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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-06
(54)【発明の名称】膵臓がんの新規診断マーカー
(51)【国際特許分類】
C07K 5/10 20060101AFI20220830BHJP
G01N 33/493 20060101ALI20220830BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20220830BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20220830BHJP
【ＦＩ】
C07K5/10 ZNA
G01N33/493 A
C12Q1/37
C12N9/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021577260
(86)(22)【出願日】2020-06-23
(85)【翻訳文提出日】2022-02-22
(86)【国際出願番号】 EP2020067542
(87)【国際公開番号】W WO2020260309
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】P.430348
(32)【優先日】2019-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PL
(31)【優先権主張番号】20150093.1
(32)【優先日】2020-01-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20166354.9
(32)【優先日】2020-03-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521563895
【氏名又は名称】ユルテステ・ソシエテ・アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100122644
【弁理士】
【氏名又は名称】寺地 拓己
(72)【発明者】
【氏名】レスナー，アダム
(72)【発明者】
【氏名】グルバ，ナタリア
【テーマコード（参考）】
2G045
4B050
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB03
2G045DA20
2G045FB12
2G045GC10
4B050CC07
4B050DD11
4B050EE10
4B050FF20C
4B050LL03
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR66
4B063QS31
4B063QS40
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA13
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、式（１）：Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２によって特徴付けられる化合物を提供し、これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。本発明はさらに、被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を本発明の化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法を提供し、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素を含むことができる。さらに、本発明は、本発明の化合物および測定緩衝液を含むキットを提供する。これに加えて、本発明は、膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、本発明の化合物、インビトロ法、またはキットの使用を提供する。本発明はまた、膵臓がんの処置方法における本発明の化合物の使用を提供し、該方法は、被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法を実施し、プロテアーゼ活性が検出された被験体において膵臓がんを処置することを含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１によって特徴付けられる化合物：Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、
Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらし、
Ｘ１は成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２は成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルは、Ｃ１およびＣ２の空間的分離によりもたらされる。
【請求項2】
配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｃ１およびＣ２の一方、とりわけＣ２が、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物が、波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項4】
Ｃ１およびＣ２が蛍光供与体および蛍光受容体の対である、請求項１～３のいずれかに記載の化合物。
【請求項5】
Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の化合物。
【請求項6】
被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができ、該化合物は、式１によって特徴付けられ：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
【請求項7】
被験体における膵臓がんの存在または非存在を検出するための請求項６に記載のインビトロ法であって、体液中のプロテアーゼ活性の存在が膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在が膵臓がんの非存在を示す、前記方法。
【請求項8】
膵臓がんの診断のための請求項６または７に記載のインビトロ法。
【請求項9】
体液が尿である、請求項６～８のいずれかに記載のインビトロ法。
【請求項10】
化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、請求項６～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
シグナルを検出することが、吸光度または蛍光を測定すること、とりわけ、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり、３００～５００ｎｍ、より具体的には３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む、請求項６～１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
請求項１～５のいずれかに記載の化合物および測定緩衝液を含むキット。
【請求項13】
膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす；
請求項６～１１のいずれかの方法；または
前記化合物および測定緩衝液を含むキット
の使用。
【請求項14】
膵臓がんの処置方法であって、ａ． 請求項７～１２のいずれかに記載の方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膵臓がんの診断に使用するための化合物に関する。とりわけ、本発明は、試料内のタンパク質分解酵素の検出に適した発色性ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
膵臓がんは通常後期に診断されるため、予後がきわめて不良であることが多い。このがんの動態に起因して、５年生存はまれである。世界中で年間約２５００００例が膵臓がんと診断されており、ポーランドでは３５００例である。残念ながら、大多数の症例は死に至る（８０％を超える）。膵臓がんの検出のための、信頼性があり、迅速で、かつ複雑でない診断方法に対する、満たされていない必要性が存在する。早期診断により外科的治療の機会が増え、患者の生存期間が大幅に延長する可能性がある。
【0003】
がん細胞の開始、成長および播種のプロセスには、いくつかのタンパク質分解酵素を含む多くの因子が関与している。この群のタンパク質は、タンパク質およびペプチドをより小さな断片に加水分解することができる。タンパク質分解酵素は細胞外マトリックスの分解を媒介し、その結果、がん細胞が新しい組織にコロニーを形成することが可能になり、新しい血管の形成（血管新生）が可能になり、腫瘍への栄養分の効率的な送達が促進される。さらに、タンパク質分解酵素は、腫瘍成長プロセスによる正常細胞の死の結果として存在する。これらのプロセスはすべて、腫瘍に特徴的なタンパク質分解酵素のプロフィルを形成する。
【0004】
タンパク質分解酵素の影響下で分解して、被験溶液の色の変化または増大を引き起こす発色性ペプチド分子は、以前に記載されている。この発色効果は発色団（例えば、４－ニトロアニリドまたは５－アミノ－２－ニトロ安息香酸）の放出の結果である。
【0005】
このタイプのペプチド誘導体は、以下の公開物から公知である：
１．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ＢＦ， Ｋｏｋｏｗｓｋｙ Ｎ， Ｃｏｈｅｎ Ｗ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６１年１１月；９５：２７１－８。
２．Ｈｏｊｏ Ｋ， Ｍａｅｄａ Ｍ， Ｉｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｓｍｉｔｈ Ｔ， Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ， Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． ＸＸＸＶ． Ｆａｃｉｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ （東京）．２０００年１１月；４８（１１）：１７４０－４。
１．Ｅｒｌａｎｇｅｒ ＢＦ， Ｋｏｋｏｗｓｋｙ Ｎ， Ｃｏｈｅｎ Ｗ． Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ． Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６１年１１月；９５：２７１－８。
２．Ｈｏｊｏ Ｋ， Ｍａｅｄａ Ｍ， Ｉｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｓｍｉｔｈ Ｔ， Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ， Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ． Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． ＸＸＸＶ． Ｆａｃｉｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ （東京）．２０００年１１月；４８（１１）：１７４０－４。
【0006】
プロテアーゼの発現を検出および測定するための方法は、以前に記載されている。開示されている方法は、特定のポリペプチドに特異的に結合する単離された抗体、および特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのＰＣＲに基づく。プロテアーゼ活性の実証は、発色性分子とコンジュゲートした適切な合成ペプチド基質の加水分解によって測定され、ここで、プロテアーゼは前記合成基質を開裂し、基質の加水分解中に放出される色原体の吸光度が測定される。（ＣＡ２４２５８２９号）。
【0007】
本発明による好ましい化合物は、化合物を膵臓がんを有する人の尿試料と接触させた場合に、シグナル、例えば３８０～４４０ｎｍの範囲の色の増大を検出することができるように開発された。この効果は、化合物を健康な人または別のタイプのがんと診断された患者の尿試料と接触させた場合には生じない。
【0008】
本発明者らは、このようなシグナル、例えば、蛍光性供与体／受容体対の分離後に放出される発色性化合物シグナルまたは蛍光性シグナルを、膵臓がんを有する被験体の尿中のタンパク質分解酵素の存在を検出するために使用することができることを発見した。化合物の酵素的加水分解は、検出可能な差異、例えば、３２０～４８０ｎｍで吸光度を示す遊離発色団分子（それぞれ、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のＡＮＢ－ＮＨ２－アミドまたはｐＮＡ－パラ－ニトロアニリン）の放出の発生をもたらす。
【0009】
本発明の化合物は、とりわけ、（ｉ）膵臓がんの検出のための迅速で非侵襲的な診断方法、（ｉｉ）膵臓がんの早期検出に適した方法、（ｉｉｉ）膵臓がんのスクリーニングに良好に用いることができる方法、（ｉｖ）より有効な処置を導入するためのがん発生の早期における完全な診断プロセスを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】ＣＡ２４２５ ８２９号
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９６１年１１月；９５：２７１－８
【非特許文献2】Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ （東京）．２０００年１１月；４８（１１）：１７４０－４
【発明の概要】
【0012】
第１の観点において、本発明は、式１によって特徴付けられる化合物に関する：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。化合物は、配列番号１に従ったテトラペプチドＴｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇを含む。
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。化合物は、配列番号１に従ったテトラペプチドＴｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇを含む。
【0013】
第２の観点において、本発明は、被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を本発明の第１の観点に従った化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法に関し、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができる。
【0014】
第３の観点において、本発明は、本発明の第１の観点に従った化合物および測定緩衝液を含むキットに関する。
第４の態様において、本発明は、膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、本発明の第１の観点に従った化合物、本発明の第２の観点に従った方法、または本発明の第３の観点に従ったキットの使用に関する。
第４の態様において、本発明は、膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、本発明の第１の観点に従った化合物、本発明の第２の観点に従った方法、または本発明の第３の観点に従ったキットの使用に関する。
【0015】
第５の観点において、本発明は、膵臓がんの処置方法における本発明の第１の観点に従った化合物の使用に関し、該方法は、（ａ）本発明の第２の観点に従った方法を実施する段階、および（ｂ）段階（ａ）でプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１は、がんと診断された患者の尿試料（試料１～１０）および健常者からの尿（１１～２５）中の基質（１）ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２の加水分解速度を示す。アラビア数字は、選択した尿試料の番号を示す。図１は、試料１～１０はすべて崩壊したが、試料３および１０では材料２または９よりもＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２基質の分解がより効率的に起こったことを示している。この結果は、タンパク質分解に関与する酵素の活性および量の差に起因し得る。さらに、図１は、式２の化合物の溶液を健常者（がんと診断されていない）からの尿試料と一緒にインキュベートしても吸光度の増大は生じず、したがって試験化合物の加水分解は起こらないことを示している。この結果は、膵臓がんに特徴的なタンパク質分解酵素が存在しないことを示している。
【図2】図２は、がんと診断された患者の尿試料（試料１～１０）および健常者からの尿（１１～２５）中の基質（２）ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡの加水分解速度を示す。アラビア数字は、選択した尿試料の番号を示す。図１について上記したのと同様の結果が得られている。
【図3】図３は、基質（１）ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ ＮＨ２の加水分解度とｐＨ環境との関係を示す。試験したｐＨ値をｘ軸に示す。タンパク質分解活性と反応環境のｐＨとの関係を評価した。この実験の結果、試験材料はアルカリ性ｐＨで最大活性を示す少なくとも１つの酵素を有することが見出された。
【図4】図４は、膵臓がんと診断された人からの尿を含有する無作為に選択された系の逆相ＨＰＬＣ分析を示す。化合物（１）（ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２、示している）および（２）（ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡ、示していない）は両方とも、ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇペプチドフラグメントおよび発色団（それぞれＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡ）に分解する。Ａ： ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中のＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ ＮＨ２基質。Ｂ：膵臓がんと診断された患者の尿中のＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ ＮＨ２基質の加水分解。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明を以下で詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬は変化し得るので、これらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。好ましくは、本明細書で用いられる用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」， Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｈ．Ｇ．Ｗ， Ｎａｇｅｌ， Ｂ．およびＫoｌｂｌ， Ｈ．編集（１９９５）， Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，スイス）に記載されているように定義される。
【0018】
本明細書の本文全体を通して、いくつかの文書が引用されている。本明細書中で引用される文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、指示書等を含む）はそれぞれ、上記または下記のいずれであっても、その全体が参照により本明細書に援用される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明に基づきそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈すべきでない。
【0019】
本発明を実施するために、特記しない限り、当分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編集， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照）に説明されている従来の化学的方法、生化学的方法、および組換えＤＮＡ技術を使用する。
【0020】
本明細書および以下の特許請求の範囲の全体にわたって、文脈に別段の要求がない限り、単語「含む(comprise)」、ならびに「含む(comprises)」および「含んでいる(comprising)」などの変形は、提示される整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を包含するが、任意の他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群を排除しないことを意味すると、理解されるであろう。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、内容が別段の明確な指示をしない限り、複数の指示対象を包含する。
【0021】
以下で、本発明の要素について記載する。これらの要素は特定の態様と共に列挙されるが、任意の方法および任意の数で組み合わせて、追加的な態様を作り出してもよいことを理解すべきである。さまざまに記載される実施例および好ましい態様は、明示的に記載される態様のみに本発明を限定するように解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される態様を、任意の数の開示されるおよび／または好ましい要素と組み合わせる態様を支持し、包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願に記載されるすべての要素の任意の並び換えおよび組み合わせは、文脈が別段の指示をしない限り、本出願の説明によって開示されるとみなされるべきである。
【0022】
特許明細書および特許請求の範囲で用いられる用語および略語は、以下のように理解されるべきである：
本発明の文脈において、「検出可能なシグナル」は、磁気標識、蛍光性部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、ポリマー染料粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的に活性な種、半導体ナノ結晶、または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子など、任意の標識によって生じるような任意のシグナルをさす。標識は、例えば、発色団、フルオロフォア、量子ドット、または放射性標識であることができる。
本発明の文脈において、「検出可能なシグナル」は、磁気標識、蛍光性部分、酵素、化学発光プローブ、金属粒子、非金属コロイド粒子、ポリマー染料粒子、顔料分子、顔料粒子、電気化学的に活性な種、半導体ナノ結晶、または量子ドットもしくは金粒子を含む他のナノ粒子など、任意の標識によって生じるような任意のシグナルをさす。標識は、例えば、発色団、フルオロフォア、量子ドット、または放射性標識であることができる。
【0023】
本発明の文脈において、「発色団」という表現は、「発色特性」を有する化合物をさすために使用される。「発色特性」という表現は、化合物が着色生成物を形成する能力をさす。
【0024】
本発明の文脈において、「フルオロフォア」という表現は、「発蛍光特性」を有する化合物をさすために使用される。「発蛍光特性」という表現は、化合物が蛍光発光性生成物を形成する能力をさす。
【0025】
本発明の蛍光染料は以下のクラスの染料を含む：キサンテン（例えば、フルオレセイン）、アクリジン（例えば、アクリジンイエロー）、オキサジン（例えば、オキサジン１）、シニン（例えば、Ｃｙ７／Ｃｙ３）、スチリル染料（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０）、ポルフィン（例えば、クロロフィルＢ）、金属配位子錯体（例えば、ＰｔＯＥＰＫ）、蛍光タンパク質（例えば、ＡＰＣ、Ｒ－フィコエリトリン）、ナノ結晶（例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ ７０５）、ペリレン（例えば、Ｌｕｍｏｇｅｎ Ｒｅｄ Ｆ３００）およびフタロシアニン(Phtalocyanine)（例えば、ＩＲＤＹＥ（商標）７００ＤＸ）ならびにこれらのクラスの染料のコンジュゲートおよび組み合わせ。
【0026】
量子ドットは、周期表のＩＩ－ＶＩ族またはＩＩＩ－Ｖ族元素からの原子で構成される半導体である（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ）。他の代替物としては、任意の二染料系が挙げられる。
【0027】
本発明の文脈において、ＮＭＰはＮ－メチルピロリドンをさす。
本発明の文脈において、ＤＭＦはジメチルホルムアミドをさす。
本発明の文脈において、ＤＣＭは塩化メチレンをさす。
本発明の文脈において、ＤＭＦはジメチルホルムアミドをさす。
本発明の文脈において、ＤＣＭは塩化メチレンをさす。
【0028】
本発明の文脈において、ｐＮＡは４－ニトロアニリンをさし、これは、パラ－ニトロアニリンとよばれることもある。
本発明の文脈において、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸をさす。
本発明の文脈において、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸をさす。
【0029】
本発明の文脈において、ＡＮＢ－ＮＨ２は、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミドをさす。
本発明の文脈において、ＡＦＣは７－アミド－４－トリフルオロメチルクマリンをさす。
本発明の文脈において、ＡＦＣは７－アミド－４－トリフルオロメチルクマリンをさす。
【0030】
本発明の文脈において、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基をさす。
本発明の文脈において、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメトキシカルボニル基をさす。
本発明の文脈において、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸をさす。
本発明の文脈において、Ｆｍｏｃは９－フルオレニルメトキシカルボニル基をさす。
本発明の文脈において、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸をさす。
【0031】
本発明の文脈において、「膵臓がん」という用語は、もっとも広い意味で使用され、膵臓で始まるすべてのがんをさす。これには、外分泌がん、内分泌がん、膵芽腫、膵肉腫、およびリンパ腫の亜型が含まれる。外分泌がんとしては、腺がん、とりわけ導管腺がんのほか、嚢胞性腫瘍および腺房細胞がんが挙げられる。内分泌がんとしては、ガストリノーマ、インスリノーマ、ソマトスタチノーマ、ビポーマ、およびグルカゴノーマが挙げられる。また、以下の病期（括弧内の対応するＴＮＭ分類（１以上）によって定義される）も包含される：０期（Ｔｉｓ、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＡ期（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＢ期（Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＩＡ期（Ｔ３、Ｎ０、Ｍ０）、ＩＩＢ期（Ｔ１－３、Ｎ１、Ｍ０）、ＩＩＩ期（Ｔ４、あらゆるＮ、Ｍ０）、およびＩＶ期（あらゆるＴ、あらゆるＮ、Ｍ１）。
【0032】
本発明に従ったペプチド、好ましくは発色性または発蛍光性ペプチドは、当技術分野で公知のように、固体支持体上でペプチド合成を実施することによって得ることができる。固体支持体は、Ｆｍｏｃ基を有する樹脂の形態にあることができ、これは反応の過程の間に除去される。このプロセスを実施するために使用される樹脂は、適切に調製されるべきである。この樹脂の調製は、疎水性溶媒で繰り返し洗浄することによってその体積を増大させることを含む。
【0033】
Ｆｍｏｃ保護基は、２０％溶媒溶液で洗浄することによって樹脂から除去しなければならない。
発色性ペプチドを得る公知のプロセスは、適切な時間および化学量論的条件下での個々の成分の付着を包含する。この付着プロセスは、個々の要素（アミノ酸誘導体）を付着させ、残基を洗浄除去し、保護基を除去して再洗浄する、後続工程からなる。このサイクルを各アミノ酸残基について繰り返す。得られたペプチドは、酸性条件下での反応によって樹脂から分離する。続いて、濾過により樹脂から溶液を分離した後、得られた溶液から非極性溶媒でペプチドを沈殿させる。次いで、ペプチド沈殿物を遠心分離する。
発色性ペプチドを得る公知のプロセスは、適切な時間および化学量論的条件下での個々の成分の付着を包含する。この付着プロセスは、個々の要素（アミノ酸誘導体）を付着させ、残基を洗浄除去し、保護基を除去して再洗浄する、後続工程からなる。このサイクルを各アミノ酸残基について繰り返す。得られたペプチドは、酸性条件下での反応によって樹脂から分離する。続いて、濾過により樹脂から溶液を分離した後、得られた溶液から非極性溶媒でペプチドを沈殿させる。次いで、ペプチド沈殿物を遠心分離する。
【0034】
発色性ペプチドを得る公知の方法は、固体支持体上で、部分的に緩衝液中で実施されるプロセスに基づく。固体支持体としてアミド樹脂を使用し、溶液として疎水性溶媒の混合物を使用する。
【0035】
本発明に従った化合物は、Ｈｏｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（東京），２０００に記載されている方法を用いて調製した。合成の詳細な説明は、以下の実施例の項に見出すことができる。
【0036】
さらに、本発明に従ったペプチドは、量子ドットに連結させてもよい。量子ドットは、金属ナノ粒子の存在によって消光される場合を除いて、高度にルミネセンスを示す。ビオロゲン（例えば、メチルビオロゲンまたはプロピルビオロゲン－スルホネート（ＰＶＳ））もまた、消光剤として用いることができる。
【0037】
プロテアーゼがコンセンサス配列を開裂すると、量子ドットが放出され、発光する。
第１の観点において、本発明は、式１：Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２（式１）によって特徴付けられる化合物を提供し、ここで、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
第１の観点において、本発明は、式１：Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２（式１）によって特徴付けられる化合物を提供し、ここで、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
【0038】
好ましい態様において、配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇは、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である。
【0039】
加水分解酵素は、プロテアーゼ、またはいくつかのプロテアーゼの組み合わせであることができる。
化合物の開裂により生じる検出可能なシグナルは、当業者に公知のさまざまな適したシグナルから選択することができる。好ましい態様において、検出可能なシグナルは光学的シグナルである。
化合物の開裂により生じる検出可能なシグナルは、当業者に公知のさまざまな適したシグナルから選択することができる。好ましい態様において、検出可能なシグナルは光学的シグナルである。
【0040】
好ましい態様において、Ｘ１は成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２は成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルは、Ｃ１およびＣ２の空間的分離により、すなわち、ペプチドＴｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇの加水分解的開裂によって、もたらされる。
【0041】
Ｃ１に加えて、Ｘ１は、例えば、Ｃ１のいずれかの側に１以上のアミノ酸を含んでいてもよい。Ｃ２に加えて、Ｘ２は、例えば、Ｃ２のいずれかの側に１以上のアミノ酸を含んでいてもよい。したがって、開裂の前に、Ｃ１およびＣ２は、Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇを含むか、またはＴｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇからなる４～２０アミノ酸または５～１０アミノ酸のアミノ酸配列によって分離されることができる。好ましい態様において、Ｃ１およびＣ２は、１０以下のアミノ酸によって分離される。
【0042】
好ましい態様において、検出可能なシグナルは、吸収または蛍光の変化である。前記変化は、増大であっても低減であってもよい。好ましい態様において、検出可能なシグナルは、３００～５００ｎｍ、とりわけ３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度の増大である。
【0043】
好ましい態様において、Ｃ１およびＣ２の一方は、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物は波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する。したがって、化合物の開裂の前後に波長２で吸収を測定すると、吸収の増大が検出される。
【0044】
開裂により発色団が遊離形態で放出されることが、とりわけ好ましい。開裂により、フラグメント１はＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇからなり、フラグメント２はＮＨ２－Ｘ２のみからなる。したがって、好ましい態様において、発色団はＣ１ではなくＣ２である。Ｃ２が発色団である場合、Ｘ２はＣ２からなるか、実質的にＣ２からなることが好ましい。一方、Ｘ１はＣ１のいずれかの側に追加のアミノ酸を含んでいてもよく、開裂前にＣ１とＣ２はＴｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇより長いアミノ酸配列によって分離されていてもよい。
【0045】
好ましい態様において、発色団は、パラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミド（ＡＮＢ－ＮＨ２）、７－アミド－４－トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）および３－ニトロＬ－チロシン（Ｔｙｒ３－ＮＯ２）から選択される。好ましい態様において、発色団はパラ－ニトロアニリン（ｐＮＡ）である。好ましい態様において、発色団は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミド（ＡＮＢ－ＮＨ２）である。
【0046】
好ましい態様において、Ｃ１およびＣ２は蛍光供与体および蛍光受容体の対である。Ｃ１およびＣ２が蛍光供与体および受容体対であり、化合物が、化合物の開裂による蛍光の変化を測定する方法において使用される場合、Ｃ１およびＣ２は、蛍光受容体による蛍光供与体の効率的な消光を保証するために、１０以下のアミノ酸によって分離されることが好ましい。当業者なら、蛍光供与体と蛍光受容体との間の距離が重要なパラメーターであることを知っている。したがって、Ｃ１およびＣ２を分離するアミノ酸配列が凝縮またはねじれた二次構造に折り畳まれて、線状リンカーの場合よりも近いＣ１およびＣ２の近接が生じる場合、Ｃ１とＣ２との間にさらに長いスペーサーが可能であることができる。
【0047】
好ましい態様において、Ｃ１およびＣ２の対は、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対は、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される。Ｃ１およびＣ２は、５００ｇ／ｍｏｌ未満、とりわけ４００ｇ／ｍｏｌ未満、より具体的には３００ｇ／ｍｏｌ未満、さらにより具体的には１００～２００ｇ／ｍｏｌの分子量を特徴とすることが好ましい。
【0048】
Ｃ１およびＣ２の対はまた、ＢＦＰ／ＧＦＰ、ＢＦＰ／ＣＦＰ、ＢＦＰ／ＹＦＰ、ＢＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ／ＧＦＰ、ＣＦＰ／ＹＦＰ、ＣＦＰ／ｍＶｅｎｕｓ、ＣｅＦＰ／ＹＦＰ、ＣｅＦＰ／ｍＶｅｎｕｓ、ＣｅＦＰ／ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＣＦＰ／ｄｓＲｅｄ、ＣＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ／ｍＶｅｎｕｓ、ＧＦＰ／ＹＦＰ、ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰ／ＲＦＰ、Ｃｌｏｖｅｒ／ｍＲｕｂｙ、Ｃｙ３／Ｃ５、Ａｌｅｘａ ４８８／Ａｌｅｘａ ５５５、およびＦＩＴＣ／ＴＲＩＴＣからなる群より選択されるタンパク質蛍光供与体および受容体対であってもよい。当業者なら、それらの発光および吸光度スペクトルに基づいて適切なタンパク質蛍光供与体および受容体対を選択する方法を知っている。
【0049】
Ｃ１およびＣ２がタンパク質蛍光供与体および受容体対である場合、比較的大きなサイズのタンパク質が化合物の開裂を妨げず、配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが加水分解酵素による開裂に接近可能であることが保証されなければならない。これは、例えば、配列番号１に従ったペプチドを含むアミノ酸配列の長さを増大させることによって達成することができる。
【0050】
好ましい態様において、化合物は、式２によって特徴付けられる：
ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ （式２）。
好ましい態様において、化合物は、式３によって特徴付けられる：
ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡ （式３）。
ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ （式２）。
好ましい態様において、化合物は、式３によって特徴付けられる：
ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡ （式３）。
【0051】
式２または３によって特徴付けられる化合物の開裂により、遊離発色団分子が放出される（それぞれＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡ）。したがって、吸光度強度の増大は、３８０～４３０ｎｍで検出することができる。これに加えて、開裂は、蛍光受容体（それぞれＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡ）からの蛍光供与体（ＡＢＺ）の空間的分離をもたらす。したがって、ＡＢＺから放出される蛍光はもはや消光されず、蛍光強度の増大を４２０ｎｍで検出することができる。
【0052】
第２の観点において、本発明は、被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を本発明の第１の観点に従った化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法を提供し、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができる。
【0053】
好ましい態様において、体液中のプロテアーゼ活性の存在は膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在は膵臓がんの非存在を示す。
好ましい態様において、本発明は、膵臓がんの診断方法を提供する。
好ましい態様において、本発明は、膵臓がんの診断方法を提供する。
【0054】
好ましい態様において、体液は、血液または尿から選択される。好ましい態様において、体液は尿である。意外にも、本発明者らは、本発明の第１の観点に従った化合物が、尿試料中の加水分解酵素活性を検出することができることを見出した。膵臓がんと診断された被験体では、健常被験体と比較して加水分解酵素活性が有意に上昇している（図１、２）。
【0055】
好ましい態様において、被験体は、膵臓がんを発症するリスクが高いか、膵臓がんを有することが疑われるか、膵臓がんを有していたことがあるか、または膵臓がんを有する。
好ましい態様において、化合物は、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくはｐＨ６．８～８．５、より好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料は、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる。
好ましい態様において、化合物は、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくはｐＨ６．８～８．５、より好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料は、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる。
【0056】
本明細書の文脈において、「中性ｐＨ」という表現は約７．０のｐＨをさす。本明細書の文脈において、「生理学的ｐＨ」という表現は約７．４のｐＨをさす。
好ましい態様において、シグナルを検出することは、吸光度または蛍光を測定することを含む。
好ましい態様において、シグナルを検出することは、吸光度または蛍光を測定することを含む。
【0057】
好ましい態様において、シグナルを検出することは、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり３００～５００ｎｍ、とりわけ３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む。
【0058】
好ましい態様において、吸光度の増大は加水分解酵素活性の存在を示す。
第３の観点において、本発明は、本発明の第１の観点に従った化合物および測定緩衝液を含むキットを提供する。
第３の観点において、本発明は、本発明の第１の観点に従った化合物および測定緩衝液を含むキットを提供する。
【0059】
第４の観点において、本発明は、膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを発症するリスクが高い、膵臓がんを有することが疑われる、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、第１の観点に従った化合物、第２の観点に従った方法、または第３の観点に従ったキットの使用を提供する。
【0060】
第２の観点の方法の使用目的に応じて、用語「被験体」は異なる制限を有する可能性がある。例えば、該方法が、膵臓がんを検出するために、または膵臓がんに関し被験体をスクリーニングするために使用される場合、被験体が膵臓がんを有することはわかっていない、すなわち、膵臓がんを有するかもしれないし、または有さないかもしれない。この例では、被験体は、好ましくは、膵臓がんを発症するリスクが高いか、膵臓がんを有することが疑われるか、または膵臓がんを有していたことがある（すなわち、検出可能な膵臓がんが治癒している）。「リスクの高い」は、がん全般または膵臓がんに対する１以上のリスク因子が、好ましくはがん全般または膵臓がんについて米国がん協会によって定義されるように、被験体に帰することができることを意味する。膵臓がんのリスク因子の例は、以下である：タバコ消費（とりわけ喫煙）、大量の飲酒、肥満、２型糖尿病、職業（ドライクリーニング業および金属工業で使用される特定の化学物質への職場での暴露）、慢性膵炎、５０歳以上（とりわけ６５歳以上）の年齢、男性の性別、民族（とりわけ、アフリカ系アメリカ人およびアフリカ人の祖先をもつカリブ人男性）、膵臓がんの家族歴（とりわけ一等親血縁者）、および、遺伝性症候群または素因（ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性乳がん卵巣がん症候群；ＰＡＬＢ２遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝性乳がん；ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の変異によって引き起こされ、皮膚および眼の黒色腫に関連する家族性異型多発母斑黒色腫（ＦＡＭＭＭ）症候群；通常ＰＲＳＳ１遺伝子の変異によって引き起こされる家族性膵炎；リンチ症候群、これは、遺伝性非ポリポーシス大腸がん（ＨＮＰＣＣ）としても知られ、ＭＬＨ１またはＭＳＨ２遺伝子の欠損によって引き起こされることがもっとも多い；または、ＳＴＫ１１遺伝子の欠損によって引き起こされるＰｅｕｔｚ－Ｊｅｇｈｅｒｓ症候群）。
【0061】
膵臓がんは、上に定義されたどの亜型および病期のものでもよい。すなわち、いずれかの亜型および／または病期の有無を検出することができる。
好ましい態様において、有意な量のプロテアーゼ活性の存在、または対照よりも多い量の存在は、膵臓がんの存在を示し、有意な量のプロテアーゼ活性の非存在、または対照以下の量は、膵臓がんの非存在を示す。
好ましい態様において、有意な量のプロテアーゼ活性の存在、または対照よりも多い量の存在は、膵臓がんの存在を示し、有意な量のプロテアーゼ活性の非存在、または対照以下の量は、膵臓がんの非存在を示す。
【0062】
特定の態様において、第２の観点の方法はさらに、膵臓がんを検出するための１以上のさらなる手段を使用することによって、膵臓がんの検出を確認することを含む。さらなる手段は、がんマーカー（または「バイオマーカー」）または従来の（非マーカー）検出手段であることができる。癌マーカーは、例えば、ＤＮＡメチル化マーカー、変異マーカー（例えば、ＳＮＰ）、抗原マーカー、タンパク質マーカー、ｍｉＲＮＡマーカー、がん特異的代謝産物、または発現マーカーであることができる。従来の手段は、例えば、生検（例えばタンパク質または発現マーカーのための染色方法を伴うまたは伴わない視覚的生検検査など）、画像化技術、または物理的な、例えば触覚検査であることができる。好ましい態様において、膵臓がん検出のためのさらなる手段は、身体的検査（肝臓または胆嚢の腫脹、黄疸、すなわち、皮膚および白眼の黄変）、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、胆管膵管造影（とりわけ、内視鏡的逆行性胆管膵管造影、磁気共鳴胆管膵管造影または経皮経肝胆管造影）、血管造影（とりわけ、ｘ線血管造影、ＣＴ血管造影またはＭＲ血管造影）、腹部超音波、超音波内視鏡、ＰＥＴスキャン、血液検査（とりわけ、ビリルビン、ＣＡ １９－９またはＣＥＡについて）および生検からなる群より選択される。
【0063】
本明細書で使用される「を示す(indicative for)」または「示す(indicate)」という用語は、示される物を識別または指定する行為をさす。当業者には理解されるように、このような評価は、正確であることが好ましいが、通常、被験体の１００％について正確であるわけではない可能性がある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な部分について正確な表示がなされ得ることを必要とする。当業者なら、ある部分が統計的に有意であるかどうかを、いくつかの周知の統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、ｐ値の決定、スチューデントｔ検定、マンホイットニー検定などを使用して、容易に決定することができる。詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｒｄｅｎ， Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８３に提供されている。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは０．０５、０．０１、または０．００５である。
【0064】
膵臓がんに関して本明細書で使用される「存在または非存在の検出方法」という語句は、被験体ががんを有するか否かの決定をさす。当業者には理解されるように、このような評価は、正確であることが好ましいが、通常、被験体の１００％について正確であるわけではない可能性がある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な部分について正確な表示がなされ得ることを必要とする。統計的有意性および適切な信頼区間およびｐ値の説明については、上記を参照されたい。
【0065】
本明細書で使用される「診断」という用語は、被験体ががんを有するか否かの決定をさす。本明細書に記載するようなプロテアーゼ活性の分析による診断を、本明細書に記載するようなさらなる手段で補って、プロテアーゼ活性の分析で検出されたがんを確認してもよい。当業者には理解されるように、診断は、正確であることが好ましいが、通常、被験体の１００％について正確であるわけではない可能性がある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な部分について正確な診断が下され得ることを必要とする。統計的有意性および適切な信頼区間およびｐ値の説明については、上記を参照されたい。
【0066】
本明細書のがんに関して本明細書で使用される「被験体集団をスクリーニングする」という語句は、第１の観点の方法を被験体集団の試料と共に使用することをさす。好ましくは、被験体は、がんのリスクが高いか、がんを有することが疑われるか、またはがんを有していたことがある。とりわけ、本明細書中に列挙される１以上のリスク因子は、集団の被験体に帰する可能性がある。特定の態様では、同じ１以上のリスク因子が、集団のすべての被験体に帰することができる。例えば、集団は、大量の飲酒および／またはタバコ消費を特徴とする被験体からなってもよい。「スクリーニング」という用語は、集団の被験体についての上記したような診断をさし、好ましくは、本明細書に記載するようなさらなる手段を用いて確認されることを理解すべきである。当業者には理解されるように、スクリーニングは、正確であることが好ましいが、通常、被験体の１００％について正確であるわけではない可能性がある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な部分について正確なスクリーニング結果を得ることができることを必要とする。統計的有意性および適切な信頼区間およびｐ値の説明については、上記を参照されたい。
【0067】
本明細書で使用される用語「モニタリング」は、処置手順中、または特定の期間中、典型的には、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、５年、１０年、または任意の他の期間中に、診断されたがんの随伴(accompaniment)をさす。用語「随伴」は、がんの状態、とりわけ、がんのこれらの状態の変化を、とりわけ、毎日、または１ヶ月に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５回（１日につき１回以下の決定）で決定される任意のタイプの周期的時間区分における量の変化に基づいて、最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、または２４ヶ月であることができる処置の過程にわたり、プロテアーゼ活性の量に基づいて検出することができることを意味する。量または量の変化はまた、処置に特異的な事象、例えば、各処置サイクルまたは薬物／治療の適用の前および／または後に、決定することもできる。サイクルは、１ラウンドの処置から次のラウンドの開始までの時間である。がんの処置は通常、１回の処置ではなく、１クールの処置である。１クールは通常３～６ヶ月かかるが、それより長くても短くてもよい。１クールの処置の間に、通常４～８サイクルの処置が行われる。通常、処置サイクルは、身体を回復させるための処置中断を包含する。当業者には理解されるように、モニタリングの結果は、正確であることが好ましいが、通常、被験体の１００％について正確であるわけではない可能性がある。しかしながら、この用語は、被験体の統計学的に有意な部分について正確なモニタリング結果を得ることができることを必要とする。統計的有意性および適切な信頼区間およびｐ値の説明については、上記を参照されたい。
【0068】
第５の観点において、本発明は、膵臓がんの処置方法における本発明の第１の観点に従った化合物の使用を提供し、該方法は、本発明の第２の観点に従った方法を実施する段階、および、プロテアーゼ活性、とりわけ増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階を含む。
【0069】
他の態様において、本発明は、本発明の第２の観点に従った方法を実施し、プロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置することを含む、膵臓がんの処置方法を提供する。
【0070】
本明細書で使用される場合、がんに関する「処置」または「処置すること」という用語は治療的処置をさし、目標は、がんの進行を低減することである。有益または望ましい臨床結果としては、限定されるものではないが、症状の緩和(release of symptom)、罹患期間の短縮、病理学的状態の安定化（特に、悪化しない）、病勢悪化の減速、病理学的状態の改善および／または寛解（部分的および全体的の両方）が挙げられ、好ましくは検出可能である。処置の成功は必ずしも治癒を意味するわけではないが、処置を行わない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間の延長を意味することもある。好ましい態様において、処置は一次処置であり、すなわち、がんは以前に処置されていなかった。がんの処置は、処置レジメンを包含する。
【0071】
本明細書で使用される「処置レジメン」という用語は、疾患ならびに利用可能な手順および投薬を考慮した被験体の処置方法をさす。がんの処置レジメンの非限定的な例は、化学療法、外科手術および／または照射またはそれらの組み合わせである。本発明によって可能になるがんの早期検出により、とりわけ外科的処置、特に治癒的切除が可能になる。とりわけ、「処置レジメン」という用語は、以下に定義されるような１以上の抗がん剤または治療を投与することをさす。本明細書で使用される「抗がん剤または治療」という用語は、抗増殖性、発がん抑制性および／または制がん制の特性を有する、化学的、物理的もしくは生物学的な薬剤または治療、またはそれらの組み合わせを含む外科手術をさす。
【0072】
化学的抗がん剤または治療は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、植物アルカロイドおよびテルペノイドおよびトポイソメラーゼ阻害剤からなる群より選択することができる。好ましくは、アルキル化剤は白金ベースの化合物である。一態様において、白金ベースの化合物は、シスプラチン、オキサリプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、カルボプラチン、イプロプラチン、テトラプラチン、ロバプラチン、ＤＣＰ、ＰＬＤ－１４７、ＪＭｌ １８、ＪＭ２１６、ＪＭ３３５、およびサトラプラチンからなる群より選択される。
【0073】
物理的抗がん剤または治療は、放射線治療（例えば、治癒的放射線療法、アジュバント放射線療法、姑息的放射線療法、遠隔放射線療法、小線源療法または代謝性放射線療法）、光線療法（例えば、ヘマトポルフォリンまたはフォトフリンＩＩを使用する）、および温熱療法からなる群より選択することができる。
【0074】
外科手術は、治癒的切除、姑息的手術、予防的手術または腫瘍縮小手術であることができる。典型的には、それは、ＢａｒｏｎおよびＶａｌｉｎ（Ｒｅｃ． Ｍｅｄ． Ｖｅｔ， Ｓｐｅｃｉａｌ Ｃａｎｃ．１９９０； １１（１６６）：９９９－１００７）に記載されているように、切除、例えば、嚢内切除、辺縁、広範囲切除または根治的切除を包含する。
【0075】
生物学的抗がん剤または治療は、抗体（例えば、がん細胞を破壊する免疫応答を刺激する抗体、例えば、レツキシマブまたはアレムツズバブ(alemtuzubab)；免疫細胞の受容体に結合して、免疫細胞が「自身」の細胞を攻撃するのを妨げるシグナルを阻害することにより、免疫応答を刺激する抗体、例えば、イピリムマブ；腫瘍成長に必要なタンパク質の作用を妨害する抗体、例えば、ベバシズマブ、セツキシマブまたはパニツムマブ；または、薬物、好ましくは、毒素、化学療法的分子または放射性分子のような細胞殺滅物質にコンジュゲートする抗体、例えば、Ｙ－イブリツモマブ チウキセタン、Ｉ－トシツモマブまたはアド－トラスツズマブ エムタンシン）、サイトカイン（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン、例えば、ＩＮＦ－アルファおよびＩＬ－２）、ワクチン（例えば、がん関連抗原を含むワクチン、例えばシプロイセル－Ｔ）、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルスもしくはムンプスウイルスなど天然の腫瘍溶解性ウイルス、または、がん関連抗原を有する細胞を優先的に標的とする、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルスなどの遺伝子操作されたウイルス）、遺伝子治療薬（例えば、変化した腫瘍抑制因子に置き換わるか、腫瘍遺伝子の発現を遮断するか、被験体の免疫系を改善するか、化学療法、放射線療法もしくは他の処置に対してがん細胞をより感受性にするか、細胞自殺を誘導するか、または抗血管新生効果をもたらす、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、および養子Ｔ細胞（例えば、抗腫瘍活性のために選択された、被験体から採取した腫瘍侵入性Ｔ細胞、または、がん関連抗原を認識するために遺伝子改変された、被験体から採取したＴ細胞）からなる群より選択することができる。
【0076】
一態様において、１以上の抗がん剤は、アビラテロン酢酸エステル、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、ＡＤＥ、アド－トラスツズマブ エムタシン、アファチニブ二マレイン酸塩、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ エルウイニア クリサンチミー、アキシチニブ、アザシチジン、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブ ベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦカペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール、カルフィルゾミブ、カルムスチン、カルムスチン埋込物、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロラムブシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クロファラビン、ＣＭＦ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、シタラビン、シタラビン、リポソーム、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクス、デニロイキン ジフチトクス、デノスマブ、デクスラゾキサン塩酸塩、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、エルトロンボパグ オラミン、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、エリブリンメシル酸塩、エルロチニブ塩酸塩、エトポシドリン酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、ＦＥＣ、フィルグラスチム、フルダラビンリン酸エステル、フルオロウラシル、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブ オゾガマイシン、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ＨＰＶ２価ワクチン、組換えＨＰＶ４価ワクチン、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ、イブリツモマブ チウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、イデラリシブ、イフォスファミド、イマチニブ、メシル酸塩、イミキモド、ヨウ素１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、イリノテカン塩酸塩、イキサベピロン、ラパチニブ二トシル酸塩、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ロイプロリド酢酸塩、リポソームシタラビン、ロムスチン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ＭＯＰＰ、ネララビン、ニロチニブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマセタキシンメペスクシナート、ＯＰＡ、ＯＦＦ、ＯＰＰＡ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセル アルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロネート二ナトリウム、パニツムマブ、パゾパニブ塩酸塩、ペグアスパラガーゼ、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、ペルツズマブ、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、塩酸プロカルバジン、ラジウム２２３二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えＨＰＶ２価ワクチン、組換えＨＰＶ４価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ－２ｂ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルキソリチニブリン酸塩、シルツキシマブ、シプロイセル－Ｔ、ソラフェニブトシル酸塩、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、スニチブリンゴ酸塩、ＴＡＣ、タルク、タモキシフェンクエン酸塩、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トシツモマブおよびＩ １３１ヨウ素トシツモマブ、ＴＰＦ、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、ＶｅＩＰ、ベムラフェニブ、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ビスモデギブ、ボリノスタット、ＸＥＬＯＸ、Ｚｉｖ－アフリベルセプトおよびゾレドロン酸、またはそれらの塩からなる群より選択される。
【0077】
他の観点において、本発明は、本発明の第１の観点に従った化合物の生産方法を提供する。
好ましい態様において、式ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミドである］によって特徴づけられる化合物は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるプロセスに従って生成される。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させる。次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂上に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸ＡＮＢを堆積させる前に、固体支持体を、ＤＭＦ中のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の３～６％溶液、続いてＤＭＦで洗浄する。次に、ＤＭＦ中のＡＮＢの溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰量で添加する：ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。得られた混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールのような溶媒で洗浄する。次に、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、続いてヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いてＡＮＢの樹脂への結合を継続し、終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、穏やかに乾燥させる、
ｂ）アミノ酸残基のＡＮＢへの付着を、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨのアミノ酸誘導体との反応を用いて行い、樹脂に対して少なくとも５倍モル過剰のアミノ酸誘導体を無水ピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂と接触させる。次に、全体を２０℃を下回らない温度に冷却し、ＰＯＣｌ３を、アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比で加え、混合する。混合プロセスは、室温、次いで高温で行い；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、穏やかに乾燥し；得られた中間化合物をアシル化プロセスに付す。
好ましい態様において、式ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミドである］によって特徴づけられる化合物は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるプロセスに従って生成される。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させる。次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂上に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸ＡＮＢを堆積させる前に、固体支持体を、ＤＭＦ中のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の３～６％溶液、続いてＤＭＦで洗浄する。次に、ＤＭＦ中のＡＮＢの溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰量で添加する：ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。得られた混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールのような溶媒で洗浄する。次に、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、続いてヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いてＡＮＢの樹脂への結合を継続し、終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、穏やかに乾燥させる、
ｂ）アミノ酸残基のＡＮＢへの付着を、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨのアミノ酸誘導体との反応を用いて行い、樹脂に対して少なくとも５倍モル過剰のアミノ酸誘導体を無水ピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂と接触させる。次に、全体を２０℃を下回らない温度に冷却し、ＰＯＣｌ３を、アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比で加え、混合する。混合プロセスは、室温、次いで高温で行い；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、穏やかに乾燥し；得られた中間化合物をアシル化プロセスに付す。
【0078】
ｃ）得られた中間体化合物のアシル化を、アミノ酸誘導体、好ましくはＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、次いでＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、続いてＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、最後にＢｏｚ－Ａｂｚ－ＯＨを用いて行う。アシル化は、カップリング剤としてジイソプロピルカルボジイミドを使用して、残基６～１の工程で実施し、カップリング剤は過剰に使用する。各段階の最後に、樹脂をＤＭＦで洗浄し、そして（好ましくは）アミノ酸誘導体の付着をモニタリングするクロラニル試験に付す。
【0079】
ｄ）Ｆｍｏｃ保護基の除去を、ＤＭＦ中の１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄し、次いで、溶媒：ＤＭＦ、イソプロパノールおよび塩化メチレンの各々で洗浄することによって行う。
【0080】
ｅ）樹脂からのペプチドの分離を、ＴＦＡ、フェノール、水、およびＴＩＰＳの混合物を、それぞれ８８：５：５：２のｖ／ｖ／ｖ／ｖ比を維持しながら用いて実施する；混合物を少なくとも１時間、好ましくは３時間撹拌し、得られた沈殿物を減圧濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、得られたペプチドを遠心分離する。
【0081】
ｆ）最終生成物の調製を、超音波の手段によりペプチドを水に溶解し、凍結乾燥することにより行う。
好ましい態様において、ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ｐＮＡはパラニトロアニリドである］によって特徴づけられる化合物は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるプロセスに従って生成される。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させ；次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂への第３のアミノ酸残基（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ）の付着を、無水塩化メチレンに溶解した樹脂堆積物に対して９倍モル過剰の適したアミノ酸誘導体を用いて行う。次いで、混合物を室温で少なくとも２時間撹拌し；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄した後、乾燥する。
好ましい態様において、ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ｐＮＡはパラニトロアニリドである］によって特徴づけられる化合物は、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるプロセスに従って生成される。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させ；次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂への第３のアミノ酸残基（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ）の付着を、無水塩化メチレンに溶解した樹脂堆積物に対して９倍モル過剰の適したアミノ酸誘導体を用いて行う。次いで、混合物を室温で少なくとも２時間撹拌し；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄した後、乾燥する。
【0082】
ｂ）次の段階で、以下アシル化とよぶアミノ酸残基の付着を行い、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨの誘導体、続いてＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨおよびＢｏｃ－ＡＢＺ－ＯＨを使用する；各段階の前に、樹脂をＤＭＦで好ましくは５分間洗浄し；続いての付着では、カップリング剤、好ましくはジイソプロピルカルボジイミドを使用し、これは過剰に使用する。この手順を２回繰り返し、各段階の後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、好ましくは、アミノ酸誘導体の付着をモニタリングするクロラニル試験に付す。
【0083】
ｃ）Ｆｍｏｃ保護基の除去を、ＤＭＦ中の１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄し、次いで、溶媒：ＤＭＦ、イソプロパノールおよび塩化メチレンの各々で洗浄することによって行う。
【0084】
ｄ）化合物（ＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨ）が得られるまで段階ｂ）～ｃ）を繰り返し；残基６～３で合成を実施した後、得られた化合物を、ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳの混合物をそれぞれ８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖの割合で攪拌しながら用いて、固体支持体から分離した。２時間後、フラスコの内容物を減圧濾過し、沈殿物をジエチルエーテルで洗浄する。その後、沈殿物を好ましくは２０分間遠心分離し、超音波の手段により水に溶解し、続いて凍結乾燥する。
【0085】
ｅ）Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡ合成を、段階的に実施する；第１の工程で、２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を２ｍｍｏｌのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、アミノ酸誘導体のカルボキシル基を２ｍｍｏｌの塩化イソブチルで活性化する。１０分間の活性化の後、３ｍｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを加え、（好ましくは）－１５℃の温度で（好ましくは）２時間、続いて室温で１日、反応を行う。反応が完了したら、溶媒を蒸発させ、乾燥残渣を酢酸エチルに溶解し；その後、得られた溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液、１０％クエン酸、５％重炭酸ナトリウムで連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し；酢酸エチルを減圧下で蒸留し、乾燥残渣を乾燥する。
【0086】
ｆ）保護ペプチドＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨをパラニトロアニリドＡｒｇ（Ｐｂｆ）と組み合わせることは、以下のプロセスに基づく：保護ペプチドＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨを少量のＤＣＭに溶解し、次に、好ましくは０℃の温度において、好ましくは３０分間にわたりＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミド）で活性化し、その後、触媒量のＤＭＡＰおよびＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）５－ｐＮＡ６を加える。反応は好ましくは室温で２４時間行い、その後溶媒を蒸発させ、得られた溶液に、側基保護を除去する混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を注ぎ入れ、好ましくは３時間混合する。
【0087】
ｇ）超音波を用いてペプチドを水に溶解した後、凍結乾燥に付すことによって、最終生成物を調製する。
【実施例】
【0088】
本発明を、以下の非限定的な実施例によって例示する。
実施例１：化合物ＡＢＺ １ －Ｔｈｒ ２ －Ｔｈｒ ３ －Ａｌａ ４ －Ａｒｇ ５ －ＡＮＢ－ＮＨ ２ ６ の合成
１．発色性ペプチドの調製
ａ）合成の第１工程は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用して、すなわち保護を使用して、固体支持体上での固相合成によって発色性ペプチドを得ることであった。配列ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－安息香酸のアミドであり、ＡＮＢは５－アミノ－２－安息香酸である］を有する化合物を、以下のアミノ酸誘導体を用いて固相での化学合成プロセスで得た。
実施例１：化合物ＡＢＺ １ －Ｔｈｒ ２ －Ｔｈｒ ３ －Ａｌａ ４ －Ａｒｇ ５ －ＡＮＢ－ＮＨ ２ ６ の合成
１．発色性ペプチドの調製
ａ）合成の第１工程は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用して、すなわち保護を使用して、固体支持体上での固相合成によって発色性ペプチドを得ることであった。配列ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、ＡＮＢ－ＮＨ２は５－アミノ－２－安息香酸のアミドであり、ＡＮＢは５－アミノ－２－安息香酸である］を有する化合物を、以下のアミノ酸誘導体を用いて固相での化学合成プロセスで得た。
【0089】
Ｂｏｃ－ＡＢＺ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、ＡＮＢ
化合物、すなわち、診断がタンパク質分解酵素の影響下でのこの化合物の加水分解に関連づけられる膵臓がん検出用の診断マーカーの合成を、５－アミノ－２－安息香酸のＡＮＢ－ＮＨ２アミドへの変換を可能にする固体支持体：例えばアミド樹脂、例えばＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（ドイツ）からのＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上で、例えば０．２３ｍｍｏｌ／ｇの堆積（deposit）で実施した。
化合物、すなわち、診断がタンパク質分解酵素の影響下でのこの化合物の加水分解に関連づけられる膵臓がん検出用の診断マーカーの合成を、５－アミノ－２－安息香酸のＡＮＢ－ＮＨ２アミドへの変換を可能にする固体支持体：例えばアミド樹脂、例えばＲＡＰＰ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（ドイツ）からのＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ上で、例えば０．２３ｍｍｏｌ／ｇの堆積（deposit）で実施した。
【0090】
Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ（ドイツ）など、他の市販のアミド樹脂を使用することも可能である。
化合物は、実験室用振盪機を用いて手動で合成した。ほとんどの段階について、固相合成用の２５ｍＬ焼結シリンジを反応器として使用した。
化合物は、実験室用振盪機を用いて手動で合成した。ほとんどの段階について、固相合成用の２５ｍＬ焼結シリンジを反応器として使用した。
【0091】
得られた最終化合物はすべて、配列の１位（すなわちＮ末端）にＡＢＺ２－アミノ安息香酸、および６位（Ｃ末端）にＡＮＢ５－アミノ－２－ニトロ安息香酸分子を含有していた。ＡＢＺは蛍光供与体として作用し、ＡＮＢ（５－アミノ－２－安息香酸）は蛍光消光剤および発色団として作用する。ペプチドは、アミノ酸残基Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２の間、化合物の５位に位置するその配列中に、少なくとも（そして好ましくは）１つの反応性部位を含有していた。アミノ酸誘導体の付着に関与する合成を、残基６～１、すなわちＣ末端～Ｎ末端で実施する。
【0092】
ｂ）ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂上でのＡＮＢの堆積：
ペプチド合成を、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）上で、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの堆積で行った。第１の工程で、洗浄サイクルによる弛緩を含めて、樹脂を調製した。続いて、ＮＭＰ中のピペリジンの２０％溶液を用いて固体支持体からＦｍｏｃアミノ基保護を除去し、溶媒洗浄サイクルを実施した。遊離アミノ基の存在を確認するために、クロラニル試験を行った。
ペプチド合成を、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）上で、０．２３ｍｍｏｌ／ｇの堆積で行った。第１の工程で、洗浄サイクルによる弛緩を含めて、樹脂を調製した。続いて、ＮＭＰ中のピペリジンの２０％溶液を用いて固体支持体からＦｍｏｃアミノ基保護を除去し、溶媒洗浄サイクルを実施した。遊離アミノ基の存在を確認するために、クロラニル試験を行った。
【0093】
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ １×１０分
ＩｓＯＨ １×１０分
ＤＣＭ １×１０分
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
ＤＭＦ １×１０分
ＩｓＯＨ １×１０分
ＤＣＭ １×１０分
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
【0094】
ｃ）クロラニル試験：
クロラニル試験は、反応器－シリンジから数粒の樹脂をガラス製アンプルに移し（スパチュラを用いて）、これにトルエン中のｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬおよび未使用のアセトアルデヒド５０μＬを加えることからなっていた。１０分後、粒子の色の制御を行った。
クロラニル試験は、反応器－シリンジから数粒の樹脂をガラス製アンプルに移し（スパチュラを用いて）、これにトルエン中のｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬおよび未使用のアセトアルデヒド５０μＬを加えることからなっていた。１０分後、粒子の色の制御を行った。
【0095】
この工程で、試験を行った後、緑色の粒子の色が得られ、これは遊離アミノ基の存在を示していた。樹脂からの９－フルオレニルメトキシカルボニル保護の除去を確認した後、次の工程、ＡＮＢ誘導体（５－アミノ－２－ニトロ安息香酸）の付着に進むことが可能であった。
【0096】
ｄ）固体支持体上での５－アミノ－２－ニトロ安息香酸の堆積
ペプチドライブラリー－ペプチドの混合物の合成における第１段階は、１ｇの樹脂上でのＡＮＢ堆積であった。発色団を付着させる前に、反応に使用する樹脂を以下の溶媒：ＤＭＦ、ＤＣＭおよび再びＤＭＦで洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ保護を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護を除去する１サイクルは以下の段階を包含していた：
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
ｅ）洗浄
Ｄ ＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
ｆ）遊離アミノ基の存在についてのクロラニル試験。
ペプチドライブラリー－ペプチドの混合物の合成における第１段階は、１ｇの樹脂上でのＡＮＢ堆積であった。発色団を付着させる前に、反応に使用する樹脂を以下の溶媒：ＤＭＦ、ＤＣＭおよび再びＤＭＦで洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ保護を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護を除去する１サイクルは以下の段階を包含していた：
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
ｅ）洗浄
Ｄ ＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
ｆ）遊離アミノ基の存在についてのクロラニル試験。
【0097】
遊離アミノ基を有する樹脂を、ＤＭＦ中のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の５％溶液、続いてＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護を除去する手順および洗浄サイクルはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ容器中で行った。別のフラスコ中で、ＡＮＢをＤＭＦに溶解し、次いでＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰量で加えた：ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。このように調製した混合物を樹脂に加え、３時間撹拌した。樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで洗浄し、アシル化手順全体を２回繰り返した。ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を用いて、樹脂へのＡＮＢ付着の後続反応を行った。最後の段階において、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、風乾した。
【0098】
ｇ）Ｃ末端アミノ酸残基のＡＮＢへの付着
対応するアミノ酸誘導体（樹脂堆積物に対して９倍モル過剰）をピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂を含有するフラスコに移した。全体を－１５℃に冷却した（氷浴：１重量部のＮＨ４Ｃｌ、１重量部のＮａＮＯ３、１重量部の氷）。望ましい温度に達した後、ＰＯＣｌ３を加え（アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比率で）、全体をマグネティックスターラーで、－１５℃で２０分間、室温で３０分間、および４０℃で６時間（油浴）撹拌した。反応が完了した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、放置して乾燥した。
対応するアミノ酸誘導体（樹脂堆積物に対して９倍モル過剰）をピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂を含有するフラスコに移した。全体を－１５℃に冷却した（氷浴：１重量部のＮＨ４Ｃｌ、１重量部のＮａＮＯ３、１重量部の氷）。望ましい温度に達した後、ＰＯＣｌ３を加え（アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比率で）、全体をマグネティックスターラーで、－１５℃で２０分間、室温で３０分間、および４０℃で６時間（油浴）撹拌した。反応が完了した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、放置して乾燥した。
【0099】
次の段階で、残基（アラニン）をＰ２位に付着させた。
アミノ酸残基の付着前に、樹脂を毎回ＤＭＦで５分間洗浄した。後続の付着におけるカップリング剤として、ジイソプロピルカルボジイミドを使用した。この手順を２回繰り返した。
アミノ酸残基の付着前に、樹脂を毎回ＤＭＦで５分間洗浄した。後続の付着におけるカップリング剤として、ジイソプロピルカルボジイミドを使用した。この手順を２回繰り返した。
【0100】
各アシル化の後、樹脂洗浄サイクルを開始し、続いて、樹脂の遊離アミノ基へのアミノ酸誘導体の付着をモニタリングするためのクロラニル試験を行った。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
試験の結果、最初の２つのカップリングの後、粒子の色は最初は緑色、その後灰色であった。そのため別のアシル化を行う必要があり、その結果、クロラニル試験で試験した樹脂の粒子は無色であった。これは、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂へのＡＮＢの付着を示し、これにより、ペプチド合成の次の工程への移行が可能になった。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
試験の結果、最初の２つのカップリングの後、粒子の色は最初は緑色、その後灰色であった。そのため別のアシル化を行う必要があり、その結果、クロラニル試験で試験した樹脂の粒子は無色であった。これは、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂へのＡＮＢの付着を示し、これにより、ペプチド合成の次の工程への移行が可能になった。
【0101】
ｈ）さらなる保護アミノ酸残基の付着：
樹脂を反応器中の付着ＡＮＢ残基と一緒にＤＭＦで洗浄した後、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護して、保護アミノ酸アラニン誘導体を付着させた。
樹脂を反応器中の付着ＡＮＢ残基と一緒にＤＭＦで洗浄した後、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護して、保護アミノ酸アラニン誘導体を付着させた。
【0102】
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
クロラニル試験は、樹脂粒子の緑色によって証明されたように、肯定的な結果をもたらした。これにより、次の工程－Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨアミノ酸残基の付着への移行が可能になった。
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
クロラニル試験は、樹脂粒子の緑色によって証明されたように、肯定的な結果をもたらした。これにより、次の工程－Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨアミノ酸残基の付着への移行が可能になった。
【0103】
アミノ酸誘導体の付着：
カップリングのプロセスの前に、樹脂をＤＭＦ中で洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護グルタミン酸残基を付着させた場合、変化しないままであった。
カップリングのプロセスの前に、樹脂をＤＭＦ中で洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護グルタミン酸残基を付着させた場合、変化しないままであった。
【0104】
各アシル化の終わりに、所定の手順に従って溶媒洗浄サイクルを行い、続いて溶液中の遊離アミノ基の存在についてクロラニル試験を行った。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
２回目のアシル化後に実施した試験中の樹脂粒子は無色であり、これにより、次の合成工程、すなわち、他の保護アミノ酸誘導体－トレオニンおよび２－アミノ安息香酸分子の導入に移行することが可能になった。カップリングプロセスは、先に論じた手順に従っていた。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
２回目のアシル化後に実施した試験中の樹脂粒子は無色であり、これにより、次の合成工程、すなわち、他の保護アミノ酸誘導体－トレオニンおよび２－アミノ安息香酸分子の導入に移行することが可能になった。カップリングプロセスは、先に論じた手順に従っていた。
【0105】
上記残基を付着させた後に行った試験は、肯定的な結果を示した：樹脂粒子は無色であった。
２．固体支持体からのペプチドの除去
合成後、ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ペプチドのアミドを固体支持体から除去し、これと併せて、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて側基保護を同時に除去した。
２．固体支持体からのペプチドの除去
合成後、ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２ペプチドのアミドを固体支持体から除去し、これと併せて、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を用いて側基保護を同時に除去した。
【0106】
３時間後、フラスコの内容物を焼結（Ｓｃｈｏｔｔ）漏斗で減圧濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。得られた沈降物をＳＩＧＭＡ ２Ｋ３０遠心分離機（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｓ）で２０分間遠心分離した。遠心分離後に得られた沈殿物を超音波の手段により水に溶解し、凍結乾燥する。
【0107】
新規化合物の識別点(identity)／特徴－ＨＰＬＣ分析、ＭＳ
ＨＰＬＣ条件：ＲＰ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８ ２５０ｍｍ ４ｍｍカラム、Ａ相系 水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ａ）中の８０％アセトニトリル、流速１ｍＬ／分、２２６ｎｍでの紫外線検出。
化合物が得られたことを確認した。
ＨＰＬＣ条件：ＲＰ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８ ２５０ｍｍ ４ｍｍカラム、Ａ相系 水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ａ）中の８０％アセトニトリル、流速１ｍＬ／分、２２６ｎｍでの紫外線検出。
化合物が得られたことを確認した。
【0108】
実施例２：式：ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６を有する化合物の調製
このプロセスは、対応するアミノ酸誘導体および追加の置換基を使用する点、ならびにこのプロセスを部分的に溶液中で、そして部分的に固体支持体上で実施する点を除き、実施例１に記載したものと同様に実施する。
このプロセスは、対応するアミノ酸誘導体および追加の置換基を使用する点、ならびにこのプロセスを部分的に溶液中で、そして部分的に固体支持体上で実施する点を除き、実施例１に記載したものと同様に実施する。
【0109】
ｐ－ニトロアニリドＡｌａの調製
ａ）合成の第１工程は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用して固相合成によって保護ペプチドを得ることであった。
ａ）合成の第１工程は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用して固相合成によって保護ペプチドを得ることであった。
【0110】
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨ化合物［式中、ＡＢＺは２－アミノ安息香酸である］を、以下のアミノ酸誘導体を用いた固相での化学合成によって得た：
Ｂｏｃ－ＡＢＺ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ。
Ｂｏｃ－ＡＢＺ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ。
【0111】
化合物を以下の固体支持体上で合成した：
－２－クロロ－クロロトリイル樹脂、例えば、Ｉｒｉｓ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ（ドイツ）からのもの、１．６ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ基での堆積。
－２－クロロ－クロロトリイル樹脂、例えば、Ｉｒｉｓ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ（ドイツ）からのもの、１．６ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ基での堆積。
【0112】
化合物は、実験室用振盪機を用いて手動で合成した。すべての工程を通して、固相合成用の２５ｍＬ焼結シリンジを反応器として使用した。
ペプチド合成を、固体支持体：２－クロロ－クロロトリチル樹脂、例えば、Ｉｒｉｓ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ（ドイツ）からのもの上で、１．６ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ基の堆積で行った。第１の工程において、洗浄サイクルで樹脂を弛緩させた。続いて、ＮＭＰ中のピペリジンの２０％溶液を用いて固体支持体からＦｍｏｃアミノ基保護を除去した。その後、溶媒洗浄サイクルを行った。遊離アミノ基の存在を確認するために、クロラニル試験を行った。
ペプチド合成を、固体支持体：２－クロロ－クロロトリチル樹脂、例えば、Ｉｒｉｓ ＢＩＯＴＥＣＨ ＧＭＢＨ（ドイツ）からのもの上で、１．６ｍｍｏｌ Ｃｌ／ｇ基の堆積で行った。第１の工程において、洗浄サイクルで樹脂を弛緩させた。続いて、ＮＭＰ中のピペリジンの２０％溶液を用いて固体支持体からＦｍｏｃアミノ基保護を除去した。その後、溶媒洗浄サイクルを行った。遊離アミノ基の存在を確認するために、クロラニル試験を行った。
【0113】
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ １×１０分
ＩｓＯＨ １×１０分
ＤＣＭ １×１０分
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
ｂ）クロラニル試験：
クロラニル試験は、反応器－シリンジから数粒の樹脂をガラス製アンプルに移し（スパチュラを用いて）、トルエン中のｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬおよび未使用のアセトアルデヒド５０μＬを加えることからなっていた。１０分後、粒子の色の制御を行った。
ＤＭＦ １×１０分
ＩｓＯＨ １×１０分
ＤＣＭ １×１０分
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
ｂ）クロラニル試験：
クロラニル試験は、反応器－シリンジから数粒の樹脂をガラス製アンプルに移し（スパチュラを用いて）、トルエン中のｐ－クロラニルの飽和溶液１００μＬおよび未使用のアセトアルデヒド５０μＬを加えることからなっていた。１０分後、粒子の色の制御を行った。
【0114】
この工程で、試験後、緑色の粒子の色が得られ、これは遊離アミノ基の存在を示していた。樹脂からの９－フルオレニルメトキシカルボニル保護の除去を確認した後、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ誘導体の付着を開始した。
【0115】
ｃ）固体支持体上でのＦｍｏｃ－Ａｌａの埋め込み
ペプチドライブラリーの合成における第１段階は、１ｇの樹脂上でのＦｍｏｃ－Ａｌａ堆積であった。アミノ酸誘導体を付着させる前に、反応に使用する樹脂を以下の溶媒：ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＣＭ（塩化メチレン）および再びＤＭＦで洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ保護を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護を除去する１サイクルは以下の段階を包含していた：
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
洗浄
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
遊離アミノ基の存在についてのクロラニル試験。
ペプチドライブラリーの合成における第１段階は、１ｇの樹脂上でのＦｍｏｃ－Ａｌａ堆積であった。アミノ酸誘導体を付着させる前に、反応に使用する樹脂を以下の溶媒：ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＣＭ（塩化メチレン）および再びＤＭＦで洗浄し、その後、Ｆｍｏｃ保護を固体支持体の官能基から除去した。Ｆｍｏｃ保護を除去する１サイクルは以下の段階を包含していた：
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
洗浄
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
遊離アミノ基の存在についてのクロラニル試験。
【0116】
遊離アミノ基を有する樹脂をＤＭＦで洗浄した。別のフラスコ中で、Ｆｍｏｃ－ＡｌａをＤＭＦに溶解した。次いで、ＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰に加えた：Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。得られた混合物を樹脂に加え、３時間撹拌した。樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで洗浄し、アシル化手順全体を２回繰り返した。ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、次いでヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を用いて、樹脂へのＦｍｏｃ－Ｐｒｏ付着の後続反応を行った。最後の段階において、樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、風乾した。
【0117】
ｃ．さらなる保護アミノ酸残基の付着：
樹脂を反応器中の付着Ｆｍｏｃ－Ａｌａ残基と一緒にＤＭＦで洗浄した後、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護して、保護トレオニン誘導体を付着させた。
樹脂を反応器中の付着Ｆｍｏｃ－Ａｌａ残基と一緒にＤＭＦで洗浄した後、アミノ基からＦｍｏｃを脱保護して、保護トレオニン誘導体を付着させた。
【0118】
Ｆｍｏｃ保護の除去：
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
クロラニル試験は、樹脂粒子の緑色によって証明されたように、肯定的な結果をもたらした。これにより、次の工程－Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨアミノ酸残基の付着への移行が可能になった。
ＤＭＦ １×５分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×３分
ＮＭＰ中の２０％ピペリジン １×８分
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
クロラニル試験は、樹脂粒子の緑色によって証明されたように、肯定的な結果をもたらした。これにより、次の工程－Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨアミノ酸残基の付着への移行が可能になった。
【0119】
アミノ酸誘導体の付着：
カップリングのプロセスの前に、樹脂をＤＭＦ中で洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護グルタミン酸残基を付着させた場合、変化しないままであった。
カップリングのプロセスの前に、樹脂をＤＭＦ中で洗浄した。カップリング混合物の組成は、保護グルタミン酸残基を付着させた場合、変化しないままであった。
【0120】
各アシル化の終わりに、所定の手順に従って溶媒洗浄サイクルを行い、続いて溶液中の遊離アミノ基の存在についてクロラニル試験を行った。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
２回目のアシル化後に実施した試験中の樹脂粒子は無色であり、これにより、次の合成工程、すなわち、他の保護アミノ酸誘導体－トレオニンおよび２－アミノ安息香酸分子の導入に移行することが可能になった。カップリングプロセスは、先に論じた手順に従っていた。
溶媒洗浄サイクル：
ＤＭＦ ３×２分
ＩｓＯＨ ３×２分
ＤＣＭ ３×２分
クロラニル試験：
２回目のアシル化後に実施した試験中の樹脂粒子は無色であり、これにより、次の合成工程、すなわち、他の保護アミノ酸誘導体－トレオニンおよび２－アミノ安息香酸分子の導入に移行することが可能になった。カップリングプロセスは、先に論じた手順に従っていた。
【0121】
上記残基を付着させた後に行った試験は、肯定的な結果を示した：樹脂粒子は無色であった。
ｄ）側基保護を維持しつつの固体支持体からのペプチドの除去
合成の完了後、保護ＡＢＺ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈ（ｔＢｕ）－Ａｌａ－ＯＨペプチドを固体支持体から除去し、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で混合物：酢酸：ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）：ＤＣＭ（２：２：６、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて側基保護を保持した。
ｄ）側基保護を維持しつつの固体支持体からのペプチドの除去
合成の完了後、保護ＡＢＺ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－Ｔｈ（ｔＢｕ）－Ａｌａ－ＯＨペプチドを固体支持体から除去し、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で混合物：酢酸：ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）：ＤＣＭ（２：２：６、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて側基保護を保持した。
【0122】
２時間後、フラスコの内容物を焼結（Ｓｃｈｏｔｔ）漏斗で減圧濾過し、収れん性混合物で洗浄した。溶液をヘキサン（１：１０、ｖ／ｖ）で洗浄し、減圧下で蒸発させた後、凍結乾燥した。
【0123】
ｅ）パラニトロアニリドＡｒｇ誘導体の化学合成
混合無水物法を用いて、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡを合成した。第１の段階で、２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を２ｍｍｏｌのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。アミノ酸誘導体のカルボキシル基を２ｍｍｏｌの塩化イソブチルで活性化した。１０分間の活性化の後、３ｍｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを加えた。－１５℃で２時間、続いて室温で２４時間にわたり反応を行った。反応完了後、溶媒を蒸発させ、乾燥残渣を酢酸エチルに溶解した。得られた溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液、１０％クエン酸および５％重炭酸ナトリウムで連続的に洗浄した。得られた溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルを減圧留去し、乾燥残渣を真空デシケーター中でＰ２Ｏ５およびＫＯＨ上で乾燥した。
混合無水物法を用いて、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡを合成した。第１の段階で、２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を２ｍｍｏｌのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。アミノ酸誘導体のカルボキシル基を２ｍｍｏｌの塩化イソブチルで活性化した。１０分間の活性化の後、３ｍｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを加えた。－１５℃で２時間、続いて室温で２４時間にわたり反応を行った。反応完了後、溶媒を蒸発させ、乾燥残渣を酢酸エチルに溶解した。得られた溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液、１０％クエン酸および５％重炭酸ナトリウムで連続的に洗浄した。得られた溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチルを減圧留去し、乾燥残渣を真空デシケーター中でＰ２Ｏ５およびＫＯＨ上で乾燥した。
【0124】
ｆ）保護ペプチドとパラニトロアニリドＡｒｇ(Ｐｂｆ)とのカップリング
保護ＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨペプチドを少量のＤＣＭに溶解した後、０℃で３０分間にわたりＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミド）で活性化した。その後、触媒量のＤＭＡＰおよびＡｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡを加えた。反応を室温で２４時間行った後、溶媒を蒸発させた。得られた溶液に、側基保護を除去する混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を注ぎ入れ、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で３時間混合した。
保護ＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨペプチドを少量のＤＣＭに溶解した後、０℃で３０分間にわたりＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミド）で活性化した。その後、触媒量のＤＭＡＰおよびＡｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡを加えた。反応を室温で２４時間行った後、溶媒を蒸発させた。得られた溶液に、側基保護を除去する混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を注ぎ入れ、マグネティックスターラー上の丸底フラスコ中で３時間混合した。
【0125】
この時間の後、フラスコに冷ジエチルエーテルを加え、得られた沈殿物を高速遠心分離機で５０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後に得られた沈殿物を超音波の手段により水に溶解した後、凍結乾燥した。
【0126】
新規化合物の識別点／特徴－ＨＰＬＣ分析、ＭＳ
ＨＰＬＣ条件：ＲＰ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８ ２５０ｍｍ ４ｍｍカラム、Ａ相系 水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ａ）中の８０％アセトニトリル、流速１ｍＬ／分、２２６ｎｍでの紫外線検出。化合物が得られたことを確認した。
ＨＰＬＣ条件：ＲＰ Ｂｉｏ Ｗｉｄｅ Ｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｃ８ ２５０ｍｍ ４ｍｍカラム、Ａ相系 水中の０．１％ＴＦＡ、Ｂ：Ａ）中の８０％アセトニトリル、流速１ｍＬ／分、２２６ｎｍでの紫外線検出。化合物が得られたことを確認した。
【0127】
実施例３
膵臓がんと診断された患者１０人の群に対し、新規化合物の適用に関する試験を行った。このために、式２：ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２または式３：ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物を、ジメチルスルホキシド（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度）に溶解し；この溶液５０μＬを、１２０μＬの緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）および膵臓がん患者の尿８０μＬと混合した。吸光度を測定するために設計された９６ウェルプレートで測定を行い、各試料を３７℃で３回分析した。測定時間は６０分であった。測定中、放出された発色団（ＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡ）に特徴的な波長を４０５ｎｍ（３８０～４３０ｎｍの範囲）でモニタリングした。
膵臓がんと診断された患者１０人の群に対し、新規化合物の適用に関する試験を行った。このために、式２：ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＮＢ－ＮＨ２または式３：ＡＢＺ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ｐＮＡを有する化合物を、ジメチルスルホキシド（０．５ｍｇ／ｍＬの濃度）に溶解し；この溶液５０μＬを、１２０μＬの緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）および膵臓がん患者の尿８０μＬと混合した。吸光度を測定するために設計された９６ウェルプレートで測定を行い、各試料を３７℃で３回分析した。測定時間は６０分であった。測定中、放出された発色団（ＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡ）に特徴的な波長を４０５ｎｍ（３８０～４３０ｎｍの範囲）でモニタリングした。
【0128】
測定の結果、膵臓がんと診断された患者からの尿試料すべてで、溶液の色が経時的に増大した。経時的に観察された吸光度の増大は、試験試料の各々で異なっていた。健常者の１５試料については、試験した１５個の尿試料のいずれも診断範囲において吸光度の増大を示さなかったため、異なる結果が得られた。
【0129】
分析により、膵臓がんの診断における本実施例に従った化合物の使用が裏付けられた。新規化合物の作用機序は、当該箇所でのその酵素的加水分解に基づいており、それぞれ５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のＡＮＢ－ＮＨ２－アミドまたはｐＮＡ－パラ－ニトロアニリンである遊離発色団分子の放出をもたらし、３２０～４８０ｎｍ、特に３８０～４３０ｎｍで吸光度を示す。
【0130】
【表1】
【0131】
【表2】
【0132】
【表3】
【0133】
本発明はさらに、以下に関連する
１．化合物－以下の一般式の診断マーカー：
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－Ｘ６ （式１）
［式中：
ＡＢＺは、２－アミノ安息香酸であり、
Ｘは、ＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡであり、
これに関し、
ＡＮＢ－ＮＨ２は、５－アミノ－２－安息香酸のアミドであり、
ＡＮＢは、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸であり、
そしてｐＮＡは、パラ－ニトロアニリンである］。
１．化合物－以下の一般式の診断マーカー：
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－Ｘ６ （式１）
［式中：
ＡＢＺは、２－アミノ安息香酸であり、
Ｘは、ＡＮＢ－ＮＨ２またはｐＮＡであり、
これに関し、
ＡＮＢ－ＮＨ２は、５－アミノ－２－安息香酸のアミドであり、
ＡＮＢは、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸であり、
そしてｐＮＡは、パラ－ニトロアニリンである］。
【0134】
２．化合物－診断マーカー：
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６、（式２）
［式中：
ＡＢＺは、２－アミノ安息香酸であり、
ＡＮＢ－ＮＨ２は、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミドである］
を得る方法は、プロセスが、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるという事実に基づく。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させる。次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂上に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸ＡＮＢを堆積させる前に、固体支持体を、ＤＭＦ中のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の３～６％溶液、続いてＤＭＦで洗浄する。次に、ＤＭＦ中のＡＮＢの溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰量で添加する：ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。得られた混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールのような溶媒で洗浄する。次に、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、続いてヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いてＡＮＢの樹脂への結合を継続し、終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、穏やかに乾燥させる、
ｂ）アミノ酸残基のＡＮＢへの付着を、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨのアミノ酸誘導体との反応を用いて行い、樹脂に対して少なくとも５倍モル過剰のアミノ酸誘導体を無水ピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂と接触させる。次に、全体を２０℃を下回らない温度に冷却し、ＰＯＣｌ３を、アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比で加え、混合する。混合プロセスは、室温、次いで高温で行い；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、穏やかに乾燥し；得られた中間化合物をアシル化プロセスに付す。
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ＡＮＢ－ＮＨ２ ６、（式２）
［式中：
ＡＢＺは、２－アミノ安息香酸であり、
ＡＮＢ－ＮＨ２は、５－アミノ－２－ニトロ安息香酸のアミドである］
を得る方法は、プロセスが、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるという事実に基づく。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させる。次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂上に５－アミノ－２－ニトロ安息香酸ＡＮＢを堆積させる前に、固体支持体を、ＤＭＦ中のＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の３～６％溶液、続いてＤＭＦで洗浄する。次に、ＤＭＦ中のＡＮＢの溶液を調製し、これにＴＢＴＵ、ＤＭＡＰ、および最後にジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を、ポリマー堆積物に対して以下の過剰量で添加する：ＡＮＢ／ＴＢＴＵ／ＤＭＡＰ／ＤＩＰＥＡ、３：３：２：６。得られた混合物を樹脂に加え、均一になるまで混合した後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールのような溶媒で洗浄する。次に、ヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、続いてヘキサフルオロホスフェート－Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム（ＨＢＴＵ）を過剰に用いてＡＮＢの樹脂への結合を継続し、終了後、固体支持体をＤＭＦ、ＤＣＭおよびイソプロパノールで連続的に洗浄し、穏やかに乾燥させる、
ｂ）アミノ酸残基のＡＮＢへの付着を、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨのアミノ酸誘導体との反応を用いて行い、樹脂に対して少なくとも５倍モル過剰のアミノ酸誘導体を無水ピリジンに溶解し、ＡＮＢを堆積させた樹脂と接触させる。次に、全体を２０℃を下回らない温度に冷却し、ＰＯＣｌ３を、アミノ酸誘導体の使用量に対して１：１の比で加え、混合する。混合プロセスは、室温、次いで高温で行い；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄し、穏やかに乾燥し；得られた中間化合物をアシル化プロセスに付す。
【0135】
ｃ）得られた中間体化合物のアシル化を、アミノ酸誘導体、好ましくはＦｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、次いでＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、続いてＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、最後にＢｏｚ－Ａｂｚ－ＯＨを用いて行う。アシル化は、カップリング剤としてジイソプロピルカルボジイミドを使用して、残基６～１の工程で実施し、カップリング剤は過剰に使用する。各段階の最後に、樹脂をＤＭＦで洗浄し、そして（好ましくは）アミノ酸誘導体の付着をモニタリングするクロラニル試験に付す。
【0136】
ｄ）Ｆｍｏｃ保護基の除去を、ＤＭＦ中の１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄し、次いで、溶媒：ＤＭＦ、イソプロパノールおよび塩化メチレンの各々で洗浄することによって行う。
【0137】
ｅ）樹脂からのペプチドの分離を、ＴＦＡ、フェノール、水、およびＴＩＰＳの混合物を、それぞれ８８：５：５：２のｖ／ｖ／ｖ／ｖ比を維持しながら用いて実施する；混合物を少なくとも１時間、好ましくは３時間撹拌し、得られた沈殿物を減圧濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、得られたペプチドを遠心分離する。
【0138】
ｆ）最終生成物の調製を、超音波の手段によりペプチドを水に溶解し、凍結乾燥することにより行う。
【0139】
３．化合物－診断マーカー：
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６ （式３）
［式中：
ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、
ｐＮＡはパラニトロアニリドである］
を得るための方法は、プロセスが、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるという事実に基づく。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させ；次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂への第３のアミノ酸残基（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ）の付着を、無水塩化メチレンに溶解した樹脂堆積物に対して９倍モル過剰の適したアミノ酸誘導体を用いて行う。次いで、混合物を室温で少なくとも２時間撹拌し；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄した後、乾燥する。
ＡＢＺ１－Ｔｈｒ２－Ｔｈｒ３－Ａｌａ４－Ａｒｇ５－ｐＮＡ６ （式３）
［式中：
ＡＢＺは２－アミノ安息香酸であり、
ｐＮＡはパラニトロアニリドである］
を得るための方法は、プロセスが、好ましくはＦｍｏｃ基を有する固体支持体上で実施されるという事実に基づく。プロセスを開始する前に、固体支持体を調製する：疎水性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンで繰り返し洗浄し、Ｆｍｏｃ保護基を、好ましくはジメチルホルムアミド、塩化メチレンまたはＮ－メチルピロリドンなどの溶媒中のピペリジンの１０～３０％溶液で洗浄することによって除去することにより、その体積を増大させ；次に、後続工程におけるプロセスを実行する：
ａ）樹脂への第３のアミノ酸残基（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ）の付着を、無水塩化メチレンに溶解した樹脂堆積物に対して９倍モル過剰の適したアミノ酸誘導体を用いて行う。次いで、混合物を室温で少なくとも２時間撹拌し；反応完了後、樹脂を減圧濾過し、ＤＭＦおよびＭｅＯＨで洗浄した後、乾燥する。
【0140】
ｂ）次の段階で、以下アシル化とよぶアミノ酸残基の付着を行い、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨの誘導体、続いてＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨおよびＢｏｃ－ＡＢＺ－ＯＨを使用する；各段階の前に、樹脂をＤＭＦで好ましくは５分間洗浄し；続いての付着では、カップリング剤、好ましくはジイソプロピルカルボジイミドを使用し、これは過剰に使用する。この手順を２回繰り返し、各段階の後、樹脂をＤＭＦで洗浄し、好ましくは、アミノ酸誘導体の付着をモニタリングするクロラニル試験に付す。
【0141】
ｃ）Ｆｍｏｃ保護基の除去を、ＤＭＦ中の１０～３０％ピペリジン溶液で洗浄し、次いで、溶媒：ＤＭＦ、イソプロパノールおよび塩化メチレンの各々で洗浄することによって行う。
【0142】
ｄ）化合物（ＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨ）が得られるまで段階ｂ）～ｃ）を繰り返し；残基６～３で合成を実施した後、得られた化合物を、ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳの混合物をそれぞれ８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖの割合で攪拌しながら用いて、固体支持体から分離した。２時間後、フラスコの内容物を減圧濾過し、沈殿物をジエチルエーテルで洗浄する。その後、沈殿物を好ましくは２０分間遠心分離し、超音波の手段により水に溶解し、続いて凍結乾燥する。
【0143】
ｅ）Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ｐＮＡ合成を、段階的に実施する；第１の工程で、２ｍｍｏｌのＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を２ｍｍｏｌのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）の存在下で無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、アミノ酸誘導体のカルボキシル基を２ｍｍｏｌの塩化イソブチルで活性化する。１０分間の活性化の後、３ｍｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを加え、（好ましくは）－１５℃の温度で（好ましくは）２時間、続いて室温で１日、反応を行う。反応が完了したら、溶媒を蒸発させ、乾燥残渣を酢酸エチルに溶解し；その後、得られた溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液、１０％クエン酸、５％重炭酸ナトリウムで連続的に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し；酢酸エチルを減圧下で蒸留し、乾燥残渣を乾燥する。
【0144】
ｆ）保護ペプチドＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨをパラニトロアニリドＡｒｇ（Ｐｂｆ）と組み合わせることは、以下のプロセスに基づく：保護ペプチドＡＢＺ１－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）２－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）３－Ａｌａ４－ＯＨを少量のＤＣＭに溶解し、次に、好ましくは０℃の温度において、好ましくは３０分間にわたりＴＦＦＨ（テトラメチルフルオロホルムアミド）で活性化し、その後、触媒量のＤＭＡＰおよびＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）５－ｐＮＡ６を加える。反応は好ましくは室温で２４時間行い、その後溶媒を蒸発させ、得られた溶液に、側基保護を除去する混合物：ＴＦＡ：フェノール：水：ＴＩＰＳ（８８：５：５：２、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）を注ぎ入れ、好ましくは３時間混合する。
【0145】
ｇ）超音波を用いてペプチドを水に溶解した後、凍結乾燥に付すことによって、最終生成物を調製する。
【0146】
４．膵臓がんの診断方法は、以下のプロセスに基づく：０．１～１０ｍｇ／ｍＬ（好ましくは１ｍｇ／ｍＬ）の濃度範囲の一般式１の化合物を、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨの測定緩衝液中で、１：２～１：１０（好ましくは１：５の尿試料対測定緩衝液）の割合範囲の少量のヒト尿と一緒にインキュベートし、３００～５００ｎｍ（好ましくは３８０～４３０ｎｍ）の範囲の吸光度強度を、２５～４０℃（好ましくは３６～３８℃）の範囲の温度で４０～６０分間にわたって測定する。
【0147】
これに加えて、本発明は、とりわけ以下の事項に関する：
１． 式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
１． 式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
【0148】
２． 配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である、事項１に従った化合物。
【0149】
３． Ｘ１が成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２が成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルが、Ｃ１およびＣ２の空間的分離によりもたらされる、事項１または２に従った化合物。
【0150】
４． Ｃ１およびＣ２の一方、とりわけＣ２が、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物が、波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する、事項１～３のいずれかに従った化合物。
【0151】
５． Ｃ１およびＣ２が蛍光供与体および蛍光受容体の対である、事項１～４のいずれかに従った化合物。
６． Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、事項１～５のいずれかに従った化合物。
６． Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、事項１～５のいずれかに従った化合物。
【0152】
７． 被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を事項１～６のいずれかに従った化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができる。
【0153】
８． 被験体における膵臓がんの存在または非存在を検出するための事項７に従ったインビトロ法であって、体液中のプロテアーゼ活性の存在が膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在が膵臓がんの非存在を示す、前記方法。
【0154】
９． 膵臓がんの診断のための事項７または８に従ったインビトロ法。
１０． 体液が尿である、事項７～９のいずれかに従ったインビトロ法。
１１． 化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、事項７～１０のいずれかに従った方法。
１０． 体液が尿である、事項７～９のいずれかに従ったインビトロ法。
１１． 化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、事項７～１０のいずれかに従った方法。
【0155】
１２． シグナルを検出することが、吸光度または蛍光を測定すること、とりわけ、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり、３００～５００ｎｍ、より具体的には３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む、事項７～１１のいずれかに従った方法。
【0156】
１３． 事項１～６のいずれかに従った化合物および測定緩衝液を含むキット。
１４． 膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、事項１～６のいずれかに従った化合物、事項７～１２のいずれかの方法、または事項１３に従ったキットの使用。
１４． 膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、事項１～６のいずれかに従った化合物、事項７～１２のいずれかの方法、または事項１３に従ったキットの使用。
【0157】
１５． 膵臓がんの処置方法で使用するための事項１～６のいずれかに従った化合物、該方法は、
ａ． 事項７～１２のいずれかに従った方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む。
ａ． 事項７～１２のいずれかに従った方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2022-02-25
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式１によって特徴付けられる化合物：Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
［式中、
Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらし、
Ｘ１は成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２は成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルは、Ｃ１およびＣ２の空間的分離により、該化合物の加水分解的開裂によってもたらされ、そして
Ｃ１およびＣ２は、蛍光供与体および蛍光受容体の対である］。
【請求項2】
配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
Ｃ１およびＣ２の一方、とりわけＣ２が、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物が、波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する、請求項１または２のいずれかに記載の化合物。
【請求項4】
Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の化合物。
【請求項5】
被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法であり、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができ、該化合物は、式１によって特徴付けられ：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす、方法。
【請求項6】
被験体における膵臓がんの存在または非存在を検出するための請求項５に記載のインビトロ法であって、体液中のプロテアーゼ活性の存在が膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在が膵臓がんの非存在を示す、前記方法。
【請求項7】
膵臓がんの診断のための請求項５または６に記載のインビトロ法。
【請求項8】
体液が尿である、請求項５～７のいずれかに記載のインビトロ法。
【請求項9】
化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
シグナルを検出することが、吸光度または蛍光を測定すること、とりわけ、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり、３００～５００ｎｍ、より具体的には３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む、請求項５～９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
請求項１～４のいずれかに記載の化合物および測定緩衝液を含むキット。
【請求項12】
膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす；
請求項５～１０のいずれかの方法；または
前記化合物および測定緩衝液を含むキット
の使用。
【請求項13】
膵臓がんの処置方法であって、ａ． 請求項５～１０のいずれかに記載の方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む、前記方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0157】
１５． 膵臓がんの処置方法で使用するための事項１～６のいずれかに従った化合物、該方法は、
ａ． 事項７～１２のいずれかに従った方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む。
本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、
Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらし、
Ｘ１は成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２は成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルは、Ｃ１およびＣ２の空間的分離によりもたらされる。
［２］配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である、［１］に記載の化合物。
［３］Ｃ１およびＣ２の一方、とりわけＣ２が、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物が、波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する、［１］または［２］のいずれかに記載の化合物。
［４］Ｃ１およびＣ２が蛍光供与体および蛍光受容体の対である、［１］～［３］のいずれかに記載の化合物。
［５］Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の化合物。
［６］被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができ、
該化合物は、式１によって特徴付けられ：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
［７］被験体における膵臓がんの存在または非存在を検出するための［６］に記載のインビトロ法であって、体液中のプロテアーゼ活性の存在が膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在が膵臓がんの非存在を示す、前記方法。
［８］膵臓がんの診断のための［６］または［７］に記載のインビトロ法。
［９］体液が尿である、［６］～［８］のいずれかに記載のインビトロ法。
［１０］化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、［６］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］シグナルを検出することが、吸光度または蛍光を測定すること、とりわけ、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり、３００～５００ｎｍ、より具体的には３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む、［６］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］［１］～［５］のいずれかに記載の化合物および測定緩衝液を含むキット。
［１３］膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、
式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす；
［６］～［１１］のいずれかの方法；または
前記化合物および測定緩衝液を含むキット
の使用。
［１４］膵臓がんの処置方法であって、
ａ． ［７］～［１２］のいずれかに記載の方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む、前記方法。
ａ． 事項７～１２のいずれかに従った方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む。
本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、
Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらし、
Ｘ１は成分Ｃ１を含むか、または成分Ｃ１からなり、Ｘ２は成分Ｃ２を含むか、または成分Ｃ２からなり、検出可能なシグナルは、Ｃ１およびＣ２の空間的分離によりもたらされる。
［２］配列Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇが、加水分解酵素、とりわけ、化合物をＸ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＯＨ（フラグメント１）およびＮＨ２－Ｘ２（フラグメント２）に開裂する加水分解酵素に接近可能である、［１］に記載の化合物。
［３］Ｃ１およびＣ２の一方、とりわけＣ２が、波長１に吸収極大１（ＡＭ１）を有する発色団であり、化合物が、波長１とは異なる波長２に吸収極大２（ＡＭ２）を有する、［１］または［２］のいずれかに記載の化合物。
［４］Ｃ１およびＣ２が蛍光供与体および蛍光受容体の対である、［１］～［３］のいずれかに記載の化合物。
［５］Ｃ１およびＣ２の対が、２－アミノ安息香酸（ＡＢＺ）／ｐＮＡ、ＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２、ＡＢＺ／ＤＮＰ、ＡＢＺ／ＥＤＤＮＰ、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭ／ＤＡＮＳＹＬ、ＡＢＺ／Ｔｙｒ（３－ＮＯ２）からなる群より選択され、とりわけ、Ｃ１およびＣ２の対が、ＡＢＺ／ｐＮＡおよびＡＢＺ／ＡＮＢ－ＮＨ２から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載の化合物。
［６］被験体の体液中のプロテアーゼ活性を検出するためのインビトロ法であって、体液を化合物と接触させ、シグナルを検出することを含む方法、該体液は、膵臓がん細胞に由来する加水分解酵素、とりわけプロテアーゼを含むことができ、
該化合物は、式１によって特徴付けられ：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす。
［７］被験体における膵臓がんの存在または非存在を検出するための［６］に記載のインビトロ法であって、体液中のプロテアーゼ活性の存在が膵臓がんの存在を示し、体液中のプロテアーゼ活性の非存在が膵臓がんの非存在を示す、前記方法。
［８］膵臓がんの診断のための［６］または［７］に記載のインビトロ法。
［９］体液が尿である、［６］～［８］のいずれかに記載のインビトロ法。
［１０］化合物が、中性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨを有する測定緩衝液中、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、とりわけ０．２５～７．５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．５～５ｍｇ／ｍＬ、より具体的には０．７５～２ｍｇ／ｍＬ、さらにより具体的には約１ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され、体液試料が、１：２～１：１０、とりわけ１：３～１：８、より具体的には１：４～１：６、さらにより具体的には約１：５の比で化合物に加えられる、［６］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］シグナルを検出することが、吸光度または蛍光を測定すること、とりわけ、２５～４０℃、とりわけ３６～３８℃において、好ましくは４０～６０分間にわたり、３００～５００ｎｍ、より具体的には３８０～４３０ｎｍにおける吸光度強度を測定することを含む、［６］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］［１］～［５］のいずれかに記載の化合物および測定緩衝液を含むキット。
［１３］膵臓がんの検出のための、または、膵臓がんを有することが疑われる、膵臓がんを発症するリスクが高い、もしくは膵臓がんを有していたことがある被験体をモニタリングするための、
式１によって特徴付けられる化合物：
Ｘ１－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ２ （式１）、
これに関し、Ｘ１を含むフラグメント１およびＸ２を含むフラグメント２への該化合物の開裂は、検出可能なシグナルをもたらす；
［６］～［１１］のいずれかの方法；または
前記化合物および測定緩衝液を含むキット
の使用。
［１４］膵臓がんの処置方法であって、
ａ． ［７］～［１２］のいずれかに記載の方法を実施する段階、および
ｂ． 段階ａでプロテアーゼ活性、とりわけ、増大したプロテアーゼ活性が検出された被験体において、膵臓がんを処置する段階
を含む、前記方法。
【国際調査報告】