2022-539684 高シアル酸含量を有し、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含むポリペプチド二量体及び同ポリペプチド二量体を含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-13

(54)【発明の名称】高シアル酸含量を有し、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含むポリペプチド二量体及び同ポリペプチド二量体を含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220906BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220906BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220906BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220906BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220906BHJP

   C07K 14/735 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 27/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20220906BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220906BHJP

   A61K 9/70 20060101ALI20220906BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20220906BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20220906BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220906BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/735

A61P37/08

A61P11/00

A61P27/02

A61P27/00

A61P17/04

A61P17/00

A61K9/70 401

A61K38/02

A61K38/16

A61K39/395 Y

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021575270

(86)(22)【出願日】2020-07-07

(85)【翻訳文提出日】2022-02-10

(86)【国際出願番号】 KR2020008855

(87)【国際公開番号】W WO2021006599

(87)【国際公開日】2021-01-14

(31)【優先権主張番号】10-2019-0082217

(32)【優先日】2019-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521550909

【氏名又は名称】ジーアイ イノベーション， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＩ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ミョン ホ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， ボ‐ギー

(72)【発明者】

【氏名】リー， キョンファ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA72

4C076CC03

4C076CC10

4C076CC15

4C076CC18

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA22

4C084CA59

4C084MA63

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA341

4C084ZA342

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB131

4C084ZB132

4C085AA33

4C085BB34

4C085BB42

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA53

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、高含量のシアル酸を有する改変されたＩｇＥ Ｆｃ受容体及び同受容体を含む医薬組成物に関する。本発明による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、従来使用されている抗ＩｇＥ抗体と比較して、身体での優れた安全性及び持続性を有するだけでなく、非常に強くＩｇＥに結合もし、投与サイクル延長の利点を有する。加えて、本発明による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、ＩｇＥ単独標的物質であり、ＩｇＧ１のＦｃが適用される従来の抗ＩｇＥ抗体と異なり、Ｆｃガンマ受容体に結合しない。したがって、肥満細胞の表面のＦｃガンマ受容体に結合することによって引き起こされるメディエーターの放出を阻害することができ、その結果、重篤な副作用を最小限にすることができる。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、皮下投与の場合でさえ血液中に高濃度を維持することができる。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体であって、
２つの単量体を含み、その各々が、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）を含有し、
前記単量体が、Ｆｃ領域を含有し、
前記Ｆｃ領域及び前記ＦｃεＲＩα－ＥＣＤが、ヒンジを介して連結し、
前記高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が少なくとも８である、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項2】

前記ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項3】

前記Ｆｃ領域が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項4】

前記ヒンジが、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域である、請求項１に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項5】

前記シアル酸がＮ－アセチルノイラミン酸である、請求項１に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項6】

前記ポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が、少なくとも１０である、請求項１に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項7】

前記ポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が、１２～２５である、請求項６に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項8】

免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来する前記ヒンジ領域が、少なくとも１つのシステインを含有する、請求項４に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項9】

免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来する前記ヒンジ領域が、
Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１７）であり、
Ｘａａ１が、Ｌｙｓ又はＧｌｙであり、
Ｘａａ２が、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒである；又は
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１８）であり、
Ｘａａ３が、Ｌｙｓ又はＧｌｙであり、
Ｘａａ４が、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒである、請求項４に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項10】

免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来する前記ヒンジ領域が、配列番号３、配列番号４、及び配列番号１９からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項12】

皮下注射用である、請求項１１に記載のアレルギー性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項13】

前記アレルギー性疾患が、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、及びアレルギー性接触皮膚炎からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１１に記載のアレルギー性疾患を治療又は予防するための医薬組成物。

【請求項14】

請求項１１に記載の医薬組成物を含む経皮パッチ。

【請求項15】

請求項１１に記載の医薬組成物を含む局所パッチ。

【請求項16】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性症状を改善又は軽減するための食品組成物。

【請求項17】

アレルギー性疾患を予防又は治療するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＩｇＥ Ｆｃ受容体を含み、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体及び同ポリペプチド二量体を含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

現代社会は工業化され、食習慣は西洋化されているので、喘息を含む、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、及び食物アレルギーなどのアレルギー性疾患の発生率が増加している。重篤なアレルギー性疾患であるアナフィラキシーの発生も増加している。これらの慢性免疫疾患は、個人の生活の質を著しく損ない、それに応じて社会経済的コストが急増している。したがって、そのような疾患を克服する手段が、切望されている。

【0003】

ほとんどのアレルギー性疾患は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の過度の免疫応答によって引き起こされる。ＩｇＥは、通常状態下で非常に低い濃度で血液中に存在する抗体である。ＩｇＥは、無害な抗原によっても通常産生される。ＩｇＥの数が、任意の特別の刺激なく増加する場合がある。そのような場合に、アレルギー性疾患が導かれる可能性がある。異常に増加した数のＩｇＥが、肥満細胞、好塩基球などの表面に発現される高親和性ＩｇＥ Ｆｃ受容体（ＦｃεＲＩｓ）に結合できる。そのような結合は、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、ブラジキニン、及び血小板活性化因子などの化学メディエーターの放出を、肥満細胞又は好塩基球に引き起こさせる。これらの化学メディエーターの放出は、アレルギー性症状をもたらす。特に、アレルギー性疾患は、ＩｇＥとＦｃεＲＩとの間の結合に起因する症状の悪化を示す可能性がある。加えて、ＦｃεＲＩ発現細胞は、アレルギー患者において増加することが知られている。

【0004】

現在、アレルギー性疾患を治療するために、アレルゲンの回避、抗アレルギー薬の投与、身体におけるＩｇＥ合成の調節、及び抗ＩｇＥ抗体の開発など、様々な方法が提案されている。しかしながら、薬の有効性が不十分である、及び深刻な副作用が発生するなど、多くの欠点がなお存在している。最近、ＩｇＥ及びＦｃγＲＩＩｂに対して高親和性で結合することができ、膜にアンカーしたＩｇＥを発現する細胞を阻害することができる組成物が研究されてきた。この組成物は、アレルギー及び喘息を含むＩｇＥ媒介疾患の治療に有用であると報告されている（ＫＲ１０－１７８３２７２Ｂ）。

【0005】

特に、ＩｇＥ抗体のＦｃ部分を標的とするオマリズマブ（商品名：ゾレア（Ｘｏｌａｉｒ））は、難治性の重症喘息及び難治性蕁麻疹の治療剤として開発され、使用されている。しかしながら、治療効果を維持するためのオマリズマブの高用量投与は、高いコスト負担、血管浮腫及びアナフィラキシー反応などの副作用を導く（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ９９、Ｎｕｍｂｅｒ ５、Ｍａｒｃｈ １９９７、９１５－９２５）。加えて、市販後の結果から、アレルギー性肉芽腫性血管炎及び特発性重症血小板減少症などの深刻な有害反応が報告されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、本発明者らは、アレルギー性疾患に対して安全且つ有効な治療剤を開発するために研究を行った。結果として、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含む２つの単量体（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）を含むポリペプチド二量体のシアル酸含量が高い場合に、上記ポリペプチド二量体は、ＩｇＥに対する優れた結合親和性を有し、血液中で高濃度を維持することが見出された。特に、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が皮下に投与されたときでさえ、身体への効果的な送達が可能であることが確認されることにより、本発明は完成した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の１つの態様では、シアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が少なくとも８である、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）を含む２つの単量体を含むポリペプチド二量体が提供される。

【0008】

本発明の別の態様では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

【0009】

本発明の別の態様では、医薬組成物を含む経皮パッチが提供される。

【0010】

本発明の別の態様では、医薬組成物を含む局所パッチが提供される。

【0011】

本発明の別の態様では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性症状を改善又は軽減するための食品組成物が提供される。

【0012】

本発明の別の態様では、アレルギー性疾患を予防又は治療するための、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体の使用が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、従来使用されている抗ＩｇＥ抗体と比較して、身体での優れた安全性及び持続性を有するだけでなく、非常に強くＩｇＥに結合もし、投与サイクル延長の利点を有する。加えて、本発明による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、ＩｇＥ単独標的物質であり、ＩｇＧ１のＦｃが適用される従来の抗ＩｇＥ抗体と異なり、Ｆｃガンマ受容体に結合しない。したがって、肥満細胞の表面のＦｃガンマ受容体に結合することによって引き起こされるメディエーターの放出を阻害することができ、その結果、重篤な副作用、例えば、ＩｇＧ１と肥満細胞のＦｃガンマ受容体ＩＩＩとの間の結合によって引き起こされうる、アナフィラキシーの出現を最小限にすることができる。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、皮下投与の場合でさえ血液中に高濃度を維持することができる。したがって、本発明による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、アレルギー性疾患の予防又は治療に有利に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって各細胞株において産生されたポリペプチド二量体が確認される結果を示す図である。

【図2】１つの実施形態によるポリペプチド二量体の非還元型及び還元型についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図3】ＩｇＥに対するオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図4】ＩｇＥに対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）の結合親和性を示す図である。

【図5a】ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体Ｉ（ＦｃγＲＩ）に対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図5b】ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体ＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＡ）に対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図5c】ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体ＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＢ）に対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図5d】ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩＡ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）に対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図5e】ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩＢ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）に対する本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブの結合親和性を示す図である。

【図6】本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブとＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体との間の結合親和性を定量化することによって得られたグラフである。

【図7】本発明の実施形態によるポリペプチド二量体の濃度に応じたＩｇＥとの結合の程度を示す図である。

【図8】本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）及びその濃度に応じたゾレア（オマリズマブ）の、ヒトＦｃεＲＩ発現マウス由来肥満細胞の活性に対する阻害能の間の比較を示す図である。

【図9】食物アレルギーモデルにおいて下痢の頻度を測定することにより、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体の抗アレルギー効果を確認する図である。

【図10】本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）の非還元型及び還元型についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。

【図11】本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）の等電点を確認する図である。

【図12】食物アレルギーモデルにおいて下痢の頻度を測定することにより、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）の皮下注射の抗アレルギー効果を確認する図である。

【図13】食物アレルギーモデルにおいて血液中のＩｇＥ濃度を測定することにより、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）の抗アレルギー効果を確認する図である。

【図14】食物アレルギーモデルにおいて血液中のＭＣＰＴ－１濃度を測定することにより、１つの実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）の抗アレルギー効果を確認する図である。

【図15】１つの実施形態によるポリペプチド二量体のマウスモデルにおけるシアル酸含量に応じた、薬物動態プロファイルの分析の結果を示す図である。

【図16】受動全身アナフィラキシーマウスモデルにおいて体温を測定することにより、シアル酸含量に応じた１つの実施形態によるポリペプチド二量体の抗アレルギー効果を確認する図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の１つの態様では、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）を含む２つの単量体を含み、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が提供され、単量体がＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域及びＦｃεＲＩα－ＥＣＤが、ヒンジを介して連結し、ポリペプチド二量体はシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が少なくとも８であることを特徴とする。

【0016】

本明細書で使用される、「ＩｇＥ」という用語は、免疫グロブリンＥとして知られる抗体を意味する。ＩｇＥは、肥満細胞、好塩基球などに対して親和性を有する。加えて、ＩｇＥとそれに対応する抗原（アレルゲン）との間の反応は炎症性反応を引き起こす。加えて、ＩｇＥはアナフィラキシーの主要な原因であることが知られている。

【0017】

本明細書で使用される、「ＩｇＥ Ｆｃ受容体」という用語は、Ｆｃε受容体とも称され、ＩｇＥのＦｃ部分に結合する受容体を示す。受容体には２つのタイプがある。ＩｇＥ Ｆｃに対して高親和性を有する受容体は、Ｆｃε受容体Ｉ（ＦｃεＲＩ）と称される。ＩｇＥ Ｆｃに対して低親和性を有する受容体は、Ｆｃε受容体ＩＩ（ＦｃεＲＩＩ）と称される。ＦｃεＲＩは、肥満細胞及び好塩基球で発現される。ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥ抗体が多価抗原で架橋される場合、肥満細胞及び好塩基球で脱顆粒が起こり、それによってヒスタミンを含む様々な化学伝達物質が放出される。この放出は、即時型アレルギー反応を導く。

【0018】

ＦｃεＲＩは、ジスルフィド結合によって連結された１つのα鎖、１つのβ鎖、及び２つのγ鎖で構成される膜タンパク質である。これらの鎖のうち、ＩｇＥが結合する部分は、α鎖（ＦｃεＲＩα）である。ＦｃεＲＩαは、約６０ｋＤａのサイズであり、細胞膜の内側に存在する疎水性ドメイン及び細胞膜の外側に存在する親水性ドメインで構成される。特に、ＩｇＥは、α鎖の細胞外ドメインに結合する。ＦｃεＲＩαは、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットとして互換的に使用することができる。

【0019】

具体的には、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットは、ＮＰ＿００１９９２．１に記載のアミノ酸配列を有していてもよい。加えて、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）は、配列番号１のアミノ酸配列を有していてもよい。ＦｃεＲＩα－ＥＣＤは、フラグメント又はバリアントがＩｇＥに結合することができる限り、ＦｃεＲＩα－ＥＣＤのフラグメント又はバリアントであってもよい。加えて、配列番号１のＦｃεＲＩα－ＥＣＤは、配列番号５の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

【0020】

バリアントは、方法がＦｃεＲＩα－ＥＣＤの機能を変更しない限り、野生型ＦｃεＲＩα－ＥＣＤにおいて１つ又は複数のアミノ酸を置換、欠失、又は追加する方法によって、調製することができる。このようなバリアントは、配列番号１のアミノ酸配列と、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一であってもよい。

【0021】

Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域又は改変されたＦｃ領域であってもよい。加えて、本明細書で使用される、「改変されたＦｃ領域」という用語は、抗体のＦｃ部分の一部が改変されている領域を意味する。Ｆｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含有し、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域並びに軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含有しない、タンパク質を意味する。特に、改変されたＦｃ領域は、Ｆｃ領域の一部のアミノ酸を置換するか、又は異なるタイプのＦｃ領域を組み合わせることによって得られてもよい。具体的には、改変されたＦｃ領域は、配列番号２のアミノ酸配列を有してもよい。加えて、配列番号２の改変されたＦｃ領域は、配列番号６の配列を有するポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

【0022】

加えて、改変されたＦｃ領域は、天然形態の糖鎖であってもよい又は天然形態と比較して糖鎖が増加してもよい。免疫グロブリンＦｃ糖鎖は、化学的方法、酵素的方法、及び微生物を用いる遺伝子工学的方法などの従来の方法によって改変することができる。
加えて、改変されたＦｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）又は補体成分１ｑ（Ｃ１ｑ）に対する結合部位がないことに起因して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）機能を欠く領域であってもよい。

【0023】

ある実施形態では、改変されたＦｃ領域及びＦｃεＲＩα－ＥＣＤは、ＩｇＤのヒンジを介して連結してもよい。ヒンジは、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域であってもよい。天然のＩｇＤのヒンジ領域は、６４個のアミノ酸で構成される。免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、２０～６０個の連続的なアミノ酸、２５～５０個の連続的なアミノ酸、又は３０～４０個のアミノ酸で構成されてもよい。ヒンジバリアントは、タンパク質産生プロセス中にトランケート型の発生を最小化するために、ＩｇＤのヒンジ領域のアミノ酸配列の一部を改変することによって得てもよい。

【0024】

ある実施形態では、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、３０又は４９個のアミノ酸で構成されてもよい。加えて、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、少なくとも１つのシステインを含有してもよい。
ある実施形態では、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、以下の配列：
Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１７）を含有してもよく、Ｘａａ１は、Ｌｙｓ又はＧｌｙであってもよく、Ｘａａ２は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒであってもよい。具体的には、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、配列番号３又は配列番号１９のアミノ酸配列を有していてもよく、それによって、タンパク質産生プロセス中にトランケート型の発生を最小化する。

【0025】

別の実施形態では、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、以下の配列：
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ（配列番号１８）を含有してもよく、Ｘａａ３は、Ｌｙｓ又はＧｌｙであってもよく、Ｘａａ４は、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、又はＳｅｒであってもよい。具体的には、免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域は、配列番号４のアミノ酸配列を有していてもよく、それによって、タンパク質産生プロセス中にトランケート型の発生を最小化する。

【0026】

特に、配列番号４の配列を有する免疫グロブリンＩｇＤ又はそのバリアントに由来するヒンジ領域では、少なくとも１つのＴｈｒがグリコシル化されてもよい。具体的には、配列番号１８のアミノ酸のうち、１３番目、１４番目、１８番目、又は１９番目のＴｈｒが、グリコシル化されてもよい。全ての４つのＴｈｒが、グリコシル化されうることが好ましい。グリコシル化は、Ｏ－グリコシル化であってもよい。

【0027】

糖タンパク質医薬品に付着している糖鎖は、品質を決定する主な因子の１つであり、治療有効性、身体での持続性、ターゲティング及び免疫応答などに重要な役割を果たしている。糖鎖の端がシアル酸で終結されていないポリペプチド二量体は、身体から即座に除去されることが確認された。

【0028】

本発明に使用される「シアル酸」という用語は、以下の式１のＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）及び以下の式２のＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含み得る。

【0029】

【化1】

【0030】

この場合、１つの実施形態では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、高含量のＮ－アセチルノイラミン酸を有してもよい。

【0031】

加えて、ポリペプチド二量体のシアル酸の含量は、精製方法によって増加されうる。加えて、ポリペプチド二量体のシアル酸の含量は、シアル酸トランスフェラーゼ遺伝子が導入される細胞においてポリペプチド二量体を産生させることによって増加されうる。

【0032】

高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、シアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が８又はそれ以上であることを特徴としてもよい。例えば、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であってもよい。好ましくは、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５であってもよい。

【0033】

ある実施形態では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１であってもよい。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、８～３０又は１２～２５であってもよい。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、１０～２５、１１～２４又は１２～２３であってもよい。また、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体中のシアル酸／ポリペプチド二量体のモル比は、１３～２２、１４～２２、１５～２２、１６～２２、１７～２２、１８～２２、又は１９～２２であってもよい。シアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸であってもよい。

【0034】

加えて、シアル酸は、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）を含む単量体における８位及びＦｃ領域に結合することができる。この場合、シアル酸は、上記位置の少なくとも４又はそれ以上に結合することができる。具体的には、シアル酸は、単量体における４、５、６、７又は８位に結合することができる。

【0035】

上記の通り、本発明によって提供される高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、２つの単量体が互いに結合し、各単量体がＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインと改変されたＦｃ領域との間の結合によって得られる形態であってもよい。高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、同じ２つの単量体が、ヒンジ部位に配置されるシステインによって互いに結合している形態であってもよい。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、２つの異なる単量体が、互いに結合している形態であってもよい。

【0036】

この場合、各ポリペプチド単量体は、シアル酸を同じ位置に含んでいてもよいが、シアル酸を異なる位置に含んでいてもよい。加えて、シアル酸／ポリペプチド二量体のモル比が８又はそれ以上である場合、二量体を構成する各単量体が異なるモル比のシアル酸／ポリペプチドを有していてもよい。

【0037】

加えて、ポリペプチド二量体は、互いに異なる２つの単量体を含有してもよい。具体的には、１つの単量体が、ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインを含有してもよく、他の単量体がＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメインのフラグメントを含有する形態であってもよい。単量体の実施形態は、配列番号２０、配列番号２１、又は配列番号２２によって表されるアミノ酸配列で構成されてもよい。

【0038】

加えて、本発明によって提供される高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、オマリズマブ（抗ＩｇＥ抗体）より１０～１００倍、２０～９０倍、２０～７０倍、３０～７０倍、又は４０～７０倍高い、ＩｇＥに対する結合親和性を示し、オマリズマブより約７０倍高い、ＩｇＥに対する結合親和性を示しうることが好ましい。

【0039】

本発明の別の態様では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

【0040】

ポリペプチド二量体は、上記と同じである。特に、医薬組成物は、皮下注射用であることを特徴としてもよい。高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が、皮下注射の際に、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体と比較して、アレルギー性疾患の治療及び／又は予防に有効であることが確認された。

【0041】

本明細書で使用される、「アレルギー性疾患」という用語は、肥満細胞の脱顆粒などの肥満細胞の活性化により媒介されるアレルギー反応によって引き起こされる病理学的な症状を意味する。例えば、そのようなアレルギー性疾患は、それに限定されないが、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、及びアレルギー性接触皮膚炎からなる群から選択されるものであってもよい。特に、アレルギー性疾患は、ＩｇＥ媒介性であってもよい。

【0042】

医薬組成物では、ポリペプチド二量体は、使用、製剤、配合目的などに応じて、ポリペプチド二量体が抗アレルギー活性を示し得る限り、任意の量（有効量）で含有されうる。ポリペプチド二量体の典型的な有効量は、組成物の総重量に基づいて、０．００１重量％～２０．０重量％の範囲内で決定される。「有効量」は、抗アレルギー効果を誘導できる量を意味する。そのような有効量は、当業者が決定することができる。

【0043】

医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含有してもよい。具体的には、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含有し、当技術分野で公知の従来の方法によって投与経路に応じて経口又は非経口製剤に作られ得る。

【0044】

本発明の医薬組成物が経口製剤に作られる場合では、医薬組成物は、当技術分野で公知の従来の方法によって、製剤、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁剤、及びウエハー剤に、適切な担体と一緒に、作られ得る。適切な薬学的に許容される担体の例には、ラクトース、グルコース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、及びキシリトールなどの糖、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、及び小麦デンプンなどのデンプン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、麦芽、ゼラチン、タルク、ポリオール、植物油などが含まれ得る。調製物に作られる場合では、調製は、必要に応じて、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、及び界面活性剤などの、希釈剤及び／又は賦形剤を含ませることにより実行することができる。

【0045】

本発明の医薬組成物が非経口製剤に作られる場合では、医薬組成物は、当技術分野で公知の従来の方法によって、注射剤、経皮剤、経鼻吸入剤、及び坐剤の形態の調製物に、適切な担体と一緒に、作られ得る。注射剤に調製される場合では、滅菌水、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロール及びプロピレングリコール、又はその混合物は、適切な担体として使用してもよい。担体に関して、等張液、例えば、リンゲル溶液、トリエタノールアミン含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、注射用滅菌水、及び５％デキストロースなどが、使用しうることが好ましい。

【0046】

医薬組成物の調製は、当技術分野で公知であり、具体的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）などを参照することができる。

【0047】

本発明の医薬組成物の好ましい１日投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢、疾患の重症度、又は投与経路に応じて、０．０１μｇ／ｋｇ～１０ｇ／ｋｇの範囲であり、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇの範囲であることが好ましい。医薬組成物は、１日１回又は投与量が高い場合には１日数回投与されてもよい。

【0048】

本発明の組成物を適用（処方）することができる対象は、哺乳動物であり、例えば、ヒト、イヌ及びネコであってもよく、ヒトが特に好ましいが、それに限定されない。医薬組成物は、抗アレルギー活性を高め且つ強化する目的で、安全性が既に確認されており、抗アレルギー活性を有することが知られている、任意の化合物又は天然抽出物をさらに含んでもよい。

【0049】

本発明者らは、アレルギー性疾患に対して安全且つ有効な治療剤を開発するために研究を行った。結果として、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体と比較して、ＩｇＥとの優れた結合親和性を有することが確認された（表３）。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が、アレルギー性疾患を患う対象に対して皮下に投与される場合、血液中のＩｇＥ及びＭＣＰＴ－１の濃度が、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体と比較して、効果的に減少し、効果が規定時間を経過した後でさえ存続することが確認された（図１３及び１４）。

【0050】

したがって、本発明の別の態様では、医薬組成物を含む、経皮パッチが提供される。加えて、本発明の別の態様では、医薬組成物を含む、局所パッチが提供される。

【0051】

本発明の別の態様では、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を含む、アレルギー性症状を改善又は軽減するための食品組成物が提供される。

【0052】

高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、上記と同じである。加えて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、腸への効率的な送達のための適切な送達手段に結合してもよい。

【0053】

加えて、食品組成物は、任意の形態で調製されてもよく、例えば、飲料、例えば、茶、ジュース、炭酸飲料、及びイオン飲料、加工乳製品、例えば、ミルク及びヨーグルト、健康機能性食品調製物、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、液剤、散剤、フレーク、ペースト、シロップ剤、ゲル剤、ゼリー剤、及びバー（ｂａｒ）などの形態で調製されてもよい。

【0054】

食品組成物は、製造及び流通された時点で施行規則に準拠する限り、法的又は機能的分類における任意の製品カテゴリーの範囲に入りうる。例えば、食品組成物は、健康機能性食品法による健康機能性食品であってもよい、又は食品衛生法（食品医薬品局から通知される食品の規格及び仕様）の食品コードにおける各食品のタイプに従って、菓子、豆、茶、飲料、特定用途食品などの範囲に入りうる。本発明の食品組成物に含有されうる他の食品添加物に関しては、食品衛生法による食品コード又は食品添加物コードを参照することができる。

【0055】

本発明の別の態様では、対象に、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体を投与するステップを含む、アレルギー性疾患を治療又は予防するための方法が提供される。高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体は、上記と同じである。

【0056】

対象は、哺乳動物であってもよく、ヒト、イヌ及びネコであることが好ましい。投与は、経口的又は非経口的に達成されてもよい。非経口投与は、皮下投与、静脈内投与、粘膜投与、及び筋肉投与などの方法により行ってもよい。

【0057】

アレルギー性疾患は、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性皮膚炎、慢性特発性蕁麻疹、及びアレルギー性接触皮膚炎からなる群から選択されるものであってもよい。

【0058】

本発明の別の態様では、アレルギー性疾患を予防又は治療するための、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体の使用が提供される。

【0059】

以下、本発明を以下の実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明を例示することのみを意図しており、本発明の範囲はそれらのみに限定されない。

【0060】

実施例１ ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ及びＦｃ領域を含有するポリペプチドの調製
ＩｇＥ Ｆｃ受容体のアルファサブユニットの細胞外ドメイン（ＦｃεＲＩα－ＥＣＤ）のＣ末端改変ポリペプチドを、米国特許第７，８６７，４９１号に開示された方法に従って調製した。

【0061】

第一に、タンパク質（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ１）、タンパク質（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２）、及びタンパク質（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３）を発現するために（配列番号１のアミノ酸配列を有するＦｃεＲＩのα鎖の細胞外ドメイン及び配列番号２の改変された免疫グロブリンＦｃが、それぞれ、配列番号１９のヒンジ、配列番号３のヒンジ、及び配列番号４のヒンジを介して連結される）、各タンパク質をコードする遺伝子を連結することによって得られるカセットをｐＡＤ１５ベクター（Ｇｅｎｅｘｉｎ，Ｉｎｃ．）にクローン化して、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃタンパク質発現ベクターを構築した。次に、各々の発現ベクターを、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞（米国のコロンビア大学のＣｈａｓｉｎ博士から）に形質導入した。

【0062】

細胞株に形質導入される時点で、α－２，６－シアル酸トランスフェラーゼ遺伝子をｐＣＩ Ｈｙｇｒｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化することによって得られた発現ベクターを、同時に形質導入して、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ及びＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３ＳＴタンパク質を発現する能力がある細胞株を別々に調製し、これにシアル酸を加える。

【0063】

一次スクリーニング手順として、ＨＴ選択を、５－ヒドロキシトリプタミン（ＨＴ）－フリー１０％ｄＦＢＳ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、３００６７－３３４）、ＭＥＭα培地（Ｇｉｂｃｏ、１２５６１、ＵＳＡ、カタログ番号１２５６１－０４９）、及びＨＴ＋培地（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ、１１０６７－０３０）を用いて実行した。次に、メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅をＨＴ選択クローンを用いて行って、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）システムを用いて生産性を増幅した。

【0064】

ＭＴＸ増幅の完了後、生産性の評価を目的として、細胞安定化のために約１～５回継代培養を実行した。その後、ＭＴＸ増幅細胞の単位生産性評価を行った。結果を以下の表１に示す。

【0065】

【表1】

【0066】

表１に示されるように、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３細胞株は、２ｕＭでのメトトレキセート増幅後に１６．９μｇ／１０^６細胞の生産性を示した。他方、２，６－シアル酸トランスフェラーゼで同時形質導入したＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３細胞株（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３ＳＴ）は、１ｕＭでのメトトレキセート増幅後に１０．２μｇ／１０^６細胞の生産性を示した。加えて、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２細胞株は、０．５ｕＭでのメトトレキセート増幅条件下で２０．９μｇ／１０^６細胞の生産性を示した。加えて、２，６－シアル酸トランスフェラーゼで同時形質導入したＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２細胞株（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）は、０．１ｕＭでのメトトレキセート増幅後に２５．１μｇ／１０^６細胞の生産性を示した。すなわち、２，６－シアル酸トランスフェラーゼで同時形質導入したＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２細胞株（０．１ｕＭでのメトトレキセート増幅条件下で選択された）は、最も優れた生産性を示すことが特定された。

【0067】

ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２細胞株から産生されたポリペプチド（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ）は、「ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２」と称され、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株から産生されたポリペプチドは、「ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ」と称される。加えて、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３細胞株から産生されたポリペプチドは、「ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３」と称され、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３＋ａ２，６－ＳＴ細胞株から産生されたポリペプチドは、「ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３ＳＴ」と称される。

【0068】

実施例２ ポリペプチド（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ）の精製及び純度の確認
上記実施例１で選択された細胞株のうち、ｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３細胞株、ｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３＋ａ２，６－ＳＴ細胞株、及びｉｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株を、回分培養法によって、６０ｍｌスケールで培養した。生じた培養物を、プロテインＡアフィニティーカラムを用いて精製してＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃを得て、次に精製されたＦｃεＲＩα ＥＣＤ－ＦｃをＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥに付してポリペプチドの純度を特定した。

【0069】

具体的には、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、非還元条件下で行った。非還元条件下、各精製されたポリペプチドを、非還元サンプル緩衝液と混合し、次に電気泳動を、３０分間、ミニプロティアンＴＧＸ（商標）ゲル（Ｍｉｎｉ－Ｐｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ^ＴＭ ｇｅｌ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＴＧＳ（ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ）緩衝液中、２００Ｖ条件下で行った。電気泳動後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。結果を以下の表２及び図１に示す：

【0070】

【表2】

【0071】

上記表２に示すように、ＳＥ－ＨＰＬＣ法によって精製された各ポリペプチドの純度が９３％又はそれ以上であることが確認された。不純物、例えば、トランケート型が非還元条件において出現しないこと及び特に解凍／凍結プロセスの後でさえ純度が９３％又はそれ以上であり、不純物がないことが確認された。

【0072】

実験例１ ポリペプチド（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ）の二量体形成の確認
上記実施例１で選択された細胞株のうち、ｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３細胞株、ｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３＋ａ２，６－ＳＴ細胞株、及びｉｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株を、回分培養法によって６０ｍｌスケールで培養した。その後、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥを、培養上清及びプロテインＡアフィニティーカラムを用いてポリペプチドの精製から得た精製された産物で行った。この場合、それらを、培養上清並びにそれぞれ非還元条件及び還元条件下で精製された産物で行った。

【0073】

非還元条件を実施例２と同じ様式で行った。他方、還元条件下、各精製されたポリペプチドを、２－メルカプトエタノールを含む還元サンプル緩衝液と混合し、次に１００℃の温度で５分間変性した。その後、電気泳動を、ミニプロティアンＴＧＸ（商標）ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）においてＴＧＳ緩衝液を用いて２００Ｖ条件下で３０分間行った。電気泳動後、タンパク質を、クーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。

【0074】

結果として、約１５０ｋＤａのサイズを有するポリペプチドを非還元条件下で検出し、約７５ｋＤａのサイズを有するポリペプチドを還元条件下で検出した。これにより、ポリペプチドが二量体を形成することが確認された（図２）。特に、ポリペプチド二量体の純度が、投入物に対応する培養上清においてさえ高く、ポリペプチドは、培養上清をアフィニティーカラムを通して通過させることによって得られたサンプル（ＦＴ；フロースルー）中に検出されないが、ポリペプチドは溶出したサンプル中に検出されることが確認された。加えて、溶出したサンプルの低ｐＨのため１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．０）ですぐ中和されたサンプル（溶出＿Ｎ）が、中和されなかったサンプル（溶出）と比較された場合でさえ有意差は観察されなかった（図２）。

【0075】

加えて、ポリペプチドは非常に高純度（９８％又はそれ以上）で精製されるだけでなく、ポリペプチドは培養上清においてさえ非常に高純度で発現されることも特定された。これにより、プロセス開発ステップは、問題の細胞株において発現されたポリペプチドを、医療製品に開発することを単純化することができ、結果として医療製品の開発コストを著しく減少させる可能性が非常に高いことが示される。

【0076】

実験例２ ＩｇＥに対するポリペプチド二量体の結合親和性の確認
ＩｇＥに対する結合親和性を、実施例１で産生されたポリペプチド、ｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２、ｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ、ｉｉｉ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３、及びｉｖ）ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ３ＳＴを上記実施例２の方法により精製することによって得られる精製された産物、並びに市販の抗ＩｇＥ抗体、オマリズマブ（商品名：ゾレア）に関して比較して測定した。

【0077】

具体的には、ＩｇＥに対する結合親和性を、ＩｇＥをタンパク質ＧＬＣセンサーチップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１７６－５０１１）のチャネルにコーティングし、オマリズマブ又は各ＦｃεＲ１αＥＣＤ－Ｆｃタンパク質を様々な濃度で、１分間当たり３０μＬの速度で流すことによって測定した。実験は、再生緩衝液として２５ｍＭ ＮａＯＨを用いてゼロベースを特定し、次に、上記のステップを繰り返すことによって行われた。その後、タンパク質結合アナライザー（ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を用いて結合曲線を特定した。結果を表３に示す。

【0078】

【表3】

【0079】

表３に示すように、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体とＩｇＥの会合速度（ｋａ）値は、オマリズマブの値よりも１．５～２．０倍低いと測定された。すなわち、ＩｇＥ以外の物質へのその結合親和性は、オマリズマブの結合親和性よりも１．５～２．０倍低いことが見出された。加えて、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体の解離速度（ｋｄ）値は、オマリズマブの値よりも４０～１０６倍高いと測定された。結果として、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体は、オマリズマブよりも２２～６９倍高い平衡解離定数（ＫＤ＜ｋｄ／ｋａ＞）値を有することが確認された。これから、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体は、オマリズマブと比較して、ＩｇＥに対する著しく増加した結合親和性を有することが特定された。特に、シアル酸が加えられたポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）は、オマリズマブよりも６９倍高い最高ＩｇＥ結合親和性を示すことが特定された。

【0080】

加えて、図３及び４に示すように、結合の後ある特定の期間の時間が経過した場合、オマリズマブはＩｇＥに対するその結合を失い、一方、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ、ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）は、一度ＩｇＥに結合すれば、ＩｇＥから分離しないことが確認された。すなわち、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体は、ＩｇＥから容易に分離せず、オマリズマブよりも結合状態を維持する、より優れた能力を有することが確認された。

【0081】

実験例３ ＩｇＧ受容体に対するポリペプチド二量体の結合親和性の確認
ＩｇＧのＦｃガンマ受容体に対する、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ、ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）又はオマリズマブ（ゾレア）の結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて確認した。

【0082】

具体的には、Ｆｃガンマ受容体である、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢ組換えタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、５μｇ／ｍｌ）を、３００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）中で活性化したＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定化した。ランニング緩衝液として、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び１％ウシ血清を含有するＰＢＳを使用した。全ての測定を、３０℃にてサンプルプレートシェーカーを用いて１，０００ｒｐｍの速度で実行した。結果を図５ａ～５ｅに示し、ＩｇＧ Ｆｃガンマ受容体に対するオマリズマブ及びポリペプチド二量体の結合親和性を定量化し、図６に示す。

【0083】

結果として、オマリズマブはＩｇＧのＦｃガンマ受容体に対する高い結合親和性を示し、一方、ポリペプチド二量体は、ＩｇＧのＦｃガンマ受容体に対する有意に低い結合親和性を有することが確認された。これにより、ポリペプチド二量体が、ＩｇＧのＦｃガンマ受容体と結合しないことが確認された。

【0084】

実験例４ マウス骨髄由来肥満細胞におけるベータ－ヘキソサミニダーゼアッセイによるポリペプチド二量体の活性の確認
ベータ－ヘキソサミニダーゼアッセイを、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体のインビトロ活性分析に関して行った。

【0085】

具体的には、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２）を、各濃度でＩｇＥ（１μｇ／ｍＬ）と混合し、２０℃にて３０分間インキュベートして、サンプルを調製した。肥満細胞活性化のための培養中のマウス骨髄由来肥満細胞を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）緩衝液で洗浄して、培地を除去し、細胞の数を測定し、次に５×１０^５細胞を４０μＬのＨＢＳＳ緩衝液に再浮遊させた。

【0086】

このように調製した５０μＬのサンプルを、活性化した肥満細胞に加えた。次に、結果物（ｒｅｓｕｌｔａｎｔ）を５％ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、外来抗原である、各１０μＬのＤＮＰ（２，４－ジニトロフェノール、１００ｎｇ／ｍＬ）の付加後、インキュベーションを再度３７℃にて３０分間、５％ＣＯ_２中で行い、次に３０μＬの上清を分離した。

【0087】

３０μＬの分離した上清と３０μＬの基質（４－ニトロフェニルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド、５．８４ｍＭ）とを十分に混合し、次に、３７℃にて２０分間、５％ＣＯ_２中でインキュベートした。次に、停止溶液として１４０μＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を加えて反応を終了させた。その後、４０５ｎｍで吸光度を測定して、活性化した肥満細胞において外来抗原によって分泌されたβ－ヘキソサミニダーゼの分泌量を特定した。結果を図７に示す。

【0088】

図７に示すように、ＩｇＥの活性は、ＩｇＥと本発明のポリペプチド二量体の濃度が１：１である場合から、かなり阻害されることが確認された。すなわち、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体は、その濃度がＩｇＥの濃度と同じ場合でさえ、反応することが確認された。

【0089】

実験例５ ヒトＦｃεＲＩ発現マウス骨髄由来肥満細胞におけるβ－ヘキソサミニダーゼアッセイを用いたポリペプチド二量体とヒト抗ＩｇＥ抗体の活性の比較
本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ、ＩｇＥ_ＴＲＡＰ）及びヒト抗ＩｇＥ抗体であるゾレア（オマリズマブ）の活性を比較するために、ベータ－ヘキソサミニダーゼ分析を行った。

【0090】

それぞれポリペプチド二量体及びゾレアを、各濃度に調製し、次にヒトＩｇＥ（１μｇ／ｍＬ）と混合した。次に、インキュベーションを室温で３０分間行って、サンプルを調製した。加えて、ヒトＦｃεＲＩ遺伝子が導入され、マウスＦｃεＲＩ遺伝子が除去されたマウス骨髄に由来し、分化させた肥満細胞を調製した。調製した肥満細胞をＨＢＳＳ緩衝液で洗浄し、次に、５×１０^５個の細胞を６０μＬのＨＢＳＳ緩衝液に再浮遊させた。

【0091】

次に、このように調製した２０μＬのサンプルを、肥満細胞に加え、次に、５％ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて３０分間インキュベートした。続いて、２０μＬのヒト抗ＩｇＥ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２５５０２、０．５μｇ／ｍＬ）を加えた後に、結果物を５％ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて３０分間再度インキュベートした。次に、４℃にて１，５００ｒｐｍで遠心分離した後、３０μＬの上清を分離した。３０μＬの分離した上清と３０μＬの基質（４－ニトロフェニルＮ－アセチル－β－グルコサミニド、５．８４ｍＭ）とを十分に混合し、次に、５％ＣＯ_２インキュベーターで３７℃にて２５分間インキュベートした。次に、１４０μＬの０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を加えて反応を終了させた。その後、４０５ｎｍで吸光度を測定して、分泌されたβ－ヘキソサミニダーゼの相対量を比較して、肥満細胞に対する阻害効果を、サンプルの各濃度に応じて特定した。結果を図８に示す。

【0092】

図８に示すように、ポリペプチド二量体のＩＣ_５０をおよそ１１．１６ｎｇ／ｍＬと測定し、ゾレアのＩＣ_５０をおよそ６４９．８ｎｇ／ｍＬと測定した。したがって、ポリペプチド二量体が、ゾレアよりも、肥満細胞活性に対する５８倍高い阻害能を有することが特定された。

【0093】

実験例６ 食物アレルギーモデルにおけるインビボアッセイによるポリペプチド二量体の活性の確認
５０μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）及び１ｍｇのアラムをＢａｌｂ／ｃマウス（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ Ｉｎｃ．）に１４日間隔で２回腹腔内に投与して、感作を誘導した。その後、２８、３０、３２、３４、及び３６日目に５０ｍｇのＯＶＡを合計５回経口投与して、腸内で食物アレルギーを誘導した。

【0094】

ＯＶＡを２回経口投与した後、すなわち、３１日目に、マウスを、各々７匹のマウスを含む３つのグループに分けた。３つに分けたグループは下記の通りであった：ポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）の高濃度（２００μｇ）を受けたグループ１、ポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）の低濃度（２０μｇ）を受けたグループ２、及び何も受けていないグループ３。

【0095】

ＯＶＡを経口投与している間、下痢が食物アレルギー性の誘導に起因して起こるのかどうかを観察した。加えて、３７日目にマウスを安楽殺し、各グループに属するマウスについて、小腸の肥満細胞の数、血液中のＩｇＥ濃度、及び血液中の肥満細胞脱顆粒酵素（肥満細胞プロテアーゼ１（ＭＣＰＴ－１））の濃度を分析した。

【0096】

結果として、図９に示すように、下痢は、ＯＶＡの第２の経口投与後、グループ３のマウスに発生した。他方、下痢は、ＯＶＡの第３の経口投与後、グループ１及びグループ２のマウスに発生した。特に、グループ１のマウスの下痢の頻度は、グループ２のマウスのものより低かった。これにより、食物アレルギーに対する効果が、ポリペプチド二量体の濃度に比例して増加することが確認された。

【0097】

実験例７ ポリペプチド二量体のシアル酸の含量の分析
上記実施例１で調製したＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株から産生されたポリペプチドの産生速度が最高であり、実験例４～６のポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）の抗アレルギー効果が優れているとの態様に基づいて、ポリペプチド二量体のシアル酸含量を分析して、シアル酸含量に応じた、ポリペプチド二量体の抗アレルギー有効性を調査した。

【0098】

具体的には、上記実施例１で調製したＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株から産生されたポリペプチド二量体（ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２ＳＴ）のグリカン構造に含有されるシアル酸含量を測定するために、シアル酸を最初にシアル酸の異化と関連している酵素であるシアリダーゼで処置することによって分離した。その後、分離したシアル酸を、ＨＰＬＣ（ｗａｔｅｒｓ、ａｌｌｉａｎｃｅ ｅ２６５９）を用いて単離し、検出し、定量化した。

【0099】

ポリペプチド二量体を、ｐＨ勾配に応じて３つのサンプルに分け、単離し、精製した。３つのサンプルを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ５０１０９６）フィルターに配置し、１０分間、１３，０００ｒｐｍ、４℃温度の条件下での遠心分離し、５回繰り返し、濃縮物を脱イオン水で交換し、濃縮した。サンプルの濃度を、２８０ｎｍの波長で測定したときに１０ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上にセットした。

【0100】

その後、０．５ｍｇの各サンプルを採り、ＥＰチューブに配置し、１μＬのシアリダーゼ（Ｒｏｃｈｅ、１０ ２６９ ６１１ ００１）及び４０μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１０ｍＭの濃度で加え、次に脱イオン水を加え、最終的な容量を１００μＬとした。２μＬの各サンプルを採り、２８０ｎｍの波長での濃度を測定し、確認した濃度値を最終的な分析濃度として使用した。

【0101】

サンプルを１８時間、３７℃インキュベーターで反応させ、次にＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ １０Ｋフィルターに配置し、１３，０００ｒｐｍ、４℃の条件下で１５分間遠心分離し、フィルターを通して通過させた濾過物を分析のために使用した。ＨＰＬＣ分析条件を以下の表４に示す。

【0102】

【表4】

【0103】

シアル酸の含量を計算するための標準物質は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（以下、ＮＡＮＡと称する）及びＮ－グリコリルノイラミン酸（以下、ＮＧＮＡと称する）の混合物である。標準曲線に関する線形回帰方程式を得て、分析物中のＮＧＮＡ及びＮＡＮＡのモル濃度を計算した。使用した混合物を以下の表５に示す。

【0104】

【表5】

【0105】

サンプル中のＮＡＮＡシアル酸含量を、ＮＡＮＡ含量を用いて計算した。サンプル中のシアル酸含量を、シアル酸／サンプルのモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）として表した。

【0106】

［等式１］
サンプルのシアル酸含量＝（サンプル中のＮＡＮＡのモル濃度）／（サンプルのモル濃度）

【0107】

加えて、サンプル中のＮＧＮＡの含量を、ＮＧＮＡ含量を用いて計算した。サンプル中のＮＧＮＡの含量を、ＮＧＮＡ／分析物のモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）として表した。

【0108】

［等式２］
サンプルのＮＧＮＡ含量＝（分析物中のＮＧＮＡモル濃度）／（分析物のモル濃度）

【0109】

結果を以下の表６に示す。

【0110】

【表6】

【0111】

表６に示すように、ｐＨ勾配に応じて３つのサンプルに分け、分離し、精製し、サンプル中のシアル酸含量を別々に測定した。シアル酸含量に応じた抗アレルギー有効性を比較するために、ポリペプチド二量体は、シアル酸含量の順に「ＳＡ^ｌｏｗ」、「ＳＡ^ｍｅｄｉ」及び「ＳＡ^ｈｉｇｈ」と称される。

【0112】

実験例８ シアル酸含量に応じたポリペプチドの二量体形成における変化の確認
シアル酸含量に応じたポリペプチドの二量体形成に変化があるかどうかを確認するために、実施例９で分離したＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈを実験例１と同じ様式の非還元条件及び還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に付した。

【0113】

結果として、ＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈの全てで、約１５０ｋＤａのサイズを有するポリペプチドを非還元条件下で検出し、約７５ｋＤａのサイズを有するポリペプチドを還元条件下で検出した。これにより、ポリペプチドが二量体を形成することが確認された（図１０）。

【0114】

実験例９ シアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の等電点の確認
ポリペプチド二量体の等電点がシアル酸含量に応じて変化するかどうかを確認するために、実験例７で分離したＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈをＩＥＦサンプル溶液と混合し、次にｐＨ３～７ ＩＥＦゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、電気泳動を１００Ｖ条件下で１時間、２００Ｖ条件下で１時間、及び５００Ｖ条件下で３０分間、で順次行った。電気泳動が完了した後、ゲルを、１２％トリクロロ酢酸及び３．５％スルホサリチル酸を含む固定液中で３０分間反応させ、次に蒸留水で洗浄した。タンパク質を、クーマシーブリリアントブルー溶液で染色した。

【0115】

結果として、ＳＡ^ｌｏｗ、ＳＡ^ｍｅｄｉ及びＳＡ^ｈｉｇｈの等電点はシアル酸含量に応じてわずかに異なり、それぞれ約５．３、４．９及び４．７であることが見出された（図１１）。

【0116】

実験例１０ 食物アレルギー動物モデルにおけるシアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の抗アレルギー活性の確認：下痢の頻度の測定
ポリペプチド二量体の活性が、シアル酸含量に応じて変化するかどうかを確認するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ）に対して５０μｇのＯＶＡ及び１ｍｇのアラムの腹腔内投与により２回、１４日間隔で感作を誘導した。その後、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０日を越えて５０ｍｇのＯＶＡを合計７回経口投与して、食物アレルギーを誘導した。この場合、ＯＶＡの経口投与を、４時間の絶食後に行った。

【0117】

ＯＶＡを２回経口投与し、次に４０日目に、マウスを、７匹のマウスの３つのグループに分けた。高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｈｉｇｈ）が皮下に高濃度（２００μｇ）で投与されるグループであるグループ１、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ）が皮下に高濃度（２００μｇ）で投与されるグループであるグループ２、及びＰＢＳが皮下に投与されるグループであるグループ３にマウスを分けた。ＯＶＡを経口投与した場合に下痢が食物アレルギーの誘導により発生するかどうかを確認した。

【0118】

結果として、下痢は、ＯＶＡの第４の経口投与後、グループ３のマウスに発生した。下痢は、ＯＶＡの第５の経口投与後、グループ２のマウスに発生した。特に、下痢の頻度は、ＯＶＡの第６の経口投与後、グループ２のマウスにおいて即座に増加した。他方、下痢は、ＯＶＡの第６の経口投与後、グループ１のマウスに発生したが、下痢の頻度は維持され、ＯＶＡの第７の経口投与後でさえ、グループ１のマウスにおいて増加しなかった（図１２）。これにより、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｈｉｇｈ）が、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ）と比較して、優れた抗アレルギー効果を有することが確認された。

【0119】

実験例１１ 食物アレルギー動物モデルにおけるシアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の抗アレルギー活性の確認：血液中のＩｇＥ濃度の測定
血液を、眼窩サンプリング法で実験例１０のＯＶＡの第７の経口投与が行われた各グループのマウスから採取した。３０分間、周囲温度で反応させた後、血清を、１３，０００ｒｐｍの条件下、温度４℃で１５分間の遠心分離によって分離した。血液中の遊離ＩｇＥ濃度を測定するために、マウス総ＩｇＥ ＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した、この場合、ＥＬＩＳＡを製造者のプロトコールに従って行った、但し、本発明の実施形態によるポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）を、抗ＩｇＥ抗体の代わりに９６ウェルプレートにコーティングする物質として使用した。

【0120】

具体的には、９６ウェルプレートを、ＰＢＳで希釈したポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ及びＳＡ^ｈｉｇｈ）でコーティングし、一晩、４℃の温度で反応させた。次の日、０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（以下、洗浄緩衝液）で洗浄後、ブロッキング緩衝液（アッセイ希釈剤）を加え、１時間反応させた。その後、洗浄緩衝液で洗浄し、次に規準液として使用されるマウスＩｇＥ及びマウスの血清サンプルを、１Ｘアッセイ希釈剤で希釈し、プレートに配置し、２時間反応させた。

【0121】

洗浄緩衝液で再度洗浄後、ビオチン標識マウス抗ＩｇＥ抗体を加え、１時間反応させた。洗浄緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識アビジン（アビジン－ＨＲＰ）を加え、３０分間反応させた。洗浄緩衝液で洗浄後、基質溶液を加え、２０分間反応させた、その間は光を遮断した、次に停止溶液（１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を加えて反応を停止した。その後、吸光度値を、４５０ｎｍの波長にてマイクロプレートリーダー（Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計）で測定し、濃度を計算した。

【0122】

結果として、ＰＢＳが皮下に投与されたグループ３のマウスに関して、血液中のＩｇＥ濃度は約８，０００ｎｇ／ｍＬであると計算された。加えて、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ）が皮下に投与されたグループ２のマウスに関して、血液中のＩｇＥ濃度は約７，０００ｎｇ／ｍＬであると計算された。他方、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｈｉｇｈ）が皮下に投与されたグループ１のマウスに関して、血液中のＩｇＥ濃度は約４，９００ｎｇ／ｍＬであると計算され、グループ２とグループ３のマウスの間の血液中のＩｇＥ濃度値に有意差があった（図１３）。

【0123】

これらの結果から、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が皮下に投与された場合、血液中のＩｇＥ含量が減少することが見出された。加えて、そのような血液中のＩｇＥの減少に基づいて、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体がアレルギーの治療に有効であることが予測された。

【0124】

実験例１２ 食物アレルギー動物モデルにおけるシアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の抗アレルギー活性の確認：血液中のＭＣＰＴ－１濃度の測定
血清を、食物アレルギー実験が完了した２日後、各グループのマウスから血液を採ることによって調製した。血液中のＭＣＰＴ－１（肥満細胞プロテアーゼ－１）濃度を測定するために、ＭＣＰＴ－１ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコールに従う手順を行った。

【0125】

具体的には、９６ウェル免疫化プレートを、マウス抗ＭＣＰＴ－１抗体でコーティングし、一晩、４℃の温度で反応させた。次の日、０．０５％ ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（以下、洗浄緩衝液）で洗浄後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳ（以下、ブロッキング緩衝液、アッセイ希釈剤）を加え、１時間反応させた。その後、洗浄緩衝液で洗浄し、次に規準液として使用されるＭＣＰＴ－１及びマウスの血清サンプルを、１Ｘアッセイ希釈剤で希釈し、プレートに配置し、２時間反応させた。

【0126】

２時間後、ビオチン標識マウス抗ＭＣＰＴ－１抗体を加え、１時間反応させた。洗浄緩衝液で洗浄後、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識アビジン（アビジン－ＨＲＰ）を加え、３０分間反応させた。洗浄緩衝液で洗浄後、基質溶液を加え、２０分間反応させた、その間は光を遮断した、次に停止溶液（１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４）を加えて反応を停止した。その後、５７０ｎｍ波長の波長で測定した吸光度値を、４５０ｎｍの波長で測定した吸光度値から除いた吸光度値を、マイクロプレートリーダー（Ｅｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計）で決定し、濃度を計算した。

【0127】

結果として、ＰＢＳが皮下に投与されたグループ３のマウスに関して、血液中のＭＣＰＴ－１濃度は約４，０００ｎｇ／ｍＬであると計算された。加えて、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｌｏｗ）が皮下に投与されたグループ２のマウスに関して、血液中のＭＣＰＴ－１濃度は約４，２００ｎｇ／ｍＬであると計算された。他方、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体（ＳＡ^ｈｉｇｈ）が皮下に投与されたグループ１のマウスに関して、血液中のＭＣＰＴ－１濃度は約２，８００ｎｇ／ｍＬであると計算され、グループ２とグループ３のマウスの間の血液中のＭＣＰＴ－１濃度値に有意差があった（図１４）。

【0128】

実施例３ 精製による高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体の調製
シアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の物理的特性を確認するために、広範囲のシアル酸を含有するポリペプチド二量体を得た。具体的には、ＦｃεＲＩαＥＣＤ－Ｆｃ２＋ａ２，６－ＳＴ細胞株から得たポリペプチド二量体を、アフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。

【0129】

最初に、細胞培養液を、アフィニティークロマトグラフィーに付して培養液から主な不純物を除去した。アフィニティークロマトグラフィーを、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ａ３樹脂を充填したＡｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ａ３プレパッキングカラム（ベッド高５ｃｍ、容量５ｍＬ）及びＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５装置の液体クロマトグラフィーシステムを用いて行った。アフィニティークロマトグラフィーを、１００ｍＭグリシンｐＨ３．３を溶出緩衝液として用いて行った。

【0130】

その後、陰イオン交換クロマトグラフィーを、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を充填したＨｉｓｃｒｅｅｎ ＱＦＦ（ベッド高１０ｃｍ、容量５ｍＬ）及びＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５装置の液体クロマトグラフィーシステムを用いて行った。２０ｍＭホスホ－シトレートｐＨ３．５を、溶出緩衝液として使用した。この場合、洗浄緩衝液として２０ｍＭの濃度のホスホ－シトレートｐＨ４．０を調節して様々なシアル酸含量を有する二量体を得た。シアル酸含量の分析を、実験例７で使用された分析方法により行った。これにより、７．０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１０．３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１２．９ｍｏｌ／ｍｏｌ、１４．９ｍｏｌ／ｍｏｌ及び２１．４ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を得た。

【0131】

実験例１３ マウスモデルでのシアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の薬物動態分析
ポリペプチド二量体のシアル酸含量に応じた薬物動態分析を行うために、実施例３で調製した７．０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１０．３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１２．９ｍｏｌ／ｍｏｌ、１４．９ｍｏｌ／ｍｏｌ及び２１．４ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスに皮下注射した。ポリペプチド二量体の薬物動態を分析するために、物質の投与後０時間、３時間、１０時間、２４時間、７２時間、１６８時間、及び２４０時間に血液を採取し、以下の様式で分析した。

【0132】

抗ＦｃεＲＩ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１Ｘ ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、イムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に加え、４℃条件下で一晩反応させた。反応が完了した後、イムノプレートを、１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、ブロッキング溶液であるＩ－Ｂｌｏｃｋ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル毎に加え、周囲温度で１時間反応させた。ブロッキング中に、標準及び分析サンプルを調製した。ポリペプチド二量体を、マウスブランク血清を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、０．１９ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈して標準物質を調製し、ブランク血清を含有する１％ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１／２０～１／３００の希釈も行って、分析サンプルを調製した。

【0133】

ブロッキングが完了した後、プレートを、１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、調製した標準及び分析サンプルをウェル毎に加え、次に周囲温度で１時間反応させた。その後、プレートを１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、１：１０，０００に希釈した抗ヒトＩｇＧ４－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、次に周囲温度で１時間反応させた。反応が完了した後、プレートを、１Ｘ ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ）をウェルに加え、反応させた。吸光度値がマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて６５０ｎｍの波長で０．８～１．０の範囲に測定されたとき、停止溶液（Ｓｉｇｍａ）をウェル毎に加えて反応を停止した。反応が終結した後、４５０ｎｍの波長にて５分間内にプレートで吸光度を測定し、数値を分析した。シアル酸含量に応じたポリペプチド二量体の得られた薬物動態グラフ及び薬物動態パラメータを図１５及び表７に示す。

【0134】

結果として、表７に示すように、マウスに投与されたポリペプチド二量体のシアル酸含量が高いほど、血液中の濃度が高いことが確認された。

【0135】

【表7】

【0136】

実験例１４ 受動全身アナフィラキシーマウスモデルでのポリペプチド二量体のシアル酸含量に応じた有効性の確認
ポリペプチド二量体のシアル酸含量に応じたインビボでの抗アレルギー効果における差を確認するために、文献に開示された方法を適用して、以下のような様式でマウスに受動全身アナフィラキシー（ＰＳＡ）を誘導した（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１０３２、ＤＯＩ １０．１００７／９７８－１－６２７０３－４９６－８＿１０）。肥満細胞がアナフィラキシーの誘導によって活性化され、体温が肥満細胞を増加させることによって減少することが知られている。これを用いてマウスにＰＳＡを誘導している間に、それぞれのシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を投与し、次に体温を測定して抗アレルギー効果を比較した。

【0137】

トランスポンダーを挿入したＢａｌｂ／ｃマウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ）の体温を測定し、次に２０μｇの抗ＤＮＰ ＩｇＥ（Ｓｉｇｍａ）含有０．９％ＮａＣｌを腹腔内に投与し、次にそれぞれ異なるシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を１０ｍｇ／ｋｇにて皮下に投与した。 ２４時間後、マウスの体温を、ＤＮＰ－ＨＡＳ（Ｓｉｇｍａ）含有０．９％ＮａＣｌ、外来抗原を投与する前に測定した。その後、１ｍｇの抗原を、静脈内に投与した。投与後、マウスの体温を、リモート体温計（Ｂｉｏ 中間ｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１０分間隔で１時間測定した。実験結果を図１６に示す。

【0138】

結果として、マウスの体温はビヒクル及び１０．３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を投与したグループで減少し、マウスの体温は１４．９ｍｏｌ／ｍｏｌ又はそれ以上のシアル酸含量を有するポリペプチド二量体を投与したグループで減少しないことが確認された。これにより、高含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体が、低含量のシアル酸を有するポリペプチド二量体と比較して、受動全身アナフィラキシーの誘導を減少させる優れた効果を有することが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】