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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-13
(54)【発明の名称】細菌発生の疫学的識別および監視のための方法
(51)【国際特許分類】
G16H 50/80 20180101AFI20220906BHJP
C12Q 1/689 20180101ALN20220906BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20220906BHJP
【ＦＩ】
G16H50/80
C12Q1/689 Z
C12Q1/6851 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500704
(86)(22)【出願日】2020-07-02
(85)【翻訳文提出日】2022-03-01
(86)【国際出願番号】 EP2020068611
(87)【国際公開番号】W WO2021008878
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】19186032.9
(32)【優先日】2019-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】304043936
【氏名又は名称】ビオメリュー
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】カネコ， ギャエル
(72)【発明者】
【氏名】ギゴン， ジスレーヌ
【テーマコード（参考）】
4B063
5L099
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
5L099AA03
(57)【要約】
本発明は、細菌発生を検出し監視するための方法に関し、収集された菌株およびデータベースからの菌株は、それらのゲノム距離が第１の所定の閾値を下回る場合、細菌発生に属し、それらのゲノム距離が第１の閾値を厳密に上回る第２の所定の閾値を上回る場合、細菌発生に属さず、またはそれらの遺伝子距離が中間にある場合、細菌発生に属する可能性がある、と予測することを含む。第１の閾値は、第３の閾値以上であり、したがって、第３の閾値を下回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属するという予測は、最大の特異性を有する。第２の閾値は、第４の閾値以下であり、したがって、第４の閾値を上回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属さないという予測は、最大の感度を有する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
地理的区域内の細菌種と関連する、細菌発生を検出し監視するための方法であって、前記地理的区域内でサンプリングされ、前記細菌種に属する菌株のデジタルゲノムを取得することと、
前記細菌種に属する菌株の少なくとも１つのデジタルゲノムを含む「疫学的」と呼ばれるデータベースのデジタルゲノムから取得された前記デジタルゲノムのゲノム距離を計算することと、
以下、すなわち、
サンプリングされた前記菌株および前記データベースの前記菌株は、それらのゲノム距離が第１の所定の閾値を下回る場合、前記細菌発生に属すること、
サンプリングされた前記菌株および前記データベースの前記菌株は、それらのゲノム距離が第１の閾値よりも厳密に高い第２の所定の閾値を上回る場合、前記細菌発生に属さないこと、または
サンプリングされた前記菌株および前記データベースの前記菌株は、それらのゲノム距離が前記第１の閾値と前記第２の閾値との間にある場合、前記細菌発生におそらく属すること、
を予測することと、
を含み、前記方法によれば、
前記第１の閾値が第３の閾値以上であり、したがって、前記第３の閾値を下回るゲノム距離を有する２つの菌株が前記細菌発生に属するという予測が、最大の特異性を有し、
前記第２の閾値が第４の閾値以下であり、したがって、前記第４の閾値を上回るゲノム距離を有する２つの菌株が前記細菌発生に属さないという予測が、最大の感度を有する、方法。
【請求項2】
前記第１および前記第２の閾値が、前記細菌種に属する菌株のデジタルゲノムの学習データベースを構成することであって、前記ベースが、
全く同一の細菌発生に属すると事前に決定され、「関連株対」としてタグ付けされた菌株対と、
全く同一の細菌発生に属さないと事前に決定され、「非関連株対」としてタグ付けされた菌株対とを含む、学習データベースを構成することと、
２つの菌株が、それらのゲノム距離を第５の閾値に対して比較することにより、関連付けられるまたは関連付けられないと予測するために構成されたバイナリ予測因子を選択することと、
第５の閾値の値の所定の集合に属する第５の閾値の値ごとに、
学習データベースの関数としての前記予測因子の混同行列と、
前記混同行列の関数としての前記予測因子の第１の品質指標であって、前記予測因子の感度および特異性と異なる、第１の品質指標と、
前記混同行列の関数としての、前記第１の指標とは異なる第２の品質指標であって、前記予測因子の前記感度および特異性の前記第１の指標と異なる、第２の品質指標とを計算することと、
前記第１の指標を最適化する第５の閾値の第１の値、および前記第２の指標を最適化する第５の閾値の第２の値を見つけることと、
前記第１の閾値を、第５の閾値の前記第１および第２の値の最小値に等しく設定し、前記第２の閾値を、第５の閾値の前記第１および第２の値の最大値に等しく設定することと、
によって計算された２つのゲノム距離に等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１の指標が、前記学習データベースにおける、関連株対の数と関連株対の数との間の不均衡を考慮して選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１の指標が、マシューズ相関係数またはＦ１スコアである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記第２の指標が、ユーデン指標である、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記予測因子は、真陽性が、前記第５の閾値を下回るゲノム距離を有する前記関連株対に対応し、
偽陰性が、前記第５の閾値を上回るゲノム距離を有する前記関連株対に対応し、
偽陽性が、前記第５の閾値を下回るゲノム距離を有する前記非関連株対に対応し、
真陰性が、前記第５の閾値を上回るゲノム距離を有する前記非関連株対に対応する、
ように選択される、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記疫学的データベースが、前記学習データベースを含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ゲノム距離が、正規化された距離である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
２つの菌株間の前記ゲノム距離が、主に、前記株の前記デジタルゲノムに共通である遺伝子座の集合において選択することと、
前記共通の遺伝子座における、前記株の２つの前記デジタルゲノム間の、対立遺伝子の差異の数を数えることと、
前記差異の数を共通の前記遺伝子座の数で割ることと、
によって計算される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
第５の閾値の前記第１および第２の値が、０．１を上回る場合、前記第２の閾値が、０．１に等しく設定され、
前記第１の閾値が、ｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）に等しく設定され、ここで、ｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）が、関連株対の中で最大ゲノム距離であり、厳密に０．２を下回る、請求項９、および請求項４または５に記載の方法。
【請求項11】
前記デジタルゲノム間の距離が、マーカのデータベース、具体的には、遺伝子のまたはＳＮＰのデータベースｗｇＭＬＳＴ、ｃｇＭＬＳＴ、ＭＬＳＴの関数として計算される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
サンプリングされた株が前記細菌発生に属すると予測された場合、前記疫学的データベースにおいて、前記細菌発生の前記菌株に対して「関連」している、および他の菌株に対して「非関連」である、としてタグ付けされる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
サンプリングされた株がおそらく前記細菌発生に属すると予測された場合、前記サンプリングされた株が実際に前記発生に属するかを決定するために、前記株の追加の特性決定が実行され、属する場合、前記サンプリングされた菌株が、前記疫学的データベースにおいて、前記細菌発生の前記菌株に対して「関連」している、および他の菌株に対して「非関連」である、としてタグ付けされる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１および前記第２の閾値が、定期的におよび／またはＮ個の新たな株が前記疫学的データベースに追加された直後に再計算され、ここで、Ｎが１以上の整数である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
株が前記細菌発生に属すると予測される場合、前記発生を阻止するために予防策が講じられる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌疫学分野に関し、詳細には、菌株のゲノム、具体的には菌株のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの部分的または全体配列決定に応じた、細菌発生の検出および監視に関する。
【背景技術】
【0002】
感染性の細菌発生の検出は従来、対象（たとえば、患者および拡張動物による）から採取されたいくつかの菌株が、対象間の同一株の最近の伝播、たとえば「ソース」対象からいくつかの対象への株の伝播、または対象から対象への株の伝播に由来するかを決定することから構成される。古典的微生物学的器具に基づいて、検出は、通常２ステップで実行される。
ａ．第一に細菌発生を疑う。この疑念は、サンプリングされた株が同一の細菌種に属し、共通の表現型特性、たとえば病原性細菌の同一または類似の耐性記録を共有している場合に、生じる。
ｂ．疑われる場合、これらの株が実に対象間の伝播に由来することを論証または無効にすることを目的として疫学的調査を実施する。この種類の調査は、具体的には、サンプリング対象が最近接触したか、全く同一の場所（たとえば、全く同一の手術室または全く同一の病室）を共有したか、全く同一の介護者に介護されたか、を調べることから構成される。この種類の調査は通常、長時間で手間が掛かり、人手もかかる。そのうえ、調査は、通常たとえば、部屋または部門を隔離状態に置く、または手術室を閉鎖するなどの予防策が調査終了前に導入されるので、伝染病の対象であることが疑われる機関または会社の運営に大きな混乱をもたらし得る。
ａ．第一に細菌発生を疑う。この疑念は、サンプリングされた株が同一の細菌種に属し、共通の表現型特性、たとえば病原性細菌の同一または類似の耐性記録を共有している場合に、生じる。
ｂ．疑われる場合、これらの株が実に対象間の伝播に由来することを論証または無効にすることを目的として疫学的調査を実施する。この種類の調査は、具体的には、サンプリング対象が最近接触したか、全く同一の場所（たとえば、全く同一の手術室または全く同一の病室）を共有したか、全く同一の介護者に介護されたか、を調べることから構成される。この種類の調査は通常、長時間で手間が掛かり、人手もかかる。そのうえ、調査は、通常たとえば、部屋または部門を隔離状態に置く、または手術室を閉鎖するなどの予防策が調査終了前に導入されるので、伝染病の対象であることが疑われる機関または会社の運営に大きな混乱をもたらし得る。
【0003】
この状況で、完全な細菌ゲノムは、古典的微生物学的技術によってもたらされるものよりも遥かに高いレベルの情報を含むので、配列決定の出現、特にＷＧＳ（完全ゲノム配列決定）型の配列決定は、細菌疫学において注目すべき発展に相当する。疫学的研究に着手することを決定するための基準がより正確であるのみならず、加えて、ゲノミクスの使用がやはり、後工程を大幅に単純化し正規化し得る。たとえば、数日おいて同じ病院の部門内のサンプルで見つかった色ブドウ球菌の２つの株が、ゲノムの立場から厳密に同一である場合、２つの株が全く同一の細菌発生の一部を実に形成することが、追加情報なしに決定され得る。
【0004】
配列決定が注目すべき発展であることを示したが、そのまま、それが種類に関わらず、２つの菌株の系統を決定することを可能にすることはできない。実際、一定の細菌種は、数日の間に非常に速く進化する成形的なゲノムを有し、抗生物質治療が使用された場合はなおさらそうであり、その結果、ゲノム間での厳密な識別情報は、唯一の基準として使用されることができない。この成形力を考慮するために、細菌発生を検出するための方法は、２０１８年１２月のＪ．Ｓｉｍｓｏｎらの「Ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ＳＮＰ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ： ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」という論文で説明されているように、たとえば単一ヌクレオチドの多形数の関数として計算された、それらのゲノムの差異が、所定の閾値より低い場合、菌株が全く同一の発生に属するかを評価することから構成されるが、この手法は、たとえば、細菌が進化する状況、または種類に応じた突然変異率の可変性などの、多くの不確実性源のためにむしろ不正確である。この論文の著者は、したがって、菌株および菌株の突然変異および伝播のメカニズムについての演繹的な知識情報を含む、サンプルの収集の時間配列を考慮することも提案している。
【0005】
疫学的予測モデルをより複雑にすることに加えて、単一の閾値の使用は、必然的に感度と予測の特異性との間の困難な妥協に導く。一方では、細菌発生に帰すること（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｔｏ）の予測が、感度が高すぎるが、あまりにも非特異的である場合、事象の伝染病特性の反証に導く疫学的調査をトリガすることは、あまりにも頻繁であり、そのことは、資源、作業、予算の点から大きなコストを伴う。他方で、発生に帰することの予測が、低感度である場合、細菌発生は、検出されず、健康、たとえば患者または消費者の健康の点で、深刻な結果を伴う。
【発明の概要】
【0006】
本発明の目的は、細菌のゲノムの比較に基づいて、細菌発生を識別し、監視するための方法を提案することであり、それは、感度および特異性に関して自由を提供する一方で、菌株の細菌発生に帰することの予測における、不確実性源を明示的に考慮する。
【0007】
この目的に関して、本発明は、地理的区域内の細菌種と関連する、細菌発生を検出し監視するための方法に関し、
－ 地理的区域内でサンプリングされ、細菌種に属する菌株のデジタルゲノムを取得することと、
－ 細菌種に属する菌株の少なくとも１つのデジタルゲノムを含む「疫学的」と呼ばれるデータベースのデジタルゲノムを使用して取得されたデジタルゲノムのゲノム距離を計算することと、
－○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の所定の閾値を下回る場合、細菌発生に属すること、
○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の閾値よりも厳密に高い第２の所定の閾値を上回る場合、細菌発生に属さないこと、または
○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の閾値と第２の閾値との間にある場合、細菌発生におそらく属すること、
を予測することと、
を含み、前記方法によれば、
－ 第１の閾値は、第３の閾値以上であり、したがって、第３の閾値を下回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属するという予測は、最大の特異性を有し、
－ 第２の閾値は、第４の閾値以下であり、したがって、第４の閾値を上回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属さないという予測は、最大の感度を有する。
－ 地理的区域内でサンプリングされ、細菌種に属する菌株のデジタルゲノムを取得することと、
－ 細菌種に属する菌株の少なくとも１つのデジタルゲノムを含む「疫学的」と呼ばれるデータベースのデジタルゲノムを使用して取得されたデジタルゲノムのゲノム距離を計算することと、
－○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の所定の閾値を下回る場合、細菌発生に属すること、
○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の閾値よりも厳密に高い第２の所定の閾値を上回る場合、細菌発生に属さないこと、または
○ サンプリングされた菌株およびデータベースの菌株は、それらのゲノム距離が第１の閾値と第２の閾値との間にある場合、細菌発生におそらく属すること、
を予測することと、
を含み、前記方法によれば、
－ 第１の閾値は、第３の閾値以上であり、したがって、第３の閾値を下回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属するという予測は、最大の特異性を有し、
－ 第２の閾値は、第４の閾値以下であり、したがって、第４の閾値を上回るゲノム距離を有する２つの菌株が細菌発生に属さないという予測は、最大の感度を有する。
【0008】
いいかえれば、２つの異なる閾値は、方法の感度および特異性を制御するために使用され、下方の閾値は、株が細菌発生に属するという予測の特異性（以下「属性の特異性」）を制御するために使用され、上方の閾値は、この予測の感度（以下「属性の感度」）を制御するために使用される。これらの２つの閾値間の区域は、したがって、ゲノム距離に基づいた予測に内在する不確実性を考慮するために特異的に提供されている。具体的には、属性の特異性および感度を最大化するために前もって適用される、第３および第４の閾値は、これらの閾値を学習するために不完全または不十分に分散しているデータ、突然変異のメカニズムが細菌種内でどれが異種であるかを知らないこと、ゲノム比較方法の選択のための方法の不正確さ、または疫学的調査からもたらされた感染中心の特性決定のそれ以外の誤差のために、株が全く同一の発生に属するか否かを知ることが難しい区域を画定する。この不確実性区域は、ユーザに伝染病管理における柔軟性を提供する。具体的には、株が中間区域にある場合、疫学的調査および細菌発生を抑制するための予防策をトリガする、細菌発生への属性の予測とは対照的に、ユーザは、完全な疫学的調査が着手されるべきか否かを決定するために、たとえばサンプルが取得された患者のファイルを使用してクロスチェックして、またはそれらの抗生物質耐性源、それらの毒性寄与遺伝子、もしくは種の生物多様性におけるそれらの系統学的位置、を分析することによって、予備的調査を設定し得る。また、第３および第４の閾値間の区域は、一定の事例では、広すぎる可能性があるため、これらの閾値に基づく予測は、最適でない。第３および第４の閾値間に厳密に含まれる区域を画定する、第１および第２の閾値は、細菌発生への属性または非属性の予測の分析的最適化を可能にする。
【0009】
一実施形態によれば、第１および第２の閾値は、
－ 細菌種に属する菌株のデジタルゲノムの学習データベースを構成することであって、前記データベースが、
○ 全く同一の細菌発生に属すると事前に決定され、「関連株対」としてタグ付けされた菌株対と、
○ 全く同一の細菌発生に属さないと事前に決定され、「非関連株対」としてタグ付けされた菌株対と、を含む、構成することと、
－ ２つの菌株が、それらのゲノム距離を第５の閾値に対して比較することにより、関連付けられるまたは関連付けられないと予測するために構成されたバイナリ予測因子を選択することと、
－ 第５の閾値の値の所定の集合に属する第５の閾値の値ごとに、
○ 学習データベースの関数としての前記予測因子の混同行列と、
○ 混同行列の関数としての予測因子の第１の品質指標であって、予測因子の感度および特異性と異なる、第１の品質指標と、
○ 混同行列の関数としての、第１の指標とは異なる第２の品質指標であって、第１の指標、予測因子の感度および特異性と異なる、第２の品質指標と、を計算することと、
－ 第１の指標を最適化する第５の閾値の第１の値、および第２の指標を最適化する第５の閾値の第２の値を見つけることと、
－ 第１の閾値を、第５の閾値の第１および第２の値の最小値に等しく設定し、第２の閾値を、第５の閾値の第１および第２の値の最大値に等しく設定することと、
によって計算された２つのゲノム距離に等しい。
－ 細菌種に属する菌株のデジタルゲノムの学習データベースを構成することであって、前記データベースが、
○ 全く同一の細菌発生に属すると事前に決定され、「関連株対」としてタグ付けされた菌株対と、
○ 全く同一の細菌発生に属さないと事前に決定され、「非関連株対」としてタグ付けされた菌株対と、を含む、構成することと、
－ ２つの菌株が、それらのゲノム距離を第５の閾値に対して比較することにより、関連付けられるまたは関連付けられないと予測するために構成されたバイナリ予測因子を選択することと、
－ 第５の閾値の値の所定の集合に属する第５の閾値の値ごとに、
○ 学習データベースの関数としての前記予測因子の混同行列と、
○ 混同行列の関数としての予測因子の第１の品質指標であって、予測因子の感度および特異性と異なる、第１の品質指標と、
○ 混同行列の関数としての、第１の指標とは異なる第２の品質指標であって、第１の指標、予測因子の感度および特異性と異なる、第２の品質指標と、を計算することと、
－ 第１の指標を最適化する第５の閾値の第１の値、および第２の指標を最適化する第５の閾値の第２の値を見つけることと、
－ 第１の閾値を、第５の閾値の第１および第２の値の最小値に等しく設定し、第２の閾値を、第５の閾値の第１および第２の値の最大値に等しく設定することと、
によって計算された２つのゲノム距離に等しい。
【0010】
いいかえれば、属性の最大特異性および特異性に基づく予測は、学習データベースに記憶された利用可能な疫学的データに関する最適な予測を必ずしも構成しない。バイナリ予測品質を最適化する第１および第２の閾値を計算することによって、実際には、伝染病事象の管理の最適化が取得される一方で、可能性のある細菌発生のユーザへの警告を続けるための十分に広い中間区域を保持する。
【0011】
一実施形態によれば、第１の指標は、学習データベースにおける、関連株対の数と関連株対の数との間の不均衡を考慮して選択される。具体的には、第１の指標は、マシューズ相関係数またはＦ１スコアである。通常、細菌発生に関するデータ、すなわち関連すると見なされる株の数は、関連しないと見なされる株よりも大幅に少ない。この不均衡を明示的に考慮する品質指標を使用することによって、予測のより良好な最適化が、獲得される。さらに、マシューズ係数またはＦ１スコアに対応する閾値は、特異性を支持するが、特異性のみを考慮するわけではない。
【0012】
一実施形態によれば、第２の指標は、ユーデン指標である。特異性および感度を明示的に考慮する、この指標は、重要データに対してその学習が通常実行される非属性の予測が、自然に最適化されることを可能にする。データベースの不均衡は、ユーデン指標が感度によってより影響される効果を有し、特異性は、第３および第４の閾値の間の完全な間隔において１に近い。
【0013】
一実施形態では、予測因子は、
－ 真陽性は、第５の閾値を下回るゲノム距離を有する関連株対に対応し、
－ 偽陰性は、第５の閾値を上回るゲノム距離を有する関連株対に対応し、
－ 偽陽性は、第５の閾値を下回るゲノム距離を有する非関連株対に対応し、
－ 真陰性は、第５の閾値を上回るゲノム距離を有する非関連株対に対応する、
ように選択される。
－ 真陽性は、第５の閾値を下回るゲノム距離を有する関連株対に対応し、
－ 偽陰性は、第５の閾値を上回るゲノム距離を有する関連株対に対応し、
－ 偽陽性は、第５の閾値を下回るゲノム距離を有する非関連株対に対応し、
－ 真陰性は、第５の閾値を上回るゲノム距離を有する非関連株対に対応する、
ように選択される。
【0014】
一実施形態によれば、疫学的データベースは、学習データベースを含む。いいかえれば、学習データベースは、方法が適用されたとき補足され、データベースがサイズを増大させるにつれて、多様な閾値を改善することを可能にする。
【0015】
一実施形態によれば、ゲノム距離は、正規化された距離である。より具体的には、２つの菌株間のゲノム距離は、
－ 主に遺伝子座の集合において選択することであって、遺伝子座が前記株のデジタルゲノムに共通である、選択することと、
－ 共通の遺伝子座における、前記株の２つのデジタルゲノム間の、対立遺伝子の差異の数を数えることと、
－ 前記差異の数を共通の遺伝子座の数で割ることと、
によって計算される。
－ 主に遺伝子座の集合において選択することであって、遺伝子座が前記株のデジタルゲノムに共通である、選択することと、
－ 共通の遺伝子座における、前記株の２つのデジタルゲノム間の、対立遺伝子の差異の数を数えることと、
－ 前記差異の数を共通の遺伝子座の数で割ることと、
によって計算される。
【0016】
共通の遺伝子座の数によって正規化することにより、配列決定誤差の効果が、具体的には、菌株における遺伝子座を識別しないことの事実が、減じられる。
【0017】
好ましい実施形態によれば、第５の閾値の第１および第２の値は、０．１を上回る場合、
－ 第２の閾値は、０．１に等しく設定され、
－ 第１の閾値は、ｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）に等しく設定され、ここでｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）は、関連株対の中で最大ゲノム距離であり、厳密に０．２を下回る。
－ 第２の閾値は、０．１に等しく設定され、
－ 第１の閾値は、ｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）に等しく設定され、ここでｍａｘ（Ｄｇ＼Ｄｇ＜０．２）は、関連株対の中で最大ゲノム距離であり、厳密に０．２を下回る。
【0018】
具体的には、発明者らは、学習データベースが不完全または不十分な多様性であるために通常取得される０．１を上回る値は、学習の失敗をもたらすことを見いだした。本発明者らはさらに、好適な学習データベースという状況で、第１および第２の閾値は、０．１以下であることを示した。２つの閾値のうちの１つは、したがって、この上限で固定される。さらに、発明者らは、同一のサブタイプの２つの株は、非常に大多数において、０．２未満のゲノム距離を有することを見いだした。したがって、ｍａｘ（ｄｒ＼ｄｒ＜０．２）に等しい他の閾値を、後者よりも大きいゲノム距離を有する２つの株に設定することで、これらの株は、同一の細菌のサブタイプに属さず、したがって伝染病を疑うための重要な指標を構成する、同一の発生に属さないことが予測される。したがって、データは、第１および第２の閾値を正確に計算するために、やはり不十分であるにもかかわらず、ユーザは、初期設定で所望の処理ができる方法を有する。
【0019】
一実施形態によれば、デジタルゲノム間の距離は、マーカのデータベース、具体的には遺伝子のまたはＳＮＰのデータベースｗｇＭＬＳＴ、ｃｇＭＬＳＴ、ＭＬＳＴの関数として計算される。
【0020】
一実施形態によれば、サンプリングされた株が、細菌発生に属すると予測された場合、疫学的データベースにおいて、細菌発生の菌株に対して「関連」している、および他の菌株に対して「非関連」である、としてタグ付けされる。
【0021】
一実施形態によれば、サンプリングされた株が、おそらく細菌発生に属すると予測された場合、サンプリングされた株が実際に前記発生に属するかを決定するために、前記株の追加の特性決定が実行され、属する場合、サンプリングされた菌株は、疫学的データベースにおいて、細菌発生の菌株に対して「関連」している、および他の菌株に対して「非関連」である、としてタグ付けされる。
【0022】
一実施形態によれば、第１および第２の閾値は、定期的におよび／またはＮ個の新たな株が疫学的データベースに追加された直後に再計算され、ここでＮは、１以上の整数である。
【0023】
一実施形態によれば、株が細菌発生に属すると予測される場合、発生を阻止するために予防策が講じられる。
【0024】
本発明は、以下に示されており、純粋に例示として与えられている説明を読むことおよび同一の参照が同一の構成要素を示す添付の図面を参照することにより、より良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】本発明による方法の実施形態のフローチャートである。
【図2】学習データベースに記憶されている菌株間の相応関係の表である。
【図3】２つの菌株の関連または非関連状態を予測するバイナリ予測因子の混同行列である。
【図5】本発明による方法によって使用されたゲノム距離にわたる種々の閾値を示す図である。
【図6】本発明による方法を実行するためのコンピューティングおよび配列決定システムの図である。
【図7】ＡおよびＢは、細菌種クロストリジウムディフィシレに関する、非関連株対の数（上の分布）および関連株対の数（下の分布）の分布図であり、Ｂは、Ａの０～０．１の拡大図である。
【図8】ＡおよびＢは、クロストリジウムディフィシレ種に関する、感度、特異性、精度、正確度（すなわち、（ＴＰ＋ＴＮ）／（Ｎ＋Ｐ））、Ｆ１スコア、ユーデン指標、およびマシューズ相関係数を含む品質指標の種々の最適値に対してのゲノム距離を示す図であり、Ｂは、図７Ｂの０～０．１の拡大図である。
【図9】ＡおよびＢは、細菌種黄色ブドウ球菌に関する、非関連株対の数（上の分布）および関連株対の数（下の分布）の分布図であり、Ｂは、Ａの０～０．１の拡大図である。
【図10】ＡおよびＢは、黄色ブドウ球菌種に関する、感度、特異性、精度、正確度、Ｆ１スコア、ユーデン指標、およびマシューズ相関係数を含む品質指標の種々の最適値に対してのゲノム距離を示す図であり、Ｂは、Ｂの０～０．１の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下において、厳密に規定されない限り、「下回る（ｂｅｌｏｗ）」または「未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」は、「以下」を意味し、「上回る（ａｂｏｖｅ）」または「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」は、「以上」を意味する。
【0027】
本発明の実施形態が、ここで、病院における特定の細菌種の感染の微生物学的中心の検出および監視と関連して説明されることになる。
【0028】
図１を参照すると、この方法は、どのゲノム比較が、菌株が細菌発生に属するか否かの判定のために実行されたかに基づいて、Ｓ１およびＳ２で示されている少なくとも２つの閾値を学習する第１のステップ１０と、ステップ１０で学習された閾値でパラメータ化された、本発明による方法を実行する第２のステップ２０と、を含む。より具体的には、方法は、ＢＳｉおよびＢＳｊで示されている２つの株の間の、Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）で示されているゲノム距離の比較に基づく。
【0029】
ステップ１０は、１２において、
－ 種に属する種々の株ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ３，．．．，ＢＳＮのデジタルゲノムと、
－ 図２で示されている、データベースの各株を他の株の全てにリンクする対応表であって、データベース内の２つの株間の各リンクは、２つの株が全く同一の細菌発生に属していると事前に判定されている場合は「関連」状態（黒四角）を、および２つの株が全く同一の細菌発生に属していないと事前に判定されている場合は「非関連」状態（白四角）を推定し得、２つの株間のリンク状態は、たとえば、事前の疫学的調査中に判定される。さらに、自体に対する株のリンクは、「関連」状態で一定である。図２で分かるように、問題となっている種のいくつかの感染の中心は、学習データベース内の株の「関連」および「非関連」状態を判定するために考慮され得る。以下で説明されることになるが、学習データベースはさらに、「関連」していると判定されているが、どの細菌発生にも属すると診断されていない株を含み得る。前記表はさらに、学習データベースの株ＢＳｉおよびＢＳｊの各対間のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を収容することが好ましい、対応表と、
－ それらの関連付けられた株と識別された感染の中心の全てを列挙する表と、
－ 株ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ３，．．．，ＢＳＮの、抗生物質耐性源（細菌の感度または抗生物質耐性に寄与する遺伝子マーカの集合）および毒性寄与遺伝子（細菌の毒性に寄与する遺伝子マーカの集合）と、
を含む、問題となっている種の学習データベースを生成することから開始する。
－ 種に属する種々の株ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ３，．．．，ＢＳＮのデジタルゲノムと、
－ 図２で示されている、データベースの各株を他の株の全てにリンクする対応表であって、データベース内の２つの株間の各リンクは、２つの株が全く同一の細菌発生に属していると事前に判定されている場合は「関連」状態（黒四角）を、および２つの株が全く同一の細菌発生に属していないと事前に判定されている場合は「非関連」状態（白四角）を推定し得、２つの株間のリンク状態は、たとえば、事前の疫学的調査中に判定される。さらに、自体に対する株のリンクは、「関連」状態で一定である。図２で分かるように、問題となっている種のいくつかの感染の中心は、学習データベース内の株の「関連」および「非関連」状態を判定するために考慮され得る。以下で説明されることになるが、学習データベースはさらに、「関連」していると判定されているが、どの細菌発生にも属すると診断されていない株を含み得る。前記表はさらに、学習データベースの株ＢＳｉおよびＢＳｊの各対間のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を収容することが好ましい、対応表と、
－ それらの関連付けられた株と識別された感染の中心の全てを列挙する表と、
－ 株ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ３，．．．，ＢＳＮの、抗生物質耐性源（細菌の感度または抗生物質耐性に寄与する遺伝子マーカの集合）および毒性寄与遺伝子（細菌の毒性に寄与する遺伝子マーカの集合）と、
を含む、問題となっている種の学習データベースを生成することから開始する。
【0030】
菌株のゲノムは、
－ 株を有する患者からサンプルを採取することと、
－ たとえば、菌株のコロニーを成長させるために、サンプルを寒天培養基上に散布し培養することによって、株の分離株を準備することと、
－ コロニーの一部を採取し、配列決定用に調べられる量を準備すること（たとえば、細菌のＤＮＡを解放する溶解、必要に応じて解放されたＤＮＡの増幅、およびそれを必要とする配列決定技術用ライブラリの準備）と、
－ たとえば、カリフォルニア州サンディエゴの企業Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から入手可能な「ＭｉＳｅｑ」配列決定プラットフォームを用いるなど、「次世代配列決定」型の技術を使用して、一般に「リード」と呼ばれるデジタル配列を生成するように、好ましくは完全なＤＮＡの配列決定（またはＷＧＳ配列決定）を行うことと、
－ 任意選択で、「コンティグ」という用語によって知られている、アセンブリされた配列を生成するようにリードをアセンブリすることと、
－ ｗｇＭＬＳＴ（「完全ゲノム多遺伝子座配列決定形式」）技術によって、一般に「ｗｇＭＬＳＴプロファイル」と呼ばれる、コンティグのまたはリードの形態にあるゲノムの特性決定することと、
によって取得されることが好ましい。それ自体が知られているように、この特性決定は、所定の遺伝子座の集合からゲノムにおける遺伝子座を位置決めすること、および識別された遺伝子座ごとに、この遺伝子座に相当する対立遺伝子を決定することから構成される。ｗｇＭＬＳＴ技術は、たとえば、２０１３年にＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに掲載されたＭａｒｔｉｎ Ｃ．Ｊ． Ｍａｉｄｅｎによる「ＭＬＳＴ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ： ｔｈｅ ｇｅｎｅ－ｂｙ－ｇｅｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」という文献で説明されている。
－ 株を有する患者からサンプルを採取することと、
－ たとえば、菌株のコロニーを成長させるために、サンプルを寒天培養基上に散布し培養することによって、株の分離株を準備することと、
－ コロニーの一部を採取し、配列決定用に調べられる量を準備すること（たとえば、細菌のＤＮＡを解放する溶解、必要に応じて解放されたＤＮＡの増幅、およびそれを必要とする配列決定技術用ライブラリの準備）と、
－ たとえば、カリフォルニア州サンディエゴの企業Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から入手可能な「ＭｉＳｅｑ」配列決定プラットフォームを用いるなど、「次世代配列決定」型の技術を使用して、一般に「リード」と呼ばれるデジタル配列を生成するように、好ましくは完全なＤＮＡの配列決定（またはＷＧＳ配列決定）を行うことと、
－ 任意選択で、「コンティグ」という用語によって知られている、アセンブリされた配列を生成するようにリードをアセンブリすることと、
－ ｗｇＭＬＳＴ（「完全ゲノム多遺伝子座配列決定形式」）技術によって、一般に「ｗｇＭＬＳＴプロファイル」と呼ばれる、コンティグのまたはリードの形態にあるゲノムの特性決定することと、
によって取得されることが好ましい。それ自体が知られているように、この特性決定は、所定の遺伝子座の集合からゲノムにおける遺伝子座を位置決めすること、および識別された遺伝子座ごとに、この遺伝子座に相当する対立遺伝子を決定することから構成される。ｗｇＭＬＳＴ技術は、たとえば、２０１３年にＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに掲載されたＭａｒｔｉｎ Ｃ．Ｊ． Ｍａｉｄｅｎによる「ＭＬＳＴ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ： ｔｈｅ ｇｅｎｅ－ｂｙ－ｇｅｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ」という文献で説明されている。
【0031】
学習は、学習データベースに応じた閾値Ｓ１およびＳ２の計算によって継続される。より具体的には、この計算は、
－ ゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）にわたってゲノム距離の空間をわずか２つの間隔に分割する単一の閾値Ｔに基づいて、２つの株の細菌発生への属性または非属性の第１の予測因子ｆＴ
を
－ ゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）にわたってゲノム距離の空間を、３つの間隔に分割する２つの閾値Ｓ１およびＳ２に基づいて、２つの株の細菌発生への属性または非属性の第２の予測因子ｇＳ１，Ｓ２
に変換することから構成される。
－ ゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）にわたってゲノム距離の空間をわずか２つの間隔に分割する単一の閾値Ｔに基づいて、２つの株の細菌発生への属性または非属性の第１の予測因子ｆＴ
－ ゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）にわたってゲノム距離の空間を、３つの間隔に分割する２つの閾値Ｓ１およびＳ２に基づいて、２つの株の細菌発生への属性または非属性の第２の予測因子ｇＳ１，Ｓ２
【0032】
好ましい変形形態では、第１の予測因子ｆＴは、
のように規定され、
第２の予測因子は、
のように規定される。
第２の予測因子は、
【0033】
好ましくは、ゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）は、正規化された距離であり、そのため０～１であり、
ａ．２つの株ＢＳｉおよびＢＳｊのｗｇＭＬＳＴプロファイルにおいて、それらが共通して有する遺伝子座を識別することと、
ｂ．少なくとも１つの対立遺伝子の差異が見いだされた場合、共通の遺伝子座ごとに、２つの株間に対立遺伝子の差異が存在するかを判定し、この場合、対立遺伝子の差異のカウンタＣｏｍｐｔを１ずつ増加させることと、
ｃ．以下の式からＤｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を計算することと、
によって計算され、ここでＮｌｃは、共通の遺伝子座の数である。
ａ．２つの株ＢＳｉおよびＢＳｊのｗｇＭＬＳＴプロファイルにおいて、それらが共通して有する遺伝子座を識別することと、
ｂ．少なくとも１つの対立遺伝子の差異が見いだされた場合、共通の遺伝子座ごとに、２つの株間に対立遺伝子の差異が存在するかを判定し、この場合、対立遺伝子の差異のカウンタＣｏｍｐｔを１ずつ増加させることと、
ｃ．以下の式からＤｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を計算することと、
によって計算され、ここでＮｌｃは、共通の遺伝子座の数である。
【0034】
閾値Ｓ１およびＳ２の計算は、１４において、たとえば、１０－４の増分を有する０～１の閾値Ｔの値の集合｛Ｔ１，Ｔ２，．．．，ＴＭ｝の値Ｔｉの各々ごとに、バイナリ予測因子ｆＴの混同行列ＭＣ（Ｔｉ）を計算することによって開始する。図３で示されている混同行列（Ｔｉ）の計算は、閾値Ｔｉに対しては、図４で示されており、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の関連株対の総数に等しい、「ＴＰｉｓ」で示されている真陽性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＞Ｔｉであるようなデータベース内の関連株対の総数に等しい、「ＦＮｉ」で示されている偽陰性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の非関連株対の総数に等しい、「ＦＰｉ」で示されている偽陽性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の非関連株対の総数に等しい、「ＴＮｉ」で示されている真陰性と、
をカウントすることから構成される。
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の関連株対の総数に等しい、「ＴＰｉｓ」で示されている真陽性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＞Ｔｉであるようなデータベース内の関連株対の総数に等しい、「ＦＮｉ」で示されている偽陰性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の非関連株対の総数に等しい、「ＦＰｉ」で示されている偽陽性と、
－ Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）≦Ｔｉであるようなデータベース内の非関連株対の総数に等しい、「ＴＮｉ」で示されている真陰性と、
をカウントすることから構成される。
【0035】
混同行列｛ＭＣ（Ｔ１），ＭＣ（Ｔ２，．．．，ＭＣ（ＴＭ））｝の集合が計算されると、方法は、１６において、図５で示されている異なる閾値の計算、
－ 予測因子ｆＴの特異性が最大であるような、したがって２つの株が関連するという予測の特異性が最大であるような、すなわち
であり、ここでＮは、非関連株対の数である、閾値Ｓ３と、
－ 予測因子ｆＴの感度が最大であるような、したがって２つの株が非関連であるという予測の感度が最大であるような、すなわち
であり、ここでＰは、関連株対の数である、閾値Ｓ４と、
－ 予測因子ｆＴの第１の品質指標を最適化し、感度および特異性と異なり、数ＰおよびＮ間の不均衡を明示的に考慮し、マシューズ相関係数（ＭＣＣ）であることが好ましい、すなわち
である、閾値Ｓ１と、
－ 予測因子ｆＴの第２の品質指標を最適化し、感度および特異性と異なり、ユーデン指標であることが好ましい、すなわち
である、閾値Ｓ２と、
を用いて継続する。
－ 予測因子ｆＴの特異性が最大であるような、したがって２つの株が関連するという予測の特異性が最大であるような、すなわち
－ 予測因子ｆＴの感度が最大であるような、したがって２つの株が非関連であるという予測の感度が最大であるような、すなわち
－ 予測因子ｆＴの第１の品質指標を最適化し、感度および特異性と異なり、数ＰおよびＮ間の不均衡を明示的に考慮し、マシューズ相関係数（ＭＣＣ）であることが好ましい、すなわち
－ 予測因子ｆＴの第２の品質指標を最適化し、感度および特異性と異なり、ユーデン指標であることが好ましい、すなわち
を用いて継続する。
【0036】
閾値Ｓ１およびＳ２の品質を検査するステップ１８が、次に実行される。より具体的には（記号「＼」は、「であるような」を意味する）、
－ 閾値Ｓ１およびＳ２が、０．１以下である場合、それらは保存され、学習データベースは、それらの計算およびそれらの後続の使用に適していることを意味し、
－ 閾値Ｓ１およびＳ２が、０．１を上回り、または１％未満で異なる場合、それらの値は、０．１およびＭ＝ｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）に固定され、ここでｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）は、この場合において、学習データベース内の関連株対間で０．２に最も近い最大ゲノム距離であり、
－ 閾値Ｓ１またはＳ２のうちの１つが０．１より大きい場合、この閾値は、このとき最小値０．１に、およびこの最小値が他の閾値と異なる（たとえば、１％よりも大きく異なる）場合、ｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）に固定され、そうでなければ、この閾値は、これらの２つの値の最大値に固定される。
－ 閾値Ｓ１およびＳ２が、０．１以下である場合、それらは保存され、学習データベースは、それらの計算およびそれらの後続の使用に適していることを意味し、
－ 閾値Ｓ１およびＳ２が、０．１を上回り、または１％未満で異なる場合、それらの値は、０．１およびＭ＝ｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）に固定され、ここでｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）は、この場合において、学習データベース内の関連株対間で０．２に最も近い最大ゲノム距離であり、
－ 閾値Ｓ１またはＳ２のうちの１つが０．１より大きい場合、この閾値は、このとき最小値０．１に、およびこの最小値が他の閾値と異なる（たとえば、１％よりも大きく異なる）場合、ｍａｘ（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＼（Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）＜０．２）に固定され、そうでなければ、この閾値は、これらの２つの値の最大値に固定される。
【0037】
簡略化するために、以下に、閾値Ｓ１は、閾値Ｓ２を下回り、その結果図４で説明されているように、これらの閾値が、ゲノム距離の空間を３つの間隔に分割することを仮定することになる。
－ 下方の間隔］０，Ｓ１］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「関連」していると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝１）
－ 上方の間隔］Ｓ２，１］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「非関連」であると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝－１）
－ 中間の間隔］Ｓ１，Ｓ２］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「潜在的に関連」していると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝０）
－ 下方の間隔］０，Ｓ１］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「関連」していると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝１）
－ 上方の間隔］Ｓ２，１］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「非関連」であると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝－１）
－ 中間の間隔］Ｓ１，Ｓ２］。２つの株間のゲノム距離がこの間隔に含まれる場合、これらの株は、「潜在的に関連」していると予測される。（ｇＳ１，Ｓ２＝０）
【0038】
閾値Ｓ１およびＳ２は次に、ここで説明されているステップ２０を実行するために使用されるコンピュータシステムのコンピュータメモリ内に記憶され、前記システムは、学習データベースをさらに含む。細菌の伝染病の性質を検出し監視するために病院内で実行されるステップ２０は、たとえば、患者が細菌感染によって影響を及ぼされた直後に組織的に実行され、環境サンプルは、病原性細菌または病院内の別の患者と同一または類似している症状を呈する患者を含む。他の基準が、当然、このステップを開始するために使用され得る。
【0039】
ステップ２０は、２２において、病原性株を含むサンプルを採取することから開始し、このサンプリングがまだ実行されていない場合は継続し、２４において、株の配列を決定し、そのｗｇＭＬＳＴプロファイルをステップ１２に関連して説明されたように確立することから開始する。２６において、サンプリングされた株と学習データベース内の株の各々との間のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）が、次に計算される。次に２８において、第１の疫学的診断が出される。より具体的には、
－ サンプリングされた株が、データベース内のどの株にも関連しない場合、すなわち、データベース内のどんな株であっても、サンプリングされた株からのゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）が、閾値Ｓ２を上回る場合、サンプリングされた株は、いずれの細菌発生にも属さないことが決定される。
－ サンプリングされた株が、データベース内の株と関連する場合、すなわちこれらの２つの株が、閾値Ｓ１以下のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を有する場合、ユーザの注意のために警報がトリガされ、より深い疫学的調査３０が開始され、同様に適用可能な場合、病院内でサンプリングされた株の伝播と闘うための予防策が開始される。
－ サンプリングされた株が、データベース内の株に潜在的に関連する（図１で「関連？」で示されている）場合、すなわち、これらの２つの株が、閾値Ｓ１とＳ２との間のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を有する場合、補助的分析が、３４において、これらの２つの株間のリンクに関する不確実性を除去するために実行される。サンプリングされた株の抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子が決定され、次に、潜在的に関連する株の抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子と比較されることが好ましい。抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子が同調している場合、株は関連していると判断され、警報がトリガされ、より深い調査３０が実行される。そうでない場合、株は、非関連であると判定される。最後に、この比較が問題を解決しない場合は、より深い調査３０が実行される。たとえば、サンプルの採取とデータベース内の株の取得との間で経過する時間、成形的な遺伝子内の異なるＳＮＰの数などのような他のデータが、この補助調査で使用され得る。
－ サンプリングされた株が、データベース内のどの株にも関連しない場合、すなわち、データベース内のどんな株であっても、サンプリングされた株からのゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）が、閾値Ｓ２を上回る場合、サンプリングされた株は、いずれの細菌発生にも属さないことが決定される。
－ サンプリングされた株が、データベース内の株と関連する場合、すなわちこれらの２つの株が、閾値Ｓ１以下のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を有する場合、ユーザの注意のために警報がトリガされ、より深い疫学的調査３０が開始され、同様に適用可能な場合、病院内でサンプリングされた株の伝播と闘うための予防策が開始される。
－ サンプリングされた株が、データベース内の株に潜在的に関連する（図１で「関連？」で示されている）場合、すなわち、これらの２つの株が、閾値Ｓ１とＳ２との間のゲノム距離Ｄｇ（ＢＳｉ，ＢＳｊ）を有する場合、補助的分析が、３４において、これらの２つの株間のリンクに関する不確実性を除去するために実行される。サンプリングされた株の抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子が決定され、次に、潜在的に関連する株の抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子と比較されることが好ましい。抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子が同調している場合、株は関連していると判断され、警報がトリガされ、より深い調査３０が実行される。そうでない場合、株は、非関連であると判定される。最後に、この比較が問題を解決しない場合は、より深い調査３０が実行される。たとえば、サンプルの採取とデータベース内の株の取得との間で経過する時間、成形的な遺伝子内の異なるＳＮＰの数などのような他のデータが、この補助調査で使用され得る。
【0040】
それ自体が知られているように、病院の疫学チームによって実施される調査３０の目的の１つは、病院内でサンプリングされた種々の株が、伝染病を構成するかを判定することである。この調査の完了において、種々の株間のリンク、すなわち「関連」または「非関連」が、決定的に確立される。さらに、伝染病が検出された場合、伝染病の株は、この伝染病に応じてやはりタグ付けされる。サンプリングされた株のゲノム、ｗｇＭＬＳＴプロファイル、抗生物質耐性源および毒性寄与遺伝子、データベース内の他の株とのそのリンク、ならびに細菌発生に関するデータは、次に、後に使用され得るように学習データベース内に記憶される。閾値Ｓ１およびＳ２は、したがって、それらの値を改善するために、定期的にまたはデータベースへの新たな登録ごとに、更新され得る。
【0041】
図６は、本発明による方法を実行するためのコンピューティングおよび配列決定システム４０を示している。システム４０は、サンプル４４の細菌ＤＮＡを配列決定するための配列決定プラットフォーム４２を含み、したがって、デジタルシーケンスの集合または「リード」を生成する。プラットフォーム４２は、データ処理ユニット４６、たとえばシーケンスを受信し任意選択でコンティグを生成するためにリードをアセンブリするためのプログラムを適用するパーソナルコンピュータに、接続されている。また、ユニット４６は、たとえば、クラウドソリューションの形態で、サービスとしてのソフトウェア（または「Ｓａａｓ」）を使用して、リモートサーバ４８に接続される。「フロントエンド」ソフトウェアが動作するユニット４６は、サーバ４８に、プラットフォーム４２によって配列決定されたゲノムを、リードまたはコンティグの形態で、送信する。情報サービスが「バックエンド」の形態で動作し、学習データベース５０に接続されているサーバ４８は、ゲノムを受信し、本発明による方法の処理ステップを実行し（たとえば、図１のステップ１４～１８および２４～３２）、サーバは、コンピュータメモリに、これを実行するために必要な命令セットを、記憶する。サーバは、処理結果をユニット４６に、報告５２の形態で、返送する。システム４０は、ユニット４２に接続されている１つまたは複数のサーバ５４をさらに備え、これらのサーバは、具体的には、患者および疫学的データを記憶するコンピュータシステムのサーバであり、これらのデータは、疫学的細菌発生を特徴づけるための、より深い調査で使用される。
【0042】
図７および９は、それぞれクロストリジウムディフィシレ（図７Ａおよび７Ｂ）ならびに黄色ブドウ球菌（図９Ａおよび９Ｂ）種の関連株対および非関連株対の数の分布を示している。これらの図から分かるように、ゲノム距離が大きい（たとえば、０．６を上回るクロストリジウムディフィシレの）関連株対およびゲノム距離が小さい（たとえば、０．２を下回る黄色ブドウ球菌の）非関連株対が存在している。したがって、単一の閾値が使用される場合、ゲノム距離が、「関連」状態または「非関連」状態の両方に関してコードし得る区域が存在する。この中間区域は、自然に存在し、たとえば、全く同一のサブタイプに属するが、全く同一の細菌発生に属すると判定されていない、株に対応する。また、図８Ａ～Ｂおよび１０Ａ～Ｂから、ゲノム距離の空間を３つに分割するための閾値Ｓ３（「特異性」で示されている最大特異性）およびＳ４（「感度」で示されている最大感度）を選択することに関して、中間区域は、大きく良好な数の株が、潜在的に関連していると判定されることが観測される。予測の品質を最適化する、閾値Ｓ１（たとえば、マシューズ係数ＭＭＣを最大化する）およびＳ２（たとえば、ユーデン指標を最適化する）を使用して、中間区域は大幅に低減され、一方、全体的に感度を非常に良好に維持することに留意されたい。
【0043】
病院内での病原性細菌の疫学に対する出願が説明された。当然、本発明は、本出願に限定されず、産業（たとえば、飲食物産業における制御）、環境、および獣医学の微生物学的制御の分野で使用され得る。
【0044】
ゲノム距離を計算するためのｗｇＭＬＳＴプロファイルの使用が説明された。ｃｇＭＬＳＴ（「コアゲノム多遺伝子座配列決定形式」）プロファイル、ＭＬＳＴ、ＳＮＰのまたは遺伝子の集合などの、他のプロファイルが使用され得る。
【0045】
ユーデン指標およびマシューズ相関係数の使用が説明された。たとえば、Ｆ１スコア（すなわち、２ＴＰ／（２ＴＰ＋ＦＰ＋ＦＮ））、係数χ１、正確度（すなわち、（ＴＰ＋ＴＮ）／（Ｎ＋Ｐ））、精度（すなわち、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ））などの他の品質指標が、使用され得る。これらの指標のうちの少なくとも１つが、データベースの不均衡を考慮することが好ましい。
【0046】
サンプリングされた株と比較するためにも使用される、学習データベースが説明された。変形形態として、個別のデータベース、または「疫学的データベース」が、サンプリングされた株を処理するために使用され得る。そのようなデータベースは、たとえば、病院、機関、企業などに適しており、学習データベースは、このとき、閾値の値を確立するためだけに使用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【国際調査報告】