▶ チルドレンズ ホスピタル メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-13
(54)【発明の名称】改変細胞および関連する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/12 20150101AFI20220906BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220906BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220906BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220906BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220906BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220906BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20220906BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220906BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220906BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20220906BHJP
A61K 35/14 20150101ALI20220906BHJP
【ＦＩ】
A61K35/12
C12N5/10 ZNA
C12N15/12
A61P43/00 111
A61P21/00
A61P21/04
A61P21/02
A61P3/10
A61P35/00
A61K35/28
A61K35/14 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500951
(86)(22)【出願日】2020-07-09
(85)【翻訳文提出日】2022-02-25
(86)【国際出願番号】 US2020041309
(87)【国際公開番号】W WO2021007383
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】62/872,610
(32)【優先日】2019-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500469235
【氏名又は名称】チルドレンズ ホスピタル メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ミレイ，ダグラス
(72)【発明者】
【氏名】ミタニ ヤスユキ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BB65
4C087MA13
4C087MA16
4C087MA22
4C087MA23
4C087MA28
4C087MA31
4C087MA35
4C087MA37
4C087MA41
4C087MA43
4C087MA52
4C087MA55
4C087MA56
4C087MA58
4C087MA59
4C087MA60
4C087MA63
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZA94
4C087ZB26
4C087ZC02
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞を含む。本発明の特定の実施形態は、改変細胞を使用する方法を含む。本発明の他の実施形態は、改変細胞を投与する方法を含む。本発明のさらなる実施形態は、疾患を治療するために改変細胞を投与する方法を含む。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変細胞を動物に投与するための方法であって、改変細胞を動物に投与することを含み、
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを発現するか、またはその両方である、方法。
【請求項2】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現するか、またはその両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを発現する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記ジストロフィンポリペプチドが、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記改変細胞が、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記改変細胞が、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現する、ＭＳＣ細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記投与することが、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、デポー注射、皮下投与、局所投与、皮内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記投与することが、注射または筋肉内注射である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記動物が、哺乳動物、霊長類、サル、マカク、アカゲザル、またはブタオザル、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、トリ、ニワトリ、マウス、ウサギ、およびラットから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記動物が、マウス、ラット、またはヒトである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記動物が疾患の治療を必要としている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記疾患が、前記動物の細胞がジストロフィンを過少発現するか、ジストロフィンを発現しないか、または欠陥のある形態のジストロフィンを発現する疾患である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記疾患が、ミオパチー、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病とも称される）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病とも称される）、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）、またはサルコペニアである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記疾患が筋ジストロフィーである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを発現するか、またはその両方である、改変細胞。
【請求項17】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現するか、またはその両方である、請求項１６に記載の改変細胞。
【請求項18】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを発現する、請求項１６または１７に記載の改変細胞。
【請求項19】
前記ジストロフィンポリペプチドが、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項20】
前記改変細胞が、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項21】
前記改変細胞が、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の改変細胞。
【請求項22】
前記改変細胞が、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現する、ＭＳＣ細胞である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の改変細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８７２，６１０号、表題「ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，ＣＥＬＬＳ，ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８７２，６１０号、表題「ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，ＣＥＬＬＳ，ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ」の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＮＩＨ ＡＲ０６８２８６の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＮＩＨ ＡＲ０６８２８６の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
【0003】
配列表の参照
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０＿０７＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿３６８２１＿０４０４９＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、７３ＫＢのサイズである。
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表が含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月２９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは、２０２０＿０７＿ｓｅｑ＿ｌｉｓｔｉｎｇ＿３６８２１＿０４０４９＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称であり、７３ＫＢのサイズである。
【背景技術】
【0004】
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、筋肉細胞膜の安定性を提供するジストロフィン－糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の変異によって引き起こされる一群の遺伝性筋障害である。ＭＤの１つの形態は、３５００人に１人の男児に発症し、ジストロフィンの突然変異によって引き起こされるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）であり、重度の筋消耗をもたらす。いくつかの治療および治療戦略が可能性を示すが、代替の戦略が有益な場合がある。
【0005】
本発明の特定の実施形態は、上記の問題のうちの１つ以上に対応する。本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞を含む。本発明の特定の実施形態は、改変細胞を使用する方法を含む。本発明の他の実施形態は、改変細胞を投与する方法を含む。本発明のさらなる実施形態は、疾患を治療するために改変細胞を投与する方法を含む。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
【発明の概要】
【0006】
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞を動物に投与することを含む、改変細胞を動物に投与するための方法を含み、改変細胞は、本明細書に開示されるような改変細胞である。いくつかの実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを発現するか、またはその両方である。他の実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現するか、またはその両方である。さらに他の実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンである。特定の実施形態において、改変細胞は、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である。さらに他の実施形態において、改変細胞は、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である。いくつかの実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現する、ＭＳＣ細胞である。他の実施形態において、投与することは、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、デポー注射、皮下投与、局所投与、皮内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与である。特定の実施形態において、投与することは、注射または筋肉内注射である。さらに他の実施形態において、動物は、哺乳動物、霊長類、サル、マカク、アカゲザル、またはブタオザル、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、トリ、ニワトリ、マウス、ウサギ、およびラットから選択される。さらに他の実施形態において、動物は、マウス、ラット、またはヒトである。いくつかの実施形態において、動物は、疾患の治療を必要としている。特定の実施形態において、疾患は、動物の細胞がジストロフィンを過少発現するか、ジストロフィンを発現しないか、または欠陥のある形態のジストロフィンを発現する疾患である。さらに他の実施形態において、疾患は、ミオパチー、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病とも称される）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病とも称される）、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）、またはサルコペニアである。さらに他の実施形態において、疾患は筋ジストロフィーである。
【0007】
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に開示されるような改変細胞を含む。他の実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを発現するか、またはその両方である。特定の実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現するか、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現するか、またはその両方である。さらに他の実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィンである。さらに他の実施形態において、改変細胞は、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である。特定の実施形態において、改変細胞は、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞である。いくつかの実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを発現し、ジストロフィンポリペプチドを過剰発現する、ＭＳＣ細胞である。
【0008】
本発明の他の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
本特許または出願ファイルは、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願の刊行物のコピーは、要請および必要な手数料の支払いに応じて特許庁から提供される。
【0010】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【0011】
【図1】ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと筋肉細胞とのインビトロおよびインビボ異種融合。（Ａ）インビトロ融合試験の概略図。ＷＴマウスの骨髄からＭＳＣを単離し、ｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスで形質導入し、次いで、ＷＴ初代筋芽細胞と共培養し、分化させた。（Ｂ）５日間の分化後に細胞を固定し、ミオシン抗体で免疫染色した（赤）。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣは、筋芽細胞と融合してキメラ筋管を形成した（ミオシン＋ ＧＦＰ＋）。（Ｃ）移植の２４時間前に心臓毒で損傷させたＷＴマウスのＴＡ筋にＭＳＣを移植してから４週間後の代表的な筋肉切片。切片をジストロフィン抗体で染色して（赤）筋線維を同定した。（Ｄ）切片当たりのＧＦＰ＋筋線維の数の定量化。データは平均±ＳＥＭ、ｎ＝４筋肉として表される。＊＊空と比較してｐ＜０．０１。スケールバー：１００μｍ。
【図2】Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣは損傷のない筋肉と融合する。（Ａ）ＷＴマウスの損傷のないＴＡ筋にＭＳＣを移植してから２週間後の代表的な筋肉切片。中心核を有する筋線維および有しない筋線維の両方でＧＦＰ蛍光が観察されたことから、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが再生線維および非再生線維の両方と融合したことが示唆される。ＤＭＤ：ジストロフィン。（Ｂ）Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するＭＳＣは、心筋と容易に融合しない。ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを直接心臓内注射によってＲｏｓａｍＴｍＧマウスに送達し、移植の３日後または１４日後に共焦点顕微鏡によって生着を評価した。送達後３日でレシピエントの心臓（膜ｔｄＴｏｍａｔｏ＋）内の注射部位に沿ってＭｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣ（ＧＦＰ＋）が検出され、１４日間保持された。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣは、注射の領域を示す針穿刺創内に局在していたが、心筋細胞とのＭＳＣ融合はほとんど検出されなかった。矢印は、膜ｔｄＴｏｍａｔｏ＋心筋細胞内の細胞質ＧＦＰによって示される単一の融合事象を示す。スケールバー、１００μｍ。（Ｃ）損傷のない筋肉にｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを移植した後の、中心核を有するおよび有しない切片当たりのＧＦＰ＋線維の定量化。ｎ＝４つの筋肉。＊＊中心核を有しない空と比較してｐ＜０．０１。（Ｄ）タモキシフェンレジメンは、衛星細胞のｍｙｏｍａｋｅｒを効率的に欠失させ、融合の欠如をもたらす。ＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘｐ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスをタモキシフェンで５日間連続して処理した（ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ）。対照は、ビヒクルで処理したＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘｐ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスであった。筋形成前駆細胞を活性化するために複数の筋肉を心臓毒（ＣＴＸ）で損傷させ、それらの細胞を損傷の３日後に単離した。（Ｅ）タモキシフェンレジメンは、衛星細胞のｍｙｏｍａｋｅｒを効率的に欠失させ、融合の欠如をもたらす。ｑＰＣＲによるｍｙｏｍａｋｅｒの発現により、ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスからの筋芽細胞における効率的な欠失が明らかになった。（Ｆ）タモキシフェンレジメンは、衛星細胞のｍｙｏｍａｋｅｒを効率的に欠失させ、融合の欠如をもたらす。対照およびｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ筋芽細胞を、３日間分化させた。対照筋芽細胞は正常に融合したが、ｍｙｏｍａｋｅｒヌル筋芽細胞は融合することができなかった。（Ｇ）ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスを使用した移植試験の概略図。衛星細胞由来のｍｙｏｍａｋｅｒを、タモキシフェンで５日間連続して処理することにより欠失させた。（Ｈ）ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスの損傷のないＴＡ筋にｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを移植してから２週間後の代表的な筋肉切片。ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスにおいて中心核が観察されなかったことから、再生の阻害が示される。（Ｉ）ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ筋肉に移植後の中心核を有するおよび有しない切片当たりのＧＦＰ＋線維の数の定量化。Ｎ．Ｓ．、有意ではない。ｎ＝４～６つの筋肉。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｊ）ＷＴ筋芽細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒ ＫＯ筋芽細胞よりも効率的に融合する。筋芽細胞をＷＴ ＴＡ筋に移植してから２週間後の筋肉切片。初代筋芽細胞を、ＷＴおよびｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスの筋肉から単離し、それぞれＧＦＰおよびｄｓＲｅｄで形質導入した。筋芽細胞の各集団を、別々に移植するかまたは混合して、移植の２４時間前に心臓毒で損傷させたＷＴマウスのＴＡ筋に移植した。ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞は、ｄｓＲＥＤ－ｍｙｏｍａｋｅｒ ＫＯ筋芽細胞と比較して生着の増加を示した。ｄｓＲｅｄ＋非融合単核細胞（中央パネル－矢印）が観察されたが、ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞の移植後にはこれは見られなかった（左パネル）。同時移植後（右パネル）、最小限のｄｓＲｅｄ＋（矢印）およびＧＦＰ＋ ｄｓＲｅｄ＋筋線維（矢印）が検出された。ｎ＝３～４。スケールバー：１００μｍ。
【図3】異種融合後のｍｄｘ４ｃｖ筋肉におけるジストロフィン回復の評価。（Ａ）インビトロ融合試験のためのプロトコルの概略図。ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを、ｍｄｘ４ｃｖマウスから単離した初代筋芽細胞と共培養し、分化させた。（Ｂ）５日間の分化後に細胞を固定し、ジストロフィン抗体で免疫染色した。ジストロフィン発現は、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと融合した筋管の膜で観察されたが、非融合ｍｄｘ４ＣＶ筋管では観察されなかった。（Ｃ）ｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡ筋に、ＧＦＰ発現ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣ、または対照としてＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞を移植してから２週間または６週間後の筋肉切片。ｍｄｘ４ｃｖマウスの１つの群を、リプログラミングを強化する手段としてトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。融合（ＧＦＰ＋筋線維）は両方の時点で観察されたが、ＧＦＰ＋ジストロフィン＋筋線維は筋芽細胞移植筋肉でのみ検出された。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣ移植筋肉のジストロフィン＋筋線維は、ＧＦＰ＋ではなく、復帰変異体（矢印）である可能性が高い。（Ｄ）ＭＳＣ移植の２週間後の筋肉における切片当たりのＧＦＰ＋線維の数の定量化。ｎ＝４つの筋肉。＊空と比較してｐ＜０．０５。スケールバー：Ｂ、２５μｍ；Ｃ、１００μｍ。データは平均±ＳＥＭとして表される。
【図4】ＣＢＳＣおよびＴＴＦのｍｄｘ４ｃｖ筋肉とのｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性異種融合ならびにジストロフィンによるリプログラミング。（Ａ）インビトロ融合試験のためのプロトコルの概略図。ＣＢＳＣをＲｏｓａ２６ｍＴｍＧマウスの脛骨および大腿骨から単離し、ｍｙｏｍａｋｅｒレトロウイルスに感染させた。ＴＴＦをＷＴマウスの尾の先端から単離し、ｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰを用いてレトロウイルスで形質導入した。細胞をｍｄｘ４ｃｖ初代筋芽細胞と共培養し、分化させた。（Ｂ）５日間の分化後に共培養細胞を固定し、ミオシンおよびジストロフィン（ＤＭＤ）抗体で免疫染色した。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣおよびＴＴＦは、筋芽細胞と融合してキメラ筋管を形成し、膜でジストロフィンの発現を示した。（Ｃ）ＭＳＣ、ＣＢＳＣ、およびＴＴＦにおけるｍｙｏｍａｋｅｒの定量的ＲＴ－ＰＣＲは、非筋肉細胞の感染後のｍｙｏｍａｋｅｒの発現が類似していることを示している。各細胞型は、分化した筋芽細胞（ＤＭ）よりも高いｍｙｏｍａｋｅｒレベルを示す。ＧＭ：増殖培地。（Ｄ）ｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡ筋に、それぞれＣＢＳＣおよびＴＴＦを移植してから２週間後および１０週間後の代表的な筋肉切片。ｍｙｏｍａｋｅｒ細胞を移植した筋肉にｍＴｏｍａｔｏ＋またはＧＦＰ＋筋線維が観察されたことから融合が示唆されたが、それらにジストロフィンは検出されなかった。ｍｄｘ４ｃｖマウスでは、復帰変異体線維（矢印）のみが観察された。（Ｅ）切片当たりのｍＴｏｍａｔｏ＋またはＧＦＰ＋線維の数の定量化。ｎ＝３つまたは４つの筋肉。＊空と比較してｐ＜０．０５。データは平均±ＳＥＭとして表される。スケールバー：Ｂ（１番目および３番目のパネル）およびＤ、１００μｍ；Ｂ（２番目および４番目のパネル）、２５μｍ。
【図5】異種細胞融合により誘導されるジストロフィンによらないインビボでのリプログラミング。（Ａ）インビボでのリプログラミングを検出するためのプロトコルの概略図。ＣＢＳＣをＭｙｌ１Ｃｒｅ／＋マウスから単離し、ｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスで形質導入し、次いで、Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＣＴＸ損傷ＴＡに移植した。（Ｂ）ＣｒｅのＰＣＲは、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣがＣｒｅを発現しないことを示している。β－アクチン－ＣｒｅマウスのＴＴＦを陽性対照として使用した。（Ｃ）移植の４週間後にｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣまたはｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣのいずれかを移植したＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ筋肉のホールマウント蛍光画像。（Ｄ）移植後のＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスからのＴＡの代表的な切片。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣおよびｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣの両方が融合した（ＧＦＰ＋筋線維）が、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現（リプログラミング）はｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣを移植した筋肉でのみ観察された。スケールバー：Ｃ、１ｃｍ；Ｄ、１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【0012】
一般的な発明の概念を包含する実施形態は多様な形態をとることができるが、本開示は単なる例示とみなされるべきであり、一般的な発明の概念は開示される実施形態に限定されることを意図しないことを理解して、様々な実施形態を本明細書で説明する。
【0013】
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞を含む。本発明の特定の実施形態は、改変細胞を使用する方法を含む。本発明の他の実施形態は、改変細胞を投与する方法を含む。本発明のさらなる実施形態は、疾患を治療するために改変細胞を投与する方法を含む。本発明の追加の実施形態もまた、本明細書で論じられる。
【0014】
ＭｙｏｍａｋｅｒポリペプチドおよびＭｙｏｍａｋｅｒ核酸分子
本発明のいくつかの実施形態は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を含む組成物、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を含む細胞、またはｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を使用することを含む。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１に開示されるｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１の表１０Ａに開示されているｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１に開示されるｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１の表２に開示されているｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。「ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」という用語は、「ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」（すなわち、意図的に人為的な改変をしていない、天然に見られるｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）および「変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドに１つ以上の改変が加えられている）を包含する。ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの非限定的な例は、ＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１の表１０Ａ、ＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１の表２、または表１Ａに見られる。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、ラット、ネコ、ウサギ、ヒト、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、サル、ツパイ、イヌ、ブタ、トガリネズミ、ゾウ、またはオポッサムを含むがこれらに限定されない任意の動物からのｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドであり得る。表１Ａは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの非限定的な例を提供し、表１Ｂおよび１Ｃは、関連する核酸配列（開始および停止コドンを含む）の非限定的な例を提供する。
本発明のいくつかの実施形態は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を含む組成物、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を含む細胞、またはｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子、もしくはその両方を使用することを含む。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１に開示されるｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１の表１０Ａに開示されているｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１に開示されるｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１の表２に開示されているｍｙｏｍａｋｅｒタンパク質である。「ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」という用語は、「ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」（すなわち、意図的に人為的な改変をしていない、天然に見られるｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）および「変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドに１つ以上の改変が加えられている）を包含する。ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの非限定的な例は、ＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１の表１０Ａ、ＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１の表２、または表１Ａに見られる。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、ラット、ネコ、ウサギ、ヒト、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、サル、ツパイ、イヌ、ブタ、トガリネズミ、ゾウ、またはオポッサムを含むがこれらに限定されない任意の動物からのｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドであり得る。表１Ａは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの非限定的な例を提供し、表１Ｂおよび１Ｃは、関連する核酸配列（開始および停止コドンを含む）の非限定的な例を提供する。
【表1】
【表2】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【表3-11】
【表3-12】
【表3-13】
【0015】
１つ以上の改変は、場合によっては、挿入、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つ以上の天然に存在するポリペプチドを包含しない（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドのうちの１つ以上を包含しない）。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドのいずれも包含しない。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、いずれの天然に存在するポリペプチドも包含しない（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはいずれか他の天然に存在するポリペプチドのいずれも包含しない）。
【0016】
いくつかの実施形態において、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドに対する１つ以上の改変は、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの疎水性領域の１つ以上のアミノ酸に対する、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの親水性領域の１つ以上のアミノ酸に対する、またはそれらの組み合わせにおける、１つ以上の置換、１つ以上の挿入、または１つ以上の欠失（またはそれらの組み合わせ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドに対する１つ以上の改変は、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの疎水性領域の１つ以上のアミノ酸に対する、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの親水性領域の１つ以上のアミノ酸に対する、またはそれらの組み合わせにおける、１つ以上の置換または１つ以上の欠失を含み得る。
【0017】
いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号４）と、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９９％、約１００％未満、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド配列を有し得る。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド配列は、配列番号１または配列番号４と、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９９％、約１００％未満、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性（例えば、パーセント同一性）は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、またはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用する等の任意の好適な方法によって決定することができる。別段の指示がない限り、アミノ酸配列同一性（例えば、パーセント同一性）は、ＢＬＡＳＴ－２を使用して決定される。
【0018】
ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸分子は、「ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子」と称される。特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、ベクター（例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、キメラウイルスベクター、プラスミド、発現ベクター、共役ベクター、または非共役ベクター）に含まれる。特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、筋肉細胞、非筋肉細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、または脂肪幹細胞）等の細胞内にある。
【0019】
他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードするために使用されない１つ以上の核酸配列（例えば、１つ以上のイントロン）を含む。例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、天然に見られるような１つ以上の核酸分子（例えば、イントロンを含む）を含むことができる。特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は１つ以上のイントロンを含まないため、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は本質的に１つ以上の核酸分子とは異なる。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、ｃＤＮＡ分子（「ｍｙｏｍａｋｅｒ ｃＤＮＡ分子」）である。特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ ｃＤＮＡ分子は、天然に見られる核酸分子と同一である。他の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ ｃＤＮＡ分子は天然に見られる核酸分子と同一ではない（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒ ｃＤＮＡ分子は、天然に見られる核酸分子に１つ以上のイントロンを含まないため）。
【0020】
いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子配列は、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６）と、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９９％、約１００％未満、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子配列は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６と、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．１％、約９９．２％、約９９．３％、約９９．４％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、約９９．９％、約９９．９５％、約９９．９９％、約１００％未満、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する。ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドおよびｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子の非限定的な例は、表２に見ることができる。核酸配列同一性（例えば、パーセント同一性）は、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＣＲＩＳＰまたはＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用する等の任意の好適な方法によって決定することができる。別段の指示がない限り、核酸配列同一性（例えば、パーセント同一性）は、ＢＬＡＳＴ－２を使用して決定される。
【0021】
いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、疎水性領域、親水性領域、またはそれらの組み合わせにおいて、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドに対する１つ以上の改変を有するｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードする。
【0022】
ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子は、限定されないが、ＷＯ２０１４／２１０４４８ Ａ１に見られるもの、ＷＯ２０１８／１５２１０３ Ａ１に見られるもの、化学合成、酵素的生成または生物学的生成等の、任意の好適な技術を用いて作製することができる。核酸分子の化学合成は、例えば、ホスホトリエステル、ホスファイトもしくはホスホルアミダイト化学および固相技術を使用するインビトロ化学合成によって、またはデオキシヌクレオシドＨ－ホスホネート中間体を介して作製される核酸分子を含み得る。酵素的に生成される核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれに限定されない任意の好適な方法を用いて達成することができる。生物学的に生成される核酸分子は、細菌中で複製された組換えＤＮＡベクター等の、生細胞で産生された（すなわち、複製された）組換え核酸を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法を用いて達成することができる。
【0023】
ｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子および／またはｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの構造においてなされた改変または変更は、本発明において使用され得る。特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは（例えば、１つ以上の挿入、１つ以上の欠失、または１つ以上の置換（例えば、保存的置換）によって）改変され得る。いくつかの実施形態において、改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、未改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの１つ以上の機能、例えば、２つの細胞の融合を活性化する能力、細胞融合を可能にする能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合可能性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒおよびｍｙｏｍｅｒｇｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、細胞に融合性を付与する能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、胚発生中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成の誘導のレベル、膜への親和性、または膜コンパートメントとの会合のレベルの、感知できるほどの損失（例えば、約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約２５％未満、約５０％未満、約７５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９９％未満、または約１００％未満の機能の低下）を有しない。いくつかの実施形態において、改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、未改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの１つ以上の機能、例えば、２つの細胞の融合を活性化する能力、細胞融合を可能にする能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合可能性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒおよびｍｙｏｍｅｒｇｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、細胞に融合性を付与する能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、胚発生中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成の誘導のレベル、膜への親和性、または膜コンパートメントとの会合のレベルの所望のレベル（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を保持する。いくつかの実施形態において、改変後のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、未改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドと比較して、増加したレベルの１つ以上の機能を有する。核酸分子は、そのような改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードするように設計することができ、そのような核酸分子は、本発明で使用することができる。
【0024】
「機能的ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、１つ以上の機能、例えば、２つの細胞の融合を活性化する能力、細胞融合を可能にする能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合可能性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒおよびｍｙｏｍｅｒｇｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、細胞に融合性を付与する能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、胚発生中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成の誘導のレベル、膜への親和性、または膜コンパートメントとの会合のレベルの所望のレベル（例えば、天然に存在するｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド等の別のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を有するｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、改変ポリペプチド）として定義される。いくつかの実施形態において、機能ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、別のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、天然に存在するｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）と比較して、増加したレベルの１つ以上の機能を有する。核酸分子は、機能的ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードするように設計することができ、そのような核酸分子は、本発明で使用することができる。
【0025】
「機能的に同等のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド」は、元のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドから（例えば、１つ以上の挿入、１つ以上の欠失、または１つ以上の置換（例えば、保存的置換）によって）改変されたｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドとして定義され、その改変ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、元のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの１つ以上の機能、例えば、２つの細胞の融合を活性化する能力、細胞融合を可能にする能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合可能性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒおよびｍｙｏｍｅｒｇｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、細胞に融合性を付与する能力（例えば、タンパク質を付加すると、タンパク質は細胞に融合性を付与し、別の細胞がｍｙｏｍａｋｅｒを含む場合、細胞はその他の細胞と融合することができる）、胚発生中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成中の発現レベル、成体生物（例えば、胚性よりも発達した）における筋形成の誘導のレベル、膜への親和性、または膜コンパートメントとの会合のレベルの所望のレベル（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を保持する。いくつかの実施形態において、機能的に同等のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、元のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドと比較して、増加したレベルの１つ以上の機能を有することができる。核酸分子は、機能的に同等のｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドをコードするように設計することができ、そのような核酸分子は、本発明で使用することができる。
【0026】
特定の実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドの長さが短いほど、例えば、所望のレベルの選択された機能を保持しながら、ポリペプチド内で行うことができる改変（例えば、置換）が少なくなる。場合によっては、より長いドメインは、例えば、所望のレベルの選択された機能を保持しながら、より多くの数のそのような変更を有し得る。他の実施形態において、全長ポリペプチドは、より短い長さのそのポリペプチドと比較して、例えば、所望のレベルの選択された機能を保持しながら、固定数の変化に対してより高い耐性を有することができる。
【0027】
置換の設計は、本明細書に記載されているものを含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、置換を設計する際に考慮され得る。ハイドロパシーインデックスにおいて、各アミノ酸に、疎水性または電荷特性に基づいて、以下のようにハイドロパシーインデックスが割り当てられる：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；またはアルギニン（－４．５）。場合によっては、特定のアミノ酸が、同様のハイドロパシーインデックスを有する他のアミノ酸に置換され得る。ハイドロパシーインデックスに基づいて変更を行う場合、ハイドロパシーインデックスによるアミノ酸の置換は、±２以下、±１以下、または±０．５以下のインデックスの差を有するアミノ酸で行うことができる。
【0028】
いくつかの実施形態において、親水性値に基づいて置換を行うこともできる。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う場合、親水性値によるアミノ酸の置換は、±２以下、±１以下、または±０．５以下の値を有するアミノ酸で行うことができる。
【0029】
アミノ酸配列またはポリペプチドの「保存的置換」は、所与のアミノ酸残基が、同様の物理化学的特性（例えば、ハイドロパシーインデックスに基づく場合は±１以下、または親水性値に基づく場合は±１以下）を有する残基によって置換されることを示す。保存的置換の例には、（ａ）脂肪族残基による１つの脂肪族残基の別の脂肪族残基への置換、（ｂ）Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａのうちの１つのＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａのうちの別の１つへの置換、（ｃ）Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａのうちの１つのＧｌｙ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａのうちの別の１つへの置換、（ｄ）１つの極性残基の別の極性残基への置換、（ｅ）ＬｙｓおよびＡｒｇのうちの１つのＬｙｓおよびＡｒｇのうちのもう一方での置換、（ｆ）ＧｌｕおよびＡｓｐのうちの１つのＧｌｕおよびＡｓｐのうちのもう一方での置換、（ｇ）ＧｌｎおよびＡｓｎのうちの１つのＧｌｎおよびＡｓｎのうちのもう一方での置換、（ｈ）１つの置換ヒドロキシルまたは硫黄含有残基の別のヒドロキシルまたは硫黄含有残基での置換、（ｉ）Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、またはＭｅｔのうちの１つのＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、またはＭｅｔのうちの別のものでの置換、（ｊ）芳香族残基による１つの芳香族残基の別の芳香族残基への置換、（ｋ）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐのうちの１つのＰｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐのうちの別のものでの置換、（ｌ）１つの塩基性残基の別の塩基性残基への置換、（ｍ）Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇのうちの１つのＨｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇのうちの別のものでの置換、（ｎ）酸性／アミド残基の別の酸性／アミド残基での置換、（ｏ）Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎのうちの１つのＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎのうちの別のものでの置換、（ｐ）残基の同様のサイズの別の残基での置換、および（ｑ）Ａｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒのうちの１つのＡｌａ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒのうちの別のものでの置換が含まれる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの疎水性領域の各アミノ酸は、保存的置換（例えば、疎水性残基に関連する保存的置換の任意の組み合わせ）で置換することができる。
【0030】
議論はアミノ酸変化に焦点を合わせてきたが、これらの変化はコードするＤＮＡの変化によって起こり得ることが理解されるであろう。遺伝暗号が縮重していること、および２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードし得ることも考慮されたい。アミノ酸およびそれらのコドンの表Ａおよび表Ｂは、そのような実施形態での使用、ならびにプローブおよびプライマー等の設計等の他の使用のために本明細書に提示されている。
【表4】
【0031】
「機能的に同等のコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンの６つのコドン等の、同じアミノ酸をコードするコドンを指すために本明細書で使用される。
【0032】
特定の例において、核酸分子は、別個の配列を含むと同時に、所望の本発明のポリペプチドをコードする能力を保持するように操作することができる。いくつかの実施形態において、これは、同じアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重（すなわち、複数のコドンの存在）によって達成することができる。他の例において、それは、核酸分子にイントロンを含める、追加する、または除外することによって達成することができる。
【0033】
特定の実施形態において、制限酵素認識配列は、核酸配列に導入され得る一方で、所望のポリペプチドをコードするその核酸分子の能力が維持される。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＤＮＡ修復テンプレート、および限定されないがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のＣａｓタンパク質のうちの１つ以上を含むＣＲＩＳＰＲシステム）を使用して核酸分子を導入することができる一方で、所望のポリペプチドをコードするその核酸分子の能力が維持される。
【0034】
アミノ酸配列（例えば、ポリペプチド）および核酸配列は、追加のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸等の追加の残基、または５’もしくは３’配列を含み得るが、配列がポリペプチド発現が関与する生物学的活性の維持を含む上記の基準を満たす限り、依然として本明細書に開示される配列の１つにおいて本質的に記載されている通りであることも理解されよう。末端配列の付加は、例えば、コード領域の５‘もしくは３’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得るか、または遺伝子内で発生し得る様々な内部配列（すなわち、イントロン）を含み得る核酸配列に特に当てはまる。
【0035】
いくつかの実施形態は、適切な核酸分子（例えば、本明細書で論じられるような核酸配列）の転写および翻訳を介した、細胞内でのポリペプチドの合成を用いる。これらのポリペプチドには、２０個の「天然」アミノ酸およびその翻訳後改変が含まれる。インビトロでのペプチド合成は、改変されたまたは通常とは異なるアミノ酸の使用を可能にする。いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドは、１つ以上の改変されたまたは通常とは異なるアミノ酸を含む改変（例えば、１つ以上の置換または１つ以上の挿入）を包含する。例示的であるが限定的ではない改変されたまたは通常とは異なるアミノ酸の表を表Ｃに提供する。
【表5】
【0036】
本発明で開示される主題は、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド（例えば、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド）を産生する方法をさらに含む。任意の好適な分子生物学的技術（例えば、原核生物または真核生物の発現系を使用する）による発現、天然の供給源からの単離、または化学合成を含むがこれらに限定されない、任意の好適な方法を用いてｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを作製することができる。真核生物の発現系は、植物ベースの系、組換えバキュロウイルスを介した昆虫細胞系；組換えバキュロウイルスを介した全昆虫系；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．およびＰｉｃｃｈｉａ ｓｐｐを含むがこれらに限定されない遺伝子操作された酵母系；ならびに、Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、または組換えタンパク質の産業規模の発現に一般的に使用される他の細胞株を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞系を含む。いくつかの実施形態において、有用な植物ベースの発現系は、トランスジェニック植物系を含み得る。いくつかの実施形態において、有用な植物ベースの発現系は、トランスプラストミック植物系を含み得る。
【0037】
いくつかの実施形態において、ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを産生する方法は、コードされたｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドが発現される条件下で作動可能なプロモーターに作動可能に連結された、本明細書に開示されるｍｙｏｍａｋｅｒ核酸分子を含む宿主細胞を提供することと、宿主細胞からｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドを回収することと、を含む。
【0038】
ジストロフィンポリペプチドおよびジストロフィン核酸分子
本発明のいくつかの実施形態は、ジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を含む組成物、ジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を含む細胞、またはジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を使用することを含む。いくつかの実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、マイクロジストロフィンポリペプチドまたはミニジストロフィンポリペプチドである。「ジストロフィンポリペプチド」という用語は、「ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド」（すなわち、意図的に人為的な改変をしていない、天然に見られるジストロフィンポリペプチド）および「変異ジストロフィンポリペプチド」（例えば、上記に開示される改変のいずれか等の、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチドに１つ以上の改変が加えられている）を包含する。他の実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド（例えば、保存的置換等の上記に開示されたもののいずれか）と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。ｗｔ－ジストロフィンポリペプチドは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、ラット、ネコ、ウサギ、ヒト、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、サル、ツパイ、イヌ、ブタ、トガリネズミ、ゾウ、またはオポッサムを含むがこれらに限定されない任意の動物からのジストロフィンポリペプチドであり得る。
本発明のいくつかの実施形態は、ジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を含む組成物、ジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を含む細胞、またはジストロフィンポリペプチド、ジストロフィン核酸分子、もしくはその両方を使用することを含む。いくつかの実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、マイクロジストロフィンポリペプチドまたはミニジストロフィンポリペプチドである。「ジストロフィンポリペプチド」という用語は、「ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド」（すなわち、意図的に人為的な改変をしていない、天然に見られるジストロフィンポリペプチド）および「変異ジストロフィンポリペプチド」（例えば、上記に開示される改変のいずれか等の、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチドに１つ以上の改変が加えられている）を包含する。他の実施形態において、ジストロフィンポリペプチドは、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド（例えば、保存的置換等の上記に開示されたもののいずれか）と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。ｗｔ－ジストロフィンポリペプチドは、いくつかの実施形態において、哺乳動物、ラット、ネコ、ウサギ、ヒト、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、サル、ツパイ、イヌ、ブタ、トガリネズミ、ゾウ、またはオポッサムを含むがこれらに限定されない任意の動物からのジストロフィンポリペプチドであり得る。
【0039】
ジストロフィンポリペプチドをコードする核酸分子は、「ジストロフィン核酸分子」と称される。特定の実施形態において、ジストロフィン核酸分子は、ベクター（例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、キメラウイルスベクター、プラスミド、発現ベクター、共役ベクター、または非共役ベクター）に含まれる。特定の実施形態において、ジストロフィン核酸分子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、筋肉細胞、非筋肉細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、または脂肪幹細胞）等の細胞内にある。
【0040】
改変細胞を含む細胞
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞等の細胞を含む。特定の実施形態において、改変細胞は、１つ以上の改変のうちの少なくとも１つがヒトによって（例えば、直接的または間接的に、ヒトの活動によって）実施された、細胞の１つ以上の改変を含む細胞である。いくつかの実施形態において、改変される細胞は、未改変細胞であり得るか、または以前に改変された（例えば、本明細書に開示されるように改変された）細胞であり得る。細胞は、（ａ）本明細書に開示される１つ以上の核酸分子（ｍｙｏｍａｋｅｒ、ジストロフィン、またはその両方）等であるがこれらに限定されない核酸分子の付加、（ｂ）本明細書に開示されるポリペプチドを含むがこれらに限定されない１つ以上のポリペプチドの付加、（ｃ）１つ以上のポリペプチド（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒ、ジストロフィン、またはその両方）の発現（例えば、過剰発現）、または（ｄ）それらの組み合わせ（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒの発現およびジストロフィンの過剰発現）を含むがこれらに限定されない、任意の所望の様式で改変することができる。場合によっては、改変細胞は、別の改変細胞のさらなる改変から生じ得る。
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞等の細胞を含む。特定の実施形態において、改変細胞は、１つ以上の改変のうちの少なくとも１つがヒトによって（例えば、直接的または間接的に、ヒトの活動によって）実施された、細胞の１つ以上の改変を含む細胞である。いくつかの実施形態において、改変される細胞は、未改変細胞であり得るか、または以前に改変された（例えば、本明細書に開示されるように改変された）細胞であり得る。細胞は、（ａ）本明細書に開示される１つ以上の核酸分子（ｍｙｏｍａｋｅｒ、ジストロフィン、またはその両方）等であるがこれらに限定されない核酸分子の付加、（ｂ）本明細書に開示されるポリペプチドを含むがこれらに限定されない１つ以上のポリペプチドの付加、（ｃ）１つ以上のポリペプチド（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒ、ジストロフィン、またはその両方）の発現（例えば、過剰発現）、または（ｄ）それらの組み合わせ（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒの発現およびジストロフィンの過剰発現）を含むがこれらに限定されない、任意の所望の様式で改変することができる。場合によっては、改変細胞は、別の改変細胞のさらなる改変から生じ得る。
【0041】
細胞を改変するための核酸分子の付加は、形質転換（本明細書で使用される場合、トランスフェクション法は形質転換という用語に含まれる）、ウイルス形質転換（例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、キメラウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体、バクテリオファージ、ウイルス、動物ウイルス、植物ウイルス、発現ベクター、共役ベクター、または非共役ベクターを使用する）、注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、超音波処理、カルシウムイオン処理、リン酸カルシウム沈殿、ＰＥＧ－ＤＭＳＯ処理、ＤＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ処理、リポソーム媒介形質転換、または受容体媒介形質転換のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法を用いて達成することができる。細胞を改変するためのポリペプチドの付加は、注射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、超音波処理、カルシウムイオン処理、リン酸カルシウム沈殿、ＰＥＧ－ＤＭＳＯ処理、ＤＥ－デキストラン処理、またはリポソーム媒介のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法を用いて達成することができる。付加される核酸分子は、ベクター（例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、キメラウイルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体、バクテリオファージ、動物ウイルス、植物ウイルス、発現ベクター、共役ベクター、または非共役ベクター）、プラスミド、コスミド、人工染色体、バクテリオファージ、ウイルス、動物ウイルス、植物ウイルスの一部であり得る。いくつかの実施形態において、付加された核酸分子は外因性である。「外因性」とは、（ａ）付加された核酸分子が細胞の外側に由来する（例えば、細胞にとって外来性である）、または（ｂ）付加された核酸分子を細胞内に見ることができるが、付加された核酸分子は、通常は見られない細胞内（例えば、染色体の別の部分または付加されたプラスミド上）に配置されることを意味する。いくつかの実施形態において、付加されたポリペプチドは外因性である。この文脈における「外因性」とは、付加されたポリペプチドが細胞の外側に由来する（例えば、細胞に対して外来性である）ことを意味する。
【0042】
改変される細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、筋肉細胞、非筋肉細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、幹細胞、または脂肪幹細胞）を含むがこれらに限定されない任意の好適な細胞であり得る。特定の実施形態において、未改変細胞は、昆虫細胞、脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、筋肉細胞、非筋肉細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、幹細胞、または脂肪幹細胞）を含むがこれらに限定されない任意の好適な細胞であり得る。
【0043】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞であり得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、改変細胞は、改変非筋肉細胞（例えば、改変線維芽細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞）である。
【0044】
他の実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加された非筋肉細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加された幹細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加された線維芽細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加された筋肉細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加された筋芽細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）、またはｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が付加されたＭＳＣ細胞（例えば、ｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはジストロフィン核酸分子が外因性である場合）である。
【0045】
改変細胞は、細胞を改変するまたは部分的に改変するための、本明細書に開示されるもの、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＬＩ ｅｔ ａｌ．２００５に見られるものを含むがこれらに限定されない任意の好適な方法を用いて（例えば、ヒトＣＭＶプロモーターまたはマウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）とともにレンチウイルスベクターを使用して）調製することができる（ＬＩ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１０９９－１１０８）。
【0046】
医薬組成物を含む組成物
１つ以上のポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または変異ジストロフィンポリペプチド）または１つ以上のｍｙｏｍａｋｅｒもしくはジストロフィン核酸分子（例えば、裸の核酸分子、ベクター、ウイルス、プラスミドの形態、または任意の好適な形態）は、組成物の一部であり得、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．１０％、少なくとも約０．１５％、少なくとも約０．２０％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５０％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９９％、約７５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約９９％以下、または約９９．９９％以下、約０．０００１％～約９９％、約０．０００１％～約５０％、約０．０１％～約９５％、約１％～約９５％、約１０％～約９０％、または約２５％～約７５％の量（全組成物の重量による）であり得る。特定の実施形態において、改変細胞（例えば、本明細書に開示される）等の細胞は、本明細書に示される任意の量（例えば、上記に示される）で組成物の一部であり得る。
１つ以上のポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または変異ジストロフィンポリペプチド）または１つ以上のｍｙｏｍａｋｅｒもしくはジストロフィン核酸分子（例えば、裸の核酸分子、ベクター、ウイルス、プラスミドの形態、または任意の好適な形態）は、組成物の一部であり得、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．１０％、少なくとも約０．１５％、少なくとも約０．２０％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５０％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９９％、約７５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約９９％以下、または約９９．９９％以下、約０．０００１％～約９９％、約０．０００１％～約５０％、約０．０１％～約９５％、約１％～約９５％、約１０％～約９０％、または約２５％～約７５％の量（全組成物の重量による）であり得る。特定の実施形態において、改変細胞（例えば、本明細書に開示される）等の細胞は、本明細書に示される任意の量（例えば、上記に示される）で組成物の一部であり得る。
【0047】
１つ以上のポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または変異ジストロフィンポリペプチド）または１つ以上のｍｙｏｍａｋｅｒもしくはジストロフィン核酸分子（例えば、裸の核酸分子、ベクター、ウイルス、プラスミドの形態、または任意の好適な形態）は、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．１０％、少なくとも約０．１５％、少なくとも約０．２０％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５０％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９９％、約７５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約９９％以下、約９９．９９％以下、約０．０００１％～約９９％、約０．０００１％～約５０％、約０．０１％～約９５％、約１％～約９５％、約１０％～約９０％、または約２５％～約７５％。の量（全組成物の重量による）で精製または単離することができる。いくつかの実施形態において、単離または精製は、不純物（例えば、化学的に合成された場合、細胞成分または不要な溶液成分）が、任意の好適な技術（例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、遠心分離、分画、ゲル、沈殿、または塩析）のうちの１つ以上によって除去されたことを意味する。
【0048】
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上のポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または変異ジストロフィンポリペプチド）または１つ以上のｍｙｏｍａｋｅｒもしくはジストロフィン核酸分子（例えば、裸の核酸分子、ベクター、ウイルス、プラスミドの形態、または任意の好適な形態）を含む組成物を含む。特定の実施形態において、改変細胞（例えば、本明細書に開示される）等の細胞は、本明細書に示される任意の量（例えば、上記に示される）で組成物の一部であり得る。特定の実施形態において、組成物は、動物（例えば、哺乳動物、霊長類、サル、ヒト、イヌ、ブタ、マウス、ウサギ、またはラット）への投与に適した組成物等の医薬組成物である。いくつかの実施形態において、固有の副作用があり得る（例えば、それは、患者に害を及ぼす可能性があるか、または一部の患者においてある程度毒性または有害である可能性がある）。
【0049】
いくつかの実施形態において、１つ以上のポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、変異ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または変異ジストロフィンポリペプチド）または１つ以上のｍｙｏｍａｋｅｒもしくはジストロフィン核酸分子（例えば、裸の核酸分子、ベクター、ウイルス、プラスミドの形態、または任意の好適な形態）は、医薬組成物の一部であり得、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．１０％、少なくとも約０．１５％、少なくとも約０．２０％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５０％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９９％、約７５％以下、以下約９０％、約９５％以下、約９９％以下、約９９．９９％以下、約０．００１％～約９９％、約０．００１％～約５０％、約０．１％～約９９％、約１％～約９５％、約１０％～約９０％、または約２５％～約７５％の量（全組成物の重量による）であり得る。いくつかの実施形態において、改変細胞（例えば、本明細書に開示される）等の細胞は、本明細書に示される任意の量（例えば、上記に示される）で医薬組成物の一部であり得る。
【0050】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所、皮下、髄腔内、腹腔内、経口、非経口、直腸、皮膚、鼻腔、膣内、または眼内投与経路に適した剤形で提示することができる。他の実施形態において、医薬組成物は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、皮下投与、局所投与、皮内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与に適した剤形で提示することができる。医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末顆粒、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤（ヒドロゲルを含む）、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター剤、水剤、送達デバイス、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、噴霧剤、エアロゾルまたは他の好適な形態の形態であり得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１つ以上の処方成分を含むことができる。「処方成分」は、任意の好適な成分（例えば、薬物（複数可）、薬物（複数可）の投与量、薬物（複数可）の放出のタイミング、疾患、病態、臓器、または送達経路に適している）であり得、例えば、水（例えば、煮沸水、蒸留水、濾過水、パイロジェンフリー水、またはクロロホルムを含む水）、砂糖（例えば、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、またはそれらから作製されるシロップ）、エタノール、グリセロール、グリコール（例えば、プロピレングリコール）、アセトン、エーテル、ＤＭＳＯ、界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート））、油（例えば、動物油、植物油（例えば、ココナッツ油またはラッカセイ油）、または鉱物油）、油誘導体（例えば、オレイン酸エチル、モノステアリン酸グリセリル、または水素化グリセリド）、賦形剤、防腐剤（例えば、システイン、メチオニン、抗酸化剤（例えば、ビタミン（例、Ａ、Ｅ、またはＣ））、セレン、パルミチン酸レチニル、クエン酸ナトリウム、クエン酸、クロロホルム、またはパラベン（例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン））、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、医薬組成物）中の任意の個々の処方成分の濃度は、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．１０％、少なくとも約０．１５％、少なくとも約０．２０％、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５０％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９９％、約７５％以下、約９０％以下、約９５％以下、約９９％以下、約９９．９９％以下、約０．００１％～約９９％、約０．００１％～約５０％、約０．１％～約９９％、約１％～約９５％、約１０％～約９０％、または約２５％～約７５％の量（全組成物の重量による）であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの処方成分の濃度は、ポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはｗｔ－ジストロフィンポリペプチド）が見出される天然の系に見られる濃度と同じではない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの処方成分の濃度は、ポリペプチド（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチドまたはｗｔ－ジストロフィンポリペプチド）をコードする核酸分子が見られる１つ以上の天然の系に見られる濃度と同じではない。
【0052】
特定の実施形態において、医薬組成物は、実質的に投与直後、または任意の実質的に所定の時間、または投与後の時間に、有効成分（例えば、ｗｔ－ｍｙｏｍａｋｅｒポリペプチド、ｗｔ－ジストロフィンポリペプチド、または改変細胞）を放出するように製剤化することができる。そのような製剤は、例えば、様々な徐放性組成物およびコーティング等の徐放性製剤を含むことができる。
【0053】
他の製剤（例えば、医薬組成物の製剤）は、特定の実施形態において、薬物（または徐放性製剤）を食物、食料品、飼料、または飲料に組み込んだものを含むことができる。
【0054】
改変細胞を含む細胞の使用方法
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞等の細胞を使用する方法を含む。本発明のいくつかの実施形態は、（例えば、本明細書に開示されるような）１つ以上の改変細胞を動物に投与するための方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、改変細胞等の細胞を使用する方法を含む。本発明のいくつかの実施形態は、（例えば、本明細書に開示されるような）１つ以上の改変細胞を動物に投与するための方法を含む。
【0055】
いくつかの実施形態において、未改変細胞は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、筋肉細胞、非筋肉細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、樹状細胞、がん細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、血液細胞、骨髄細胞、幹細胞、または脂肪幹細胞）を含むがこれらに限定されない任意の好適な細胞であり得る。
【0056】
いくつかの実施形態において、改変細胞は、改変動物細胞、改変脊椎動物細胞、改変哺乳動物細胞、改変ヒト細胞、改変ラット細胞、改変マウス細胞、改変筋肉細胞、改変非筋肉細胞、改変筋芽細胞、改変線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、改変Ｃ２Ｃ１２細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変樹状細胞、改変がん細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞を含むがこれらに限定されない任意の好適な細胞であり得る。他の実施形態において、改変細胞は、改変非筋肉細胞（例えば、改変線維芽細胞、１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変１０Ｔ １／２線維芽細胞、改変ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、改変ＣＨＯ細胞、改変樹状細胞、改変がん細胞、改変間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、改変造血幹細胞、改変血液細胞、改変骨髄細胞、改変幹細胞、または改変脂肪幹細胞）である改変細胞であり得る。いくつかの実施形態において、改変細胞は、ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するか、ジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現もしくは過剰発現するか、またはそれらの組み合わせである、ＭＳＣ細胞である。
【0057】
この方法における１つ以上の改変細胞の投与することは、本明細書に開示されるもの等であるがこれに限定されない、任意の好適な様式によって行うことができる。例えば、投与することは、動物に１つ以上の改変細胞を移植する、注射する、または生着させることによって達成することができる。本明細書に開示されるものを含むがこれらに限定されない、任意の好適な投与経路を使用することができる。
【0058】
動物には、哺乳動物、霊長類、サル（例えば、マカク、アカゲザル、またはブタオザル）、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、トリ（例えば、ニワトリ）、マウス、ウサギ、およびラットが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび動物の両方の対象を指す。
【0059】
特定の実施形態において、投与する方法は、疾患の治療の一部であり得る。いくつかの実施形態において、疾患は、細胞がジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を過少発現する、ジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現しない、ジストロフィンの欠陥型（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現する、またはそれらの組み合わせの疾患等を含むがこれらに限定されない任意の疾患であり得る。いくつかの実施形態において、疾患は、細胞がジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を過少発現する、ジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現しない、ジストロフィンの欠陥型（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現する、またはそれらの組み合わせの非筋肉疾患等を含むがこれらに限定されない非筋肉関連疾患であり得る。いくつかの実施形態において、疾患は、細胞がジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を過少発現する、ジストロフィン（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現しない、ジストロフィンの欠陥型（例えば、マイクロジストロフィンまたはミニジストロフィン）を発現する、またはそれらの組み合わせの筋肉関連疾患等を含むがこれらに限定されない筋肉関連疾患であり得る。特定の実施形態において、治療される疾患は、ミオパチー、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルーゲーリック病とも呼ばれる）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病とも称される）、横紋筋肉腫（ＲＭＳ）、サルコペニア、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、疾患はがんであり得る。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語（および「治療」等のその変形）は、その最も広い意味で考慮されるべきである。特に、「治療すること」という用語は、動物が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味するものではない。したがって、「治療すること」には、症状の改善、状態に関連する症状または影響の軽減、状態の重症度の低下、または症状の予防、予防的改善、またはその他の方法で特定の状態を発症するリスクの低減が含まれる。本明細書で使用される場合、動物を「治療すること」への言及には、予防的治療および治療的治療が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の方法または組成物（例えば、医薬組成物）のいずれかを使用して、動物を治療することができる。
【0060】
さらに他の実施形態において、１つ以上の改変細胞の送達は、任意の好適な投与経路によって行うことができる。投与経路は、経口経路、非経口経路、皮膚経路、鼻腔内経路、直腸経路、膣経路、および眼経路であり得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、投与経路は、非経口投与、粘膜投与、静脈内投与、デポー注射、皮下投与、局所投与、皮内投与、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、または筋肉内投与（例えば、筋肉内注射）であり得る。特定の実施形態において、送達は、注射または筋肉内注射を含む。特定の実施形態において、送達は、改変細胞を含む注射を含む（例えば、組成物または医薬組成物中）。他の実施形態において、送達は、改変細胞を含む筋肉内注射を含む（例えば、組成物または医薬組成物中）。
【0061】
さらに他の実施形態において、治療は、投与するステップのうちの１つ以上をさらに含むことができる。
【0062】
本発明で開示される主題は、以下の特定ではあるが非限定的な例によってさらに説明される。以下の実施例は、本発明に関連する開発および実験の過程の様々な時点で収集されたデータを代表するデータの編集を含み得る。
【実施例】
【0063】
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、ｍｄｘ４ｃｖ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００２３７８）、ＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２（ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ）、Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００７６７６）、Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００７９０５）、ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号０２４７１３）マウスを、細胞の供給源および／または細胞移植試験のレシピエントとして使用した。ＭｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスを以前に記載されたように生成した（ＭＩＬＬＡＹ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ｍｙｏｍａｋｅｒ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．１６４１－１６４６）。１０％エタノールを含むコーン油に２５ｍｇ／ｍＬの濃度でタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解し、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で５日間腹腔内投与した。すべての動物の手順は、シンシナティ小児病院医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認され、ＡＡＡＬＡＣガイドラインに従って実施された。
動物
Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）、ｍｄｘ４ｃｖ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００２３７８）、ＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２（ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ）、Ｒｏｓａ２６ｍＴｍＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００７６７６）、Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号００７９０５）、ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ番号０２４７１３）マウスを、細胞の供給源および／または細胞移植試験のレシピエントとして使用した。ＭｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯマウスを以前に記載されたように生成した（ＭＩＬＬＡＹ ｅｔ ａｌ．（２０１４）“Ｍｙｏｍａｋｅｒ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，Ｖｏｌ．２８，ｐｐ．１６４１－１６４６）。１０％エタノールを含むコーン油に２５ｍｇ／ｍＬの濃度でタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解し、０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で５日間腹腔内投与した。すべての動物の手順は、シンシナティ小児病院医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認され、ＡＡＡＬＡＣガイドラインに従って実施された。
【0064】
細胞の調製
ＷＴ ＭＳＣを、以前に記載されたように生成した（ＧＯＮＺＡＬＥＺ－ＮＩＥＴＯ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｃｏｎｎｅｘｉｎ－４３ ｉｎ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ＢＭ ｎｉｃｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ”Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．５１４４－５１５４）。簡単に説明すると、骨髄細胞を、２０％のＭＳＣ刺激サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μＭ ２－メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｎｇ／ｍＬヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）－ＢＢ、および１０ｎｇ／ｍＬ組換えマウス上皮成長因子（ｒＭ－ＥＧＦ）を添加したＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）のフィブロネクチンコーティングしたウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。接着クラスターを最低でも５継代増殖させ、マクロファージの枯渇をフローサイトメトリーにより評価した。ＷＴ ＭＳＣは、１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で維持した。
ＷＴ ＭＳＣを、以前に記載されたように生成した（ＧＯＮＺＡＬＥＺ－ＮＩＥＴＯ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｃｏｎｎｅｘｉｎ－４３ ｉｎ ｔｈｅ ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ＢＭ ｎｉｃｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｆｆｉｃ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ”Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．１１９，ｐｐ．５１４４－５１５４）。簡単に説明すると、骨髄細胞を、２０％のＭＳＣ刺激サプリメント（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００μＭ ２－メルカプトエタノール、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｎｇ／ｍＬヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）－ＢＢ、および１０ｎｇ／ｍＬ組換えマウス上皮成長因子（ｒＭ－ＥＧＦ）を添加したＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）のフィブロネクチンコーティングしたウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。接着クラスターを最低でも５継代増殖させ、マクロファージの枯渇をフローサイトメトリーにより評価した。ＷＴ ＭＳＣは、１０％ウシ成長血清（ＢＧＳ、ＨｙＣｌｏｎｅ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した高グルコースＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）で維持した。
【0065】
ｍＴｏｍａｔｏ ＣＢＳＣは、他者によって記載されるようにＲｏｓａ２６ｍＴｍＧマウスから分離した（ＤＵＲＡＮ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）“Ｂｏｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｐａｉｒ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．５３９－５５２）。この方法を、ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋およびＷＴマウスからＣＢＳＣを単離するために変更した。大腿骨および脛骨を採取し、骨端を取り除いた後、乳鉢および乳棒で粉砕した。粉砕した骨をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄して骨髄細胞を除去し、メスで約２ｍｍの断片になるよう細かく刻んだ。０．３％コラゲナーゼＩ型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で１．５時間インキュベーションした後、骨片と細胞の両方を、２０％ＭＳＣ刺激サプリメント、３０％Ｈａｍ Ｆ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μＭ ２－メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬマウスＰＤＧＦ－ＢＢ（ＰｒｏＳｐｅｃ）、１０ｎｇ／ｍＬマウスＥＧＦ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２．５ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した低グルコースＤＭＥＭに播種した。７日後、骨片を廃棄し、細胞をトリプシン処理し、増殖させた。ＣＢＳＣは、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４０％Ｈａｍ Ｆ１０、１０ｎｇ／ｍＬマウスＥＧＦ、２．５ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを添加した低グルコースＤＭＥＭで維持した。
【0066】
ＴＴＦを取得するために、成体ＷＴマウスの尾の皮膚を剥ぎ、かみそりの刃で小片に切断した。尾の外植片を、１０％ＢＧＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する高グルコースＤＭＥＭを含む１００ｍｍの培養皿に播種し、培地を１日置きに交換した。線維芽細胞を尾の外植片から７～１０日間遊走させ、次いでトリプシン処理し、ウイルス形質導入のために播種した。
【0067】
初代筋芽細胞は、以前に記載されたように、ＷＴ、ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ、またはｍｄｘ４ｃｖマウスから単離した（ＭＩＬＬＡＹ ｅｔ ａｌ（２０１６）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｏｍａｋｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．２１１６－２１２１）。細胞をコラーゲンコーティングしたプレートに播種し、増殖培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを含む低グルコースＤＭＥＭ中の１５％ＦＢＳ、４０％Ｈａｍ Ｆ１０、および２．５ｎｇ／ｍＬヒトｂＦＧＦ）で維持し、分化培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭ中の２％馬血清）で分化させた。非筋肉細胞の感染について以下に記載したように、ＷＴおよびｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ一次筋芽細胞を、ＧＦＰまたはｄｓＲＥＤレトロウイルスに感染させた。
【0068】
インビトロ異種融合
非筋肉細胞を、以前に記載されたようにｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはＧＦＰレトロウイルスで形質導入した（ＭＩＬＬＡＹ ｅｔ ａｌ（２０１６）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｏｍａｋｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．２１１６－２１２１）。簡単に説明すると、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｅ Ｃｅｌｌ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にウイルス培地を回収した。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、ウイルス上清を標的細胞上で１８時間インキュベートした。すべての非筋肉細胞の形質導入効率を、カスタム生成されたｍｙｏｍａｋｅｒ抗体を用いて免疫染色により評価したところ、すべての感染症で９５～１００％であった（未発表の観察結果）。一次筋芽細胞を３７，５００細胞／ｃｍ２の密度でコラーゲンコーティングしたプレートに播種し、翌日、非筋肉細胞を６，２５０細胞／ｃｍ２の密度で添加し、分化培地で培養した。５日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳで透過処理した後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳでブロッキングし、次いで、抗ミオシン重鎖（１：１０００、クローンＭＦ２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および／または抗ジストロフィン抗体（１：１０００、番号ａｂ１５２７７、Ａｂｃａｍ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ－Ｆｌｏｕｒ－二次抗体（１：１０００）とインキュベートした。
非筋肉細胞を、以前に記載されたようにｍｙｏｍａｋｅｒおよび／またはＧＦＰレトロウイルスで形質導入した（ＭＩＬＬＡＹ ｅｔ ａｌ（２０１６）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｏｍａｋｅｒ ｄｏｍａｉｎｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍｙｏｂｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ”Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．２１１６－２１２１）。簡単に説明すると、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ Ｅ Ｃｅｌｌ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にウイルス培地を回収した。ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を添加した後、ウイルス上清を標的細胞上で１８時間インキュベートした。すべての非筋肉細胞の形質導入効率を、カスタム生成されたｍｙｏｍａｋｅｒ抗体を用いて免疫染色により評価したところ、すべての感染症で９５～１００％であった（未発表の観察結果）。一次筋芽細胞を３７，５００細胞／ｃｍ２の密度でコラーゲンコーティングしたプレートに播種し、翌日、非筋肉細胞を６，２５０細胞／ｃｍ２の密度で添加し、分化培地で培養した。５日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／ＰＢＳで固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ／ＰＢＳで透過処理した後、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳでブロッキングし、次いで、抗ミオシン重鎖（１：１０００、クローンＭＦ２０、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および／または抗ジストロフィン抗体（１：１０００、番号ａｂ１５２７７、Ａｂｃａｍ）と４℃で一晩インキュベートし、続いてＡｌｅｘａ－Ｆｌｏｕｒ－二次抗体（１：１０００）とインキュベートした。
【0069】
細胞移植
細胞をトリプシン処理し、２×１０７細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再懸濁し、氷上に維持した。２５μＬの細胞懸濁液（５００，０００細胞）を３０ゲージの針を備えたＧａｓｔｉｇｈｔハミルトンシリンジに装填し、前脛骨筋（ＴＡ）の遠位端から近位端まで針を縦方向に挿入した。注射は、筋肉当たり５回の連続動作によって行われ、約１ｍｍ抜針するごとに５μＬの注射で構成されていた。示されている場合、移植の２４時間前に１０μＭの心臓毒（５０μＬ）を注射することによりＴＡを損傷させた。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（ＡｐｅｘＢｉｏ）処理では、浸透圧ポンプ（番号００００２９８、Ｄｕｒｅｃｔ）に６ｍｇ／ｍＬ ＴＳＡを含有する５０％ＤＭＳＯ／１５％エタノールを充填し、皮下に移植した。移植前に細胞を０．１μＭ ＴＳＡで２４時間処理した。心臓内細胞送達のために、心臓を左開胸術によって露出させ、５×１０４ ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣ（２１μＬの滅菌生理食塩水に懸濁）を３３ｇハミルトンシリンジで左心室の前壁に沿った３つの定義された領域に注入した。
細胞をトリプシン処理し、２×１０７細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳに再懸濁し、氷上に維持した。２５μＬの細胞懸濁液（５００，０００細胞）を３０ゲージの針を備えたＧａｓｔｉｇｈｔハミルトンシリンジに装填し、前脛骨筋（ＴＡ）の遠位端から近位端まで針を縦方向に挿入した。注射は、筋肉当たり５回の連続動作によって行われ、約１ｍｍ抜針するごとに５μＬの注射で構成されていた。示されている場合、移植の２４時間前に１０μＭの心臓毒（５０μＬ）を注射することによりＴＡを損傷させた。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（ＡｐｅｘＢｉｏ）処理では、浸透圧ポンプ（番号００００２９８、Ｄｕｒｅｃｔ）に６ｍｇ／ｍＬ ＴＳＡを含有する５０％ＤＭＳＯ／１５％エタノールを充填し、皮下に移植した。移植前に細胞を０．１μＭ ＴＳＡで２４時間処理した。心臓内細胞送達のために、心臓を左開胸術によって露出させ、５×１０４ ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣ（２１μＬの滅菌生理食塩水に懸濁）を３３ｇハミルトンシリンジで左心室の前壁に沿った３つの定義された領域に注入した。
【0070】
筋肉組織学
ＴＡが骨に付着した状態で後肢を切断し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳに４℃で１～２時間浸漬した。骨を取り除く前に、Ｚｅｉｓｓ実体顕微鏡を使用して筋肉のサブセットをホールマウントで画像化してｔｄＴｏｍａｔｏを視覚化した。ＴＡ筋を骨から外し、筋腹で２つに切断し、２％ＰＦＡ／ＰＢＳに４℃で一晩浸漬した後、４℃の３０％スクロース／ＰＢＳに入れた。１～２日後、筋肉をＯＣＴに包埋し、凍結し、１０μｍの切片を回収した。透過性／ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１％熱不活化ヤギ血清、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で切片を１時間室温で処理した後、抗ジストロフィン（１：２００）および／または抗ラミニン－２（１：５００、番号Ｌ－０６３３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と４℃で一晩インキュベートした。切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体（１：１０００）と室温で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄを用いてマウントした。心臓組織における融合の分析のために、心臓を氷冷１Ｍ ＫＣｌの心臓内注射により拡張期に停止させ、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで灌流した。ＰＦＡ／ＰＢＳで４時間固定した後、心臓をＰＢＳで２回洗浄し、３０％スクロース／ＰＢＳで一晩凍結保護し、５μｍの凍結切片を採取した。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓを実行するＡ１Ｒ共焦点を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡でインビトロおよびインビボでのすべての免疫染色を視覚化し、画像をＦｉｊｉで分析した（ＳＣＨＩＮＤＥＬＩＮ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｆｉｊｉ：ａｎ ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．６７６－６８２）。
ＴＡが骨に付着した状態で後肢を切断し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳに４℃で１～２時間浸漬した。骨を取り除く前に、Ｚｅｉｓｓ実体顕微鏡を使用して筋肉のサブセットをホールマウントで画像化してｔｄＴｏｍａｔｏを視覚化した。ＴＡ筋を骨から外し、筋腹で２つに切断し、２％ＰＦＡ／ＰＢＳに４℃で一晩浸漬した後、４℃の３０％スクロース／ＰＢＳに入れた。１～２日後、筋肉をＯＣＴに包埋し、凍結し、１０μｍの切片を回収した。透過性／ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、１％熱不活化ヤギ血清、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で切片を１時間室温で処理した後、抗ジストロフィン（１：２００）および／または抗ラミニン－２（１：５００、番号Ｌ－０６３３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体と４℃で一晩インキュベートした。切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体（１：１０００）と室温で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄを用いてマウントした。心臓組織における融合の分析のために、心臓を氷冷１Ｍ ＫＣｌの心臓内注射により拡張期に停止させ、４％ＰＦＡ／ＰＢＳで灌流した。ＰＦＡ／ＰＢＳで４時間固定した後、心臓をＰＢＳで２回洗浄し、３０％スクロース／ＰＢＳで一晩凍結保護し、５μｍの凍結切片を採取した。ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓを実行するＡ１Ｒ共焦点を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡でインビトロおよびインビボでのすべての免疫染色を視覚化し、画像をＦｉｊｉで分析した（ＳＣＨＩＮＤＥＬＩＮ ｅｔ ａｌ．（２０１２）“Ｆｉｊｉ：ａｎ ｏｐｅｎ－ｓｏｕｒｃｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．６７６－６８２）。
【0071】
ＲＮＡ分析
細胞を溶解し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）マイクロキット（番号ＡＭ１９３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ Ｉで処理した。ランダムヘキサマープライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成した。ｍｙｏｍａｋｅｒの発現は、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、標準的な定量的ＰＣＲを使用して評価した。分析は、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、以下のプライマーを用いて行われた：フォワード、ＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＧＴＴ（配列番号１７）；リバース、ＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＧ（配列番号１８）。結果を、以下のプライマーとともにＧＡＰＤＨを使用して正規化した：フォワード、ＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１９）；リバース、ＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣ（配列番号２０）。Ｃｒｅの発現は、以下のプライマーを用いて、標準的なＰＣＲおよびゲル電気泳動を使用して評価した：フォワード、ＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＡ（配列番号２１）；リバース、ＴＣＧＡＣＣＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＣＣＣ（配列番号２２）。ＧＡＰＤＨの発現は、上記と同じプライマーを用いて参照遺伝子として評価した。
細胞を溶解し、ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（登録商標）マイクロキット（番号ＡＭ１９３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ Ｉで処理した。ランダムヘキサマープライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを合成した。ｍｙｏｍａｋｅｒの発現は、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、標準的な定量的ＰＣＲを使用して評価した。分析は、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、以下のプライマーを用いて行われた：フォワード、ＡＴＣＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＧＴＴ（配列番号１７）；リバース、ＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＧＧ（配列番号１８）。結果を、以下のプライマーとともにＧＡＰＤＨを使用して正規化した：フォワード、ＴＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣ（配列番号１９）；リバース、ＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣ（配列番号２０）。Ｃｒｅの発現は、以下のプライマーを用いて、標準的なＰＣＲおよびゲル電気泳動を使用して評価した：フォワード、ＡＧＧＴＴＣＧＴＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＡ（配列番号２１）；リバース、ＴＣＧＡＣＣＡＧＴＴＴＡＧＴＴＡＣＣＣ（配列番号２２）。ＧＡＰＤＨの発現は、上記と同じプライマーを用いて参照遺伝子として評価した。
【0072】
定量化および統計分析
インビボ融合の定量的評価のために、各筋肉の代表的な切片におけるＧＦＰ＋またはｍＴｏｍａｔｏ＋筋線維の数を手動でカウントし、平均±ＳＥＭとして提示した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて、対応のないスチューデントのｔ検定で分析した。ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であるとみなされた。
インビボ融合の定量的評価のために、各筋肉の代表的な切片におけるＧＦＰ＋またはｍＴｏｍａｔｏ＋筋線維の数を手動でカウントし、平均±ＳＥＭとして提示した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いて、対応のないスチューデントのｔ検定で分析した。ｐ＜０．０５の値が統計的に有意であるとみなされた。
【0073】
結果
ＭＳＣにおけるｍｙｏｍａｋｅｒの発現は筋肉との融合を誘発する
Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する１０Ｔ １／２線維芽細胞は、初代筋芽細胞と融合する。ＭＳＣがｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性の融合に適しているかどうかを判断するために、マウスＭＳＣをｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスに同時感染させた。対照として、ＭＳＣを空のレトロウイルスおよびＧＦＰレトロウイルスにも同時感染させた。次いで、ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを野生型（ＷＴ）マウスの初代筋芽細胞と混合し、５日間分化させた（図１Ａ）。筋分化のマーカーであるミオシンに対する抗体を用いた免疫染色によって筋芽細胞を追跡した。筋芽細胞をｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと混合したときにＧＦＰ＋ミオシン＋構造が観察されたことから、これらの細胞集団間の融合が示唆される（図１Ｂ）。ＧＦＰ＋ミオシン－多核細胞は観察されなかったことから、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが互いに融合しなかったことが示唆される。ＧＦＰ＋ミオシン＋細胞は、空－ＭＳＣおよび筋芽細胞を含む培養物では容易に検出されなかった（図１Ｂ）。次に、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣがインビボで筋肉と融合できるかどうかを試験した。前脛骨筋（ＴＡ）を心毒性（ＣＴＸ）で損傷させ、翌日、５００，０００個のＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣをＴＡに移植した。ジストロフィン＋筋線維内のＧＦＰの存在は、ＭＳＣと筋肉との融合を示唆し、移植の４週間後に評価した。空－ＭＳＣの移植後に最小限のＧＦＰ＋筋線維が検出されたが、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣでは異種融合の増加が観察された（図１Ｃ）。切片当たりのＧＦＰ＋筋線維の数の定量化により、空－ＭＳＣと比較してｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣの融合が５倍増加することが明らかになった（図１Ｄ）。これらの結果は、ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するＭＳＣが融合能を有し、インビボ移植環境で筋肉が異種融合の影響を受けやすいことを示している。
ＭＳＣにおけるｍｙｏｍａｋｅｒの発現は筋肉との融合を誘発する
Ｍｙｏｍａｋｅｒを発現する１０Ｔ １／２線維芽細胞は、初代筋芽細胞と融合する。ＭＳＣがｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性の融合に適しているかどうかを判断するために、マウスＭＳＣをｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスに同時感染させた。対照として、ＭＳＣを空のレトロウイルスおよびＧＦＰレトロウイルスにも同時感染させた。次いで、ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを野生型（ＷＴ）マウスの初代筋芽細胞と混合し、５日間分化させた（図１Ａ）。筋分化のマーカーであるミオシンに対する抗体を用いた免疫染色によって筋芽細胞を追跡した。筋芽細胞をｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと混合したときにＧＦＰ＋ミオシン＋構造が観察されたことから、これらの細胞集団間の融合が示唆される（図１Ｂ）。ＧＦＰ＋ミオシン－多核細胞は観察されなかったことから、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが互いに融合しなかったことが示唆される。ＧＦＰ＋ミオシン＋細胞は、空－ＭＳＣおよび筋芽細胞を含む培養物では容易に検出されなかった（図１Ｂ）。次に、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣがインビボで筋肉と融合できるかどうかを試験した。前脛骨筋（ＴＡ）を心毒性（ＣＴＸ）で損傷させ、翌日、５００，０００個のＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣをＴＡに移植した。ジストロフィン＋筋線維内のＧＦＰの存在は、ＭＳＣと筋肉との融合を示唆し、移植の４週間後に評価した。空－ＭＳＣの移植後に最小限のＧＦＰ＋筋線維が検出されたが、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣでは異種融合の増加が観察された（図１Ｃ）。切片当たりのＧＦＰ＋筋線維の数の定量化により、空－ＭＳＣと比較してｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣの融合が５倍増加することが明らかになった（図１Ｄ）。これらの結果は、ｍｙｏｍａｋｅｒを発現するＭＳＣが融合能を有し、インビボ移植環境で筋肉が異種融合の影響を受けやすいことを示している。
【0074】
次に、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが損傷のない状態で筋肉と融合できるかどうかを評価したが、それは、衛星細胞が活性化されていない非ジストロフィー性疾患の設定において異種融合を利用できることを意味する。損傷のないＴＡにｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを注入するとＧＦＰ＋ジストロフィン＋筋線維によって示されるように筋肉との融合が生じた（図２Ａ）。心臓組織へのｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣの移植は広範囲の融合をもたらさなかったため、ｍｙｏｍａｋｅｒが非筋肉細胞を筋肉と融合させる能力は骨格筋に特異的であった（図２Ｂ）。中心核は、筋線維の再生の特徴であり得、したがって、筋前駆細胞活性の代わりとなり得る。この実験のレシピエント筋肉はＣＴＸで損傷させなかったが、観察された中心核は細胞移植中の針による軽度の損傷によるものであると推測される。空のＭＳＣまたはｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣの移植後に、中心核を有する筋線維全体（ＧＦＰ＋またはＧＦＰ－）に明らかな差異が検出されなかったことから、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが針による損傷に起因する傷害を増強しないことが示唆される（図２Ａ、挿入図）。しかしながら、中心核を有するおよび有しないＧＦＰ＋線維は、空－ＭＳＣと比較してｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣでそれぞれ２倍および４倍増加したことから、ｍｙｏｍａｋｅｒが成熟筋線維および活性化筋芽細胞に融合能力を付与することが示唆される（図２Ｃ）。
【0075】
細胞の移植は針の挿入により筋肉損傷を引き起こす可能性があるため、ｍｙｏｍａｋｅｒの遺伝子欠失により内因性衛星細胞の融合能力を不活性化して、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが筋線維に直接融合できるかどうかを判断した。衛星細胞におけるｍｙｏｍａｋｅｒの条件付き欠失は、ｍｙｏｍａｋｅｒを標的とする対立遺伝子（ｍｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘＰ）および衛星細胞でＣｒｅを特異的に発現するＰａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２／＋対立遺伝子を含むマウスを利用することによって達成した。この手法が融合できない筋芽細胞を生成するのに十分であることを確実にするために、ＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスをビヒクル（対照）またはタモキシフェン（ｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ）のいずれかで処理し、ＣＴＸ損傷の３日後に筋肉から衛星細胞を単離した。ｍｙｏｍａｋｅｒの発現がｍｙｏｍａｋｅｒｓｃＫＯ筋芽細胞で減少したため、これらの細胞は融合していないと考えられ、衛星細胞の融合をブロックするこのシステムの有用性が強調された（図２Ｄ、図２Ｅ、および図２Ｆ）。次いで、ＭｙｏｍａｋｅｒＬａｃＺ／ｌｏｘＰ；Ｐａｘ７ＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを、ビヒクルまたは５用量のタモキシフェンで処理して衛星細胞中のｍｙｏｍａｋｅｒを欠失させた後、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣを移植した（図２Ｇ）。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣは、内因性衛星細胞が融合不能になった後でも融合能力を示したことから、それらが筋線維に融合できたことが示唆される（図２Ｈ）。中心核がある場合およびない場合の融合事象の定量化は、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが衛星細胞融合活性の非存在下で実際に筋線維に融合することを示している（図２Ｉ）。ビヒクルと比較して、タモキシフェンで処理した試料において、中心核を有しないＧＦＰ＋筋線維の統計的に有意でない減少が観察された。この減少は、中心核を有する繊維の数が過小評価であること、および中心核を有しないいくつかの繊維がこの切断面の上下に中心核を含み得ることを示唆している可能性がある。
【0076】
ｍｙｏｍａｋｅｒを発現していない細胞（空－ＭＳＣ）が筋肉と融合できることを実証したが、このことは、インビボでの融合が両方の細胞でｍｙｏｍａｋｅｒを絶対に必要とするわけではないことを示唆している。この概念をさらに評価するために、ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞およびｍｙｏｍａｋｅｒ ＫＯ－ｄｓＲＥＤ筋芽細胞を生成し、ＣＴＸ誘発損傷後にそれらをＷＴマウスに移植した。Ｍｙｏｍａｋｅｒ ＫＯ－ｄｓＲＥＤ筋芽細胞と比較して、ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞はより高い生着能を示した（図２Ｊ）。さらに、小さな単核ｄｓＲＥＤ＋細胞の数の増加が観察され、これらの細胞が融合できないことが示された（図２Ｊ）。また、ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞とｍｙｏｍａｋｅｒ ＫＯ－ｄｓＲＥＤ筋芽細胞を一緒に移植したところ、ｄｓＲＥＤ＋線維ではなく、主としてＧＦＰ＋筋線維が観察されたことから、ＷＴ－ＧＦＰ筋芽細胞がより融合能力が高いことが示唆される（図２Ｊ）。全体として、これらのデータは、２つの細胞のうち少なくとも一方がｍｙｏｍａｋｅｒを発現する場合、筋芽細胞－筋芽細胞融合と非筋肉－筋芽細胞融合の両方が、筋肉再生中にインビボで起こり得ることを示している。
【0077】
異種融合後のＭＳＣ核のジストロフィンによるリプログラミング
ｍｙｏｍａｋｅｒはＭＳＣの融合を促進するため、ＭＳＣ核がリプログラミングの影響を受けやすく、ｍｄｘ４ｃｖ筋管におけるジストロフィンの発現を回復できるかどうかを評価した。ｍｄｘ４ｃｖマウスから筋芽細胞を単離し、それらをＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと共培養した（図３Ａ）。５日間の分化後に、これらの培養物における融合とジストロフィンの発現を評価した。予想通り、ジストロフィンはＷＴ筋芽細胞に由来する筋管で検出されたが、ｍｄｘ４ｃｖ筋管では検出されなかった（図３Ｂ）。いくつかのキメラ筋管において、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣとｍｄｘ４ｃｖ筋芽細胞との融合、および膜に沿ったジストロフィン発現が観察されたが、ほとんどのＧＦＰ＋筋線維は依然としてジストロフィン－であった（図３Ｂ）。ｍｄｘ４ｃｖマウスはジストロフィンを発現しないため、これらの筋管で観察されたジストロフィンは、ＷＴ ＭＳＣ核に由来する確率が高く、リプログラミングが示唆される。核のリプログラミングがインビボでも起こるかどうかを判断するために、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣをｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡに移植し、移植後２週間および６週間に融合およびリプログラミングについてアッセイした。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣはジストロフィン筋線維に融合したが、移植後２週間または６週間のいずれにも、検出可能なレベルのジストロフィンは観察されなかった（図３Ｃ）。ＷＴマウスからのＧＦＰ＋筋芽細胞も、ジストロフィン回復の陽性対照として使用するためにｍｄｘ４ｃｖマウスに移植した（図３Ｃ）。切片当たりのＧＦＰ＋筋線維の定量化により、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが切片当たり約２００個のｍｄｘ４ｃｖ筋線維に融合したことが明らかになった（図３Ｄ）。また、転写活性を包括的に増強する手段として、マウスをＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡで処理したが、この手法でもジストロフィンの回復はもたらされなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが検出可能なレベルのジストロフィンによるリプログラミングに抵抗性であると考えられることを示している。
ｍｙｏｍａｋｅｒはＭＳＣの融合を促進するため、ＭＳＣ核がリプログラミングの影響を受けやすく、ｍｄｘ４ｃｖ筋管におけるジストロフィンの発現を回復できるかどうかを評価した。ｍｄｘ４ｃｖマウスから筋芽細胞を単離し、それらをＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと共培養した（図３Ａ）。５日間の分化後に、これらの培養物における融合とジストロフィンの発現を評価した。予想通り、ジストロフィンはＷＴ筋芽細胞に由来する筋管で検出されたが、ｍｄｘ４ｃｖ筋管では検出されなかった（図３Ｂ）。いくつかのキメラ筋管において、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣとｍｄｘ４ｃｖ筋芽細胞との融合、および膜に沿ったジストロフィン発現が観察されたが、ほとんどのＧＦＰ＋筋線維は依然としてジストロフィン－であった（図３Ｂ）。ｍｄｘ４ｃｖマウスはジストロフィンを発現しないため、これらの筋管で観察されたジストロフィンは、ＷＴ ＭＳＣ核に由来する確率が高く、リプログラミングが示唆される。核のリプログラミングがインビボでも起こるかどうかを判断するために、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣをｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡに移植し、移植後２週間および６週間に融合およびリプログラミングについてアッセイした。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣはジストロフィン筋線維に融合したが、移植後２週間または６週間のいずれにも、検出可能なレベルのジストロフィンは観察されなかった（図３Ｃ）。ＷＴマウスからのＧＦＰ＋筋芽細胞も、ジストロフィン回復の陽性対照として使用するためにｍｄｘ４ｃｖマウスに移植した（図３Ｃ）。切片当たりのＧＦＰ＋筋線維の定量化により、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが切片当たり約２００個のｍｄｘ４ｃｖ筋線維に融合したことが明らかになった（図３Ｄ）。また、転写活性を包括的に増強する手段として、マウスをＨＤＡＣ阻害剤ＴＳＡで処理したが、この手法でもジストロフィンの回復はもたらされなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣが検出可能なレベルのジストロフィンによるリプログラミングに抵抗性であると考えられることを示している。
【0078】
ｍｙｏｍａｋｅｒ－ＣＢＳＣおよびｍｙｏｍａｋｅｒ－ＴＴＦの融合および核のリプログラミング
ｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性の異種融合および機能的リプログラミングの欠如がＭＳＣに限定されているのか、または他の異種細胞で同様の現象が発生しているのかについても調べた。ＴＴＦは、古典的なヘテロカリオン実験でリプログラミングを示したために試験し、またＣＢＳＣは、ＭＳＣに類似しているために試験したが、それらはより原始的な状態にある可能性がある。ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦまたは膜Ｔｏｍａｔｏ（ｍＴｏｍ）＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣのいずれかとｍｄｘ４ｃｖ筋芽細胞とを混合し（図４Ａ）、融合およびジストロフィンによるリプログラミングをインビトロで成功裏に検出した（図４Ｂ）。ＭＳＣ、ＣＢＳＣ、およびＴＴＦのｍｙｏｍａｋｅｒレベルは同等であった（図４Ｃ）。次いで、両方の細胞型をｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡに移植し、融合を観察した（図４Ｄ）。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦおよびｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣは、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと比較して同様のレベルでｍｄｘ４ｃｖ筋肉と融合した（図４Ｅ）。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣで観察されたのと同様に、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦまたはｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣのいずれかと融合した後に、ｍｄｘ４ｃｖ筋肉でジストロフィンの回復は検出されなかった（図４Ｄ）。ジストロフィンは、ＣＢＳＣの移植後７週間でも検出されなかった（データは図示せず）。総合すると、ｍｙｏｍａｋｅｒは、複数の非筋肉細胞型と筋肉との融合を促進するが、ジストロフィンの発現は回復しないと考えられる。
ｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性の異種融合および機能的リプログラミングの欠如がＭＳＣに限定されているのか、または他の異種細胞で同様の現象が発生しているのかについても調べた。ＴＴＦは、古典的なヘテロカリオン実験でリプログラミングを示したために試験し、またＣＢＳＣは、ＭＳＣに類似しているために試験したが、それらはより原始的な状態にある可能性がある。ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦまたは膜Ｔｏｍａｔｏ（ｍＴｏｍ）＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣのいずれかとｍｄｘ４ｃｖ筋芽細胞とを混合し（図４Ａ）、融合およびジストロフィンによるリプログラミングをインビトロで成功裏に検出した（図４Ｂ）。ＭＳＣ、ＣＢＳＣ、およびＴＴＦのｍｙｏｍａｋｅｒレベルは同等であった（図４Ｃ）。次いで、両方の細胞型をｍｄｘ４ｃｖマウスの損傷のないＴＡに移植し、融合を観察した（図４Ｄ）。Ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦおよびｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣは、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣと比較して同様のレベルでｍｄｘ４ｃｖ筋肉と融合した（図４Ｅ）。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＭＳＣで観察されたのと同様に、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＴＴＦまたはｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣのいずれかと融合した後に、ｍｄｘ４ｃｖ筋肉でジストロフィンの回復は検出されなかった（図４Ｄ）。ジストロフィンは、ＣＢＳＣの移植後７週間でも検出されなかった（データは図示せず）。総合すると、ｍｙｏｍａｋｅｒは、複数の非筋肉細胞型と筋肉との融合を促進するが、ジストロフィンの発現は回復しないと考えられる。
【0079】
異種融合後のジストロフィンによらないインビボでの核のリプログラミング
異種融合は機能的なジストロフィンによるリプログラミングを誘発しないというデータを踏まえて、ジストロフィン非依存性のシステムを使用してリプログラミングが起こるかどうかを調べた。骨格筋特異的ミオシン軽ポリペプチド１（Ｍｙｌ１またはＭＬＣ１ｆ）遺伝子座の制御下でＣｒｅを発現するＭｙｌ１Ｃｒｅ／＋マウスからＣＢＳＣを単離した。Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣをｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスに感染させ、次いで、Ｃｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏカセットを有するＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＣＴＸで損傷させたＴＡ内に移植した（図５Ａ）。したがって、このシステムでリプログラミングを行うには、Ｍｙｌ１の発現に必要な因子がＣＢＳＣ核内に拡散する必要があるが、それは、これらの核が通常はＭｙｌ１を発現しないためである。これによりＣＢＳＣ核内でＣｒｅを活性化させ、次いで、Ｃｒｅが内因性Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ筋核内に移行してｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導する必要がある（図５Ａ）。最初に、ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣが移植前にＣｒｅを発現しないことを確認した。実際に、ＣｒｅのＲＴ－ＰＣＲは、Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣでは検出されなかったが、遍在性β－アクチン－Ｃｒｅコンストラクトを発現する細胞で明確に検出され、Ｃｒｅ ＰＣＲの陽性対照として機能した（図５Ｂ）。Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＴＡ筋のホールマウント蛍光画像により、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣではなく、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣの移植が、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導することが明らかになった（図５Ｃ）。凍結切片によっても、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣが筋肉と融合したことが示されたが（ＧＦＰ＋筋線維）、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現は観察されなかった（図５Ｄ）。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣの融合後、ＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏの共局在が検出され、効率的なリプログラミングが示された（図５Ｄ）。全体として、これらの発見は、筋肉依存性のリプログラミングはインビボで起こるが、特定の遺伝子の遺伝子座に依存している可能性が高いことを示唆している。
異種融合は機能的なジストロフィンによるリプログラミングを誘発しないというデータを踏まえて、ジストロフィン非依存性のシステムを使用してリプログラミングが起こるかどうかを調べた。骨格筋特異的ミオシン軽ポリペプチド１（Ｍｙｌ１またはＭＬＣ１ｆ）遺伝子座の制御下でＣｒｅを発現するＭｙｌ１Ｃｒｅ／＋マウスからＣＢＳＣを単離した。Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣをｍｙｏｍａｋｅｒおよびＧＦＰレトロウイルスに感染させ、次いで、Ｃｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏカセットを有するＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＣＴＸで損傷させたＴＡ内に移植した（図５Ａ）。したがって、このシステムでリプログラミングを行うには、Ｍｙｌ１の発現に必要な因子がＣＢＳＣ核内に拡散する必要があるが、それは、これらの核が通常はＭｙｌ１を発現しないためである。これによりＣＢＳＣ核内でＣｒｅを活性化させ、次いで、Ｃｒｅが内因性Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ筋核内に移行してｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導する必要がある（図５Ａ）。最初に、ＧＦＰ＋ ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣが移植前にＣｒｅを発現しないことを確認した。実際に、ＣｒｅのＲＴ－ＰＣＲは、Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣでは検出されなかったが、遍在性β－アクチン－Ｃｒｅコンストラクトを発現する細胞で明確に検出され、Ｃｒｅ ＰＣＲの陽性対照として機能した（図５Ｂ）。Ｒｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＴＡ筋のホールマウント蛍光画像により、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣではなく、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣの移植が、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を誘導することが明らかになった（図５Ｃ）。凍結切片によっても、ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１＋／＋ ＣＢＳＣが筋肉と融合したことが示されたが（ＧＦＰ＋筋線維）、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現は観察されなかった（図５Ｄ）。ｍｙｏｍａｋｅｒ＋ Ｍｙｌ１Ｃｒｅ／＋ ＣＢＳＣの融合後、ＧＦＰとｔｄＴｏｍａｔｏの共局在が検出され、効率的なリプログラミングが示された（図５Ｄ）。全体として、これらの発見は、筋肉依存性のリプログラミングはインビボで起こるが、特定の遺伝子の遺伝子座に依存している可能性が高いことを示唆している。
【0080】
考察
データの一部において、我々は、様々な非筋肉細胞と筋肉との融合、およびそれに続く核のリプログラミングを調べている。この研究のいくつかの目標のうちの１つは、この戦略を遺伝子送達ビヒクルとして使用するための概念実証として、ｍｄｘ４ｃｖマウスでジストロフィン発現を回復させるための異種融合の効率を評価することであった。ＭＳＣ、ＣＢＳＣ、およびＴＴＦと骨格筋との融合を強化するために、筋特異的融合因子であるｍｙｏｍａｋｅｒを使用した。各細胞型がｍｙｏｍａｋｅｒの発現後に筋肉と融合することができたが、ジストロフィンの回復は、培養筋管のサブセットで検出されたが、ｍｄｘ４ｃｖマウスの筋線維では検出されなかった。しかしながら、筋特異的Ｍｙｌ１遺伝子座からＣｒｅを発現するｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣが、融合後に筋線維核におけるＣｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化できたため、成体筋線維はリプログラミングを受けることができる。
データの一部において、我々は、様々な非筋肉細胞と筋肉との融合、およびそれに続く核のリプログラミングを調べている。この研究のいくつかの目標のうちの１つは、この戦略を遺伝子送達ビヒクルとして使用するための概念実証として、ｍｄｘ４ｃｖマウスでジストロフィン発現を回復させるための異種融合の効率を評価することであった。ＭＳＣ、ＣＢＳＣ、およびＴＴＦと骨格筋との融合を強化するために、筋特異的融合因子であるｍｙｏｍａｋｅｒを使用した。各細胞型がｍｙｏｍａｋｅｒの発現後に筋肉と融合することができたが、ジストロフィンの回復は、培養筋管のサブセットで検出されたが、ｍｄｘ４ｃｖマウスの筋線維では検出されなかった。しかしながら、筋特異的Ｍｙｌ１遺伝子座からＣｒｅを発現するｍｙｏｍａｋｅｒ＋ ＣＢＳＣが、融合後に筋線維核におけるＣｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化できたため、成体筋線維はリプログラミングを受けることができる。
【0081】
我々は、ＭＳＣおよびＣＢＳＣがｍｙｏｍａｋｅｒベースの遺伝子送達に適したビヒクルであり得ることを実証する。ＭＳＣは、骨髄または脂肪組織から容易に入手でき、ゲノム不安定性がない場合に拡張および増殖できるため、細胞治療での使用において臨床的に関連するいくつかの特性を示す。さらに、ＭＳＣは、最小限のＭＨＣクラスＩおよびＩＩを発現し、また、ｍｙｏｍａｋｅｒベースの異種融合における使用に追加の利点となる免疫調節特性を示すため、同種異系の設定で使用することができる。ＣＢＳＣは、マウスに生着した後の栄養因子の分泌により、心臓損傷に対して有益な効果を示す。本試験では、損傷のないｍｄｘ４ｃｖ筋肉において筋線維の５％が、１回の移植後にｍｙｏｍａｋｅｒを発現する非筋肉細胞と融合した。
【0082】
分化細胞のリプログラミングは、転写因子の発現または細胞融合によって達成することができる。実際に、線維芽細胞におけるＭｙｏＤの発現は、筋肉への変換に十分であり、定義された因子の体細胞への異所性発現は、多能性への変換を誘導する。細胞培養では、筋肉細胞と線維芽細胞または肝細胞との間のヘテロカリオン形成により、非筋核からの筋遺伝子が活性化される。マウス網膜ニューロンは、損傷中に造血前駆細胞と融合した後にリプログラミングを受け、最終的に網膜の部分的な再生をもたらす。
【0083】
結論として、ｍｙｏｍａｋｅｒは、複数の細胞型がインビボでＷＴおよびジストロフィー性の筋肉に融合することを可能にする。非筋肉細胞のｍｙｏｍａｋｅｒ媒介性の融合は、リプログラミングに依存しない戦略を用いることにより、ジストロフィー筋線維への治療材料の送達を支援し得る。
【0084】
本開示で使用される見出しは、その見出しに関連するすべての開示がその見出しで始まる項内にあることを示唆することを意図するものではない。あらゆる主題の開示は、本明細書全体を通して見られる場合がある。
【0085】
「好ましくは」、「一般的に」、および「典型的に」等の用語は、特許請求される発明の範囲を限定するため、または特定の特徴が、特許請求される発明の構造もしくは機能にとって重要、不可欠、またはさらには重要であることを暗示するために本明細書で使用されるものではないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態で利用されてもされなくてもよい代替または追加の特徴を強調することを意図しているに過ぎない。
【0086】
本開示で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、別段の規定がない限り、１つまたは１つより多くを意味する。特許請求の範囲で、「含む」という語と組み合わせて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語は、別段の規定がない限り、１つまたは１つより多くを意味する。本開示または特許請求の範囲で使用される場合、「別の」は、別段の規定がない限り、少なくとも２番目それ以上を意味する。本開示で使用される場合、「等」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、および「例えば（ｅ．ｇ．）」という句は、その用語（「等」、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」、および「例えば（ｅ．ｇ．）」）に続くリストはいくつかの例を提供するが、そのリストは必ずしも完全に包括的なリストではないという点で、「限定されないが、例えば」を意味する。「含む」という語は、「含む」という語に続く項目が、追加の列挙されていない要素またはステップを含む可能性があること、すなわち、「含む」は、追加の列挙されていないステップまたは要素を除外するものではないことを意味する。
【0087】
別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件等の特性等を表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明で開示される主題によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
【0088】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、質量、重量、時間、体積、濃度、またはパーセンテージの値または量に言及する場合、指定された量から、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、およびいくつかの実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示される方法を実行するのに適切である。
【0089】
１つ以上の実施形態の詳細な説明が本明細書に提供される。しかしながら、本発明は様々な形態で具現化され得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書に開示される特定の詳細は（たとえ、好ましいまたは有利なと表記されていても）限定的であると解釈されるべきではなく、むしろ特許請求の範囲の例示的な根拠として、および当業者に本発明を任意の適切な様式で用いることを教示するための代表的な根拠として使用されるべきである。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な修正例が、前述の記載および添付の図から当業者に明らかになるであろう。そのような修正例は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【配列表】
【国際調査報告】