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特表2022-538935遺伝子およびタンパク質の大きな運送物をヒト細胞に送達するための原核生物－真核生物ハイブリッドウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-06
(54)【発明の名称】遺伝子およびタンパク質の大きな運送物をヒト細胞に送達するための原核生物－真核生物ハイブリッドウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20220830BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220830BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220830BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12N7/01
C12N15/864 100Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022510123
(86)(22)【出願日】2020-08-12
(85)【翻訳文提出日】2022-04-15
(86)【国際出願番号】 IB2020057588
(87)【国際公開番号】W WO2021033082
(87)【国際公開日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】62/888,576
(32)【優先日】2019-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】16/990,289
(32)【優先日】2020-08-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】504228117
【氏名又は名称】ザ カトリック ユニバーシティ オブ アメリカ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラオ、ヴェニガラ ビー．
(72)【発明者】
【氏名】チュー、ジンゲン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AA98X
4B065AA98Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
(57)【要約】
バクテリオファージＴ４などの第１のウイルス；アビジン－ビオチン架橋などの架橋を介して第１のウイルスに結合した、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などの１つ以上の第２のウイルス；第１のウイルスにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子；第２のウイルスにパッケージされた１つ以上の核酸分子；および第１のウイルスの表面に表示される１つ以上のタンパク質を含む、ハイブリッドウイルスベクターが記載される。そのようなハイブリッドウイルスベクターを作製および使用する方法も記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のウイルスベクター；第２のウイルスベクター；および
真核生物ウイルスベクターを原核生物ウイルスベクターに連結する架橋を含む、生成物。
【請求項2】
前記第１のウイルスベクターが、ラムダファージ、バチルスファージＰｈｉ２９、大腸菌ファージＴ２、Ｔ３およびＴ７、腸内細菌ファージＰ２２、ファージＳＰＰ１、ヘルペスウイルスならびにアデノウイルスからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項3】
前記第２のウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルスおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項4】
前記架橋が、ＳＢＡ、ＨＢＢＡおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項5】
前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項6】
前記ＤＮＡが二本鎖である、請求項５記載の生成物。
【請求項7】
前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項8】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される、請求項７記載の生成物。
【請求項9】
前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の二本鎖ＤＮＡ分子と、前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子とをさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項10】
前記第１のウイルスベクターの表面に表示される１つ以上のタンパク質をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項11】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞に核酸を送達する、請求項１記載の生成物。
【請求項12】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞にタンパク質を送達する、請求項１記載の生成物。
【請求項13】
生物学的検体に投与された場合、前記生物学的検体において免疫応答が誘導される、請求項１記載の生成物。
【請求項14】
Ｔ４ヘッドカプシド；ビオチン化ＡＡＶ；および
ビオチン－アビジン架橋を含む生成物であって、
前記ビオチン－アビジン架橋が、Ｓｏｃ－ビオチン－アビジン（ＳＢＡ）またはＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチン－アビジン（ＨＢＢＡ）であり；
前記架橋のアビジンがビオチン化ＡＡＶ上のビオチンに結合し、ＨｏｃまたはＳｏｃがＴ４に結合する、生成物。
【請求項15】
前記Ｔ４にパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１４記載の生成物。
【請求項16】
前記ＤＮＡが二本鎖である、請求項１５記載の生成物。
【請求項17】
ＡＡＶにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１４記載の生成物。
【請求項18】
前記ＤＮＡが一本鎖である、請求項１７記載の生成物。
【請求項19】
Ｔ４にパッケージされた１つ以上の二本鎖ＤＮＡ分子と、ＡＡＶにパッケージされた１つ以上の一本鎖ＤＮＡ分子とをさらに含む、請求項１４記載の生成物。
【請求項20】
前記Ｔ４の表面に表示される１つ以上のタンパク質をさらに含む、請求項１４記載の生成物。
【請求項21】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞にＤＮＡを送達する、請求項１４記載の生成物。
【請求項22】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞にタンパク質を送達する、請求項１４記載の生成物。
【請求項23】
生物学的検体に投与された場合、前記生物学的検体において免疫応答を誘導する、請求項１４記載の生成物。
【請求項24】
第１のウイルスベクター；前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子；
第２のウイルスベクター；
前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子、および
前記第２のウイルスベクターを前記第１のウイルスベクターに連結する架橋を含む、生成物。
【請求項25】
前記ＤＮＡ分子が前記核酸分子と同じである、請求項２４記載の生成物。
【請求項26】
前記ＤＮＡ分子が二本鎖である、請求項２５記載の生成物。
【請求項27】
前記核酸分子が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される、請求項２５記載の生成物。
【請求項28】
生物学的検体に投与された場合、前記生物学的検体において免疫応答が誘導される、請求項２４記載の生成物。
【請求項29】
第１のウイルスベクター；前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の二本鎖ＤＮＡ分子；
第２のウイルスベクター；
前記第２のウイルスベクターにパッケージされた、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む１つ以上の核酸分子、および
前記第２のウイルスベクターを前記第１のウイルスベクターに連結する架橋を含む、生成物。
【請求項30】
生物学的検体に投与された場合、前記生物学的検体において免疫応答が誘導される、請求項２９記載の生成物。
【請求項31】
第１のウイルスベクター；前記第１のウイルスベクターの表面に表示される１つ以上のタンパク質
第２のウイルスベクター；および
前記第２のウイルスベクターを前記第１のウイルスベクターに連結する架橋を含む生成物であって、
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞にタンパク質を送達する、生成物。
【請求項32】
ＳＢＡまたはＨＢＢＡ架橋を設計すること；前記架橋のＳｏｃまたはＨｏｃ末端をＴ４に結合させること；
ＡＡＶをビオチン化すること；および
前記架橋のアビジン末端をＡＡＶに結合することを含む、方法。
【請求項33】
架橋を設計すること；前記架橋の一端を第１のウイルスベクターに結合させること；および
前記架橋の他端を第２のウイルスベクターに結合することを含む、方法。
【請求項34】
生物学的検体を処置する方法であって、前記生物学的検体に第１のウイルスベクター；
第２のウイルスベクター；および
前記第２のウイルスベクターを前記第１のウイルスベクターに連結する架橋を投与することを含み、
投与経路が、混合、経口摂取、吸入、皮下移動、筋肉内注射、静脈内注射、経皮移動、鼻腔内吸入、直腸挿入、眼、局所移動、舌下または頬側からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表への言及
本出願は、電子的に提出されたテキスト形式の配列表を含む。テキストファイルは、２０２０年８月７日に作成された「１０９００７－２３５３０ＵＳ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表を含み、サイズは２，０７９バイトである。このテキストファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子的に提出されたテキスト形式の配列表を含む。テキストファイルは、２０２０年８月７日に作成された「１０９００７－２３５３０ＵＳ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の配列表を含み、サイズは２，０７９バイトである。このテキストファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の権益表明
本発明は、ＮＩＡＩＤおよびＮＩＨによって授与された助成金番号ＡＩ１１１５３８およびＡＩ０８１７２６の下、米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する
本発明は、ＮＩＡＩＤおよびＮＩＨによって授与された助成金番号ＡＩ１１１５３８およびＡＩ０８１７２６の下、米国政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する
【0003】
本発明は、一般に、タンパク質および核酸の送達成分、組成物、機構およびその送達方法に関する。
【背景技術】
【0004】
標的細胞への遺伝子およびタンパク質の送達は、機構研究ならびに癌、感染症および遺伝性疾患などの多くのヒト疾患の予防および治療に不可欠であろう。しかしながら、遺伝子およびタンパク質の両方を標的細胞に効率的かつ安全に送達することができるビヒクルを製剤化することは、依然として大きな課題である。本出願は、本明細書に記載されるように従来技術の欠点を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
第１の広域な態様によれば、本発明は、第１ウイルス（例えばバクテリオファージＴ４）；架橋（例えば、アビジン－ビオチン架橋）によって原核生物ウイルスのヘッドに結合した１つ以上の第２ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、ＡＡＶ）を含むハイブリッドウイルスベクター（例えばＴ４－ＡＡＶ）を含む生成物を提供する。
【0006】
第２の広域な態様によれば、本発明は、アビジン－ビオチン架橋を設計する工程；架橋の一端（ＳｏｃまたはＨｏｃ）を第１ウイルス（バクテリオファージＴ４）に結合させる工程；および架橋の他端（アビジン）を第２ウイルス（ＡＡＶ）に結合させる工程を含む方法を提供する。
【0007】
第３の広域な態様によれば、本発明は、生物学的検体の細胞をハイブリッドウイルスベクター（Ｔ４－ＡＡＶ）に曝露し、それによってベクターを細胞に結合させるか、またはハイブリッドベクターを生物学的検体に投与する工程を含む方法を提供し、ここでベクターは、第１ベクターまたは第２ベクターのいずれかまたは両方にパッケージされた１つ以上の核酸分子を含み、場合により第１ウイルスの表面上に提示される１つ以上のＳｏｃ融合タンパク質が存在し、ベクターは細胞内に内在化され、ベクターの細胞内への内在化によって、パッケージされた核酸が各細胞内のサイトゾル内へ放出され、パッケージされた１つ以上の核酸分子が各細胞のサイトゾル内に放出されることによって、１つ以上の核酸分子が各細胞の核へ入り、１つ以上の核酸分子が各細胞の核へ入ることによって、ＤＮＡの転写またはＲＮＡの逆転写、および核酸にコード化されるタンパク質の過剰発現が起こる。
【0008】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて、局から提供される。
【0009】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明の例示的な実施形態を示し、上記の一般的な説明および以下の詳細な説明と共に、本発明の特徴を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明の一実施形態によるバクテリオファージＴ４の概略図である。
【0011】
【図2】本発明の一実施形態によるＴ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターの概略図である。
【0012】
【図3】本発明の一実施形態によるＴ４－ＡＡＶ組み立ての工程を示す概略図である。
【0013】
【図4】本発明の一実施形態によるＳｏｃタンパク質のビオチン化を示すグラフである。
【0014】
【図5】本発明の一実施形態によるＨｏｃへのＢＡＰの結合を示すグラフである。
【0015】
【図6】本発明の一実施形態によるＨｏｃ－ＢＡＰのビオチン化を示すグラフである。
【0016】
【図7】本発明の一実施形態によるＳｏｃ－ビオチンのＴ４への異なる比率での結合を示すグラフである。
【0017】
【図8】本発明の例示的実施形態による、異なる比率でのアビジンのＴ４－Ｓｏｃ－ビオチンへの結合を示すグラフである。
【0018】
【図9】本発明の例示的実施形態による、アビジンのＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチンへの結合を示すグラフである。
【0019】
【図10】本発明の例示的実施形態による、ＨＢＢＡのＴ４への異なる比率での結合を示すグラフである。
【0020】
【図11】本発明の例示的実施形態による、ＡＡＶのビオチン化を示すグラフである。
【0021】
【図12】本発明の例示的な実施形態による、チュアブル錠の異なるＡＡＶ対Ｔ４比率形態での未結合ＡＡＶの量を示すグラフである。
【0022】
【図13】本発明の例示的実施形態による、ＡＡＶのＴ４への結合を示す電子顕微鏡写真である。
【0023】
【図14】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４またはＡＡＶにパッケージされたＤＮＡの概略図である。
【0024】
【図15】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４（ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ粒子を使用して、Ｔ４に対するＡＡＶ比が増加するとルシフェラーゼＤＮＡ送達および発現がどのように増加するかを示すグラフである。
【0025】
【図16】本発明の例示的な実施形態による、細胞に対してＴ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶ比が増加するとルシフェラーゼＤＮＡ送達および発現がどのように増加するかを示すグラフである。
【0026】
【図17】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶの結合によるルシフェラーゼＤＮＡ送達および発現の増加を示すグラフである。
【0027】
【図18】本発明の例示的な実施形態による、細胞に対してＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶ比が増加するとルシフェラーゼＤＮＡ送達および発現がどのように増加するかを示すグラフである。
【0028】
【図19】本発明の例示的な実施形態による、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ ＤＮＡの送達および細胞における発現を示す顕微鏡写真である。
【0029】
【図20】本発明の例示的な実施形態によるβ－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子の概略図である。
【0030】
【図21】本発明の例示的な実施形態による、β－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子を使用して、Ｔ４に対するＡＡＶ比が増加するとルシフェラーゼＤＮＡ送達および発現がどのように増加するかを示すグラフである。
【0031】
【図22】本発明の例示的な実施形態による、β－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子を使用して、Ｔ４に対するＡＡＶ比が増加するとＧＦＰ ＤＮＡ送達および発現がどのように増加するかを示すグラフである。
【0032】
【図23】本発明の例示的な実施形態による、β－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子を使用してＴ４－ＨｏｃＡＡＶに対するＳｏｃ－β－ｇａｌ比が増加するとβ－ガラクトシダーゼタンパク質送達がどのように増加するか、およびＡＡＶの結合がβ－ガラクトシダーゼタンパク質送達をどのように増強するかを示すグラフである。
【0033】
【図24】本発明の例示的な実施形態による、ＧＦＰ－Ｔ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶおよびＮＬＳ－ＧＦＰ－Ｔ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶ粒子を使用したＧＦＰおよびＮＬＳ－ＧＦＰタンパク質の送達ならびにｍＣｈｅｒｒｙ ＤＮＡの送達および発現を示す顕微鏡写真である。
【0034】
【図25】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４またはＡＡＶにパッケージされたＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡの概略図である。
【0035】
【図26】本発明の例示的な実施形態による、パッケージされたＤＮＡの送達およびインビボ持続性をＡＡＶが増強したことを示すマウスのＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡ送達および発現の画像である。
【0036】
【図27】本発明の例示的な実施形態による、マウスにおけるＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡの送達および発現およびインビボ持続性を示すグラフである。
【0037】
【図28】本発明の例示的な実施形態による、パッケージされたＤＮＡの送達およびインビボ持続性をＡＡＶが増強したことを示す、Ｔ４－ＡＡＶの投与量を減らしたマウスにおけるＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡ送達および発現の画像である。
【0038】
【図29】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４－ＡＡＶの投与量を減らしたマウスにおけるＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡの送達および発現およびインビボ持続性を示すグラフである。
【0039】
【図30】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４またはＡＡＶにパッケージされたＩＴＲ－ＨＡ４９００ ＤＮＡの概略図である。
【0040】
【図31】本発明の例示的な実施形態による、Ｔ４にパッケージされたＨＡ４９００ ＤＮＡの送達および発現を示すグラフである。
【0041】
【図32】本発明の例示的実施形態による、ＡＡＶのＴＳＡへの結合を示すグラフである。
【0042】
【図33】本発明の例示的実施形態による、ＡＡＶのＴＨＡへの結合を示すグラフである。
【0043】
【図34】本発明の例示的な実施形態による、野生型ＡＡＶ、またはＳｏｃもしくはＨｏｃで架橋されたＰＬＡ２変異を有するＡＡＶのいずれかとＴ４にパッケージされたルシフェラーゼＤＮＡの送達効率を比較するグラフである。
【0044】
【図35】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶが混合されているが結合されていない、Ｔ４にパッケージされたルシフェラーゼＤＮＡの送達効率を示すグラフである。
【0045】
【図36】本発明の例示的な実施形態によるプライムブーストスキームを示すグラフである。
【0046】
【図37】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させないＴ４（ＨＡ４９００）によって誘導された１４日目の抗ＨＡ ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【0047】
【図38】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させないＴ４（ＨＡ４９００）によって誘導された３５日目の抗ＨＡ ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【0048】
【図39】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させないＴ４（ＨＡ４９００）によって誘導された０日目～１８０日目までの抗ＨＡ ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【0049】
【図40】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させないＴ４（ＨＡ４９００）によって誘導された０日目～１８０日目までの血清ＣＸＣＬ１３を示すグラフである。
【0050】
【図41】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させない、およびＦ１ｍｕｔＶを結合させたまたはさせないＴ４（ＨＡ４９００）によって誘導された抗ＨＡ ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【0051】
【図42】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶを結合させたまたは結合させないＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）によって誘導された抗Ｆ１ｍｕｔＶ ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【0052】
【図43】本発明の例示的な実施形態による、ＡＡＶ結合させたまたは結合させないＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）で免疫したマウスの生存率を示すグラフである。
【0053】
【図44】本発明の例示的な実施形態による、軟質ゲルの剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0054】
【図45】本発明の例示的な実施形態による、硬質カプセルの剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0055】
【図46】本発明の例示的な実施形態による、別様に被覆された化合物を含む硬質カプセルの剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0056】
【図47】本発明の例示的な実施形態による、錠剤の剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0057】
【図48】本発明の例示的な実施形態による、チュアブル錠剤の剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0058】
【図49】本発明の例示的な実施形態による、カプレットの剤形に製剤化された組成物を示す画像である。
【0059】
【図50】本発明の例示的な実施形態による、シェルに包まれたコアを含むカプレットの剤形を示す。
【0060】
【図51】本発明の例示的な実施形態による、注射用薬物送達装置および注射液を含む、本明細書に開示される組成物を送達するための治療送達装置を示す。
【0061】
【図52】本発明の例示的な実施形態による、本明細書に開示される組成物を対象の体内に送達するための経皮パッチを含む治療送達装置を示す。
【0062】
【図53】本発明の例示的な実施形態による、経皮パッチ内に埋め込まれた本明細書に開示される組成物を含む経皮パッチを示す。
【発明を実施するための形態】
【0063】
定義
用語の定義が用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、出願人は、特に示されない限り、以下に提供される定義を利用することを意図している。
用語の定義が用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、出願人は、特に示されない限り、以下に提供される定義を利用することを意図している。
【0064】
別に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、特許請求される対象が属するものが一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書における用語について複数の定義がある場合、このセクションのものが優先する。本明細書で言及されるすべての特許、特許出願、刊行物ならびに公開されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベースで利用可能な配列）は、参照により組み込まれる。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変わる可能性があり、インターネット上の特定の情報が行き来する可能性があるが、インターネットを検索することによって同等の情報が見出され得ることが理解される。それへの言及は、そのような情報が利用可能であり、一般に公開されていることを証明する。
【0065】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される対象を限定するものではないことを理解されたい。本出願では、特に明記しない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本出願では、「または」の使用は、別途記載されない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに他の形態、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定するものではない。
【0066】
本発明の目的のために、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、およびこれらの単語の変形は、オープンエンドであることを意図しており、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
【0067】
本発明の目的のために、「上（ｔｏｐ）」、「下（ｂｏｔｔｏｍ）」、「より上（ｕｐｐｅｒ）」、「より下（ｌｏｗｅｒ）」、「上（ａｂｏｖｅ）」、「下（ｂｅｌｏｗ）」、「左（ｌｅｆｔ）」、「右（ｒｉｇｈｔ）」、「水平（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）」、「垂直（ｖｅｒｔｉｃａｌ）」、「上（ｕｐ）」、「下（ｄｏｗｎ）」などの方向を示す用語は、単に本発明の様々な実施形態を説明する際の便宜のために使用される。本発明の実施形態は、様々な方法で方位を決定することができる。例えば、図面に示されているダイヤグラム、装置などをひっくり返しても、任意の方向に９０°回転しても、反転してもよい。
【0068】
本発明の目的のために、値または特性は、その値がその値、特性または他の要因を使用して数学的計算または論理的決定を実行することによって導出される場合、特定の値、特性、条件の満足、または他の要因に「基づく」。
【0069】
本発明の目的のために、本明細書に与えられるいくつかの量的表現は、より簡潔な説明を提供するために「約」という用語で修飾されていないことに留意されたい。「約」という用語が明示的に使用されているかどうかにかかわらず、本明細書に与えられるすべての量は、実際の所与の値を指すことを意味し、当業者の通常の技能に基づいて合理的に推測されるそのような所与の値の近似値を指すことも意味する、と理解される。そのような所与の値には、実験および／または測定条件による近似値を含む。
【0070】
本発明の目的のために、用語「結合する」、用語「結合している」および用語「結合した」は、任意の種類の化学的または物理的結合を指し、これには、限定されないが、共有結合、水素結合、静電結合、生物学的束縛、膜貫通結合、細胞表面結合および発現が含まれる。
【0071】
本発明の目的のために、「ベクター」、「ビヒクル」、および「ナノ粒子」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、遺伝子またはタンパク質を送達するために使用され得るウイルスまたはハイブリッドウイルス粒子を指す。
【0072】
本発明の目的のために、「指向性」という用語は、ウイルスが特定の宿主の細胞または組織に感染する傾向を指す。
【0073】
本発明の目的のために、用語「生物学的試料」および用語「生物学的検体」は、インビトロまたはインビボでのヒト、脊椎動物、無脊椎動物、微生物または植物の一部または全体のいずれかを指す。この用語には、ヒト、脊椎動物、無脊椎動物、微生物または植物起源の材料、例えばヒト、動物、微生物または植物の組織切片、細胞または組織培養物、ヒト、脊椎動物、無脊椎動物、微生物または植物の細胞またはその単離された部分の懸濁液、ヒトまたは動物の生検物、血液試料、細胞含有流体および分泌物が含まれるが、これらに限定されない。
【0074】
本発明の目的のために、用語「カプシド」および用語「カプシドシェル」は、タンパク質のいくつかの構造サブユニットを含むウイルスのタンパク質シェルを指す。カプシドは、ウイルスの核酸コアを封入する。
【0075】
本発明の目的のために、用語「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵならびにそれらの誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は、当技術分野で周知である。この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの類似体を含むと理解されるべきである。この用語はまた、線状および環状ＤＮＡの両方を含むと理解されるべきである。この用語は本明細書で使用される場合、ｃＤＮＡ、すなわちＲＮＡ鋳型から、例えば逆転写酵素の作用によって生成された相補的またはコピーＤＮＡも包含する。
【0076】
本発明の目的のために、「免疫応答」という用語は、抗原または免疫原に対する生物学的検体の免疫系の特異的応答を指す。免疫応答には、抗体の産生および細胞性免疫が含まれ得る。
【0077】
本発明の目的のために、「免疫」という用語は、感染生物または物質に対する生物学的検体の耐性の状態を指す。感染生物または物質は広く定義され、寄生生物、毒性物質、癌細胞および他の細胞、ならびに細菌およびウイルスを含むことが理解されよう。
【0078】
本発明の目的のために、「免疫化条件」という用語は、免疫応答に影響を及ぼす因子を指し、生物学的検体に送達される免疫原またはアジュバントの量および種類、送達方法、接種回数、接種間隔、生物学的検体の種類およびその状態を含む。「ワクチン」は、免疫を誘導することができる医薬製剤を指す。
【0079】
本発明の目的のために、「免疫用量」という用語は、免疫応答を引き起こすのに必要な抗原または免疫原の量を指す。この量は、様々なアジュバントの存在および有効性によって変動する。この量は、生物学的検体および抗原、免疫原および／またはアジュバントによって異なるが、一般に、約０．１μｇ／ｍｌ以下～接種当たり約１００μｇである。
【0080】
本発明の目的のために、用語「ネックタンパク質」および用語「テールタンパク質」は、ウイルス粒子、特にバクテリオファージのネックまたはテールの任意の部分の集合に関与するタンパク質を指す。テールバクテリオファージはカウドウイルス目に属し、３つのファミリーを含む。シフォウイルス科は長い柔軟なテールを有し、テールウイルスの大部分を構成する。マイオウイルス科は長い硬質のテールを有し、細菌宿主へのファージ結合時に収縮する尾鞘によって十分に特徴付けられる。テールウイルスの最も小さいファミリーは、ポドウイルス科（短い脚状のテールを有するファージ）である。例えば、Ｔ４において、バクテリオファージｇｐ１０はｇｐ１１と会合して、ベースプレートのテールピンを形成する。テールピンの集合は、テール集合の第１の工程である。バクテリオファージＴ４のテールは、硬質チューブを取り囲み、ファージの長いテール繊維および短いテール繊維が結合される多タンパク質ベースプレートで終端する収縮性尾鞘からなる。ヘッドがＤＮＡとパッケージされると、タンパク質ｇｐ１３、ｇｐ１４およびｇｐ１５は、パッケージされたヘッドを密封するネックに集合し、ｇｐ１３タンパク質は、ＤＮＡパッケージング後にポータルタンパク質ｇｐ２０と直接相互作用し、ｇｐ１４およびｇｐ１５は、次いでｇｐ１３プラットフォーム上に集合する。Ｔ４バクテリオファージのネックおよびテールタンパク質には、タンパク質ｇｐ６、ｇｐ２５、ｇｐ５３、ｇｐ８、ｇｐ１０、ｇｐ１１、ｇｐ７、ｇｐ２９、ｇｐ２７、ｇｐ５、ｇｐ２８、ｇｐ１２、ｇｐ９、ｇｐ４８、ｇｐ５４、ｇｐ３、ｇｐ１８、ｇｐ１９、ｇｐ１３、ｇｐ１４、ｇｐ１５およびｇｐ６３が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0081】
本発明の目的のために、「精製された」という用語は、比較的純粋な状態の、例えば少なくとも約９０％純粋、または少なくとも約９５％純粋、または少なくとも約９８％純粋な成分を指す。
【0082】
説明
本発明は、様々な修正および代替形態が可能であるが、その特定の実施形態は、例として図面に示されており、以下で詳細に説明される。しかしながら、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図するものではなく、それどころか、本発明は、本発明の精神および範囲内に入るすべての修正、等価物、および代替物を包含するものであることを理解されたい。
本発明は、様々な修正および代替形態が可能であるが、その特定の実施形態は、例として図面に示されており、以下で詳細に説明される。しかしながら、本発明を開示された特定の形態に限定することを意図するものではなく、それどころか、本発明は、本発明の精神および範囲内に入るすべての修正、等価物、および代替物を包含するものであることを理解されたい。
【0083】
標的細胞形態への遺伝子およびタンパク質の送達は、機構研究ならびに癌、感染症および遺伝性疾患などの多くのヒト疾患の予防および治療に不可欠であろう。ウイルスベクターは、遺伝子およびタンパク質を標的細胞に送達するビヒクルとして利用されてきた。一般的に使用されるウイルスベクターには、真核生物ウイルスベクターおよび原核生物ウイルスベクターが含まれる。
【0084】
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルスなどの真核生物ウイルスベクターは、それらのゲノムを哺乳動物細胞に効率的に送達するように自然に進化しており、ヒト細胞に遺伝子を送達することを可能にしている。しかしながら、ＡＡＶなどの真核生物ウイルスベクターは、それらの送達能力が限定されている、すなわち（１）１つまたは２つの遺伝子かつ４～８ ｋｂのサイズしか送達することができず、（２）タンパク質の送達には適していないので、効率的な送達ビヒクルではないさらに、ヒト細胞に対するそれらの指向性および毒性、既存の免疫、および安全性の懸念は、それらの広範な適用を制限する２。
【0085】
バクテリオファージ（ファージ）Ｔ４などの原核ウイルスベクターは、真核生物ウイルスベクターの欠点を克服する４～１３。しかしながら、ファージも効率的な送達ビヒクルではない。哺乳動物細胞への導入、または導入後の適切な細胞内区画への到達のための天然機構を欠いているからである。図１の１１２は、ファージＴ４の構造モデルである。図１の表面図１２０に示すように、Ｔ４ヘッドカプソマーは、カプシドタンパク質ｇｐ２３＊（「＊」はｇｐ２３の切断された成熟形態を表す）１２６と、２つの必須ではない外側カプシドタンパク質、Ｓｏｃ １２４およびＨｏｃ １２２とからなる。ＳｏｃおよびＨｏｃは、短いポリペプチド、大きなドメイン、全長タンパク質、または多量体複合体を含む様々な外来タンパク質の表示に使用できることが発見された８、１０。これらの発見は、真核生物ウイルス粒子をファージに結合させて、細胞関連生物学的検体のためのより効率的な送達ビヒクルを作製することができるかどうかという疑問を提起した。一実施形態では、本発明は、遺伝子およびタンパク質を標的細胞に高効率で送達するために独自に設計されたハイブリッドウイルスベクターを提供する。本発明の方法および組成物は、効果的なワクチン、遺伝療法およびバイオテクノロジー分野における研究ツールに使用することができる。
【0086】
Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターの設計および構築
一実施形態では、本発明は、ビオチン－アビジン架橋によってＡＡＶをＴ４ヘッドに結合させることによって、Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターを提供する。図２に示すように、ＡＡＶは、Ｓｏｃ－ビオチン－アビジン（ＳＢＡ）２１０およびＨｏｃ－ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）－ビオチン－アビジン（ＨＢＢＡ）２２０の２種類の架橋分子によってＴ４ヘッドに結合している。Ｓｏｃ ２１２およびＨｏｃ ２２２はＴ４ヘッド２０２に結合し、アビジン２０６は反対側のビオチン化ＡＡＶ ２０４に結合する。
一実施形態では、本発明は、ビオチン－アビジン架橋によってＡＡＶをＴ４ヘッドに結合させることによって、Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターを提供する。図２に示すように、ＡＡＶは、Ｓｏｃ－ビオチン－アビジン（ＳＢＡ）２１０およびＨｏｃ－ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）－ビオチン－アビジン（ＨＢＢＡ）２２０の２種類の架橋分子によってＴ４ヘッドに結合している。Ｓｏｃ ２１２およびＨｏｃ ２２２はＴ４ヘッド２０２に結合し、アビジン２０６は反対側のビオチン化ＡＡＶ ２０４に結合する。
【0087】
一実施形態では、本発明は、Ｓｏｃ架橋Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターを作製する方法であって、（１）Ｓｏｃタンパク質をビオチン化する工程；（２）ビオチン化Ｓｏｃ（Ｓｏｃ－ビオチン）タンパク質をＴ４ヘッドに結合させてＴ４－Ｓｏｃ－ビオチンを作製する工程；（３）Ｔ４－Ｓｏｃ－ビオチンにアビジンを結合させてＴ４－Ｓｏｃ－アビジン（ＴＳＡ）を作製する工程；（４）ＡＡＶをビオチン化する工程；（５）ＡＡＶ上のビオチンをアビジンに結合させることによって、ビオチン化ＡＡＶをＴＳＡに結合させる工程を含む方法を提供する。
【0088】
別の実施形態では、本発明は、Ｈｏｃ架橋Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドウイルスベクターを作製する方法であって、（１）ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）をＨｏｃタンパク質に結合させてＨｏｃ－ＢＡＰを作製する工程；（２）Ｈｏｃ－ＢＡＰをビオチン化してＨＢＢを形成する工程；（２）アビジンをＨＢＢに結合させてＨＢＢＡを形成する工程；（３）ＨＢＢＡをＴ４ヘッドに結合させてＴＨＡを作製する工程；（４）ＡＡＶをビオチン化する工程；（５）ＡＡＶ上のビオチンをアビジンに結合させることによって、ビオチン化ＡＡＶをＴＨＡに結合させる工程を含む方法を提供する。
【0089】
ＴＳＡの作製
図３は、Ｓｏｃ－ビオチンを作製する工程を示す。Ｓｏｃ－ビオチン３１６を作製するために、精製Ｓｏｃタンパク質３１２を最初に、ビオチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）３１４での活性化によってビオチン化した（図３）。図４に示すように、Ｓｏｃ ４１２の効率的なビオチン化が確認される。
図３は、Ｓｏｃ－ビオチンを作製する工程を示す。Ｓｏｃ－ビオチン３１６を作製するために、精製Ｓｏｃタンパク質３１２を最初に、ビオチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）３１４での活性化によってビオチン化した（図３）。図４に示すように、Ｓｏｃ ４１２の効率的なビオチン化が確認される。
【0090】
次に、Ｓｏｃ－ビオチンをＴ４ヘッドに結合させる。図５に示すように、ビオチン化Ｓｏｃの結合は、Ｓｏｃ－ビオチン７１２の量の増加によって示されるように、カプシド結合部位に対するＳｏｃ－ビオチン分子の比が増加するにつれて増加する。３０：１の比で、Ｔ４結合Ｓｏｃ－ビオチンピークの相対強度はピークに達し（図５）、ほぼすべてのカプシド結合部位がＳｏｃ－ビオチンによって占められたことを示唆している。その後、アビジンはＴ４－Ｓｏｃ－ビオチンに結合してＴＳＡを形成する。アビジンのＴ４－Ｓｏｃ－ビオチンへの結合も、ＴＳＡ ６１２中のアビジンの量の増加によって示されるように（図６）、Ｔ４－Ｓｏｃ－ビオチン比率に対するアビジンの比率が増加するにつれて増加する。２：１の比率において、Ｔ４－Ｓｏｃ－ビオチン結合アビジンの相対強度はピークに達し、ほぼすべてのＴ４－Ｓｏｃ－ビオチンがアビジンを結合させたことを示唆している（図６）。
【0091】
ＴＨＡの作製
図３は、Ｈｏｃ－ビオチンを作製する工程を示す。Ｈｏｃ架橋を作製するために、ＢＡＰ ３２４を最初にＨｏｃ ３２２のＮ末端に結合させる（図３）。図７に示すように、ＢＡＰのＨｏｃ ７１２への結合が確認される。次いで、図３に示すように、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）を用いてＨｏｃ－ＢＡＰ ３２６をビオチン化する。図８に示すように、Ｈｏｃ－ＢＡＰ ８１２のビオチン化が確認される。
図３は、Ｈｏｃ－ビオチンを作製する工程を示す。Ｈｏｃ架橋を作製するために、ＢＡＰ ３２４を最初にＨｏｃ ３２２のＮ末端に結合させる（図３）。図７に示すように、ＢＡＰのＨｏｃ ７１２への結合が確認される。次いで、図３に示すように、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）を用いてＨｏｃ－ＢＡＰ ３２６をビオチン化する。図８に示すように、Ｈｏｃ－ＢＡＰ ８１２のビオチン化が確認される。
【0092】
その後、アビジンがビオチン化Ｈｏｃ－ＢＡＰ（ＨＢＢ）３２８に結合し、ＨＢＢＡを形成する。次いで、ＨＢＢＡをＴ４に結合させて、ＴＨＡ ９１２を効率的に形成する（図９）。ＨＢＢＡの結合は、ＴＨＡ １００２中のアビジンに対する量の増加によって示されるように、カプシド結合部位に対するＨＢＢＡ分子の比が増加するにつれて増加する。３０：１の比率で、Ｔ４結合Ｈｏｃ－ＢＡＰ－ビオチン－アビジンの相対強度がピークを示し（図１０）、ほぼすべての結合部位が占有されていることを示唆している。
【0093】
ＡＡＶのビオチン化および結合
ＡＡＶをＴ４に結合させるために、ＡＡＶ－ＤＪ、ウイルス粒子を最初にビオチン－ＮＨＳによる活性化によってビオチン化した。ＡＡＶ－ＤＪは、３つのＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有する。図１１に示すように、３つすべてのＡＡＶカプシドタンパク質のビオチン化が確認される。図１１において、列１１０２はＡＡＶカプシドタンパク質の検出を示し、列１１０４はビオチンの検出を示す。
ＡＡＶをＴ４に結合させるために、ＡＡＶ－ＤＪ、ウイルス粒子を最初にビオチン－ＮＨＳによる活性化によってビオチン化した。ＡＡＶ－ＤＪは、３つのＡＡＶカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有する。図１１に示すように、３つすべてのＡＡＶカプシドタンパク質のビオチン化が確認される。図１１において、列１１０２はＡＡＶカプシドタンパク質の検出を示し、列１１０４はビオチンの検出を示す。
【0094】
次いで、ビオチン化ＡＡＶ－ＤＪ粒子を、ＡＡＶ－ＤＪ粒子上のアビジンおよびビオチンの結合を通してＴＳＡおよびＴＨＡ架橋に結合させる（図１２および図１３）。図１２は、ＴＳＡへのＡＡＶの効率的な結合を確認し、列１２０２はＡＡＶカプシドタンパク質の検出を示す。図１３は、ＴＨＡへのＡＡＶの効率的な結合を確認し、列１３０２はＡＡＶカプシドタンパク質の検出を示す。
【0095】
ＡＡＶのＴ４へのコンジュゲーションもまた、未結合ＡＡＶの量を通して監視する。ＴＳＡまたはＴＨＡに添加されるｂｉｏＡＡＶ（ＧＦＰ）の比率を増加させた後、未結合ｂｉｏＡＡＶ（ＧＦＰ）を収集し、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入して、ｂｉｏＡＡＶによって運ばれるＧＦＰ遺伝子を発現させる。したがって、蛍光強度は、ＧＦＰ発現の量および非結合ＡＡＶの量の指標である。図１４は、未結合ｂｉｏＡＡＶ ＧＦＰ発現の定量化を示す。点１４０２および１４０４における未結合ＡＡＶの量の急激な増加は、ＡＡＶのＴ４への飽和したコンジュゲーションを示唆する。平均して、最大４つのＡＡＶ粒子がＴＳＡ架橋によって１つのＴ４カプシドにコンジュゲートされる一方、最大２つのＡＡＶ粒子がＴＨＡ架橋によって１つのＴ４カプシドにコンジュゲートされる（図１４）。ＡＡＶをさらに添加すると、フロースルー中のウイルスの溶出量が増加した。Ｔ４－ＡＡＶの効率的な集合は、図１５に示すように、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によっても確認される。図１５では、青色矢印はＴ４ １５０２を示し、赤色矢印はＴ４の表面に結合したＡＡＶ １５０４を示す。
【0096】
ＡＡＶが結合すると、遺伝子はＴ４によって著しくより効率的に送達される
Ｔ４ヘッド単独による哺乳動物細胞（ＨＥＫ ２９３）への形質導入は非常に非効率的であることが以前に示されている１０。本発明は、遺伝子がＴ４にパッケージされている場合のＴ４ヘッド単独とＴ４－ＡＡＶとで送達効率を比較した。
Ｔ４ヘッド単独による哺乳動物細胞（ＨＥＫ ２９３）への形質導入は非常に非効率的であることが以前に示されている１０。本発明は、遺伝子がＴ４にパッケージされている場合のＴ４ヘッド単独とＴ４－ＡＡＶとで送達効率を比較した。
【0097】
一実施形態では、輝度遺伝子（ｌｕｍｉｎａｎｃｅ ｇｅｎｅ）を含むプラスミドを、ＴＳＡ架橋によって結合したＡＡＶと共にＴ４カプシドにパッケージし、ＨＥＫ２９３細胞に送達する。送達効率は、相対発光単位によって測定される。
【0098】
図１６に示すように、ＤＮＡパッケージングモーターを使用してＴ４カプシドにパッケージされた核酸は、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉ）、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含有する３つの異なるプラスミドを含む。
【0099】
１つの好ましい実施形態では、ルシフェラーゼＤＮＡが、Ｔ４（ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶを使用して細胞に送達される。送達効率は、相対発光単位によって示される。図１７は、Ｔ４ヘッド単独１７０２、ならびに異なるＡＡＶ対Ｔ４比率、０．５：１（１７０４）、１：１（１７０６）、２：１（１７０８）、および３：１（１７１０）を有するＴ４－ＡＡＶベクターの相対発光単位を示す。図１７に示すように、ＴＳＡ架橋を介したＡＡＶへの結合によって、形質導入効率が少なくとも４０，０００倍増加する。加えて、送達効率は、ルシフェラーゼ活性の量によって示されるように、細胞あたりに添加されたＳｏｃ架橋Ｔ４－ＡＡＶ粒子の数に比例し、細胞あたり１０５個の粒子で最大に達した（図１８）。
【0100】
別の好ましい実施形態では、ルシフェラーゼＤＮＡは、Ｔ４（ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶを使用して細胞に送達される。図１９は、Ｔ４ヘッド単独１９０２、ならびにＨｏｃ １９０４およびＳｏｃ １９０６によって架橋されたＴ４－ＡＡＶベクターの相対発光単位を示す。図１９に示すように、ＨＳＡ架橋を介したＡＡＶへの結合によって、形質導入効率は、Ｔ４ヘッド単独と比較して１０，０００倍増加する。加えて、送達効率はまた、ルシフェラーゼ活性の量によって示されるように、細胞あたりに添加されたＨｏｃ架橋Ｔ４－ＡＡＶ粒子の数に比例し、細胞あたり１０６個の粒子で最大に達した（図２０）。
【0101】
遺伝子はＴ４およびＡＡＶの両方によって効率的に送達される
Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドベクターの利点は、Ｔ４とＡＡＶの両方を同時に使用して遺伝子を送達できることである。Ｔ４が二本鎖ＤＮＡの形態で遺伝子を送達するのに対して２３、ＡＡＶは、パッケージされたＡＡＶゲノムの天然状態である一本鎖ＤＮＡの形態で遺伝子を送達する１５。
Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドベクターの利点は、Ｔ４とＡＡＶの両方を同時に使用して遺伝子を送達できることである。Ｔ４が二本鎖ＤＮＡの形態で遺伝子を送達するのに対して２３、ＡＡＶは、パッケージされたＡＡＶゲノムの天然状態である一本鎖ＤＮＡの形態で遺伝子を送達する１５。
【0102】
一実施形態では、ｍＣｈｅｒｒｙ ＤＮＡ（赤色蛍光）はＴ４カプシドにパッケージされ、ＧＦＰ ＤＮＡ（緑色蛍光）はＡＡＶにパッケージされ、両方がＳｏｃ架橋を介してコンジュゲートされる。次いで、これらのＴ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）ナノ粒子を、緑色蛍光および赤色蛍光の両方の送達および発現のためにＨＥＫ２９３細胞に添加し、蛍光シグナルを細胞全体に均一に分布させる（図２１中、２１０２）。重要なことに、シグナルは高度に融合し、Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドベクターによってＴ４関連ｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＡＶ関連ＧＦＰの両方が共送達されるため、同じ細胞において両方のシグナルが発現することを実証する。
【0103】
別の実施形態では、ＧＦＰ ＤＮＡ（緑色蛍光）はＴ４カプシドにパッケージされ、ｍＣｈｅｒｒｙ ＤＮＡ（赤色蛍光）はＡＡＶにパッケージされ、これらはまた、Ｓｏｃ架橋を介してコンジュゲートされ、Ｔ４（ＧＦＰ）－ＡＡＶ（ｍＣｈｅｒｒｙ）粒子を形成する。Ｔ４（ＧＦＰ）－ＡＡＶ（ｍＣｈｅｒｒｙ）粒子をＨＥＫ２９３細胞に添加した後、緑色および赤色蛍光シグナルの両方も均一に分布され、高度に融合される（図２１中、２１０４）。
【0104】
両方の実施形態では、緑色蛍光シグナルおよび赤色蛍光シグナルの相関係数は、線形ピアソン（ｒｐ）および非線形スピアマンの順位（ｒｓ）を用いて定量化される。結果は、両方について高いｒｐおよびｒｓ値を示し（Ｔ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）の場合：ｒｐ＝０．８８１、ｒｓ＝０．８８４；Ｔ４（ＧＦＰ）－ＡＡＶ（ｍＣｈｅｒｒｙ）の場合：ｒｐ＝０．８５６、ｒｓ＝０．９０２）、Ｔ４およびＡＡＶによって送達される蛍光遺伝子の高い共発現を実証する。
【0105】
Ｔ４－ＡＡＶは、遺伝子およびタンパク質の両方を同時に効率的に送達する
Ｔ４－ＡＡＶベクターはまた、タンパク質および遺伝子の両方を送達する能力で有利であり、ハイブリッドナノ粒子の治療的可能性をさらに拡大する。
Ｔ４－ＡＡＶベクターはまた、タンパク質および遺伝子の両方を送達する能力で有利であり、ハイブリッドナノ粒子の治療的可能性をさらに拡大する。
【0106】
一実施形態では、Ｓｏｃ（Ｓｏｃ－β－ｇａｌ）２２０４に融合した大腸菌由来の１１６ ｋＤａβ－ガラクトシダーゼの約２５０コピーがＴ４ヘッド２２０２に表示され、約６．２ ｋｂのルシフェラーゼプラスミド（表示せず）の約９分子がＴ４ヘッド２２０２にパッケージされ、ＧＦＰ ＤＮＡ（表示せず）が、Ｈｏｃ架橋を介してＴ４に結合したＡＡＶ ２２０６にパッケージされている（図２２）。得られたβ－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子をＨＥＫ２９３細胞に形質導入する。
【0107】
図２３は、送達効率の指標である相対発光単位を、Ｔ４ヘッド単独２３０２、ならびにＴ４に対して様々な比率、０．５：１（２３０４）、１：１（２３０６）および２：１（２３０８）でＡＡＶを含むβ－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子によるルシフェラーゼ送達の結果として示す。図２３に示すように、ＨＳＡ架橋を介したＡＡＶへの結合によって、形質導入効率は、Ｔ４ヘッド単独と比較して１０，０００倍増加する。
【0108】
図２４では、ＡＡＶ関連ＧＦＰの発現は、ＡＡＶ対Ｔ４の比率への明確な用量依存性を示し、３：１の比率でピークに達する。
【0109】
Ｔ４によって送達されたβ－ガラクトシダーゼ酵素の発現を、Ｘ－Ｇａｌ基質を使用して試験する。切断されたＸ－Ｇａｌ基質の青色の外観は、機能性β－ガラクトシダーゼ酵素の発現が成功したことを示す。図２５は、Ｔ４ヘッド単独２５０２、およびＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶに対して異なる比率でＳｏｃ－β－ｇａｌを含むβ－ｇａｌ－Ｓｏｃ－Ｔ４（ｌｕｃｉ）－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子２５０４によって送達した場合の青色の強度を示す。図２５に示すように、色の強度は、表示されたＳｏｃ－β－ｇａｌタンパク質のコピー数に比例する。結果は、ＡＡＶの結合が、Ｔ４の表面に表示されたタンパク質の送達の増強にもつながることを裏付けている。
【0110】
別の実施形態では、Ｔ４カプシドを、核局在化シグナル（ＮＬＳ）に融合されたＧＦＰまたはＧＦＰのいずれかと共に表示し、ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドＤＮＡと共にパッケージし、ＡＡＶに結合させた。次いで、これらのＴ４－ＡＡＶナノ粒子をＨＥＫ２９３細胞に形質導入した。図２６に示すように、緑色蛍光シグナルおよびｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、ＧＦＰ－Ｔ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶ形質導入細胞およびＮＬＳ－ＧＦＰ－Ｔ４（ｍＣｈｅｒｒｙ）－ＡＡＶ形質導入細胞の両方で検出され、Ｔ４－ＡＡＶ粒子によるタンパク質および遺伝子の両方の効率的な送達を裏付けている。
【0111】
さらに、Ｔ４－ＡＡＶ粒子による形質導入後、Ｓｏｃ架橋またはＨｏｃ架橋にかかわらず、細胞あたり１０６個のＴ４－ＡＡＶベクターのレベルまで添加した場合でも、細胞生存率に対する測定可能な影響は観察されなかった。
【0112】
ＡＡＶを変異体に置換すると、送達効率を高めることができない。
一実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を変異させて、ＡＡＶ－ＰＬＡ２変異体を作製する。Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子は、ＳＢＡ架橋またはＨＢＢＡ架橋のいずれかを介してＡＡＶ－ＰＬＡ２変異体をＴ４に結合することによって組み立てられる。ルシフェラーゼＤＮＡをＴ４にパッケージし、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮおよびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮハイブリッドベクターを作製し、ＨＥＫ２９３細胞に送達する。図２７は、ＰＬＡ２変異を有さないＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴ ２７０２およびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴ ２７０６と比較した、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ ２７０４およびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ ２７０８の相対発光を示す。結果は、野生型ＡＡＶを含むＴ４－ＡＡＶが、Ｔ４にパッケージされた送達遺伝子にＰＬＡ２変異体を含むＴ４－ＡＡＶよりも少なくとも５倍効率的であることを立証する。言い換えれば、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ（ＰＬＡ２変異を含む）は、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴの形質導入効率の２０％を維持し、したがって、核酸の送達においてＴ４ヘッド単独よりも依然としてさらに効率的である。
一実施形態では、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質のホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）を変異させて、ＡＡＶ－ＰＬＡ２変異体を作製する。Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子は、ＳＢＡ架橋またはＨＢＢＡ架橋のいずれかを介してＡＡＶ－ＰＬＡ２変異体をＴ４に結合することによって組み立てられる。ルシフェラーゼＤＮＡをＴ４にパッケージし、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮおよびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮハイブリッドベクターを作製し、ＨＥＫ２９３細胞に送達する。図２７は、ＰＬＡ２変異を有さないＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴ ２７０２およびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴ ２７０６と比較した、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ ２７０４およびＴ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ ２７０８の相対発光を示す。結果は、野生型ＡＡＶを含むＴ４－ＡＡＶが、Ｔ４にパッケージされた送達遺伝子にＰＬＡ２変異体を含むＴ４－ＡＡＶよりも少なくとも５倍効率的であることを立証する。言い換えれば、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＡＮ（ＰＬＡ２変異を含む）は、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ－ＡＡＶ－ＷＴの形質導入効率の２０％を維持し、したがって、核酸の送達においてＴ４ヘッド単独よりも依然としてさらに効率的である。
【0113】
ビオチン－アビジン架橋が存在しないと、送達効率を高めることができない
一実施形態では、ビオチン－アビジン架橋による結合なしに、Ｔ４をＡＡＶと混合する。次いで、ルシフェラーゼＤＮＡをＴ４にパッケージし、ＨＥＫ２９３細胞に送達する。図２８は、様々なＴ４対ＡＡＶ比率でのＴ４およびＡＡＶ混合物２８０２の相対発光単位を示す。ビオチン－アビジン架橋が存在しない場合、結果は、Ｔ４単独と比較して、Ｔ４送達が増強されないことを立証する。ペプチドＴの結合は、Ｔ４によるＬｕｃｉ遺伝子の送達を改善する。しかしながら、混合物へ異なるＴ４対ＡＡＶ比率でＡＡＶを添加しても、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－Ｔ ２８０４の送達効率のさらなる改善はない。
一実施形態では、ビオチン－アビジン架橋による結合なしに、Ｔ４をＡＡＶと混合する。次いで、ルシフェラーゼＤＮＡをＴ４にパッケージし、ＨＥＫ２９３細胞に送達する。図２８は、様々なＴ４対ＡＡＶ比率でのＴ４およびＡＡＶ混合物２８０２の相対発光単位を示す。ビオチン－アビジン架橋が存在しない場合、結果は、Ｔ４単独と比較して、Ｔ４送達が増強されないことを立証する。ペプチドＴの結合は、Ｔ４によるＬｕｃｉ遺伝子の送達を改善する。しかしながら、混合物へ異なるＴ４対ＡＡＶ比率でＡＡＶを添加しても、Ｔ４（Ｌｕｃｉ）－Ｈｏｃ－Ｔ ２８０４の送達効率のさらなる改善はない。
【0114】
上記の実施形態に従って、Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドベクター作製の各工程における実務上の比率範囲および最適比率を以下の表に要約する。
【表1】
【0115】
Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子による効率的なインビボ遺伝子送達
高い送達効率に加えて、長いインビボ持続性は、ウイルスベクターの別の望ましい特徴である。核に入ると、一本鎖ＡＡＶ遺伝子は、複製して二本鎖ＡＡＶ ＤＮＡを生成する。二本鎖ＡＡＶ ＤＮＡは、ＩＴＲでの分子内または分子間再構成を介して頭尾コンカテマーに変換され、長期の導入遺伝子発現のためのエピソームとして存続すると考えられる。肝臓および筋肉を含む様々なＡＡＶ形質導入組織に関する研究は、コンカテマーが長期間、最長２２ヶ月間持続することを示した１５、２６。以前の研究はまた、Ｔ４にパッケージされたＤＮＡのインビボ持続性をＩＴＲが有意に増強することを示した１０。
高い送達効率に加えて、長いインビボ持続性は、ウイルスベクターの別の望ましい特徴である。核に入ると、一本鎖ＡＡＶ遺伝子は、複製して二本鎖ＡＡＶ ＤＮＡを生成する。二本鎖ＡＡＶ ＤＮＡは、ＩＴＲでの分子内または分子間再構成を介して頭尾コンカテマーに変換され、長期の導入遺伝子発現のためのエピソームとして存続すると考えられる。肝臓および筋肉を含む様々なＡＡＶ形質導入組織に関する研究は、コンカテマーが長期間、最長２２ヶ月間持続することを示した１５、２６。以前の研究はまた、Ｔ４にパッケージされたＤＮＡのインビボ持続性をＩＴＲが有意に増強することを示した１０。
【0116】
一実施形態では、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）は、パッケージされたＤＮＡの導入遺伝子に隣接するように操作される。
【0117】
好ましい実施形態では、導入遺伝子は、ＳｏｃまたはＨｏｃ架橋のいずれかを介してＡＡＶに結合されるＴ４ヘッドにパッケージされた約９個のＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡ分子である。得られたＴ４（ＩＴＲ－Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ／Ｈｏｃ－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子を次いでマウスに注射する。図２９に示されるように、ＩＴＲ－Ｌｕｃｉ ＤＮＡ分子からなる配列は、ＩＴＲ ２９０２、ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶｐｒｏ）２９０４、ルシフェラーゼ遺伝子２９０６、ポリＡ ２９０８およびＩＴＲ ２９１０の順序で連結する。
【0118】
一実施形態では、約２×１０１１個のＴ４（ＩＴＲ－Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ／Ｈｏｃ－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子をマウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）注射する。マウスにおけるルシフェラーゼの発現を全身画像化によって監視し、６０日間の光束を測定することによって定量化する。
【0119】
図３０に示すように、ルシフェラーゼシグナルは局所注射部位で検出可能であり、Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子の単回注射により、ルシフェラーゼがマウスにおいて効率的かつ長期に発現したことを立証している。Ｔ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶを欠くＴ４粒子と比較した場合、３０日目にルシフェラーゼシグナルの約２５倍の増強をもたらした（図３０および図３１）。シグナルは３０日目にピークに達し、６０日目にも高レベルで保持された。対照的に、ＡＡＶを欠くＴ４粒子を投与されたマウスでは、シグナルは１５日目にピークに達し、６０日目までにほぼ消失した（図３０および図３１）。Ｈｏｃ架橋Ｔ４－ＡＡＶ粒子は、６０日目にＡＡＶを欠くＴ４よりも約１３０倍高い顕著なルシフェラーゼシグナルを生成した。
【0120】
一実施形態では、約５×１０１０個のＴ４（ＩＴＲ－Ｌｕｃｉ）－Ｓｏｃ／Ｈｏｃ－ＡＡＶ（ＧＦＰ）粒子をマウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）注射する。結果はまた、コンジュゲートされたＴ４－ＡＡＶが、Ｔ４単独と比較した場合、Ｔ４運送物のより効率的なマウス細胞への送達を促進し、結果として、より長期間にわたって遺伝子発現を増強することを確認した（図３２および図３３）。したがって、Ｔ４－ＡＡＶハイブリッドベクターは、治療適用のための魅力的な戦略を提供し得る。
【0121】
Ｔ４－ＡＡＶによって送達された多価ＤＮＡワクチンおよびタンパク質抗原は、防御免疫応答を効率的に誘導した
ＤＮＡワクチンは、それらの生産が全体的に安全かつ容易であるので、ワクチン開発の魅力的な候補である。ＤＮＡを分解から保護するためのＤＮＡワクチンの製剤化および効率的な送達技術の開発は、ＤＮＡワクチンの最終的な有効性において重要な役割を果たす２９。さらに、ＤＮＡワクチンによって誘発された免疫応答は、相同タンパク質のブーストによって劇的に増強された３０。したがって、本発明では、ＤＮＡとタンパク質の両方を効率的に送達することができ、送達された遺伝子の発現を最大６０日間維持することもできるＴ４－ＡＡＶハイブリッドベクターが、多機能遺伝子およびタンパク質（プライムブースト）ワクチン送達プラットフォームとして使用される。
ＤＮＡワクチンは、それらの生産が全体的に安全かつ容易であるので、ワクチン開発の魅力的な候補である。ＤＮＡを分解から保護するためのＤＮＡワクチンの製剤化および効率的な送達技術の開発は、ＤＮＡワクチンの最終的な有効性において重要な役割を果たす２９。さらに、ＤＮＡワクチンによって誘発された免疫応答は、相同タンパク質のブーストによって劇的に増強された３０。したがって、本発明では、ＤＮＡとタンパク質の両方を効率的に送達することができ、送達された遺伝子の発現を最大６０日間維持することもできるＴ４－ＡＡＶハイブリッドベクターが、多機能遺伝子およびタンパク質（プライムブースト）ワクチン送達プラットフォームとして使用される。
【0122】
インフルエンザウイルスは、インフルエンザを引き起こす病原体である。インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質のヘマグルチニン（ＨＡ）「ステム」領域は、非常に魅力的な「ユニバーサル」ワクチン候補である３１。
【0123】
一実施形態では、本発明は、ＨＡ－ステム（ＨＡ４９００）を含むＴ４－ＡＡＶ送達ベクターを提供する。このＤＮＡを、３０：１のパッケージング比でカプシドあたり約１０分子でＴ４ヘッドにパッケージした。図３４に示されるように、パッケージされたＤＮＡ分子は、以下の順序、ＩＴＲ ３４０２、ＣＭＶプロモーター３４０４、ＨＡ４９００ ３４０６、ポリＡ ３４０８およびＩＴＲ ３４１０で配列を含有する。これらの粒子をＨＥＫ２９３細胞へ形質導入すると、培養培地へのＨＡ４９００抗原の効率的な発現および分泌をもたらす（図３５）。図３５では、行３５０２は、ＨＡ４９００タンパク質が細胞培養培地から回収されることを示す。
【0124】
一実施形態では、外部アジュバントなしのプライムブーストスキームを使用して、約２×１０１１個のＨｏｃ架橋Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶ（ＶＲＣ ０１）粒子でマウスを筋肉内免疫する。ＶＲＣ－ＨＩＶＭＡＢ ０６０－００－ＡＢ（ＶＲＣ０１）は、ＨＩＶ感染患者のＢ細胞から単離された広域中和ＨＩＶ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＶＲＣ０１の形質導入は、マウスにおいても検出することができ（データは示さず）、２つの異なる遺伝子をパッケージおよび送達するＴ４－ＡＡＶハイブリッドベクターの能力を示している。
【0125】
図３６は、プライムブーストスキームの実験設計を示す。手短に言えば、プライム注射の２１日後、マウスはブースト注射を受ける。いくつかの実施形態では、マウスを５１日目にペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ ９２でチャレンジする。病原体ＤＮＡを運ぶＴ４－ＡＡＶ粒子の注入によって誘導される免疫応答を評価するために、ＩｇＧ力価を測定する。マウスでは、ＩｇＧ２ａ力価はＴＨ１（１型Ｔヘルパー細胞）免疫応答を反映し、ＩｇＧ１力価はＴＨ２（２型Ｔヘルパー細胞）免疫応答を反映する。
【0126】
一実施形態では、マウスは、２１日目にプライム注射およびブースト注射を受ける。ＩｇＧ力価として示される免疫応答を、１４日目、３５日目、６０日目、１２０日目および１８０日目に測定する。Ｔ４（ＨＡ４９００）の単回注射は、マウスにおいて抗ＨＡ ＩｇＧ力価を誘発し（１４日目）（図３７）、これを２回目の注射でさらに増強した（３５日目）（図３８）。図３７および図３８は、それぞれ１４日目および３５日目のＩｇＧ力価を示す。ＰＢＳおよびＴ４対照は免疫応答を誘導しないが、ＡＡＶの結合は、ＡＡＶが結合されないＨＡ４９００を運ぶＴ４と比較して、高いＩｇＧ力価、したがってより強い免疫応答を誘導する。結果は、ＡＡＶへのコンジュゲーションがＴ４（ＨＡ４９００）送達を有意に改善し、その結果、抗原発現の増加および感染因子に対するより強い免疫をもたらしたことを確認する。図３７および図３８は、ＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価も示す。Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶ血清は、約２５倍高いサブクラスＩｇＧ２ａ力価を含有していた。図６Ｅは、免疫後６ヶ月でも安定し続ける、抗ＨＡ ＩｇＧ２ａ力価の耐久性を示す。さらに、Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶのＩｇＧ力価は、プライム注射後１８０日間を通して、Ｔ４単独によって誘導されたものよりも高いままである（図３９）。これらのデータは、Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子が、Ｔ４ヘッド単独と比較した場合、より強いＴＨ１バイアス性免疫応答を誘発することを示唆している。
【0127】
強力で耐久性のある体液性免疫活性は、通常、胚中心応答および長寿命の血漿およびメモリーＢ細胞を特徴とし、ＣＤ４＋濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）の支援に大きく依存する３３。ＣＸＣＬ１３［ケモカイン（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフ）リガンド１３］ケモカインは、リンパ系組織における胚中心およびＴｆｈ細胞の活性について認められた血漿バイオマーカーである３４。
【0128】
図４０は、Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子による免疫後１８０日間にわたる血清ＣＸＣＬ１３レベルを示す。図４０に示すように、Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶ免疫化マウスは、Ｔ４（ＨＡ４９００）免疫化マウスと比較してＣＸＣＬ１３の血清濃度が約４倍高く、ハイブリッドベクターによって誘発される胚中心およびＴｆｈ細胞の活性の増強を示している。
【0129】
ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓｉｓ）は、ペストを引き起こす病原体である。ペスト抗原Ｆ１ｍｕｔＶは、ペストに対する永続的な免疫応答を誘発することが知られている。
【0130】
別の実施形態では、本発明は、Ｔ４にパッケージされた約１０分子のＨＡ４９００ ＤＮＡ、Ｓｏｃ融合タンパク質としてＴ４の表面に表示された約５９０分子のＦ１ｍｕｔＶ、Ｈｏｃ架橋を介してＴ４に結合したＡＡＶを含むハイブリッドＴ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶナノ粒子を使用してマウスを免疫化する方法を提供する。プライム－ブーストスキームに従って、プライム注射の２１日後のブースト注射でマウスを免疫化する。
【0131】
図４１はＩｇＧ力価を示し、ＡＡＶの結合が抗ＨＡ ＩｇＧ、特にＩｇＧ２ａ力価の増強をもたらすことを立証する。さらに、図４２に示すように、Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶはまた、Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）よりも高い総抗Ｆ１ｍｕｔＶ ＩｇＧ力価を刺激し、ＡＡＶの結合がＴ４によって送達されたタンパク質抗原に対する免疫応答も増強することを立証している。
【0132】
別の実施形態では、プライムブーストスキームを使用してマウスをＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶベクターで免疫化し、次いで、５１日目に、最も致死的なペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２の２９５ ＬＤ５０［Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて１ ＬＤ ５０＝１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）］のチャレンジ用量でチャレンジする。
【0133】
図４３は、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２でチャレンジしたマウスの生存率を示す。高い生存率は、免疫化による保護の増強を示す。図４３に示すように、Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶベクターは完全な保護を示したが、非コンジュゲートＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）ベクターは部分的な６７％の保護を示した。したがって、結果は、ＡＡＶの結合がＴ４で送達された抗原によって誘導された免疫応答を改善することを確認した。
【0134】
別の実施形態では、プライムブーストスキームを使用してマウスをＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４－ＡＡＶ（ＨＡ４９００）ベクターで免疫化し、次いで、５１日目に、最も致死的なペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）ＣＯ９２の２９５ ＬＤ５０［Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて１ ＬＤ５０＝１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）］のチャレンジ用量でチャレンジする。
【0135】
しかしながら、ＡＡＶの結合は、Ｔ４ヘッド単独と比較した、ＨＡに対する免疫応答の増強をもたらすことができない（データは示さず）。
【0136】
本発明では、有害作用または毒性関連作用、例えば血清アルカリホスファターゼの変化、体重減少、または温度変化の徴候は、Ｔ４－ＡＡＶナノ粒子で免疫化したマウスのいずれにおいても明らかにされなかった。
【0137】
本発明の多くの実施形態を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく修正および変形が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は、本発明の多くの実施形態を示しているが、非限定的な例として提供されており、したがって、そのように示された様々な態様を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【0138】
例
例１
プラスミド構築
プラスミドｐＥＴ－２８ｂ－Ｓｏｃ、ｐＥＴ－２８ｂ－Ｓｏｃ－β－ｇａｌ、およびｐＥＴ－２８ｂ－Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｓｏｃを以前に記載されたように構築した１０、１２。ｐＥＴ－２８ｂ－ＢＡＰ－Ｈｏｃの構築のために、以下の３つのプライマー：ＦＷ１＝ＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＣＴＣＣ（配列番号１）、ＦＷ２＝ＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴ ＴＣＧ（配列番号２）、およびＲＷ＝ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号３）を使用して、２回のＰＣＲを行ってＢＡＰ－Ｈｏｃを増幅した。第１回目のＰＣＲは、ＦＷ１プライマーおよびＲＷプライマーを用いてＢＡＰ配列の一部にＨｏｃを融合することによって行った。
例１
プラスミド構築
プラスミドｐＥＴ－２８ｂ－Ｓｏｃ、ｐＥＴ－２８ｂ－Ｓｏｃ－β－ｇａｌ、およびｐＥＴ－２８ｂ－Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｓｏｃを以前に記載されたように構築した１０、１２。ｐＥＴ－２８ｂ－ＢＡＰ－Ｈｏｃの構築のために、以下の３つのプライマー：ＦＷ１＝ＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＣＡＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＣＴＣＣ（配列番号１）、ＦＷ２＝ＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴ ＴＣＧ（配列番号２）、およびＲＷ＝ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣ（配列番号３）を使用して、２回のＰＣＲを行ってＢＡＰ－Ｈｏｃを増幅した。第１回目のＰＣＲは、ＦＷ１プライマーおよびＲＷプライマーを用いてＢＡＰ配列の一部にＨｏｃを融合することによって行った。
【0139】
ＦＷ２プライマーおよびＲＷプライマーを使用する２回目のＰＣＲによって全長ＢＡＰ－Ｈｏｃを得、次いで、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化したＢＡＰ－Ｈｏｃ断片をＥＴ－２８ｂベクター内にサブクローニングした。ＢｉｒＡ発現プラスミドｐＥＴ－２１ａ－ＢｉｒＡは、Ａｄｄｇｅｎｅ（登録商標）プラスミド＃２０８５７から購入した。プラスミドｐＡＡＶ－ＤＪ、ｐＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ、ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－ルシフェラーゼおよびｐＡＡＶ－ｍＣｈｅｒｒｙは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（商標）から購入した。ＤＪ－Ｈ７５Ａ－Ｄ７６Ｎ変異体をクローニングするために、上流断片を、プライマーＡＮ－Ｆ（ＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＧ）（配列番号４）およびＨＤ－ＡＮ－Ｒ（ＧＴＴＴＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＴＣＴＧＣＣＴＣ）（配列番号５）および鋳型ｐＡＡＶ－ＤＪを使用して増幅し、下流断片を、プライマーＨＤ－ＡＮ－Ｆ（ＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＣＴＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＣＡ）（配列番号６）およびＡＮ－Ｒ（ＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＧＴＣ）（配列番号７）を使用して増幅した。次いで、２つの断片を等量で混合し、これを鋳型として使用して、プライマーＡＮ－ＦおよびＡＮ－Ｒを用いてＤＪ－Ｈ７５Ａ－Ｄ７６Ｎを増幅した。その後、ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位でｐＡＡＶ－ＤＪベクターにクローニングして、ｐＡＡＶ－ＤＪ－Ｈ７５Ａ－Ｄ７６Ｎを構築した。インフルエンザＨＡ４９００ ＤＮＡ断片を最近の報告に従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）によって合成し３１、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化後にｐＡＡＶベクターにサブクローニングした。構築したすべてのプラスミドを配列決定して、正しい断片挿入を確認した（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、ＣＡ）。
【0140】
例２
タンパク質の発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ細胞で発現した組換えタンパク質を、以前に記載されたプロトコルに従って精製した１０、１２。インフルエンザＨＡ４９００を、以前の報告に従ってＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）から精製した３１。簡潔に説明すると、ｐＡＡＶ－ＩＴＲｓ－ＨＡ４９００プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）に維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性に形質導入した。次いで、１３０ｒｐｍで一晩振盪しながら、３７℃かつ８％ ＣＯ２で細胞をインキュベートした。１２時間後、酪酸ナトリウム溶液（タンパク質発現を増強、最終濃度２ ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、ＭＯ）を補充した等容量の新鮮培地を細胞に添加した。７日目に、純粋な上清を遠心分離によって回収し、０．２２μｍフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過した。タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐＨＰおよびゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、ＩＬ）を使用して精製した。
タンパク質の発現および精製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＰＬ細胞で発現した組換えタンパク質を、以前に記載されたプロトコルに従って精製した１０、１２。インフルエンザＨＡ４９００を、以前の報告に従ってＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）から精製した３１。簡潔に説明すると、ｐＡＡＶ－ＩＴＲｓ－ＨＡ４９００プラスミドを、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を使用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（登録商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）に維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一過性に形質導入した。次いで、１３０ｒｐｍで一晩振盪しながら、３７℃かつ８％ ＣＯ２で細胞をインキュベートした。１２時間後、酪酸ナトリウム溶液（タンパク質発現を増強、最終濃度２ ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、ＭＯ）を補充した等容量の新鮮培地を細胞に添加した。７日目に、純粋な上清を遠心分離によって回収し、０．２２μｍフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過した。タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐＨＰおよびゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、ＩＬ）を使用して精製した。
【0141】
例３
Ｔ４ヘッドおよびＡＡＶの作製
１０アンバー１３アンバーｈｏｃ－ｄｅｌ ｓｏｃ－ｄｅｌ Ｔ４ヘッドを以前に記載されたプロトコルに従って精製した６。この変異体に感染した大腸菌Ｐ３０１（ｓｕｐ－）細胞（５００ ｍＬ）を、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩおよびクロロホルム（１ ｍＬ）を含有する４０ ｍＬのＰｉ－Ｍｇ緩衝液（２６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／６８ｍＭ ＮａＣｌ／２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．５）に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。溶解物を２回の低速（６，０００×ｇ、１０分間）および高速（３５，０００×ｇ、４５分間）遠心分離に供し、最終ヘッドペレットを２００μＬのＴｒｉｓ Ｍｇ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製した。５ ｍＬ勾配の底から約１／３に沈降した主要なヘッド帯域を抽出し、Ｔｒｉｓ・Ｍｇ緩衝液に対して一晩透析した。ヘッドをＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによってさらに精製した。ピークヘッド留分を濃縮し、－８０℃で保存した。
Ｔ４ヘッドおよびＡＡＶの作製
１０アンバー１３アンバーｈｏｃ－ｄｅｌ ｓｏｃ－ｄｅｌ Ｔ４ヘッドを以前に記載されたプロトコルに従って精製した６。この変異体に感染した大腸菌Ｐ３０１（ｓｕｐ－）細胞（５００ ｍＬ）を、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩおよびクロロホルム（１ ｍＬ）を含有する４０ ｍＬのＰｉ－Ｍｇ緩衝液（２６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／６８ｍＭ ＮａＣｌ／２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／１ｍＭ ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．５）に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。溶解物を２回の低速（６，０００×ｇ、１０分間）および高速（３５，０００×ｇ、４５分間）遠心分離に供し、最終ヘッドペレットを２００μＬのＴｒｉｓ Ｍｇ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５／５０ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製した。５ ｍＬ勾配の底から約１／３に沈降した主要なヘッド帯域を抽出し、Ｔｒｉｓ・Ｍｇ緩衝液に対して一晩透析した。ヘッドをＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによってさらに精製した。ピークヘッド留分を濃縮し、－８０℃で保存した。
【0142】
ｒＡＡＶ－ＤＪは、トリプルプラスミドトランスフェクション法（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用して製造した。簡潔に言うと、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）、ｒｅｐおよびｃａｐを発現するｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ｐＡＡＶ－ＤＪまたはｐＡＡＶ－ＤＪ－Ｈ７５Ａ－Ｄ７６Ｎ）、およびＡＡＶ導入遺伝子カセット（ＡＡＶゲノム）を運ぶ導入遺伝子プラスミド（ｐＡＡＶ－ＧＦＰ、ｐＡＡＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＡＡＶ－ルシフェラーゼ、ｐＡＡＶ－ＨＡ４９００またはｐＡＡＶ－ＶＲＣＯ１）（１：１：１）を含むプラスミドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＡ）を使用して、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂタンパク質を発現するＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションした。７２時間後、１，１４０×ｇで１０分間遠心分離することによって細胞を回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ）に再懸濁し、ドライアイス－エタノールおよび３７℃水浴での３回の凍結／解凍サイクルによって溶解した。ベンゾナーゼを混合物に添加し（最終濃度５０Ｕ／ｍｌ）、溶解物を３７℃で３０分間インキュベートした。溶解物を３，７００×ｇで２０分間の遠心分離によって清澄化し、ウイルス含有上清を粗溶解物とみなした。次いで、ウイルスを、５００，０００ｒｐｍで１６時間の、４℃での非連続的イオジキサノール密度勾配遠心分離（５５型 Ｔｉローター、Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）、ＣＡ）によって、および製造者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、ＩＬ）の説明書に従ってＨｉＴｒａｐ ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰによって精製した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）で、ピーク留分をＰＢＳ－ＭＫ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭＫＣｌ、および１ｍＭＭｇＣｌ２）に対して透析した。透析したＡＡＶ粒子を濃縮し、－８０℃で保存した。ＡＡＶ力価を、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）、ＣＡ）を使用して決定した。
【0143】
例４
Ｔ４ヘッドのインビトロＤＮＡパッケージングおよびタンパク質表示
インビトロＤＮＡパッケージングアッセイのために、２０μｌの各反応混合物は、パッケージング緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＡＴＰ）中に精製Ｔ４ヘッド（約２×１０１０粒子）、精製全長ｇｐ１７（約３μＭ）および線状ＤＮＡを含有していた。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、ベンゾナーゼヌクレアーゼを添加し、３７℃で２０分間インキュベートしてパッケージされていない余分なＤＮＡを除去した。カプセル化されたヌクレアーゼ耐性ＤＮＡは、５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）、および０．２％のＳＤＳで６５℃にて３０分間処理することによって放出された。パッケージされたＤＮＡを１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル電気泳動によって分析し、続いて臭化エチジウムで染色し、パッケージされたＤＮＡの量を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）を使用して定量化した。パッケージング効率を、Ｔ４あたりにパッケージされたＤＮＡ分子の数として定義した。
Ｔ４ヘッドのインビトロＤＮＡパッケージングおよびタンパク質表示
インビトロＤＮＡパッケージングアッセイのために、２０μｌの各反応混合物は、パッケージング緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＡＴＰ）中に精製Ｔ４ヘッド（約２×１０１０粒子）、精製全長ｇｐ１７（約３μＭ）および線状ＤＮＡを含有していた。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした後、ベンゾナーゼヌクレアーゼを添加し、３７℃で２０分間インキュベートしてパッケージされていない余分なＤＮＡを除去した。カプセル化されたヌクレアーゼ耐性ＤＮＡは、５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．５μｇ／μｌのプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）、および０．２％のＳＤＳで６５℃にて３０分間処理することによって放出された。パッケージされたＤＮＡを１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル電気泳動によって分析し、続いて臭化エチジウムで染色し、パッケージされたＤＮＡの量を、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）を使用して定量化した。パッケージング効率を、Ｔ４あたりにパッケージされたＤＮＡ分子の数として定義した。
【0144】
Ｔ４ヘッド上のインビトロタンパク質表示を、以前に記載された共沈降によって評価した８。簡潔に言うと、上記のように線状ＤＮＡをカプセル化した後、Ｔ４ヘッドをＳｏｃ融合タンパク質および／またはＨｏｃ融合タンパク質と共に４℃で４５分間インキュベートした。混合物を３０，０００×ｇで４５分間の遠心分離によって沈降させ、上清中の未結合タンパク質を除去した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ペレットを４℃で一晩インキュベートし、次いでＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析用のＰＢＳに、または形質導入用のＯｐｔｉ－ＭＥＭに再懸濁した。クマシーブルーＲ２５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）染色および脱色後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上のタンパク質バンドをスキャンし、レーザーデンシトメトリー（ＰＤＳＩ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（商標）、ＩＬ）によって定量化した。Ｈｏｃ、Ｓｏｃおよびｇｐ２３バンドの密度を各レーンについて別々に決定し、カプシド当たりの結合したＨｏｃまたはＳｏｃ融合分子のコピー数を、ｇｐ２３を内部対照（９３０コピー／カプシド）として使用して計算した。
【0145】
例５
ＡＡＶベクターおよびＳｏｃタンパク質のビオチン化
ＡＡＶベクターおよびＳｏｃタンパク質を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）に従って使用してビオチン化した。精製ＡＡＶベクター（１×１０１２粒子）を５００ ｎｍｏｌのＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンと共にＰＢＳ緩衝液中３７℃で２時間インキュベートした。Ｓｏｃタンパク質のビオチン化のために、２０倍モル過剰のビオチン試薬を使用して、ＰＢＳ緩衝液中で１０ｍｇのＳｏｃを標識した。遊離ビオチンを除去するために、反応混合物を、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）中のＰＢＳ－ＭＫ緩衝液に対して透析した。透析したｂｉｏＡＡＶおよびｂｉｏＳｏｃを濃縮し、－８０℃で保存した。
ＡＡＶベクターおよびＳｏｃタンパク質のビオチン化
ＡＡＶベクターおよびＳｏｃタンパク質を、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンを製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）に従って使用してビオチン化した。精製ＡＡＶベクター（１×１０１２粒子）を５００ ｎｍｏｌのＳｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチンと共にＰＢＳ緩衝液中３７℃で２時間インキュベートした。Ｓｏｃタンパク質のビオチン化のために、２０倍モル過剰のビオチン試薬を使用して、ＰＢＳ緩衝液中で１０ｍｇのＳｏｃを標識した。遊離ビオチンを除去するために、反応混合物を、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）中のＰＢＳ－ＭＫ緩衝液に対して透析した。透析したｂｉｏＡＡＶおよびｂｉｏＳｏｃを濃縮し、－８０℃で保存した。
【0146】
例６
ＨＢＢＡの製造
１５アミノ酸ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号８）をＨｏｃタンパク質のＮ末端に融合した。大腸菌酵素ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）配列は、ビオチンをＢＡＰに特異的に連結する。簡潔に言うと、ＢＬ２１ＲＩＰＬ細胞においてＨｉｓ６タグ付きＢｉｒＡおよびＨｏｃ－ＢＡＰを誘導し、ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムおよびＳＥＣによって精製した。Ｈｏｃ－ＢＡＰのビオチン化のために、１μＭの組換えＢｉｒＡリガーゼを、０．３ｍＭのビオチンおよび５ｍＭのＡＴＰの存在下で３０μＭのＨｏｃ－ＢＡＰモノマー（ｐＨ７．４のＰＢＳ－ＭｇＣｌ２緩衝液中）に添加した。反応を室温（ＲＴ）で３時間進行させた。ビオチン化をストレプトアビジン－ＨＲＰウエスタンブロット分析によって確認した。遊離ビオチンをＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）によって除去した。ビオチン化反応混合物を緻密な樹脂床の中心に充填し、１，０００×ｇで２分間遠心分離して脱塩試料を回収した。精製したＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチンをアビジンと１：３の比率で４℃で１時間インキュベートした。ＨＢＢＡをＳＥＣによって精製した。ピーク留分を濃縮し、－８０℃で保存した。
ＨＢＢＡの製造
１５アミノ酸ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ、ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号８）をＨｏｃタンパク質のＮ末端に融合した。大腸菌酵素ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）配列は、ビオチンをＢＡＰに特異的に連結する。簡潔に言うと、ＢＬ２１ＲＩＰＬ細胞においてＨｉｓ６タグ付きＢｉｒＡおよびＨｏｃ－ＢＡＰを誘導し、ＨｉｓＴｒａｐＨＰカラムおよびＳＥＣによって精製した。Ｈｏｃ－ＢＡＰのビオチン化のために、１μＭの組換えＢｉｒＡリガーゼを、０．３ｍＭのビオチンおよび５ｍＭのＡＴＰの存在下で３０μＭのＨｏｃ－ＢＡＰモノマー（ｐＨ７．４のＰＢＳ－ＭｇＣｌ２緩衝液中）に添加した。反応を室温（ＲＴ）で３時間進行させた。ビオチン化をストレプトアビジン－ＨＲＰウエスタンブロット分析によって確認した。遊離ビオチンをＺｅｂａ（商標）脱塩スピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）によって除去した。ビオチン化反応混合物を緻密な樹脂床の中心に充填し、１，０００×ｇで２分間遠心分離して脱塩試料を回収した。精製したＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチンをアビジンと１：３の比率で４℃で１時間インキュベートした。ＨＢＢＡをＳＥＣによって精製した。ピーク留分を濃縮し、－８０℃で保存した。
【0147】
例７
Ｔ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶおよびＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶベクターの製造
ニッケルビーズ上でのＴ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶベクターの組み立てのために、Ｔ４－Ｓｏｃ（Ｈｉｓ６）－ビオチンベクターをＮｉ２＋－ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上に充填した。４℃で１時間インキュベートした後、混合物を１００×ｇで３０秒間遠心分離し、結合緩衝液で５回洗浄した。次いで、結合緩衝液に溶解したアビジンをビーズに添加した。４℃で２０分間インキュベートした後、遊離アビジンを洗浄および遠心分離によって除去した。次いで、ビオチン化ＡＡＶベクターをＴ４－Ｓｏｃ－ＳＢＡ固定化ビーズに添加し、３０分間インキュベートした。結合緩衝液で５回洗浄した後、結合したＴ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶベクターを溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。ニッケルビーズ上にＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶを組み立てるためのプロトコルは、Ｔ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶに利用されたものと同様であった。最後に、溶出したベクターはＰＢＳ－ＭＫ緩衝液に替えられた。
Ｔ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶおよびＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶベクターの製造
ニッケルビーズ上でのＴ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶベクターの組み立てのために、Ｔ４－Ｓｏｃ（Ｈｉｓ６）－ビオチンベクターをＮｉ２＋－ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上に充填した。４℃で１時間インキュベートした後、混合物を１００×ｇで３０秒間遠心分離し、結合緩衝液で５回洗浄した。次いで、結合緩衝液に溶解したアビジンをビーズに添加した。４℃で２０分間インキュベートした後、遊離アビジンを洗浄および遠心分離によって除去した。次いで、ビオチン化ＡＡＶベクターをＴ４－Ｓｏｃ－ＳＢＡ固定化ビーズに添加し、３０分間インキュベートした。結合緩衝液で５回洗浄した後、結合したＴ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶベクターを溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌおよび３００ｍＭイミダゾール）で溶出した。ニッケルビーズ上にＴ４－Ｈｏｃ－ＡＡＶを組み立てるためのプロトコルは、Ｔ４－Ｓｏｃ－ＡＡＶに利用されたものと同様であった。最後に、溶出したベクターはＰＢＳ－ＭＫ緩衝液に替えられた。
【0148】
例８
ウエスタンブロット分析
ＡＡＶまたはＴ４－ＡＡＶ粒子を充填緩衝液中で１０分間煮沸し、１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いでニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）に転写した。ブロッキングは、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中、穏やかに振盪しながら室温で１時間行った。次いで、ブロットをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。一次抗体をブロットに添加し、５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベートした。ＡＡＶ ＶＰタンパク質を、それらの同一のＣ末端領域に基づいてＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を認識するＡＡＶカプシドタンパク質特異的抗体Ｂ１（１：５０で希釈、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＡ）を使用して検出した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ中で１：２，０００に希釈して室温で１時間適用し、続いてＰＢＳ－Ｔで３回すすいだ。ｂｉｏ－ＡＡＶ、ｂｉｏ－Ｓｏｃ、およびＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチンは、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ＵＫ）によって直接検出された。シグナルを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋システムおよびＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを製造者の説明書（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）に従って使用して、増強された化学発光基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）で可視化した。
ウエスタンブロット分析
ＡＡＶまたはＴ４－ＡＡＶ粒子を充填緩衝液中で１０分間煮沸し、１２％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、次いでニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）に転写した。ブロッキングは、５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）中、穏やかに振盪しながら室温で１時間行った。次いで、ブロットをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。一次抗体をブロットに添加し、５％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベートした。ＡＡＶ ＶＰタンパク質を、それらの同一のＣ末端領域に基づいてＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を認識するＡＡＶカプシドタンパク質特異的抗体Ｂ１（１：５０で希釈、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＡ）を使用して検出した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、二次ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ－Ｔ中で１：２，０００に希釈して室温で１時間適用し、続いてＰＢＳ－Ｔで３回すすいだ。ｂｉｏ－ＡＡＶ、ｂｉｏ－Ｓｏｃ、およびＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチンは、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｂｃａｍ（登録商標）、ＵＫ）によって直接検出された。シグナルを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ＋システムおよびＩｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを製造者の説明書（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）に従って使用して、増強された化学発光基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（商標）、ＣＡ）で可視化した。
【0149】
例９
Ｔ４カプシドの標識
Ｔ４カプシドをアミン反応性Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）で標識するために、ペレット化したＴ４ヘッドを０．１ Ｍカルボナート緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌまで添加した。暗所で回転させながら室温で１時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のＰＢＳへの緩衝液交換を介して未結合色素を除去した。
Ｔ４カプシドの標識
Ｔ４カプシドをアミン反応性Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）で標識するために、ペレット化したＴ４ヘッドを０．１ Ｍカルボナート緩衝液、ｐＨ９．０に再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌまで添加した。暗所で回転させながら室温で１時間インキュベートした後、ｐＨ７．４のＰＢＳへの緩衝液交換を介して未結合色素を除去した。
【0150】
例１０
ＴＥＭ
Ｔ４－ＡＡＶ複合体を室温で５分間カーボングリッドに適用した。次いで、Ｇａｔａｎ（登録商標）ＣＰ３低温プランジャを使用して、グリッドを液体窒素中で凍結させた。Ｔ４、ＡＡＶ、およびＴ４－ＡＡＶ複合体の低温ＥＭ画像は、親切にもパデュー大学のＤｒ．Ｑｉａｎｇｌｉｎ Ｆａｎｇによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ顕微鏡を使用して収集された。この実験のためのＡＡＶ粒子は、フロリダ大学のＤｒ．Ｍａｖｉｓ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａによって提供された。
ＴＥＭ
Ｔ４－ＡＡＶ複合体を室温で５分間カーボングリッドに適用した。次いで、Ｇａｔａｎ（登録商標）ＣＰ３低温プランジャを使用して、グリッドを液体窒素中で凍結させた。Ｔ４、ＡＡＶ、およびＴ４－ＡＡＶ複合体の低温ＥＭ画像は、親切にもパデュー大学のＤｒ．Ｑｉａｎｇｌｉｎ Ｆａｎｇによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ顕微鏡を使用して収集された。この実験のためのＡＡＶ粒子は、フロリダ大学のＤｒ．Ｍａｖｉｓ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａによって提供された。
【0151】
例１１
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）、１×ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）および１％抗生物質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ（登録商標））（完全ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を８０～９０％集密で１：５の継代培養比で０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで継代し、３７℃および５％ ＣＯ２の加湿雰囲気でインキュベートした。
細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）、１×ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）および１％抗生物質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ（登録商標））（完全ＤＭＥＭ）中で培養した。細胞を８０～９０％集密で１：５の継代培養比で０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで継代し、３７℃および５％ ＣＯ２の加湿雰囲気でインキュベートした。
【0152】
例１２
細胞形質導入ならびに遺伝子およびタンパク質送達の検出
ＨＥＫ２９３細胞を、完全ＤＭＥＭにおいて２４ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ中、異なるＭＯＩでＡＡＶ、ｂｉｏ－ＡＡＶ、Ｔ４またはＴ４－ＡＡＶベクターと共に６時間インキュベートした。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを除去し、完全ＤＭＥＭと交換した。細胞を３７℃でさらに４８時間インキュベートした。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の発現を、形質導入の４８時間後に蛍光顕微鏡法（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって観察し、平均蛍光強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）で染色した。Ｔ４またはＴ４－ＡＡＶによる細胞へのルシフェラーゼ遺伝子送達を分析するために、本発明者らは、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）を用いて製造者の説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。簡潔に言うと、増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液ですすいだ。洗浄緩衝液を除去した後、１５０μｌの受動的溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を各ウェルに添加し、その後室温で２０分間穏やかに振盪した。次いで、２０マイクロリットルの細胞溶解物を９６ウェル白色不透明プレートに移し、８０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、発光シグナルをＧｌｏｍａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）によって記録した。β－ガラクトシダーゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、ＭＯ）を用いてＸ－Ｇａｌで染色することにより、細胞内のＴ４ヘッドに表示されるＳｏｃ－β－ｇａｌ酵素の活性を測定した。３回の測定を各群に適用した。
細胞形質導入ならびに遺伝子およびタンパク質送達の検出
ＨＥＫ２９３細胞を、完全ＤＭＥＭにおいて２４ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、抗生物質を含まないＯｐｔｉ－ＭＥＭ中、異なるＭＯＩでＡＡＶ、ｂｉｏ－ＡＡＶ、Ｔ４またはＴ４－ＡＡＶベクターと共に６時間インキュベートした。その後、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを除去し、完全ＤＭＥＭと交換した。細胞を３７℃でさらに４８時間インキュベートした。ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ導入遺伝子の発現を、形質導入の４８時間後に蛍光顕微鏡法（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって観察し、平均蛍光強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化した。核をＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）、ＭＡ）で染色した。Ｔ４またはＴ４－ＡＡＶによる細胞へのルシフェラーゼ遺伝子送達を分析するために、本発明者らは、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）を用いて製造者の説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。簡潔に言うと、増殖培地を除去し、細胞をＰＢＳ緩衝液ですすいだ。洗浄緩衝液を除去した後、１５０μｌの受動的溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を各ウェルに添加し、その後室温で２０分間穏やかに振盪した。次いで、２０マイクロリットルの細胞溶解物を９６ウェル白色不透明プレートに移し、８０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、発光シグナルをＧｌｏｍａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）によって記録した。β－ガラクトシダーゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）、ＭＯ）を用いてＸ－Ｇａｌで染色することにより、細胞内のＴ４ヘッドに表示されるＳｏｃ－β－ｇａｌ酵素の活性を測定した。３回の測定を各群に適用した。
【0153】
例１３
共局在化分析
Ｚｅｎ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を処理した。２色比較のための共局在化の程度を定量化するために、緑色および赤色チャネルで蛍光シグナルを表すピクセルの線形ピアソン（ｒｐ）および非線形スピアマンのランク（ｒｓ）相関係数を、ＩｍａｇｅＪ ＰＳＣプラグインを使用して計算した。
共局在化分析
Ｚｅｎ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を処理した。２色比較のための共局在化の程度を定量化するために、緑色および赤色チャネルで蛍光シグナルを表すピクセルの線形ピアソン（ｒｐ）および非線形スピアマンのランク（ｒｓ）相関係数を、ＩｍａｇｅＪ ＰＳＣプラグインを使用して計算した。
【0154】
例１４
細胞生存率アッセイ
４８時間のトランスフェクション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）を製造者の説明書に従って使用して細胞生存率を決定した。簡潔に言うと、等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェル中の細胞培養物に加えた。混合物を軌道振盪機上に２分間置いて細胞溶解を誘導し、次いで室温で１０分間インキュベートして発光シグナルを安定化し、これをＧｌｏｍａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）によって記録した。未処理細胞群の生存率を任意に１００％に設定し、各群に３回の測定を適用した。
細胞生存率アッセイ
４８時間のトランスフェクション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）を製造者の説明書に従って使用して細胞生存率を決定した。簡潔に言うと、等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を各ウェル中の細胞培養物に加えた。混合物を軌道振盪機上に２分間置いて細胞溶解を誘導し、次いで室温で１０分間インキュベートして発光シグナルを安定化し、これをＧｌｏｍａｘ Ｍｕｌｔｉ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、ＷＩ）によって記録した。未処理細胞群の生存率を任意に１００％に設定し、各群に３回の測定を適用した。
【0155】
例１５
インビボ生物発光画像化
インビボ生物発光画像化を以前に記載されたように行った１０。具体的には、５×１０１０個および２×１０１１個のＴ４またはＴ４－ＡＡＶ粒子をＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射した。投与後０．２５日目（ｄ）、０．５ｄ、１ｄ、２ｄ、５ｄ、１０ｄ、１５ｄ、３０ｄおよび６０ｄに、０．９％生理食塩水に溶解したルシフェラーゼ基質であるＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｕｌｔｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ（商標）、ＭＡ）３０μｇを腹腔内注射した。５分後、マウスを２％イソフルランで軽く麻酔し、ＩＶＩＳ ２００生物発光全身画像化ワークステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ（商標））に置いた。生物発光放出シグナルを、カメラ制御プログラム、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して定量化し、表面放射輝度の物理単位、ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの毎秒光子（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）で表示した。
インビボ生物発光画像化
インビボ生物発光画像化を以前に記載されたように行った１０。具体的には、５×１０１０個および２×１０１１個のＴ４またはＴ４－ＡＡＶ粒子をＢＡＬＢ／ｃマウスに筋肉内注射した。投与後０．２５日目（ｄ）、０．５ｄ、１ｄ、２ｄ、５ｄ、１０ｄ、１５ｄ、３０ｄおよび６０ｄに、０．９％生理食塩水に溶解したルシフェラーゼ基質であるＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｕｌｔｒａ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ（商標）、ＭＡ）３０μｇを腹腔内注射した。５分後、マウスを２％イソフルランで軽く麻酔し、ＩＶＩＳ ２００生物発光全身画像化ワークステーション（Ｃａｌｉｐｅｒ（商標））に置いた。生物発光放出シグナルを、カメラ制御プログラム、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して定量化し、表面放射輝度の物理単位、ステラジアン当たりの平方センチメートル当たりの毎秒光子（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）で表示した。
【0156】
例１６
マウス免疫化
すべての動物実験は、アメリカカトリック大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）およびテキサス大学医学部（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＴＸ）の動物実験委員会によって承認された。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、６～８週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＥ）を無作為にグループ分けし、７日間順応させ、その後、ベクターを用いて後肢に筋肉内免疫化した（０日目のプライミングおよび２１日目のブースティング）。擬免疫化マウス（ＰＢＳのみ）の一群を陰性対照として含めた。０日目（出血前）、１４日目、２１日目、３５日目、６０日目、１２０日目および１８０日目に各動物から血液を採取し、単離した血清を－８０℃で保存した。
マウス免疫化
すべての動物実験は、アメリカカトリック大学（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）およびテキサス大学医学部（Ｇａｌｖｅｓｔｏｎ，ＴＸ）の動物実験委員会によって承認された。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、６～８週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＥ）を無作為にグループ分けし、７日間順応させ、その後、ベクターを用いて後肢に筋肉内免疫化した（０日目のプライミングおよび２１日目のブースティング）。擬免疫化マウス（ＰＢＳのみ）の一群を陰性対照として含めた。０日目（出血前）、１４日目、２１日目、３５日目、６０日目、１２０日目および１８０日目に各動物から血液を採取し、単離した血清を－８０℃で保存した。
【0157】
例１７
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を、ウェルあたり、コーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中の０．１μｇのタンパク質で４℃にて一晩被覆した。ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ－３％ ＢＳＡ緩衝液で３７℃にて１時間プレートをブロッキングした。血清中の抗原特異的ＩｇＧ／Ｇ１／Ｇ２ａの濃度を、ＰＢＳ－１％ ＢＳＡにおける最初の１００倍希釈から始まる５倍希釈系列を使用して監視した。希釈した血清試料を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で５回洗浄した。次いで、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ二次抗体をＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａサブタイプに使用した、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を１：５，０００希釈で各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ－Ｔ緩衝液で５回洗浄した。次に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ）を、発色のために暗所で塗布した。１０分後、ＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ（ＫＰＬ）溶液を添加することによって酵素反応をクエンチし、ＥＬＩＳＡリーダー（ＶＥＲＳＡ ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって３０分以内に６５０ ｎｍでプレートを読み取った。エンドポイント力価を、アッセイの平均バックグラウンド（陰性血清）の２倍に等しいＯＤ６５０をもたらす試料希釈として提示した。血清中のＣＸＣＬ１３定量のために、マウスＣＸＣＬ１３ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用した。
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレート（Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ）を、ウェルあたり、コーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム－重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中の０．１μｇのタンパク質で４℃にて一晩被覆した。ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で３回洗浄した後、ＰＢＳ－３％ ＢＳＡ緩衝液で３７℃にて１時間プレートをブロッキングした。血清中の抗原特異的ＩｇＧ／Ｇ１／Ｇ２ａの濃度を、ＰＢＳ－１％ ＢＳＡにおける最初の１００倍希釈から始まる５倍希釈系列を使用して監視した。希釈した血清試料を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔ緩衝液で５回洗浄した。次いで、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ二次抗体をＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａサブタイプに使用した、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を１：５，０００希釈で各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ－Ｔ緩衝液で５回洗浄した。次に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＰＬ）を、発色のために暗所で塗布した。１０分後、ＴＭＢ ＢｌｕｅＳＴＯＰ（ＫＰＬ）溶液を添加することによって酵素反応をクエンチし、ＥＬＩＳＡリーダー（ＶＥＲＳＡ ｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって３０分以内に６５０ ｎｍでプレートを読み取った。エンドポイント力価を、アッセイの平均バックグラウンド（陰性血清）の２倍に等しいＯＤ６５０をもたらす試料希釈として提示した。血清中のＣＸＣＬ１３定量のために、マウスＣＸＣＬ１３ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用した。
【0158】
例１８
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ
ＡＬＰ生化学的パラメータを、Ｔ４、ＡＡＶ、またはＴ４－ＡＡＶで免疫化したマウスの血清で決定した。対照として未処理マウスを使用した。ＡＬＰレベルは、市販のＡＬＰアッセイキット（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）、ＭＤ）を製造者の説明書に従って使用して測定した。
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ
ＡＬＰ生化学的パラメータを、Ｔ４、ＡＡＶ、またはＴ４－ＡＡＶで免疫化したマウスの血清で決定した。対照として未処理マウスを使用した。ＡＬＰレベルは、市販のＡＬＰアッセイキット（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）、ＭＤ）を製造者の説明書に従って使用して測定した。
【0159】
例１９
マウスチャレンジ
順化マウスを、Ｔ４、ＡＡＶ、Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）またはＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶで後肢に筋肉内免疫した（０日目にプライミングおよび２１日目にブースティング）。０日目（出血前）および３５日目に免疫学的分析のために各動物から血清を収集した。４２日目に、マウスに２９５ ＬＤ５０のペスト菌ＣＯ９２細菌を鼻腔内チャレンジした４０。動物を監視し、死亡率、体重および体温について記録した。
マウスチャレンジ
順化マウスを、Ｔ４、ＡＡＶ、Ｆ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）またはＦ１ｍｕｔＶ－Ｔ４（ＨＡ４９００）－ＡＡＶで後肢に筋肉内免疫した（０日目にプライミングおよび２１日目にブースティング）。０日目（出血前）および３５日目に免疫学的分析のために各動物から血清を収集した。４２日目に、マウスに２９５ ＬＤ５０のペスト菌ＣＯ９２細菌を鼻腔内チャレンジした４０。動物を監視し、死亡率、体重および体温について記録した。
【0160】
例２０
統計
定量化されたすべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）提示されている。統計分析を両側スチューデントのｔ検定によって行った。２群間の有意差を＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．０１で示す。
統計
定量化されたすべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ）提示されている。統計分析を両側スチューデントのｔ検定によって行った。２群間の有意差を＊ｐ＜０．０５または＊＊ｐ＜０．０１で示す。
【0161】
例２１
使用の有用性
治療有効量のハイブリッドベクターは、ＤＮＡおよびタンパク質送達ツールとして、または感染症、例えば、これらに限定されないがＣＯＶＩＤ、インフルエンザ、ＨＩＶ、炭疽およびペストに対するワクチン接種のために使用される。
使用の有用性
治療有効量のハイブリッドベクターは、ＤＮＡおよびタンパク質送達ツールとして、または感染症、例えば、これらに限定されないがＣＯＶＩＤ、インフルエンザ、ＨＩＶ、炭疽およびペストに対するワクチン接種のために使用される。
【0162】
投与経路
ＤＮＡ分子またはタンパク質を運ぶハイブリッドベクターの治療有効量を、様々な経路によって投与することができる。限定されないが、ＣＯＶＩＤ、インフルエンザ、ＨＩＶ、炭疽およびペストなどの感染性疾患を予防するための、対象へのワクチン接種の実施において、ハイブリッドベクターは、ハイブリッドベクターを有効量で生物学的に利用可能にする任意の形態または様式で投与することができる。例えば、化合物は、経口、吸入、または皮下、筋肉内、静脈内、経皮、鼻腔内、直腸、眼、局所、舌下、頬側、または他の経路によって投与することができる。
ＤＮＡ分子またはタンパク質を運ぶハイブリッドベクターの治療有効量を、様々な経路によって投与することができる。限定されないが、ＣＯＶＩＤ、インフルエンザ、ＨＩＶ、炭疽およびペストなどの感染性疾患を予防するための、対象へのワクチン接種の実施において、ハイブリッドベクターは、ハイブリッドベクターを有効量で生物学的に利用可能にする任意の形態または様式で投与することができる。例えば、化合物は、経口、吸入、または皮下、筋肉内、静脈内、経皮、鼻腔内、直腸、眼、局所、舌下、頬側、または他の経路によって投与することができる。
【0163】
ハイブリッドベクターを調製する当業者は、選択されたハイブリッドベクターの特定の特徴、治療される障害または状態、障害または状態の段階、および他の関連する状況に応じて適切な投与形態および投与様式を容易に選択することができる。
【0164】
医薬組成物
医薬組成物は、医薬分野で周知の方法で調製され、医薬組成物は、１つ以上のＤＮＡ分子およびタンパク質を運ぶハイブリッドベクターの組成物の治療有効量を含む。担体または賦形剤は、活性成分のためのビヒクルまたは媒体として機能することができる固体、半固体または液体材料であり得る。適切な担体または賦形剤は、当技術分野で周知である。
医薬組成物は、医薬分野で周知の方法で調製され、医薬組成物は、１つ以上のＤＮＡ分子およびタンパク質を運ぶハイブリッドベクターの組成物の治療有効量を含む。担体または賦形剤は、活性成分のためのビヒクルまたは媒体として機能することができる固体、半固体または液体材料であり得る。適切な担体または賦形剤は、当技術分野で周知である。
【0165】
医薬組成物は、経口または非経口に適合させることができ、錠剤、糖衣錠、カプセル、遅延放出硬質カプセル、軟質ゲル、チュアブル錠、ガム状、注射液、カプレット、粉末、顆粒、シロップ、エアロゾル、吸入剤、坐剤、溶液、懸濁液、組成物を含むカテーテル、組成物を含むシリンジ、組成物を含むインプラント、経皮パッチなどの剤形で対象に投与することができる。
【0166】
一例では、本明細書に開示される組成物は、図４４に示すような軟質ゲルの剤形で製剤化され得る。本明細書に開示される組成物は、図４５に示されるような硬質カプセルの剤形で製剤化され得る。本明細書に開示される組成物はまた、硬質カプセルの剤形で製剤化され得、組成物中のそれぞれ異なる化合物が別様に被覆される（図４６）。
【0167】
別の例では、本明細書に開示される組成物は、図４７に示すような錠剤の剤形で製剤化され得る。本明細書中に開示される組成物を含む錠剤は、図４８に示されるようなチュアブル錠であり得る。本明細書に開示される組成物は、図４９に示されるようなカプレット中に製剤化され得る。本明細書に開示される組成物を含むカプレットは、図５０に示すように、コアおよびシェルなどの２つ以上の部分を含む徐放性カプレットとして製剤化されてもよく、コアはシェル内にある。
【0168】
経口投与のための剤形の上記の例に加えて、開示される組成物はまた、注射などによって対象の身体に送達されてもよい。組成物は、注射液の剤形に製剤化され、対象の体内に注射するために、注射用の装置（例えば、シリンジ）に充填され得る。図５１は、注射用薬物送達装置（５１１２）と、注射液の剤形の本明細書に開示される組成物（５１１４）とを含む治療送達装置（５１１０）の図である。本明細書に開示される組成物は、注射によって対象の皮膚（５１２０）を通して送達され、対象の体内（５１２２）に入ることができる。選択の実施形態では、注射用薬物送達装置は、対象の身体の外側（５１２４）に留まることができる。
【0169】
図５１は、組成物を対象の体内に送達するための１つの例示的な実施形態を表すにすぎない。送達器具は、シリンジ型装置に限定されなくてもよい。当業者は、開示された生成物または薬剤の患者の身体への送達に適した任意の注射用装置が本発明の態様に従って利用され得ることを容易に理解するであろう。
【0170】
いくつかの例では、本明細書に開示される組成物は、経皮パッチなどを介して対象の体内に送達され得る。図５２は、本明細書に開示される組成物を含む経皮パッチ５２１４を示す。経皮パッチ５２１４は、対象の皮膚５２１２上に配置するための接着剤パッチと、接着剤パッチに埋め込まれた１つ以上の活性層とを含むことができ、１つ以上の活性層は、治療有効量で本明細書に開示される組成物を含む。経皮パッチ５２１４を対象の身体に配置して、接着剤パッチに埋め込まれた組成物を対象の血流中に送達させることができる。
【0171】
いくつかの例では、図５３に示すように、経皮パッチ５３００において治療有効量のハイブリッドベクターの組成物は、１つ以上の活性層（例えば、５３１２および５３１４）に製剤化され、不透過性裏打ち層５３１０の下に埋め込まれる。図５２および図５３は、開示された組成物の経皮パッチを介した対象の体内への例示的な送達の単なる例証的表示である。当業者は、本発明に記載される開示された生成物を送達するのに適した任意の種類の経皮パッチが利用され得ることを容易に理解するであろう。
【0172】
用量
組成物を、あらゆる潜在的な毒性または他の望ましくない効果を最小限に抑えながら、慣例的な試験によって規定された適切な投与量で使用して、最適な薬理学的効果を得ることができる。
組成物を、あらゆる潜在的な毒性または他の望ましくない効果を最小限に抑えながら、慣例的な試験によって規定された適切な投与量で使用して、最適な薬理学的効果を得ることができる。
【0173】
有効量は、当業者である主治医によって、従来の技術を使用することによって、および類似の状況下で得られた結果を観察することによって、容易に決定することができる。有効量、ハイブリッドベクターの用量の決定において、いくつかの因子が主治医によって考慮され、これには、限定されないが、投与されるべきベクター；種－そのサイズ、年齢、および全般的な健康状態；関与する特定の障害；障害の関与の程度または重症度；個々の対象の応答；投与様式；投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性；選択された用量レジメン；他の併用薬の使用；および他の関連状況が含まれる。
【0174】
投与される特定の用量は、各々の状況を取り巻く特定の状況によって決定され得る。これらの状況には、投与経路、レシピエントの過去の病歴、治療される症状、治療される症状の重症度、およびレシピエントの年齢が含まれ得る。レシピエント対象の主治医は、関連する状況を考慮して投与される治療用量を決定すべきである。
【0175】
また、正確な用量は、レシピエントを「用量滴定する」という医療分野の標準的な慣行に従って決定され得ることが理解されるべきである。すなわち、最初に低用量の化合物を投与し、所望の治療効果が観察されるまで用量を徐々に増加させる。
【0176】
投薬レジメンは様々な因子に従って選択され得ることが、さらに理解されるべきである。これらには、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別、食事および医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；対象の腎臓および肝臓の機能；投与時間；排泄速度；使用される特定のハイブリッドベクターが含まれる。当業者の主治医は、治療されている疾患または障害の進行を予防、対抗または停止するために必要な薬物の有効量を容易に決定および処方することができる。
【0177】
一例では、この生成物は、１日１回の投与および／または１日複数回の投与の１つまたは複数から選択される投与間隔を有する連続スケジュールに従って投与するために使用され得る。一実施形態では、この生成物は、それを慢性的に必要とする対象に投与され得る。
【0178】
本発明は、本発明を実施するために企図される本明細書に開示された特定の実施形態に限定されず、本発明は特許請求の範囲内に入るすべての実施形態を含むことが意図される。
【0179】
本出願で引用されたすべての文書、特許、雑誌論文および他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0180】
本発明の多くの特徴および利点は、詳細な明細書から明らかであり、したがって、添付の特許請求の範囲によって、本発明の真の精神および範囲内に入る本発明のすべてのそのような特徴および利点を網羅することが意図される。さらに、多数の修正および変形が当業者には容易に思い浮かぶであろうから、本発明を図示および説明された厳密な構成および動作に限定することは望ましくなく、したがって、すべての適切な修正および等価物を本発明の範囲内に向かわせ、その中に入れることができる。
参考文献
参考文献
【0181】
本出願で引用されたすべての文書、特許、雑誌論文および他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0182】
本発明は、特定の実施形態を参照して開示されているが、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の領域および範囲から逸脱することなく、記載された実施形態に対する多くの修正、改変、および変更が可能である。したがって、本発明は、記載された実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有することが意図される。
【配列表フリーテキスト】
【0183】
配列表１ ＜２２３＞合成プライマー：ＦＷ１
配列表２ ＜２２３＞合成プライマー：ＦＷ２
配列表３ ＜２２３＞合成プライマー：ＲＷ
配列表４ ＜２２３＞合成プライマー：ＡＮ－Ｆ
配列表５ ＜２２３＞合成プライマー：ＨＤ－ＡＮ－Ｒ
配列表６ ＜２２３＞合成プライマー：ＨＤ－ＡＮ－Ｆ
配列表７ ＜２２３＞合成プライマー：ＡＮ－Ｒ
配列表８ ＜２２３＞合成：ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）
配列表２ ＜２２３＞合成プライマー：ＦＷ２
配列表３ ＜２２３＞合成プライマー：ＲＷ
配列表４ ＜２２３＞合成プライマー：ＡＮ－Ｆ
配列表５ ＜２２３＞合成プライマー：ＨＤ－ＡＮ－Ｒ
配列表６ ＜２２３＞合成プライマー：ＨＤ－ＡＮ－Ｆ
配列表７ ＜２２３＞合成プライマー：ＡＮ－Ｒ
配列表８ ＜２２３＞合成：ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-04-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のウイルスベクター；第２のウイルスベクター；および
第１のウイルスベクターを第２のウイルスベクターに連結する架橋を含む生成物であって、
前記生成物が、ハイブリッドウイルスベクターであり、ハイブリッドウイルスベクターの形で宿主対象または宿主細胞に感染する能力を有する、生成物。
【請求項2】
前記第１のウイルスベクターが、ラムダファージ、バチルスファージＰｈｉ２９、大腸菌ファージＴ２、Ｔ３およびＴ７、腸内細菌ファージＰ２２、ファージＳＰＰ１、ヘルペスウイルスならびにアデノウイルスからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項3】
前記第２のウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項4】
前記架橋が、ＳＢＡ、およびＨＢＢＡからなる群から選択される、請求項１記載の生成物。
【請求項5】
前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項6】
前記ＤＮＡが二本鎖である、請求項５記載の生成物。
【請求項7】
前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項8】
前記核酸が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される、請求項７記載の生成物。
【請求項9】
前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の二本鎖ＤＮＡ分子と、前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子とをさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項10】
前記第１のウイルスベクターの表面に表示される１つ以上の非ウイルスタンパク質をさらに含む、請求項１記載の生成物。
【請求項11】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞に核酸を送達する、請求項１記載の生成物。
【請求項12】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞に非ウイルスタンパク質を送達する、請求項１０記載の生成物。
【請求項13】
Ｔ４ヘッドカプシド；ビオチン化ＡＡＶ；および
ビオチン－アビジン架橋を含む生成物であって、
前記ビオチン－アビジン架橋が、Ｓｏｃ－ビオチン－アビジン（ＳＢＡ）またはＨｏｃ－ＢＡＰ－ビオチン－アビジン（ＨＢＢＡ）であり；
前記架橋のアビジンがビオチン化ＡＡＶ上のビオチンに結合し、ＨｏｃまたはＳｏｃがＴ４に結合する、生成物。
【請求項14】
前記Ｔ４にパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１３記載の生成物。
【請求項15】
前記ＤＮＡが二本鎖である、請求項１４記載の生成物。
【請求項16】
ＡＡＶにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１３記載の生成物。
【請求項17】
前記ＤＮＡが一本鎖である、請求項１６記載の生成物。
【請求項18】
Ｔ４にパッケージされた１つ以上の二本鎖ＤＮＡ分子と、ＡＡＶにパッケージされた１つ以上の一本鎖ＤＮＡ分子とをさらに含む、請求項１３記載の生成物。
【請求項19】
前記Ｔ４の表面に表示される１つ以上の非ウイルスタンパク質をさらに含む、請求項１３記載の生成物。
【請求項20】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞にＤＮＡを送達する、請求項１３記載の生成物。
【請求項21】
生物学的検体の細胞に曝露されると、前記生物学的検体の前記細胞に非ウイルスタンパク質を送達する、請求項１９記載の生成物。
【請求項22】
第１のウイルスベクター；前記第１のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上のＤＮＡ分子；
第２のウイルスベクター；
前記第２のウイルスベクターにパッケージされた１つ以上の核酸分子、および
前記第２のウイルスベクターを前記第１のウイルスベクターに連結する架橋を含む生成物であって、
前記生成物が、ハイブリッドウイルスベクターであり、ハイブリッドウイルスベクターの形で宿主対象または宿主細胞に感染する能力を有する、生成物。
【請求項23】
前記第１のウイルスベクターにパッケージされた前記ＤＮＡ分子が、前記第２のウイルスベクターにパッケージされた前記核酸分子と同じである、請求項２２記載の生成物。
【請求項24】
前記ＤＮＡ分子が二本鎖である、請求項２３記載の生成物。
【請求項25】
前記核酸分子が、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される、請求項２２記載の生成物。
【請求項26】
ＳＢＡまたはＨＢＢＡ架橋を構築すること；前記架橋のＳｏｃまたはＨｏｃ末端をＴ４に結合させること；
ＡＡＶをビオチン化すること；および
前記架橋のアビジン末端をＡＡＶに結合することを含む方法であって、
前記ＳＢＡ架橋が、Ｓｏｃ、ビオチンおよびアビジンを順次接続して構築され、
前記ＨＢＢＡ架橋が、Ｈｏｃ、ビオチン受容体ペプチド（ＢＡＰ）、ビオチンおよびアビジンを順次接続して構築される、方法。
【請求項27】
架橋を設計すること；前記架橋の一端を第１のウイルスベクターに結合させること；および
前記架橋の他端を第２のウイルスベクターに結合することを含む方法であって、
結果として生じる生成物が、ハイブリッドウイルスベクターであり、ハイブリッドウイルスベクターの形で宿主対象または宿主細胞に感染する能力を有する、方法。
【国際調査報告】