(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-13
(54)【発明の名称】細胞培養を増強するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20220906BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20220906BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20220906BHJP
C12N 5/16 20060101ALI20220906BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220906BHJP
C12N 13/00 20060101ALI20220906BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220906BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220906BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220906BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20220906BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
C12N1/00 F ZNA
C12N5/07
C12N5/16
C12N5/0783
C12N13/00
C12N15/62 Z
C12N15/13
C12N15/12
C12N1/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500850
(86)(22)【出願日】2020-07-06
(85)【翻訳文提出日】2022-03-07
(86)【国際出願番号】 US2020040916
(87)【国際公開番号】W WO2021007170
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】62/871,409
(32)【優先日】2019-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】502221282
【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】マンスール サリャ
(72)【発明者】
【氏名】カーン ジョアンナ
(72)【発明者】
【氏名】ピアース アンソン
(72)【発明者】
【氏名】リン ペイ－イ
【テーマコード（参考）】
4B033
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B033NJ01
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB19
4B065BB32
4B065BD12
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】
本明細書では、細胞培養方法およびそれに関連する組成物の改良が提供される。一部具体的には、本明細書では、細胞分裂時間および生存率を増加させる組成物および方法、ならびにキットが提供される。また、本明細書では、エレクトロポレーションを実行するための組成物および方法が提供され、高レベルのエレクトロポレーション効率が達成され、細胞に対するエレクトロポレーションの有害な影響が減少する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無血清細胞培養培地を調製するための方法であって、リポタンパク質粒子組成物またはリポタンパク質組成物を基礎培養培地に添加することを含み、前記リポタンパク質粒子組成物またはリポタンパク質組成物が血清代替物として機能する量で添加される方法。
【請求項2】
前記リポタンパク質粒子組成物が、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、
（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および
（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記リポタンパク質粒子組成物が、ヒト血液から得られたリポタンパク質粒子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記リポタンパク質粒子組成物が、合成リポタンパク質粒子を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記リポタンパク質粒子組成物が、合成高密度リポタンパク質粒子を含む、請求項１、２、または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記合成リポタンパク質粒子が、アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記合成リポタンパク質粒子が、アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩの一部を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩが、組換え的に産生される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩの組換え的産生が、非哺乳動物細胞を使用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記非哺乳動物細胞が、昆虫細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地であって、前記無血清細胞培養培地は、哺乳動物細胞の増殖を補助し、前記哺乳動物細胞の前記増殖は、前記１つ以上のリポタンパク質化合物を含まないが血清を含む培地で増殖した同じ細胞と比較して、前記１つ以上のリポタンパク質化合物を含む前記無血清細胞培養培地において１０％増加する、無血清細胞培養培地。
【請求項12】
前記１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、アポリポタンパク質ＡＩである、請求項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項13】
前記１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、アポリポタンパク質ＡＩＩである、請求項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項14】
前記１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、リポタンパク質粒子の成分である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項15】
前記リポタンパク質粒子が、高密度リポタンパク質である、請求項１４に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項16】
前記リポタンパク質粒子が、哺乳動物から得られる、請求項１４または１５に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項17】
前記リポタンパク質粒子が、非天然型である、請求項１４または１５に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項18】
前記非天然リポタンパク質粒子が、非天然タンパク質、天然アポリポタンパク質、または天然アポリポタンパク質の一部のいずれかを含む、請求項１７に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項19】
細胞生存率の増加が、１０％～約７５％の範囲である、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項20】
前記哺乳動物細胞が、ハイブリドーマ細胞である、請求項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項21】
前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項２０に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項22】
前記哺乳動物細胞が、免疫細胞である、請求項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項23】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項２２に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項24】
前記Ｔ細胞が、（ａ）調節性Ｔ細胞、
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、
（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、
（ｄ）ＴH１細胞、
（ｅ）ＴH２細胞、
（ｆ）ＴH３細胞、
（ｇ）ＴH１７細胞、
（ｈ）ＴH９細胞、および
（ｉ）ＴFH細胞からなる群から選択される１つ以上のＴ細胞である、請求項２３に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項25】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ３表面マーカーへのライゲーションを介して血液から単離される、請求項２３または２４に記載の無血清細胞培養培地。
【請求項26】
哺乳動物細胞を増殖させるための方法であって、前記哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地中で前記哺乳動物細胞をインキュベートすることを含む、方法。
【請求項27】
前記リポタンパク質化合物が、１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記リポタンパク質粒子化合物が、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、
（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および
（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
哺乳動物細胞集団のエレクトロポレーションのための方法であって、（ａ）前記哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、無血清培地中で少なくとも１２時間、前記哺乳動物細胞集団を１つ以上のリポタンパク質化合物と接触させることと、
（ｂ）前記哺乳動物細胞集団に１つ以上の電気パルスを印加して、それにより前記哺乳動物細胞集団のメンバーの細胞膜をエレクトロポレーションすることと、を含み、
エレクトロポレーション効率は少なくとも６０％であり、前記哺乳動物細胞集団における細胞の生存率は１０％未満減少する、方法。
【請求項30】
前記エレクトロポレーション効率が、前記哺乳動物細胞集団のメンバーにおける検出可能なマーカーの発現によって測定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記検出可能なマーカーが、蛍光タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
活性化されたＴ細胞集団を維持するための方法であって、（ａ）Ｔ細胞の活性化集団を生成することと、
（ｂ）リポタンパク質サプリメントの存在下で、ステップ（ａ）において生成された前記Ｔ細胞の活性化集団を増殖させることと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において生成された増殖した前記Ｔ細胞の活性化集団を、次の７日間で細胞増殖速度の少なくとも３０％の低下をもたらすのに十分な強度の電界に曝露することと、
（ｄ）ステップ（ｂ）と同じ条件下でステップ（ｃ）の前記Ｔ細胞の活性化集団を７日間維持することと、を含み、
ステップ（ａ）～（ｄ）の間の前記Ｔ細胞の活性化集団の生存率は７０％超を維持する、方法。
【請求項33】
１つ以上の核酸分子が、ステップ（ｃ）において、前記Ｔ細胞の活性化集団の個々のＴ細胞に導入される、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つが、キメラ抗原受容体をコードする、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記キメラ抗原受容体が、前記Ｔ細胞の活性化集団の個々のＴ細胞において安定して発現される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記Ｔ細胞の活性化集団が、ステップ（ｂ）において３日間増殖される、請求項３２に記載の方法。
【請求項37】
（ｅ）ステップ（ｄ）後に前記Ｔ細胞の活性化集団を洗浄することと、（ｆ）リポタンパク質サプリメントの非存在下で、ステップ（ｅ）において生成された洗浄された前記Ｔ細胞の活性化集団を増殖させることと、をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項38】
５日間の期間にわたり、前記洗浄されたＴ細胞の活性化集団の生存率が７０％超を維持し、前記洗浄されたＴ細胞の活性化集団が、少なくとも３倍増殖する、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記Ｔ細胞の活性化集団が、ステップ（ｄ）の間に異なる場所に輸送される、請求項３２に記載の方法。
【請求項40】
前記異なる場所が、１００マイル超離れている、請求項３２に記載の方法。
【請求項41】
哺乳動物細胞を保存するための方法であって、（ａ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で前記哺乳動物細胞を増殖させるステップと、
（ｂ）前記哺乳動物細胞を電界に曝露するステップと、
（ｃ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で前記哺乳動物細胞を増殖させるステップと、をこの順番で含み、
ステップ（ｃ）における前記哺乳動物細胞は、ステップ（ａ）よりも少なくとも５０％低い速度で増殖し、
前記哺乳動物細胞の生存率は、ステップ（ａ）～（ｃ）の間７０％超を維持する、方法。
【請求項42】
前記哺乳動物細胞が、Ｔ細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記哺乳動物細胞が、ステップ（ｃ）において７日間増殖される、請求項４１に記載の方法。
【請求項44】
ステップ（ｃ）における前記哺乳動物細胞の細胞生存率が、７日間の増殖の間、７０％超を維持する、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
ステップ（ｃ）における前記哺乳動物細胞が洗浄され、少なくとも５０％低い濃度の前記１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地に移される、請求項４１に記載の方法。
【請求項46】
核酸分子が、ステップ（ｂ）において前記哺乳動物細胞に導入される、請求項４１に記載の方法。
【請求項47】
前記核酸分子が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記哺乳動物細胞が、Ｔ細胞である、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，４０９号に対する優先権の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，４０９号に対する優先権の利益を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＬＴ０１４５７＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは８，０９０バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、ＬＴ０１４５７＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは８，０９０バイトである。
【0003】
本明細書では、細胞培養方法およびそれに関連する組成物の改良が提供される。一部具体的には、本明細書では、細胞分裂時間および生存率を増加させる組成物および方法、ならびにキットが提供される。また、本明細書では、エレクトロポレーションを実行するための組成物および方法が提供され、高レベルのエレクトロポレーション効率が達成され、細胞に対するエレクトロポレーションの有害な影響が減少する。
【背景技術】
【0004】
細胞培養組成物および方法は当技術分野で知られている。多くの場合において、細胞が多数に増殖し、細胞集団内で多数の生細胞を維持する条件下で細胞を培養することが望ましい。本明細書では、これらの目標、ならびに他の目標を達成することを目的とした組成物および方法が提供される。
【0005】
細胞を治療目的で使用する場合、血清の非存在下でこれらの細胞を培養することが一般的に望ましい。この理由には、血清中に存在する外来物質（例えばウイルス、プリオン、マイコプラズマ等）で細胞が汚染される可能性が含まれる。また、かなりの数（例えば、１００匹以上）の動物の血液からプールされた血清でさえ、哺乳動物細胞培養で使用される場合、かなりのロット間変動を有する（図１を参照）。図１に提示されたデータから分かるように、市販のヒト血清の異なるロットは、総Ｔ細胞収量において実質的な変動（１５％～５０％）を示す。形質導入効率に関しても見られる実質的な変動（データは示さず）。上記は、血清代替物が頻繁に使用されるいくつかの理由である。
【0006】
エレクトロポレーションは、材料が細胞に導入され得る方法である。細胞および導入される材料を含む溶液が、短時間の高強度電界に曝露される。電界は細胞を「穿孔」し、外膜に一時的な細孔を生成し、溶液中の物質を細胞内に拡散させる。
【0007】
細胞のエレクトロポレーションに関する問題の１つは、このプロセスによって細胞の生存率が低下することが多いことである。さらに、逆相関エレクトロポレーション効率と細胞生存率との間のバランスがしばしば求められる。一例として、細胞内量に等しい生理学的レベルのカリウムは、エレクトロポレーションされた細胞の生存率を増加させる傾向がある（例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：２９０２（１９９２）を参照されたい）。カルシウムイオンの存在は、エレクトロポレーション後の細胞の生存率を高めることが報告されている。生存率の増加の理由は、エレクトロポレーション後の再密封プロセスにおけるカルシウムによる寄与であると報告されていると仮定される。ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：２９０２（１９９２））の表１は、細胞に印加される電荷が高いほど細胞生存率が低くなり、測定された最高細胞生存率は約６９％であることを本質的に示している。
【0008】
エレクトロポレーション培地の浸透圧は、細胞の生存率および細胞膜を通過する大きな分子の移動効率に影響を与える。例えば、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：６４６４（１９９０））は、低張エレクトロポレーション培地の使用を推奨していない。
【0009】
高レベルの細胞生存率を維持するとともに、細胞への分子の高レベルの導入をもたらすエレクトロポレーション法が必要である。
【発明の概要】
【0010】
高い細胞生存率を有する細胞（例えばヒト細胞）を培養および／または増殖させるための組成物および方法が提供される。さらに、本明細書では、とりわけ、細胞に高分子を導入するための組成物、方法システム、キット、および方法が提供され、細胞は高い生存率を維持する。したがって、一般に、本明細書では、高い細胞生存率の維持、および組成物中の細胞が高レベルの生存率を維持する細胞組成物の生成のための細胞プロセスに関連する組成物および方法が提供される。
【0011】
いくつかの態様において、本明細書では、無血清細胞培養培地を調製するための方法、およびそのような方法で使用される組成物、およびそのような方法によって調製される得られる培養培地である。そのような方法は、１つ以上のリポタンパク質粒子組成物および／または１つ以上のリポタンパク質が基礎培地に添加される方法を含む。多くの場合において、リポタンパク質粒子組成物および／またはリポタンパク質は、血清代替物として機能する量で添加される。
【0012】
方法で使用され、本明細書に記載の組成物中に存在するリポタンパク質粒子は、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子、ならびに他の種類のリポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含み得る。
【0013】
方法で使用され、本明細書に記載の組成物中に存在するリポタンパク質粒子は、天然源（例えば、血液またはヒト等の哺乳動物）から得られ得るか、または合成的に生成され得る（例えば、合成高密度リポタンパク質粒子等の合成リポタンパク質粒子）。いくつかの場合において、合成リポタンパク質粒子は、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＩＶ、アポリポタンパク質－ＣＩ、アポリポタンパク質ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ、および／またはそのようなアポリポタンパク質の１つ以上の一部を含み得る。
【0014】
さらに、組成物中に存在し、本明細書に記載の方法で使用されるアポリポタンパク質は、天然源（例えば、血液またはヒト等の哺乳動物）から得られ得、および／または組換え的に産生され得る。さらに、アポリポタンパク質および／またはその一部の組換え的産生は、非哺乳動物細胞（例えば、細菌細胞、植物細胞、および昆虫細胞等）を使用して行うことができる。
【0015】
いくつかの態様において、本明細書では、無血清細胞培養培地が提供される。そのような培地は、１つ以上のリポタンパク質を含み得る。さらに、そのような培養培地は、哺乳動物細胞の増殖を補助することができ、哺乳動物細胞の増殖は、１つ以上のリポタンパク質を含まないが血清を含む培養培地で増殖させた同じ細胞と比較して、１つ以上のリポタンパク質を含む無血清細胞培養培地において少なくとも１０％（例えば、約１０％～約７５％、約１０％～約７０％、約１０％～約５５％、約１０％～約４５％、約１０％～約３５％、約１０％～約２５％、約２０％～約７０％、約２０％～約５５％等）増加する。本明細書に記載の無血清細胞培養培地は、１つ以上のリポタンパク質化合物（例えば、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＩＶ、アポリポタンパク質－ＣＩ、アポリポタンパク質ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、およびアポリポタンパク質Ｅ等）、ならびに／またはリポタンパク質の１つ以上の下位部分のうちの１つを含み得る。さらに、リポタンパク質および／またはリポタンパク質下位部分は、リポタンパク質粒子の成分であり得る（例えば、高密度リポタンパク質粒子、低密度リポタンパク質粒子、超低密度リポタンパク質粒子等）。
【0016】
本明細書に記載の培養培地（例えば無血清培地）中に存在するリポタンパク質粒子は、天然源（例えばヒト等の哺乳動物の血液）から得られ得るか、または非天然型であり得る（例えば合成的に産生される）。さらに、非天然リポタンパク質粒子は、１つ以上の非天然タンパク質、１つ以上の天然アポリポタンパク質、天然アポリポタンパク質の１つ以上の部分、またはこれらの１つ以上の組み合わせを含み得る。
【0017】
本明細書に記載の組成物および方法を使用して培養され得る細胞は、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト細胞等の哺乳動物細胞を含む。さらに、そのような細胞は、特定の組織（例えば、肝臓、脾臓、リンパ節、肺等）に由来し得るか、または細胞カテゴリー型（例えば免疫系細胞）、および／もしくは特定の細胞型（例えば、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞）のものであり得る。そのような細胞はまた、Ｔ細胞および／または特定のＴ細胞、例えば調節性Ｔ細胞（例えば、ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＦｏｘＰ３－制御性Ｔ細胞等）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴH１細胞、ＴH２細胞、ＴH３細胞、ＴH１７細胞、ＴH９細胞、ＴFH細胞等であり得る。
【0018】
いくつかの場合において、本明細書では、哺乳動物細胞を増殖させるための方法が提供される。そのような方法は、哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地中で哺乳動物細胞をインキュベートすることを含み得る。
【0019】
そのような培養培地中に存在するリポタンパク質化合物は、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子、ならびに他の種類のリポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含み得る。
【0020】
また、本明細書では、哺乳動物細胞集団のエレクトロポレーションのための方法も提供される。そのような方法は、（ａ）哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、培養培地（例えば無血清培地）中で少なくとも１２時間（例えば、約１２～約１６８時間、約１２～約１５０時間、約１２～約１２０時間、約１２～約１００時間、約１２～約１００時間、約１２～約７２時間、約２４～約９６時間、約４８～約１５０時間、約４８～約９６時間、約７０～約１２０時間等）、哺乳動物細胞集団を１つ以上のリポタンパク質化合物と接触させること、および（ｂ）哺乳動物細胞集団に１つ以上の電気パルスを印加して、それにより哺乳動物細胞集団のメンバーの細胞膜をエレクトロポレーションすることを含み、エレクトロポレーション効率は少なくとも６０％（例えば、約６０％～約１００％、約６０％～約９５％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約７０％～約１００％、約７０％～約９５％、約７０％～約９０％、約８０％～約１００％、約８０％～約９５％等）であり、哺乳動物細胞集団における細胞の生存率は１０％未満（例えば、約０％～約１０％、約０％～約８％、約０％～約７％、約０％～約５％、約３％～約１０％、約３％～約８％、約３％～約６％、約５％～約１０％等）減少する。
【0021】
いくつかの場合において、エレクトロポレーション効率は、哺乳動物細胞集団のメンバーにおけるマーカー（例えば検出可能なマーカー）の発現によって測定され得る。さらに、マーカー（例えば検出可能なマーカー）は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ／Ｆ６４Ｌ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ等）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ等）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＴａｇＢＦＰ等）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ等）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ等）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ２、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等）、または他の適切な蛍光タンパク質であり得る。
【0022】
さらに、本明細書では、活性化されたＴ細胞集団を維持するための方法が提供される。いくつかの場合において、そのような方法は、（ａ）Ｔ細胞の活性化集団を生成すること、（ｂ）リポタンパク質サプリメントの存在下で、ステップ（ａ）において生成されたＴ細胞の活性化集団を増殖させること、（ｃ）ステップ（ｂ）において生成された増殖したＴ細胞の活性化集団を、次の７日間で細胞増殖速度の少なくとも３０％（例えば、約３０％～約１００％、約３０％～約９５％、約３０％～約９０％、約３０％～約８５％、約３０％～約８０％、約５０％～約１００％、約５０％～約９５％、約５０％～約８５％、約６５％～約１００％、約６５％～約９５％、約６０％～約９０％、約７０％～約１００％、約７０％～約９５％、約８０％～約９８％等）の低下をもたらすのに十分な強度の電界に曝露すること、および（ｄ）ステップ（ｂ）と同じ条件下でステップ（ｃ）のＴ細胞の活性化集団を少なくとも５日間（例えば、７日間、約５日～約１２日間、約６日～約１２日間、約６日～約１０日間、約６日～約８日間等）維持することを含み、ステップ（ａ）～（ｄ）の間のＴ細胞の活性化集団の生存率は７０％超（例えば、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７０％～約９８％、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８５％～約１００％等）を維持する。
【0023】
いくつかの場合において、１つ以上の核酸分子（例えば、キメラ抗原受容体をコードする１つ以上の核酸分子）が、ステップ（ｃ）において、Ｔ細胞の活性化集団の個々のＴ細胞に導入され得る。１つ以上の核酸分子がタンパク質（例えばキメラ抗原受容体）をコードする場合、タンパク質は、それらが導入されるＴ細胞内で安定して、または一過的に発現され得る。
【0024】
例えば、上記のように、活性化されたＴ細胞集団を維持するための方法が実践される場合、Ｔ細胞の活性化集団は、上記ステップ（ｂ）において約１日～約６日間（例えば約１日～約６日間、約２日～約６日間、約３日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間等）増殖され得る。
【0025】
さらに、例えば、上記のように、活性化されたＴ細胞集団を維持するための方法は、（ｅ）ステップ（ｄ）後にＴ細胞の活性化集団を洗浄すること、および（ｆ）リポタンパク質サプリメントの非存在下で、ステップ（ｅ）において生成された洗浄されたＴ細胞の活性化集団を増殖させることをさらに含み得る。
【0026】
さらに、多くの場合において、洗浄されたＴ細胞の活性化集団の生存率は、５日間の期間にわたり７０％超（例えば、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７０％～約９８％、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８５％～約１００％等）を維持し、洗浄されたＴ細胞の活性化集団は、少なくとも３倍（例えば、約３倍～約１２倍、約４倍～約１２倍、約５倍～約１２倍、約６倍～約１２倍、約３倍～約１０倍、約５倍～約１１倍等）増殖する。
【0027】
上記のような方法は、高レベルの細胞生存率を維持しながら、細胞の保存および／または輸送を可能にする。したがって、本明細書では、Ｔ細胞の活性化集団がステップ（ｄ）の間に異なる場所（例えば、約１０～約５，０００マイルの場所、約１０～約１００マイルの場所、約５０～約５，０００マイルの場所、約５０～約３，５００マイルの場所、約２００～約３，５００マイルの場所、約３００～約３，５００マイルの場所、約５００～約３，５００マイルの場所、約１，０００～約５，０００マイルの場所等）に輸送される方法もまた提供される。
【0028】
また、哺乳動物細胞（例えばＴ細胞）を保存するための方法が提供される。そのような方法は、（ａ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で哺乳動物細胞を増殖させるステップ、（ｂ）哺乳動物細胞を電界に曝露するステップ、および（ｃ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で哺乳動物細胞を増殖させるステップを含み（例えばこれらのステップをこの順番で含み）、ステップ（ｃ）における哺乳動物細胞は、ステップ（ａ）よりも少なくとも５０％（例えば、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約６０％～約８５％等）低い速度で増殖し、哺乳動物細胞の生存率は、ステップ（ａ）～（ｃ）の間７０％超（例えば、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約７０％～約９８％、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８５％～約１００％等）を維持する。
【0029】
さらに、哺乳動物細胞は、ステップ（ｃ）において約１日～約６日間（例えば、７日間、約１日～約６日間、約２日～約６日間、約３日～約６日間、約１日～約５日間、約１日～約４日間等）増殖され得る。
【0030】
いくつかの場合において、ステップ（ｃ）における哺乳動物細胞は洗浄され、少なくとも５０％（例えば、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約９５％～約１００％、約５０％～約９０％、約６０％～約８０％等）低い濃度の１つ以上のタンパク質化合物を含む培養培地に移され得る。
【0031】
いくつかの場合において、１つ以上の核酸分子（例えば、キメラ抗原受容体をコードする１つ以上の核酸分子）は、ステップ（ｂ）において哺乳動物細胞（例えばＴ細胞）に導入され得る。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】ヒト血清はロット間で不一致を示している。ヒトＴ細胞を、対照ロットのヒト血清と比較していくつかの不適格ロットのヒト血清（「ｈｕＡＢ血清」と表示）を補充した基礎培地で増殖させた。ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）５％ヒト血清を含む培地。成長は、刺激後１０日間にわたり測定された。
【図2】ヒトアポリポタンパク質ＡＩ（配列番号１）のアミノ酸配列、およびこのタンパク質の一部の領域を示す図である。
【図3】ヒトアポリポタンパク質ＡＩＩ（配列番号２）のアミノ酸配列、およびこのタンパク質の一部の領域をアウトラインスタイルのボックスで示す図である。
【図4】８ｍｇ／ＬのＨＤＬを添加したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で培養したＴ細胞（ｎ＝４）の５日目および１０日目の増殖倍率を示す図であり、ＨＤＬは（１）事前配合物として（「Ｔ細胞サプリメント中のＨＤＬ」）、または（２）ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）に直接添加される（それぞれ「Ｔ細胞サプリメント中のＨＤＬ」および「使用時点でのＨＤＬ」）（例１を参照されたい）。これら２つのＨＤＬ添加の増殖倍率を、（１）完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）および（２）５％ヒト血清を含むＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５中のＴ細胞の増殖と比較した。
【図6】（１）ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）およびＨＤＬ、ならびに（２）完全なＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の存在下での１０日目のＴ細胞増殖のＣＤ８＋／ＣＤ４＋比を示す図である（ｎ＝３）。ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）においてＣＤ８＋：ＣＤ４＋比の１．３０倍の変化が見られた。
【図7】（１）ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）およびＨＤＬ、ならびに（２）完全なＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の存在下での１０日目の細胞増殖の表現型を示す図である（ｎ＝４）ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）においてＣＤ２７＋Ｔ細胞の１２％の増加が見られた。ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）においてＣＣＲ７＋Ｔ細胞の１９％の増加が見られた。
【図8】エレクトロポレーションの前に６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ）および完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で増殖させた、５人の異なるドナー（Ｄ０３２、Ｄ０９３、Ｄ１６８、Ｄ２４２およびＤ９３８）からのＴ細胞の生存率の違いを示す図である。完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）におけるＴ細胞生存率は、Ｙ軸でゼロ（０）である。５つすべてのドナー試料のＴ細胞を３日目にエレクトロポレーションした（黒い上向き矢印を参照されたい）。
【図9】図８に示されたデータを使用したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で培養された５人の異なるドナーからのＴ細胞の平均総細胞生存率を示す図である。図８のように、細胞を３日目にエレクトロポレーションした（黒い下向き矢印を参照されたい）。
【図10】ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中での１０日間の期間にわたるＴ細胞の増殖を示す図である。５人のドナーからのＴ細胞を、３日目にエレクトロポレーションした。
【図11】ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で増殖させた５人の異なるドナーからのＴ細胞のエレクトロポレーションから２４時間後のエレクトロポレーション効率を示す図である
【図13】様々な条件下でエレクトロポレーションの前に増殖させた２人の異なるドナーからのＴ細胞のエレクトロポレーション効率を示す図である。これらの増殖条件は次の通りである：（１）ＩＣＳＲを含まず６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（２）ＩＣＳＲを含まず５ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび１ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（３）ＩＣＳＲを含まず４ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび２ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（４）ＩＣＳＲを含まず３ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび３ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（５）ＩＣＳＲを含まず２ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび４ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（６）ＩＣＳＲを含まず１ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび５ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、（７）ＩＣＳＲを含まず６ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、ならびに（８）ＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、ならびに（９）完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）。白抜きの下向き矢印は、２人のドナーで見られる一般的な最高のエレクトロポレーション効率を示す。
【図14】様々な条件下でのＴ細胞の生存率を示す図である。単一ドナー（Ｄ０３２）からのＴ細胞を３日目にエレクトロポレーションした。「ＡＬＬ」と表示されたＴ細胞試料は、エレクトロポレーション前に接触させたのと同じ培養培地中で、１０日間の増殖期間を通して維持された。細胞を洗浄し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培養培地中でエレクトロポレーションした。
【発明を実施するための形態】
【0033】
概要
本明細書では、（１）無血清細胞培養、（２）細胞への核酸分子の導入、および（３）低レベルの細胞増殖での細胞の維持に関連する組成物および方法が部分的に提供される（図１４および１５を参照されたい）。
本明細書では、（１）無血清細胞培養、（２）細胞への核酸分子の導入、および（３）低レベルの細胞増殖での細胞の維持に関連する組成物および方法が部分的に提供される（図１４および１５を参照されたい）。
【0034】
無血清細胞培養に関して、リポタンパク質粒子および／またはリポタンパク質を用いた動物細胞の培養のための組成物および方法が本明細書で提供される。多くの場合において、そのような動物細胞は、血清の存在下で増強された増殖を示す細胞である。
【0035】
細胞への核酸分子の導入に関して、エレクトロポレーション後の細胞生存率およびトランスフェクション効率の増加を可能にする条件下での細胞のエレクトロポレーションのための組成物および方法が本明細書で提供される。いくつかの場合において、本明細書に記載の方法は、リポタンパク質粒子および／またはリポタンパク質を用いた細胞のエレクトロポレーション前のインキュベーションを含む。
【0036】
定義
以下の定義は、本主題を理解する目的、および添付の特許請求の範囲を構築する目的で含まれる。本明細書で使用される略語は、化学および生物学の当該技術分野におけるそれらの従来の意味を有する。
以下の定義は、本主題を理解する目的、および添付の特許請求の範囲を構築する目的で含まれる。本明細書で使用される略語は、化学および生物学の当該技術分野におけるそれらの従来の意味を有する。
【0037】
本明細書で使用される場合、数値または範囲の文脈における「約」という用語は、別段文脈がより限定的な範囲を要求しない限り、列挙または特許請求される数値または範囲の±１０％を意味する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、ワックス、脂肪、油、脂肪酸、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質等を含む。実施形態では、脂質は、アルコール中には溶解するが水中には溶解しないワックス、脂肪、油、脂肪酸、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、またはリン脂質等の物質である。実施形態では、脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、プレノール脂質、糖脂質、またはポリケタイドである。実施形態では、脂質は、ケトアシルまたはイソプレン基を含む。実施形態では、脂質は、ワックスエステルである。実施形態では、脂質は、エイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、リポキシン、レゾルビン、またはエオキシン）である。実施形態では、脂質は、ステロール脂質である。実施形態では、ステロール脂質は、コレステロールまたはその誘導体である。実施形態では、コレステロールは、ｎａｔ－コレステロールおよび／またはｅｎｔ－コレステロールである。
【0039】
本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和のいずれかの、多くの場合長い脂肪族尾部を有するカルボン酸（または有機酸）を指す。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも４個の炭素原子長の炭素－炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも８個の炭素原子長の炭素－炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素原子長の炭素－炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、４～２４個の炭素原子長の炭素－炭素結合鎖を有する。実施形態では、脂肪酸は、天然に存在する脂肪酸である。実施形態では、脂肪酸は、人工のものである（例えば、天然には産生されない）。実施形態では、天然に存在する脂肪酸は、偶数個の炭素原子を有する。実施形態では、天然に存在する脂肪酸の生合成は、２個の炭素原子を有するアセテートに関与する。実施形態では、脂肪酸は、遊離状態（エステル化されていない）であっても、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル－ＣｏＡ（チオエステル）結合、または他の結合形態等のエステル化された形態であってもよい。実施形態では、脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態等のリン脂質としてエステル化されてもよい。実施形態では、脂肪酸または脂肪酸の誘導体は、遊離脂肪酸、本明細書に開示される脂肪酸のエステル（例えば、メチル、エチル、プロピル等）、モノ、ジ、もしくはトリグリセリド（例えば、グリセロールエステル）、アルデヒド、アミド、またはリン脂質バージョンである。「飽和脂肪酸」は、いかなる二重結合または鎖に沿った他の官能基も含有しない。「飽和」という用語は、すべての炭素（カルボン酸［－ＣＯＯＨ］基を除く）が可能な限り多くの水素を含有するという点で、水素を指す。換言すると、オメガ末端は、３個の水素（ＣＨ３－）を含有し、鎖内の各炭素は、２個の水素（－ＣＨ２－）を含有する。「不飽和脂肪酸」では、鎖に沿って１つ以上のアルケン官能基が存在し、各アルケンは、鎖の単結合の「－ＣＨ２－ＣＨ２－」部分を二重結合の「－ＣＨ＝ＣＨ－」部分（つまり、別の炭素に二重結合した炭素）で置換する。二重結合のいずれかの側に結合している鎖内の次の２個の炭素原子は、シスまたはトランス配置で発生し得る。脂肪酸の非限定的な例の表は、以下の通りである。
【表1】
【0040】
本明細書で使用される場合、「リポタンパク質サプリメント」という用語は、１つ以上のリポタンパク質化合物を含み、細胞培養培地に添加され得る材料を指す。リポタンパク質サプリメントに存在し得るリポタンパク質化合物の例には、リポタンパク質粒子、アポリポタンパク質およびその下位部分、合成ＨＤＬ粒子、血液（例えばヒト血液）から単離されたＨＤＬ、ならびに１つ以上のリポタンパク質のみ、または１つ以上の脂質および／または１つ以上の脂肪酸との組み合わせの混合物が含まれる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「リポタンパク質粒子」という用語は、脂質（例えば、コレステロールおよびトリグリセリド）、ならびに他の分子を運搬する分子集合体を指す。多くの場合、リポタンパク質粒子はリン脂質およびコレステロールの外層を有し、親水性部分は周囲の水に向かって外側に配向し、各分子の親油性部分は粒子内の脂質分子に向かって内側に配向している。アポリポタンパク質は、外層に埋め込まれている。したがって、複合体は脂肪を乳化するのに役立つ。リポタンパク質粒子の例には、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質、中間密度リポタンパク質、および超低密度として分類される血漿リポタンパク質粒子が含まれる。リポタンパク質粒子はまた、合成的に生成され得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「高密度リポタンパク質」（ＨＤＬ）粒子という用語は、リポタンパク質の主要な群の１つを指す。ＨＤＬ粒子は組成が不均一であり、典型的には、粒子当たり８０～１００個のタンパク質分子で構成され、数百の脂質分子で構成されている場合もある。天然ＨＤＬ粒子には多くの様々な種類があるが、これらの粒子は、典型的にはアポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＩＶ、アポリポタンパク質－ＣＩ、アポリポタンパク質ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｄ、およびアポリポタンパク質Ｅを含むいくつかの種類のアポリポタンパク質を含む。ＨＤＬ粒子は、多くの場合約５５％のタンパク質、３％～１５％のトリグリセリド、２６％～４６％のリン脂質、１５％～３０％のコレステリルエステル、および２％～１０％のコレステロールで構成される。ＨＤＬ粒子のタンパク質の約７０％は、典型的にはアポリポタンパク質ＡＩである。
【0043】
電気泳動移動に基づいて、ＨＤＬ粒子は一般に３つのサブタイプに分類され得る。これらのサブタイプは、（１）α移動種（例えば、球状ＨＤＬ２およびＨＤＬ３）、（２）β移動種（例えば、プレβ円盤状ＨＤＬ、低脂質ＡＰＯ－ＡＩ、および遊離ＡＰＯ－ＡＩ）、ならびに（３）γ移動種である。
【0044】
本明細書で使用される場合、「アポリポタンパク質ＡＩ」（ＡＰＯ－ＡＩ）という用語は、約３１ｋＤａの分子量を有し、アスパラギン酸をＨＤＬ粒子に見られるＮ末端残基として、およびグルタミン酸をＣ末端残基として有する２６７アミノ酸からなるヒト細胞において発現される（すなわち処理前に）タンパク質を指す（例えば図２を参照されたい）。５．６のｐＩを有する１つの主要なＡＰＯ－ＡＩタンパク質アイソフォーム、５．５３および５．４６のｐＩを有する２つの副次的なアイソフォーム、および４つもの追加のアイソフォームがある。このタンパク質は、α－ヘリックス構造を多く含んでいる。他の生物からの関連タンパク質もこの用語の範囲に含まれる。
【0045】
ＡＰＯ－ＡＩは、Ｎ末端で約１アミノ酸～約３０アミノ酸（例えば、約１アミノ酸～約２６アミノ酸、約１アミノ酸～約２５アミノ酸、約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約１９アミノ酸、約１０アミノ酸～約３０アミノ酸、約１０アミノ酸～約２６アミノ酸、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸、約１０アミノ酸～約１９アミノ酸、約１９アミノ酸～約３０アミノ酸、約１９アミノ酸～約２６アミノ酸、約１８アミノ酸～約２６アミノ酸等）で切り詰めることができる。
【0046】
本明細書で使用される場合、「基礎培養培地」という用語は、特定の細胞型の増殖を改善するために追加の成分（例えば、血清、血清置換物等）が補充され得る細胞培養培地を指す。基礎培地は、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、ならびに炭水化物源を含む多くの成分を含み得る。各成分は、細胞の培養を補助する量で存在することができ、そのような量は、当業者に一般的に知られている。基礎培地はまた、緩衝物質（重曹等）、抗酸化剤、機械的ストレスに対抗する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤等の追加の物質を含んでもよい。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓから入手可能な例示的な基礎培地には、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（カタログ番号１２４９１－０１５）、ＣＴＳ（商標） ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ（カタログ番号Ａ１２８６１－０１）、ＤＭＥＭ、高グルコース（カタログ番号１１９６５－０８４）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（カタログ番号１２６３４－０１０）、ＣＴＳ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（カタログ番号Ａ１３７０８－０１）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（カタログ番号１１３２０－０３３）、ＩＭＥＭ（改良最小必須培地）（カタログ番号Ａ１０４８９－０１）、ＩＭＤＭ（カタログ番号１２４４０－０４６）、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ－１５培地（カタログ番号１１４１５－０６４）、ＭｃＣｏｙの５Ａ（改変）培地（カタログ番号１６６００－０８２）、ＭＣＤＢ１３１培地（カタログ番号１０３７２－０１９）、培地１９９（カタログ番号１１１５０－０６７）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（カタログ番号１２４９２－０１３）、フィッシャー培地（カタログ番号２１４７５－０２５）、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０培地（カタログ番号１２６３３－０１２）、ＲＰＭＩ１６４０培地（カタログ番号１１８７５－０８５）、およびＷｉｌｌｉａｍのＥ培地（カタログ番号１２５５１－０３２）が含まれる。
【0047】
本明細書で使用される場合、「血清置換物」という用語は、血清が増殖を増強する細胞の増殖を増強するために血清の代わりに使用され得る組成物を指す。血清代替物は、多くの場合、脂質等の成分の混合物を含む。血清代替物の例には、ＣＴＳ（商標）免疫細胞ＳＲ（ＩＣＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ２５９６１０１およびＡ２５９６１０２）、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０８２８０２８）、Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ １（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｓ０６３８）、およびＳｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ、カタログ番号ＳＲ１００）が含まれる。
【0048】
血清置換物は、それらの成分において包括的である必要はない。したがって、追加の成分（例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）等の１つ以上のサイトカイン）が、１つ以上の血清置換物に加えて基礎培地に添加されてもよい。
【0049】
「免疫細胞」という用語は、免疫系の一部であってもよく、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、先天性リンパ系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、間葉系幹細胞もしくは間葉系間質細胞（ＭＳＣ）、単球またはマクロファージ等の特定の機能を実行する細胞を指す。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＩＬＣ、ＣＩＫ細胞、ＬＡＫ細胞、ガンマデルタＴ細胞等の細胞毒性機能を持つ免疫細胞も含まれます。「免疫細胞」の範囲には、（ａ）Ｔｈ１ Ｔ細胞、（ｂ）Ｔｈ２ Ｔ細胞、（ｃ）Ｔｈ１７ Ｔ細胞、（ｄ）Ｔｈ２２ Ｔ細胞、（ｅ）調節性Ｔ細胞、（ｆ）ナイーブＴ細胞、（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞、（ｈ）中央記憶Ｔ細胞、（ｉ）エフェクター記憶Ｔ細胞、（ｊ）組織に存在する記憶Ｔ細胞、および（ｋ）仮想メモリーＴ細胞からなる群から選択され得るＴ細胞サブセットも含まれる。
【0050】
本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、測定可能な形態的、表現型的、および／または機能的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分のライゲーションの後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈において、そのような活性化は、細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態であり得る。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および／または分泌、ならびに受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現の上方制御もしくは下方制御、またはある特定の分子の分泌の上方制御もしくは下方制御、ならびに制御性または細胞溶解性機能の実行も誘導し得る。他の細胞の文脈において、この用語は、特定の物理化学プロセスの上方制御もしくは下方制御のいずれかを暗示する。
【0051】
実施形態では、刺激は、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を含む。例えば、受容体の文脈において、そのような刺激は、受容体のライゲーションおよびその後のシグナル伝達事象を伴い得る。実施形態では、Ｔ細胞の培養は、Ｔ細胞を刺激することを含む。Ｔ細胞の刺激に関して、そのような刺激は、一実施形態では、その後にＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合等のシグナル伝達事象を誘導するＴ細胞表面部分のライゲーションを指す。実施形態では、刺激事象は、細胞を活性化し、受容体もしくは接着分子等の細胞表面分子の発現を上方制御もしくは下方制御し得るか、または分子の分泌を上方制御もしくは下方制御し得、例えば腫瘍成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）を下方制御し得る。活性化に使用され得るリガンドは、抗体を含む。そのような抗体は、任意の種、クラス、またはサブタイプの抗体であってもよいが、ただし、そのような抗体は、必要に応じて、対象となる標的、例えば、ＣＤ３、ＴＣＲ、またはＣＤ２８と反応することができる。
【0052】
本明細書に記載の方法（例えば、Ｔ細胞活性化、免疫細胞精製等）で使用するための「抗体」は、以下を含む。
【0053】
（ａ）免疫グロブリンの様々なクラスまたはサブクラスのいずれか（例えば、任意の動物、例えば従来使用される動物のいずれか、例えばヒツジ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ラクダ類、または卵黄由来のＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ）、
（ｂ）モノクローナルまたはポリクローナル抗体、
（ｃ）モノクローナルであるかポリクローナルであるかに関わらず、無傷抗体または抗体の断片（この断片は、抗体の結合領域を含有するもの、例えば、Ｆｃ部分を欠く断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＶHＨ、または他の単一ドメイン抗体）、無傷抗体内の重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元開裂によって得られるいわゆる「半分子」断片である）。Ｆｖは、２つの鎖として発現した、軽鎖の可変領域、および重鎖の可変領域を含有する断片と定義され得る。
（ｂ）モノクローナルまたはポリクローナル抗体、
（ｃ）モノクローナルであるかポリクローナルであるかに関わらず、無傷抗体または抗体の断片（この断片は、抗体の結合領域を含有するもの、例えば、Ｆｃ部分を欠く断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ＶHＨ、または他の単一ドメイン抗体）、無傷抗体内の重鎖成分を接続するジスルフィド結合の還元開裂によって得られるいわゆる「半分子」断片である）。Ｆｖは、２つの鎖として発現した、軽鎖の可変領域、および重鎖の可変領域を含有する断片と定義され得る。
【0054】
（ｄ）モノクローナル抗体、抗体の断片、「ヒト化抗体」、キメラ抗体、または合成的に作製もしくは変更された抗体様構造体を含む、組換えＤＮＡまたは他の合成技術によって生成または修飾された抗体。
【0055】
抗体、例えば、一本鎖抗体、ＣＤＲ移植抗体等の機能的誘導体または「等価物」もまた含まれる。一本鎖抗体（ＳＣＡ）は、融合した一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって結合された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する、遺伝子操作された分子と定義され得る。
【0056】
本明細書で使用される場合、「分離」という用語は、（例えば、濾過、親和性、浮遊密度、または磁気引力によって）１つの成分を別の成分から実質的に精製する任意の手段を含む。
【0057】
本明細書で使用される場合、「精製する」または「精製された」という用語は、混合物の成分の量を１つ以上の他の成分よりも増強することを指す。例として、Ｔｒｅｇ細胞がＴ細胞の混合集団に存在し、Ｔｒｅｇ細胞が集団の５％を表し、他のすべてのＴ細胞が総Ｔ細胞集団の９５％を表すと仮定する。集団の２０％をＴｒｅｇ細胞とし、他のＴ細胞が総Ｔ細胞集団の８０％となるプロセスが実行された場合、Ｔｒｅｇ細胞は「精製」されている。典型的には、Ｔ細胞サブセット（または他の細胞型）が精製されると、Ｔ細胞サブセット（または他の細胞型）の比率は少なくとも２倍増加する（例えば、１：１０の比率から１：５の比率）（例えば、約２倍～約１００倍、約２倍～約１００倍、約２倍～約１００倍、約５倍～約１００倍、約８倍～約１００倍、約１５倍～約１００倍、約１０倍～約４０倍等）。
【0058】
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、抗体等のポリペプチドが精製目的で付着され得る任意の固相材料を指す。したがって、「固体支持体」という用語は、樹脂、マルチウェルプレートのウェル、および様々なタイプのビーズを含む。いくつかの実施形態において、固体支持体の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、または表面の形態である。いくつかの実施形態において、表面は、平面、実質的に平面、または非平面である。いくつかの実施形態において、固体支持体は、多孔性または非多孔性であってもよい。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ウェル、くぼみ、または他の容器の形態で構成され得る。いくつかの実施形態において、固体支持体は、天然多糖、合成ポリマー、無機材料、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、固体支持体はビーズであってもよい。いくつかの実施形態において、そのようなビーズは、架橋ポリスチレンマトリックスとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのグラフトコポリマーである樹脂を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるビーズは、磁性であってもよい。例えば、ビーズの磁化により、自動処理技術を使用してビーズを洗浄および操作することができる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「磁性ビーズ」は、１つ以上の金属またはその酸化物または水酸化物を含む磁気応答性粒子を指す。対象となる磁気応答性材料は、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、およびメタ磁性材料を含む。いくつかの実施形態において、これらの粒子が水性媒体中に分散または懸濁され、磁場の印加によって分散液または懸濁液から分離される能力を有する限り、任意の磁気ビーズが使用される。いくつかの実施形態において、磁性ビーズは、例えば、鉄、コバルトまたはニッケルの塩、酸化物、ホウ化物または硫化物；および磁化率の高い希土類元素（ヘマタイトおよびフェライト等）を含む。磁性ビーズの具体例としては、鉄、ニッケル、コバルト等が挙げられる。
【0060】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」という用語は、その表面上に共受容体ＣＤ８を提示するＴ細胞を指す。ＣＤ８は、特定の抗原を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての役割を果たす膜貫通糖タンパク質である。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は、主要組織適合性複合体Ｉ（ＭＨＣ Ｉ）分子に結合する。実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、（細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔキラー細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としても知られる）細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞抑制因子とも称される制御性ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【0061】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」という用語は、その表面上に共受容体ＣＤ４を提示するＴ細胞を指す。ＣＤ４は、特定の抗原を認識することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての役割を果たす膜貫通糖タンパク質である。実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫プロセスにおいて、他の白血球細胞を支援する。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原に提示されたときに活性化される。一旦活性化された後、それらは、急速に分裂し、サイトカインと呼ばれる小タンパク質（これは、能動的な免疫応答を制御または支援する）を分泌する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができ、これらは、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を促進する。ＡＰＣからのシグナル伝達は、Ｔ細胞を特定のサブタイプへと指向する。実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞である。
【0062】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲ（複数）」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞等のＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせ）に移植する、操作された受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原特異的標的化ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、ＣＡＲが２つの異なる抗原を標的化する場合、抗原特異的標的化ドメインは、直列に配置され得る。実施形態では、ＣＡＲが２つの異なる抗原を標的化する場合、抗原特異的標的化ドメインは、直列に配置され、リンカー配列により分離され得る。
【0063】
ＣＡＲは、免疫細胞（例えば、活性化Ｔ細胞等のＴ細胞）に任意の特異性を移植する操作された受容体である。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性を免疫細胞に移植するために使用されるが、それらのコード配列の移入は、レトロウイルスベクターによって促進される。受容体は、キメラと呼ばれるが、これは、それらが異なる源に由来する部分で構成されているためである。ＣＡＲは、養子細胞移入によるがんの療法として使用することができる。Ｔ細胞を患者から取り出し、それらが患者の特定のがんに特異的な受容体を発現するように修飾する。がん細胞を認識および殺滅するＴ細胞を、患者に再導入する。実施形態では、患者以外のドナーから供給されたＴ細胞の修飾を使用して、患者を治療することができる。
【0064】
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入を使用して、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を操作して、任意の腫瘍関連抗原を標的化することができる。患者のＴ細胞を収集した後、患者に注入して戻す前に、細胞を遺伝子操作して、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に指向されたＣＡＲを発現するようにする。
【0065】
がん免疫療法のためにＣＡＲ－Ｔ細胞を操作するためのいくつかの方法は、導入遺伝子を宿主細胞ゲノムに組み込む、レトロウイルス、レンチウイルス、またはトランスポゾン等のウイルスベクターを使用する。あるいは、プラスミドまたはｍＲＮＡ等の非組み込みベクターを使用してもよいが、これらの種類のエピソームＤＮＡ／ＲＮＡは、細胞分裂を繰り返した後に失われる可能性がある。結果として、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、最終的にそれらのＣＡＲ発現を失う可能性がある。別のアプローチでは、そのゲノムに組み込まれることなく、Ｔ細胞内で安定して維持されるベクターが使用される。この戦略は、挿入変異原性または遺伝毒性のリスクを有することなく、長期的な導入遺伝子発現を可能にすることが見出されている。
【0066】
本明細書で使用する場合、「相同組換え」という用語は、類似のヌクレオチド配列を含む２つのＤＮＡ鎖がゲノム物質を交換する、遺伝子組換えの機序を指す。細胞は減数分裂中に相同組換えを使用し、ＤＮＡを再配列して、完全に固有の一倍体染色体のセットを創出する働きをするが、損傷したＤＮＡの修復、特に二本鎖破断の修復にも役立つ。相同組換えの機序は当業者に周知であり、例えば、ＰａｑｕｅｓおよびＨａｂｅｒ（Ｐａｑｕｅｓ Ｆ，Ｈａｂｅｒ Ｊ Ｅ．；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６３：３４９－４０４（１９９９））により説明されている。本明細書に示される方法では、相同組換えは、該標的配列内の連続ＤＮＡ配列に相同である該ドナーＤＮＡ配列のそれぞれ上流（５´）および下流（３´）に配置されている該第１および該第２の隣接エレメントの存在により可能になる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「非相同末端接合」（ＮＥＨＪ）という用語は、相同性からほとんど独立したプロセスを介して二本鎖破断（ＤＳＢ）の２つの末端を接合する細胞プロセスを指す。天然ＤＳＢは、複製フォークが損傷したテンプレートに遭遇したときのＤＮＡ合成の間に、およびＶ（Ｄ）Ｊ組換え、免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座でのクラススイッチ組換え、および減数分裂を含む、ある特定の特殊な細胞プロセスの間に、自然に生成される。加えて、電離放射線（Ｘ線およびガンマ線）、ＵＶ光、トポイソメラーゼ毒、または放射性類似薬に細胞をさらすと、ＤＳＢが生成され得る。ＮＨＥＪ（非相同末端接合）経路は、相同性からほとんど独立したプロセスを介してＤＳＢの２つの末端を接合する。ＤＳＢで生成される特定の配列および化学修飾に応じて、ＮＨＥＪは正確であっても、変異原性であってもよい（Ｌｉｅｂｅｒ Ｍ Ｒ．，Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａｉｒ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９：１８１－２１１）。
【0068】
本明細書で使用する場合、「ドナーＤＮＡ」または「ドナー核酸」は、相同組換えにより遺伝子座に導入されるように設計された核酸を指す。ドナー核酸は、多くの場合、遺伝子座と配列相同性の少なくとも１つ領域を有することになる。多くの場合において、ドナー核酸は、遺伝子座と配列相同性の２つの領域を有することになる。これらの相同性の領域は、一方または両方の末端にあっても、ドナー核酸分子の内部にあってもよい。多くの場合において、細胞に存在する核酸分子に導入することが望まれる核酸を有する「挿入」領域は、相同性の２つの領域の間に位置することになる。
【0069】
細胞培養組成物
任意の数の細胞培養配合物を使用して本明細書に記載の組成物を調製することができ、および／または本明細書に記載の方法で使用することができる。
任意の数の細胞培養配合物を使用して本明細書に記載の組成物を調製することができ、および／または本明細書に記載の方法で使用することができる。
【0070】
細胞培養組成物は、多くの場合、本質的にモジュール式になるように設計されている。１つの形態は、基礎培地が調製され、１つ以上のサプリメントが、特定の細胞型および／または用途のために基礎培地に添加される場合である。また、個々の成分（例えば、成長因子、サイトカイン等）を培地製剤に添加することができる。したがって、多くの場合において、かなり一般的な基礎培地が、いくつかの特定の用途のために改変され得る。
【0071】
哺乳動物細胞培養培地を含む培養培地に含まれる成分は、アミノ酸、ビタミン、グルコース、緩衝液、塩、ミネラル、ｐＨ指示薬（例えばフェノールレッド）、脂肪酸、ステロール（例えばコレステロール）、タンパク質／ペプチド（例えば血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子、インターロイキン－２、ホルモン等）、およびシクロデキストリン等の脂肪酸担体を含む。培養培地におけるシクロデキストリンの使用は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／０５５８５３に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0072】
基礎培地
かなりの数の基礎培地が何年にもわたって開発されてきた。基礎培地は、多くの場合、細胞増殖のための基本的な材料を含む。これらは、ビタミンおよびミネラルを含む。また、グルコース等の炭素源が存在することが多いが、追加することもできる。
かなりの数の基礎培地が何年にもわたって開発されてきた。基礎培地は、多くの場合、細胞増殖のための基本的な材料を含む。これらは、ビタミンおよびミネラルを含む。また、グルコース等の炭素源が存在することが多いが、追加することもできる。
【0073】
基礎培地は、一般的に、細胞の種類、起源（動物種）、および培養の目的に基づいて、それぞれの場合で設計される。したがって、基礎培地の組成は、そのような要因に応じて大きく異なる可能性がある。
【0074】
基礎培地の一例はＤＭＥＭ／Ｆ－１２である。この培地の配合を以下の表２に示す。当然ながら、これは基礎培地の一例にすぎない。
【表2】
【0075】
培養培地サプリメント
本明細書の他の場所に示されているように、特定の目的のために基礎培地に追加が行われてもよい。基礎培地へのこれらの追加は、一般に、特定の目的を達成するために行われる。目的には、特定の細胞型の増殖、混合細胞集団における１つ以上の特定の細胞型の優先的増殖、１つ以上の特定の細胞型の増殖速度の増加、混合培養物中に存在する１つ以上の細胞型の細胞生存率の向上等を可能にすることが含まれる。
本明細書の他の場所に示されているように、特定の目的のために基礎培地に追加が行われてもよい。基礎培地へのこれらの追加は、一般に、特定の目的を達成するために行われる。目的には、特定の細胞型の増殖、混合細胞集団における１つ以上の特定の細胞型の優先的増殖、１つ以上の特定の細胞型の増殖速度の増加、混合培養物中に存在する１つ以上の細胞型の細胞生存率の向上等を可能にすることが含まれる。
【0076】
サプリメントは、多くの場合、１つ以上の培地で使用するために配合され、それらの培地が少なくとも１つの目的を満たすことができるようにする。培養培地サプリメントに含まれ得るいくつかの成分には、（１）血清および組織タンパク質および抽出物（例えば、胎児ウシ血清タンパク質、ウシ下垂体抽出物）、（２）動物由来（例えば、動物組織、乳）、微生物由来（酵母）および／または植物由来（大豆、小麦、米）であり得る加水分解物、（３）成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ）、（４）ホルモン（例えば、成長ホルモン、インスリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、プロラクチン、濾胞刺激ホルモン、ガストリン放出ペプチド）、（５）キャリアタンパク質（例えば、アルブミン、トランスフェリン、ラクトフェリン等）、（６）脂質および関連分子、例えばコレステロール、ステロイド、脂肪酸（例えば、パルミテート、ステアレート、オレエート、リノレエート）、エタノールアミン、コリン、イノシトール等、（７）金属（例えば、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｃｒ、Ｉ、Ｃｏ、Ｓｅ、Ｍｎ、Ｍｏ等）、（８）ビタミン（例えば、脂溶性ビタミン（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）、水溶性ビタミン（例えば、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ6、Ｂ12、Ｃ、葉酸）、（９）ポリアミン、例えばプトレシン、スペルミジン、およびスペルミン、（１０）還元剤、例えば２－メルカプトエタノール、α－チオグリセロール、還元型グルタチオン、（１１）保護剤／洗剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、Ｔｗｅｅｎ８０等）、（１２）接着因子、例えばフィブロネクチンおよびラミニン、ならびに（１３）これらの成分の組み合わせが含まれる。
【0077】
血清代替物
本明細書の他の場所で述べられているように、一般に、細胞培養系における動物血清の使用を避けたいという要望がある。さらに、細胞培養培地は、細胞培養のために血清を必要としないように配合され得るか、または血清代替物が培養培地に添加され得るようにモジュール方式で配合され得る。
本明細書の他の場所で述べられているように、一般に、細胞培養系における動物血清の使用を避けたいという要望がある。さらに、細胞培養培地は、細胞培養のために血清を必要としないように配合され得るか、または血清代替物が培養培地に添加され得るようにモジュール方式で配合され得る。
【0078】
多くの血清代替物が開発されている。これらには、Ｇｉｂｃｏ（商標）ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１０８２８０１０）およびＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲが含まれる。
【0079】
血清代替物は、動物起源不含および／またはイムノグロビン不含であってもよい。
【0080】
さらに、血清代替物は、特定の細胞型（例えば、ヒト胎児幹細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、１つ以上のＴ細胞サブタイプ、Ｂ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＨＥＫ細胞等）の培養のために配合され得る。
【0081】
リポタンパク質サプリメント
本明細書の他の場所で説明されているように、細胞組成物へのリポタンパク質サプリメントの添加から有益な結果を得ることができることが見出された。
本明細書の他の場所で説明されているように、細胞組成物へのリポタンパク質サプリメントの添加から有益な結果を得ることができることが見出された。
【0082】
さらに、本明細書に提示されるデータは、リポタンパク質およびリポタンパク質粒子が血清代替物として作用し得ることを示している。このような血清代替物の例は、次の成分が示された量で培養培地中に存在するように基礎培養培地に配合および添加された配合物である：ＨＤＬ（０．００８ｇ／Ｌ）、Ｎ－アセチルＬシステイン（０．３５３ｇ／Ｌ）、エタノールアミンＨＣｌ（０．０１０８ｇ／Ｌ）、ヒトアルブミン（２１．５７５ｇ／Ｌ）、塩化カリウム（０．００００２１６ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０００００５４０ｇ／Ｌ）、リン酸ナトリウム、二塩基性、７Ｈ2Ｏ（０．０００２３３ｇ／Ｌ）、リン酸カリウム、一塩基性（０．００００２１６ｇ／Ｌ）、および塩化ナトリウム（０．０００８６３ｇ／Ｌ）（例１を参照されたい）。本明細書で論じられるように、ＨＤＬは、そのような培養培地において、他のリポタンパク質粒子および／または１つ以上のリポタンパク質（例えば、ＡＰＯ－ＡＩおよび／またはＡＰＯ－ＡＩＩ）で置き換えることができる。
【0083】
リポタンパク質サプリメントは、任意の数の形態であり得、またいくつかの異なる成分を含み得る。そのような成分の例には、１つ以上のアポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ（例えば、ＡＰＯ－ＡＩ、ＡＰＯ－ＡＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩＶ、アポリポタンパク質ＡＶ）、アポリポタンパク質Ｂ（例えば、アポリポタンパク質Ｂ４８、アポリポタンパク質Ｂ１００）、アポリポタンパク質Ｃ（例えば、アポリポタンパク質ＣＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ）、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ（例えば、アポリポタンパク質Ｅ－ＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ－ＩＶ）、アポリポタンパク質Ｆ、アポリポタンパク質Ｇ、および／またはアポリポタンパク質Ｈ）が含まれる。
【0084】
リポタンパク質サプリメントは、動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、チンパンジー、アフリカミドリザル、ニワトリ等）から得られたリポタンパク質粒子を含み得る。リポタンパク質サプリメントは、生物の外部で生成されるリポタンパク質粒子（すなわち合成リポタンパク質粒子）を含み得る。
【0085】
リポタンパク質粒子の精製方法は知られている。ＬＤＬ粒子を精製するための１つの方法は次の通りである。ＬＤＬ粒子は、以下のように３００ｍｌのヒト血漿から単離され得る。１００ｍＭのＥＤＴＡを３ｍｌの血漿に添加する。次いで、混合物を１２℃で２０分間、４１，０００×Ｇで遠心分離する。白色の上層を廃棄し、下層を新しい管に移す。次いで、管を１２℃で２４時間、２８０，０００×Ｇで再度遠心分離する。下層を混合し、緑がかったペレットをそのまま残す。次いで、下位レベルを収集し、ペレットを廃棄する。収集されたＬＤＬ－血漿の密度を、臭化カリウム（ＫＢｒ）を使用して１．０６に調節する。次いで、溶液を１２℃で４８時間、１６５，０００×Ｇで遠心分離する。最上部の画分には、精製されたＬＤＬ粒子が含まれている。ＬＤＬ粒子は、使用するまで窒素下、暗所、４℃で保管され得る。
【0086】
ＷｅｉｂｅおよびＳｍｉｔｈ（“Ｓｉｘ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３１：７４６－７５０（１９８５））は、血清からＨＤＬ粒子を得るためのいくつかの異なる方法を説明および比較している。
【0087】
リポタンパク質粒子はまた、商業的供給源から入手することができる。例として、ヒト血液からのＨＤＬおよびＬＤＬ粒子は、Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（それぞれカタログ番号３６１－１０－０．１および３６０－１０－０．１）、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（それぞれカタログ番号ＰＲＯ－５５９およびＰＲＯ－５６２）から購入され得る。
【0088】
合成リポタンパク質粒子を製造するための多くの方法が開発されている。１つのそのような方法は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｒｏｕｔｅ ｏｆ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ”，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，５８：１２４－１３６（２０１７）に示されている。この論文では、薄膜水和法による合成ＨＤＬ粒子。簡単に説明すると、リン脂質１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）を、２０ｍｇ／ｍｌでクロロホルムに溶解した。ＡＰＯ－ＡＩ模倣ペプチド２２Ａ、ＰＶＬＤＬＦＲＥＬＬＮＥＬＬＥＡＬＫＱＫＬＫ（配列番号３）を、１０ｍｇ／ｍｌでメタノール：水（１：１の体積比）に溶解した。ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、および２２Ａを、４ｍｌのガラスバイアル内で様々な重量比で混合し、５秒間ボルテックスした。次いで、混合物を窒素ガス流によって乾燥させ、次いで一晩真空オーブンに入れて残留溶媒を除去した。得られた脂質フィルムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）（２２Ａの最終濃度＝１５ｍｇ／ｍｌ）で水和し、ボルテックスした。懸濁液をバス型ソニケーターで５分間、次いでプローブ型ソニケーターで断続的に（５０Ｗ×１０Ｓ×１２サイクル）ホモジナイズし、透明または半透明の２２Ａ－ｓＨＤＬ溶液を形成した。
【0089】
合成ＬＤＬ（ｓＬＤＬ）の製造方法も開発されている（例えば、Ｈａｙａｖｉ ａｎｄ Ｈａｌｂｅｒｔ，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｏｗ－Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｌｉｐｉｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２１：１２６２－１２６８（２００５）を参照されたい）。１つのそのような方法では、ホスファチジルコリン、トリオレイン、およびコレステリルオレエートの３：２：１モル比を、ジクロロメタンおよびコレステロール、ならびに次のＮ末端からＣ末端への配列を有する合成ペプチドの混合物に溶解した：レチノイン酸－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－コレステロール（配列番号４）またはレチノイン酸－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号５）。これらのペプチドは、１モル当たり様々なモル濃度でオレイン酸コレステリルと混合された。次いで、ジクロロメタンをオレイン酸ナトリウムの水溶液に添加し、ＥｍｕｓｉＦｌｅｘ－Ｃ５マイクロフルイダイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｃａｎａｄａ）を使用して最大３０，０００ｐｓｉの圧力で４℃で混合した。次いで、混合物の有機溶媒成分を、室温で蒸発により除去した。
【0090】
また、０．０３ｍｏｌ／ｍｏｌコレステリルエステルでの純粋なオレイン酸コレステリルおよびトリオレインおよびレチン酸－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－コレステロール（配列番号４）の代わりに、対応するコレステリルエステルおよびトリグリセリドの以下の比率、オレイン酸（２１：４１）／リノール酸（５０：１５）／パルミチン酸（１２：２５）／アラキドン酸（６：１．３）／ステアリン酸（０：５．７）を使用して、上記のように混合ｓＬＤＬ（ｓＬＤＬ（混合））脂肪酸系を調製した。
【0091】
培養培地組成物に添加され得るアポリポタンパク質模倣ペプチドは、表３に示される１つ以上のペプチドを含む。さらに、そのようなペプチドを含むタンパク質、ならびに他のアポリポタンパク質模倣ペプチドもまた、培養培地組成物に添加され得る。そのようなタンパク質は、表３に示されるペプチドのサイズより大きくてもよく、例えば、約１５～約２５０（例えば、約１５～約２５０、約２０～約２５０、約３０～約２５０、約４０～約２５０、約６０～約２５０、約２０～約２００、約２０～約１５０、約３０～約１２０等）アミノ酸の長さであってもよい。さらに、アポリポタンパク質模倣タンパク質は、表３に示される１つ以上のペプチドのコンカテマー、および他のアポリポタンパク質模倣ペプチドを含み得る（表４を参照されたい）。
【表3】
【表4】
【0092】
ペプチドおよびタンパク質が培養培地で使用される場合、これらの分子は、化学合成または組換え等の方法によって生成され得る。これは、動物起源不含細胞培養が望まれる場合に特に望ましいであろう。
【0093】
組換えタンパク質の生成は、当技術分野において周知である。さらに、組換えタンパク質は、動物起源ではない細胞に存在し得る。
【0094】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、植物細胞等の非動物である。培養で容易に成長する植物細胞の例には、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（クレス）、Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔ．ｃｕｓｐｉｄａｔａ、Ｔ．ｂａｃｃａｔａ、Ｔ．ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａおよびＴ．ｍａｉｒｅｉ（イチイ）、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ（ツルニチニチソウ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（ナス科）、ＮＴ－１やＢＹ－２等のタバコ細胞株を含むＮ ｔａｂａｃｕｍ（タバコ）（ＮＴ－１細胞はＡＴＣＣ、Ｎｏ．７４８４０から入手可能、米国特許第６，１４０，０７５号も参照されたい）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（コメ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（スイートリーフ）、Ｓｔｉｚｏｌｏｂｉｕｍ ｈａｓｓｊｏｏ（スベリヒユ（ｐｕｒｓｅｌａｎｅ））、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、およびＺｅａ ｍａｙｓ ｓｐｐ．（トウモロコシ／コーン）が含まれる。組換えタンパク質の生成に使用され得る追加の宿主細胞の例には、次の属の生物が含まれる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｈａｃｅｌｏｍａ、ＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ。このような属の代表的な種には、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｔｉｇｒｉｎｕｓ、Ｌａｅｔｉｐｏｒｕｓ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｕｒｕｌａ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ、Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ／Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが含まれる。
【0095】
細胞培養
本明細書では、細胞（例えばＴ細胞）の培養のためのワークフロー、組成物、および方法が提供される。本明細書に記載の方法は、培養中の細胞が急速な分裂時間で高レベルの細胞生存率を示す細胞の培養のために設計されている。多くの場合において、そのような方法は、１つ以上のリポタンパク質サプリメントを使用する細胞（例えば哺乳動物細胞）の培養を含み得る。
本明細書では、細胞（例えばＴ細胞）の培養のためのワークフロー、組成物、および方法が提供される。本明細書に記載の方法は、培養中の細胞が急速な分裂時間で高レベルの細胞生存率を示す細胞の培養のために設計されている。多くの場合において、そのような方法は、１つ以上のリポタンパク質サプリメントを使用する細胞（例えば哺乳動物細胞）の培養を含み得る。
【0096】
本明細書の他の場所に示されているように、細胞はしばしば補充された基礎培地で培養される。培地中に存在する１つ以上の細胞型の増殖を可能にするかまたは増強するために、いくつかの成分が基礎培地に添加され得る。そのような成分には、ビタミン、ミネラル、脂質、成長因子、およびサイトカインが含まれる。
【0097】
血清および動物起源の材料を含まない細胞培養培地を使用したいという要望がある。「動物起源不含」とは、成分が動物または動物細胞から得られないことを意味する。したがって、例えば酵母細胞で産生される組換え発現されたヒトタンパク質は、それがヒトタンパク質であるにもかかわらず、動物起源不含とみなされる。本明細書では、血清（例えばヒト血清、ウシ血清等）を含まずに動物細胞（例えば哺乳動物細胞）の効率的な増殖を可能にする組成物および方法が提供される。また、本明細書では、動物細胞（例えば哺乳動物細胞）の効率的な増殖を可能にする、動物不含組成物、およびそれに関連する方法が提供される。
【0098】
多くの場合において、細胞の添加前、添加中、および／または添加後に、１つ以上のリポタンパク質サプリメントが細胞培養培地に添加され得る。さらに、１つ以上のリポタンパク質サプリメントは、細胞増殖プロセス中に細胞培養培地から除去され得る。
【0099】
図４は、異なる培養培地および異なる成分を含む異なる培養培地におけるＴ細胞の増殖のデータを示している。Ｔ細胞増殖の最低レベルは、ＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（完全なＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標））で見られた。次に低いレベルのＴ細胞増殖は、Ｘ－Ｖｉｖｏ（商標）５％ヒト血清で見られた。最高レベルのＴ細胞増殖は、８ｍｇ／ＬのＨＤＬを含みＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で見られ、結果は、２つのＨＤＬ追加データセットで同様であった。
【0100】
図５は、図４（５）に示されているデータに関連するＴ細胞の％生存率のデータを示す。１つの例外を除いて、生細胞の％はすべての試料およびすべての時点において類似していた。この例外は、ＩＣＳＲ試料を含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の５日目の測定に対するものである。
【0101】
図４および５に示されているデータは、リポタンパク質サプリメント（例えばＨＤＬ）が血清代替物として使用され得ることを示している。さらに、リポタンパク質サプリメント（例えば８ｍｇ／ＬのＨＤＬ）は、増殖プロセス中に血清（例えばヒト血清）または血清代替物（例えばＩＣＳＲ）よりも培養培地においてより高い増殖レベルをもたらし、細胞をより高いレベルの生存率に維持するように配合され得る。
【0102】
組成物に添加され、本明細書に記載の方法で使用されるリポタンパク質サプリメントは、本明細書に記載の任意の数の成分または成分の組み合わせを含み得る。多くの場合において、リポタンパク質サプリメントは、少なくとも１つのリポタンパク質の一部をすべて含む。
【0103】
さらに、リポタンパク質サプリメントは、完全に動物起源であってもよく、部分的に動物起源であってもよく、または動物起源を含まなくてもよい。例えば、リポタンパク質サプリメントは、１つ以上のタイプのリポタンパク質粒子を含み得る。さらに、そのようなリポタンパク質粒子は、天然供給源（例えば哺乳動物の血液）に由来してもよく、または合成的に生成されてもよい。
【0104】
リポタンパク質サプリメントを培養培地に添加して、培養培地中のリポタンパク質サプリメントの成分の最終量をもたらすことができる。例えば、リポタンパク質サプリメントを培養培地に添加して、最終成分濃度を約０．１ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌ（例えば、約０．２ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約３ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約４５０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約４００ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約３５０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約３００ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約２５０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約５０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ～約１２ｍｇ／Ｌ等）の最終成分濃度をもたらすことができる。
【0105】
さらに、リポタンパク質サプリメントは、特定の増殖特性をもたらす量で培地に添加され得る。例えば、リポタンパク質サプリメントは、設定された時点で、ＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（完全なＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標））よりも高いＴ細胞増殖をもたらす量で添加され得る。測定され得る他の成長特性は、％生存率および１つ以上のＴ細胞サブタイプの有病率である。さらに、設定された時点は、リポタンパク質サプリメントの存在下での増殖の開始から３、４、５、６、７、または１０日後であってもよい。
【0106】
例として、性能比較は次のように実行され得る。４人の異なるドナーからのＴ細胞を、ＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）および様々な量のリポタンパク質サプリメント（例えば、精製されたアポリポタンパク質、ＨＤＬ、ＬＤＬ等）を含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）を用いて試験することができる。時間ゼロで、活性化Ｔ細胞（実施例１を参照されたい）を、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含むＧ－Ｒｅｘ（商標）プレートのウェル当たり１×１０6細胞で播種する。次いで、Ｔ細胞を３７℃のインキュベーターに入れる。次いで、Ｔ細胞試料を、設定された時点で関心のある特性について比較する。例えば、関心のある特性が５日目の増殖倍数であり、表５に示すデータが得られた場合、４人のドナーから得られたデータは、増殖倍数の増加が統計的に有意であり、ＩＣＳＲ試料を含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒに対する様々な量のリポタンパク質サプリメント試料を含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の増殖倍数が３．５であることを示している。これは２９％の増加に相当する。
【表5】
【0107】
多くの場合において、リポタンパク質サプリメントは、血清代替物の性能に等しいか、または血清代替物の性能を超える量で培養培地に添加される（例えば、約５％～約１００％、約５％～約９０％、約５％～約８０％、約５％～約７０％、約１０％～約１００％、約２０％～約１００％等）。
【0108】
リポタンパク質サプリメント成分は、単一のタンパク質（もしくはペプチド）、タンパク質の混合物、タンパク質断片、タンパク質断片の混合物、および／または１つ以上のリポタンパク質粒子を含み得る。例えば、リポタンパク質サプリメント成分は、ＨＤＬまたはＬＤＬ等のリポタンパク質粒子を含み得る。さらに、ＨＤＬおよびＬＤＬリポタンパク質粒子の両方が培養培地に添加されてもよい。これが行われる場合、これらのリポタンパク質粒子のいずれか１つまたは両方の組み合わせの濃度は、上記の範囲内であってもよいか、または約１ｍｇ／Ｌ～約３０ｍｇ／Ｌ（例えば、約１ｍｇ／Ｌ～約１８ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ～約１３ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ～約１２ｍｇ／Ｌ等）の範囲であってもよい。さらに、培養培地に添加される２つのリポタンパク質粒子の比率もまた変化し得る。例えば、ＨＤＬ：ＬＤＬの比率は、約１０：１～約１：１０（例えば、約１０：１～約１：１０、約５：１～約１：１０、約１：１～約１：１０、約１０：１～約１：５、約１０：１～約１：１等）で変化し得る。当然ながら、他のリポタンパク質粒子も培養培地に添加することができる。そのようなリポタンパク質粒子は、天然の供給源（例えばヒトの血液）から得られてもよく、および／または合成されてもよい。
【0109】
図６および表１４の組み合わせで示されたデータは、８ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞がＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で優先的に増殖することを示している。図７および表１５の組み合わせで示されたデータは、ＣＤ２７ Ｔ細胞が８ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）において優先的に増殖されること、およびＣＤ６２Ｌ Ｔ細胞が優先的に増殖しないことを示している。
【0110】
本明細書には、Ｔ細胞の増殖のための組成物および方法が記載される。いくつかの場合において、この増殖により、２つ以上のＴ細胞サブタイプが増殖前および増殖後で本質的に同じ比率（すなわち、約１０％以内）で存在するＴ細胞集団が生成される。いくつかの場合において、この増殖により、２つ以上のＴ細胞サブタイプが増殖前および増殖後で異なる同じ比率（すなわち、約１０％超、例えば約１１％～約２００％、約１１％～約９０％、約１１％～約７５％、約３０％～約２００％、約３０％～約１００％等）で存在するＴ細胞集団が生成される。さらに、そのようなＴ細胞サブタイプには、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ２７＋Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞、およびＣＣＲ７＋Ｔ細胞が含まれる。
【0111】
表１６～２０のデータが示すように、個々のリポタンパク質を血清代替物として培地に添加することもできる。表１６および２０に示されているデータは、ＡＰＯ－ＡＩおよびＡＰＯ－ＡＩＩがＩＣＳＲの代替物として機能することを示している。
【0112】
表１６～２０のデータからわかるように、ＡＰＯ－ＡＩおよびＡＰＯ－ＡＩＩは、Ｔ細胞増殖および高レベルの細胞生存率の両方を補助し得る。これらのデータは、アポリポタンパク質が血清代替物として機能し得ることを示している。したがって、本明細書では、１つ以上のアポリポタンパク質（例えば、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約１～約４、約２～約５等）および／またはその下位部分が培養培地に含まれる組成物および方法が提供される。
【0113】
エレクトロポレーション
本明細書では、細胞のエレクトロポレーションのための組成物および方法が提供される。特に、細胞のエレクトロポレーションを可能にし、エレクトロポレーション後の細胞生存率を高くする組成物および方法が本明細書で提供される。
本明細書では、細胞のエレクトロポレーションのための組成物および方法が提供される。特に、細胞のエレクトロポレーションを可能にし、エレクトロポレーション後の細胞生存率を高くする組成物および方法が本明細書で提供される。
【0114】
細胞膜の膜電位Ｕｍ（ｔ）を細胞膜の多孔性が劇的に上昇する値まで急速に増加させる電界パルスに対する細胞膜の応答に関連する機構理論については、かなりの量の研究が行われている（Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７：２３６－２４３（２０１２）を参照されたい）。膜の多孔性の変化は、細孔の形成が原因であると考えられている。
【0115】
エレクトロポレーションに使用される大きな電界パルスは、主な原因である加熱によって、または加熱なしで細胞を死滅させることができる。２つの非加熱死滅機構は、アポトーシスまたは壊死の誘導によるものと考えられている。さらに、高強度電界細胞死滅はアポトーシスによるものであると考えられており、低強度電界細胞死滅は壊死によるものであると考えられている。したがって、細胞死のメカニズムに関係なく、高い細胞生存率が維持されるように電界条件を調節することが一般的に望ましい。
【0116】
異なる「ギャップ」サイズのエレクトロポレーションキュベットが使用され得る。「ギャップ」とは、電気が通過する空間である。ギャップサイズは、約０．１ｍｍ～約１５ｍｍ（例えば、約０．５ｍｍ～約１５ｍｍ、約１ｍｍ～約１５ｍｍ、約２ｍｍ～約１５ｍｍ、約２ｍｍ～約１０ｍｍ、約２ｍｍ～約８ｍｍ、約３ｍｍ～約６ｍｍ等）であってもよい。多くの場合において、動物細胞のエレクトロポレーションには約４ｍｍのギャップサイズが使用される。
【0117】
エレクトロポレーション中に細胞に印加される電圧の量は大きく変動し得、約２００ボルト（Ｖ）～約１，５００Ｖ（例えば、約２００Ｖ～約１，５００Ｖ、約２００Ｖ～約１，５００Ｖ、約２５０Ｖ～約１，５００Ｖ、約３５０Ｖ～約１，５００Ｖ、約３００Ｖ～約１，５００Ｖ、約４００Ｖ～約１，５００Ｖ、約５００Ｖ～約１，５００Ｖ、約６００Ｖ～約１，５００Ｖ、約２００Ｖ～約１，０００Ｖ、約２２５Ｖ～約９００Ｖ、約２５０Ｖ～約９００Ｖ、約２５０Ｖ～約８００Ｖ、約３００Ｖ～約７５０Ｖ、約３００Ｖ～約６５０Ｖ等）であってもよい。
【0118】
さらに、電圧は、様々なパルス持続時間にわたって印加され得る。そのような持続時間は、約１ナノ秒～約１秒（例えば、約１５０ナノ秒～約１秒、約２５０ナノ秒～約１秒、約３００ナノ秒～約１秒、約５００ナノ秒～約８００秒、約１マイクロ秒～約１秒、約１００マイクロ秒～約１秒、約１マイクロ秒～約８００マイクロ秒、約１マイクロ秒～約６００マイクロ秒、約１マイクロ秒～約５００マイクロ秒、約１マイクロ秒～約４００マイクロ秒、約１マイクロ秒～約３００マイクロ秒、約１００マイクロ秒～約７００マイクロ秒、約２００マイクロ秒～約６００マイクロ秒等）であってもよい。
【0119】
２つ以上のパルスが使用される場合、パルスの数は変動し得、約１～約５００（例えば、約２～約５００、約１０～約５００、約２０～約５００、約３０～約５００、約１０～約２５０、約１０～約２００、約１０～約１７０、約１０～約１５０、約２５～約２５０、約２５～約２００、約２５～約１５０等）のパルスであってもよい。
【0120】
エレクトロポレーションの前に細胞をリポタンパク質サプリメントとインキュベートすることで、エレクトロポレーションが細胞の生存率に及ぼす影響を有利に調整できることが分かっている。したがって、細胞がリポタンパク質サプリメントと一定期間接触され、次いでエレクトロポレーションされる組成物および方法が本明細書に記載される。
【0121】
図８および９は、実施例２に示されているように生成されたデータを示している。６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、またはＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）でＴ細胞を３日間増殖させた。次いで、細胞生存率を４日目に測定した。見てわかるように、エレクトロポレーションの前にＴ細胞を６ｍｇ／ＬのＨＤＬで３日間増殖させた試料は、ＩＣＳＲでＴ細胞を３日間増殖させた試料よりも有意に高いレベルの生存率を示した。図８および表２１から分かるように、２つの増殖条件の間の４日目の増加したＴ細胞生存率は、２０．２３～３６．２１の範囲であり、６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で増殖させたＴ細胞の平均Ｔ細胞生存率は７０．５０であり、ＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で増殖させたＴ細胞の平均Ｔ細胞生存率は４９．２６である。
【0122】
図１１および１２は、６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）またはＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で３日間増殖させたＴ細胞のエレクトロポレーション効率のデータを示す。１つを除くすべてのドナー試料のＴ細胞は、エレクトロポレーション効率の向上を示した。
【0123】
本明細書では、細胞に対するエレクトロポレーションの効果を調節するための組成物および方法が提供される。いくつかの態様において、細胞は、エレクトロポレーションの前に、一定期間（例えば、約１～約６日、約１～約５日、約１～約４日、約１～約３日、約２～約６日、約２～約５日等）リポタンパク質サプリメントと接触させられる。多くの場合において、リポタンパク質サプリメントは培養培地中に存在し、細胞はエレクトロポレーション前の期間中に活発に増殖する。いくつかの場合において、細胞はエレクトロポレーションの前に洗浄され、非培養培地溶液（例えば緩衝液）中でエレクトロポレーションされ、エレクトロポレーション後に培養培地に再懸濁される。いくつかの場合において、エレクトロポレーション後の培養培地はリポタンパク質サプリメントを含むが、含まれない場合もある。一例として、いくつかの場合において、Ｔ細胞は６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で３日間増殖され、洗浄され、緩衝液に再懸濁され、次いで緩衝液中でエレクトロポレーションされ、次いで緩衝液から分離されて、さらなる増殖のためにＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）に再懸濁されてもよい。このプロセスは、本質的に、図８～１２に示されている日が生成された方法である。
【0124】
培養培地に添加され得るリポタンパク質サプリメントの量は様々である。いくつかの場合において、例２に示された方法を使用して、指定されたエレクトロポレーション効率を達成するように量が調節される。エレクトロポレーション効率は、細胞の種類、細胞の代謝状態、細胞に導入される核酸分子等を含む様々な要因によって決定される。
【0125】
また、本明細書では、細胞のエレクトロポレーションの効率を高めるための組成物および方法が提供される。多くの場合において、細胞がエレクトロポレーション前に一緒にインキュベートされるリポタンパク質サプリメントの量は、本明細書の他の場所に記載されている通りである。
【0126】
本明細書に記載の方法によって細胞に導入され得る核酸分子には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせ（ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）が含まれる。そのような核酸分子は、一過性または安定した発現のために設計され得る。安定した発現は、例えば、複製起点を有する核酸分子、または相同組換えによって宿主細胞ゲノムに組み込まれるように設計された核酸分子（例えばドナー核酸分子）の導入によって達成され得る。
【0127】
さらに、一本鎖ＤＮＡドナー（ｓｓＤＮＡ）、平滑末端ｄｓＤＮＡドナー（平滑）、５’オーバーハング（５’）のｄｓＤＮＡドナー、および／または３’オーバーハング（３’）のｄｓＤＮＡドナーを含む細胞に導入された核酸分子。
【0128】
細胞に導入された核酸分子は、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードし得る。
【0129】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、任意の数の構造を有し得、また任意の数の目的のために設計され得る。多くのＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結し、これにより、抗原が結合すると細胞（Ｔ細胞等）が活性化される。ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインの３つの領域で構成されることが多い。
【0130】
細胞外ドメインは、細胞の外側に露出し、潜在的な標的分子と相互作用することができるＣＡＲの領域である。膜貫通ドメインは、典型的には、細胞膜にまたがる疎水性領域からなる（例えばヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン）。細胞内ドメイン（例えばＣＤ３－ゼータの細胞質ドメイン）は、細胞の内部にシグナルを「伝達」する受容体の内部細胞質末端である。
【0131】
細胞維持
リポタンパク質サプリメントとのインキュベーション後に細胞をエレクトロポレーションし、リポタンパク質サプリメントとの接触を維持すると、細胞は一定期間高い生存率を維持するが、増殖速度の低下を示すことが見出された。
リポタンパク質サプリメントとのインキュベーション後に細胞をエレクトロポレーションし、リポタンパク質サプリメントとの接触を維持すると、細胞は一定期間高い生存率を維持するが、増殖速度の低下を示すことが見出された。
【0132】
図１４および１５に示されるデータは、示された培地で増殖されたＴ細胞を使用して生成された。次いで、これらのＴ細胞を３日目にエレクトロポレーションした。次いで、すべての試料のＴ細胞を、示された培養培地で維持した。図１４は、Ｔ細胞が示されたリポタンパク質サプリメントの存在下で増殖され、次いでエレクトロポレーションされ、それぞれが元の培養培地で維持される場合、リポタンパク質サプリメントが存在すると細胞生存率が高いままであることを示すデータを示す。図１５は、Ｔ細胞がリポタンパク質粒子（ＨＤＬ、ならびにＨＤＬおよびＬＤＬの組み合わせ）の存在下でエレクトロポレーションされ、リポタンパク質粒子と接触したままにされると、増殖が減少することを示すデータを示す。したがって、本明細書では、高い細胞生存率を維持しながら細胞の増殖速度を低下させるための組成物および方法が提供される。
【0133】
多くの場合において、哺乳類動物細胞集団の増殖は増殖を続け、生存率の低下を示し、細胞分裂を低下させる。細胞が最初にリポタンパク質サプリメントの存在下で増殖され、次いで電界中に置かれる場合、細胞生存率の比較的低いレベルの損失で核酸が細胞に導入され得ることが観察された。さらに、そのような細胞がリポタンパク質サプリメントを含む培養培地中で維持される場合、これらの細胞は、細胞増殖の減少を示しながら、高レベルの細胞生存率を維持し続ける。したがって、本明細書では、哺乳動物細胞の増殖を可能にし、その後低レベルの増殖であるが高い細胞生存率を有する細胞の維持を可能にする組成物および方法が提供される。そのような組成物および方法は、細胞の保存に有用である。
【0134】
本明細書では、哺乳動物細胞を保存するための方法が提供される。そのような方法は、次の手順を含む方法を含んでいた。まず、哺乳動物細胞を、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で一定期間（例えば、約１日～約１０日、約２日～約１０日、約３日～約１０日、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約５日、約１日～約４日、約２日～約４日等）増殖させる。次いで、哺乳動物細胞は哺乳動物細胞を電界に曝露している。電界への曝露後、細胞は、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で哺乳動物細胞の増殖に適した条件下で維持される。上記のプロセスの条件は、哺乳動物細胞が高レベルの細胞生存率を維持しながら低レベルの増殖を示すように調節され得ることが見出された（図１４および１５を参照されたい）。
【0135】
保存のために調製され、本明細書に記載の条件下で保存される細胞は、Ｔ細胞等の操作された細胞を含む、任意の数の異なる細胞型であり得る。これらの細胞は、保存中に３７℃で保存され得、少なくとも２４日間（例えば、約５日～約２４日、約５日～約２０日、約５日～約１８日、約５日～約１５日、約５日～約１２日、約５日～約１０日、約５日～約７日、約１日約１０日、約３日～約７日、約２日～約８日等）高レベルの細胞生存率を維持しながら保存状態で維持され得る。
【0136】
さらに、保存期間の終了時に、細胞を洗浄して１つ以上のリポタンパク質化合物を除去し、次いで、細胞増殖を阻害するのに十分な量の１つ以上のリポタンパク質化合物を含まない培養培地と接触させることができる。
【0137】
そのような方法で保存され得る細胞は、操作されたＴ細胞を含む。Ｔ細胞保存法は、ある場所から別の場所への細胞（例えば、操作されたＴ細胞等のＴ細胞）の運搬に使用され得る。
【0138】
Ｔ細胞
任意の数の異なる種類のＴ細胞が組成物中に存在し得、本明細書に記載の方法で使用され得る。これらのＴ細胞のいくつかは次の通りである。
任意の数の異なる種類のＴ細胞が組成物中に存在し得、本明細書に記載の方法で使用され得る。これらのＴ細胞のいくつかは次の通りである。
【0139】
ナイーブＴ細胞は一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）およびＣ－Ｃケモカイン受容体型７（ＣＣＲ７）の表面発現；活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の欠如；ならびにメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの欠如を特徴とする。
【0140】
Ｔｈ１７細胞：Ｔヘルパー１７細胞（または「Ｔｈ１７細胞」または「Ｔｈ１７ヘルパー細胞」）は、宿主防御を制御すると考えられるＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の炎症サブセットであり、組織の炎症およびある特定の自己免疫性疾患に関与する。担がんマウスに養子移入した場合、Ｔｈ１７細胞はＴｈ１または非極性（ＴｈＯ）よりも黒色腫を根絶するのに強力であることが分かっている。Ｔｈ１７細胞の表現型は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ１６１＋である。
【0141】
メモリーＴ細胞：「抗原経験細胞」とも称されるメモリーＴ細胞は、抗原との遭遇前に経験される。これらのＴ細胞は、長寿命であり、抗原を認識し、これらのＴ細胞が以前に曝露された抗原に対する免疫応答に迅速かつ強力に影響を与えることができる。メモリーＴ細胞は、幹細胞様メモリー細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリー細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）を含み得る。ＴＳＣＭ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ－７Ｒａ＋を有するが、それらはまた、大量のＩＬ－２Ｒ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ－１も発現する。ＴＣＭ細胞は、Ｌ－セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、それらは、ＩＬ－２を分泌するが、ＩＦＮ－γまたはＩＬ－４は分泌しない。ＴＥＭ細胞は、Ｌ－セレクチンまたはＣＣＲ７を発現しないが、ＩＦＮγおよびＩＬ－４等のサイトカインを産生する。
【0142】
メモリーＴ細胞サブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ、Ｃ－Ｃケモカイン受容体型７（ＣＣＲ７）、およびＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）を発現する。セントラルメモリーＴ細胞は中レベルから高レベルのＣＤ４４を発現する。このメモリー亜集団は、リンパ節および末梢循環によく見られる。
【0143】
組織常駐メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）は、通常、再循環することなく組織（皮膚、肺、胃腸管等）を占有します。これらの細胞は、病原体に対する防御免疫において役割を果たすと考えられている。機能不全ＴＲＭ細胞は、様々な自己免疫疾患に関与している。
【0144】
仮想メモリーＴ細胞は、強力なクローン増殖イベントの後に発生したようには見えないという点で、他のメモリーサブセットとは異なる。この集団は全体として、典型的には末梢循環内に豊富に存在する。
【0145】
治療方法
いくつかの態様において、治療を必要とする対象における疾患を治療する方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される方法によって得られるかまたは生成される対象細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）またはそのような細胞の子孫に投与することを含むそのような方法。
いくつかの態様において、治療を必要とする対象における疾患を治療する方法が本明細書で提供される。本明細書で提供される方法によって得られるかまたは生成される対象細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）またはそのような細胞の子孫に投与することを含むそのような方法。
【0146】
一例として、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子をＴ細胞に導入して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成することができる。次いで、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を増殖させて、ＣＡＲ－Ｔ細胞薬を生成する。次いで、Ｔ細胞の活性化が、ＣＤ３およびＣＤ２８細胞表面受容体の抗体の結合によって媒介され得る。
【0147】
任意の数の細胞型（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）が治療方法において使用され得る。
【0148】
ＮＫ細胞は、自然免疫系の主要な構成要素を構成する細胞傷害性リンパ球であり、インターフェロンおよびマクロファージ由来のサイトカイン等の細胞シグナルに応答して活性化される。ＮＫ細胞の細胞毒性活性は、「活性化受容体」または「阻害性受容体」とみなされ得る２種類の表面受容体によって主に調節されるが、一部の受容体（ＣＤ９４および２Ｂ４（ＣＤ２４４等））は、リガンド相互作用に応じてどちらの方法でも機能する。
【0149】
ＮＫ細胞は、例えばＣＤ５６およびＣＤ３に対する抗体を用いて、ならびにＣＤ５６+ＣＤ３細胞ために選択して、単離または濃縮され得る。したがって、細胞組成物は、ＣＤ３のために陰性選択され得、続いてＣＤ５６+細胞について陽性選択され得る。両方の選択は、細胞表面マーカーに結合特異性を有する抗体が結合する固体支持体を使用して実行され得るが、ＮＫ細胞の放出は陽性選択ステップ（すなわちＣＤ５６+ベースの細胞精製）によってのみ媒介される必要がある。
【0150】
例として、ＮＫ細胞は腫瘍の宿主拒絶反応において役割を果たし、ウイルス感染細胞を死滅させることができることが示されている。したがって、ＮＫ細胞は、ウイルス感染症の治療に使用され得る。さらに、ＮＫ細胞（例えば、活性化ＮＫ細胞）は、がんのエクスビボ治療およびインビボ処置の両方で使用され得る。
【0151】
ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、増加したＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を含むＴ細胞の増殖集団、またはそのような増殖集団から単離したＣＤ８＋Ｔ細胞）の用途の非限定的な例には、免疫抑制された移植患者の治療のための、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染症等のためのウイルス特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が含まれる。例えば、Ｈｅｓｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１５（５）：９２５－３５を参照されたい。追加の非限定的な例には、がんおよび感染性疾患の治療のための、ＣＡＲ－Ｔおよび他の様式のウイルス特異的Ｔ細胞の操作の使用が含まれる。例えば、Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１５（５）：９２５－３５およびＧｈａｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５（２）：１５９－１６８を参照されたい。ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、増加したＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を含むＴ細胞の増殖集団、またはそのような増殖集団から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞）の用途の非限定的な例には、ＨＩＶ＋患者の治療、および増殖させたＣＤ４＋Ｔヘルパーサブセット（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨ）、および自己免疫を治療するための制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）が含まれる。例えば、Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７０（１０）：９０１－１０およびＲｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０（５）：６５６－６６５を参照されたい。
【0152】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【0153】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、分化の段階に基づいて単離される。Ｔ細胞集団は、特定の細胞マーカーまたはタンパク質の存在または不在に基づいて分化の段階を評価することができる。Ｔ細胞分化の段階を評価するために使用されるマーカーには、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＣＤ１６１、ＣＣＲ７、および転写因子ＦＯＸＰ３が含まれる。
【0154】
実施形態では、適切な細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団、Ｂ細胞集団等）または亜集団が患者または動物から単離されると、任意選択で、得られた細胞集団が本明細書に記載の組成物および方法を使用して増殖される前に、遺伝的または任意の他の適切な改変または操作が行われてもよい。この操作は、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いてＴ細胞を刺激／再刺激して、それらを活性化／再活性化させる形態をとり得る。
【0155】
実施形態では、活性化細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）を対象に投与し、次いでその後に再び採血し（またはアフェレーシスを実行し）、本発明で提供される方法に従って、その血液から細胞を活性化および増殖させ、これらの活性化および増殖させた細胞を患者に再注入することが望ましくなり得る。
【0156】
実施形態では、本明細書で提供される方法に従って生成されるＴ細胞亜集団は、実験用途および治療用途を含む多くの潜在的な用途を有し得る。実施形態では、少数のＴ細胞を患者から取り出し、その後それらをエクスビボで操作し、増殖させてから、患者に再注入する。この方法で治療することができる疾患の非限定的な例は、抑制された免疫活性が（例えば、同種移植免疫寛容のために）望ましい、自己免疫性疾患および病態である。実施形態では、治療方法は、哺乳動物を提供し、Ｔ細胞を含有する該哺乳動物から生体試料を得ることと、本明細書で提供される方法に従って、エクスビボでＴ細胞を増殖／活性化させることと、増殖／活性化させたＴ細胞を治療される哺乳動物に投与することとを含む。実施形態では、第１の哺乳動物および治療される哺乳動物は、同じであっても異なっていてもよい。実施形態では、哺乳動物は一般に、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、またはヒト等の任意の哺乳動物であり得る。実施形態では、第１の哺乳動物（「ドナー」）は、同系、同種、または異種であり得る。
【0157】
実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を使用して産生されるＴ細胞亜集団は、様々な用途および治療モダリティで使用することができる。実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、がん、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含むがこれらに限定されない疾患状態の治療において使用することができる。実施形態では、Ｔ細胞療法には、免疫枯渇後もしくは免疫枯渇後ではない、本明細書で提供される方法によって外部で増殖させたＴ細胞亜集団の対象への注入、またはドナー対象から単離した、外部で増殖させた異種Ｔ細胞の対象への注入（例えば、養子細胞移入）が含まれる。
【0158】
Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞である実施形態において、抗原結合部分の選択は、処置されるがんの特定の種類に依存し得る。腫瘍抗原は、当該技術分野で知られており、例えば、膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト慢性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵＬ ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビングおよびテロメラーゼ（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、前立腺がん腫腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ－１）、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ならびにメソセリンを含む。
【0159】
Ｔ細胞の混合集団の源の例
実施形態では、Ｔ細胞の混合集団の出発源は、対象から単離され得る血液（例えば循環血液）である。実施形態では、循環血液は、１単位以上の血液から、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスから得ることができる。実施形態では、アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、幹細胞（例えば誘導多能性幹細胞）、および血小板を含む、リンパ球を含む。Ｔ細胞および他の細胞は、血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を含む（がこれらに限定されない）いくつかの源から得ることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株および自己または同種の源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、異種の源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタからも得ることができる。
実施形態では、Ｔ細胞の混合集団の出発源は、対象から単離され得る血液（例えば循環血液）である。実施形態では、循環血液は、１単位以上の血液から、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスから得ることができる。実施形態では、アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、幹細胞（例えば誘導多能性幹細胞）、および血小板を含む、リンパ球を含む。Ｔ細胞および他の細胞は、血液単核細胞、骨髄、胸腺、組織バイオプシー、腫瘍、リンパ節組織、胃腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓組織、または任意の他のリンパ組織、および腫瘍を含む（がこれらに限定されない）いくつかの源から得ることができる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞株および自己または同種の源から得ることができる。Ｔ細胞はまた、異種の源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびブタからも得ることができる。
【0160】
実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離等の当業者に既知の任意の数の技術を使用して対象から収集された血液の単位から得ることができる。Ｔ細胞は、対象の循環血液から単離されてもよい。実施形態では、血液は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって対象から得ることができる。実施形態では、アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＰＢＭＣ、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、および血小板を含むリンパ球を含む。実施形態では、感作組成物への曝露ならびにその後の活性化および／または刺激の前に、Ｔ細胞の源は、対象から得られる。実施形態では、アフェレーシスによって収集した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を、その後の処理ステップのために、適切な緩衝液または培地中に入れてもよい。本明細書に記載の実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されてもよい。実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、かつマグネシウムを欠いてもよいか、またはすべてではなくとも多くの二価カチオンを欠いてもよい。当業者であれば容易に理解するように、洗浄ステップは、製造業者の指示に従う、半自動「流水式」遠心分離機（例えば、ＣＯＢＥ（登録商標）２９９１細胞プロセッサであるＢａｘｔｅｒ）の使用等によって、当業者に既知の方法によって達成され得る。実施形態では、洗浄後、細胞を、例えばカルシウム（Ｃａ）不含、マグネシウム（Ｍｇ）不含ＰＢＳ等の様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁させてもよい。実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁させてもよい。
【0161】
実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解または除去し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血液リンパ球から単離される。実施形態では、特異的なＴ細胞の亜集団は、正または負の選択技術によってさらに単離することができる。
【0162】
実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋細胞について正に選択することができる。当業者に既知の任意の選択技術が、使用されてもよい。非限定的な一例は、フローサイトメトリー選別である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３ビーズとともにインキュベートすることによって単離することができる。非限定的な一例は、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたる、ＣＴＳ（商標）Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号１１１４１Ｄ）等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８結合ビーズである。実施形態では、期間は、３０分間～３６時間以上、およびそれらの間のすべての整数値の範囲である。実施形態では、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。別の実施形態では、期間は、１０～２４時間である。実施形態では、インキュベーション時間は、２４時間である。２４時間等のより長いインキュベーション時間は、細胞の産生量を増加させ得る。実施形態では、他の細胞型と比較して、Ｔ細胞がほとんど存在しないあらゆる状況において、より長いインキュベーション時間を使用して、Ｔ細胞を単離することができる。実施形態では、負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１つの可能性のある方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。実施形態では、増殖倍率は、ドナー細胞の可変性のために、出発材料に基づいて異なり得る。実施形態では、通常の出発密度は、約０．５×１０6個～約１．５×１０6個であり得る。
【0163】
実施形態では、Ｔ細胞亜集団は、１つ以上のマーカーが存在するかまたは不在であるかに基づく選択によって生成され得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７負／低、および任意でＦＯＸＰ３＋である細胞の選択に基づいて、混合集団から得ることができる。実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＦＯＸＰ３－であり得る。この例では、選択は、１つ以上の定義可能な特徴に基づいて、細胞を「選ぶこと」を事実上指す。さらに、選択は、１つ以上の特徴を有する細胞（正）または１つ以上の特徴を有しない細胞（負）に関しての選択であり得るという点で、正または負であり得る。
【0164】
Ｔｒｅｇ細胞に関して、例示の目的で、これらの細胞は、これらの細胞がＣＤ４および／またはＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に結合すること、ならびにＣＤ１２７に結合する抗体が結合した表面（例えば、磁気ビーズ）に非Ｔｒｅｇ細胞が結合することを通して、混合集団から得ることができる。特定の例として、ＣＤ３に結合する抗体が結合した磁気ビーズを使用して、ＣＤ３＋細胞を単離してもよい。一旦放出された後、得られたＣＤ３＋細胞を、ＣＤ４に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよい。その後、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ２５に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよい。その後、得られたＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ１２７に結合する抗体が結合した磁気ビーズと接触させてもよく、収集される細胞は、これらのビーズに結合しない細胞である。
【0165】
実施形態では、複数の特徴を同時に使用して、Ｔ細胞亜集団（例えばＴｒｅｇ細胞）を得ることができる。例えば、２つ以上の細胞表面マーカーに結合する抗体をそれに結合した状態で含有する表面もまた、使用することができる。特定の例として、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞は、混合集団から、ＣＤ４およびＣＤ２５に結合する抗体が結合した表面にこれらの細胞が結合することにより、得ることができる。複数の特徴の同時選択は、所望の細胞型とともに「共精製」する望ましくないいくつかの細胞型をもたらし得る。これは、上記の特定の実施例を使用して、ＣＤ４＋、ＣＤ２５－およびＣＤ４－、ＣＤ２５＋である細胞が、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋細胞に加えて得られ得るため、その通りである。
【0166】
本明細書では、１つ以上のＴ細胞亜集団のメンバーを得るための方法が含まれ、Ｔ細胞亜集団のメンバーは、特定の特徴によって特定され、これらの特徴に関して異なる細胞から分離される。本明細書に示される方法において使用され得る特徴の例には、以下のタンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ２７８、ＣＤ３３５、ＣＣＲ７、Ｋ５６２Ｐ、Ｋ５６２ＣＤ１９、およびＦＯＸＰ３の存在または非存在が含まれる。
【0167】
ＣＡＲ－Ｔ細胞
また、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を生成するための組成物および方法も提供される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、指定された免疫細胞を提供するように設計された操作された受容体である。受容体は、キメラと呼ばれるが、これは、それらが異なる源に由来する部分で構成されているためである。
また、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を生成するための組成物および方法も提供される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、指定された免疫細胞を提供するように設計された操作された受容体である。受容体は、キメラと呼ばれるが、これは、それらが異なる源に由来する部分で構成されているためである。
【0168】
多くの場合において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原結合機能およびＴ細胞活性化機能を組み合わせた組換え受容体を発現する。通常、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインの３つの領域を含む。
【0169】
細胞外ドメインは、細胞の外部に露出している受容体の領域であり、典型的には、シグナルペプチド、抗原認識領域、およびスペーサーの３つの領域を含む。シグナルペプチドは、ＣＡＲの細胞膜への組み込みを促進する。ＣＡＲの抗原認識領域は、典型的には、単鎖可変抗体断片（例えば、ＣＤ１９受容体に対する結合活性を有する抗体断片）である。膜貫通ドメイン（例えばＣＤ２８膜貫通ドメイン）は、典型的には、Ｔ細胞の細胞膜にまたがる疎水性領域であり、細胞外ドメインによって受信されたシグナルの通過を可能にして、Ｔ細胞の内部に伝達させる。抗原認識後、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞内ドメインに伝達される。
【0170】
ＣＡＲをコードする核酸分子は、任意の数のフォーマットで構造化することができ、任意の数の方法によってＴ細胞に導入することができる。ＣＡＲコード領域は、通常、プロモータ（例えばＣＭＶプロモータ）等の発現制御配列に作動可能に連結される。さらに、これらの核酸分子は、典型的には、調節される要素、翻訳ターミネータ、および１つ以上の選択可能なマーカー等の成分を含む核酸ベクター（例えばクローニングベクター）中に存在する。
【0171】
治療を必要とする対象または患者を治療するための１つのアプローチは、増殖させたＴ細胞を使用し、ＣＡＲを発現させることにより腫瘍細胞上で発現した抗原を標的化するようにＴ細胞を遺伝子組換えすることである。多くの場合において、ＣＡＲ等のタンパク質をコードする核酸分子がＴ細胞に導入され、続いて操作されたＴ細胞が増殖される。
【0172】
ＣＡＲを利用する治療において、免疫細胞を、患者血液または他の組織から採取してもよい。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の表面上でＣＡＲを発現するように、下記のように操作され、Ｔ細胞が特異的抗原（例えば、腫瘍抗原）を認識することを可能にする。次いで、これらのＣＡＲ－Ｔ細胞は、本明細書に記載の方法によって増殖させ、患者に注入することができる。患者への注入後、Ｔ細胞は、増殖し続け、ＣＡＲを発現し続け、ＣＡＲが操作されて認識する特異的抗原を抱えるＴ細胞に対して、免疫応答を開始させる。
【0173】
また、本明細書では、ＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えばＴ細胞）が提供され、ＣＡＲ－Ｔ細胞は抗腫瘍特性を示す。ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖（例えばＣＤ３ゼータ）の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有する細胞外ドメインを含むように設計され得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現したとき、抗原結合特異性に基づいて、抗原認識の方向を変えることができる。
【0174】
ＣＡＲの抗原結合部分は、他に抗原結合部分と称される標的特異的結合エレメントを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を画定するリガンドの種類および数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上で細胞表面マーカーとして機能するリガンドを認識するように選択されてもよい。したがって、ＣＡＲの抗原部分ドメインには、ウイルス、細菌、および寄生虫感染症、自己免疫性疾患ならびにがん細胞と関連するものが含まれる。
【0175】
ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的に、ＣＡＲポリペプチドまたはプロモータへのＣＡＲポリペプチドの部分をコードする核酸を動作可能に結合させ、その構築物を発現ベクター内に組み込むことにより達成される。ベクターは、複製および組み込み真核生物に好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネータ、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモータを含む。
【0176】
核酸をクローニングして、いくつかの種類のベクターにすることができる。例えば、核酸をクローニングして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにすることができる。特定の目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが含まれる。
【0177】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞内にもたらされ得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物体内に複製機能の起点、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【0178】
いくつかのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞内への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、ベクター内に挿入され、当該技術分野で既知の技術を使用して、レトロウイルス粒子内にパッケージ化され得る。次いで、組換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達してもよい。いくつかのレトロウイルス系は、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。いくつかのアデノウイルスベクターは、当該技術分野で既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。
【0179】
追加のプロモータエレメント（例えばエンハンサ）が、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の上流の領域３０～１１０ｂｐに位置するが、いくつかのプロモータは、開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが最近示された。プロモータエレメント間の隙間は多くの場合柔軟であり、そのため、エレメントが反転または互いに対して移動された場合、プロモータ機能が保持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータでは、プロモータエレメント間の間隙は、活性が低下し始める前に、５０塩基対離れるまで増加され得る。プロモータに応じて、個々のエレメントは、転写を活性化させるように協働してまたは独立して機能し得るようである。ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する方法は、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第８，９０６，６８２号を参照されたい）。
【0180】
細胞生存率
細胞生存率を決定するための多くの方法が知られている。そのような方法は、（１）生きているかもしくは死んでいる、または（２）活発に増殖している細胞の検出に基づくことができる。細胞集団が研究されている場合、細胞生存率は一般的にパーセンテージまたは比率のいずれかとして表される。例として、生きている細胞と生きていない細胞とを区別するためのトリパンブルー色素ベースアッセイが、１００細胞の集団サイズで使用され、４０細胞がこの色素で染色され、６０細胞がこの色素で染色されない場合、細胞は生存可能であり、非生存細胞対生存細胞の比率は１：１．５である。
細胞生存率を決定するための多くの方法が知られている。そのような方法は、（１）生きているかもしくは死んでいる、または（２）活発に増殖している細胞の検出に基づくことができる。細胞集団が研究されている場合、細胞生存率は一般的にパーセンテージまたは比率のいずれかとして表される。例として、生きている細胞と生きていない細胞とを区別するためのトリパンブルー色素ベースアッセイが、１００細胞の集団サイズで使用され、４０細胞がこの色素で染色され、６０細胞がこの色素で染色されない場合、細胞は生存可能であり、非生存細胞対生存細胞の比率は１：１．５である。
【0181】
細胞生存率アッセイは、以下を含むいくつかのカテゴリーに分類され得る。
【0182】
膜破壊アッセイ：これらのアッセイは、細胞が細胞成分を保持する、および／または細胞の外に物質を保持することができないことに基づく。細胞膜が破壊された細胞から放出され得るある酵素の１つは、乳酸デヒドロゲナーゼである。これは多くの哺乳動物細胞に見られる安定した酵素であり、細胞膜が無傷でなくなった場合に容易に検出され得る。トリパンブルーは色素排除アッセイとして使用でき、この色素は生存細胞に取り込まれないが非生存細胞に取り込まれる。トリパンブルーアッセイは、光学顕微鏡を使用して細胞を容易にカウントできるため、有利である。トリパンブルーと同様に、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）もまた膜不透過性色素であり、通常は生細胞から除外される。この色素は、インターカレーションによって二本鎖ＤＮＡに結合する。ＰＩは４８８ｎｍで励起され、最大波長６１７ｎｍで発光する。これらのスペクトル特性により、ＰＩは、４８８ｎｍで励起されたもの（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびフィコエリトリン（ＰＥ）等）等の他の蛍光色素とともに使用され得る。
【0183】
７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）は、ＤＮＡと結合するとスペクトルシフトを生じる蛍光インターカレータである。７－ＡＡＤ／ＤＮＡ複合体は、４８８ｎｍレーザーで励起され得、６４７ｎｍの最大発光を有するため、この核酸染色は多色蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーに役立つ。７－ＡＡＤは、一般的に生細胞から除外される。
【0184】
ミトコンドリア活性およびカスパーゼアッセイ：アポトーシスの初期段階の特徴は、膜および酸化還元電位の変化を含むミトコンドリアの破壊である。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）染料（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｍ３４１５０、Ｍ３４１５１、およびＭ３４１５２）は、例えば、生細胞におけるミトコンドリアを染色するための膜電位依存性プローブである。ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）色素の蛍光シグナルは、脱分極した膜を有するミトコンドリアよりも活性ミトコンドリアの方が明るく、集団内の健康な細胞を識別する方法を提供する。
【0185】
レサズリンおよびホルマザン（ＭＴＴ／ＸＴＴ）は、細胞死の前兆となるアポトーシスプロセスの様々な段階を分析することができる。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）ＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＤＡＬ１０２５）は、生細胞の還元力を使用して生存率を定量的に測定することにより細胞の健康指標として機能する、すぐに使用できるレサズリンベースの溶液である。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）試薬の有効成分であるレサズリンは、毒性がない細胞透過性の化合物であり、青色で実質的に非蛍光性である。生細胞に入ると、レサズリンは還元されて、赤色で蛍光性の高い化合物レソルフィンになる。生存率の変化は、吸光度または蛍光ベースのプレートリーダーを使用して検出され得る。
【0186】
セルに加えられると、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔは、生細胞の還元環境によって修飾されて赤色に変わり、蛍光性が高くなる。この色の変化および蛍光の増加は、吸光度（５７０ｎｍおよび６００ｎｍで検出）または蛍光（５３０～５６０ｎｍの励起および５９０ｎｍでの発光を使用）を使用して検出され得る。生存率をアッセイするために、この試薬が完全培地中の細胞に添加され（洗浄または細胞溶解ステップは不要）、１～４時間インキュベートされ、吸光度または蛍光ベースのプレートリーダーを使用して読み取られる。
【0187】
アポトーシスを検出するための１つの手段は、カスパーゼ－３／７活性を検出することである。そのような検出のために使用され得る１つの試薬はＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）カスパーゼ－３／７グリーン検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ１０４２３）である。ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）カスパーゼ－３／７グリーン検出試薬は、約５０２／５３０ｎｍの最大吸収／発光を有する核酸結合色素にコンジュゲートした４アミノ酸ペプチド（ＤＥＶＤ（配列番号１７））である。ＤＥＶＤペプチド配列（配列番号１７）は、カスパーゼ－３／７の切断部位であり、コンジュゲート色素はペプチドから切断されてＤＮＡに結合するまで非蛍光性である。ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）カスパーゼ－３／７グリーン検出試薬は、ＤＥＶＤペプチド（配列番号１７）が色素がＤＮＡに結合する能力を阻害するため、本質的に非蛍光性である。しかしながら、アポトーシス細胞でカスパーゼ－３／７が活性化された後、ＤＥＶＤペプチド（配列番号１７）が切断され、色素がＤＮＡに結合して、明るい蛍光発生応答を生成できるようになる。ＤＮＡに結合したときの色素の蛍光発光は約５３０ｎｍであり、標準のＦＩＴＣフィルターセットを使用して観察され得る。
【0188】
機能アッセイ：細胞機能のアッセイは、アッセイされる細胞型に固有である傾向がある。一例として、運動性を使用して精子細胞の機能を評価することができる。配偶子の生存を使用して、受胎能力をアッセイすることができる。赤血球は、酸素濃度に基づく変形能、浸透圧脆弱性、溶血、ヘモグロビン含有量、およびＡＴＰレベルの観点から分析されている。
【0189】
核酸取り込みアッセイ：これらのアッセイは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）への成分の取り込みに基づいている。そのようなアッセイの例は、ＤＮＡへの［3Ｈ］－チミジンまたはＢｒｄＵの取り込みに基づくものである。
【0190】
細胞生存率アッセイの選択は、多くの場合、コスト、速度、アッセイの容易さ、データの再現性および／または信頼性、ならびに利用可能な測定機器等の多くの要因に基づいて行われる。これらの点に従い、例えば、以下の機器および／またはデバイスを使用して、測定データを取得することができる：光学顕微鏡、フローサイトメトリー、マイクロアレイ、シンチレーション検出器、および分光光度計。
【0191】
細胞増殖の測定は、一般に、少なくとも細胞集団に存在する生存細胞に関して、細胞生存率に直接関連している。細胞増殖および分裂する細胞の能力は、部分的に細胞生存率の尺度である。細胞集団に関して、増殖アッセイは、集団内の細胞が分裂する能力を測定する。換言すれば、非生存細胞は典型的には増殖しない。したがって、細胞集団内の増殖細胞の多くは生細胞である。しかしながら、ほとんどの細胞集団は、これらの集団内の細胞が分裂しているかどうかに関係なく、非生存細胞を含む。
【0192】
細胞増殖は、いくつかの異なる方法で測定することができる。１つのそのような方法は、細胞培養培地中で培養されている細胞の光学密度を測定することによるものである。これらの方法は、一般に、細胞が光を散乱する能力に基づいており、細胞の数が多いほど、より多くの光を散乱する。光学密度は、光度計を使用して６００ｎｍで測定されることが多い。
【0193】
細胞増殖は、蛍光色素を使用して行うこともできる。１つのそのような方法は、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｃ７０２６）の使用を含む。このキットの基本は、緑色蛍光色素であるＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）ＧＲ色素の使用であり、これは、細胞の核酸に結合すると強い蛍光増強を示す。ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）ＧＲ色素を含む緩衝液を添加して細胞を溶解し、次いで蛍光を直接測定する。このアッセイは、２００μＬの容量で５０個以下の細胞～約２５０，０００個の細胞までの線形検出範囲を有する。励起は典型的には約４８５ｎｍであり、発光検出は典型的には約５３０ｎｍである。
【0194】
キット
細胞の培養ならびに／または細胞の増殖、遺伝子操作、活性化、保存およびエレクトロポレーション高分子のためのキットも本明細書で提供される。本明細書で提供されるキットは、以下の成分のうちの１つ以上、または２つ以上を有し得る：（１）１つ以上の細胞培養培地、（２）１つ以上のエレクトロポレーション試薬、（３）１つ以上の高密度リポタンパク質、（４）１つ以上のリポタンパク質化合物（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＰＯ－ＡＩ、ＡＰＯ－ＡＩ等）、（５）Ｔ細胞を活性化するための１つ以上の試薬（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を含むビーズ）、（６）キットの成分を使用するための１つ以上の指示セット（例えば書面による指示）。
細胞の培養ならびに／または細胞の増殖、遺伝子操作、活性化、保存およびエレクトロポレーション高分子のためのキットも本明細書で提供される。本明細書で提供されるキットは、以下の成分のうちの１つ以上、または２つ以上を有し得る：（１）１つ以上の細胞培養培地、（２）１つ以上のエレクトロポレーション試薬、（３）１つ以上の高密度リポタンパク質、（４）１つ以上のリポタンパク質化合物（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＡＰＯ－ＡＩ、ＡＰＯ－ＡＩ等）、（５）Ｔ細胞を活性化するための１つ以上の試薬（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を含むビーズ）、（６）キットの成分を使用するための１つ以上の指示セット（例えば書面による指示）。
【実施例】
【0195】
実施例１：リポタンパク質を含む培養培地でのＴ細胞の増殖
材料／方法：
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１０８５０ Ｍｅｔｒｏ Ｃｏｕｒｔ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ、カタログ番号３６１－１２）を、使用するまで－８０℃で出荷および保管し、使用前に３７℃の水浴で解凍した。３つの異なるロットを購入し、試験した。
材料／方法：
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１０８５０ Ｍｅｔｒｏ Ｃｏｕｒｔ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ、カタログ番号３６１－１２）を、使用するまで－８０℃で出荷および保管し、使用前に３７℃の水浴で解凍した。３つの異なるロットを購入し、試験した。
【0196】
組換えアポリポタンパク質Ｉ（ＡＰＯ－ＡＩ）（Ａｂｃａｍ、１ Ｋｅｎｄａｌｌ Ｓｑｕａｒｅ，Ｓｕｉｔｅ Ｂ２３０４，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、カタログ番号ａｂ５０２３９）をＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で最終濃度１ｍｇ／ｍＬまで再懸濁した。
【0197】
アポリポタンパク質ＩＩ（ＡＰＯ－ＡＩＩ）：血漿由来のＡＰＯ－ＡＩＩをＬｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から入手し、冷凍して出荷し、次いで－２０℃で保存し、使用直前に解凍することにより調製して使用した（上記のＨＤＬの調製を参照されたい）。
【0198】
Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）は、造血細胞用に配合されたＬ－グルタミン、ゲンタマイシンおよびフェノールレッドを含む無血清培地である。
【0199】
別段に指定しない限り、ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびアポリポタンパク質は表６に示されるように配合された。
【表6】
【0200】
細胞培養：Ｔ細胞の単離：正常なドナー由来の非特定化された凍結アフェレーシスバッグを、ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ（９７０７ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｕｉｔｅ ２３０，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ、カタログ番号ＬＥ００５Ｆ）から入手した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１３４４Ｄ）を用いて、Ｔ細胞をＰＢＭＣから負に単離した。
【0201】
Ｔ細胞の活性化および増殖：Ｔ細胞（播種密度０．１２５×１０6ｖｃ／ｍＬ、８ｍＬの総培地中で１×１０6ｖｃ／ウェル）をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号．１１１４１Ｄ）でＴ細胞当たり３ビーズの比率で活性化し、２４ウェルＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレートでＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ中で培養した。Ｖｉ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲアナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で細胞をカウントした。
【0202】
２４ウェル静止プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５２４）で行ったＡＰＯ－ＡＩ実験を除くすべての実験は、２４ウェルＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、３３ ５ｔｈ Ａｖｅ ＮＷ，Ｓｕｉｔｅ ７００，Ｓｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ、Ｐ／Ｎ８０１９２Ｍ）で行った。
【0203】
この実施例では、以下の培地を使用した。
１．ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）＋ＨＤＬ：２．６％のＴ細胞サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３７０５０－０１）、２ｍＭのグルタミン、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３５０５００６１）、８ｍｇ／ＬのＨＤＬ。
２．完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）：２．５％のＩＣＳＲ、２．６％のＴ細胞サプリメント、２ｍＭのグルタミン、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。
１．ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）＋ＨＤＬ：２．６％のＴ細胞サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３７０５０－０１）、２ｍＭのグルタミン、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３５０５００６１）、８ｍｇ／ＬのＨＤＬ。
２．完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）：２．５％のＩＣＳＲ、２．６％のＴ細胞サプリメント、２ｍＭのグルタミン、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。
【0204】
ＨＤＬおよびＡＰＯ－ＡＩＩ実験は、２４ウェルＧ－Ｒｅｘ（登録商標）プレートで以下のプロトコルを使用して行った。
【0205】
０日目：バルクＴ細胞を、ＩＣＳＲ、Ｔ細胞サプリメント、およびグルタミンを含まない基礎ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）またはＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）中で解凍し、次いで各ウェルに合計８ｍＬで１×１０6細胞／ウェルでそれらを播種した。次いで、Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で３：１のビーズ：細胞で活性化した。次いで、ＩＬ－２を１００Ｕ／ｍＬまで加えた。
【0206】
３日目：ＩＬ－２をさらに１００Ｕ／ｍＬまで追加した。
【0207】
５日目：細胞を乱すことなく４ｍＬの全培地をゆっくりと除去することにより培地交換を行い、次いで新鮮な４ｍＬの培地をウェルに加えた。次いで、細胞を懸濁し、Ｖｉ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲアナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントした。また、ＩＬ－２をさらに１００Ｕ／ｍＬまで追加した。
【0208】
７日目：細胞を乱すことなく４ｍＬの全培地をゆっくりと除去することにより培地交換を行い、次いで細胞を乱すことなく新鮮な４ｍＬの培地を加えた。また、ＩＬ－２をさらに１００Ｕ／ｍＬまで追加した。
【0209】
１０日目：Ｖｉ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲアナライザを使用して細胞をカウントした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、磁気分離によって０．５ｘ１０6個の細胞から除去した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌに対する抗体を用いて、表面染色を行った。Ｇａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメーターおよびＫａｌｕｚａ（商標）ソフトウェアで、フローサイトメトリー分析を行った。
【0210】
ＡＰＯ－ＡＩ実験は、２４ウェル静止プレートで以下のプロトコルを使用して行った。
【0211】
０日目：バルクＴ細胞を基底ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で解凍し、各ウェルに合計８ｍＬで１×１０6細胞／ウェルでそれらを播種した。次いで、Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８で３：１のビーズ：細胞で活性化する。次いで、ＩＬ－２を１００Ｕ／ｍＬまで加えた。
【0212】
３、５および７日目：Ｖｉ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲアナライザを使用して、細胞をカウントした。細胞を０．５×１０6細胞／ｍＬの濃度で供給した。また、ＩＬ－２は、毎回の供給後にさらに１００Ｕ／ｍＬまで追加した。
【0213】
１０日目：Ｖｉ－ＣＥＬＬ（商標）ＸＲアナライザを使用して細胞をカウントした。
【0214】
表現型の決定：初代ヒトＴ細胞を、ＨＤＬあり、およびなしで１０日間増殖させた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を、磁気分離によって０．５×１０6個の細胞から除去した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＣＲ７に対する抗体を用いて、表面染色を行った。Ｇａｌｌｉｏｓ（商標）フローサイトメーターおよびＫａｌｕｚａ（商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）で、フローサイトメトリー分析を行った。
【0215】
結果：
細胞の成長および生存率：Ｔ細胞の増殖は、総増殖倍数として表される。表７および８に示されているデータは、ＩＣＳＲを含まないＨＤＬ含有培地およびＩＣＳＲを含む培地でのＴ細胞の増殖を示している。細胞は、２つの異なるセットの条件下で増殖された。条件１：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中の８ｍｇ／ＬのＨＤＬ、２．６％のＴ細胞サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３７０５０－０１）、２ｍＭのグルタミン、および４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。条件２：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中の２．６％のＩＣＳＲ、Ｔ細胞サプリメント、２ｍＭのグルタミン、および４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。結果は、ＩＣＳＲを含まないがＨＤＬが添加されたＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）でＴ細胞を増殖させると、Ｔ細胞成長が有意に増加することを示した。表８は、条件１および２で増殖させたＴ細胞の生存率が、５日目および７日目にＨＤＬにより有意に増加することを示すデータを示している。
細胞の成長および生存率：Ｔ細胞の増殖は、総増殖倍数として表される。表７および８に示されているデータは、ＩＣＳＲを含まないＨＤＬ含有培地およびＩＣＳＲを含む培地でのＴ細胞の増殖を示している。細胞は、２つの異なるセットの条件下で増殖された。条件１：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中の８ｍｇ／ＬのＨＤＬ、２．６％のＴ細胞サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ３７０５０－０１）、２ｍＭのグルタミン、および４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。条件２：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中の２．６％のＩＣＳＲ、Ｔ細胞サプリメント、２ｍＭのグルタミン、および４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）。結果は、ＩＣＳＲを含まないがＨＤＬが添加されたＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）でＴ細胞を増殖させると、Ｔ細胞成長が有意に増加することを示した。表８は、条件１および２で増殖させたＴ細胞の生存率が、５日目および７日目にＨＤＬにより有意に増加することを示すデータを示している。
【0216】
ＨＤＬを用いた実験を８回行ったが、結果はＨＤＬが５日目に平均８倍、１０日目に６．６倍成長を増加させることを示している。ＨＤＬは５日目に平均２２．５％生存率を増加させることが分かった。
【0217】
図４（表１０および１１）は、ＨＤＬが成長に対して使用時に添加するのと同じ効果があるかどうかを評価するためにＨＤＬがＴ細胞サプリメントに配合されたデータを示す。４人の異なるドナーからのＴ細胞を試験した。結果は、Ｔ細胞サプリメントに配合されたＨＤＬが、細胞成長に対して使用時にＨＤＬを添加した場合と同じ効果を示したことを実証した。結果はまた、５日目に完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較してＨＤＬを含む条件で成長の４．４倍の増加を示し、５％ヒト血清を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ、カタログ番号ＢＥＢＰ０２－０５４Ｑ）と比較してＨＤＬの１．３倍の増加を示した。図５（表１２および１３）は、ＨＤＬを含むＴ細胞サプリメント、使用時点でのＨＤＬ、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、および５％ヒト血清を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）中で増殖させた細胞の生存率のデータを示す。結果は、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＨＤＬで細胞生存率が３４％増加することを示した。
【0218】
図６（表１４）は、ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で成長させた細胞のＣＤ８：ＣＤ４比率を示す。結果は、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＨＤＬを含む条件ではＣＤ８対ＣＤ４の比率に１．８倍の変化があることを示した。
【0219】
図７（表１５）は、１０日目に評価された細胞の表現型を示している。結果は、ＨＤＬを含む細胞が完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（ＣＯ）と比較してより高いＣＤ２７＋およびＣＣＲ７＋表現型を有していたことを示している。
【0220】
表１６、１７、および１８は、ネイティブＡＰＯ－ＡＩＩがＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で試験されたデータを示している。結果は、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（ＣＯ）と比較して、２μｇ／ｍＬのＡＰＯ－ＡＩＩを含む条件では、５日目に平均１．３倍の成長の増加、および１０日目に１．３倍の成長の増加があることを示している。図８Ａ、９Ａ、および１０Ａに示される生存率は、２μｇ／ｍＬのＡＰＯ－ＡＩＩを含む条件で５日目に平均１４．３％の増加、および１０日目に平均９．５％の増加を示す。
【0221】
表１９に示すデータは、ＩＣＳＲを含む組換えＡＰＯ－ＡＩ培養培地を使用してＴ細胞の増殖が決定されたときに生成されたものである。結果は、１０日目の成長が１．１倍増加したことを示している。表２０のデータは、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（ＣＯ）の使用と比較して、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中では１ｍｇ／ｍｌのＡＰＯ－ＡＩ＋ＩＣＳＲを含む条件で５日目の生存率が３．５％増加し、１０日目の生存率が５．６％増加することを示している。
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【表13】
【表14】
【表15】
【表16】
【表17】
【表18】
【表19】
【表20】
【0222】
実施例２：脂質で増殖させた細胞のエレクトロポレーション
方法
別段に指定されない限り、この実施例では以下の方法が使用された。また、この実施例では、ＨＤＬはＬｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１０８５０ Ｍｅｔｒｏ Ｃｏｕｒｔ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ（カタログ番号３６１－１０および３６１－１２）から入手し、さらに希釈せずに培地に直接添加した。
方法
別段に指定されない限り、この実施例では以下の方法が使用された。また、この実施例では、ＨＤＬはＬｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１０８５０ Ｍｅｔｒｏ Ｃｏｕｒｔ，Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＯ（カタログ番号３６１－１０および３６１－１２）から入手し、さらに希釈せずに培地に直接添加した。
【0223】
（１）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体ビーズを含むビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１１３１Ｄ）ならびに（２）ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＣＴＰ００２１）を使用して、回復培地（６ｍｇ／ＬのＨＤＬを含み、ＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）、ここでは「ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ」と呼ばれる）または対照としての完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）（ＩＣＳＲを含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標））中で３日間Ｔ細胞を活性化した。３日目に細胞をカウントし、洗浄し、次いでＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１１０５８０２１）に再懸濁し、エレクトロポレーションした（Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、１１００Ｖ、各２０ｍｓの２つのパルス長）。エレクトロポレーション後、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を含むＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）完全培地中で細胞をインキュベートした。ｐＡＡＶ－ＧＦＰベクター（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号ＡＡＶ－４００）を使用して、細胞生存率およびエレクトロポレーション効率（ＧＦＰ発現）をエレクトロポレーションの２４時間後に決定した。フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｇａｌｌｉｏｓ（商標）機器）を使用してＧＦＰ発現を決定した。細胞を７日目にカウントし、新鮮な培地およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を含む０．５ｘ１０6／ｍｌの濃度で新しい１２ウェル静止プレートに移し、生存率およびカウントが決定される１０日目まで培養した。
【0224】
図１４および１５に示されるデータは、以下のバリエーションで生成された。これらの実験では、１０日間のワークフローを通して、細胞を指定された培養培地と継続的に接触させた。
【0225】
結果
本明細書に記載されている実験のいくつかでは、個々のドナー間でデータの変動が見られた。そのような変動は、５人の異なるドナーからのＴ細胞を使用して生成されたデータを示す図８において観察され得る。
本明細書に記載されている実験のいくつかでは、個々のドナー間でデータの変動が見られた。そのような変動は、５人の異なるドナーからのＴ細胞を使用して生成されたデータを示す図８において観察され得る。
【0226】
図８に示すデータは、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で培養されたＴ細胞間の生存率データの比較を表している。各時点および各ドナーのベースライン（ゼロ）は、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中のＴ細胞の細胞生存率測定によって設定された。したがって、各バーの高さは生存率の違いを反映している。
【0227】
図８のデータは、エレクトロポレーションの２４時間後に生存率に最大の違いが見られ、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ試料のＴ細胞生存率の平均的な向上は約２０％である。データから分かるように、エレクトロポレーション前のＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ中で増殖させたＴ細胞の生存率は、エレクトロポレーション後２４時間の５つのドナー試料すべてにおいて、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で増殖させたＴ細胞よりも高い。これらのデータは、６ｍｇ／ＬのＨＤＬによるＴ細胞のエレクトロポレーション前の増殖が、エレクトロポレーションの２４時間後に細胞生存率の増加をもたらすことを実証している。
【0228】
図９に示されるデータもまた、６ｍｇ／ＬのＨＤＬによるＴ細胞のエレクトロポレーション前の増殖が、エレクトロポレーション後のより高い細胞生存率をもたらすことを実証している。特に、図９に示されるデータは、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）よりも、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標６ＨＤＬにおいてエレクトロポレーションの２４時間後の細胞生存率のより低い平均減少を示している。ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬの場合、３日目および７日目の平均細胞生存率は約９０％であることが示された（３日目：８８．９５％、ＳＤ ２．４２；７日目：９１．８３％、ＳＤ ３．０８）が、これは４日目で平均約７０％に減少する（７１．１４％、ＳＤ ７．２６）。完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の場合、３日目および７日目の平均細胞生存率は約８７％であることが示された（３日目：８６．５７％、ＳＤ １．１３；７日目：８８．１７％、ＳＤ ５．７９）が、これは４日目で平均約５０％に減少する（５０．８３％、ＳＤ １０．５４）。したがって、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬの４日目の生存率の低下は約１８％（１７．８１％）であり、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）の４日目の生存率の低下は約３６％（３５．７４％）である。したがって、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ中の細胞の増殖は、エレクトロポレーションの２４時間後に完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中よりも約５０％高い細胞生存率をもたらす。
【0229】
図１０に記載のデータは、エレクトロポレーション前のＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ中で増殖したＴ細胞が、完全ＣＴＳＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中で増殖したＴ細胞よりも１０日目に高い増殖を達成する（それぞれ４６．３４倍の増殖、ＳＤ １６．６２対４１．０５倍の増殖、ＳＤ １１．８３）ことを示している。
【0230】
図１１および１２は、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬおよび完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中でのエレクトロポレーションの前に増殖させたＴ細胞のエレクトロポレーション効率の比較を示している。エレクトロポレーション効率は、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬにおいて平均５８．９９％、ＳＤ １１．６４、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）において５１．７４％、ＳＤ ５．７９であることが分かった。したがって、完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）と比較して、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬにおいて約７％のエレクトロポレーション効率の増加が観察された。
【0231】
図１３に示されるデータは、異なる条件下で２人のドナーから得られたＴ細胞のエレクトロポレーション効率の比較を示している。最高の一貫したエレクトロポレーション効率が、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）６ＨＤＬ、ならびに５ｍｇ／ＬのＨＤＬおよび１ｍｇ／ＬのＬＤＬを含むＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）で見られた。
【0232】
図１４に示されるデータは、細胞がＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中でＨＤＬおよびＬＤＬと接触し続けている場合、エレクトロポレーション後７日間にわたってＴ細胞の生存率が維持されることを示している。図１５のデータは、ＩＣＳＲを含まないＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）中でＨＤＬおよびＬＤＬと接触し続けたＴ細胞の増殖が、エレクトロポレーション後に完全ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）に移されたＴ細胞よりも著しく遅かったことを示している。したがって、図１４および１５に示されるデータは、核酸分子がＴ細胞に導入され得、細胞が低増殖／高生存率状態で少なくとも７日間維持され得ることを実証している。
【表21】
【表22】
【表23】
【表24】
【表25】
【表26】
【0233】
他の実施形態
本発明を、発明を実施するための形態と併せて記載している一方で、前述の記載は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明を、発明を実施するための形態と併せて記載している一方で、前述の記載は、例示を意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【0234】
本発明が、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、記載される一方で、当業者であれば、形態および詳細の様々な変更が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その中で行われ得ることを理解するであろう。
【0235】
実施形態は、以下の番号付き条項に従ってもよい。
【0236】
項１．無血清細胞培養培地を調製するための方法であって、リポタンパク質粒子組成物またはリポタンパク質組成物を基礎培養培地に添加することを含み、リポタンパク質粒子組成物またはリポタンパク質組成物が血清代替物として機能する量で添加される方法。
【0237】
項２．リポタンパク質粒子組成物が、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、項１に記載の方法。
【0238】
項３．リポタンパク質粒子組成物が、ヒト血液から得られたリポタンパク質粒子を含む、項１または２に記載の方法。
【0239】
項４．リポタンパク質粒子組成物が、合成リポタンパク質粒子を含む、項１または２に記載の方法。
【0240】
項５．リポタンパク質粒子組成物が、合成高密度リポタンパク質粒子を含む、項１、２、または４のいずれか１つに記載の方法。
【0241】
項６．合成リポタンパク質粒子が、アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩを含む、項４に記載の方法。
【0242】
項７．合成リポタンパク質粒子が、アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩの一部を含む、項５に記載の方法。
【0243】
項８．アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩが、組換え的に産生される、項６または７に記載の方法。
【0244】
項９．アポリポタンパク質ＡＩまたはアポリポタンパク質ＡＩＩの組換え的生産が、非哺乳動物細胞を使用して行われる、項８に記載の方法。
【0245】
項１０．非哺乳動物細胞が、昆虫細胞である、項９に記載の方法。
【0246】
項１１．１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地であって、無血清細胞培養培地は、哺乳動物細胞の増殖を補助し、哺乳動物細胞の増殖は、１つ以上のリポタンパク質化合物を含まないが血清を含む培地で増殖した同じ細胞と比較して、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地において１０％増加する、無血清細胞培養培地。
【0247】
項１２．１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、アポリポタンパク質ＡＩである、項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【0248】
項１３．１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、アポリポタンパク質ＡＩＩである、項１１または１２に記載の無血清細胞培養培地。
【0249】
項１４．１つ以上のリポタンパク質化合物のうちの少なくとも１つが、リポタンパク質粒子の成分である、項１１～１３のいずれか１つに記載の無血清細胞培養培地。
【0250】
項１５．リポタンパク質粒子が、高密度リポタンパク質である、項１４に記載の無血清細胞培養培地。
【0251】
項１６．リポタンパク質粒子が、哺乳動物から得られる、項１４または１５に記載の無血清細胞培養培地。
【0252】
項１７．リポタンパク質粒子が、非天然型である、項１４または１５に記載の無血清細胞培養培地。
【0253】
項１８．非天然リポタンパク質粒子が、非天然タンパク質、天然アポリポタンパク質、または天然アポリポタンパク質の一部のいずれかを含む、項１７に記載の無血清細胞培養培地。
【0254】
項１９．細胞生存率の増加が、１０％～約７５％の範囲にある、項１１～１８のいずれか１つに記載の無血清細胞培養培地。
【0255】
項２０．哺乳動物細胞が、ハイブリドーマ細胞である、項１１に記載の無血清細胞培養培地。
【0256】
項２１．哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、項２０に記載の無血清細胞培養培地。
【0257】
項２２．ヒト細胞が、免疫細胞である、項２１に記載の無血清細胞培養培地。
【0258】
項２３．免疫細胞が、Ｔ細胞である、項２２に記載の無血清細胞培養培地。
【0259】
項２４．Ｔ細胞が、（ａ）調節性Ｔ細胞、（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞、（ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、（ｄ）ＴＨ１細胞、（ｅ）ＴＨ２細胞、（ｆ）ＴＨ３細胞、（ｇ）ＴＨ１７細胞、（ｈ）ＴＨ９細胞、および（ｉ）ＴＦＨ細胞からなる群から選択される１以上のＴ細胞である、項２３に記載の無血清細胞培養培地。
【0260】
項２５．Ｔ細胞が、ＣＤ３表面マーカーへのライゲーションを介して血液から単離される、項２３または２４に記載の無血清細胞培養培地。
【0261】
項２６．哺乳動物細胞を増殖させるための方法であって、哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、１つ以上のリポタンパク質化合物を含む無血清細胞培養培地中で哺乳動物細胞をインキュベートすることを含む、方法。
【0262】
項２７．リポタンパク質化合物が、１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、項２６に記載の方法。
【0263】
項２８．リポタンパク質粒子化合物が、（ａ）高密度リポタンパク質粒子、（ｂ）低密度リポタンパク質粒子、および（ｃ）超低密度リポタンパク質粒子からなる群から選択される１つ以上のリポタンパク質粒子を含む、項２７に記載の方法。
【0264】
項２９．哺乳動物細胞集団のエレクトロポレーションのための方法であって、（ａ）哺乳動物細胞の増殖を可能にする条件下で、無血清培養培地中で少なくとも１２時間、哺乳動物細胞集団を１つ以上のリポタンパク質化合物と接触させることと、（ｂ）哺乳動物細胞集団に１つ以上の電気パルスを印加して、それにより哺乳動物細胞集団のメンバーの細胞膜をエレクトロポレーションすることと、を含み、エレクトロポレーション効率は少なくとも６０％であり、哺乳動物細胞集団における細胞の生存率は１０％未満減少する、方法。
【0265】
項３０．エレクトロポレーション効率が、哺乳動物細胞集団のメンバーにおける検出可能なマーカーの発現によって測定される、項２９に記載の方法。
【0266】
項３１．検出可能なマーカーが、蛍光タンパク質である、項３０に記載の方法。
【0267】
項３２．活性化されたＴ細胞集団を維持するための方法であって、（ａ）Ｔ細胞の活性化集団を生成することと、（ｂ）リポタンパク質サプリメントの存在下で、ステップ（ａ）において生成されたＴ細胞の活性化集団を増殖させることと、（ｃ）ステップ（ｂ）において生成された増殖したＴ細胞の活性化集団を、次の７日間で細胞増殖速度の少なくとも３０％の低下をもたらすのに十分な強度の電界に曝露することと、（ｄ）ステップ（ｂ）と同じ条件下でステップ（ｃ）のＴ細胞の活性化集団を７日間維持することと、を含み、ステップ（ａ）～（ｄ）の間のＴ細胞の活性化集団の生存率は７０％超を維持する、方法。
【0268】
項３３．１つ以上の核酸分子が、ステップ（ｃ）において、Ｔ細胞の活性化集団の個々のＴ細胞に導入される、項３２に記載の方法。
【0269】
項３４．１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つが、キメラ抗原受容体をコードする、項３３に記載の方法。
【0270】
項３５．キメラ抗原受容体が、Ｔ細胞の活性化集団の個々のＴ細胞において安定して発現される、項３４に記載の方法。
【0271】
項３６．Ｔ細胞の活性化集団が、ステップ（ｂ）において３日間増殖される、項３２に記載の方法。
【0272】
項３７．（ｅ）ステップ（ｄ）後にＴ細胞の活性化集団を洗浄することと、（ｆ）リポタンパク質サプリメントの非存在下で、ステップ（ｅ）において生成された洗浄されたＴ細胞の活性化集団を増殖させることと、をさらに含む、項３２に記載の方法。
【0273】
項３８．５日間の期間にわたり、洗浄されたＴ細胞の活性化集団の生存率が７０％超を維持し、洗浄されたＴ細胞の活性化集団が、少なくとも３倍増殖する、項３７に記載の方法。
【0274】
項３９．Ｔ細胞の活性化集団が、ステップ（ｄ）の間に異なる場所に輸送される、項３２に記載の方法。
【0275】
項４０．異なる場所が、１００マイル超離れている、項３２に記載の方法。
【0276】
項４１．哺乳動物細胞を保存するための方法であって、（ａ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で哺乳動物細胞を増殖させるステップと、（ｂ）哺乳動物細胞を電界に曝露するステップと、（ｃ）１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地中で哺乳動物細胞を増殖させるステップと、をこの順番で含み、ステップ（ｃ）における哺乳動物細胞は、ステップ（ａ）よりも少なくとも５０％低い速度で増殖し、哺乳動物細胞の生存率は、ステップ（ａ）～（ｃ）の間７０％超を維持する、方法。
【0277】
項４２．哺乳動物細胞が、Ｔ細胞である、項４１に記載の方法。
【0278】
項４３．哺乳動物細胞が、ステップ（ｃ）において７日間増殖される、項４１に記載の方法。
【0279】
項４４．ステップ（ｃ）における哺乳動物細胞の細胞生存率が、７日間の増殖の間、７０％超を維持する、項４３に記載の方法。
【0280】
項４５．ステップ（ｃ）における哺乳動物細胞が洗浄され、少なくとも５０％低い濃度の１つ以上のリポタンパク質化合物を含む培養培地に移される、項４１に記載の方法。
【0281】
項４６．核酸分子が、ステップ（ｂ）において哺乳動物細胞に導入される、項４１に記載の方法。
【0282】
項４７．核酸分子が、キメラ抗原受容体をコードする、項４６に記載の方法。
【0283】
項４８．哺乳動物細胞が、Ｔ細胞である、項４７に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】