特表 2022-539037 子宮内膜のｍｉＲＮＡ受容性分析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-07

(54)【発明の名称】子宮内膜のｍｉＲＮＡ受容性分析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20220831BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20220831BHJP

   G16B 25/10 20190101ALI20220831BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220831BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20220831BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20220831BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALN20220831BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68 ZNA

C12Q1/6876 Z

G16B25/10

C12N15/113 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6813 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2021576586

(86)(22)【出願日】2020-07-01

(85)【翻訳文提出日】2021-12-23

(86)【国際出願番号】 CN2020099781

(87)【国際公開番号】W WO2021000893

(87)【国際公開日】2021-01-07

(31)【優先権主張番号】62/869,574

(32)【優先日】2019-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522318232

【氏名又は名称】英▲てい▼生物科技股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(72)【発明者】

【氏名】康 詩▲チン▼

(72)【発明者】

【氏名】陳 偉銘

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

(57)【要約】

開示は、女性からのサンプル、例えば、子宮内膜の生検を使用して子宮内膜の状態を判断する方法に関しており、（ａ）女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイルを判断することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する、１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）例えば、コンピューターベースのアルゴリズムを使用して、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することとを含む。開示の態様は、さらに、方法を実施することに適したキット、および診断および治療目的のためのキットの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

子宮内膜の状態を判断する方法であって、
（ａ）女性の前記子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイルを判断することであって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、
（ｂ）前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することであって、前記受容性予測スコアは、前記女性の前記子宮内膜の状態を分類し、前記子宮内膜の状態は、受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態を含み、前記複数のｍｉＲＮＡは、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する、少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含むこととを備える方法。

【請求項2】

請求項１の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、前記女性の子宮腔から取得される方法。

【請求項3】

請求項１または請求項２の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、子宮内膜の生検、子宮内膜の洗浄、またはその組み合わせを含む方法。

【請求項4】

請求項１乃至３のいずれか一項の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、（ｉ）前記女性の内因性黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急増後７日間または（ｉｉ）前記女性のプロゲステロン投与後５日間取得される方法。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか一項の方法であって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャ技術により判断される方法。

【請求項6】

請求項５の方法であって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、前記子宮内膜サンプルの前記ｍｉＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ製剤において実施されたｑＰＣＲにより判断される方法。

【請求項7】

請求項６の方法であって、前記ｃＤＮＡ合成は、以下の一般式：５’－Ｒ－（ｄＴ）ｎＶＮ－３’で表されるヌクレオチド配列を有するユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施され、Ｒは配列番号：１６８を含み、（ｄＴ）ｎはｎ個の連続したチミン残基であり、ｎは１９であり、Ｖはアデニン残基、グアニン残基、またはシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基、またはチミン残基である方法。

【請求項8】

請求項１乃至７のいずれか一項の方法であって、前記受容性予測スコアは、コンピューターベースのアルゴリズムにより作成され、

【数1】

の方程式を使用して計算された値であり、βは係数のベクトルであり、εは誤差である方法。

【請求項9】

請求項８の方法であって、前記コンピューターベースのアルゴリズムは、以下のステップ：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証の１以上を実施することにより確立される方法。

【請求項10】

請求項８または請求項９の方法であって、１より大きい受容性予測スコアは、前記受容期前の状態を示し、－１未満の受容性予測スコアは、前記受容期後の状態を示し、－１から１の受容性予測スコアは、前記受容期の状態を示す方法。

【請求項11】

請求項１乃至１０のいずれか一項の方法であって、前記子宮内膜の状態が前記受容期前の状態または前記受容期後の状態であると判断された場合、さらに、少なくとも一度または前記子宮内膜の状態が前記受容期の状態であると判断されるまで、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すことを備える方法。

【請求項12】

請求項１乃至１１のいずれか一項の方法であって、前記女性は、着床不全を患っているまたは患っていた方法。

【請求項13】

請求項１乃至１２のいずれか一項の方法であって、前記女性は、体外受精（ＩＶＦ）治療を受けている方法。

【請求項14】

請求項１３の方法であって、前記受容性予測スコアは、さらに、前記女性の前記ＩＶＦ治療に対する反応性を分類する方法。

【請求項15】

女性の胚着床に対する子宮内膜の受容性を検出する方法であって、
（ａ）前記女性の前記子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイルを判断することであって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、
（ｂ）前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することであって、前記受容性予測スコアは、前記女性が胚着床に対する子宮内膜の受容性を有するかを判断し、前記複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは配列番号：１－１６７の配列を有する少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含むこと、
とを備える方法。

【請求項16】

請求項１５の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、前記女性の子宮腔から取得される方法。

【請求項17】

請求項１５または請求項１６の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、子宮内膜の生検、子宮内膜の洗浄、またはその組み合わせを含む方法。

【請求項18】

請求項１５乃至１７のいずれか一項の方法であって、前記子宮内膜サンプルは、（ｉ）前記女性の内因性黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急増後７日間または（ｉｉ）前記女性のプロゲステロン投与後５日間取得される方法。

【請求項19】

請求項１５乃至１８のいずれか一項の方法であって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャ技術により判断される方法。

【請求項20】

請求項１９の方法であって、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、前記子宮内膜サンプルの前記ｍｉＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ製剤において実施されたｑＰＣＲにより判断される方法。

【請求項21】

請求項２０の方法であって、前記ｃＤＮＡ合成は、以下の一般式：５’－Ｒ－（ｄＴ）ｎＶＮ－３’で表されるヌクレオチド配列を有するユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施され、Ｒは配列番号：１６８を含み、（ｄＴ）ｎはｎ個の連続したチミン残基であり、ｎは１９であり、Ｖはアデニン残基、グアニン残基、またはシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基、またはチミン残基である方法。

【請求項22】

請求項１５乃至２１のいずれか一項の方法であって、前記受容性予測スコアは、コンピューターベースのアルゴリズムにより作成され、

【数2】

の方程式を使用して計算された値であり、βは係数のベクトルであり、εは誤差である方法。

【請求項23】

請求項２２の方法であって、前記コンピューターベースのアルゴリズムは、以下のステップ：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証の１以上を実施することにより確立される方法。

【請求項24】

請求項２２または請求項２３の方法であって、－１から１の受容性予測スコアは、前記女性が胚着床に対する子宮内膜の受容性を有することを示す方法。

【請求項25】

請求項１５乃至２４のいずれか一項の方法であって、前記女性は、着床不全を患っているまたは患っていた方法。

【請求項26】

キットであって、
（ａ）複数のｍｉＲＮＡを標的にする１以上のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）プロファイリングチップと、（ｂ）（ｉ）任意に１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを使用して、女性の子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断することと、（ｉｉ）コンピューターベースのアルゴリズムを使用して、前記ｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づき受容性予測スコアを取得することとに関する指示とを備え、ここで前記複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは配列番号：１－１６７の配列を有する少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含む、キット。

【請求項27】

請求項２６のキットであって、前記１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップは、前記複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの検出のためのプライマーを含むキット。

【請求項28】

請求項２７のキットであって、前記ｍｉＲＮＡプロファイリングチップは、前記複数のｍｉＲＮＡの前記発現レベルを検出するために、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャアッセイ、好ましくはｑＰＣＲを実施することに適しているキット。

【請求項29】

女性の子宮内膜の状態を判断するための請求項２７または請求項２８のキットの使用。

【請求項30】

請求項２９の使用であって、前記女性は、着床不全を患っているまたは患っていた、および／または体外受精（ＩＶＦ）治療を受けている使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年７月２日に出願された米国仮出願第６２／８６９，５７４号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

開示は、（ａ）複数のｍｉＲＮＡ、例えば、１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現プロファイル、および（ｂ）ｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づき女性の子宮内膜の状態を分類するコンピューターベースのアルゴリズムを使用して、女性の子宮内膜の受容性を判断する方法に関する。開示の態様は、さらに、方法を実施することに適したキット、および診断および治療目的のためのキットの使用に関する。いくつかの実施形態において、方法および／またはキットは、女性の体外受精（ＩＶＦ）治療に対する反応性を分類するために使用される。

【背景技術】

【0003】

ＩＶＦを含む生殖補助医療は、生殖が成功しないことに対処するための潜在的アプローチとして登場した。ＩＶＦの成功率の主要な要因は、子宮内膜の受容期の状態にある。子宮内膜は、着床のウィンドウ（ＷＯＩ）と呼ばれる比較的短期間にのみ受容期である。これは、通常、月経周期の１９－２１日頃に生じる。信頼性のない傾向にある、カレンダーアプローチに基づくだけではなく、より確実な方法で胚着床の機会を示すであろう、子宮内膜自体を直接検査することにより、子宮内膜の状態をモニタリングすることが長年のニーズである。

【0004】

ヒト子宮内膜は、タンパク質およびｍｉＲＮＡの両方により周期的に調節される組織である。ヒトゲノムは、２５００より多いｍｉＲＮＡを含み、その中には、生殖周期で役割を果たすものも見られる。例えば、最近の文献では、特定のｍｉＲＮＡがＷＯＩの確立および進行に関与している遺伝子の発現を調節することが証明された。

【0005】

従来、子宮内膜の状態を評価するため、組織学的方法および画像検査法が使用されてきた。しかし、それらは時間のかかり、しばしば子宮内膜の受容期の状態および受容不可能な状態を明確に区別することができないことが長く認識されてきた。遺伝子発現レベルの検査に基づく方法も開発されてきた。初期の研究は、少数の標識遺伝子を重要視した。Ｉｇｅｎｏｍｉｘは、子宮内膜の受容性に関与している特定の２３８の遺伝子のマイクロアレイに頼った、「子宮内膜着床能」（ＥＲＡ）検査を開発した。しかし、マイクロアレイベースのＥＲＡ検査には、ある欠点がある。例えば、マイクロアレイベースの遺伝子発現測定にはかなりの量の組織サンプルが必要となることが知られている。加えて、マイクロアレイ技術は、一般的に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）技術と比較すると特異性が低い。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ベースのＥＲＡ検査は、まだ登場したばかりである。

【0006】

従って、依然として、必要となる組織のインプットが少ない、および／または女性の子宮内膜の受容可能または受容不可能な状態についてより信頼性のある判断を提供する、子宮内膜の受容性を判断する方法の改善へのニーズがある。

【発明の概要】

【0007】

開示は、女性からのサンプル、例えば、子宮内膜の生検を使用して子宮内膜の受容性を判断する方法に関しており、（ａ）女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する、１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することであって、受容性予測スコアは、女性の子宮内膜の受容性の状態を判断することとを含む。開示の態様は、さらに、方法を実施することに適したキット、および女性の子宮内膜の状態を判断するためのキットの使用に関する。

【0008】

本開示の特定の実施形態は、以下の段落に要約される。このリストは、例示のみであり、本開示により提供される実施形態の全てを網羅してはいない。

【0009】

実施形態１． 子宮内膜の状態を判断する方法であって、（ａ）女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することであって、受容性予測スコアは、女性の子宮内膜の状態を分類し、子宮内膜の状態は、受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態を含み、複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは配列番号：１－１６７の配列を有する少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含むこととを備える。

【0010】

実施形態２． 実施形態１の方法であって、子宮内膜サンプルは、女性の子宮腔から取得される。

【0011】

実施形態３． 実施形態１または実施形態２の方法であって、子宮内膜サンプルは、子宮内膜の生検、子宮内膜の洗浄、またはその組み合わせを含む。

【0012】

実施形態４． 実施形態１乃至３のいずれか一つの方法であって、子宮内膜サンプルは、（ｉ）女性の内因性黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急増後７日間または（ｉｉ）女性のプロゲステロン投与後５日間取得される。

【0013】

実施形態５． 実施形態１乃至４のいずれか一つの方法であって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、ｑＰＣＲ、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャ技術により判断される。

【0014】

実施形態６． 実施形態５の方法であって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ製剤において実施されたｑＰＣＲにより判断される。

【0015】

実施形態７． 実施形態６の方法であって、ｃＤＮＡ合成は、以下の一般式：５’－Ｒ－（ｄＴ）ｎＶＮ－３’で表されるヌクレオチド配列を有するユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施され、Ｒは配列番号：１６８を含み、（ｄＴ）ｎはｎ個の連続したチミン残基であり、ｎは１９であり、Ｖはアデニン残基、グアニン残基、またはシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基、またはチミン残基である。

【0016】

実施形態８． 実施形態１乃至７のいずれか一つの方法であって、受容性予測スコアは、コンピューターベースのアルゴリズムにより作成され、

【数1】

の方程式を使用して計算された値であり、βは係数のベクトルであり、εは誤差である。

【0017】

実施形態９． 実施形態８の方法であって、コンピューターベースのアルゴリズムは、以下のステップ：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証の１以上を実施することにより確立される。

【0018】

実施形態１０． 実施形態８または実施形態９の方法であって、１より大きい受容性予測スコアは、受容期前の状態を示し、－１未満の受容性予測スコアは、受容期後の状態を示し、－１から１の受容性予測スコアは、受容期の状態を示す。

【0019】

実施形態１１． 実施形態１乃至１０のいずれか一つの方法であって、子宮内膜の状態が受容期前の状態または受容期後の状態であると判断された場合、さらに、少なくとも一度または子宮内膜の状態が受容期の状態であると判断されるまで、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すことを備える。

【0020】

実施形態１２． 実施形態１乃至１１のいずれか一つの方法であって、女性は、着床不全を患っているまたは患っていた。

【0021】

実施形態１３． 実施形態１乃至１２のいずれか一つの方法であって、女性は、ＩＶＦ治療を受けている。

【0022】

実施形態１４． 実施形態１３の方法であって、受容性予測スコアは、さらに、女性のＩＶＦ治療に対する反応性を分類する。

【0023】

実施形態１５． 女性の胚着床に対する子宮内膜の受容性を検出する方法であって、（ａ）女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施して子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析して受容性予測スコアを取得することであって、受容性予測スコアは、女性が胚着床に対する子宮内膜の受容性を有するかを判断し、複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは、配列番号：１－１６７の配列を有する少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含むこととを備える。

【0024】

実施形態１６． 実施形態１５の方法であって、子宮内膜サンプルは、女性の子宮腔から取得される。

【0025】

実施形態１７． 実施形態１５または実施形態１６の方法であって、子宮内膜サンプルは、子宮内膜の生検、子宮内膜の洗浄、またはその組み合わせを含む。

【0026】

実施形態１８． 実施形態１５乃至１７のいずれか一つの方法であって、子宮内膜サンプルは、（ｉ）女性の内因性黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急増後７日間または（ｉｉ）女性のプロゲステロン投与後５日間取得される。

【0027】

実施形態１９． 実施形態１５乃至１８のいずれか一つの方法であって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、ｑＰＣＲ、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャ技術により判断される。

【0028】

実施形態２０． 実施形態１９の方法であって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ製剤において実施されたｑＰＣＲにより判断される。

【0029】

実施形態２１． 実施形態２０の方法であって、ｃＤＮＡ合成は、以下の一般式：５’－Ｒ－（ｄＴ）ｎＶＮ－３’で表されるヌクレオチド配列を有するユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施され、Ｒは配列番号：１６８を含み、（ｄＴ）ｎはｎ個の連続したチミン残基であり、ｎは１９であり、Ｖはアデニン残基、グアニン残基、またはシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基、またはチミン残基である。

【0030】

実施形態２２． 実施形態１５乃至２１のいずれか一つの方法であって、受容性予測スコアは、コンピューターベースのアルゴリズムにより作成され、

【数2】

の方程式を使用して計算された値であり、βは係数のベクトルであり、εは誤差である。

【0031】

実施形態２３． 実施形態２２の方法であって、コンピューターベースのアルゴリズムは、以下のステップ：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証の１以上を実施することにより確立される。

【0032】

実施形態２４． 実施形態２２または実施形態２３の方法であって、－１から１の受容性予測スコアは、女性が胚着床に対する子宮内膜の受容性を有することを示す。

【0033】

実施形態２５． 実施形態１５乃至２４のいずれか一つの方法であって、女性は、着床不全を患っているまたは患っていた。

【0034】

実施形態２６． キットであって、（ａ）複数のｍｉＲＮＡを標的にする１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップと、（ｂ）（ｉ）任意に１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを使用して、女性の子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断することと、（ｉｉ）コンピューターベースのアルゴリズムを使用して、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づき受容性予測スコアを取得することとに関する指示とを備え、複数のｍｉＲＮＡは、それぞれ、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡ、および好ましくは配列番号：１－１６７の配列を有する少なくとも１６７のｍｉＲＮＡを含む。

【0035】

実施形態２７． 実施形態２６のキットであって、１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの検出のためのプライマーを含む。

【0036】

実施形態２８． 実施形態２７のキットであって、ｍｉＲＮＡプロファイリングチップは、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出するために、ｑＰＣＲ、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャアッセイ、好ましくはｑＰＣＲを実施することに適している。

【0037】

実施形態２９． 女性の子宮内膜の状態を判断するための実施形態２７または実施形態２８のキットの使用。

【0038】

実施形態３０． 実施形態２９の使用であって、女性は、着床不全を患っているまたは患っていた、および／またはＩＶＦ治療を受けている。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】自然な周期またはホルモン補充療法周期における女性の子宮内膜の状態を示す。ＬＨ＋５：女性の内因性黄体形成ホルモン（ＬＨ）の急増後５日間；ＬＨ＋７：女性の内因性ＬＨの急増後７日間；およびＬＨ＋９：女性の内因性ＬＨの急増後９日間。Ｐ＋３：女性のプロゲステロン投与後３日間；Ｐ＋５：女性のプロゲステロン投与後５日間；およびＰ＋７：女性のプロゲステロン投与後７日間。

【図2】本開示にかかる１６７のｍｉＲＮＡを標的とするＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐを使用した、子宮内膜の受容性テストのワークフローを示す。

【図3】どのようにコンピューターベースのアルゴリズム（ＭＩＲＡ Ｍｏｄｅｌ）が構築され、どのようにＭＩＲＡ Ｍｏｄｅｌがテスト結果を作成するかのプロセスを示す。

【図4A】子宮内膜の状態を３つの状態：受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態の１つに分類する、子宮内膜受容性の例示の分析を示す。

【図4B】３つの受容的状態の下に分類された女性の例示の着床結果を示す。

【図5】１８３の子宮内膜サンプルからの１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むｍｉＲＮＡ発現プロファイルを使用した、１０分割交差検証および妊娠率を示す。ＳＥＮ：感度＝真陽性／（真陽性＋偽陰性）；ＳＰＥ：特異性＝真陰性／（真陰性＋偽陽性）；ＰＰＶ：精度または陽性予測値＝真陽性／（真陽性＋偽陽性）；およびＮＰＶ：陰性予測値＝真陰性／（真陰性＋偽陰性）。Ｐ＋６：子宮内膜が受容期前の状態にあるとあらかじめ判断された女性のプロゲステロン投与後６日間の胚着床；Ｐ＋５：子宮内膜が受容期の状態にあるとあらかじめ判断された女性のプロゲステロン投与後５日間の胚着床；およびＰ＋４．５：子宮内膜が受容期後の状態にあるとあらかじめ判断された女性のプロゲステロン投与後４．５日間（すなわち、１０８時間）の胚着床。

【図6】受容性予測スコアの値によって、子宮内膜サンプルを３つの状態：受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態の１つに分類する、ＭＩＲＡ採点システムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本明細書において説明される開示および実施形態は、例示のみと解釈され、発明の範囲を限定するものではない。本明細書において特定の用語が使用されているが、特に断りのない限り、それらは総称および記述的な意味でのみ使用され、制限を目的としていない。

【0041】

定義

【0042】

本明細書において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を示す場合を除き、複数形も含むことを意図している。

【0043】

用語「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素を使用してＲＮＡ製剤に逆転写を実施することにより生成される相補的ＤＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ製剤は、子宮内膜の組織サンプルから抽出されるｍｉＲＮＡを含む。例１参照。

【0044】

用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｈａｖｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」は、無制限の連結動詞である。「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」のような、これらの動詞の１以上の任意の形式または時制も、無制限である。例えば、１以上のステップを「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｈａｓ」または「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」）任意の方法は、それらの１以上のステップのみを持つことに制限されず、他の列挙されていないステップも含めることできる。同様に、１以上の特性を「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、」「ｈａｓ」または「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」）任意の組成またはキットは、それらの１以上の特性のみを持つことに制限されず、他の列挙されていない特性も含めることできる。本明細書における特定の実施形態に関して提供される任意のおよび全ての例、または例示の言葉（例えば、「ｓｕｃｈ ａｓ」）の使用は、単に本開示の理解をより容易にすることを意図しており、他で請求される本開示の範囲に制限を与えるものではない。

【0045】

用語「ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（発現）」は、女性の生体サンプル、例えば、子宮内膜の組織サンプルのＲＮＡ分子の転写および／または蓄積を指す。これに関連して、用語「ｍｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｍｉＲＮＡ発現）」は、生体サンプルの１以上のｍｉＲＮＡの量を指し、ｍｉＲＮＡ発現は、当技術分野で周知の適切な方法を使用することにより検出されうる。例えば、例１参照。

【0046】

用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）」または「ｍｉＲＮＡ」は、内在性遺伝子に由来する、おおよそ１８から２５のヌクレオチド長鎖型ノンコーディングＲＮＡのクラスを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解または翻訳阻害に対する、それらの標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）への塩基対合により、遺伝子発現の転写後調節因子として機能する。

【0047】

用語「ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（核酸）」、「ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ヌクレオチド）」および「ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ポリヌクレオチド）」は、言い換え可能に使用され、単鎖または二本鎖形式いずれかにおけるＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを指す。特に断りのない限り、これらの用語は、基準核酸として同様の結合特性を有し、自然に発生するヌクレオチドと同様の方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含むポリヌクレオチドを包含する。

【0048】

用語「ｐｒｉｍｅｒ（プライマー）」は、プライマー伸長物の合成が誘発される条件下、例えば、ヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼのような重合誘発剤の存在下で、適切な温度、ｐＨ、金属イオン濃度、および塩濃度で置かれた場合、相補的核酸の鎖の合成を開始するように作用するオリゴヌクレオチドを指す。

【0049】

用語「ｐｒｏｂｅ（プローブ）」は、標的核酸分析物（例えば、核酸増幅産物）に存在している核酸配列に相補的な核酸配列を含む、ポリヌクレオチドを含む構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチド類似体で構成されてもよい。プローブは、一般的に、標的核酸の標的配列の全てまたは一部の特定の検出におけるそれらの使用に対応している長さを持つ。

【0050】

用語「ｑＰＣＲ」または「ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ（定量ＰＣＲ）」は、標的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを同時に増幅させ、定量化するための、ポリメラーゼ連鎖反応を使用した実験的方法を指す。定量化は、（例えば、ＳＹＢＲ(R)グリーンの蛍光色素またはＴａｑｍａｎプローブの蛍光レポーターオリゴヌクレオチドプローブを含む）複数の化学物質を使用して実施され、リアルタイムの定量化は、１以上の増幅周期後の反応における増幅ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを測定することにより実施される。

【0051】

用語「ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（標的とする）」は、対象の核酸配列にハイブリッド形成する適切なヌクレオチド配列の選択を指す。いくつかの実施形態において、対象の核酸配列は、配列番号：１－１６７の任意の１つの配列を有するｍｉＲＮＡを含む。例１参照。

【0052】

子宮内膜の状態を判断する方法の概観

【0053】

子宮内膜の受容性は、女性の子宮内膜が胚着床のために準備している状態である。これは、ＷＯＩと呼ばれる期間に全て月経周期で生じる。図１に示されるように、自然な周期において、排卵はＬＨの急増後に生じ、ＷＯＩはＬＨの急増後７日間程度である（ＬＨ＋７）。ホルモン補充療法周期において、ＷＯＩは、プロゲステロン投与後５日間程度である（Ｐ＋５）。これらの推定により、子宮内膜の受容性に関する確からしい情報がもたらされる。しかし、子宮内膜の状態についての最終回答は、子宮内膜自体の検査によってのみ提供されうる。

【0054】

その目的に向けて、子宮内膜サンプルは、ホルモン補充療法周期におけるプロゲステロン投与後５日間（Ｐ＋５）または自然な周期における内因性ＬＨの急増後７日間（ＬＨ＋７）のいずれかに、女性の子宮腔から採取されうる。サンプルは、続いて、子宮内膜の受容性状態を分析する分子診断ツールの対象となる。本開示にかかる子宮内膜の状態を判断する方法においては、分子診断ツールにより、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルが分析される。

【0055】

図２に示されるように、本開示は、（ａ）子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断するため、子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）受容性予測スコアを取得するため、コンピューターベースのアルゴリズムでｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析することであって、受容性予測スコアは、子宮内膜の状態を受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態に分類することとを含む、子宮内膜の状態を判断する方法を提供する。

【0056】

受容期前の状態は、子宮内膜が胚を受け取る準備がまだできていないことを示し、この時点の胚着床は早過ぎるかもしれない。受容期の状態（ＷＯＩ）は、子宮内膜が胚着床に最適な時期にあることを示す。受容期後の状態は、子宮内膜が既に胚着床に最適な段階を過ぎたことを示す。

【0057】

子宮内膜の受容性を判断するためのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの分析

【0058】

本開示は、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断する。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、または２００のｍｉＲＮＡの発現レベルを含み、それらの全ては、子宮内膜の受容性の調整に関わるかもしれない。好適な実施形態において、本開示は、その発現レベルが子宮内膜の受容性の調整に関わっている１６７のｍｉＲＮＡの選択を提供する。例１参照。これらの１６７のｍｉＲＮＡは、まず、Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙデータベースから生殖の疾患に関与している遺伝子を識別し、続いて、ｍｉＲＴＡＲＢａｓｅ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、およびｍｉＲＤＢを使用して潜在的な調節因子ｍｉＲＮＡを選択することにより選ばれた。

【0059】

子宮内膜の状態を判断するため、本開示にかかる方法は、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断するためのアッセイを実施することを含み、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、表１に示される、１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含む。

【0060】

１６７のｍｉＲＮＡの名称および配列

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【0061】

ｍｉＲＮＡの発現レベルは、当技術分野で周知の定量法で分析されうる。いくつかの実施形態において、分析を促進するため、これらの１６７のｍｉＲＮＡを標的とする１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップが使用されうる。例えば、例１において、これらの１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを分析するため、２つのｍｉＲＮＡプロファイリングチップが設計および開発される。いくつかの実施形態において、１以上のチップは、さらに、特定のＲＮＡ配列、例えば、ｍｉＲＮＡ発現分析のための内在性コントロールとして使用されうる、１８ｓ ｒＲＮＡを標的とする。例１参照。

【0062】

本開示は、子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断する方法を提供する。方法は、一般的に、（ｉ）女性の子宮腔から子宮内膜サンプルを取得するまたは取得したことと、（ｉｉ）子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断するためのアッセイを実施することとを含み、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、子宮内膜サンプルは、例えば、子宮内膜から小さな生検を取得することにより、侵襲的な方法を用いて取得されてもよい。例１参照。いくつかの実施形態において、子宮内膜サンプルは、例えば、子宮内洗浄において存在している分離した細胞を収集することにより、低侵襲的な方法を用いて取得されてもよい。任意の理論に制約されることを望まず、本開示にかかる方法において必要とされうる子宮内膜サンプルの量が著しく少ないように、請求されたｑＰＣＲベースのｍｉＲＮＡ発現プロファイリング方法は、マイクロアレイベースのｍＲＮＡ発現プロファイリング方法と比較して高い特異性および感度を提供すると考えられる。Ｗａｎｇ他、「Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｌｏｎｇ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００６、７：５９－７５参照。

【0064】

いくつかの実施形態において、子宮内膜サンプルは、女性の内因性ＬＨの急増後７日間に取得される（ＬＨ＋７）。いくつかの実施形態において、子宮内膜サンプルは、女性のプロゲステロン投与後５日間に取得される（Ｐ＋５）。

【0065】

子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡは、当技術分野で周知の方法を使用して抽出および濃縮されうる。例えば、ｍｉＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して子宮内膜の組織から抽出されうる。例１参照。ｍｉＲＮＡ濃縮製剤は、－８０°Ｃで保管されうる。ｍｉＲＮＡの量と質は、当技術分野で周知の方法を使用して分析されうる。例えば、ｍｉＲＮＡは、市販のＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用して分析されうる。

【0066】

各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、ｑＰＣＲ、シークエンシング、マイクロアレイ、またはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドキャプチャ技術を含む、当技術分野で周知の方法により定量化されうる。いくつかの実施形態において、本開示にかかる方法は、一般的に、ノーザンブロットハイブリダイゼーションおよび／またはマイクロアレイ遺伝子チップ分析より高い感度および特異性を有する、ｑＰＣＲ反応を使用する。その目的に向けて、ｃＤＮＡは、逆転写反応において抽出および濃縮されたｍｉＲＮＡから合成され、ｑＰＣＲ反応は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを定量化するために実施されうる。従って、いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、任意に、本明細書において開示される１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを使用して、ｑＰＣＲにより判断される。例１参照。

【0067】

現在、ｑＰＣＲアッセイは、２つのタイプに分けられうる。第一のタイプは、ステムループ逆転写プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を実施すること、およびｍｉＲＮＡに特異的なプローブまたはユニバーサルプローブを使用してｍｉＲＮＡを定量化することである。第二の方法は、線形ユニバーサル逆転写プライマーを使用してｃＤＮＡ合成を実施すること、およびｍｉＲＮＡに特異的な順方向プライマー、逆転写プライマーに特異的な逆方向プライマー、および二重鎖ＤＮＡ挿入色素を使用してｍｉＲＮＡを定量化することである。

【0068】

いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ合成は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第１０，５９０，４７８号に開示されているようなユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡ合成は、以下の一般式：５’－Ｒ－（ｄＴ）ｎＶＮ－３’で表されるヌクレオチド配列を有するユニバーサル逆転写プライマーを使用して実施され、ここで、ＲはＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣＧＴ（配列番号：１６８）の配列を含み、（ｄＴ）ｎはｎ個の連続したチミン残基であり、ｎは１９であり、Ｖはアデニン残基、グアニン残基、またはシトシン残基であり、Ｎはアデニン残基、グアニン残基、シトシン残基、またはチミン残基である。

【0069】

コスト削減と使いやすさのため、いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲ反応は、本開示にかかる１６７のｍｉＲＮＡの全てを標的とする１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを使用して実施されうる。例１参照。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡプロファイリングチップの各々には、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００のｍｉＲＮＡの発現を同時に分析可能な適切なプライマーおよび／またはプローブが予め組み込まれている。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡプロファイリングチップは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，７２４，６９２号、特許第１０，４１５，０８４号、出願番号第１６／１９１，４５１号および出願番号第１６／２３３，１２１号に開示されているようなマルチプレックススライド式プレートを含む。

【0070】

ｑＰＣＲ反応は、当技術分野で周知の方法を使用して実施されうる。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲ反応は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第９，１６８，５３３号および出願番号第１６／５５９，６４２号に開示されるようなサーマルサイクラー装置を使用して実施されうる。例１も参照。

【0071】

子宮内膜の受容性を判断するためのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムおよびその使用

【0072】

本開示の方法によれば、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムを使用して、受容性予測スコアを生成するために使用されうる。受容性予測スコアは、子宮内膜の状態を以下の３つの状態：受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態の１つに分類する。

【0073】

コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムは、ｍｉＲＮＡ発現データを使用し、様々な受容性の状態に応じてクラスを区別することを学習する数学的予測分類器である。

【0074】

アルゴリズムを構築するため、ｍｉＲＮＡ発現レベルについての生データは、訓練セットおよび検証セットに分けられる。訓練セットは、予測分類器を訓練するために使用され、検証セットは、予測分類器の性能を評価および改善するために使用される。図３に示されるように、以下のステップの１以上がアルゴリズムを構築および立証するために実施される：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証。

【0075】

統計的特性が同一の分布になるように、データは、Ｂｏｌｓｔａｄ他、「Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉａｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００３、１９（２）：１８５－１９３に記載されるように、Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎにより正規化されうる。さらに、目的関数が正確に働くように、データは、ゼロ平均および単位分散を有するデータを作成するため、値域に標準化されうる。

【0076】

データ整理および特徴抽出の両方のため、主成分分析（ＰＣＡ）は、多数のオリジナル変数から情報を圧縮し、オリジナル変数を線形結合することにより、小さな新しい特性のセットを生成するために使用されうる。

【0077】

ＰＣＡ変換データは、Ｚｏｕ他、「Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ」、Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ｓｏｃ．Ｂ、２００５、６７、ｐａｒｔ２、３０１－３２０に記載されているように、ｌａｓｓｏおよびｒｉｄｇｅ法のＬ１およびＬ２ペナルティを線形結合した正規化回帰法である弾性ネット正則化で、一般化線形モデルをさらに構築するために使用されうる。ｇｌｍｎｅｔに関する追加の情報は、ｇｌｍｎｅｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕで既知であり、入手可能である。

【0078】

ｋ分割交差検証法、例えば、１０分割交差検証は、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムの予測値をまとめる前に、それを評価するために使用されうる。図５参照。ｋ分割交差検証において、元のサンプルは、ｋ個の同じ大きさのサブサンプルにランダムに分割される。ｋ個のサブサンプルのうち、単一のサブサンプルは、モデルをテストするための検証データとして保持され、残りのｋ－１個のサブサンプルは、訓練データとして使用される。交差検証プロセスは、続いて、検証データとして正確に一度使用されるｋ個のサブサンプルの各々で、ｋ回（分割）繰り返される。分割からのｋ個の結果は、続いて、単一の推定を作成するために平均化（または、そうでなければ結合）されうる。

【0079】

妊娠率は、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムの予測値を評価するために使用されうる。例２参照。

【0080】

検証および改善後、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムが生成される。アルゴリズムを実行することにより、女性の子宮内膜の状態を以下のような３つの状態の１つに分類する受容性予測スコアが生成される：スコアが１より大きい場合、女性の子宮内膜は受容期前の状態にある；スコアが－１未満の場合、女性の子宮内膜は受容期後の状態にある；そしてスコアが－１から１の場合、女性の子宮内膜は受容期の状態にある。図６参照。

【0081】

本開示にかかる方法の適用

【0082】

本開示は、サンプル、例えば、子宮内膜の生検を使用して、子宮内膜の状態を判断する方法であって、（ａ）子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断するため、女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）例えば、コンピューターベースのアルゴリズムを使用して、受容性予測スコアを取得するため、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析することとを含む方法を提供する。

【0083】

本開示の方法は、ＩＶＦ治療を含むがそれに限定されない、様々な診断および治療目的で使用されうる。例えば、いくつかの実施形態において、子宮内膜の結果に基づき、方法は、さらに、女性の胚を移植すること、または着床不全を患っているまたは患っていた女性に１以上の治療を施すことを含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示は、胚着床に対する子宮内膜の受容性を検出する方法であって、（ａ）子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断するため、女性の子宮内膜サンプルについてのアッセイを実施することであって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むことと、（ｂ）受容性予測スコアを取得するため、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを分析することであって、受容性予測スコアは、女性が子宮内膜の受容性を有するかどうかを判断することと、（ｃ）子宮内膜の受容性を有すると判断された女性の子宮内膜に胚を移植することとを含む方法を提供する。

【0084】

いくつかの実施形態において、子宮内膜の状態を判断する方法は、女性の胚着床のタイミングを判断するために使用されうる。いくつかの実施形態において、子宮内膜の状態が受容期の状態である場合、女性は、胚着床に適していると判断される。子宮内膜の状態が受容期前または受容期後の状態である場合、女性は、胚着床に適していないと判断される。いくつかの実施形態において、子宮内膜の状態が受容期前の状態または受容期後の状態であると判断された場合、本開示は、子宮内膜の状態に関する情報に基づき、胚着床のための方法を提供する。例えば、子宮内膜の状態が受容期前の状態であると判断された場合、次の周期の間、胚着床は、プロゲステロン投与後５．５から７．５日の間、例えば、５．５、６、６．５、７、または７．５日間実施されうる。あるいは、子宮内膜の状態が受容期後の状態であると判断された場合、次の周期の間、胚着床は、プロゲステロン投与後２．５から４．５日の間、例えば、２．５、３、３．５、４、または４．５日間実施されうる。

【0085】

子宮内膜がサンプリング時に受容不可能な状態を示した場合、得られた情報は有益である。それは、方法が別の時に子宮内膜サンプルを取得することにより繰り返され、初めの判断の結果に従って修正されうるためである。例として、子宮内膜の状態が受容期前の状態である場合、子宮内膜サンプルを取得する次の時点は、内因性ＬＨの急増後７日間より長く、またはプロゲステロン投与後５日間より長くなりうる。例えば、子宮内膜サンプルを取得する次のポイントは、内因性ＬＨの急増後７．５から１０．５日の間、例えば、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、または１０．５日間、またはプロゲステロン投与後５．５から７．５日の間、例えば、５．５、６、６．５、７、または７．５日間になりうる。あるいは、子宮内膜の状態が受容期後の状態である場合、子宮内膜サンプルを取得する次の時点は、内因性ＬＨの急増後７日間より短く、またはプロゲステロン投与後５日間より短くなりうる。例えば、子宮内膜サンプルを取得する次のポイントは、内因性ＬＨの急増後３．５および６．５日の間、例えば、３．５、４、４．５、５、５．５、６、または６．５日間、またはプロゲステロン投与後２．５から４．５日の間、例えば、２．５、３、３．５、４、または４．５日間になりうる。これらの手順に従うことにより、受容期の状態が見つかり、ＩＶＦ治療の成功率が改善しうる。これらの使用の任意の１つとして、女性が着床不全を患っているまたは患っていたことがある。いくつかの実施形態において、女性は、ＩＶＦ治療を受けている。

【0086】

いくつかの実施形態において、子宮内膜の状態が受容期前の状態または受容期後の状態であると判断された場合、子宮内膜の状態を判断する方法は、少なくとも一度または子宮内膜の状態が受容期の状態であると判断されるまで繰り返されうる。

【0087】

いくつかの実施形態において、本開示にかかる子宮内膜の状態を判断する方法は、女性のＷＯＩを判断するために使用されうる。いくつかの実施形態において、本開示にかかる方法は、女性のＩＶＦ治療に対する反応性を分類するために使用されうる。これらの使用の任意の１つとして、いくつかの実施形態において、女性が着床不全を患っているまたは患っていたことがある。いくつかの実施形態において、女性は、ＩＶＦ治療を受けている。

【0088】

いくつかの実施形態において、本開示にかかる子宮内膜の状態を判断する方法は、妊娠薬の女性の子宮内膜への効果を調査するための有益な手段として使用されうる。これらの実施形態において、女性は、着床不全を患っているまたは患っていた。いくつかの実施形態において、女性は、ＩＶＦ治療を受けている。

【0089】

キット

【0090】

本開示の他の態様は、子宮内膜の状態を判断する方法を実施するキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、複数のｍｉＲＮＡ、例えば、それぞれ配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルの検出に適したプライマーおよび／またはプローブを含む。例１参照。いくつかの実施形態において、プライマーおよび／またはプローブは、１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出するためのｑＰＣＲ反応を実施することに適している。いくつかの実施形態において、キットは、１６７のｍｉＲＮＡを標的とする１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを含む。いくつかの実施形態において、１以上のチップは、さらに、ｍｉＲＮＡ発現分析に対する内在性コントロールとして使用されうる、ＲＮＡ配列、例えば、１８ｓ ｒＲＮＡを標的とする。

【0091】

キットは、さらに、（ｉ）任意に１以上のｍｉＲＮＡプロファイリングチップを使用して、女性の子宮内膜サンプルのｍｉＲＮＡ発現プロファイルを判断すること、および／または（ｉｉ）コンピューターベースのアルゴリズムを使用して、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づき受容性予測スコアを取得することに関する指示を含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、受容性予測スコアをどのように解釈および使用するかに関する指示を含む。

【0092】

いくつかの実施形態において、キットは、ＩＶＦ治療を含むがそれに限定されない、診断および治療目的に役立つ。

【実施例】

【0093】

例１：ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを生成する材料および方法

【0094】

子宮内膜の生検． ホルモン補充療法周期におけるプロゲステロン投与後５日間（Ｐ＋５）または自然な周期における内因性黄体形成ホルモンの急増後７日間（ＬＨ＋７）のいずれかに、Ｐｉｐｅｌｌｅ Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｓｕｃｔｉｏｎ Ｃｕｒｅｔｔｅ（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を使用して、子宮内膜の生検が女性の子宮腔から採取された。子宮内膜の組織は、すぐにＲＮＡｌａｔｅｒに保管された。

【0095】

ＲＮＡ抽出およびｍｉＲＮＡ濃縮． 製造業者の指示に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、全てのＲＮＡが子宮内膜の組織から分離された。短時間で、５ｍｇの子宮内膜の組織が、モーターおよび乳棒で液体窒素内において破壊および均質化された。７００μｌのＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔが均質化された組織に追加され、結果として生じたサンプルは、核タンパク複合体の解離を促進するため、５分間室温で培養された。７００μｌのＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔにつき１４０μｌのクロロホルムが管に追加され、管は、１５秒間勢いよく手で振られ、２－３分間室温で培養された。サンプルは、４°Ｃで１５分間、１２，０００ｇで遠心分離された。遠心分離後、上部の水相が新しい管に移され、サンプルと同量の７０％のエタノールが管に追加され、管は完全にボルテックスされた。サンプルは、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移され、室温で１５秒間、８，０００ｇで遠心分離された。素通り画分は、２ｍｌの管にピペットで移され、サンプルの０．６５倍量の１００％のエタノールが素通り画分に追加され、結果として生じたサンプルは、完全にボルテックスされた。サンプルは、続いて、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移され、室温で１５秒間、８，０００ｇで遠心分離された。素通り画分は廃棄され、７００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＷＴがＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに追加され、カラムは、洗浄のため１５秒間８０００ｇで遠心分離された。素通り画分は廃棄され、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＲＰＥがＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに追加され、カラムは、洗浄のため１５秒間８，０００ｇで遠心分離された。素通り画分は廃棄され、５００μｌの８０％のエタノールがＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに追加され、カラムは、スピンカラム膜を乾燥させるため、２分間８，０００ｇで遠心分離された。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムは、新しい２ｍｌの採取管に入れられ、５分間８，０００ｇで遠心分離された。ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムは１．５ｍｌの採取管に入れられ、１４－２０μｌのヌクレアーゼフリー水がスピンカラム膜上に追加され、カラムは、ｍｉＲＮＡ濃縮画分を溶離するため、１分間８，０００ｇで遠心分離された。ｍｉＲＮＡ濃縮画分は、－８０°Ｃで保管された。

【0096】

ｃＤＮＡ合成． 子宮内膜の組織からの≧２ｎｇのｍｉＲＮＡ濃縮画分が、２０μｌの逆転写反応においてｃＤＮＡを合成するために使用された。逆転写は、製造業者の指示に従い、ＱｕａｒｋＢｉｏ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｕａｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｉｎｃ．）を使用して実施された。短時間で、ポリＡテールが、ポリＡポリメラーゼを使用してｍｉＲＮＡに追加され、その後ｃＤＮＡ合成が続いた。ｃＤＮＡ合成は、続いて、以下のプログラムを使用して実施された：４２°Ｃで６０分間および９５°Ｃで５分間、続いて、プログラムの完了まで４°Ｃ。合成されたｃＤＮＡは、－２０°Ｃで保管された。

【0097】

ＮｅｘｔＡｍｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＳｙｓｔｅｍおよびＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐセットを使用したｍｉＲＮＡ発現プロファイリング． ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐセットは、合計１６７のｍｉＲＮＡアッセイを含む。１６７のｍｉＲＮＡに対する配列は、表１に示される。加えて、ＲＮＵ６Ｂ、ＲＮＵ４３、および１８ｓ ｒＲＮＡが、内在性コントロールとして使用された。３つの内在性スパイクインコントロールが、ｍｉＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、およびｑＰＣＲ効率をモニタリングするために使用された（Ｑｕａｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｉｎｃ．）。ｃＤＮＡは、ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐセットで分析された。（０．１ｎｇのｍｉＲＮＡ濃縮画分に相当する）ｃＤＮＡが、３０μｌの２Ｘ ＳＹＢＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｕａｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｉｎｃ．）を含む混合物に追加され、ヌクレアーゼフリー水が、６０μｌの最終量を取得するため、混合物に追加された。混合物は、手で完全に混合され、底部に液体を集めるために短時間で沈降された。６０μｌの混合物が、チップの端に沿ってＰｉｐｅｔｍａｎを使用して投与され、混合物は、続いて、ガラススライドでの剥離動作により、ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐの全表面にわたって塗布された。各チップは、続いて、トレイの底に対向する反応ウェルで、Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｑｕａｒｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔａｉｗａｎ，Ｉｎｃ．）を含むトレイに沈められた。各トレイは、続いて、ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐアッセイおよびデータ分析が都合よく、すぐに実施されうるように、ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐ適用に対するサーモサイクラー（図２のＰａｎｅｌＳｔａｔｉｏｎ参照）であり、ビルトインサンプル管理データベースおよび解析プラットフォームを含む、Ｑ Ｓｔａｔｉｏｎに入れられた。ＭＩＲＡ ＰａｎｅｌＣｈｉｐ分析は、続いて、以下のプログラムに従って実施された：４０周期の間、９５°Ｃで３６秒および６０°Ｃで７２秒。

【0098】

例２：コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムおよびその使用

【0099】

図３に示されるように、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズム（ＭＩＲＡ）は、以下のステップ：データ正規化、データのスケーリング、データ媒体変換、予測モデリング、および交差検証の１以上を実施することにより構築された。

【0100】

データ正規化． 統計的特性が同一の分布になるように、データは、Ｑｕａｎｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎにより正規化された。図３の方程式（Ａ）参照。また、Ｂｏｌｓｔａｄ他、「Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙ ｄａｔａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉａｓ」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００３、１９（２）：１８５－１９３参照。

【0101】

データのスケーリング． 目的関数が正確に働くように、データは、ゼロ平均および単位分散を有するデータを作成するため、値域に標準化された。図３の方程式（Ｂ）参照。

【0102】

データ媒体変換． データ整理および特徴抽出のため、ＰＣＡは、多数のオリジナル変数から情報を圧縮し、オリジナル変数を線形結合することにより、小さな新しい特性のセットを生成した。図３の方程式（Ｃ）参照。

【0103】

モデリング． ＰＣＡ変換データは、ｌａｓｓｏおよびｒｉｄｇｅ法のＬ１およびＬ２ペナルティを線形結合した正規化回帰法である弾性ネット正則化で一般化線形モデルをさらに構築するために使用された。図３の方程式（Ｄ）参照。また、Ｚｏｕ他、「Ｒｅｇｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ ｅｌａｓｔｉｃ ｎｅｔ」、Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ｓｏｃ．Ｂ、２００５、６７、ｐａｒｔ２、３０１－３２０参照。

【0104】

ＭＩＲＡモデルをまとめる前に、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムの予測値を評価するため、交差検証が実施された。図４Ａに示されるように、表１に示される配列番号：１－１６７の配列を有する１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むｍｉＲＮＡ発現プロファイルを使用して、ＭＩＲＡモデルは、ｃｌｉｎａｌサンプルを３つの状態グループ：受容期前の状態、受容期の状態、または受容期後の状態の１つにうまく分類された。さらに、図４Ｂに示されるように、予備検証は、受容期の状態に分類された女性で１００％の妊娠率を示した（テストセット）。

【0105】

モデル評価のための１０分割交差検証を実現するため、１８３人の女性のデータが１０個のサブセットに分けられた。図５は、１８３個の子宮内膜サンプルの１６７のｍｉＲＮＡの発現レベルを含むｍｉＲＮＡ発現プロファイルを使用した、１０分割交差検証および妊娠率を示した。これらのテストにおいて、初めの周期に、各女性の子宮内膜の状態が判断された。女性の子宮内膜が受容期前の状態であると判断された場合、胚着床は、次の周期にプロゲステロン投与後６日間実施された（Ｐ＋６グループ；３５人の女性）。女性の子宮内膜が受容期の状態であると判断された場合、胚着床は、次の周期にプロゲステロン投与後５日間実施された（Ｐ＋５グループ；１４２人の女性）。女性の子宮内膜が受容期後の状態であると判断された場合、胚着床は、次の周期にプロゲステロン投与後４．５日間実施された（Ｐ＋４．５グループ；６人の女性）。加えて、図５は、１０分割交差検証結果の感度、特異性、ＰＰＶ、ＮＰＶ、および全体の一致率を示す。

【0106】

３つのグループの中で、Ｐ＋６グループから２２件、Ｐ＋５グループから１１３件、およびＰ＋４．５グループから２件の、１３７件の妊娠が検出された。図５参照。コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムの予測評価に関して、１３７件の妊娠の中で、Ｐ＋４．５グループの２件のうち１件、Ｐ＋５グループの１１３件のうち１０７件、およびＰ＋６グループの２２件のうち１７件は、アルゴリズムにより判断された正確な胚着床タイミング調整を示し、９１．２４％の妊娠率（１２５／１３７）をもたらした。図５参照。

【0107】

ＭＩＲＡ Ｍｏｄｅｌ． 本例に記載される全てのパラメーターを考慮して（図３、方程式（Ａ－Ｄ）および後続の交差検証に基づくそれらのパラメーターの微調整参照）、全てのサンプルを３つの明確な子宮内膜の状態に分類する予測モデルが生成された。ＭＩＲＡを実行することにより、以下の方程式：

【数3】

を使用して計算された受容性予測スコア（ＭＩＲＡスコア）が生成され、ここで、βは係数のベクトルであり、εは誤差であり、両方とも交差検証を通したｇｌｍｎｅｔにより生成されている（図３）。このモデルは、子宮内膜の状態を予測するため、子宮内膜の任意のｑＰＣＲプロファイリングに適用することができた。

【0108】

図６に示されるように、コンピューターベースのｍｉＲＮＡ分析アルゴリズムを実行することにより、女性の子宮内膜の状態を３つの状態の１つに分類する受容性予測スコアが生成された：スコアが１より大きい場合、女性の子宮内膜は受容期前の状態にあり；スコアが－１未満の場合、女性の子宮内膜は受容期後の状態にあり；そしてスコアが－１から１の場合、女性の子宮内膜は受容期の状態（ＷＯＩ）にある。

【0109】

開示は、特に、特定の実施形態を参照して示され、記載されているが、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく、形式および細部における様々な変更がその中でなされてもよいことは、当業者により理解されるべきである。
（参照）

【0110】

Ａｍｂｒｏｓ、「ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ： ｔｉｎｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」、Ｃｅｌｌ、２００１、１０７（７）：８２３－８２６．

【0111】

Ｂａｒｔｅｌ、「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ： ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， ｍｅｃｈａｎｉｓｍ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ、２００４、１１６（２）：８１－９７．

【0112】

Ｌｅｅ他、「Ｔｈｅ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｌｉｎ－４ ｅｎｃｏｄｅｓ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｔｏ ｌｉｎ－１４」、Ｃｅｌｌ、１９９３、７５（５）：８４３－８５４．

【0113】

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【0114】

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【0115】

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【0125】

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【0128】

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【0129】

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【0130】

Ｈｕａｎｇ他、「ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ ２０２０： ｕｐｄａｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０２０、４８：Ｄ１４８－Ｄ５４．

【0131】

Ａｇａｒｗａｌ他、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍＲＮＡｓ」、２０１５、Ｅｌｉｆｅ、４．

【0132】

Ｃｈｅｎ他、「ｍｉＲＤＢ： ａｎ ｏｎｌｉｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４８：Ｄ１２７－Ｄ３１．

【0133】

Ｗａｎｇ他、「Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｌｏｎｇ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００６、７：５９－７５．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【配列表】

2022539037000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021-12-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】