フラグメントを提供する。環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、細胞内カルシウムイオン動員メッセンジャーである環状アデノシン５’－二リン酸リボースを合成して加水分解する４６－ｋＤａタイプＩＩ膜貫通糖タンパク質である。多機能タンパク質であるＣＤ３８は、受容体媒介性の細胞接着及びシグナル伝達にも関与している。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法で使用するための、ＣＤ３８に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性フラグメントを提供する。環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼとしても知られるＣＤ３８は、細胞内カルシウムイオン動員メッセンジャーである環状アデノシン５’－二リン酸リボースを合成して加水分解する４６－ｋＤａタイプＩＩ膜貫通糖タンパク質である。多機能タンパク質であるＣＤ３８は、受容体媒介性の細胞接着及びシグナル伝達にも関与している。
【0242】
本明細書で使用する抗体（複数の形態で互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子であって、この免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな（即ち完全長）モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダＶＨＨ抗体又はラマＶＨＨ抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント及び共有結合的に修飾された抗体等、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。
【0243】
典型的な抗体分子は、抗原結合に通常関与する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合に関与するこれらの領域／残基は、当技術分野で既知の方法により、参照抗体（例えば、本明細書で説明されている抗ＣＤ３８抗体）のＶＨ／ＶＬ配列のアミノ酸配列から同定され得る。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として既知である、より保存されている領域が挿入された、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても既知である超可変領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、下記の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当技術分野で既知の方法論を使用して、例えば全てが当技術分野で公知であるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義及び／又はｃｏｎｔａｃｔ定義により、正確に同定され得る。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、当技術分野で既知の任意の方法により定義されたＣＤＲを指し得る。同一のＣＤＲを有する２つの抗体は、これら２つの抗体が、同一の方法により決定されたＣＤＲと同じアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８；及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照されたい。
【0244】
抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ若しくはＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、及び抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、各種クラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、下記の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）に更に分類され得、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分類され得る。免疫グロブリンの各種クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造及び三次元配置は、公知である。
【0245】
本明細書に記載されているように使用される抗体は、マウス、ラット、ヒト又は任意の他の起源（キメラ抗体若しくはヒト化抗体を含む）であり得る。いくつかの例では、抗体は、免疫学的に不活性である（例えば、補体に媒介される溶解をトリガしないか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない）定常領域などの修飾された定常領域を含む。
【0246】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はこれらの抗原結合性フラグメントである非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能を更に洗練させ且つ最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインを実質的に全て含むことになる。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域又はドメイン（Ｆｃ））の少なくとも一部も含むことになる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に関して改変された１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、及び／又は６つ）を有する。ヒト化抗体は、親和性成熟も伴い得る。
【0247】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体由来の重定常領域及び軽定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種に由来する可変領域又は可変領域の部分と、第２の種に由来する定常領域とを有する抗体を指す。典型的には、このキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ及びラットなどの非ヒト哺乳動物）の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、可変領域及び／又は定常領域においてなされ得る。
【0248】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、標的抗原（例えば、ヒトＣＤ３８）に特異的に結合する。標的又はエピトープに「特異的に結合する」（本明細書では互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当技術分野でよく知られている。分子は、代替の標的よりも特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するより高い親和性で、より高い結合活性で、より迅速に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、ＣＤ３８エピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、同じ抗原又は異なる抗体のその他のエピトープに結合するよりも、より高い親和性で、より高い結合活性で、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこのエピトープに結合する抗体である。これは、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的又は優先的に結合し得るか又はし得ないというこの定義を読むことによっても理解される。そのため、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を（含むことはできるが）必要とするものではない。一般に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、優先的な結合を意味する。
【0249】
本明細書に開示されている例示的な抗体のいずれかの機能的バリアントも本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体と比較して、ＶＨ及び／若しくはＶＬにおいて、又はＨＣ ＣＤＲの１つ以上及び／又はＶＬ ＣＤＲの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基の変異を含み得るが、この参照抗体と実質的に同様の結合活性及び生物学的活性（例えば、実質的に同様の結合親和性、結合特異性、阻害活性、抗腫瘍活性又はこれらの組み合わせ）を保持している。
【0250】
場合により、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用される場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特徴を変えないアミノ酸置換を指す。バリアントは、こうした方法をまとめた参考文献、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に既知のポリペプチド配列を改変するための方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換として、下記の群内のアミノ酸の中でなされる置換が挙げられる：（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。
【0251】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される併用療法で使用されるＮＫ細胞阻害剤は、抗ＣＤ３８抗体である。ＣＤ３８は、リンパ系細胞、赤血球系細胞、及び骨髄性細胞を含む多くの免疫細胞上で発現する。更に、ＣＤ３８は、多発性骨髄腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びＴ細胞ＡＬＬを含む様々な白血病、骨髄腫、及び固形腫瘍中で高度に発現する。ＣＤ３８は、リンパ球活性化のマーカーであり、慢性リンパ性白血病を患う患者のための予後マーカーとして使用される。
【0252】
例示的なヒトＣＤ３８タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５９（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ００１７６６．２）に提供される。例示的なヒトＣＤ３８タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列は、配列番号６０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１７７５．４）に提供される（ホモサピエンスＣＤ３８分子（ＣＤ３８）、転写産物変異体１）。ヒトＣＤ３８に特異的に結合する抗体を生成するための方法は当業者に既知である。
【0253】
抗ＣＤ３８抗体は、様々な前臨床研究及び臨床研究で、例えば、ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、免疫グロブリンに関して試験されてきた。抗腫瘍特性に関して試験された例示的な抗ＣＤ３８抗体としては、ＣＤ３８＋Ｂ細胞悪性腫瘍を患う患者における第１相臨床試験におけるＳＡＲ６５０９８４（イサツキシマブ、キメラｍＡｂとも称される）（Ｄｅｃｋｅｒｔ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．（２０１４）：２０（１７）：４５７４－８３）、ＭＯＲ２０２（ＭＯＲ０３０８７、完全ヒトｍＡｂとも称される）、及びＴＡＫ－０７９（完全ヒトｍＡｂ）が挙げられる。
【0254】
いくつかの実施形態では、本開示で使用するための抗ＣＤ３８抗体としては、ＳＡＲ６５０９８４（イサツキシマブ）、ＭＯＲ２０２、Ａｂ７９、Ａｂ１０、ＨＭ－０２５、ＨＭ－０２８、ＨＭ－０３４；並びに米国特許９，９４４，７１１号明細書、米国特許７，８２９，６７３号明細書、国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレット、同第２００８／０４７２４２号パンフレット、同第２０１２／０９２６１２号パンフレット、及び欧州特許第１７２０９０７Ｂ１号明細書で開示される抗体が挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗ＣＤ３８抗体は、本明細書に開示される参照抗体のいずれかの機能的バリアントであり得る。こうして機能的バリアントは、参照抗体として同じ重鎖及び軽鎖相補性決定領域を含み得る。いくつかの例では、機能的バリアントは、参照抗体と同じ重鎖可変領域及び同じ軽鎖可変領域を含み得る。
【0255】
いくつかの実施形態では、本開示で使用するための抗ＣＤ３８抗体はダラツムマブである。ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）、ＨｕＭａｘ－ＣＤ３８、又はＩｇＧ１－００５とも称される）は、ＣＤ３８を標的化する完全ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体であり、多発性骨髄腫の治療に認可済みである。これは、新規に診断された、又は過去に治療を受けた多発性骨髄腫患者を治療するための単剤療法又は併用療法として使用されている。ダラツムマブは、米国特許第７，８２９，６７３号明細書及び国際公開第２００６／０９９８７５号パンフレットで説明されている。
【0256】
ダラツムマブは、ＣＤ３８のアミノ酸２３３～２４６及び２６７～２８０に位置する２つのβストランドを含むＣＤ３８上のエピトープに結合する。ＣＤ３８変異体ポリペプチドを用いた実験は、Ｓ２７４アミノ酸残基が、ダラツムマブの結合に重要であることを示す。（ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ ＮＷＣＪ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２０１６）２７０：９５～１１２）。ＣＤ３８に対するダラツムマブの結合配向により、Ｆｃ受容体媒介性の下流免疫プロセスが可能となる。
【0257】
リンパ腫及び多発性骨髄腫療法としてのダラツムマブに起因する作用機序としては、などのＦｃ依存性エフェクター機序補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介性抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）（Ｄｅ Ｗｅｅｒｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１１）１８６：１８４０－８）、抗体媒介性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）（Ｏｖｅｒｄｉｊｋ ＭＢ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ（２０１５），７（２）：３１１－２１）、及び架橋後アポトーシス（ｖａｎ ｄｅ Ｄｏｎｋ ＮＷＣＪ ａｎｄ Ｕｓｍａｎｉ ＳＺ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８），９：２１３４）が挙げられる。
【0258】
ダラツムマブの完全重鎖アミノ酸配列は、配列番号６１に記載されており、ダラツムマブの完全軽鎖アミノ酸配列は、配列番号６３に記載されている。ダラツムマブの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６２に記載されており、ダラツムマブの軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号６４に記載されている。ダラツムマブは、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２、及び３（それぞれ配列番号６５、６６、及び６７）、並びに軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）１、２、及び３（それぞれ配列番号 ６８、６９、及び７０）を含む。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ＣＤ３８に結合するモノクローナル抗体を生成するために用いられ得る。例えば、ダラツムマブを製造するための方法は、米国特許第７，８２９，６７３号明細書に記載されている（参照により本明細書で参照される目的及び主題に関して組み込まれる）。
【0259】
いくつかの実施形態では、本開示で使用するための抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ、ダラツムマブと同じ機能的特徴を有する抗体、又はダラツムマブと同じエピトープに結合する抗体である。
【0260】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、（ａ）免疫グロブリン重鎖可変領域及び（ｂ）免疫グロブリン軽可変領域（ｌｉｇｈｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、ここで重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、ＣＤ３８の結合部位（パラトープ）を画定する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号６５に記載されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号６６に記載されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列は、免疫グロブリンフレームワーク（ＦＲ）配列によって分離される。
【0261】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、（ａ）免疫グロブリン軽鎖可変領域及び（ｂ）免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、ここで軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ＣＤ３８の結合部位（パラトープ）を画定する。いくつかの実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号６８に記載されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号６９に記載されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列は、免疫グロブリンフレームワーク（ＦＲ）配列によって分離される。
【0262】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、及び免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、配列番号６２に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、７０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％同一なアミノ酸配列を含むＶＨを含み、また、配列番号６４に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、７０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％同一なアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【0263】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３にあるとおりに修正されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを用いて決定される。こうしたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間のギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されるとおりに利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラムのデフォルトパラメーター（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる。
【0264】
ＣＤ３８は、ＮＫ細胞上で発現し、ダラツムマブの注入は、末梢血及び骨髄中のＮＫ細胞の減少をもたらす。ＮＫ細胞の減少は、ＡＤＣＣを介したＮＫ細胞の死滅に起因し、ここでＮＫ細胞は隣接するＮＫ細胞の細胞毒性死滅を媒介する。ダラツムマブの投与も、骨髄由来サプレッサ細胞、制御性Ｔ細胞、及び制御性Ｂ細胞の細胞数を低減させることが示されている。制御免疫細胞が消失した結果、Ｔ細胞応答が増加し、Ｔ細胞数が増加する（Ｊ Ｋｒｅｊｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１６），１２８（３）：３８４－３９４）。
【0265】
したがって、いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体（例えば、ダラツムマブ）、ＮＫ細胞の絶対数を減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＰＢＭＣ中のＮＫ細胞のパーセンテージを減少させる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、Ｆｃ媒介機序を介してＮＫ細胞の活性を阻害する。その他の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＣＤＣを介したＮＫ細胞の死滅を媒介する。その他の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＡＤＣＣを介したＮＫ細胞の死滅を媒介する。その他の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＮＫ細胞の細胞貪食作用を増強する。その他の実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ＦｃγＲ媒介架橋後にアポトーシス誘導を増強する。
【0266】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブ、又はダラツムマブと同じ機能的特徴を有する抗体、例えばダラツムマブの機能的バリアントである。いくつかの例では、機能的バリアントは、ダラツムマブと実質的に同じＶＨ及びＶＬ ＣＤＲを含む。例えば、これは、抗体の合計ＣＤＲ領域中に最大で８個（例えば８、７、６、５、４、３、２、又は１個）のみのアミノ酸残基の変異を含むことができ、ダラツムマブと実質的に同様の親和性（例えば、同じ順序でＫＤ値を有する）を備えたＣＤ３８の同じエピトープに結合する。場合によっては、機能的バリアントは、ダラツムマブと同じ重鎖ＣＤＲ３、及び任意選択的にダラツムマブと同じ軽鎖ＣＤＲ３を有し得る。或いは、又は加えて、機能的バリアントは、ダラツムマブと同じ重鎖ＣＤＲ２を有し得る。こうした抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブのＶＨと比較して、重鎖ＣＤＲ１にのみＣＤＲアミノ酸残基の変異を有するＶＨフラグメントを含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブと同じＶＬ ＣＤＲ３、及び任意選択的に同じＶＬ ＣＤＲ１又はＶＬ ＣＤＲ２を有するＶＬフラグメントを更に含み得る。或いは、又は加えて、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る（上記の開示を参照されたい）。
【0267】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブのＶHＣＤＲと比較して、個々に又は集合的に少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、又は９８％）配列同一性である重鎖ＣＤＲを含み得る。或いは、又は加えて、抗ＣＤ３８抗体は、ダラツムマブとしてのＶLＣＤＲと比較して、個々に又は集合的に少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、又は９８％）配列同一性である軽鎖ＣＤＲを含み得る。本明細書で使用する時、「個々に」とは、抗体のＣＤＲが、ダラツムマブの対応するＣＤＲに対して、示された配列同一性を共有することを意味する。「集合的に」とは、抗体の３つのＶH又はＶLＣＤＲが、組み合わせで、ダラツムマブの対応する３つのＶH又はＶLＣＤＲに対して、示される配列同一性を共有することを意味する。
【0268】
いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ヒトＣＤ３８上のダラツムマブによって結合された同じエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３８抗体は、ヒトＣＤ３８への結合に関してダラツムマブと競合する。
【0269】
抗体が、ＣＤ３８への結合に関してダラツムマブと同じエピトープに結合するか、又はダラツムマブと競合するかを判定するための競合アッセイは、当技術分野において既知である。例示的な競合アッセイとしては、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡコア分析）、生体層干渉法、及びフローサイトメトリが挙げられる。
【0270】
競合アッセイは、通常は、不動化抗原（例えばＣＤ３８）、試験抗体（例えばＣＤ３８結合抗体）及び参照抗体（例えばダラツムマブ）を伴う。参照又は試験抗体のうちいずれか一方がラベリングされ、もう一方はラベリングされない。いくつかの実施形態では、競合的結合は、漸増濃度の試験抗体中で不動化抗原に結合した参照抗体の量によって決定される。参照抗体と競合する抗体としては、参照抗体と同じか又は重複するエピトープに結合する抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、試験抗体は、隣接する非重複エピトープに結合し、その結果、抗体の近接性によって、抗原に対する参照抗体の結合に影響を及ぼすのに十分な立体障害が生じる。
【0271】
競合アッセイは、ラベル又は立体障害の存在が、エピトープへの結合に干渉するか又はこれを阻害しないことを保証するために、両方の方向で行われてよい。例えば、第１の方向では、参照抗体はラベリングされ、試験抗体はラベリングされない。第２の方向では、試験抗体はラベリングされ、参照抗体がラベリングされない。別の実施形態では、第１の方向で、競合的結合を測定するために、参照抗体が不動化抗原に結合し、漸増濃度の試験抗体が添加される。第２の方向で、競合的結合を測定するために、試験抗体が不動化抗原に結合され、漸増濃度の参照抗体が添加される。
【0272】
いくつかの実施形態では、抗原中で一方の抗体の結合を減少又は消失させる本質的に全てのアミノ酸変異が、もう一方の結合を低減又は消失させる場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると判定され得る。一方の抗体の結合を減少又は消失させる変異のサブセットのみが、もう一方の結合を低減又は消失させる場合、２つの抗体は重複するエピトープに結合すると判定され得る。
【0273】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ３８抗体（例えばダラツムマブ）のうちのいずれかの重鎖は、重鎖定常領域（ＣＨ）又はその一部分（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はこれらの組み合わせ）を更に含み得る。重鎖定常領域は、任意の好適な起源、例えばヒト、マウス、ラット、又はウサギのものであってよい。或いは、又はそれに加えて、抗ＣＤ３８抗体の軽鎖は、当該技術分野で既知の任意の軽鎖定常領域（ＣＬ）であり得るＣＬを更に含み得る。いくつかの例では、ＣＬはカッパ軽鎖である。その他の例では、ＣＬはラムダ軽鎖である。抗体重鎖及び軽鎖定常領域は、当該技術分野で周知されている（例えば、そのどちらも参照により本明細書に組み込まれる、ＩＭＧＴデータベース（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）又はｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／ｖｂｓｔａｔ．ｐｈｐで提供されるもの）。
【0274】
ヒト抗体又はヒト化抗体を含む抗ＣＤ３８抗体のいずれも、従来型のアプローチ、例えば、ハイブリドーマ技術、抗体ライブラリスクリーニング、又は組み換え技術によって調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，（１９９８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、国際公開８７／０４４６２号パンフレット、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１、及びＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（１９８９）を参照されたい。
【0275】
記載される抗体は例示に過ぎず、任意の抗ＣＤ３８抗体が、本明細書に開示される組成物及び方法で使用され得ることを理解されたい。抗体を生産するための方法は、当業者に既知である。
【0276】
ＩＩＩ．併用療法
いくつかの態様では、本開示は、併用療法を投与される対象（例えばヒト患者）の臨床転帰を改善するために、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、及びＮＫ細胞阻害剤のいずれかを伴う併用療法を提供する。いくつかの実施形態では、併用療法は、有効量の本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を投与されているか、又は投与済みである対象に投与することを含む。その他の実施形態では、併用療法は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を投与されているか、又は投与済みである対象に投与することを含む。更にその他の実施形態では、併用療法は、有効量の遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団及び有効量のＮＫ細胞阻害剤を、同時的に又は逐次的にのいずれかで対象に投与することを含む。
いくつかの態様では、本開示は、併用療法を投与される対象（例えばヒト患者）の臨床転帰を改善するために、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、及びＮＫ細胞阻害剤のいずれかを伴う併用療法を提供する。いくつかの実施形態では、併用療法は、有効量の本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を、これも本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤を投与されているか、又は投与済みである対象に投与することを含む。その他の実施形態では、併用療法は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を投与されているか、又は投与済みである対象に投与することを含む。更にその他の実施形態では、併用療法は、有効量の遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団及び有効量のＮＫ細胞阻害剤を、同時的に又は逐次的にのいずれかで対象に投与することを含む。
【0277】
Ａ．臨床転帰の改善
本明細書で使用する時、「臨床転帰」とは、併用療法から得られた、ＣＡＲ－Ｔ細胞単剤療法及び／又はＮＫ細胞阻害剤単剤療法と比較して治療効力の改善につながる。対象における１つ以上の治療的効果（直接的又は間接的な）を指す。いくつかの例では、改善された臨床転帰は、１つ以上の実際の治療的利点、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する臨床応答の増加（例えば、疾患負荷の減少、１つ以上の病気の症状の緩和、及び／又は生存率の延長）を含む。がん療法との関係においては、治療的利点は、腫瘍容積の低減、腫瘍細胞数の減少、及び／又は抗腫瘍応答の増加を含み得る。或いは、改善された臨床転帰は、最終的に治療的利点につながる、１つ以上の望ましい特徴の強化、及び／又は１つ以上の望ましくない特徴の減少を含む。例えば、改善された臨床転帰は、対象における改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率の増加、ＮＫ細胞によって誘導され得るＣＡＲ－Ｔ細胞溶解の低減、ＮＫ細胞の減少、又はこれらの組み合わせを含み得る。
本明細書で使用する時、「臨床転帰」とは、併用療法から得られた、ＣＡＲ－Ｔ細胞単剤療法及び／又はＮＫ細胞阻害剤単剤療法と比較して治療効力の改善につながる。対象における１つ以上の治療的効果（直接的又は間接的な）を指す。いくつかの例では、改善された臨床転帰は、１つ以上の実際の治療的利点、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する臨床応答の増加（例えば、疾患負荷の減少、１つ以上の病気の症状の緩和、及び／又は生存率の延長）を含む。がん療法との関係においては、治療的利点は、腫瘍容積の低減、腫瘍細胞数の減少、及び／又は抗腫瘍応答の増加を含み得る。或いは、改善された臨床転帰は、最終的に治療的利点につながる、１つ以上の望ましい特徴の強化、及び／又は１つ以上の望ましくない特徴の減少を含む。例えば、改善された臨床転帰は、対象における改変ヒトＣＡＲ－Ｔ細胞の残存率の増加、ＮＫ細胞によって誘導され得るＣＡＲ－Ｔ細胞溶解の低減、ＮＫ細胞の減少、又はこれらの組み合わせを含み得る。
【0278】
医学的状態の治療のための組成物を含む治療の臨床転帰は、熟達した臨床医により判定され得る。治療は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善されるか又は緩和される場合、「有効な治療」とみなされる。臨床転帰は、入院、又は医学的介入の必要性により評価して対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、及び／又は本明細書で説明されている。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること、又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと、及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることを含む。
【0279】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床応答を増加させるための方法が提供され、方法は、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けていたか又は受けている対象に、有効量のＮＫ細胞阻害剤を対象に投与することを含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床応答を増加させるための方法が提供され、方法は、対象に、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与することを含み、ここで対象は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を受けていたか又は受けている。
【0281】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床応答を増加させるための方法が提供され、方法は、対象に、有効量の（ａ）破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法、及び（ｂ）ＮＫ細胞阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、臨床応答の増加は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法のみを含む療法と比較してのものであるか、又はＮＫ細胞阻害剤のみを含む療法と比較してのものである。いくつかの実施形態では、臨床応答の増加は、加法的又は相乗的である。
【0282】
いくつかの実施形態では、臨床応答は、腫瘍容積又は腫瘍サイズの減少である。いくつかの実施形態では、臨床応答は腫瘍成長の阻害である。いくつかの実施形態では、臨床応答は腫瘍細胞数の減少である。いくつかの実施形態では、臨床応答は寛解期である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、ＮＫ細胞阻害剤の不在下でＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象と比較して、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象における臨床応答を増加させる。
【0283】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞阻害剤を投与することによって、対象におけるＣＡＲ Ｔ細胞療法の抗腫瘍応答を増加させるための方法を提供する。
【0284】
いくつかの実施形態では、対象におけるＣＡＲ Ｔ細胞療法の抗腫瘍応答を増加させるための方法が提供され、方法は、対象に、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与することを含み、ここで対象は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を受けていたか又は受けている。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答の増加は、細胞毒性分子の増加である。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答の増加は、腫瘍細胞中のグランザイムＢ活性の増加、又はグランザイムＢの発現による腫瘍細胞数若しくは腫瘍細胞画分の増加である。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答の増加は、免疫細胞又は改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞によるＩＦＮ－γサイトカインの分泌の増加である。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答の増加は、免疫細胞又は改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞により媒介される腫瘍細胞死滅の増加である。
【0285】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法効力の臨床応答を増加させることは、抗腫瘍活性の増加、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の残存率の増加、改変ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞溶解の低減、又は寛解の延長である。いくつかの実施形態では、改善された臨床転帰は、全生存若しくは無進行生存の増加、療法を投与される時間の減少、療法を受ける時間の低減、最大療法応答の増加、臨床的利点（例えば、療法に対する安定した疾患、部分寛解、又は完全寛解）、有害事象の減少、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞阻害剤を投与することによって、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与される対象における改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の残存率を改善する方法を提供する。
【0286】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象におけるＮＫ細胞活性を減少させるための方法が提供され、方法は、対象に、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与することを含み、ここで対象は、有効量のＮＫ細胞阻害剤を受けていたか又は受けている。
【0287】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けている対象におけるＮＫ細胞活性を減少させるための方法が提供され、方法は、破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を受けていたか又は受けている対象に、有効量のＮＫ細胞阻害剤を対象に投与することを含む。
【0288】
いくつかの実施形態では、対象におけるＮＫ細胞活性を減少させる方法が提供され、方法は、対象に有効量の（ａ）ＮＫ細胞阻害剤、及び（ｂ）破壊されたＭＨＣクラスＩ複合体を含む改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を含むＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与することを含む。
【0289】
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の投与後に投与される。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞はＮＫ細胞阻害剤と組み合わせで与えられ、ここで改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞阻害剤の投与の前に、それと同時に、又はその後に与えられる。
【0290】
いくつかの実施形態では、２用量以上のＮＫ細胞阻害剤が対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤の初回用量が、ＣＡＲ Ｔ細胞療法の前に、それと同時に、又はその後に、対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤の少なくとも１つの後続用量が投与される。いくつかの実施形態では、初回用量及び後続用量で同じＮＫ細胞阻害剤が投与される。いくつかの実施形態では、初回用量及び後続用量で異なるＮＫ細胞阻害剤が投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ阻害剤の後続用量は、対象におけるＮＫ細胞数が、ＮＫ細胞阻害剤を投与する前のＮＫ細胞数の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％まで回復した時に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞数は、ＮＫ細胞阻害剤の投与から１、２、３、４、５、６、７、及び／又は８週間後に測定される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞数は、ＮＫ細胞阻害剤の投与から３、４、５、６、７、８及び／又は１２ヶ月後に測定される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞数は、ＣＡＲ Ｔ療法の投与から１、２、３、４、５、６、７、及び／又は８週間後に測定される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤の後続用量は、改変ヒトＴ細胞の残存率を維持する。
【0291】
Ｂ．遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＮＫ細胞阻害剤の投与
併用療法においては、本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれもが、同じく本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤のいずれとも併用することができる。こうした遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＮＫ細胞阻害剤は、好適な経路、例えば静脈注入を介して、治療を必要とする対象に与えることができる。
併用療法においては、本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれもが、同じく本明細書に開示されるＮＫ細胞阻害剤のいずれとも併用することができる。こうした遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＮＫ細胞阻害剤は、好適な経路、例えば静脈注入を介して、治療を必要とする対象に与えることができる。
【0292】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、（ｉ）配列番号４０に記載されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されるＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む改変ヒトＴ細胞を含む細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号３９に記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号５８に記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の０．５％未満が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の３０％未満が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＴ細胞は同種異系である。
【0293】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、（ｉ）配列番号７６に記載されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されるＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む改変ヒトＴ細胞を含む細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号７５に記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号７４に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の０．５％未満が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の３０％未満が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＴ細胞は同種異系である。
【0294】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、（ｉ）配列番号８６に記載されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されるＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む改変ヒトＴ細胞を含む細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号８５に記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号８４に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の０．５％未満が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の３０％未満が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＴ細胞は同種異系である。
【0295】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、（ｉ）配列番号１１５に記載されるアミノ酸配列を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸の挿入によって破壊されるＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む改変ヒトＴ細胞を含む細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、配列番号１１２に記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号２８のヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号１１１に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の０．５％未満が、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の３０％未満が、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＣＡＲ表面タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＴ細胞は同種異系である。
【0296】
本明細書に開示される併用療法は、上記の特定の遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、及びＮＫ細胞阻害剤、例えば、ダラツムマブ又はその機能的バリアントを伴い得る。
【0297】
ＣＡＲ Ｔ細胞療法を投与する工程は、所望の効果がもたらされるように、腫瘍などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、対象への細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の配置（例えば、移植）を含み得る。改変Ｔ細胞は、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路により投与し得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）という短い期間から、数日、数年又は更には対象の寿命（即ち長期の生着）までであり得る。例えば、本明細書で説明されているいくつかの態様では、有効量の改変Ｔ細胞を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与する。
【0298】
対象は、治療又は療法が望まれる任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、この対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、ヒトである。
【0299】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法に従って投与される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞集団及び／又はＮＫ細胞阻害剤は、対象中で毒性を誘発せず、例えば、この改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞阻害剤は、非がん細胞中で毒性を誘発しない。いくつかの実施形態では、投与される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞集団及び／又はＮＫ細胞阻害剤は、補体に媒介される溶解をトリガしないか、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を刺激しない。いくつかの実施形態では、投与される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞集団及び／又はＮＫ細胞阻害剤は、アポトーシスをトリガしない。いくつかの実施形態では、投与される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞集団及び／又はＮＫ細胞阻害剤は、ＡＤＣＰをトリガしない。
【0300】
有効量は、医学的状態（例えば、がん）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は緩和するのに必要な改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団及び／又はＮＫ細胞阻害剤の量を指し、例えば、医学的状態を有する対象を処置するために所望の効果をもたらすのに十分な量の組成物に関する。有効量としては、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。いくつかの実施形態では、有効量のＮＫ細胞阻害剤とは、ＮＫ細胞が媒介する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の溶解、又はＮＫ細胞活性のうち少なくとも１つの予防又は緩和するのに必要な量を指す。いくつかの実施形態では、有効量のＮＫ細胞阻害剤とは、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の残存を可能にするのに必要な量を指す。
【0301】
任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、当業者により通常の実験を使用して決定され得ることが理解される。
【0302】
いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０7、２×１０7、３×１０7、４×１０7、５×１０7、６×１０7、８×１０7、９×１０7、１×１０8、２×１０8、３×１０8、４×１０8、５×１０8、６×１０8、７×１０8、８×１０8、９×１０8、又は１×１０9の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０7、３×１０7、１×１０8、３×１０8、又は１×１０9の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を含む細胞の集団を、約３×１０7、１×１０8、又は３×１０8の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０7～３×１０8の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。
【0303】
いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０7の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約３×１０7の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０8の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を含む細胞の集団を、約３×１０8の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を含む細胞の集団を、約１×１０9の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲを発現する改変Ｔ細胞の用量で投与される。
【0304】
いくつかの実施形態では、対象は、細胞を、約１×１０7の、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量で投与される（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ抗原結合ドメイン）。いくつかの実施形態では、対象は、細胞を、約３×１０7の、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量で投与される（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ抗原結合ドメイン）。いくつかの実施形態では、対象は、細胞を、約１×１０8の、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量で投与される（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ抗原結合ドメイン）。いくつかの実施形態では、対象は、細胞を、約３×１０8の、検出可能なレベルのＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の用量で投与される（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ抗原結合ドメイン）。
【0305】
いくつかの実施形態では、細胞は１つ以上のドナーから誘導される。本明細書で説明されているいくつかの例において、細胞は、それを必要とする対象への投与前に培養で増殖される。
【0306】
改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞阻害剤のための投与の方式としては、注射及び注入が挙げられる。注射としては、静脈内、くも膜下腔内、腹腔内、脊髄内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ ｓｐｉｎａｌ）、及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
【0307】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞阻害剤が全身的に投与されるが、これは、標的部位、組織又は臓器に直接的ではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様の過程に供されるような投与を指す。
【0308】
Ｃ．標的がん
いくつかの実施形態では、がん（例えば、白血病、例えば、急性の骨髄性白血病）を治療するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞療法を、がんを有する対象（例えば、ヒト患者）に送達することを含む。
いくつかの実施形態では、がん（例えば、白血病、例えば、急性の骨髄性白血病）を治療するための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞療法を、がんを有する対象（例えば、ヒト患者）に送達することを含む。
【0309】
本明細書で提供されるように治療され得るがんの非限定的な例としては、多発性骨髄腫、白血病、及び／又は腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）が挙げられる。本明細書で提供されるように治療され得る白血病の非限定的な例としては、Ｔ細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、等級３ＢのＦＬ、及びＣＬＬのリヒター形質転換）、及び急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、方法は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＢＣＭＡ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３及び／又は抗ＣＤ７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、多発性骨髄腫、白血病、又はリンパ腫を有する対象に送達することを含む。本明細書に提供されるとおりに治療され得る癌（例えば、固形腫瘍）の他の非限定的な例としては、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、腎臓癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫、及び／又は黒色腫が挙げられる。
【0310】
いくつかの実施形態では、本開示は、約１×１０7～３×１０8、又は約１×１０7～１×１０9の静脈内用量の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞を投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、約３×１０7の静脈内用量の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞を投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、約１×１０8の静脈内用量の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞を投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、約３×１０8の静脈内用量の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞を投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、約１×１０9の静脈内用量の、検出可能なレベルの本明細書に記載されるＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ１９ＣＡＲ）を発現する改変ヒトＴ細胞を投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。
【0311】
いくつかの実施形態では、本開示は、約１×１０7～３×１０8の用量の、又は約１×１０7～１×１０9の用量の、検出可能なレベルの抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を、ダラツムマブなどの本明細書に開示されるＮＫ阻害剤のうちのいずれかと組み合わせて静脈内投与することによって、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するための方法を提供する。
【0312】
いくつかの実施形態では、本開示は、ダラツムマブと組み合わせて、約２．５×１０7～４．５×１０8の用量の、検出可能なレベルの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内投与することによって、ヒト患者における多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するための方法を提供する。
【0313】
いくつかの実施形態では、本開示は、ダラツムマブと組み合わせて、約１．０×１０7～１×１０9の用量で、検出可能なレベルの抗ＣＤ７０ ＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内投与することによって、ヒト患者における腎細胞癌又はＴ細胞若しくはＢ細胞悪性腫瘍などの固形腫瘍を治療するための方法を提供する。
【0314】
いくつかの態様では、本開示は、対象に本明細書に記載される細胞又は改変ＣＡＲ Ｔ細胞の集団を投与するための方法を提供する。いくつかの態様では、改変Ｔ細胞は、改変ヒトＴ細胞である。いくつかの態様では、対象は、がんを有する。いくつかの態様では、がんは、ＣＤ７０、ＢＭＣＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３３、又はこれらの組み合わせを発現する。いくつかの態様では、細胞の集団は、がんを治療するのに有効な量で対象に投与される。いくつかの態様では、がんは、固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍である。いくつかの態様では、固形悪性腫瘍は、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、腎臓腫瘍、肺腫瘍、及び腸腫瘍からなる群から選択される。いくつかの態様では、細胞の集団は、対象における腫瘍の容積又は腫瘍細胞数を減少させるのに有効な量で対象に投与される。
【0315】
いくつかの態様では、本開示は、対象におけるがんを治療するための方法であって、本明細書に記載される細胞又は改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0316】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されている方法に従って投与される改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞集団は、１つ以上のドナーから得られた同種異系Ｔ細胞を含む。同種異系とは、１つ以上の座位での遺伝子がレシピエントと同一ではない細胞、細胞集団又は同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与される改変ＣＡＲ Ｔ細胞集団は、１つ以上の血縁ではないドナー又は１つ以上の同一ではない同胞由来のＴ細胞から誘導され得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、同一の双子）から得られたものなどの同系細胞集団が使用され得る。
【0317】
いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は同種異系である。いくつかの実施形態では、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞は同種異系移植体として投与される。
【0318】
Ｄ．ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の毒性の減少
腫瘍標的化ＣＡＲ Ｔ細胞療法による腫瘍再発のリスクは、一部には、投与後に対象内でＣＡＲ Ｔ細胞の残存率が限られていることに起因すると考えられる（Ｍａｕｄｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１：１５０７－１５１７；Ｔｕｒｔｌｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２６：２１２３－２１３８）。本明細書に開示される併用療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に伴われる毒性を減少させることも目的としている。例としては、宿主対移植片疾患（ＨｖＧＤ）及び移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）が挙げられる。
腫瘍標的化ＣＡＲ Ｔ細胞療法による腫瘍再発のリスクは、一部には、投与後に対象内でＣＡＲ Ｔ細胞の残存率が限られていることに起因すると考えられる（Ｍａｕｄｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１：１５０７－１５１７；Ｔｕｒｔｌｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２６：２１２３－２１３８）。本明細書に開示される併用療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法に伴われる毒性を減少させることも目的としている。例としては、宿主対移植片疾患（ＨｖＧＤ）及び移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）が挙げられる。
【0319】
（ｉ）宿主対移植片疾患（ＨｖＧＤ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、減少した又は最小の宿主対移植片（ＨｖＧ）応答に起因する延長された残存率を有する。ＨｖＧ応答は、レシピエントによる活性免疫応答に起因する同種異系移植片（例えば同種異系ドナーＴ細胞）の機能的及び構造的劣化として定義される。ＨｖＧ応答の原因は、宿主の免疫系を活性化する同種異系ドナー細胞上の抗原である。ドナー細胞によって発現される同種異系主要組織適合抗原（例えばヒト内のヒト白血球抗原又はＨＬＡと称される）は、ＨｖＧ応答の強力な誘導因子である（Ｉｎｇｕｌｌｉ，Ｅ．（２０１０）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２５：６１－７４；Ａｌｅｌｉｇｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ５９８６７４０）。対象中のＴ細胞の約１～１０％が、同種異系ＨＬＡ複合体を認識することのできるＴＣＲを発現する。認識は直接的であってもよく、ここでは宿主Ｔ細胞が、ドナー細胞上に存在する同種異系ＨＬＡ分子を直接認識するＴＣＲを発現する。認識は間接的であってもよく、ここではドナー細胞が、最初に宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内部移行及び処理され、宿主Ｔ細胞は、宿主ＡＰＣによってペプチド形態で提示される同種異系ＨＬＡ分子を認識する。ドナー細胞上の同種異系抗原を認識して活性化される宿主Ｔ細胞は、ＨｖＧ応答をトリガする。移植前にドナー細胞から同種異系抗原を消失させることで、ＨｖＧ応答のリスクを消失又は減少させ、それにより投与後の残存率を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変Ｔ細胞は、減少した又は最小の宿主対移植片（ＨｖＧ）応答に起因する延長された残存率を有する。ＨｖＧ応答は、レシピエントによる活性免疫応答に起因する同種異系移植片（例えば同種異系ドナーＴ細胞）の機能的及び構造的劣化として定義される。ＨｖＧ応答の原因は、宿主の免疫系を活性化する同種異系ドナー細胞上の抗原である。ドナー細胞によって発現される同種異系主要組織適合抗原（例えばヒト内のヒト白血球抗原又はＨＬＡと称される）は、ＨｖＧ応答の強力な誘導因子である（Ｉｎｇｕｌｌｉ，Ｅ．（２０１０）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２５：６１－７４；Ａｌｅｌｉｇｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ５９８６７４０）。対象中のＴ細胞の約１～１０％が、同種異系ＨＬＡ複合体を認識することのできるＴＣＲを発現する。認識は直接的であってもよく、ここでは宿主Ｔ細胞が、ドナー細胞上に存在する同種異系ＨＬＡ分子を直接認識するＴＣＲを発現する。認識は間接的であってもよく、ここではドナー細胞が、最初に宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって内部移行及び処理され、宿主Ｔ細胞は、宿主ＡＰＣによってペプチド形態で提示される同種異系ＨＬＡ分子を認識する。ドナー細胞上の同種異系抗原を認識して活性化される宿主Ｔ細胞は、ＨｖＧ応答をトリガする。移植前にドナー細胞から同種異系抗原を消失させることで、ＨｖＧ応答のリスクを消失又は減少させ、それにより投与後の残存率を増加させることができる。
【0320】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の集団は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用することによって改変されて、標的遺伝子配列中で部位特異的破壊を生じさせ、これが同種異系抗原の発現を消失させる。いくつかの実施形態では、同種異系抗原は主要組織適合抗原である。いくつかの実施形態では、主要組織適合抗原は、ＭＨＣクラスＩ複合体である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子配列は、ＭＨＣクラスＩ複合体のタンパク質成分をコードするＢ２Ｍ遺伝子中に見出される。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、宿主対改変ＣＡＲ Ｔ細胞応答のリスクを排除するか又は減少させ、レシピエントに投与した後で改変Ｔ細胞残存率を増加させる。
【0321】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の残存率は、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の投与後に対象から回収された１つ以上の組織試料中に存在する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の存在及び量を分析することによって評価される。いくつかの実施形態では、残存率は、投与時点から、所与の組織タイプ（例えば末梢血）中に検出可能なレベルの改変Ｔ細胞が存在する時点までの最長期間として定義される。
【0322】
いくつかの実施形態では、残存率は、疾患の連続した不在として定義される（例えば、完全寛解又は部分寛解）。疾患の不在及び治療に対する応答は、当業者に既知であり、また本明細書に記載されている。
【0323】
適切な組織回収、調製、及び貯蔵の方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の残存率は、末梢血、脳脊髄液、腫瘍、皮膚、骨、骨髄、乳房、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、脾臓、胃腸管、扁桃腺、胸腺、及び前立腺からなる群からの１つ以上の組織試料中で評価される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量は、単一のタイプの組織試料（例えば末梢血）中で測定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量は、複数の組織タイプ（例えば骨髄及び脳脊髄液に加えて末梢血）中で測定される。複数の組織タイプ中で改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の量を測定することによって、身体の様々な組織全体にわたる改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の分布を判定することができる。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量は、投与後の単一の時点で、１つ以上の組織試料中で測定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量は、投与後の複数の時点で、１つ以上の組織試料中で測定される。いくつかの実施形態では、投与後のある時点で１つ以上の組織試料中に存在する改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量が、投与前に患者から回収された同じ組織タイプの試料と比較される。
【0324】
所与の組織中で検出可能なレベルの改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）は、既知の技法によって測定することができる。関心対象の組織中における改変Ｔ細胞の存在又は量を評価するための方法は当業者に既知である。こうした方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）、定量的免疫蛍光法（ＱＩＦ）、フローサイトメトリ、ノーザンブロット法、ＤＮＡを用いた核酸マイクロアレイ、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、組織免疫染色法、免疫沈降アッセイ、補体結合アッセイ、蛍光－活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）、質量分析法、電磁ビーズ－抗体免疫沈降法、又はタンパク質チップが挙げられるが、これらに限定されない。
【0325】
本明細書で使用する時、いくつかの実施形態では、残存率は、投与時点から、検出可能なレベルの改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）が測定される時点までの最長期間である。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルの改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）は、分析方法の検出限界の点から定義される。検出限界は、関心対象の成分又は物質の量を全く有さないと見込まれる組織試料と比較した場合の、分析手順によって確実且つ再現可能に測定することが可能な成分又は物質の最低量として定義され得る。再現可能な検出限界を決定するための非限定的な例示的方法は、ブランク試料と比較してゼロ較正物質の複製に対する分析信号を測定することである（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｒｅｖ．２９：Ｓ４９－Ｓ５２）。ブランク試料は、関心対象の分析質を含まないことが知られている。ゼロ較正物質は、既知の濃度又は量の試験試料の最大希釈であり、ブランク試料に対して測定されたものを上回る分析信号をもたらす。ゼロ較正物質の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の複製に対する分析信号を定量化することによって、関心対象の分析方法の検出限界の平均偏差及び標準偏差（ＳＤ）を決定することができる。所与の組織中の改変Ｔ細胞を定量化するために好適な検出限界を用いる方法の選択は、当業者によって確かめられ得る。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルの改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）は、分析方法の検出限界を上回る分析信号をもたらす組織試料中の任意の量の改変Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルの改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）は、分析方法の検出限界を少なくとも２ＳＤ、３ＳＤ、４ＳＤ、５ＳＤ、６ＳＤ、７ＳＤ、８ＳＤ、９ＳＤ、又は１０ＳＤ上回る分析信号をもたらす、組織試料中の任意の量の改変Ｔ細胞である。
【0326】
ＣＡＲ発現改変Ｔ細胞は、レシピエントへの投与後に増殖を経験し得ることが知られている。増殖は、抗原認識及び信号活性化に対する応答である（Ｓａｖｏｌｄｏ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：１８２２；ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｔｅｇｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．１４：４９９－５０９）。いくつかの実施形態では、増殖後に、改変Ｔ細胞は収縮期間を経るが、ここで短命のエフェクター細胞である改変Ｔ細胞集団の一部分は消失して、長命の記憶細胞である改変Ｔ細胞集団の一部分が残る。いくつかの実施形態では、残存率は、増殖及び収縮後の改変Ｔ細胞集団の寿命の指標である。増殖、収縮、及び残存率相の期間は、薬物動態プロファイルを用いて評価される。いくつかの実施形態では、薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、所与の組織中で経時的に測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量の記述であり、これは、所与の組織（例えば末梢血）中で複数の時点における改変Ｔ細胞の量を測定することによって当業者により容易に確かめられる。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルの指標は、対象を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルの指標は、がんを有する対象における改変Ｔ細胞療法（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の有効性を評価又は監視する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルの指標は、対象における改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の残存率を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルは、対象における改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の増殖を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の残存率の指標を用いて、対象における改変Ｔ細胞療法の有効性を評価する。いくつかの実施形態では、対象における改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の増殖の指標を用いて、対象における改変Ｔ細胞療法の有効性を評価する。
【0327】
いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルは、レシピエントから回収した所与の組織タイプ（例えば末梢血）の試料中の改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量を測定し、様々な時点で評価を繰り返すことによって調製される。いくつかの実施形態では、ベースライン組織試料は、投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１２日、１３日、１４日、又は１５日以内にレシピエントから回収される。いくつかの実施形態では、レシピエントからの組織の回収は、改変Ｔ細胞の投与時間から０．２５～２時間以内、１～３時間以内、２～６時間以内、３～１１時間以内、４～２０時間以内、５～４８時間以内に実施される。いくつかの実施形態では、レシピエントからの組織の回収は、１日目、２日目、３日目、又は４日目に開始し、少なくとも５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、又は２０日目まで継続して毎日実施される。いくつかの実施形態では、レシピエントからの組織の回収は、改変Ｔ細胞の投与後に、最大１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、又は１６週間の間、１週間あたり少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又は６回実施される。いくつかの実施形態では、レシピエントからの組織の回収は、改変Ｔ細胞の投与後に、最大で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３ヶ月間、又は２４ヶ月間の間、１ヶ月あたり少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又は６回実施される。いくつかの実施形態では、レシピエントからの組織の回収は、改変Ｔ細胞の投与後に、最大で１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、又は１０年間の間、１年間あたり少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、又は６回実施される。
【0328】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は投与からの期間として定義され、ここでは改変Ｔ細胞のピーク量の少なくとも０．００５～０．０５％、０．０１～０．１％、０．０５～０．５％、０．１～１％、０．５％～５％、又は１～１０％である改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）量が存在する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、所与の組織タイプ（例えば末梢血）中で測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量を、同じ組織タイプ中で測定された改変Ｔ細胞のピーク量に対して比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、所与の組織タイプ（例えば末梢血）中で測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量を、異なる組織タイプ中で測定された改変Ｔ細胞のピーク量に対して比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、所与の対象（例えば末梢血）中で測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量を、同じ対象中で測定された改変Ｔ細胞のピーク量に対して比較することによって決定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、所与の対象（例えば末梢血）中で測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量を、異なる対象（例えば、部分寛解した対象、完全寛解した対象）中で測定された改変Ｔ細胞のピーク量に対して比較することによって決定される。
【0329】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、投与後に１つ以上の組織タイプ（例えば末梢血）中に存在し、ここで改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞）は１日目に投与される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、投与後、最大で１日、２日、３日、４，日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２１日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、又は３５日間１つ以上の組織タイプ（例えば末梢血）中に存在し、ここで改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）は１日目に投与される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の投与後、最大で１ヶ月間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、又は２４ヶ月間、１つ以上の組織タイプ（例えば末梢血）中に存在する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の残存率は、改変Ｔ細胞の投与後、最大で１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、及び１０年間の間、１つ以上の組織タイプ（例えば末梢血）中で測定される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞が１日目に投与され、投与後少なくとも１０～２５日、少なくとも２５～５０日、少なくとも５０～１００日、少なくとも１００～３６４日、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、又は少なくとも５年間である改変Ｔ細胞の残存率は、レシピエントにおける応答（例えば、完全寛解又は部分寛解）を示す。
【0330】
いくつかの実施形態では、曲線下面積（ＡＵＣ）は、所与の組織タイプ（例えば末梢血）中で経時的に測定された改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量の曲線下の総面積として定義される。ＡＵＣの計算方法は、当業者には既知であり、これは、一連の台形によってＡＵＣを概算することと、台形の面積を計算することと、台形の面積を合計してＡＵＣを決定することと、からなる。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルに関してＡＵＣが定義され、ここでは所与の組織タイプに関して改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の量が経時的に測定される。いくつかの実施形態では、ＰＫプロファイルに関して１つの指定された時点から別の指定された時点までＡＵＣが定義される（すなわち、ＡＵＣ１０～８０は、投与後１０日目～８０日目の量を示す量－時間曲線下の総面積を指す）。いくつかの実施形態では、投与時間（例えば、１日目）から１日の終了時間までにわたる予め選択された期間、すなわち、投与後１０～２０日、１５～４５日、２０～７０日、２５～１００日、又は４０～１８０日間に対してＡＵＣが決定される。いくつかの実施形態では、レシピエント中のＰＫプロファイルに関して測定されるＡＵＣは、レシピエントの応答（例えばＣＲ又はＰＲ）を示す。いくつかの実施形態では、レシピエント中のＰＫプロファイルに関して測定されるＡＵＣは、レシピエントの再発のリスクを示す。
【0331】
（ｉｉ）移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）
今日までに開発された大半のＣＡＲ Ｔ細胞療法は、自己由来ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる（すなわち、患者自身のＴ細胞の遺伝子修飾により誘導されたＣＡＲ Ｔ細胞）。ドナーＴ細胞は、ヒト内のヒト白血球抗原又はＨＬＡとして知られる、宿主組織抗原及び／又は組織適合抗原に対して潜在的に反応性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するため、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、遺伝的に異なるヒトドナー由来のＴ細胞の遺伝子修飾により生成されたＣＡＲ Ｔ細胞）の使用は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を生じさせるリスクを有する。ＧｖＨＤは、同種異系細胞を移植した後に起きる、免疫適格ドナー細胞（移植片）が免疫不全の同種異系レシピエント（宿主）中の組織を認識して攻撃する症候群である（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９６２）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：３７４－３８５；Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．（１９６６）Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ．６２：２１－７８）。相当な臨床的証拠が、特に造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の状況下で同種異系Ｔ細胞移植を投与することによるＧｖＨＤのリスクを強調している。
今日までに開発された大半のＣＡＲ Ｔ細胞療法は、自己由来ＣＡＲ Ｔ細胞を用いる（すなわち、患者自身のＴ細胞の遺伝子修飾により誘導されたＣＡＲ Ｔ細胞）。ドナーＴ細胞は、ヒト内のヒト白血球抗原又はＨＬＡとして知られる、宿主組織抗原及び／又は組織適合抗原に対して潜在的に反応性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するため、同種異系ＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、遺伝的に異なるヒトドナー由来のＴ細胞の遺伝子修飾により生成されたＣＡＲ Ｔ細胞）の使用は、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）を生じさせるリスクを有する。ＧｖＨＤは、同種異系細胞を移植した後に起きる、免疫適格ドナー細胞（移植片）が免疫不全の同種異系レシピエント（宿主）中の組織を認識して攻撃する症候群である（Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（１９６２）Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：３７４－３８５；Ｂｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．（１９６６）Ｈａｒｖｅｙ Ｌｅｃｔ．６２：２１－７８）。相当な臨床的証拠が、特に造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の状況下で同種異系Ｔ細胞移植を投与することによるＧｖＨＤのリスクを強調している。
【0332】
ＨＳＣＴは、白血病又はリンパ腫などの難治性の血液学的悪性腫瘍を患う患者に対する治療レジメンの一部として投与される。同種異系ＨＳＣＴ（すなわち、宿主患者と遺伝的に同一でない個体由来のＨＳＣＴ）の実質的な治療効果は、移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果である。ＨＳＣＴ移植で投与されたドナーＴ細胞は、一部が腫瘍細胞上の腫瘍抗原及び同種異系ＨＬＡ抗原を外来物（ｆｏｒｅｉｇｎ）として認識し、腫瘍細胞を消失させるという点において、ＧＶＴ効果の主媒介物質である（Ｋｏｌｂ，Ｈ．（２００８）Ｂｌｏｏｄ１１２：４３７１－４３８３）。しかしながら、移植されたドナーＴ細胞も、宿主ＨＬＡを外来物として認識し、皮膚、胃腸、肝臓、及び肺などの臓器に組織損傷を生じさせることで応答することによって、ＧｖＨＤをトリガする可能性を有する。移植前にＨＳＣＴ調製物からＴ細胞を除去することにより、ＧｖＨＤの発生が大幅に減少され得るが、腫瘍再発及び移植片不全のリスクは著しく増加する（Ａｐｐｅｒｌｅｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．６９：２３９－２４５；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｂｌｏｏｄ ６６：６６４－６７２；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．６３：２２１－２３０）。したがって、改変同種異系Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ７０、又はＢＣＭＡ ＣＡＲを発現する改変ヒトＴ細胞）の移植は、有益のみならず、有害な転帰ももたらし、移植された宿主反応性Ｔ細胞は、有益なＧＶＴ効果を促進するが、健康な組織の破壊も生じさせ、これがＧｖＨＤをもたらす。
【0333】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、ＧＶＴ効果を生じさせるための外因的に投与されたＴ細胞の使用に対して相当な改善を提供する。ＣＡＲは、ＨＬＡの抗原提示を必要とすることなしに腫瘍抗原を高い親和性で認識する修飾Ｔ細胞を提供する。更に、ＣＡＲは、抗原認識時にＴ細胞の活性化に貢献する共刺激成分を提供する（Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．３：３８８－３９８；Ｄａｖｉｌａ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：１５７７－１５８３）。しかしながら、大半のＣＡＲ Ｔ細胞生成物は、ＴＣＲの発現を保持する、従って、ドナーと遺伝的に同一でない宿主に投与された時にＧｖＨＤを生じさせるリスクを有するＴ細胞クローンの混合集団から生成される。ＧｖＨＤを生じさせるリスクを回避するために、今日までに開発されたＣＡＲ Ｔ細胞療法の大部分は、自己由来ＣＡＲ Ｔ細胞を用いており、そのため、ＣＡＲ Ｔ細胞によって発現されたＴＣＲが宿主抗原に対して反応的ではない（Ｍａｕｄｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１：１５０７－１５１７；Ｎｅｅｌａｐｕ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７７：２５３１－２５４４；Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７７：２５４５－２５５４）。しかしながら自己由来ＣＡＲ Ｔ細胞の生成は高価で且つ時間のかかるものであり、その結果、一部の患者は治療を待つ間に疾患の進行又は死を経験する。
【0334】
いくつかの実施形態では、本開示は、破壊されたＴＣＲ及びＭＨＣを含む改変Ｔ細胞（例えばＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を投与し、それによりレシピエント患者におけるＧｖＨＤのリスクを減少させることに関する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集成分は、ＴＣＲ及び／又はＭＣＨなどの、ＧｖＨＤに関連する遺伝子配列における部位特異的破壊を導入するために用いられる。いくつかの実施形態では、遺伝子配列はＴＣＲの成分から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ成分はＴＲＡＣである。いくつかの実施形態では、部位特異的破壊は、遺伝子の少なくとも一部分の永久的欠失である。いくつかの実施形態では、部位特異的破壊は、遺伝子中の小欠失である。いくつかの実施形態では、部位特異的破壊は、遺伝子中の小挿入である。いくつかの実施形態では、部位特異的破壊は、遺伝子中のＣＡＲをコードする核酸の挿入である。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子の部位特異的破壊は、機能的ＴＣＲを含まないＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座の部位特異的破壊は、同種異系レシピエント中にＧｖＨＤを生じさせるＴ細胞の能力を減少又は消失させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの部位特異的破壊は、同種異系Ｔ細胞を対象に投与した後のＧｖＨＤのリスクを減少させる。
【0335】
いくつかの実施形態では、本開示は、レシピエント患者中でＧｖＨＤが生じるリスクが減少した、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与に関する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集成分は、ＴＲＡＣ遺伝子座に部位特異的破壊を導入するために用いられる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座における部位特異的破壊は、遺伝子中のＣＡＲをコードする核酸の挿入である。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座における部位特異的破壊は、ドナーＴ細胞の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座における部位特異的破壊は、改変Ｔ細胞の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座における部位特異的破壊、及び精製工程は、改変Ｔ細胞の少なくとも９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子座における部位特異的破壊、及び精製工程は、改変Ｔ細胞の少なくとも９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）の少なくとも９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞の集団の投与は、レシピエント患者への投与後にＧｖＨＤのリスクを減少させる。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の少なくとも９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は１００％が機能的ＴＣＲの発現を欠く改変Ｔ細胞の投与は、レシピエント患者への投与後にＧｖＨＤのリスクを減少させる。
【0336】
臨床的には、ＧｖＨＤは、臨床兆候、及び同種異系ドナー細胞の投与に対する発生時間に基づいて、急性、慢性、及び重複症候群に分類される。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、レシピエントにおける急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）のリスクの減少を伴う。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の投与は、レシピエントにおける急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）のリスクの減少を伴う。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、レシピエントにおける慢性ＧｖＨＤのリスクの減少を伴う。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の投与は、レシピエントにおける慢性ＧｖＨＤのリスクの減少を伴う。ａＧｖＨＤを生じる患者において、症状としては、斑点状丘疹；小胆管の損傷に起因して胆汁鬱滞をもたらす、黄疸を伴う高ビリルビン血症；悪心、嘔吐、及び食欲不振；並びに水様性又は出血性の下痢、及び痙性腹痛が挙げられ得る（Ｚｅｉｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２１６７－２１７９）。ａＧｖＨＤの重症度は、臨床兆候に基づいており、また、例えば表４で定義される広く受け入れられている等級パラメーターを用いて当業者によって容易に評価される。
【0337】
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲを発現する改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、減少した又は軽度のａＧｖＨＤをもたらす。いくつかの実施形態では、減少した又は軽度のａＧｖＨＤとは、臨床等級２未満、臨床等級１未満、又は等級０である。いくつかの実施形態では、減少した又は軽度のａＧｖＨＤとは、臨床等級２未満である。いくつかの実施形態では、減少した又は軽度のａＧｖＨＤとは、臨床等級１未満である。いくつかの実施形態では、減少した又は軽度のａＧｖＨＤとは、臨床等級０である。
【0338】
いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ発現Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、ａＧｖＨＤの発生をほとんど又は全くもたらさない（例えば、本開示の改変Ｔ細胞の集団を投与した後で、どの対象も臨床的に有意な（例えば等級２～４）のａＧｖＨＤ、又はａＧｖＨＤの症状を経験しない）。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の投与は、ａＧｖＨＤの発生をほとんど又は全くもたらさない（例えば、改変Ｔ細胞を投与した後で、どの対象も臨床的に有意な（例えば等級２～４）のａＧｖＨＤ、又はａＧｖＨＤの症状を経験しない）。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、ａＧｖＨＤの部分的発生を伴い、対象のうち１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％、又は１８％未満が、投与後に、臨床的に有意な（例えば等級２～４）のａＧｖＨＤの症状を経験する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞の投与は、ａＧｖＨＤの部分的発生を伴い、対象のうち１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％、又は１８％未満が、投与後に、臨床的に有意な（例えば等級２～４）ａＧｖＨＤの症状を経験する。
【0339】
【表4】
【0340】
ステロイドは、ａＧｖＨＤに対する第一選択治療として用いられる。しかしながら、奏効率は限定されており、患者の約５０のみが第一選択療法に応答する。ステロイド難治性ａＧｖＨＤを有する患者の転帰は、長期死亡率が９０％に達し、悲惨である（Ｗｅｓｔｉｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ．Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ６０１９５３）。
【0341】
いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、ステロイド難治性ａＧｖＨＤの発生を伴わず、どの対象も、投与後に、臨床的に有意な（例えば等級２～４）のステロイド難治性ａＧｖＨＤの症状を経験しない。いくつかの実施形態では、本開示の改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与は、ステロイド難治性ａＧｖＨＤの部分的発生を伴い、対象のうち１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１１％未満、１２％未満、１３％未満、１４％未満、１５％未満、１６％未満、１７％、又は１８％未満が、投与後に、臨床的に有意な（例えば等級２～４）のステロイド難治性ａＧｖＨＤの症状を経験する。
【0342】
いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与後、最大で２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、又は３６日の間、ａＧｖＨＤの症状に関して観察される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団の投与後、少なくとも２０～５０日、２５～７０日、２８～１００日の間、ａＧｖＨＤの症状に関して観察される。
【0343】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣＴの臨床状況は、改変Ｔ細胞を含む細胞の集団の投与に応答したａＧｖＨＤの発生に関するベンチマークを提供する。臨床的に有意な（例えば等級２～４）ａＧｖＨＤの全発生率は、同種異系ＨＳＣＴの投与後で約５０％であるが、これは、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡの不一致、ドナー及びレシピエントの性別、ドナー及びレシピエントの年齢、移植片の組織供給源、並びに条件付けレジメンの強度が挙げられるがこれらに限定されない因子に応じて大きく変化し得る（Ｈａｔｚｉｍｉｃｈａｅｌ，Ｅ．（２０１０）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３：１０５－１１７）。より具体的には、ＨＬＡが一致する同胞ドナー由来のＨＳＣＴを投与した後の臨床的に有意な（例えば等級２～４）ａＧｖＨＤの発生率は、約２０～３５％である（Ｒｅｍｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１９：７５１－７５９；Ｈａｈｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２６：５７２８－５７３４）。発生率は、無関係な、又はＨＬＡが一致しないドナーの場合で上昇する。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ）の投与は、同種異系ＨＳＣＴを投与することにより誘導される臨床的に有意な（例えば等級２～４）ａＧｖＨＤの発生率よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％低い、臨床的に有意な（例えば等級２～４）ａＧｖＨＤの発生を伴う。いくつかの実施形態では、ＨＳＣＴは、ＨＬＡが一致する同胞ドナー由来である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣＴは、ＨＬＡが一致する非血縁ドナー由来である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣＴは、ＨＬＡが不一致の同胞ドナー由来である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣＴは、ＨＬＡが不一致の非同胞ドナー由来である。
【0344】
Ｅ．前条件付けレジメン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する宿主免疫応答を防ぐために、前条件付けレジメンが対象に投与される。Ｔ細胞注入を投与する前に１つ以上の免疫抑制化学療法薬で患者を前条件付けすることで、移植後のドナーＴ細胞の有効性が増加され得る（Ｎｏｒｔｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１５５：１０６３－１０７４；Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：２３４－２３８；Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：７１１－７１４）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞療法に対する宿主免疫応答を防ぐために、前条件付けレジメンが対象に投与される。Ｔ細胞注入を投与する前に１つ以上の免疫抑制化学療法薬で患者を前条件付けすることで、移植後のドナーＴ細胞の有効性が増加され得る（Ｎｏｒｔｈ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１５５：１０６３－１０７４；Ｂｅｒｅｎｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１５：２３４－２３８；Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：７１１－７１４）。
【0345】
本明細書に開示される併用療法のいずれも、前条件レジメンを更に伴い得る。いくつかの実施形態では、前条件付けレジメンは、ＣＡＲ Ｔ細胞療法（例えば、改変Ｔ細胞）の投与の前に、それと同時に、又はそれに続いて、投与される。いくつかの実施形態では、前条件レジメンは、ＮＫ細胞阻害剤の投与の前に、それと同時に、又はそれに続いて、投与される。
【0346】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法が本明細書に記載される前条件付けレジメン（例えば、リンパ球枯渇レジメン）を含む場合、ＮＫ細胞阻害剤は前条件付けレジメン（例えば、リンパ球枯渇レジメン）と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、前条件付けレジメン（例えば、リンパ球枯渇レジメン）の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞阻害剤は、前条件付けレジメン（例えば、リンパ球枯渇レジメン）の投与後に投与される。
【0347】
いくつかの実施形態では、前条件付けレジメンはリンパ球枯渇レジメンを含む。
【0348】
（ｉ）リンパ球枯渇
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を含む細胞の集団は、対象（例えば、がん、例えば非ホジキンリンパ腫を有するヒト患者）がリンパ球枯渇レジメン及び／又はＮＫ細胞阻害剤を投与された後で、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞）を含む細胞の集団は、対象（例えば、がん、例えば非ホジキンリンパ腫を有するヒト患者）がリンパ球枯渇レジメン及び／又はＮＫ細胞阻害剤を投与された後で、対象に投与される。
【0349】
リンパ球枯渇（ＬＤ）化学療法は、注入後に移植されたＴ細胞の増殖及びエフェクター機能を可能にする目標を有する。内因性制御性Ｔ細胞及びその他の免疫細胞が、特定のサイトカイン（例えばインターロイキン７（ＩＬ－７）、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１）を循環から吸収（ｓｉｐｈｏｎ）し得ることは既知である。ＬＤ化学療法の機能は、刺激性サイトカインの「細胞シンク（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｎｋ）」として機能し、それにより、投与後にドナーＴ細胞の活性化及び増殖を促進するサイトカインの発生量を増加させる、内因性免疫細胞の一時的消失である（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｅｘｐｔ Ｍｅｄ ２０２：９０７－９１２）。更に、宿主のナイーブＴ細胞の量を特定の閾値未満に減少させることによって、移植されたドナーＴ細胞が枯渇したＴ細胞集団を回復させるために増殖及び分化することは知られている（Ｄｕｍｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１８５－１９２；Ｍｕｒａｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ Ｏｎｃｏｌ．３：６６８－６８１）。したがって、ＬＤ化学療法のもう１つの機能は、移植されたドナーＴ細胞の増殖及び分化を助けるための、宿主中におけるナイーブなＴ細胞の一時的な減少である（例えば、改変ヒトＴ細胞、例えば、改変同種異系ヒトＴ細胞）。いくつかの実施形態では、条件付け療法は、内因性免疫細胞を減少させ、また、対象中に存在する恒常性サイトカイン及び／又は免疫促進因子（ｐｒｏ－ｉｍｍｕｎｅｆａｃｔｏｒｓ）の血中濃度を増加させることを意図している。いくつかの実施形態では、条件付け療法は、投与すると、内因性リンパ球を閾値未満に減少させ、ドナーＴ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞、例えば、改変同種異系ヒトＴ細胞）の増殖を助けることを意図している。いくつかの実施形態では、条件付け療法は、レシピエントに投与されると、ドナーＴ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞、例えば、改変同種異系ヒトＴ細胞）が増殖するのにより最適な微環境を生成する。いくつかの実施形態では、条件付け療法は、レシピエントに投与されると、ドナーＴ細胞（例えば、改変ヒトＴ細胞、例えば、改変同種異系ヒトＴ細胞）がエフェクター機能を有するのにより最適な微環境を生成する。
【0350】
いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの化学療法薬からなる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、１回以上の用量のシクロホスファミドを投与することからなる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、１回以上の用量のフルダラビンを投与することからなる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第９，８５５，２９８号明細書に記載されるように、１回以上の用量の追加化学療法薬（例えばシクロホスファミド＋フルダラビン）と組み合わせて１回以上の用量のシクロホスファミドを投与することからなる。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、白血球搬出を誘導するために、放射線照射と組み合わせられる。
【0351】
いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、静脈内投与される（例えば、静脈注入として）。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの注入は、約２００ｍｇ／ｍ2～約２０００ｍｇ／ｍ2の用量で投与される（ｍ2はレシピエントの体面積を指す）。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの注入は、約３００ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの注入は、約５００ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの注入は、約７５０ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。
【0352】
いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、少なくとも１用量、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量、又は１０用量からなる注入として投与される。いくつかの実施形態では、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、又は３２時間以下の介在間隔で２回以上のシクロホスファミドの逐次注入が投与される。いくつかの実施形態では、１日、２日、３日、４日、又は５日以下の介在間隔で２回以上のシクロホスファミドの逐次注入が投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの逐次注入間の介在間隔は同じである。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの逐次注入間の介在間隔は異なる。いくつかの実施形態では、２日、３日、４日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、又は１２日間の間隔以内でシクロホスファミドの２回以上の逐次注入が投与される。
【0353】
いくつかの実施形態では、フルダラビンは、静脈内投与される（例えば、静脈注入として）。いくつかの実施形態では、フルダラビンの注入は、約１０ｍｇ／ｍ2～約９００ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンの注入は、約３０ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。
【0354】
いくつかの実施形態では、フルダラビンは、少なくとも１用量、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量、８用量、９用量、又は１０用量のシクロホスファミドからなる注入として投与される。いくつかの実施形態では、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３１時間、又は３２時間以下の介在間隔で２回以上のフルダラビンの逐次注入が投与される。いくつかの実施形態では、１日、２日、３日、４日、又は５日以下の介在間隔で２回以上のフルダラビンの逐次注入が投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンの逐次注入間の介在間隔は同じである。いくつかの実施形態では、フルダラビンの逐次注入間の介在間隔は異なる。いくつかの実施形態では、２日、３日、４日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、又は１２日間の間隔以内でフルダラビンの２回以上の逐次注入が投与される。
【0355】
いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、化学療法薬の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、シクロホスファミドとフルダラビンとの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンは同時投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンは逐次投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンは逐次投与され、フルダラビンの投与間の介在間隔は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、又は２０時間以下である。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドはフルダラビンの投与前に投与され、投与間の介在間隔は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、又は２０時間以下である。
【0356】
いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、又は１２日間毎日投与される。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は１～４日間毎日投与される。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法は３日間毎日投与される。
【0357】
いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンを含むＬＤ化学療法は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、又は１２日間毎日投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンを含むＬＤ化学療法は１～４日間毎日投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド及びフルダラビンを含むＬＤ化学療法は３日間毎日投与される。
【0358】
いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法（例えば、シクロホスファミド及びフルダラビン）の投与は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１０、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＰＬＧＦ、ＣＲＰ、ｓＩＣＡＭ－１、ｓＶＣＡＭ－１、又は任意のこれらの組み合わせの血中濃度の増加を伴う。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法（例えば、シクロホスファミド及びフルダラビン）の投与は、パーフォリン、ＭＩＰ－１ｂ、又は任意のこれらの組み合わせの血中濃度の低減を伴う。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法（例えば、シクロホスファミド及びフルダラビン）の投与は、リンパ球減少症を伴う。いくつかの実施形態では、ＬＤ化学療法（例えば、シクロホスファミド及びフルダラビン）の投与は、対象における制御性Ｔ細胞の低減（例えば枯渇）を伴う。
【0359】
いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する前に、ＬＤ化学療法レジメンを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日前に、ＬＤ化学療法レジメンを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、又は少なくとも１０日前に、ＬＤ化学療法レジメンを投与される。
【0360】
いくつかの実施形態では、対象は、ＬＤ化学療法レジメンを１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日の間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、ＬＤ化学療法レジメンの完了後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日の間投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＬＤ化学療法レジメンを１～３日間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、ＬＤ化学療法レジメンの完了後、少なくとも２日間（例えば４８時間）であるが７日以下の間投与される。いくつかの実施形態では、対象は、ＬＤ化学療法レジメンを約３日間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、ＬＤ化学療法レジメンの完了後、少なくとも２日間（例えば４８時間）であるが７日以下の間投与される。
【0361】
いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する前に、シクロホスファミド及びフルダラビンを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日前に、シクロホスファミド及びフルダラビンを投与される。いくつかの実施形態では、対象は、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団を投与する少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、又は少なくとも１０日前に、シクロホスファミド及びフルダラビンを投与される。
【0362】
いくつかの実施形態では、対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンを１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日の間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与完了後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日の間投与される。いくつかの実施形態では、対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンを１～３日間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与完了後、少なくとも２日間（例えば４８時間）であるが７日以下の間投与される。いくつかの実施形態では、対象は、シクロホスファミド及びフルダラビンを約３日間投与され、改変Ｔ細胞（例えば、改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞）を含む細胞の集団は、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与完了後、少なくとも２日間（例えば４８時間）であるが７日以下の間投与される。
【0363】
ＩＶ．ＣＡＲ－Ｔ療法に伴う臨床転帰を改善させるためのキット
本開示はまた、臨床転帰を改善させるために、どちらも本明細書に開示される、ＮＫ細胞阻害剤と組み合わせた遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を使用するためのキットを提供する。こうしたキットは、本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、又はＣＡＲコンストラクトをコードする核酸（例えばＡＡＶベクター）を含む１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のリンパ球枯渇剤と１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を含む容器を更に含み得る。或いは、又はそれに加えて、キットは、ＮＫ細胞阻害剤のいずれかと１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を更に含み得る。
本開示はまた、臨床転帰を改善させるために、どちらも本明細書に開示される、ＮＫ細胞阻害剤と組み合わせた遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を使用するためのキットを提供する。こうしたキットは、本明細書に開示される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれか、又はＣＡＲコンストラクトをコードする核酸（例えばＡＡＶベクター）を含む１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上のリンパ球枯渇剤と１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を含む容器を更に含み得る。或いは、又はそれに加えて、キットは、ＮＫ細胞阻害剤のいずれかと１つ以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を更に含み得る。
【0364】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかで使用するための指示を含み得る。同梱される指示は、ヒト患者において目的の活性を達成するための、遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞、リンパ球枯渇剤、及び／又はＮＫ細胞阻害剤を投与することの説明を含み得る。キットは、ヒト患者が治療を必要としているか否かを特定することに基づいて治療に適したヒト患者を選択することの説明を更に含み得る。
【0365】
本明細書に記載される遺伝子改変ＣＡＲ－Ｔ細胞、リンパ球枯渇剤、及び／又はＮＫ細胞阻害剤の集団の使用に関する指示は、一般的には、目的の治療のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。容器は、単位容量、バルクパッケージ（例えば複数用量パッケージ）又は副単位用量であり得る。本開示のキット内で供給される指示は、典型的には、ラベル又は添付文書上の書面指示である。ラベル又は添付文書は、遺伝子改変Ｔ細胞の集団が、対象における腎細胞癌を治療する、発病を遅らせる、及び／又は緩和するために用いられることを示す。
【0366】
本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージング内にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージングなどが挙げられるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置、又は注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも検討される。キットは、滅菌接近ポート（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｃｃｅｓｓ ｐｏｒｔ）を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋又はバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌接近ポートを有し得る。
【0367】
キットは、任意選択的に、緩衝材及び解説情報などの追加の構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器と、容器上の又は容器に付随したラベル又は添付文書とを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記で説明されたキットの内容を含む製造物品を提供する。
【0368】
一般的技術
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当該技術分野の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で完全に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；及びＡ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９８４）。
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当該技術分野の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で完全に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；及びＡ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９８４）。
【0369】
更に詳述する必要なく、当業者であれば、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、本開示の残りの部分をいかなる意味においても限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、参照により本明細書で参照される目的又は主題に関して組み込まれる。
【実施例】
【0370】
本開示を、その特定の実施形態を参照して記載したが、本開示の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことができ、等価物を置換することができることが当業者には理解されよう。更に、特定の条件、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程又は工程を本開示の目的、趣旨、及び範囲に適合させるように、多くの改変を行うことが可能である。こうした改変の全てが本開示の範囲内に入るものと意図される。
【0371】
実施例１．改変ヒトＣＡＲ Ｔ細胞の調製。
この実施例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、ＴＣＲ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子の発現を欠く、同種異系改変ヒトＴ細胞の生産について説明する。細胞は、がん抗原、例えばＣＤ１９及び／又はＢＣＭＡを標的化するキメラ抗原受容体を発現することができる。これらのＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８－０３２５９５５号明細書に記載されている。
この実施例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、ＴＣＲ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子の発現を欠く、同種異系改変ヒトＴ細胞の生産について説明する。細胞は、がん抗原、例えばＣＤ１９及び／又はＢＣＭＡを標的化するキメラ抗原受容体を発現することができる。これらのＣＡＲ Ｔ細胞を製造する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８－０３２５９５５号明細書に記載されている。
【0372】
簡潔には、初代ヒトＴ細胞を、最初に、ＴＲＡＣ（ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号２８）及びＢ２Ｍ（ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ（配列番号２９））を標的化するＣａｓ９又はＣａｓ９：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体でエレクトロポレーションした。ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖切断を、下記で説明する相同組み換え修復によって修復した。
【0373】
抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の生成
抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖切断を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）カセット（配列番号５８）に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対して右及び左の相同性アームを含有する配列番号５７のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノ随伴アデノウイルスベクター、血清型６（ＡＡＶ６）による相同組み換え修復によって修復した。ＣＡＲは、ＣＤ１９に対して特異的なマウス抗体から誘導される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ８ヒンジ領域と、膜貫通ドメイン並びにＣＤ３ｚ及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインと、を含んだ。ＣＡＲのアミノ酸配列、及びこれをコードするヌクレオチド配列は配列番号３９及び４０にそれぞれ記載される。ＡＡＶ６を、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭのＣａｓ９、５μＭのｇＲＮＡ）と共に活性化ヒトＴ細胞まで送達した。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０6細胞、１μＭのＣａｓ９及び５μＭのｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５－９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５において記載される）を含有した。
抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＴＲＡＣ遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖切断を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）カセット（配列番号５８）に隣接するＴＲＡＣ遺伝子座に対して右及び左の相同性アームを含有する配列番号５７のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノ随伴アデノウイルスベクター、血清型６（ＡＡＶ６）による相同組み換え修復によって修復した。ＣＡＲは、ＣＤ１９に対して特異的なマウス抗体から誘導される一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ＣＤ８ヒンジ領域と、膜貫通ドメイン並びにＣＤ３ｚ及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインと、を含んだ。ＣＡＲのアミノ酸配列、及びこれをコードするヌクレオチド配列は配列番号３９及び４０にそれぞれ記載される。ＡＡＶ６を、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭのＣａｓ９、５μＭのｇＲＮＡ）と共に活性化ヒトＴ細胞まで送達した。ヌクレオフェクション混合物は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液、５×１０6細胞、１μＭのＣａｓ９及び５μＭのｇＲＮＡ（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３（９）：９８５－９８９，ＰＭＩＤ：２６１２１４１５において記載される）を含有した。
【0374】
各ＲＮＰ複合体は、ｓａＣａｓ９、及びＴＲＡＣ中の配列番号２８又はβ２Ｍ中の配列番号２９を標的化する２つのｓｇＲＮＡのうちの１つを含んだ。例示的なＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡとしては、配列番号１８及び２２が挙げられる。例示的なＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡスペーサーとしては、配列番号１９及び２３が挙げられる。例示的なβ２Ｍ ｓｇＲＮＡとしては、配列番号２０及び２４が挙げられる。例示的なβ２Ｍ ｓｇＲＮＡスペーサーとしては、配列番号２１及び２５が挙げられる。以下のｓｇＲＮＡを使用した：ＴＲＡＣ（配列番号２２）及びβ２Ｍ（配列番号２４）。ｇＲＮＡの非修飾バージョン（又は他の修飾バージョン）も使用され得る（例えば、配列番号１８及び配列番号２０）。
【0375】
エレクトロポレーションから約１週間後、細胞は、未処理のままであるか、又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）／イオノマイシンで一晩処理された。翌日、細胞をフローサイトメトリのために処理して（例えば、Ｋａｌａｉｔｚｉｄｉｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１７；１２７（４）：１４０５－１４１３）、編集された細胞集団の細胞表面でＴＲＡＣ及びβ２Ｍの発現レベルを評価した。以下の一次抗体が使用された（表５）：
【0376】
【表5】
【0377】
抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現は、ビオチン化組み換えヒトＣＤ１９（ＡＣＲＯＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＩＮＣ；ＣＤ９－Ｈ８２５）を使用して検出された。
【0378】
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の生成
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＴＲＡＣ遺伝子座における二重鎖切断を、配列番号８３のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ６（配列番号８６のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする、配列番号８４におけるドナー鋳型を含む）による相同組み換え修復によって修復し、ＡＡＶ６をＣａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭ Ｃａｓ９、及び５μＭ ｇＲＮＡ）と共に活性化同種異系ヒトＴ細胞に送達する。以下のｇＲＮＡを使用することができる：ＴＲＡＣ（配列番号２２）及びβ２Ｍ（配列番号２４）。ｇＲＮＡの非修飾バージョン（又は他の修飾バージョン）も使用され得る（例えば、配列番号１８及び配列番号２０）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞に関して上述したようにフローサイトメトリのために処理するが、以下の相違を有する。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現は、ビオチン化組み換えヒトＢＣＭＡ（ＡＣＲＯＳ Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）を使用して検出された。
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＴＲＡＣ遺伝子座における二重鎖切断を、配列番号８３のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ６（配列番号８６のアミノ酸配列を含む抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードする、配列番号８４におけるドナー鋳型を含む）による相同組み換え修復によって修復し、ＡＡＶ６をＣａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭ Ｃａｓ９、及び５μＭ ｇＲＮＡ）と共に活性化同種異系ヒトＴ細胞に送達する。以下のｇＲＮＡを使用することができる：ＴＲＡＣ（配列番号２２）及びβ２Ｍ（配列番号２４）。ｇＲＮＡの非修飾バージョン（又は他の修飾バージョン）も使用され得る（例えば、配列番号１８及び配列番号２０）。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、抗ＣＤ１９ＣＡＲ＋Ｔ細胞に関して上述したようにフローサイトメトリのために処理するが、以下の相違を有する。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現は、ビオチン化組み換えヒトＢＣＭＡ（ＡＣＲＯＳ Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）を使用して検出された。
【0379】
実施例２：ＣＡＲ Ｔ細胞上でのＣＤ３８発現。
ＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＤ３８細胞の発現を、フローサイトメトリによって測定した。具体的には、上記のエレクトロポレーション工程から約１５日後に、実施例１で概説したように調製した抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を抗体のパネルで染色し、ＣＤ３８発現を測定した。
ＣＡＲ Ｔ細胞上のＣＤ３８細胞の発現を、フローサイトメトリによって測定した。具体的には、上記のエレクトロポレーション工程から約１５日後に、実施例１で概説したように調製した抗ＣＤ１９及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を抗体のパネルで染色し、ＣＤ３８発現を測定した。
【0380】
生ＣＡＲ Ｔ細胞をその前方散乱（ＦＳＣ）及び側方散乱（ＳＳＣ）プロファイルによって、並びにｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染料（ｃａｔ＃Ｌ３４９６５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でゲートをかけた。続いて、細胞を抗体のパネル：ＣＤ３８ ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３ ＰＥ（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４ ＡＰＣ／Ｃｙ７（ＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び ＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＳＫ－１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。続いてＣＤ３Ｔ細胞にゲートをかけて、ＣＤ３８発現を測定した。ＣＤ３８＋集団のゲーティングカットオフ（ｇａｔｉｎｇ ｃｕｔ－ｏｆｆ）を確立するために、蛍光マイナスワン（ＦＭＯ）対照染色細胞を用いた（図１Ｃ）。データは、抗ＢＣＭＡ（７０．５％）及び抗ＣＤ１９（８７．１％）ＣＡＲ Ｔ細胞の大部分がＣＤ３８＋を発現することを示す。
【0381】
実施例３：正常なＰＢＭＣからのＮＫ及びＴ細胞上のＣＤ３８発現。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから回収して、正常な免疫細胞におけるＣＤ３８発現を評価した。２つのドナー（ドナー３４６９及びドナー３３８３）から回収したＰＢＭＣを、１０％の補体（プールされた補体血清、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を含む又は含まない培地（５％のヒトＡＢ血清（ｃａｔ＃ＨＰ１０２２ＨＩ、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を追加したＸ－ｖｉｖｏ培地（ｃａｔ＃０４－７４４，Ｌｏｎｚａ）、ＩＬ－２及びＩＬ７）で培養した。補体が媒介する溶解が抗ＣＤ３８抗体によってトリガされると、細胞が、補体を含む又は含まない培地中で培養されて、ＣＤ３８＋細胞に対する補体の効果を評価した。インビトロ培養の０日目（図２Ａ～２Ｄ及び３Ａ～３Ｄ）及び７２時間（図４Ａ～４Ｄ及び５Ａ～５Ｄ）に、フローサイトメトリを用いて、ＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）中のＣＤ３８発現を評価した。フローサイトメトリに使用した抗体パネルは、ＣＤ３ ＰＥ（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３８ ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６ ＡＰＣ（ＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ６９ ＰＥＣＹ５（ＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから回収して、正常な免疫細胞におけるＣＤ３８発現を評価した。２つのドナー（ドナー３４６９及びドナー３３８３）から回収したＰＢＭＣを、１０％の補体（プールされた補体血清、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）を含む又は含まない培地（５％のヒトＡＢ血清（ｃａｔ＃ＨＰ１０２２ＨＩ、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を追加したＸ－ｖｉｖｏ培地（ｃａｔ＃０４－７４４，Ｌｏｎｚａ）、ＩＬ－２及びＩＬ７）で培養した。補体が媒介する溶解が抗ＣＤ３８抗体によってトリガされると、細胞が、補体を含む又は含まない培地中で培養されて、ＣＤ３８＋細胞に対する補体の効果を評価した。インビトロ培養の０日目（図２Ａ～２Ｄ及び３Ａ～３Ｄ）及び７２時間（図４Ａ～４Ｄ及び５Ａ～５Ｄ）に、フローサイトメトリを用いて、ＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）中のＣＤ３８発現を評価した。フローサイトメトリに使用した抗体パネルは、ＣＤ３ ＰＥ（ＵＣＨＴ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３８ ＦＩＴＣ（Ｃｌｏｎｅ ＨＩＴ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ５６ ＡＰＣ（ＨＣＤ５６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＣＤ６９ ＰＥＣＹ５（ＦＮ５０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）であった。
【0382】
０日目（培養後１時間）に、ＮＫ細胞の大部分、及びＴ細胞の約半分が、その細胞表面上でＣＤ３８を発現した。ドナー３４６９由来のＰＢＭＣは、ＮＫ細胞の９６．１％（培地のみ）及び９６．６％（培地＋１０％補体）でＣＤ３８発現を示した（図２Ｃ～２Ｄ）。培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養したＴ細胞上のＣＤ３８発現を、４６．５％及び４４．９％でそれぞれ測定した（図２Ａ～２Ｂ）。同様に、培地、又は１０％の補体を追加した培地で培養したドナー３３８３由来のＰＢＭＣは、ＮＫ細胞の９７．２％（培地のみ）及び９７．０％（培地＋１０％補体）、並びにＴ細胞の５７．９％（培地のみ）及び５８．２％（培地＋補体）でＣＤ３８を発現した（図３Ａ～３Ｄ）。
【0383】
７２時間の培養の後、ＮＫ細胞及びＴ細胞の大部分がその細胞表面上でＣＤ３８を発現した。ドナー３４６９由来のＰＢＭＣを、培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養した場合、ＣＤ３８発現は、ＮＫ細胞の９８．４％（培地のみ）及び９９．５％（培地＋１０％補体）で検出された（図４Ｃ～４Ｄ）。培地のみ、又は１０％の補体を追加した培地で培養したＴ細胞上のＣＤ３８発現を、８５．３％及び８７．９％でそれぞれ測定した（図４Ａ～４Ｂ）。同様に、培地、又は１０％の補体を追加した培地で培養したドナー３３８３由来のＰＢＭＣは、ＮＫ細胞の９９．２％（培地のみ）及び９９％（培地＋１０％補体）、並びにＴ細胞の７１％（培地のみ）及び８２．６％（培地＋補体）でＣＤ３８を発現した（図５Ａ～５Ｄ）。
【0384】
これらのデータは、ＣＤ３８活性マーカーは、ＮＫ細胞の大部分（＞９０％）に存在し、また、細胞がインビトロで培養される時、補体の有無にかかわらず高いレベルのＣＤ３８発現が維持されることを示した。ＣＤ３８発現は、正常なＴ細胞集団では比較的低い（約５０％）が、ＣＤ３＋Ｔ細胞中のＣＤ３８発現は、培地のみでは７２時間の培養後に７１％及び８５．３％に増加し、１０％の補体を追加した培地では７２時間の培養後に８７．９％及び８２．６％に増加した。補体によって媒介される溶解は、誘発抗ＣＤ３８抗体（例えばダラツムマブ）であることが過去に報告されているが、データは、補体の存在はＣＤ３８＋ＮＫ又はＴ細胞数の細胞数に影響を及ぼさないことを示す。
【0385】
実施例４：ダラツムマブの処理はＮＫ細胞を枯渇させたが、Ｔ細胞数は影響を受けないままであった。
ＮＫ及びＴ細胞上のＣＤ３８の発現レベルに基づき、こうした細胞に対する抗ＣＤ３８抗体であるダラツムマブ（ＴＡＢ－２３６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）の効果を評価した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブを含有する培地中で９６時間培養した。細胞培養に対する１０％補体の効果も試験した。未処理の細胞及び０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１ｋ）（カタログ＃４０３５０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理した細胞を対照として用いた。９６時間の培養後、ＮＫ及びＴ細胞の頻度及び数を測定した。
ＮＫ及びＴ細胞上のＣＤ３８の発現レベルに基づき、こうした細胞に対する抗ＣＤ３８抗体であるダラツムマブ（ＴＡＢ－２３６、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）の効果を評価した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのダラツムマブを含有する培地中で９６時間培養した。細胞培養に対する１０％補体の効果も試験した。未処理の細胞及び０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬのアイソタイプ対照ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１ｋ）（カタログ＃４０３５０１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で処理した細胞を対照として用いた。９６時間の培養後、ＮＫ及びＴ細胞の頻度及び数を測定した。
【0386】
ダラツムマブのインビトロ培養は、ＮＫ細胞の頻度及び数の用量依存的な低減をもたらした（図６Ａ～６Ｂ）。試験された最大用量の１μｇ／ｍＬで、ダラツムマブは９６時間後にＮＫ細胞数を約７５％減少させた。アイソタイプ対照ｍＡｂによる処理はＮＫ細胞数に影響を及ぼさなかったため、この効果は、ダラツムマブに特異的である。１０％補体を細胞培養に添加しても、ＮＫ細胞のダラツムマブの効果は変化しなかったため、ＮＫ細胞の減少は、これらの培養条件下では補体依存性ではない。
【0387】
別のドナー由来の第２の実験ＰＢＭＣでは、ダラツムマブはわずか７２時間後にＮＫ細胞数を約５７％減少させた（データは示さない）。これらのデータは、ダラツムマブが異なるドナー集団由来のＮＫ細胞に対して同様の効果を有することを実証する。
【0388】
ＮＫ細胞に対するその効果とは反対に、ダラツムマブは、Ｔ細胞の数又は頻度に影響を及ぼさなかった（図６Ｃ～６Ｄ）。ＣＤ３８発現がＴ細胞上で検出され（図２Ａ～２Ｂ及び図３Ａ～３Ｂ）、ＰＢＭＣのインビトロ培養がＴ細胞中でＣＤ３８表面発現のアップレギュレーションをもたらしたが（図４Ａ～４Ｂ及び図５Ａ～５Ｂ）、Ｔ細胞数は、ダラツムマブを培養培地に添加したことによる影響を意外にも受けなかった。
【0389】
実施例５：ダラツムマブ処理はＣＡＲ Ｔ数に影響を及ぼさない。
破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲ Ｔ細胞にダラツムマブ処理が影響を及ぼすかどうかを評価するために、実施例１で生成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１０％の補体を含む又は含まないダラツムマブで処理した。７２時間の培養期間後、実施例３に記載するように、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数及び頻度をフローサイトメトリアッセイで測定した（図７Ａ～７Ｂ）。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の大部分（７０．５％）がＣＤ３８を発現したが（図１Ａ）、１０％の補体の有無に関わらず、ダラツムマブによる処置は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数又は頻度に影響を及ぼさなかった。
破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲ Ｔ細胞にダラツムマブ処理が影響を及ぼすかどうかを評価するために、実施例１で生成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１０％の補体を含む又は含まないダラツムマブで処理した。７２時間の培養期間後、実施例３に記載するように、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数及び頻度をフローサイトメトリアッセイで測定した（図７Ａ～７Ｂ）。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の大部分（７０．５％）がＣＤ３８を発現したが（図１Ａ）、１０％の補体の有無に関わらず、ダラツムマブによる処置は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の数又は頻度に影響を及ぼさなかった。
【0390】
実施例６：ダラツムマブ処理はＣＡＲ Ｔ細胞を活性化しない。
ダラツムマブがＣＡＲ Ｔ細胞を活性化し、それに続く増殖又は活性化誘発性の細胞死を引き起こすかどうかを判定するために、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を、ダラツムマブのみ、又は２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトアイソタイプ対照抗体を含むダラツムマブを用いて２４時間培養した。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。未処理の細胞、又はＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照ｍＡｂで処理した抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を、対照として使用した。２４時間のインキュベーション期間の最後に、初期活性化マーカーであるＣＤ６９の発現を評価した（図８Ａ～８Ｎ）。代表的なフローサイトメトリパネルに示すとおり、ＣＤ６９の発現は、処理に関係なく試験された全ての抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞集団で変化しなかった。したがって、データは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞上でＣＤ３８細胞表面マーカーが発現したにもかかわらず（８７．１％）（図１Ｂ）、ダラツムマブ処理が抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を誘導しなかったことを示す。
ダラツムマブがＣＡＲ Ｔ細胞を活性化し、それに続く増殖又は活性化誘発性の細胞死を引き起こすかどうかを判定するために、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を、ダラツムマブのみ、又は２μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトアイソタイプ対照抗体を含むダラツムマブを用いて２４時間培養した。ダラツムマブは、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。未処理の細胞、又はＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照ｍＡｂで処理した抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞を、対照として使用した。２４時間のインキュベーション期間の最後に、初期活性化マーカーであるＣＤ６９の発現を評価した（図８Ａ～８Ｎ）。代表的なフローサイトメトリパネルに示すとおり、ＣＤ６９の発現は、処理に関係なく試験された全ての抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞集団で変化しなかった。したがって、データは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞上でＣＤ３８細胞表面マーカーが発現したにもかかわらず（８７．１％）（図１Ｂ）、ダラツムマブ処理が抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を誘導しなかったことを示す。
【0391】
実施例７：ダラツムマブ前処理は、ＮＫ細胞に誘導されるＣＡＲ Ｔ細胞溶解を減少させた。
ダラツムマブが、ＮＫ細胞が媒介するＣＡＲ Ｔ細胞溶解を鈍らせるかどうかを判定するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した（図９Ａ）。６０時間の前処理期間の最後に、５０，０００個のｅｆｌｕｏｒでラベリングした抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１５０，０００個のＮＫ細胞及びＤａｒａ／アイソタイプ対照を含有するプレートに添加し、更に２４時間インキュベートした。２４時間の共培養期間の最後に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の溶解を、ＤＡＰＩを用いた細胞死滅アッセイ（ｃｅｌｌ－ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）で測定した。
ダラツムマブが、ＮＫ細胞が媒介するＣＡＲ Ｔ細胞溶解を鈍らせるかどうかを判定するために、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、０．０１、０．１、又は１μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した（図９Ａ）。６０時間の前処理期間の最後に、５０，０００個のｅｆｌｕｏｒでラベリングした抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１５０，０００個のＮＫ細胞及びＤａｒａ／アイソタイプ対照を含有するプレートに添加し、更に２４時間インキュベートした。２４時間の共培養期間の最後に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の溶解を、ＤＡＰＩを用いた細胞死滅アッセイ（ｃｅｌｌ－ｋｉｌｌ ａｓｓａｙ）で測定した。
【0392】
具体的には、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、５μＭのｅｆｌｕｏｒ６７０（カタログ＃６５－０８４０－９０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でラベリングし、洗浄し、ＮＫ細胞との共培養物（３：１（ＮＫ：Ｔ）比）中でインキュベートした。共培養物を２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、培地を、５ｍｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する１５０μＬの１×ＦＡＣＳ緩衝液、及び１２．５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｃ３６９５０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で置き換えた。細胞を、フローサイトメトリによって分析した（すなわち、生存細胞はＤＡＰＩ染色陰性である）。ダラツムマブで前処理した結果、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞の溶解は用量依存的に減少した（図９Ａ）。１μｇ／ｍＬのダラツムマブで６０時間前処理したＮＫ細胞は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞溶解を引き起こするその能力を５０％減少させた。アイソタイプ対照ｍＡｂで前処理したＮＫ細胞と共培養した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞が媒介するＣＡＲ Ｔ細胞溶解の変化に影響を及ぼさなかったため、この効果はダラツムマブに特異的である。
【0393】
実施例８：ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞に対する高濃度のダラツムマブの効果。
高濃度のダラツムマブ（１０μｇ／ｍＬ）がＣＡＲ Ｔ細胞を活性化させ、それに続く増殖又は活性化誘発性の細胞死を引き起こすかどうかを判定するために、Ｂ２Ｍが欠乏した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブと共に２４時間培養した。未処理の細胞、又はＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照ｍＡｂで処理したＢ２Ｍ欠乏抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、対照として使用した。図１０Ａは、ダラツムマブの濃度を１０μｇ／ｍＬに増加させても、Ｂ２Ｍ欠乏ＣＡＲ Ｔ細胞数が有意に減少しなかったことを実証する。
高濃度のダラツムマブ（１０μｇ／ｍＬ）がＣＡＲ Ｔ細胞を活性化させ、それに続く増殖又は活性化誘発性の細胞死を引き起こすかどうかを判定するために、Ｂ２Ｍが欠乏した抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブと共に２４時間培養した。未処理の細胞、又はＩｇＧ１ｋアイソタイプ対照ｍＡｂで処理したＢ２Ｍ欠乏抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、対照として使用した。図１０Ａは、ダラツムマブの濃度を１０μｇ／ｍＬに増加させても、Ｂ２Ｍ欠乏ＣＡＲ Ｔ細胞数が有意に減少しなかったことを実証する。
【0394】
１０μｇ／ｍＬのダラツムマブが、ＮＫ細胞が媒介するＣＡＲ Ｔ細胞溶解を鈍らせるかどうかを判定するために、Ｂ２Ｍ欠乏抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、０．１、１、又は１０μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブ又はアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した。簡潔に言えば、ＮＫ細胞を１ウェルあたり５０，０００又は１５０，０００細胞で平板培養し、０、０．１、１、及び１０μｇ／ｍＬの濃度のダラツムマブ又はアイソタイプ対照で処理した。ＮＫ細胞をダラツムマブで６０時間処理した後、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、５μＭのｅｆｌｕｏｒ６７０（カタログ＃６５－０８４０－９０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でラベリングし、洗浄し、ダラツムマブで処理したＮＫ細胞との共培養物に１ウェルあたり５０，０００細胞で播種して、１：１又は３：１（ＮＫ：Ｔ）の比にした。共培養物を更に２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、培地を、５ｍｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する１５０μＬの１×ＦＡＣＳ緩衝液、及び１２．５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｃ３６９５０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で置き換えた。細胞を、フローサイトメトリによって分析した（すなわち、生存細胞はＤＡＰＩ染色陰性である）。ダラツムマブでの前処理は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＫ誘導細胞溶解から用量依存的に保護した（図１０Ｂ～１０Ｃ）。ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＫ細胞と１：１比で共培養した場合、ＮＫ細胞を０．１μｇ／ｍＬのダラツムマブで前処理すると、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞溶解に対して９１％の最大保護効果を示した（図１０Ｂ）。ＮＫ：ＣＡＲ Ｔ細胞の比を３：１に増加させた場合、ダラツムマブは、１μｇ／ｍＬのわずかに高い用量で、ＮＫ細胞溶解からの有意な保護効果を依然としてもたらした（８５％保護）（図１０Ｃ）。
【0395】
実施例９：ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞に対するダラツムマブの用量増加の効果。
ダラツムマブは、診療所では１６ｍｇ／ｋｇ（（２２５μｇ／ｍＬ当量）で処方されている。ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞に対する高濃度のダラツムマブの効果を判定するために、Ｂ２Ｍ欠乏抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、前述の実施例に記載されるとおりの方法を用いてそれぞれ濃度０．０１、０．１、１、１０、１００、又は３００μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１κ又はダラツムマブのいずれかで６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した。前述の実施例に記載されるとおりの方法を用いて前処理したＮＫ細胞との共培養から７２時間後に、フローサイトメトリを用いて、ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞の数を評価した。
ダラツムマブは、診療所では１６ｍｇ／ｋｇ（（２２５μｇ／ｍＬ当量）で処方されている。ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞に対する高濃度のダラツムマブの効果を判定するために、Ｂ２Ｍ欠乏抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞を、前述の実施例に記載されるとおりの方法を用いてそれぞれ濃度０．０１、０．１、１、１０、１００、又は３００μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１κ又はダラツムマブのいずれかで６０時間前処理した精製ＮＫ細胞と共培養した。前述の実施例に記載されるとおりの方法を用いて前処理したＮＫ細胞との共培養から７２時間後に、フローサイトメトリを用いて、ＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞の数を評価した。
【0396】
図１１Ａは、ダラツムマブの用量を増加させると、暴露から７２時間後にＮＫ細胞数が低減したことを実証する。１μｇ／ｍＬのダラツムマブに暴露した後で２９％のＮＫ細胞の低減が見られ、一方で３００μｇ／ｍＬのダラツムマブでは更に３８％のＮＫ細胞の低減がもたらされる。対照的に、ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞数は、高いダラツムマブの濃度による影響を受けなかった（図１１Ｂ）。
【0397】
実施例１０：急性リンパ芽球性白血病のマウス異種移植モデルにおけるＮＫ及びＣＡＲ Ｔ細胞に対するダラツムマブのインビボ効果。
播種マウスモデルを用いて、ダラツムマブを含む、及び含まない場合の両方で、ＮＫ細胞の存在下でのＢ２Ｍ不足抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ効力を更に評価した。
播種マウスモデルを用いて、ダラツムマブを含む、及び含まない場合の両方で、ＮＫ細胞の存在下でのＢ２Ｍ不足抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ効力を更に評価した。
【0398】
２４頭の５～８週齢の雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩ１２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）マウスを、試験開始の５～７日前に、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に収容し、無菌条件下で維持した。研究開始時に、マウスを１２の治療群に分けた。マウスを静脈接種して（尾静脈）、播種性疾患をモデリングした。１日目に、マウスにＮＡＬＭ６腫瘍細胞の静脈注射を投与した（マウスあたり０．５×１０6細胞）。この実験で使用したＮＡＬＭ６腫瘍細胞は、ＧＦＰ及び発光酵素を発現するヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）腫瘍細胞株であった。２日目に、群２～１２に、ＮＫ細胞、ＰＢＳ、ダラツムマブ（ＤＡＲＡ）、及び／又はＩｇＧ１の静脈注射を投与した。ＰＢＳ及びＩｇＧ１は陰性対照として含めた。群１～３及び７～８には、研究の４日目に抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞（マウスあたり４×１０6細胞）の静脈注射も投与した。注射された抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞は、実施例１に記載されるとおりに調製した。群３。６、９、及び１２は、ダラツムマブの代わりにＩｇＧ１で処理した陰性対照群であった。ＩｇＧ１群の予期せぬ効果は存在しなかった（データは示さず）。実験群の詳細を下記の表６に示す。
【0399】
【表6】
【0400】
研究過程において、マウスを毎日監視し、体重を週２回測定した。注射後２週間で、マウスから血液を回収し、フローサイトメトリによって細胞数を測定して、循環中のＮＫ細胞に対するＤＡＲＡの効果を判定した。図１２は、ＤＡＲＡがインビボマウスモデル中のＮＫ細胞数を効果的に低減させたことを示す。
【0401】
疾患負荷を、発光酵素を発現するレンチウイルスベクターでマークしたＮＡＬＭ６腫瘍細胞の生物発光イメージングによって測定した。簡潔に言えば、マウスを麻酔し、腹腔内注射によってルシフェリンを投与した。発光酵素でマークしたＮＡＬＭ６白血病細胞は、ルシフェリンを代謝し、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）により採用され、本明細書に記載される方法を用いて、放射された光を検出して定量化した。この方法を用いて、研究の２日目に生物発光（ＢＬＩ；合計ＲＯＩ、光子／秒）を開始して週に２回測定し、白血病負荷の測定及び生着の検出を可能にする。
【0402】
ＮＫ細胞、ＤＡＲＡ、又はＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を投与されなかった対照群１０、１１、及び１２は、１５日目で生物発光の急激な増加を示し、２０日を超えて生存しなかった（図１３）。抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞による処理（群１：図１３）は、対照と比較して腫瘍進行を遅らせ、生存率を増加させた。ＮＫ細胞の存在は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞のみの効力に悪影響を及ぼすようには見えなかった。しかしながら、ＮＫ細胞の存在下では、ダラツムマブの添加により、抗ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の効率が劇的に増加した（群８、図１３）。予期せぬことに、ダラツムマブのみ（群１１）及びＮＫ細胞の存在下でのダラツムマブ（群５）も、対照と比較して腫瘍成長を遅らせ、ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞と組み合わせると相乗効果を有した（群２）（図１３）。
【0403】
有意なエンドポイント（罹患前後までの時間）及びＴ細胞生着の効果も評価した。研究の全ての群に対して動物死亡率のパーセンテージ及び死亡までの時間を記録した。マウスは、瀕死状態に達する前に安楽死させた。以下の基準の１つ以上が適合した場合、マウスは瀕死状態にあると定義して犠牲にした：
・１週間を超える期間にわたり持続する２０％以上の体重の減少；
・摂食、飲水、運動性、並びに排尿及び／又は排便能力などの正常な生理学的機能を阻害する腫瘍；
・過剰な体重減少（＞２０％）をもたらす長期の過剰な下痢；又は
・持続的な喘鳴及び呼吸困難。
・１週間を超える期間にわたり持続する２０％以上の体重の減少；
・摂食、飲水、運動性、並びに排尿及び／又は排便能力などの正常な生理学的機能を阻害する腫瘍；
・過剰な体重減少（＞２０％）をもたらす長期の過剰な下痢；又は
・持続的な喘鳴及び呼吸困難。
【0404】
動物は、臨床的観察によって定義して、下記のものなどの長期の又は過剰な疼痛又は困難が存在する場合も瀕死であると見なされた：衰弱、猫背の姿勢（ｈｕｎｃｈｅｄ ｐｏｓｔｕｒｅ）、麻痺／不全麻痺、腹部膨張、潰瘍形成、膿瘍、痙攣、及び／又は出血。動物の生存率に対するダラツムマブの効果を下記の表７に示し、ここで統計的有意性はマン－ホイットニー検定を用いて決定し、ｐ値はＰＢＳ対照と比較して計算した（例えば、群１０対群１、群２、など）。
【0405】
【表7】
【0406】
実施例１１：ダラツムマブは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性を強化し、多発性骨髄腫の異種移植マウスモデルにおける生存率を延長する。
免疫不全ＮＯＧマウスにおけるダラツムマブ及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理の組み合わせの効果を、皮下ＭＭ．１Ｓ異種移植モデルで試験した（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩｌ２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）。簡潔に言えば、５～８週齢の雌ＮＯＧマウスを、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に収容し、無菌条件下で維持した。動物はそれぞれ右側腹部に５０％マトリゲル中５×１０6個のＭＭ．１Ｓ細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍容積が１５０ｍｍ3（約１２５～１７５ｍｍ3）に達した時、マウスを各群５匹のマウスの群に無作為化した。試験群は、未処理治療群、ダラツムマブのみの処理、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみの処理（低用量又は高用量）、及びダラツムマブと組み合わせた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低用量又は高用量）を含んだ。０日目に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、０．８×１０6（低用量）又は２．４×１０6（高用量）ＣＡＲ+Ｔ細胞の静脈注射によって投与した。ダラツムマブは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞投薬の２日前に開始して、週２回１５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ＩＰ）投薬した。
免疫不全ＮＯＧマウスにおけるダラツムマブ及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理の組み合わせの効果を、皮下ＭＭ．１Ｓ異種移植モデルで試験した（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩｌ２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）。簡潔に言えば、５～８週齢の雌ＮＯＧマウスを、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で個別に収容し、無菌条件下で維持した。動物はそれぞれ右側腹部に５０％マトリゲル中５×１０6個のＭＭ．１Ｓ細胞の皮下接種を受けた。平均腫瘍容積が１５０ｍｍ3（約１２５～１７５ｍｍ3）に達した時、マウスを各群５匹のマウスの群に無作為化した。試験群は、未処理治療群、ダラツムマブのみの処理、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のみの処理（低用量又は高用量）、及びダラツムマブと組み合わせた抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞（低用量又は高用量）を含んだ。０日目に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞を、０．８×１０6（低用量）又は２．４×１０6（高用量）ＣＡＲ+Ｔ細胞の静脈注射によって投与した。ダラツムマブは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞投薬の２日前に開始して、週２回１５ｍｇ／ｋｇを腹腔内（ＩＰ）投薬した。
【0407】
腫瘍容積及び体重は、週に２回測定され、個々のマウスは、それらの腫瘍容積が≧２０００ｍｍ3に達した時に安楽死させられた。試験された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれの用量でも、腫瘍阻害の最大効力は、各単一治療群の処理と比較して組み合わせ治療群で観察された。更に、長期の生存率は、低用量（図１４Ａ）及び高用量（図１４Ｂ）抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理のいずれにおいても、ダラツムマブ又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞のいずれかの単一治療群処理と比較して、組み合わせ治療群で観察された。２６日目における腫瘍容積を図１４Ｃに示す。高用量の抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞、又はダラツムマブのみのいずれかで処理された動物は、約１５００ｍｍ3（それぞれ１４８６ｍｍ3及び１４７５ｍｍ3）の平均腫瘍容積を示し、一方で組み合わせ治療群における平均腫瘍容積は６６８ｍｍ3の平均を示した（図１４Ｃ）。
【0408】
要約すると、これらの結果は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞とダラツムマブとの組み合わせは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞又はダラツムマブのみのいずれかと比較して、多発性骨髄腫のマウスモデルにおける腫瘍阻害及び生存率の増加の両方における効力の増加を示したことを実証する。
【0409】
【表8】
【0410】
【表9】
【0411】
【表10】
【0412】
【表11】
【0413】
【表12】
【0414】
【表13】
【0415】
【表14】
【0416】
【表15】
【0417】
【表16】
【0418】
【表17】
【0419】
【表18】
【0420】
【表19】
【0421】
【表20】
【0422】
【表21】
【0423】
【表22】
【0424】
【表23】
【0425】
【表24】
【0426】
【表25】
【0427】
【表26】
【0428】
【表27】
【0429】
【表28】
【0430】
【表29】
【0431】
【表30】
【0432】
【表31】
【0433】
【表32】
【0434】
【表33】
【0435】
【表34】
【0436】
【表35】
【0437】
【表36】
【0438】
【表37】
【0439】
他の実施形態
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせが可能である。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、又は同様の目的に役立つ代替的な特徴へと置き換えが可能である。つまり、特に記載されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価又は同様の特徴の単なる一例である。
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせが可能である。本明細書に開示される各特徴は、同じ、等価の、又は同様の目的に役立つ代替的な特徴へと置き換えが可能である。つまり、特に記載されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の等価又は同様の特徴の単なる一例である。
【0440】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特性を容易に把握することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の種々の変更及び修正を行い、本発明を各種の用途及び条件に適合させることができる。したがって、その他の実施形態も請求項の範囲に含まれるものとする。
【0441】
等価物
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、並びに／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々なその他の手段及び／又は構造を容易に想定するものであり、こうした変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料、及び構成は例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く等価物を、日常の実験のみを用いて認識するか、又は確認可能である。したがって、上述の実施形態は単に例として提示されており、また、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内において、本発明の実施形態が、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合は、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、並びに／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々なその他の手段及び／又は構造を容易に想定するものであり、こうした変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料、及び構成は例示的であることを意図し、実際のパラメーター、寸法、材料、及び／又は構成は、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く等価物を、日常の実験のみを用いて認識するか、又は確認可能である。したがって、上述の実施形態は単に例として提示されており、また、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内において、本発明の実施形態が、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾しない場合は、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【0442】
本明細書中で定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義、及び／又は定義される用語の普通の意味を超えて優先されるものと理解されたい。
【0443】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。
【0444】
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
【0445】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する時、「及び／又は」という表現は、等位結合される要素、すなわち、一部の場合では接続的に提示され、その他の場合で離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」を意味するものとして理解されたい。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素のうちの「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定された要素に関連する又は関連しないに関わらず、その他の要素が任意選択的に提示されてよい。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は、「～を備える」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。
【0446】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する時、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する際に、「又は」又は「及び／又は」は、包括的である、すなわち、要素のリストのうち少なくとも１つを含むが、２つ以上の数、及び任意選択的に追加的な列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。「～のうち１つのみ（ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」又は「～のうちの厳密に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」、或いは特許請求の範囲で使用される時の「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの反対を明らかに示す用語のみが、多数の要素又は要素のリストのうちの厳密に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用する時、用語「又は」は、「いずれか」、「～のうちの１つ」、「～のうち１つのみ」、又は「～のうちの厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合のみ、排他的代替用語（すなわち、「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「本質的に～からなる（Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲内で使用される時、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【0447】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する時、「少なくとも１つ」という語句は、１つ以上の要素のリストを参照して、要素のリスト中の要素のうちのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されたあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含まず、また、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しないものと理解されるべきである。この定義はまた、具体的に特定された要素に関連する又は関連しないに関わらず、「少なくとも１つ」という語句を指す、要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることを許容する。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は、同等に「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、若しくは同等に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、Ｂが存在しない、任意選択的に１つ超のＡを含む少なくとも１つのＡ（且つ任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ａが存在しない、任意選択的に１つ超のＢを含む少なくとも１つのＢ（且つ任意選択的にＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態では、任意選択的に２つ以上のＡを含む少なくとも１つのＡ、及び任意選択的に２つ以上のＢを含む少なくとも１つのＢ（且つ任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。
【0448】
同様に、明確に反対に示されない限り、複数の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A-2B】
【図2C-2D】
【図3A-3B】
【図3C-3D】
【図4A-4B】
【図4C-4D】
【図5A-5B】
【図5C-5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図8F】
【図8G】
【図8H】
【図8I】
【図8J】
【図8K】
【図8L】
【図8M】
【図8N】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【配列表】
【国際調査報告】