特表 2022-539527 Ｔ細胞活性化のための抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-12

(54)【発明の名称】Ｔ細胞活性化のための抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220905BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220905BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220905BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220905BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220905BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220905BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220905BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220905BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220905BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C07K16/46

C07K16/28

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/02

A61P35/00

A61K47/68

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576891

(86)(22)【出願日】2020-06-24

(85)【翻訳文提出日】2022-02-16

(86)【国際出願番号】 US2020039218

(87)【国際公開番号】W WO2020263879

(87)【国際公開日】2020-12-30

(31)【優先権主張番号】62/866,699

(32)【優先日】2019-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/953,302

(32)【優先日】2019-12-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＷＩＮＤＯＷＳ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517015786

【氏名又は名称】エーピー バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ハー チェン－ホーン

(72)【発明者】

【氏名】イウ ジョン－チェ

(72)【発明者】

【氏名】スー チン－シュアン

(72)【発明者】

【氏名】ホァン ポ－リン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA17

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA25

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB44

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本願明細書において、ＣＤ１３７に結合する抗原結合領域を含む抗体を提供する。本願明細書において、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域と、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合領域とを含む二重特異性抗体もまた提供する。当該抗体を含む医薬組成物、及びがんを治療する方法を提供する。
【選択図】図１３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）配列番号１、配列番号９及び配列番号１７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、
（ｉｉ）配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域と
を含む、抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤ１３７に結合する、前記抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記Ｖ_Ｈ領域が、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記Ｖ_Ｌ領域が、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項3】

（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３と
を含む、請求項２記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項4】

前記Ｖ_Ｈ領域が、配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記Ｖ_Ｌ領域が、配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項5】

（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号１２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３と
を含む、請求項４記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項6】

前記Ｖ_Ｈ領域が、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記Ｖ_Ｌ領域が、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項7】

（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、
（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３と
を含む、請求項６記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項8】

前記抗体が、Ｆｃドメインを含む、請求項１記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項9】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＭドメイン、及びＩｇＤドメイン、ＩｇＡドメイン、又はＩｇＹドメインである、請求項８記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項10】

前記ＩｇＧドメインが、ＩｇＧ１ドメイン、ＩｇＧ２ドメイン、ＩｇＧ３ドメイン、又はＩｇＧ４ドメインである、請求項９記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＩｇＧ１ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項12】

前記ＩｇＧ４ドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１０記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項13】

前記抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦａｂを含む、請求項１記載の抗体又は抗原結合断片。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項15】

前記薬学的に許容される担体が、前記抗体又は抗原結合断片の１又は複数のポリペプチドのＣ末端に結合する、請求項１４記載の医薬組成物。

【請求項16】

対象におけるがんを治療する方法であって、
請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片又は医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記がんを治療すること
を含む、前記方法。

【請求項17】

前記がんが、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、又は白血病から選択される、請求項１６記載の方法。

【請求項18】

配列番号１から２６に記載される、単離されたアミノ酸配列。

【請求項19】

配列番号１から２６のいずれか１つをコードする、単離された核酸配列。

【請求項20】

第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域を含む二重特異性抗体であって、該第１の抗原結合領域がＣＤ１３７に結合する、前記二重特異性抗体。

【請求項21】

前記抗体が、
（ｉ）配列番号１、配列番号９及び配列番号１７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、
（ｉｉ）配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８からなる群から選択される配列の約１００から１２０アミノ酸のＮ末端配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域と
を含み、
前記第２の抗原結合領域が、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する、
請求項２０記載の二重特異性抗体。

【請求項22】

前記第１の抗原結合領域が、
（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、及び配列番号１０のＮ末端配列の約１００から１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、又は
（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、及び配列番号１８のＮ末端配列の約１００から１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域
を含む、請求項２１記載の二重特異性抗体。

【請求項23】

前記第２の抗原結合領域が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ２、又はグリカンから選択される抗原に結合する、請求項２１記載の二重特異性抗体。

【請求項24】

前記第２の抗原結合領域が、ＰＤ－Ｌ１、Ｈｅｒ２、又はグリカンに結合する、請求項２３記載の二重特異性抗体。

【請求項25】

前記第１の抗原結合領域及び前記第２の抗原結合領域が、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２３記載の二重特異性抗体。

【請求項26】

前記第１の抗原結合領域がｓｃＦｖを含み、前記第２の抗原結合領域がＦａｂを含む、請求項２５記載の二重特異性抗体。

【請求項27】

前記ｓｃＦｖが、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、及び配列番号１０のＮ末端配列の約１００から１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域、又は
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域、及び配列番号１８のＮ末端配列の約１００から１２０アミノ酸のアミノ酸を含むＶ_Ｌ領域
を含む、請求項２６記載の二重特異性抗体。

【請求項28】

前記ｓｃＦｖの前記Ｖ_Ｈ領域と前記Ｖ_Ｌ領域との間にリンカーをさらに含む、請求項２７記載の二重特異性抗体。

【請求項29】

前記ｓｃＦｖが、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項２８記載の二重特異性抗体。

【請求項30】

Ｆｃドメインをさらに含む、請求項２６記載の二重特異性抗体。

【請求項31】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＭドメイン、及びＩｇＤドメイン、ＩｇＡドメイン、又はＩｇＹドメインである、請求項３０記載の二重特異性抗体。

【請求項32】

前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧドメインである、請求項３１記載の二重特異性抗体。

【請求項33】

前記ＩｇＧドメインが、ＩｇＧ１ドメイン、ＩｇＧ２ドメイン、ＩｇＧ３ドメイン、又はＩｇＧ４ドメインである、請求項３２記載の二重特異性抗体。

【請求項34】

前記ｓｃＦｖが、前記ＦｃドメインのＣ末端に連結する、請求項３０記載の二重特異性抗体。

【請求項35】

前記Ｆｃドメインと前記ｓｃＦｖとの間にリンカーをさらに含む、請求項３０記載の二重特異性抗体。

【請求項36】

前記Ｆａｂが、前記ＦｃドメインのＮ末端に連結する、請求項３０記載の二重特異性抗体。

【請求項37】

配列番号３１又は配列番号３２の重鎖配列を含む、請求項２０記載の二重特異性抗体。

【請求項38】

配列番号３０の軽鎖配列をさらに含む、請求項３７記載の二重特異性抗体。

【請求項39】

配列番号３６の重鎖配列を含む、請求項２０記載の二重特異性抗体。

【請求項40】

配列番号３５の軽鎖配列をさらに含む、請求項３９記載の二重特異性抗体。

【請求項41】

配列番号３８の重鎖配列を含む、請求項２０記載の二重特異性抗体。

【請求項42】

配列番号３７の軽鎖配列をさらに含む、請求項４１記載の二重特異性抗体。

【請求項43】

配列番号４０の重鎖配列を含む、請求項２０記載の二重特異性抗体。

【請求項44】

配列番号３９の軽鎖配列をさらに含む、請求項４３記載の二重特異性抗体。

【請求項45】

配列番号３０から４０に記載される、単離されたアミノ酸配列。

【請求項46】

配列番号３０から４０のいずれか１つをコードする、単離された核酸配列。

【請求項47】

治療薬と、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、又は請求項２０から４４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片とを含む、抗体－薬剤複合体。

【請求項48】

前記治療薬が、リンカーを介して前記抗体又は抗原結合断片に共有結合している、請求項４７記載の抗体－薬剤複合体。

【請求項49】

請求項２０から４４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項50】

対象におけるがんを治療する方法であって、
請求項２０から４４のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記がんを治療すること
を含む、前記方法。

【請求項51】

前記がんが、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、又は白血病から選択される、請求項５０記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本願は、２０１９年６月２６日出願の米国シリアル番号第６２／８６６，６９９号及び２０１９年１２月２４日出願の米国シリアル番号第６２／９５３，３０２号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を請求し、そのいずれもそれら全体として参照により本明細書に援用する。

【0002】

配列表の援用
添付の配列表の内容は、参照によりここで本願に援用する。添付の配列表のテキストファイルは、ＡＰ１１００＿２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前で、２０２０年６月１２日に作成され、６６ｋｂである。このファイルは、ＷｉｎｄｏｗｓのＯＳを用いるコンピュータ上でマイクロソフト社のＷｏｒｄを用いてアクセス可能である。

【0003】

発明の分野
本発明は、概して、抗体及びその抗原結合断片に関し、より詳細には、Ｔ細胞機能を増強する抗体及び抗原結合断片に関する。

【背景技術】

【0004】

背景情報
適応免疫系の免疫制御機構は、副作用がほとんどないこと及びがんの再発からの長期的な保護を理由に、がん免疫療法において魅力的な領域となっている。Ｔ細胞を完全に活性化するために、概して２つのシグナル、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）よりの抗原特異性シグナル及び例えばＣＤ２８等である共起刺激分子よりのシグナル、の２つのシグナルが必要である。過去１０年に、ＴＣＲシグナル伝達を正に又は負に調節することが可能であるさらなる共起刺激分子のみならず共抑制分子が、Ｔ細胞上で発見された。

【0005】

１９８９年に、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する共起刺激分子、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）が、活性化されたＴ細胞よりクローン化された（Ｋｗｏｎ＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，１９８９）。４－１ＢＢ：４－１ＢＢＬ経路が、既存の共起刺激シグナルを増幅するように思われるが、強いＴＣＲシグナル伝達の存在下で４－１ＢＢが関与することにより、ＣＤ２８に依存しない手法でのＩＬ－２産生を誘導可能である。ＣＤ１３７シグナル伝達が、ＴＣＲシグナル伝達を増強し、サイトカイン合成及びＴ細胞増殖を誘導し、そして活性化により誘導されるアポトーシスを阻害することは実証されている。Ｔ細胞におけるＣＤ１３７刺激が、それぞれＴ細胞活性化により誘導されるアポトーシスを防止すること、Ｔ細胞増殖を誘導することに関与する、ＮＦ－κＢ及びＰＩ３Ｋ／ＥＲＫのシグナル伝達経路を誘導する。ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞がいずれも、増強された増殖及びエフェクター機能を結果的に生じるＣＤ１３７刺激に応答する一方で、ＣＤ８ Ｔ細胞は、優先的に、より大きいサイトカイン産生を誘導することによってＣＤ１３７シグナル伝達に応答する。ＣＤ１３７は、活性化されたＴ細胞での発現に加えて、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単核球、及び樹状細胞（ＤＣ）を含む多系統の造血細胞において発現する。ＤＣにおいては、ＣＤ１３７の刺激により、ＩＬ－６及びＩＬ－１２の分泌を増加し、より重要なことには、同種抗原及び微量抗原に応じて、ＤＣのＴ細胞増殖を刺激する能力を増強する。ＮＫにおいては、ＣＤ１３７刺激が、増殖とＩＦＮ－γ産生とを促進するが、細胞溶解活性は促進しない。それにもかかわらず、ＣＤ１３７に刺激されたＮＫ細胞は、活性化したＴ細胞の増殖を促進する際にヘルパーの役割を示す。

【0006】

臨床的には、抗－ＣＤ１３７アゴニスト抗体ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）（ＢＭＳ－６６３５１３）が、疾患の部分的な緩解及び一部の安定化を示した。しかしながら、ほとんどの治験の終りに致命的な肝毒性を結果的に生じた。別の抗－ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）（ＰＦ－０５０８２５６６）の治験では、肝毒性を引き起こすことなく、完全応答及び部分応答を含めて、客観的奏効率が固形腫瘍患者では３．８％、メルケル細胞がん患者では１３．３％を達成した。ウレルマブ及びウトミルマブは、別個の特徴を示す。アゴニスト活性に関しては、ウレルマブは強く、また架橋結合非依存性であるが、その一方でウトミルマブは弱く、また架橋結合依存性である。ＣＤ１３７とのウレルマブ及びウトミルマブの結晶構造により、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌの相互作用に影響する別個の結合性エピトープが明らかになる。別個のエピトープの認識と、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ結合の阻止により、これら２つの抗－ＣＤ１３７抗体の別個の効力及び毒性を結果としてもたらすことができる。しかしながら、抗－４－１ＢＢモノクローナル抗体（ｍＡｂ）３Ｈ３及び２Ａは、ＣＤ１３７Ｌ結合に対してそれぞれ対立する影響を有するが、同様の肝毒性を示すという理由から、リガンドの結合がＣＤ１３７媒介性の毒性を決定するのではない。近年、弱いアゴニスト抗体の操作されたＦｃ領域が、ＦｃγＲＩＩＢ（低いＡ／Ｉ ＦｃγＲ結合比で）に優先的に結合し、それが肝毒性を誘導することなくウレルマブに匹敵する強力なアゴニスト活性を結果的に生じるということが示された。アゴニスト抗－ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ４０に依存する手法でＴ－細胞傷害性を増強することにより抗がん活性を有することが示されている。さらに、十分に樹立されていない抗原性腫瘍を退行させるために、抗－ＣＤ１３７抗体には抗原発現が必要とされる。さらにまた、抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＤ１３７抗体を組み合わせることで、各抗体での単一治療と比較して、Ｔ細胞エフェクター機能及び腫瘍浸潤の増強を介したマウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の増強が示された。抗がん治療に加えて、抗－ＣＤ１３７アゴニスト抗体はまた、治療のタイミングに依存して、実験的な自己免疫性脳脊髄炎の改善及び抗ウイルス免疫を増強することを示した。

【0007】

はじめにアポトーシス進行中のＴ細胞から、ＰＤ－１が単離された。次にそのリガンドＰＤ－Ｌ１が同定され、そしてＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の相互作用により、Ｔ細胞活性化を阻止することが実証された。ＰＤ－１は、休止期Ｔ細胞上では発現されないが、活性化により誘導される。持続的なＰＤ－１の発現は、慢性感染症及びがんにおける疲弊したＴ細胞上で見られる。正常状態下では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、自己免疫を予防するための末梢性トレランスの維持にとって重要である。しかしながら、がんにおいてＰＤ－Ｌ１の自己保護機能は乗っ取られているものであり、ＰＤ－Ｌ１は、種々のがん細胞型により発現されて免疫系の監視を免れる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、阻害性のシグナル伝達を阻止して、Ｔ細胞の抗がん活性を修復する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路は、抗腫瘍Ｔ細胞のエフェクター機能のドミナントネガティブ調節因子としてみなされてきた。臨床的には、この経路の阻止が、一部のがんのタイプにおいて、例えばホジキンリンパ腫、メルケル細胞がん及び黒色腫等において、３５％～８７％の範囲にわたる高い客観的奏効率を達成してきた。例えばＮＳＣＬＣ、頭頸部がん、ならびに腎細胞がん等の他のがんのタイプでは、１５％～２５％の範囲の低い客観的奏効率が達成された。

【0008】

抗－ＰＤ－１抗体及び抗－ＣＤ１３７抗体の組み合わせにより、各抗体での単一治療と比較して、Ｔ細胞エフェクター機能及び腫瘍浸潤の増強によりマウス腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性の増強が示された。臨床的には、ウトミルマブ（０．４５～５．０ｍｇ／ｋｇ）及びペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の組み合わせが、用量制限毒性なしに、進行した固形腫瘍の患者において、相乗的な抗腫瘍効果を示した。

【0009】

ＣＤ１３７の免疫調節性に基づいて、抗－ヒト４－１ＢＢアゴニスト抗体を、がん及び自己免疫疾患及び感染症の治療に用いることも可能であろう。しかしながら、抗－ヒト４－１ＢＢアゴニスト抗体の使用は、肝臓毒性のために制限される。さらに、免疫阻害経路又は腫瘍シグナル伝達経路を阻止することと、肝臓毒性のない、４－１ＢＢ：４－１ＢＢＬ経路の活性化を組み合わせた有効な治療は記載されてきていない。すなわち、免疫活性化の阻害の除去と組み合わせた又は腫瘍細胞シグナル伝達の阻害と組み合わせた、４－１ＢＢ：４－１ＢＢＬ経路の効果的な関与に対する要望が存在している。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、強力な架橋結合依存性のアゴニスト活性を有し、かつ、治験で見られる肝臓毒性を回避する可能性がある、抗－ＣＤ１３７抗体を生成することができるという基本的な発見に基づいている。本発明は、ＰＤ－Ｌ１及びＣＤ１３７を標的とする二重特異性抗体が、Ｔ－細胞エフェクター機能を高め、また各抗体での単一治療又は組み合わせ治療より良好にインビボでの腫瘍増殖を阻害する特別な活性を所有するという発見にさらに基づいている。二重特異性抗体は、例えばＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体のもう一方のアームを介した架橋結合によりＴ細胞を活性化する、固有の抗－ＣＤ１３７一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を有し得る。二重特異性抗体はまた、抗－ＰＤ－Ｌ１アームを他の腫瘍特異性バインダー、例えば本明細書において提供するような抗－Ｈｅｒ２又は抗－腫瘍特異性グリカン等、に変えることによって、非ＰＤ－Ｌ１発現腫瘍に向けられ得る。標的依存性のＴ－細胞活性化を誘導する二重特異性抗体は、抗－ＣＤ１３７モノクローナル抗体の抗腫瘍能力を維持しつつ、肝毒性を回避することができる。

【0011】

一部の実施形態においては、本発明は、以下の３つのアゴニスト抗体又はその抗原結合断片を提供する：抗－ＣＤ１３７抗体クローン１５（ＣＤ１３７ ＃１５）、抗－ＣＤ１３７抗体クローン３１（ＣＤ１３７ ＃３１）、及び抗－ＣＤ１３７抗体クローン５４（ＣＤ１３７ ＃５４）。一態様においては、本明細書において提供する抗－ＣＤ１３７抗体は、配列番号１、配列番号９又は配列番号１７から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域と；及び配列番号２、配列番号１０又は配列番号１８から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域とを含む。別の態様においては、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する抗体又は抗原結合断片は、（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。

【0012】

別の態様においては、配列番号９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号１２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。

【0013】

さらに別の態様においては、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３であって、ＣＤＲ－Ｈ１が配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２が配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｈ３が配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＨのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と、（ｂ）Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３であって、ＣＤＲ－Ｌ１が配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２が配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ－Ｌ３が配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｖ_ＬのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。

【0014】

一態様においては、本明細書において提供する抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃドメインを含む。別の態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＹドメインである。さらに別の態様においては、ＩｇＧドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ドメインである。さらなる態様においては、ＩｇＧ１ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。ある態様においては、ＩｇＧ１は、野生型ＩｇＧ１と比較して、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変又は減少させる点変異を含む。例示的な点変異としては、Ｋ２９７Ａ及びＫ３２２Ａの変異が挙げられる。さらに別の態様においては、ＩｇＧ４ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。さらなる態様においては、本明細書において提供する抗原断片には、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、又はＦａｂが含まれる。

【0015】

ある実施形態においては、本開示はまた、本明細書において提供する抗体又はその抗原結合断片のうちのいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。一態様においては、本明細書において提供する医薬組成物の抗体又は抗原結合断片は、抗体又はその抗原結合断片のうちの１又は複数のポリペプチドのＣ末端に結合した薬学的に許容される担体を含む。別の態様においては、本明細書において提供する医薬組成物には、二重特異性抗体が含まれる。

【0016】

一実施形態においては、本開示はまた、がんを治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書において提供する有効量の抗体もしくはその抗原結合断片又は本明細書において提供する有効量の二重特異性抗体を投与することを含む、当該方法を提供する。一態様においては、当該がんは、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、又は白血病から選択される。

【0017】

一実施形態においては、本明細書においては、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域を含む二重特異性抗体であって、第１の抗原結合領域がＣＤ１３７に結合する、該二重特異性抗体が提供される。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、（ｉ）配列番号１、配列番号９及び配列番号１７から選択される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、（ｉｉ）配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８から選択される配列の約１００～１２０アミノ酸のＮ末端配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含み、第２の抗原結合領域が、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子又は腫瘍抗原に結合するものである。

【0018】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３１又は配列番号３２の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３０の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３６の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３５の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３８の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３７の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号４０の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３９の軽鎖配列をさらに含む。

【0019】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有するか又は（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する、第１の抗原結合領域を含む。別の態様においては、第２の抗原結合領域は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ２、又はグリカンから選択される抗原に結合する。さらに別の態様においては、第２の抗原結合領域は、ＰＤ－Ｌ１、Ｈｅｒ２、又はグリカンに結合する。

【0020】

一態様においては、本発明は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）が、抗－ＣＤ１３７＃５４一本鎖の架橋結合依存性アゴニスト活性による標的依存性Ｔ細胞活性化を発揮するプラットフォームとして作用することができるということを開示する。

【0021】

別の態様においては、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に結合する二重特異性抗体は、ＣＤ１３７と、例えばＨｅｒ２又は腫瘍特異性グリカン等である免疫調節分子及び腫瘍特異性マーカーを含める、腫瘍で発現する他の標的とに結合するように改変される。

【0022】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、Ｆｃドメイン、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。さらに別の態様においては、ｓｃＦｖは、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含むか、又は（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む。さらなる態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ｓｃＦｖのＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域の間にリンカーを含む。さらなる態様においては、ｓｃＦｖは、アミノ酸配列、配列番号３３又は配列番号３４を含む。

【0023】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを含む。別の態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＭドメイン、及びＩｇＤドメイン、ＩｇＡドメイン、又はＩｇＹドメインである。さらに別の態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメインである。さらなる態様においては、ＩｇＧドメインは、ＩｇＧ１ドメイン、ＩｇＧ２ドメイン、ＩｇＧ３ドメイン、又はＩｇＧ４ドメインである。

【0024】

一態様においては、ｓｃＦｖは、ＦｃドメインのＣ末端に結合する。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ＦａｂドメインとｓｃＦｖドメインとの間にリンカーを含む。さらなる態様においては、Ｆａｂ断片は、ＦｃドメインのＮ末端に結合する。またさらなる態様においては、Ｆａｂは、ＰＤ－Ｌ１結合部位、Ｈｅｒ２結合部位又はグリカン結合部位を含み、またｓｃＦｖは、ＣＤ１３７結合部位を含む。

【0025】

一実施形態においては、本発明は、本明細書において提供する任意の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含める、治療薬及び抗体を含む抗体－薬剤複合体を提供する。一態様においては、治療薬は、リンカーを介して抗体又は抗原結合断片に共有結合している。

【0026】

一実施形態においては、本明細書においては、本明細書において提供する任意の二重特異性抗体及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

【0027】

一実施形態においては、本発明は、配列番号１～２６に記載される単離されたアミノ酸配列を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号３０～４０に記載される単離されたアミノ酸配列を提供する。

【0028】

一実施形態においては、本開示はまた、抗体、その抗原結合断片、又は本発明の二重特異性抗体をコードする単離された核酸配列も提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号１～２６のいずれか１つをコードする単離された核酸を提供する。別の実施形態においては、本発明は、配列番号３０～４０のいずれか１つをコードする単離された核酸配列を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、直接ＥＬＩＳＡによる、ＣＤ１３７に向けられるファージクローンのスクリーニングを示す。

【図2-1】図２は、フローサイトメトリーによる、ＣＤ１３７を過剰発現するＨＥＫ－２９３Ｆ細胞上での、ＣＤ１３７に向けられるファージクローンの結合を示す。

【図2-2】図２－１の説明を参照のこと。

【図2-3】図２－１の説明を参照のこと。

【図3】図３Ａ～図３Ｂは、ＰＡＧＥによる、一工程プロテインＧにより精製された抗－ＣＤ１３７抗体リードの完全性及び純度を示す。２つのバッチの結果（上図及び下図）を示す。

【図4】図４は、フローサイトメトリーによる、活性化したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞に対する抗－ＣＤ１３７抗体リードの結合を示す。

【図5】図５は、ＥＬＩＳＡによる、組換えヒトＣＤ１３７への抗－ＣＤ１３７抗体リードの結合活性（ＥＣ_５０）を示す。

【図6】図６は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる、高度に濃縮された抗－ＣＤ１３７抗体のクローン３１及びクローン５４のタンパク質凝集を示す。

【図7-1】図７は、抗－ＣＤ１３７抗体リードのアゴニスト活性の存在下でのＴ細胞のサイトカイン産生を示す。

【図7-2】図７－１の説明を参照のこと。

【図8-1】図８は、初代ヒトＴ細胞における抗－ＣＤ１３７抗体リードクローンによるヒトＴ細胞サイトカイン産生の用量依存的な誘導を示す。

【図8-2】図８－１の説明を参照のこと。

【図9】図９は、抗－ＣＤ１３７抗体と組み合わせた治療が、混合したリンパ球反応においてＴ細胞による抗－ＰＤ－Ｌ１抗体媒介性のＩＦＮ－γ産生を増強することを示す。

【図10】図１０は、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ相互作用に対する抗－ＣＤ１３７抗体クローンの明白な効果を示す。

【図11】図１１は、インビボでの抗－ＣＤ１３７抗体のクローン＃３１及び＃５４の薬物動態プロファイルを示す。

【図12】図１２は、ウトミルマブ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ）及びウレルマブ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ２）と比較した、抗－ＣＤ１３７抗体クローンのアゴニスト活性に関する架橋結合の様々な所要量を示す。

【図13】図１３は、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の対称的なフォーマットを示す。

【図14】図１４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる、プロテインＧで精製した抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂの純度及び完全性を示す。一工程のプロテインＧクロマトグラフィーにより、９０％以上を達成することが可能である。

【図15】図１５は、μＣＥ－ＳＤＳによる、プロテインＡで精製した抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂの純度及び完全性を示す。

【図16-1】図１６は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）のバイオセンサー解析により見られるとおり、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂが、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１を同時に認識することを示す。

【図16-2】図１６－１の説明を参照のこと。

【図17】図１７は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、混合されたリンパ球反応において、単一治療、組み合わせ治療又は抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃３１ ｂｓＡｂによる治療と比較して、相乗的なＴ細胞活性化を誘導することを示す。

【図18】図１８Ａ～図１８Ｂは、メモリーＣＤ４（Ａ）及びメモリーＣＤ８（Ｂ）のＴ細胞の抗原特異性リコール応答が、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂによって顕著に増強されることを示す。

【図19】図１９は、標的依存性Ｔ細胞活性化が、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ－２９３細胞と共にＴ細胞を共培養する間に、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃３１ ｂｓＡｂ又は抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂにより誘導されることを示す。

【図20A】図２０Ａ～図２０Ｃは、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、ＰＤ－Ｌ１陽性のがん細胞と共培養すると、Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生（図２０Ａ、図２０Ｃ及び図２０Ｂの左図）及びがん細胞の細胞傷害性（図２０Ｂの右図）を誘導することを示す。（Ａ）ＮＣＩ－Ｈ１９７５、非小細胞肺がん細胞；（Ｂ）ＰＣ－３、前立腺がん細胞；（Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、乳がん細胞。

【図20B-1】図２０Ａの説明を参照のこと。

【図20B-2】図２０Ａの説明を参照のこと。

【図20C】図２０Ａの説明を参照のこと。

【図21】図２１Ａ～図２１Ｂは、トラスツズマブ（Ｔｒａ）－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂ又は抗－Ｈｅｒ２＃３－７－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、Ｈｅｒ２陽性がん細胞と共培養すると、ＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生を誘導することを示す。（Ａ）ＳＫＢＲ－３、乳がん細胞；（Ｂ）ＭＤＡ－ＭＤ－３６１、乳がん細胞。

【図22A】図２２Ａ～図２２Ｂは、抗－グリカン－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、グリカン陽性のがん細胞と共培養すると、ＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生（図２２Ａの左図、及び図２２Ｂ）及びがん細胞の細胞傷害性（図２２Ａの右図）を誘導することを示す。（Ａ）ＭＣＦ－７、乳がん細胞；（Ｂ）ＮＣＩ－Ｎ８７、胃がん細胞。

【図22B】図２２Ａの説明を参照のこと。

【図23】図２３は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、ＨＥＫ２９３細胞において発現されたＣＤ１３７の取込み（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することを示す。

【図24A】図２４Ａ～図２４Ｂは、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂが、Ｔレグ（Ｔｒｅｇ）細胞の存在下での、Ｔ－細胞増殖（Ａ）及びサイトカイン産生（Ｂ）を救済したことを示す。

【図24B】図２４Ａの説明を参照のこと。

【図25】図２５Ａ～図２５Ｃは、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、ＰＤ－Ｌ１陽性の（Ａ）ＮＣＩ－Ｈ２９２、（Ｂ）ＮＣＩ－Ｈ１９７５及び（Ｃ）ＢｘＰＣ－３の腫瘍細胞により異種移植したヒト化マウスにおいて、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６抗体及び抗－ＣＤ１３７＃５４抗体の組み合わせ治療と比較して、より大きい腫瘍成長阻害を結果的に生じることを示す。

【図26-1】図２６は、ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂ、Ｈｅｒ２＃３－７－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂ及びグリカン－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、ヒトＰＢＭＣにおいて顕著なサイトカイン放出を誘導しないことを示す。

【図26-2】図２６－１の説明を参照のこと。

【図27】図２７Ａ～図２７Ｂは、サルにおける抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂのＰＫパラメータを、（Ａ）グラフ及び（Ｂ）表の形式として示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

発明の詳細な説明
本組成物及び方法を記述する前に、本発明は、特定の組成物、方法、及び記載の実験条件に限定されないものであり、そのため組成物、方法、及び条件は変動する可能性があるということを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることとなるため、本明細書において用いる専門用語は、単に特定の実施形態を記述する目的のためであり、限定することを意図していないということもまた理解されたい。

【0031】

本明細書においては、一部の実施形態において、ＣＤ１３７に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。本明細書においては、ＣＤ１３７に結合する抗体のアミノ配列もまた提供する。本明細書において用いる場合、「抗体」の語は、抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子を指す。「抗体」の語には、文脈により別を明示していない限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体及び抗－イディオタイプ抗体が含まれるがこれに限定されない。一態様においては、本明細書において提供する抗体には、モノクローナル抗体が含まれる。本明細書において提供する抗体には、任意のアイソタイプ及びクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）が含まれる。本明細書において用いる場合、「抗原結合断片」は、免疫グロブリン分子又は抗体の断片又は部分であって、当該免疫グロブリン分子又は抗体と同じ抗原に特異的に結合する能力を有する該免疫グロブリン分子又は抗体の断片又は部分を意味する。例示的な抗原結合断片には、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ）２の断片が含まれる。本明細書において用いる場合、「抗原結合領域」は、例えば、抗原又はタンパク質と接触することにより抗原又はタンパク質に結合する抗体又は免疫グロブリン分子の部分を意味する。抗原結合領域は概して、重鎖可変（Ｖ_Ｈ）領域及び軽鎖可変（Ｖ_Ｌ）領域を含む。抗原結合領域は概して、１又は複数の抗原結合部位又はパラトープを含む。

【0032】

本明細書において提供する抗体は、配列番号１、配列番号９又は配列番号１７の配列と、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間にある任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域を有する。本明細書において提供する抗体はまた、配列番号２、配列番号１０又は配列番号１８の配列と、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間にある任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。

【0033】

概して、「配列同一性」又は「配列相同性」は、区別なく用い得るが、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の、寸分たがわぬヌクレオチド－ヌクレオチド間の、又はアミノ酸－アミノ酸間の一致を指す。典型的には、配列同一性を決定する技術としては、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列もしくはポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、及びこれら配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することが挙げられる。本明細書において用いる場合、「パーセント配列同一性（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ（％） ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」又は「パーセント同一性（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ（％） ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」の語は、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」も含めて、配列をアラインしてギャップを導入し、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成した後で、また配列同一性の部分として任意の保存的置換を検討せずに、参照配列内のアミノ酸残基又はヌクレオチドと一致する、配列内のアミノ酸残基又はヌクレオチドの百分率を指すものである。すなわち、２以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、「パーセント相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とも呼ばれるそれらの「パーセント同一性」を決定することによって比較することが可能である。より長い分子（例えばポリヌクレオチド、又はポリペプチド）内の配列であり得る参照配列（例えば、核酸又はアミノ酸配列）に対するパーセント同一性は、参照配列の長さで除算して１００を掛けた、２つの最適にアラインした配列間の寸分たがわぬマッチ数として算出され得る。パーセント同一性はまた、例えばアメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）より利用可能である、バージョン２．２．９を含めた高度のＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを用いた配列情報の比較によって、決定することもできる。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアラインメント方法に基づき、またＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）に論じられるとおりである。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、２つの配列のうちの短い方におけるシンボルの総数で除算される、アラインされたシンボル（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の一致数として同一性を決定する。当該プログラムを用いて、比較されている配列の全長にわたってパーセント同一性を決定することができる。例えばｂｌａｓｔｐプログラムにより、短いクエリ配列での検索を最適化するために、デフォルトパラメータが提供される。当該プログラムはまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるようなクエリ配列のマスクオフセグメントに対してＳＥＧフィルターの使用を可能にする。望まれる程度の配列同一性の範囲は、およそ８０％～１００％及びその間の整数値である。参照配列と特許請求の範囲に記載の配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．９％であり得る。概して、寸分たがわぬマッチは、参照配列の長さにわたる１００％の同一性を示唆する。配列を比較及び／又は配列同一性を評価するためのさらなるプログラム及び方法には、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／において利用可能である、随意にデフォルト設定でなされるＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／において利用可能である、随意にデフォルト設定でなされるＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照）、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性のサーチ方法、又はこれらアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）が含まれる。一部の態様においては、パーセント配列同一性への言及は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて測定されるような配列同一性を指す。他の態様においては、多重の配列アラインメントのためにＣｌｕｓｔａｌＷを用いる。最適なアラインメントは、デフォルトパラメータを含めて選択したアルゴリズムの任意の好適なパラメータを用いて評価され得る。

【0034】

一態様においては、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号２に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する。配列番号１は、抗－ＣＤ１３７抗体クローン＃１５の重鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。配列番号２は、抗－ＣＤ１３７クローン＃１５の軽鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。

【0035】

抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、概して、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌの超可変領域を指す。ＣＤＲは、タンパク質又は抗原への結合に関する特異性を与える抗体の標的タンパク質又は抗原結合部位を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは概して、３つの連続する番号が付いたＣＤＲを含む。本明細書において用いる場合、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３は、重鎖ポリペプチドのＮ末端から番号付けされた、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）の３つの連続して並んだＣＤＲを指す。本明細書において用いる場合、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３は、軽鎖ポリペプチドのＮ末端から番号付けされた、軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）の３つの連続して並んだＣＤＲを指す。

【0036】

一態様においては、配列番号１に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号２に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号３に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号４に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号５に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを有する。別の態様においては、配列番号１に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号２に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号６に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号７に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号８に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを有する。

【0037】

一部の態様においては、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む。配列番号９は、抗－ＣＤ１３７抗体クローン＃３１の重鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。配列番号１０は、抗－ＣＤ１３７クローン＃３１の軽鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。

【0038】

一態様においては、配列番号９に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号１１に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号１２に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号１３に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを有する。別の態様においては、配列番号９に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号１４に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号１５に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号１６に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを有する。

【0039】

一部の態様においては、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１７に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを有する。配列番号１７は、抗－ＣＤ１３７抗体クローン＃５４の重鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。配列番号１８は、抗－ＣＤ１３７クローン＃５４の軽鎖の可変領域を含むアミノ酸配列を提供する。

【0040】

一態様においては、配列番号１７に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号１９に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１と、配列番号２０に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２と、配列番号２１に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３とを有する。別の態様においては、配列番号１７に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む抗体又はその抗原結合断片の抗原結合領域は、配列番号２２に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１と、配列番号２３に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２と、配列番号２４に対して、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、少なくとも約９９．５％の同一性、少なくとも約９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３とを有する。

【0041】

本明細書において提供する抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃドメインをさらに含む。本明細書において用いる場合、Ｆｃドメインの語は、文脈により別を明示していない限り、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む抗体の領域を指す。Ｆｃドメイン及びＦｃ領域の語は、文脈により別を明示していない限り、区別なく用い得る。ある態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＭドメイン、及びＩｇＤドメイン、ＩｇＡドメイン、又はＩｇＹドメインである。任意の配列の任意の種からのＦｃドメインを用いることが可能であり、ヒト、類人猿（ａｐｅ）、サル、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ウマ及びその他が含まれる。ある態様においては、Ｆｃドメインは操作されており、すなわち例えば、分子生物学の技術を用いて生成された非天然の又は組換えのＦｃドメインである。一部の態様においては、ＩｇＧドメインは、ＩｇＧ１ドメイン、ＩｇＧ２ドメイン、ＩｇＧ３ドメイン、又はＩｇＧ４ドメインである。一態様においては、ＩｇＧ４ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。別の態様においては、ＩｇＧ１ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。一態様においては、Ｆｃドメインはヒトである。

【0042】

本明細書においては、一部の実施形態において、本明細書において提供される抗体又はその抗原結合断片のうちのいずれかと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。一部の態様においては、薬学的に許容される担体は、抗体又は抗原結合断片の１又は複数のポリペプチドのＣ末端に結合する。薬学的に許容される担体を結合する任意の好適な手段を用いることが可能であり、例えば共有結合的な結合及びリンカーの使用が含まれる。

【0043】

一部の実施形態においては、本明細書においては、配列番号１～２６に記載される単離されたアミノ酸配列を提供する。本明細書においては、一部の実施形態において、配列番号１～２６のアミノ酸配列のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸配列もまた提供する。

【0044】

一部の実施形態においては、本明細書において、対象におけるがんを治療する方法を提供する。一部の態様においては、がんを治療する方法は、がんを治療するのに有効である、ＣＤ１３７に結合する本明細書において提供する抗体又はその抗原結合断片のうちのいずれかのある量を対象に投与することを含む。一部の態様においては、当該がんは、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、又は白血病である。

【0045】

本明細書において用いる場合、「治療する」、「治療」、「療法」、「治療上の」等の語は、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ることを指し、進行を緩和、遅延又は遅くさせること、影響又は症状を軽減すること、発症を予防すること、疾患又は障害の発症を阻害、改善すること、例えば治療効果及び／又は予防効果等である疾患、障害又は病状に関する有益な又は所望の結果を得ることが含まれるがこれに限定されない。本明細書において用いる場合「治療」には、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療が含まれ、また（ａ）疾患の素因がある又は疾患にかかる危険性があるがまだそうであると診断されていない対象を含めて、ある対象において疾患が生じることを予防すること、（ｂ）該疾患を阻害すること、すなわちその発症を止めること、及び（ｃ）該疾患を軽減すること、すなわち疾患を退行させること、が含まれる。治療効果には、治療される根底にある障害の根絶又は回復が含まれる。治療効果はまた、根底にある障害に付随する生理的症状のうちの１又は複数の根絶又は回復により達成されるので、対象が根底にある障害にいまだ苦しめられる可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察される。一部の態様においては、予防的効果のために、治療又は治療用組成物が、特定の疾患を発症する危険性がある対象に、又は疾患の生理的症状のうちの１又は複数が報告されている対象に、当該疾患の診断がいまだ下されていなかったとしても、投与される。本開示の方法は、任意の哺乳動物又は他の動物に用いられ得る。一部の態様においては、治療により、症状の減少又は停止が結果として生じる。予防効果には、ある疾患もしくは状態の出現を遅延もしくは除去すること、ある疾患もしくは状態の症状の発症を遅延もしくは除去すること、ある疾患又は状態の進行を遅らせる、停止するもしくは逆行させること、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0046】

本明細書において用いる場合、「対象」の語は、本明細書において開示する方法が実施される任意の個体又は患者を指す。「対象」の語は、「個体」又は「患者」の語と区別なく用い得る。対象は、ヒトとすることが可能であるが、対象は当業者によって認識されることとなるような動物であってもよい。すなわち、他の動物が、例えばげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター及びモルモットを含める）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜であってウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含めた家畜、及び霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、及びゴリラを含める）を含めて、対象の定義の範囲内に含まれる。

【0047】

本明細書において用いる場合、「有効量」又は「治療有効量」の語は、本明細書において規定するような、疾患の治療に限定されない意図する適用を生じさせるのに十分である、本明細書に記載の抗体、その抗原結合断片、又は他の組成物の量を指す。治療有効量は、意図した治療上の適用（例えば、インビボで）に、又は治療対象の患者及び疾患の状態に応じて、例えば患者の体重及び年齢、疾患の状態の重症度、投与形態等に応じて、変動し得るものであるが、当業者によって容易に決定することが可能である。当該語はまた、標的細胞において特定の応答を誘導することとなる用量も当てはまる。明確な用量は、特定の抗体、その抗原結合断片、又は選択された他の組成物、以下の投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、投与する先の組織、及びそれを運ぶ体内での送達系、に応じて変動することとなる。

【0048】

一部の態様においては、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、単一療法として用いられるか、又は例えば放射線療法薬、細胞傷害性化学療法薬等である他の治療薬と、及び例えばワクチン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン等である他の免疫調節剤と、及び組み合わせ療法としての生物製剤と組み合わされる。免疫療法のための例示的なインターロイキンとしては、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２３が挙げられる。免疫療法のための例示的なサイトカインとしては、インターフェロン、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、Ｇ－ＣＳＦ、及びＧＭ－ＣＳＦが挙げられる。免疫療法のための例示的なケモカインとしては、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、及びＣＸＣＬ７が挙げられる。例示的な生物製剤としては、ＣＡＲ Ｔ－細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、及びモノクローナル抗体が挙げられ、例えばアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、イブリツモマブチウキセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ）、ブレンツキシマブ ベドチン（ＡＤＣＥＴＲＩＳ）、トラスツズマブエムタンシン（ａｄｏ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）（ＫＡＤＣＹＬＡ）、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、及びセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）等である。抗体はまた、ＰＤ－１阻害剤、例えばペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ）及びセミプリマブ（ＬＩＢＴＡＹＯ）等、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、例えばアテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ）、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ）及びデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ）等、ＣＴＬＡ－４阻害剤、例えばイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）等、を含むチェックポイント阻害剤、ならびに例えば抗Ｂ７－Ｈ３抗体（ＭＧＡ２７１）、抗－ＫＩＲ抗体（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）及び抗－ＬＡＧ３抗体（ＢＭＳ－９８６０１６）等である他のチェックポイント阻害剤も含む。

【0049】

一部の実施形態においては、本発明は、以下の実施例において詳説するように、抗－ＣＤ１３７アゴニスト抗体の発現、精製及び特徴決定をさらに提供する。本明細書において提供する抗体のための発現コンストラクトに、シグナル配列が含まれ得る。任意の好適なシグナル配列、例えば配列番号２７の配列等を、用いることが可能である。一部の態様においては、本明細書において提供する抗－ＣＤ１３７抗体と一緒に抗－ＰＤ－Ｌ１抗体により処理したＴ細胞は、Ｔ細胞エフェクター機能のさらなる増加を示した。理論に制限されることなく、このことは、組み合わせの治療又はＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１の両方を標的とする二重特異性抗体による治療により、臨床試験においてそれぞれの抗体単独で見られた単一療法でのより低い奏効率を克服することができるということを示す。抗－ＰＤ－Ｌ１抗体に加えて、例えばＣＤ４０もしくはＣＴＬＡ－４等の他の免疫増強抗原を標的とする組み合わせ治療のための又はＣＤ１３７と例えばＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４０又はＣＴＬＡ－４等である第２の抗原とを標的とする二重特異性抗体による治療のための第２の抗体を用いることが可能である。

【0050】

例えば二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）等である二重特異性分子は、単一の治療薬による同一の又は異なる分子標的上の複数のエピトープを同時に標的とする手段を提供する。理論に制限されることなく、がん治療薬としての二重特異性分子は、例えば２つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の混合物と比較して、新規の又は複数の強い活性、より低い物品の価格をもたらし、また新しい治療レジメンの開発を促進する可能性を有する。

【0051】

したがって、本明細書においては、二重特異性抗体を含めた二機能性のタンパク質の発現、精製及び特徴決定もまた提供する。本明細書において用いる場合、「二機能性のタンパク質」の語は、少なくとも２つの機能を有するタンパク質を指す。二機能性のタンパク質の非限定的な例としては、２つの抗原に結合することができる二重特異性抗体が挙げられる。本明細書において提供する二重特異性抗体は、例えば、ＣＤ１３７に結合し、かつ、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃドメインのＣ末端と融合する、単離された機能性ｓｃＦｖ断片を含み得る。一部の態様においては、本明細書において提供する融合コンストラクト内のＣＤ１３７に結合するＣ末端に位置するｓｃＦｖは、例えばＣＤ４０又はＣＴＬＡ－４等である他の免疫調節分子に結合する抗体のＦｃドメインに融合する。他の態様においては、Ｃ末端に位置するｓｃＦｖは、例えばＣＤ４０又はＣＴＬＡ－４等である免疫調節分子に結合することが可能である。

【0052】

一部の実施形態においては、本明細書においては、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域を含む二重特異性抗体が提供される。概して、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、異なる抗原又は標的に特異的に結合する。一部の態様においては、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、同一の抗原又は標的における異なるエピトープに結合する。

【0053】

ある実施形態においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域を含む。第１の抗原結合領域は、配列番号１、配列番号９及び配列番号１７から選択される配列に対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、少なくとも９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８から選択される配列のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸に対して、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９１％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、少なくとも９９．５％の同一性、少なくとも９９．９％の同一性、及びその間の任意の数又は範囲を有するアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む。一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第２の抗原結合領域は、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する。

【0054】

Ｖ_Ｈ領域を含む配列番号１、配列番号９及び配列番号１７に記載される配列又はＶ_Ｌ領域を含む配列番号２、配列番号１０及び配列番号１８に記載される配列の任意の数のアミノ酸が、二重特異性抗体の中に含まれ得る。Ｖ_Ｈ領域又はＶ_Ｌ領域を有する本明細書において提供する配列のＮ末端又はＣ末端の配列は、二重特異性抗体の中に含まれ得る。一態様においては、配列番号１、配列番号２、配列番号９、配列番号１０、配列番号１７又は配列番号１８のＮ末端又はＣ末端の配列の、約１００～１０５アミノ酸、約１００～１１０アミノ酸、約１００～１１５アミノ酸、約１００～１２０アミノ酸、約１００～１２５アミノ酸、及びその間の任意の数又は範囲が、本明細書において提供する二重特異性抗体の中に含まれる。別の態様においては、二重特異性抗体は、配列番号１、配列番号９又は配列番号１７の配列を含む。さらに別の態様においては、二重特異性抗体は、配列番号２、配列番号１０又は配列番号１８のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸を含む。またさらなる態様においては、二重特異性抗体は、配列番号１０のＮ末端配列の約１１２アミノ酸又は配列番号１８のＮ末端配列の約１０８アミノ酸を含む。

【0055】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第１の抗原結合領域は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ領域と、配列番号１０のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌ領域とを含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第１の抗原結合領域は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈ領域と、配列番号１８のＮ末端の配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌ領域とを含む。

【0056】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第２の抗原結合領域は、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する。本明細書において用いる場合、「免疫チェックポイント分子」の語は、免疫応答を阻害又は負に調節する任意の分子を指す。一態様においては、免疫チェックポイント分子への第２の抗原結合領域の結合により、免疫チェックポイント分子が阻害される。例示的な免疫チェックポイント分子としては、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、及びＬＡＧ３が挙げられる。本明細書において用いる場合、「免疫刺激分子」の語は、免疫応答を誘導、増強又は正に調節する任意の分子を指す。例示的な免疫刺激分子としては、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、及びＩＣＯＳが挙げられる。一部の態様においては、免疫刺激分子への第２の抗原結合領域の結合により、免疫刺激分子が活性化されて、例えばシグナル伝達の増加及び免疫活性化の増加が結果的に生じる。本明細書において用いる場合、「腫瘍抗原」の語は、腫瘍細胞の表面に存在する又は腫瘍細胞において発現した任意の抗原を指す。例示的な腫瘍抗原としては、変異したオンコジーンの産物、変異した腫瘍抑制遺伝子の産物、オンコジーン又は腫瘍抑制因子以外の変異した遺伝子の産物、発がん性ウイルスにより産生された腫瘍抗原、変化した細胞表面の糖脂質及び糖タンパク質、がん胎児性抗原、ならびに他のものが挙げられる。また腫瘍抗原には、例えば免疫チェックポイント阻害剤及び免疫刺激分子等の免疫調節分子が含まれる。したがって、一部の態様においては、腫瘍抗原、本明細書において提供する二重特異性抗体の第２の抗原結合領域は、免疫調節分子としての機能と結合する。一態様においては、第２の抗原結合領域の腫瘍抗原への結合により、例えばＴ細胞等の免疫細胞を、腫瘍細胞に向かわせることが結果的に生じる。

【0057】

第１及び第２の抗原結合領域の任意の組み合わせが、本明細書において提供する二重特異性抗体の中に含まれ得、例えば任意の免疫チェックポイント分子、任意の免疫刺激分子、又は任意の腫瘍抗原に結合する第１及び第２の抗原結合領域が含まれる。したがって、一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体の第２の抗原結合領域は、任意の免疫チェックポイント分子、任意の免疫刺激分子、又は任意の腫瘍抗原に結合する。一部の態様においては、第１及び第２の抗原結合領域は、同一の分子に結合する。例えば、第１及び第２の抗原結合領域は、同一分子の同一の又は異なるエピトープに結合し得る。他の態様においては、第１及び第２の抗原結合領域は、異なる分子に結合する。

【0058】

一部の態様においては、第２の抗原結合領域は、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、ヒト上皮細胞増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、又はグリカンから選択される抗原に結合する。例示的なグリカンとしては、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、及びグリコスフィンゴリピドが挙げられる。グリカンは、がん細胞において独占的に発現し得、例えばＧｌｏｂｏＨ等である。一態様においては、第２の抗原結合領域は、ＰＤ－Ｌ１に結合する。別の態様においては、第２の抗原結合領域は、Ｈｅｒ２に結合する。さらに別の態様においては、第２の抗原結合領域は、グリカンに結合する。さらなる態様においては、グリカンはＧｌｏｂｏＨである。ＣＤ１３７と、ＰＤ－Ｌ１に加えて又はＰＤ－Ｌ１以外の腫瘍上で発現する抗原とに結合する二重特異性抗体のレパートリーを増殖することにより、例えばＰＤ－Ｌ１を発現しないがん型へと二重特異性抗体を向かわせることが可能になる。

【0059】

一態様においては、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域とＰＤ－Ｌ１に結合する第２の抗原結合領域とを有する二重特異性抗体は、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に同時に結合する（図１６）。理論に制限されることなく、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１の両方に結合することが可能である二重特異性抗体を設計することによってＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍部位に対する抗－ＣＤ１３７結合活性を制限することにより、例えばウレルマブ等の抗－ＣＤ１３７抗体での臨床試験で見られた肝毒性の危険性及びそれに付随する致死率を減少させることができる。さらに、ＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１に同時に結合することにより、架橋結合の結果としてのＴ細胞活性化を増強することができると考えられている（以下の実施例１０も参照のこと）。別の態様においては、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域とＰＤ－Ｌ１に結合する第２の抗原結合領域とを有する二重特異性抗体が、例えばウトミルマブ及びウレルマブ等である参照抗体と比較してより強いＣＤ１３７取込みを誘導する（図２３）。

【0060】

一部の態様においては、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。一態様においては、第１の抗原結合領域はｓｃＦｖを含み、第２の抗原結合領域はＦａｂを含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体に含まれるｓｃＦｖは、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する。さらに別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体に含まれるｓｃＦｖは、ＣＤ１３７に結合する。一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体に含まれるＦａｂは、免疫チェックポイント分子、免疫刺激分子、又は腫瘍抗原に結合する。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体に含まれるＦａｂは、ＰＤ－Ｌ１に結合する。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体のｓｃＦｖは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１０のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む。さらに別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体のｓｃＦｖは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域と、配列番号１８のＮ末端配列の約１００～１２０アミノ酸のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域とを含む。

【0061】

一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域と、Ｈｅｒ２に結合する第２の抗原結合領域とを含む。ＣＤ１３７及びＨｅｒ２に結合する二重特異性抗体は、例えばトラスツズマブ（重鎖 配列番号３６）又は抗－Ｈｅｒ２＃３－７（重鎖 配列番号３８）等であるＨｅｒ２に結合する抗体のＦｃドメインのＣ末端に融合するＣＤ１３７に結合するｓｃＦｖを含む。ある態様においては、ＣＤ１３７及びＨｅｒ２に結合する二重特異性抗体は、配列番号３５（トラスツズマブ）又は配列番号３７（抗－Ｈｅｒ２＃３－７）の軽鎖をさらに含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ＣＤ１３７に結合する第１の抗原結合領域と、腫瘍特異性グリカンに結合する第２の抗原結合領域とを含む。ＣＤ１３７及び腫瘍特異性グリカンに結合する二重特異性抗体は、例えば本明細書において提供する抗－グリカン等である腫瘍特異性グリカンに結合する抗体のＦｃドメインのＣ末端に融合するＣＤ１３７に結合するｓｃＦｖを含む（重鎖 配列番号４０）。ある態様においては、ＣＤ１３７及び腫瘍特異性グリカンに結合する二重特異性抗体は、配列番号３９の軽鎖（抗－グリカン）をさらに含む。一部の態様においては、ＣＤ１３７及びＨｅｒ２又はＣＤ１３７及び腫瘍特異性グリカンに結合する二重特異性抗体は、抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖをＦｃドメインに結合させるリンカーをさらに含む。例えばＧＳリンカー（配列番号２８）、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２９）又はその複合体等である任意のリンカーを用いることが可能である。一態様においては、当該リンカーはＧ４Ｓリンカーである。

【0062】

したがって、本発明は、標的依存性Ｔ細胞活性化のプラットフォームを提供する。一態様においては、抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖのアゴニスト活性は、図１９及び図２０に示すように、例えばＰＤ－Ｌ１等の腫瘍特異性抗原に結合すると誘導される。抗－ＣＤ１３７アゴニスト活性はまた、図２１及び図２２に示すように、例えばＨｅｒ２及び腫瘍特異性グリカン等である他の腫瘍特異性抗原に結合することによって活性化することも可能である。

【0063】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、ｓｃＦｖのＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域の間にリンカーを含む。任意のリンカーを用いることが可能である。例えば、リンカーは、任意のアミノ酸配列を含むことが可能である。リンカーは、例えば１個のアミノ酸、２個のアミノ酸、３個のアミノ酸、４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、１５個のアミノ酸、１６個のアミノ酸、１７個のアミノ酸、１８個のアミノ酸、１９個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、又はそれ以上のアミノ酸等である任意の長さのものとすることが可能である。リンカーはまた、アミノ酸配列の複合体を含むことも可能である。任意の数のアミノ酸配列複合体をリンカー内に含めることが可能である。例示的なリンカー配列としては、配列番号２８及び配列番号２９に提供する。一部の態様においては、ｓｃＦｖは、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

【0064】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、Ｆｃドメインをさらに含む。ある態様においては、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、ＩｇＥドメイン、ＩｇＭドメイン、及びＩｇＤドメイン、ＩｇＡドメイン、又はＩｇＹドメインである。任意の配列の任意の種からのＦｃドメインを用いることが可能であり、ヒト、類人猿（ａｐｅ）、サル、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ウマ及びその他が含まれる。一部の態様においては、ＩｇＧドメインは、ＩｇＧ１ドメイン、ＩｇＧ２ドメイン、ＩｇＧ３ドメイン、又はＩｇＧ４ドメインである。一態様においては、ＩｇＧ４ドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。別の態様においては、ＩｇＧ１ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。一態様においては、Ｆｃドメインはヒトである。概して、ヒトＦｃドメインは、ヒトにおいて免疫原性ではなく、したがってヒトの治療での使用に好適である。

【0065】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体のｓｃＦｖは、ＦｃドメインのＣ末端に結合する。一態様においては、リンカーは、Ｆｃドメイン及びｓｃＦｖの間に含まれる。別の態様においては、リンカーは、ｓｃＦｖをＦｃドメインに結合する。例えば本明細書において提供するＧ４Ｓリンカー等の任意のリンカーを用いることが可能である。

【0066】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体のＦａｂは、ＦｃドメインのＮ末端に結合する。一態様においては、Ｆａｂは、ペプチド結合を介してＦｃドメインのＮ末端に直接結合する。別の態様においては、Ｆａｂドメインは、リンカーを介してＦｃドメインのＮ末端に結合する。

【0067】

一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３１又は配列番号３２の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３０の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３６の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３５の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３８の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３７の軽鎖配列をさらに含む。一態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号４０の重鎖配列を含む。別の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体は、配列番号３９の軽鎖配列をさらに含む。例えば配列番号３１、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０及びその他等である重鎖配列は、１又は複数のＧリンカー（配列番号２８）、１又は複数のＧ４Ｓリンカー（配列番号２９）、又はＧリンカーもしくはＧ４Ｓリンカーの任意の複合体含むことが可能であるが、任意の他の好適なリンカーを用いることが可能である。

【0068】

一部の実施形態においては、本明細書においては、配列番号３０～４０に記載される単離されたアミノ酸配列を提供する。本明細書においては、一部の実施形態において、配列番号３０～４０のアミノ配列のうちのいずれか１つをコードする単離された核酸配列もまた提供する。

【0069】

一部の実施形態においては、本明細書においては、抗体－薬剤複合体を提供する。本明細書において提供する抗体－薬剤複合体は、本明細書において提供する任意の抗体又はその抗原結合断片を含み得る。例えば、ＣＤ１３７に特異的に結合する任意の抗体又はその抗原結合断片が、抗体－薬剤複合体に含まれ得る。本明細書において提供する任意の二重特異性抗体又はその抗原結合断片はまた、抗体－薬剤複合体に含まれ得る。一部の態様においては、本明細書において提供する抗体－薬剤複合体は、治療薬を含む。任意の治療薬は、小分子を含めて、本明細書において提供する抗体－薬剤複合体に含まれ得る。一部の態様においては、治療薬は細胞傷害活性を有する。細胞傷害活性を有する任意の化学療法薬が、抗体－薬剤複合体に含まれ得る。例示的な化学療法薬としては、アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、抗エストロゲン剤、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポシロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、タキソール、タキソテール、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビンデシンが挙げられるがこれに限定されない。

【0070】

一部の態様においては、本明細書において提供する抗体－薬剤複合体は、がんの治療に用いられる。例えば、抗体－薬剤複合体に含まれる抗体は、腫瘍細胞上の抗原に結合し、それによって細胞傷害活性をもつ小分子又は該抗体－薬剤複合体に含まれる他の治療薬を、腫瘍細胞に向かわせる。抗体－薬剤複合体が腫瘍細胞に結合すると、小分子又は他の治療薬は、腫瘍細胞内に取り込まれて放出される。

【0071】

一部の態様においては、本明細書において提供する抗体－薬剤分子に含まれる治療薬は、本明細書において提供する抗体もしくはその抗原結合断片と、又は本明細書において提供する二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片と共有結合する。治療薬を抗体もしくはその抗原結合断片に又は二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片に共有結合させるために、リンカーを用いることが可能である。治療薬を本明細書において提供する抗体もしくはその抗原結合断片に又は本明細書において提供する二重特異性抗体もしくはその抗原結合断片に共有結合させるために、任意の好適なリンカーを用いることが可能である。一部の態様においては、本明細書において提供する抗体－薬剤複合体に含まれるリンカーは、血液循環を含めて標的細胞の外側において安定であり、標的細胞内側で切断されて治療薬を放出する。細胞傷害活性を有する治療薬は、例えば、放出されると標的細胞死を誘導することが可能である。したがって、一部の態様においては、治療薬は、選択的に腫瘍細胞に向けられる。治療薬の腫瘍細胞に対する選択的標的化により、概して、例えば非腫瘍細胞に対する細胞傷害性の減少及び忍容性の増加が結果的に生じる。

【0072】

本明細書においては、一部の態様においては、本明細書において提供する二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。本明細書において提供する任意の二重特異性抗体は、医薬組成物に含まれ得る。一態様においては、本明細書において提供する医薬組成物に含まれる二重特異性抗体は、ＣＤ１３７、ＰＤ－Ｌ１、又はＣＤ１３７及びＰＤ－Ｌ１の両方に結合する。本明細書において提供する抗体－薬剤複合体もまた、医薬組成物に含まれ得る。一部の態様においては、がんの治療のために医薬組成物を用いる。本明細書において提供する医薬組成物を用いて、任意のがんを治療することが可能である。例示的ながんとしては、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、及び白血病が挙げられる。

【0073】

一部の実施形態においては、本明細書において、対象におけるがんを治療する方法を提供する。がんを治療する方法は、がんを治療するのに有効である、本明細書において提供する任意の二重特異性抗体又はその抗原結合断片のある量を対象に投与することを含む。一部の態様においては、当該がんは、前立腺がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫、リンパ腫、乳がん、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、子宮がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、口腔がん、咽頭がん、膵がん、甲状腺がん、皮膚がん、脳がん、骨がん、造血器がん、又は白血病である。

【実施例】

【0074】

実施例１
この実施例では、ＯｍｎｉＭａｂライブラリーよりの抗体産生を説明する。

【0075】

ＣＤ１３７に対する治療用抗体を生成するために、ＯｍｎｉＭａｂファージミドライブラリーによる選択を実行した。当該ファージミドライブラリーは、１００例を超える健常ドナーからの末梢血単核球の採取群からＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．社（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．社）により構築された。予め被覆したＣＤ１３７－Ｆｃ組換えタンパク質を、救済したファージを含有する上清と共に１時間インキュベートし、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳで３回洗浄した。結合したファージをＨＲＰ標識した抗－Ｍ１３抗体（Ｒｏｃｈｅ社）で検出し、またシグナル発生のためにＴＭＢ基質を用いた。ＯＤ４５０読み取り値を記録した。

【0076】

１回目のパニングは、ハイパーファージ（Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ）（Μ１３Κ０７ΔρΙΙΙ、Ｐｒｏｇｅｎ社、ドイツ国ハイデルベルグ）を用いて実施した。ＣＤ１３７に対する固相パニング及び細胞パニングを、ＯｍｎｉＭａｂライブラリーからのＣＤ１３７特異性バインダーの選択及び単離のために用いた。固相パニングは、１回目での選択で用いた組換えヒトＣＤ１３７－ＥＣＤ－Ｆｃ（ＡＰＢｉｏ Ｉｎｃ．社）を用いて実施した。２回目及び３回目の濃縮には、ＣＤ１３７を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いた。３回目のパニングの後で、特異性ＣＤ１３７バインダーを、直接ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによりスクリーニング及び単離した（図１及び図２）。ＦＡＣＳ解析のために、ＣＤ１３７を安定的に発現する２９３Ｆ細胞を、抗－ＣＤ１３７ファージ上清（５０ｕｌ／ウェル）で染色し、ＣＤ１３７結合活性を調べた。ＣＤ１３７を安定的に発現する２９３Ｆ細胞はまた、対照としての２．５ｕｇ／ｍｌの抗－ＣＤ１３７抗体（Ａｂ）と共に、１時間氷上でインキュベートした。当該細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、次いで抗－Ｍ１３抗体（Ｐｒｏｇｅｎ社）と共に、１時間氷上でインキュベートした。再度、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、抗－マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．社）と共に、さらに１時間氷上でインキュベートした。染色後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、１×ＰＢＳ中で再懸濁してから、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社）及びＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，ＬＬＣ社）で解析した。ＣＤ１３７を安定的に発現する２９３Ｆ細胞クローン１３についてのＦＡＣＳ解析を、図２に示す。陽性であるバインダーを単離して、重鎖の配列及び多様性を確認するために配列決定に送った。図１及び図２に示すように、負の対照と比較して、ＣＤ１３７抗原を特異的に認識したいくつかのクローンが単離された。

【0077】

これら結果は、３回のＣＤ１３７特異的な濃縮後に得られたファージクローンが、ＣＤ１３７を特異的に認識するということを示す。

【0078】

実施例２
この実施例では、ＩｇＧ形態での、ＣＤ１３７に特異的に結合するタンパク質のサブクローニング、発現及び精製について説明する。

【0079】

Ｔ細胞活性化における機能性をもつ候補を素早くスクリーニングするために、ＥＬＩＳＡにより同定された陽性であるＣＤ１３７又はＰＤ－Ｌ１のバインダーの重鎖及び軽鎖を増幅し、消化し、そしてＡＰＢｉｏ社により生成されてＩｇＧ４定常領域（配列番号２５）を担持するＩｇＧ発現ベクターにサブクローニングした。配列検証後、２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、抗体発現のためにプラスミドを調製してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。培養の４日後、無血清培地中に分泌された抗体を、プロテインＧクロマトグラフィーにより培養上清からアフィニティ精製した。精製した抗体は、濃縮して、その後にＰＢＳバッファー中での透析が続いた。透析タンパク質の最終濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を用いて決定し、そしてその純度及び完全性を、還元剤と共に又は還元剤を伴わずに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより決定した。

【0080】

図３は、精製した抗－ＣＤ１３７抗体リードの第１のバッチ（図３、上図）及び第２のバッチ（図３、下図）の代表的なＰＡＧＥゲル解析を示す。トランスフェクション４日後に採取した哺乳動物細胞よりの培養上清を、プロテインＧクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて精製した。精製したタンパク質は、還元条件又は非還元条件下で解析してから、ゲル上にロードした（３μｇ／レーン）。結果は、非還元条件下では両タンパク質が分子量約１４５ｋＤａであり、また還元条件下では重鎖及び軽鎖はそれぞれ、分子量約５５ｋＤａ及び約２５ｋＤａであることを示した。一工程のプロテインＧクロマトグラフィーにより、９０％以上の純度を達成することができた。

【0081】

これら結果により、種々の精製された抗体リードの完全性がＨＥＫ２９３細胞において正常であることが示される。

【0082】

実施例３
この実施例では、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞への抗－ＣＤ１３７抗体の結合を説明する。

【0083】

精製した抗－ＣＤ１３７抗体リードはまた、ＣＤ１３７を誘導したジャーカット細胞に適用されて、ＦＡＣＳで結合活性を決定した。ジャーカット細胞は、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で処理し、２日間ＣＤ１３７発現を誘導した。刺激した細胞は、陽性対照としての抗－ＣＤ１３７（０．５μｇ／ｍｌ）及び参照（ｒｅｆ）抗体（０．５μｇ／ｍｌ）と共に１時間氷上でインキュベートしたか、未染色のままとしたか、又は陰性対照としてのＯＸ４０参照（ｒｅｆ）抗体と共にインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、次いでＡｌｅｘａ－４８８標識したヤギ抗－ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．社）と共に、さらに１時間氷上でインキュベートした。染色後、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄して、１×ＰＢＳ中で再懸濁してから、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社）及びＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，ＬＬＣ社）で解析した。ＣＤ１３７抗体リードのうち、いくつかのリードは、図４に示すように参照抗体と匹敵する結合活性を保有した。

【0084】

これら結果は、フローサイトメトリーで見られるように、抗－ＣＤ１３７抗体リードの活性化ジャーカット細胞への結合を示す。

【0085】

実施例４
この実施例では、ＥＬＩＳＡによる抗－ＣＤ１３７抗体結合活性の決定について説明する。

【0086】

ＣＤ１３７に結合する抗－ＣＤ１３７抗体の直接のリガンド結合アッセイを実施するために、組換えＣＤ１３７／Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて予め被覆したウェルを調製した。簡潔には、精製したヒトＣＤ１３７－ＩｇＧ４ Ｆｃ（ＡＰＢｉｏ社）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で透析し、１ｍｇ／ｍｌに調節し、次いでＰＢＳで最終濃度１μｇ／ｍｌに希釈した。Ｎｕｎｃイムノマキシソープ（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐ）９６ウェルプレートを、非特異的に結合する対照のために空のウェルを残しつつ、組換えＣＤ１３７タンパク質で１ウェル当たり０．１ｍｌで予め被覆して、４℃で一晩インキュベートした。ＣＤ１３７組換えタンパク質溶液を除き、プレートを０．４ｍｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で３回洗浄した。０．４ｍｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ中５％の低脂肪乳粉末）を全てのウェルに添加して、室温で１時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除き、０．４ｍｌ洗浄緩衝液で３回洗浄した。

【0087】

予め被覆したウェルを、精製した抗－ＣＤ１３７抗体の段階希釈物と共にインキュベートした。ＣＤ１３７抗体の段階希釈物は、ＰＢＳ中で調製し、各ウェルに０．１ｍｌを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。抗体溶液を除き、プレートを０．４ｍｌ洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰ標識したヤギ抗－ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社 ＃１０９－０３６－０９７）をＰＢＳで１：２０００で希釈し、１ウェル当たり０．１ｍｌで添加した。当該プレートを室温で１時間インキュベートし、１ウェル当たり０．４ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートを０．１ｍｌのＴＭＢ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発色させ、室温で１～５分間インキュベートした。０．０５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止し、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｓｐｅｃｔｒａで４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。ＯＤ４５０の読み取り値を抗－ＣＤ１３７の濃度に対してプロットし、ＣＤ１３７／Ｆｃに結合する抗－ＣＤ１３７抗体の５０％有効濃度（ＥＣ_５０）値を算出した。ＥＣ_５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて算出した。抗－ＣＤ１３７抗体のクローン３１及びクローン５４について算出されたＥＣ_５０値が、参照抗体に匹敵する結合活性を示した。抗－ＣＤ１３７特異性抗体リードについて算出されたＥＣ_５０値が、参照抗体と比較して良好な結合活性を示した（図５）。

【0088】

発色前に、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体を、ＨＲＰ標識した抗－ヒトＩｇＧ１ Ｆａｂ抗体により検出して、ＯＤ４５０の読み取り値を抗－ＰＤ－Ｌ１濃度に対してプロットした。

【0089】

実施例５
この実施例では、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる、高度に濃縮された抗－ＣＤ１３７抗体リードのタンパク質凝集の評価について説明する。

【0090】

ＳＥＣ－ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ社２９９６ Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ検出装置を備えたＷａｔｅｒｓ社Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ ２６９５を用いて実施した。ＳＥＣ分離のための移動相バッファーとして、均一溶媒である２５ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８を用いて、サンプルをＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ社、カタログ番号＃１７６００７６４０）にロードした。流速は０．４ｍＬ／分とし、またサンプル注入量は１０μＬとした。２８０ｎｍにおける吸光度でピークを検出した。ＳＥＣカラムへの注入前に、全てのサンプルを０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、カタログ番号＃ＳＬＧＰ００３ＲＢ）でろ過して、沈殿したあらゆるタンパク質物質を除いた。データは、Ｅｍｐｏｗｅｒ ２ソフトウェアで解析した。図６に示すように、高度に濃縮した抗－ＣＤ１３７抗体のクローン３１及びクローン５４のメインピークの百分率は、９０％を超えており、明らかなタンパク質の凝集はなかった。

【0091】

これら結果は、高濃度の抗－ＣＤ１３７抗体は結果として凝集を形成しないということを示す。

【0092】

実施例６
この実施例では、抗－ＣＤ１３７抗体のアゴニスト活性について説明する。

【0093】

精製した抗体リードを、サイトカインの産生、増殖及びヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞の増殖の誘導が増強されたことにより見られるような、ヒトＣＤ３＋細胞の活性化を増強するそれらの能力に関して機能的スクリーニングを行った。抗－ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ、ＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号３１７３０４）、抗－ＣＤ１３７抗体リード又はアイソタイプ抗体（１、３、及び１０μｇ／ｍｌ）を、マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ） ９６ウェルプレート上に被覆した。ヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社、カタログ番号１５０６１）を用いて、健常な成人ボランティアの末梢血から単離した。単離したＣＤ３＋ Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） ＣＦＳＥ細胞増殖キット（ＣＦＳＥ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号Ｃ３４５５４）で標識して、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎仔血清、２．５ｍＭのＬ－グルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）で予め被覆したウェルに播種した（１ウェル当たり１×１０＾５細胞）。３日後、細胞増殖をフローサイトメトリーで解析して、またＩＬ－２及びＩＮＦ－γのサイトカイン産生をＥＬＩＳＡで解析した。図７及び図８に示すように、抗－ＣＤ１３７抗体リード＃１５、＃３１、及び＃５４は、試験した４ドナーのうち少なくとも２ドナーに関して、用量依存的及びドナー依存的にＣＤ３＋ Ｔ細胞の活性化を増強するアゴニスト活性を示した。抗－ＣＤ１３７のクローン＃３１及び＃５４は、参照抗体（ウトミルマブ；ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ－ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｄｒ：Ｄ１０９９７におけるＣｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；また米国特許第８，３３７，８５０号も参照）と比較してＴ細胞活性化が増強されたことでわかるように、匹敵する又はより高いアゴニスト活性を示した。したがって、クローン＃３１及び＃５４を、以下に記載するように、二重特異性抗体の構築のために選択した。

【0094】

実施例７
この実施例では、混合したリンパ球反応における抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＣＤ１３７抗体での組み合わせ治療について説明する。

【0095】

単核球をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標） ヒト単核球濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（カタログ番号１５０６８）によって健常ドナーの末梢血から単離して、ヒトＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４（それぞれ１０００Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０分化培地中で、６日間培養した。フローサイトメトリーを用いて、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＤ１４、ＣＤ８０又はＣＤ８３の発現によって、樹状細胞（ＤＣ）の分化が検証された。分化されたＤＣは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いた。同種異系のＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（カタログ番号１５０６２）を用いて、ヒト末梢血から単離した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の純度は、ＣＤ３及びＣＤ４発現に基づいて約９５％であった。ＣＦＳＥで標識したＣＤ４＋ Ｔ細胞を、抗体リードの存在下（０．４、２、及び１０μｇ／ｍｌ）で、ＤＣと共に３～５日間共培養した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーで解析し、また培養培地中のＩＬ－２及びＩＦＮ－γのサイトカイン産生をＥＬＩＳＡで検出した。ＩＬ－２及びＩＮＦ－γの産生は、アイソタイプの対照抗体と比較して、ＭＬＲにおける抗－ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下で有意に増加した。興味深いことに、例えばクローン＃３１等である抗－ＣＤ１３７抗体は、図９に示すように、２つの別個のドナーペアでのＭＬＲにおける抗－ＰＤ－Ｌ１抗体媒介性のＩＦＮ－γ産生を増強した。

【0096】

実施例８
この実施例では、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ相互作用に対する抗－ＣＤ１３７抗体の効果について説明する。

【0097】

ＨＥＫ－２９３Ｆ／ＣＤ１３７細胞を、アイソタイプ対照及び抗－ＣＤ１３７抗体（５０μｇ／ｍｌ）と共に、３０分間氷上でインキュベートし、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ（ＰＢＳ２）で２回洗浄し、そしてＨｉｓ標識した４－１ＢＢＬ（０．５μｇ／ｍｌ、Ａｃｒｏ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）と共に、２０分間氷上でインキュベートした。ＰＢＳ２での２回の洗浄後、ＨＥＫ－２９３Ｆ／ＣＤ１３７細胞上での抗－ＣＤ１３７抗体及び４－１ＢＢＬの提示を、それぞれ抗－ヒトＦｃ－Ａ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）及び抗－Ｈｉｓ抗体－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて検出し、その後にＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ社）を用いた解析が続いた。アイソタイプ対照とのインキュベート以外は、ほとんど全ての細胞がＡ４８８陽性であった。ＡＰＣチャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，ＬＬＣ社）を用いて算出し、そして値をヒストグラムとして示した（図１０）。図１０に示すように、参照抗体１（ｒｅｆ１）及びクローン＃５４が、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ相互作用を効果的に阻止し、一方で、参照抗体２（ｒｅｆ２）、クローン＃１５、及びクローン＃３１は、ＣＤ１３７－ＣＤ１３７Ｌ相互作用の阻止において効果を欠いていた又は非効率的であった。

【0098】

実施例９
この実施例では、インビボでの抗－ＣＤ１３７抗体リードの薬物動態について説明する。

【0099】

抗体を、ＳＣＩＤ－ベージュマウスに、静脈内ボーラス注射により体重１ｋｇ当たり５ｍｇ量で投与した。注射後の図示した時点で、末梢血を採取した。以下に記載するように、ＥＬＩＳＡによって抗体血漿中濃度を検出した。ＣＤ１３７－ヒトＦｃ（１μｇ／ｍＬ）で予め被覆したウェルを、漸増濃度の精製した抗－ＣＤ１３７ ＩｇＧ４抗体と共にインキュベートして、血漿中の抗体濃度を算出するために標準曲線を作成した（ブロッキング溶液中での新しい調製物を用いて）。様々な時点で採取したサンプルを、検出用に予め被覆したＣＤ１３７－ヒトＦｃウェルに加えた。発色前に、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄後、結合した抗体を、ＨＲＰ標識した抗－ヒトＦａｂ抗体（０．４μｇ／ｍＬ）を用いて検出した。抗体血漿中濃度は、内挿法によって算出した。ＰＫパラメータは、ＰＫＳｏｌｖｅｒソフトウェア（Ｚｈａｎｇ，Ｈｕｏ，Ｚｈｏｕ，＆ Ｘｉｅ，２０１０）を用いて算出した。抗体は、約１７６時間という良好なｔ_１／２と、約７８００ｕｇ／ｍｌ＊ｈというＡＵＣを示した（図１１）。

【0100】

実施例１０
この実施例では、抗－ＣＤ１３７抗体リードの架橋結合依存性アゴニスト活性について説明する。

【0101】

ＮＦ－κＢによるルシフェラーゼ及び全長ＣＤ１３７でＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションし、その後にそれぞれハイグロマイシン及びＧ４１８による選択を続けることにより、ＣＤ１３７レポーター細胞の安定なクローンを生成した。アゴニスト活性アッセイのために、単独の又はヤギ抗－ヒトＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９－００６－００８）により架橋結合した、抗－ＣＤ１３７抗体（１０、２、及び０．４μｇ／ｍｌ）を、当該レポーター細胞に添加して５時間インキュベートした。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ活性アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ６１２０）を用いて、ルシフェラーゼ活性を検出した。これまでの報告と一貫して、ウトミルマブ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ、図１２）が、架橋結合依存性のアゴニスト活性を示し、一方でウレルマブ（ＣＤ１３７ ｒｅｆ２、図１２）が、臨床試験で観察される深刻な肝毒性を引き起こす可能性がある架橋結合非依存性のアゴニスト活性を示した。ウトミルマブと比較して、ＣＤ１３７＃５４は、架橋結合することによってより大きなアゴニスト活性を示し、一方で架橋結合がない場合のアゴニスト活性は中程度で、ウトミルマブのアゴニスト活性と同様であった（図１２）。理論に制限されることなく、ＣＤ１３７＃５４のこの特性は、腫瘍特異性バインダーをもつ二重特異性抗体に含まれるときに、標的依存性Ｔ細胞活性化を誘導することができる。

【0102】

要約すれば、これら結果は、抗－ＣＤ１３７＃１５、抗－ＣＤ１３７＃３１、抗－ＣＤ１３７＃５４のアゴニスト活性の異なる架橋結合依存性を示す。

【0103】

実施例１１
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体の構築、発現及び精製について説明する。

【0104】

抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のクローン６を、ＡＤＣＣを含まないＩｇＧ形態で用い、また抗－ＣＤ１３７抗体を、ｓｃＦｖフォーマットで用いて、抗－ＰＤ－Ｌ１のクローン６の抗体Ｆｃ領域のＣ末端に融合した。ＣＤ１３７ ｓｃＦｖと融合した抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃ領域を含む二重特異性抗体コンストラクトを、概略を図１０に示すと共に以下の表１（配列）に示す。短いフレキシブルなペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２９）を、正確なフォールディングを確実にし、また立体障害を最小限にするように、抗－ＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃ領域の重鎖Ｃ－末端（配列番号２５又は配列番号２６）と抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖのＮ－末端モジュールとの間に配置した。抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ重鎖のアミノ酸配列は、配列番号３１及び配列番号３２に示す。抗体Ｆｃ融合タンパク質コンストラクトを、Ｇｉｂｃｏ ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを用いて発現させて、一工程のプロテインＧクロマトグラフィーを介してトランスフェクションした細胞の細胞培養上清から精製した。

【0105】

抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖに融合した抗体は、上記に示した抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖに融合した二重特異性の抗－ＰＤ－Ｌ１抗体Ｆｃに加えて、例えば抗－ＰＤ－１、抗－ＣＴＬＡ－４、抗－ＬＡＧ３及びその他等である抗－阻害性免疫チェックポイント抗体又は例えば抗－ＣＤ２８、抗－ＣＤ４０、抗－ＣＤ１３７、抗－ＣＤ２７、抗－ＩＣＯＳ及びその他等である免疫刺激抗体を含み得る。二重特異性抗体ごとに、あるリンカーを、抗体Ｆｃドメインと抗－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖとの間に配置して、二重特異性抗体を生成することが可能である。

【0106】

二重特異性抗体の純度は、９０％を超えていた（図１４及び図１５）。９０％を超える純度は、単一工程の精製プロセスで達成され、正確な分子量（Ｍｗ＝２２０ｋＤ）を有する精製された融合タンパク質と一貫していた。図１４は、精製された抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の代表的なＰＡＧＥゲル解析を示す。トランスフェクション４日後に採取した哺乳動物細胞よりの培養上清を、プロテインＧクロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて精製した。精製したタンパク質は、還元条件又は非還元条件下で解析してから、ゲル上にロードした（３μｇ／レーン）。結果は、非還元条件下では両タンパク質が分子量約２２０ｋＤａであり、また還元条件下では重鎖－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ及び軽鎖はそれぞれ、分子量約８５ｋＤａ及び約２５ｋＤａであることを示した。図１５は、μＣＥ－ＳＤＳによる、一工程のプロテインＡで精製した抗－ＰＤ－Ｌ１ ＃６－ＣＤ１３７ ＃５４ ｂｓＡｂの純度及び完全性を示す。

【0107】

実施例１２
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体による抗原認識について説明する。

【0108】

抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体の結合活性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）（カリフォルニア州メンローパーク）バイオセンサー解析で決定した。Ｈｉｓ標識したＣＤ１３７（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を、０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ＢＳＡを含むＤＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬで、ＨＩＳ１Ｋ（抗－Ｐｅｎｔａ－ＨＩＳ）バイオセンサー（カタログ番号１８－５１２０）に５分間ロードした。次いでセンサーを、同じバッファーを用いて１００ｎＭで、示されているような抗体に５分間曝露し、その後にさらに５分間の１００ｎＭの第２の抗原（マウスＦｃドメインに融合したＰＤ－Ｌ１）との結合が続いた。次いで、メーカーによって説明されるとおりに、Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、図１６に示す結合チャートを作成した。対照抗体と比較して、両方の二重特異性抗体（抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃３１及び抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４）が、まずＣＤ１３７を認識し、次いでＰＤ－Ｌ１も同様に認識することが可能であったが、これは二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１とＣＤ１３７を同時に標的にすることができることを実証している。

【0109】

要約すると、これら結果は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）バイオセンサー解析によって決定されたように、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１及びＣＤ１３７を同時に認識するということを示す。

【0110】

実施例１３
この実施例では、同種異系の混合したリンパ球反応における抗－ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）によるＴ細胞活性化の増強について説明する。

【0111】

単核球をＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標） ヒト単核球濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（カタログ番号１５０６８）によって健常ドナーの末梢血から単離して、ヒトＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４（それぞれ１０００Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ社）を含有するＲＰＭＩ１６４０分化培地中で、６日間培養した。同種異系のＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（カタログ番号１５０６２）で、ヒト末梢血から単離した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の純度は、ＣＤ３及びＣＤ４発現に基づいて約９５％であった。ＣＦＳＥで標識したＣＤ４＋ Ｔ細胞を、抗体リードの存在下（１、３、及び１０μｇ／ｍｌ）で、ＤＣと共に３～５日間共培養した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーで解析し、また培養培地中のＩＬ－２及びＩＦＮ－γのサイトカイン産生をＥＬＩＳＡで検出した。抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＣＤ１３７抗体での単一での治療及び組み合わせの治療と比較して、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４が、Ｔ細胞の活性化を顕著に増強した（図１７、２つのドナーペアに関する結果を示す）。

【0112】

これら結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、抗－ＰＤＬ－１及び抗－ＣＤ１３７抗体の単一での治療又は組み合わせでの治療と比較して、また抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃３１ ｂｓＡｂでの治療と比較して、混合したリンパ球反応におけるより有力なＴ細胞活性化を誘導したことを示す。

【0113】

実施例１４
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７ ｓｃＦｖ二重特異性抗体リードによる抗原特異性Ｔ細胞活性化の増強について説明する。

【0114】

ヒトメモリーＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞を、それぞれ、ＥａｓｙＳｅｐ（商標） ヒトメモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞濃縮キット（Ｈｕｍａｎ Ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社、カタログ番号１９１５７）及びヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社、カタログ番号１７９５３）を用いて、単離した。メモリーＣＤ４－Ｔ細胞と自己由来の未成熟ＤＣとの共培養を、抗体（０．４、２、及び１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＥＦＸ Ｕｌｔｒａ ＳｕｐｅｒＳｔｉｍ Ｐｏｏｌ ＭＨＣ－ＩＩサブセット（１ｕｇ／ｍｌ、ＪＰＴ社）により７日間刺激した。ＣＤ８－Ｔ細胞との共培養のため、ＴＬＲ－ＤＣを生成したが、ＩＬ－１β（１０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、ＩＦＮ－γ（５０００ＩＵ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、ＰＧＥ２（２５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）、及びＲ８４８（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）を分化培地に添加することによって、２４時間、未成熟ＤＣを成熟化するようにした。ＣＤ８ Ｔ細胞と自己由来のＴＬＲ－ＤＣとの共培養を、抗体（０．４、２、及び１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＣＥＦＸ Ｕｌｔｒａ ＳｕｐｅｒＳｔｉｍ Ｐｏｏｌ（１μｇ／ｍｌ、ＪＰＴ社）により７日間刺激した。実施例１２のＭＬＲで観察された結果と同様に、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、抗－ＰＤ－Ｌ１又は抗－ＣＤ１３７モノクローナル抗体での単一治療又は抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＣＤ１３７モノクローナル抗体での組み合わせ治療と比較して（図１８Ａ～図１８Ｂ）、メモリーＣＤ４ Ｔ細胞（図１８、Ａ図）及びＣＤ８ Ｔ細胞（図１８、Ｂ図）のリコール応答を増強した。

【0115】

要約すると、図１７（実施例１３）及び図１８（本実施例）で示した結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＣＤ１３７モノクローナル抗体の単独又は組み合わせのいずれかで治療すると見られたＴ細胞活性化よりもより頑健であるＴ細胞活性化を顕著に増強したということを示す。さらに、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂで治療すると見られたＴ－細胞活性化は、ＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞でのリコール応答アッセイにおいて見られたように、抗原依存性であった。理論に制限されることなく、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃３１ ｂｓＡｂと比較して、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂで見られた大きい効力をもつＴ細胞活性化により、二重特異性抗体の抗－ＣＤ１３７＃５４アームが立体障害なく固有のＣＤ１３７エピトープに結合することができるために結果的に二重特異性抗体の抗－ＰＤ－Ｌ１アームによるＰＤ－Ｌ１への結合を結果的に生じるということが示唆される。

【0116】

実施例１５
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体により誘導された標的依存性のＴ細胞活性化について説明する。

【0117】

ヒトＴ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標） ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社、カタログ番号１５０６１）を用いて単離した。精製したＴ細胞は、プレートに結合した抗－ＣＤ３（ＯＫＴ３、１μｇ／ｍｌ）により活性化され、そして図示されるような抗体治療下で、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するか又は親であるＨＥＫ２９３細胞と共に共培養した（図１９）。抗－ＰＤ－Ｌ１及び抗－ＣＤ１３７モノクローナル抗体での単一治療又は組み合わせ治療と比較して、抗－ＰＤ－Ｌ１－ＣＤ１３７二重特異性抗体は、図１９に示すように、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現する細胞での共培養によってはＴ細胞活性化を大きく増強したが、ＰＤ－Ｌ１陰性の親細胞での共培養では大きく増強しなかった。

【0118】

要約すると、これら結果は、プレート結合した抗－ＣＤ３（ＯＫＴ３）の存在下で、親ＨＥＫ２９３細胞ではなく、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現するＨＥＫ－２９３細胞と共に共培養した場合、標的依存性のＴ細胞活性化が抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７ ｂｓＡｂによってのみ誘導されたということを示す。

【0119】

実施例１６
この実施例では、抗－腫瘍抗原特異性ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体により誘導される腫瘍抗原依存性Ｔ細胞活性化について説明する。

【0120】

ヒトＣＤ８－Ｔ細胞を、上記に記載したように（実施例１５）、陽性選択によって単離した。精製したＣＤ８－Ｔ細胞を、１：１比での抗－ＣＤ３（ＯＫＴ３）被覆ポリビーズの存在下でＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞（ＮＣＩ－Ｈ１９７５、ＰＣ－３、及びＭＤＡ－ＭＤ－２３１）と共に共培養した。３日後、Ｔ細胞活性化を、ＥＬＩＳＡで測定されるＩＦＮ－γ産生に基づいて解析して、腫瘍細胞の細胞傷害性をＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号＃Ｇ１７８０）で検出した。

【0121】

抗－ＰＤ－Ｌ１＃６抗体及び抗－ＣＤ１３７＃５４抗体での単一療法又は組み合わせ療法と比較して、より頑健なＩＦＮ－γ産生が、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂにより誘導された（図２０）。ＣＤ８ Ｔ細胞のより高い腫瘍細胞の細胞傷害性が、ＰＣ－３細胞との共培養によって観察された（図２０Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍に加えて、抗－Ｈｅｒ２（トラスツズマブ又は＃３－７）と、ＣＤ１３７＃５４ ｓｃＦｖに結合する抗－腫瘍グリカン抗体とにより標的にされる、Ｈｅｒ２陽性（ＳＫＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－３６１）腫瘍細胞、及びグリカン陽性（ＭＣＦ－７及びＮＣＩ－Ｎ８７）腫瘍細胞もまた、単一療法又は組み合わせ療法と比較して、はるかに強力な、ＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ産生（図２１Ａ～図２１Ｂ及び図２２Ａ～図２２Ｂ）及び腫瘍細胞の細胞傷害性（図２２Ａ）を結果的に生じた。

【0122】

これら結果は、標的依存性Ｔ細胞活性化が、腫瘍を標的とするＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂによって特異的に誘導されたことを示す。

【0123】

実施例１７
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体によるＣＤ１３７取込みの誘導について説明する。

【0124】

ＣＤ１３７取込みもまた抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体のみならず参照抗体ウレルマブ及びＵｔｏｌｉｕｍａｂにより誘導されるか否かを調べるために、ＣＤ１３７を発現するＨＥＫ２９３細胞を用いて取込みアッセイを実施した（図２３）。１ウェル当たり５×１０＾３個のＣＤ１３７発現細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む黒色の９６ウェルプレートに予め播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。示されるような抗体を、メーカーのプロトコールに従ってｐＨＡｂアミン反応性色素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．社）で標識し、次いで培地中で１００ｎＭからの３倍段階希釈として調製した。次いで予め播種した細胞の培地を、標識した抗体を含有する培地で置換し、細胞を、インキュベーター内でさらに２４時間培養した。インキュベーション後、細胞をすすぎ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉＤ３での蛍光記録のためにＰＢＳ中に維持した。ＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて算出した。図２３に示すように、参照の抗－ＣＤ１３７抗体での治療と比較して、より強いＣＤ１３７の取込みの誘導が、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体での治療で観察された。理論に制限されることなく、二重特異性抗体（Ａｂ）がＣＤ１３７結合のみを介してＴ細胞に結合するならば、このレベルのＣＤ１３７取込みが、ＣＤ１３７活性化を減少させ得る。したがって、インビボで二重特異性抗体を投与すると、参照抗体と比較して、特にウレルマブと比較して、より低い毒性が二重特異性抗体では見られ得る。

【0125】

実施例１８
この実施例では、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体による、Ｔ細胞増殖のＴレグ（Ｔｒｅｇ）細胞媒介性阻害の救済について説明する。

【0126】

Ｔレグ抑制アッセイは、実施例１２に記載される混合したリンパ球反応を用いて確立された。Ｔレグ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ４^＋ＣＤ１２７^ｌｏｗＣＤ２５^＋制御Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社、カタログ番号１８０６３）を用いて末梢血から単離され、そしてＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴレグエキスパンダ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１２９Ｄ）を用いて増殖させた。増殖させたＴレグ細胞は、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖及びＩＬ－２産生を大きく抑制した。Ｔレグ細胞の抑制活性は、培養液への抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂの添加によって消失した（図２４Ａ～図２４Ｂ）。抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂは、Ｔレグ細胞の存在下での、Ｔ細胞増殖（図２４、Ａ図）とサイトカイン産生（図２４、Ｂ図）とを救済した。これら結果は、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂが、Ｔレグが媒介するＴ細胞活性化抑制を救済することができるということを示す。

【0127】

実施例１９
この実施例は、インビボでの抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体による腫瘍成長の阻害について説明する。

【0128】

マウスＰＤ－Ｌ１及びマウスＣＤ１３７と交差反応しない抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂの抗－腫瘍活性を検証するために、ヒト腫瘍細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２、ＮＣＩ－Ｈ１９７５及びＢｘＰＣ－３）を、ヒトＰＢＭＣと予め混合し、そしてＳＣＩＤ－ベージュマウスに対して皮下に異種移植して、インビボでの抗がん活性を評価した。腫瘍接種の７日後、等モルのｍＡｂ（分子量１５０ｋＤａ、１ｍｇ／ｋｇ）及びｂｓＡｂ（分子量１９５ｋＤａ、１．３ｍｇ／ｋｇ）を、週に２回腹腔内注射した。腫瘍サイズ（ｍｍ^３）は、週に２回測定し、また（長さ×幅×幅）／２として算出した。ＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍モデルにおいて、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂ（ＴＧＩ：６７．５％）の腫瘍成長阻害指数（ＴＧＩ）は、ＭＰＤＬ－３２８０ａの指数（ＴＧＩ：４４．３％）、及びＰＤ－Ｌ１＃６＋ＣＤ１３７＃５４の組み合わせの際の指数（ＴＧＩ：－１８．７７％）を超えていた（図２５、Ａ図）。同様に、ＮＣＩ－Ｈ１９７５腫瘍モデルにおいて、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂのＴＧＩ（ＴＧＩ：８０％）は、ＰＤ－Ｌ１＃６＋ＣＤ１３７＃５４の組み合わせの際の指数（ＴＧＩ：６７．２％）を超えていた（図２５、Ｂ図）。肺がんに加えて、ＢｘＰＣ－３膵臓がんモデルにおいて、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂはまた、組み合わせ療法（１０ｍｇ／ｍｌのＴＧＩがそれぞれ：－９．２％）と比較して、より大きい抗腫瘍活性（１．３ｍｇ／ｋｇのＴＧＩは４３％）を示した（図２５、Ｃ図）。すなわち、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂは、インビボでの２つの異なるがんモデルにおいて抗腫瘍活性を示した。

【0129】

要約すると、これら結果は、マウスでの異種移植腫瘍モデルにおいて、抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂで治療すると、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＣＤ１３７抗体での組み合わせ治療と比較して腫瘍成長阻害がより大きいことを示す。

【0130】

実施例２０
この実施例では、インビトロでの二重特異性抗体の存在下でのサイトカイン放出について説明する。

【0131】

３ドナーよりのヒトＰＢＭＣを、アイソタイプ、抗－ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、陽性対照として）、及び３つの二重特異性抗体（抗－ＰＤ－Ｌ１＃６、抗－Ｈｅｒ２＃３－７、及びＣＤ１３７＃５４ ｓｃＦｖに結合した抗－グリカン）と共に、０．６７、６．６７、及び６６．６７ｎＭで２４時間インキュベートした。培養培地に放出されたサイトカインは、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘイムノアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で検出した。ＯＫＴ３が顕著なサイトカイン放出を誘導したが、一方で３つの二重特異性抗体は、サイトカイン放出を誘導しなかった（図２６）。

【0132】

これら結果は、ＯＫＴ３と比較して、ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４、Ｈｅｒ２＃３－７－ＣＤ１３７＃５４及びグリカン－ＣＤ１３７＃５４のｂｓＡｂが、ヒトＰＢＭＣとインキュベートした場合にバックグラウンドより高い顕著なサイトカイン放出を誘導しなかったということを示す。

【0133】

実施例２１
この実施例では、アカゲザルにおける抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４二重特異性抗体の薬物動態パラメータを説明する。

【0134】

二重特異性の抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４抗体（体重１ｋｇ当たり５及び２５ｍｇ）を、２つの群（１群当たり１匹のオス及び１匹のメス）のアカゲザルに静脈内ボーラス注射により投与した。注射後０．５、６、２４、４８、７２及び１４４時間で、末梢血を採取した。抗体の血漿中濃度を、ＥＬＩＳＡで決定した。マキシソーププレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＣＤ１３７－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、１μｇ／ｍＬ）で被覆して、その後標準曲線として、段階希釈した血漿サンプルと抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂとを加えた。結合した抗体を、ＴＭＢ基質を用いて、ビオチン化ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＡＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）及びＨＲＰ標識ストレプトアビジンとで検出した。抗体の血漿中濃度は、内挿法によって算出した。ＰＫパラメータは、ＰＫＳｏｌｖｅｒソフトウェア（Ｚｈａｎｇ，Ｈｕｏ，Ｚｈｏｕ，＆ Ｘｉｅ，２０１０）を用いて算出した。抗－ＰＤ－Ｌ１＃６－ＣＤ１３７＃５４ ｂｓＡｂのｔ_１／２は、２５ｍｇ／ｋｇ注射群及び５ｍｇ／ｋｇ注射群でそれぞれ約８７及び４９時間であり（図２７Ａ～図２７Ｂ）、また実験期間中に、ＡＬＴ／ＡＳＴのレベルの上昇は観察されなかった（図示せず）。

【0135】

配列

【0136】

（表１）二重特異性抗体のモノクローナル抗体及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の規定されたＣＤＲ領域の配列

【0137】

参考文献

【0138】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈において別段に明示されていない限り複数形が含まれる。すなわち、例えば「その方法」という記載は、本開示を一読するなどして当業者に明らかになることとなる、本明細書に記載のタイプの、１もしくは複数の方法及び／又は工程を含む。

【0139】

本明細書において言及した公開公報、特許、及び特許出願は、あたかも個々の公開公報、特許又は特許出願のそれぞれが参照によって援用されるように具体的にかつ別個に示すのと同程度に参照により本明細書において援用される。

【0140】

別段に規定しない限り、本明細書において用いた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は同等である任意の方法及び物質を、本発明の実施又は試験において用いることが可能であるが、変形及びバリエーションが、本開示の趣旨及び範囲の範囲内に包含されるということが理解されるだろう。

【0141】

範囲：この開示全体にわたって、本発明の様々な態様が、範囲の形態で存在し得る。範囲の形態での記載は、単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する固定された制限として解釈されるべきではないということを理解されたい。したがって、ある範囲についての記載は、可能性のある下位の範囲の全てのみならずその範囲内にある個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲についての記載は、例えば１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等である具体的に開示された下位の範囲のみならず、その範囲の中の例えば１、２、２．１、２．２、２．７、３、４、５、５．５、５．７５、５．８、５．８５、５．９、５．９５、５．９９、及び６である個々の数を有するものとみなされるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。

【0142】

本発明について、上記の実施例を参照しながら記載してきたが、変形及びバリエーションが、本発明の趣旨及び範囲内に包含されるということを理解されたい。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B-1】

【図20B-2】

【図20C】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【配列表】

2022539527000001.app

【国際調査報告】