特表 2022-539600 改変されたＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ ＣＯＬＩ株ＮＩＳＳＬＥ及び胃腸障害の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-12

(54)【発明の名称】改変されたＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡ ＣＯＬＩ株ＮＩＳＳＬＥ及び胃腸障害の処置

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20220905BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20220905BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220905BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20220905BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220905BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220905BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220905BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

A61K35/74 A

A61P1/00

A61P1/04

A61P31/04

C12N15/31

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022500706

(86)(22)【出願日】2020-07-07

(85)【翻訳文提出日】2022-02-28

(86)【国際出願番号】 EP2020069124

(87)【国際公開番号】W WO2021005059

(87)【国際公開日】2021-01-14

(31)【優先権主張番号】19184867.0

(32)【優先日】2019-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】510139564

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ポール サバティエ トゥールーズ トロワ

(71)【出願人】

【識別番号】521313636

【氏名又は名称】エコール・ナショナル・ヴェテリネール・ドゥ・トゥールーズ

【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬＥ ＶＥＴＥＲＩＮＡＩＲＥ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ

(71)【出願人】

【識別番号】505129079

【氏名又は名称】アンスティテュ・ナシオナル・ドゥ・ルシェルシュ・プール・ラグリキュルテュール，ラリマンタシオン・エ・ランヴィロンヌマン

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＰＯＵＲ Ｌ’ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ，Ｌ’ＡＬＩＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＥＴ Ｌ’ＥＮＶＩＲＯＮＮＥＭＥＮＴ

(71)【出願人】

【識別番号】515034781

【氏名又は名称】サントル・オスピタリエ・ユニヴェルシテール・ドゥ・トゥールーズ

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＨＯＳＰＩＴＡＬＩＥＲ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＩＲＥ ＤＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】オズワルド，エリク

(72)【発明者】

【氏名】ヌゲレド，ジャン－フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】マシップ，クレマンス

(72)【発明者】

【氏名】マルティン，パトリシア

(72)【発明者】

【氏名】ブランチュ，プリシラ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC34

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA66

4C087ZA68

4C087ZB32

(57)【要約】

本発明は、改変されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）及び胃腸障害を処置するためのその使用の分野に関する。本発明は、Escherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）のプロバイオティックス特性に関係するメカニズムの研究に基づいている。本研究により、本発明者等は、遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する酵素であるＥｃＮ ＣｌｂＰタンパク質もプロバイオティックスＥｃＮのシデロフォア－ミクロシン活性に必要であるが、興味深いことに、プレコリバクチンを開裂させて、活性なコリバクチンを形成するその酵素ドメインは必要でないことを実証することにより、ＥｃＮのプロバイオティックス活性をその遺伝毒性活性から切り離すことが可能となった。さらに、本発明者らは、細菌性病原体に感染させたｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードするｃｌｂＰ遺伝子を有するＥｃＮ改変株の投与には遺伝毒性がなく（コリバクチンを産生せず）、細菌アンタゴニスト活性を維持し、シデロフォア－ミクロシン産生を維持することにより、病原体のコロニー形成及び毒性が低下することを実証する。このように、本研究は、ＥｃＮの安全な使用の道を開き、したがって、本発明は、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子を有するEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌並びに薬物として、とりわけ、胃腸疾患の処置に使用するためのその使用を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子を有するEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌であって、
ここで、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＣｌｂＰタンパク質のペプチダーゼドメインは、遺伝毒性物質であるコリバクチンの活性化に関与し、
前記ＥｃＮ細菌は、（ｉ）抗菌活性を有する能力を有し、（ｉｉ）遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する能力を欠いている、
ＥｃＮ細菌。

【請求項2】

ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質が、
Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
Ｋ９８の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
Ｙ１８６の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
ペプチダーゼドメインを有さないＣｌｂＰタンパク質
からなるリストより選択される、請求項１記載のＥｃＮ細菌。

【請求項3】

Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質が、好ましくは、セリンと同等の極性アミノ酸及び非荷電アミノ酸により置換されていない、請求項２記載のＥｃＮ細菌。

【請求項4】

Ｋ９８の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質が、好ましくは、リシンと同等の正に荷電したアミノ酸で置換されていない、請求項２記載のＥｃＮ細菌。

【請求項5】

Ｙ１８６の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質が、好ましくは、チロシンの疎水性側鎖と同等のアミノ酸で置換されていない、請求項２記載のＥｃＮ細菌。

【請求項6】

ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質が、
ＣｌｂＰ Ｓ９５Ａ突然変異体（配列番号：４）、
ＣｌｂＰ Ｋ９８Ｔ突然変異体（配列番号：６）、
ＣｌｂＰ Ｓ９５Ｒ突然変異体（配列番号：８）、
ＣｌｂＰ Ｙ１８６Ｇ突然変異体（配列番号：１０）、
ＰｈｏＡのアルカリホスファターゼ酵素ドメインにより置換されたペプチダーゼドメインを有するＣｌｂＰタンパク質（配列番号：１１）
からなるリストより選択される、請求項２～５のいずれか一項記載のＥｃＮ細菌。

【請求項7】

薬剤として使用するための、請求項１～６のいずれか一項記載のEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌。

【請求項8】

プロバイオティックスとして使用するための、請求項７記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項9】

胃腸疾患の処置に使用するための、請求項１～６のいずれか一項記載のEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌。

【請求項10】

胃腸疾患が、細菌性胃腸感染症、腸炎症性疾患及び内臓痛からなるリストより選択される、請求項９記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項11】

細菌性胃腸感染症が、Salmonella enterica serovar EnteritidisもしくはTyphimurium感染症又は腸管出血性E. coli感染症である、請求項１０記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項12】

腸炎症性疾患が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である、請求項１０記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項13】

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、グルテン過敏症及び嚢炎からなるリストより選択される、請求項１２記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項14】

内臓痛が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に関連する疼痛である、請求項１０記載の使用のためのＥｃＮ細菌。

【請求項15】

胃腸疾患の対象における胃腸疾患を処置するための方法であって、
治療上有効量の請求項１～６のいずれか一項記載のＥｃＮ細菌を前記対象に投与することを含む、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、一般的には、改変されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）及び胃腸障害を処置するためのその使用の分野に関する。

【0002】

発明の背景
プロバイオティックスEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）は、重篤な下痢の集団発生に抵抗性を示した兵士において、Alfred Nissleにより第一次世界大戦中に単離された（１、２）。ＥｃＮは、最初に、細菌性胃腸感染症と闘うその能力について研究された。Salmonella enterica serovar Typhimurium（S. Typhimurium）による腸内コロニー形成を阻害し（３、４）、腸管出血性E. coli株に対して抗菌活性を示す（５）ことが実証された。ＥｃＮは、ヒト腸管の優れた生着菌であり、種々の腸管機能障害、例えば、乳幼児における急性下痢（６）、慢性便秘（７）及び過敏性腸症候群を有する患者における腹痛（８）に有益な効果を示す。ＥｃＮは、炎症性腸疾患の処置に広く使用されており（１）、小児及び成人の潰瘍性大腸炎の寛解維持のためのゴールドスタンダードであるメサラジンと同等の有効性があることが証明されている（９）。

【0003】

ＥｃＮプロバイオティックス活性は、他の細菌に対する抗菌活性を含む複数の特定の特性と適応度決定因子に基づくと考えられている（１０）。シデロフォア（エンテロバクチン、サルモケリン、エルシニアバクチン及びアエロバクチン）及び複数のシデロフォアレセプター並びに鉄輸送系の広範なリストのために、ＥｃＮは、鉄について競合することにより、S. Typhimuriumの腸内コロニー形成を減少させる（３）。エンテロバクチン、サルモケリン及びエルシニアバクチンは、非リボソームペプチド（ＮＲＰ）又はポリケチド（ＰＫ）－ＮＲＰハイブリッドであり、これらは、同族ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）により活性化されるＮＲＰシンターゼ及びＰＫシンターゼ（ＮＲＰＳ及びＰＫＳ）により合成される。制限栄養素についてのこの競合に加えて、ＥｃＮは、２つのミクロシン（Ｍｃｃ）、Ｈ４７（ＭｃｃＨ４７）及びＭ（ＭｃｃＭ）の産生に関連する直接的な抗菌活性を示す（４、１１～１３）。Ｍｃｃは、リボソームにより合成され、翻訳後修飾され、系統発生的に関連した細菌に対して強力な殺菌活性を示す分泌型低分子量ペプチドである（１４、１５）。ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭは、「シデロフォア－Ｍｃｃ」と呼ばれる。カテコールシデロフォアの結合により翻訳後修飾されるためである（１３、１６）。ＭｃｃペプチドのＣ末端は、エンテロバクチンの線状化され、グリコシル化誘導体と共有結合している（１３、１６、１７）。このシデロフォア部分は、ターゲット細菌のカテコラートシデロフォアレセプターにより認識される（１２，１６）。したがって、シデロフォア－Ｍｃｃを、鉄－シデロフォア複合体を模倣することによる「トロイの木馬」戦略により感受性細菌に導入し、殺傷することができる。

【0004】

比較ゲノム分析により、ＥｃＮは、病原性E. coli株、例えば、尿路病原性株ＣＦＴ０７３と密接に関連していることが示されている（１８～２０）。ＥｃＮ及びＣＦＴ０７３は、遺伝毒性物質であるコリバクチンを合成するＮＲＰＳ－ＰＫＳアセンブリ系統をコードするＰＫＳ／ｃｌｂアイランドを含む８つのゲノムアイランドを共有している（２１、２２）。コリバクチンは、プロドラッグ部分として産生され、排出ポンプであるＣｌｂＭによりペリプラズム中に輸送され（２３）、ついで、ペプチダーゼ活性を有するペリプラズム膜結合ＣｌｂＰタンパク質により加水分解され、活性コリバクチンを放出する（２４、２５）。コリバクチンは、真の病原因子（２６、２７）であるだけでなく、推定上の前発ガン性化合物でもある。コリバクチンは、宿主細胞のＤＮＡをアルキル化し、その結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でＤＮＡ架橋、二本鎖切断、染色体異常及び遺伝子突然変異をもたらす（２１、２２、２８～３０）。コリバクチン産生E. coliは、大腸ガンを有する患者の生検において過剰発現しており（３１、３２）、マウスモデルにおいて大腸ガンを促進することが示された（３１、３３）。

【0005】

ｐｋｓ／ｃｌｂアイランドの特定の酵素により、鎮痛性リポペプチドの合成が可能となること（３４）及びＥｃＮのプロバイオティックス特性が病原性アイランドの存在に関連すること（３５）を本発明者らが示した時点で、ＥｃＮの病原性とプロバイオティックス能力との間の両価性が明らかになった。Olier et al（２０１２）の研究において、発明者らは、コリバクチン合成に特異的であると考えられていたホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）ＣｌｂＡをコードする遺伝子を不活性化した。一方、より近年の研究から、ＣｌｂＡは、多面的効果を有し、また、シデロフォアの合成及び鎮痛性リポペプチドの合成をモデュレーションすることが示された（３４、３６）。予想されるように、遺伝毒性物質を産生するプロバイオティックス株の使用は、公衆衛生上の懸念事項である。したがって、本発明者らは、遺伝毒性物質をプロバイオティックス活性から明確に切り離そうと試みた。本研究において、発明者らは、コリバクチンの遺伝毒性活性を特異的に排除するために、ｐｋｓ／ｃｌｂアイランドにより直接的又は間接的に産生されるコリバクチン及び他の二次代謝産物の生合成経路の知見を使用した。発明者らは、有益な二次代謝産物を依然として産生しながら、病原性細菌の増殖を阻害する突然変異体の能力を調べた。発明者らは、プロバイオティックス活性を遺伝毒性活性から切り離すことに成功し、その結果、ＥｃＮを最適化する道を開いた。一方、本発明者らは、驚くべきことに、ｐｋｓ／ｃｌｂアイランドが予想よりＥｃＮプロバイオティックス活性にさらに密接に関連していること並びに細菌において病原性及びプロバイオティックス特性の同時進化が存在することを観察した。ＥｃＮは、ある程度、「特効薬」アスピリンと同様である。アスピリンと同様に、この細菌株は、１世紀以上にわたって成功裏に使用されてきたが、作用方法を理解し、安全性及び潜在的な副作用を考慮することが極めて重要である。

【0006】

発明の概要
本発明は、Escherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）のプロバイオティックス特性に関係するメカニズムの研究に基づいている。その直接的な抗菌作用を担う２つのシデロフォア－ミクロシン（Ｍｃｃ）の産生に加えて、ＥｃＮは、ｐｋｓアイランドによりコードされる遺伝毒性物質であるコリバクチンを合成する。コリバクチンは、病原因子であり、推定上の前発ガン性化合物である。したがって、本研究により、本発明者らは、ＥｃＮのプロバイオティックス活性をその遺伝毒性活性から切り離すことが可能となった。本発明者らは、プロバイオティックスＥｃＮのシデロフォア－ミクロシン活性には、遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する酵素であるｐｋｓコードＣｌｂＰが必要であるが、興味深いことに、プレコリバクチンを開裂させて、活性型コリバクチンを形成するその酵素ドメインには必要ないことを実証した。本研究により、本発明者らは、ＥｃＮの安全な使用に道を開くＣｌｂＰのペプチダーゼドメインを特異的にターゲット化することにより、遺伝毒性活性からシデロフォア－ミクロシンを切り離すことが可能となった。実際、コリバクチン産生に必須のＣｌｂＰペプチダーゼ活性は、シデロフォア－ミクロシン産生には役割を有さず、シデロフォア－ミクロシン産生は、その抗菌活性を保持する非遺伝毒性株を構築する方法を提供する。さらに、本発明者らは、腸内細菌性病原体（S. Typhimurium）に感染させたｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質（すなわち、Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰ）をコードするｃｌｂＰ遺伝子を有するＥｃＮ改変株の投与が非遺伝毒性である（コリバクチンを産生しない）が、細菌アンタゴニスト活性を維持し、シデロフォア－ミクロシン産生を維持することにより、病原体のコロニー形成及び毒性を低下させる（図８）ことを実証している。

【0007】

このため、第１の態様では、本発明は、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子を有するEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌であって、ここで、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＣｌｂＰタンパク質のペプチダーゼドメインが遺伝毒性物質であるコリバクチンの活性化に関与する、ＥｃＮ細菌を提供する。

【0008】

本発明の第２の目的は、薬剤として使用するための、上記定義されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌に関する。

【0009】

本発明の第３の目的は、胃腸疾患の処置に使用するための、上記定義されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌に関する。

【0010】

発明の詳細な説明
改変されたEscherichia coli株Nissle 1917
第１の態様では、本発明は、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子を有するEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌であって、配列番号：３のアミノ酸配列を有するＣｌｂＰタンパク質のペプチダーゼドメインが遺伝毒性物質であるコリバクチンの活性化に関与している、ＥｃＮ細菌を提供する。

【0011】

本発明者らは、遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する酵素である配列番号：１のアミノ酸配列を有する天然（野生型）ＣｌｂＰタンパク質もプロバイオティックスＥｃＮのシデロフォア－ミクロシン活性に必要であるが、興味深いことに、プレコリバクチンを開裂させ、活性なコリバクチンを形成するその酵素ドメインは必要でないことを示した。特に、本発明者らは、本発明のペプチダーゼドメインについてのみ不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子についての突然変異体ＥｃＮ細菌（すなわち、突然変異体Ｓ９５Ａ、Ｓ９５Ｒ、Ｋ９８Ｔ又はＣｌｂＰ－３Ｈ）がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、その抗菌活性を（シデロフォア－ＭＣＣ産生を介して）維持するが、全ＣｌｂＰタンパク質をコードする不活性化遺伝子を有する突然変異体ＥｃＮ細菌は維持しないことを示した（すなわち、実施例セクションの図４を参照のこと）。これらの結果から、コリバクチン産生に必須のＣｌｂＰペプチダーゼ活性が、シデロフォア－ミクロシン産生には役割を有さず、その抗菌活性を保持する非遺伝毒性ＥｃＮ株を構築する方法を提供することが証明される。その結果、本発明の突然変異体ＥｃＮ細菌は、より安全かつ防御的な応答を誘発し、このため、本発明の改変ＥｃＮ株を使用したｉｎ ｖｉｖｏデータで実証されたように（図８を参照のこと）、非常に有望で新規なプロバイオティックスを構成する。

【0012】

「Escherichia coli株Nissle 1917」（ＥｃＮ又はＤＳＭ６６０１とも呼ばれる）は、重篤な下痢の集団発生に抵抗性を示した兵士において、Alfred Nissleにより第一次世界大戦中に単離されたプロバイオティックスEscherichia coli株を意味する（１、２）。ＥｃＮは、最初に、細菌性胃腸感染症と闘うその能力について研究された。Salmonella enterica serovar Typhimuriumによる腸内コロニー形成を阻害し（３、４）、腸管出血性E. coli株に対して抗菌活性を示す（５）ことが実証された。ＥｃＮは、ヒト腸管の優れた生着菌であり、種々の腸管機能障害、例えば、乳幼児における急性下痢（６）、慢性便秘（７）及び過敏性腸症候群を有する患者における腹痛（８）に有益な効果を示す。ＥｃＮは、炎症性腸疾患の処置に広く使用されており（１）、小児及び成人の潰瘍性大腸炎の寛解維持のためのゴールドスタンダードであるメサラジンと同等の有効性があることが証明されている（９）。

【0013】

Escherichia coli Nissle 1917（ＥｃＮ）は、複数の腸管障害の処置について数か国で認可されているプロバイオティックス薬であるMutaflor（登録商標）（Ardeypharm GmbH, Herdecke, Germany）の有効成分である（１０）。ＥｃＮは、ｐｋｓと命名されたゲノムアイランドを有することが公知である。ｐｋｓは、ハイブリッドペプチドポリケチド及び特に、コリバクチンと呼ばれる遺伝毒性物質の合成を可能にする遺伝子クラスターを有する（２１）。コリバクチンは、構造的に特徴づけられていないＰＫ－ＮＲＰであり、プレコリバクチンと呼ばれるプロドラッグから生じると考えられている。プレコリバクチンも、構造的に十分に解明されていない（Li, Z.R. et al. Nat Chem Biol 12, 773-5 (2016)；Bode, H.B. Angew Chem Int Ed Engl 54, 10408-11 (2015)）。この毒性物質は、ＣｌｂＡからＣｌｂＳへのタンパク質の連続的な作用を含む複雑な生合成機構により産生される（Taieb, F., et al EcoSal Plus 7(2016)）。コア機構は、３つのポリケチドシンターゼ、３つの非リボソームペプチドシンテターゼ及び２つのハイブリッドＰＫＳ－ＮＲＰＳからなる。また、この機構は、更なる成熟タンパク質及び排出ポンプも利用する。

【0014】

コリバクチンは、排出ポンプであるＣｌｂＭによりペリプラズム中に輸送されるプロドラッグ部分として産生され（２３）、ついで、ペプチダーゼ活性を有するペリプラズム膜結合ＣｌｂＰタンパク質により加水分解され、活性なコリバクチンが放出される（２４、２５）。コリバクチンは、真の毒性因子であるだけでなく（２６，２７）、推定上の前発ガン性化合物でもある。

【0015】

「ＣｌｂＰタンパク質」という用語は、Escherichia coli（及び他のEnterobactriaceae）のｐｋｓゲノムアイランドによりコードされるペプチダーゼを意味する。ＣｌｂＰタンパク質は、タンパク質を内膜に向かわせるＮ末端シグナル配列、プロテアーゼの活性部位を含有するペリプラズムペプチダーゼドメイン（ペプチダーゼを形成するＡＡ残基は、３９～３３７である）及び３つのＣ末端膜貫通ヘリックス（３つの膜貫通ヘリックスを形成するＡＡ残基は、３９０～４１２、４３３～４５５及び４６５～４８５である）を含有する。ＣｌｂＰの結晶構造及び突然変異誘発実験から、ペプチダーゼ活性（２４）ＣｌｂＰに関連するセリン活性部位及び本来の構造的特徴により、プレコリバクチンからＮ－アシル－Ｄ－アスパラギンプロドラッグ足場を除去するＣｌｂＰペプチダーゼ活性を介して、プレコリバクチンの遺伝毒性物質であるコリバクチンへの成熟が可能となることが明らかとなった（２４、２５）。Ｓ９５、Ｋ９８及びＹ１８６は、ＣｌｂＰペプチダーゼ活性に重要な残基であり、これらの残基についての突然変異体では、プレコリバクチンを開裂させ、成熟活性遺伝毒性物質を放出することができない（２４、２５）。

【0016】

ＣｌｂＰの配列を下記表１に示す。

【表1】

【0017】

本発明によれば、「ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質をコードする遺伝子」という用語は、非機能性ペプチダーゼドメインをコードする突然変異を有する遺伝子（例えば、ＣｌｂＰ Ｓ９５、Ｋ９８、Ｙ１８６突然変異体）又は全くペプチダーゼドメインをコードしない突然変異を有する遺伝子（例えば、ＣｌｂＰ－３Ｈ突然変異体）を意味する。本発明によれば、遺伝子の特定のドメインの不活性化を当業者に公知の種々の方法により行うことができる。遺伝子を不活性化するための方法の例は、特に、Conde-Alvarez R. et al., Cell Microbiol 2006 Aug;8(8):1322-35に記載されるような定方向突然変異誘発又は相同組換えである。また、当業者であれば、ＣｌｂＰタンパク質のペプチダーゼドメインを不活性化するのに遺伝子点突然変異を導入するために又は非活性同等物で置き換えるためにＣｌｂＰタンパク質のペプチダーゼドメインを遺伝子的に特異的に組み換えるために、特定の「ヌクレアーゼ」又は「エンドヌクレアーゼ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）を設計することについても知っている。

【0018】

また、本発明の遺伝子の特定のドメインを不活性化するための特定の方法は、実験セクション（ラムダレッドリコンビナーゼ法により行われる遺伝子突然変異誘発（３７を参照のこと））にも記載されている。

【0019】

このため、典型的には、本発明のＥｃＮ突然変異体は、（ｉ）（シデロフォア－ＭＣＣ：ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭの合成を介して）抗菌活性を有する能力を有し、（ｉｉ）（不活性なＣｌｂＰペプチダーゼドメインにより）遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する能力を欠いている。

【0020】

当業者であれば、本発明のＥｃＮ細菌が生物学的に活性であるかどうかを容易に決定することができる。例えば、抗菌活性を有する能力を、例えば、当業者に周知の任意の日常的な試験：耐性記録、競合的増殖アッセイ．．．により決定することができる。

【0021】

抗菌活性の効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（競合的増殖アッセイ）を使用して、本発明の突然変異体ＥｃＮ組成物を適用する前後の表面に存在するターゲット細菌株（ＥｃＮに感受性の株、例えば、E. coli株ＬＦ８２）の減少をモニターすることにより測定することができる。産生株及びターゲット株の両方（すなわち、それぞれＥｃＮ又はＥｃＮ突然変異体及びＬＦ８２）を以前に記載されているように（（３）及び実施例＋図１～５にも記載されるように）植菌する。

【0022】

（ＥｃＮ突然変異体候補についての）コリバクチンにより誘引される遺伝毒性作用の決定を、巨赤血球増加症と呼ばれる関連する細胞肥大に伴うコリバクチンにより誘引される細胞老化をモニターすることにより測定することができる。前述のように（４０）、ＨｅＬａ細胞をＥｃＮ候補で４時間感染させる。ＥｃＮ及びＥｃＮ突然変異体（すなわち、ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ）の遺伝毒性を以前に記載されているように（３６）、Ｉｎ－Ｃｅｌｌウェスタン法により確認する。簡潔に、ＨｅＬａ細胞を所定の感染多重度（感染開始時の細胞当たりに一定数の細菌）で４時間感染させる。感染終了の４時間後、細胞を固定し、透過性にし、ウサギモノクローナル抗ガンマ－Ｈ２ＡＸ、続けて、赤外線蛍光二次抗体で染色する。

【0023】

本明細書で使用する場合、本発明の「生物学的に活性な」ＥｃＮ突然変異体は、ＥｃＮ突然変異体の生物学的活性の全てを示すＥｃＮ突然変異体を指す。ただし、生物学的に活性な突然変異体は、抗菌活性の野生型ＥｃＮ能力を保持しているが、遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する能力を欠いているという条件である。本発明の生物学的に活性なＥｃＮ突然変異体は、例えば、（シデロフォア－ＭＣＣの産生を介して）抗菌活性を有することが可能であること；及びｉｉ）遺伝毒性物質であるコリバクチンを活性化する能力を欠いている（不活性なＣｌｂＰペプチダーゼドメインを有する）ことを特徴とすることができる（実施例及び図５を参照のこと）。

【0024】

本発明の特定の実施態様では、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質は、
Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
Ｋ９８の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
Ｙ１８６の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質、
ペプチダーゼドメインを有さないＣｌｂＰタンパク質（配列番号：３）
からなるリストより選択される。

【0025】

本発明において、突然変異（ペプチダーゼドメインの点突然変異（ｐｕｎｃｔｕａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は組換え）に関するアミノ酸のナンバリングは、野生型ＣｌｂＰタンパク質配列（配列番号：１）に従う。

【0026】

好ましい実施態様では、Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質は、好ましくは、セリンと同等の極性のアミノ酸及び非荷電アミノ酸では置換されていない。したがって、Ｓ９５の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質は、好ましくは、スレオニン、アスパラギン又はグルタミンでは置換されていない。

【0027】

好ましい実施態様では、Ｋ９８の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質が、好ましくは、リシンと同等の正に荷電したアミノ酸では置換されていない。したがって、Ｋ９８の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質は、好ましくは、アルギニン、アスパラギン又はヒスチジンで置換されていない。

【0028】

好ましい実施態様では、Ｙ１８６の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質は、好ましくは、チロシンの疎水性側鎖と同等のアミノ酸では置換されていない。したがって、Ｙ１８６の位置で突然変異したＣｌｂＰタンパク質は、好ましくは、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン又はトリプトファンでは置換されていない。

【0029】

好ましい実施態様では、ペプチダーゼドメインを有さないＣｌｂＰタンパク質では、ＣｌｂＰのペプチダーゼドメインは、１５～１５０kDa、好ましくは、２５～１００kDa、より好ましくは、３０～８０kDa、さらにより好ましくは、３０～５０kDaの分子量を有するペプチドドメインで置換され又は置き換えられている。

【0030】

ペプチドドメイン（重量は同等であるが、Ｎ－アシル－Ｄ－アスパラギンプロドラッグ足場をプレコリバクチンから除去してコリバクチンを形成する（２４、２５）ことからなる任意のＣｌｂＰペプチダーゼ活性を欠く）についてのこの置換により、突然変異体ＣｌｂＰタンパク質の三次元構造及び組織化を維持し、抗菌活性を維持することが可能である。

【0031】

ＣｌｂＰのペプチダーゼドメインを置き換えるのに使用することができるペプチドドメインの例は、Escherichia coli ｐｈｏＡ遺伝子によりコードされる成熟型アルカリホスファターゼＰｈｏＡ又はｂｌａ遺伝子によりコードされる成熟型酵素ベータ－ラクタマーゼ又はEscherichia coli ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる成熟型酵素β－ガラクトシダーゼである。

【0032】

ペプチドドメイン（アルカリホスファターゼＰｈｏＡ、酵素ベータ－ラクタマーゼ、酵素ベータ－ガラクトシダーゼ）のこれらの例は、特に、原核生物における遺伝子融合研究のための、特にペリプラズムドメインを有する膜貫通融合タンパク質のためのレポータタンパク質として（本研究においても同様に）最も一般的に使用されるアルカリホスファターゼＰｈｏＡである（the review van Geest M. and. Lolkema JS. Microbiol Mol Biol Rev. 2000 Mar; 64(1): 13-33を参照のこと）。

【0033】

好ましい実施態様では、ペプチダーゼドメインを有さず、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質は、ＰｈｏＡのアルカリホスファターゼ酵素ドメイン（配列番号：１１）で置換されたペプチダーゼドメインを有するＣｌｂＰタンパク質である。遺伝子融合物を生成する能力は、当業者に周知である。このＣｌｂＰ融合タンパク質に関して、そのシグナル配列を欠くＰｈｏＡの成熟部分のみが、膜タンパク質のＣ末端切断部分後ろに融合される（これも、the review van Geest M. and. Lolkema JS. Microbiol Mol Biol Rev. 2000 Mar; 64(1): 13-33を参照のこと）。より正確には、ＰｈｏＡドメインは、ペリプラズムへの移行を可能にするＣｌｂＰ Ｎ末端シグナル配列及びアミノ酸３９０からのＣｌｂＰ Ｃ末端配列と融合される。３つの膜貫通ヘリックスを形成する残基は、３９０～４１２、４３３～４５５及び４６５～４８５である（実施例セクションを参照のこと）。

【0034】

本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、キラルアミノ酸についてのそれらのＤ及びＬ立体異性体における天然又は非天然アミノ酸を指す。例えば、アミノ酸及び対応するアミノ酸残基の両方が、例えば、ペプチジル構造で存在することを指すと理解される。天然及び非天然アミノ酸は、当技術分野において周知である。一般的な天然アミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）を含むが、これらに限定されない。

【0035】

アミノ酸は、典型的には、それらの側鎖に従って、極性、疎水性、酸性、塩基性及び芳香族を含む１つ以上のカテゴリーに分類される。極性アミノ酸の例は、側鎖官能基、例えば、ヒドロキシル、スルフヒドリル及びアミドを有するもの並びに酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を含む。極性アミノ酸は、アスパラギン、システイン、グルタミン、ヒスチジン、セレノシステイン、セリン、スレオニン、トリプトファン及びチロシンを含むが、これらに限定されない。疎水性又は非極性アミノ酸の例は、非極性脂肪族側鎖を有するような残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、プロリン、メチオニン及びフェニルアラニンを含むが、これらに限定されない。塩基性アミノ酸残基の例は、塩基性側鎖、例えば、アミノ基又はグアニジノ基を有するものを含む。塩基性アミノ酸残基は、アルギニン、ホモリシン及びリシンを含むが、これらに限定されない。酸性アミノ酸残基の例は、酸性側鎖官能基、例えば、カルボキシ基を有するものを含む。酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸には、芳香族側鎖基を有するものを含む。芳香族アミノ酸の例は、ビフェニルアラニン、ヒスチジン、２－ナフチルアラニン、ペンタフルオロフェニルアラニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含むが、これらに限定されない。一部のアミノ酸は、２つ以上のグループに分類され、例えば、ヒスチジン、トリプトファン及びチロシンは、極性アミノ酸及び芳香族アミノ酸の両方に分類されることが留意される。アミノ酸を非荷電アミノ酸又は荷電（正又は負）アミノ酸とさらに分類することができる。正に荷電したアミノ酸の例は、リシン、アルギニン及びヒスチジンを含むが、これらに限定されない。負に荷電したアミノ酸の例は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含むが、これらに限定されない。上記各群に分類される更なるアミノ酸は、当業者に公知である。

【0036】

「同等のアミノ酸」は、機能のいかなる認識可能な損失もなく、本発明のペプチド化合物中で別のアミノ酸で置換することができるアミノ酸を意味する。同等のアミノ酸は、当業者により認識されるであろう。同様のアミノ酸の置換は、例えば、本明細書に記載されたように、サイズ、電荷、親水性及び疎水性について、側鎖置換基の相対的類似性に基づいて行われる。「同等のアミノ酸」という表現は、個々のアミノ酸のリストに続けて使用される場合、リストに含まれる個々のアミノ酸の１つ以上の同等物を意味する。

【0037】

本発明のより特定の実施態様では、遺伝子によりコードされるペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質は、
ＣｌｂＰ Ｓ９５Ａ突然変異体（配列番号：４）、
ＣｌｂＰ Ｋ９８Ｔ突然変異体（配列番号：６）、
ＣｌｂＰ Ｓ９５Ｒ突然変異体（配列番号：８）、
ＣｌｂＰ Ｙ１８６Ｇ突然変異体（配列番号：１０）、
ＰｈｏＡのアルカリホスファターゼ酵素ドメインにより置換されたペプチダーゼドメインを有するＣｌｂＰタンパク質（配列番号：１１）
からなるリストより選択される。

【0038】

本発明の突然変異したＣｌｂＰの配列を下記表２に示す。

【表2】

【0039】

ＣｌｂＰペプチダーゼドメインにおける突然変異（又は置換）は、ＡＡ配列において太字で示される。本発明において、アミノ酸のナンバリングは、野生型ＣｌｂＰタンパク質配列（配列番号：１）に従う。

【0040】

胃腸障害を処置するための方法
本発明の第２の目的は、薬剤として使用するための、上記定義されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌に関する。

【0041】

以前に示されたＥｃＮは、最初に、細菌性胃腸感染と闘う能力について研究された。Salmonella enterica serovar Typhimuriumによる腸内コロニー形成を阻害し（３、４）、腸管出血性E. coli株に対して抗菌活性を示す（５）ことが実証された。ＥｃＮは、ヒト腸管の優れた生着菌であり、種々の腸管機能障害、例えば、乳幼児における急性下痢（６）、慢性便秘（７）及び過敏性腸症候群を有する患者における腹痛（８）に有益な効果を示す。ＥｃＮは、炎症性腸疾患の処置に広く使用されており（１）、小児及び成人の潰瘍性大腸炎の寛解維持のためのゴールドスタンダードであるメサラジンと同等の有効性があることが証明されている（９）。さらに、本発明者らは、細菌性腸内病原体（S. Typhimurium）に感染させたｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、ペプチダーゼドメインについて不活性なＣｌｂＰタンパク質（すなわち、Ｓ９５の位置で変異したＣｌｂＰ）をコードするｃｌｂＰ遺伝子を有するＥｃＮ改変株の投与が非遺伝毒性である（コリバクチンを産生しない）が、細菌性アンタゴニスト活性を維持し、シデロフォア－ミクロシン産生を維持することにより、病原体のコロニー形成及び毒性を低下させること（図８を参照のこと）を実証している。

【0042】

したがって、本発明の第３の目的は、胃腸疾患の処置に使用するための、上記定義されたEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌に関する。

【0043】

したがって、本発明の別の目的は、その対象における胃腸疾患を処置する方法であって、治療上有効量の本発明のＥｃＮ細菌を対象に投与することを含む、方法に関する。

【0044】

処置は、疼痛に苦しんでいる対象の治療的処置及び疼痛に苦しんでいない対象（例えば、胃腸疾患についての高リスクであると特定された対象）の予防的処置を含む、任意の目的のためのものであることができる。本明細書で使用する場合、「処置」、「処置する」及び「処置すること」という用語は、採用された手段の不存在下で生じるであろうものと比較して、本明細書に記載された疾患もしくは障害（すなわち、胃腸疾患）の進行を逆転させ、軽減し、阻害すること又は本明細書に記載された障害もしくは疾患の発生もしくは発症を遅延させ、排除しもしくは減少させることを指す。本明細書で使用する場合、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」又は「予防的使用（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｕｓｅ）」及び「予防的処置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、その目的が本明細書に開示された疾患（すなわち、胃腸疾患）を予防することである任意の医学的又は公衆衛生手法を指す。本明細書で使用する場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」及び「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、所定の状態（すなわち、胃腸疾患）を獲得もしくは進行のリスクの減少又は病気ではないが、その状態（すなわち、胃腸疾患）にある対象であった対象もしくはその状態に近い場合がある対象における再発もしくは前記状態（すなわち、胃腸疾患）の減少もしくは阻害を指す。

【0045】

特定のEscherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌を胃腸疾患、例えば、細菌性胃腸感染症、腸炎症性疾患及び内臓痛を処置するのに使用することができる。

【0046】

胃腸疾患を引き起こす非常に多くの細菌（E. coli、Salmonella、Shigella、Campylobacter、Clostridium）が存在する。腸管の細菌感染症のほとんどは、下痢もしくは赤痢、吐き気、嘔吐及び腹痛又はけいれんをもたらす。細菌感染症が、小腸にある場合、症状は、水様性下痢及び／又は嘔吐を含む。大腸における細菌感染症は、通常、赤痢（糞便量が少なく、粘液及び血液を何度も伴う）をもたらす。一部の疾患は、特定の素因となる状態（抗生物質療法：偽膜性大腸炎）に続発する。これらの疾患の全てが感染症に続発するわけではないが、既成の毒素の摂取後に起こる場合がある（ブドウ球菌性食中毒）。通常、中毒症状（嘔吐、下痢）は、毒素の摂取後すぐ（数時間）に起こる。この一連の疾患を分類するいくつかの方法がある。腸内での位置（小腸ｖｓ大腸）に基づいて分類されるものもあれば、疾患がどのように獲得されたか（食物ｖｓ水ｖｓ人から人へ）により分類されるものもあり、また、病原体がホストにどのように作用するか（中毒ｖｓ胃腸炎ｖｓ非炎症性下痢ｖｓ炎症性下痢ｖｓ腸熱）に基づいて分類されるものもある。これらの病因を分類するこれらの手段は全て、医師が症状の原因を絞り込むのに役立てるのに使用される。消化管感染症は、非常に一般的である。発展途上国では、下痢が最も多い死因である（死亡数２５０万人／年）。下痢を引き起こす病原体は、３つの基本的な方法：食物中、水中および人から人で、ヒトに伝播する場合がある。これらの感染症の多くは自然治癒し、処置を必要としない。一部は、身体の他の部位に広がる場合があり、更なる損傷を防ぐための処置が必要となる。その策略は、患者をいつ処置すべきか、患者をどのように処置すべきかを知ることにある。

【0047】

特定の実施態様では、細菌性胃腸感染症は、Salmonella enterica serovar Typhimurium感染症又は腸管出血性E. coli感染症である。

【0048】

より特定の実施態様では、細菌性胃腸感染症は、Salmonella enterica感染症である。

【0049】

特定の実施態様では、Escherichia coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）細菌を、胃腸疾患、例えば、腸炎症性疾患を処置するのに使用することができる。このような腸炎症性疾患は、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である。

【0050】

本明細書で使用する場合、「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）」という用語は、結腸及び小腸の一群の炎症性疾患である。

【0051】

特定の実施態様では、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、グルテン過敏症及び嚢炎からなる群より選択される。

【0052】

本明細書で使用する場合、「過敏性腸症候群（ＩＢＳ）」という用語は、胃腸管において不快感を引き起こす各種の病理学的状態についての用語である。慢性腹痛、不快感、腹部膨満、排便習慣の変化を特徴とする機能性腸障害であり、臓器に原因はない。また、一部の形態の食物に関連した内臓過敏症、例えば、グルテン過敏症（すなわち、セリアック病）も含まれる。

【0053】

また、別のタイプの胃腸疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に伴う疼痛を含む内臓痛でもある。内臓痛は、腹腔の臓器を包含する内臓に関連する疼痛である。これらの臓器は、脾臓及び消化器系の一部を含む。内臓に関連する疼痛を消化器性内臓痛と非消化器性内臓痛に分けることができる。疼痛を誘引する一般的に遭遇する胃腸（Ｇｌ）障害は、機能性腸障害（ＦＢＤ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。これらのＧｌ障害は、ＦＢＤに関して、胃食道逆流、消化不良、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び機能性腹痛症候群（ＦＡＰＳ）並びにＩＢＤに関して、クローン病、回腸炎及び潰瘍性大腸炎を含む現在中等度にしかコントロールされていない広い範囲の疾患を含み、これらは全て、定期的に内臓痛を生じる。

【0054】

一部の実施態様では、本発明の方法は、機能性腸障害（ＦＢＤ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、胃食道逆流、消化不良、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び機能性腹痛症候群（ＦＡＰＳ）並びにＩＢＤに関して、クローン病、回腸炎、潰瘍性大腸炎を含む胃腸障害により生じる内臓痛、月経困難症、膀胱炎及び膵炎並びに骨盤痛の処置に特に適している。

【0055】

特定の実施態様では、内臓痛は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）からなる群より選択される。

【0056】

一部の実施態様では、本発明の予防方法は、疼痛の高いリスクがあると特定された対象に特に適している。典型的には、疼痛のリスクがある対象は、外科手術を受けるであろう患者を含む。

【0057】

本発明の前記ＥｃＮ細菌を薬剤として、特に、プロバイオティックスとして使用することができる。

【0058】

「プロバイオティックス」という用語は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、適切な量で投与された場合、ホストに健康上の利益を付与する生きた微生物を指す（Clinical Infectious Diseases, Volume 46, Issue Supplement_2, 1 February 2008, Pages S58-S61, https://doi.org/10.1086/523341を参照のこと）。

【0059】

本発明の化合物及び組成物の１日用量は、正常な医学的判断の範囲内で、主治医により決定されるであろうと理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療上有効用量は、処置する障害の種類及び重症度、利用される特定の化合物の活性、利用される特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投与のタイミング及び経路並びに利用される特定の化合物の排泄速度、処置の期間、利用される特定の細菌と組み合わせて又は同時に使用される薬剤並びに医学分野において周知の他の要因を含む各種の要因により決まるであろう。例えば、当技術分野の技能の範囲内で、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルより低いレベルの化合物の用量で処置を開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることが推奨される。

【0060】

本発明の化合物を任意の適切な投与経路により投与することができる。例えば、本発明の化合物を経口（頬側及び舌下を含む）、直腸、鼻、局所、肺、膣又は非経口（筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、皮下及び静脈内を含む）により投与することができる。

【0061】

本発明の好ましい実施態様では、本発明の化合物を含有する治療組成物は、直腸内、局所又は経口投与される。直腸投与は、好ましくは、座剤、注腸又は泡状物質の形態で行われる。直腸内投与は、下腸部分、例えば、結腸に影響を及ぼす腸管疾患に特に適している。

【0062】

医薬組成物
本発明のＥｃＮ細菌は、１つ以上の従来のアジュバント、担体又は希釈剤と共に、医薬組成物及び単位投与の形態にすることができる。

【0063】

「薬学的に」又は「薬学的に許容され得る」は、ほ乳類、特に、ヒトに適切に投与された場合、有害なアレルギー性又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容され得る担体又は賦形剤は、任意のタイプの無毒性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を指す。

【0064】

医薬組成物及び単位投与形態は、追加の活性化合物又は原理の有無に関わらず、従来の割合で従来の成分を含むことができ、単位投与形態は、利用される意図された１日用量範囲に相応する任意の適切な有効量の有効成分を含有することができる。医薬組成物を固体、例えば、錠剤又は充填カプセル剤、半固体、散剤、徐放性製剤又は液体、例えば、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、エリキシル剤もしくは経口使用のための充填カプセル剤として又は直腸投与のための座薬の形態又は非経口使用のための滅菌注射溶液の形態で使用することができる。したがって、錠剤当たりに約１ミリグラム 有効成分又はより広くは、約０．０１～約１００ミリグラム 有効成分を含有する製剤が、適切で代表的な単位投与形態である。

【0065】

本発明の化合物を広い各種の経口投与形態に製剤化することができる。医薬組成物及び投薬形態は、有効成分として本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩を含むことができる。薬学的に許容され得る担体は、固体又は液体のいずれかであることができる。固形調製物は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤及び分散性顆粒剤を含む。固体担体は、希釈剤、風味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、バインダー、保存剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料としても作用することができる１つ以上の物質であることができる。散剤では、担体は、一般的には、微細固体であり、これは、微細有効成分との混合物である。錠剤では、有効成分は、一般的には、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。散剤及び錠剤は、好ましくは、約１～約７０％ 活性化合物を含有する。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂等を含むが、これらに限定されない。

【0066】

「調製物」という用語は、担体としてのカプセル化材料を含む活性化合物の製剤を含むことを意図し、担体の有無に関わらず、有効成分が、それと関連する担体により取り囲まれるカプセル剤を提供する。同様に、カシェ剤及びトローチ剤が含まれる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェ剤、及びロゼンジ剤は、経口投与に適した固体形態であることができる。

【0067】

経口投与に適した他の形態は、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤、水溶液剤、水性懸濁剤を含む液体形態調製物又は液体形態調製物に使用直前に変換されることが意図される固体形態調製物を含む。エマルジョン剤を、例えば、水性プロピレングリコール溶液中で溶液に調製することができ又は乳化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレアート又はアカシアを含有することができる。水溶液剤を、有効成分を水に溶解し、適切な着色剤、香味剤、安定剤及び増粘剤を加えることにより調製することができる。水性懸濁剤を、微細有効成分を粘性物質、例えば、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び他の周知の懸濁化剤と共に水中に分散させることにより調製することができる。固体形態調製物は、液剤、懸濁剤及びエマルジョン剤を含み、有効成分に加えて、着色剤、香味剤、安定剤、バッファー、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含有することができる。

【0068】

代替的には、有効成分は、粉末形態にあることができ、滅菌固体の無菌単離により又は適切な媒体、例えば、無菌の発熱物質を含まない水で使用する前に、構成のための溶液から凍結乾燥することにより得ることができる。

【0069】

本発明を下記図面及び実施例によりさらに例証するものとする。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1】ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性におけるｐｋｓ／ｃｌｂアイランドの役割。（Ａ）野生型（ＷＴ）E. coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）又はコリバクチン成熟ペプチダーゼＣｌｂＰについての突然変異体とのE. coli ＬＦ８２（リファンピシン抵抗性）の２４時間共培養物の系列希釈物を、リファンピシンを含有するＬＢプレート上にスポットし（１０μL）、３７℃で一晩インキュベーションした。（Ｂ）ＷＴ ＥｃＮ、スホパンテテイニルトランスフェラーゼＣｌｂＡ、ペプチダーゼＣｌｂＰ及び対応する補完変異体（ｐｃｌｂＰ）、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）ＣｌｂＣ及びＣｌｂＯ、非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）ＣｌｂＨ及びＣｌｂＮ、ハイブリッドＰＫＳ－ＮＲＰＳ ＣｌｂＢ、推定上のアミダーゼＣｌｂＬ、排出ポンプであるＣｌｂＭ並びにチオエステラーゼＣｌｂＱについての遺伝子欠失とのＭ６３培地中での２４時間共培養後のE. coli ＬＦ８２のコロニー形成単位（CFU）カウント。ＬＦ８２も対照として単独で培養した（φ）。独立した実験の中央値及び個々の結果を示す。ＷＴとの共培養との比較における一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト；★★★Ｐ＜０．００１。

【図2】ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性におけるミクロシン遺伝子クラスターの役割。野生型（ＷＴ）E. coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）、ミクロシンＭ（ＭｃｃＭ）前駆体遺伝子ｍｃｍＡについてのＥｃＮ突然変異体、ミクロシンＨ４７（ＭｃｃＨ４７）前駆体遺伝子ｍｃｈＢについてのＥｃＮ突然変異体、ｍｃｍＡ、ｍｃｈＢ遺伝子の両方についてのＥｃＮ突然変異体、翻訳後修飾を担うｍｃｈＣ ｃｈｍＤ遺伝子についてのＥｃＮ突然変異体及び補完株並びにＭｃｃＭ及びＭｃｃＨ４７排出ポンプをコードするｍｃｈＥ ｍｃｈＦ遺伝子についてのＥｃＮ突然変異体とのＭ６３培地中での２４時間共培養後のE. coli ＬＦ８２のコロニー形成単位（CFU）カウント。ＬＦ８２も対照として単独で培養した（φ）。独立した実験の中央値及び個々の結果を示す。ＷＴとの共培養との比較における一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト；★★０．００１＜Ｐ＜０．０１；★★★Ｐ＜０．００１。

【図3】ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性におけるシデロフォアの役割。（Ａ）野生型（ＷＴ）E. coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）、エンテロバクチンシンターゼＥをコードするｅｎｔＥについてのＥｃＮ突然変異体及びホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＣｌｂＡ及びＥｎｔＤについての二重突然変異体、グルコシルトランスフェラーゼＩｒｏＢ、細胞質エステラーゼＩｒｏＤ、ペリプラズムエステラーゼＩｒｏＥ及び輸出タンパク質ＩｒｏＣについてのＥｃＮ突然変異体及び補完株とのＭ６３培地中での２４時間共培養後のE. coli ＬＦ８２のコロニー形成単位（CFU）カウント。ＬＦ８２も対照として単独で培養した（φ）。独立した実験の中央値及び個々の結果を示す。ＷＴとの共培養との比較における一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト；★★★Ｐ＜０．００１。

【図4】ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性におけるＣｌｂＰ触媒及び膜貫通ドメインの役割。野生型（ＷＴ）E. coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）、ｃｌｂＰ遺伝子欠損並びに野生型ＣｌｂＰをコードするプラスミド（ｐｃｌｂＰ）、触媒部位に突然変異Ｓ９５Ａ又はＫ９８Ｔを有するＣｌｂＰをコードするプラスミド及びアミノ酸３９０からのアルカリホスファターゼＰｈｏＡとＣｌｂＰ Ｃ末端配列との融合物をコードするプラスミド（ｐｃｌｂＰ－３Ｈ）を有する補完変異体とのＭ６３培地中での２４時間共培養後のE. coli ＬＦ８２のコロニー形成単位（CFU）カウント。ＬＦ８２も対照として単独で培養した（φ）。独立した実験の中央値及び個々の結果を示す。ＷＴとの共培養との比較における一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト；★★★Ｐ＜０．００１。

【図5】ＣｌｂＰ触媒ドメインを不活性化するゲノム点突然変異はＥｃＮの遺伝毒性を消失させるが、ＬＦ８２に対する抗菌活性は消失させない。（Ａ）ＨｅＬａ細胞に、野生型E. coli Nissle（ＷＴ）、触媒部位を不活性化するｃｌｂＰ遺伝子（ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ）に単一の染色体ヌクレオチド変化を有するゲノム編集突然変異体及びプラスミドｐｃｌｂＰで補完したゲノム編集突然変異体を一過性に感染させた。ついで、細胞を固定し、透過性にし、ウサギモノクローナル抗ガンマ－Ｈ２ＡＸ、続けて、赤外線蛍光二次抗体で染色した。ＤＮＡをRedDot2で対比染色した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、野生型E. coli Nissle（写真Ｂ）、ｃｌｂＰ遺伝子欠失突然変異体（Ｃ）及びゲノム編集ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ突然変異体（Ｄ）を一過性に感染させた。ついで、これらの細胞を洗浄し、ゲンタマイシンと共に７２時間インキュベーションし、その後、ギムザで染色した。対照を写真Ａに示す。バーは、５０μmを表わす。（Ｃ）野生型（ＷＴ）E. coli株Nissle 1917（ＥｃＮ）、ｃｌｂＰ遺伝子欠失突然変異体（ΔｃｌｂＰ）及び触媒部位にＳ９５Ｒ突然変異をもたらすｃｌｂＰ遺伝子の一ヌクレオチド変化を有するゲノム編集突然変異体（ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ）とのＭ６３培地中での２４時間共培養後のE. coli ＬＦ８２のコロニー形成単位（ＣＦＵ）カウント。ＬＦ８２も対照として単独で培養した（φ）。独立した実験の中央値及び個々の結果を示す。ＷＴとの共培養との比較における一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト；★★★Ｐ＜０．００１。

【図6】E. coli株Nissle（ＥｃＮ）におけるミクロシンＨ４７及びＭ（ＭｃｃＨ４７及びＭ）の産生に関与する遺伝子クラスターをゲノム地図上に表わした。ＥｃＮゲノムアイランド（ＧＥＩ）ＩＶ上のエンテロバクチン（ｅｎｔ）、コリバクチン（ｐｋｓ）、イエルシニアバクチン（ｙｂｔ）、ＧＥＩ Ｉ上のサルモケリン（ｉｒｏ）並びにＭｃｃＨ４７（ｍｃｈ）及びＭ（ｍｃｍ）をコードするローカスを表わす。矢印は、ＥｃＮにおけるＭｃｃＨ４７及びＭの産生に関与する異なる遺伝子クラスター間の相互作用を表わす。

【図7】E. coli Nissleにおけるシデロフォア－ミクロシンＨ４７及びＭの生合成のために提唱されたモデル。エンテロバクチン前駆体は、エンテロバクチングルコシルトランスフェラーゼＩｒｏＢにより修飾される。このシデロフォア部分は、ＭｃｈＣＤ複合体により前駆体ペプチドのＣ末端に移される。シデロフォア－ミクロシンの活性型は、特異的排出ポンプであるＭｃｈＥＦ－ＴｏｌＣによるその排出の間のリーダーペプチドの開裂によりもたらされる。ＣｌｂＰのＣ末端ドメインにより、シデロフォア－ミクロシン産生のこの最終段階が可能となり、一方、そのＮ末端酵素ドメインは、プレコリバクチンを開裂させて、コリバクチンを産生する。

【図8】ＣｌｂＰ触媒ドメインを不活性化するゲノム点突然変異ではなく、ｃｌｂＰ欠失は、マウスの腸内病原菌Salmonella Typhimuriumに対するＥｃＮ保護を損なう。Ｃ５７ＢＬ／６のメスマウスを２０mg ストレプトマイシン/osで処置し、ついで、２４時間後に、ＰＢＳ中の１０^９個のS. Typhimurium（ＳＴｍ）に経口感染させるか又は１０^９個のS. Typhimuriumと１０^９個のＥｃＮ野生型、ΔｃｌｂＰ又はｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株とを同時投与した。（Ａ）マウスを４日間毎日、臨床徴候（体重減少、下痢、腹痛の徴候）についてモニターした。各点は、３回の独立した実験において、群当たりに１０～１５匹の動物の平均臨床スコア＋／－ＳＥＭに対応する。３回の実験の最後の２回では、動物を盲検的に（感染菌を知らずに）スコア化した。ＳＴｍ＋ＥｃＮと比較した二元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニポストテスト、ａ：ｐ＜０．０５、ｃ：ｐ＜０．００１。（Ｂ）ＳＴｍの糞排泄を感染後２日目及び４日目に採取した糞の計数により調べた。中央値及び個々の結果を示す。ＳＴｍ＋ＰＢＳと比較した対数変換ＣＦＵカウントの一元配置ＡＮＯＶＡ、ａ：ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＳＴｍ及びＥｃＮの糞カウントを使用して、競合指数（ＣＦＵ ＳＴｍ／ＣＦＵ ＥｃＮ）を決定した。ＳＴｍ＋ＥｃＮ ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒと比較した一元配置ＡＮＯＶＡ、ａ：ｐ＜０．０５。

【図9】ＥｃＮ野生型、ΔｃｌｂＮ及びｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株におけるＮ－アシル－Ａｓｎ－ＧＡＢＡＯＨの検出。ＥｃＮ野生型、ΔｃｌｂＮ又はｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株をＤＭＥＭ Ｈｅｐｅｓ中で８時間増殖させ、ついで、細菌ペレット中のＮ－アシル－Ａｓｎ－ＧＡＢＡＯＨを三重四重極質量分光計（G6460 Agilent）に連結させた高速液体クロマトグラフィー（Agilent 1290 Infinity）により定量した。濃度Ｃを１Ｅ＋８ CFU当たりのピコグラムとして示す。

【0071】

実施例
材料及び方法
細菌株、突然変異体及びプラスミド
本研究に使用された細菌株及びプラスミドを表３に列記する。遺伝子突然変異誘発をラムダレッドリコンビナーゼ法（３７）により行った。二重突然変異体を連続的に構築した。ＦＲＴカセットの突然変異及び欠失を、ターゲット遺伝子の上流及び下流のプライマーを使用するＰＣＲにより検証した。

【0072】

ＣｌｂＰ Ｎ末端シグナル配列、アルカリホスファターゼＰｈｏＡ及びＣｌｂＰの３つの膜貫通ヘリックス間の融合物を、各フラグメント間に重複するプライマーを有するHiFi ＤＮＡアセンブリキット（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）を使用して構築した。構築をＰＣＲにより検証し、配列決定により確認した。４０mg/L ５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルホスファートを含むＬＢプレート上で青色に染色されたコロニー形成単位から、以前に報告されたように（３８）、ペリプラズム中のＰｈｏＡアルカリホスファターゼドメインの存在が明らかとなった。

【0073】

プラスミドｐｍｃｈＥＦ及びｐｍｃｈＣＤを構築するために、遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ－ＸＬ－ＴＯＰＯ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）にクローニングした。

【0074】

プラスミドｐＩｒｏＢを構築するために、ｉｒｏＢ遺伝子をテンプレートとしてのＥｃＮゲノムＤＮＡ及びプライマーＩＲＳＤＮＧ７及びＩＲＳＤＮＧ８でＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、ｒｆｐ遺伝子を除去するために消化されたｐＢｂＡ５ａ－ＲＦＰ（Addgeneから入手）にライゲーションした。

【0075】

ＥｃＮ ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ染色体同質遺伝子突然変異株を、ゲノム編集技術（３９）を使用して構築した。ＥｃＮをｐＯＲＴＭＡＧＥでトランスフォーメンションし、ついで、３０℃及び３００rpmでＬＢ中において増殖させて、ＯＤ６００＝０．５に到達させた。最初の突然変異誘発サイクルを、ラムダリコンビナーゼ及びドミナントネガティブｍｕｔＬＥ３２Ｋアレルの発現を４２℃、２５０rpmで１５分間誘引することにより開始した。ついで、培養物を０℃に冷却し、水中で洗浄し、ｃｌｂＰ遺伝子配列中にＳ９５Ａ突然変異を含む５０μM オリゴヌクレオチドＩＲＳＤＮＧ２６でエレクトロポレーションした。対照実験では、ｌａｃＺ遺伝子を特異的変異原性オリゴヌクレオチドのターゲットとした。ＬＢ中において３０℃及び３００rpmで１時間回復させた後、２つの他の突然変異誘発サイクルを行い、細菌を最後に、抗生物質を含まないMacConkeyアガー上に播種した。対照実験では、分離株の約３３％がＬａｃＺ陰性であった。６０の候補ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ突然変異体について、以前に記載されているように（４０）、感染ＨｅＬａ細胞における遺伝毒性の消失及び巨赤血球症の表現型を検査した。ｐＯＲＴＭＡＧＥプラスミドを失った非遺伝毒性突然変異体を選択し、最終的に、ＰＣＲ増幅ｃｌｂＰ配列中のＳ９５Ａ突然変異によるＣｌａＩ制限部位の除去について検証した。

【0076】

コリバクチンにより誘引される遺伝毒性作用の測定
コリバクチンにより誘引される細胞老化は、巨赤血球増加症と呼ばれる関連する細胞肥大と関連しており、Ｍｃｃ遺伝子クラスター、ｉｒｏＡローカスにおいて、本研究で構築された全てのＥｃＮ突然変異体及びｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ突然変異体で測定した。以前に記載されているように（４０）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－２）を４時間感染させた。ついで、細胞を洗浄し、ゲンタマイシンと共に７２時間インキュベーションした後、ギムザで染色した。ＥｃＮ及びｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ染色体突然変異体の遺伝毒性を以前に記載されているように（３６）、Ｉｎ－Ｃｅｌｌウェスタン法により確認した。簡潔に、ＨｅＬａ細胞を所定の感染多重度（感染開始時の細胞当たりに一定数の細菌）で４時間、９６ウェルプレートにおいて感染させた。感染終了の４時間後、細胞を固定し、透過性にし、ウサギモノクローナル抗ガンマ－Ｈ２ＡＸ（Cell Signaling,20E4、１：２００）、続けて、赤外線蛍光二次抗体で染色した。ＤＮＡをRedDot2（Biotum）で対比染色した。蛍光をOdyssey赤外撮像システム（Li-Cor）で記録した。

【0077】

競合的増殖アッセイ
株をＬＢ培地（LB Lennox, Invitrogen）中において、２４０rpmで振とうしながら、３７℃で一晩増殖させた。リファンピシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、カルベニシリン又はクロラムフェニコールを必要に応じて、培地に加えた。

【0078】

共培養実験に使用された培地は、１５mM 硫酸アンモニウム、１mM 硫酸マグネシウム七水和物、１００mM リン酸一カリウム、２．５g/L グルコース、１mg/L チアミン及び１g/Lバクトトリプトン（BD Biosciences, Le Pont de Claix, France）の最終濃度を有するＭ６３最小培地又は２５mM Ｈｅｐｅｓ、１０％（v/v） ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Eurobio, Courtaboeuf, France）及び１％（v/v） 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Invitrogen）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）GlutaMAX（Invitrogen）のいずれかとした。

【0079】

各一晩培養物 ５００μLを共培養培地 ９．５mL中で培養し、２４０rpmで振とうしながら、３７℃で２時間インキュベーションした。産生株及びターゲット株（それぞれＥｃＮ及びＬＦ８２）の両方を、以前に記載されているように（３）、これらの２時間培養物から、共培養培地 １０mL中に１０６CFU/mLで植菌し、２４０rpmで振とうしながら、３７℃で２４時間インキュベーションした。ＣＦＵ数値化のために、培養培地をＰＢＳ中で系列希釈し、必要とされる抗生物質（例えば、ＬＦ８２についてリファンピシン（４１））を含有する選択的ＬＢアガープレート上に播種した。全結果セクションでは、ターゲット株（主にＬＦ８２）の増殖のみを報告する。対照として、競合株（主にＥｃＮ及びＥｃＮ突然変異体）の増殖を系統的にチェックした（データを示さず）。

【0080】

動物への感染
動物への感染を、科学的目的で使用される動物保護のための欧州指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って行った。プロトコールは、地域倫理委員会により承認された（プロトコール番号：２０１９０４１７１０２９２２７１）。メスのＣ５７ＢＬ／６（Janvier）を、食物及び水に自由にアクセスできる状態で、ケージ当たりに５匹の動物で、換気されたケージに収容した。

【0081】

動物に２０mg ストレプトマイシンを強制経口投与し、ついで、２４時間後、１０^９個のS. Typhimurium株ＩＲ７１５（ナリジクス酸抵抗性）に経口感染させるか又は１０^９個のS. Typhimurium及び１０^９個のＥｃＮ、ＥｃＮΔｃｌｂＰ又はＥｃＮ ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ（ストレプトマイシン抵抗性を付与するｒｐｓＬＫ４２Ｒアレルを有する）と同時投与した。

【0082】

S. Typhimurium及びＥｃＮの糞排泄を、ＰＢＳ中での糞のホモジナイゼーション、系列希釈及びナリジクス酸又はストレプトマイシンを補充したＬＢアガープレート上での播種により決定した。

【0083】

サルモネラ症の重症度を体重減少、腹痛の徴候、発熱及び下痢の毎日のスコアリングにより評価した。

【0084】

致死を避けるために、実験を感染後４日で終了した。

【0085】

実験を群当たりに５匹ずつ３回繰り返し、３回の独立した実験のうち２回で盲検的に（感染菌を知らずに）臨床スコアをスコア化した。

【0086】

バイオインフォマティクス分析
ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ合成に関与する遺伝子を、BLASTn及びＣＡ５８ Ｍｃｃ遺伝子クラスター：前駆体タンパク質をコードするｍｃｈＢ及びｍｃｍＡ、免疫遺伝子ｍｃｈＩ及びｍｃｍＩ、特異的排出ポンプをコードする遺伝子ｍｃｈＥ及びｍｃｈＦ、翻訳後修飾を担う遺伝子ｍｃｍＫ及びｍｃｍＬ（及びE.coli Ｈ４７ Ｍｃｃ遺伝子クラスターであるｍｃｈＳ１及びｍｃｈＡにおける各相同体）を参照として検索した。有意性のカットオフ値として、クエリーカバー＞８０％、同一性＞９０％、及びＥ値＜１ｅ４０を選択した。ｐｋｓアイランドの５’及び３’領域それぞれについてのマーカーとしての遺伝子ｃｌｂＢ及びｃｌｂＰを、同じ方法を使用して特定したため、サルモケリン遺伝子クラスター（ｉｒｏＡローカス）の５’及び３’領域についてのマーカーとして、遺伝子ｉｒｏＮ及びｉｒｏＢとした。４つの遺伝子：ａｒｐＡ、ｃｈｕＡ、ｙｊａＡ及びｔｓｐＥ４．Ｃ２（並びにＡ及びＣ系統群を区別するためのｔｒｐＡ）の存在／不存在に基づいて、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで系統群を決定した（４２）。系統樹を、ｒｐｏＣ配列を使用して構築した。配列をPATRIC 3.5.8（４３）を使用して収集し、MEGA7.0.26ソフトウェア（４４）による対数期待値（ＭＵＳＣＬＥ）による多重配列比較によりアライメントさせ、系統樹を、MEGA7.0.26を使用する最尤法に従って構築した。

【0087】

統計分析
統計分析を、GraphPad Prism 7.0a（GraphPad, San Diego, CA, USA）を使用して行った。Ｐ値を、一元配置ＡＮＯＶＡ、続けて、ボンフェローニポストテストを使用して計算した。CFU/mLを分析のために対数変換した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなし、≪により示し、Ｐ＜０．０１を≪≪により示し、Ｐ＜０．００１を≪≪≪により示す。

【0088】

結果
ＥｃＮの抗細菌活性にはＣｌｂＰが必要であるが、コリバクチン合成経路の他の成分は必要ではない
遺伝毒性活性をプロバイオティックス活性から特異的に切り離すために、プレコリバクチンの遺伝毒性物質であるコリバクチンへの成熟を可能にするＣｌｂＰ（２４、２５）を欠失したＥｃＮ突然変異体の抗細菌活性を試験した。ＰＰＴａｓｅ（２７、３５、３６）をコードする多面発現性ＣｌｂＡ突然変異体と比較した。野生型ＥｃＮ、ＥｃＮ ΔｃｌｂＡ及びΔｃｌｂＰ突然変異体と、ＥｃＮに感受性であることが以前に示されている（４５、４６）クローン病関連E. coli株ＬＦ８２との共培養実験を行った。ＣＦＵから、ＥｃＮ株が、ＬＦ８２増殖を強力に阻害することが示された。ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性は、ΔｃｌｂＡ突然変異体では変化しなかったが、ΔｃｌｂＰ突然変異体では完全に失われた（図１）。動力学実験から、ＬＦ８２に対するＥｃＮの阻害活性が、植菌後６時間で始まり、定常期の開始時である植菌後８時間で最高に達したことが示された（データを示さず）。ＬＦ８２の増殖は、ΔＣｌｂＰ突然変異体によってはいつも変化せず、ＥｃＮの抗菌作用のＣｌｂＰ依存性がさらに証明された。このＥｃＮのＣｌｂＰ依存性阻害活性は、E. coliの他の病原株（ＪＪ１８６及びＮＲＧ８５７ｃ）及び密接に関連する菌種、例えば、Salmonella enterca subp. enterica Typhimurium及びEnterobacter aerogenesにおいても観察された（データを示さず）。

【0089】

ＣｌｂＰ以外のコリバクチン合成経路の他の成分が、ＥｃＮの抗菌活性に必要であるかどうかをさらに決定するために、ＰＫＳ ＣｌｂＣ及びＣｌｂＯ、ＮＲＰＳ ＣｌｂＨ及びＣｌｂＮ、ハイブリッドＰＫＳ－ＮＲＰＳ ＣｌｂＢ、推定上のアミダーゼＣｌｂＬ、排出ポンプであるＣｌｂＭ並びにチオエステラーゼＣｌｂＱについての突然変異体の阻害効果をＬＦ８２に対して評価した。ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性は、これらの突然変異体のいずれにおいても変化しなかった（図１）。これらの結果から、コリバクチン自体又は開裂産物であるＮ－ミリストイル－Ｄ－アスパラギンが、ＬＦ８２（及び他のグラム陰性細菌、データを示さず）に対するＥｃＮの抗菌活性に必須ではないことが確認される。したがって、ＥｃＮのプロバイオティックス活性は、ｐｋｓ／ｃｌｂアイランド及びＣｌｂＰの存在と明らかに関連しているが、コリバクチンは、ＥｃＮの阻害活性に関与しない。

【0090】

ＥｃＮ ＣｌｂＰ依存性抗菌活性にはＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭが必要である
以前の研究では、ＥｃＮの抗菌活性とＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭとが関連づけられている（４、１１、１４、１５）。したがって、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ産生系において、ＬＦ８２とＥｃＮ及び突然変異体との共培養実験を行った。ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性は、ＭｃｃＭ前駆体遺伝子ｍｃｍＡ単独又はＭｃｃＨ４７前駆体遺伝子ｍｃｈＢ単独の欠失により影響を受けなかった（図２）。対照的に、ｍｃｍＡ及びｍｃｈＢの両方の欠失により、ＬＦ８２に対するＥｃＮの阻害効果がほぼ完全に消失した。同様に、ＭｃｃＭ及びＭｃｃＨ４７排出ポンプをコードする遺伝子ｍｃｈＥ及びｍｃｈＦを欠失させると、抗菌活性が失われた（図２）。ｍｃｈＥとｍｃｈＦとのトランス補完性により、野生型ＥｃＮ株と比較して、ＥｃＮの阻害活性が向上した（図２）。おそらく、ＭｃｈＥ－ＭｃｈＦ排出ポンプの過剰発現後にＭｃｃ輸送が増加したためであろう。Ｍｃｃ産生系におけるこれらの突然変異のいずれも、ＥｃＮが活性なコリバクチンを産生する能力に影響を及ぼさなかった（データを示さず）。

【0091】

ＥｃＮの抗菌活性におけるＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭの役割をさらに確認するために、ＭｃｃＨ４７又はＭｃｃＭ免疫遺伝子をコードするプラスミドをＬＦ８２にトランスフォーメーションし、得られた株の抵抗性をＥｃＮに対して評価した（データを示さず）。ＥｃＮ ΔｍｃｈＢ突然変異体の抗菌活性は、ＭｃｃＭ免疫遺伝子ｍｃｍＩを有するＬＦ８２に対してほとんど完全に消失した（データを示さず）。同様の結果が、ΔｍｃｍＡ突然変異体とＭｃｃＨ４７免疫遺伝子ｍｃｈＩを有するＬＦ８２とでも得られた（データを示さず）。全体として、これらの結果から、ＬＦ８２に対するＥｃＮ ＣｌｂＰ依存性阻害活性が、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭによることが確認された。

【0092】

ＥｃＮ ＣｌｂＰ依存性抗菌活性はシデロフォア－Ｍｃｃの産生による
ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭは、カテコールシデロフォアの結合により翻訳後に修飾されて、「シデロフォア－Ｍｃｃ」を形成することができる（１３）。したがって、本発明者らは、ＣｌｂＰ依存性抗菌活性がこれらの修飾型のミクロシンに依存する場合があると仮定した。実際、ＬＦ８２に対するＥｃＮの抗菌活性は、シデロフォアエンテロバクチン産生に必須な酵素である２，３－ジヒドロキシベンゾアート－ＡＭＰリガーゼを欠損させたΔｅｎｔＥ突然変異体において強力に低下した（４７）。同様の結果が、エンテロバクチンを産生できないＥｃＮ ΔｃｌｂＡΔｅｎｔＤ二重突然変異体でも得られた（３６）（図３）。

【0093】

エンテロバクチンのグリコシル化及びエステル化を担う２つの遺伝子（ｍｃｍＬ及びｍｃｍＫ）は、ＥｃＮのＭｃｃ遺伝子クラスターから欠落している（１８、４８）。結果として、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭが、シデロフォア－Ｍｃｃであるか又は未修飾Ｍｃｃであるかは、依然として議論されている（１３）。ＥｃＮが、ＭｃｍＬ及びＭｃｍＫホモログ、グルコシルトランスフェラーゼＩｒｏＢ及びエステラーゼＩｒｏＤそれぞれを有している（１３）ことを考慮して、Ｍｃｃとサルモケリン産生系の間の相互作用を調査した。グルコシルトランスフェラーゼＩｒｏＢ、細胞質エステラーゼＩｒｏＤ、ペリプラズムエステラーゼＩｒｏＥ及び輸出タンパク質ＩｒｏＣをコードする遺伝子（４９、５０）についてのＥｃＮ突然変異体の抗菌活性を、野生型ＥｃＮ株の活性と比較した。ｉｒｏＢ欠失のみにより、ＥｃＮの抗菌活性における有意な低下がもたらされた（図３）。ΔｉｒｏＢ突然変異体の補完により、抗菌活性は完全に回復した。ｉｒｏＡローカスにおけるこれらの突然変異はいずれも、コリバクチンの遺伝毒性作用と関連する巨赤血球増加症を引き起こすＥｃＮの能力に影響を及ぼさなかった（データを示さず）。これらの結果から、ＩｒｏＢが、エンテロバクチンのグリコシル化を担う可能性があり、ＭｃｍＬの不存在下でＭｃｃ前駆体タンパク質のシデロフォア由来部分への結合を可能にすることが示唆される。

【0094】

ＭｃｈＣ及びＭｃｈＤは、K. pneumoniae株Ｅ４９２のＭｃｅＪ及びＭｃｅＩにそれぞれ相同である（１３）。これらのタンパク質は、グリコシル化エンテロバクチン誘導体の前駆体ペプチドＭｃｅＡであるＭｃｃＥ４９２への結合を担う複合体を形成する（５１）。ｍｃｈＣ及びｍｃｈＤについてのＥｃＮ突然変異体では、ＬＦ８２に対する抗菌作用が失われたが、補完により、最初の表現型が回復した（図２）。これらの結果から、エンテロバクチン由来部分を有するＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭの翻訳後修飾が、ＥｃＮの抗菌活性に必要であることが示される。要するに、ＥｃＮ ＣｌｂＰ依存性抗菌活性は、シデロフォア－Ｍｃｃによる。

【0095】

ペリプラズムペプチダーゼ触媒部位ではなくＣｌｂＰ膜貫通ドメインがＥｃＮの抗菌活性に必要である
シデロフォア－Ｍｃｃ産生におけるＣｌｂＰの役割をさらに解明するために、ＣｌｂＰ触媒活性が、ＥｃＮの抗菌活性に必要かどうかを調べた。Ｓ９５及びＫ９８は、ＣｌｂＰペプチダーゼ活性に重要な残基であり、これらの残基についての突然変異体は、プレコリバクチンを開裂させて、成熟した活性な遺伝毒性物質を放出することができない（２４、２５）。共培養試験をＬＦ８２と、野生型ＣｌｂＰタンパク質又はＳ９５ＡもしくはＫ９８Ｔの置換を有するＣｌｂＰタンパク質をコードするプラスミドで補完されたＥｃＮ ΔＣｌｂＰ突然変異体とで行った。ＣｌｂＰ Ｓ９５Ａ又はＫ９８Ｔで補完されたＥｃＮ ΔＣｌｂＰ突然変異体は、野生型ＣｌｂＰタンパク質と同様の抗菌活性を示したが（図４）、コリバクチンの遺伝毒性作用に関連する巨赤血球増加症を引き起こす能力を失っていた（データを示さず）。

【0096】

ＣｌｂＰ酵素ドメインの別の推定上の触媒部位の役割を排除するために、この酵素ドメインを以前に報告されているように（３８）、ＰｈｏＡのアルカリホスファターゼ酵素ドメインにより置き換えた。ＰｈｏＡドメインを、ペリプラズムへの移行を可能にするＣｌｂＰ Ｎ末端シグナル配列及びアミノ酸３９０からのＣｌｂＰ Ｃ末端配列と融合させた。３つの膜貫通ヘリックスを形成する残基は、３９０～４１２、４３３～４５５及び４６５～４８５である（２４）。この融合物を有するプラスミドでトランスフォーメーションされたＥｃＮ ΔｃｌｂＰ突然変異体は、ＥｃＮ ＷＴ株と同様のＬＦ８２に対する阻害活性を示したが（図４）、巨赤血球増加症は引き起こさなかった（データを示さず）。したがって、３つの膜貫通ヘリックスを含むＣｌｂＰのＣ末端ドメインは、遺伝毒性活性にのみ重要なＣｌｂＰペリプラズムペプチダーゼドメインとは対照的に、ＥｃＮの抗菌活性に必須である。

【0097】

この観察を確認し、非遺伝毒性ＥｃＮプロバイオティックス株を操作することができるという概念の証明として、染色体ｃｌｂＰ遺伝子に一ヌクレオチド突然変異を示し、アミノ酸レベルでＣｌｂＰ触媒部位にＳ９５Ｒ突然変異をもたらすＥｃＮ突然変異株を構築するためにゲノム編集を使用した。この突然変異体は、コリバクチンを産生せず、遺伝毒性はないが、野生型遺伝毒性ＥｃＮ株と同様のＬＦ８２に対する抗菌活性を依然として示した（図５）。

【0098】

ｃｌｂＰ遺伝子に点突然変異を有するＥｃＮ株は非遺伝毒性であるが、アンタゴニスト活性を保ち、S. Typhimuriumの腸内コロニー形成及び病原性を低下させる
ＥｃＮプロバイオティックスは、鉄について競合し、シデロフォア－ミクロシンを産生することにより、腸内病原体、例えば、Salmonellaに対して防御を提供することが周知である（３，４）。このため、ＥｃＮ野生型、ΔｃｌｂＰ及びｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ突然変異体により、S. Typhimurium腸内コロニー形成及び病因を減少するかどうかを、ｉｎ ｖｉｖｏモデルを使用して調べた。（高いコロニー形成を確実にするために）ストレプトマイシンで処置され、ついで、２４時間後に、S. Typhimuriumのみに感染させ又はS. Typhimuriumと各ＥｃＮ株とを同時投与されたＣ５７ＢＬ／６マウス（３、４、６６）を利用した。マウスを臨床徴候（体重減少、下痢、腹痛の徴候）についてモニターし、細菌コロニー形成を４日間（致死性により実験を停止しなければならない点）、糞の計数により調べた。単独投与した場合、S. Typhimuriumは腸管に容易にコロニー形成し、これは、強い腸管サルモネラ症と関連する高い臨床スコアと関連していた（図８）。野生型ＥｃＮと同時投与された動物では、臨床スコア及びS. Typhimuriumの糞コロニー形成の顕著な低下が認められた（図８Ａ～図８Ｂ）。感染後２日目までに、ＥｃＮは、S. Typhimuriumを有意に上回った（図８Ｃ）。対照的に、ＥｃＮ ΔＣｌｂＰ突然変異体が同時投与された動物では、より高い臨床スコアが示され、S. Typhimuriumのコロニー形成に対する拮抗作用が低下したことから、急性サルモネラ大腸炎時のＥｃＮの有益な効果におけるＣｌｂＰの役割が実証された。ＥｃＮ ｃｌｂＰ－Ｓ９５Ｒ株により、野生型ＥｃＮと同様に、糞排出が相当減少し、S. Typhimuriumを上回り、臨床スコアが低下した（図８）。

【0099】

まとめると、これらの結果から、ＥｃＮの遺伝毒性活性をそのプロバイオティックス（抗菌）活性から切り離すことが可能であることが示され、また、コリバクチン及びシデロフォア－ミクロシンの生合成経路は、当初考えられていたより絡み合っていることが示される。

【0100】

ＣｌｂＰ依存性抗菌活性が切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスター及びｐｋｓアイランドを有するE.coli株のサブセットで観察される
比較ゲノム分析により、ＥｃＮは、E. coli腎盂腎炎株ＣＦＴ０７３及び無症候性細菌尿株ＡＢＵ８３９７２と密接に関連していることが示されている（１８）。これらの３つ株及び参照株ATCC（登録商標）２５９２２は、ｐｋｓアイランド、ｉｒｏＡローカス及び遺伝子ｍｃｍＬ／ｍｃｈＡ及びｍｃｍＫ／ｍｃｈＳ１を欠いた切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスターを有する。したがって、ＥｃＮで観察されたように、これらの株のシデロフォア－Ｍｃｃ抗菌作用がＣｌｂＰ依存性であるかどうかを評価した。２つのセットのE. coli株の阻害作用をＬＦ８２と各ΔｃｌｂＰ変異株：ｉ）切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスター及びｐｋｓアイランドの両方を有するＥｃＮに類似する株：株ＣＦＴ０７３、ＡＢＵ８３９７２及びATCC（登録商標）２５９２２並びにｉｉ）ｐｋｓアイランドを有するが、Ｍｃｃコード遺伝子を欠く株：ヒト共生株Ｍ１／５、髄膜炎原因株ＳＰ１５、マウス共生株ＮＣ１０１及びｐｋｓアイランドを有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）をホストする実験室株ＭＧ１６５５とに対する共培養実験で調べた。切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスター及びｐｋｓアイランドの両方を有する３つの野生型株は、ＥｃＮで観察されたように、顕著な阻害効果を示した（データを示さず）。対応する３つの全てのΔＣｌｂＰ突然変異株の阻害効果は著しく低下したが、ＣｌｂＰ補完により、最初の表現型が回復した（データを示さず）。対照的に、ｐｋｓアイランドのみを有する株では、野生型株又はΔｃｌｂＰ突然変異体と培養したかどうかに関わらず、ＬＦ８２の増殖に有意差は認められなかった（データを示さず）。累積的に、これらの結果から、ｐｋｓアイランド及び切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスターの両方を有するE. coli株において、ペプチダーゼＣｌｂＰが、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭの抗菌活性に関与していることが示される。また、この結果から、この関連性が、病原性株及びプロバイオティックス株の両方に存在することも示される。

【0101】

E. coli集団におけるｐｋｓ、サルモケリン並びにＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ遺伝子クラスターの分布
切断型Ｍｃｃ遺伝子クラスターを有するE. coli株が、シデロフォア－Ｍｃｃ依存性抗菌活性を示すことが実証された（データを示さず）。この抗菌活性には、遺伝毒性物質であるコリバクチンを産生する生合成経路からのＣｌｂＰ及びシデロフォアサルモケリンを産生する生合成経路からのＩｒｏＢが必要である。その結果、GenBankで利用可能なゲノムを有するE. coli株において、ｐｋｓアイランド、ｉｒｏローカス及びＭｃｃアイランド間のこの関連性を確認した。興味深いことに、翻訳後修飾を担うｍｃｍＬ及びｍｃｍＫ遺伝子を欠いた株は全て、Ｂ２系統群に属し、ｐｋｓアイランドを欠く株１１０５を除き、ｐｋｓアイランド及びｉｒｏＡを有していた（データを示さず）。逆に、ｍｃｍＬ／ｍｃｈＡ及びｍｃｍＫ／ｍｃｈＳ１を有する株は、Ｂ１、Ｃ又はＤ系統群に属し、ｐｋｓアイランドを欠いていた。これらの遺伝的決定因子の特別な関連性から、切断されたアイランドは、ほとんどｐｋｓ及びｉｒｏＡローカスを有する株にのみ存在するという仮説が導かれた。コリバクチン、サルモケリン及びシデロフォア－Ｍｃｃ生合成経路間のこの相互作用は、病原性又はプロバイオティックスのいずれかである株における共選択によることが示唆される。

【0102】

Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株によるNissle 1917のプロバイオティックス活性に関与するであろう有益な化合物の産生
ｐｋｓアイランドにコードされる酵素により合成されるコリバクチン以外の代謝産物は、Nissle 1917のプロバイオティックス特性に役割を有する可能性がある。代謝産物Ｃ１２ＡｓｎＧＡＢＡＯＨが、Nissle 1917野生型により産生されることが近年示された（一方、ｃｌｂＮ突然変異体によっては産生されない。これは、ｐｋｓコード機構がその産生に役割を有していることを示している）（３４）。Ｃ１２－Ａｓｎ－ＧＡＢＡＯＨは、ニューロンにおける侵害レセプター活性化を阻害することが示された。腸管の侵害レセプターニューロンは、Ｍ細胞密度及び炎症をレギュレーションするため、腸管病原体に対する保護及び腸管のホメオスタシスに重要な役割を果たしている。このため、非遺伝毒性改変株が、Nissleの抗炎症特性に役割を有するＣ１２ＡｓｎＧＡＢＡＯＨの産生を保持することを確実にすることが重要である。

【0103】

Nissle 1917野生型、Nissle ｃｌｂＮ突然変異体及びNissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒの細菌培養物中のＮ－アシル－Ａｓｎ－ＧＡＢＡＯＨをＨＰＬＣ－ＱＱＱ（３４）により定量した。Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒは、野生型株と同様に、有益なＧＡＢＡＯＨリポペプチドをなおも産生する（図９）。

【0104】

Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒの遺伝的安定性
Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株が遺伝的に安定であることを検証するために、マウスの強制経口投与（病原性Salmonella（６７）と共に）及び糞からの再分離の前後にそのゲノムＤＮＡを配列決定した。このゲノムを野生型株のゲノムと比較した。野生型株のゲノムも配列決定した。Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒ株は、野生型と比較して（５４４１２００bpのうち）わずか２bpの変化を示した。マウス腸管通過前後のNissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒで差は認められなかった（データを示さず）。このため、Nissle ｃｌｂＰ Ｓ９５Ｒは、遺伝的に安定であると考えられる。

【0105】

議論
Flemingが、１９２８年にペニシリンを発見して以来、抗生物質は、ヒトの平均余命の延長に寄与してきた。以前は致死的であった多くの感染症が治癒可能となった。残念ながら、抗生物質の過剰使用及び誤用により、新たな抗菌剤の不足と並行して、多剤耐性菌が出現し、蔓延することになってしまった（５２）。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、この現象は、「世界中で罹患率及び死亡率に相当な脅威をもたらしている」（５３）。この傾向は、特に、グラム陰性細菌について懸念されている。例えば、第３世代セファロスポリン抵抗性又はカルバペネム抵抗性E. coliに起因する死亡数は、２００７年から２０１５年の間に欧州で４倍以上増加した（５４）。静脈内投与用に現在開発されている抗生物質のうち、グラム陰性細菌に対してある程度の活性を示すのはごく一部（４４種類中１５種類）であり、これらの分子は全て、公知の抗生物質クラスに由来する。その結果、ＷＨＯは、グラム陰性細菌に対する新たな抗生物質の研究開発が「極めて重要な優先事項」であることを立証した（５３）。

【0106】

新たな抗菌剤の探索において、ミクロシンは、「従来の」抗生物質に代わる有望な選択肢であると考えられる。実際、多くのミクロシンは、強力な狭域抗菌活性を示すが、抗生物質は、有益な細菌を排除し、微生物叢を変化させ、抵抗性株の選択を促進してしまう場合がある（５５、５６）。ミクロシンを使用する際の大きな課題は、特に、経口投与後の感染部位への十分な量の送達である。ミクロシンは、多くの場合、上部消化管で分解されるためである（５７、５８）。その結果、操作されたプロバイオティックス細菌が、腸管病原菌（５９）と闘うか又は多剤耐性菌（６０）によるコロニー形成を減少させるために、ミクロシンのｉｎ ｓｉｔｕ産生菌として提案された。

【0107】

ＥｃＮは、１世紀以上にわたってプロバイオティックスとして使用されており、多くの治療上の利点が記載されている。しかしながら、ＥｃＮ投与の安全性についての深刻な懸念が、長年にわたって現れてきた。ＥｃＮは、乳児における重度敗血症の原因となることが報告されており（６１）、そのゲノムは、腸外感染の原因となるE. coli株の真の毒性因子であるコリバクチン（２６、２７）をコードする病原性アイランドｐｋｓを有することが示された（２１、３５）。加えて、コリバクチン産生E. coliの保菌は、腸のホメオスタシスにも有害である場合がある。成体ラットでは、腸管上皮の透過性を亢進させ、腸管細胞に遺伝毒性損傷の徴候、例えば、陰窩分裂をもたらし、細胞増殖を亢進させた（２８）。大腸ガンの素因があるマウスでは、ｐｋｓ陽性E. coliにより、腫瘍のサイズ及び数が増加した（３１、６２）。ヒトでは、ｐｋｓ陽性E. coliが、対照と比較して結腸直腸ガン生検で大きな比率を占めることが、幾つかの研究で報告されている（３１、３２、６３）。全体として、これらの研究から、コリバクチン産生細菌により腫瘍形成が促進されるおそれがあることが示唆される。したがって、目標は、ＥｃＮのプロバイオティックス活性において、遺伝毒性物質であるコリバクチンの産生とｐｋｓアイランドに関連する有益な効果との相互作用を理解することであった。その結果、そのプロバイオティックス特性を維持しながら、ＥｃＮの武装解除を試みた。

【0108】

以前の試みにおいて、本発明者らは、そのプロバイオティックス活性も失った非遺伝毒性ＥｃＮ ＰＰＴａｓｅ ＣｌｂＡ突然変異体を構築した（３５）。続けて、ＰＰＴａｓｅ ＣｌｂＡが、エンテロバクチン（及びしたがって、サルモケリン）及びイエルシニアバクチンの合成に寄与することが発見された（３６）。本研究では、サルモケリン（ｉｒｏＢ）とＭｃｃ遺伝子クラスターとの間に協調関係があることが実証された（図６）。これらは両方とも、ＥｃＮゲノムアイランドＩ及びｐｋｓアイランド（ｃｌｂＰ）に位置する。織り合わせは、これらの決定因子の間で非常に強力であり、単一のタンパク質であるＣｌｂＰはコリバクチン産生及びＭｃｃ産生の両方に関与する。これまで、ＣｌｂＰは、プレコリバクチンからＮ－アシル－Ｄ－アスパラギンプロドラッグ足場を除去するペプチダーゼとしてのみ記載されていた（２４、２５）。ＣｌｂＰの生物活性には、３つの膜貫通ヘリックスを有する完全なＣ末端ドメインが必要であるが、触媒活性は、Ｎ末端ペリプラズムドメインにより行われる（２５、３８）。本研究では、公知の酵素機能を欠くＣｌｂＰのＣ末端ドメインが、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭによるＥｃＮの抗菌活性に必要であることが実証された。ＣｌｂＰ Ｃ末端膜貫通ドメインが、ＭｃｈＥ－ＭｃｈＦ排出ポンプを介して、ＥｃＮのＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭの輸送を促進することができることが示唆される（図７）。

【0109】

機能分析及びバイオインフォマティクス分析の両方を使用して、シデロフォア－Ｍｃｃ、サルモケリン及びコリバクチンアセンブリ系統間の相互作用が実証された。驚くべきことに、２つの群のE. coli株が出現した。一方で、「切断型」ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ遺伝子クラスターを有する全ての株（すなわち、ｍｃｍＬ／ｍｃｈＡ及びｍｃｍＫ／ｍｃｈＳ１を欠くＥｃＮ等の株）は、ｐｋｓアイランド及びｉｒｏＡローカスも有するＢ２株である。尿からの分離株は、この群の株（ＣＦＴ０７３、クローンＤ ｉ１４及びＤ ｉ２、ＵＰＥＣ ２６－１、ＡＢＵ ８３９７２）が大きな比率を占めていたことに留意されたい。他方で、ｐｋｓアイランド及びｉｒｏＡローカスは、「完全な」ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ遺伝子クラスターを有する非Ｂ２株には存在しない。これらの株は全て、糞から分離された（起源が不明のＡＣＮ００２を除く）。したがって、「完全な」Ｍｃｃ遺伝子クラスターを有するこれらの株は、その排他的ニッチである競合的腸内環境で生存するために、Ｍｃｃ生産に特化しているという仮説を立てることができる。対照的に、腸外病原性E. coli（ＥｘＰＥＣ）は、腸管ニッチから出現し、その後適応しなければならない他の身体部位（例えば、尿路）に感染するために、効率的な腸内生着菌でなければならない。そのため、ＥｘＰＥＣは特殊な株ではなく、「ゼネラリスト」であることが示唆されている（６４）。本研究で調べられた株は、このモデルに適合する。これらの株は、環境に応じた種々の毒性因子：例えば、ＭｃｃＨ４７及びＭｃｃＭ、シデロフォア並びにコリバクチン経路に由来する鎮痛性リポペプチドを発現することができる。限られた大きさのゲノムにより非常に多くの毒性因子又は適応因子を産生可能なように（６５）、これらの決定因子を産生するアセンブリ系統の要素は万能であり、幾つかの明らかに独立した代謝経路に介入しなければならない。

【0110】

結論として、ｐｋｓアイランドは、予想されるよりＥｃＮプロバイオティックス活性にさらに密接に関連していることが発見された。この絡み合いは、種々の環境に適応するためのプロバイオティック決定因子及び病原性決定因子の同時進化を反映する。ＣｌｂＰの酵素ドメインを特異的にターゲットとすることにより、プロバイオティックスを遺伝毒性活性から切り離すことにより、ＥｃＮの安全な使用に道が開かれる。

【0111】

【表3】

【0112】

参考文献
本願全体を通して、種々の参考文献に、本発明が属する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

【0113】

【表4】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】