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特表2022-539257ベンズイミダゾール－２－オン系化合物の結晶体、溶媒和物、溶媒和物の結晶体、およびそれらの調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-07
(54)【発明の名称】ベンズイミダゾール－２－オン系化合物の結晶体、溶媒和物、溶媒和物の結晶体、およびそれらの調製方法
(51)【国際特許分類】
C07D 235/26 20060101AFI20220831BHJP
A61P 7/10 20060101ALI20220831BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20220831BHJP
A61K 31/4184 20060101ALI20220831BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220831BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220831BHJP
【ＦＩ】
C07D235/26 C CSP
A61P7/10
A61P27/16
A61K31/4184
A61P35/00
A61P43/00 111
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500106
(86)(22)【出願日】2020-07-03
(85)【翻訳文提出日】2022-03-03
(86)【国際出願番号】 CN2020100129
(87)【国際公開番号】W WO2021000934
(87)【国際公開日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】201910602489.2
(32)【優先日】2019-07-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010426911.6
(32)【優先日】2020-05-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516304780
【氏名又は名称】メッドシャイン ディスカバリー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162695
【弁理士】
【氏名又は名称】釜平 双美
(74)【代理人】
【識別番号】100156155
【弁理士】
【氏名又は名称】水原 正弘
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(72)【発明者】
【氏名】雷 茂義
(72)【発明者】
【氏名】羅 雲富
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC39
4C086GA15
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA03
4C086ZA34
4C086ZA83
4C086ZB26
4C086ZC20
(57)【要約】
本発明は、化合物（１）の結晶体、その溶媒和物、その溶媒和物の結晶体、およびそれらの調製方法に関し、さらに、ＴＮＦαに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における前記結晶体の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｘ線粉末回折パターンは、１１．９１±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２３．１７±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、【化1】
【請求項2】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項3】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１５．８３±０．２０°、１７．５３±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２０．３３±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°、２６．５０±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項２に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項4】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６°、１１．９１°、１２．９１°、１４．２７°、１５．８３°、１７．５３°、１９．３６°、２０．３３°、２２．２６°、２２．５９°、２３．１７°、２４．９７°、２６．５０°、２９．４６°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項３に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項5】
ＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである、請求項４に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項6】
示差走査熱量測定曲線が、１４７．０±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項7】
ＤＳＣパターンが図２に示すとおりである、請求項６に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項8】
熱重量分析曲線が、１４０．０±３．０℃で０．７０％の重量損失を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項9】
ＴＧＡ曲線が図３に示すとおりである、請求項８に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項10】
【化2】
式（Ｉ－１）で表される化合物の溶媒和物。
【請求項11】
ｎが０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４および１．５から選択される、請求項１０に記載の溶媒和物。
【請求項12】
ｎが０．５である、請求項１１に記載の溶媒和物。
【請求項13】
【化3】
Ｘ線粉末回折パターンは、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、
式（Ｉ－１－１）で表される溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項14】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１３に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項15】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、１９．１７±０．２０°、１９．７０±０．２０°、２０．４１±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°、２５．９５±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１４に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項16】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４°、８．９０°、１１．２７°、１２．７５°、１３．２９°、１４．９４°、１６．１５°、１７．５４°、１７．９３°、１９．１７°、１９．７０°、２０．４１°、２０．７９°、２２．０６°、２２．７２°、２３．００°、２３．８６°、２５．９５°、２７．８２°、２８．４５°、３０．１４°、３２．８７°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１５に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項17】
ＸＲＰＤパターンが図５に示すとおりである、請求項１６に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項18】
示差走査熱量測定曲線が、７７．５±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項19】
ＤＳＣパターンが図６に示すとおりである、請求項１３に記載の結晶体Ｂ。
【請求項20】
熱重量分析曲線が、８０．０±３．０℃で１０．４６％の重量損失を有する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項21】
ＴＧＡ曲線が図７に示すとおりである、請求項２０に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項22】
ＴＮＦαに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載の溶媒和物、または請求項１３～２１のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１９年０７月０４日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１９１０６０２４８９．２および２０２０年０５月１９日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２０１０４２６９１１．６に基づく優先権を主張する。
本出願は、２０１９年０７月０４日に出願された中国特許出願ＣＮ２０１９１０６０２４８９．２および２０２０年０５月１９日に出願された中国特許出願ＣＮ２０２０１０４２６９１１．６に基づく優先権を主張する。
【0002】
本発明は、化合物１の結晶体、その溶媒和物、その溶媒和物の結晶体、およびそれらの調製方法に関し、さらに、ＴＮＦαに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における前記結晶体の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）は、主に単核マクロファージが免疫刺激物に応答する際に放出するサイトカインである。ＴＮＦαは、分化、動員、増殖、タンパク質分解などのほとんどの細胞プロセスを促進することができる。低レベルでは、ＴＮＦαは、感染性病原体、腫瘍、および組織の損傷に対して保護効果がある。しかしながら、ＴＮＦαの過剰放出は、疾患を引き起こす可能性がある。たとえば、哺乳動物またはヒトにＴＮＦαを投与すると、炎症、発熱、心血管系の影響、出血、血液凝固、および急性感染症やショック状態と同様の急性反応を引き起こしたり、悪化させたりすることがある。動物またはヒトにおける過剰または制御されていないＴＮＦαの産生は、内毒素血症および／または毒素性ショック症候群、悪液質、成人呼吸窮迫症候群、癌（例えば、固形腫瘍および血液腫瘍）、心臓病（例えば、うっ血性心不全）、ウイルス感染症、遺伝性疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、または自己免疫疾患のような疾患を示唆することが多い。
【0004】
癌は特に壊滅的な疾患である。血中のＴＮＦαレベルの上昇は、癌のリスクまたは癌の広がりを示唆している。一般的に、癌細胞は、健康な生物体の循環器系で生き残ることができず、その理由の１つは、血管の内壁が癌細胞の血管外漏出に対する障壁として機能することである。研究によると、内皮細胞上のＥＬＡＭ－１は、サイトカインで処理された内皮に結腸癌細胞が付着することを媒介・促進することができる。
【0005】
環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、多くの疾患および病症において役割を果たす。炎症時の白血球中のｃＡＭＰ濃度の増加は、白血球の活性化を阻害し、その後、ＴＮＦαおよびＮＦ－κＢなどを含む炎症制御因子を放出する。また、ｃＡＭＰレベルの上昇は、気道の平滑筋の弛緩も引き起こす。
【0006】
ｃＡＭＰ不活性化の主な細胞メカニズムは、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と呼ばれるアイソザイムのファミリーによるｃＡＭＰの破壊である。なお、ＰＤＥファミリーには１１メンバーがあることが知られている。これまで、ＰＤＥ４酵素の阻害は、炎症性メディエーターの放出を阻害し、気道の平滑筋を弛緩させることに特に効果的であることが実証されているため、ＰＤＥ４酵素は、創薬標的の一つとして注目されている。異なる遺伝子コードによって、ＰＤＥ－４ファミリーは４つのサブタイプ（ＰＤＥ－４Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に分けることができる。そのうち、炎症細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞および好中球など）におけるＰＤＥ－４Ａ、ＰＤＥ－４ＢおよびＰＤＥ－４Ｄの発現は、ＰＤＥ－４Ｃよりも強い。ＰＤＥ４酵素の阻害は、ｃＡＭＰレベルの上昇を引き起こすため、ＴＮＦαのレベルを調節し、疾患を治療する目的を達成する。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、化合物１の結晶体Ａを提供する。そのＸ線粉末回折パターンは、１１．９１±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２３．１７±０．２°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【化1】
【0008】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0009】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１５．８３±０．２０°、１７．５３±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２０．３３±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°、２６．５０±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0010】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体Ａは、Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６°、１１．９１°、１２．９１°、１４．２７°、１５．８３°、１７．５３°、１９．３６°、２０．３３°、２２．２６°、２２．５９°、２３．１７°、２４．９７°、２６．５０°、２９．４６°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0011】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体ＡのＸＲＰＤパターンの解析データは、表１に示すとおりである。
表１
表１
【表1】
【0012】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体ＡのＸＲＰＤパターンは、図１に示すとおりである。
【0013】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体Ａの示差走査熱量測定曲線は、１４７．０±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する。
【0014】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体ＡのＤＳＣパターンは、図２に示すとおりである。
【0015】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体Ａの熱重量分析曲線は、１４０．０±３．０℃で０．７０％の重量損失を有する。
【0016】
本発明の一部の実施形態において、前記化合物１の結晶体ＡのＴＧＡパターンは、図３に示すとおりである。
【0017】
また、本発明は、式（Ｉ－１）で表される化合物の溶媒和物を提供する。
ただし、ｎは０．１～１．５から選択される。
【化2】
【0018】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物におけるｎは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４および１．５から選択される。
【0019】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物におけるｎは、０．５である。
【0020】
また、本発明は、ｎが０．５である、式（Ｉ－１－１）で表される溶媒和物の結晶体Ｂを提供する。そのＸ線粉末回折パターンは、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【化3】
【0021】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＸ線粉末回折パターンは、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0022】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＸ線粉末回折パターンは、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、１９．１７±０．２０°、１９．７０±０．２０°、２０．４１±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°、２５．９５±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0023】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＸ線粉末回折パターンは、６．８４°、８．９０°、１１．２７°、１２．７５°、１３．２９°、１４．９４°、１６．１５°、１７．５４°、１７．９３°、１９．１７°、１９．７０°、２０．４１°、２０．７９°、２２．０６°、２２．７２°、２３．００°、２３．８６°、２５．９５°、２７．８２°、２８．４５°、３０．１４°、３２．８７°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【0024】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＸＲＰＤパターンの解析データは、表２に示すとおりである。
【0025】
表２
【表2】
【0026】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＸＲＰＤパターンは、図５に示すとおりである。
【0027】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体Ｂの示差走査熱量測定曲線は、７７．５±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有する。
【0028】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＤＳＣパターンは、図６に示すとおりである。
【0029】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体Ｂの熱重量分析曲線は、８０．０±３．０℃で１０．４６％の重量損失を有する。
【0030】
本発明の一部の実施形態において、前記溶媒和物の結晶体ＢのＴＧＡパターンは、図７に示すとおりである。
【0031】
さらに、本発明の一部の実施形態において、ＴＮＦαに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における前記化合物１の結晶体Ａ、前記溶媒和物または前記溶媒和物の結晶体Ｂの使用を提供する。
【発明の効果】
【0032】
本発明の化合物１の結晶体Ａは、安定性が良く、吸湿性が低く、ドラッガビリティが優れている。本発明の化合物１は、ホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ）を阻害する優れたインビトロ活性を示す。本発明の化合物１は、ｈＰＢＭＣにおいてＴＮＦαの産生を阻害する優れたインビトロ活性を示す。本発明の化合物１は、０．１、０．３および３ｍｇ／耳の３つの用量群においてマウスにおけるＰＭＡ誘発性耳浮腫の症状に対して顕著な改善効果を示し、耳の重量増加を著しく阻害することができ、しかも３つの用量群はいずれも良好な用量関係関係を示す。
【0033】
定義と説明
特に断らない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有する。特定の用語や語句は、特定の定義がなければ、不明瞭または不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品またはその有効成分を指すものである。
特に断らない限り、本明細書で使用される以下の用語および語句は、以下の意味を有する。特定の用語や語句は、特定の定義がなければ、不明瞭または不明確であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品またはその有効成分を指すものである。
【0034】
本発明の中間化合物は、以下に列挙される特定の実施形態、それらを他の化学合成方法と組み合わせることにより形成される実施形態、および当業者に周知の同等の代替方法を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって調製することができる。好ましい実施形態は、本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【0035】
本明細書に開示される特定の実施形態における化学反応は、本発明の化学変化および必要とされる試薬や材料に適する適切な溶媒中で行う。本発明の化合物を得るために、当業者が、既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択する必要がある場合がある。
【0036】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【0037】
本発明の化合物は、当業者に周知の通常の方法によって構造を確認することができる。本発明が化合物の絶対配置に関与する場合、絶対配置は、当技術分野の従来の技術によって確認することができる。例えは、単結晶Ｘ線回折法（ＳＸＲＤ）では、育成した単結晶を、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ｖｅｎｔｕｒｅ Ｘ線回折計で回折強度データ（光源：ＣｕＫα放射線、スキャンモード：φ/ωスキャン）を収集し、関連データを収集した後、直接法（Ｓｈｅｌｘｓ９７）で結晶構造をさらに解析することで、絶対配置を確認することができる。
【0038】
本発明で使用されるすべての溶媒は市販されるものであり、さらに精製することなく使用される。
【0039】
化合物は、当技術分野における一般的な命名法又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物は、メーカのカタログ名を使用する。
【0040】
本発明における粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ，ＸＲＰＤ）方法
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ分析に使用した。
ライトチューブ：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
ライトチューブ電圧：４０ｋＶ、ライトチューブ電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４～４０ｄｅｇ
ステップサイズ：０．０２ｄｅｇ
ステップ長さ：０．１２秒
サンプルディスクの回転数：１５ｒｐｍ
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ａｄｖａｎｃｅ Ｘ線回折計
測定方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ分析に使用した。
ライトチューブ：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）
ライトチューブ電圧：４０ｋＶ、ライトチューブ電流：４０ｍＡ
発散スリット：０．６０ｍｍ
検出器スリット：１０．５０ｍｍ
散乱防止スリット：７．１０ｍｍ
走査範囲：４～４０ｄｅｇ
ステップサイズ：０．０２ｄｅｇ
ステップ長さ：０．１２秒
サンプルディスクの回転数：１５ｒｐｍ
【0041】
本発明における含有量の測定方法
機器モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフ
クロマトグラフィー条件における詳細なパラメーターは以下の通りである。
カラム：ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ３ ｓｕｐｅｒ Ｃ１８（４．６＊１５０ｍｍ ｉｄ），Ｐ．Ｎ．：ＥＸＬ－１１１１－１５４６Ｕ
カラム温度：３５℃
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２３０ｎｍ
注入量：５μＬ
実行時間：１５ｍｉｎ
移動相Ａ：０．０４％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｖ／Ｖ）
移動相Ｂ：１００％アセトニトリル
希釈剤：アセトニトリル：純水＝５０：５０（Ｖ／Ｖ）
プローブ洗浄液：アセトニトリル：純水＝５０：５０（Ｖ／Ｖ）
グラジエンドプログラム：
機器モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０高速液体クロマトグラフ
クロマトグラフィー条件における詳細なパラメーターは以下の通りである。
カラム：ＡＣＥ Ｅｘｃｅｌ ３ ｓｕｐｅｒ Ｃ１８（４．６＊１５０ｍｍ ｉｄ），Ｐ．Ｎ．：ＥＸＬ－１１１１－１５４６Ｕ
カラム温度：３５℃
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２３０ｎｍ
注入量：５μＬ
実行時間：１５ｍｉｎ
移動相Ａ：０．０４％トリフルオロ酢酸水溶液（Ｖ／Ｖ）
移動相Ｂ：１００％アセトニトリル
希釈剤：アセトニトリル：純水＝５０：５０（Ｖ／Ｖ）
プローブ洗浄液：アセトニトリル：純水＝５０：５０（Ｖ／Ｖ）
グラジエンドプログラム：
【表3】
【図面の簡単な説明】
【0042】
【発明を実施するための形態】
【0043】
以下、本発明の内容をよりよく理解するために、特定の実施例によって本発明をさらに説明するが、これらの特定の実施形態は、本発明の内容を限定するものではない。
【0044】
実施例１：アモルファス形態の化合物１の調製
【化4】
【0045】
工程１：化合物４の合成
室温、窒素雰囲気下で化合物２（１５．００ｇ，９４．２９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解させた後、化合物３（２５．７７ｇ，９４．２９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１９．５５ｇ，１４１．４３ｍｍｏｌ）を順次に加え、反応混合物を７０℃に加熱して、撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、室温に冷却し、飽和食塩水（４００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（２００ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～２：３、体積比）で精製して、目的化合物４を得た。１ＨＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ： ８．５２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０－７．１５（ｍ，１Ｈ），６．９６－６．９３（ｍ，１Ｈ），６．９０－６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８２－６．７８（ｍ，１Ｈ），５．２０－５．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
室温、窒素雰囲気下で化合物２（１５．００ｇ，９４．２９ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）に溶解させた後、化合物３（２５．７７ｇ，９４．２９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１９．５５ｇ，１４１．４３ｍｍｏｌ）を順次に加え、反応混合物を７０℃に加熱して、撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、室温に冷却し、飽和食塩水（４００ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（２００ｍＬ×３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～２：３、体積比）で精製して、目的化合物４を得た。１ＨＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ： ８．５２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０－７．１５（ｍ，１Ｈ），６．９６－６．９３（ｍ，１Ｈ），６．９０－６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８２－６．７８（ｍ，１Ｈ），５．２０－５．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
【0046】
工程２：化合物５の合成
室温、窒素雰囲気下で化合物４（１６．００ｇ，３８．７９ｍｍｏｌ）を、エタノール（１２８ｍＬ）と酢酸エチル（３２ｍＬ）との混合溶媒に溶解させた後、パラジウム炭素（水湿潤品）（５．００ｇ，純度：１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、反応混合物を、室温、水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、反応混合物を濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）でフィルターケーキを洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～３：２、体積比）で精製して、目的化合物５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ： ７．０７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，２Ｈ），６．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８， ２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｔｄ，Ｊ＝８．６，２．９，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔｄ，Ｊ＝９．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．７３－３．６７（ｍ，４Ｈ），３．３９－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
室温、窒素雰囲気下で化合物４（１６．００ｇ，３８．７９ｍｍｏｌ）を、エタノール（１２８ｍＬ）と酢酸エチル（３２ｍＬ）との混合溶媒に溶解させた後、パラジウム炭素（水湿潤品）（５．００ｇ，純度：１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、反応混合物を、室温、水素雰囲気（３０ｐｓｉ）下で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、反応混合物を濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）でフィルターケーキを洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～３：２、体積比）で精製して、目的化合物５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ： ７．０７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，２Ｈ），６．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８， ２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｔｄ，Ｊ＝８．６，２．９，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔｄ，Ｊ＝９．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．７３－３．６７（ｍ，４Ｈ），３．３９－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0047】
工程３：アモルファス形態の化合物１の合成
室温で、化合物５（１２．２ｇ，３１．９０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１２０ｍＬ）に溶解させた後、カルボニルジイミダゾール（１５．５２ｇ，９５．７０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、室温に冷却し、１Ｍ希塩酸（５ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（８０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～３：２、体積比）で精製し、さらに分取ＨＰＬＣ（移動相：アセトニトリル／水、中性系）で精製し、真空で凍結乾燥し、アモルファス形態の目的化合物１を得た。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ： ４０９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ： ７．１１－７．０８（ｍ，２Ｈ），７．０６－７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９－６．７４（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０８－３．９６（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
室温で、化合物５（１２．２ｇ，３１．９０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１２０ｍＬ）に溶解させた後、カルボニルジイミダゾール（１５．５２ｇ，９５．７０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、室温に冷却し、１Ｍ希塩酸（５ｍＬ）および水（５０ｍＬ）を添加し、酢酸エチル（８０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（５０ｍＬ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、得られた残留物をカラムクロマトグラフィー（溶離液：酢酸エチル／石油エーテル＝０：１～３：２、体積比）で精製し、さらに分取ＨＰＬＣ（移動相：アセトニトリル／水、中性系）で精製し、真空で凍結乾燥し、アモルファス形態の目的化合物１を得た。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ： ４０９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ： ７．１１－７．０８（ｍ，２Ｈ），７．０６－７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９－６．７４（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０８－３．９６（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0048】
実施例２：化合物１の結晶体Ａの調製
【化5】
【0049】
工程１：化合物４の合成
２０℃～３０℃で、化合物２（２００．０５ｇ，１．２６ｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２０００ｍＬ）に溶解した後、化合物３（５１６．４５ｇ，１．８９ｍｏＬ）を加え、さらに、上記溶液にジイソプロピルエチルアミン（３２５．００ｇ，２．５２ｍｏｌ）をゆっくりと滴下（滴下時間：約２０分）し、滴下した後、反応混合物を１１０℃～１２０℃に加熱し、また１１０℃～１２０℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、１５℃に冷却し、反応液を氷水（１０５００ｍＬ）にゆっくりと注いだ。大量の固形物が析出し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去した後、サンプルをエタノール（１５００ｍＬ）に加え、１５℃でスラリー化させ、１６時間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを減圧下で乾燥させて溶媒を除去し、目的化合物４を得た。１ＨＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ： ８．５２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．９， ３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０－７．１５（ｍ，１Ｈ），６．９６－６．９３（ｍ，１Ｈ），６．９０－６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８２－６．７８（ｍ，１Ｈ），５．２０－５．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄｄ，Ｊ＝１４．７， ８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１４．７， ４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
２０℃～３０℃で、化合物２（２００．０５ｇ，１．２６ｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（２０００ｍＬ）に溶解した後、化合物３（５１６．４５ｇ，１．８９ｍｏＬ）を加え、さらに、上記溶液にジイソプロピルエチルアミン（３２５．００ｇ，２．５２ｍｏｌ）をゆっくりと滴下（滴下時間：約２０分）し、滴下した後、反応混合物を１１０℃～１２０℃に加熱し、また１１０℃～１２０℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、１５℃に冷却し、反応液を氷水（１０５００ｍＬ）にゆっくりと注いだ。大量の固形物が析出し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去した後、サンプルをエタノール（１５００ｍＬ）に加え、１５℃でスラリー化させ、１６時間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを減圧下で乾燥させて溶媒を除去し、目的化合物４を得た。１ＨＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ： ８．５２（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．９， ３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０－７．１５（ｍ，１Ｈ），６．９６－６．９３（ｍ，１Ｈ），６．９０－６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８２－６．７８（ｍ，１Ｈ），５．２０－５．１５（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．０１（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄｄ，Ｊ＝１４．７， ８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．４８（ｄｄ，Ｊ＝１４．７， ４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。
【0050】
工程２：化合物５の合成
窒素雰囲気下、２０℃～２５℃で、化合物４（１２２．８３ｇ，０．３０ｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）と酢酸エチル（５００ｍＬ）との混合溶媒に溶解させた後、パラジウム炭素（水湿潤品）（７．５０ｇ，純度：１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、水素雰囲気（２５～３５ｐｓｉ）下、２５℃～３５℃で反応混合物を撹拌しながら１６時間反応（４つのバッチを並行して反応させた後、合わせて処理した）させた。反応が完了した後、４つのバッチの反応液を合わせて、セライトで濾過し、フィルターケーキをジクロロメタン（２００ｍＬ）で洗浄し、濾液を減圧下で回転蒸発して乾固させ、粗生成物を得た。粗生成物をエタノール（３２００ｍＬ）に加え、７８℃に昇温し、さらに７８℃で１時間（反応混合物が完全に透明になるまで）撹拌し、加熱を停止し、撹拌しながら２０℃にゆっくりと冷却させ、また２０℃でさらに１２時間撹拌した。撹拌中に大量の固形物が析出した。反応混合物を濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で回転蒸発乾固させた後、４０６．１５ｇの生成物を得た。３２９．５０ｇの生成物を秤量し、ジクロロメタン（２０００ｍＬ）で溶解させ、カラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝１：０、体積比）で精製して化合物５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ： ７．０７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，２Ｈ），６．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｔｄ，Ｊ＝８．６，２．９，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔｄ，Ｊ＝９．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．７３－３．６７（ｍ，４Ｈ），３．３９－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
窒素雰囲気下、２０℃～２５℃で、化合物４（１２２．８３ｇ，０．３０ｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）と酢酸エチル（５００ｍＬ）との混合溶媒に溶解させた後、パラジウム炭素（水湿潤品）（７．５０ｇ，純度：１０％）を加え、水素ガスで３回置換し、水素雰囲気（２５～３５ｐｓｉ）下、２５℃～３５℃で反応混合物を撹拌しながら１６時間反応（４つのバッチを並行して反応させた後、合わせて処理した）させた。反応が完了した後、４つのバッチの反応液を合わせて、セライトで濾過し、フィルターケーキをジクロロメタン（２００ｍＬ）で洗浄し、濾液を減圧下で回転蒸発して乾固させ、粗生成物を得た。粗生成物をエタノール（３２００ｍＬ）に加え、７８℃に昇温し、さらに７８℃で１時間（反応混合物が完全に透明になるまで）撹拌し、加熱を停止し、撹拌しながら２０℃にゆっくりと冷却させ、また２０℃でさらに１２時間撹拌した。撹拌中に大量の固形物が析出した。反応混合物を濾過し、フィルターケーキをエタノール（２００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で回転蒸発乾固させた後、４０６．１５ｇの生成物を得た。３２９．５０ｇの生成物を秤量し、ジクロロメタン（２０００ｍＬ）で溶解させ、カラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン／メタノール＝１：０、体積比）で精製して化合物５を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ： ７．０７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１－６．８４（ｍ，２Ｈ），６．３６（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝８．６，５．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｔｄ，Ｊ＝８．６，２．９，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），４．７４（ｔｄ，Ｊ＝９．４，３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２－３．９６（ｍ，２Ｈ），３．７３－３．６７（ｍ，４Ｈ），３．３９－３．３６（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0051】
工程３：化合物１の結晶体Ａの合成
窒素雰囲気下、２０℃で化合物５（１７５．０９ｇ，０．４６ｍｏＬ）をアセトン（１８００ｍＬ）に溶解した後、カルボニルジイミダゾール（１６３．３２ｇ，１．０１ｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５℃～２５℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、反応混合物をそのまま減圧下で濃縮し、得られた残留物を酢酸エチル（１０００ｍＬ）で溶解させ、１Ｍ希塩酸（１０００ｍＬ×２）で洗浄し、水（１０００ｍＬ×２）で洗浄し、飽和食塩水（１０００ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。得られた残留物をエタノール（３６０ｍＬ）に加え、３０分間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（１００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、さらに、減圧下で溶媒を除去し、生成物を得た。次に、生成物をエタノール（１５０ｍＬ）と酢酸エチル（１５０ｍＬ）との混合溶媒に加え、反応混合物を７８℃に加熱し、反応液が透明になるまで７８℃でさらに撹拌した。加熱を停止し、撹拌しながら反応液を２０℃まで自然に冷却し、さらに１２時間撹拌した。撹拌中に固形物が析出し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（５０ｍＬ×２）で洗浄した。フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去し、生成物を得た。その後、生成物をエタノール（６０ｍＬ）と酢酸エチル（６０ｍＬ）との混合溶媒に加え、反応混合物を２０℃で２時間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去した後、真空で６時間乾燥（温度４０～４５℃、圧力：－０．０８ＭＰａ）させ、目的化合物１の結晶体Ａを得た。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ： ４０９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ： ７．１１－７．０８（ｍ，２Ｈ），７．０６－７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９－６．７４（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０８－３．９６（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
窒素雰囲気下、２０℃で化合物５（１７５．０９ｇ，０．４６ｍｏＬ）をアセトン（１８００ｍＬ）に溶解した後、カルボニルジイミダゾール（１６３．３２ｇ，１．０１ｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５℃～２５℃で撹拌しながら１６時間反応させた。反応が完了した後、反応混合物をそのまま減圧下で濃縮し、得られた残留物を酢酸エチル（１０００ｍＬ）で溶解させ、１Ｍ希塩酸（１０００ｍＬ×２）で洗浄し、水（１０００ｍＬ×２）で洗浄し、飽和食塩水（１０００ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。得られた残留物をエタノール（３６０ｍＬ）に加え、３０分間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（１００ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、さらに、減圧下で溶媒を除去し、生成物を得た。次に、生成物をエタノール（１５０ｍＬ）と酢酸エチル（１５０ｍＬ）との混合溶媒に加え、反応混合物を７８℃に加熱し、反応液が透明になるまで７８℃でさらに撹拌した。加熱を停止し、撹拌しながら反応液を２０℃まで自然に冷却し、さらに１２時間撹拌した。撹拌中に固形物が析出し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（５０ｍＬ×２）で洗浄した。フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去し、生成物を得た。その後、生成物をエタノール（６０ｍＬ）と酢酸エチル（６０ｍＬ）との混合溶媒に加え、反応混合物を２０℃で２時間撹拌し、濾過し、フィルターケーキをエタノール（１０ｍＬ）で洗浄し、フィルターケーキを回収し、減圧下で溶媒を除去した後、真空で６時間乾燥（温度４０～４５℃、圧力：－０．０８ＭＰａ）させ、目的化合物１の結晶体Ａを得た。ＭＳ－ＥＳＩｍ／ｚ： ４０９．０ ［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ： ７．１１－７．０８（ｍ，２Ｈ），７．０６－７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７９－６．７４（ｍ，１Ｈ），６．００（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，１０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０８－３．９６（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），２．９４（ｓ，３Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0052】
実施例３：化合物１の結晶体Ａの調製
約１７５ｍｇのアモルファス形態の化合物１を１．０ｍＬのエタノールに加え、超音波で溶解した。次に、超音波処理を続けて白色固形物を大量に析出させた。室温で懸濁液を３時間撹拌した後、遠心分離して、化合物１の結晶体Ａである固体を得た。
約１７５ｍｇのアモルファス形態の化合物１を１．０ｍＬのエタノールに加え、超音波で溶解した。次に、超音波処理を続けて白色固形物を大量に析出させた。室温で懸濁液を３時間撹拌した後、遠心分離して、化合物１の結晶体Ａである固体を得た。
【0053】
実施例４：化合物１の溶媒和物の結晶体Ｂの調製
【化6】
【0054】
約２４ｍｇのアモルファス形態の化合物１を０．２ｍＬのｍ－キシレンに加え、室温で懸濁液を約２日間撹拌し、遠心分離して、結晶体Ｂである固体を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ｍＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ： ８．２１（ｓ，１Ｈ），７．１５（ｄｄ，Ｊ＝７．４，７．４Ｈｚ，０．５Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄ，Ｊ＝８．３，２．３Ｈｚ，１Ｈ），７．００－６．９７（ｍ，２．５Ｈ），６．８４－６．７８（ｍ，３Ｈ），５．７６（ｄｄ，Ｊ＝９．５，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．７１（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，９．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０６（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），１．４４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）。
【0055】
実験例１：化合物１の結晶体Ａの吸湿性に関する研究
実験材料：
ＳＭＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ－１動的蒸気吸着測定装置
実験法：
１０～３０ｍｇの化合物１の結晶体ＡをＤＶＳサンプルパンに取り、測定を行った。
実験の結果：
化合物１の結晶体ＡのＤＶＳ曲線を図４に示す。ΔＷ＝０．０５％である。
実験の結論：
化合物１の結晶体Ａは、２５℃および８０％ＲＨでの吸湿による重量増加が０．０５％であり、０．２％未満であり、吸湿性がないか、またはほとんどない。
実験材料：
ＳＭＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ－１動的蒸気吸着測定装置
実験法：
１０～３０ｍｇの化合物１の結晶体ＡをＤＶＳサンプルパンに取り、測定を行った。
実験の結果：
化合物１の結晶体ＡのＤＶＳ曲線を図４に示す。ΔＷ＝０．０５％である。
実験の結論：
化合物１の結晶体Ａは、２５℃および８０％ＲＨでの吸湿による重量増加が０．０５％であり、０．２％未満であり、吸湿性がないか、またはほとんどない。
【0056】
実験例２：異なる溶媒での化合物１の結晶体Ａの安定性実験
化合物１の結晶体Ａの１７部をそれぞれ約１５ｍｇで秤量し、以下の表に示す単一または混合溶媒を適量でそれぞれ加え、室温または５０℃の条件下で懸濁液を２週間撹拌した。遠心分離して、固体を収集し、ＸＲＰＤによってその結晶体の状態を検出した。結果を表３に示す。
化合物１の結晶体Ａの１７部をそれぞれ約１５ｍｇで秤量し、以下の表に示す単一または混合溶媒を適量でそれぞれ加え、室温または５０℃の条件下で懸濁液を２週間撹拌した。遠心分離して、固体を収集し、ＸＲＰＤによってその結晶体の状態を検出した。結果を表３に示す。
【0057】
表３ 異なる溶媒での化合物１の結晶体Ａの安定性実験
【表4】
【0058】
実験結論：化合物１の結晶体Ａは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、トルエン、水、およびアルコール系溶媒と水との混合溶媒などの溶媒中で良好な安定性を有する。
【0059】
実験例３：高温、高湿度および強光照射の条件での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、高温（６０℃、開放）、高湿度（室温／相対湿度９２．５％、開放）および強光照射（５０００±５００Ｌｕｘ、９０μｗ／ｃｍ２、密閉）の条件での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、高温（６０℃、開放）、高湿度（室温／相対湿度９２．５％、開放）および強光照射（５０００±５００Ｌｕｘ、９０μｗ／ｃｍ２、密閉）の条件での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
【0060】
化合物１の結晶形Ａを１．５ｇ秤量し、開放した時計皿に入れ、薄層に広げた。高温および高湿度の条件下で放置したサンプルを、デシケーターに入れ、５日目、１０日目および３０日目にサンプリングして測定し、測定結果を０日目の初期測定結果と比較した。強光照射の条件下で放置したサンプルを石英ガラスキャップで覆い、５日目および１０日目にサンプリングして測定し、測定結果を０日目の初期測定結果と比較した。実験の結果を以下の表４に示す。
【0061】
表４ 高温、高湿度および強光照射の条件での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験の結果
【表5】
【0062】
結論：化合物１の結晶体Ａは、高温、高湿度または強光照射の条件下で良好な安定性を有する。
【0063】
実験例４：加速条件での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、高温および高湿度の加速条件（４０℃／相対湿度７５％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、高温および高湿度の加速条件（４０℃／相対湿度７５％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
【0064】
化合物１の結晶形Ａを約１．５ｇ秤量し、２層の低密度ポリエチレンバッグに入れた。低密度ポリエチレンバッグの各層をそれぞれ縛って密封し、さらに、アルミホイルバッグに入れてヒートシールした。１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目にサンプリングして測定し、測定結果を０日目の初期測定結果と比較した。実験の結果を以下の表５に示す。
【0065】
表５ 加速条件（４０℃／相対湿度７５％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験の結果
【表6】
【0066】
結論：化合物１の結晶体Ａは、４０℃／相対湿度７５％の加速条件下で良好な安定性を有する。
【0067】
実験例５：長期条件での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、長期条件（２５℃／相対湿度６０％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
《原薬と製剤の安定性試験のガイドライン》（中国薬局方２０１５年版、第四巻、一般原則９００１）に従って、長期条件（２５℃／相対湿度６０％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの安定性を考察した。
【0068】
化合物１の結晶形Ａを約１．５ｇ秤量し、２層の低密度ポリエチレンバッグに入れた。低密度ポリエチレンバッグの各層をそれぞれ縛って密封し、さらに、アルミホイルバッグに入れてヒートシールした。３ヶ月目、６ヶ月目にサンプリングして測定し、測定結果を０日目の初期測定結果と比較した。実験の結果を以下の表６に示す。
【0069】
表６ 長期条件（２５℃／相対湿度６０％、密閉）での化合物１の結晶体Ａの固体安定性実験の結果
【表7】
【0070】
結論：化合物１の結晶体Ａは、２５℃／相対湿度６０％の長期条件下で良好な安定性を有する。
【0071】
アッセイ例１：ホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ酵素）に対する化合物１の阻害活性
この生物学的実験では、蛍光偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、即ち、ＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡することで酵素の活性を示す。
この生物学的実験では、蛍光偏光によりＡＭＰ／ＧＭＰの発現を測定し、即ち、ＡＭＰ／ＧＭＰ抗体の結合を追跡することで酵素の活性を示す。
【0072】
試薬：
実験緩衝溶液：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸緩衝溶液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び１％ＤＭＳＯ。
酵素：組換えヒトＰＤＥ４Ｂ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００２６００；アミノ酸３０５末端）は、Ｎ末端ＧＳＴタグを使用して、Ｓｆ９昆虫細胞においてバキュロウイルスで発現された。ＭＷ＝７８ｋＤａ。
酵素基質：１μＭ ｃＡＭＰ
検出：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ａｎｔｉｂｏｄｙおよびＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３ ｔｒａｃｉｎｇ。
実験緩衝溶液：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸緩衝溶液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３５）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び１％ＤＭＳＯ。
酵素：組換えヒトＰＤＥ４Ｂ（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００２６００；アミノ酸３０５末端）は、Ｎ末端ＧＳＴタグを使用して、Ｓｆ９昆虫細胞においてバキュロウイルスで発現された。ＭＷ＝７８ｋＤａ。
酵素基質：１μＭ ｃＡＭＰ
検出：Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ａｎｔｉｂｏｄｙおよびＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３ ｔｒａｃｉｎｇ。
【0073】
操作手順：
１．組換えヒトＰＤＥ４Ｂ酵素および酵素基質（１μＭ ｃＡＭＰ）を、新たに調製した実験緩衝液にそれぞれ溶解した。
２．上記のＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．アコースティックテクノロジー（エコー５５０ナノリットル範囲）により、１００％ＤＭＳＯで溶解した化合物１を、ＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝液の反応ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。
４．次に、酵素基質緩衝溶液を上記の反応ウェルに加えて反応を開始した。
５．室温で１時間インキュベートした。
６．検出混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ａｎｔｉｂｏｄｙおよびＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３ ｔｒａｃｉｎｇ）を加えて反応を停止し、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光偏光測定の範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
１．組換えヒトＰＤＥ４Ｂ酵素および酵素基質（１μＭ ｃＡＭＰ）を、新たに調製した実験緩衝液にそれぞれ溶解した。
２．上記のＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝溶液を反応ウェルに移した。
３．アコースティックテクノロジー（エコー５５０ナノリットル範囲）により、１００％ＤＭＳＯで溶解した化合物１を、ＰＤＥ４Ｂ酵素緩衝液の反応ウェルに添加し、室温で１０分間インキュベートした。
４．次に、酵素基質緩衝溶液を上記の反応ウェルに加えて反応を開始した。
５．室温で１時間インキュベートした。
６．検出混合物（Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ（登録商標）ＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ａｎｔｉｂｏｄｙおよびＡＭＰ２／ＧＭＰ２ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３ ｔｒａｃｉｎｇ）を加えて反応を停止し、ゆっくりと混合しながら９０分間インキュベートした。蛍光偏光測定の範囲はＥｘ／Ｅｍ＝６２０／６８８であった。
【0074】
データ分析：
ＡＭＰ／ＧＭＰ標準曲線とＥｘｃｅｌソフトウェアで計算したＤＭＳＯ対照に対する酵素活性％から、蛍光偏光信号をｎＭに換算した。カーブフィッティングではＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（医学アイコンの描画）を使用した。
ＡＭＰ／ＧＭＰ標準曲線とＥｘｃｅｌソフトウェアで計算したＤＭＳＯ対照に対する酵素活性％から、蛍光偏光信号をｎＭに換算した。カーブフィッティングではＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（医学アイコンの描画）を使用した。
【0075】
表７ 本発明の化合物１のインビトロスクリーニングアッセイの結果
【表8】
【0076】
＊３つのウェルで同様なアッセイを実施し、平均値をとる。
【0077】
結論：化合物１は、ホスホジエステラーゼ４Ｂサブタイプ（ＰＤＥ４Ｂ）を阻害する優れたインビトロ活性を示す。
【0078】
アッセイ例２：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）におけるＴＮＦαの産生に対する阻害効果のインビトロ評価
実験目的：
リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発されるヒト末梢血単核細胞におけるＴＮＦαの産生に対する化合物１の阻害活性。
実験目的：
リポ多糖（ＬＰＳ）によって誘発されるヒト末梢血単核細胞におけるＴＮＦαの産生に対する化合物１の阻害活性。
【0079】
実験操作の手順：
１．ＰＢＭＣ実験
細胞培養グレードの９６ウェルプレートに、１０００００細胞／１００μＬ／ウェルの密度でＰＢＭＣ細胞を播種した。細胞培養培地は、１０％血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０であった。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでプレートを２時間インキュベートした。１６．８μＬ／ウェルの試験化合物を細胞に添加し、次に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６０分間インキュベートした。その後、１６．８μＬ／ウェルのＬＰＳを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１８時間インキュベートした。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった
１．ＰＢＭＣ実験
細胞培養グレードの９６ウェルプレートに、１０００００細胞／１００μＬ／ウェルの密度でＰＢＭＣ細胞を播種した。細胞培養培地は、１０％血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０であった。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでプレートを２時間インキュベートした。１６．８μＬ／ウェルの試験化合物を細胞に添加し、次に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６０分間インキュベートした。その後、１６．８μＬ／ウェルのＬＰＳを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１８時間インキュベートした。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった
【0080】
２．化合物の用量の勾配希釈
１番目のステップでは、化合物１を、１００％ＤＭＳＯでストック濃度から１．５ｍＭに希釈した。２番目のステップでは、希釈した化合物を最初の点として使用し、１００％ＤＭＳＯで３倍で９点まで連続希釈した。３番目のステップでは、無血清培地で１２５倍に希釈し、その時にＤＭＳＯの濃度は０．８％であった。次に、１００μＬの細胞プレートに、培地で希釈した化合物を１６．８μＬ移した。
化合物を加えた後、細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
１番目のステップでは、化合物１を、１００％ＤＭＳＯでストック濃度から１．５ｍＭに希釈した。２番目のステップでは、希釈した化合物を最初の点として使用し、１００％ＤＭＳＯで３倍で９点まで連続希釈した。３番目のステップでは、無血清培地で１２５倍に希釈し、その時にＤＭＳＯの濃度は０．８％であった。次に、１００μＬの細胞プレートに、培地で希釈した化合物を１６．８μＬ移した。
化合物を加えた後、細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
【0081】
３．ＬＰＳの希釈
１番目のステップでは、超純水でＬＰＳを１ｍｇ／ｍＬのストック濃度に希釈した。２番目のステップでは、ストック濃度のＬＰＳを無血清培地で１μｇ／ｍＬに希釈した。３番目のステップでは、ＬＰＳを無血清培地で１６６６．６６６倍に希釈した。次に、１１６．８μＬの細胞プレートに、培地で希釈したＬＰＳを１６．８μＬ移し、その時にＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。ＬＰＳを添加した後、細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１８時間インキュベートした。
１番目のステップでは、超純水でＬＰＳを１ｍｇ／ｍＬのストック濃度に希釈した。２番目のステップでは、ストック濃度のＬＰＳを無血清培地で１μｇ／ｍＬに希釈した。３番目のステップでは、ＬＰＳを無血清培地で１６６６．６６６倍に希釈した。次に、１１６．８μＬの細胞プレートに、培地で希釈したＬＰＳを１６．８μＬ移し、その時にＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。ＬＰＳを添加した後、細胞プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１８時間インキュベートした。
【0082】
４．ＥＬＩＳＡアッセイ
１）コーティング溶液でＴＮＦ－α抗体を１倍の容量に希釈した後、高い結合性能を持つ９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μＬで添加した。プレートをフィルムで密封し、４℃の冷蔵庫に１８時間入れた。
２）２０００ｍＬの洗浄緩衝液を１倍量まで配合して用意した。
３）プレートを一晩コーティングした後、コーティング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
４）プレートを洗浄した後、ブロッキング緩衝液を各ウェルに２００μＬで添加し、プレートをフィルムで密封し、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
５）１８時間インキュベートした細胞プレートを遠心分離機で遠心分離（温度：２５℃、回転数：２０００ｒｐｍ、時間：１０分、速度増加：９、速度減少：１）した。遠心分離した後、ウェルあたり１００μＬの細胞上清を３５９９細胞プレートに移し、４℃の冷蔵庫に入れた。
６）ブロッキング緩衝液で細胞上清を４０倍に希釈し、４℃の冷蔵庫に入れた。標準液を配合し、４℃の冷蔵庫に入れた。
７）ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
８）希釈した細胞上清サンプルおよび標準液をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートをフィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、２時間インキュベートした。
９）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
１０）抗体液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した。プレートを密封フィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
１１）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で７回洗浄した。
１２）発色溶液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した後、２５℃のインキュベーターに入れ、暗所で３０分間インキュベートした。
１３）各ウェルに５０μＬの停止液を加え、プレートを遠心分離（温度：２５℃、回転数：１０００ｒｐｍ、時間：１分、速度増加：９、速度減少：９）した。
１４）遠心分離後３０分以内にＥｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、４５０での吸光度から５７０での吸光度を差し引いた値を最終的な生データとして使用した。
１）コーティング溶液でＴＮＦ－α抗体を１倍の容量に希釈した後、高い結合性能を持つ９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μＬで添加した。プレートをフィルムで密封し、４℃の冷蔵庫に１８時間入れた。
２）２０００ｍＬの洗浄緩衝液を１倍量まで配合して用意した。
３）プレートを一晩コーティングした後、コーティング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
４）プレートを洗浄した後、ブロッキング緩衝液を各ウェルに２００μＬで添加し、プレートをフィルムで密封し、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
５）１８時間インキュベートした細胞プレートを遠心分離機で遠心分離（温度：２５℃、回転数：２０００ｒｐｍ、時間：１０分、速度増加：９、速度減少：１）した。遠心分離した後、ウェルあたり１００μＬの細胞上清を３５９９細胞プレートに移し、４℃の冷蔵庫に入れた。
６）ブロッキング緩衝液で細胞上清を４０倍に希釈し、４℃の冷蔵庫に入れた。標準液を配合し、４℃の冷蔵庫に入れた。
７）ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
８）希釈した細胞上清サンプルおよび標準液をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートをフィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、２時間インキュベートした。
９）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
１０）抗体液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した。プレートを密封フィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
１１）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で７回洗浄した。
１２）発色溶液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した後、２５℃のインキュベーターに入れ、暗所で３０分間インキュベートした。
１３）各ウェルに５０μＬの停止液を加え、プレートを遠心分離（温度：２５℃、回転数：１０００ｒｐｍ、時間：１分、速度増加：９、速度減少：９）した。
１４）遠心分離後３０分以内にＥｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、４５０での吸光度から５７０での吸光度を差し引いた値を最終的な生データとして使用した。
【0083】
５．データ処理
生データに基づいて、以下の式に従って阻害率を算出した。
阻害率＝（１－（生データの値－ＨＰＥ平均値）／（ＺＰＥ平均値－ＨＰＥ平均値））＊１００
ここで、ＺＰＥは０％阻害（７５ｐｇ／ｍＬ ＬＰＳ、０．１％ＤＭＳＯ）であり、ＨＰＥは１００％阻害（ＬＰＳなし、０．１％ＤＭＳＯ）である。
ＸＬｆｉｔ統計ソフトウェアを用いてデータ分析を実施した。ＩＣ５０は、以下のように算出した。４パラメーターのロジスティック（ｌｏｇｉｓｔｉｃ）用量反応方程式を使用して、試験化合物の濃度と阻害率（％）をプロットし、５０％阻害に必要な化合物濃度（ＩＣ５０）を決定した。
生データに基づいて、以下の式に従って阻害率を算出した。
阻害率＝（１－（生データの値－ＨＰＥ平均値）／（ＺＰＥ平均値－ＨＰＥ平均値））＊１００
ここで、ＺＰＥは０％阻害（７５ｐｇ／ｍＬ ＬＰＳ、０．１％ＤＭＳＯ）であり、ＨＰＥは１００％阻害（ＬＰＳなし、０．１％ＤＭＳＯ）である。
ＸＬｆｉｔ統計ソフトウェアを用いてデータ分析を実施した。ＩＣ５０は、以下のように算出した。４パラメーターのロジスティック（ｌｏｇｉｓｔｉｃ）用量反応方程式を使用して、試験化合物の濃度と阻害率（％）をプロットし、５０％阻害に必要な化合物濃度（ＩＣ５０）を決定した。
【0084】
表８ ｈＰＢＭＣにおけるＴＮＦαの産生に対する本発明の化合物１の阻害活性の結果
【表9】
【0085】
＊３つのウェルで同様なアッセイを実施し、平均値をとる。
【0086】
実験結論：化合物１は、ｈＰＢＭＣにおいてＴＮＦαの産生を阻害する優れたインビトロ活性を示す。
【0087】
アッセイ例３：ＰＭＡに誘発されるＣＤ－１マウスの耳浮腫のインビボモデル
実験の目的：
炎症性浮腫は、組織浮腫とも呼ばれ、炎症による滲出液が組織の隙間に蓄積することで生じる浮腫である。ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－Ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）をマウスの耳に局所投与すると、プロテインキナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ、ＰＫＣ）によって媒介される明らかな炎症反応が起こり、それによってヒトアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、ＡＤ）と同様の一連の症状を引き起こす。通常、ＡＤの治療のための候補化合物の前臨床評価において、マウスにおけるＰＭＡ誘発性耳浮腫の動物モデルは、その有効性を評価するために用いられる。
この実験の目的は、ＰＭＡに誘発されるＣＤ－１マウスの耳浮腫のモデルにおける化合物１の治療効果を考察し、その後の臨床研究のための前臨床薬力学的情報を提供することである。
実験の目的：
炎症性浮腫は、組織浮腫とも呼ばれ、炎症による滲出液が組織の隙間に蓄積することで生じる浮腫である。ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２－Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３－Ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）をマウスの耳に局所投与すると、プロテインキナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ、ＰＫＣ）によって媒介される明らかな炎症反応が起こり、それによってヒトアトピー性皮膚炎（Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、ＡＤ）と同様の一連の症状を引き起こす。通常、ＡＤの治療のための候補化合物の前臨床評価において、マウスにおけるＰＭＡ誘発性耳浮腫の動物モデルは、その有効性を評価するために用いられる。
この実験の目的は、ＰＭＡに誘発されるＣＤ－１マウスの耳浮腫のモデルにおける化合物１の治療効果を考察し、その後の臨床研究のための前臨床薬力学的情報を提供することである。
【0088】
実験の方法：
１．ＰＭＡの調製
１ｍＬのアセトンを加えて１ｍｇのＰＭＡを完全に溶解させた後、８００μＬの母液をピペットで取り、２４００μＬのアセトンに加えて、０．２５ｍｇ／ｍＬのＰＭＡを調製した。
２．ＰＭＡ誘発処理
ＣＤ－１マウスを、耳の厚さおよび体重に従って並べ替えた。平均値と大きく異なる４匹のマウスを取り除いた後、残りのマウスをランダムに正常対照群（６匹のマウス）と治療群（各治療群に１０匹のマウス）に分けた。濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬである１０μＬのＰＭＡを、それぞれマウスの右耳の表裏両面に塗布した。
正常対照群のマウスは、誘発処理を実施する必要はない。
３．投与および用量のデザイン
第１群のマウスは正常なマウスであり、何の処理もされなかった。第２群のマウスに溶媒を投与した。第３群、第４群、および第５群のマウスに、それぞれ、０．１ｍｇ／耳、０．３ｍｇ／耳、および１ｍｇ／耳の用量で化合物１を投与した。なお、ＰＭＡ誘発処理の３０分前とＰＭＡ誘発処理の１５分後に、それぞれマウスの右耳に薬を塗布した。
１．ＰＭＡの調製
１ｍＬのアセトンを加えて１ｍｇのＰＭＡを完全に溶解させた後、８００μＬの母液をピペットで取り、２４００μＬのアセトンに加えて、０．２５ｍｇ／ｍＬのＰＭＡを調製した。
２．ＰＭＡ誘発処理
ＣＤ－１マウスを、耳の厚さおよび体重に従って並べ替えた。平均値と大きく異なる４匹のマウスを取り除いた後、残りのマウスをランダムに正常対照群（６匹のマウス）と治療群（各治療群に１０匹のマウス）に分けた。濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬである１０μＬのＰＭＡを、それぞれマウスの右耳の表裏両面に塗布した。
正常対照群のマウスは、誘発処理を実施する必要はない。
３．投与および用量のデザイン
第１群のマウスは正常なマウスであり、何の処理もされなかった。第２群のマウスに溶媒を投与した。第３群、第４群、および第５群のマウスに、それぞれ、０．１ｍｇ／耳、０．３ｍｇ／耳、および１ｍｇ／耳の用量で化合物１を投与した。なお、ＰＭＡ誘発処理の３０分前とＰＭＡ誘発処理の１５分後に、それぞれマウスの右耳に薬を塗布した。
【0089】
表９ 実験の群分けおよび用量のデザイン
【表10】
【0090】
注：ＮＡは「なし」を表し、ＢＩＤは「１日２回の投与」を表す。
【0091】
４．耳浮腫の発症指標の測定
測定およびサンプリング：ＰＭＡ誘発処理の１０時間後、マウスに麻酔をかけ、右耳の厚さを測定した。右耳の厚さを測定した後、すぐにマウスを安楽死させ、耳の部分（ｅａｒ ｐｉｅｃｅ）を集めて秤量した。
測定およびサンプリング：ＰＭＡ誘発処理の１０時間後、マウスに麻酔をかけ、右耳の厚さを測定した。右耳の厚さを測定した後、すぐにマウスを安楽死させ、耳の部分（ｅａｒ ｐｉｅｃｅ）を集めて秤量した。
【0092】
５．統計学的処理
実験データは、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表され、耳の腫脹の程度および耳の重量は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析され、ここで、ｐ＜０．０５の場合、有意差があると見なされる。
実験データは、平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表され、耳の腫脹の程度および耳の重量は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）によって分析され、ここで、ｐ＜０．０５の場合、有意差があると見なされる。
【0093】
実験の結果：
ＰＭＡ誘発処理後、１０時間の時点で測定した結果、耳の厚さは０．３００～０．４００ｍｍ増加し、通常の腫脹の範囲（－０．０１０～０．００２ｍｍ）よりもはるかに高く、また、耳の重量は平均２８．８ｍｇ増加し、耳浮腫モデルの確立は非常に成功したことを示した。
試験化合物１は、１０時間の時点では、０．１ｍｇ／耳、０．３ｍｇ／耳および１ｍｇ／耳の３つの用量で、耳浮腫マウスの浮腫程度を著しく低下させることができ、良好な用量反応関係を示した。なお、耳の浮腫の阻害率はそれぞれ２２％、３９％、および８８％であり、耳の重量増加の阻害率はそれぞれ３９％、４６％、および８５％であった（溶媒対照群と比較して、すべてのｐ値＜０．０００１）。
ＰＭＡ誘発処理後、１０時間の時点で測定した結果、耳の厚さは０．３００～０．４００ｍｍ増加し、通常の腫脹の範囲（－０．０１０～０．００２ｍｍ）よりもはるかに高く、また、耳の重量は平均２８．８ｍｇ増加し、耳浮腫モデルの確立は非常に成功したことを示した。
試験化合物１は、１０時間の時点では、０．１ｍｇ／耳、０．３ｍｇ／耳および１ｍｇ／耳の３つの用量で、耳浮腫マウスの浮腫程度を著しく低下させることができ、良好な用量反応関係を示した。なお、耳の浮腫の阻害率はそれぞれ２２％、３９％、および８８％であり、耳の重量増加の阻害率はそれぞれ３９％、４６％、および８５％であった（溶媒対照群と比較して、すべてのｐ値＜０．０００１）。
【0094】
実験の結論：
０．１、０．３および１ｍｇ／耳の３つの用量群において、化合物１は、ＰＭＡ誘発性耳浮腫の症状に対して顕著な改善効果を有し、耳の重量増加を著しく阻害することができ、しかも３つの用量群はすべて良好な用量反応関係を示した。
０．１、０．３および１ｍｇ／耳の３つの用量群において、化合物１は、ＰＭＡ誘発性耳浮腫の症状に対して顕著な改善効果を有し、耳の重量増加を著しく阻害することができ、しかも３つの用量群はすべて良好な用量反応関係を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2022-03-03
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｘ線粉末回折パターンは、１１．９１±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２３．１７±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、【化1】
【請求項2】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項3】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６±０．２０°、１１．９１±０．２０°、１２．９１±０．２０°、１４．２７±０．２０°、１５．８３±０．２０°、１７．５３±０．２０°、１９．３６±０．２０°、２０．３３±０．２０°、２２．２６±０．２０°、２３．１７±０．２０°、２４．９７±０．２０°、２６．５０±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項２に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項4】
Ｘ線粉末回折パターンが、１１．２６°、１１．９１°、１２．９１°、１４．２７°、１５．８３°、１７．５３°、１９．３６°、２０．３３°、２２．２６°、２２．５９°、２３．１７°、２４．９７°、２６．５０°、２９．４６°の２θ角に特徴的回折ピークを有し、好ましくは、ＸＲＰＤパターンが図１に示すとおりである、
請求項３に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項5】
示差走査熱量測定曲線が、１４７．０±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有し、好ましくは、ＤＳＣパターンが図２に示すとおりである、
請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項6】
熱重量分析曲線が、１４０．０±３．０℃で０．７０％の重量損失を有し、好ましくは、ＴＧＡ曲線が図３に示すとおりである、
請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ。
【請求項7】
【化2】
式（Ｉ－１）で表される化合物の溶媒和物。
【請求項8】
ｎが０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４および１．５から選択され、好ましくは、ｎが０．５である、
請求項７に記載の溶媒和物。
【請求項9】
【化3】
式（Ｉ－１－１）で表される溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項10】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項９に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項11】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、１１．２７±０．２０°、１２．７５±０．２０°、１６．１５±０．２０°、１７．５４±０．２０°、１９．１７±０．２０°、１９．７０±０．２０°、２０．４１±０．２０°、２２．０６±０．２０°、２３．００±０．２０°、２５．９５±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する、請求項１０に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項12】
Ｘ線粉末回折パターンが、６．８４°、８．９０°、１１．２７°、１２．７５°、１３．２９°、１４．９４°、１６．１５°、１７．５４°、１７．９３°、１９．１７°、１９．７０°、２０．４１°、２０．７９°、２２．０６°、２２．７２°、２３．００°、２３．８６°、２５．９５°、２７．８２°、２８．４５°、３０．１４°、３２．８７°の２θ角に特徴的回折ピークを有し、好ましくは、ＸＲＰＤパターンが図５に示すとおりである、
請求項１１に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項13】
示差走査熱量測定曲線が、７７．５±３．０℃に吸熱ピークの開始点を有し、好ましくは、ＤＳＣパターンが図６に示すとおりである、
請求項９～１２のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項14】
熱重量分析曲線が、８０．０±３．０℃で１０．４６％の重量損失を有し、好ましくは、ＴＧＡ曲線が図７に示すとおりである、
請求項９～１３のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂ。
【請求項15】
ＴＮＦαに関連する疾患を治療するための医薬品の調製における、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物１の結晶体Ａ、または請求項７～８のいずれか一項に記載の溶媒和物、または請求項９～１４のいずれか一項に記載の溶媒和物の結晶体Ｂの使用。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0020】
また、本発明は、式（Ｉ－１－１）で表される溶媒和物の結晶体Ｂを提供する。そのＸ線粉末回折パターンは、６．８４±０．２０°、８．９０±０．２０°、２３．００±０．２０°の２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【化3】
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0082】
４．ＥＬＩＳＡアッセイ
１）コーティング溶液でＴＮＦ－α抗体を１倍の容量に希釈した後、高い結合性能を持つ９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μＬで添加した。プレートをフィルムで密封し、４℃の冷蔵庫に１８時間入れた。
２）２０００ｍＬの洗浄緩衝液を１倍量まで配合して用意した。
３）プレートを一晩コーティングした後、コーティング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
４）プレートを洗浄した後、ブロッキング緩衝液を各ウェルに２００μＬで添加し、プレートをフィルムで密封し、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
５）１８時間インキュベートした細胞プレートを遠心分離機で遠心分離（温度：２５℃、回転数：２０００ｒｐｍ、時間：１０分、速度増加：９、速度減少：１）した。遠心分離した後、ウェルあたり１００μＬの細胞上清を３５９９細胞プレートに移し、４℃の冷蔵庫に入れた。
６）ブロッキング緩衝液で細胞上清を４０倍に希釈し、４℃の冷蔵庫に入れた。標準液を配合し、４℃の冷蔵庫に入れた。
７）ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
８）希釈した細胞上清サンプルおよび標準液をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートをフィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、２時間インキュベートした。
９）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
１０）抗体液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した。プレートを密封フィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
１１）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で７回洗浄した。
１２）発色溶液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した後、２５℃のインキュベーターに入れ、暗所で３０分間インキュベートした。
１３）各ウェルに５０μＬの停止液を加え、プレートを遠心分離（温度：２５℃、回転数：１０００ｒｐｍ、時間：１分、速度増加：９、速度減少：９）した。
１４）遠心分離後３０分以内にＥｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、４５０ｎｍでの吸光度から５７０ｎｍでの吸光度を差し引いた値を最終的な生データとして使用した。
１）コーティング溶液でＴＮＦ－α抗体を１倍の容量に希釈した後、高い結合性能を持つ９６ウェルプレートに、ウェルあたり１００μＬで添加した。プレートをフィルムで密封し、４℃の冷蔵庫に１８時間入れた。
２）２０００ｍＬの洗浄緩衝液を１倍量まで配合して用意した。
３）プレートを一晩コーティングした後、コーティング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
４）プレートを洗浄した後、ブロッキング緩衝液を各ウェルに２００μＬで添加し、プレートをフィルムで密封し、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
５）１８時間インキュベートした細胞プレートを遠心分離機で遠心分離（温度：２５℃、回転数：２０００ｒｐｍ、時間：１０分、速度増加：９、速度減少：１）した。遠心分離した後、ウェルあたり１００μＬの細胞上清を３５９９細胞プレートに移し、４℃の冷蔵庫に入れた。
６）ブロッキング緩衝液で細胞上清を４０倍に希釈し、４℃の冷蔵庫に入れた。標準液を配合し、４℃の冷蔵庫に入れた。
７）ブロッキングが完了した後、ブロッキング溶液を捨て、ウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。
８）希釈した細胞上清サンプルおよび標準液をＥＬＩＳＡプレートに加えた。プレートをフィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、２時間インキュベートした。
９）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で５回洗浄した。
１０）抗体液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した。プレートを密封フィルムで密封した後、２５℃のインキュベーターに入れ、１時間インキュベートした。
１１）プレート内の液体を捨て、プレートをウェルあたり３００μＬの洗浄緩衝液で７回洗浄した。
１２）発色溶液を調製し、ウェルあたり１００μＬでプレートに添加した後、２５℃のインキュベーターに入れ、暗所で３０分間インキュベートした。
１３）各ウェルに５０μＬの停止液を加え、プレートを遠心分離（温度：２５℃、回転数：１０００ｒｐｍ、時間：１分、速度増加：９、速度減少：９）した。
１４）遠心分離後３０分以内にＥｎｖｉｓｉｏｎでプレートを読み取り、４５０ｎｍでの吸光度から５７０ｎｍでの吸光度を差し引いた値を最終的な生データとして使用した。
【国際調査報告】