特表 2022-539338 改良された相同性依存性修復ゲノム編集

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-08

(54)【発明の名称】改良された相同性依存性修復ゲノム編集

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/90 20060101AFI20220901BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20220901BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 15/82 20060101ALI20220901BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220901BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220901BHJP

【ＦＩ】

C12N15/90 Z

A01K67/027 ZNA

A01H1/00 A

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/31

C12N15/34

C12N15/55

C12N15/63 Z

C12N15/82 Z

C12N5/10

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576666

(86)(22)【出願日】2020-06-24

(85)【翻訳文提出日】2022-02-18

(86)【国際出願番号】 US2020039410

(87)【国際公開番号】W WO2020264016

(87)【国際公開日】2020-12-30

(31)【優先権主張番号】62/866,317

(32)【優先日】2019-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521559371

【氏名又は名称】イナリ アグリカルチャー テクノロジー， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】チェルマク， トマーシュ

【テーマコード（参考）】

2B030

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

2B030AA02

2B030AB02

2B030CA17

2B030CB03

4B063QA05

4B063QA13

4B063QA20

4B063QQ09

4B063QQ42

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR42

4B063QR56

4B063QR62

4B063QR82

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS39

4B063QX02

4B065AA88X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA53

4B065CA60

(57)【要約】

ゲノム編集分子による標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）の頻度を増加させるための真核細胞並びに関連する試薬、システム、方法、及び組成物が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させる方法であって、
ゲノム編集分子とＨＤＲ促進剤とを真核細胞に提供することであって、前記ゲノム編集分子が、（ｉ）前記標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）前記標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及び前記ＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；
それによって前記ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによる前記ドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた前記真核細胞ゲノムの前記標的編集部位の修飾をもたらすことを含む、方法。

【請求項2】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ゲノム編集分子が、前記標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、前記ガイドＲＮＡ分子が、前記標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記ドナーＤＮＡ分子が、環状ＤＮＡベクター、ジェミニウイルスレプリコン上に、又は線状ＤＮＡ断片として提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列のコピーが隣接する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、前記標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、前記ガイドＲＮＡに相補的な、且つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に前記標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項17】

線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項23】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と前記ＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、前記ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢタンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢが、前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として前記細胞に提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞が植物細胞であり、前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記ゲノム修飾を含む植物細胞、前記植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、前記植物細胞、珠芽、又は植物の前記ゲノムが前記ゲノム修飾を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させるためのシステムであって、
（ａ）真核細胞；
（ｂ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むＨＤＲ促進剤；及び
（ｃ）前記標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、前記標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含む１つ又は複数のゲノム編集分子
を含み；
前記真核細胞が有効量の前記ＨＤＲ促進剤及び前記１つ又は複数のゲノム編集分子と会合し、それに接触し、及び／又はそれを含有する、システム。

【請求項37】

前記ゲノム編集分子及び／又は配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項38】

前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、請求項３７に記載のシステム。

【請求項39】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項40】

前記ゲノム編集分子が、前記標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項41】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４０に記載のシステム。

【請求項42】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、前記ガイドＲＮＡ分子が、前記標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、請求項４０に記載のシステム。

【請求項43】

前記ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、請求項３６に記載のシステム。

【請求項44】

前記ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、請求項３６に記載のシステム。

【請求項45】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、前記標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、前記ガイドＲＮＡに相補的な、且つ前記ＰＡＭ配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項46】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に前記標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、請求項３６に記載のシステム。

【請求項47】

前記ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して少なくとも２倍に増加した頻度でＨＤＲによる前記ドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた前記真核細胞ゲノムの前記標的編集部位の修飾をもたらす、請求項３６に記載のシステム。

【請求項48】

前記ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、請求項３６に記載のシステム。

【請求項49】

前記ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項50】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、請求項４９に記載のシステム。

【請求項51】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、請求項４９に記載のシステム。

【請求項52】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項４９に記載のシステム。

【請求項53】

前記ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項４９に記載のシステム。

【請求項54】

前記ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項４９に記載のシステム。

【請求項55】

線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項３６に記載のシステム。

【請求項56】

リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項３６に記載のシステム。

【請求項57】

前記エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項３６に記載のシステム。

【請求項58】

前記エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項３６に記載のシステム。

【請求項59】

前記エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項60】

前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項４０に記載のシステム。

【請求項61】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と前記ＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、請求項３６に記載のシステム。

【請求項62】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項３６に記載のシステム。

【請求項63】

前記ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項６２に記載のシステム。

【請求項64】

前記ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項65】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照システムと比較して、前記ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、請求項３６に記載のシステム。

【請求項66】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照システムと比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、請求項３６に記載のシステム。

【請求項67】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、請求項３６に記載のシステム。

【請求項68】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢが、前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として前記細胞に提供される、請求項３６に記載のシステム。

【請求項69】

前記真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、請求項３６～６８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項70】

前記植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、請求項６９に記載のシステム。

【請求項71】

前記植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、請求項６９に記載のシステム。

【請求項72】

前記細胞が植物細胞であり、前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項６９に記載のシステム。

【請求項73】

前記システムが、前記ゲノム修飾を含む植物細胞、前記植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離すること及び／又は成長させることを提供し、及び前記植物細胞、珠芽、又は植物の前記ゲノムが前記ゲノム修飾を含む、請求項６９に記載のシステム。

【請求項74】

ゲノム修飾を有する真核細胞を作製する方法であって、
（ａ）ゲノム編集分子と相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤とを真核細胞に提供することであって、前記ゲノム編集分子が、（ｉ）前記標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、前記標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及び前記ＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；それによって前記ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによる前記ドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた前記真核細胞ゲノムの前記標的編集部位の修飾をもたらすこと；及び
（ｂ）前記ゲノム修飾を含む真核細胞を単離し又は増殖させることであって、それによってゲノム修飾を有する前記真核細胞を作製すること
を含む方法。

【請求項75】

前記ゲノム編集分子及び／又は配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項78】

前記ゲノム編集分子が、前記標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項79】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、前記ガイドＲＮＡ分子が、前記標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、請求項７８に記載の方法。

【請求項81】

前記ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、請求項７４に記載の方法。

【請求項82】

前記ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、請求項７４に記載の方法。

【請求項83】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、前記標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、前記ガイドＲＮＡに相補的な、且つ前記ＰＡＭ配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項84】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に前記標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、請求項７４に記載の方法。

【請求項85】

前記ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、請求項７４に記載の方法。

【請求項86】

前記ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項87】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

前記ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項90】

前記ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項91】

線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項７４に記載の方法。

【請求項92】

リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項７４に記載の方法。

【請求項93】

前記エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項７４に記載の方法。

【請求項94】

前記エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項７４に記載の方法。

【請求項95】

前記エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項96】

前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項97】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と前記ＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、請求項７４に記載の方法。

【請求項98】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項７４に記載の方法。

【請求項99】

前記ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

前記ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項101】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、前記ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、請求項７４に記載の方法。

【請求項102】

対照真核細胞が前記ゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、請求項７４に記載の方法。

【請求項103】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、請求項７４に記載の方法。

【請求項104】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢが、前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として前記細胞に提供される、請求項７４に記載のシステム。

【請求項105】

前記真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、請求項７４～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

前記ＳＳＡＰ、前記エキソヌクレアーゼ、及び／又は前記ＳＳＢが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項109】

前記ゲノム修飾を含む植物細胞、前記植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、前記植物細胞、珠芽、又は植物の前記ゲノムが前記ゲノム修飾を含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項110】

前記ＨＤＲ促進剤、ゲノム編集分子及び真核細胞又は前記ゲノム修飾を含む真核細胞が、複数の容器、区画、又は位置を含むアレイで提供され、各容器、区画、又は位置が、前記ＨＤＲ促進剤、ゲノム編集分子及び真核細胞又は前記ゲノム修飾を含む真核細胞を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法、請求項３６～６８のいずれか一項に記載のシステム、又は請求項７４～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

真核細胞を遺伝子操作する方法であって、前記真核細胞に、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を提供することを含み、
前記細胞の前記標的編集部位が前記ドナー鋳型ＤＮＡ分子によって修飾される、方法。

【請求項112】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１４、又は操作されたヌクレアーゼを含む、請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項115】

ガイドＲＮＡを更に含み、前記配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、前記標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する、請求項１１１に記載の方法。

【請求項116】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含み、前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、前記標的編集部位のエンドヌクレアーゼ認識配列に特異的である、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、前記ガイドＲＮＡ分子が、前記標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、請求項１１５に記載の方法。

【請求項118】

前記ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、請求項１１１に記載の方法。

【請求項119】

前記ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、請求項１１１に記載の方法。

【請求項120】

前記ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項121】

前記ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項123】

リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、前記エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、請求項１１１に記載の方法。

【請求項124】

前記エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項１１１に記載の方法。

【請求項125】

前記エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、請求項１１１に記載の方法。

【請求項126】

前記エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項127】

前記エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項128】

前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）と前記ＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、請求項１１１に記載の方法。

【請求項129】

前記真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、請求項１１１～１２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項130】

前記植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ゲノム修飾を含む植物細胞、前記植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、前記植物細胞、珠芽、又は植物の前記ゲノムが前記ゲノム修飾を含む、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有する前記ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼ、及びｖ）前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、１つ以上のベクターに提供される、請求項１１１～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記ベクターがアグロバクテリウムベクターである、請求項１３３に記載の方法。

【請求項136】

前記ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有する前記ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼ、及びｖ）前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、染色体によって提供される、請求項１１１～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項137】

前記ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有する前記ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼ、及びｖ）前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、ポリペプチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡを導入すること、及び／又は性的交雑によって提供される、請求項１１１～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項138】

前記ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有する前記ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼ、及びｖ）前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、ｉ）～ｖ）のうちの１つ以上を含む前駆細胞によって提供され、
前記前駆細胞が、ｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、
前記前駆細胞に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つが、続いて前記前駆細胞にポリペプチド、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡを送達すること及び／又は前記前駆細胞の性的交雑によって提供される、請求項１１１～１３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項139】

前記修飾を検出すること更に含む、請求項１１１～１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記修飾を検出することが、アンプリコンシーケンシングを含む、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記標的編集部位が、タンパク質コード配列中又はプロモーター中にある、請求項１１１～１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記標的編集部位の前記修飾が、挿入、欠失、又は置換である、請求項１１１～１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記標的編集部位が、作物栽培学的に重要な形質をコードする遺伝子又は哺乳類疾患に関わる遺伝子である、請求項１１１～１４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項144】

遺伝子修飾された標的編集部位を有する真核細胞の作製方法であって、
（ａ）前記標的編集部位中の少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識配列ＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供すること、及び
（ｂ）少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのドナー分子を提供することであって、（ｉ）前記ＤＮＡ配列が、前記標的編集部位に隣接する配列と少なくとも５０ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも９０％の相同性を有し、及び（ｉｉ）前記ドナー配列が、前記標的編集部位と比較して少なくとも１つの修飾を含むこと；及び
（ｃ）少なくとも１つの相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤を提供することであって、前記ＨＤＲ促進剤が、
（ｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、及び
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる少なくとも１つのエキソヌクレアーゼ、及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）
を含み；
及びそれによって前記少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、前記少なくとも１つのドナー分子、及び前記少なくとも１つのＨＤＲ促進剤が前記真核細胞の前記標的編集部位に前記修飾を導入すること；及び
（ｄ）前記標的編集部位に修飾を含む真核細胞を単離すること
を含む方法。

【請求項145】

前記修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、又は１つ以上のヌクレオチドの置換からなる群から選択される、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

前記標的編集部位の一部分が、前記標的編集部位における２つの配列特異的切断を用いることによって欠失され、前記ドナー分子によって提供される配列に置き換えられる、請求項１４４に記載の方法。

【請求項147】

ベクター内で前記ドナー配列にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、請求項１４４～１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記修飾を含む前記真核細胞を増殖させることを更に含む、請求項１４４～１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

遺伝子修飾された生物を作製する方法であって、
（ｉ）請求項１４４～１４８のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された真核細胞を作製するステップ、及び
（ｉｉ）前記細胞を生物へと再生するステップ
を含む方法。

【請求項150】

前記生物が、植物及び非ヒト動物からなる群から選択される、請求項１４９に記載の生物。

【請求項151】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含む組成物。

【請求項152】

前記核酸が１つ以上のベクター内にある、請求項１５１に記載の組成物。

【請求項153】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含むベクター。

【請求項154】

前記ドナー鋳型ＤＮＡと、前記配列特異的エンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項１５３に記載のベクター。

【請求項155】

前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼと、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む、１５３に記載のベクター。

【請求項156】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む、１５３に記載のベクター。

【請求項157】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸と、真核細胞の遺伝子操作に関する使用説明書とを含むキット。

【請求項158】

前記キットが第１のベクターと第２のベクターとを含み、ここで
ｉ）前記第１のベクターが、前記ドナー鋳型ＤＮＡと前記配列特異的エンドヌクレアーゼとを含む核酸を含み、前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み；及び
ｉｉ）前記第２のベクターが、前記一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる前記エキソヌクレアーゼと、前記一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む、請求項１５７に記載のキット。

【請求項159】

遺伝子操作された細胞の検出用薬剤を更に含む、請求項１５７又は１５８に記載のキット。

【請求項160】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む細胞。

【請求項161】

ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む細胞。

【請求項162】

植物又は哺乳類細胞である、請求項１６０又は１６１に記載の細胞。

【請求項163】

宿主細胞である、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項164】

請求項１～３５又は７４～１４９のいずれか一項に記載の方法によって作製される遺伝子操作された細胞。

【請求項165】

標的編集部位における遺伝子操作のための前駆真核細胞又は生物であって、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）前記真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のサブセットを含み、前記細胞がｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、ここで前記前駆細胞又は生物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つを前記細胞又は生物に提供すると、前記ドナー鋳型分子によって前記標的編集部位が修飾されることになる、前駆真核細胞又は生物。

【請求項166】

前記ドナー鋳型が二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１６５に記載の前駆真核細胞又は生物。

【請求項167】

前記細胞が生殖系列細胞である、請求項１６５に記載の前駆細胞。

【請求項168】

前記前駆真核細胞が前駆植物細胞であり、前記前駆植物細胞又は植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つが形質転換によって供給される、請求項１６５に記載の前駆真核細胞又は生物。

【請求項169】

前記生物が植物であり、前記前駆植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つが、前記前駆植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つを含む第２の植物との性的交雑によって供給される、請求項１６５に記載の前駆生物。

【請求項170】

前記前駆真核細胞が動物細胞であり、前記前駆細胞に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つがトランスフェクションによって供給される、請求項１６５に記載の前駆真核細胞。

【請求項171】

前記前駆生物が非ヒト動物であり、前記非ヒト動物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つが、前記非ヒト動物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの前記少なくとも１つを含む非ヒト動物との性的交雑によって供給される、請求項１６５に記載の前駆生物。

【請求項172】

前記配列特異的ヌクレアーゼが、誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１５３に記載のベクター。

【請求項173】

前記配列特異的エンドヌクレアーゼがニッカーゼである、請求項１１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８６６，３１７号に対する優先権を主張するものであり、その内容は、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
以下のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出の内容は、全体として参照により本明細書に援用される：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１６５３６２０００６４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年６月２４日、サイズ：２８４ＫＢ）。

【0003】

本願は、遺伝子編集のための方法、キット、及び組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

相同組換え修復（ＨＤＲ）は、所望の置換配列を持つ提供されたＤＮＡ鋳型の配列によって標的ゲノムＤＮＡ部位を高精度で置換するために用いることのできるゲノム編集方法である。ＨＤＲの結果は極めて望ましいものであるが、幾つもの理由から、ＨＤＲはあまり上手く機能しない。最も大きな問題としてあるのは、特に、ゲノム中の標的とする編集部位を切断するゲノム編集分子によって引き起こされることの多い代替的な非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構と比較したときの、その全体的な発生頻度の低さである。ほとんどの細胞は、ＨＤＲを媒介する可能性のある経路を幾つか有し得るが、その中には細胞周期の間に最も活性が高いものもあり、典型的な細胞培養条件におけるＨＤＲの成功率は下がる。

【0005】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物宿主では、相同遺伝子置換は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼと、バクテリオファージλベータタンパク質と、相補ＤＮＡ鎖のアニーリングを促進する一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、ＤＮＡ鋳型とを含むバクテリオファージλ Ｒｅｄ相同組換えシステムで達成され得る（Ｍｕｒｐｈｙ，２０１６）。バクテリオファージλ Ｒｅｄ相同組換えシステムを原核生物のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと組み合わせることにより、細菌ゲノム中の標的配列における組換えが達成されている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書には、対照と比較して、真核細胞ゲノムの標的編集部位が相同組換え修復（ＨＤＲ）によってドナー鋳型ポリヌクレオチドで修飾される頻度の増加をもたらすことのできる方法、システム、真核細胞（例えば、植物細胞又は哺乳類細胞）、及び組成物（例えば、細胞培養組成物、核酸、ベクター、キット、又は細胞）が開示される。そのようなＨＤＲ頻度の増加をもたらすことのできるかかる方法、システム、真核細胞（例えば、植物細胞又は哺乳類細胞）、及び組成物（例えば、細胞培養組成物、核酸、ベクター、キット、又は細胞）の特徴には、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むＨＤＲ促進剤を、真核細胞ゲノム中の標的編集部位を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含むゲノム編集分子と組み合わせて提供することが含まれる。特定の実施形態において、ドナー鋳型ＤＮＡ分子には、エンドヌクレアーゼ認識配列のコピーが隣接する。

【0007】

本明細書に提供される方法は、真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させる方法であって、ゲノム編集分子とＨＤＲ促進剤とを真核細胞に提供することであって、ゲノム編集分子が、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；それによってゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらすことを含む方法を含む。

【0008】

本明細書に提供される方法はまた、ゲノム修飾を有する真核細胞を作製する方法であって、ゲノム編集分子と相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤とを真核細胞に提供することであって、ゲノム編集分子が、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；それによってゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらすこと；及びゲノム修飾を含む真核細胞を単離し又は増殖させることを含む方法も含む。

【0009】

本明細書に提供されるシステムは、真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させるためのシステムであって、
（ａ） 真核細胞；
（ｂ） 一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むＨＤＲ促進剤；及び
（ｃ） 標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含む１つ又は複数のゲノム編集分子を含み；真核細胞が、有効量のＨＤＲ促進剤及び１つ又は複数のゲノム編集分子と会合し、それに接触し、及び／又はそれを含有する、システムを含む。

【0010】

本明細書に提供される方法はまた、真核細胞を遺伝子操作する方法であって、真核細胞に、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を提供することを含み、細胞の標的編集部位がドナー鋳型ＤＮＡ分子によって修飾される、方法も含む。

【0011】

本明細書に提供される方法はまた、遺伝子修飾された標的編集部位を有する真核細胞の作製方法であって、（ａ）前記標的編集部位中の少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識配列ＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供すること、及び（ｂ）少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのドナー分子を提供することであって、（ｉ）前記ＤＮＡ配列が、標的編集部位に隣接する配列と少なくとも５０ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも９０％の相同性を有し、及び（ｉｉ）前記ドナー配列が、前記標的編集部位と比較して少なくとも１つの修飾を含むこと；及び（ｃ）少なくとも１つの相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤を提供することであって、ＨＤＲ促進剤が、（ｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、及び（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる少なくとも１つのエキソヌクレアーゼ、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含み；それによって少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのドナー分子、及び少なくとも１つのＨＤＲ促進剤が前記真核細胞の前記標的編集部位に前記修飾を導入すること；及び（ｄ）前記標的編集部位に修飾を含む真核細胞を単離することを含む方法も含む。

【0012】

本明細書に提供される組成物は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含む組成物を含む。

【0013】

本明細書に提供されるベクターは、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含むベクターを含む。

【0014】

本明細書に提供されるキットは、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸と、真核細胞の遺伝子操作に関する使用説明書とを含むキットを含む。

【0015】

本明細書に提供される細胞は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む細胞を含む。

【0016】

本明細書に提供される細胞はまた、標的編集部位における遺伝子操作のための前駆真核細胞又は生物であって、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のサブセットを含み、細胞がｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、ここで前駆細胞又は生物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを細胞又は生物に提供すると、ドナー鋳型分子によって標的編集部位が修飾されることになる、前駆真核細胞又は生物も含む。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ベクターｐＲＳ０８ｔの概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、Ｃａｓ発現カセット（トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ発現カセット（シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）Ｕ６プロモーター（ＡｔＵ６）、ガイドＲＮＡをコードする配列、及び３５Ｓプロモーター）、ｍＧＦＰ６配列、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター、ＡＮＴ１ドナー鋳型、及びスペクチノマイシン耐性マーカー（ＳｐｎＲ）を含む。

【図2】ベクターｐＲＳ０４５の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、アンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ＰｃＵｂｉプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２核局在化配列（ＮＬＳ）、エンドウ３Ａターミネーター、トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、ＨＳＰターミネーター、２ｘ ３５Ｓプロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及び３５Ｓターミネーター）、及びｐＵＣ複製起点（ｐＵＣ起点）を含む。

【図3】ベクターｐＡＰ０４６の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、Ｃａｓ発現カセット（トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ及びリボザイム発現カセット（３５Ｓプロモーター、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイムをコードする配列、ガイドＲＮＡをコードする配列、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードする配列、及び３５Ｓターミネーター）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ＰｃＵｂｉプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウ３Ａターミネーター、トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、ＨＳＰターミネーター、２ｘ ３５Ｓプロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及び３５Ｓターミネーター）、ＡＮＴ１ドナー鋳型、及びスペクチノマイシン耐性マーカー（ＳｐｎＲ）を含む。

【図4】ベクターｐＲＳ１４８の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、Ｃａｓ発現カセット（トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ及びリボザイム発現カセット（３５Ｓプロモーター、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイムをコードする配列、ガイドＲＮＡをコードする配列、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードする配列、及び３５Ｓターミネーター）、及びスペクチノマイシン耐性マーカー（ＳｐｎＲ）を含む。

【図5】ベクターｐＲＳ１９２の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ＰｃＵｂｉプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウ３Ａターミネーター、トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、ＨＳＰターミネーター、２ｘ ３５Ｓプロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及び３５Ｓターミネーター）、ＡＮＴ１ドナー鋳型、及びアンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）を含む。

【図6】ベクターｐＴＣ８０１の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、Ｃａｓ発現カセット（トウモロコシユビキチン（ＺｍＵｂｉ）プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ及びリボザイム発現カセット（３５Ｓプロモーター、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイムをコードする配列、ガイドＲＮＡ１及び２をコードする配列、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードする配列、及び３５Ｓターミネーター）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）アクチン（ＯｓＡｃｔｉｎ）プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウ３Ａターミネーター、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）ユビキチン（ＰｖＵｂｉ１）プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）ユビキチン（ＯｓＵＢ１）プロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及びタバコエクステンシン（ＮｔＥＸＴ）ターミネーター）、ＳＰＸドナー鋳型、及びスペクチノマイシン耐性マーカー（ＳｐｎＲ）を含む。

【図7】ベクターｐＡＢ１５６の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）、左Ｔ－ＤＮＡ境界、ハイグロマイシン耐性カセット（２ｘ ３５Ｓプロモーター、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇＲ）コード配列、及び３５Ｓターミネーター）、Ｃａｓ発現カセット（トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ及びリボザイム発現カセット（３５Ｓプロモーター、ガイドＲＮＡをコードする配列、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイムをコードする配列、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードする配列、及び３５Ｓターミネーター）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ＰｃＵｂｉ４プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウ３Ａターミネーター、ＡｔＵｂｉ１０プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター、ＨａＵｂｉＣｈ４プロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及びＥｘｔ３’ターミネーター）、ＧＦＰドナー鋳型、右Ｔ－ＤＮＡ境界、及びｐＶＳ１由来のＳＴＡ領域を含む。

【図8】スーパーバイナリーＴ－ＤＮＡベクターｐＩＮ１７５７（下）及びｐＩＮ１５７６（上）の挿入領域設計の概略図を示す。ｐＩＮ１７５７は、左Ｔ－ＤＮＡ境界、ＮＯＳターミネーター、グルホシネート選択用のＰＡＴ、３５Ｓプロモーター、Ｃａｓ発現カセット（トウモロコシユビキチン（ＺｍＵｂｉ）プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ発現カセット（コムギＵ６（ＴａＵ６）プロモーター、ガイドＲＮＡをコードする配列（Ｇｌｎ１－３ Ｐｒｏ－２）、及びＰｏｌ ＩＩＩターミネーター）、Ｇｌｎ１－３ドナー鋳型、及び右Ｔ－ＤＮＡ境界を含む。加えて、ベクターｐＩＮ１７５６は、ＨＤＲ促進剤発現カセット（イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）アクチン（ＯｓＡｃｔｉｎプロモーター＋イントロン）プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（ＳＳＢ）、エンドウ３Ａターミネーター；スイッチグラス（Ｐ．ｖｉｒｇａｔｕｍ）ユビキチン（ＰｖＵｂｉ１プロモーター＋イントロン）プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅ）、ＳＳＡＰコード配列（ｂｅｔａ）、エンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーター；イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）ユビキチン（ＯｓＵＢ１）プロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｅｘｏ）、及びタバコエクステンシン（ＮｔＥＸＴ）ターミネーター）を含む。

【図9】図９Ａ～図９Ｂは、トマト子葉の形質転換用のベクター及び発現カセットの概略図を示す。図９Ａは、ベクターｐＩＮ１７０５の概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）、左Ｔ－ＤＮＡ境界、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸（ＥＰＳＰＳ）シンターゼ発現カセット（即ち、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ユビキチンプロモーター（ＡｔＵｂｉ１０）及びエンドウｒｂｃＳ Ｅ９ターミネーターの制御下にあるＥＰＳＰＳコード配列（ＣＤＳ））、Ｃａｓ発現カセット（トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びＨＳＰターミネーター）、ガイドＲＮＡ及びリボザイム発現カセット（３５Ｓプロモーター、ハンマーヘッド型（ＨＨ）リボザイムをコードする配列、ガイドＲＮＡをコードする配列、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムをコードする配列、３５Ｓターミネーター）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ＰｃＵｂｉプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、エンドウ３Ａターミネーター、トマトＳｌＵＢＩ１０プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、ＨＳＰターミネーター、２ｘ ３５Ｓプロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に融合したｃ２ ＮＬＳ、及び３５Ｓターミネーター）、ＡＮＴ１ドナー鋳型、右Ｔ－ＤＮＡ境界、ｐＶＳ１由来のＳＴＡ領域、ｐＶＳ１複製起点（起点）、及び複製起点（起点）を含む。図９Ｂは、トマト子葉のゲノムへの染色体組込み用のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ－ＤＮＡベクターの左右の境界間にある領域の概略図を示す。図示されるのは、上から下に、ｐＩＮ１７０３、ｐＩＮ１７０４、及びｐＩＮ１７０５ベクターの領域である。ＣＳは切断部位を示し、ＥＰＳＰＳはＥＰＳＰＳ発現カセットを示し、ＣａｓＳはＣａｓ発現カセットを示し、ＡＮＴ１ドナーはドナー鋳型を示し、ＨＤＲ剤は、ＳＳＡＰ、ＳＳＢ、及びエキソヌクレアーゼをコードするＨＤＲ促進剤発現カセットを示し、及びＧＦＰは緑色蛍光タンパク質コード配列を示す。

【図10】ヒトにおける発現用ベクターの概略図を示す。塩基対の長さは、ベクターの外側の目盛りによって示される。このベクターは、塩基対１から始まって、高コピー数複製起点（高コピー起点）、Ｃａｓ発現カセット（ＣＡＧプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼコード配列（ＣａｓヌクレアーゼＣＤＳ）、及びウサギβ－グロビン（ｒｂグロビン）ターミネーター）、ガイドＲＮＡ発現カセット（ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）Ｕ６（ＨｓＵ６）プロモーター、ガイドＲＮＡをコードする配列）、ＨＤＲ促進剤発現カセット（ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＥＦ１ａプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢコード配列（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ ＣＤＳ）に連結されたＳＶ４０ ＮＬＳ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ターミネーター、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＡＣＴＢ（ｈＡＣＴＢ）プロモーター、ＳＳＡＰコード配列（Ｒｅｄ Ｂｅｔａ ＣＤＳ）に連結されたＳＶ４０ ＮＬＳ、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ターミネーター、ＣＭＶプロモーター、エキソヌクレアーゼコード配列（Ｒｅｄ Ｅｘｏ ＣＤＳ）に連結されたＳＶ４０ ＮＬＳ、及びＳＶ４０ポリＡシグナル）、ＥＭＸ１ ＦＲＴドナー鋳型、及びスペクチノマイシン耐性マーカー（ＳｐｎＲ）を含む。

【発明を実施するための形態】

【0018】

Ｉ．定義
特に指定されない限り、本明細書の本文中にある核酸配列は、左から右に読んだとき、５’から３’方向で提供される。核酸配列は、指定されるとおり、ＤＮＡとして、又はＲＮＡとして提供され得る；当業者に公知のとおり、一方の開示が必然的に他方を定義するとともに、必然的に正確な相補体も定義する。用語が単数形で提供される場合、本発明者らはまた、その用語の複数形によって記載される実施形態も企図する。

【0019】

語句「アレルバリアント」は、本明細書で使用されるとき、所与の生物の異なる株、変種、又は分離株に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチド配列バリアントを指す。

【0020】

用語「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と受け取られるべきである。従って、用語「及び／又は」は、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられるとき、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられるとき、以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することが意図される。

【0021】

本明細書で使用されるとき、用語「Ｃｐｆ１」及び「Ｃａｓ１２ａ」は、本明細書では、同じＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを指して同義的に使用される。

【0022】

本明細書で使用されるとき、語句「ゲノム編集分子」は、少なくとも１つのＤＮＡ配列をエンドヌクレアーゼ認識部位で切断する１つ又は複数の配列特異的エンドヌクレアーゼ又はそのような１つ又は複数の配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを指す。

【0023】

本明細書で使用されるとき、「外因性」薬剤又は分子は、システム、組成物、真核細胞若しくは植物細胞培養物、反応系、又は真核細胞若しくは植物細胞に提供されるか、又はそこに導入される外部供給源由来の任意の薬剤又は分子を指す。特定の実施形態において、外部供給源由来の外因性薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、又は化合物）は、真核細胞又は植物細胞にも見られる薬剤であり得る。特定の実施形態において、外部供給源由来の外因性薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、又は化合物）は、真核細胞又は植物細胞にとって異種の薬剤であり得る。

【0024】

本明細書で使用されるとき、「異種」薬剤又は分子は、（ｉ）野生型の、未処理の、又は天然に存在する組成物、真核細胞、又は植物細胞には見られない任意の薬剤又は分子；及び／又は（ｉｉ）例えばゲノム又はベクター内において、その配列が自然中に存在する場合以外のコンテクストで位置するポリヌクレオチド又はペプチド配列を指す。例えば、そのプロモーターが自然中で作動可能に連結されている遺伝子以外の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターは、異種プロモーターである。

【0025】

本明細書で使用されるとき、用語「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「～を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、それが言及する特徴を少なくとも有するが、任意の追加的な特定されていない特徴を除外しないものと解釈されるべきである。

【0026】

用語「相同組換え」は、本明細書で使用されるとき、相同性部位における２つのＤＮＡ分子間でのＤＮＡ断片の交換を指す。相同組換えの頻度は、幾つもの要因に影響される。異なる生物は、相同組換えの量及び相同組換えと非相同組換えとの相対的比率の点で違いがある。概して、相同組換えイベントの頻度には、相同性領域の長さが影響を及ぼす：相同性領域が長いほど、頻度が高くなる。相同組換えを観察するのに必要な相同性領域の長さもまた、種間でばらつきがある。多くの場合、少なくとも５ｋｂの相同性が利用されているが、僅か２５～５０ｂｐほどの短い相同性でも、相同組換えは観察されている。

【0027】

本明細書で使用されるとき、相同組換え修復（ＨＤＲ）は、提供されるドナー配列の取込みによって標的編集部位の高精度編集（ｐｒｅｃｉｔｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）を生じさせるＤＮＡ修復方法を意味する。

【0028】

本明細書で使用されるとき、「ＨＤＲの頻度」、「ＨＤＲ頻度」などの語句は、分析する標的編集部位の総数と比較した、標的編集部位におけるＨＤＲ媒介性イベントの数を指す。標的編集部位の総数は、（ａ）ＮＨＥＪ媒介性イベントがある標的編集部位と；（ｂ）変化のない標的編集部位と；（ｃ）ＨＤＲ媒介性イベントがある標的編集部位との合計である。ＨＤＲ媒介性イベントは、挿入された異種配列、異種挿入体に隣接する相同配列、又は異種配列と相同配列との接合部に位置する配列のいずれにも、いかなる意図しないヌクレオチド挿入、欠失、又は置換も含まない、標的編集部位への異種配列の高精度な挿入を含む。

【0029】

本明細書で使用されるとき、語句「真核細胞」は、核を持つ任意の細胞を指し、従って、哺乳類のもの（例えば、ヒト、家畜、及び伴侶動物細胞）、昆虫細胞、爬虫類細胞、植物細胞（例えば、単子葉及び双子葉植物細胞）、酵母細胞、及び真菌細胞（例えば、糸状菌及び非糸状菌）が含まれる。

【0030】

「修飾されたヌクレオチド」又は「編集されたヌクレオチド」は、その非修飾ヌクレオチド配列と比較したとき少なくとも１つの改変を含む目的のヌクレオチド配列を指す。かかる「改変」には、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが含まれる。

【0031】

本明細書で使用されるとき、語句「植物細胞」は、植物細胞壁を有する植物細胞又は植物細胞壁を欠く植物細胞プロトプラストのいずれも指し得る。

【0032】

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、２つ以上のヌクレオチド残基を含有する核酸分子である。ポリヌクレオチドは、概して、一本鎖又は二本鎖として記載される。ポリヌクレオチドが、分子内又は分子間ハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖領域を含む場合、各二本鎖領域の長さは、好都合には、塩基対の数を単位として記載される。本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物の実施形態は、（ｉ）２～２５残基長の１つ以上のポリヌクレオチド、２６残基長より長い１つ以上のポリヌクレオチド、又は両方の混合物を用いることができ、又はそれを含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、その化学的に修飾された類似体、又はこれらの混合物を含むことができる。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドには、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせ（例えば、リボヌクレオチドから主になるが、１つ以上の末端デオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドから主になるが、１つ以上の末端ジデオキシリボヌクレオチドを有する合成ポリヌクレオチド）が含まれてもよく、又はイノシン、チオウリジン、若しくはプソイドウリジンなど、非カノニカルなヌクレオチドが含まれてもよい。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドには、化学的に修飾されたヌクレオチドが含まれる（例えば、Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：９９－１３４を参照のこと）。本明細書に提供されるポリヌクレオチドに使用することのできる化学的に修飾されたヌクレオチドは、（ｉ）リン酸ジエステル骨格のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はメチルホスホネートインターヌクレオチド結合修飾；（ｉｉ）修飾塩基及び／又は修飾糖を含むヌクレオシド；及び／又は（ｉｉｉ）蛍光部分（例えば、フルオレセイン若しくはローダミン又は発色団標識の蛍光共鳴エネルギー転移対、即ちＦＲＥＴ対）又は他の標識（例えば、ビオチン又は同位体）を含む検出可能標識を含む。本明細書において提供又は使用されるポリヌクレオチドにはまた、米国特許第９，４６４，１２４号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に開示される修飾核酸、特に修飾ＲＮＡも含まれる。

【0033】

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つの、一部の実施形態では２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の異種配列（即ち、ＡＡＶ由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。かかるｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染した（又は好適なヘルパー機能を発現している）、且つＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（即ちＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞に存在するとき、複製及び感染性ウイルス粒子へのパッケージングが可能である。ｒＡＡＶベクターが大型ポリヌクレオチド（例えば、染色体、又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に取り込まれると、そのとき（ｍｅｎ）ｒＡＡＶベクターは「プロベクター」と称されてもよく、これは、ＡＡＶパッケージング機能及び好適なヘルパー機能の存在下で複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得るものである。ｒＡＡＶベクターは、限定はされないが、プラスミド、線状人工染色体、脂質と複合体化した形態、リポソーム内に封入された形態、及びウイルス粒子、特にＡＡＶ粒子にカプシド化された形態を含め、幾つもの形態のいずれであってもよい。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングすると、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を作成することができる。

【0034】

「組換えアデノウイルスベクター」は、少なくとも１つのアデノウイルス逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の異種配列（即ち、アデノウイルス由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態において、この組換え核酸には、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。かかる組換えウイルスベクターは、組換えウイルスゲノムから欠失した必須アデノウイルス遺伝子（例えば、Ｅｌ遺伝子、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子等）を発現している宿主細胞に存在するとき、複製及び感染性ウイルス粒子へのパッケージングが可能である。組換えウイルスベクターが大型ポリヌクレオチド（例えば、染色体、又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に取り込まれると、そのとき（ｍｅｎ）組換えウイルスベクターは「プロベクター」と称されてもよく、これは、アデノウイルスパッケージング機能の存在下で複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得るものである。組換えウイルスベクターは、限定はされないが、プラスミド、線状人工染色体、脂質と複合体化した形態、リポソーム内に封入された形態、及びウイルス粒子、例えばアデノウイルス粒子にカプシド化された形態を含め、幾つもの形態のいずれであってもよい。組換えウイルスベクターをアデノウイルスウイルスカプシドにパッケージングすると、「組換えアデノウイルス粒子」を作成することができる。

【0035】

「組換えレンチウイルスベクター」は、少なくとも１つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する１つ以上の異種配列（即ち、レンチウイルス由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態において、組換え核酸には、２つのレンチウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接している。かかる組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能に感染した宿主細胞に存在するとき、複製及び感染性ウイルス粒子へのパッケージングが可能である。組換えレンチウイルスベクターをレンチウイルスカプシドにパッケージングすると、「組換えレンチウイルス粒子」を作成することができる。

【0036】

「組換え単純ヘルペスベクター（組換えＨＳＶベクター）」は、ＨＳＶ末端反復配列が隣接する１つ以上の異種配列（即ち、ＨＳＶ由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。かかる組換えウイルスベクターは、好適なヘルパー機能に感染した宿主細胞に存在するとき、複製及び感染性ウイルス粒子へのパッケージングが可能である。組換えウイルスベクターが大型ポリヌクレオチド（例えば、染色体、又はクローニング若しくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター）に取り込まれると、そのとき組換えウイルスベクターは「プロベクター」と称されてもよく、これは、ＨＳＶパッケージング機能の存在下で複製及びカプシド形成によって「レスキュー」され得るものである。組換えウイルスベクターは、限定はされないが、プラスミド、線状人工染色体、脂質と複合体化した形態、リポソーム内に封入された形態、及びウイルス粒子、例えばＨＳＶ粒子にカプシド化された形態を含め、幾つもの形態のいずれであってもよい。組換えウイルスベクターをＨＳＶカプシドにパッケージングすると、「組換え単純ヘルペスウイルス粒子」を作成することができる。

【0037】

本明細書で使用されるとき、語句「標的編集部位」は、ドナー核酸によって修飾されるＤＮＡ配列を指す。

【0038】

本明細書で使用されるとき、語句「標的遺伝子」は、本明細書に提供されるシステム、方法、組成物及び／又は真核細胞に提供される遺伝子編集分子によって修飾されることになるゲノム内に位置する遺伝子を指し得る。標的遺伝子の実施形態には、（タンパク質）コード配列、非コード配列、及びコード配列と非コード配列との組み合わせが含まれる。標的遺伝子の修飾には、転写エンハンサー又はプロモーター、５’又は３’非翻訳領域、成熟又は前駆ＲＮＡコード配列、イントロン、スプライスドナー及び／又はアクセプター、タンパク質コード配列、ポリアデニル化部位、及び／又は転写ターミネーターを含めた、遺伝子の１つ以上のエレメントにおけるヌクレオチド置換、挿入、及び／又は欠失が含まれる。特定の実施形態では、二倍体又は倍数体植物細胞における所与の標的遺伝子の全てのコピー又は全てのアレルが、植物細胞において修飾された標的遺伝子のホモ接合性をもたらすように修飾される。遺伝子編集によって標的遺伝子に導入される機能喪失型突然変異により所望の形質が付与される実施形態では、植物細胞、植物細胞集団、植物、又は種子は、その機能喪失型突然変異を有する修飾された標的遺伝子に関してホモ接合体である。他の実施形態では、所与の標的遺伝子のコピー又はアレルの一部のみが、植物細胞において修飾された標的遺伝子のヘテロ接合性をもたらすように修飾される。遺伝子編集によって標的遺伝子に導入される優性突然変異により所望の形質が付与される特定の実施形態では、植物細胞、植物細胞集団、植物、又は種子は、その優性突然変異を有する修飾された標的遺伝子に関してヘテロ接合体である。かかる修飾によって特定の植物標的遺伝子に与えられる形質としては、いずれも修飾を含まない対照植物と比較して向上した収量、昆虫、真菌、細菌性病原体、及び／又は線虫に対する抵抗性、除草剤耐性、非生物的ストレス耐性（例えば、耐干性、耐寒性、耐塩性、及び／又は耐暑性）、タンパク質の量及び／又は質、デンプンの量及び／又は質、脂質の量及び／又は質、二次代謝産物の量及び／又は質などが挙げられる。本明細書に提供されるシステム、方法、組成物及び／又は植物細胞に提供される遺伝子編集分子によって修飾されたゲノムを有する植物は、従来の育種（即ち、雄性親植物と雌性親植物との交雑）によって修飾されたゲノムを有する植物とは異なり、従来の育種では、典型的には、ゲノム領域の望ましくないランダムな交換並びにランダムな有糸分裂又は減数分裂でゲノムに生じる遺伝的及び後成的変化が交雑中に起こり、次にそれが子孫植物に見出される。従って、修飾されたゲノムを有する植物（又は植物細胞）の実施形態において、その修飾されたゲノムは、元の（修飾されていない）ゲノムと９９．９％超同一である。実施形態において、修飾されたゲノムは、元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、ランダムな有糸分裂又は減数分裂で生じた遺伝的又は後成的変化を欠いている。実施形態において、修飾されたゲノムは、元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、ゲノムの０．０１％未満に後成的変化の違いを含む。実施形態において、修飾されたゲノムは、（ａ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、ゲノムの０．０１％未満にＤＮＡメチル化の違いを含み；又は（ｂ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、ゲノムの０．００５％未満にＤＮＡメチル化の違いを含み；又は（ｃ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、ゲノムの０．００１％未満にＤＮＡメチル化の違いを含む。実施形態において、目的の遺伝子は植物細胞の染色体に位置し、修飾されたゲノムは、（ａ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、目的の遺伝子を含む染色体内に含まれるゲノムの一部分の０．０１％未満にＤＮＡメチル化の違いを含み、；又は（ｂ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、目的の遺伝子を含む染色体内に含まれるゲノムの一部分の０．００５％未満にＤＮＡメチル化の違いを含み；又は（ｃ）元の（修飾されていない）ゲノムと比べて、目的の遺伝子を含む染色体内に含まれるゲノムの一部分の０．００１％未満にＤＮＡメチル化の違いを含む。実施形態において、修飾されたゲノムは、元の（修飾されていない）ゲノムと比較して、意図的でない変化を１回の複製当たり各塩基対につき１×１０^－８突然変異より多く有することはない。特定の実施形態において、修飾されたゲノムは、意図的でない変化を自然突然変異率で起こるであろうより多く有することはない。自然突然変異率は、実験的に決定することができ、又は文献に記載されているとおりである（Ｌｙｎｃｈ，Ｍ．，２０１０；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0039】

「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、インビトロ又はインビボのいずれにしろ、宿主細胞の中に送達されることになる核酸を含む組換えプラスミドを指す。

【0040】

上記の定義のいずれかが、参照により本明細書に援用される任意の特許若しくは非特許文献、本明細書に引用される任意の特許若しくは非特許文献、又は他の部分に見られる任意の特許若しくは非特許文献に提供される定義と矛盾する限りにおいて、本明細書には上記の定義が用いられるものとすることが理解される。

【0041】

ＩＩ．方法及び組成物
Ａ．相同組換え修復媒介性ゲノム修飾を増加させる方法
本明細書には、ＨＤＲ促進剤（ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）とゲノム編集分子とを含む、且つ真核細胞遺伝子編集実験において対照実験と比較して相同性依存性修復（ＨＤＲ）頻度の増加をもたらす様々な試薬、システム、方法、及び組成物が提供される。特定の実施形態において、対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、ＨＤＲ促進剤（ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）のうちの少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、ＨＤＲ頻度は少なくとも２倍、３倍、５倍、又は１０倍に増加する。特定の実施形態において、対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、ＨＤＲ促進剤（ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）のうちの少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、ＨＤＲ頻度は少なくとも２倍、３倍、又は５倍～約１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、又は３０倍に増加する。一部の実施形態において、本方法は、有糸分裂又は減数分裂を起こしていない細胞に利用することができる。一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ複製を必要としない。

【0042】

ｉ．核局在化シグナル（ＮＬＳ）
本明細書に提供されるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又は遺伝子編集分子を指向させることができる核局在化シグナル（ＮＬＳ）には、単節型及び双節型核局在化シグナルが含まれる（Ｋｏｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。使用し得る単節型ＮＬＳの例としては、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号１１）などの少なくとも４個の連続する塩基性アミノ酸を含むＮＬＳ及びＫ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）コンセンサス配列（配列番号１２）を有する３個の塩基性アミノ酸のみを有する別のクラスが挙げられる。提供される本明細書において使用し得る双節型ＮＬＳの例としては、（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ_{１０－１２}（Ｋ／Ｒ）_３／５（配列番号１３）（式中、（Ｋ／Ｒ）_３／５は、５個の連続するアミノ酸のうち少なくとも３個がリジン又はアルギニンのいずれかであることを表す）が挙げられる。ＮＬＳはまた、ＬＧＫＲ（Ｋ／Ｒ）（Ｗ／Ｆ／Ｙ）（配列番号１４）のコンセンサス配列を有する植物特異的クラス５ ＮＬＳも含むことができる。使用し得る特異的ＮＬＳの例としては、更に、トウモロコシｏｐａｑｕｅ－２核局在化シグナル（配列番号１０、オクラ葉脈黄化モザイクウイルス（ＢＹＶＭＶ） ｃ２ ＮＬＳ（配列番号１５、及び伸長ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（配列番号１６）が挙げられる。

【0043】

一部の実施形態において、ＮＬＳは、哺乳類のもの（ヒトＮＬＳなど）である。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳである。一部の実施形態において、ＮＬＳは、アミノ酸リンカーを有するＳＶ４０ ＮＬＳである。一部の実施形態において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＧＳ（配列番号１４８）を有する。

【0044】

特定の実施形態において、ＮＬＳエレメント又は他の所望のエレメント（例えば、エピトープタグ）は、本明細書に提供されるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又は遺伝子編集分子に対し、エレメントとドメインとの直接的な共有結合を介するか、又はリンカーペプチド若しくは可動性ヒンジポリペプチドを使用するかのいずれかにより、作動可能に連結することができる。可動性ヒンジポリペプチドは、グリシンリッチ又はグリシン／セリン含有ペプチド配列を含む。かかる配列としては、限定はされないが、（Ｇｌｙ４）ｎ配列、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ配列、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎ配列、これらの組み合わせ、及びそのバリアント（式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に等しい正の整数である）を挙げることができる。特定の実施形態において、かかるグリシンリッチ又はグリシン／セリン含有ヒンジペプチドはまた、可動性のためのスレオニル及び／又はアラニル残基並びに極性リシル及び／又はグルタミル残基も含有し得る。使用し得るヒンジペプチドの他の例としては、免疫グロブリンヒンジペプチドが挙げられる（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0045】

本明細書に提供されるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又は遺伝子編集分子には、種々の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）もまた使用することができる。使用し得るＣＰＰとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応し、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１７を含む）；細胞への侵入を導くのに十分な幾つものアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；トランケート型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号１８）；トランスポータン（例えば、ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１９）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２０）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２１）が挙げられる。例示的ＣＰＰアミノ酸配列としてはまた、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２２；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号２３）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号２４）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号２５）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）も挙げられる。

【0046】

ｉｉ．一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）
特定の実施形態において、本明細書に提供される方法、システム、細胞、及び細胞培養組成物に使用される一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）は、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を促進し、又は触媒するタンパク質を含む。本明細書で使用されるＳＳＡＰの特徴としては、ＲｅｃＡ依存性及び非依存性経路の刺激、インビトロでのオリゴマー環及び／又はフィラメント形成、ｓｓＤＮＡ結合活性、及び相補ｓｓＤＮＡ鎖アニーリングのＡＴＰアーゼ非依存性刺激が挙げられる。ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβ、ＥＲＦ、又はＲＡＤ５２タンパク質ファミリーのＳＳＡＰタンパク質の特徴については、Ｍｕｒｐｈｙ，２０１６及びＩｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２に開示されている。特定の実施形態において、ＳＳＡＰは、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含むＲｅｃＴ／Ｒｅｄβタンパク質ファミリーのメンバーである。特定のＲｅｃＴ／Ｒｅｄβタンパク質ファミリーの特徴としては、５つのβストランドと５つのαヘリックスとのコアを有するα＋βドメイン、Ｍｇ^＋２依存性一本鎖アニーリング活性及び全てではないが、ほとんどのメンバーにおける２個のＣ末端酸性残基の保存が挙げられる（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。特定の実施形態において、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質は、配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含み、及び任意選択で、５つのβストランドと５つのαヘリックスとのコアを有する保存されたα＋βドメイン、Ｍｇ^＋２依存性一本鎖アニーリング活性、及び／又は２個のＣ末端酸性残基の保存を含む。特定の実施形態において、ＳＳＡＰは、ＥＲＦファミリータンパク質である。ＥＦＲタンパク質ファミリーの特徴としては、ＧｕＸＸｏＹｈｐ＋ＹＸｈＸＸｈｈ（配列番号３２）モチーフ［式中、Ｇはグリシンであり、Ｙ－チロシンであり、ｕは「小さい」残基（グリシン、セリン、アラニン）であり、ｈ－疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン）であり、ｐは極性残基（リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、セリン）であり、ｏはアルコール含有アミノ酸残基（セリン又はスレオニン）であり、＋は塩基性残基であり、及びＸは任意の残基である］を含む約１５０アミノ酸残基の保存された領域が挙げられる（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＥＲＦファミリータンパク質には、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が含まれ、任意選択で、ＧｕＸＸｏＹｈｐ＋ＹＸｈＸＸｈｈ（配列番号３２）モチーフを更に含むことができる。ＥＲＦファミリーのＳＳＡＰにはまた、ワールドワイドウェブサイトｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎのＮＣＢＩデータベースにアクセッション（ｇｉ、即ち遺伝子識別名）番号９６３４１８８、９６３５６９４、１６８０４３５７、１２７１９４０９、４５８２１９、１１４９７３０８、１１４９７２８０、１４９７１６８、１１５２７３００、９６３４６３４、９６３５６４３、１３４９１６４２、６０１５５１１、１１１３８３３５、９６２７９３８、９６２８６６８、及び１５０８８７５３として掲載されているタンパク質も含まれる。特定の実施形態において、本明細書で使用されるＳＳＡＰには、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）のＲＡＤ５２ファミリータンパク質、並びにそれぞれ、配列番号５、６、及び７の全長にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するその変異体；又は配列番号５、６、又は７に１つ以上の保存的及び／又は半保存的アミノ酸置換を有する変異体が含まれる。ＲＡＤ５２タンパク質ファミリーの特徴としては、ＤＮＡ結合活性を有する保存されたヘリックス－ヘアピン－ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフが挙げられる（Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。本明細書で使用されるＳＳＡＰには、国際公開第２０１７／１８４２２７号パンフレットとして公開された、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６１８４号明細書の米国国内段階である米国特許出願第１６／０７５，２８１号明細書（この内容は、全体として参照により本明細書に援用される）の少なくとも表１、表２、表３、表４、表５、及び表６に掲載される「リコンビナーゼ」として特定されるタンパク質が更に含まれ得る。特定の実施形態において、ＳＳＡＰは、前述のＳＳＡＰのうちのいずれかのアレル変異体を含み得る。特定の実施形態において、前述のＳＳＡＰのいずれも、ＳＳＡＰをコードする核酸（例えば、発現ベクター、ｍＲＮＡ、又はウイルス発現ベクター）を用いて細胞に提供することができる。特定の実施形態において、前述のＳＳＡＰのいずれも、タンパク質、融合タンパク質（例えば、細胞透過性ペプチド及び／又は核局在化配列との融合タンパク質）として、又はＳＳＡＰと他のタンパク質との間に挿入された（例えば、ＳＳＢ及び／又はエキソヌクレアーゼとの組み合わせでの）プロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供することができる。

【0047】

ｉｉｉ．エキソヌクレアーゼ
特定の実施形態において、本明細書に提供される方法、システム、細胞、及び細胞培養組成物において使用されるエキソヌクレアーゼには、それぞれ、露出した３’末端又は露出した５’末端を有する少なくとも部分的に一本鎖のＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む産物を生じさせることができる５’→３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）基質に及ぼすエキソヌクレアーゼが含まれる。特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、５’リン酸基を有する平滑末端を含めた、平滑末端を有するｄｓＤＮＡ基質を認識することになる。特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡのオーバーハング（例えば、ｄｓＤＮＡ基質中に付着末端型の切断をもたらすエンドヌクレアーゼによって作り出される末端を含めた、ｄｓＤＮＡ分子の末端にある５’又は３’ｓｓＤＮＡ領域）を有するｄｓＤＮＡ基質を認識することになる。特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質（例えば、ニックの入ったｄｓＤＮＡ）を認識することになる。本明細書で使用し得る５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼには、バクテリオファージラムダエキソタンパク質（例えば、配列番号８）、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号９）、アルテミスタンパク質（例えば、配列番号１３６）、アポロタンパク質（例えば、配列番号１３７）、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号１３８）、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号１３９）、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質（例えば、配列番号１４０）、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号１４１）、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩタンパク質（例えば、配列番号１４２）、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号１４３）又は同等の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、又は１４３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。特定の実施形態において、本明細書に提供される５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼには、配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、又は１４３に少なくとも１つ又はそれ以上の保存的及び／又は半保存的アミノ酸置換を有する配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、又は１４３に示されるタンパク質が含まれる。本明細書で使用し得る３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼには、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩタンパク質（例えば、配列番号１４４）、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼタンパク質（例えば、配列番号１４５）、同等の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４４又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。特定の実施形態において、本明細書に提供される３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼには、配列番号１４４又は１４５に少なくとも１つ又はそれ以上の保存的及び／又は半保存的アミノ酸置換を有する配列番号１４４又は１４５に示されるタンパク質が含まれる。特定の実施形態において、前述のエキソヌクレアーゼは、ＤＥＤＤ／ＤｎａＱエキソヌクレアーゼスーパーファミリーに特徴的な保存されたＤＥＤＤ触媒残基を含むことになる（Ｂｅｒｎａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。特定の実施形態において、前述のエキソヌクレアーゼのいずれも、タンパク質、融合タンパク質（例えば、細胞透過性ペプチド及び／又は核局在化配列との融合タンパク質）として、又はエキソヌクレアーゼと他のタンパク質との間に挿入された（例えば、ＳＳＢ及び／又はＳＳＡＰとの組み合わせでの）プロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供することができる。特定の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、前述のエキソヌクレアーゼのうちのいずれかのアレル変異体を含み得る。特定の実施形態において、前述のエキソヌクレアーゼのいずれも、エキソヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、発現ベクター、ｍＲＮＡ、又はウイルス発現ベクター）を用いて細胞に提供することができる。一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼはニッカーゼである。

【0048】

ｉｖ．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）
本明細書に提供される方法、システム、細胞、及び細胞培養組成物には、様々な一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を使用することができる。特定の実施形態において、ＳＳＢには、細菌ＳＳＢ又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢが含まれる。特定の実施形態において、ＳＳＢは、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）である。本明細書に提供されるＳＳＢには、配列番号３１、及び配列番号３４～１３１、及び１３２に示されるもの、並びに配列番号３１、配列番号３４～１３１、又は１３２の全長にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するか；又は配列番号３１、又は配列番号３４～１３１、又は１３２に１つ以上の保存的及び／又は半保存的アミノ酸置換を有するその変異体が含まれる。本明細書で使用されるＳＳＢには、本開示及び国際公開第２０１７／１８４２２７号パンフレットとして公開された、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６１８４号明細書の米国国内段階である米国特許出願第１６／０７５，２８１号明細書（この内容は、全体として参照により本明細書に援用される）の少なくとも表７及び表８に示されるＳＳＢタンパク質が含まれ得る。特定の実施形態において、ＳＳＢは、前述のＳＳＢのうちのいずれかのアレル変異体を含み得る。特定の実施形態において、前述のＳＳＢのいずれも、ＳＳＢをコードする核酸（例えば、発現ベクター、ｍＲＮＡ、又はウイルス発現ベクター）を用いて細胞に提供することができる。特定の実施形態において、前述のＳＳＢのいずれも、タンパク質、融合タンパク質（例えば、細胞透過性ペプチド及び／又は核局在化配列との融合タンパク質）として、又はＳＳＢと他のタンパク質との間に挿入された（例えば、ＳＳＡＰ及び／又はエキソヌクレアーゼとの組み合わせでの）プロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供することができる。

【0049】

一部の実施形態において、本方法に使用されるＳＳＢ及びＳＳＡＰは、同じ生物由来であるか、又はファージ及びファージの細菌宿主由来である。

【0050】

一部の実施形態において、ＳＳＢは不要である。一部の実施形態において、ＳＳＡＰは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）結合パートナーと融合される（Ｆａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１５），４１２６－４１３７）。一部の実施形態において、ＳＳＢは内因性ＳＳＢである。一部の実施形態において、内因性ＳＳＢに結合するように修飾されたＳＳＡＰが提供される。

【0051】

一部の実施形態において、本明細書に提供される方法に使用される構成要素は、融合タンパク質として提供される。一部の実施形態において、ＳＳＡＰはＳＳＢと融合される。一部の実施形態において、ＳＳＡＰは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）に融合される。

【0052】

ｖ．植物、植物組織、及び植物細胞
特定の実施形態において、ＨＤＲは、単離された植物細胞又は植物プロトプラスト（即ち、解離されていない又はインタクトな植物組織、植物部分、又は全植物に位置しない）で増加する。特定の実施形態において、植物細胞は、任意の植物部分又は組織又はカルスから入手される。特定の実施形態において、培養物は、植物組織、培養植物組織外植片、全植物、インタクトな芽の節、茎頂又は茎頂分裂組織、根端又は根端分裂組織、側部分裂組織、介在分裂組織、実生、全種子、半分に割られた種子又は他の種子断片、接合胚、体細胞胚、未熟胚、胚珠、花粉、小胞子、葯、胚軸、子葉、葉、葉柄、茎、塊茎、根、カルス、又は植物細胞懸濁液から入手される植物細胞を含む。特定の実施形態において、植物細胞は、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、又はコメ）の未熟胚又は成熟胚のＬ１層又はＬ２層に由来する。

【0053】

特定の実施形態において、ＨＤＲは、解離されていない又はインタクトな植物組織、植物部分、植物外植片、又は全植物に位置する植物細胞で増加する。特定の実施形態において、植物細胞は、インタクトな芽の節、培養植物組織外植片、茎頂又は茎頂分裂組織、根端又は根端分裂組織、側部分裂組織、介在分裂組織、実生、全種子、半分に割られた種子又は他の種子断片、接合胚、体細胞胚、未熟胚、胚珠、花粉、小胞子、葯、胚軸、子葉、葉、葉柄、茎、塊茎、根、又はカルスに位置し得る。特定の実施形態において、使用される外植片には、未熟胚が含まれる。未熟胚（例えば、未熟トウモロコシ胚）には、１．８～２．２ｍｍ胚、１～７ｍｍ胚、及び３～７ｍｍ胚が含まれる。特定の実施形態において、前述の胚は、成熟穂由来の種子、葉脚、成熟植物の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟穂、及び絹糸から入手される。様々な態様において、形質転換に使用される植物由来の外植片には、未熟胚、１．８～２．２ｍｍ胚、１～７ｍｍ胚、及び３．５～７ｍｍ胚が含まれる。ある態様において、本開示の方法に使用される胚は、成熟穂由来の種子、葉脚、成熟植物の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟穂、又は絹糸に由来することができる。特定の実施形態において、植物細胞は、多能性植物細胞（例えば、幹細胞又は分裂組織細胞）である。特定の実施形態において、植物細胞は、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、又はコメ）の未熟胚又は成熟胚のＬ１層又はＬ２層内に位置する。特定の実施形態において、国際公開第２０１８０８５６９３号パンフレット（これは全体として参照により本明細書に援用される）に公開されている全植物、種子、胚、外植片、又は分裂組織のゲノムを編集する方法は、本明細書に提供される植物細胞及び関連するシステム、方法、組成物、又は培養物における使用に応用することができる。

【0054】

特定の実施形態において、植物細胞は、一倍体、二倍体、又は倍数体植物細胞又は植物プロトプラスト、例えば、一倍体、二倍体、又は倍数体植物、植物部分若しくは組織、又はカルスから入手されたものを含み得る。特定の実施形態において、培養下の植物細胞（又は再生植物、子孫種子、及び子孫植物）は、一倍体であるか、又は一倍体になるように誘導することができる；一倍体植物及び植物細胞の作製及び使用技法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ ａｎｄ Ｃｈａｎによって“Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｈａｐｌｏｉｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ［ｄｏｔ］ｏｒｇ／ｉｍａｇｅｓ／ｄ／ｄ３／Ｈａｐｌｏｉｄ＿Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ［ｄｏｔ］ｐｄｆで利用可能なプロトコルに記載されるとおりの、改変型のセントロメア特異的ヒストンＣＥＮＨ３を発現する一倍体誘導株と野生型株を交雑することによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）における一倍体の作成方法を参照のこと；（Ｒａｖｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：５３３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６３３４）。一倍体はまた、米国特許第９，２１５，８４９号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるとおり、多種多様な単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、モロコシ、オオムギ）又は双子葉植物（例えば、ダイズ、キャノーラを含めたアブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、ワタ、トマト）において、突然変異型ＣＥＮＨ３遺伝子を含む植物を野生型二倍体植物と交雑させて一倍体子孫を作成することによっても入手し得る。一倍体トウモロコシ植物及び／又は細胞を入手するのに使用することができる一倍体誘導トウモロコシ株には、Ｓｔｏｃｋ ６、ＭＨＩ（Ｍｏｌｄｏｖｉａｎ Ｈａｐｌｏｉｄ Ｉｎｄｕｃｅｒ（モルドバ一倍体誘導体））、不確定配偶体（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ：ｉｇ）突然変異、ＫＥＭＳ、ＲＷＫ、ＺＥＭ、ＺＭＳ、ＫＭＳ、並びに米国特許第９，６７７，０８２号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるトランスジェニック一倍体誘導株が含まれる。一倍体細胞の例としては、限定はされないが、一倍体植物から入手された植物細胞及び生殖組織から入手された、例えば、花、発育中の花又は花芽、子房、胚珠、大胞子、葯、花粉、大配偶体、及び小胞子から入手された植物細胞が挙げられる。植物細胞又は植物プロトプラストが一倍体である特定の実施形態では、植物細胞又は植物プロトプラストにおいて遺伝的相補体を染色体倍加（例えば、減数分裂時の非減数による自然染色体倍加によるか、又はコルヒチン、オリザリン、トリフルラリン、プロナミド、亜酸化窒素ガス、抗微小管除草剤、抗微小管剤、及び有糸分裂阻害薬などの染色体倍加剤を用いることによる）によって倍加させると、倍加一倍体植物細胞又は植物プロトプラストを作製することができ、ここで遺伝子の相補体又はアレルはホモ接合性であり；更に他の実施形態は、倍加一倍体植物細胞又は植物プロトプラストからの倍加一倍体植物の再生を含む。別の実施形態は、この手法によって提供される倍加一倍体植物である少なくとも１つの親植物を有するハイブリッド植物に関する。倍加一倍体植物を作製すると、ホモ接合性植物を入手するのに数世代の自家交雑を必要とする代わりに、１世代でホモ接合性がもたらされる。倍加一倍体の使用は、最小限の時間で遺伝的純度（即ちホモ接合性）を確立することが所望される任意の状況で有利である。倍加一倍体の作製は、果実及び他の樹木など、成長が遅い植物において、又は少なくとも１つの倍加一倍体植物の子孫であるハイブリッド植物の作製に、特に有利であり得る。

【0055】

植物細胞においてＨＤＲが増加する特定の実施形態、並びに本明細書に提供される関連する方法、システム、組成物、又は反応混合物には、任意の目的の単子葉又は双子葉植物種、例えば、条植え作物植物、果実産生植物及び樹木、野菜、樹木、及び装飾花を含む観賞植物、低木、樹木、地被植物、及び芝草から入手されるか、又はそこに位置する植物細胞が含まれ得る。特定の非限定的な実施形態において、植物細胞は、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、アーモンド類（プルヌス・デュルキス（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ））、リンゴ類（マルスｘドメスティカ（Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、アンズ類（プルヌス・アルメニアカ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、Ｐ．ブリガンティネ（Ｐ．ｂｒｉｇａｎｔｉｎｅ）、Ｐ．マンドシュリカ（Ｐ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ）、Ｐ．ムメ（Ｐ．ｍｕｍｅ）、Ｐ．シビリカ（Ｐ．ｓｉｂｉｒｉｃａ））、アスパラガス類（アスパラグス・オフィキナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ））、バナナ類（バショウ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、オオムギ類（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、マメ類（インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．））、ブルーベリー類及びクランベリー類（スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．））、カカオ（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、キャノーラ及びナタネ又はアブラナ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ））、カーネーション（ダイアンサス・カリオフィルス（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ニンジン類（ダウクス・カロタ・サティブス（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ ｓａｔｉｖｕｓ））、キャッサバ（マニホット・エスクレンツム（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、サクランボ（プルヌス・アビウム（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ））、ヒヨコマメ（キケル・アリエティヌム（Ｃｉｄｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、チコリ（キコリウム・インティブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ））、チリペッパー類及び他のトウガラシ類（カプシクム・アンヌウム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、Ｃ．フルテスセンス（Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．キネンセ（Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、Ｃ．プベスセンス（Ｃ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．バッカトゥム（Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ））、キク類（キク属種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｐｐ．））、ココナツ（ココス・ヌキフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、コーヒー（コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）及びコフィア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）を含むコーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．））、ワタ（ゴシピウム・ヒルストゥム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．））、ササゲ（ビグナ・ウンギュイクラタ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ））、キュウリ（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））、スグリ類及びグズベリー類（スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．））、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）又はナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））、ユーカリ（ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ．））、アマ（リナム・ウシタティッスムム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｕｍｕｍ Ｌ．））、ゼラニウム類（ペラルゴニウム属種（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｓｐｐ．））、グレープフルーツ（シトラスｘパラディシ（Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ））、ワイン用ブドウ類（ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｕｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ））を含むブドウ類（ブドウ属種（Ｖｉｔｕｓ ｓｐｐ．））、グアバ（プシディウム・グアヤバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、アサ及び大麻（例えば、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）及びアサ属種（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓｐｐ．））、ホップ類（フムルス・ルプルス（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ））、アヤメ類（アヤメ属種（Ｉｒｉｓ ｓｐｐ．））、レモン（シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ））、レタス（ラクトゥカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））、ライム類（ミカン属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．））、トウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、マンゴスチン（ガルシニア・マンゴスタナ（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ））、メロン（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ））、アワ類（エノコログサ属種（Ｓｅｔａｒｉａ ｓｐｐ）、ヒエ属種（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｓｐｐ）、オヒシバ属種（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｓｐｐ）、キビ属種（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、チカラシバ属種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｓｐｐ．））、オートムギ類（アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））、アブラヤシ（エレイス・グイネエンシス（Ｅｌｌｉｓ ｑｕｉｎｅｅｎｓｉｓ））、オリーブ（オレア・エウロペア（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、タマネギ（アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ））、オレンジ（シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、パパイヤ（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、モモ類及びネクタリン類（プルヌス・ペルシカ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ））、セイヨウナシ（ナシ属種（Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ．））、エンドウ（ピスム・サティブム（Ｐｉｓａ ｓａｔｉｖｕｍ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、シャクヤク（ボタン属種（Ｐａｅｏｎｉａ ｓｐｐ．））、ペチュニア類（ペチュニア属種（Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ．））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、オオバコ類（バショウ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、セイヨウスモモ（プルヌス・ドメスティカ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、ポインセチア（ユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、ポーランドアブラナ（Ｐｏｌｉｓｈ ｃａｎｏｌａ）（ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ））、ポプラ（ポプルス属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、カボチャ（ククルビタ・ペポ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．））、バラ（バラ属種（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．））、ゴム（ヘベア・ブラシリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ））、ゴマ種子（セサムム・インディクム（Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｕｍ））、モロコシ（ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．））、カボチャ（ククルビタ・ペポ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ））、イチゴ類（オランダイチゴ属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、フラガリアｘアナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ））、サトウダイコン（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ類（サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ））、サツマイモ（イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ））、タンジェリン（シトラス・タンゲリナ（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｎｇｅｒｉｎａ））、茶（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．））、トマト（リコペルシコン・エスクレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、チューリップ類（チューリップ属種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．））、カブ（ブラッシカ・ラパ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒａｐａ））、クルミ類（クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．Ｌ．））、スイカ（キトルルス・ラナツス（Ｃｉｔｒｕｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ））、コムギ（トリティウム・エスティブム（Ｔｒｉｔｉｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、又はヤムイモ類（ヤマノイモ属種（Ｄｉｓｃｏｒｅａ ｓｐｐ．））から入手されるか、又はそこに位置する。

【0056】

ｖｉ．真核細胞
特定の実施形態において、ＨＤＲが増加する真核細胞（例えば、植物細胞）は、（ａ）ポリマー（例えば、ペクチン、アガロース、又は他の多糖）又は他の支持体（固体若しくは半固体表面若しくはマトリックス、又は粒子若しくはナノ粒子）にカプセル化若しくは封入され、又は取り付けられる細胞；（ｂ）小胞又はリポソーム又は他の液体区画にカプセル化若しくは封入され、又は取り付けられる細胞；又は（ｃ）カプセル化されず、又は封入されず、又は取り付けられない細胞であり得る。特定の実施形態において、細胞は液体若しくは浮遊培養下にあってもよく、又は半固形若しくは固形培地内若しくはその上で、又は液体培地と固形若しくは半固形培地との組み合わせで培養されてもよい（例えば、液体培地を重層した固形培地上で培養される植物細胞又はプロトプラストか、或いは固形ビーズ又はマトリックスに取り付けられ、液体培地で成長する植物細胞又はプロトプラスト）。特定の実施形態において、ポリマー（例えば、ペクチン、アガロース、又は他の多糖）又は他のカプセル化材料にカプセル化されるか、小胞又はリポソームに封入されるか、混合相培地（エマルション又は逆エマルションなど）に懸濁されるか、又はマトリックス又は他の固体支持体（例えば、ビーズ又はマイクロビーズ、膜、又は固体表面）に包埋され又は取り付けられる細胞。

【0057】

関連する態様において、本開示は、スクリーニング目的に好都合か、又はハイスループット及び／又は多重形質転換又は遺伝子編集実験に好都合な細胞の構成体など、本明細書に記載されるシステム、方法、及び組成物におけるＨＤＲ頻度が向上した真核細胞（例えば、植物細胞）の構成体を提供する。ある実施形態において、本開示は、（ａ）ＨＤＲ促進剤と；任意選択で（ｂ）ゲノム編集分子とを含む複数の細胞の構成体を提供する。特定の実施形態において、細胞の構成体は、少なくとも１つの化学的、酵素的、又は物理的送達剤を更に含み得る。別の実施形態において、本開示は、ＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度が増加した少なくとも１つの細胞を各々が含む複数の容器を含むアレイを提供する。ある実施形態において、本開示は、ＨＤＲ促進剤と、任意選択でゲノム編集分子とを有する細胞の構成体を提供し、ここで細胞は、例えばマルチウェルプレートにアレイ化されたフォーマットであるか、小胞、リポソーム、又は液滴にカプセル化又は封入されているか（有用な、（例えば、マイクロ流体デバイス内で）、又はマトリックスに、又は個別の粒子若しくはビーズに個別に取り付けられ；具体的な実施形態は、アレイ化されたフォーマットで提供されるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度が増加した複数の細胞のかかる構成体であって、アレイ上の少なくとも一部の位置が異なり得るか、又は更にはアレイ上の各位置が異なり得る少なくとも１つのゲノム編集分子（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、少なくとも１つのガイドＲＮＡ、又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼと少なくとも１つのガイドＲＮＡとの両方を含むリボ核タンパク質）、及び任意選択で少なくとも１つの化学的、酵素的、又は物理的送達剤を更に含む構成体である。

【0058】

本明細書に提供されるシステム及び方法において、真核細胞（例えば、植物細胞）は、１つ以上のＨＤＲ促進剤及び／又は１つ以上の遺伝子編集分子に任意の時間的順序で曝露することができる。特定の実施形態において、ＨＤＲ促進剤と遺伝子編集分子とは、同時に提供される。他の実施形態において、ゲノム編集分子は、ＨＤＲ促進剤が提供された後に提供される。他の実施形態において、遺伝子編集分子は、ＨＤＲ促進剤が提供される前に提供される。つまり、ＨＤＲ促進剤を真核細胞（例えば、植物細胞）に提供するのは、細胞を遺伝子編集分子に曝露する前、それと同時、又はその後のいずれであってもよい。

【0059】

本明細書には、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）及び／又は修飾されたＤＮＡドナー鋳型によって付与される相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾頻度の増加を呈する真核細胞（例えば、植物細胞）が提供される。本開示によってはまた、本明細書に開示されるシステム及び方法によってもたらされる、ＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度の増加を呈する植物細胞又は植物プロトプラストに由来する、又はそれから成長した組成物も提供される；かかる組成物は、ＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度の増加を呈する植物細胞又は植物プロトプラストから成長した複数のプロトプラスト又は細胞、カルス、体細胞胚、体細胞分裂組織、胚形成カルス、又は再生植物を含む。ＨＤＲ促進剤及び／又は修飾されたＤＮＡドナー鋳型に供された細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度の増加は、種々の技法によって評価することができる。特定の実施形態において、かかる技法は、ＨＤＲ促進剤に供された細胞で観察されるＨＤＲ頻度と、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）及び／又は修飾されたＤＮＡドナー鋳型に供されていない対照細胞のＨＤＲ頻度とを比較することができる。

【0060】

特定の実施形態において、本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物に使用される真核細胞（例えば、植物細胞）は、非分裂細胞を含み得る。かかる非分裂細胞には、植物細胞プロトプラスト、遺伝的及び／又は薬剤誘導性細胞周期阻害のうちの１つ以上に供された真核細胞などが含まれ得る。特定の実施形態において、非分裂細胞は、本明細書に提供されるＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢ）及び／又は修飾されたＤＮＡドナー鋳型を任意選択で含み得る遺伝子編集分子による処理の後、（例えば、遺伝的な又は薬剤による細胞周期阻害を反転させるか、又は取り除くことにより）分裂するように誘導することができる。

【0061】

特定の実施形態において、本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物に使用される真核細胞（例えば、植物細胞）は、分裂細胞を含み得る。分裂細胞には、葉、分裂組織、及び胚を含めた様々な植物組織に見られる細胞が含まれ得る。そうした組織としては、限定はされないが、トウモロコシ幼葉からの分裂細胞、分裂組織及び約８又は１０～約１２又は１４日の受粉後日数（ＤＡＰ）胚からの胚盤組織が挙げられる。トウモロコシ胚の単離については、幾つかの既発表文献に記載されている（Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂｅｃｋｅｒ，ａｎｄ Ｌｏｅｒｚ １９９７；Ｌｅｄｕｃ ｅｔ ａｌ．１９９６；Ｆｒａｍｅ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｋ．Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｆｒａｍｅ ２００９）。特定の実施形態において、根出葉組織（例えば、トウモロコシ植物の葉舌から約０～３ｃｍに位置する葉組織；Ｋｉｒｉｅｎｋｏ，Ｌｕｏ，ａｎｄ Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ ２０１２）がＨＤＲ媒介性遺伝子編集の標的となる。再生可能な植物構造体を入手し、本明細書に提供される植物細胞のＨＤＲ媒介性遺伝子編集から植物を再生する方法は、米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書（これは、全体として、特にかかる開示に関して参照により本明細書に援用される）に開示される方法を応用することができる。特定の実施形態では、ＨＤＲ媒介性遺伝子編集に供された単一の植物細胞が、単一の再生可能な植物構造体を生じることになる。特定の実施形態において、単一の再生可能な植物細胞構造体は、ＨＤＲ媒介性遺伝子編集に供された外植片上、又はその中にある単一の細胞で形成されてもよい。

【0062】

ｖｉｉ．植物再生
一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、改良されたＨＤＲ媒介性遺伝子編集に供された植物細胞から、又はそのような植物細胞から入手された再生可能な植物構造体から、植物を成長又は再生させる追加のステップを含み得る。特定の実施形態において、植物は、本明細書に開示される方法及び組成物によって提供されるとおりの挿入されたトランス遺伝子、標的遺伝子編集、又はゲノム編集を更に含み得る。特定の実施形態では、植物細胞からカルスを作製し、かかるカルスから小植物及び植物を作製する。他の実施形態では、カルス段階を経ずに植物細胞から直接、全実生又は植物を成長させる。従って、追加的な関連態様は、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞又は植物プロトプラストから成長又は再生した全実生及び植物、並びにかかる植物の種子に関する。植物細胞又は植物プロトプラストが遺伝子修飾（例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを例えば用いることによるゲノム編集）に供される特定の実施形態では、成長又は再生した植物は、その遺伝子修飾に関連する表現型を示す。特定の実施形態において、成長又は再生した植物は、そのゲノムに、組み合わせになって少なくとも１つの目的の表現型をもたらす２つ以上の遺伝的又は後成的修飾を含む。特定の実施形態において、本方法によれば、その少なくとも一部が少なくとも１つの遺伝的又は後成的修飾を含む標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞の異種集団が提供される；関連する態様は、標的遺伝子又はゲノム編集を有する植物細胞の異種集団から選択される植物細胞又は植物プロトプラストから目的の表現型を有する植物を再生すること、又は標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞の集団から成長又は再生させた植物の異種集団から目的の表現型を有する植物を選択することのいずれかによって提供される、遺伝的又は後成的修飾に関連する目的の表現型を有する植物を含む。目的の表現型の例としては、除草剤抵抗性、非生物的ストレス耐性（例えば、極端な温度への耐性、耐干性、又は耐塩性）又は生物的ストレス耐性（例えば、線虫、細菌性、又は真菌性病原体に対する抵抗性）の向上、栄養又は水利用率の向上、脂質、炭水化物、又はタンパク質組成の修飾、風味又は外観の向上、保存特性（例えば、傷、褐変、又は軟化に対する抵抗性）の向上、収量増大、形態（例えば、花の構成又は色、草高、分枝、根構造）の改変が挙げられる。ある実施形態において、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞の異種集団（又はそれから成長又は再生した実生又は植物）は、目的の表現型の発現を可能にする条件に曝露される；例えば、除草剤抵抗性の選択は、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞の集団（又はそれから成長又は再生した実生又は植物）を、所定量の除草剤又はその他の成長を阻害する物質若しくは毒性のある物質に曝露することにより、処理を生き残る抵抗性の植物細胞（又は実生又は植物）の同定及び選択を実現することを含み得る。再生可能な植物構造体を入手し、植物細胞又は再生可能な植物構造体から植物を再生する方法には、既発表の手順を応用することができる（Ｒｏｅｓｔ ａｎｄ Ｇｉｌｉｓｓｅｎ，Ａｃｔａ Ｂｏｔ．Ｎｅｅｒｌ．，１９８９，３８（１），１－２３；Ｂｈａｓｋａｒａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３０（６）：１３２８－１３３７；Ｉｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１６，１４３：１４４２－１４５１）。再生可能な植物構造体を入手し、植物細胞又は再生可能な植物構造体から植物を再生する方法にはまた、米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書（これは、全体として、特にかかる開示に関して参照により本明細書に援用される）も応用することができる。また、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有するかかる植物の異種集団、アレイ、若しくはライブラリ、植物細胞若しくは植物プロトプラストから成長若しくは再生させたかかる植物の後続世代若しくは種子、植物の一部分（接穂又は台木として接木に使用される植物部分を含む）、又は植物若しくはその種子から作られる生産品（例えば、果実又は他の可食植物部分、精製後の穀粒又は種子、食用油、穀粉又はデンプン、タンパク質、及び他の加工生産品）も提供される。実施形態は、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有する植物細胞から成長又は再生させた植物を含み、ここでこの植物は、遺伝的又は後成的修飾を有しない細胞又は組織を含有し、例えば、接穂若しくは台木が遺伝的又は後成的修飾を含有する接木植物、又は全てではないが、一部の細胞又は組織が遺伝的若しくは後成的修飾を含有するキメラ植物である。一般に接木が有用な植物としては、多くの柑橘樹、リンゴ類、石果（例えば、モモ、アンズ、サクランボ、及びセイヨウスモモ）、アボカド類、トマト類、ナス、キュウリ、メロン類、スイカ類、及びブドウ類などの多くの果樹及び植物、並びにバラなどの様々な観賞植物が挙げられる。接木植物は、同じ又は異なる（概して近縁の）種間の接木であり得る。追加的な関連態様は、標的遺伝子編集又はゲノム編集を有し且つ少なくとも１つの遺伝的又は後成的修飾を有する植物細胞又は植物プロトプラストから成長又は再生させた第１の植物を第２の植物と交雑させることにより提供されるハイブリッド植物を含み、ここでこのハイブリッド植物は、遺伝的又は後成的修飾を含有し；また、ハイブリッド植物によって作られる種子も企図される。また、関連する態様として、ハイブリッド種子及びハイブリッド植物を含め、親又は祖先として再生植物を有する子孫種子及び子孫植物も想定される。本明細書に開示される植物細胞並びに派生植物及び種子は、消費者又は栽培者に有用な様々な目的に使用することができる。例えば、被覆作物又は観賞植物として成長させる植物など、インタクトな植物それ自体が望ましいこともある。他の実施形態では、抽出タンパク質、油、糖、及びデンプン、発酵製品、動物用飼料又はヒト用食品、木及び木製品、医薬品、及び様々な工業製品など、植物又はその種子から加工品が作られる。

【0063】

ｖｉｉｉ．真核細胞へのＨＤＲ促進剤の提供
ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、任意の好適な技術によって真核細胞（例えば、植物細胞又は植物プロトプラスト）に提供することができる。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ、又はＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドを細胞と直接接触させることにより提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、化学的、酵素的、又は物理的薬剤を使用してＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ、又はＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドを細胞内に輸送することにより提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、細菌の媒介により（例えば、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、シノリゾビウム属種（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、メソリゾビウム属種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブラディリゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、アゾトバクター属種（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、フィロバクテリウム属種（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．））、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドを植物細胞又は植物プロトプラストにトランスフェクトすることにより提供される；例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３３：６２９－６３３を参照のこと。ある実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードし且つ植物細胞のゲノムに安定に組み込まれるＤＮＡが植物細胞又は植物プロトプラストにおいて転写されることによって提供されるか、又はＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするプラスミド又は発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）の形態で植物細胞又は植物プロトプラストに提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドとして、例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするＲＮＡ（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を持つｍＲＮＡ又はＲＮＡ）の形態で植物細胞又は植物プロトプラストに提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、コードされるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの間にプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むアミノ酸配列が挿入された、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢを任意の順番で含むポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして植物細胞又は植物プロトプラストに提供される。かかるプロテアーゼ認識配列の例としては、内因性植物プロテアーゼによって切断され得る植物メタロチオネイン様タンパク質（ＰｓＭＴａ）のスペーサー領域（Ｕｎｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、又は同様に細胞に提供される特異的プロテアーゼ（例えば、ＴＶＭＶ Ｎｉａプロテイナーゼ；Ｄａｓｇｕｐｔａ，ｅｔ ａｌ．，１９９８）の認識配列が挙げられる。かかる自己プロセシングタンパク質配列の例としては、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列（配列番号３３；Ｈａｌｐｉｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ，１９９９）が挙げられる。ゲノム編集分子もまた、同様の技法によって植物細胞に導入することができる。

【0064】

ｉｘ．ＨＤＲ促進剤の一過性発現
本明細書に提供される方法、システム、細胞、及び組成物の特定の実施形態においては、ＨＤＲ促進剤及び／又はゲノム編集分子の一過性発現が用いられる。ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ又はゲノム編集分子の一過性発現は、種々の技法によって実現することができる。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤の発現は誘導性発現である。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子は、単離された分子として、無細胞合成法（例えば、インビトロ翻訳）の単離又は半精製された産物として、又は細胞ベースの合成法における（例えば、細菌又は他の細胞のライセート中などの）単離又は半精製された産物として、細胞、システム、方法、及び組成物に直接提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子）は、一過性発現が確実となる方法で（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．２０１６；又はＬｉ ｅｔ ａｌ．２００９から応用される方法によって）細胞又は細胞核へと標的化される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子は、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子をコードするいかなるポリヌクレオチドも存在することのないＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子の送達によって細胞内に送達される。いかなるコードポリヌクレオチドも存在することなく送達できる外因性薬剤の例としては、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ配列特異的エンドヌクレアーゼ、及びＲＮＡガイドが挙げられる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド／ＲＮＡガイドは、別々に、及び／又はＲＮＰ複合体として送達することができる。特定の実施形態では、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質を異種システムで作製し、精製して、パーティクルボンバードメントによって（例えば、Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｔｉｇｏｓａ ａｎｄ Ｗａｎｇ ２０１４から応用される方法によって）植物細胞に送達することができる。いかなるコードポリヌクレオチドも存在することなくＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢが送達される実施形態において、送達剤は、一過性発現を生じさせるために導入された任意のコードポリヌクレオチドからの進行中の発現がなければ、時間とともに分解するものと予想される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドの送達によって細胞内に送達される。特定の実施形態では、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢを細菌プラスミドにコードし、パーティクルボンバードメントによって（例えば、Ｈａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．２０１８；又はＫｉｒｉｅｎｋｏ，Ｌｕｏ，ａｎｄ Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ ２０１２から応用される方法によって）植物組織に送達することができる。特定の実施形態では、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをＴ－ＤＮＡにコードし、アグロバクテリウムを用いて（例えば、Ｌｅｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１６；又はＷｕ ｅｔ ａｌ．２０１４から応用される方法によって）植物細胞に一過性に移入させることができる。特定の実施形態では、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをウイルスゲノムにコードし、（例えば、Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．２０１５から応用される方法によって）植物に送達することができる。特定の実施形態では、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをＩＲＥＳ含有ｍＲＮＡ又はＲＮＡにコードし、標的細胞に送達することができる。ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド及びＲＮＡガイドを含む特定の実施形態において、ポリペプチド又はガイドは、（ｉ）ポリペプチド又はガイドのいずれかのコードポリヌクレオチドと；（ｉｉ）コードポリヌクレオチドの非存在下でのポリペプチド又はガイドのいずれかそれ自体との組み合わせによって送達することができる。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、ＨＤＲ促進剤をコードするポリヌクレオチドの送達によって植物細胞内に送達される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドは、植物細胞ゲノムに組み込まれず（例えば、組込みをもたらす配列を欠くポリヌクレオチドとしてか、組込み欠損Ｔ－ＤＮＡベクター又はシステムへのアグロインフィルトレーションによるか、又はウイルスベクターにおいて）、自己複製をもたらすポリヌクレオチドに作動可能に連結されておらず、及び／又は自己複製をもたらす因子（例えば、ウイルス複製タンパク質）のみが提供される。本明細書に提供されるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの一過性発現には、バイオリスティック法などによるポリヌクレオチド送達、アグロインフィルトレーション、及びＣａｎｔｏ，２０１６によって開示されるウイルスベクターの使用などを含め、好適な一過性発現技法を応用することができる。非組込み型のポリヌクレオチドによってコードされる薬剤の一過性発現は、ポリヌクレオチドの切り出し及び／又は薬剤の調節された発現によって達成される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞ゲノム（例えば、植物核又はプラスチドゲノム）に組み込まれ、薬剤の一過性発現は、ポリヌクレオチドの切り出し及び／又はＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの調節された発現によって達成される。薬剤をコードするポリヌクレオチドの切り出しは、部位特異的組換えシステム（例えば、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ、ＦＬＰ－ＦＲＴ）の使用により提供され得る。薬剤の調節された発現は、（ｉ）発生調節性の、抑制解除可能な、及び／又は誘導可能なプロモーターへの、薬剤をコードするポリヌクレオチドの作動可能な連結；及び／又は（ｉｉ）薬剤のｓｉＲＮＡ媒介性阻害を誘導することができるポリヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）の導入を含む方法によって達成することができる。好適な部位特異的組換えシステム並びに発生調節性の、抑制解除可能な、及び／又は誘導可能なプロモーターとしては、米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書（これは、全体として、特にかかる開示に関して、参照により本明細書に援用される）に開示されるものが挙げられる。

【0065】

ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及び／又はゲノム編集分子の一過性発現を達成するために使用することのできるポリヌクレオチド（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、及び／又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）には、（ａ）二本鎖ＲＮＡ；（ｂ）一本鎖ＲＮＡ；（ｃ）化学的に修飾されたＲＮＡ；（ｄ）二本鎖ＤＮＡ；（ｅ）一本鎖ＤＮＡ；（ｆ）化学的に修飾されたＤＮＡ；又は（ｇ）（ａ）～（ｆ）の組み合わせが含まれる。ポリヌクレオチドの特定の実施形態は、有用な機能を提供する追加的なヌクレオチド配列を更に含む；かかる追加的なヌクレオチド配列の非限定的な例としては、アプタマー又はリボスイッチ配列、ステム－ループなどの二次構造を提供するか、又は酵素に対する配列特異的部位（例えば、配列特異的リコンビナーゼ又はエンドヌクレアーゼ部位）を提供するヌクレオチド配列、Ｔ－ＤＮＡ（例えば、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）由来又は植物で感染する若しくは腫瘍を誘導する他の細菌由来の左右のＴ－ＤＮＡ境界間に、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするＤＮＡ配列が囲まれる）、ＤＮＡ核ターゲティング配列、プロモーター配列などの調節配列、及び転写物安定化又は不安定化配列が挙げられる。ポリヌクレオチドの特定の実施形態には、非核酸エレメント、例えば、担体分子、抗体、抗原、ウイルス移動タンパク質、細胞透過性若しくは膜孔形成性ペプチド、ポリマー、検出可能標識、量子ドット、又は粒子若しくはナノ粒子とポリヌクレオチドが複合体化しているか、又は共有結合的若しくは非共有結合的に結合しているものが含まれる。一部の実施形態において、本明細書に提供される構成要素のうちの１つ以上は、誘導性プロモーターの誘導によって一過性に発現する。

【0066】

ｘ．ＨＤＲ促進剤の送達
遺伝子編集分子及び／又はＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢを真核細胞（例えば、植物細胞）に送達するには、様々な処理が有用である。特定の実施形態では、ＨＤＲ促進剤（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はこれらの組み合わせを含む）が、例えば、細胞壁、細胞膜、核膜、及び／又は他の脂質二重層などのバリアを通り抜けて真核細胞又は植物細胞内へと送達されるように、１つ以上の処理が利用される。特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤を含むポリヌクレオチド含有、ポリペプチド含有、又はＲＮＰ含有組成物が、例えば組成物を真核細胞と直接接触させることによって直接送達される。前述の組成物は、液体、溶液、懸濁液、エマルション、逆エマルション、コロイド、分散液、ゲル、リポソーム、ミセル、注射用材料、エアロゾル、固体、粉末、粒子、ナノ粒子、又はこれらの組み合わせの形態で提供されてもよく、真核細胞、真核生物組織、真核生物器官、真核生物、植物、植物部分、植物細胞、又は植物外植片に（例えば、細胞壁又は細胞膜の擦過又は穿刺又は他の方法による破壊を用いて、噴霧又は浸漬若しくは液浸又は他の方法で直接接触させることにより、マイクロインジェクションにより）直接適用することができる。例えば、植物細胞又は植物プロトプラストは、液体ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ含有組成物に液浸され、それによって薬剤が植物細胞に送達される。特定の実施形態において、薬剤含有組成物は、負圧又は正圧を用いて、例えば、減圧浸潤又は流体力学的圧力若しくは流体圧力の印加を用いて送達される。特定の実施形態において、薬剤含有組成物は、例えば、マイクロインジェクションによるか、又は細胞壁若しくは細胞膜の破壊若しくは変形により、例えば、負圧若しくは正圧、剪断力を加えることによるなどの物理的処理によるか、又は界面活性剤、リポソーム、若しくはナノ粒子などの化学的若しくは物理的送達剤での処理により、植物細胞又は植物プロトプラスト内に導入される；例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２８７５０９号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおりの、細胞変形収縮を通じたマイクロ流体フローを利用した細胞への材料の送達を参照のこと。真核細胞、植物細胞又は植物プロトプラストへの薬剤含有組成物の送達に有用な他の技法としては、超音波又は音波処理；振動、摩擦、ずり応力、ボルテックス、キャビテーション；遠心又は機械的な力を加えること；機械的細胞壁又は細胞膜変形又は破壊；酵素的細胞壁又は細胞膜破壊又は透過処理；擦過又は機械的表面剥離（例えば、カーボランダム若しくは他の研磨粒子による擦過又はやすり若しくはサンドペーパーによる表面剥離）又は化学的表面剥離（例えば、酸又は腐食剤による処理）；及び電気穿孔が挙げられる。特定の実施形態において、薬剤含有組成物は、細菌の媒介により（例えば、アグロバクテリウム属種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、リゾビウム属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、シノリゾビウム属種（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、メソリゾビウム属種（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブラディリゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、アゾトバクター属種（Ａｚｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、フィロバクテリウム属種（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．））、薬剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はガイドＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを植物細胞又は植物プロトプラストにトランスフェクトすることによって提供される；例えば、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３３：６２９－６３３を参照のこと。こうした技法のいずれか又はこれらの組み合わせが、或いは、任意選択で続いて植物細胞が入手又は単離される元となる植物外植片、植物部分若しくは組織又はインタクトな植物（又は種子）に利用される；特定の実施形態において、薬剤含有組成物は、植物細胞が単離された後に別個のステップで送達される。特定の実施形態において、前述の方法はまた、真核細胞（例えば、植物細胞）へのゲノム編集分子の導入にも使用することができる。

【0067】

実施形態において、ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢを真核細胞（例えば、植物細胞）に送達するのに利用される処理は、特別な熱的レジームの下で行われ、これには、１つ以上の適切な温度、例えば、冷却若しくは寒冷ストレス（正常な植物成長が起こる温度を下回る温度への曝露）、又は加熱若しくは温熱ストレス（正常な植物成長が起こる温度を上回る温度への曝露）、又は種々の温度の組み合わせでの処理が関わり得る。特定の実施形態において、特別な熱的レジームは、植物細胞、又は続いて植物細胞若しくは植物プロトプラストが入手若しくは単離される元となる植物、植物外植片、若しくは植物部分に対して、薬剤の送達とは別の１つ以上のステップで行われる。特定の実施形態において、前述の方法はまた、真核細胞へのゲノム編集分子の導入にも使用することができる。

【0068】

本明細書に提供される植物部分、システム、方法、及び組成物の特定の実施形態において、全植物又は植物部分若しくは種子、又は単離された植物細胞、植物外植片、植物細胞若しくは植物プロトプラストが入手若しくは単離される元となる植物若しくは植物部分は、少なくとも１つの化学的、酵素的、又は物理的薬剤、又はこれらの組み合わせを含み得る１つ以上の送達剤で処理される。特定の実施形態において、ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、送達のための１つ又は２つ以上の化学的、酵素的、又は物理的薬剤を更に含む。化学的、酵素的又は物理的薬剤による処理は、薬剤の送達と同時に行われてもよく、又は薬剤の送達に先行する、若しくはその後に続く１つ以上の別個のステップで行われてもよい。特定の実施形態において、化学的、酵素的、又は物理的薬剤、又はこれらの組み合わせは、ポリヌクレオチド組成物と会合又は複合体化され、ドナー鋳型ポリヌクレオチドと会合又は複合体化され、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢと会合又は複合体化される；かかる会合又は複合体化の例としては、非共有結合性相互作用（例えば、イオン又は静電相互作用、疎水性又は親水性相互作用、リポソーム、ミセル、又は他の異種組成物の形成）及び共有結合性相互作用（例えば、ペプチド結合、架橋剤を用いて形成される結合）が関わるものが挙げられる。非限定的な例において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、カチオン性脂質とのリポソーム複合体として提供される；ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、カーボンナノチューブとの複合体として提供される；及び／又はＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、薬剤と細胞透過性ペプチドとの融合タンパク質として提供される。ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの送達に有用な薬剤の例としては、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１２３：１－１０によってレビューされる様々なカチオン性リポソーム及びポリマーナノ粒子、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３５６４１４ Ａ１号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載される架橋多重膜リポソームが挙げられる。前述の任意の実施形態において、前述の方法がまた、真核細胞（例えば、植物細胞）へのゲノム編集分子の導入にも用いられ得ることが更に企図される。

【0069】

特定の実施形態において、ＨＤＲ頻度を増加させることができるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチドの送達に使用される化学的薬剤は、以下を含み得る：
（ａ）溶媒（例えば、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、Ｎ－ピロリジン、ピリジン、ヘキサメチルホスホラミド、アルコール類、アルカン類、アルケン類、ジオキサン類、ポリエチレングリコール、及び水に対して混和性若しくは乳化性の、又はホスホヌクレオチドを非水溶液系に溶解させることになる他の溶媒）；
（ｂ）フルオロカーボン類（例えば、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロメチルデカリン）；
（ｃ）グリコール類又はポリオール類（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）；
（ｄ）カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、及び両親媒性界面活性剤などの界面活性剤、例えば、アルキル又はアリール硫酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、又はカルボン酸塩；第一級、第二級、又は第三級アミン類；第四級アンモニウム塩；スルタイン類、ベタイン類；カチオン性脂質；リン脂質；牛脂アミン；コール酸などの胆汁酸；長鎖アルコール類；トリシロキサンエトキシレート界面活性剤などの非イオン性オルガノシリコーン界面活性剤又はポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンとアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルとの共重合体（ＣＡＳ番号２７３０６－７８－１及びＥＰＡ番号ＣＡＬ．ＲＥＧ．ＮＯ．５９０５－５００７３－ＡＡのＳＩＬＷＥＴ Ｌ－７７（商標）ブランドの界面活性剤として市販されている、Ｍｏｍｅｎｔｉｖｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ａｌｂａｎｙ，Ｎ．Ｙ．）などのシリコーンポリエーテル共重合体を含めた、オルガノシリコーン界面活性剤；有用な界面活性剤の具体的な例としては、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎシリーズの界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１１４、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯ、ＴｅｒｇｉｔｏｌタイプのＮＰ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０が挙げられる；
（ｅ）脂質、リポタンパク質、リポ多糖；
（ｆ）酸、塩基、腐食剤；
（ｇ）ペプチド、タンパク質、又は酵素（例えば、セルラーゼ、ペクトリアーゼ、マセロエンザイム（ｍａｃｅｒｏｅｎｚｙｍｅ）、ペクチナーゼ）、例えば、細胞透過性又は膜孔形成性ペプチド（例えば、（ＢＯ１００）２Ｋ８、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ポリリジン、ポリアルギニン、又はポリホモアルギニンペプチド；γゼイン、米国特許出願公開第２０１１／０２４７１００号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと；ヒト免疫不全ウイルス１型の転写活性化因子（「ＨＩＶ－１ Ｔａｔ」）及び他のＴａｔタンパク質、例えば、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｌｉｆｅｔｅｉｎ［ｄｏｔ］ｃｏｍ／Ｃｅｌｌ＿Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ＿Ｐｅｐｔｉｄｅｓ［ｄｏｔ］ｈｔｍｌ及びＪａｅｒｖｅｒ（２０１２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１：ｅ２７，１－１７を参照のこと）；オクタアルギニン又はノナアルギニン；ポリホモアルギニン（Ｕｎｎａｍａｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５６６：３０７－３１０を参照のこと）を含めたもの；また、ｃｒｄｄ［ｄｏｔ］ｏｓｄｄ［ｄｏｔ］ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／で公開されている細胞透過性ペプチドのデータベースＣＰＰｓｉｔｅ ２．０も参照のこと
（ｈ）ＲＮアーゼ阻害薬；
（ｉ）カチオン性分岐又は線状ポリマー、例えば、キトサン、ポリリジン、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリビニルピロリドン（「ＰＶＰ」）、又はポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」、例えば、ＰＥＩ、分岐、ＭＷ２５，０００、ＣＡＳ番号９００２－９８－６；ＰＥＩ、線状、ＭＷ５０００、ＣＡＳ番号９００２－９８－６；ＰＥＩ線状、ＭＷ２５００、ＣＡＳ番号９００２－９８－６）など；
（ｊ）デンドリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１１／００９３９８２号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと）；
（ｋ）対イオン、アミン又はポリアミン（例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシン）、オスモライト、緩衝液、及び塩（例えば、リン酸カルシウム、リン酸アンモニウム）；
（ｌ）ポリヌクレオチド（例えば、非特異的二本鎖ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ）；
（ｍ）トランスフェクション剤（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、及びＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、及びＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（供給元は全て、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、ＰｅｐＦｅｃｔ（Ｅｚｚａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９：５２８４－５２９８を参照のこと）、ＴｒａｎｓＩｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ，ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＬｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，５８：２２８８－２２９４に記載されるとおりの、ポリリジン、ポリホモアルギニン、並びにオクトアルギニン及びノノアルギニン（ｎｏｎｏ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）を含めたポリアルギニン分子）；
（ｎ）抗生物質、例えば、非特異的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤（例えば、フレオマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン）を含めたもの；及び／又は
（ｏ）抗酸化剤（例えば、グルタチオン、ジチオスレイトール、アスコルビン酸）。

【0070】

前述の任意の実施形態において、更に、前述の化学的薬剤はまた、真核細胞（例えば、植物細胞）へのゲノム編集分子の導入にも使用できることが企図される。

【0071】

特定の実施形態において、化学的薬剤は、ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢと同時に提供される。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、１つ以上の化学的薬剤に共有結合的又は非共有結合的に連結され、又はそれと複合体化される；例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ及び／又は配列特異的エンドヌクレアーゼは、ペプチド又はタンパク質（例えば、細胞透過性ペプチド又は膜孔形成性ペプチド）に共有結合的に連結されてもよく、又はカチオン性脂質、ポリカチオン（例えば、ポリアミン）、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）と非共有結合的に複合体化されてもよい。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢは、１つ以上の化学的薬剤と複合体化して、例えば、溶液、リポソーム、ミセル、エマルション、逆エマルション、懸濁液、コロイド、又はゲルを形成する。前述の任意の実施形態において、更に、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含むゲノム編集分子もまた、上記に記載するとおり送達できることが企図される。

【0072】

特定の実施形態において、ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢを送達するための物理的薬剤は、様々なサイズ範囲及び形状の粒子又はナノ粒子（例えば、炭素、ケイ素、炭化ケイ素、金、タングステン、ポリマー、又はセラミックなどの材料でできている粒子又はナノ粒子）、磁性粒子又はナノ粒子（例えば、ｓｉｌｅｎｃｅＭａｇ Ｍａｇｎｅｔｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（商標）薬剤、ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、研磨剤又は表面剥離剤、ニードル又はマイクロニードル、マトリックス、及びグリッドからなる群から選択される少なくとも１つである。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの送達には、粒子及びナノ粒子が有用である。有用な粒子及びナノ粒子としては、金属（例えば、金、銀、タングステン、鉄、セリウム）、セラミック（例えば、酸化アルミニウム、炭化ケイ素、窒化ケイ素、炭化タングステン）、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリジアセチレン、及びポリ（３，４－エチレンジオキシチオフェン）水和物）、半導体（例えば、量子ドット）、ケイ素（例えば、炭化ケイ素）、炭素（例えば、グラファイト、グラフェン、グラフェンオキシド、又はカーボンナノシート、ナノ複合体、又はナノチューブ）、及びコンポジット（例えば、ポリビニルカルバゾール／グラフェン、ポリスチレン／グラフェン、白金／グラフェン、パラジウム／グラフェンナノコンポジット）でできているものが挙げられる。特定の実施形態において、かかる粒子及びナノ粒子は、更に共有結合的又は非共有結合的に官能化されるか、又は修飾物質若しくは架橋された材料、例えば、ポリマー（例えば、線状又は分岐ポリエチレンイミン、ポリリジン）、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、多糖、脂質、ポリグリコール（例えば、ポリエチレングリコール、チオール化ポリエチレングリコール）、ポリペプチド若しくはタンパク質、及び検出可能標識（例えば、フルオロフォア、抗原、抗体、又は量子ドット）を更に含む。様々な実施形態において、かかる粒子及びナノ粒子は、中性であるか、又は正電荷を帯びているか、又は負電荷を帯びている。粒子を含む組成物の実施形態には、例えば、液体、コロイド、分散液、懸濁液、エアロゾル、ゲル、及び固体として製剤化されるものが含まれる。実施形態には、表面又は支持体に取り付けられたナノ粒子、例えば、ケイ素又は銅ウエハ基板上に垂直に整列したカーボンナノチューブのアレイが含まれる。実施形態には、バイオリスティックタイプの技法によるか、又は磁力で送達された粒子（例えば、金若しくはタングステン又は磁性粒子）を含むポリヌクレオチド組成物が含まれる。バイオリスティック法に使用される粒子のサイズは、概して、「マイクロパーティクル」範囲で、例えば、０．６、１．０、及び１．６マイクロメートルサイズ範囲の金マイクロキャリアであり（例えば、Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）遺伝子銃システム、Ｒａｎｄｏｌｐｈ－Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｕｂ－ｍｉｃｒｏｎ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ｌａｒｇｅｒ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標） ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ”，Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＵＳ／ＥＧ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ２０１５の取扱説明書を参照のこと）、しかし、より大きい（４０ナノメートル）ナノ粒子を使用したバイオリスティック送達の成功が、培養動物細胞で報告されている；Ｏ’Ｂｒｉａｎ ａｎｄ Ｌｕｍｍｉｓ（２０１１）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１：６６－７１を参照のこと。有用な粒子の他の実施形態はナノ粒子であり、これは、概してナノメートル（ｎｍ）サイズ範囲又は１マイクロメートル未満であり、例えば、直径が約１ｎｍ未満、約３ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、及び約１００ｎｍ未満である。市販のナノ粒子の具体的な非限定的実施形態（供給元は全て、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）としては、直径が５、１０、又は１５ｎｍの金ナノ粒子；粒径が１０、２０、４０、６０、又は１００ｎｍの銀ナノ粒子；２５ｎｍ未満の粒径のパラジウム「ナノ粉末」；例えば、直径が０．７～１．１、１．３～２．３、０．７～０．９、又は０．７～１．３ｎｍ、又はナノチューブ束寸法が２～１０ｎｍ×１～５マイクロメートル、６～９ｎｍ×５マイクロメートル、７～１５ｎｍ×０．５～１０マイクロメートル、７～１２ｎｍ×０．５～１０マイクロメートル、１１０～１７０ｎｍ×５～９マイクロメートル、６～１３ｎｍ×２．５～２０マイクロメートルの単層、二層、及び多層カーボンナノチューブが挙げられる。特定の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの送達用の物理的薬剤は、金、ケイ素、セリウム、又は炭素などの材料、例えば、金又は金被覆ナノ粒子、炭化ケイ素ウィスカー、カーボランダム、多孔質シリカナノ粒子、ゼラチン／シリカナノ粒子、ナノセリア又は酸化セリウムナノ粒子（ＣＮＰ）、単層、二層、又は多層カーボンナノチューブ及びその化学的に官能化されたバージョン（例えば、アミド、アミノ、カルボン酸、スルホン酸、又はポリエチレングリコール部分で官能化されたカーボンナノチューブ）などのカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、及びグラフェン又はグラフェンオキシド又はグラフェン複合体を含み得る。ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの送達に応用することができるかかる物理的薬剤としては、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，１６：１１６１－１１７２；Ｇｉｒａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１３：４００－４０９；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２：２８３－２９４；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２２：２５５８－２５６７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｏｍｍ．，１３２：９２７４－９２７６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｒｅｓ．Ｌｅｔｔ．，１１：１９５－２０３；及びＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２３５：２２２－２３５に開示されるものが挙げられる。また、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３１１１６８号明細書、同第２０１２／００２３６１９号明細書、同第２０１２／０２４４５６９号明細書、同第２０１３／０１４５４８８号明細書、同第２０１３／０１８５８２３号明細書、同第２０１４／００９６２８４号明細書、同第２０１５／００４０２６８号明細書、同第２０１５／００４７０７４号明細書、及び同第２０１５／０２０８６６３号明細書（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）に開示される各種の粒子及びナノ粒子、その調製、並びに例えば細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達におけるその使用方法も参照のこと。前述の任意の実施形態において、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含むゲノム編集分子もまた、上記に記載するとおり送達できることが更に企図される。

【0073】

一部の実施形態において、「提供される」は、本明細書で使用されるとき、細胞の核において構成要素を一つにまとめ合わせることを含む。一部の実施形態において、１つ以上の構成要素を提供することは、ポリペプチドの送達の形態で提供することである。一部の実施形態において、１つ以上の構成要素の送達は、ポリヌクレオチドと複合体化したポリペプチドの形態である。一部の実施形態において、１つ以上の構成要素の送達は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である。一部の実施形態において、Ｃａｓ及びガイドＲＮＡは、リボ核タンパク質として送達される。一部の実施形態において、ＲＮＰは、リポフェクション又は電気穿孔を用いて細胞に送達される。一部の実施形態において、ポリペプチド又はＲＮＰは、バイオリスティック法で細胞に送達される。一部の実施形態において、ポリペプチド又はＲＮＰは、ＰＥＧ媒介性トランスフェクションで細胞に送達される。一部の実施形態において、構成要素は、性的交雑によって送達される。

【0074】

一部の実施形態において、構成要素は、ＲＮＡとして、又はＤＮＡとして提供される。例えば一部の実施形態において、１つ以上の構成要素は、ｍＲＮＡとして提供される。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、構成要素の１つであるタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、細胞において翻訳されて、１つ以上の構成要素を産生する。

【0075】

一部の実施形態において、１つ以上の構成要素は、染色体に組み込まれた核酸として提供される。

【0076】

一部の実施形態において、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、ｉ）～ｖ）のうちの１つ以上を含む前駆細胞によって提供される。一部の実施形態において、前駆細胞は、本明細書に記載される細胞のいずれか１つ、例えば、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、又は他の真核細胞である。一部の実施形態において、前駆細胞は、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢタンパク質のうちの少なくとも１つを含まない。一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢタンパク質のうちの前駆細胞に含まれない少なくとも１つは、続いて前駆細胞へのポリペプチド、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡの送達及び／又は前駆細胞の性的交雑によって提供される。一部の実施形態において、構成要素は、以下の表Ａに示されるとおり提供される。

【0077】

【表1】

【0078】

【表2】

【0079】

【表3】

【0080】

【表4】

【0081】

ｘｉ．遺伝子編集分子
遺伝子編集分子がｇＲＮＡ（又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド）を含み、それが、ヌクレアーゼ活性欠損のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（又はそれをコードするポリヌクレオチド）を更に含む組成物中に提供される特定の実施形態において、同様に１つ以上の１つの化学的、酵素的、又は物理的薬剤を利用することができる。特定の実施形態において、ＲＮＡガイドとヌクレアーゼ活性欠損ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ｎｄＲＧＤＢＰ）又はそれをコードするポリヌクレオチド）とは、別個に提供され、例えば、別個の組成物で提供される。かかる組成物は、ポリヌクレオチド組成物に有用であるとして上記に記載したものなど、他の化学的又は物理的薬剤（例えば、溶媒、界面活性剤、タンパク質又は酵素、トランスフェクション剤、粒子又はナノ粒子）を含み得る。例えば、多孔質シリカナノ粒子は、ＤＮＡリコンビナーゼをトウモロコシ細胞に送達するのに有用である；例えば、Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｔｉｇｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１６４：５３７－５４７を参照されたく、これは、ｎｄＲＧＤＢＰ又はそれをコードするポリヌクレオチドをトウモロコシ又は他の植物細胞に提供するのに応用することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド組成物はｇＲＮＡとｎｄＲＧＤＢＰとを含み、更に、ｎｄＲＧＤＢＰに作動可能に連結されてもよい界面活性剤及び細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、ｇＲＮＡとｎｄＲＧＤＢＰとの両方をコードするプラスミド又はウイルスベクターを含み、更に、界面活性剤及びカーボンナノチューブを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、複数のｇＲＮＡとｎｄＲＧＤＢＰをコードするｍＲＮＡとを含み、更に、粒子（例えば、金又はタングステン粒子）を含み、このポリヌクレオチド組成物は、バイオリスティック法によって植物細胞又は植物プロトプラストに送達される。前述の任意の実施形態において、ゲノム編集分子を含めた他の目的のポリヌクレオチドもまた、ｇＲＮＡ及びｎｄＲＧＤＢＰの送達の前、その間、又はその後に送達され得ることが更に企図される。

【0082】

特定の実施形態において、植物細胞が入手又は単離される元となる植物、植物外植片、又は植物部分は、植物細胞を入手し、単離し、又は処理する過程で、１つ以上の化学的、酵素的、又は物理的薬剤によって処理される。特定の実施形態において、植物細胞、植物、植物外植片、又は植物部分は、研磨剤、腐食剤、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７又はカチオン性脂質などの界面活性剤、又はセルラーゼなどの酵素によって処理される。前述の任意の実施形態において、ゲノム編集分子を含めた他の目的のポリヌクレオチドもまた、ＨＤＲ促進剤の送達の前、その間、又はその後に送達され得ることが更に企図される。

【0083】

特定の実施形態において、１つ又は２つ以上の化学的、酵素的、又は物理的薬剤は、植物細胞が処理され、入手され、又は単離される植物位置、部分、又は組織以外にある植物又は植物部分中の位置に、ＨＤＲ頻度を増加させるＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢをコードするポリヌクレオチド組成物と別個に、又はそれとの組み合わせで提供され／適用される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、隣接又は遠隔細胞又は組織に適用され、続いて植物細胞が単離されるところである分裂組織に（例えば、維管束系を通じて、又は細胞間移行により）輸送される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド含有組成物は、種子若しくは種子断片又は接合胚若しくは体細胞胚をポリヌクレオチド含有組成物に液浸することにより適用され、それによってポリヌクレオチドが植物細胞に送達される。特定の実施形態において、花芽又は茎頂をポリヌクレオチド含有組成物と接触させ、それによって、所望の植物細胞が入手されるところである花芽又は茎頂においてポリヌクレオチドが細胞に送達される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド含有組成物は、植物の表面又は植物の一部の表面（例えば、葉表面）に適用され、それによって、所望の植物細胞が入手されるところである植物の組織に１つ又は複数のポリヌクレオチドが送達される。特定の実施形態において、全植物又は植物組織がポリヌクレオチド含有組成物の粒子媒介性又はナノ粒子媒介性送達（例えば、バイオリスティック法又はカーボンナノチューブ若しくはナノ粒子送達）に供され、それによって、続いて植物細胞が入手されるところである細胞又は組織に１つ又は複数のポリヌクレオチドが送達される。前述の任意の実施形態において、ゲノム編集分子を含めた他の目的のポリヌクレオチドもまた、ＨＤＲ促進剤の送達の前、その間、又はその後に送達され得ることが更に企図される。

【0084】

ゲノム編集分子は、本明細書に提供されるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾頻度の増加を呈する植物細胞において遺伝子修飾を誘導するための遺伝子編集分子を含む。特定の実施形態において、かかるゲノム編集分子は、（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ用のＲＮＡガイド、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ用のＲＮＡガイドをコードするＤＮＡからなる群から選択されるポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９、ｎＣａｓ９、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａ、ｎＣａｓ１２ａ、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１４、操作されたヌクレアーゼ、コドン最適化されたヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ又は操作されたメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼ；（ｉｉｉ）標的ヌクレオチド配列の部位特異的切断を達成する能力を有する１つ以上のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；及び／又は（ｉｖ）ドナー鋳型ＤＮＡ分子を含むことができる。特定の実施形態において、少なくとも１つの送達剤は、溶媒、フルオロカーボン、グリコール又はポリオール、界面活性剤；第一級、第二級、又は第三級アミン類及び第四級アンモニウム塩；オルガノシリコーン界面活性剤；脂質、リポタンパク質、リポ多糖；酸、塩基、腐食剤；ペプチド、タンパク質、又は酵素；細胞透過性ペプチド；ＲＮアーゼ阻害薬；カチオン性分岐又は線状ポリマー；デンドリマー；対イオン、アミン類又はポリアミン類、オスモライト、緩衝液、及び塩；ポリヌクレオチド；トランスフェクション剤；抗生物質；キレート剤、例えば、シュウ酸アンモニウム、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、又はシクロヘキサンジアミン四酢酸など、非特異的ＤＮＡ二本鎖切断誘導剤；及び抗酸化剤；粒子又はナノ粒子、磁性粒子又はナノ粒子、研磨剤又は表面剥離剤、ニードル又はマイクロニードル、マトリックス、及びグリッドからなる群から選択される。特定の実施形態において、本明細書に提供される細胞を含む真核細胞（例えば、植物細胞）、システム、方法、又は組成物は、（ａ）少なくとも１つのＣａｓ９、ｎＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、ｎＣａｓ１２ａ、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、又はＣａｓ１２ｉヌクレアーゼ又はニッカーゼを有する少なくとも１つの細胞；（ｂ）少なくとも１つのガイドＲＮＡ；及び（ｃ）任意選択で、少なくとも１つの化学的、酵素的、又は物理的送達剤を更に含む。

【0085】

本明細書に提供される細胞、システム、方法、組成物、及び反応混合物に有用な遺伝子編集分子は、ゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ内に位置する標的遺伝子など、二本鎖ＤＮＡに二本鎖切断（「ＤＳＢ」）を導入する能力を有する分子、並びに付随するガイドＲＮＡ又はドナー鋳型ポリヌクレオチドを含む。かかる遺伝子編集分子の例としては、（ａ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９、ｎＣａｓ９ニッカーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、ｎＣａｓ１２ａニッカーゼ、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１４ 操作されたヌクレアーゼ、コドン最適化されたヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はニッカーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）又はニッカーゼ、アルゴノート、及びメガヌクレアーゼ又は操作されたメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼ；（ｂ）標的編集部位の部位特異的改変（ＤＳＢの導入など）を達成する能力を有する１つ以上のヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；（ｃ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ用のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ用のｇＲＮＡをコードするＤＮＡ；及び（ｄ）ドナー鋳型ポリヌクレオチドが挙げられる。

【0086】

ＣＲＩＳＰＲ型ゲノム編集は、本明細書に提供される真核細胞（例えば、植物細胞）、システム、方法、及び組成物における使用に幾つかの方法で応用することができる。ＣＲＩＳＰＲエレメント、即ち、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲシングルガイドＲＮＡ又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子編集分子は、ＣＲＩＳＰＲエレメントの残遺物又は選択的遺伝子マーカーが子孫に現れることなくゲノム編集を達成するのに有用である。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲエレメントは、単離された分子として、無細胞合成法（例えば、インビトロ翻訳）の単離若しくは半精製された産物として、又は細胞ベースの合成法（例えば、細菌又は他の細胞のライセート中など）の単離若しくは半精製された産物として、真核細胞（例えば、植物細胞）、システム、方法、及び組成物に直接提供される。特定の実施形態において、ゲノムが挿入されたＣＲＩＳＰＲエレメントは、本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物における使用に適合された植物株において有用である。特定の実施形態において、本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物に使用される植物又は植物細胞は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１型又は他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ）を発現するトランス遺伝子を含み得る。特定の実施形態において、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ認識部位と共に使用することができる。ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）がＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するｇＤＮＡ標的編集部位の配列に特異的に結合することができる。典型的には、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの種類から、好適なＰＡＭ部位の位置及びｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの設計を知ることができる。Ｃａｓ９タンパク質と使用されるｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの設計については、典型的にはＧリッチＰＡＭ部位、例えば５’－ＮＧＧが標的となる。Ｃａｓ１２ａタンパク質（例えば、配列番号２７、２８、２９、及び３０）と使用されるｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡの設計については、典型的にはＴリッチＰＡＭ部位（例えば、５’－ＴＴＴＶ［１］、式中、「Ｖ」は、Ａ、Ｃ、又はＧである）が標的となる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ並びに対応するガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位については、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３ Ａ１号明細書（これは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ並びにガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位のその開示に関して参照により本明細書に援用される）に開示される。植物ゲノムに組み込まれるか、又はそれとは別様に植物に提供されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼと相互作用する多種多様なＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのうちの１つ以上を導入することは、所望の表現型又は形質を付与するための遺伝子編集、形質スクリーニング、又は遺伝子編集媒介性の形質遺伝子移入（例えば、反復親との戻し交雑のない、又は反復親との戻し交雑を制限した新規遺伝子型への形質の導入）に有用である。複数のエンドヌクレアーゼが適切なプロモーターと共に発現カセットに提供されてもよく、染色体ＤＮＡ又はエピソームＤＮＡのいずれかにおける空間的又は時間的に離れた形での複数のゲノム編集が可能となる。

【0087】

真核生物の遺伝子を編集するためのＣＲＩＳＰＲ技術については、米国特許出願公開第２０１６／０１３８００８Ａ１号明細書及び同第２０１５／０３４４９１２Ａ１号明細書、並びに米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，９４５，８３９号明細書、同第８，９９９，６４１号明細書、同第８，９９３，２３３号明細書、同第８，８９５，３０８号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，９３２，８１４号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、及び同第８，９０６，６１６号明細書に開示される。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ並びに対応するガイドＲＮＡ及びＰＡＭ部位については、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３ Ａ１号明細書に開示される。ゲノムの編集に有用な他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１２ｂ及びＣａｓ１２ｃ（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７を参照）並びにＣａｓＸ及びＣａｓＹ（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２１０５９を参照）が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現用の植物ＲＮＡプロモーター及び植物コドン最適化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１８１０４号明細書（国際公開第２０１５／１３１１０１号パンフレットとして公開されており、米国仮特許出願第６１／９４５，７００号明細書に対する優先権を主張する）に開示される。植物におけるゲノム編集へのＣＲＩＳＰＲ技術の使用方法が、米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書及び同第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書並びに国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３８７６７ Ａ１号明細書（国際公開第２０１６／００７３４７号パンフレットとして公開されており、米国仮特許出願第６２／０２３，２４６号明細書に対する優先権を主張する）に開示される。本段落中で言及される特許公報は全て、全体として参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、標的編集部位がエンドヌクレアーゼ認識配列で切断された後に平滑末端が残るＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが使用される。平滑末端に切断するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｃ、及びＣａｓ１２ｈが挙げられる（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼ認識配列の切断後に付着末端型一本鎖ＤＮＡオーバーハング末端が残るＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが使用される。付着末端に切断するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、及びＣａｓ１２ｅが挙げられる。

【0088】

本方法、システム、組成物、真核細胞（例えば、植物細胞）はまた、標的編集部位内のエンドヌクレアーゼ認識配列にあるｄｓＤＮＡの単一ＤＮＡ鎖を切断する配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡも使用することができる。ｄｓＤＮＡ標的編集部位における単一ＤＮＡ鎖のかかる切断は、本明細書及び他の部分では「ニッキング」とも称され、これは様々な「ニッカーゼ」又はニッキングをもたらすシステムによって達成され得る。使用し得るニッカーゼとしては、ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａアミノ酸置換を含むＣａｓ９）、ｎＣａｓ１２ａ（例えば、Ｒ１２２６Ａアミノ酸置換を含むＣａｓ１２ａ；Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、Ｃａｓ１２ｉ（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）、ジンクフィンガーニッカーゼ、例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２に開示されるとおり）、ＴＡＬＥニッカーゼ（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４に開示されるとおり）、又はこれらの組み合わせが挙げられる。特定の実施形態において、ニッキングをもたらすシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａ）と、標的編集部位のＤＮＡ配列に対して少なくとも１塩基のミスマッチを有するガイドＲＮＡ分子とを含み得る（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。特定の実施形態において、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、又は２００ＤＮＡ塩基対以下しか離れていないゲノム位置に一本鎖切断（即ち、「ニック」）を作り出すことにより、標的編集部位にゲノム修飾を導入することができる。特定の例示的且つ非限定的な実施形態では、２つのニッカーゼ（即ち、ｎＣａｓ９、ｎＣａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、これらの組み合わせなどを含めた、一本鎖ＤＮＡ切断を導入するＣＡＳヌクレアーゼ）又はニッカーゼシステムを指向させて、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０又は１００ＤＮＡ塩基対以下しか離れていない近接部位に切れ目を入れることができる。ＲＮＡ誘導型ニッカーゼ及びＲＮＡガイドが使用される例では、ＲＮＡガイドは、十分に近い（即ち、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、又は２００ＤＮＡ塩基対以下しか離れていない）ＰＡＭ配列に隣接する。ニッカーゼ又はニッカーゼシステムが使用される前述の実施形態のいずれにおいても、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質を認識することのできる５’→３’又は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを使用することができる。特定の実施形態では、ニッカーゼ又はニッカーゼシステム、ＳＳＡＰ、及びＳＳＢと併せて、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を使用することができる。

【0089】

遺伝子編集の目的では、ＣＲＩＳＰＲアレイは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を持つように設計され得る；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１－２３０８を参照のこと。Ｃａｓ９がＤＮＡ切断を起こすには、少なくとも１６又は１７ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要である；Ｃｐｆ１については、検出可能なＤＮＡ切断の実現に少なくとも１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要とされ、インビトロでの効率的なＤＮＡ切断には少なくとも１８ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列が必要と報告されている；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照のこと。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、概して、１７～２４ヌクレオチド（多くの場合に１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の長さ及び標的とする遺伝子又は核酸配列との正確な相補性（即ち、完全な塩基対合性）を有するように設計される；標的配列との相補性が１００％未満のガイドＲＮＡが使用されてもよく（例えば、２０ヌクレオチドの長さで、標的配列と１～４個のミスマッチを有するｇＲＮＡ）、但し、オフターゲット効果の可能性が高まり得る。植物ゲノム編集における使用に有効なガイドＲＮＡの設計については、米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８ Ａ１号明細書（この明細書全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。最近になって、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣した、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼへの結合用）と少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的となる配列にヌクレアーゼを誘導する）との両方を持つ操作された（合成の）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いて、効率的な遺伝子編集が実現している；例えば、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９－８２３；Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．，１４：３２７－３４０を参照のこと。化学的に修飾されたｓｇＲＮＡがゲノム編集において有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照のこと。植物ゲノム編集における使用に有効なｇＲＮＡの設計については、米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８ Ａ１号明細書（この明細書全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。

【0090】

本明細書に提供されるシステム、方法、及び組成物における、標的ヌクレオチド配列の部位特異的修飾を達成する能力を有する他の配列特異的エンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮ）、アルゴノートタンパク質、及びメガヌクレアーゼ又は操作されたメガヌクレアーゼが挙げられる。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、核酸切断ドメイン、例えばヌクレアーゼに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む操作されたタンパク質である。ジンクフィンガー結合ドメインが特異性を提供し、これは、いかなる所望の標的ＤＮＡ配列も特異的に認識するように操作することができる。植物及び他の生物におけるＺＦＮの構築及び使用のレビューについては、例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：６３６－６４６を参照のこと。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）と呼ばれる大規模な真核生物転写因子クラスのＤＮＡ結合ドメインに由来する。ＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、各々が特異的ＤＮＡトリプレットを認識する少なくとも３個のジンク「フィンガー」のタンデムアレイを含んでいる。ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の設計には、幾つもの戦略を用いることができる。「モジュラーアセンブリ」と称される一つの手法は、ＤＮＡとの個々のジンクフィンガーの機能的自律性に頼る。この手法では、配列中のトリプレット成分毎にジンクフィンガーを同定し、それらをつなぎ合わせてマルチフィンガーペプチドにすることにより、所与の配列を標的化する。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計には、幾つかの代替的な戦略も開発されている。それらの方法は、ジンクフィンガーが隣接フィンガー並びにその標的トリプレットの外側にあるヌクレオチド塩基と接触する能力を適応させるように設計される。典型的には、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を呈する。操作方法には、例えば、合理的設計及び各種の選択が含まれる。合理的設計には、例えば、トリプレット（又はクアドルプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列のデータベースの使用が含まれ、そこでは各トリプレット又はクアドルプレットヌクレオチド配列が、特定のトリプレット又はクアドルプレット配列と結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連付けられている。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号明細書及び同第６，５３４，２６１号明細書（両方とも全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。例示的選択方法（例えば、ファージディスプレイ及び酵母２ハイブリッドシステム）は周知であり、文献に記載されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性を増強することが、米国特許第６，７９４，１３６号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。加えて、個々のジンクフィンガードメインが、任意の好適なリンカー配列を用いて一体に連結されてもよい。リンカー配列の例は公知であり、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照されたい。核酸切断ドメインは非特異的であり、典型的には、Ｆｏｋｌなどの制限エンドヌクレアーゼである。このエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するためには二量化しなければならない。従って、ＺＦＮの一部としてのＦｏｋｌによる切断には、２つの隣接する且つ独立した結合イベントが必要であり、それらは、正しい向き、及び二量体形成を許容する適切な間隔の両方を伴い起こらなければならない。２つのＤＮＡ結合イベントが必要であるため、長い、且つ潜在的にユニークな認識部位を一層特異的に標的化することが可能となる。活性が増強されたＦｏｋｌバリアントが記載されている；例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４００：９６－１０７を参照のこと。

【0091】

転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、宿主植物の遺伝子発現を調節するため、並びに細菌によるコロニー形成及びその生存を促進するため、特定のキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種によって分泌されるタンパク質である。ＴＡＬＥは転写因子として働き、植物における耐性遺伝子の発現を調節する。ＴＡＬＥの最近の研究から、ＴＡＬＥの繰り返し領域をその標的ＤＮＡ結合部位と関係付けるコードが明らかになっている。ＴＡＬＥは、概ね３３又は３４アミノ酸セグメントのタンデムリピートからなる高度に保存された繰り返し領域を含む。これらのリピート単量体は、主にアミノ酸位置１２位及び１３位で互いに異なる。１２位及び１３位のユニークなアミノ酸対とＴＡＬＥ結合部位における対応するヌクレオチドとの間には、強い相関があることが分かっている。アミノ酸配列とＴＡＬＥ結合ドメインのＤＮＡ認識との間のこの単純な関係のおかげで、あらゆる所望の特異性のＤＮＡ結合ドメインを設計することが可能となる。ＴＡＬＥを非特異的ＤＮＡ切断ドメインに連結して、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮと称される配列特異的エンドヌクレアーゼを調製することができる。ＺＦＮの場合のように、好都合にはＦｏｋｌなどの制限エンドヌクレアーゼを使用することができる。植物におけるＴＡＬＥＮの使用の説明については、Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０８：２６２３－２６２８及びＭａｈｆｏｕｚ（２０１１）ＧＭ Ｃｒｏｐｓ，２：９９－１０３を参照のこと。

【0092】

アルゴノートは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列）を含むポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡ）と結合することによって配列特異的エンドヌクレアーゼとして機能できるタンパク質であり、このポリヌクレオチドがアルゴノートを標的ヌクレオチド配列に誘導し、標的ヌクレオチド配列の部位特異的改変を生じさせる；例えば、米国特許出願公開第２０１５／００８９６８１号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。

【0093】

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ認識配列に結合する。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ認識配列を切断する。一部の実施形態において、用語「エンドヌクレアーゼ認識配列」は、エンドヌクレアーゼ切断部位配列と同義的に使用される。

【0094】

一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは不要である。一部の実施形態において、本方法は、二本鎖切断を非特異的に導入する化合物を提供することによって行われる。例示的な二本鎖切断誘導化合物としては、ヒドロキノン（ＨＱ）、ベンゾキノン（ＢＱ）、ベンゼントリオール（ＢＴ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ブレオマイシン（ＢＬＭ）又はアスコルビン酸ナトリウム（Ｖｉｔ Ｃ）が挙げられ、二本鎖切断の導入に使用される。

【0095】

本明細書に提供される方法、システム、真核細胞（例えば、植物細胞）、及び組成物に使用されるドナー鋳型ＤＮＡ分子は、５’から３’に、第１の相同アーム、置換ＤＮＡ、及び第２の相同アームを含むＤＮＡ分子を含み、ここで相同アームは、ｇＤＮＡにおいてエンドヌクレアーゼ認識配列に隣接するゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）配列と部分的又は完全に相同の配列を含み、及び置換ＤＮＡは、標的ｇＤＮＡと比べて１ＤＮＡ塩基対以上の挿入、欠失、又は置換を含み得る。特定の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、約２０、５０、１００、２００、４００、又は６００～約８００、又は１０００塩基対長であり得る。特定の実施形態において、ドナー鋳型ＤＮＡ分子は、環状（例えば、プラスミド又はジェミニウイルスベクターを含めたウイルスベクター）又は線状ＤＮＡ分子で真核細胞（例えば、植物細胞）に送達することができる。特定の実施形態において、使用し得る環状又は線状ＤＮＡ分子は、５’から３’に、エンドヌクレアーゼ認識配列の第１のコピー、第１の相同アーム、置換ＤＮＡ、第２の相同アーム、及びエンドヌクレアーゼ認識配列の第２のコピーを含む修飾されたドナー鋳型ＤＮＡ分子を含み得る。理論によって制限されることを望むものではないが、かかる修飾されたＤＮＡドナー鋳型分子は、真核細胞の標的編集部位（ｅｉｄｉｔｎｇ ｓｉｔｅ）ゲノムＤＮＡ内のエンドヌクレアーゼ認識配列の切断に使用されるのと同じ配列特異的エンドヌクレアーゼによって切断されることができるため、ドナー鋳型ＤＮＡ分子が放出されて、それが真核細胞ゲノムにおける標的編集部位のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾に関与することができる。特定の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は、５’から３’に、切断型エンドヌクレアーゼ認識配列、第１の相同アーム、置換ＤＮＡ、第２の相同アーム、及び切断型エンドヌクレアーゼ認識配列を含む線状ＤＮＡ分子を含み得る。特定の実施形態において、切断型エンドヌクレアーゼ配列は、平滑末端型のＤＮＡ末端又は５’リン酸基を任意選択で含み得る平滑末端型のＤＮＡ末端を含み得る。特定の実施形態において、切断型エンドヌクレアーゼ配列は、一本鎖５’又は３’ＤＮＡオーバーハングを有するＤＮＡ末端を含む。かかる切断型エンドヌクレアーゼ認識配列は、インタクトな標的配列の切断、又は切断された標的配列特異的エンドヌクレアーゼ認識配列のコピーの合成のいずれかによって作られ得る。ドナーＤＮＡ鋳型は、化学的に合成されても、又は酵素的に（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で）合成されても、いずれであってもよい。

【0096】

二本鎖ＤＮＡ以外のドナー鋳型の使用も企図される。例えば、一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡの前駆体が提供される。一部の実施形態では、逆転写酵素のＲＮＡ鋳型が提供される。一部の実施形態では、ＲＮＡに加えて逆転写酵素が提供される。一部の実施形態において、本方法は、一本鎖ＤＮＡドナー鋳型の使用を含む。一部では、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ鋳型が使用される。一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの使用を含む。一部の実施形態では、ＰＮＡを使用してドナー鋳型が作成される。

【0097】

一部の実施形態において、２つ以上のドナー鋳型が提供される。一部の実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のドナー鋳型が提供される。一部の実施形態において、それらのドナー鋳型は同じ遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、それらのドナー鋳型は、同じ経路内にある異なる遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、それらのドナー鋳型は、同じ機能を果たす複数の遺伝子を標的とする。

【0098】

本明細書に提供される植物細胞及び方法において使用される他のゲノム編集分子は、トランス遺伝子又はそれを含むベクターを有する植物又は細胞に対して使用することができる。かかるトランス遺伝子は、除草剤耐性、耐害虫性（例えば、昆虫、線虫、又は植物病原性真菌及び細菌に対する耐性）、収量向上、油、デンプン、及びタンパク質含有分の増加及び／又は定性的向上、非生物的ストレス耐性の向上（例えば、水利用効率又は耐干性、浸透圧ストレス耐性、高塩分ストレス耐性、熱ストレス耐性の向上又は亢進、低温発芽耐性を含めた耐寒性の亢進）などを含めた有用な形質を付与することができる。かかるトランス遺伝子には、外因性タンパク質の発現によって形質を付与するトランス遺伝子並びに内因性植物遺伝子の発現を阻害することによって（例えば、内因性植物遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ応答を誘導することによって）形質を付与するトランス遺伝子の両方が含まれる。かかる形質を提供することのできるトランス遺伝子については、米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書及び同第２０１７０２７５６３６号明細書（これらは、各々が、全体として参照により、特にかかる開示に関して本明細書に援用される）に開示されている。

【0099】

一部の実施形態では、真核細胞（例えば、植物細胞）内に、前述のＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ及び／又はゲノム編集分子のいずれかをコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現をドライブする１つ以上のポリヌクレオチド又はベクターが導入される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドベクターは、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ又はゲノム編集分子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターなどの調節エレメントを含む。かかる実施形態において、それらのポリヌクレオチドの発現は、適切なプロモーター、特に真核細胞（例えば、植物細胞）で機能性のプロモーターの選択によって制御することができる；有用なプロモーターは、構成的な、条件的な、誘導性の、及び時間的又は空間的に特異的なプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、発生調節性プロモーター、又は細胞周期調節性プロモーター）を含む。植物細胞において使用し得る発生調節性プロモーターとしては、米国特許出願公開第２０１７０１２１７２２号明細書（これは全体として、特にかかる開示に関して参照により本明細書に援用される）に開示されるリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼタンパク質、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマンフォールドタンパク質、脂肪細胞細胞膜結合タンパク質様タンパク質、リスケ［２Ｆｅ－２Ｓ］鉄硫黄ドメインタンパク質、葉緑体呼吸還元６タンパク質、Ｄ－グリセリン酸３－キナーゼ、葉緑体様タンパク質、クロロフィルａ－ｂ結合タンパク質７、葉緑体様タンパク質、紫外線Ｂ抑制性タンパク質、Ｓｏｕｌヘム結合ファミリータンパク質、光化学系Ｉ反応中心サブユニットｐｓｉ－Ｎタンパク質、及び短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼタンパク質が挙げられる。特定の実施形態において、プロモーターは、複数のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、ここでガイドＲＮＡをコードする配列は、マイクロＲＮＡ認識／切断部位又は自己切断型リボザイムをコードするヌクレオチド配列などの切断部位によって隔てられている（例えば、Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ（２０１４）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ Ｂｉｏｌ．，２：ａ００３５７４を参照のこと）。特定の実施形態において、プロモーターは、１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。特定の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、真核細胞（例えば、植物細胞）において遺伝子発現をドライブする構成的プロモーターである。特定の実施形態において、プロモーターは、核において、又は葉緑体若しくはミトコンドリアなどの細胞小器官において遺伝子発現をドライブする。植物に使用される構成的プロモーターの例としては、米国特許第５，８５８，７４２号明細書及び同第５，３２２，９３８号明細書に開示されるとおりのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、米国特許第５，６４１，８７６号明細書に開示されるとおりのコメアクチンプロモーター、米国特許第７，１５１，２０４号明細書に開示されるとおりのトウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター、並びにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ゲノム編集システムのエレメントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）由来のプロモーター、ルビスコプロモーター、又は光合成組織において活性のピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーターである。他の企図されるプロモーターとしては、細胞特異的若しくは組織特異的又は発生調節性プロモーター、例えば、核酸ターゲティングシステムの発現を生殖細胞系列又は生殖細胞に制限するプロモーター（例えば、ＤＮＡリガーゼ、リコンビナーゼ、レプリカーゼをコードする遺伝子、又は生殖細胞系列若しくは生殖細胞に特異的に発現する他の遺伝子のプロモーター）が挙げられる。特定の実施形態において、ゲノム改変は、そこからのＤＮＡが遺伝によって後続の世代に受け継がれる細胞のみに制限され、これは、遺伝毒性又は他の望ましくない効果を回避するためにゲノム編集システムの発現が制限されることが望ましい場合に有利である。本段落中で言及される特許公報は全て、全体として参照により本明細書に援用される。

【0100】

本明細書に提供される発現ベクター又はポリヌクレオチドは、発現カセットの３’末端の近傍に、転写を終結させるシグナルとして働き、且つ得られたｍＲＮＡのポリアデニル化を導く、またプロモーター活性も支持し得るＤＮＡセグメントを含んでもよい。かかる３’エレメントは、一般に「３’－非翻訳領域」又は「３’－ＵＴＲ」又は「ポリアデニル化シグナル」と称される。ある場合には、植物遺伝子ベースの３’エレメント（又はターミネーター）は、３’－ＵＴＲと下流非転写配列との両方からなる（Ｎｕｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。有用な３’エレメントとしては、米国特許第６，０９０，６２７号明細書（参照により本明細書に援用される）に開示されるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） ｎｏｓ ３’、ｔｍｌ ３’、ｔｍｒ ３’、ｔｍｓ ３’、ｏｃｓ ３’、及びｔｒ７ ３’エレメント、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９２８１３ Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用される）に開示されるコムギ（トリチカム・エスティブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））由来の熱ショックタンパク質１７、ユビキチン、及びフルクトース－１，６－ビホスファターゼ遺伝子、並びにコメ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））由来のグルテリン、乳酸デヒドロゲナーゼ、及びβ－チューブリン遺伝子など、植物遺伝子由来の３’エレメントが挙げられる。

【0101】

特定の実施形態において、発現カセットを含むベクター又はポリヌクレオチドは、追加的な構成要素、例えば、薬剤抵抗性若しくは除草剤遺伝子をコードするポリヌクレオチド又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）若しくはβ－グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）などの検出マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、そのベクター若しくはポリヌクレオチドを発現する細胞を簡便にスクリーニング又は選択することが可能である。選択マーカーとしては、グリホサート、スルホニル尿素類、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン類、及び２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）などの除草化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。かかる選択マーカー遺伝子及び選択的薬剤としては、スルホニル尿素類及びイミダゾリノン類に対する抵抗性を付与するトウモロコシＨＲＡ遺伝子（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ ７：１２４１－１２４８）、グリホサートに対する抵抗性を付与するＣＰ４遺伝子（米国再発行特許ＲＥ０３９２４７号明細書、全体として、並びにかかる遺伝子及び関連する選択方法に関して、具体的に参照により本明細書に援用される）、グリホサートに対する抵抗性を付与するＧＡＴ遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０４：１１５１－１１５４）、ａａｄＡ遺伝子など、スペクチノマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子（Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１４：１９７－２０５）及びグルホシネートアンモニウムに対する抵抗性を付与するｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１０６２）、及びＰＡＴ（又はトウモロコシについてのｍｏＰＡＴ、Ｒａｓｃｏ－Ｇａｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１：５６９－７６を参照のこと；また、Ｓｉｖａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９も参照のこと）及びマンノース含有培地での成長を可能にするＰＭＩ遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２：６８４－６９０）が挙げられる。

【0102】

特定の実施形態において、本明細書に提供される真核細胞（例えば、植物）、方法、システム、及び組成物では、対抗選択マーカーを使用することができる。かかる対抗選択マーカーは、特定の実施形態では、宿主細胞ゲノムへの標的編集部位における挿入が意図されない任意のＤＮＡに取り入れることができる。かかる実施形態において、対抗選択マーカーを有するＤＮＡの非限定的な例としては、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＢ、ＳＳＡＰ、及び／又はエキソヌクレアーゼ）、遺伝子編集分子、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードするＤＮＡに連結される任意のＤＮＡ分子が挙げられる。ドナー鋳型ＤＮＡ分子を含むベクター又はＤＮＡ分子、ここで対抗選択マーカーはドナー鋳型ＤＮＡに連結され、且つ任意選択で、ドナー鋳型ＤＮＡと標的編集部位配列によって隔てられている。植物において使用し得る対抗選択マーカーの例としては、シトシンデアミナーゼ遺伝子（例えば、５－フルオロシトシンと併せて使用される；Ｓｃｈｌａｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｏｙｋａａｓ，１９９７）、ホスホン酸エステルヒドロラーゼ（例えば、グリセロールグリホサートを含めた、グリホサートのホスホン酸エステル類と併せて使用される；Ｄｏｔｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．１９９６）、硝酸レダクターゼ（例えば、アンモニアを単一窒素源として含有する培地で塩素酸塩と併せて使用される；Ｎｕｓｓａｕｍｅ，ｅｔ ａｌ．１９９１）が挙げられる。

【0103】

特定の実施形態では、ＨＤＲ促進剤（即ち、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ）及び／又は修飾された鋳型ＤＮＡ分子によってＨＤＲ頻度の増加がもたらされるため、選択マーカーの使用は不要となる。かかる実施形態では、本明細書に提供される細胞、システム、方法、又は組成物に使用されるドナー鋳型ＤＮＡ分子、ドナー鋳型ＤＮＡ分子若しくは他のＤＮＡ分子の送達に使用されるプラスミド、又は任意の他のベクター（例えば、ウイルスベクター）若しくはポリヌクレオチドのいずれからも、選択マーカー及び／又は対抗選択マーカーを省くことができる。

【0104】

Ｂ．遺伝子操作方法
一態様において、本開示は、真核細胞を遺伝子操作する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を提供することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を送達することを含む。

【0105】

別の態様において、本開示は、真核細胞を遺伝子操作する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、及びｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼを含む。

【0106】

別の態様において、本方法は、ｉ）二本鎖切断誘導化合物、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、及びｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼを含む。

【0107】

ｉ．遺伝子修飾
遺伝子操作は、遺伝子機能（即ち、コードされる遺伝子産物の活性）の低減であり得る。これには、本明細書で考察するとおり、欠損配列を提供するための対応する修復鋳型が必要であり得るか、又はそれは、ＤＳＢの誘導を経るものであり得る。詳細には、遺伝子摂動は遺伝子ノックダウンである。一部の実施形態において、細胞は植物又は動物細胞である。一部の実施形態において、遺伝子操作は、遺伝子内への終止コドンの導入である。一部の実施形態において、遺伝子操作は、プロモーター又は開始コドンの突然変異である。

【0108】

或いは、遺伝子操作は、遺伝子機能（即ち、コードされる遺伝子産物の活性）の増加であり得る。これには、本明細書で考察するとおり、修正された配列を提供するための対応する修復鋳型が必要であり得る。一部の実施形態において、遺伝子操作は、タンパク質コード遺伝子における１つ以上のヌクレオチドの置換である。

【0109】

一部の実施形態において、標的編集部位はプロモーター領域に位置する。一実施形態において、ヌクレオチド配列はプロモーターであってもよく、ここでプロモーターを編集すると、以下のいずれか１つ又は以下を組み合わせたいずれか１つが生じることになる：プロモーター活性の増加、プロモーター組織特異性の増加、プロモーター活性の低下、プロモーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの突然変異及び／又はＤＮＡ結合エレメントの欠失若しくは付加。

【0110】

一実施形態において、ヌクレオチド配列は、細胞のゲノム中の調節配列であり得る。調節配列は、生物における特異的遺伝子の発現を増加又は減少させる能力を有する核酸分子中のセグメントである。調節配列の例としては、限定はされないが、転写アクチベーター、転写リプレッサー、及び翻訳リプレッサー、スプライシング因子、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、人工ｍｉＲＮＡ、ＣＡＡＴボックス、ＣＣＡＡＴボックス、プリブノーボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＥＣＩＳエレメント及びポリアデニル化シグナルが挙げられる。一部の実施形態において、調節エレメントを編集すると、タンパク質翻訳、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、又は転写終結が改変されることになる。

【0111】

一実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用してＴＥＴオペレーターリプレッサー／オペレーター／インデューサーシステムの構成要素又はスルホニル尿素（Ｓｕ）リプレッサー／オペレーター／インデューサーシステムの構成要素を植物ゲノムに挿入することにより、誘導性発現システムを作成又は制御することができる。

【0112】

別の実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用してプロモーター又はプロモーターエレメントの欠失を実現することができ、ここでプロモーターを欠失させると（又はプロモーターエレメントを欠失させると）、以下のいずれか１つ又は以下を組み合わせたいずれか１つが生じることになる：遺伝子座の永久的な不活化、プロモーター活性の増加（プロモーター強度の増加）、プロモーター組織特異性の増加、プロモーター活性の低下、プロモーター組織特異性の低下、新規プロモーター活性、誘導性プロモーター活性、遺伝子発現ウィンドウの延長、遺伝子発現のタイミング又は発生進行の修飾、ＤＮＡ結合エレメントの突然変異及び／又はＤＮＡ結合エレメントの付加。欠失させることになるプロモーターエレメントは、限定はされないが、プロモーターコアエレメント、プロモーターエンハンサーエレメント又は３５Ｓエンハンサーエレメントであり得る。欠失させることになるプロモーター又はプロモーター断片は、編集下の細胞にとって内因性であるか、人工的であるか、前から存在するか、又はトランスジェニックであり得る。

【0113】

一実施形態において、修飾されることになるヌクレオチド配列はターミネーターであってもよく、ここでターミネーターの編集は、ターミネーター（「ターミネータースワップ」又は「ターミネーター置換」とも称される）又はターミネーター断片を別のターミネーター（置換ターミネーターとも称される）又はターミネーター断片（置換ターミネーター断片とも称される）に置き換えることを含み、ここでターミネーターを置換すると、以下のいずれか１つ又は以下を組み合わせたいずれか１つが生じることになる：ターミネーター活性の増加、ターミネーター組織特異性の増加、ターミネーター活性の低下、ターミネーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの突然変異及び／又はＤＮＡ結合エレメントの欠失若しくは付加”。修飾されることになるターミネーター（又はターミネーター断片）は、編集下の細胞にとって内因性の、人工的な、前から存在する、又はトランスジェニックのターミネーター（又はターミネーター断片）であり得る。置換ターミネーター（又は置換ターミネーター断片）は、編集下の細胞にとって内因性の、人工的な、前から存在する、又はトランスジェニックのターミネーター（又はターミネーター断片）であり得る。

【0114】

挿入されることになるターミネーター（又はターミネーターエレメント）は、編集下の細胞にとって内因性の、人工的な、前から存在する、又はトランスジェニックのターミネーター（又はターミネーターエレメント）であり得る。

【0115】

別の実施形態において、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用してターミネーター又はターミネーターエレメントの欠失を実現することができ、ここでターミネーターを欠失させると（又はターミネーターエレメントを欠失させると）、以下のいずれか１つ又は以下を組み合わせたいずれか１つが生じることになる：ターミネーター活性の増加（ターミネーター強度の増加）、ターミネーター組織特異性の増加、ターミネーター活性の低下、ターミネーター組織特異性の低下、ＤＮＡ結合エレメントの突然変異及び／又はＤＮＡ結合エレメントの付加。欠失させることになるターミネーター又はターミネーター断片は、編集下の細胞にとって内因性であるか、人工的であるか、前から存在するか、又はトランスジェニックであり得る。

【0116】

修飾には、５’キャップ、３’ポリアデニル化尾部、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドを細胞内位置に標的化する修飾又は配列、追跡手段を提供する修飾又は配列、タンパク質の結合部位を提供する修飾又は配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣヌクレオチド、２，６－ジアミノプリンヌクレオチド、２’－フルオロＡヌクレオチド、２’－フルオロＵヌクレオチド；２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子との連結、ポリエチレングリコール分子との連結、スペーサー１８分子との連結、５’→３’共有結合、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。これらの修飾により、少なくとも１つの追加の有益な特徴を得ることができ、ここで追加の有益な特徴は、安定性の修飾又は調節、細胞内ターゲティング、追跡、蛍光標識、タンパク質又はタンパク質複合体の結合部位、相補的標的編集部位に対する結合親和性の修飾、細胞分解抵抗性の修飾、及び細胞透過性の増加の群から選択される。

【0117】

一部の実施形態において、修飾されることになる目的のゲノム配列はポリユビキチン化部位であり、ここでポリユビキチン化部位を修飾すると、タンパク質分解速度が修飾されることになる。ユビキチンタグにより、タンパク質がプロテアソーム又はオートファジーによって分解されるように運命付けられる。プロテアソーム阻害薬は、タンパク質の過剰産生を引き起こすことが公知である。目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に修飾を設けると、目的のタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸修飾を生じさせることができ、ここで前記修飾は、タンパク質のポリユビキチン化（翻訳後修飾）を実現するため、タンパク質分解が修飾されることになる。

【0118】

一部の実施形態において、標的編集部位は遺伝子コード領域に位置する。一部の実施形態において、標的配列は遺伝子内領域に位置する。一部の実施形態において、標的配列はテロメアに位置する。

【0119】

一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、標的編集部位の１つ以上のヌクレオチドに修飾を生じさせる。

【0120】

一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１つ以上のヌクレオチドの置換である。一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上の置換である。

【0121】

一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１つ以上のヌクレオチドの欠失である。一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上の置換である。

【0122】

一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１つ以上のヌクレオチドの挿入である。一部の実施形態において、標的編集部位に対する修飾は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上の置換である。

【0123】

一部の実施形態において、標的編集部位は、標的編集部位と比較して１つ以上の挿入、欠失、又は置換を有するドナー配列によって修飾される。一部の実施形態において、標的編集部位はドナー配列によって置き換えられる。

【0124】

標的配列の操作というとき、本出願人らはまた、標的編集部位の後成的操作も意味する。これは、標的編集部位のメチル化状態の修飾（即ち、メチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧ島の付加又は除去）、ヒストン修飾、標的編集部位の露出度の増加又は低減によるか、又は３次元の折り畳みの促進によるなど、標的配列のクロマチン状態の操作であり得る。

【0125】

また、１つ以上の動物又は植物細胞における１つ以上の遺伝子の機能を調べる方法であって、本明細書に提供される方法を用いて遺伝的摂動を導入すること、及び改変された細胞における１つ以上の遺伝子の発現の変化を決定することを含み、それによって１つ以上の遺伝子の機能を調べる方法も提供される。一部の実施形態において、遺伝的摂動は機能喪失突然変異である。

【0126】

一部の実施形態において、本方法は、同じ標的に対する異なる修飾（即ち、挿入、欠失、又は置換）を有する複数のドナーＤＮＡを使用することを含む。一部の実施形態において、複数のドナーＤＮＡは、プロモーター領域（ｐｒｏｍｏｇｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ）又はコード配列を標的とする。一部の実施形態では、異なる修飾を有する細胞が、続いて（ｓｕｂｅｓｅｑｕｅｎｔｌｙ）特定の表現型に関してスクリーニングされてもよい。

【0127】

ｉｉ．哺乳類の遺伝子操作
また、本明細書には、哺乳類細胞の遺伝子編集方法も提供される。一部の実施形態において、遺伝子編集は、遺伝子病態又は疾患に関わる遺伝子座のものである。一部の実施形態において、疾患又は障害は、酵素の突然変異によって引き起こされる。一部の実施形態において、遺伝子病態は代謝障害である。

【0128】

例示的病態及び遺伝子は、アミロイドニューロパチー（ＴＴＲ、ＰＡＬＢ）；アミロイドーシス（ＡＰＯＡ１、ＡＰＰ、ＡＡＡ、ＣＶＡＰ、ＡＤ１、ＧＳＮ、ＦＧＡ、ＬＹＺ、ＴＴＲ、ＰＡＬＢ）；硬変（ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＣＩＲＨ１Ａ、ＮＡＩＣ、ＴＥＸ２９２、ＫＩＡＡ１９８８）；嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ、ＡＢＣＣ７、ＣＦ、ＭＲＰ７）；糖原病（ＳＬＣ２Ａ２、ＧＬＵＴ２、Ｇ６ＰＣ、Ｇ６ＰＴ、Ｇ６ＰＴ１、ＧＡＡ、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰＢ、ＡＧＬ、ＧＤＥ、ＧＢＥ１、ＧＹＳ２、ＰＹＧＬ、ＰＦＫＭ）；肝細胞腺腫、１４２３３０（ＴＣＦ１、ＨＮＦ１Ａ、ＭＯＤＹ３）、肝不全、早期発症型、及び神経学的障害（ＳＣＯＤ１、ＳＣＯｌ）、肝性リパーゼ欠損症（ＬＩＰＣ）、肝芽腫、癌及び癌腫（ＣＴＮＮＢ１、ＰＤＧＦＲＬ、ＰＤＧＲＬ、ＰＲＬＴＳ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ、ＣＴＮＮＢ１、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＬＦＳ１、ＩＧＦ２Ｒ、ＭＰＲＩ、ＭＥＴ、ＣＡＳＰ８、ＭＣＨ５；腎髄質嚢胞症（ＵＭＯＤ、ＨＮＦＪ、ＦＪＨＮ、ＭＣＫＤ２、ＡＤＭＣＫＤ２）；フェニルケトン尿症（ＰＡＨ、ＰＫＵ１、ＱＤＰＲ、ＤＨＰＲ、ＰＴＳ）；多発性嚢胞腎及び肝疾患（ＦＣＹＴ、ＰＫＨＤ１、ＡＲＰＫＤ、ＰＫＤ１、ＰＫＤ２、ＰＫＤ４、ＰＫＤＴＳ、ＰＲＫＣＳＨ、Ｇ１９Ｐ１、ＰＣＬＤ、ＳＥＣ６３）である。他の好ましい標的としては、ＰＣＳＫ９；Ｈｍｇｃｒ；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＡｐｏＢ；ＬＤＬ；ハンチントン病（ハンチントン）、ヘモクロマトーシス（ＨＥＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン）、鎌状赤血球貧血（βグロビン）、及びテイ・サックス（ヘキソサミニダーゼＡ）のうちの任意の１つ以上が挙げられる。

【0129】

ヒト又は非ヒト哺乳類又は生物を含めた生物又は哺乳類を目的のゲノム遺伝子座における標的編集部位の操作によって修飾する方法について言及される場合、それは、生物（又は哺乳類）全体に適用されてもよく、又は単に（生物が多細胞性であるならば）当該生物からの単一細胞若しくは細胞集団だけに適用されてもよいことが理解されるであろう。ヒトの場合には、例えば、本出願人らは単一細胞又は細胞集団をとりわけ想定し、これらは好ましくは、エキソビボで修飾され、次に再導入され得る。その場合、生検又は他の組織若しくは生体液試料が必要となり得る。この点で幹細胞もまた特に好ましい。しかし、当然ながら、インビボ実施形態もまた想定される。

【0130】

本方法は、エキソビボ又はインビトロ、例えば細胞培養物又はエキソビボ若しくはインビトロモデル（オルガノイド又は「オンチップ動物又は植物細胞」など）であってもよい。或いは、本方法はインビボであってもよく、その場合、方法はまた、対象から第１の細胞集団を単離すること、及び第２の細胞集団を（再び）対象に移植することも含む。遺伝子摂動は、１つ以上、又は２つ以上、又は３つ以上、又は４つ以上の遺伝子に対するものであってよい。

【0131】

本発明の一部の実施形態では、ノックアウトモデルを作製することができる。

【0132】

一部の実施形態において、送達は、レンチウイルス又はバキュロウイルス又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターなど、ウイルスベクターであってよいベクターの形態であるが、他の送達手段が公知であり（酵母システム、微小胞、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に取り付ける手段など）、提供される。ベクターとは、ウイルス又は酵母システム（例えば、ここでは目的の核酸がプロモーターに（最終的にプロセシングされたＲＮＡを提供するためなど、発現の点で）作動可能に連結され、その制御下にあってもよい）を意味するのみならず、宿主細胞内への核酸の直接的な送達もまた意味する。本明細書の方法では、ベクターはウイルスベクターであってよく、これは有利にはＡＡＶであるが、レンチウイルスなど、本明細書で考察するとおりの他のウイルスベクターを利用することもできる。例えば、昆虫細胞における発現には、バキュロウイルスが用いられてもよい。こうした昆虫細胞は、次には、本発明の送達に適合されたＡＡＶ又はレンチウイルスベクターなど、更なるベクターを大量に作製するのに有用となり得る。

【0133】

ｉｉｉ．植物の遺伝子操作
一部の実施形態において、本明細書には、植物の遺伝子操作方法が提供される。目的のポリヌクレオチド／ポリペプチドとしては、限定はされないが、除草剤耐性コード配列、殺虫性コード配列、殺線虫性コード配列、抗微生物性コード配列、抗真菌性コード配列、抗ウイルス性コード配列、非生物的及び生物的ストレス耐性コード配列、又は収量、穀粒品質、栄養含量、デンプンの質及び量、窒素固定及び／又は利用、脂肪酸、及び含油量及び／又は組成など、植物形質を修飾する配列が挙げられる。より具体的な目的のポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、作物収穫量を向上させる遺伝子、作物の望ましさを向上させるポリペプチド、干ばつ、窒素、温度、塩分、有毒金属又は微量元素などの非生物的ストレスに対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、又は農薬及び除草剤などの毒素に対する抵抗性、又は真菌、ウイルス、細菌、昆虫、及び線虫による攻撃、並びにこれらの生物に関連する病害の発生などの生物的ストレスに対する抵抗性を付与するものが挙げられる。目的の遺伝子の一般的カテゴリーには、例えば、ジンクフィンガーなど、情報に関わる遺伝子、キナーゼなど、コミュニケーションに関わる遺伝子、及び熱ショックタンパク質など、ハウスキーピングに関わる遺伝子が含まれる。トランス遺伝子のより具体的なカテゴリーには、例えば、作物栽培学、虫害抵抗性、病害抵抗性、除草剤抵抗性、稔性又は不稔性、穀粒特性、及び市販用生産物に重要な形質をコードする遺伝子が含まれる。目的の遺伝子としては、概して、油、デンプン、炭水化物、又は栄養素代謝に関わる遺伝子、並びに他の形質と積み重ねるか、又は組み合わせて用いてもよい、穀粒サイズ、ショ糖負荷などに影響を及ぼす遺伝子が挙げられる。

【0134】

従来の育種方法を用いることに加えて、油、デンプン、及びタンパク質含量などの作物栽培学的に重要な形質を遺伝的に改変することができる。修飾には、オレイン酸、飽和及び不飽和油の含量を増加させること、リジン及び硫黄のレベルを増加させること、必須アミノ酸を提供すること、及びまた、デンプンの修飾が含まれる。ホルドチオニンタンパク質修飾について、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書、及び同第５，９９０，３８９号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されている。別の例は、米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載されるダイズ２Ｓアルブミンによってコードされるリジン及び／又は硫黄リッチ種子タンパク質、及びＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９－１０６に記載されるオオムギ由来のキモトリプシン阻害薬（これらの開示は本明細書において参照により援用される）である。

【0135】

目的のポリヌクレオチドにはまた、例えば、エタノール生産用のデンプンを増加させ得るか、又はタンパク質の発現を提供し得る商業的形質もコードすることができる。形質転換植物の別の重要な商業的利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書に記載されるなどの、ポリマー及びバイオプラスチックの生産である。β－ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ）、及びアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼなどの遺伝子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７－５８４７を参照）は、ポリヒドロキシアルカノエート類（ＰＨＡ類）の発現を促進する。

【0136】

部位特異的突然変異誘発によってコード配列の誘導体を作製することにより、コードされるポリペプチド中にある予め選択されたアミノ酸のレベルを増加させることができる。例えば、オオムギ高リジンポリペプチド（ＢＨＬ）をコードする遺伝子は、オオムギキモトリプシン阻害剤に由来する。１９９６年１１月１日に出願された米国特許出願第０８／７４０，６８２号明細書、及び国際公開第９８／２０１３３号パンフレット（これらの開示は本明細書において参照により援用される）。他のタンパク質としては、ヒマワリ種子（Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．），ｐｐ．４９７－５０２；本明細書において参照により援用される）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７１：３５９；これらは両方とも、本明細書において参照により援用される）；及びコメ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３、本明細書において参照により援用される）由来などのメチオニンリッチ植物性タンパク質が挙げられる。他の作物栽培学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ ２、成長因子、種子貯蔵因子、及び転写因子をコードする。

【0137】

作物収穫量を向上させるポリヌクレオチドとしては、Ｒｈｔ１及びＲｈｔ２など、矮化遺伝子（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：２５６－２６１）、及びアンモニウム誘導性グルタミン酸デヒドロゲナーゼなど、植物成長を増加させるものが挙げられる。作物の望ましさを向上させるポリヌクレオチドとしては、例えば、植物の飽和脂肪含量を低下させるもの、植物の栄養価を押し上げるもの、及び穀粒タンパク質を増加させるものが挙げられる。耐塩性を向上させるポリヌクレオチドは、１つ又は複数の耐塩性遺伝子が導入された植物の天然環境と比べて高塩分の環境での植物成長を増加させるもの又は可能にするものである。

【0138】

アミノ酸生合成に影響を与えるポリヌクレオチド／ポリペプチドとしては、例えば、植物、真菌、及び細菌において芳香族アミノ酸経路からトリプトファン生合成へと枝分かれする最初の反応を触媒するアントラニル酸シンターゼ（ＡＳ；ＥＣ４．１．３．２７）が挙げられる。植物では、トリプトファン生合成の化学的過程は葉緑体に区画化される。例えば、米国特許出願公開第２００８００５０５０６号明細書（本明細書において参照により援用される）を参照のこと。更なる目的の配列としては、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）が挙げられ、これは、コリスミ酸からピルビン酸及びｐＨＢＡへの変換を触媒する酵素をコードする遺伝子を指す。最も良く特徴付けられているＣＰＬ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離されており、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９６２６８を有する。米国特許第７，３６１，８１１号明細書（本明細書において参照により援用される）を参照のこと。

【0139】

これらの目的のポリヌクレオチド配列は、病害又は害虫抵抗性を提供することに関わるタンパク質をコードし得る。「病害抵抗性」又は「害虫抵抗性」とは、植物病原菌相互作用の結果である有害な症状を植物が回避することを意図する。害虫抵抗性遺伝子は、根食い虫、根切り虫、アワノメイガなど、収穫量低下の大きな要因となる害虫に対する抵抗性をコードし得る。抗細菌保護のためのリゾチーム又はセクロピンなどの病害抵抗性及び昆虫抵抗性遺伝子、又は抗真菌保護のためのデフェンシン、グルカナーゼ又はキチナーゼなどのタンパク質、又は線虫若しくは昆虫の防除のためのバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）エンドトキシン、プロテアーゼ阻害薬、コラゲナーゼ、レクチン、又はグリコシダーゼは、全て、有用な遺伝子産物の例である。病害抵抗性形質をコードする遺伝子としては、フモニシンに対するものなど、解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）；非病原性（ａｖｒ）及び病害抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；及びＭｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）などが挙げられる。昆虫抵抗性遺伝子は、根食い虫、根切り虫、アワノメイガなど、収穫量低下の大きな要因となる害虫に対する抵抗性をコードし得る。かかる遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書；同第５，７４７，４５０号明細書；同第５，７３６，５１４号明細書；同第５，７２３，７５６号明細書；同第５，５９３，８８１号明細書；及びＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）などが挙げられる。

【0140】

「除草剤抵抗性タンパク質」又は「除草剤抵抗性コード核酸分子」の発現によって生じるタンパク質としては、そのタンパク質を発現しない細胞と比べて高濃度の除草剤に耐える能力、又はそのタンパク質を発現しない細胞と比べてある種の濃度の除草剤に対して長時間耐える能力を細胞に付与するタンパク質が挙げられる。除草剤抵抗性形質は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の作用を阻害する働きをする除草剤、詳細にはスルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子、ホスフィノトリシン又はバスタ（ｂａｓｔａ）（例えば、ｂａｒ遺伝子）、グリホサート（例えば、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子及びＧＡＴ遺伝子）、ＨＰＰＤ阻害薬（例えば、ＨＰＰＤ遺伝子）など、グルタミンシンターゼの作用を阻害する働きをする除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子又は当該技術分野において公知の他のかかる遺伝子によって植物に導入され得る。例えば、米国特許第７，６２６，０７７号明細書、同第５，３１０，６６７号明細書、同第５，８６６，７７５号明細書、同第６，２２５，１１４号明細書、同第６，２４８，８７６号明細書、同第７，１６９，９７０号明細書、同第６，８６７，２９３号明細書、及び米国仮特許出願第６１／４０１，４５６号明細書（これらの各々は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。ｂａｒ遺伝子は、除草剤バスタ（ｂａｓｔａ）に対する抵抗性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は、抗生物質カナマイシン及びジェネティシンに対する抵抗性をコードし、及びＡＬＳ遺伝子突然変異体は、除草剤クロルスルフロンに対する抵抗性をコードする。

【0141】

更なる選択マーカーとしては、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン類、及び２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）など、除草化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５０６－１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４－８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３－７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２４１９－２２；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５－６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３－１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３－２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００－４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９－５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０－３；Ｇｏｓｓｅｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７－２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：３３４３－５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２－６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２－６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４６４７－５３；Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ １０：１４３－６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５：１５９１－５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４－１０４；Ｂｏｎｉｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３６：９１３－９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１－４を参照のこと。１つ又は複数の遺伝子にはまた、例えば、エタノール生産用のデンプンを増加させ得るか、又はタンパク質の発現を提供し得る商業的形質もコードすることができる。形質転換植物の別の重要な商業的利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書に記載されるなどの、ポリマー及びバイオプラスチックの生産である。β－ケトチオラーゼ、ＰＨＢアーゼ（ポリヒドロキシ酪酸シンターゼ（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｂｕｒｙｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ））、及びアセトアセチル－ＣｏＡレダクターゼなどの遺伝子（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７－５８４７を参照）は、ポリヒドロキシアルカノエート類（ｐｏｌｙｈｙｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ）（ＰＨＡ類）の発現を促進する。

【0142】

外因性産物には、植物酵素及び産物並びに原核生物及び他の真核生物を含めた他の供給源からのものが含まれる。かかる産物には、酵素、補因子、ホルモンなどが含まれる。植物の栄養価値を向上させるため、アミノ酸分布が向上したタンパク質、特に修飾タンパク質のレベルを増加させることができる。これは、アミノ酸含量が亢進したかかるタンパク質の発現によって実現される。

【0143】

一部の実施形態において、真核細胞は、生合成経路中の１つ以上の外因性タンパク質を産生するように操作される。一部の実施形態において、生合成経路は、バイオ燃料生産の生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、アルコールの生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、エタノールの生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、小分子の生産の生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、薬物の生産の生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、ステロールの生産の生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、ホルモンの生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、ペプチドの生産の生合成経路である。一部の実施形態において、生合成経路は、テルペンの生合成経路である。

【0144】

一部の実施形態において、真核細胞は、その子孫がもはや複製できないように操作される。一部の実施形態において、真核細胞は病原性細胞である。

【0145】

トランス遺伝子、組換えＤＮＡ分子、目的のＤＮＡ配列、及び目的のポリヌクレオチドは、遺伝子サイレンシング用の１つ以上のＤＮＡ配列を含み得る。植物におけるＤＮＡ配列の発現が関わる遺伝子サイレンシング方法は当該技術分野において公知であり、限定はされないが、共抑制、アンチセンス抑制、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）干渉、ヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）干渉、イントロン含有ヘアピンＲＮＡ（ｉｈｐＲＮＡ）干渉、転写遺伝子サイレンシング、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）干渉が挙げられる。

【0146】

ｉｖ．検出
当業者は、標的編集部位の遺伝子修飾を様々な手段によって検出し得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、本方法は、細胞をシーケンシングすることを更に含む。一部の実施形態において、本方法は、レポーター遺伝子を検出することを含む。一部の実施形態において、本方法は、選択マーカーを用いて細胞を選択することを含む。

【0147】

選択マーカーの例としては、限定はされないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、バスタ（Ｂａｓｔａ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）など、抗生物質を含めた、本来毒性の化合物に対する抵抗性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント）；本来レシピエント細胞に欠けている産物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）をコードするＤＮＡセグメント；容易に同定し得る産物（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳなどの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質、及び細胞表面タンパク質）をコードするＤＮＡセグメント；ＰＣＲ用の新規プライマー部位の作成（例えば、それまで並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼ又は他のＤＮＡ修飾用酵素、化学薬品等の作用を受けない又は受けるＤＮＡ配列の取込み；及び、その同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）に必要なＤＮＡ配列の取込みが挙げられる。

【0148】

更なる選択マーカーとしては、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン類、及び２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）などの除草化合物に対する抵抗性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５０６－１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４－８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３－７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２４１９－２２；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５－６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３－１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３－２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００－４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９－５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０－３；Ｇｏｓｓｅｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７－２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：３３４３－５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２－６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２－６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４６４７－５３；Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ １０：１４３－６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５：１５９１－５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４－１０４；Ｂｏｎｉｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３６：９１３－９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１－４を参照のこと。

【0149】

Ｃ．核酸
一態様において、本開示は、ＨＤＲ促進剤をコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本明細書には、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含む組成物が提供される。一部の実施形態において、核酸は、１つ以上のベクターにある。一部の実施形態において、核酸は、１つのベクターにある。

【0150】

一部の実施形態において、核酸は、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、核酸は、ＨＤＲ促進剤をコードする。一部の実施形態において、核酸は、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）をコードする。一部の実施形態において、核酸は、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする。一部の実施形態において、核酸は、発現コンストラクト又はベクターである。一部の実施形態において、発現コンストラクト又はベクターは核酸を含む。

【0151】

一部の実施形態において、核酸は、遺伝子編集分子をコードする。一部の実施形態において、核酸は、配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は配列特異的エンドヌクレアーゼをコードし、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、核酸は、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｃａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含む配列特異的エンドヌクレアーゼをコードし、及びガイドＲＮＡ分子は、標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する。

【0152】

一部の実施形態において、核酸は、ドナーＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、核酸は、ドナー鋳型ＤＮＡを含む。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、環状ＤＮＡベクター、ジェミニウイルスレプリコン上に、又は線状ＤＮＡ断片として提供される。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子にはエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接する。

【0153】

一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ標的編集部位の修飾された配列を含む。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、標的編集部位と比較して１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上の置換を含む。

【0154】

一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム標的編集部位と比較して１つ以上のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上の欠失を含む。

【0155】

一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ分子は、ゲノム標的編集部位と比較して１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む。一部の実施形態において、挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド又はそれ以上である。

【0156】

一部の実施形態において、核酸は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む配列特異的エンドヌクレアーゼをコードし、標的編集部位は、ＰＡＭ配列と、ガイドＲＮＡに相補的な、且つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接した位置にある配列とを含む。一部の実施形態において、核酸は、切断後に標的編集部位に５’オーバーハングを提供する配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供するＳＳＡＰをコードする。一部の実施形態において、核酸は、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含むＳＳＡＰをコードする。一部の実施形態において、核酸は、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含むＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸は、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含むＥＲＦファミリータンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含むＲＡＤ５２ファミリータンパク質をコードする。

【0157】

一部の実施形態において、核酸は、エキソヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態において、核酸はエキソヌクレアーゼをコードし、ここでは線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である。一部の実施形態において、リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼには、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼには、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。

【0158】

一部の実施形態において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする。一部の実施形態において、核酸は、ＳＳＢ及びＳＳＡＰをコードする。一部の実施形態において、核酸は、同じ宿主生物から入手された一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）及びＳＳＡＰをコードする。一部の実施形態において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は、細菌ＳＳＢ又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである。一部の実施形態において、ＳＳＢは、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである。一部の実施形態において、ＳＳＢは、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。

【0159】

一部の実施形態において、核酸は、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含むＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸は、植物細胞で発現させるためのタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。

【0160】

一部の実施形態において、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする本明細書に提供される核酸は、各々がプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、プロモーターは構成的に活性なプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは植物特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは哺乳類プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは３５Ｓプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはユビキチンプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはアクチンプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは哺乳類プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはＣＡＧプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはＵ６プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはＥＦ１ａプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはヒトＡＣＴＢプロモーターであり、一部の実施形態、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはＵ６プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはＴ７プロモーターである。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼ、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースヌクレアーゼ用のそのガイドＲＮＡは、誘導性プロモーターの制御下で発現する。この構成では、システムの他の構成要素の濃度が律速因子とならない時点でゲノム編集プロセスの開始を誘導することができる。

【0161】

一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、１つ以上のベクターに提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、１つのベクターに提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、２つのベクターに提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、３つのベクターに提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、４つのベクターに提供される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、５つのベクターに提供される。

【0162】

一部の実施形態において、本明細書には、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードするベクターが提供される。一部の実施形態において、本明細書には、ＨＤＲ促進エレメントをコードするベクターが提供される。一部の実施形態において、本明細書には、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードするベクターが提供される。一部の実施形態において、本明細書には、少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ及びドナー鋳型をコードするベクターが提供される。

【0163】

また、本明細書には、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む第１のベクター、及びドナー鋳型ＤＮＡとガイドＲＮＡとを含む第２のベクターも提供される。

【0164】

一部の実施形態において、核酸は、特定の細胞型での発現用に最適化される。一部の実施形態において、核酸は、特定の種での発現用に最適化される。一部の実施形態において、核酸は、植物細胞での発現用に最適化される。一部の実施形態において、核酸は、哺乳類細胞での発現用に最適化される。一部の実施形態において、核酸は、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢタンパク質、及び／又はＳＳＡＰなどのタンパク質コード配列を含む。一部の実施形態において、タンパク質コード配列は、植物細胞での翻訳にコドン最適化される。一部の実施形態において、タンパク質コード配列は、哺乳類細胞での翻訳にコドン最適化される。

【0165】

特定の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、約２０、５０、１００、２００、４００、又は６００～約８００、又は１０００塩基対長であり得る。例えば、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、約２０～約１０００、約５０～約１０００、約１００～約１０００、約２００～約１０００、又は約６００～１０００塩基対長であり得る。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、約４００～約８００塩基対長である。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、２５０塩基対長未満である。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームは、１００塩基対長未満である。

【0166】

特定の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型相同アームのＧＣ含量が修飾される。一部の実施形態において、ＧＣ含量は最大化される。

【0167】

一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、特定の細胞型での発現用に修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、真核細胞での発現用に修飾される。一部の実施形態において、核酸は、植物又は動物細胞での発現用に修飾される。一部の実施形態において、核酸は、哺乳類細胞用に修飾される。一部の実施形態において、核酸は、マウス又は霊長類細胞用に修飾される。一部の実施形態において、核酸は、ヒト細胞用に修飾される。一部の実施形態において、核酸は、マウス細胞用に修飾される。

【0168】

特定の細胞型での発現用に核酸組成物を修飾する方法は、当該技術分野において周知である。一部の実施形態において、本明細書に提供されるヌクレオチドのＧＣ（グアニン－シトシン）含量が修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される核酸は、特定の細胞型、例えば真核細胞用にコドン最適化される。

【0169】

ｉ．ウイルスベクター
一態様において、本開示は、哺乳類細胞での発現用の本明細書に開示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、発現コンストラクトを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードする核酸を含む。

【0170】

一部の実施形態において、本明細書には、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及び／又はｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含むベクターが提供される。

【0171】

一部の実施形態において、第１のベクターが、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする。一部の実施形態において、第２のベクターが、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする。一部の実施形態において、第１のベクターは、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢタンパク質のうちの少なくとも１つをコードしない。一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢタンパク質のうちの第１のベクターによってコードされない少なくとも１つは、第２のベクターによってコードされる。一部の実施形態において、構成要素は、以下の表Ｂに示されるとおりの第１及び第２のベクターによってコードされる。

【0172】

【表5】

【0173】

【表6】

【0174】

【表7】

【0175】

【表8】

【0176】

一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢは、様々な組み合わせで３つのベクターに提供される。例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼを含む第１のベクター、ドナー鋳型ＤＮＡを含む第２のベクター、及びＳＳＡＰとエキソヌクレアーゼとＳＳＢとを含む第３のベクター、又は配列特異的エンドヌクレアーゼとドナー鋳型ＤＮＡとＳＳＡＰとを含む第１のベクター、エキソヌクレアーゼを含む第２のベクター、及びＳＳＢを含む第３のベクター。

【0177】

一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢは、様々な組み合わせで４つのベクターに提供される。例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼを含む第１のベクター、ドナー鋳型ＤＮＡを含む第２のベクター、ＳＳＡＰを含む第３のベクター、及びエキソヌクレアーゼとＳＳＢとを含む第４のベクター、又は配列特異的エンドヌクレアーゼとドナー鋳型ＤＮＡとを含む第１のベクター、ＳＳＡＰを含む第２のベクター、エキソヌクレアーゼを含む第３のベクター、及びＳＳＢを含む第４のベクター。

【0178】

一部の実施形態において、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ドナー鋳型ＤＮＡ分子、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＢは、５つのベクターに提供される。

【0179】

一部の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはパルボウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターはアデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはレトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはヘルペスウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはバキュロウイルスベクターである。

【0180】

一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４－３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕＳＯ、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、又はブタＡｄ３型に由来する。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２又はアデノウイルス血清型５バリアントに由来する。一部の実施形態において、ベクターは組換えレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ １１４又はこれらにおけるバリアントでシュードタイプ化したレンチウイルスに由来する。一部の実施形態において、ベクターはｒＨＳＶベクターである。一部の実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１又はｒＨＳＶ－２に由来する。

【0181】

上記の方法の一部の実施形態において、ベクターはｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードする発現コンストラクトには、１つ以上のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する。一部の実施形態において、発現コンストラクトには、２つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接する。一部の実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、又はマウスＡＡＶ血清型ＩＴＲである。一部の実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。一部の実施形態において、ベクターは、スタッフィアー（ｓｔｕｆｆｉｅｒ）核酸を更に含む。一部の実施形態において、スタッフィアー（ｓｔｕｆｆｉｅｒ）核酸は、プロモーターと発現コンストラクトをコードする核酸との間に位置する。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的ｒＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードする第１の核酸配列と、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードする第２の核酸配列とを含む。一部の実施形態において、第１の核酸配列と第２の核酸配列とは、突然変異型ＡＡＶ ＩＴＲによって連結され、ここで突然変異型ＡＡＶ ＩＴＲはＤ領域の欠失を含み、及び末端分解配列の突然変異を含む。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）のいずれかを含む細胞を提供する。

【0182】

上記の方法の一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードするベクターはウイルス粒子中にあり、ここでウイルス粒子は、ｒＡＡＶベクターをカプシド化するＡＡＶ粒子、組換えアデノウイルスベクターをカプシド化するアデノウイルス粒子、組換えレンチウイルスベクターをカプシド化するレンチウイルス粒子又は組換えＨＳＶベクターをカプシド化するＨＳＶ粒子である。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えアデノウイルスベクターをカプシド化するアデノウイルス粒子である。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕＳＯ、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、又はブタＡｄ３型由来のカプシドを含む。一部の実施形態において、アデノウイルス粒子は、アデノウイルス血清型２カプシド又はアデノウイルス血清型Ｓカプシドのバリアントを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えレンチウイルスベクターをカプシド化するレンチウイルス粒子である。一部の実施形態において、レンチウイルス粒子は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４又はこれらにおけるバリアントでシュードタイプ化したカプシドを含む。一部の実施形態において、ウイルス粒子はＨＳＶ粒子である。一部の実施形態において、ＨＳＶ粒子はｒＨＳＶ－１粒子又はｒＨＳＶ－２粒子である。

【0183】

上記の方法の一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組換えＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、又はマウスＡＡＶカプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶｌ血清型カプシドを含む。一部の実施形態において、ＩＴＲとｒＡＡＶウイルス粒子のカプシドとは、同じＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲとｒＡＡＶウイルス粒子のカプシドとは、異なるＡＡＶ血清型に由来する。一部の実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ２に由来し、ｒＡＡＶ粒子のカプシドは、ＡＡＶ１に由来する。本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つの発現コンストラクトを含むベクターを提供する。一部の実施形態において、発現コンストラクトは、ＨＤＲ促進剤（例えば、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢ）、配列特異的エンドヌクレアーゼ、及び／又はドナー鋳型ＤＮＡ分子をコードする。一部の実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、組換えアデノウイルスベクター、組換えレンチウイルスベクター又は組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは組換えアデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２、１、５、６、１９、３、１１、７、１４、１６、２１、１２、１８、３１、８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４～３０、３７、４０、４１、ＡｄＨｕ２、ＡｄＨｕ３、ＡｄＨｕ４、ＡｄＨｕ２４、ＡｄＨｕ２６、ＡｄＨｕ３４、ＡｄＨｕ３５、ＡｄＨｕ３６、ＡｄＨｕ３７、ＡｄＨｕ４１、ＡｄＨｕ４８、ＡｄＨｕ４９、ＡｄＨｕ５０、ＡｄＣ６、ＡｄＣ７、ＡｄＣ６９、ウシＡｄ３型、イヌＡｄ２型、ヒツジＡｄ、又はブタＡｄ３型に由来する。一部の実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型２又はアデノウイルス血清型Ｓのバリアントに由来する。一部の実施形態において、ベクターは組換えレンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、組換えレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、モコラウイルス（Ｍｏｋａｌａ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４又はこれらにおけるバリアントでシュードタイプ化したレンチウイルスに由来する。一部の実施形態において、ベクターはｒＨＳＶベクターである。一部の実施形態において、ｒＨＳＶベクターは、ｒＨＳＶ－１又はｒＨＳＶ－２に由来する。

【0184】

一部の実施形態において、ベクターは選択マーカーを含む。

【0185】

上記の方法の一部の実施形態において、ウイルス粒子は組成物（例えば、医薬組成物）である。一部の実施形態において、この組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含む。

【0186】

ｉｉ．他のベクター
一部の実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターはプラスミドである。一部の実施形態において、ベクターは植物形質転換ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、組織培養物又は植物組織におけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性一過性発現又は安定形質転換用のベクターである。

【0187】

本発明と適合性のある組換えプラスミドベクターを使用する例示的システムとしては、限定はされないが、「融合構造体」及び「バイナリー」システムが挙げられる。「融合構造体」システムでは、例えば、ｐＭＬＪ１シャトルベクター及び非発癌性プラスミドｐＧＶ３８５０の場合のように、植物細胞形質転換に必要なシス作用性エレメント及びトランス作用性エレメントの両方を含む非発癌性プラスミドに、目的の遺伝子を含有するシャトルベクターが遺伝子組換えによって挿入される。第２のシステムは「バイナリー」システムと呼ばれ、ここでは２つのプラスミドが使用される；目的の遺伝子は、植物形質転換に必要なシス作用性エレメントを含むシャトルベクターに挿入される。他の必要な機能は、ｐＢＩＮ１９シャトルベクター及び非発癌性プラスミドＰＡＬ４４０４によって例示されるとおり、非発癌性プラスミドによってトランスで提供される。これらのシステムに有用な上記及び他のベクターは、市販されている。

【0188】

Ｄ．細胞
一態様において、本開示は、ＨＤＲ促進剤を含む真核細胞を提供する。一部の実施形態において、真核細胞は、ゲノム編集分子とＨＤＲ促進剤とを含む。一部の実施形態において、細胞は、宿主細胞である。一部の実施形態において、細胞は、本方法により修飾されることになる細胞である。一部の実施形態において、ゲノム編集分子は、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含む。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤は、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。

【0189】

別の態様において、本開示は、本明細書に提供される方法によって作製される真核細胞を提供する。一部の実施形態において、真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾は、ゲノム編集分子とＨＤＲ促進剤とを真核細胞に提供することを含み、ここでゲノム編集分子は、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、（ｉｉ）標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤は、ＳＳＡＰと、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、ＳＳＢタンパク質とを含む。一部の実施形態において、細胞は、本方法に係る修飾によって作製されるゲノムシグネチャを有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ切断部位が除去される。一部の実施形態において、核酸配列タグが関心をもたれる。

【0190】

一部の実施形態において、本明細書には、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）をコードする核酸、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼをコードする核酸、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む１つ以上のベクターを含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態において、宿主細胞は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）をコードする核酸、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼをコードする核酸、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸をコードする１つのベクターを含む。一部の実施形態において、細胞は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子を含む第１のベクターと、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）をコードする核酸、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼをコードする核酸、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む第２のベクターとを含む。

【0191】

更に、本明細書に記載されるとおり、真核細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する真核細胞を作り、及び／又は真核細胞を遺伝子操作するため、本開示の方法が用いられる。

【0192】

一部の実施形態において、細胞は単離細胞である。一部の実施形態において、細胞は細胞培養下にある。一部の実施形態において、細胞はエキソビボである。一部の実施形態において、細胞は、生体から入手され、細胞培養物中に維持される。一部の実施形態において、細胞は単細胞生物である。一部の実施形態において、細胞は生物の内部にある。一部の実施形態において、細胞は生物である。一部の実施形態において、細胞は、単細胞真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞、藻類細胞（例えば、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、ヤツマタモク（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ，Ｃ．ａｇａｒｄｈ）など）、海藻（例えばケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細、哺乳類（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ）；げっ歯類（例えば、ラット、マウス）；非ヒト霊長類；ヒト；ネコ科動物（例えば、ネコ）；イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞などである。一部の実施形態において、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は合成的に作られた細胞であってもよい；人工細胞とも称される）。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養物（例えば、インビトロ細胞培養物）中にある。一部の実施形態において、細胞は、一群の細胞のうちの１つである。一部の実施形態において、細胞は真核細胞であるか、又は真核細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は植物細胞であるか、又は植物細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は動物細胞であるか、又は動物細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は無脊椎動物細胞であるか、又は無脊椎動物細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は脊椎動物細胞であるか、又は脊椎動物細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は哺乳類細胞であるか、又は哺乳類細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞はげっ歯類細胞であるか、又はげっ歯類細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞であるか、又はヒト細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は非ヒト動物細胞であるか、又は非ヒト動物細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は非ヒト哺乳類細胞であるか、又は非ヒト哺乳類細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は真菌細胞であるか、又は真菌細胞に由来する。一部の実施形態において、細胞は昆虫細胞である。一部の実施形態において、細胞は節足動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は原虫細胞である。一部の実施形態において、細胞は蠕虫細胞である。一部の実施形態において、細胞は非哺乳類動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は魚類細胞である。一部の実施形態において、細胞は昆虫細胞である。一部の実施形態において、細胞はショウジョウバエ細胞である。一部の実施形態において、細胞はドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞である。一部の実施形態において、細胞は線虫細胞である。一部の実施形態において、細胞はカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）細胞である。一部の実施形態において、細胞は回虫細胞である。

【0193】

一部の実施形態において、細胞は、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上を含む前駆細胞であり、ここで前駆細胞は、ｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、前駆細胞に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つは、続いて前駆細胞にポリペプチド、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡを送達すること及び／又は前駆細胞の性的交雑によって提供される。例えば、一部の実施形態において、前駆細胞はｉ）～ｖ）のうちの１つ以上の構成要素を欠いており、欠けている構成要素で形質転換される。

【0194】

ｉ．植物細胞
一部の実施形態において、真核細胞は植物細胞である。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤を含む真核細胞は、植物細胞である。更に、植物細胞のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する植物細胞を作り、及び／又は植物細胞を遺伝子操作するため、本開示の方法が用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物細胞を編集することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物細胞においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物細胞ゲノムの標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、植物細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させることを含む。

【0195】

特定の実施形態において、細胞は、単離植物細胞又は植物プロトプラストである（即ち、解離されていない又はインタクトな植物組織、植物部分、又は全植物に位置しない）。特定の実施形態において、植物細胞は、任意の植物部分又は組織又はカルスから入手される。特定の実施形態において、培養物は、植物組織、培養植物組織外植片、全植物、インタクトな芽の節、茎頂又は茎頂分裂組織、根端又は根端分裂組織、側部分裂組織、介在分裂組織、実生、全種子、半分に割られた種子又は他の種子断片、接合胚、体細胞胚、未熟胚、胚珠、花粉、小胞子、葯、胚軸、子葉、葉、葉柄、茎、塊茎、根、カルス、又は植物細胞懸濁液から入手された植物細胞を含む。特定の実施形態において、植物細胞は、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、又はコメ）の未熟胚又は成熟胚のＬ１層又はＬ２層に由来する。

【0196】

特定の実施形態において、植物細胞は、解離されていない又はインタクトな植物組織、植物部分、植物外植片、又は全植物に位置する。特定の実施形態において、植物細胞は、インタクトな芽の節、培養植物組織外植片、茎頂又は茎頂分裂組織、根端又は根端分裂組織、側部分裂組織、介在分裂組織、実生、全種子、半分に割られた種子又は他の種子断片、接合胚、体細胞胚、未熟胚、胚珠、花粉、小胞子、葯、胚軸、子葉、葉、葉柄、茎、塊茎、根、又はカルスに位置し得る。特定の実施形態において、使用される外植片には、未熟胚が含まれる。未熟胚（例えば、未熟トウモロコシ胚）には、１．８～２．２ｍｍ胚、１～７ｍｍ胚、及び３～７ｍｍ胚が含まれる。特定の実施形態において、前述の胚は、成熟穂由来の種子、葉脚、成熟植物の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟穂、及び絹糸から入手される。様々な態様において、形質転換に使用される植物由来の外植片には、未熟胚、１．８～２．２ｍｍ胚、１～７ｍｍ胚、及び３．５～７ｍｍ胚が含まれる。ある態様において、胚は、成熟穂由来の種子、葉脚、成熟植物の葉、葉頂、未熟花序、雄穂、未熟穂、又は絹糸に由来し得る。特定の実施形態において、植物細胞は、多能性植物細胞（例えば、幹細胞又は分裂組織細胞）である。特定の実施形態において、植物細胞は、単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、又はコメ）の未熟胚又は成熟胚のＬ１層又はＬ２層内に位置する。

【0197】

特定の実施形態において、植物細胞は、一倍体、二倍体、又は倍数体植物細胞又は植物プロトプラスト、例えば、一倍体、二倍体、又は倍数体植物、植物部分若しくは組織、又はカルスから入手されたものである。特定の実施形態において、培養下の植物細胞（又は再生植物、子孫種子、及び子孫植物）は、一倍体であるか、又は一倍体になるように誘導することができる；一倍体植物及び植物細胞の作製及び使用技法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｍａｒｕｔｈａｃｈａｌａｍ ａｎｄ Ｃｈａｎによって“Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｈａｐｌｏｉｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ”、ｗｗｗ［ｄｏｔ］ｏｐｅｎｗｅｔｗａｒｅ［ｄｏｔ］ｏｒｇ／ｉｍａｇｅｓ／ｄ／ｄ３／Ｈａｐｌｏｉｄ＿Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ［ｄｏｔ］ｐｄｆで利用可能なプロトコルに記載されるとおりの、改変型のセントロメア特異的ヒストンＣＥＮＨ３を発現する一倍体誘導株と野生型株を交雑することによるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）における一倍体の作成方法を参照のこと；（Ｒａｖｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：５３３４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６３３４）。一倍体はまた、米国特許第９，２１５，８４９号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるとおり、多種多様な単子葉植物（例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、モロコシ、オオムギ）又は双子葉植物（例えば、ダイズ、キャノーラを含めたアブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、ワタ、トマト）において、突然変異型ＣＥＮＨ３遺伝子を含む植物を野生型二倍体植物と交雑させて一倍体子孫を作成することによっても入手し得る。一倍体トウモロコシ植物及び／又は細胞を入手するために使用し得る一倍体誘導トウモロコシ株には、Ｓｔｏｃｋ ６、ＭＨＩ（Ｍｏｌｄｏｖｉａｎ Ｈａｐｌｏｉｄ Ｉｎｄｕｃｅｒ（モルドバ一倍体誘導体））、不確定配偶体（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ：ｉｇ）突然変異、ＫＥＭＳ、ＲＷＫ、ＺＥＭ、ＺＭＳ、ＫＭＳ、並びに米国特許第９，６７７，０８２号明細書（これは全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるトランスジェニック一倍体誘導株が含まれる。一倍体細胞の例としては、限定はされないが、一倍体植物から入手された植物細胞及び生殖組織から入手された、例えば、花、発育中の花又は花芽、子房、胚珠、大胞子、葯、花粉、大配偶体、及び小胞子から入手された植物細胞が挙げられる。植物細胞又は植物プロトプラストが一倍体である特定の実施形態では、植物細胞又は植物プロトプラストにおいて遺伝的相補体を染色体倍加（例えば、減数分裂時の非減数による自然染色体倍加によるか、又はコルヒチン、オリザリン、トリフルラリン、プロナミド、亜酸化窒素ガス、抗微小管除草剤、抗微小管剤、及び有糸分裂阻害薬などの染色体倍加剤を用いることによる）によって倍加させると、倍加一倍体植物細胞又は植物プロトプラストを産生することができ、ここで遺伝子の相補体又はアレルはホモ接合性であり；更に他の実施形態は、倍加一倍体植物細胞又は植物プロトプラストからの倍加一倍体植物の再生を含む。別の実施形態は、この手法によって提供される倍加一倍体植物である少なくとも１つの親植物を有するハイブリッド植物に関する。倍加一倍体植物を作製すると、ホモ接合植物を入手するのに数世代の自家交雑を必要とする代わりに、１世代でホモ接合性がもたらされる。倍加一倍体の使用は、最小限の時間で遺伝的純度（即ちホモ接合性）を確立することが所望される任意の状況で有利である。倍加一倍体の作製は、果実及び他の樹木など、成長が遅い植物において、又は少なくとも１つの倍加一倍体植物の子孫であるハイブリッド植物の作製に、特に有利であり得る。

【0198】

特定の実施形態において、植物細胞は、任意の目的の単子葉又は双子葉植物種、例えば、条植え作物植物、果実産生植物及び樹木、野菜、樹木、及び装飾花を含む観賞植物、低木、樹木、地被植物、及び芝草から入手されるか、又はそこに位置する。特定の非限定的な実施形態において、植物細胞は、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、アーモンド類（プルヌス・デュルキス（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｕｌｃｉｓ））、リンゴ類（マルスｘドメスティカ（Ｍａｌｕｓ ｘ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、アンズ類（プルヌス・アルメニアカ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ）、Ｐ．ブリガンティネ（Ｐ．ｂｒｉｇａｎｔｉｎｅ）、Ｐ．マンドシュリカ（Ｐ．ｍａｎｄｓｈｕｒｉｃａ）、Ｐ．ムメ（Ｐ．ｍｕｍｅ）、Ｐ．シビリカ（Ｐ．ｓｉｂｉｒｉｃａ））、アスパラガス（アスパラグス・オフィキナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ））、バナナ類（バショウ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、オオムギ（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、マメ類（インゲンマメ属種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．））、ブルーベリー類及びクランベリー類（スノキ属種（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｓｐｐ．））、カカオ（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、キャノーラ及びナタネ又はアブラナ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ））、カーネーション（ダイアンサス・カリオフィルス（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ニンジン類（ダウクス・カロタ・サティブス（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ ｓａｔｉｖｕｓ））、キャッサバ（マニホット・エスクレンツム（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、サクランボ（プルヌス・アビウム（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ））、ヒヨコマメ（キケル・アリエティヌム（Ｃｉｄｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ））、チコリ（キコリウム・インティブス（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｉｎｔｙｂｕｓ））、チリペッパー類及び他のトウガラシ類（カプシクム・アンヌウム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、Ｃ．フルテスセンス（Ｃ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．キネンセ（Ｃ．ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、Ｃ．プベスセンス（Ｃ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｃ．バッカトゥム（Ｃ．ｂａｃｃａｔｕｍ））、キク類（キク属種（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｐｐ．））、ココナツ（ココス・ヌキフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、コーヒー（コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）及びコフィア・カネフォラ（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）を含むコーヒーノキ属種（Ｃｏｆｆｅａ ｓｐｐ．））、ワタ（ゴシピウム・ヒルストゥム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．））、ササゲ（ビグナ・ウンギュイクラタ（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ））、キュウリ（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））、スグリ類及びグズベリー類（スグリ属種（Ｒｉｂｅｓ ｓｐｐ．））、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）又はナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））、ユーカリ（ユーカリ属種（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｐｐ．））、アマ（リナム・ウシタティッスムム（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｕｍｕｍ Ｌ．））、ゼラニウム類（ペラルゴニウム属種（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｓｐｐ．））、グレープフルーツ（シトラスｘパラディシ（Ｃｉｔｒｕｓ ｘ ｐａｒａｄｉｓｉ））、ワイン用ブドウ類（ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｕｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ））を含むブドウ類（ブドウ属種（Ｖｉｔｕｓ ｓｐｐ．））、グアバ（プシディウム・グアヤバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、アサ及び大麻（例えば、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）及びアサ属種（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓｐｐ．））、ホップ類（フムルス・ルプルス（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ））、アヤメ類（アヤメ属種（Ｉｒｉｓ ｓｐｐ．））、レモン（シトラス・リモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ））、レタス（ラクトゥカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））、ライム類（ミカン属種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．））、トウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、マンゴスチン（ガルシニア・マンゴスタナ（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ））、メロン（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ））、アワ類（エノコログサ属種（Ｓｅｔａｒｉａ ｓｐｐ）、ヒエ属種（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｓｐｐ）、オヒシバ属種（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｓｐｐ）、キビ属種（Ｐａｎｉｃｕｍ ｓｐｐ．）、チカラシバ属種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｓｐｐ．））、オートムギ類（アベナ・サティバ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））、アブラヤシ（エレイス・グイネエンシス（Ｅｌｌｉｓ ｑｕｉｎｅｅｎｓｉｓ））、オリーブ（オレア・エウロペア（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、タマネギ（アリウム・ケパ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ））、オレンジ（シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、パパイヤ（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、モモ類及びネクタリン類（プルヌス・ペルシカ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ））、セイヨウナシ（ナシ属種（Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ．））、エンドウ（ピスム・サティブム（Ｐｉｓａ ｓａｔｉｖｕｍ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、シャクヤク（ボタン属種（Ｐａｅｏｎｉａ ｓｐｐ．））、ペチュニア類（ペチュニア属種（Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ．））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、オオバコ類（バショウ属種（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、セイヨウスモモ（プルヌス・ドメスティカ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ））、ポインセチア（ユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、ポーランドアブラナ（Ｐｏｌｉｓｈ ｃａｎｏｌａ）（ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ））、ポプラ（ポプルス属種（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）（ククルビタ・ペポ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ））、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．））、バラ（バラ属種（Ｒｏｓａ ｓｐｐ．））、ゴム（ヘベア・ブラシリエンシス（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、ライムギ（セカレ・ケレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ Ｌ））、ゴマ種子（セサムム・インディクム（Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｕｍ））、モロコシ（ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．））、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）（ククルビタ・ペポ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｐｅｐｏ））、イチゴ類（オランダイチゴ属種（Ｆｒａｇａｒｉａ ｓｐｐ．）、フラガリアｘアナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｘ ａｎａｎａｓｓａ））、サトウダイコン（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ類（サトウキビ属種（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アンヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ））、サツマイモ（イポメア・バタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ））、タンジェリン（シトラス・タンゲリナ（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｎｇｅｒｉｎａ））、茶（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．））、トマト（リコペルシコン・エスクレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、チューリップ類（チューリップ属種（Ｔｕｌｉｐａ ｓｐｐ．））、カブ（ブラッシカ・ラパ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｒａｐａ））、クルミ類（クルミ属種（Ｊｕｇｌａｎｓ ｓｐｐ．Ｌ．））、スイカ（キトルルス・ラナツス（Ｃｉｔｒｕｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ））、コムギ（トリティウム・エスティブム（Ｔｒｉｔｉｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、又はヤムイモ類（ヤマノイモ属種（Ｄｉｓｃｏｒｅａ ｓｐｐ．））から入手されるか、又はそこに位置する。

【0199】

ｉｉ．哺乳類細胞
一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤を含む真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、動物細胞は哺乳類細胞である。更に、動物細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する動物細胞を作り、及び／又は動物細胞を遺伝子操作するため、本開示の方法が用いられ得る。一部の実施形態において、本方法は、ＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する細胞を作り、及び／又は哺乳類細胞を遺伝子操作するために用いられ得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、動物細胞、例えば哺乳類細胞を編集することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、動物細胞、例えば哺乳類細胞においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、動物細胞、例えば哺乳類細胞の標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、動物細胞、例えば哺乳類細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させることを含む。

【0200】

一部の実施形態において、細胞は、任意の多細胞脊椎動物又は無脊椎動物由来の動物細胞である。一部の実施形態において、動物は、生物学的、生理学的、又は遺伝学的研究に使用されるモデル生物である。従って、一部の実施形態において、動物は、マウス（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））、ショウジョウバエ（ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、ネコ（フェリス・シルベストリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ ｃａｔｕｓ））、ニワトリ（ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））、イヌ（カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ））、モルモット（カビア・ポルセルス（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ））、ラット（ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））及び線虫（カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））から選択される。一部の実施形態において、動物は、家畜化された又は農場飼育されている動物である。従って、一部の実施形態において、動物は、ヤギ（カプラ・エガグルス・ヒルクス（Ｃａｐｒａ ａｅｇａｇｒｕｓ ｈｉｒｃｕｓ））、ブタ（スス・スクロファ・ドメスティクス（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ヒツジ（オビス・アリエス（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ））、ウシ（ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ））、ネコ（フェリス・カトゥス（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ））、ロバ（エクウス・アフリカヌス・アシヌス（Ｅｑｕｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ａｓｉｎｕｓ））、アヒル（アナス・プラチリンコス・ドメスティクス（Ａｎａｓ ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、スイギュウであって、ブバルス・ブバリス・ブバリス（Ｂｕｂａｌｕｓ ｂｕｂａｌｉｓ ｂｕｂａｌｉｓ）及びブバルス・ブバリス・カラベネシス（Ｂｕｂａｌｕｓ ｂｕｂａｌｉｓ ｃａｒａｂｅｎｅｓｉｓ）を含めたもの、セイヨウミツバチ（アピス・メリフェラ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））であって、亜種イタリアミツバチ（Ａ．メリフェラ・リグスティカ（Ａ．ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ｌｉｇｕｓｔｉｃａ））、ヨーロッパクロバチ（Ａ．メリフェラ・メリフェラ（Ａ．ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））、カーニオランミツバチ（Ａ．メリフェラ・カルニカ（Ａ．ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ｃａｒｎｉｃａ））、コーカサスミツバチ（Ａ．メリフェラ・カウカシア（Ａ．ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ｃａｕｃａｓｉａ））、及びギリシャミツバチ（Ａ．メリフェラ・ケクロピア（Ａ．ｍｅｌｌｉｆｅｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ））を含めたもの、ヒトコブラクダ（カメルス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ））、ウマ（エクウス・フェルス・カバルス（Ｅｑｕｕｓ ｆｅｒｎｓ ｃａｂａｌｌｕｓ））、カイコガ（ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ））、ハト（コルンバ・リビア（Ｃｏｌｕｍｂａ ｌｉｖｉａ））、ガチョウ（アンセル・ドメスティクス（Ａｎｓｅｒ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）及びアンセル・キグノイデス・ドメスティクス（Ａｎｓｅｒ ｃｙｇｎｏｉｄｅｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ヤク（ボス・グルニエンス（Ｂｏｓ ｇｒｕｎｎｉｅｎｓ））、フタコブラクダ（カメルス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ））、ラマ（ラマ・グラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ））、アルパカ（ビクーニャ・パコス（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ））、ホロホロチョウ（ヌミダ・メレアグリス（Ｎｕｍｉｄａ ｍｅｌｅａｇｒｉｓ））、フェレット（ムステラ・プトリウス・フロ（Ｍｕｓｔｅｌａ ｐｕｔｏｒｉｕｓ ｆｕｒｏ））、シチメンチョウ（メレアグリス・ガロパボ（Ｍｅｌｅａｇｒｉｓ ｇａｌｌｏｐａｖｏ））、ソウギョ、ハクレン、コイ、ナイルティラピア、コクレン、カトラ（インディアンカープ）、フナ、タイセイヨウサケ、ローフー、サバヒー、ニジマス、ダントウボウ、マゴイ、カムルチー及びナマズから選択される。

【0201】

一部の実施形態において、細胞は、細胞株、例えば、哺乳類細胞株又はヒト細胞株に由来する。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、Ａ５４９、ＨＥＫ－２９３、２９３Ｔ、ＭＦ７、Ｋ５６２、Ｃａｃｏ－２、ＨｅＬａ細胞、及びこれらのトランスジェニック変種が挙げられる。一部の実施形態において、細胞はＨＥＫ－２９３細胞である。一部の実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。細胞株は、当業者に公知の種々の供給源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）を参照のこと）。一部の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの１つ以上の核酸（ＨＤＲ促進剤をコードするベクターなど）をトランスフェクトした細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規細胞株を樹立することにより、標的核酸に対する修飾を含む新規細胞株が樹立される。

【0202】

一部の実施形態において、細胞は、初代細胞、例えば、哺乳類初代細胞又はヒト初代細胞である。例えば、初代細胞の培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回又はそれ以上継代されてもよい、初代細胞は、任意の公知の方法によって個体から採取される。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって採取されてもよい。皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等の組織からの細胞は、生検によって採取することができる。採取された細胞の分散又は懸濁に、適切な溶液が使用され得る。かかる溶液は、概して、低濃度の許容可能な緩衝液と併せた、好都合にはウシ胎仔血清又は他の天然に存在する因子が補足された平衡塩類溶液（例えば、標準生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液等）であり得る。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等を挙げることができる。細胞はすぐに使用されてもよく、又は細胞は（例えば、凍結することにより）保存されてもよい。凍結細胞は解凍することができ、再使用可能であり得る。細胞は、ＤＭＳＯ、血清、培地緩衝液（例えば、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝培地）、及び／又は凍結温度で細胞を維持するために使用される他の何らかのかかる一般的な溶液中に凍結することができる。

【0203】

一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は生殖系列細胞である。一部の実施形態において、細胞は体細胞である。一部の実施形態において、細胞は分裂終了細胞である。一部の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はマクロファージなど、免疫細胞である。一部の実施形態において、細胞は、患者又はドナーから入手されたヒトＴ細胞である。本明細書に提供される方法を用いると、免疫療法用の初代Ｔ細胞の標的核酸を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、例えば、Ｔ細胞のゲノムを編集し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する発現コンストラクトを導入することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞が作成される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、免疫細胞がエキソビボで修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞がエキソビボで作成される。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ヒト細胞を編集することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ヒト細胞においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ヒト細胞の標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ヒト細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させることを含む。

【0204】

一部の実施形態において、細胞は幹細胞又は前駆細胞である。一部の実施形態において、細胞は未分化細胞である。一部の実施形態において、細胞はヒト幹細胞又は前駆細胞である。一部の実施形態において、細胞は哺乳類幹細胞又は前駆細胞である。一部の実施形態において、細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、又は前駆細胞（例えば、心筋前駆細胞、神経前駆細胞等）である。一部の実施形態において、細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一部の実施形態において、細胞は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。一部の実施形態において、細胞は神経幹細胞である。一部の実施形態において、細胞は上皮幹細胞である。細胞には、げっ歯類幹細胞、げっ歯類前駆細胞、ヒト幹細胞、ヒト前駆細胞等を含め、哺乳類幹細胞及び前駆細胞が含まれ得る。

【0205】

一部の実施形態において、細胞は、罹患細胞、例えば、罹患哺乳類細胞又は罹患ヒト細胞である。罹患細胞は、代謝的特徴、遺伝子発現特徴、及び／又は形態学的特徴の改変を呈し得る。一部の実施形態において、細胞は、疾患に関連する遺伝的変異を含むゲノムを有する。一部の実施形態において、細胞は、疾患に関連するＳＮＰを有する。一部の実施形態において、細胞のゲノムは、疾患に関連する遺伝子マーカーを有する。一部の実施形態において、細胞は、有害な突然変異を有する。一部の実施形態において、細胞は、疾患を引き起こす突然変異を有する。一部の実施形態において、細胞は、疾患に関連する突然変異アレルを有する。一部の実施形態において、細胞は、機能喪失型突然変異を有する。一部の実施形態において、細胞は、疾患遺伝子型を有する。一部の実施形態において、細胞は、疾患表現型を有する。一部の実施形態において、細胞は、遺伝的欠陥を有する。一部の実施形態において、細胞は、発癌突然変異を有する。一部の実施形態において、細胞は、組み込まれた及び／又は安定して維持されているウイルスを有する。一部の実施形態において、細胞のゲノムにレトロウイルスが組み込まれる。一部の実施形態において、細胞のゲノムにレンチウイルスが組み込まれる。一部の実施形態において、細胞は、持続性ウイルス感染を有する。一部の実施形態において、細胞は、ＨＩＶを有する。一部の実施形態において、細胞は、ＨＩＶゲノムの組み込まれたコピーを有する。一部の実施形態において、細胞は、ウイルスに感染している。一部の実施形態において、細胞は、潜伏ウイルス感染を有する。一部の実施形態において、細胞は、ヘルペスウイルスに感染している。一部の実施形態において、細胞は、ヒトヘルペスウイルス６型又は７型に感染している。一部の実施形態において、細胞は、単純ヘルペスウイルス１型又は２型に感染している。一部の実施形態において、細胞は、水痘帯状疱疹ウイルスに感染している。一部の実施形態において、細胞は、ヒトパポバウイルスに感染している。一部の実施形態において、細胞は、エプスタイン・バーウイルスに感染している。罹患細胞は、癌細胞、糖尿病細胞、又はアポトーシス細胞であり得る。罹患細胞は、罹患対象からの細胞であり得る。例示的疾患としては、遺伝的障害、感染性疾患、血液障害、癌、代謝障害、眼障害、臓器障害、筋骨格障害、心疾患などを挙げることができる。一部の実施形態において、細胞は患者に由来する。一部の実施形態において、細胞はエキソビボで修飾される。一部の実施形態において、細胞は癌細胞である。一部の実施形態において、細胞は胚細胞である。一部の実施形態において、細胞は胚性幹細胞である。

【0206】

一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、罹患細胞、例えば、罹患哺乳類細胞又は罹患ヒト細胞が遺伝子修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、罹患細胞が遺伝子修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、罹患細胞に遺伝子の野生型アレルが挿入される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、罹患細胞の有害突然変異が修正される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、癌遺伝子が遺伝子修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、疾患に関連する遺伝子のアレルが遺伝子修飾される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、遺伝子の健常アレルが挿入される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、疾患に関連しない遺伝子のアレルが挿入される。一部の実施形態において、本明細書に提供される方法を用いて、レンチウイルス、レトロウイルス、又はヘルペスウイルスなど、組み込まれた又は安定して維持されているウイルスが細胞のゲノムから除去される。

【0207】

ｉｉｉ．真菌細胞
一部の実施形態において、真核細胞は真菌細胞である。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤を含む真核細胞は、真菌細胞である。更に、真菌細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する真菌細胞を作り、及び／又は真菌細胞を遺伝子操作するため、本開示の方法が用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、真菌細胞を編集することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、真菌細胞においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、真菌細胞の標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、真菌細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させることを含む。

【0208】

一部の実施形態において、真菌細胞は、多細胞真菌に由来する細胞である。一部の実施形態において、細胞は子嚢菌細胞である。一部の実施形態において、細胞は単細胞真菌である。一部の実施形態において、細胞は酵母細胞である。一部の実施形態において、細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エピデルモフィトン属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ラカンセア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、オフィオストマ属（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、プルラリア属（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の真菌細胞である。一部の実施形態において、細胞は、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．アウリス（Ｃ．ａｕｒｉｓ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、又はＣ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）細胞など、カンジダ属種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐ．）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ツボカビ真菌細胞、即ち、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、カエルツボカビ（Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｂａｔｉｄｉｓ）細胞など、カエルツボカビ属種（Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、グルゲア属種（Ｇｌｕｇｅａ ｓｐ．）又はノセマ属種（Ｎｏｓｅｍａ ｓｐ．）細胞など、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）細胞である。一部の実施形態において、真菌細胞は、寄生虫である。一部の実施形態において、細胞は、白癬菌属種（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｐ．）又はミクロスポルム属種（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｓｐ．）細胞、即ち、白癬を引き起こす寄生性変種を含む真菌属のメンバーである。一部の実施形態において、細胞は、糸状菌細胞、即ち、糸状菌類由来の細胞である。一部の実施形態において、細胞は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）細胞など、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、ボトリチス・アリ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｌｌｉｉ）、ボトリチス・アントフィラ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｎｔｈｏｐｈｉｌａ）、ボトリチス・エリプティカ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｅｌｌｉｐｔｉｃａ）、ボトリチス・ファバエ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｆａｂａｅ）、ボトリチス・スクアモサ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｑｕａｍｏｓａｌ）、又はボトリチス・トラケイフィラ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌａ）細胞など、ボトリチス属種（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｓｐ．）細胞である。

【0209】

ｉｖ．他の真核細胞
一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤を含む真核細胞は、微生物真核細胞である。更に、微生物真核細胞におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させ、ゲノム修飾を有する微生物真核細胞を作り、及び／又は微生物真核細胞を遺伝子操作するため、本開示の方法が用いられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、微生物真核生物を編集することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、微生物真核生物においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、微生物真核生物の標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、微生物真核生物におけるＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させることを含む。一部の実施形態において、細胞は微生物真核生物である。一部の実施形態において、細胞は、単細胞真核生物の細胞である。一部の実施形態において、細胞は原虫細胞である。一部の実施形態において、細胞は原生生物である。一部の実施形態において、細胞は感染性微生物真核生物である。一部の実施形態において、細胞は寄生性微生物真核生物である。一部の実施形態において、細胞は、ランブル鞭毛虫（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）、Ｇ．ムリス（Ｇ．ｍｕｒｉｓ）、Ｇ．アルデエ（Ｇ．ａｒｄｅａｅ）、Ｇ．プシッタキ（Ｇ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｇ．アギリス（Ｇ．ａｇｉｌｉｓ）又はＧ．ミクロティ（Ｇ．ｍｉｃｒｏｔｉ）細胞など、ジアルジア属種（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐ．）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、又はサルマラリア原虫（Ｐ．ｋｎｏｗｌｅｓｉ）細胞など、プラスモジウム属種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐ．）細胞である。一部の実施形態において、細胞はキネトプラスト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）又はブルーストリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）細胞など、トリパノソーマ属種（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐ．）細胞である。

【0210】

一部の実施形態において、細胞は藻類細胞である。一部の実施形態において、藻類細胞は、ツメケイソウ属（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプロラ属（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、ニセクチビルケイソウ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス属（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、アステロモナス属（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、ボエケロビア属（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス属（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロジネラ属（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、フウセンモ属（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス属（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、ブラクテアコッカス属（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ツノケイソウ属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア属（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、コナミドリムシ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコックム属（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム属（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クロオモナス属（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、クリコスファエラ属（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス属（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、タイコケイソウ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、ドゥナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、エリプソイドン属（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスフェラ属（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、エルノデスミス属（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ミドリムシ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースチグマトス属（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア属（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、オビケイソウ属（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラジラリオプシス属（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、グレオタムニオン属（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス属（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハロカフェテリア属（Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ）、アカシオモ属（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ヒメノモナス属（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、ニセウチワヒゲムシ属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム属（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、モノラフィディウム属（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ナンノクロリス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス属（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ササノハケイソウ属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、サヤミドロ属（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、オオキスティス属（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、オストレオコッカス属（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、パラクロレラ属（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パスケリア属（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、ペラゴモナス属（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファガス属（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム属（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プラチモナス属（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、シュードクロレラ属（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードネオクロリス属（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラスツルム属（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス属（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、ホネツギケイソウ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、スピロギラ属（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス属（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、タラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ属（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ属（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ属（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）、ビスケリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、又はボルボックス属（Ｖｏｌｖｏｘ）の種の細胞である。一部の実施形態において、細胞は珪藻である。珪藻類には、ツメケイソウ属（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、ニセクチビルケイソウ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、ツノケイソウ属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、コアミケイソウ属（Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ）、シリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）、タイコケイソウ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、クチビルケイソウ属（Ｃｙｍｂｅｌｌａ）、オビケイソウ属（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラジラリオプシス属（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、ユミケイソウ属（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）、フナガタケイソウ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ササノハケイソウ属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、ニセササノハケイソウ属（Ｐｓｅｕｄｏ－Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、フェオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、プサモディクチオン属（Ｐｓａｍｍｏｄｉｃｔｙｏｎ）、ホネツギケイソウ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、タラシオネマ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｎｅｍａ）、及びタラシオシラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）のメンバーが含まれる。一部の実施形態において、細胞は、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）種又はモノドス属（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、シュードスタウラスツルム属（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ビスケリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、及びユースチグマトス属（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）の種など、真正眼点藻である。一部の実施形態において、細胞は、限定はされないが、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）、Ｎ．グラヌラタ（Ｎ．ｇｒａｎｕｌａｔａ）、Ｎ．リムネティカ（Ｎ．ｌｉｍｎｅｔｉｃａ）、Ｎ．オセアニカ（Ｎ．ｏｃｅａｎｉｃａ）、Ｎ．オクラタ（Ｎ．ｏｃｕｌａｔａ）、及びＮ．サリナ（Ｎ．ｓａｌｉｎａ）など、ナンノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）の藻類細胞である。

【0211】

一部の実施形態において、細胞は不等毛類である。例えば、不等毛類には、上記に挙げたものなどの真正眼点藻類及び珪藻類のみならず、ラビリンチュラ類（ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）及びヤブレツボカビ類を含めたツボカビ種もまた含まれる。一部の実施形態において、細胞は、限定はされないが、珪藻類、真正眼点藻類、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、及びヤブレツボカビ類を含めた不等毛類種の細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ラビリンチュラ属（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）、ラビリンチュロイデス属（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オーランチオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ジャポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ディプロフリス属（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、又はウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）の種の細胞である。例えば、株は、トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、又はオーランチオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の種であってもよい。一部の実施形態において、細胞はオピストコントである。一部の実施形態において、細胞は襟鞭毛虫である。一部の実施形態において、細胞は、アメソミセトゾエア（ａｍｅｓｏｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）（例えば、スフェロフォルマ（Ｓｐｈａｅｒｏｆｏｒｍａ））である。一部の実施形態において、細胞はユニコントである。一部の実施形態において、細胞はアメーバ動物である。一部の実施形態において、細胞は、アカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、アメーバ属（Ａｍｏｅｂａ）、カオス属（Ｃｈａｏｓ）、タマホコリカビ属（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）、エントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、又はペロミクサ属（Ｐｅｌｏｍｙｘａ）の細胞である。

【0212】

ｖ．細胞の組成物
本明細書には、細胞の組成物が提供される。一態様において、本明細書に提供される方法を用いて、真核細胞の組成物が作製され得る。一部の実施形態において、真核細胞の組成物は、本明細書に記載される細胞のいずれか、例えば、植物、動物、真菌、又は他の真核細胞を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞集団を編集すること含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、編集された細胞集団を作製することを含む。一部の実施形態において、編集された細胞集団を作製することを含む本明細書に開示される方法、ここで集団中の編集された細胞の比率は、ＨＤＲ促進剤の非存在下で編集された細胞の集団と比べて約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍のいずれか１つ（これらの値の間にある任意の値又は範囲を含む）の高さである。一部の実施形態において、編集された細胞集団を作製することを含む本明細書に開示される方法、ここで集団中の編集された細胞の比率は、ＨＤＲ促進剤の非存在下で編集された細胞の集団と比べて１０倍の高さである。

【0213】

一部の実施形態において、本明細書には、組成物、本明細書に提供される方法に使用される細胞のクローン部分集団が提供される。一部の実施形態において、クローン部分集団は、細胞株の部分集団である。一部の実施形態において、クローン部分集団は、個体に由来する細胞の部分集団である。一部の実施形態において、クローン細胞部分集団は、単一の細胞に由来する細胞の集団である。一部の実施形態において、クローン細胞部分集団は、同じ遺伝的及び後成的プロファイルを有する。

【0214】

一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞集団においてゲノム修飾を実施することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ゲノム修飾を有する細胞の組成物を作製することを含む。一部の実施形態において、ゲノム修飾を有する細胞の組成物を作製することを含む本明細書に開示される方法、ここで集団中のゲノム修飾を有する細胞の比率は、ＨＤＲ促進剤の非存在下で修飾された細胞の集団と比べて２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍（これらの値の間にある任意の値又は範囲を含む）の高さである。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、細胞集団の標的遺伝子座を修飾することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、修飾された標的遺伝子座を有する細胞の集団を作製することを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、修飾された標的遺伝子座を有する細胞の集団を作製することを含み、ここで集団中の修飾された標的遺伝子座を有する細胞の比率は、ＨＤＲ促進剤の非存在下で修飾された細胞の集団と比べて２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍（これらの値の間にある任意の値又は範囲を含む）の高さである。

【0215】

Ｅ．キット
本発明の方法は、キットの形態で提供され得る。一部の実施形態において、本キットは、ＨＤＲ促進剤をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、本キットは、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸と、使用説明書とを含む。一部の実施形態において、本キットは、核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態において、本キットは、ドナー鋳型ＤＮＡ分子を使用して細胞の標的編集部位を修飾するために使用される。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるベクターのいずれかを含む。一部の実施形態において、本キットは、植物又は哺乳類細胞ゲノムなど、真核細胞ゲノムの標的編集部位のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させるためのベクターを含む。一部の実施形態において、本キットは、植物細胞における標的編集部位のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させるためのベクターを含む。一部の実施形態において、キットは、哺乳類細胞における標的編集部位のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾を増加させるためのベクターを含む。

【0216】

一部の実施形態において、本キットは説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、細胞を核酸で形質転換することに関する説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、細胞中の核酸の存在を検出することに関する説明書を含む。一部の実施形態において、説明書は、細胞における核酸の効果を評価することに関する説明書を含む。

【0217】

一部の実施形態において、本キットは、遺伝子操作された細胞の検出用薬剤を含む。一部の実施形態において、本キットは、遺伝子操作された細胞の検出用薬剤の使用説明書を含む。一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞の検出用薬剤は、ＰＣＲアッセイ、ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイ、サザンブロット、又はシーケンシングアッセイなど、細胞のゲノムを評価するアッセイである。一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞の検出用薬剤は、オリゴヌクレオチドプライマーセットであり、ここでは特定のプライマー対が、遺伝子修飾、又は野生型標的遺伝子座を特異的に増幅する。一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞の検出は、蛍光レポーター、転写レポーター、比色レポーター、又は化学発光レポーターなど、レポーターを使用して実施される。従って、一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞の検出用薬剤は、レポーターの検出手段である。

【0218】

一部の実施形態において、本明細書には、植物又は哺乳類細胞ゲノムなど、真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させるためのキットが提供される。一部の実施形態において、本キットは、ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ゲノム編集分子は、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含む。一部の実施形態において、ＨＤＲ促進剤は、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。一部の実施形態において、ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤は、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらす。一部の実施形態において、本キットは、標的編集部位のＨＤＲ媒介性ゲノム修飾レベルの測定用薬剤を含む。

【0219】

一部の実施形態において、本明細書には、ゲノム修飾を有する真核細胞を作製するためのキットが提供される。一部の実施形態において、本キットは、ゲノム編集分子及び相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤をコードする核酸を含み、ここでゲノム編集分子は、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤は、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；それによってゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤は、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらす。一部の実施形態において、本キットは、ゲノム修飾を含む真核細胞を単離し又は増殖させる手段を提供し、それによってゲノム修飾を有する真核細胞を作り出す。一部の実施形態において、本キットは、標的編集部位のゲノム修飾の存在の検出用薬剤を含む。

【0220】

一部の実施形態において、本明細書には、真核細胞を遺伝子操作する方法のためのキットが提供される。一部の実施形態において、本キットは、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、本キットは、標的編集部位の遺伝子操作の検出用薬剤を含む。

【0221】

実施形態
以下の非限定的な実施形態リストには、本明細書に提供される真核細胞（例えば、植物細胞及び哺乳類細胞）、システム、及び方法の様々な実施形態が含まれる。

【0222】

１．真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させる方法であって、
ゲノム編集分子とＨＤＲ促進剤とを真核細胞に提供することであって、ゲノム編集分子が、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと；（ｉｉ）標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；
それによってゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらすことを含む、方法。

【0223】

２．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、実施形態１に記載の方法。

【0224】

３．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、実施形態２に記載の方法。

【0225】

４．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、実施形態１に記載の方法。

【0226】

５．ゲノム編集分子が、標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。

【0227】

６．配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５に記載の方法。

【0228】

７．配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、ガイドＲＮＡ分子が、標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、実施形態５に記載の方法。

【0229】

８．ドナーＤＮＡ分子が、環状ＤＮＡベクター、ジェミニウイルスレプリコン上に、又は線状ＤＮＡ断片として提供される、実施形態１に記載の方法。

【0230】

９．ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列のコピーが隣接する、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0231】

１０．配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、ガイドＲＮＡに相補的な、且つプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0232】

１１．配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0233】

１２．ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。

【0234】

１３．ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。

【0235】

１４．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１３に記載の方法。

【0236】

１５．ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１３に記載の方法。

【0237】

１６．ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１３に記載の方法。

【0238】

１７．線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0239】

１８．リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態１７に記載の方法。

【0240】

１９．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0241】

２０．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0242】

２１．エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0243】

２２．エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１、５、又は６のいずれか１つに記載の方法。

【0244】

２３．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。

【0245】

２４．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0246】

２５．ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態２４に記載の方法。

【0247】

２６．ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。

【0248】

２７．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。

【0249】

２８．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。

【0250】

２９．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢタンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。

【0251】

３０．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢが、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供される、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。

【0252】

３１．真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0253】

３２．植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、実施形態３１に記載の方法。

【0254】

３３．植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、実施形態３２に記載の方法。

【0255】

３４．細胞が植物細胞であり、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態３１～３３のいずれか１つに記載の方法。

【0256】

３５．ゲノム修飾を含む植物細胞、植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、植物細胞、珠芽、又は植物のゲノムがゲノム修飾を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つに記載の方法。

【0257】

３６．真核細胞ゲノムの標的編集部位の相同組換え修復（ＨＤＲ）媒介性ゲノム修飾を増加させるためのシステムであって、
（ａ）真核細胞；
（ｂ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含むＨＤＲ促進剤；及び
（ｃ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含む１つ又は複数のゲノム編集分子
を含み；
真核細胞が有効量のＨＤＲ促進剤及び１つ又は複数のゲノム編集分子と会合し、それに接触し、及び／又はそれを含有する、システム。

【0258】

３７．ゲノム編集分子及び／又は配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、実施形態３６に記載のシステム。

【0259】

３８．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、実施形態３７に記載のシステム。

【0260】

３９．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、実施形態３６に記載のシステム。

【0261】

４０．ゲノム編集分子が、標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、実施形態３６に記載のシステム。

【0262】

４１．配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態４０に記載のシステム。

【0263】

４２．配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、ガイドＲＮＡ分子が、標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、実施形態４０に記載のシステム。

【0264】

４３．ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、実施形態３６に記載のシステム。

【0265】

４４．ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、実施形態３６～４３のいずれか１つに記載のシステム。

【0266】

４５．配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、ガイドＲＮＡに相補的な、且つＰＡＭ配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、実施形態３６～４４のいずれか１つに記載のシステム。

【0267】

４６．配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、実施形態３６～４５のいずれか１つに記載のシステム。

【0268】

４７．ゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して少なくとも２倍に増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらす、実施形態３６～４６のいずれか１つに記載のシステム。

【0269】

４８．ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、実施形態３６～４７のいずれか１つに記載のシステム。

【0270】

４９．ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、実施形態３６又は４８に記載のシステム。

【0271】

５０．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、実施形態４９に記載のシステム。

【0272】

５１．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、実施形態４９に記載のシステム。

【0273】

５２．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態４９に記載のシステム。

【0274】

５３．ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態４９に記載のシステム。

【0275】

５４．ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態４９に記載のシステム。

【0276】

５５．線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態３６～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0277】

５６．リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態３６～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0278】

５７．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態３６～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0279】

５８．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態３６～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0280】

５９．エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態３６～５８のいずれか１つに記載のシステム。

【0281】

６０．エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態３６、４０、又は４１のいずれか１つに記載のシステム。

【0282】

６１．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、実施形態３６～６０のいずれか１つに記載のシステム。

【0283】

６２．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態３６～６１のいずれか１つに記載のシステム。

【0284】

６３．ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態６２に記載のシステム。

【0285】

６４．ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態３６～６３のいずれか１つに記載のシステム。

【0286】

６５．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照システムと比較して、ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、実施形態３６～６４のいずれか１つに記載のシステム。

【0287】

６６．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照システムと比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、実施形態３６～６４のいずれか１つに記載のシステム。

【0288】

６７．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、実施形態３６～６６のいずれか１つに記載のシステム。

【0289】

６８．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢが、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供される、実施形態３６～６４のいずれか１つに記載のシステム。

【0290】

６９．真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、実施形態３６～６８のいずれか１つに記載のシステム。

【0291】

７０．植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、実施形態６９に記載のシステム。

【0292】

７１．植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、実施形態６９又は７０に記載のシステム。

【0293】

７２．細胞が植物細胞であり、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態６９、７０、又は７１に記載のシステム。

【0294】

７３．システムが、ゲノム修飾を含む植物細胞、植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離すること及び／又は成長させることを提供し、及び植物細胞、珠芽、又は植物のゲノムがゲノム修飾を含む、実施形態６９～７２のいずれか１つに記載のシステム。

【0295】

７４．ゲノム修飾を有する真核細胞を作製する方法であって、
（ａ）ゲノム編集分子と相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤とを真核細胞に提供することであって、ゲノム編集分子が、（ｉ）標的編集部位中のＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又はその配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドと、標的編集部位との相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子とを含み；及びＨＤＲ促進剤が、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含み；それによってゲノム編集分子及びＨＤＲ促進剤が、対照と比較して増加した頻度でＨＤＲによるドナー鋳型ポリヌクレオチドを用いた真核細胞ゲノムの標的編集部位の修飾をもたらすこと；及び
（ｂ）ゲノム修飾を含む真核細胞を単離し又は増殖させることであって、それによってゲノム修飾を有する真核細胞を作製すること
を含む方法。

【0296】

７５．ゲノム編集分子及び／又は配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、実施形態７４に記載の方法。

【0297】

７６．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、又は操作されたヌクレアーゼを含む、実施形態７５に記載の方法。

【0298】

７７．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、実施形態７４に記載の方法。

【0299】

７８．ゲノム編集分子が、標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する１つ以上の配列特異的エンドヌクレアーゼ又は配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む、実施形態７４に記載の方法。

【0300】

７９．配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態７８に記載の方法。

【0301】

８０．配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、ガイドＲＮＡ分子が、標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、実施形態７８に記載の方法。

【0302】

８１．ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、実施形態７４に記載の方法。

【0303】

８２．ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、実施形態７４～８１のいずれか１つに記載の方法。

【0304】

８３．配列特異的エンドヌクレアーゼがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含み、標的編集部位が、ＰＡＭ配列と、ガイドＲＮＡに相補的な、且つＰＡＭ配列に直接隣接した位置にある配列とを含む、実施形態７４～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0305】

８４．配列特異的エンドヌクレアーゼが、切断後に標的編集部位に５’オーバーハングを提供する、実施形態７４～８３のいずれか１つに記載の方法。

【0306】

８５．ＳＳＡＰが、ＤＮＡ鎖交換及び相同ＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖の塩基対合を提供する、実施形態７４～８４のいずれか１つに記載の方法。

【0307】

８６．ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、実施形態７４～８５のいずれか１つに記載の方法。

【0308】

８７．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、実施形態８６に記載の方法。

【0309】

８８．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、配列番号１、２、又は３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態８６に記載の方法。

【0310】

８９．ＥＲＦファミリータンパク質が、バクテリオファージＰ２２ ＥＲＦタンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態８６に記載の方法。

【0311】

９０．ＲＡＤ５２ファミリータンパク質が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒａｄ５２タンパク質、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）Ｒａｄ２２タンパク質、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）Ｒａｄ５２タンパク質、機能的に関連性のあるタンパク質、又は配列番号５、６、又は７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態８６に記載の方法。

【0312】

９１．線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態７４～９０のいずれか１つに記載の方法。

【0313】

９２．リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態７４～９１のいずれか１つに記載の方法。

【0314】

９３．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態７４～９２のいずれか１つに記載の方法。

【0315】

９４．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態７４～９２のいずれか１つに記載の方法。

【0316】

９５．エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態７４～９０のいずれか１つに記載の方法。

【0317】

９６．エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態７４、７８、又は７９に記載の方法。

【0318】

９７．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、実施形態７４～９６のいずれか１つに記載の方法。

【0319】

９８．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）が、細菌ＳＳＢ、又は任意選択で腸内細菌科種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態７４～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0320】

９９．ＳＳＢが、大腸菌属種（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、赤痢菌属種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．）、エンテロバクター属種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クレブシエラ属種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア属種（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｓｐ．）、パントエア属種（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．）、又はエルシニア属種（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐ．）ＳＳＢである、実施形態９８に記載の方法。

【0321】

１００．ＳＳＢが、配列番号３１、３４～１３１、又は１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態７４～９９のいずれか１つに記載の方法。

【0322】

１０１．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、ＨＤＲ頻度が少なくとも２倍に増加する、実施形態７４～１００のいずれか１つに記載の方法。

【0323】

１０２．対照真核細胞がゲノム編集分子の提供を受けるが、前記ＨＤＲ促進剤の少なくとも１つに曝露されない対照方法と比較して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度が維持されるか、又は少なくとも２分の１に低下する、実施形態７４～１００のいずれか１つに記載の方法。

【0324】

１０３．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又は一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び／又は細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を更に含む、実施形態７４～１０２のいずれか１つに記載の方法。

【0325】

１０４．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢが、ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢの間に挿入されたプロテアーゼ認識部位又は自己プロセシングタンパク質配列を含むポリタンパク質として細胞に提供される、実施形態７４～１０３のいずれか１つに記載のシステム。

【0326】

１０５．真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、実施形態７４～１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0327】

１０６．植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、実施形態１０５に記載の方法。

【0328】

１０７．植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、実施形態１０５又は１０６に記載の方法。

【0329】

１０８．ＳＳＡＰ、エキソヌクレアーゼ、及び／又はＳＳＢが、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される作動可能に連結された核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１０５、１０６、又は１０７に記載の方法。

【0330】

１０９．ゲノム修飾を含む植物細胞、植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、植物細胞、珠芽、又は植物のゲノムがゲノム修飾を含む、実施形態１０５～１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0331】

１１０．ＨＤＲ促進剤、ゲノム編集分子及び真核細胞又はゲノム修飾を含む真核細胞が、複数の容器、区画、又は位置を含むアレイで提供され、各容器、区画、又は位置が、ＨＤＲ促進剤、ゲノム編集分子及び真核細胞又はゲノム修飾を含む真核細胞を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法、実施形態３６～６８のいずれか１つに記載のシステム、又は実施形態７４～１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0332】

１１１．真核細胞を遺伝子操作する方法であって、真核細胞に、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を提供することを含み、
細胞の標的編集部位がドナー鋳型ＤＮＡ分子によって修飾される、方法。

【0333】

１１２．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ又はＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、実施形態１１１に記載の方法。

【0334】

１１３．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｖ型Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＣａｓＹヌクレアーゼ、ＣａｓＸヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１４、又は操作されたヌクレアーゼを含む、実施形態１１２に記載の方法。

【0335】

１１４．配列特異的エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ）、アルゴノート、メガヌクレアーゼ、又は操作されたメガヌクレアーゼを含む、実施形態１１１に記載の方法。

【0336】

１１５．ガイドＲＮＡを更に含み、配列特異的エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、標的編集部位にある２つの個別のＤＮＡ配列で単一のＤＮＡ鎖を切断する、実施形態１１１に記載の方法。

【0337】

１１６．配列特異的エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのＣａｓ９ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ａニッカーゼ、ジンクフィンガーニッカーゼ、ＴＡＬＥニッカーゼ、又はこれらの組み合わせを含み、配列特異的エンドヌクレアーゼが、標的編集部位のエンドヌクレアーゼ認識配列に特異的である、実施形態１１５に記載の方法。

【0338】

１１７．配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓ９及び／又はＣａｓ１２ａを含み、ガイドＲＮＡ分子が、標的編集部位のＤＮＡ配列と少なくとも１塩基のミスマッチを有する、実施形態１１５に記載の方法。

【0339】

１１８．ドナーＤＮＡ分子が、プラスミド又はジェミニウイルスゲノムに提供される、実施形態１１１に記載の方法。

【0340】

１１９．ドナーＤＮＡ分子にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、実施形態１１１に記載の方法。

【0341】

１２０．ＳＳＡＰが、ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリー、ＥＲＦファミリー、又はＲＡＤ５２ファミリータンパク質を含む、実施形態１１１に記載の方法。

【0342】

１２１．ＲｅｃＴ／Ｒｅｄβファミリータンパク質が、Ｒａｃ細菌プロファージＲｅｃＴタンパク質、バクテリオファージλベータタンパク質、バクテリオファージＳＰＰ１ ３５タンパク質、又は同等のＳＳＡＰ活性を有する関連するタンパク質を含む、実施形態１２０に記載の方法。

【0343】

１２２．線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態１１１に記載の方法。

【0344】

１２３．リン酸化した５’末端を含む線状ｄｓＤＮＡ分子が、エキソヌクレアーゼの好ましい基質である、実施形態１１１に記載の方法。

【0345】

１２４．エキソヌクレアーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態１１１に記載の方法。

【0346】

１２５．エキソヌクレアーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、平滑末端型ｄｓＤＮＡ基質、一方の鎖に内部切断を有するｄｓＤＮＡ基質、５’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質、及び／又は３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡ基質を認識することができる、実施形態１１１に記載の方法。

【0347】

１２６．エキソヌクレアーゼが、バクテリオファージラムダエキソタンパク質、ＲａｃプロファージＲｅｃＥエキソヌクレアーゼ、アルテミスタンパク質、アポロタンパク質、ＤＮＡ２エキソヌクレアーゼ、Ｅｘｏ１エキソヌクレアーゼ、ヘルペスウイルスＳＯＸタンパク質、ＵＬ１２エキソヌクレアーゼ、腸内細菌エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、哺乳類Ｔｒｅｘ２エキソヌクレアーゼ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号８、９、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、又は１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１１１に記載の方法。

【0348】

１２７．エキソヌクレアーゼが、Ｔ７ファージエキソヌクレアーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、同等のエキソヌクレアーゼ活性を有する関連するタンパク質、又は配列番号１４３又は１４４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む、実施形態１１１に記載の方法。

【0349】

１２８．一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とＳＳＡＰとが、同じ宿主生物から入手される、実施形態１１１に記載の方法。

【0350】

１２９．真核細胞が哺乳類細胞又は植物細胞である、実施形態１１１～１２８のいずれか１つに記載の方法。

【0351】

１３０．植物細胞が一倍体、二倍体、又は倍数体である、実施形態１２９に記載の方法。

【0352】

１３１．植物細胞が、培養培地中、植物中、又は植物組織中にある、実施形態１３０に記載の方法。

【0353】

１３２．ゲノム修飾を含む植物細胞、植物細胞から入手された珠芽、又は植物を単離する及び／又は成長させるステップを更に含み、植物細胞、珠芽、又は植物のゲノムがゲノム修飾を含む、実施形態１３１に記載の方法。

【0354】

１３３．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、１つ以上のベクターに提供される、実施形態１１１～１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0355】

１３５．ベクターがアグロバクテリウムベクターである、実施形態１３３に記載の方法。

【0356】

１３６．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、染色体によって提供される、実施形態１１１～１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0357】

１３７．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、ポリペプチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡを導入すること、及び／又は性的交雑によって提供される、実施形態１１１～１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0358】

１３８．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上が、ｉ）～ｖ）のうちの１つ以上を含む前駆細胞によって提供され、
前駆細胞が、ｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、
前駆細胞に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つが、続いて前駆細胞にポリペプチド、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡを送達すること及び／又は前駆細胞の性的交雑によって提供される、実施形態１１１～１３２のいずれか１つに記載の方法。

【0359】

１３９．修飾を検出することを更に含む、実施形態１１１～１３８のいずれか１つに記載の方法。

【0360】

１４０．修飾を検出することが、アンプリコンシーケンシングを含む、実施形態１３９に記載の方法。

【0361】

１４１．標的編集部位が、タンパク質コード配列中又はプロモーター中にある、実施形態１１１～１４０のいずれか１つに記載の方法。

【0362】

１４２．標的編集部位の修飾が、挿入、欠失、又は置換である、実施形態１１１～１４１のいずれか１つに記載の方法。

【0363】

１４３．標的編集部位が、作物栽培学的に重要な形質をコードする遺伝子又は哺乳類疾患に関わる遺伝子である、実施形態１１１～１４２のいずれか１つに記載の方法。

【0364】

１４４．遺伝子修飾された標的編集部位を有する真核細胞の作製方法であって、
（ａ）前記標的編集部位中の少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ認識配列ＤＮＡ配列を切断する少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ又は前記少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを提供すること、及び
（ｂ）少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ配列を含む少なくとも１つのドナー分子を提供することであって、（ｉ）前記ＤＮＡ配列が、標的編集部位に隣接する配列と少なくとも５０ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも９０％の相同性を有し、及び（ｉｉ）前記ドナー配列が、前記標的編集部位と比較して少なくとも１つの修飾を含むこと；及び
（ｃ）少なくとも１つの相同組換え修復（ＨＤＲ）促進剤を提供することであって、ＨＤＲ促進剤が、
（ｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、及び
（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできる少なくとも１つのエキソヌクレアーゼ、及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）
を含み；
及びそれによって少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、少なくとも１つのドナー分子、及び少なくとも１つのＨＤＲ促進剤が前記真核細胞の前記標的編集部位に前記修飾を導入すること；及び
（ｄ）前記標的編集部位に修飾を含む真核細胞を単離すること
を含む方法。

【0365】

１４５．修飾が、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、又は１つ以上のヌクレオチドの置換からなる群から選択される、実施形態１４４に記載の方法。

【0366】

１４６．標的編集部位の一部分が、前記標的編集部位における２つの配列特異的切断を用いることによって欠失され、ドナー分子によって提供される配列に置き換えられる、実施形態１４４に記載の方法。

【0367】

１４７．ベクター内で前記ドナー配列にエンドヌクレアーゼ認識配列が隣接している、実施形態１４４～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0368】

１４８．修飾を含む真核細胞を増殖させることを更に含む、実施形態１４４～１４７のいずれか１つに記載の方法。

【0369】

１４９．遺伝子修飾された生物を作製する方法であって、
（ｉ）実施形態１４４～１４８のいずれかにより、遺伝子修飾された真核細胞を作製するステップ、及び
（ｉｉ）前記細胞を生物へと再生するステップ
を含む方法。

【0370】

１５０．生物が、植物及び非ヒト動物からなる群から選択される、実施形態１４９に記載の生物。

【0371】

１５１．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含む組成物。

【0372】

１５２．核酸が１つ以上のベクター内にある、実施形態１５１に記載の組成物。

【0373】

１５３．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のうちの１つ以上をコードする核酸を含むベクター。

【0374】

１５４．ドナー鋳型ＤＮＡと、配列特異的エンドヌクレアーゼと、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、実施形態１５３に記載のベクター。

【0375】

１５５．一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む、実施形態１５３に記載のベクター。

【0376】

１５６．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む、実施形態１５３に記載のベクター。

【0377】

１５７．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸と、真核細胞の遺伝子操作に関する使用説明書とを含むキット。

【0378】

１５８．キットが第１のベクターと第２のベクターとを含み、
ｉ）第１のベクターが、ドナー鋳型ＤＮＡと配列特異的エンドヌクレアーゼとを含む核酸を含み、配列特異的エンドヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み；及び
ｉｉ）第２のベクターが、一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）と、二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼと、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む、実施形態１５７に記載のキット。

【0379】

１５９．遺伝子操作された細胞の検出用薬剤を更に含む、実施形態１５７又は１５８に記載のキット。

【0380】

１６０．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む細胞。

【0381】

１６１．ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型ＤＮＡ分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）をコードする核酸を含む細胞。

【0382】

１６２．植物又は哺乳類細胞である、実施形態１６０又は１６１に記載の細胞。

【0383】

１６３．宿主細胞である、実施形態１６０～１６２のいずれか１つに記載の細胞。

【0384】

１６４．実施形態１～３５又は７４～１４９のいずれか１つに記載の方法によって作製される遺伝子操作された細胞。

【0385】

１６５．標的編集部位における遺伝子操作のための前駆真核細胞又は生物であって、ｉ）少なくとも１つの配列特異的エンドヌクレアーゼ、ｉｉ）真核細胞の標的編集部位と相同性を有するドナー鋳型分子、ｉｉｉ）一本鎖ＤＮＡアニーリングタンパク質（ＳＳＡＰ）、ｉｖ）二本鎖ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡ産物へと少なくとも部分的に変換することのできるエキソヌクレアーゼ、及びｖ）一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）のサブセットを含み、細胞がｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含まず、ここで前駆細胞又は生物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを細胞又は生物に提供すると、ドナー鋳型分子によって標的編集部位が修飾されることになる、前駆真核細胞又は生物。

【0386】

１６６．ドナー鋳型が二本鎖ＤＮＡ分子である、実施形態１６５に記載の前駆真核細胞又は生物。

【0387】

１６７．細胞が生殖系列細胞である、実施形態１６５に記載の前駆細胞。

【0388】

１６８．前駆真核細胞が前駆植物細胞であり、前駆植物細胞又は植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つが形質転換によって供給される、実施形態１６５に記載の前駆真核細胞又は生物。

【0389】

１６９．生物が植物であり、前駆植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つが、前駆植物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含む第２の植物との性的交雑によって供給される、実施形態１６５に記載の前駆生物。

【0390】

１７０．前駆真核細胞が動物細胞であり、前駆細胞に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つがトランスフェクションによって供給される、実施形態１６５に記載の前駆真核細胞。

【0391】

１７１．前駆生物が非ヒト動物であり、非ヒト動物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つが、非ヒト動物に含まれないｉ）～ｖ）のうちの少なくとも１つを含む非ヒト動物との性的交雑によって供給される、実施形態１６５に記載の前駆生物。

【0392】

１７２．配列特異的ヌクレアーゼが誘導性プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１５３に記載のベクター。

【0393】

１７３．配列特異的エンドヌクレアーゼがニッカーゼである、実施形態１１１に記載の方法。

【実施例】

【0394】

以下の実施例は、単に本発明を例示することを意図しており、従って、いかなる形であれ本発明を限定するものと見なされてはならない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定としてではなく、例示として提供される。

【0395】

実施例１．エキソヌクレアーゼ、ＳＳＡＰ、及びＳＳＢ発現ベクター及びドナーＤＮＡ鋳型配列
本実施例は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号８）、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質（配列番号１）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ（配列番号３１）の発現に使用される植物発現ベクターの構築について記載する。

【0396】

バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号８）、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質（配列番号１）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ（配列番号３１）の発現用の植物発現コンストラクトを構築した。配列番号１５のタバコｃ２核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするＤＮＡ配列を、エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結して、それぞれ、配列番号１３５、配列番号１３４、及び配列番号１３３に示される、ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ（別名Ｒｅｄ－Ｅｘｏ）、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ（別名Ｒｅｄ－Ｂｅｔａ）、及びｃ２ ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供した。ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ＮＬＳｆ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、２ｘ３５Ｓ、ＳｌＵＢＩ１０、ＰｃＵＢＩ４プロモーター及び３５Ｓ、ＡｔＨＳＰ、エンドウ３Ａポリアデニル化部位に作動可能に連結して、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＡＰ、及びＳＳＢ植物細胞遺伝子発現カセットを提供した（図２を参照）。

【0397】

ＨＤＲによる４２塩基対異種配列の挿入用のトマトＡｎｔ１遺伝子のプロモーター領域を標的とするＤＮＡドナー鋳型プラスミドを構築した（図１）。この環状ＤＮＡドナープラスミドは、両側に相同アーム約６００～８００ｂｐ長が隣接する所望の挿入領域（４２塩基対長）を有する置換鋳型を含んだ。相同アームは、標的ｇＤＮＡ挿入部位に隣接するｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）領域にマッチした（即ち、それと相同であった）。ドナーＤＮＡを含む置換鋳型領域には、各端に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって認識される標的ｇＤＮＡ配列と同一のＤＮＡ配列が隣接した。ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼ及び挿入部位に隣接する配列に相補的なガイドＲＮＡの発現をもたらす植物発現カセットもまた構築した（図１）。

【0398】

実施例２．トマトプロトプラストを用いたゲノム編集実験
本実施例は、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及びＳＳＡＰの存在下及び非存在下における平滑末端切断型及び付着末端切断型の両方のＣＡＳヌクレアーゼによるトマトプロトプラストの遺伝子編集について記載する。

【0399】

本質的に既発表の手順のとおり（Ｃｚｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．２０１７）、トマトプロトプラストを単離し、培養し、ＰＥＧ媒介性トランスフェクションに供した。トランスフェクトした材料は、実施例１に記載されるドナーＤＮＡ鋳型領域を有するとともに、指示されるとおりのｇＲＮＡ及びＣａｓポリヌクレオチドも発現するプラスミド（図１）を含んだ。Ｃａｓポリヌクレオチドは核局在化シグナルに融合した。ｇＲＮＡは、意図されるゲノムＤＮＡ標的内への二本鎖切断の標的化、及びドナープラスミドからの置換鋳型の放出の両方を行う（図１を参照）。一部の実験は、エンドヌクレアーゼ認識配列の切断後に平滑末端が残るＣＡＳヌクレアーゼを代表する、且つ本明細書でＣａｓＢヌクレアーゼと称されるＣａｓヌクレアーゼで行った。他の実験は、エンドヌクレアーゼ認識配列の切断後に付着末端型一本鎖ＤＮＡ突出末端が残るＣＡＳヌクレアーゼを代表する、且つ本明細書においてＣａｓＳヌクレアーゼと称されるＣａｓヌクレアーゼで行った。

【0400】

トランスフェクションに続いてプロトプラストを４８時間インキュベートした後、トランスフェクト試料からｇＤＮＡを抽出し、導入された置換配列及び置換鋳型の相同アームに隣接するゲノム配列と相補的なプライマーで標的遺伝子座を増幅し、アンプリコンシーケンシングによって分析した。

【0401】

アンプリコンは、ペアエンドＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを用いてシーケンシングした。アンプリコンのサイズに起因して、ペアエンドリードのうちの僅か１リードエンド（Ｒｅａｄ１）が、標的化される配列挿入を含む目的の部位をカバーした。目的のリード（Ｒｅａｄ１）をクオリティに関してトリムし、参照アンプリコンとアラインメントした。リードは、それをある種のＰＣＲ重複と区別するためのユニークな分子識別子（ＵＭＩ）タグを有し、そうした重複リードはアラインメントから排除した。次に、未編集のゲノム配列にマッピングされたリード（Ｒｅａｄ２）について、ゲノムに正しくマッピングされているか調べた。Ｒｅａｄ１から生成されたアラインメントをＣｒｉｓｐＲＶａｒｉａｎｔｓで分析し、それによって切断部位を中心とした１００ｂｐウィンドウの範囲内で異なる全ての配列アレルが記述され、集計された（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１６ ３４：７０１－７０２）。ＣｒｉｓｐＲＶａｒｉａｎｔｓから、アラインメント全体のリード数における各アレルのリード頻度が報告された。種々の配列アレルが、１）野生型配列、ＳＮＰ、又はシーケンシングアーチファクト、２）インデル突然変異、又は３）正確な挿入イベントに分類された。ＣｒｉｓｐＲＶａｒｉａｎｔｓが、突然変異の種類及び定義された切断部位からのその距離に基づきＳＮＰを自動的に検出し、更なるフィルタリングステップを用いて、予想切断部位の両側５ｂｐ以内の塩基に関わらない任意の他の配列異常を除去した。これらのアレルはカテゴリー１に入れた。切断部位の両側５ｂｐ以内にある任意の塩基に関わる挿入又は欠失突然変異を有するシーケンシングアレルは全て、インデルであると決定し、カテゴリー２に入れた。高精度遺伝子ターゲティングが成功すると、予想されるサイズ及び配列の挿入によって同定可能な単一のＣｒｉｓｐＲＶａｒｉａｎｔｓ配列アレルが生じた。以下の表１～表２の中で、％インデルに関して報告される頻度は、インデルであると決定された全てのシーケンシングアレルの全ての頻度の合計である。％精度に関して報告される頻度は、単一の高精度挿入シーケンシングアレルの頻度である。両方の頻度とも、分母は、参照アンプリコンに対してアラインメントした全てのリードの合計である。

【0402】

平均測定値の結果を以下の表１にまとめる。ＣａｓＳ（１）とＣａｓＳ（２）とは、（１）と比較して（２）では２倍に増やしたガイドＲＮＡを使用したことを除き、同様の処理であった。「ラムダＲＥＤ」は、３つ全てのＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及びＳＳＢ）を指す。ＳＤ＝標準偏差。

【0403】

【表9】

【0404】

３つ全てのＨＤＲ促進剤（即ち、ＳＳＢ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＡＰ）をトランスフェクトすると、ＣａｓＢ平滑末端ヌクレアーゼ実験及びＣａｓＳ付着末端切断型ヌクレアーゼの両方について、ＨＤＲ発生率が大幅に亢進した（約１０倍）。ベースラインは全３つのＨＤＲ促進剤の非存在下で測定し、このときゲノム編集の編集対象の僅か０．１～０．２２％にドナー鋳型（ＨＤＲ）が取り込まれたに過ぎなかった。表１に示されるとおり、ＨＤＲ促進剤を含まない試料をベースライン対照として供した。

【0405】

３つのＨＤＲ促進剤のうちのいずれか１つ又は２つを省くと、ＨＤＲ発生率は大きく下がったが、いずれの場合にも、ベースラインを上回ってなおも測定可能であった（表２）。

【0406】

【表10】

【0407】

標的編集部位に付着末端を有するＣａｓＳヌクレアーゼ媒介性編集では、標的編集部位に平滑末端を有するＣａｓＢヌクレアーゼ媒介性編集と比べると、高精度編集イベント（ＨＤＲ）が高い比率で生じた。従って、編集イベントは、ＣａｓＳヌクレアーゼ媒介性の約８０％及びＣａｓＢヌクレアーゼ媒介性の３０％が、ＮＨＥＪイベントではなく高精度ＨＤＲイベントであった。ＨＤＲ促進剤が存在することにより、ＮＨＥＪイベントの生成率は有意に低下した。

【0408】

実施例３．トウモロコシプロトプラストを用いたゲノム編集実験
本実施例は、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢ、及びＳＳＡＰの存在下及び非存在下でのトウモロコシプロトプラストにおける遺伝子編集について記載し、ここでは平滑末端切断型ＣＡＳヌクレアーゼが、ごく近接した２つの二本鎖切断を誘導して、挿入よりむしろ配列置換を誘導する。

【0409】

トウモロコシＰＹＬ－Ｅ遺伝子のコード領域を１１０塩基対配列のＨＤＲ媒介性置換の標的とするＤＮＡドナー鋳型プラスミドを構築し、この置換は、２つのｇＲＮＡが標的とする２つのＰＡＭ部位の同義突然変異及び破壊を生じさせる７塩基編集及びアミノ酸変化を生じさせる１塩基編集を導入するものである。環状ＤＮＡドナープラスミドは、両側に約５００ｂｐ長の相同アームが隣接する所望の修飾を有する置換鋳型（８塩基修飾を有する１１０塩基対長領域）を含む。相同アームは、２つのｇＲＮＡ標的部位に隣接するｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）領域に一致する（即ち、それと相同である）。ドナーＤＮＡを含む置換鋳型領域には、いずれの側にも、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって認識される２つの標的ｇＤＮＡ配列のうちの一方と同一のＤＮＡ配列が隣接する。

【0410】

トウモロコシプロトプラストを単離し、培養し、ＰＥＧ媒介性トランスフェクションに供する。トランスフェクトした材料は、それぞれ、配列番号１３５、配列番号１３４、及び配列番号１３３に示される、且つ２ｘ３５Ｓ、ＺｍＵＢＩ１、ＯｓＡＣＴ１プロモーター及び３５Ｓ、ＡｔＨＳＰ、エンドウ３Ａポリアデニル化部位に作動可能に連結されている、ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質を発現するプラスミドを含む。プラスミドはまた、上記に記載した、指示されるとおりの２つのｇＲＮＡ及びＣａｓポリヌクレオチドを発現するドナーＤＮＡ鋳型領域も有する。Ｃａｓポリヌクレオチドは核局在化シグナルに融合される。２つのｇＲＮＡの各々は、意図されるゲノムＤＮＡ標的及びドナープラスミドから置換鋳型を遊離させるため置換鋳型に一端で隣接する配列を、両方ともに二本鎖切断を入れる標的とする。実験は、エンドヌクレアーゼ認識配列の切断後に平滑末端が残る、本明細書においてＣａｓＢヌクレアーゼと称されるＣａｓヌクレアーゼで行われる。

【0411】

トランスフェクションに続いてプロトプラストを４８時間インキュベートした後、トランスフェクトした試料からｇＤＮＡを抽出し、導入された塩基修飾及び置換鋳型の相同アームに隣接するゲノム配列と相補的なプライマーで標的遺伝子座を増幅し、アンプリコンシーケンシングによって分析した。ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドのみをトランスフェクトした対照と比較して、ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質、ｇＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを発現するプラスミドをトランスフェクトしたプロトプラストでは、ＨＤＲが増加したレベルで観察される。

【0412】

実施例４．生物学的配列
本実施例では、本明細書において言及されるタンパク質及び核酸配列の非限定的な実施形態を提供する。生物学的配列及びその配列番号は表３に示す。

【0413】

【表11】

【0414】

【表12】

【0415】

【表13】

【0416】

【表14】

【0417】

【表15】

【0418】

【表16】

【0419】

【表17】

【0420】

【表18】

【0421】

【表19】

【0422】

【表20】

【0423】

【表21】

【0424】

【表22】

【0425】

【表23】

【0426】

【表24】

【0427】

【表25】

【0428】

【表26】

【0429】

【表27】

【0430】

【表28】

【0431】

【表29】

【0432】

【表30】

【0433】

【表31】

【0434】

【表32】

【0435】

【表33】

【0436】

実施例５．トマトプロトプラストにおけるゲノム編集
以下の実施例は、ＨＤＲ促進剤（即ち、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢタンパク質、及びＳＳＡＰ）の存在下及び非存在下でのＣａｓヌクレアーゼを使用したトマトプロトプラストにおける遺伝子編集を評価する実験について記載する。具体的には、鋳型ドナーＤＮＡ、ＨＤＲ促進剤、及びヌクレアーゼ試薬の形態及び送達方法が変わるとゲノム編集に効果が及ぶかを試験する実験を実施した。

【0437】

材料及び方法
実施例２に記載されるとおりトマトプロトプラストを単離し、培養し、トランスフェクトした。実施例２に記載されるとおり、アンプリコンシーケンシングを用いてゲノム編集を評価した。

【0438】

トランスフェクション用のプラスミドの設計
単一のベクターの一部として全ての構成要素を含むか（プラスミド、図３を参照）、又は構成要素をコトランスフェクション用の２つの異なるプラスミドに分けるか（図４～図５を参照）、いずれかのプラスミドを構築した。詳細には、第１のベクターがＣａｓＳヌクレアーゼ及びその対応するガイドＲＮＡをコードし、第２のベクターが３つ全てのＨＤＲ促進剤（即ち、ＳＳＢタンパク質、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＡＰ）をコードした。加えて、第１のベクター又は第２のベクターのいずれかに、エンドヌクレアーゼ認識配列が隣接するドナー鋳型が存在した。

【0439】

トマトＡｎｔ１遺伝子のプロモーター領域をＨＤＲによる４２塩基対異種配列の挿入及び３塩基対の欠失の標的とするためのＤＮＡドナー鋳型を構築した。

【0440】

線状化ドナーＤＮＡ
ドナー鋳型ＤＮＡは、線状二本鎖ＤＮＡ分子として加えるか、又は特異的ヌクレアーゼ認識配列が隣接する環状ベクターの一部として加えるかのいずれかとした。

【0441】

ＤＮＡ鋳型上のｇＲＮＡ認識部位の存在
ｇＲＮＡによって認識される切断部位がドナーＤＮＡ鋳型の隣に存在する効果について、それらの部位をトランスフェクションベクターから除くことにより試験した。

【0442】

結果
ＨＤＲ促進剤（即ち、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＢタンパク質、及びＳＳＡＰ）の存在下及び非存在下で、Ｃａｓヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡをコードする１つ又は２つのプラスミドベクターによってトマトプロトプラストを形質転換した（図３～図５を参照）。以下の表４Ａ～表４Ｃは、トマトプロトプラスト遺伝子編集実験からのデータの要約を提供する。

【0443】

２つのベクターの同時形質転換では、以下の表４Ａに示されるとおり、ＨＤＲに帰せられる高精度ゲノム編集の有意な増加、並びに非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に帰せられる挿入及び欠失（インデル）編集の減少が一貫して示された。ＨＤＲ促進剤（即ち、ＳＳＢ、エキソヌクレアーゼ、及びＳＳＡＰ）の存在下では、高精度インデル編集の比率が高かった（例えば約７０～８０％）。ドナー鋳型ＤＮＡとＣａｓヌクレアーゼとを別個のベクターで同時形質転換したとき（図４～図５）、ＨＤＲ促進剤の非存在下でドナー鋳型を含めると、ＮＨＥＪ編集が有意に減少したが、高精度編集が有意に促進されることはなかった。ドナー鋳型ＤＮＡとＣａｓヌクレアーゼとが単一のベクター上にあるとき（図３）、ＨＤＲ促進剤が存在することによってＮＨＥＪ編集は減少したが、程度は低かった。ドナー鋳型ＤＮＡに隣接するｇＲＮＡ認識切断部位を除くと、ＨＤＲ促進剤が存在しても、ＮＨＥＪ編集レベルは減少しなかった。異なるベクター上にある構成要素の同時形質転換によっては、ＨＤＲ効率が実施例２に記載される効率を上回って有意に向上することはなかった。

【0444】

【表34】

【0445】

線状鋳型ＤＮＡは、実施例２で使用したとおりの、特異的ヌクレアーゼ認識配列が隣接する環状ベクターと同程度に高精度（ＨＤＲ）編集を促進するのに有効で、インデル（ＮＨＥＪ）編集が減少した（表４Ｂ）。

【0446】

【表35】

【0447】

ＤＮＡ鋳型に隣接する切断部位の効果について、それらの部位をトランスフェクションベクターから除くことにより試験した。高精度編集の数及び割合は、ＨＤＲ促進剤を有しない陰性対照よりも多かったが、実施例２にあるとおりのＤＮＡ鋳型に隣接する切断部位を有する陽性対照と比べると少なかった（表４Ｃ）。同様に、インデル頻度は陰性対照よりも少なく、陽性対照よりもやや多かった。

【0448】

【表36】

【0449】

実施例６．トウモロコシにおけるＳＰＸのゲノム置換
以下の実施例は、ＨＤＲ促進剤（即ち、エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰ、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質）を使用したトウモロコシプロトプラストのＳＰＸ遺伝子座におけるｍｉＲＮＡ結合部位の編集について記載する。

【0450】

材料及び方法
プラスミドコンストラクトの設計
トウモロコシのＳＰＸ遺伝子座にあるｍｉＲＮＡ結合部位の周辺領域がＣａｓＳ媒介性切断の標的となり、それによってその部位の置換が媒介されるように、２つのｇＲＮＡを使用する。ＨＤＲ促進剤によって媒介されるＨＤＲ修復／編集の鋳型として、ドナーＤＮＡ断片を使用する。

【0451】

トウモロコシのＳＰＸ遺伝子座にあるｍｉＲＮＡ結合部位及びその隣接領域を、ｍｉＲＮＡ結合部位内に３塩基対毎にＳＮＰを含む断片で置き換えるためのプラスミドコンストラクトを設計する。加えて、２つのＰＡＭ部位を突然変異させるＳＮＰを導入して、それにより編集が起こった後に遺伝子座が切断されるのを防ぐ。ｍｉＲＮＡ結合部位に導入されるＳＮＰのうちの１つは、ｍｉＲＮＡ結合部位とＰＡＭ配列の一方との両方に対するＳＮＰとして働く。

【0452】

標的に特異的な２つのｇＲＮＡを伴うＣａｓＳヌクレアーゼ、ＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰ、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質）、並びに置換断片及び標的編集部位と相同の約７００塩基対相同アームを有するドナー鋳型を含むシステムを使用する。Ｃａｓ９及びＨＤＲ促進剤を発現するベクターは、実施例６に記載されるとおり設計した。これまでの実験では、約５００～７５０塩基対のアームが機能性であることが示されているため（実施例６を参照）、相同アームは約７００塩基対となるように設計した。加えて、相同アームのＧＣ含量もまた考慮して最大化しており、これは、理論によって拘束されることを望むものではないが、アニーリング及び高精度編集促進の助けとなり得る。２つのｇＲＮＡ標的配列の各々はまた、続くＨＤＲ促進剤の媒介による編集のためドナーがプラスミドから切断されて放出されるようにするため、ドナーの両末端にも存在した。単一のプラスミドが、編集に必要な全ての構成要素を発現した（図６を参照）。発現する各構成要素は、その専用のプロモーターによってドライブされた。

【0453】

トウモロコシ培養及びトランスフェクション、及びアンプリコンシーケンシング
各個別のプラスミドを別個の４レプリケートでトウモロコシプロトプラストにトランスフェクトする。細胞を４８時間インキュベートする。次にゲノムＤＮＡを抽出し、アンプリコンシーケンシングライブラリを調製する。上記の実施例２に記載されるとおり、アンプリコンシーケンシングデータから挿入及び欠失（インデル）頻度及び置換効率を定量化する。

【0454】

結果
ＨＤＲ促進剤の存在下又は非存在下で２つのｇＲＮＡによって標的化されるＣａｓＳヌクレアーゼを使用して、トウモロコシのＳＰＸ遺伝子座にあるｍｉＲＮＡ結合部位を編集する。本実験には、この実験試料に加えて、ベースライン対照並びに幾つかの他の対照を含める。表５に示されるとおり、ＣａｓＳと２つのｇＲＮＡ及びドナー、ＣａｓＳと２つのｇＲＮＡ、ＣａｓＳと個別のｇＲＮＡ、及びドナーのみをコードするベクターを対照として供した。

【0455】

【表37】

【0456】

高精度編集及びインデルをシーケンシングによって測定し、異なる試料間で比較する。

【0457】

実施例７．ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）におけるＨＤＲの亢進
以下の実施例は、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉におけるゲノム編集について記載する。詳細には、ＨＤＲ促進剤（即ち、エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰ、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質）の存在下又は非存在下でＧＦＰの突然変異体アレルによってベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）レポーター株のＧＦＰコード配列を修復することにより、インプランタで編集効率を測定する。

【0458】

材料及び方法
ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の培養及びトランスフェクション
ＧＦＰの機能喪失型アレルを有するベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の種子をカナマイシン選択培地（５０ｍｇ／ｍＬ）で２週間発芽させた後、土中に移し替え、Ｃｏｎｖｉｒｏｎグロースチャンバー（１２時間／１２時間／７５μｍｏｌ／ｍ^２ｓ^－１、昼：夜：光）で２週間成長させる。ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に、ＣａｓＳ及びＨＤＲ促進剤発現カセット、並びにＧＦＰ修復鋳型を有するドナー鋳型を含むＴ－ＤＮＡベクター（図７を参照）を発現するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＧＶ３１０１株）をシリンジで浸潤させる。次に遺伝子タイピング用に葉試料を採取して、ＰＣＲでレポータートランス遺伝子の存在を確認する。グロースチャンバーの蓋を閉めて植物を３日間インキュベートした後、判定及び回収する。処理した葉を組織培養に移し替え、組織培養から全植物を再生する。試料は全て、トリプリケートで試験する。

【0459】

ＧＦＰコード配列修復の評価
幾つもの方法のうちの１つを用いてＧＦＰコード配列の修復を評価する。浸潤から３日後の蛍光顕微鏡法を用いたＧＦＰシグナルの可視化により、標的とする挿入を含む葉細胞の比率及び数を定量化する。

【0460】

右側ゲノム／ドナー境界のアンプリコンシーケンシング（実施例２に記載されるとおり）を用いて浸潤後の葉内での標的挿入頻度を定量化して、全体の高精度編集効率を推定する。

【0461】

蛍光顕微鏡法を用いてＧＦＰシグナルを可視化することにより、再生した全植物を定性的に比較して、標的とする挿入の安定発現を確認する。

【0462】

再生した全植物内での標的挿入頻度を右側ゲノム／ドナー境界のサンガーシーケンシングによって定量化して、全体の高精度編集効率を推定する。

【0463】

結果
突然変異体ＧＦＰ遺伝子を遺伝子修飾するためのＣａｓＳシステムをＨＤＲ促進剤と共に及びそれ無しで発現するように、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉を形質転換する。以下の表６に、ベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に形質転換される構成要素の概要を提供する。「ラムダＲＥＤ」は、３つ全てのＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及びＳＳＢ）を指す。

【0464】

【表38】

【0465】

突然変異体ＧＦＰの修復を測定し、試料間で比較する。

【0466】

実施例８．トマト及びトウモロコシ分裂組織におけるＨＤＲの亢進
以下の実施例は、分裂植物組織でＨＤＲ促進剤によって媒介される遺伝子編集を試験する実験について記載する。詳細には、ＨＤＲ促進剤の存在下及び非存在下でＣａｓヌクレアーゼを使用してトマト子葉外植片を編集した。加えて、ＨＤＲ促進剤の存在下及び非存在下でＣａｓヌクレアーゼを使用してトウモロコシ胚外植片を編集する。

【0467】

トウモロコシ外植片の形質転換
材料及び方法
トウモロコシ形質転換用のプラスミドの設計
本実施例は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性トウモロコシ形質転換用の植物発現ベクターの構築について記載する。２つの植物遺伝子発現ベクターを調製した。バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号８）、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質（配列番号１）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ（配列番号３１）の発現用の植物発現カセットを構築した。エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢをコードするＤＮＡ配列に、配列番号１５のタバコｃ２核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするＤＮＡ配列を融合して、それぞれ、配列番号１３５、配列番号１３４、及び配列番号１３３に示される、ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供した。ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、ＯｓＵＢＩ１、ＳｌＵＢＩ１、ＯｓＡＣＴプロモーター及びエンドウ３Ａ、エンドウｒｂｃｓＥ９、ＮｔＥＸＴポリアデニル化部位に作動可能に連結して、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＡＰ、及びＳＳＢ植物発現カセットを提供した。

【0468】

トウモロコシｇｌｎ１－３遺伝子のプロモーター領域をＨＤＲによる３６塩基対異種配列の挿入の標的とするＤＮＡドナー配列を構築した。このＤＮＡドナー配列は、所望の挿入領域（３６塩基対長）の両側に約５００～６３５ｂｐ長の相同アームが隣接する置換鋳型を含む。これらの相同アームは、標的ｇＤＮＡ挿入部位に隣接するｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）領域とマッチする（即ち、それと相同である）。ドナーＤＮＡを含む置換鋳型領域には、いずれの側にも、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって認識されるｇｌｎ１－３遺伝子配列と同一のＤＮＡ配列が隣接する。

【0469】

ＲＮＡ誘導型配列特異的（ＣａｓＢ切断型）エンドヌクレアーゼの発現を提供する植物発現カセットを構築した。挿入部位に隣接する配列と相補的なガイドＲＮＡの発現を提供する植物発現カセットを構築した。ホスフィノトリシンＮ－アセチルトランスフェラーゼシンターゼ（ＰＡＴ）タンパク質の発現を提供するカセットを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）スーパーバイナリープラスミド形質転換ベクターを構築した。これらのカセット、ドナー配列及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）スーパーバイナリープラスミド形質転換ベクターを構築したところで、それらを組み合わせて２つのトウモロコシ形質転換プラスミドを作成した。

【0470】

ＰＡＴカセット、ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼカセット、ガイドＲＮＡカセット、及びｇｌｎ１－３ＤＮＡドナー配列をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）スーパーバイナリープラスミド形質転換ベクターに入れて、トウモロコシ形質転換プラスミドｐＩＮ１７５７を構築した（図８）。

【0471】

ＰＡＴカセット、ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼカセット、ガイドＲＮＡカセット、ＳＳＢカセット、ラムダベータＳＳＡＰカセット、Ｅｘｏカセット、及びｇｌｎ１－３ＤＮＡドナー配列をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）スーパーバイナリープラスミド形質転換ベクターに入れて、トウモロコシ形質転換プラスミドｐＩＮ１７５６を構築した（図８）。

【0472】

トウモロコシの形質転換
コンストラクトは全て、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４におけるスーパーバイナリーベクターから送達した。

【0473】

既発表の方法に基づき（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７；２，１６１４－１６２１）、トウモロコシ形質転換を実施した。簡潔に言えば、受粉後１０～１４日の表面を滅菌した穂から、約１．８～２．２ｍｍサイズの近交系ＧＩＢＥ０１０４由来の未熟胚を単離した。感染培地で作られたアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液に胚をＯＤ_６００＝１．０の濃度で入れた。使用時に、感染培地にアセトシリンゴン（２００μＭ）を加えた。胚及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を低速のロッカー式振盪機に１５分間置いた。次に胚を共培養培地プレートの表面に注ぎかけた。プレートを傾け、ピペットで全ての液体を抜き出すことにより、余分な液体培地を除去した。胚盤（ｓｃｕｔｅｌｕｍ）を上向きに保つため、必要に応じて胚を反転させた。共培養プレートを蓋付きの箱に入れ、２２℃の暗所で３日間培養した。次に胚を静止培地へと、胚盤を上向きに保ちながら移し替えた。胚は静止培地に２７～２８℃で７日間置いておく。カルスを生成した胚を、７．５ｍｇ／Ｌホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を含有する選択１培地に移し替え、更に７日間培養した。カルス化した胚を、１０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有する選択２培地に入れ、２７～２８℃で１４日間培養した。選択薬剤に抵抗性を示す成長中のカルスを１０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴ含有再生前培地に移し替え、シュートの生育を開始した。カルスは再生前培地に７日間置いておいた。シュートを発芽し始めたカルスを、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ中７．５ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有する再生培地に移し替え、２７～２８℃の明所下で培養した。インタクトな根を有するＰｈｙｔａｔｒａｙの上部に達したシュートをシュート伸長培地中に分離した後、土中に移植し、温室条件下に徐々に順化させた。

【0474】

結果
実験条件毎の外植片の数を、以下の表７Ａに提供する。再生したシュートを試料採取し、ｐＩＮ１７５７については１６個の胚（「イベント」）からの４５個の再生植物から、及びｐＩＮ１７５６については５３個の胚からの２０１個の再生植物から、ｇＤＮＡを抽出した。約８３５塩基対のアンプリコンを生成するように設計したプライマーを使用して、ｇＤＮＡからＺｍＧｌｎ１．３遺伝子座を増幅した；フォワードプライマーはエンドヌクレアーゼ切断部位から５’側に約１３０ｂｐであり、リバースプライマーは３’相同アームの外側であるため、内因性遺伝子座のみが増幅される。ビーズクリーンアップ後、次世代シーケンシングによってアンプリコンを分析した。

【0475】

表７Ａのインデル数及びＨＤＲ数の列に報告される数字は、標的配列に対して少なくとも５，０００個のマッピングされたリードを有し、且つアンプリコンと少なくとも５０％の完全アラインメントを有する試料に相当する。標的配列にマッピングされる少なくとも５，０００個のリード及びアンプリコンと少なくとも５０％の完全アラインメントを有する試料をフィルタリングした後、ＨＤＲ促進剤が存在しなかったとき１６イベント中０であったのと比較して、ＨＤＲ促進剤が存在したとき５３イベント（２０１個の植物）中２つの独立したイベント（５個の植物）に、標的とする挿入（３．７７％）があったと同定された。

【0476】

【表39】

【0477】

トマト外植片の形質転換
材料及び方法
トマト形質転換用のプラスミドの設計
バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号８）、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質（配列番号１）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ（配列番号３１）の発現用の植物発現カセットを構築した。エキソヌクレアーゼ、バクテリオファージラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢをコードするＤＮＡ配列に、配列番号１５のタバコｃ２核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするＤＮＡ配列を作動可能に連結して、それぞれ、配列番号１３５、配列番号１３４、及び配列番号１３３に示される、ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供した。ｃ２ ＮＬＳ－Ｅｘｏ、ｃ２ ＮＬＳラムダベータＳＳＡＰ、及びｃ２ＮＬＳ－ＳＳＢ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、２ｘ３５Ｓ、ＳｌＵＢＩ１０、ＰｃＵＢＩ４プロモーター及び３５Ｓ、ＡｔＨＳＰ、エンドウ３Ａポリアデニル化部位に作動可能に連結して、エキソヌクレアーゼ、ＳＳＡＰ、及びＳＳＢ植物発現カセットを提供した。

【0478】

加えて、トマトＡｎｔ１遺伝子（ＳｌＡｎｔ１）のプロモーター領域をＨＤＲによる４２塩基対異種配列の挿入の標的とするＤＮＡドナー配列を構築した。このＤＮＡドナー配列は、両側に相同アーム約６００～８００ｂｐ長が隣接する所望の挿入領域（４２塩基対長）を有する置換鋳型を含んだ。相同アームは、標的ｇＤＮＡ挿入部位に隣接する内因性ＤＮＡ領域にマッチした（即ち、それと相同であった）。ドナーＤＮＡを含む置換鋳型領域には、各端に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼによって認識される内因性標的編集部位配列と同一のＤＮＡ配列が隣接した。

【0479】

更に、ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼの発現を提供する植物発現カセットを構築した。挿入部位に隣接する配列と相補的なガイドＲＮＡの発現を提供する植物発現カセットを構築した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を提供する植物発現カセットを構築した。５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸（ＥＰＳＰＳ）シンターゼの発現を提供するカセットを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）バイナリープラスミド形質転換ベクターを構築した。

【0480】

カセット、ドナー配列及びアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換プラスミドベクターを構築したところで、それらを組み合わせて３つのトマト形質転換プラスミドを作成した。

【0481】

ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼカセット、ガイドＲＮＡカセット及びＧＦＰカセットをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換プラスミドベクターにクローニングして、トマト形質転換プラスミドｐＩＮ１７０３を構築した（図９Ｂ）。ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼカセット、ガイドＲＮＡカセット及びＡｎｔ１ ＤＮＡドナー配列をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換プラスミドベクターにクローニングして、トマト形質転換プラスミドｐＩＮ１７０４を構築した（図９Ｂ）。ＲＮＡ誘導型配列特異的エンドヌクレアーゼカセット、ガイドＲＮＡカセット、ＳＳＢカセット、ラムダベータＳＳＡＰカセット、エキソヌクレアーゼカセット及びＡｎｔ１ ＤＮＡドナー配列をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換プラスミドベクターにクローニングして、トマト形質転換プラスミドｐＩＮ１７０５を構築した（図９Ａ～図９Ｂ）。

【0482】

ベクターは全て、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＥＨＡ１０５を使用してトマトに送達した。

【0483】

トマト外植片の形質転換
上記に記載されるベクターを使用してトマト（栽培品種マネーメーカー（Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ））外植片を形質転換することにより、上述の構成要素を有する安定に形質転換されたトランスジェニックシュートを再生した。トマトの形質転換は、既発表の方法に基づき実施した（Ｖａｎ Ｅｃｋ Ｊ．，Ｋｅｅｎ Ｐ．，Ｔｊａｈｊａｄｉ Ｍ．（２０１９）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ．Ｉｎ：Ｋｕｍａｒ Ｓ．，Ｂａｒｏｎｅ Ｐ．，Ｓｍｉｔｈ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １８６４．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。簡潔に言えば、トマト種子を５０％の市販漂白剤で１０分間滅菌し、２分の１強度のＭＳＯ培地で発芽させた。本葉が出る前に子葉を切断して、葉の中央の３～５ｍｍ片を採取した。これらの葉をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で形質転換し、次に静止再生培地に２週間置いた。２週間後、選択薬剤としての２ｍｇ／Ｌグリホサートを補足した再生培地に外植片を移した。外植片は２週間毎に継代培養した。約６～７週間で、これらの外植片からシュートが再生し始めた。

【0484】

良好に伸長したシュートから試料を採取し、２ｍｇ／Ｌグリホサートを補足した発根培地にシュートを移した。小さいシュートについては、分子解析用に一塊のシュート全体を採取した（即ち、破壊的試料採取）。

【0485】

トマト外植片形質転換の評価
再生したシュートは、初めに、ヌクレアーゼ配列の存在を検出するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲアッセイによりトランス遺伝子陽性であることを同定した。更に、このｑＰＣＲアッセイを用いて、以下の表７Ｂに示されるとおり、トランス遺伝子挿入が低いコピー数（１～２つのコピー）で起こったか、それとも高いコピー数（２つより多いコピー）で起こったかを推定した。ＨＤＲ媒介性編集イベントのレベルを評価するため、既に確認済みのヌクレアーゼ配列陽性外植片から抽出した同じｇＤＮＡ源からＳｌＡｎｔ１遺伝子座を増幅し、次世代シーケンシングで分析した。

【0486】

結果
上記に記載されるとおり、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（ＣａｓＳ）、部位特異的切断用のガイドＲＮＡ及びＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢ）でシステムを設計した。組み込もうとする配列に標的ゲノム遺伝子座とマッチする相同アームが隣接することを特徴とするドナーＤＮＡ分子もまた含まれた。トランス遺伝子が挿入されるゲノム挿入部位からドナー分子が切り出されて放出され得るように、このドナーＤＮＡには、いずれの側にも、ガイドＲＮＡとマッチする切断部位が隣接した。このシステムが分裂植物組織のゲノムへの標的化した組込みを改善する有効性を試験するため、上記に記載される完全なシステムをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）でトマトの外植片に送達した。

【0487】

システムの有効性は、単にＣａｓＳヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、及びＤＮＡドナーだけで構成されるベースライン実験条件（図９ＢのｐＩＮ１７０４を参照）と比較した、ＨＤＲ促進剤システムによる高精度標的化組込み効率（図９Ａ）の比較によって測定した。高精度標的化組込み効率は、形質転換した外植片から再生したシュートのＤＮＡシーケンシングに基づき計算した。再生したシュートの総数に対する組み込まれたドナー配列を含むトマトシュートの割合を、コンストラクト毎に以下の表７Ｂに示す。試料採取した組織は、トマト形質転換システムの性質に起因して、遺伝的に均一というよりむしろキメラであり、シーケンシング結果は、個々の植物内での何らかの独立した編集の発生を反映した。表７Ｂでは、インデルは、ＳｌＡｎｔ１プロモーター内の標的位置におけるＮＨＥＪ型及びＨＤＲ型の両方の突然変異を指す。ＨＤＲ突然変異は、個々の試料からの３０％を超えるシーケンシングリードが高精度編集、即ち鋳型ＤＮＡの挿入であったとき、遺伝的である可能性が高いと見なした。高精度編集のレベルはトランス遺伝子コピー数と相関しなかった。遺伝的ＨＤＲ媒介性編集イベントの割合は、ＨＤＲ促進剤をコードするベクター（ｐＩＮ１７０５）で形質転換したシュートにおいて最も高かった。編集された植物の少数は、長いリードシーケンシングによって更に特徴付けられた。６個のｐＩＮ１７０４形質転換植物試料のうち１個のみに、何らかのスカーレス編集が検出された。１５個のｐＩＮ１７０５形質転換植物試料のうち１０個に、何らかのスカーレス編集が検出され、そのうち少なくとも４個は両アレル性の１００％スカーレス編集を有した。標的化した配列挿入の結果として、編集された植物は種々のアントシアニン蓄積レベルを示した。まとめると、ＨＤＲ促進剤をコードするベクターは、ＨＤＲ媒介性の高精度編集を有意に改善した。

【0488】

【表40】

【0489】

上記に記載されるとおりのトマト編集実験を繰り返した。結果を表７Ｃに示す。この場合もやはり、遺伝的ＨＤＲ媒介性編集イベントの割合は、ＨＤＲ促進剤をコードするベクター（ｐＩＮ１７０５）で形質転換したシュートで最も高かった；同じ傾向が観察された。

【0490】

【表41】

【0491】

実施例９．哺乳類細胞におけるＨＤＲの亢進
以下の実施例は、ＨＤＲ促進剤の存在又は非存在でのヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ－２９３）細胞における遺伝子座の高精度編集について記載する。ＦＲＴ部位及び最小ＡＡＶＳ１部位を、それぞれ、ＥＭＸ１及びＧＲＩＮ２ｂ遺伝子に挿入する。これらの遺伝子の特異的標的編集部位に標的化した挿入を誘導するため、編集機構を発現するプラスミドを細胞株にトランスフェクトする。

【0492】

材料及び方法
トランスフェクション用のプラスミドの設計
ＥＭＸ１又はＧＲＩＮ２ｂ標的遺伝子座に特異的なｇＲＮＡを伴うＣａｓＳヌクレアーゼ、ＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰ、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳＢタンパク質）、及び挿入配列と標的編集部位に相同の約７００塩基対の相同アームとを有するドナー鋳型をコードする単一のプラスミドを作成する。各構成要素は別個のプロモーターによってドライブされる。これらの遺伝子カセットは、初めに、モジュールＡ、Ｂ及びＣと呼ばれる３つの別個の中間プラスミドに合成し、次に、単一の発現プラスミドにアセンブルする。

【0493】

ＣａｓＳ及びＨＤＲ促進剤のアミノ酸配列は、ＨＤＲ促進剤用のＮＬＳを除いては、実施例１に記載されるとおりである。詳細には、ＨＤＲ促進剤は、アミノ酸リンカー（配列番号１４８、ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＧＳ）でＳＶ４０ ＮＬＳに融合される。コード配列は全て、ヒトでの発現用にコドン最適化される。図１０に示されるとおり、ＣａｓＢはＣＡＧプロモーター及びウサギβ－グロビンターミネーターの制御下にあり（ＣＡＧｐ－ＣａｓＳ－ｒｂ＿グロビン＿ｔ）、ｇＲＮＡはヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）Ｕ６プロモーターの制御下にあり（ＨｓＵ６ｐ－ｇＲＮＡ）、ＳＳＢタンパク質はヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＥＦ１ａプロモーター及びヒト成長ホルモンの制御下にあり（ｈＧＨ）ターミネーター（ＨｓＥＦ１ａｐ－ＳＳＢ－ｈＧＨｔ）、ＳＳＡＰは、ヒト（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）ＡＣＴＢプロモーター及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ターミネーターの制御下にあり（ＨｓＡＣＴＢ－β－ｂＧＨｔ）、及びエキソヌクレアーゼは、ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ターミネーターの制御下にある（ＣＭＶｐ－Ｅｘｏ－ＳＶ４０ｔ）。

【0494】

加えて、ドナーにはまた、ゲノム標的に存在するのと同じｇＲＮＡ標的配列が隣接し、従って送達されたプラスミドからドナーが放出されることにつながり、続いてＨＤＲ促進剤によって媒介される編集が起こる（図１０を参照）。

【0495】

以下の表８に示す試料毎に別個のプラスミドを構築する。

【0496】

ＨＥＫ－２９３細胞のトランスフェクション
プラスミドをＨＥＫ－２９３細胞にトランスフェクトする。各プラスミドにつき３つの別個のトランスフェクションをレプリケートとして供する。

【0497】

トランスフェクション後、細胞を４８～７２時間インキュベートし、その後、続くアンプリコンシーケンシングライブラリの調製用に、全ての試料からゲノムＤＮＡを抽出する。

【0498】

アンプリコンシーケンシング
挿入部位に直接隣接する配列にアニールするプライマー及びドナーに存在する相同性領域の外側のゲノム配列にアニールするプライマーで標的を増幅する（これによりプラスミドからのドナーの増幅を防ぐ）。次に挿入配列に隣接するプライマーから来るリードからのアンプリコンシーケンシングデータを用いて、標的遺伝子座における挿入効率を定量化する。

【0499】

ＨＤＲ促進剤の存在下又は非存在下でＨＥＫ－２９３細胞を編集する。詳細には、上記に記載されるプラスミドを使用して、ＥＭＸ１遺伝子座に３４塩基対ＦＲＴ部位を挿入し、ＧＲＩＮ２ｂ遺伝子座に３３塩基対最小ＡＡＶＳ１部位を挿入する。

【0500】

ＣａｓＳを含む試料に加えて、ＨＤＲ促進剤による試料の編集効率をベースライン対照と比較するため、表８に示されるとおり、３つ全てのＨＤＲ促進剤（「ラムダＲｅｄ」）、ｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡ、幾つかの対照を含める。「ラムダＲＥＤ」とは、３つ全てのＨＤＲ促進剤（エキソヌクレアーゼ、ラムダベータＳＳＡＰタンパク質、及びＳＳＢ）を指す。

【0501】

【表42】

【0502】

詳細には、ＣａｓＳとｇＲＮＡ及びドナー（ＨＤＲ促進剤のないベースライン対照）、ラムダＲｅｄ遺伝子及びドナー（ヌクレアーゼ媒介性の標的ＤＮＡ切断が重要であることを確認するため、ヌクレアーゼなし対照）、ドナーのみ、及びＣａｓＳとｇＲＮＡ（標的の効率的な切断が得られていることを確かめるための切断対照）を含む試料を個々に対照としてトランスフェクトする。ＣａｓＳとｇＲＮＡ及びドナーを含む試料は、ＨＤＲ促進剤を含む試料と比較されるベースライン試料である。加えて、トランスフェクションなし対照もまた評価する。

【0503】

本開示の広さ及び範囲は、上述の実施例のいずれによっても限定されてはならず、前出の実施形態、以下の特許請求の範囲、及びその均等物によってのみ定義されなければならない。

【0504】

参考文献
Ｂｅｒｎａｄ Ａ，Ｂｌａｎｃｏ Ｌ，Ｌａｚａｒｏ ＪＭ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇ，Ｓａｌａｓ Ｍ．Ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ３’－５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ．１９８９ Ｏｃｔ ６；５９（１）：２１９－２８．
Ｂｒｅｔｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．，Ｄ．Ｂｅｃｋｅｒ，ａｎｄ Ｈ．Ｌｏｅｒｚ．１９９７．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒ Ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｉｍｍａｔｕｒｅ Ｍａｉｚｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９４（６－７）：７３７－４８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１２２００５０４７３．
Ｃｚｅｒｍａｋ，Ｔｏｍａｓ，Ｓｈａｕｎ Ｊ．Ｃｕｒｔｉｎ，Ｊａｖｉｅｒ Ｇｉｌ－Ｈｕｍａｎｅｓ，Ｒａｄｉｍ Ｃｚｅｇａｎ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｙ．Ｋｏｎｏ，Ｅｖａ ＫｏｎｅＣｚｎａ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｊ．Ｂｅｌａｎｔｏ，ｅｔ ａｌ．２０１７．“Ａ Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｔｏ Ｅｎａｂｌｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ．”Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｏｎｌｉｎｅ ２９（６）：１１９６－１２１７．ｄｏｉ：１０．１１０５／ｔｐｃ．１６．００９２２．
Ｄｏｔｓｏｎ ＳＢ，Ｌａｎａｈａｎ ＭＢ，Ｓｍｉｔｈ ＡＧ，Ｋｉｓｈｏｒｅ ＧＭ．Ａ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃａｒｙｏｐｈｉｌｌｉ ＰＧ２９８２ ｉｓ ｕｓｅｆｕｌ ａｓ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９６ Ａｕｇ；１０（２）：３８３－９２．
Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｔａｖａｒｅ，Ｓ．，Ｄｏｅｂｌｅｙ，Ｊ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ａ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｒａｔｅ ｆｏｒ Ｍａｉｚｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｔ ａ Ｍａｊｏｒ Ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎ Ｌｏｃｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ２２，Ｉｓｓｕｅ １１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００５，Ｐａｇｅｓ ２３０４－２３１２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｉ２２８．
Ｄａｓｇｕｐｔａ Ｓ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＧＢ，Ｈｕｎｔ ＡＧ．Ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９８ Ｏｃｔ；１６（１）：１０７－１６．
Ｆｒａｍｅ，Ｂｒｏｎｗｙｎ，Ｍａｒｃｙ Ｍａｉｎ，Ｒｏｓｅｍａｒｉｅ Ｓｃｈｉｃｋ，ａｎｄ Ｋａｎ Ｗａｎｇ．２０１１．“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｉｚｅ Ｉｍｍａｔｕｒｅ Ｚｙｇｏｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ．”Ｍｅｔｈｏａｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）７１０：３２７－４１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－６１７３７－９８８－８＿２２．
Ｆｕ ＢＸＨ，Ｓｍｉｔｈ ＪＤ，Ｆｕｃｈｓ ＲＴ，Ｍａｂｕｃｈｉ Ｍ，Ｃｕｒｃｕｒｕ Ｊ，Ｒｏｂｂ ＧＢ，Ｆｉｒｅ ＡＺ．Ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｉｃｋａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ Ｃｐｆ１ ａｎｄ Ｃａｓ９．Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１９ Ｍａｙ；４（５）：８８８－８９７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５６４－０１９－０３８２－０．Ｍａｒ ４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：３０８３３７３３；ＰｕｂＭｅｄ Ｃｅｎｔｒａｌ ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ６５１２８７３．
Ｇａｏ，Ｃａｉｘｉａ，Ｊｉｎ－Ｌｏｎｇ Ｑｉｕ，Ｊｉｎｘｉｎｇ Ｌｉｕ，Ｋｕｎｌｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｙａｎｐｅｎｇ Ｗａｎｇ，Ｙｉ Ｚｈａｎｇ，Ｙｕａｎ Ｚｏｎｇ，ａｎｄ Ｚｈｅｎ Ｌｉａｎｇ．２０１６．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｗｈｅａｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７（Ａｕｇｕｓｔ）：１２６１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６１７．
Ｈａｌｐｉｎ Ｃ，Ｃｏｏｋｅ ＳＥ，Ｂａｒａｋａｔｅ Ａ，Ｅｌ Ａｍｒａｎｉ Ａ，Ｒｙａｎ ＭＤ．Ｓｅｌｆ－ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ２Ａ－ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ－－ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏ－ｏｒｄｉｎａｔｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９９ Ｆｅｂ；１７（４）：４５３－９．
Ｈａｍａｄａ，Ｈａｒｕｙａｓｕ，Ｙｕｅｌｉｎ Ｌｉｕ，Ｙｏｚｏ Ｎａｇｉｒａ，Ｒｙｕｊｉ Ｍｉｋｉ，Ｎａｏａｋｉ Ｔａｏｋａ，ａｎｄ Ｒｙｏｚｏ Ｉｍａｉ．２０１８．“Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ－Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－Ｂａｓｅｄ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｅｎａｂｌｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｗｈｅａｔ．”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８（１）：１４４２２．￥ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－３２７１４－６．
Ｈｏｎｉｇ，Ａｒｉｋ，Ｉｒａ Ｍａｒｔｏｎ，Ｍｉｃｈａｌ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｊ．Ｊｅｆｆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄｅｒｅｋ Ｊａｎｔｚ，Ａｍｉｒ Ｚｕｋｅｒ，ａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ．２０１５．“Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌｌｙ Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ Ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎ Ｐｌａｎｔａ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ ８（８）：１２９２－９４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１５．０４．００１．
Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．，Ｈｉｅｉ Ｙ．，Ｋｏｍａｒｉ Ｔ．２００７．Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２，１６１４－１６２１．
Ｉｙｅｒ ＬＭ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ａｒａｖｉｎｄ Ｌ．２００２．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＲｅｃＴ，Ｒｅｄｂｅｔａ，ＥＲＦ ａｎｄ ＲＡＤ５２．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３：８．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１６４－３－８．
Ｊｉａｎｇ Ｗ，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ，Ｃｏｘ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３－９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２５０８．
Ｊｉｎｅｋ Ｍ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ，Ｆｏｎｆａｒａ Ｉ，Ｈａｕｅｒ Ｍ，Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２ Ａｕｇ １７；３３７（６０９６）：８１６－２１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２２５８２９．
Ｋｉｍ Ｅ，Ｋｉｍ Ｓ，Ｋｉｍ ＤＨ，Ｃｈｏｉ ＢＳ，Ｃｈｏｉ ＩＹ，Ｋｉｍ ＪＳ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＤＮＡ－ｎｉｃｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１２ Ｊｕｌ；２２（７）：１３２７－３３．ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１３８７９２．１１２．
Ｋｉｒｉｅｎｋｏ ＤＲ，Ｌｕｏ Ａ，Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ ＡＷ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍａｉｚｅ ｌｅａｆ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ；１５９（４）：１３０９－１８．ｄｏｉ：１０．１１０４／ｐｐ．１１２．１９９７３７．
Ｋｏｓｕｇｉ Ｓ，Ｈａｓｅｂｅ Ｍ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｎ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ Ｈ，Ｍｉｙａｍｏｔｏ－Ｓａｔｏ Ｅ，Ｔｏｍｉｔａ Ｍ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．Ｓｉｘ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｏｖｅｓ ｏｆ ｉｍｐｏｒｔｉｎ ａｌｐｈａ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ ２；２８４（１）：４７８－８５．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８０７０１７２００．
Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２０１６．ＣｒｉｓｐＲＶａｒｉａｎｔｓ Ｃｈａｒｔｓ ｔｈｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：７０１－７０２．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３６２８．
Ｌｉｕ，Ｗｕｓｈｅｎｇ，Ｊｏｓｈｕａ Ｓ．Ｙｕａｎ，ａｎｄ Ｃ．Ｎｅａｌ Ｓｔｅｗａｒｔ．２０１３．“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４（１１）：７８１－９３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３５８３．
Ｌｏｎｇ Ｌ，Ｇｕｏ ＤＤ，Ｇａｏ Ｗ，Ｙａｎｇ ＷＷ，Ｈｏｕ ＬＰ，Ｍａ ＸＮ，Ｍｉａｏ ＹＣ，Ｂｏｔｅｌｌａ ＪＲ，Ｓｏｎｇ ＣＰ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ｂｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｇＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８ Ｏｃｔ ３；１４：８５．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３００７－０１８－０３５３－０．
Ｌｙｎｃｈ Ｍ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２０１０ Ａｕｇ；２６（８）：３４５－５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｇ．２０１０．０５．００３
Ｍａｒｔｉｎ－Ｏｒｔｉｇｏｓａ，Ｓｕｓａｎａ，ａｎｄ Ｋａｎ Ｗａｎｇ．２０１４．“Ｐｒｏｔｅｏｌｉｓｔｉｃｓ：Ａ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３（５）：７４３－５６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１２４８－０１４－９８０７－ｙ．
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．２０１６．λ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ ２０１６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｅｃｏｓａｌｐｌｕｓ．
Ｎａｇｌｅ Ｍ，Ｄｅｊａｒｄｉｎ Ａ，Ｐｉｌａｔｅ Ｇ，Ｓｔｒａｕｓｓ ＳＨ．Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔ Ｔｒｅｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．２０１８ Ｏｃｔ ２；９：１４４３．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１８．０１４４３．
Ｎｕｓｓａｕｍｅ，Ｌ．Ｖｉｎｃｅｎｔｚ，Ｍ．，ａｎｄ Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．１９９１．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．１（２）：２６７－２７４．
Ｎｕｃｃｉｏ Ｍ．，Ｃｈｅｎ Ｘ．，Ｃｏｎｖｉｌｌｅ Ｊ．，Ｚｈｏｕ Ａ．，Ｌｉｕ Ｘ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｉｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｄｅｓｉｇｎ．Ｉｎ：Ａｚｈａｋａｎａｎｄａｍ Ｋ．，Ｓｉｌｖｅｒｓｔｏｎｅ Ａ．，Ｄａｎｉｅｌｌ Ｈ．，Ｄａｖｅｙ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｉｎ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ Ｄ，Ｋａｒｔｊｅ ＺＪ，Ａｇｅｅｌｙ ＥＡ，Ｍａｌｅｋ－Ａｄａｍｉａｎ Ｅ，Ｈａｂｉｂｉａｎ Ｍ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ Ａ，Ｂａｒｋａｕ ＣＬ，Ｒｏｈｉｌｌａ ＫＪ，ＤｅＲｏｓｓｅｔｔ ＬＢ，Ｗｅｉｇｌｅ ＡＴ，Ｄａｍｈａ ＭＪ，Ｇａｇｎｏｎ ＫＴ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｆｏｒ Ｃａｓ９ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１９ Ｊａｎ ２５；４７（２）：５４６－５５８．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ１２１４．
Ｓｉｖａｍａｎｉ，Ｅ．，Ｎａｌａｐａｌｌｉ，Ｓ．，Ｐｒａｉｒｉｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（２０１９）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ１１０３３－０１９－０４７３７－３．
Ｓｃｈｉｎｄｅｌｅ Ｐ，Ｗｏｌｔｅｒ Ｆ，Ｐｕｃｈｔａ Ｈ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，Ｃａｓ１２ ａｎｄ Ｃａｓ１３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８ Ｊｕｎ；５９２（１２）：１９５４－１９６７．ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３－３４６８．１３０７３．
Ｓｃｈｌａｍａｎ，Ｈ．Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈｏｏｙｋａａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｊ．（１９９７）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｃｏｄＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（６）：１３７７－１３８５．
Ｓｏｄａ，Ｎｅｅｌａｍ，Ｌｏｋｅｓｈ Ｖｅｒｍａ，ａｎｄ Ｊｉｔｅｎｄｅｒ Ｇｉｒｉ．２０１７．“ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ｂａｓｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ，Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ．”Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｌａｐｈｙ．２０１７．１０．０２４．
Ｕｒｎｏｖ，Ｆｙｏｄｏｒ Ｄ．，Ｅｄｗａｒｄ Ｊ．Ｒｅｂａｒ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｈ．Ｓｔｅｖｅ Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ Ｐｈｉｌｉｐ Ｄ．Ｇｒｅｇｏｒｙ．２０１０．“Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１（９）：６３６－４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ２８４２．
Ｕｒｗｉｎ ＰＥ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ，Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＨＪ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｂｙ ｄｕａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｐｌａｎｔａ．１９９８ Ａｐｒ；２０４（４）：４７２－９．
Ｖａｎ Ｅｃｋ Ｊ．，Ｋｅｅｎ Ｐ．，Ｔｊａｈｊａｄｉ Ｍ．（２０１９）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ．Ｉｎ：Ｋｕｍａｒ Ｓ．，Ｂａｒｏｎｅ Ｐ．，Ｓｍｉｔｈ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １８６４．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．
Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ，Ｄｅｋｋｅｒｓ Ｇ，Ｒｉｓｐｅｎｓ Ｔ．ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ２０；５：５２０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．
Ｗａｎｇ Ｋ，Ｆｒｅｄｅｎｓ Ｊ，Ｂｒｕｎｎｅｒ ＳＦ，Ｋｉｍ ＳＨ，Ｃｈｉａ Ｔ，Ｃｈｉｎ ＪＷ．Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｃｏｄｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｎｏｖ ３；５３９（７６２７）：５９－６４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０１２４．
Ｗａｎｇ，Ｋａｎ，ａｎｄ Ｂｒｏｎｗｙｎ Ｆｒａｍｅ．２００９．“Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ Ｇｕｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍａｉｚｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）５２６：２９－４５．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－５９７４５－４９４－０＿３．
Ｗａｎｇ，Ｗｅｉ，Ｑｉａｎｌｉ Ｐａｎ，Ｆｅｉ Ｈｅ，Ａｌｉｎａ Ａｋｈｕｎｏｖａ，Ｓｈｉａｏｍａｎ Ｃｈａｏ，Ｈａｒｏｌｄ Ｔｒｉｃｋ，ａｎｄ Ｅｄｕａｒｄ Ａｋｈｕｎｏｖ．２０１８．“Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄ Ｗｈｅａｔ．”Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ １（１）：６５－７４．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１７．００１０．
Ｗｕ Ｙ，Ｇａｏ Ｔ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｈｕ Ｙ，Ｈｕ Ｘ，Ｈｕ Ｚ，Ｐａｎｇ Ｊ，Ｌｉ Ｚ，Ｘｕｅ Ｊ，Ｆｅｎｇ Ｍ，Ｗｕ Ｌ，Ｌｉａｎｇ Ｄ．ＴＡＬＥ ｎｉｃｋａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉ－ｃｏｐｙ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｌｏｃｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４ Ｍａｒ ２８；４４６（１）：２６１－６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｒｃ．２０１４．０２．０９９．
Ｙａｍａｎｏ Ｔ，Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ Ｈ，Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｈｉｒａｎｏ Ｈ，Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ＩＭ，Ｌｉ Ｙ，Ｆｅｄｏｒｏｖａ Ｉ，Ｎａｋａｎｅ Ｔ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｉｓｈｉｔａｎｉ Ｒ，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｎｕｒｅｋｉ Ｏ．Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｍａｙ ５；１６５（４）：９４９－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０４．００３．
Ｙａｎ ＷＸ，Ｈｕｎｎｅｗｅｌｌ Ｐ，Ａｌｆｏｎｓｅ ＬＥ，Ｃａｒｔｅ ＪＭ，Ｋｅｓｔｏｎ－Ｓｍｉｔｈ Ｅ，Ｓｏｔｈｉｓｅｌｖａｍ Ｓ，Ｇａｒｒｉｔｙ ＡＪ，Ｃｈｏｎｇ Ｓ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ，Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｃｈｅｎｇ ＤＲ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｖｅｒｓｅ ｔｙｐｅ Ｖ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１９ Ｊａｎ ４；３６３（６４２２）：８８－９１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１．
Ｙｉｎ Ｈ，Ｓｏｎｇ ＣＱ，Ｓｕｒｅｓｈ Ｓ，Ｗｕ Ｑ，Ｗａｌｓｈ Ｓ，Ｒｈｙｍ ＬＨ，Ｍｉｎｔｚｅｒ Ｅ，Ｂｏｌｕｋｂａｓｉ ＭＦ，Ｚｈｕ ＬＪ，Ｋａｕｆｆｍａｎ Ｋ，Ｍｏｕ Ｈ，Ｏｂｅｒｈｏｌｚｅｒ Ａ，Ｄｉｎｇ Ｊ，Ｋｗａｎ ＳＹ，Ｂｏｇｏｒａｄ ＲＬ，Ｚａｔｓｅｐｉｎ Ｔ，Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ Ｖ，Ｗｏｌｆｅ ＳＡ，Ｘｕｅ Ｗ，Ｌａｎｇｅｒ Ｒ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＤＧ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｅｎａｂｌｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｄｅｃ；３５（１２）：１１７９－１１８７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．４００５．
Ｚｈａｎｇ，Ｙｉ，Ｚｈｅｎ Ｌｉａｎｇ，Ｙｕａｎ Ｚｏｎｇ，Ｙａｎｐｅｎｇ Ｗａｎｇ，Ｊｉｎｘｉｎｇ Ｌｉｕ，Ｋｕｎｌｉｎｇ Ｃｈｅｎ，Ｊｉｎ－Ｌｏｎｇ Ｑｉｕ，ａｎｄ Ｃａｉｘｉａ Ｇａｏ．２０１６．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－Ｆｒｅｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｗｈｅａｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７（Ａｕｇｕｓｔ）：１２６１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１２６１７．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【配列表】

2022539338000001.app

【国際調査報告】