知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ライプニッツ−インスティトゥート フィア ノイエ マテリアーリエン ゲマインニュッツィゲ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクタ ハフトゥンクの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-12
(54)【発明の名称】新規のヒドロゲル
(51)【国際特許分類】
C08G 81/00 20060101AFI20220905BHJP
【ＦＩ】
C08G81/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021577328
(86)(22)【出願日】2020-06-23
(85)【翻訳文提出日】2022-01-20
(86)【国際出願番号】 EP2020067410
(87)【国際公開番号】W WO2021001203
(87)【国際公開日】2021-01-07
(31)【優先権主張番号】102019117997.1
(32)【優先日】2019-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500449008
【氏名又は名称】ライプニッツ－インスティトゥート フィア ノイエ マテリアーリエン ゲマインニュッツィゲ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクタ ハフトゥンク
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パエス フリエタ アイ．
(72)【発明者】
【氏名】ファルク アリーザ
(72)【発明者】
【氏名】デル カンポ アランサス
【テーマコード（参考）】
4J031
【Ｆターム（参考）】
4J031AA53
4J031AB04
4J031AC11
4J031AD01
4J031AF03
(57)【要約】
本発明はヒドロゲル、それらを作製する方法及びそれらの使用に関する。ヒドロゲルは、チオールと電子不足ヘテロ芳香族化合物との反応に基づく。この反応は、生理的条件下で行うことができるため、細胞のカプセル化に適している。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）ａ１）官能基として少なくとも２個のチオール基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
ａ２）官能基として、それぞれが少なくとも１個のスルホニル基によって置換された少なくとも２個の芳香族又はヘテロ芳香族基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
を含み、少なくとも１つの成分ａ１）又はａ２）が前記官能基を少なくとも３個有する組成物を調製する工程と、
ｂ）前記官能基を介して前記２つのマクロマーを反応させて、ヒドロゲルを形成する工程と、
を含む、ヒドロゲルを作製する方法。
【請求項2】
前記マクロマーが５００ｋＤａ未満の平均モル質量を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記マクロマーが２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の官能基を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記マクロマーが、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリＨＰＭＡ、若しくはポリＨＥＭＡ等のポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミド、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリアセタール、ポロキサマー（ＰＥＧ－Ｃｏ－ＰＰＧ－Ｃｏ－ＰＥＧ等のエチレンオキシド（ＰＥＧ）とプロピレンオキシド（ＰＰＧ）とのブロックコポリマー）、ポリ－２－オキサゾリン、ポリホスファゼン、ポリグリセロール、ポリリシン若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミン、ポリカーボネート、ポリグルタミン酸、特にポリ－ガンマ－グルタミン酸、ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）、ポリホスホネート、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼラチン、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－ガンマ－グルタミン酸、コラーゲン、ＶＰＭ、アルブミン、若しくはフィブリン等のタンパク質若しくはペプチド、アガロース、キチン、キトサン、コンドロイチン、マンナン、イヌリン、デキストラン、セルロース、アルギン酸塩、若しくはヒアルロン酸等の多糖類等のオリゴマー又はポリマーをベースとすることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記マクロマーａ２）の前記官能基が、式（１）：Ｍ－Ａｒ－ＳＯ２－Ｒ１ （１）
（式中、
Ａｒは、電子不足アリール基又は電子不足ヘテロアリール基であり、
Ｍは、マクロマーとの結合部であり、
Ｒ１はＮ（Ｒ２）２、１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基、又は２個～２０個のＣ原子を有するアルケニル若しくはアルキニル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＯ、ＮＲ２、Ｓ、Ｒ２Ｃ＝ＣＲ２、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ２によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基であり、
Ｒ２は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ３）２、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は２個～２０個のＣ原子を有するアルケニル若しくはアルキニル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＲ３Ｃ＝ＣＲ３、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ又はＣ（＝Ｏ）ＮＲ３によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基であり、
Ｒ３は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、ＯＨ、又は脂肪族、芳香族及び／又はヘテロ芳香族有機ラジカル、特に１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基であり、１個以上のＨ原子がＦによって置き換えられていてもよい）の官能基であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ａｒが、ニトロベンゼン、ベンズアルデヒド、ベンゾニトリル、安息香酸エステル、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン、テトラジン、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、１，２，３－チアジアゾール、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、又は１，３，４－チアジアゾール等のチアジアゾール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、キノリン、イソキノリン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾピリダジン、ベンゾピリミジン、キノキサリン、ベンゾトリアゾール、ナフタルイミド、プリン、プテリジン、インドリジン、及びベンゾチアジアゾールを包含する群から選択されることを特徴とする（ここで、Ａｒは、それぞれ、付加的に１個以上のＲ２基によって置換されていてもよい）、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記組成物のマクロマー含有量が１ｗｔ％～３０ｗｔ％であることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
生理的条件下でゲル化を行うことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載のように得られるヒドロゲル。
【請求項10】
第２の複数のマクロマーと架橋された第１の複数のマクロマーを含むヒドロゲルであって、架橋が複数のＡｒ－Ｓ結合を介して行われ、Ａｒが芳香族又はヘテロ芳香族基である、ヒドロゲル。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の成分ａ１）及びａ２）を含む、ヒドロゲルを作製するための組成物。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載の成分ａ１）及びａ２）を含む、ヒドロゲルを作製するためのキット。
【請求項13】
細胞のカプセル化、三次元細胞培養、オルガノイド、生体材料、注射用生体材料、細胞療法、組織改変、組織再生、組織移植、再生医療、３Ｄ印刷、３Ｄバイオプリンティング、創傷被覆材若しくは創傷治療、活性成分の輸送剤、診断剤若しくは治療剤の研究若しくは試験のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、又は細胞移植への請求項９又は１０に記載のヒドロゲルの使用。
【請求項14】
ａ）成分ａ１）による少なくとも２個の官能基又は成分ａ２）による少なくとも２個の官能基を有するゲル又はその前駆体を準備する工程と、ｂ）それぞれ他の成分に応じて、少なくとも２個の官能基を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのマクロマーを含む組成物を添加する工程と、
ｃ）前記マクロマーの前記官能基と前記ゲル又はその前駆体とを反応させることによって、前記ゲル又はその前駆体を修飾する工程と、
を含む、ゲルを修飾する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はヒドロゲル、それらを作製する方法及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒドロゲルは、高い割合の水を含む架橋親水性ポリマーの三次元網目構造である。かかる材料の既知の用途には活性成分輸送、創傷材料、組織工学等の生物学的用途のためのマトリックス材料が含まれ、これらは細胞培養にも使用することができる。ヒドロゲルは、それらの水性かつ多孔質の構造により、栄養素を細胞に効果的に輸送することができる。
【0003】
多くの天然又は合成ポリマー、例えばコラーゲン、ゼラチン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が既にヒドロゲルの調製に使用されている。ヒドロゲルの架橋のために、例えば光重合、マイケル付加等の様々な反応及び機構が研究されている。
【0004】
特に、架橋反応の制御は大きな課題である。これは、細胞を被覆する目的でヒドロゲルが作製される場合に特に当てはまる。ゲルが過度に急速に重合する場合、均一に架橋しないことが多い。ゲルが過度に緩徐に重合する場合、封入すべき構成成分、例えば細胞が沈降する可能性があり、均一に封入されない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、特に細胞の被覆に使用することができるヒドロゲルを作製する方法を提供することである。更なる目的は、かかるヒドロゲル及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記目的は、独立請求項の特徴を有する発明によって達成される。本発明の有利な発展形態は、従属請求項において特徴付けられている。これによって、全ての特許請求の範囲の文面は、引用することにより本明細書の一部をなす。本発明はまた、独立請求項及び／又は従属請求項の全ての合理的な組合せ、特に全ての指定された組合せを包含する。
【0007】
ａ）
ａ１）官能基として少なくとも２個のチオール基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
ａ２）官能基として、それぞれが少なくとも１個のスルホニル基によって置換された少なくとも２個の芳香族又はヘテロ芳香族基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
を含み、少なくとも１つの成分ａ１）又はａ２）が記載の官能基を少なくとも３個有する組成物を調製する工程と、
ｂ）官能基を介して２つのマクロマーを反応させて、ヒドロゲルを形成する工程と、
を含む、ヒドロゲルを作製する方法。
ａ１）官能基として少なくとも２個のチオール基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
ａ２）官能基として、それぞれが少なくとも１個のスルホニル基によって置換された少なくとも２個の芳香族又はヘテロ芳香族基を有する少なくとも１つのマクロマーと、
を含み、少なくとも１つの成分ａ１）又はａ２）が記載の官能基を少なくとも３個有する組成物を調製する工程と、
ｂ）官能基を介して２つのマクロマーを反応させて、ヒドロゲルを形成する工程と、
を含む、ヒドロゲルを作製する方法。
【0008】
個々の方法工程を以下でより詳細に説明する。工程は必ずしも指定の順序で行う必要はなく、概説される方法は、記載されていない更なる工程を含んでいてもよい。
【0009】
マクロマーは５００ｋＤａ未満、好ましくは１００ｋＤａ未満、特に５０ｋＤａ未満の平均モル質量を有する化合物であると理解される。平均モル質量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって重量平均分子量として決定される。
【0010】
特に好ましいマクロマーは５０ｋＤａ未満、特に３０ｋＤａ未満の平均モル質量を有するマクロマーである。
【0011】
本発明の特定の一実施の形態においては、マクロマーの平均モル質量は、１００Ｄａ～５００ｋＤａ、好ましくは２００Ｄａ～２００ｋＤａ、特に８００Ｄａ～１００ｋＤａである。
【0012】
ここで、マクロマーが対応する官能基を有し、これらの基が反応に利用可能であることが重要である。
【0013】
これに関連して好ましいマクロマーは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の官能基、好ましくは２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個の官能基、より好ましくは２個、３個、４個、５個又は６個の官能基を有し、特に２個、３個又は４個の官能基を有するマクロマーである。
【0014】
「ヒドロゲルを形成する」とは、架橋の結果としてヒドロゲルが形成されることを意味する。したがって、架橋反応が十分な程度まで行われる。これは、用いられる成分の性質及び量によって制御することができる。
【0015】
別の好ましい実施の形態においては、少なくとも１つの成分ａ１）又はａ２）が、記載の官能基を少なくとも４個有する。
【0016】
好ましい一実施の形態においては、成分ａ１）及びａ２）の両方が記載の官能基を少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個有する。より好ましくは、成分ａ１）及びａ２）の両方が３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の官能基、好ましくは３個、４個、５個、６個、７個、８個の官能基、より好ましくは３個、４個、５個又は６個の官能基、特に３個又は４個の官能基を有する。
【0017】
水溶性マクロマーが好ましい。これは、マクロマーが反応の条件下で必要とされる程度まで溶液中に存在することを意味する。
【0018】
好ましいマクロマーは、オリゴマー又はポリマーをベースとするマクロマーである。これらは、天然又は合成オリゴマー又はポリマーであり得る。合成オリゴマー又はポリマーの例は、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリＨＰＭＡ、若しくはポリＨＥＭＡ等のポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミド、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリアセタール、ポロキサマー（ＰＥＧ－Ｃｏ－ＰＰＧ－Ｃｏ－ＰＥＧ等のエチレンオキシド（ＰＥＧ）とプロピレンオキシド（ＰＰＧ）とのブロックコポリマー）、ポリ－２－オキサゾリン、ポリホスファゼン、ポリグリセロール、ポリリシン若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミン、ポリカーボネート、ポリグルタミン酸、特にポリ－ガンマ－グルタミン酸、ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）、ポリホスホネートであり、天然オリゴマーは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼラチン、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－ガンマ－グルタミン酸、コラーゲン、ＶＰＭ、アルブミン、又はフィブリン等のタンパク質又はペプチド、アガロース、キチン、キトサン、コンドロイチン、マンナン、イヌリン、デキストラン、セルロース、アルギン酸塩、又はヒアルロン酸等の多糖類である。好ましいオリゴマーは、ポリエチレングリコールをベースとするオリゴマーである。オリゴマー及びポリマーは、対応する官能基で官能基化される。
【0019】
ペプチドベースのオリゴマーの場合、チオール基は、システイン又はホモシステイン等の対応するアミノ酸によって与えられるのが好ましい。ここでの「ペプチドベースの」とは、問題のオリゴマーが分子質量の少なくとも８０％の程度まで天然又は非天然アミノ酸から構成されることを意味する。したがって、かかるオリゴマーは少なくとも２個のチオール基、特に少なくとも２個のシステインを有する。
【0020】
また、天然ポリマーの少なくとも部分的な使用は、例えば酵素によって特異的に切断可能な部位のヒドロゲルへの導入を可能にする。
【0021】
官能基が短いリンカー、例えば１つ以上のエステル、エーテル又はアミド結合を介してオリゴマー又はポリマーに結合することが必要な場合がある。好ましいリンカーは、１５００ｍｏｌ未満、好ましくは８００ｍｏｌ未満、特に５００ｍｏｌ未満又は２００ｍｏｌ未満のモル質量を有するリンカーである。
【0022】
チオール基は、遊離チオール基の形態であるのが好ましい。ヒドロゲルが形成される前に除去される基を有することも可能である。
【0023】
マクロマーａ２）は、それぞれが少なくとも１個のスルホニル基によって置換された少なくとも２個の芳香族基を有するマクロマーである。好ましい基は、式（１）：
Ｍ－Ａｒ－ＳＯ２－Ｒ１ （１）
（式中、Ａｒは、電子不足アリール基又は電子不足ヘテロアリール基である）の基である。結果として、第１のマクロマーのチオール基がＡｒ基に対して芳香族求核置換を行うことができ、ＳＯ２－Ｒ１基が脱離基として働く反応条件を選択することが可能である。
Ｍ－Ａｒ－ＳＯ２－Ｒ１ （１）
（式中、Ａｒは、電子不足アリール基又は電子不足ヘテロアリール基である）の基である。結果として、第１のマクロマーのチオール基がＡｒ基に対して芳香族求核置換を行うことができ、ＳＯ２－Ｒ１基が脱離基として働く反応条件を選択することが可能である。
【0024】
Ｍは、好ましくはマクロマーとの共有結合部であり、好ましくは単結合、エーテル又はカルボニル基である。カルボニル基は、エステル又はアミド結合の一部であってもよい。したがって、Ａｒ基として、例えば相応に置換された安息香酸エステル又は安息香酸アミド等の対応するエステル又はアミドをマクロマーへのカップリングに使用することができる。
【0025】
本発明の意味におけるアリール基は、６個～４０個のＣ原子を有し、本発明の意味におけるヘテロアリール基は、１個～４０個のＣ原子及び少なくとも１個のヘテロ原子を有するが、但し、Ｃ原子及びヘテロ原子の合計は少なくとも５となる。ヘテロ原子はＮ、Ｏ及び／又はＳから選択されるのが好ましい。ここでのアリール基又はヘテロアリール基は、単一の芳香環、すなわちベンゼン、又は単一のヘテロ芳香環、例えばピリジン、ピリミジン、チオフェン等、又は縮合アリール若しくはヘテロアリール基、例えばナフタレン、ナフタルイミド、アントラセン、キノリン、イソキノリン等のいずれかを指す。
【0026】
電子不足アリール基又はヘテロアリール基は、負の誘導効果又は負のメソメリー効果（－Ｉ効果又は－Ｍ効果）の結果としてπ電子密度が低下したアリール基又はヘテロアリール基を指す。これらの効果をもたらす置換基又は基のリストは、有機化学の任意の標準的な教科書に見られる。限定されずに挙げることができる例は、－Ｉ置換基についてはＯＨ、ハロゲン、特にフッ素及び塩素、ＮＯ２、不飽和の基であり、－Ｍ置換基についてはＮＯ２、ＣＮ、アリール基又はヘテロアリール基である。これらの電子求引性基（ＥＷＧ）は当然ながら、所望の効果を発揮することができるためには、脱離基－ＳＯ２－Ｒ１、すなわち、炭素環系の場合はオルト位又はパラ位に共役する必要がある。ヘテロアリール基の場合、ヘテロ原子がそれらの位置に応じて相応に電子密度の低下に寄与する。２個以上の異なる基が存在していてもよい。
【0027】
電子不足アリール基の例は、ニトロベンゼン、ベンズアルデヒド、ベンゾニトリル、ベンゾエステル（benzoesters）であり、以下に定義するように付加的に１個以上のＲ２基によって置換されていてもよい。この種のアリール基の例は、１個又は２個のニトロ基を有するニトロ安息香酸をベースとする化合物、例えば少なくとも１つの位置に－ＳＯ２－Ｒ１基を有するニトロ安息香酸エステル又はニトロ安息香酸アミドである。この基は、ニトロ基に対してメタ位に配置されるのが好ましい。３位のニトロ基及び４位の－ＳＯ２－Ｒ１基が特に好ましい。かかる化合物の一例は、３－ニトロ－４－スルホメチル安息香酸である。
【0028】
電子不足ヘテロアリール基の例は、例えば、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、１，３，５－トリアジン、１，２，４－トリアジン、又は１，２，３－トリアジン等のトリアジン、１，２，４，５－テトラジン、１，２，３，４－テトラジン、又は１，２，３，５－テトラジン等のテトラジン、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２－チアゾール又は１，３－チアゾール等のチアゾール、イソチアゾール、１，２，３－オキサジアゾール、１，２，４－オキサジアゾール、１，２，５－オキサジアゾール、及び１，３，４－オキサジアゾール等のオキサジアゾール、１，２，３－チアジアゾール、１，２，４－チアジアゾール、１，２，５－チアジアゾール、又は１，３，４－チアジアゾール等のチアジアゾール、イミダゾール、ピラゾール、特に１，２，４－トリアゾール又は１，２，３－トリアゾール等のトリアゾール、テトラゾール等の単環式ヘテロ芳香族化合物、以下に定義するように付加的に１個以上のＲ２基によって置換されていてもよい、キノリン、イソキノリン、ナフタルイミド、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾピリダジン、ベンゾピリミジン、キノキサリン、ベンゾトリアゾール、プリン、プテリジン、インドリジン、及びベンゾチアジアゾール等の多環式ヘテロ芳香族化合物である。
【0029】
好ましいヘテロアリール基は、オキサジアゾール及びベンゾチアゾールである。
【0030】
本発明の好ましい一実施の形態においては、Ａｒは、少なくとも１個の更なるアリール基又はヘテロアリール基、好ましくはフェニルによって置換された多環式ヘテロアリール基又は単環式ヘテロアリール基である。
【0031】
別の特に好ましい実施の形態においては、Ａｒは、好ましくは少なくとも１個のフェニル基、特に１個のフェニル基によって置換されたオキサジアゾール基、特に１，３，４－オキサジアゾール基である。
【0032】
別の実施の形態においては、Ａｒは少なくとも１個、好ましくは１個又は２個の－Ｉ又は－Ｍ置換基、好ましくはＦ又はＮＯ２、より好ましくはＮＯ２を有するアリール基である。
【0033】
Ｒ１はＮ（Ｒ２）２、１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基、又は２個～２０個のＣ原子を有するアルケニル若しくはアルキニル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、ここでアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＯ、ＮＲ２、Ｓ、Ｒ２Ｃ＝ＣＲ２、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ２によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である。
【0034】
Ｒ２は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ３）２、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は２個～２０個のＣ原子を有するアルケニル若しくはアルキニル基、又は３個～２０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、ここでアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＲ３Ｃ＝ＣＲ３、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ３によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である。
【0035】
Ｒ３は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、ＯＨ、又は脂肪族、芳香族及び／又はヘテロ芳香族有機ラジカル、特に１個～２０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基であり、１個以上のＨ原子がＦによって置き換えられていてもよい。
【0036】
好ましい一実施の形態においては、Ｒ１はＮ（Ｒ２）２、１個～１０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は３個～１０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、ここでアルキル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＯ、ＮＲ２、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ２によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である。
【0037】
Ｒ２は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ（Ｒ３）２、ＣＮ、ＮＯ２、ＯＲ３、ＳＲ３、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）２、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、１個～１０個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は２個～１０個のＣ原子を有するアルケニル若しくはアルキニル基、又は３個～１０個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、ここでアルキル、アルケニル又はアルキニル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＲ３Ｃ＝ＣＲ３、Ｃ≡Ｃ、Ｃ＝Ｏ、ＮＲ３、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ３によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ３によって置換されていてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基である。
【0038】
Ｒ３は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、ＯＨ、又は１個～５個のＣ原子を有する直鎖アルキル基であり、１個以上のＨ原子がＦ又はＯＨによって置き換えられていてもよい。
【0039】
１つの特に好ましい実施形態において、Ｒ１はＮ（Ｒ２）２、１個～６個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は３個～６個のＣ原子を有する分岐若しくは環状アルキル基であり、ここでアルキル基は、それぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよく、１個以上の非隣接ＣＨ２基がＯ、ＮＲ２、Ｓ、Ｃ＝Ｏ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ若しくはＣ（＝Ｏ）ＮＲ２によって置き換えられていてもよく、又はそれぞれ１個以上のラジカルＲ２によって置換されていてもよい、５個～１０個の芳香環原子を有するアリール基若しくはヘテロアリール基である。
【0040】
Ｒ２は、それぞれ同一であるか又は異なり、Ｈ、Ｄ、Ｆ、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、１個～５個のＣ原子を有する直鎖アルキル基、又は５個～１０個の芳香環原子を有するアリール基若しくはヘテロアリール基であり、炭素に結合した１個以上のＨ原子がＦ又はＮＯ２によって置き換えられていてもよい。
【0041】
より好ましくは、Ｒ１は、置換若しくは非置換の、好ましくはＦ若しくはＣＯＯＨによって置換されたメチル基、エチル基、プロピル基であるか、又はＮ（Ｒ２）２、より好ましくはＮＨＲ２であり、ここでＲ２は５個～１０個の環原子を有するアリール基又はヘテロアリール基であり、炭素に結合した１個以上のＨ原子がＦ、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＯ２によって置き換えられていてもよい。特に好ましくは、Ｒ１はメチル、ＣＨ２－ＣＯＯＨ又はＮＨ－フェニルであり、ここでＮはＳＯ２基に結合している。
【0042】
本発明の好ましい一実施の形態においては、少なくとも１つのマクロマーは、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリＨＰＭＡ、又はポリＨＥＭＡ等のポリ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミド、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリラクチド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、又はポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）等のポリエステル、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリアセタール、ポロキサマー（ＰＥＧ－Ｃｏ－ＰＰＧ－Ｃｏ－ＰＥＧ等のエチレンオキシド（ＰＥＧ）とプロピレンオキシド（ＰＰＧ）とのブロックコポリマー）、ポリ－２－オキサゾリン、ポリホスファゼン、ポリグリセロール、ポリリシン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミン、ポリカーボネート、ポリグルタミン酸、特にポリ－ガンマ－グルタミン酸、ポリアスパラギン酸（ＰＡＳＡ）、ポリホスホネートをベースとしており、他のマクロマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼラチン、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリ－ガンマ－グルタミン酸、コラーゲン、ＶＰＭ、アルブミン、又はフィブリン等のペプチド、アガロース、キチン、キトサン、コンドロイチン、マンナン、イヌリン、デキストラン、セルロース、アルギン酸塩、又はヒアルロン酸等の多糖類をベースとしている。結果として、生化学的反応性、例えばマクロマー中のエステル基若しくは炭酸基による、又は酵素反応による切断又は分解能をヒドロゲルに組み入れることが可能である。好適なペプチドの例は、例えばＶＰＭ（配列：ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＧＤＲＣＧ）等の酵素的に切断可能なジチオールペプチドである。
【0043】
好ましくは、架橋に寄与する２つのマクロマー中の官能基ＳＨ：Ａｒ－ＳＯ２－Ｒ１の数が２：１～１：２、好ましくは１．５：１～１：１．５、より好ましくは１．２：１～１：１．２、特に１：１となるように両方のマクロマーを使用する。それぞれの官能基を有する２つ以上の異なる化合物を使用する場合、例えばチオール基を有する異なる化合物を使用する場合、数値はこれらの基の総数をベースとする。例えば、或るチオール化合物を修飾に使用し、別の化合物を架橋に使用することができる。
【0044】
両方のマクロマーが溶液、好ましくは水溶液中に存在するのが好ましい。ｐＨを、好ましくは緩衝液を用いて適合させる必要がある場合もある。
【0045】
好ましい一実施の形態においては、チオール基を有する第１のマクロマーを含む第１の溶液及び芳香族スルホニル基を有する第２のマクロマーを含む第２の溶液を準備する。次いで、これら２つの溶液を互いに組み合わせる。
【0046】
好ましい一実施の形態においては、使用されるマクロマーの溶液、特に組成物のｐＨは、（２５℃で）６～９である。ｐＨは、好ましくは緩衝液によって、好ましくは５ｍＭ～１００ｍＭの緩衝液濃度を用いて調整される。緩衝液の例は、ＰＢＳ又はＨＥＰＥＳである。比較的高い緩衝液濃度を用いることで、高いマクロマー濃度を用いた場合に、脱離基が酸として作用することができるため、ゲルのｐＨを安定させることが可能である。６～９、好ましくは６．５～８、より好ましくは６．６～７．５のｐＨが好ましい。結果として、例えば３秒間（ｐＨ８）～３．５分間（ｐＨ６．６）のゲル化時間（一定のマクロマー濃度を用いて２５℃で測定する）を確立することが可能である。
【0047】
第１のｐＨで組成物を構成した後、ｐＨを第２のｐＨに変化させることで架橋反応を開始することも可能である。架橋反応は、好ましくは第１のｐＨで少なくとも大幅に減速されるため、第１のｐＨが上述の範囲外であるのが好ましい。第２のｐＨは、上述の範囲の１つに含まれるのが好ましい。ｐＨの変化は、組成物を対応するｐＨの媒体に入れることによっても達成することができる。好ましくは、第２のｐＨは６～９、好ましくは６．５～８、より好ましくは６．６～７．５である。
【0048】
ｐＨを変化させることで反応を開始又は加速することもできる。
【0049】
別の好ましい実施の形態においては、組成物のマクロマー含有量は、使用される全てのマクロマーをベースとして１ｗｔ％～３０ｗｔ％、好ましくは３ｗｔ％～１５ｗｔ％、より好ましくは３ｗｔ％～１０ｗｔ％である。
【0050】
ヒドロゲルが形成される温度は、好ましくは２０℃～４５℃、好ましくは２０℃～４０℃である。
【0051】
本明細書に記載されるヒドロゲルの形成のための反応は、多数の利点を特徴とする。既知の架橋反応とは対照的に、この反応は生理的条件下で特に速くも特に遅くもなく、むしろｐＨを含む因子によって制御することができる。これにより、ゲルの形成時に細胞、又はペプチド、酵素、化学化合物等の他の物質をカプセル化することができる。ゲルの形成時に、組成物がより長時間粘性に保たれるため、低い剪断力でより長時間混合することができる。これにより、硬化の間にゲルを回転させる等の更なる工程を必要とすることなく、細胞をヒドロゲル中に均一に分布させることができる。
【0052】
また、提案した反応は、生理的条件下で十分に高速である。これにより、細胞培養、好ましくは三次元細胞培養又は更にはｉｎ ｓｉｔｕで使用することができる。ｐＨによってもゲル化を制御することができるため、例えば対応する組成物を注入した場合のｉｎ ｓｉｔｕ、３Ｄ印刷、又は生物におけるゲルの構築への使用が可能となる。
【0053】
好ましい一実施の形態においては、３秒～５分以内にゲル化が達成されるように条件が選択される。ここでのゲル化時間は、好ましくはマクロマー濃度、ｐＨ及び温度によって調整することができる。これにより、ゲルの物理的特性、例えば長期安定性、膨潤挙動及び機械的特性を調節することもできる。
【0054】
反応は、生理的条件下で反応しないＯＨ基、アミノ基、カルボン酸基及びアクリレート基に対しても直交性である。
【0055】
本発明の好ましい一実施の形態においては、２つのマクロマーの反応は、ヒドロゲルの形成のみに寄与する。他の架橋反応は起こらない。
【0056】
反応の速度は、スルホニル基を有する芳香族又はヘテロ芳香族基の選択及びｐＨの選択によって制御することができる。ゲル化速度は、特定の用途に応じて適合させることができる。他の反応とは対照的に、任意の開始剤又は促進剤を添加する必要はない。
【0057】
２つのマクロマーの比率は、反応後に全ての官能基が反応しているように選択するのが好ましい。比率は、更なる官能基化を行うかによって異なり得る。
【0058】
このため、例えば、第１のマクロマーの添加によってヒドロゲルの架橋及び形成が開始する前に、チオール含有化合物の事前添加によって第２のマクロマーを修飾することが可能である。このようにして、ヒドロゲルを更なる官能基で修飾することができる。例えば、フルオロフォア又は生物活性試薬が可能である。
【0059】
生物活性試薬の例は組織成長促進剤、化学療法剤、タンパク質（糖タンパク質、コラーゲン、リポタンパク質）、細胞結合メディエーター、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、フィブリン、若しくはインテグリン結合配列（例えばｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ））若しくはカドヘリン結合配列、成長因子、分化因子、又は上述の試薬の断片である。例は上皮成長因子ＥＧＦ、内皮成長因子ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子（例えばＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換成長因子（例えばＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β）、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、アプタマー又はペプチド模倣薬であり、ＶＥＧＦ等の細胞結合メディエーターが好ましい。
【0060】
修飾は、例えば培養すべき細胞に応じてヒドロゲル内に適切な環境を作り出すために用いることができる。
【0061】
試薬は、好ましくは効果的な濃度で使用され、これは例えば、膨潤ゲルをベースとして０．０１ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ～５０ｍＭ、特に０．２ｍＭ～１０ｍＭ、特に０．５ｍＭ～５ｍＭの範囲であり得る。
【0062】
本発明は、方法について記載したような少なくとも２個のマクロマーａ１）及びａ２）を含むハイブリッドゲルを作製するための組成物にも関する。
【0063】
本発明は、本発明の方法によって得られるヒドロゲルにも関する。
【0064】
本発明はまた、第２の複数のマクロマーと架橋された第１の複数のマクロマーを含むヒドロゲルであって、架橋が複数のＡｒ－Ｓ結合を介して行われ、Ａｒが芳香族又はヘテロ芳香族基である、ヒドロゲルに関する。
【0065】
この種の結合は、上記のように電子不足芳香族化合物に対するチオールによる求核置換から得ることができる。有利な実施の形態は、方法について記載している。
【0066】
本発明のヒドロゲルは、好ましくは最長６週間にわたる長期安定性を有する。これらは、簡単な方法で生理的条件下にて得て、修飾することができる。
【0067】
本発明のヒドロゲルは、細胞のカプセル化、三次元細胞培養、オルガノイド、生体材料、注射用生体材料、細胞療法、組織改変、組織再生、組織移植、再生医療、３Ｄ印刷、３Ｄバイオプリンティング、創傷被覆材若しくは創傷治療、活性成分の輸送剤、診断剤若しくは治療剤の研究若しくは試験のためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、又は細胞移植に特に適している。
【0068】
生理的条件下での反応であることから、記載の反応を特に生物学の分野で用いることができる。例えば、互いに反応する２つのマクロマーをｉｎ ｓｉｔｕでのみ互いに混合するか又は組み合わせることが考えられる。これは、例えば多成分注射器を用いて達成することができる。
【0069】
本発明は、細胞を被覆するためにヒドロゲルを細胞の存在下で形成する、細胞を被覆する方法に関する。これは、例えば細胞培養、特に三次元細胞培養に用いることができる。
【0070】
本発明は、方法について記載したようなマクロマーａ１）及びａ２）を含むヒドロゲルを作製するためのキットにも関する。
【0071】
記載の反応は、既存のゲルの付加的な架橋の達成にも適している。この種のプロセスにおいては、例えば、A. Farrukh, J. I. Paez, M. Salierno, A. del Campo, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2092-2096から知られるように、成分ａ１）又はａ２）の官能基を少なくとも２個含むゲルを、かかるモノマーのポリアクリルアミドゲルへの共重合によって準備し、マクロマーａ１）又はａ２）に従って対応する官能基を有するマクロマーと反応させ、この場合、マクロマーａ１）又はａ２）は、官能基を少なくとも２個有し、この反応の結果としてゲルが架橋される。
【0072】
したがって、本発明はまた、
ａ）成分ａ１）による少なくとも２個の官能基又は成分ａ２）による少なくとも２個の官能基を有するゲル又はその前駆体を準備する工程と、
ｂ）それぞれ他の成分に応じて、少なくとも２個の官能基を有する少なくとも１つのマクロマーを含む組成物を添加する工程と、
ｃ）ゲル又はその前駆体を、官能基と反応させることによって修飾する工程と、
を含む、ゲルを修飾する方法に関する。
ａ）成分ａ１）による少なくとも２個の官能基又は成分ａ２）による少なくとも２個の官能基を有するゲル又はその前駆体を準備する工程と、
ｂ）それぞれ他の成分に応じて、少なくとも２個の官能基を有する少なくとも１つのマクロマーを含む組成物を添加する工程と、
ｃ）ゲル又はその前駆体を、官能基と反応させることによって修飾する工程と、
を含む、ゲルを修飾する方法に関する。
【0073】
この方法は、好ましくはゲルの調製後に事後修飾のために使用される。結果として、ゲルを生理学的条件下で、例えばその機械的パラメーターを適合させるために修飾することが可能である。
【0074】
反応のｐＨ依存性及び／又は温度のために、例えば条件の規定の変化が起こった場合にのみこの修飾を行うことができる。
【0075】
更なる詳細及び特徴は、従属クレームと併せた以下の好ましい実施例の説明から明らかである。これに関連して、それぞれの特徴を単独で又は複合的に互いに組み合わせて実現することができる。目的を達成する可能性は、実施例に限定されない。例えば、範囲の指定は常に、言及されていない全ての中間値及び考えられる全ての部分区間を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1】本発明に従うヒドロゲルの作製の概略図である。
【図2】ａ）ＰＥＧ－チオール－ＭＳヒドロゲル（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｗｔ％のポリマー濃度）の写真；ｂ）ゲル化中の剪断弾性率（５ｗｔ％ポリマー、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）、Ｔ＝２５℃）を示す図である。
【図3a】２５℃での様々なヒドロゲルのゲル化中の剪断弾性率（それぞれ５ｗｔ％；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液；ｐＨ８）を示す図である。
【図3b】３７℃での様々なヒドロゲルのゲル化中の剪断弾性率（それぞれ５ｗｔ％；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液；ｐＨ８）を示す図である。
【図4】架橋動態及び剪断弾性率に対する（５ｗｔ％ポリマー含有量、２５℃での）ｐＨの影響を示す図である（ａ）チオール－Ｍａｌ、チオール－ＭＳ、ｂ）チオール－ＶＳ）。
【図5】温度の関数としての剪断弾性率を示す図である（条件：３０分間、５ｗｔ％、ｐＨ７．０）。
【図6】調製したチオール－ＭＳゲルの機械的特性（棒、左目盛り）及びｐＨ（四角、右目盛り）に対するポリマー含有量及びＨＥＰＥＳ緩衝液濃度の影響を示す図である。条件：ｐＨ＝７．５、Ｔ＝２５℃、６０分間。
【図7】膨潤チオール－Ｘゲルの正規化質量の比較を示す図である。ゲルを３７℃で細胞培養培地において６週間又は４週間にわたってインキュベートした（ａ）１０ｗｔ％のポリマー分率、ｐＨ８．０；ｂ）ｐＨ７．０で５ｗｔ％のポリマー含有量）。これらの条件下で調製したチオール－ＭＳゲルは、細胞培養培地中で６週間のインキュベーション後であっても加水分解に対して安定している。
【図8】様々な酵素的に切断可能なチオール－Ｘヒドロゲルにカプセル化した線維芽細胞Ｌ９２９を示す図である。材料に１日カプセル化したＬ９２９線維芽細胞の単一細胞の生／死アッセイ（ａ～ｃ）：他の系と比較して、チオール－ＭＳヒドロゲル中で培養した細胞は、材料全体にわたってより均一な分布（ａ、Ｚスタック）及び同様の生存率（ｃ）を示した。
【図9】（ａ）細胞スフェロイドのカプセル化に使用される酵素的に切断可能なゲルのスキーム；（ｂ及びｃ）カプセル化スフェロイドからの細胞の移動挙動を示す図である。３日間の培養後の移動試験の結果から、チオール－ＭＳゲル中の移動距離が中間にあることが示された。染色：ＦＩＴＣ－ファロイジン（アクチン線維）、ＤＡＰＩ（核）。
【図10】３日間の細胞培養後の様々な酵素的に切断可能なチオール－Ｘヒドロゲルに封入した個々の細胞（マウス線維芽細胞Ｌ９２９）の形態を示す図である。他の系と比較して、チオール－ＭＳヒドロゲル中で培養した細胞は、より均一な分布、より少ないクラスター化又は凝集を示した。染色：ＦＩＴＣ－ファロイジン（アクチン線維）、ＤＡＰＩ（核）；スケールは、それぞれ５０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0077】
実施例を図面に示す。実施例においては、マクロマーはポリマーと称される。
【0078】
化学合成
化学物質及び溶媒はｐ．ａ．純度で入手し、特に記載のない限り直接使用した。４－（５－メチル－スルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）アニリンは、Ark Pharm（米国）から入手した。マレイミド（ＰＥＧ－Ｍａｌ）、ビニルスルホン（ＰＥＧ－ＶＳ）、チオール（ＰＥＧ－ＳＨ）及びＮ－スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＮＨＳ－ＰＥＧ）で官能基化された４アームポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ、ペンタエリスリトールをベースとして２０ｋＤａ）、並びにそれぞれＮＨＳ、ＳＨ、Ｍａｌ及びＶＳで同様に官能基化された線状メトキシル化ＰＥＧポリマー（５ｋＤａ）は、Jenkem（米国）から入手した。緩衝溶液は新たに調製した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０、ｐＨ７．０及びｐＨ６．７）及びリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及びｐＨ７．０）を使用した。
化学物質及び溶媒はｐ．ａ．純度で入手し、特に記載のない限り直接使用した。４－（５－メチル－スルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）アニリンは、Ark Pharm（米国）から入手した。マレイミド（ＰＥＧ－Ｍａｌ）、ビニルスルホン（ＰＥＧ－ＶＳ）、チオール（ＰＥＧ－ＳＨ）及びＮ－スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＮＨＳ－ＰＥＧ）で官能基化された４アームポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ、ペンタエリスリトールをベースとして２０ｋＤａ）、並びにそれぞれＮＨＳ、ＳＨ、Ｍａｌ及びＶＳで同様に官能基化された線状メトキシル化ＰＥＧポリマー（５ｋＤａ）は、Jenkem（米国）から入手した。緩衝溶液は新たに調製した。１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０、ｐＨ７．０及びｐＨ６．７）及びリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４及びｐＨ７．０）を使用した。
【0079】
重水素化溶媒は、Deutero GmbH Deutschland（D-56288 Kastellaun）から得た。重水素化リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）は、正確な量のリン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、塩化ナトリウム及び塩化カリウムをＤ２Ｏに溶解し、続いて８．０、７．４、７．０、７．０及び６．０のｐＤ値に達するまで２０％ＤＣｌ溶液（Merck）でｐＤ調整を行うことによって調製した。ｐＨメーターを用いてｐＨをモニタリングし、以下の補正係数を適用した：ｐＤ＝ｐＨｏｂｓ＋０．４（Bates et al., Anal. Chemie 1968 40 (4), 700-706を参照されたい）。
【0080】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（ＡＬＵＧＲＡＭ（商標） ＳＩＬ Ｇ／ＵＶ２５４）及びカラムクロマトグラフィー用のシリカゲル（６０Åの細孔径、６３μｍ～２００μｍの粒径）は、Macherey-Nagel（52355 Dueren、ドイツ）から得た。ＴＬＣプレートを２５４ｎｍ又は３６５ｎｍの光の下で観察した。化合物のＨＰＬＣ分析及びＨＰＬＣ精製は、ダイオードアレイ、ＵＶ－Ｖｉｓ検出器及びフラクションコレクターを備えるＨＰＬＣ ＪＡＳＣＯ ４０００（日本）を用いて行った。Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃ１８カラムをセミ分取（２５０ｍｍ×２５ｍｍ）及び分析（２５０ｍｍ×５ｎｍ）ランに使用した。溶媒勾配を、通例、４０分間にわたって以下の溶離液の組合せで用いた：溶媒Ａ（ＭｉｌｌｉＱ水＋０．１％ＴＦＡ）及び溶媒Ｂ（９５％ＡＣＮ／５％ＭｉｌｌｉＱ水＋０．１％ＴＦＡ）。修飾ポリマーを通例、アセトン及び水に対する透析によって精製した。Spectrum Inc.のＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ３透析チューブ（分子量カットオフ限界ＭＷＣＯ＝３．５ｋＤａ）を用いた。
【0081】
１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲ溶液スペクトルを２５℃でBrukerのＡｖａｎｃｅ ３００ＭＨｚ又はBrukerのＡｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄ ５００ＭＨｚにて記録した。後者は、外部水冷を用いるプロトン最適化三重共鳴ＮＭＲインバースプローブであるＨｅ冷却５ｍｍ ＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（ＣＰ ＴＣＩ ５００Ｓ２、Ｈ Ｃ／Ｎ－Ｄ－０５ Ｚ）を備えるものであった。他に指定のない限り、全ての測定を２９８Ｋで行った。テトラメチルシラン（ＴＭＳ）（δ＝０ｐｐｍ）を内部参照として使用した。化学シフトはｐｐｍ部で報告し、結合定数はヘルツで報告する。使用する略号は以下の通りである：ｓ－シングレット、ｄ－ダブレット、ｔ－トリプレット、ｑ－カルテット、ｍ－マルチプレット。ＰＥＧポリマーの置換度を末端基定量によって算出した。ＰＥＧ骨格に対応するシグナル（３．７０ｐｐｍ～３．４０ｐｐｍ）の積分値を４４０Ｈに設定し、組み込まれる分子２に対応するプロトン（８．１０ｐｐｍ～７．７０ｐｐｍの芳香族－ＣＨ及び４．２０ｐｐｍのメチレン）の積分値と比較した。全ての場合で９１％超の官能基化度及び９１％超の収率が達成された。データをＭｅｓｔＲｅＮｏｖａで分析した。
【0082】
質量スペクトルは、Agilent Technologiesの１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ液体クロマトグラフィー／質量選択検出器（ＬＣ／ＭＳＤ）及び６５４５精密質量四極飛行時間（accurate-mass quadrupol time of flight）（ＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ－ＭＳ）を使用し、エレクトロスプレーによる化学イオン化を用いて記録した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｃａｒｙ ４０００ ＵＶ／ＶＩＳ分光計（Varian Inc.、Palo Alto、米国）を使用して記録した。
【0083】
ヒドロゲルのレオロジー特性は、１２ｍｍ平行板及びペルチェプラットホームを備えるｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ－３レオメーター（TA Instruments、米国）にて２５℃及び３７℃で決定した。ソフトウェアはＴｒｉｏｓ ｖ４であった。データをＯｒｉｇｉｎ ９．１で記録し、分析した。
【化1】
【0084】
以下のプロトコルを幾らか修正して採用した：G. Liang et al., Chem. Commun., 2017, 53, 3567-3570、J. Ling et al., ChemBioChem 2018, 19, 1060。
【0085】
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（（４－（５－（メチルスルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）フェニル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバメート（１）の合成：
Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１当量、２．２８ｍｍｏｌ、０．３９４ｇ）を無水ＴＨＦ（３ｍｌ）に０℃で溶解した。クロロギ酸イソブチル（１．２当量、２．８５ｍｍｏｌ、０．３１４ｍｌ）及びＮ－メチルモルホリン（２．６当量、５．７ｍｍｏｌ、０．６２７ｍｌ）を窒素雰囲気下にて注射器を用いて溶液に慎重に添加した後、３０分間撹拌した。ＴＨＦ（３ｍｌ）中の４－（５－（メチルスルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）アニリン（０．２５当量、０．５７ｍｍｏｌ、０．１３６ｇ）の溶液を混合物に滴加した後、０℃で更に２時間、次いで室温で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、反応混合物を酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させ、分取ＨＰＬＣ（５Ｂ→９５Ｂ ２８０ｎｍ、反応時間＝２８分）によって精製し、凍結乾燥後に白色の固体１６５ｍｇを得た（収率＝７３％）。
Ｂｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１当量、２．２８ｍｍｏｌ、０．３９４ｇ）を無水ＴＨＦ（３ｍｌ）に０℃で溶解した。クロロギ酸イソブチル（１．２当量、２．８５ｍｍｏｌ、０．３１４ｍｌ）及びＮ－メチルモルホリン（２．６当量、５．７ｍｍｏｌ、０．６２７ｍｌ）を窒素雰囲気下にて注射器を用いて溶液に慎重に添加した後、３０分間撹拌した。ＴＨＦ（３ｍｌ）中の４－（５－（メチルスルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）アニリン（０．２５当量、０．５７ｍｍｏｌ、０．１３６ｇ）の溶液を混合物に滴加した後、０℃で更に２時間、次いで室温で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、反応混合物を酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させ、分取ＨＰＬＣ（５Ｂ→９５Ｂ ２８０ｎｍ、反応時間＝２８分）によって精製し、凍結乾燥後に白色の固体１６５ｍｇを得た（収率＝７３％）。
【0086】
２－アミノ－Ｎ－（４－（５－（５－（メチルスルホニル）－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）フェニル）アセトアミド（２）の合成：
化合物１（４５ｍｇ）を１：１ ＴＦＡ／ＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解し、溶液を室温で２時間撹拌し、窒素流下で蒸発させた。ＨＰＬＣ精製（５Ｂ→９５Ｂ ２８０ｎｍ、反応時間＝１８分）後に最終生成物が得られた（Ｙ＝９９％超）。純粋な化合物は即座にＰＥＧポリマーとカップリングしたが、そうでなければ－２０℃での貯蔵後に１週間の間に分解が観察された。
化合物１（４５ｍｇ）を１：１ ＴＦＡ／ＤＣＭ（２ｍｌ）に溶解し、溶液を室温で２時間撹拌し、窒素流下で蒸発させた。ＨＰＬＣ精製（５Ｂ→９５Ｂ ２８０ｎｍ、反応時間＝１８分）後に最終生成物が得られた（Ｙ＝９９％超）。純粋な化合物は即座にＰＥＧポリマーとカップリングしたが、そうでなければ－２０℃での貯蔵後に１週間の間に分解が観察された。
【0087】
ＰＥＧ－ＭＳの合成：
新たに調製した化合物２（５０μｍｏｌ、１５ｍｇ）及びＮ－メチルモルホリン（１８μｍｏｌ、２０μＬ）を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、窒素でフラッシングし、１５分間撹拌した。２０ｋＤａの４アームＰＥＧ－ＮＨＳ（１００ｍｇ、５μｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解し、窒素流下で添加した。混合物を不活性雰囲気下にて室温で一晩撹拌した後、アセトン及び水中で透析し、凍結乾燥した。白色の固体ポリマーを得て、ＤＣＭ ｄ２中での１Ｈ－ＮＭＲによって特性評価した。９１％超の官能基化度及び９０％超の収率が算出された。
【化2】
【0088】
２－（メチルスルホニル）－５－フェニル－１，３，４－オキサジアゾール基をチオールカップリングのＭＳ基質として選択した。記載のヘテロ芳香族ＭＳ環のうち、この基質は高い変換率及び中程度の反応速度でチオールと反応する（N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592-12596、X. Chen, H. Wu, C. M. Park, T. H. Poole, G. Keceli, N. O. Devarie-Baez, A. W. Tsang, W. T. Lowther, L. B. Poole, S. B. King, M. Xian, C. M. Furdui, ACS Chemical Biology 2017, 12, 2201-2208）。４アームＰＥＧ－ＭＳマクロマー（２０ｋＤａ）を３回の合成工程にわたって５００ｍｇ規模にて良好な収率（９１％超の置換度）で合成した。
【0089】
ヒドロゲルに対するレオロジー測定
４アームＰＥＧ－ＭＳ及び４アームＰＥＧ－チオール混合物のゲル化を研究した。用いた架橋条件は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）中５ｗｔ％のポリマー含有量、２５℃であった。１：１のＭＳ：チオール比を実験に用いた。研究により、チオール－ＭＳゲルが３分～４分以内に架橋ゲルを形成することが示された（表１を参照されたい）。これは、前駆体溶液の完璧な混合及び均質化を可能にする、好都合な架橋時間に相当する。レオロジー研究により、架橋ゲルがＧ’約１ｋＰａの剪断貯蔵弾性率に達することが明らかになった（図２ｂ）。膨潤ＰＥＧ－チオール－ＭＳヒドロゲル（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｗｔ％のポリマー濃度）を図２ａに示す。
４アームＰＥＧ－ＭＳ及び４アームＰＥＧ－チオール混合物のゲル化を研究した。用いた架橋条件は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）中５ｗｔ％のポリマー含有量、２５℃であった。１：１のＭＳ：チオール比を実験に用いた。研究により、チオール－ＭＳゲルが３分～４分以内に架橋ゲルを形成することが示された（表１を参照されたい）。これは、前駆体溶液の完璧な混合及び均質化を可能にする、好都合な架橋時間に相当する。レオロジー研究により、架橋ゲルがＧ’約１ｋＰａの剪断貯蔵弾性率に達することが明らかになった（図２ｂ）。膨潤ＰＥＧ－チオール－ＭＳヒドロゲル（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｗｔ％のポリマー濃度）を図２ａに示す。
【0090】
２０ｋＤａの４アームＰＥＧ－Ｘポリマーの溶液を新たに調製し、これらの研究に使用した。ポリマーを対応する溶媒に溶解し、ボルテクサーによって混合し、超音波浴内に保持し、遠心分離して泡を除去した。２１μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ Ｘ溶液、続いて２１μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－チオール溶液をレオメーターの下部ペルチェプレートに塗布し、ピペットチップによって直接プレート上で混合を行った。上部プレートを近付けてサンプルを２枚のプレートの間に挟み、測定中の蒸発を防ぐためにサンプルを続いて流動パラフィンで封止した。測定開始を含む全サンプルローディング時間は、約２分～３分であった。
【0091】
ヒドロゲルのゲル化時間及び最終剪断弾性率をレオメーターによって決定した。ひずみラン（周波数＝１Ｈｚで０．１％～１０００％のひずみ）及び周波数ラン（ひずみ＝１％で０．０１Ｈｚ～１００Ｈｚ）を行って線形粘弾性領域を決定した。時間ランは、以下のパラメーターを用いて線形粘弾性領域内で行った：スロット３００μｍ、軸力（０．０±０．１Ｎ）、周波数１Ｈｚ、ひずみ１％、温度＝２５℃又は３７℃。
【0092】
【0093】
図３ａにおいては、チオール－ＭＳの架橋動態とチオール－Ｍａｌ及びチオール－ＶＳ系の架橋動態とを比較する。実験は細胞培養に典型的な条件（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中５ｗｔ％のポリマー、２５℃）下で行った（E. A. Phelps, N. O. Enemchuwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012, 24, 64-70、A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734）。これらの条件下においては、チオール－ＭＳゲルが３秒～４秒で形成された（表１）。これは短い架橋時間に相当するが、ゲル前駆体の混合及び均質化には許容可能である。これと比較して、チオール－Ｍａｌゲルは架橋に１秒かかり、得られるゲルは不均一であり、一方でチオール－ＶＳ系は約１０分間のゲル化時間を生じ、架橋の完了に約２時間かかった。これらの結果から、表２に示されるように、ゲル化速度において以下の傾向：チオール－Ｍａｌ＞チオール－ＭＳ＞チオール－ＶＳが示され、モデル化合物について特定された反応速度と一致する（X. Chen, H. Wu., C. M. Park, T. H. Poole, G. Keceli, N. O. Devarie-Baez, A. W. Tsang, W. T. Lowther, L. B. Poole, S. B. King, M. Xian, C. M. Furdui, ACS Chemical Biology 2017, 12, 2201-2208、F. Saito, H. Noda, J. W. Bode, ACS Chemical Biology 2015, 10, 1026-1033、H. Wang, F. Cheng, M. Li, W. Peng, J. Qu, Langmuir 2015, 31, 3413-3421）。
【0094】
１時間後の架橋ゲルの剪断弾性率の値は、それぞれＧ’２５℃がチオール－ＶＳについては２０００Ｐａ、チオール－ＭＳについては１０００Ｐａ、チオール－Ｍａｌについては４７０Ｐａであった。チオール－ＭＳゲルのより高い剛性は、より遅いゲル化動態の結果として系の均一性がより高くなることで、網目構造の欠陥がより少なく、架橋度がより高くなるためである可能性が高い。
【0095】
この結果は、リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で同様の変換率が示された、小さなモデル分子に対するチオール－Ｍａｌ及びチオール－ＭＳカップリングの以前の反応性研究とは矛盾している（N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592-12596）。塩基性ｐＨで起こるＭａｌ基の加水分解が、チオール－Ｍａｌのより低い機械的特性の理由であり得ると仮定した。この仮定を検証するために、ｐＤ ８．０での重水素化ＰＢＳ中の４ｗｔ％ＰＥＧ－Ｍａｌ溶液の安定性を１Ｈ－ＮＭＲによって研究した。
【0096】
Ｍａｌ基の加水分解が２時間後に検出された。したがって、試験した条件の範囲内でＭａｌ基の加水分解がチオール－Ｍａｌの機械的特性に大きな影響を与えるものとは期待されない。チオール－ＶＳは最も高い剪断弾性率を達成したが、これはより高い変換率又は最も遅い硬化と一致し、はるかに欠陥の少ない網目構造が確実となる。全体として、これらの結果から、チオール－ＭＳ架橋が、非常に急速に架橋するチオール－Ｍａｌと遅いチオール－ＶＳベースの材料との間の中間的な動態となることが示される。数秒間の範囲で観察された架橋時間は、低い剪断力での成分の簡便な混合及びピペッティングを可能にし、細胞カプセル化に適しているようである。
【0097】
ｐＨ依存性
４アームＰＥＧ－ＭＳ及び４アームＰＥＧ－チオール混合物のゲル化を研究した（図１）。用いた架橋条件は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）中５ｗｔ％のポリマー含有量、２５℃であった。１：１のＭＳ：チオール比を実験に用いた。チオール－Ｘヒドロゲルのバルクにおけるゲル化時間を異なるｐＨ値で決定した。実験は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｗｔ％のポリマー溶液、Ｔ＝２５℃で行った。ゲル化時間は、成分の混合と混合物に対してピペッティングを行うことが不可能となる時点との間の間隔として推定した。研究から、チオール－ＭＳゲルが３分～４分以内に架橋ゲルを形成することが示された（表１を参照されたい）。これは、前駆体溶液の完璧な混合及び均質化を可能にする好都合な架橋時間に相当する。
４アームＰＥＧ－ＭＳ及び４アームＰＥＧ－チオール混合物のゲル化を研究した（図１）。用いた架橋条件は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．６）中５ｗｔ％のポリマー含有量、２５℃であった。１：１のＭＳ：チオール比を実験に用いた。チオール－Ｘヒドロゲルのバルクにおけるゲル化時間を異なるｐＨ値で決定した。実験は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｗｔ％のポリマー溶液、Ｔ＝２５℃で行った。ゲル化時間は、成分の混合と混合物に対してピペッティングを行うことが不可能となる時点との間の間隔として推定した。研究から、チオール－ＭＳゲルが３分～４分以内に架橋ゲルを形成することが示された（表１を参照されたい）。これは、前駆体溶液の完璧な混合及び均質化を可能にする好都合な架橋時間に相当する。
【0098】
極性チオール－Ｘカップリングの反応速度は、ｐＨ範囲６～９のｐＨに依存する。これは、チオール基（ｐＫａ約８）から、これらの反応において求核試薬として作用するチオレートアニオンへの脱プロトン化のためである（M. H. Stenzel, ACS Macro Letters 2013, 2, 14-18）。この特徴は、生理的に適切な条件下でのｐＨにより制御される硬化動態の興味深い機会を提供する。チオール－ＭＳ架橋を８．０～６．６のｐＨ範囲で分析した。ｐＨの低下とともに架橋速度の減少が観察された（図４ａ及び図４ｂ、並びに表１）。ｐＨを８．０から６．６へと変化させることで、ゲル化時間を数秒から数分に調整することができ（表１）、３Ｄ細胞カプセル化用途に理想的な実験時間枠がもたらされることが注目に値する。これとは対照的に、チオール－Ｍａｌのゲル化時間は数秒の範囲でしか変動せず、一方でチオール－ＶＳは数分間～数時間の間であった。これらの結果から、取扱い及び用途要件への適合性の点でチオール－Ｍａｌ及びチオール－ＶＳと比べたチオール－ＭＳゲルの利点が示される。
【0099】
チオール－ＭＳ架橋ヒドロゲルの剪断弾性率は、僅かにｐＨの影響を受けた。ｐＨ８．０において、おそらくは非常に急速な架橋が起こり、網目構造内に多数の不均質性及び欠陥が生じたために、これらは比較的低いＧ’を示した。これは、同様の最終Ｇ’が得られた、ｐＨ７．５～６．６で形成されたチオール－ＭＳゲルには当てはまらなかった。したがって、これがゲルの品質及び機械的安定性を損なうことなく架橋速度を調整することができる最適な間隔であるようである。これと比較して、チオール－Ｍａｌ系はｐＨ≧７．５で機械的特性の低下を示したが、ｐＨ＝７．０～６．６で同様の最終剪断弾性率を示し、一方でチオール－ＶＳはｐＨの低下とともに、より遅いゲル化動態及び僅かに低下した剪断弾性率への明らかな傾向を示した。この目的で、ｐＨ値８．０、７．５、７．０及び６．６、５ｗｔ％のポリマー含有量、並びに２５℃で１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液において測定を行った。ここで、最も速く硬化する系（ｐＨ≧７．０のＭａｌ及びｐＨ≧７．５のＭＳ）が、レオメーターのローディングとともに即時に硬化することが注目に値する（図４ａ及び図４ｂ）。
【0100】
ゲル化時間に対する温度の影響
２０ｋＤａの４アームＰＥＧ－Ｘポリマーの溶液を新たに調製し、これらの研究に使用した。ポリマーを対応する溶媒に溶解し、ボルテクサーを用いて混合し、超音波浴内に保持し、遠心分離して泡を除去した。３０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－Ｘ溶液、続いて３０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－チオール溶液を、ピペットを用いて連続的に混合しながらプラスチックエッペンドルフチューブに入れた。「バルクにおける」ゲル化時間を、硬化性（hardness）混合物が流動しなくなり、連続的なピペッティングが可能でなくなった時間として記録した。温度調節される水浴を用いて温度を制御した。
２０ｋＤａの４アームＰＥＧ－Ｘポリマーの溶液を新たに調製し、これらの研究に使用した。ポリマーを対応する溶媒に溶解し、ボルテクサーを用いて混合し、超音波浴内に保持し、遠心分離して泡を除去した。３０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－Ｘ溶液、続いて３０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－チオール溶液を、ピペットを用いて連続的に混合しながらプラスチックエッペンドルフチューブに入れた。「バルクにおける」ゲル化時間を、硬化性（hardness）混合物が流動しなくなり、連続的なピペッティングが可能でなくなった時間として記録した。温度調節される水浴を用いて温度を制御した。
【0101】
チオール－ＭＳゲルの特性の調整にも温度を用いることができる。４５℃～２５℃の範囲で温度を低下させることで、剪断弾性率の低下（図５）及びゲル化時間の延長（表３を参照されたい）が可能であった。
【0102】
チオール－ＭＳヒドロゲルに対するポリマー含有量及びＨＥＰＥＳ緩衝液濃度の影響
ヒドロゲルを、１０ｍＭ又は５０ｍＭのいずれかのＨＥＰＥＳ緩衝液濃度を用い、一定のｐＨ＝７．５及びＴ＝２５℃でポリマー含有量の値を１．３ｗｔ％、２．５ｗｔ％、５．０ｗｔ％、７．５ｗｔ％及び１０．０ｗｔ％と増大させて調製した。調製したヒドロゲルのｐＨを、平面電極を有するｐＨメーター（ＰＨ１００ Ｗａｔｅｒｐｒｏｏｆ ＥｘＳｔｉｋ（商標）、Extech Instruments、米国）を用いて測定した。
ヒドロゲルを、１０ｍＭ又は５０ｍＭのいずれかのＨＥＰＥＳ緩衝液濃度を用い、一定のｐＨ＝７．５及びＴ＝２５℃でポリマー含有量の値を１．３ｗｔ％、２．５ｗｔ％、５．０ｗｔ％、７．５ｗｔ％及び１０．０ｗｔ％と増大させて調製した。調製したヒドロゲルのｐＨを、平面電極を有するｐＨメーター（ＰＨ１００ Ｗａｔｅｒｐｒｏｏｆ ＥｘＳｔｉｋ（商標）、Extech Instruments、米国）を用いて測定した。
【0103】
最後に、チオール－ＭＳヒドロゲルの架橋動態及び剪断弾性率に対するポリマー含有量の影響の研究を行った（図６ａ、図６ｂ）。ゲル化時間は、ポリマー含有量の増加とともに短くなった（１８秒～２秒の範囲；表４を参照されたい）。さらに、Ｇ’は、ポリマー濃度を１．３ｗｔ％から７．５ｗｔ％に増加させることで上昇し、１０ｗｔ％を超えるポリマー濃度で低下した。前駆体溶液は１０ｗｔ％であっても正確に均質化することができるため、この結果は驚くべきものであった。したがって、不十分な混合効果がこの挙動の原因となるとは予想されなかった。
【0104】
反応機構を研究するために、得られたゲルのｐＨを測定した（図６ａ、図６ｂを参照されたい）。新たに調製したチオール－ＭＳゲルのｐＨがポリマー濃度の増加とともに低下することが分かった。１．３ｗｔ％～７．５ｗｔ％のゲルは７．５～６．５のｐＨを示したが、１０ｗｔ％のゲルは５．１に近いｐＨを有していた。これは、チオール－ＭＳカップリングにおける脱離基としてのメタンスルフィン酸の遊離によって説明することができる。ポリマー分率が高いと、脱離基がより高濃度で生成され、架橋媒体のｐＨが低下することで、達成される最終剪断弾性率が低下する。この効果は、架橋媒体の緩衝能を増大させることで制御することができ、これはＨＥＰＥＳ緩衝液濃度を１０ｍＭから５０ｍＭに増加させることによって達成される（図６を参照されたい）。後者の濃度は、依然として細胞適合性であることが知られている。これらの結果から、ポリマーの含有量を用いてゲルの機械的特性を制御することもできることが示される。比較的高い濃度（１０ｗｔ％）においては、緩衝能を高めることでｐＨを制御するべきである。
【0105】
チオール－Ｘヒドロゲルについての膨潤測定
これらの研究は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で調製し、予め氷浴内で冷却した５％（ｗ／ｖ）の前駆体溶液を用いて行った。５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－Ｘ溶液をフレキシブルＰＤＭＳ円筒モールド（直径０．７５ｃｍ）に入れ、５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－チオール溶液とともに迅速に混合し、３７℃で４時間、湿潤チャンバ内で架橋させた。得られたヒドロゲルを慎重に取り出し、ＭｉｌｌｉＱ水中で２４時間膨潤させた後、膨潤ゲルの質量を決定した（Ｍｓ）。
これらの研究は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で調製し、予め氷浴内で冷却した５％（ｗ／ｖ）の前駆体溶液を用いて行った。５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－Ｘ溶液をフレキシブルＰＤＭＳ円筒モールド（直径０．７５ｃｍ）に入れ、５０μＬの５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－チオール溶液とともに迅速に混合し、３７℃で４時間、湿潤チャンバ内で架橋させた。得られたヒドロゲルを慎重に取り出し、ＭｉｌｌｉＱ水中で２４時間膨潤させた後、膨潤ゲルの質量を決定した（Ｍｓ）。
【0106】
ゲルを３７℃の炉内で４８時間乾燥させ、乾燥ヒドロゲルの質量を確認した（Ｍｄ）。膨潤率（ＳＲ；膨潤度）を以下の式に従って算出した：
ＳＲ＝（Ｍｓ－Ｍｄ）／Ｍｄ
ＳＲ＝（Ｍｓ－Ｍｄ）／Ｍｄ
【0107】
実験は３回行った。平均値及び標準偏差を報告した。
【0108】
５％チオール－ＭＳゲルの膨潤率（ＳＲ）をｐＨ７．０の水中で測定した。ポリマー１ｍｇ当たり３３．６ｍｇの水の膨潤が得られた（表５を参照されたい）。チオール－ＶＳゲルは同様のＳＲ値を示すが、チオール－Ｍａｌは約１．５倍増加した。これらの結果から、チオール－ＭＳ及びチオール－ＶＳ網目構造の同様の架橋度、並びにチオール－Ｍａｌゲルのより少ない架橋が示される。
【0109】
加水分解安定性は、３Ｄ細胞培養に使用されるヒドロゲルにとって重要な材料特性である。
【0110】
したがって、５ｗｔ％チオール－ＭＳゲルの加水分解安定性を、３７℃で４週間にわたって異なる時点で細胞培養培地においてインキュベートした後に膨潤ゲルの重量分析によって決定した（図７ａ）。最初の２週間で、膨潤チオール－ＭＳゲルの質量は元の質量の１．２倍に達し、チオール－ＭＳゲルの少ないゲル浸食及び高い加水分解安定性が示唆された。ゲルの長期安定性が長期細胞培養にとって利点であり、特定の分解性配列との共重合によって分解特性を細かく調整することができることに留意する必要がある（E. A. Phelps, N. O. Enemchukwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012, 24, 64-70）。チオール－ＭＳ系の安定性は、長期培養に通例使用されるチオール－ＶＳの安定性と同様であり（M. P. Lutolf, G. P. Raeber, A. H. Zisch, N. Tirelli, J. A. Hubbell, Advanced Materials 2003, 15, 888-892）、チオール－Ｍａｌゲルの場合よりもはるかに高かった（２日間で１．２倍及び１８日目のヒドロゲルの崩壊）（N. Boehnke, C. Cam, E. Bat, T. Segura, H. D. Maynard, Biomacromolecules 2015, 16, 2101-2108）。チオール－Ｍａｌゲルの加水分解は、細胞培養培地中の他の可溶性チオールの存在下でレトロマイケル反応及び交換反応を経ることが可能なチオエーテル－スクシンイミド結合の低い安定性に起因する。この結果は、治療関連条件下でチオール－Ｍａｌ化合物に対して、チオール－ＭＳカップリングから得られるチオヘテロ芳香族コンジュゲートの優れた安定性を示す、モデル－ＭＳ化合物を用いた研究と一致している（N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592-12596）。最後に、１０ｗｔ％のゲルを用いて行った実験から、チオール－ＭＳゲルが６週間超にわたって加水分解に安定したままであることが示された（図７ｂを参照されたい）。
【0111】
細胞カプセル化への使用
３Ｄ細胞培養のためのＰＥＧヒドロゲル調製
３Ｄ ＰＥＧヒドロゲルは、記載のプロトコルを適合させて調製した（Phelps et al., Advanced Materials 2012, 24, 64-70及びFarrukh et al., Adv. Funct. Mater. 2018）。２０ｋＤａの４アームＰＥＧ Ｍａｌ／ＶＳ／ＭＳの前駆体溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ））を、滅菌層流中でＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解することによって調製した。ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ）（３．４５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＭ）及びＶＰＭペプチド（ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＤＲＣＧ、２６．６ｍｇ／ｍＬ、１５．６８ｍＭ）の溶液を同様に滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中で調製した。これらの濃度を全ての細胞実験の間、一定に維持した。
３Ｄ細胞培養のためのＰＥＧヒドロゲル調製
３Ｄ ＰＥＧヒドロゲルは、記載のプロトコルを適合させて調製した（Phelps et al., Advanced Materials 2012, 24, 64-70及びFarrukh et al., Adv. Funct. Mater. 2018）。２０ｋＤａの４アームＰＥＧ Ｍａｌ／ＶＳ／ＭＳの前駆体溶液（１００ｍｇ／ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ））を、滅菌層流中でＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．０）に溶解することによって調製した。ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ）（３．４５ｍｇ／ｍＬ、５ｍＭ）及びＶＰＭペプチド（ＧＣＲＤＶＰＭＳＭＲＧＤＲＣＧ、２６．６ｍｇ／ｍＬ、１５．６８ｍＭ）の溶液を同様に滅菌ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中で調製した。これらの濃度を全ての細胞実験の間、一定に維持した。
【0112】
４アームＰＥＧ Ｍａｌ／ＭＳ／ＶＳストック溶液（１０％（ｗ／ｖ））を５ｍＭ ｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ）と２：１の体積比で混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ培地（２μＬ）中の細胞懸濁液（１０×１０６細胞／ｍＬ）を上記の溶液に添加し、得られた混合物の８μＬ滴をそれぞれＩｂｉｄｉ １５マイクロタイタープレート血管新生スライドに入れた。ＶＰＭペプチドの溶液（２μＬ、１５．８ｍＭ）を即座に各マイクロタイタープレートに入れ、ピペットチップを用いて慎重に混合し、架橋させた。１５分間にわたってＭａｌ及びＭＳ ３Ｄヒドロゲルの重合を行い、一方でＶＳヒドロゲルは３７℃及び５％ＣＯ２で４５分間重合させた。ゲル化後にＲＰＭＩ培地を添加し、１日～３日間培養を維持した。代替的には、スフェロイド培養のために、ＲＰＭＩ培地（２μＬ）をｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ）修飾ＰＥＧ前駆体溶液（６μＬ、上記）と混合し、それぞれ（８μＬ）マイクロタイタープレートに導入した。フィブリン塊を各タイタープレートに添加した後、１５．８ｍＭ ＶＰＭペプチド（２μＬ）を添加し、３７℃で１５分～４５分間ゲル化させることができた。培地を各タイタープレートに添加し、細胞培養の間、２４時間に１回新鮮培地と交換した。
【0113】
このプロセスを用いて、ＰＥＧ－ＭＳ成分を初めにｃｙｃｌｏ（ＲＧＤｆＣ）ペプチドで官能基化し、次いでＬ９２９線維芽細胞と混合し、最後に酵素的に切断可能なジチオールペプチド（ＶＰＭ）と架橋させた。４ｗｔ％ＰＥＧ－ＭＳ、１ｍＭ ＲＧＤペプチド及び３．１４ｍＭ ＶＰＭの組成物を用いた（E. A. Phelps, N. O. Enemchukwu, V. F. Fiore, J. C. Sy, N. Murthy, T. A. Sulchek, T. H. Barker, A. J. Garcia, Advanced Materials 2012, 24, 64-70、A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734）。混合後に溶液は流動性が高いままであり、混合物を低い剪断力でピペッティングによって均質化することができた。安定したゲルが１５分以内に形成され、肉眼で確認することができた。ヒドロゲル内の細胞の分布を共焦点顕微鏡でのＺスタックイメージングによって分析した。ヒドロゲルの厚さ全体にわたる細胞の均一な分布が観察された（図８ａ）。
【0114】
細胞培養条件
線維芽細胞Ｌ９２９細胞株（ATCC）を、１０％ＦＢＳ（Gibco、１０２７０）及び１％Ｐ／Ｓ（Invitrogen）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco、６１８７０－０１０）において３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。懸濁細胞培養については、Ｌ９２９細胞（１０×１０６細胞／ｍＬ）を重合時にＰＥＧ前駆体溶液に直接懸濁した。
線維芽細胞Ｌ９２９細胞株（ATCC）を、１０％ＦＢＳ（Gibco、１０２７０）及び１％Ｐ／Ｓ（Invitrogen）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco、６１８７０－０１０）において３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。懸濁細胞培養については、Ｌ９２９細胞（１０×１０６細胞／ｍＬ）を重合時にＰＥＧ前駆体溶液に直接懸濁した。
【0115】
スフェロイド培養については、以下の文献報告を用いて線維芽細胞Ｌ９２９細胞株のフィブリン塊を調製した（J. L. West, Biomaterials 2008, 29, 2962-2968、C. A. DeForest, K. S. Anseth, Nature Chemistry 2011, 3, 925-931）。
【0116】
要約すると、１０×１０６細胞／ｍＬのペレットをフィブリノゲン（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍＬ）中で解離させ、Ｓｉｇｍａｃｏｔｅをコーティングした疎水性スライドガラスに２μＬ滴を塗布した。１μＬのトロンビン溶液（ＰＢＳ中５ＵＮ／ｍＬ）を各フィブリノゲン滴に添加し、細胞をインキュベーターに１５分間入れ、フィブリン塊を得た。
【0117】
固定及び染色
３Ｄ ＰＥＧヒドロゲルサンプルを、４％ＰＦＡ溶液を用いて室温で２時間固定し、ＰＢＳで洗浄した。サンプルを１％ＢＳＡ溶液で１時間ブロッキングした後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１時間透過処理した。ＦＩＴＣファロイジン（水中１：２００、Thermo Fisher Scientific）をアクチン線維の染色に使用し、ＤＡＰＩ（水中１：５００、Life Technology）を核の染色に使用した。サンプルを抗体とともに室温で５時間インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄した。
３Ｄ ＰＥＧヒドロゲルサンプルを、４％ＰＦＡ溶液を用いて室温で２時間固定し、ＰＢＳで洗浄した。サンプルを１％ＢＳＡ溶液で１時間ブロッキングした後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１時間透過処理した。ＦＩＴＣファロイジン（水中１：２００、Thermo Fisher Scientific）をアクチン線維の染色に使用し、ＤＡＰＩ（水中１：５００、Life Technology）を核の染色に使用した。サンプルを抗体とともに室温で５時間インキュベートし、続いてＰＢＳで洗浄した。
【0118】
生－死アッセイ
細胞培養培地を除去し、サンプルをＰＢＳ中の二酢酸フルオレセイン（４０μｇ／ｍＬ）及びヨウ化プロピジウム（３０μｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて記録した。
細胞培養培地を除去し、サンプルをＰＢＳ中の二酢酸フルオレセイン（４０μｇ／ｍＬ）及びヨウ化プロピジウム（３０μｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ８８０共焦点顕微鏡を用いて記録した。
【0119】
チオール－ＭＳゲル中に１日カプセル化された細胞に対する生／死アッセイにより、本発明による材料の細胞適合性が示される（９０％超の生存率、図８ａ、図８ｂ、図８ｃ）。これらの結果から、系の架橋動態が簡便かつ細胞適合性の実験条件下で均一な構築物を得るのに理想的であることが示唆される。
【0120】
逆に、チオール－Ｍａｌヒドロゲルは、前駆体溶液と混合すると即時の硬化を生じたため、適当な均質化がより困難となり、ゲルの上部で細胞凝集が起こった。一方、チオール－ＶＳ系は、効果的な混合が可能であったが、遅いゲル化動態によりゲルの底面に細胞沈降が起こった。これらの結果は、チオール－Ｍａｌヒドロゲルにカプセル化された蛍光ビーズの分布との関連での架橋速度の影響に関するPeyton et al.による以前の報告（L. E. Jansen, L. J. Negron-Pineiro, S. Galarza, S. R. Peyton, Acta Biomaterialia 2018, 70, 120-128）、及び細胞の堆積を防ぐために硬化時にチオール－ＶＳゲルを回転させる必要性を指摘しているShikanov et al.による以前の報告（J. Kim, Y. P. Kong, S. M. Niedzielski, R. K. Singh, A. J. Putnam, A. Shikanov, Soft Matter 2016, 12, 2076-2085）と一致している。これに関連して、チオール－ＭＳヒドロゲルは、より適切な動態を示し、これらの不都合を克服する。
【0121】
移動アッセイ
チオール－ＭＳヒドロゲル中で培養した細胞が機能性のままであることを示すために、移動アッセイを行った。Ｌ９２９線維芽細胞スフェロイドを分解性チオール－ＭＳヒドロゲルにカプセル化し（A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734）、３日間培養し、固定し、染色した。スフェロイドの細胞移動距離をゲル分解及びゲル内での細胞移動能力の指標として定量化した（図９ａ～図９ｃ）。細胞は、ｄ約４２５μｍの距離を移動した。この結果を、３Ｄ細胞カプセル化の材料としてのチオール－Ｍａｌ及びチオール－ＶＳについて得られた結果と比較した。移動距離は、Ｍａｌについては約４７０μｍ、ＶＳ系については約３６０μｍであった（図９ｃ）。この結果は、架橋度の差（Ｇ’３７℃＝ＶＳ＞ＭＳ＞Ｍａｌ；図３ｂを参照されたい）及び加水分解安定性の差（ＭＳ＝ＶＳ＞＞Ｍａｌ；図７）によるものである。架橋度がより低いか又は分解がより急速であると、細胞のための空間ができ、すなわち移動経路がより長くなる。
チオール－ＭＳヒドロゲル中で培養した細胞が機能性のままであることを示すために、移動アッセイを行った。Ｌ９２９線維芽細胞スフェロイドを分解性チオール－ＭＳヒドロゲルにカプセル化し（A. Farrukh, J. I. Paez, A. del Campo, Advanced Functional Materials 2019, 29, 1807734）、３日間培養し、固定し、染色した。スフェロイドの細胞移動距離をゲル分解及びゲル内での細胞移動能力の指標として定量化した（図９ａ～図９ｃ）。細胞は、ｄ約４２５μｍの距離を移動した。この結果を、３Ｄ細胞カプセル化の材料としてのチオール－Ｍａｌ及びチオール－ＶＳについて得られた結果と比較した。移動距離は、Ｍａｌについては約４７０μｍ、ＶＳ系については約３６０μｍであった（図９ｃ）。この結果は、架橋度の差（Ｇ’３７℃＝ＶＳ＞ＭＳ＞Ｍａｌ；図３ｂを参照されたい）及び加水分解安定性の差（ＭＳ＝ＶＳ＞＞Ｍａｌ；図７）によるものである。架橋度がより低いか又は分解がより急速であると、細胞のための空間ができ、すなわち移動経路がより長くなる。
【0122】
さらに、３日間のインキュベーション後に、チオール－ＭＳヒドロゲル中で培養した細胞は、他の２つの系よりもゲル内に均一に分布し、より少ないクラスター化の例を示した（図１０を参照されたい）。
【0123】
チオール－ＭＳ反応は、細胞カプセル化との関連でのヒドロゲルの架橋に適している。この反応は、チオール－Ｍａｌ系とチオール－ＶＳ系との間の動態を達成し、高い変換率に達する。得られる架橋単位は、良好な加水分解安定性及び細胞適合性を示す。温和な水性条件下では、ＭＳ－チオール反応はアルコール、アミン、カルボン酸及びアクリレート官能基に対して直交性であるため（D. Zhang, N. O. Devarie-Baez, Q. Li, K. R. Lancaster, M. Xian, Organic Letters 2012, 14, 3396-3399、A. Farrukh, J. I. Paez, M. Salierno, A. del Campo, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2092-2096、A. Farrukh, J. I. Paez, M. Salierno, W. Fan, B. Berninger, A. del Campo, Biomacromolecules 2017, 18, 906-913）、この架橋機構を生物医学分野で関心のある殆どの天然ポリマースキャフォールドとともに用いることができる。チオール－ＭＳ対の反応性は、用いられるｐＨ及び異なるＭＳ－芳香族基質の選択によって調節することができる（N. Toda, S. Asano, C. F. Barbas, Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 12592-12596）。これらの特性の全ての組合せのために、チオール－ＭＳが３Ｄ細胞カプセル化にとって他の反応性化学物質の優れた代替品となる。
【0124】
【表1】
【0125】
【表2】
【0126】
【表3】
【0127】
【表4】
【0128】
【表5】
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】