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特表2022-539351制御性Ｔ細胞をターゲットとして増殖させるための方法及び材料
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-08
(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞をターゲットとして増殖させるための方法及び材料
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220901BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220901BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20220901BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220901BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20220901BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20220901BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220901BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220901BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220901BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220901BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20220901BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220901BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220901BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220901BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20220901BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220901BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220901BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220901BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220901BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220901BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C07K14/55
C12N15/13
C12N15/26
C07K16/24
A61P3/10
A61P25/00
A61P37/06
A61P1/04
A61P17/06
A61P17/00
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P5/14
A61P1/16
A61P3/00
A61K48/00
A61K39/395 Y
A61K38/20
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021577021
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(85)【翻訳文提出日】2022-02-18
(86)【国際出願番号】 US2020039854
(87)【国際公開番号】W WO2020264318
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/867,012
(32)【優先日】2019-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501335771
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】ジェイミー スパングラー
(72)【発明者】
【氏名】デレク ヴァンダイク
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA41
4C084BA44
4C084CA53
4C084DA14
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA012
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZA961
4C084ZA962
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB151
4C084ZB152
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC351
4C084ZC352
4C085AA35
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA42
4H045DA04
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書は、制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）をターゲットとして増殖させるための方法及び材料に関する。例えば、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）ポリペプチド、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）ポリペプチド及び共通ガンマ鎖（γｃ）ポリペプチドを含むヘテロトリマー受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体）に結合することができる１種以上の一本鎖抗体／サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン）を、ほ乳類の免疫反応を低減又は消失させるためにほ乳類に投与して、ほ乳類のＴＲｅｇを刺激することができる。場合によっては、ほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類を処置するために使用され得る方法及び物質も、提供される。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを、免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリン重鎖と、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）ポリペプチド、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）ポリペプチド、及び共通ガンマ鎖（γｃ）ポリペプチドを含むポリペプチド複合体（ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体）に結合することができるＩＬ－２ポリペプチドと、
免疫グロブリン軽鎖と、
を含む、一本鎖免疫サイトカインであって、
前記ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項2】
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含む、請求項１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項3】
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む、請求項２に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項4】
前記免疫グロブリン重鎖が、γ型重鎖定常ドメインを含む、請求項２又は３に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項5】
前記γ型重鎖定常ドメインが、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項6】
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含む、請求項４又は５に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項7】
前記免疫グロブリン重鎖が、シグナル配列を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項8】
前記シグナル配列が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項9】
前記免疫グロブリン重鎖が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項10】
前記ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項11】
前記ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項12】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含む、請求項１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項13】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む、請求項１２に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項14】
前記免疫グロブリン軽鎖が、ラムダ（λ）型軽鎖定常ドメインを含む、請求項１２又は１３に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項15】
前記λ型軽鎖定常ドメインが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１４に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項16】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含む、請求項１４又は１５に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項17】
前記免疫グロブリン軽鎖が、シグナル配列を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項18】
前記シグナル配列が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項19】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項20】
前記ＩＬ－２ポリペプチドと、前記免疫グロブリン軽鎖とが、融合ポリペプチドである、請求項１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項21】
前記ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項22】
前記ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項23】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含む、請求項２０に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項24】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む、請求項２３に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項25】
前記免疫グロブリン軽鎖が、λ型軽鎖定常ドメインを含む、請求項２３又は２４に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項26】
前記λ型軽鎖定常ドメインが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項２５に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項27】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含む、請求項２５又は２６に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項28】
前記ＩＬ－２ポリペプチドと、前記免疫グロブリン軽鎖とが、リンカーを介して融合している、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項29】
前記リンカーが、１０～６０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである、請求項２８に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項30】
前記リンカーが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７である、請求項２９に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項31】
前記免疫グロブリン軽鎖が、シグナル配列を含む、請求項２０～３０のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項32】
前記シグナル配列が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項33】
前記免疫グロブリン軽鎖が、配列番号３、配列番号２４又は配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項34】
前記一本鎖免疫サイトカインが、約５分～約６か月の半減期を有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項35】
前記一本鎖免疫サイトカインが、約１０ｎＭ ＫＤ～約１ｐＭ ＫＤのＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対するアフィニティを有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項36】
前記一本鎖免疫サイトカインが、約３００ｎＭ ＫＤ超のＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対するアフィニティを有する、請求項１～３３のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項37】
ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、請求項１～３６のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項38】
非ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合しない、請求項３７に記載の一本鎖免疫サイトカイン。
【請求項39】
請求項１～３８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカインをコードする核酸。
【請求項40】
前記免疫グロブリン重鎖をコードすることができる第１の核酸と、前記免疫グロブリン軽鎖に融合した前記ＩＬ－２ポリペプチドをコードすることができる第２の核酸とを含む、請求項３９に記載の核酸。
【請求項41】
請求項１～３８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物又は請求項３９又は４０に記載の核酸を含む組成物を、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与することを含む、自己免疫疾患を有するほ乳類を処置するための方法。
【請求項42】
前記ほ乳類が、ヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記自己免疫疾患が、１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、ギラン－バレー症候群、狼瘡、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、橋本甲状腺炎、セリアック病、アジソン病、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群及びグレーブス病からなる群より選択される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項44】
前記ほ乳類中に存在する自己抗体の数が減少する条件下において、１種以上の自己免疫疾患の処置を前記ほ乳類に施用することをさらに含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
請求項１～３８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物又は請求項３９又は４０に記載の核酸を含む組成物を、ほ乳類に投与することを含む、ほ乳類の制御性Ｔ細胞を刺激するための方法。
【請求項46】
前記ほ乳類が、ヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
請求項１～３８のいずれか一項に記載の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物又は請求項３９若しくは４０に記載の核酸を含む組成物を、移植片拒絶反応を有するほ乳類に投与することを含む、移植片拒絶反応を有するほ乳類を処置するための方法。
【請求項48】
前記ほ乳類が、ヒトである、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記移植片拒絶反応が、同種移植又は自家移植の拒絶反応を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項50】
エフェクターＴ細胞を実質的に活性化しない、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月２６日に出願された米国特許出願第６２／８６７，０１２号の利益を主張する。先願の開示は、本出願の開示の一部として考えられる（先願の開示は、参照により本出願の開示に組み込まれもする）。
本出願は、２０１９年６月２６日に出願された米国特許出願第６２／８６７，０１２号の利益を主張する。先願の開示は、本出願の開示の一部として考えられる（先願の開示は、参照により本出願の開示に組み込まれもする）。
【0002】
連邦政府による資金提供に関する記載
本発明は、アメリカ合衆国国防総省から第Ｗ８１ＸＷＨ－１８－１－０７３５番で助成を受けて、アメリカ合衆国連邦政府の支援によりなされた。アメリカ合衆国連邦政府は、本発明に対して一定の権利を留保する。
本発明は、アメリカ合衆国国防総省から第Ｗ８１ＸＷＨ－１８－１－０７３５番で助成を受けて、アメリカ合衆国連邦政府の支援によりなされた。アメリカ合衆国連邦政府は、本発明に対して一定の権利を留保する。
【0003】
１．技術分野
本明細書は、制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）をターゲットとして増殖させるための方法及び物質に関する。例えば、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）ポリペプチド、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）ポリペプチド及び共通ガンマ鎖（γｃ）ポリペプチドを含むヘテロトリマー受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体）に結合することができる１種以上のアミノ酸鎖（例えば、１種以上の一本鎖抗体／サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン））を含有する組成物を、ほ乳類の免疫反応（例えば、自己免疫反応）を低減又は消失させるためにほ乳類に投与して、ほ乳類のＴＲｅｇを刺激することができる。場合によっては、本明細書において提供される方法及び物質を使用して、ほ乳類の免疫反応（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応）の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類を処置することもできる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
本明細書は、制御性Ｔ細胞（ＴＲｅｇ）をターゲットとして増殖させるための方法及び物質に関する。例えば、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）ポリペプチド、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）ポリペプチド及び共通ガンマ鎖（γｃ）ポリペプチドを含むヘテロトリマー受容体（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体）に結合することができる１種以上のアミノ酸鎖（例えば、１種以上の一本鎖抗体／サイトカイン融合タンパク質（免疫サイトカイン））を含有する組成物を、ほ乳類の免疫反応（例えば、自己免疫反応）を低減又は消失させるためにほ乳類に投与して、ほ乳類のＴＲｅｇを刺激することができる。場合によっては、本明細書において提供される方法及び物質を使用して、ほ乳類の免疫反応（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応）の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類を処置することもできる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
【背景技術】
【0004】
２．背景技術
ＩＬ－２は、免疫細胞の分化、増殖、生存及び活性を巧みに協調させる、多機能サイトカインである。低用量のＩＬ－２による処置は、免疫エフェクター細胞（Ｅｆｆ）のポリクローナル増殖よりＴＲｅｇのポリクローナル増殖を優先的に刺激する（Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）；及びＬｉａｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３８（１）：１３～２５（２０１３））。前臨床研究及び臨床研究により、低用量ＩＬ－２は、ＴＲｅｇの増殖を促進できることが実証されている。しかしながら、ＩＬ－２は、Ｅｆｆ（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞）も増殖させることができ、これにより、望ましくないオフターゲット効果及び毒性を生じさせる（Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）；及びＫｌａｔｚｍａｎｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（５）：２８３～２９４（２０１５））。
ＩＬ－２は、免疫細胞の分化、増殖、生存及び活性を巧みに協調させる、多機能サイトカインである。低用量のＩＬ－２による処置は、免疫エフェクター細胞（Ｅｆｆ）のポリクローナル増殖よりＴＲｅｇのポリクローナル増殖を優先的に刺激する（Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）；及びＬｉａｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３８（１）：１３～２５（２０１３））。前臨床研究及び臨床研究により、低用量ＩＬ－２は、ＴＲｅｇの増殖を促進できることが実証されている。しかしながら、ＩＬ－２は、Ｅｆｆ（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞）も増殖させることができ、これにより、望ましくないオフターゲット効果及び毒性を生じさせる（Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）；及びＫｌａｔｚｍａｎｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（５）：２８３～２９４（２０１５））。
【0005】
ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及びγｃ鎖からなるアフィニティ（親和性）が高い（ＫＤ約１０ｐＭ）ヘテロトリマー受容体又はＩＬ－２Ｒβ及びγｃ鎖のみからなるアフィニティが中等度の（ＫＤ約１ｎＭ）ヘテロダイマー受容体によって、細胞シグナル伝達を活性化する。したがって、ＩＬ－２反応性は、ＩＬ－２Ｒαサブユニットによって決定されるが、ＩＬ－２Ｒαサブユニットは、ＴＲｅｇには高発現するが、ナイーブＥｆｆには事実上存在しないため、ＴＲｅｇは、ＩＬ－２より感度が１００倍高いものになる（例えば、Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～９０（２０１２）；Ｍａｌｅｋ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４５３７９（２００８）；及びＳｐａｎｇｌｅｒら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１３９～６７（２０１５）を参照されたい。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）
【非特許文献2】Ｌｉａｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３８（１）：１３～２５（２０１３）
【非特許文献3】Ｂｏｙｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（３）：１８０～１９０（２０１２）
【非特許文献4】Ｋｌａｔｚｍａｎｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（５）：２８３～２９４（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＩＬ－２の免疫抑制作用を識別し、選択的に調整する能力は、免疫療法の開発に変革をもたらす進歩であり、自己免疫疾患及び移植に関する医学においては重大な意味をもつ。
【発明を解決するための手段】
【0008】
本明細書は、ＴＲｅｇをターゲットとして増殖させるための方法及び物質を提供する。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインが、本明細書において提供される。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖（ＨＣ）、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）及び免疫グロブリン軽鎖（ＬＣ）を含んでもよい（例えば、含むように設計されていてもよい）。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインを製造及び使用するための方法も、本明細書において提供される。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、それを必要としているほ乳類（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類）に投与して、ほ乳類を処置することができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、（例えば、ほ乳類の自己免疫反応等の免疫反応を低減又は消失させるために）ほ乳類のＴＲｅｇを刺激することもできる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、移植片拒絶反応を有する又は移植片拒絶反応を発症するリスクがあるほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
【0009】
本明細書において実証されているように、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合するように遺伝子操作された一本鎖免疫サイトカインは、インビボでＴＲｅｇを特異的に刺激する（例えば、増殖させる）ことが可能であり、インビボで病原性自己免疫を抑制することができる。（例えば、Ｅｆｆではなく）免疫ＴＲｅｇを刺激する能力は、ほ乳類（例えば、ヒト）の病原性自己免疫及び／又は移植片拒絶反応を安全かつ選択的に低減又は消失させることができる、いまだ実現されたことがないユニークなターゲットサイトカイン療法をもたらすものであり、自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する若しくは移植片拒絶反応を発症するリスクがある、ほ乳類を処置するために使用され得る。
【0010】
一般に、本明細書の一態様は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む、一本鎖免疫サイトカインであって、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、一本鎖免疫サイトカインを特徴とする。免疫グロブリン重鎖は、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は、γ型重鎖定常ドメインを含んでもよい。γ型重鎖定常ドメインは、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し得る。免疫グロブリン重鎖は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列を含んでもよい。シグナル配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、ラムダ（λ）型軽鎖定常ドメインを含んでもよい。λ型軽鎖定常ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し得る。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含んでもよい。シグナル配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。ＩＬ－２ポリペプチドと、免疫グロブリン軽鎖とが、融合ポリペプチドであってもよい。ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、λ型軽鎖定常ドメインを含んでもよい。λ型軽鎖定常ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し得る。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。ＩＬ－２ポリペプチドと、免疫グロブリン軽鎖とが、リンカーを介して融合していてもよい。リンカーは、１０～６０個のアミノ酸を含み得るペプチドリンカーであってよい。リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７リンカーであってよい。免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含んでもよい。シグナル配列は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３、配列番号２４又は配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。一本鎖免疫サイトカインは、約５分間～約６か月の半減期を持つことができる。一本鎖免疫サイトカインは、約１０ｎＭ ＫＤ～約１ｐＭ ＫＤのＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対するアフィニティを有し得る。一本鎖免疫サイトカインは、約３００ｎＭ ＫＤ超のＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対するアフィニティを有し得る。場合によっては、一本鎖免疫サイトカインは、ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することもできる。場合によっては、一本鎖免疫サイトカインは、非ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合しない。
【0011】
別の態様において、本明細書は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む一本鎖免疫サイトカインをコードする核酸であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、核酸を特徴とする。核酸は、免疫グロブリン重鎖をコードすることができる第１の核酸と、免疫グロブリン軽鎖に融合したＩＬ－２ポリペプチドをコードすることができる第２の核酸とを含むことができる。
【0012】
別の態様において、本明細書は、自己免疫疾患を有するほ乳類を処置するための方法を特徴とする。本方法は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物；又は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む一本鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物を、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与することを含み、又はから本質的になることができる。ほ乳類は、ヒトであってもよい。自己免疫疾患は、１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、ギラン－バレー症候群、狼瘡、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、橋本甲状腺炎、セリアック病、アジソン病、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群又はグレーブス病であり得る。本方法は、ほ乳類中に存在する自己抗体の数が減少する条件下において、１種以上の自己免疫疾患の処置をほ乳類に施用することを含んでもよい。本方法は、エフェクターＴ細胞を実質的に活性化しない。
【0013】
別の態様において、本明細書は、ほ乳類の制御性Ｔ細胞を刺激するための方法を特徴とする。本方法は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物；又は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む一本鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物を、ほ乳類に投与することを含み、又はから本質的になることができる。ほ乳類は、ヒトであってもよい。本方法は、エフェクターＴ細胞を実質的に活性化しない。
【0014】
別の態様において、本明細書は、移植片拒絶反応を有するほ乳類を処置するための方法を特徴とする。本方法は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物；又は、（ａ） 免疫グロブリン重鎖；（ｂ） ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド；及び（ｃ） 免疫グロブリン軽鎖を含む一本鎖免疫サイトカインをコードする核酸を含む組成物であって、一本鎖免疫サイトカインが、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する、組成物を、移植片拒絶反応を有するほ乳類に投与することを含み、又はから本質的になることができる。ほ乳類は、ヒトであってもよい。移植片拒絶反応は、同種移植の拒絶反応であってもよいし、又は自家移植の拒絶反応であってもよい。本方法は、エフェクターＴ細胞を実質的に活性化しない。
【0015】
そうではないとの規定がない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語及び科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似する又は等価な方法及び物質を使用して、本発明を実施することも可能であるが、適切な方法及び物質については後述する。本明細書において言及されたすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考資料は、その全体を参照により組み込む。矛盾がある場合、規定を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法及び例は、説明用のものにすぎず、限定を加えるものとして意図されていない。
【0016】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び下記の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、これらの説明及び図面並びに特許請求の範囲から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＩＬ－２／Ｆ５１１１一本鎖融合タンパク質（免疫サイトカイン）の設計の概略図である。ヒトＩＬ－２は、Ｆ５１１１抗体軽鎖のＮ末端に融合している。
【図2】図２Ａは、組換えＦ５１１１抗体のＦＰＬＣトレース（左側のパネル）及びＦ５１１１免疫サイトカイン（ＩＣ）ＬＮ１５のＦＰＬＣトレース（右側のパネル）を示している、グラフである。ＬＮ１５は、ヒトＩＬ－２のＣ末端と、Ｆ５１１１抗体軽鎖のＮ末端との間にある１５個のアミノ酸からなるリンカーを指す。プールされた画分は、実線によって示されている。図２Ｂは、精製されたＦ５１１１抗体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及び還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。
【図3】Ｆ５１１１抗体が、マウスＩＬ－２サイトカインではなく、ヒトＩＬ－２サイトカインに結合することを示している、グラフである。フローサイトメトリーによって測定したときの、酵母表面上におけるヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２、実線）又はマウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２、点線）へのＦ５１１１抗体の結合が、示されている。
【図4】図４Ａは、フローサイトメトリーによって測定したときの、酵母表面ディスプレイしたｈＩＬ－２へのＦ５１１１抗体及びＩＣの結合を示している、グラフである。図４Ｂは、バイオレイヤー干渉法によって測定したときの、固定化ｈＩＬ－２への精製されたＦ５１１１抗体、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５の結合を示している、グラフである。無関係のタンパク質（モノクローナル抗体トラツズマブ）を、ネガティブコトロールとして使用した。
【図5】図５Ａは、固定化ＩＬ－２Ｒαに対する、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５のバイオレイヤー干渉法による結合滴定を示している、グラフである。無関係のタンパク質（モノクローナル抗体トラツズマブ）を、ネガティブコトロールとして使用した。図５Ｂは、固定化ＩＬ－２Ｒβに対する、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５のバイオレイヤー干渉法による結合滴定を示している、グラフである。無関係のタンパク質（モノクローナル抗体トラツズマブ）を、ネガティブコトロールとして使用した。
【図6】Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５がＩＬ－２Ｒα＋細胞を選択的に活性化することを示している、模式図及びグラフを含む、図である。フローサイトメトリーによって測定したときの、ＩＬ－２Ｒαを有するＹＴ－１ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（図６Ａ）又はＩＬ－２Ｒαを有さないＹＴ－１ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（図６Ｂ）上における、ＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体又はＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５に応じたＳＴＡＴ５活性化が、示されている。
【図7】Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５がＨＥＫ２９３細胞内で生成され、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製されたことを示している、図である。図７Ａは、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５のＳＥＣトレースを示している、グラフである。ピーク１（Ｐ１）及びピーク２（Ｐ２）は、より高次のオリゴマー型構造を含むが、ピーク３（Ｐ３）は、モノマー型Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５を含むことが予想されている。したがって、後続するすべての実験には、Ｐ３を使用しており、そうではないと指定されていない限り、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５は、プールされたＰ３画分を指す。図７Ｂは、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５のＳＥＣの比較を示している、グラフである。図７Ｃは非還元条件及び還元条件下における、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５ Ｐ３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の画像である。
【図8】ＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１ヒトＮＫ細胞及びＩＬ－２Ｒα－ＹＴ－１ヒトＮＫ細胞上における、様々なＩＬ－２による処置に応じたＳＴＡＴ５活性化を示している、図である。フローサイトメトリーによって測定したときの、ＩＬ－２Ｒαを有するＹＴ－１細胞（図８Ａ）又はＩＬ－２Ｒαを有さないＹＴ－１細胞（図８Ｂ）上における、ＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体又はＦ５１１１ ＩＣバリアントに応じたＳＴＡＴ５活性化が、示されている。
【図9】ｈＩＬ－２及びｈＩＬ－２受容体サブユニットへのｈＩＬ－２サイトカイン／受容体タンパク質、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣバリアントの結合を示している、図である。図９Ａは、バイオレイヤー干渉法によって測定したときの、固定化ｈＩＬ－２への精製されたＦ５１１１抗体、Ｆ５１１１／ｈＩＬ－２複合体及びＦ５１１１ ＩＣバリアントの結合を示している、グラフである。図９Ｂは、バイオレイヤー干渉法によって測定したときの、固定化ｈＩＬ－２Ｒαへの精製されたＦ５１１１抗体、Ｆ５１１１／ｈＩＬ－２複合体及びＦ５１１１ ＩＣバリアントの結合を示している、図である。図９Ｃは、バイオレイヤー干渉法によって測定したときの、固定化ｈＩＬ－２Ｒβへの精製されたＦ５１１１抗体、Ｆ５１１１／ｈＩＬ－２複合体及びＦ５１１１ ＩＣバリアントの結合を示している、図である。
【図10】全血から単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に属する異なる免疫細胞サブセット上における、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣバリアントに応じたＳＴＡＴ５活性化を示している、図である。図１０Ａは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞）上におけるＳＴＡＴ５活性化を示している、図であり、図１０Ｂは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉｇｈＦＯＸＰ３Ｈｉｇｈ細胞（ＴＲｅｇ細胞）上におけるＳＴＡＴ５活性化を示している、図であり、図１０Ｃは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＬｏｗＦＯＸＰ３Ｌｏｗ細胞（ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞）上におけるＳＴＡＴ５活性化を示している、図である。
【図11】シグナル配列（太字）、Ｆ５１１１ ＶＨ（斜体）及びヒトＩｇＧ１ ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３（太字かつ斜体）を含む例示的な組換え抗体重鎖（Ｆ５１１１抗体に対応する）の配列（配列番号１）を示している、図である。
【図12】シグナル配列（太字）、Ｆ５１１１ ＶＬ（斜体）及びλ型ＣＬ（太字かつ斜体）を含む例示的な組換え抗体軽鎖（Ｆ５１１１抗体に対応する）の配列（配列番号２）を示している、図である。
【図13】シグナル配列（太字）、ｈＩＬ－２（プレーンテキスト）、リンカー（下線）、Ｆ５１１１ ＶＬ（斜体）及びλ型ＣＬ（太字かつ斜体）を含む例示的な免疫サイトカイン軽鎖（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５に対応する）の配列（配列番号３）を示している、図である。
【図14】シグナル配列（太字）、ｈＩＬ－２（プレーンテキスト）、リンカー（下線）、Ｆ５１１１ ＶＬ（斜体）及びλ型ＣＬ（太字かつ斜体）を含む、例示的な免疫サイトカイン軽鎖（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５に対応する）の配列（配列番号２４）を示している、図である。
【図15】シグナル配列（太字）、ｈＩＬ－２（プレーンテキスト）、リンカー（下線）、Ｆ５１１１ ＶＬ（斜体）及びλ型ＣＬ（太字かつ斜体）を含む例示的な免疫サイトカイン軽鎖（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５に対応する）の配列（配列番号２５）を示している、図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本明細書は、ＴＲｅｇをターゲットとして増殖させるための方法及び物質を提供する。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインが、本明細書において提供される。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）及び免疫グロブリン軽鎖を含んでもよい（例えば、含むように設計されていてもよい）。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインを製造及び使用するための方法も、本明細書において提供される。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、それを必要としているほ乳類（例えば、ヒト）（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類）に投与して、ほ乳類を処置することができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、（例えば、ほ乳類の自己免疫反応等の免疫反応を低減又は消失させるために）ほ乳類に投与して、ほ乳類のＴＲｅｇを刺激することもできる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を、移植片拒絶反応を有する又は移植片拒絶反応を発症するリスクがあるほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
【0019】
本明細書において使用されているとき、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、抗体又はそのフラグメント（例えば、サイトカイン／抗体融合タンパク質）に融合した（例えば、遺伝子融合した）サイトカインを含む融合タンパク質である。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、抗サイトカイン抗体又はそのフラグメント（例えば、抗ＩＬ－２抗体又はそのフラグメント）に融合したサイトカインを含んでもよい。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、一本鎖免疫サイトカインの内部でサイトカインと抗体とが分子内結合するように抗体に融合した、サイトカインを含むこともできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、抗体の１つ以上の末端（例えば、抗体重鎖のＮ末端若しくはＣ末端、及び／又は、抗体軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端）に融合したサイトカインを含んでもよい。例えば、一本鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）及び免疫グロブリン軽鎖を含む（例えば、含むように設計された）アミノ酸鎖であってもよい。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、抗サイトカイン抗体の少なくとも一部（例えば、免疫グロブリン重鎖及び／又は免疫グロブリン軽鎖）に融合したサイトカインを含む融合ポリペプチドであってもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、免疫グロブリン軽鎖（例えば、抗サイトカイン抗体に由来の免疫グロブリン軽鎖）に融合した、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）に融合した、免疫グロブリン重鎖（例えば、抗サイトカイン抗体に由来の免疫グロブリン重鎖）を含む、融合ポリペプチドであってもよい。
【0020】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、任意の適切な供給源（例えば、ヒト又はマウス等の任意の適切なほ乳類）に由来のＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することもできる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）が、第１の種のほ乳類に由来のＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する場合、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、第２の種のほ乳類に由来のＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体と交差反応しない。例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）が、ヒトＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合する場合、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、非ヒト種（例えば、マウスＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体）に由来のＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体と交差反応しない。
【0021】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、任意の適切な免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切なアイソタイプ免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ免疫グロブリン、ＩｇＤ免疫グロブリン、ＩｇＥ免疫グロブリン、ＩｇＧ免疫グロブリン及びＩｇＭ免疫グロブリン）に由来のものであり得る。場合によっては、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ重鎖（例えば、ＩｇＧ１重鎖）であってもよい。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切なクラスの免疫グロブリン（例えば、γ、σ、α、μ及びε）に由来のものであり得る。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有することができる。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を有することができる。場合によっては、免疫グロブリン重鎖は、γ型重鎖、α型重鎖又はδ型重鎖等の３種の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する免疫グロブリンであってもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖は、μ型重鎖又はε型重鎖等の４種の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を有する免疫グロブリンであってもよい。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な免疫グロブリンに由来のものであり得る。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、同じ免疫グロブリンに由来のものであってもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、異なる免疫グロブリンに由来のものであってもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、天然の免疫グロブリンに由来のものであってもよい（例えば、天然の免疫グロブリンに由来し得る）。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、合成物であってもよい。重鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン重鎖定常ドメインが本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリンの例には、限定はないが、モノクローナル抗体Ｆ５１１１（本明細書では、「Ｆ５１１１」と呼ぶ。）重鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．４重鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．７重鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．８重鎖及びモノクローナル抗体Ｆ５１１１．２重鎖が挙げられる。場合によっては、重鎖可変ドメイン及び／又は重鎖定常ドメインが本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリンは、本明細書以外の場所で説明されているものであってもよい（例えば、Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（７）：１００５１０１４（２０１８）を参照されたい。）。免疫グロブリン重鎖は、任意の適切な配列（例えば、アミノ酸配列）を含むことができる。場合によっては、免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性（例えば、約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、配列番号５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約８％、約９９％又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列を含むこともできる。シグナル配列は、任意の適切なシグナル配列（例えば、配列番号６及び配列番号７）であり得る。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有する免疫グロブリン重鎖を含んでもよい。
【0022】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）中に使用され得る例示的な免疫グロブリン重鎖は、配列番号１に記載されている。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン重鎖は、シグナル配列、Ｆ５１１１抗体に由来の可変ドメイン、及び、ＩｇＧ１定常ドメインを含むことができる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及び配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン重鎖は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン重鎖は、アミノ酸配列に対する１つ以上の変更（例えば、配列番号１に対する１つ以上の変更）を有することもできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインのサイトカインアフィニティを改変する可能性がある。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインの受容体の競合を変化させる可能性がある。
【0023】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる任意の適切なＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を含んでもよい。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、任意の供給源に由来のものであり得る。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる天然のＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）であってもよい。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、合成物であってもよい。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、任意の適切な配列を有することができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、配列番号９に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性（例えば、約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を含んでもよい。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、アミノ酸配列に対する１つ以上の変更（例えば、配列番号９に対する１つ以上の変更）を有することもできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれるＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）のアミノ酸配列に対する変更により、一本鎖免疫サイトカインの分子内集合の乱れを軽減することもできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる重鎖のアミノ酸配列に対する変更により、一本鎖免疫サイトカインの活性（例えば、シグナル伝達活性）を高めることもできる。
【0024】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、任意の適切な免疫グロブリン軽鎖を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な種類の免疫グロブリン軽鎖（例えば、（κ）型軽鎖及びラムダ（λ）型軽鎖）に由来のものであり得る。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖は、λ型軽鎖（例えば、ヒトλ型軽鎖）であってもよい。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有することができる。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有することができる。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な免疫グロブリンに由来のものであり得る。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、同じ免疫グロブリンに由来のものであってもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、異なる免疫グロブリンに由来のものであってもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、天然の免疫グロブリンに由来のものであってもよい（例えば、天然の免疫グロブリンに由来し得る）。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、合成物であってもよい。軽鎖可変ドメイン及び／又は免疫グロブリン軽鎖定常ドメインが本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリンの例には、限定はないが、モノクローナル抗体Ｆ５１１１軽鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．４軽鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．７軽鎖、モノクローナル抗体Ｆ５１１１．８軽鎖及びモノクローナル抗体Ｆ５１１１．２軽鎖が挙げられる。場合によっては、軽鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖定常ドメインが本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリンは、本明細書以外の場所で説明されているものであってもよい（例えば、Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（７）：１００５～１０１４（２０１８）を参照されたい。）。免疫グロブリン軽鎖は、任意の適切な配列（例えば、アミノ酸配列）を含むことができる。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性（例えば、約８２％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性（例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９３％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列を含むこともできる。シグナル配列は、任意の適切なシグナル配列（例えば、配列番号７及び配列番号８）であり得る。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含んでもよい。
【0025】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）中に使用され得る例示的な免疫グロブリン軽鎖は、配列番号２に記載されている。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列、Ｆ５１１１抗体に由来の可変ドメイン、及び、λ型定常ドメイン（例えば、ヒトλ型定常ドメイン）を含むことができる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖は、アミノ酸配列に対する１つ以上の変更（例えば、配列番号２に対する１つ以上の変更）を有することもできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインのサイトカインアフィニティを改変する可能性がある。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインの受容体の競合を変化させる可能性がある。
【0026】
場合によっては、免疫グロブリン軽鎖は、本明細書に記載のＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を含んでもよい。免疫グロブリン軽鎖が、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を含む場合、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、免疫グロブリン軽鎖の内部の任意の適切な場所に存在することができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、免疫グロブリン軽鎖（例えば、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン）に融合することもできる。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）と、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとが融合ポリペプチドである場合、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）と、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとが、リンカーを介して融合していてもよい。リンカーは、任意の適切なリンカーであり得る。場合によっては、リンカーは、（例えば、分子内相互作用を可能にするために）柔軟であってもよい。場合によっては、リンカーは、ペプチドリンカーであってもよい。ペプチドリンカーは、任意の適切な数のアミノ酸を含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、約１０～約６０個のアミノ酸（例えば、約１０～約５０個のアミノ酸、約１０～約４０個のアミノ酸、約１０～約３０個のアミノ酸、約２０～約６０個のアミノ酸、約３０～約６０個のアミノ酸、約４０～約６０個のアミノ酸、約５０～約６０個のアミノ酸、約１５～約５５個のアミノ酸、約２０～約５０個のアミノ酸、約３０～約４０個のアミノ酸、約２０～約４０個のアミノ酸、約３０～約５０個のアミノ酸又は約４０～約６０個のアミノ酸）を含むことができる。ペプチドリンカーは、任意の適切なアミノ酸を含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、１個以上のグリシン（Ｇｌｙ）残基及び／又は１個以上のセリン（Ｓｅｒ）残基を含んでもよい。ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに融合させるために使用され得るリンカーの例には、限定はないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカー（配列番号１２）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー（配列番号１３）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー（配列番号１４）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカー（配列番号１５）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６リンカー（配列番号１６）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７リンカー（配列番号１７）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）８リンカー（配列番号１８）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９リンカー（配列番号１９）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０リンカー（配列番号２０）、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１１リンカー（配列番号２１）及び（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１２リンカー（配列番号２２）が挙げられる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するリンカーを介して免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに融合した、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を有する、免疫グロブリン軽鎖を含むことができる。場合によっては、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）は、アミノ酸配列に対する１つ以上の変更（例えば、配列番号１２に対する１つ以上の変更、配列番号１３に対する１つ以上の変更、配列番号１５に対する１つ以上の変更又は配列番号１７に対する１つ以上の変更）を有することができる。場合によっては、リンカーのアミノ酸配列に対する変更は、リンカーの長さ、電荷、構造及び／又は組成を変化させる可能性がある。
【0027】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）中に使用され得るＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）を含む例示的な免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３、配列番号２４及び配列番号２５に記載されている。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、シグナル配列と、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）と、リンカーと、Ｆ５１１１抗体に由来の可変ドメインと、λ型定常ドメイン（例えば、ヒトλ型定常ドメイン）とを含むことができる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、（ａ） 配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するシグナル配列、（ｂ） 配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するＩＬ－２ポリペプチド、（ｃ） 配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するリンカー、（ｄ） 配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する可変ドメイン、及び、（ｅ） 配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する定常ドメインを含んでもよい。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に使用され得る免疫グロブリン軽鎖は、配列番号３、配列番号２４又は配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。場合によっては、免疫グロブリン軽鎖は、アミノ酸配列に対する１つ以上の変更（例えば、配列番号３に対する１つ以上の変更、配列番号２４に対する１つ以上の変更又は配列番号２５に対する１つ以上の変更）を有することもできる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインのサイトカインアフィニティを改変する可能性がある。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインに含まれる軽鎖のアミノ酸配列に対する変更は、一本鎖免疫サイトカインの受容体の競合を変化させる可能性がある。
【0028】
場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、（例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に存在しないＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる分子に比較して）安定な分子であり得る。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、約５分～約６か月（例えば、約１５分～約６か月、約３０分～約６か月、約１時間～約６か月、約２４時間～約６か月、約３日～約６か月、約７日～約６か月、約１か月～約６か月、約３か月～約６か月、約５分～約３か月、約５分～約１か月、約５分～約２週間、約５分～約７日、約５分～約３日、約５分～約２４時間、約５分～約１２時間、約５分～約６０分、約３０分～約３日、約３日～約１週間、約１週間～約１か月又は約１か月～約３か月）の半減期（例えば、血清中半減期又は血漿中半減期等のインビボ半減期）を有することができる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、標準的な室温条件（例えば、約２５℃）において、約１日～約１か月間（例えば、約１日～約２週間、約１日～約１週間、約１日～約５日間、約４日～約１か月間、約１週間～約１か月間、約２週間～約１か月間、約３日～約２週間間、約２日～約５日間、約５日～約２週間又は約１週間～約３週間）の有効期間を有することができる。任意の適切な方法を使用して、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインの安定性を測定することができる。例えば、サーマルシフトアッセイ、タンパク質安定性曲線分析、サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は動的光散乱を用いて、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインの安定性を測定することができる。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、ＩＬ－２Ｒαポリペプチドとの間での（例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に存在しないＩＬ－２Ｒαポリペプチドに結合することができる分子に比較して）強化された相互作用を有し得る（例えば、ＩＬ－２Ｒαポリペプチドに対するより強い結合アフィニティ）。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、約１０ｎＭ ＫＤ～約１ｐＭ ＫＤのＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に対するアフィニティを有し得る。
【0029】
場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、（例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に存在しないＩＬ－２Ｒβポリペプチドに結合することができる分子に比較して）低減された又は消失したＩＬ－２Ｒβポリペプチドとの相互作用（例えば、ＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対するより弱い結合アフィニティ）を有することもできる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、約３００ｎＭ ＫＤ超のＩＬ－２Ｒβポリペプチドに対するアフィニティを有し得る。
【0030】
任意の適切な方法を用いて、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）と、ＩＬ－２Ｒβポリペプチド及び／又はＩＬ２Ｒαポリペプチドとの結合アフィニティを測定することができる。例えば、アフィニティ滴定による研究、表面プラズモン共鳴、等温滴定カロリメトリー及び／又はバイオレイヤー干渉法を用いて、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインと、ＩＬ－２Ｒβポリペプチド及び／又はＩＬ－２Ｒαポリペプチドとの結合アフィニティを測定することができる。
【0031】
場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、（例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン中に存在しないＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる分子に比較して）減少した数のＥｆｆを活性化することもできるし、又は、活性化するＥｆｆの数が０にすることもできる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインは、Ｅｆｆを実質的に活性化しない（例えば、検出可能なレベル及び／又は免疫反応を誘導するのに十分なレベルになるまでＥｆｆを活性化しない）。任意の適切な方法を用いて、Ｅｆｆの有無又は量を判定することができる。例えば、Ｅｆｆマーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫ１．１、ＮＫ１．２、ＣＤ４４及び／又はＣＤ６２Ｌ）用の免疫染色を使用して、Ｅｆｆの有無又は量を判定することができる。
【0032】
本明細書は、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を製造するための方法及び物質も提供する。例えば、本明細書は、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドをコードすることができる核酸（例えば、核酸ベクター）も提供する。場合によっては、核酸は、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る免疫グロブリン軽鎖をコードすることもできる。例えば、第１の核酸は、免疫グロブリン重鎖をコードすることができ、第２の核酸は、免疫グロブリン軽鎖に融合したＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）をコードすることができる。
【0033】
本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を生成するために使用され得るポリペプチドを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）をコードする核酸（例えば、核酸ベクター）は、任意の適切な核酸であってよい。核酸は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡコンストラクト）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又はこれらの組合せであり得る。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチドをコードする核酸は、ベクター（例えば、発現ベクター又はプラスミド）であってもよい。
【0034】
場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を生成するために使用され得るポリペプチドを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）をコードする核酸は、（例えば、アミノ酸鎖の発現を調節するために）１種以上の制御要素を含むこともできる。本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチドをコードする核酸に含まれ得る制御要素の例には、限定はないが、プロモーター（例えば、構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、組織／細胞特異的プロモーター、並びに、化学的に活性化される型のプロモーター及び光によって活性化される型のプロモーター等の誘導的プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ））及びエンハンサーが挙げられる。
【0035】
場合によっては、本明細書に記載の核酸によってコードされる１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）を使用して、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を生成することができる。例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）及び免疫グロブリン軽鎖を含む２個以上のポリペプチドは、集合して（例えば、自己集合して）本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）になることができる。場合によっては、第１の核酸によってコードされる免疫グロブリン重鎖と、第２の核酸によってコードされる免疫グロブリン軽鎖に融合したＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）とは、集合して（例えば、自己集合して）本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインになることもできる。免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）及び免疫グロブリン軽鎖を含む２個以上のポリペプチドが集合して本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインになる場合、これらの２個以上のポリペプチドは、インビボ又はインビトロで集合することができる。
【0036】
場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）、又は本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得るポリペプチドを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）をコードする核酸は、精製することもできる。「精製された」ポリペプチド又は核酸は、複数の成分からなる混合物中の主要な成分を構成する、例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９重量％以上を構成する、ポリペプチド又は核酸を指す。例えば、精製された一本鎖免疫サイトカインは、１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物の約３０重量％以上を構成することができる。ポリペプチドは、限定されるわけではないがアフィニティクロマトグラフィー及び免疫吸着アフィニティカラムを含む方法によって、精製することができる。例えば、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチドをコードする精製された核酸は、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のアミノ酸鎖を含有する組成物の約３０重量％以上を構成することができる。核酸は、限定されるわけではないがフェノール－クロロホルム抽出及びカラム精製（例えば、ミニカラム精製）を含む方法によって、精製することができる。
【0037】
それを必要としているほ乳類（例えば、ヒト）（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失よって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類）を処置するための方法及び物質も、本明細書において提供される。場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）、又は本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）をコードする核酸を含有する組成物は、自己免疫疾患を有するほ乳類を処置するために使用することもできる。例えば、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン、又は本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチドをコードする核酸を含有する組成物を、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）、又は、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができるＩＬ－２ポリペプチド（又はそのフラグメント）、及び／又は、免疫グロブリン軽鎖）をコードする核酸を含有する組成物は、移植片拒絶反応を有するほ乳類を処置するために使用することもできる。例えば、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン、又は、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインを生成するために使用され得る１種以上のポリペプチドをコードする核酸を含有する組成物を、移植片拒絶反応を有するほ乳類に投与して、ほ乳類を処置することができる。
【0038】
自己免疫疾患を有する任意の適切なほ乳類は、本明細書に記載のようにして（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を投与することによって）処置することができる。本明細書に記載のようにして処置され得るほ乳類の例には、限定はないが、霊長類（例えば、ヒト及びサル）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス及びラットが挙げられる。例えば、自己免疫疾患を有するヒトは、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物によって処置することができる。
【0039】
本明細書に記載のようにして（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を投与することによって）自己免疫疾患を有するほ乳類を処置する場合、ほ乳類は、任意の種類の自己免疫疾患を有し得る。本明細書に記載のようにして処置され得る自己免疫疾患の例には、限定はないが、１型糖尿病、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、ギラン－バレー症候群、狼瘡、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、橋本甲状腺炎、セリアック病、アジソン病、自己免疫性肝炎、抗リン脂質抗体症候群及びグレーブス病が挙げられる。
【0040】
任意の適切な方法を用いて、ほ乳類（例えば、ヒト）を、自己免疫疾患を有するほ乳類であると特定することができる。例えば、臨床検査（例えば、抗核抗体検査（ＡＮＡ））、症状の分析、診察、ＭＲＩ及び／又はＣＴスキャンを用いて、自己免疫疾患を有するほ乳類（例えば、ヒト）を特定することができる。
【0041】
本明細書に記載のようにして（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を投与することによって）移植片拒絶反応を有する又は移植片拒絶反応を発症するリスクがあるほ乳類を処置する場合、ほ乳類は、任意の適切な臓器及び／又は組織の移植片を受け入れることができ、又は受け入れる準備ができている状態であってよい。本明細書に記載のようにして処置することができるほ乳類に移植され得る臓器及び組織の例には、限定はないが、皮膚、骨、血液、心臓、肝臓、腎臓、膵臓、腸、胃、精巣、陰茎、角膜、骨髄及び肺が挙げられる。移植は、同種移植であってもよいし、又は自家移植であってもよい。場合によっては、本明細書に記載の物質及び方法を使用して、移植片に関連付けられた合併症又は疾患（例えば、移植片対宿主病）を有するほ乳類を処置することもできる。
【0042】
任意の適切な方法を用いて、ほ乳類（例えば、ヒト）を、移植片拒絶反応を有するほ乳類であると特定することができる。例えば、臨床検査（例えば、ＡＮＡ）、症状の分析、診察、臓器生検及び／又はＣＴスキャンを用いて、移植片拒絶反応を有するほ乳類（例えば、ヒト）を特定することができる。
【0043】
自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する若しくは移植片拒絶反応を発症するリスクがあるものであると特定されたらすぐに、ほ乳類（例えば、ヒト）は、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物を投与されてもよいし、又は自己投与するように指示されてもよい。場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を使用して、ほ乳類（例えば、自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する、ほ乳類）中に存在する自己抗体の数を減少させることもできる。場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物を使用して、自己免疫疾患を有するほ乳類の１種以上の症状を低減又は消失させることもできる。
【0044】
場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応を処置するために使用される唯一の活性成分として、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与することもできる。
【0045】
場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）が、自己免疫疾患を有するほ乳類に投与される場合において、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインは、自己免疫疾患及び／又は１種以上のさらなる免疫抑制剤を処置するために使用される１種以上のさらなる処置との併用療法として投与することもできる。例えば、自己免疫疾患を処置するために使用される併用療法は、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインをほ乳類（例えば、ヒト）に投与することと、養子細胞（例えば、ＴＲｅｇ）移植、寛容原性ワクチン接種、免疫チェックポイントアゴニスト及び／又はステロイド投与等の１種以上の自己免疫疾患の処置をほ乳類（例えば、ヒト）に施用することとを含むこともできる。例えば、免疫反応を増進するために使用される併用療法は、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインと、シクロスポリン、ラパマイシン、メトトレキサート、アザチオプリン、クロラムブシル、レフルノミド及び／又はミコフェノール酸モフチル等の１種以上の免疫抑制剤とをほ乳類（例えば、ヒト）に投与することを含むことができる。
【0046】
場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を、移植片拒絶反応を有する又は移植片拒絶反応を発症するリスクがあるほ乳類に投与する場合において、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインは、移植片拒絶反応を処置するために採用される１種以上のさらなる処置との併用療法として、投与することもできる。例えば、移植片拒絶反応を処置するために使用される併用療法は、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインと、シクロスポリン、ラパマイシン、メトトレキサート、アザチオプリン、クロラムブシル、レフルノミド及び／又はミコフェノール酸モフチル等の１種以上のさらなる免疫抑制剤とをほ乳類（例えば、ヒト）に投与することを含むことができる。
【0047】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインが、１種以上のさらなる処置と組み合わせて使用される場合、１種以上のさらなる処置は、同時に又は独立に施用することができる。例えば、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを最初に投与し、１種以上のさらなる処置を２番目に施用することも可能であるし、又はこの投与及び施用を逆の順番にして行うことも可能である。
【0048】
場合によっては、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）は、それを必要としているほ乳類（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態を有するほ乳類）に投与するための組成物（例えば、薬学的に許容される組成物）に配合することができる。例えば、ある治療有効量の本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインは、１種以上の薬学的に許容されるキャリア（添加剤）及び／又は希釈剤と一緒にして配合されてもよい。医薬組成物は、投与のために、任意の適切な剤形にして製剤化することができる。剤形の例には、限定はないがガム剤、カプセル剤、錠剤（例えば、チュアブル錠及び腸溶錠）、坐剤、液剤、浣腸剤、懸濁剤、溶液（例えば、無菌溶液）、徐放性製剤、放出遅延製剤、丸剤、散剤及び顆粒剤を含む、固体形態又は液体形態が挙げられる。本明細書に記載の医薬組成物中に使用され得る薬学的に許容されるキャリア、充填剤及び溶媒には、限定はないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、ホスフェート等の緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物（ｐａｒｔｉａｌ ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｍｉｘｔｕｒｅ）、水、塩又は電解質、例えばプロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースをベースとする物質、ビタミンＥ ＴＰＧＳ等のポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー及び羊毛脂が挙げられる。
【0049】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物（例えば、医薬組成物）は、経口投与又は非経口投与（皮下投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、静脈内投与及び皮内投与を含む）のために設計され得る。経口投与される場合、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する医薬組成物は、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよい。非経口投与に適した組成物は、抗酸化剤と、バッファーと、静菌剤と、製剤を所期のレシピエントの血液に対して等張の状態にする溶質とを含有することができる水性及び非水性無菌注射液；並びに、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁液を含む。製剤は、ユニットドーズ型容器又はマルチドーズ型容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアルの中に入れられた状態で存在してもよく、使用直前に無菌液体キャリア、例えば注射用水を加えることのみ必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することもできる。用時調製の注射液（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び懸濁液は、無菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することもできる。
【0050】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物（例えば、医薬組成物）は、局所投与することもできるし、又は全身投与することもできる。例えば、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物は、経口投与又は注射によってほ乳類（例えば、ヒト）に全身投与することができる。
【0051】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）の有効用量は、自己免疫疾患の重症度、投与経路、対象の年齢及び総合的な健康状態、賦形剤の使用、他の作用物質の使用等の他の治療処置と併用する可能性、並びに／又は、治療医の判断に応じて変化し得る。
【0052】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物の有効量は、ほ乳類に対する有意な毒性を発生させることなくほ乳類（例えば、自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する若しくは移植片拒絶反応を発症するリスクがある、ほ乳類）を処置することができる、任意の量であり得る。本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインの有効量は、任意の適切な量であり得る。場合によっては、本明細書に記載の一本鎖免疫サイトカインの有効量は、ほ乳類（例えば、ヒト）の体重１ｋｇ当たり約０．０５ミリグラム（ｍｇ）～約５００ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ；例えば、体重に対して約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ又は約３００ｍｇ／ｋｇ～約４００ｍｇ／ｋｇ）であってもよい。有効量は、一定のままであってもよいし、又は、処置に対するほ乳類の反応に応じて変動する用量若しくは変更することができる用量であるように調整することもできる。様々な要因が、特定の用途のために使用される実際の有効量に影響し得る。例えば、投与頻度、処置継続期間、複数の処置用作用物質の使用、投与経路及び／又は状態（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態）の重症度により、投与される実際の有効量を増やし、又は減らすことが必要になることもある。
【0053】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃポリペプチド複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物の投与頻度は、ほ乳類に対する有意な毒性を発生させることなくほ乳類（例えば、自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する若しくは移植片拒絶反応を発症するリスクがある、ほ乳類）を処置することができる、任意の頻度であり得る。例えば、投与頻度は、概ね１日３回～概ね１週間に１回、概ね１日２回～概ね１週間に２回又は概ね１日１回～概ね１週間に２回であってよい。投与頻度は、一定のままであってもよいし、又は、処置継続期間中に変更することができるものであってもよい。本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物による処置の経過は、休薬期間を含み得る。例えば、本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカインを含有する組成物は、２週間の期間にわたって毎日投与し、続いて、２週間の休薬期間を置くことも可能であり、このようなレジメンが、複数回繰り返されてもよい。有効量の場合と同様に、様々な要因が、特定の用途のために採用される実際の投与頻度に影響し得る。例えば、有効量、処置継続期間、複数の処置用作用物質の使用、投与経路及び／又は状態（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態）の重症度により、投与頻度を増やし、又は減らすことが必要になることもある。
【0054】
本明細書に記載の１種以上の一本鎖免疫サイトカイン（例えば、ＩＬ－２Ｒα／ＩＬ－２Ｒβ／γｃ複合体に結合することができる一本鎖免疫サイトカイン）を含有する組成物を投与するための有効な期間は、ほ乳類に対する有意な毒性を発生させることなくほ乳類（例えば、自己免疫疾患を有し、及び／又は移植片拒絶反応を有する若しくは移植片拒絶反応を発症するリスクがある、ほ乳類）を処置する、任意の期間であり得る。例えば、有効な期間は、数日から数週間、数か月又は数年まで様々であり得る。場合によっては、ほ乳類の処置のための有効な期間は、約１か月～約１０年間の範囲の期間であり得る。場合によっては、ほ乳類の処置のための有効な期間は、（例えば、ほ乳類の寿命の期間にわたる）慢性処置であってもよい。複数の要因が、特定の処置のために採用される実際の有効な期間に影響し得る。例えば、有効な期間は、投与頻度、有効量、複数の処置用作用物質の使用、投与経路、及び／又は、処置される状態（例えば、自己免疫疾患及び／又は移植片拒絶反応等のほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある状態）の重症度に応じて変化し得る。
【0055】
場合によっては、ほ乳類に存在する自己免疫疾患、及び／又は、処置されている自己免疫疾患の１種以上の症状の重症度は、モニタリングすることができる。例えば、処置されているほ乳類中に存在する自己抗体の存在は、モニタリングすることができる。任意の適切な方法を用いて、ほ乳類中に存在する自己抗体レベルが低下するか否かを判定することができる。
【0056】
代替的には、本明細書に記載の方法及び物質は、ほ乳類の免疫反応の低減又は消失によって利益を受ける可能性がある別の状態を有するほ乳類（例えば、ヒト）を処置するために使用することもできる。
【0057】
以下の例においては、本発明をさらに説明するが、これにより、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することはない。
【実施例】
【0058】
物質及び方法
タンパク質の発現及び精製
公開されているＦ５１１１のＶＨ及びＶＬ配列（例えば、Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（７）：１００５１０１４（２０１８）を参照されたい。）を使用して、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）１ λ型アイソタイププラットフォーム（配列番号１及び配列番号２）により、組換え抗体を作製した。Ｆ５１１１抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を、ｇＷｉｚベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）内に別々にクローニングした。ＨＣ及びＬＣをコードするプラスミドの一過性コトランスフェクションによって、抗体をヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｆ細胞に組換え発現させた。小規模なコトランスフェクション試験において、ＨＣ及びＬＣプラスミドを滴定して、大規模な発現に最適な比を判定した。トランスフェクションから５日後に、分泌された抗体を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって細胞上清から精製し、続いて、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ。ｐＨ７．３の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＦＰＬＣ機器に搭載のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、純度（９９％超）を確認した。ＩＣ生成のために、ＩＬ－２サイトカインを、完全Ｆ５１１１抗体のＬＣのＮ末端に融合させたが、分子内相互作用を可能にするために、１５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５、配列番号３）、２５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５、配列番号２４）又は３５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５、配列番号２５）によって連結された状態にしておいた。別々のプラスミドを、Ｆ５１１１ ＨＣ及びｈＩＬ－２融合Ｆ５１１１ ＬＣをコードするｇＷｉｚベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）内に調製した。Ｆ５１１１抗体について説明したのと同じようにして、ＨＥＫ ２９３Ｆ細胞の一過性コトランスフェクションによってＩＣを発現させ、精製した。
タンパク質の発現及び精製
公開されているＦ５１１１のＶＨ及びＶＬ配列（例えば、Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．２４（７）：１００５１０１４（２０１８）を参照されたい。）を使用して、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）１ λ型アイソタイププラットフォーム（配列番号１及び配列番号２）により、組換え抗体を作製した。Ｆ５１１１抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を、ｇＷｉｚベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）内に別々にクローニングした。ＨＣ及びＬＣをコードするプラスミドの一過性コトランスフェクションによって、抗体をヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３Ｆ細胞に組換え発現させた。小規模なコトランスフェクション試験において、ＨＣ及びＬＣプラスミドを滴定して、大規模な発現に最適な比を判定した。トランスフェクションから５日後に、分泌された抗体を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって細胞上清から精製し、続いて、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ。ｐＨ７．３の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化したＦＰＬＣ機器に搭載のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、純度（９９％超）を確認した。ＩＣ生成のために、ＩＬ－２サイトカインを、完全Ｆ５１１１抗体のＬＣのＮ末端に融合させたが、分子内相互作用を可能にするために、１５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５、配列番号３）、２５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５、配列番号２４）又は３５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）７からなる柔軟なリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５、配列番号２５）によって連結された状態にしておいた。別々のプラスミドを、Ｆ５１１１ ＨＣ及びｈＩＬ－２融合Ｆ５１１１ ＬＣをコードするｇＷｉｚベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）内に調製した。Ｆ５１１１抗体について説明したのと同じようにして、ＨＥＫ ２９３Ｆ細胞の一過性コトランスフェクションによってＩＣを発現させ、精製した。
【0059】
完全ｈＩＬ－２サイトカイン（残基１～１３３）と、ｈＩＬ－２Ｒα（残基１～２１４）及びｈＩＬ－２Ｒβ（残基１～２１４）受容体サブユニットの細胞外ドメインとを、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを有するｇＷｉｚベクター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）にクローニングした。ＨＥＫについて説明したのと同じようにして、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによってタンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、続いて、ＨＢＳで平衡化したＦＰＬＣ機器に搭載のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、純度（９９％超）を確認した。
【0060】
ビオチン化ｈＩＬ－２Ｒα及びｈＩＬ－２Ｒβの発現のために、Ｃ末端ビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）（配列番号２３）を含有するタンパク質を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製した後、ｐＨ８．３の０．５ｍＭ ビシン、１００ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ酢酸マグネシウム及び５００ｍＭビオチン（Ｓｉｇｍａ）中で可溶性ＢｉｒＡリガーゼ酵素によってビオチン化した。ＨＢＳで平衡化したＦＰＬＣ機器に搭載のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、過剰なビオチンを除去した。
【0061】
細胞株
０．０１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を培養した。改変されていないＹＴ－１及びＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１ヒトナチュラルキラー細胞（例えば、Ｋｕｚｉｅｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（８）：３３５７～３３６５（１９９３）を参照されたい。）を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、最低限度の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及びペニシリン－ストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ］を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気下で３７℃に維持した。
０．０１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）中で、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を培養した。改変されていないＹＴ－１及びＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１ヒトナチュラルキラー細胞（例えば、Ｋｕｚｉｅｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（８）：３３５７～３３６５（１９９３）を参照されたい。）を、ＲＰＭＩ完全培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、最低限度の非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及びペニシリン－ストレプトマイシン［Ｇｉｂｃｏ］を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）中で培養し、５％ＣＯ２を含む加湿された雰囲気下で３７℃に維持した。
【0062】
酵母表面上における結合についての研究
酵母上における抗体結合を研究するために、ｈＩＬ－２（残基１～１３３）又はマウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２；残基１～１４９）をｐＣＴ３０２ベクターにクローニングし、本明細書以外の場所で説明されているようにして酵母の表面上で提示させた（例えば、Ｂｏｄｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５（６）：５５３～５５７（１９９７）を参照されたい。）。酵母ディスプレイしたヒト又はマウスＩＬ－２を、組換えＦ５１１１抗体ＥＣＤの希釈系列を含有するＰＢＳＡ中において室温で２時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＰＢＳＡ中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７と複合体化したストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ）の１：２００希釈物によって４℃で１５分間染色した。最後の洗浄後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、抗体結合について細胞を分析した。バックグラウンドを差し引いて正規化した結合曲線を、一次結合モデルに当てはめ、平衡解離定数（ＫＤ）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して判定した。研究を３回実施したが、同様の結果だった。
酵母上における抗体結合を研究するために、ｈＩＬ－２（残基１～１３３）又はマウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２；残基１～１４９）をｐＣＴ３０２ベクターにクローニングし、本明細書以外の場所で説明されているようにして酵母の表面上で提示させた（例えば、Ｂｏｄｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５（６）：５５３～５５７（１９９７）を参照されたい。）。酵母ディスプレイしたヒト又はマウスＩＬ－２を、組換えＦ５１１１抗体ＥＣＤの希釈系列を含有するＰＢＳＡ中において室温で２時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＰＢＳＡ中のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７と複合体化したストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ）の１：２００希釈物によって４℃で１５分間染色した。最後の洗浄後、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、抗体結合について細胞を分析した。バックグラウンドを差し引いて正規化した結合曲線を、一次結合モデルに当てはめ、平衡解離定数（ＫＤ）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して判定した。研究を３回実施したが、同様の結果だった。
【0063】
バイオレイヤー干渉法による結合についての研究。
ＩＬ－２と免疫サイトカインとを対比させたアフィニティ滴定による研究に関しては、分析のために、ビオチン化ヒトＩＬ－２サイトカイン又はＩＬ－２Ｒα若しくはＩＬ－２Ｒβ受容体鎖を、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）のストレプトアビジンコーティングされた先端に固定化した。シグナル単位（ｎｍ）が５未満の受容体は、物質移動の影響を最小化するために固定化した。９６ウェルプレートの中で、ｈＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体又は一本鎖ＩＬ－２／Ｆ５１１１ ＩＣコンストラクトの希釈系列に先端を３００秒間さらし、解離を６００秒間測定した。非特異的結合を差し引くために、無関係のタンパク質（ヒトモノクローナル抗体トラツズマブ）を参照用ウェルに入れた。すべての相互作用に関する表面の再生は、ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンに１５秒間さらすことによって実施した。実験は、ＰＢＳＡ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中において２５℃で実施された。データは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）データ分析ソフトウェアバージョン７．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して可視化及び処理した。すべての結合相互作用が一次であると仮定した上で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、平衡滴定曲線の当てはめ及びＫＤ値の判定を実施した。実験を２回再現したが、同様の結果だった。
ＩＬ－２と免疫サイトカインとを対比させたアフィニティ滴定による研究に関しては、分析のために、ビオチン化ヒトＩＬ－２サイトカイン又はＩＬ－２Ｒα若しくはＩＬ－２Ｒβ受容体鎖を、ＯＣＴＥＴ（登録商標）Ｒｅｄ９６バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）のストレプトアビジンコーティングされた先端に固定化した。シグナル単位（ｎｍ）が５未満の受容体は、物質移動の影響を最小化するために固定化した。９６ウェルプレートの中で、ｈＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体又は一本鎖ＩＬ－２／Ｆ５１１１ ＩＣコンストラクトの希釈系列に先端を３００秒間さらし、解離を６００秒間測定した。非特異的結合を差し引くために、無関係のタンパク質（ヒトモノクローナル抗体トラツズマブ）を参照用ウェルに入れた。すべての相互作用に関する表面の再生は、ｐＨ３．０の０．１Ｍグリシンに１５秒間さらすことによって実施した。実験は、ＰＢＳＡ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中において２５℃で実施された。データは、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）データ分析ソフトウェアバージョン７．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して可視化及び処理した。すべての結合相互作用が一次であると仮定した上で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、平衡滴定曲線の当てはめ及びＫＤ値の判定を実施した。実験を２回再現したが、同様の結果だった。
【0064】
ＹＴ－１細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化についての研究
約２×１０５個のＩＬ－２Ｒα－ＹＴ－１細胞又はＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、必要な処理の希釈系列を含有するＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。ｈＩＬ－２に対して１：１のモル比のＦ５１１１抗体を３７℃で１時間インキュベートすることによって、サイトカイン／抗体複合体を形成した。細胞を２０分間３７℃で刺激したらすぐに、１．５％になるまでホルムアルデヒドを加えることによって固定し、室温で１０分間インキュベートした。氷冷した１００％メタノールに４℃で３０分間再懸濁させることにより、細胞の透過処理を実施した。固定及び透過処理した細胞を、ＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）によって２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに希釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と複合体化した抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に室温で２時間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳバッファー中で細胞を２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに当てはめ、無刺激細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に対して正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して、半数効果濃度（ＥＣ５０）を計算した。実験は、トリプリケートで行われ、３回実施したが、同様の結果だった。
約２×１０５個のＩＬ－２Ｒα－ＹＴ－１細胞又はＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、必要な処理の希釈系列を含有するＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。ｈＩＬ－２に対して１：１のモル比のＦ５１１１抗体を３７℃で１時間インキュベートすることによって、サイトカイン／抗体複合体を形成した。細胞を２０分間３７℃で刺激したらすぐに、１．５％になるまでホルムアルデヒドを加えることによって固定し、室温で１０分間インキュベートした。氷冷した１００％メタノールに４℃で３０分間再懸濁させることにより、細胞の透過処理を実施した。固定及び透過処理した細胞を、ＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）によって２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに希釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７と複合体化した抗ＳＴＡＴ５ ｐＹ６９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と一緒に室温で２時間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳバッファー中で細胞を２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに当てはめ、無刺激細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に対して正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して、半数効果濃度（ＥＣ５０）を計算した。実験は、トリプリケートで行われ、３回実施したが、同様の結果だった。
【0065】
ヒトＰＢＭＣにおけるＳＴＡＴ５リン酸化についての研究。
製造業者のプロトコルに従ったＦｉｃｏｌｌグラジエントにより、健康なドナーの全血からヒトＰＢＭＣを単離し、次いで、赤血球の除去のためにＡＣＫ溶解バッファーと一緒にインキュベートした。約１×１０６個のヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、必要な処理の希釈系列を含有するＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。ｈＩＬ－２に対して１：１のモル比のＦ５１１１抗体を３７℃で１時間インキュベートすることによって、サイトカイン／抗体複合体を形成した。細胞は、３７℃で２０分間刺激したらすぐに、１×Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって固定し、４℃で５０分間インキュベートした。Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に－２０℃で終夜再懸濁させることにより、細胞の透過処理を実施した。固定及び透過処理した細胞を、ＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）によって２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに希釈された適切な抗ヒト抗体のパネル（ヒトＰＢＭＣ用の場合、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＦＯＸＰ３、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ１２７及び抗リン酸化ＳＴＡＴ５）と一緒に室温で２時間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳバッファー中で細胞を２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに当てはめ、無刺激細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に対して正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して、半数効果濃度（ＥＣ５０）を計算した。実験は、トリプリケートで行われ、２回実施したが、同様の結果だった。
製造業者のプロトコルに従ったＦｉｃｏｌｌグラジエントにより、健康なドナーの全血からヒトＰＢＭＣを単離し、次いで、赤血球の除去のためにＡＣＫ溶解バッファーと一緒にインキュベートした。約１×１０６個のヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、必要な処理の希釈系列を含有するＲＰＭＩ完全培地に再懸濁させた。ｈＩＬ－２に対して１：１のモル比のＦ５１１１抗体を３７℃で１時間インキュベートすることによって、サイトカイン／抗体複合体を形成した。細胞は、３７℃で２０分間刺激したらすぐに、１×Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加によって固定し、４℃で５０分間インキュベートした。Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に－２０℃で終夜再懸濁させることにより、細胞の透過処理を実施した。固定及び透過処理した細胞を、ＦＡＣＳバッファー（０．１％ＢＳＡ［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を含有するｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）によって２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに希釈された適切な抗ヒト抗体のパネル（ヒトＰＢＭＣ用の場合、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＦＯＸＰ３、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ１２７及び抗リン酸化ＳＴＡＴ５）と一緒に室温で２時間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳバッファー中で細胞を２回洗浄し、ＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によってＭＦＩを測定した。用量反応曲線をロジスティックモデルに当てはめ、無刺激細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を差し引き、最大シグナル強度に対して正規化した後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍデータ分析ソフトウェアを使用して、半数効果濃度（ＥＣ５０）を計算した。実験は、トリプリケートで行われ、２回実施したが、同様の結果だった。
【0066】
（実施例１）
ヒト制御性Ｔ細胞をターゲットとして増殖するための遺伝子操作されたサイトカイン／抗体融合体
Ｆ５１１１抗体と複合体化したヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の投与は、ヒト化マウスモデルにおいては、ヒト末梢血に由来のＴＲｅｇを増殖させるが、エフェクターＴ細胞は増殖させないことが判明したが、これにより、ターゲットサイトカイン療法を目指す上で大変興味深い可能性がもたらされている。ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体による処置は、マウスのＴ１Ｄの重症度を低下させることも、さらに示された（Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ。２４（７）：１００５～１０１４（２０１８））。この胸が躍るようなターゲットＩＬ－２療法には、極めて大きな臨床可能性があるが、サイトカインと抗体とが混合した複合体の治療目的での開発は、用量比に関する考慮事項と、複合体が不安定であることとにより、制限されている。実際、このような複合体の解離は、遊離サイトカインから危険な毒性を引き出す場合もあるし、可能性としては、自己反応性エフェクターＴ細胞を活性化することによって、自己免疫による発病を悪化させることもあり得る。さらに、遊離サイトカインは、血流から５分未満で消える（Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０（５）：２２０３～２２０８（１９８３））。
ヒト制御性Ｔ細胞をターゲットとして増殖するための遺伝子操作されたサイトカイン／抗体融合体
Ｆ５１１１抗体と複合体化したヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）の投与は、ヒト化マウスモデルにおいては、ヒト末梢血に由来のＴＲｅｇを増殖させるが、エフェクターＴ細胞は増殖させないことが判明したが、これにより、ターゲットサイトカイン療法を目指す上で大変興味深い可能性がもたらされている。ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体による処置は、マウスのＴ１Ｄの重症度を低下させることも、さらに示された（Ｔｒｏｔｔａら、Ｎａｔ Ｍｅｄ。２４（７）：１００５～１０１４（２０１８））。この胸が躍るようなターゲットＩＬ－２療法には、極めて大きな臨床可能性があるが、サイトカインと抗体とが混合した複合体の治療目的での開発は、用量比に関する考慮事項と、複合体が不安定であることとにより、制限されている。実際、このような複合体の解離は、遊離サイトカインから危険な毒性を引き出す場合もあるし、可能性としては、自己反応性エフェクターＴ細胞を活性化することによって、自己免疫による発病を悪化させることもあり得る。さらに、遊離サイトカインは、血流から５分未満で消える（Ｄｏｎｏｈｕｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０（５）：２２０３～２２０８（１９８３））。
【0067】
この実施例では、ＴＲｅｇを特異的に刺激して、病原性自己免疫を抑制する、臨床的に意義のある一本鎖融合タンパク質（免疫サイトカイン、ＩＣと呼ぶ）の設計及び遺伝子操作について説明する。このＩＣは、Ｆ５１１１抗体と、ほ乳類細胞のＩＬ－２とを含む。
【0068】
サイトカインの効力と、薬学的に好ましい抗体特性とを、目的とする単分子型のコンストラクトの中で組み合わせるために、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）を、サイトカインに対するバイアスのあるＦ５１１１抗体に融合させて、免疫サイトカイン（ＩＣ）を作製した（図１）。完全ｈＩＬ－２サイトカインを、完全長Ｆ５１１１ヒトＩｇＧ１ λ型抗体のＬＣの末端に融合させたが、１５個のアミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３からなる柔軟なリンカーによって連結された状態にしておいた。これは、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５と呼ぶ。迅速で小規模なＨＥＫ２９３Ｆ細胞トランスフェクションアッセイを用いて、免疫サイトカイン発現を最適化した。重鎖（ＨＣ）プラスミドＤＮＡと、ＩＬ－２融合軽鎖（ＬＣ）プラスミドＤＮＡとが所定の比になるように、６ウェルプレートの中で細胞をトランスフェクションした。３日間のインキュベーション後、分泌されたタンパク質を、プロテインＧ樹脂によって上清から捕集し、ｐＨ２．０の０．１Ｍグリシンによって溶出させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＨＣ：ＬＣ比の滴定により、最適な発現条件が明らかになった。免疫サイトカインの発現を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内でスケールアップし、分泌されたタンパク質を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。上記プロセスは、組換えＦ５１１１抗体の発現のためにも実施した。ＦＰＬＣ機器により、均一になるまでＦ５１１１抗体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５を精製し（図２Ａ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって純度（９９％超）を確認した（図２Ｂ）。目的ｈＩＬ－２サイトカインへの組換えＦ５１１１抗体の結合を確認するために、可溶性抗体を滴定して、酵母ディスプレイしたｈＩＬ－２又はｍＩＬ－２に結合させた。予想のとおり、抗体は、ｈＩＬ－２に結合したが、見かけの二価アフィニティは、ＫＤ＝４２０ｐＭだった。抗体は、ｍＩＬ－２と交差反応しなかった（図３）。
【0069】
（実施例２）
この実施例により、組換え発現一本鎖Ｆ５１１１ ＩＣが適切に集合し、ＩＬ－２Ｒβに結合しないことが実証される。
この実施例により、組換え発現一本鎖Ｆ５１１１ ＩＣが適切に集合し、ＩＬ－２Ｒβに結合しないことが実証される。
【0070】
ＩＣの内部において、ｈＩＬ－２がＦ５１１１抗体に分子内結合していることを実証するために、ｈＩＬ－２に対するＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５の結合アフィニティを測定し、組換えＦ５１１１抗体（Ａｂ）の結合アフィニティに対して比較した。フローサイトメトリーによって測定したときの、酵母表面ディスプレイしたｈＩＬ－２への精製されたＦ５１１１抗体及びＩＣの結合が、図４Ａに示されている。ビオチン化ｈＩＬ－２がストレプトアビジンコーティングされた先端に固定化されたＯＣＴＥＴ（登録商標）機器により、バイオレイヤー干渉法を用いて、結合アフィニティも評価した（図４Ｂ）。酵母表面による研究と、バイオレイヤー干渉法による研究とのいずれにおいても、Ｆ５１１１ Ａｂとの比較でＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５には結合アフィニティの有意な低下が観察されており、分子内でのサイトカイン／抗体の集合が確認された。バイオレイヤー干渉法ベースの結合の研究も実施して、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５と、ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体鎖との相互作用を評価し、これによって、一本鎖抗体／サイトカイン融合体が、ＩＬ－２Ｒβとの比較でＩＬ－２Ｒα（ＴＲｅｇ細胞においては高発現しているが、エフェクター細胞においては高発現していない）との結合に対してバイアスを有することを保証した。実際、生物物理的評価により、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５は、遊離ＩＬ－２サイトカインに等しい効力を伴ってＩＬ－２Ｒαに結合するが（図５Ａ）、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５は、遊離ＩＬ－２サイトカインに比べて有意に低下したＩＬ－２Ｒβに対する結合を示すことが示された（図５Ｂ）。これらのデータは、ＩＣの適切なフォールディング、分子内結合及び活性を裏付けている。
【0071】
（実施例３）
この実施例により、免疫サイトカインが、ＩＬ－２シグナル伝達に選択的にバイアスをかけることが実証される。
この実施例により、免疫サイトカインが、ＩＬ－２シグナル伝達に選択的にバイアスをかけることが実証される。
【0072】
ＩＬ－２は、核に移動して、転写プログラムを実施するものである、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）の活性化よってシグナル伝達する（例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７８（５）：２６２３～２６２９（２００７）；並びに、Ｂｒｏｍｂｅｒｇ，Ｊ．及びＷａｎｇ，Ｔ．Ｃ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、１５（２）：７９～８０（２００９）を参照されたい。）。ＩＣバリアントによってもたらされる免疫のバイアスをキャラクタリゼーションするために、ＩＬ－２Ｒαサブユニットを誘導発現するＹＴ－１ヒトＮＫ細胞株を利用した（例えば、Ｙｏｄｏｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４（３）：１６２３～１６３０（１９８５）を参照されたい。）。フローサイトメトリーベースの研究を実施して、ＴＲｅｇの活性化と免疫エフェクター細胞の活性化との対比の代用として誘導ありのＩＬ－２Ｒα＋ＹＴ－１細胞と誘導なしのＩＬ－２Ｒα－ＹＴ－１細胞とを対比させたときの、ＩＬ－２、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５によって誘起されたＳＴＡＴ５シグナル伝達を定量化した（図６）。何も結合していないＩＬ－２（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ ＩＬ－２）は、ＩＬ－２Ｒα＋細胞とＩＬ－２Ｒα－細胞との両方において、強度にシグナル伝達し、ＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体は、ＩＬ－２Ｒα＋細胞とＩＬ－２Ｒα－細胞との両方を完全に活性化した。対照的に、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５活性は、ＩＬ－２Ｒα＋細胞においてはわずかにしか低下しなかったが（図６Ａ）、ＩＬ－２Ｒα－細胞においては劇的に低下した（図６Ｂ）。
【0073】
上記結果は、Ｆ５１１１免疫サイトカインにより、ＩＬ－２活性が、免疫エフェクター細胞よりもＴＲｅｇ細胞の方に効果的にバイアスをかけられることと、このようなバイアスを、Ｆ５１１１免疫サイトカインが、ＩＬ－２とＦ５１１１とが混合した複合体より著しく効果的にかけることとを示している（図６）。
【0074】
（実施例４）
この実施例では、Ｆ５１１１免疫サイトカインの発現及び機能を最適化するための実験について説明する。
この実施例では、Ｆ５１１１免疫サイトカインの発現及び機能を最適化するための実験について説明する。
【0075】
先述のＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５は、ｈＩＬ－２のＣ末端と、Ｆ５１１１抗体の軽鎖のＮ末端との間に１５個のアミノ酸からなる柔軟なリンカーを含む。２５個のアミノ酸からなるリンカー（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５）及び３５個のアミノ酸リンカーからなる（Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５）を含むより長いリンカーによって、１５個のアミノ酸からなるリンカーを置きかえて、代替的なＦ５１１１ ＩＣコンストラクトを設計した。Ｆ５１１１重鎖及びＩＬ－２融合Ｆ５１１１軽鎖をコードするプラスミドの一過性コトランスフェクションにより、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５をＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で発現させた。プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーによって細胞上清からタンパク質を精製し、続いて、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）機器を用いたＳＥＣによって精製した。Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５とＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５との両方を対象とするＳＥＣ分析によって、３つのピーク（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３と標示されている）が観察されており、各ピークを分析用にプールした。Ｐ１及びＰ２は、ＳＥＣカラムからより早く溶出するため、より高次のオリゴマー型構造を含み、一方で、Ｐ３は、モノマー型Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５を表すことが予想された（図７Ａ）。Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５のＳＥＣトレースを、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５のＳＥＣトレースに対して比較した（図７Ｂ）。図７Ｂに見られるように、生成されたＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５の大部分は、オリゴマー化していたが、このことは、生成されたＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５の大部分が、ＳＥＣカラムからＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５のＰ１及びＰ２と同時に溶出したことによって実証されている。さらに、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５のＰ３は、抗体の分子量に近い体積で溶出しており、このことは、このピークが、モノマー型ＩＣからなることを示唆している。したがって、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５を用いたさらなる実験においては、評価のためにＰ３を使用しており、そうではないと指定されていない限り、以下で行われるＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５への言及はすべて、Ｐ３を意味する。Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５は、総じて、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５より少ないオリゴマーを含有していた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施して、純度を確認した（図７Ｃ）。
【0076】
Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５は、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５及びｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体より大きなバイアスを伴って、ＩＬ－２Ｒα－エフェクターＴ細胞（ＴＥｆｆ）様細胞よりもＩＬ－２Ｒα＋ＴＲｅｇ様細胞を選択的に活性化することが実証された。細胞シグナル伝達アッセイを、ＩＬ－２Ｒαが発現した又は発現していないＹＴ－１ヒトＮＫ細胞に実施した。図８Ａ及び図８Ｂは、フローサイトメトリーによって測定したときの、ＩＬ－２Ｒα＋細胞（図８Ａ）又はＩＬ－２Ｒα－細胞（図８Ｂ）上における、ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５又はＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５に応じたＳＴＡＴ５リン酸化を示している。Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５は、サブナノモルの濃度でＩＬ－２Ｒα＋細胞を活性化したが、ＩＬ－２Ｒα－細胞上におけるＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５の活性は、測定できないほどに弱く、このことは、ＩＬ－２Ｒαを発現したＴＲｅｇ様細胞に対するこれらのＩＣのバイアスを実証している。
【0077】
実験を実施して、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５コンストラクトの内部において、ｈＩＬ－２が抗体に分子内結合していることと、ＩＬ－２Ｒβ結合部位を完全に遮断して、高レベルのＩＬ－２Ｒαを発現させた細胞との相互作用を増進することにより、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５が、ｈＩＬ－２をＴＲｅｇ細胞に選択的に誘導することとを実証した。ビオチン化ｈＩＬ－２がストレプトアビジンコーティングされた先端に固定化されたＯｃｔｅｔ（登録商標）機器により、バイオレイヤー干渉法を用いて、ＩＬ－２と、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５との結合相互作用を評価した（図９Ａ）。さらに、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）機器により、バイオレイヤー干渉法を用いて、ビオチン化ｈＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβを、ストレプトアビジンコーティングされた先端に固定化することによって、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５と、ヒトＩＬ－２Ｒα（ｈＩＬ－２Ｒα）及びｈＩＬ－２Ｒβサブユニットとの結合相互作用も測定した。図９Ｂに示されているように、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５と、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５とは、遊離ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５に比較すれば、ｈＩＬ－２Ｒαに対する結合アフィニティが類似していた。対照的に、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５と、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５とは、遊離ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５に比較すれば、ｈＩＬ－２Ｒβへの結合アフィニティが有意に低下しており、これにより、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ２５及びＦ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５の分子のバイアスが、Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ１５及びｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体との比較で改善されていることもさらに示されている（図９Ｃ）。
【0078】
免疫サイトカイン活性についても、健康なドナーの全血から単離されたヒトＰＢＭＣで調査した。ＳＴＡＴ５リン酸化を測定して、３つの細胞集団：ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞）（図１０Ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＨｉｇｈＦＯＸＰ３Ｈｉｇｈ細胞（ＴＲｅｇ細胞）（図１０Ｂ）及びＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ＬｏｗＦＯＸＰ３Ｌｏｗ細胞（ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞）（図１０Ｃ）の活性化を定量化した。Ｆ５１１１ ＩＣ ＬＮ３５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋エフェクターＴ細胞との両方より有意に強力なＴＲｅｇ細胞の活性化を実証した。対照的に、ｈＩＬ－２／Ｆ５１１１複合体による処置は、遊離ｈＩＬ－２との比較で、Ｔ細胞サブセットにおけるバイアスを示さなかった。
【0079】
サマリー
上記結果により、ＩＬ－２／Ｆ５１１１免疫サイトカインは、ＴＲｅｇを選択的に増殖させることが可能であり、したがって、患者の病原性自己免疫を直接抑制し、移植片拒絶反応を軽減するために使用できることが実証されている。
上記結果により、ＩＬ－２／Ｆ５１１１免疫サイトカインは、ＴＲｅｇを選択的に増殖させることが可能であり、したがって、患者の病原性自己免疫を直接抑制し、移植片拒絶反応を軽減するために使用できることが実証されている。
【0080】
その他の実施形態
本発明は、本発明の詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は、添付した特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の範囲を説明するように意図されており、本発明の範囲を限定するようには意図されていないことを理解すべきである。他の態様、利点及び変更形態も、下記の特許請求の範囲含まれる。
本発明は、本発明の詳細な説明と併せて説明してきたが、上記の説明は、添付した特許請求の範囲の範囲によって規定される本発明の範囲を説明するように意図されており、本発明の範囲を限定するようには意図されていないことを理解すべきである。他の態様、利点及び変更形態も、下記の特許請求の範囲含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【0081】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
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【図13】
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【図15】
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【国際調査報告】