特表2022-539919サンプル干渉を検出および枯渇させるための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-13
(54)【発明の名称】サンプル干渉を検出および枯渇させるための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/531 20060101AFI20220906BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20220906BHJP
【ＦＩ】
G01N33/531 B
G01N33/543 541A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022541772
(86)(22)【出願日】2020-06-25
(85)【翻訳文提出日】2022-03-09
(86)【国際出願番号】 US2020039503
(87)【国際公開番号】W WO2020264083
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】62/866,318
(32)【優先日】2019-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/006,630
(32)【優先日】2020-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522093591
【氏名又は名称】ベラバス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ケイン ソルド， ジョシュア
(72)【発明者】
【氏名】ダグラス バーグマン， スコット
(72)【発明者】
【氏名】ネルソン， エリック
(57)【要約】
本明細書は、抗ストレプトアビジン干渉および抗ビオチン干渉に特異的な試薬および微粒子結合表面を調製するための方法を提供する。診断試験の前に、試薬および微粒子結合表面を使用して、サンプル中の抗ストレプトアビジン干渉および抗ビオチン干渉の濃度を、アッセイ遮断閾値（ABT）未満に遮断、枯渇、または低減する方法も開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体の生物学的サンプルからの干渉を軽減するための方法であって、以下を含む方法：a）サンプルをストレプトアビジンを含む粒子と組み合わせて混合物を提供する。
b）ストレプトアビジンへの干渉の結合を促進するために混合物を混合する。と
c）粒子をサンプルから分離する。
これにより、干渉の量を除去または削減します。
【請求項2】
ストレプトアビジン上のビオチン結合部位が占有されていないため、抗ストレプトアビジン、ビオチン、またはその両方による干渉が除去または低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ストレプトアビジン上のビオチン結合部位がビオチンで飽和され、その結果、抗ストレプトアビジンによる干渉が除去または低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
抗ビオチン、またはその両方による干渉が除去または低減される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ストレプトアビジンが追加の非ビオチン捕捉部分とコンジュゲートされ、その結果、捕捉部分に結合する物質による干渉も除去または低減される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
粒子が磁性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
粒子をサンプルから分離することは、混合物を磁石に曝し、液体サンプルを収集することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
液体生物学的サンプルからの干渉を軽減するための方法であって、以下を含む方法。a）サンプルをビオチン飽和ストレプトアビジン（QSAv ）と組み合わせて混合物を提供します。
b）ストレプトアビジンへの干渉の結合を促進するために混合物を混合する。
それにより、抗ストレプトアビジン干渉の量をブロックまたは低減します。
【請求項9】
抗ストレプトアビジン、抗ビオチン、またはその両方による干渉が遮断または低減されるように、ＱＳＡｖがビオチン化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ＱＳＡｖが追加の非ビオチン捕捉部分とコンジュゲートされ、その結果、捕捉部分に結合する物質による干渉も遮断または低減される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
ビオチン化またはコンジュゲーションが共有結合である、請求項４、５、９、または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ビオチン化が、エステル誘導体化ビオチンの使用を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
エステル誘導体化ビオチンが、ＮＨＳ－ビオチン、ＮＨＳ－ＬＣ－ビオチン、ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチン、ＴＦＰ－ＬＣ－ビオチン、ＮＨＳ－クロマリンク－ビオチンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。、NHS-PECM-ビオチン、TFP-（PEO）n-ビオチン、およびNHS-（PEO）n-ビオチン。
【請求項14】
ストレプトアビジン上のビオチン結合部位に非共有結合したビオチンリンカーによってビオチン化またはコンジュゲーションが媒介される、請求項4、5、9、または10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ＱＳＡｖが主に単量体である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項16】
ＱＳＡｖまたは粒子が遮断されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ＱＳＡｖまたは粒子が、 ＰＥＧ化によって遮断されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
診断アッセイ中の干渉を低減するための方法。この方法は、以下を含む。a）液体の生物学的サンプルをビオチンで飽和したストレプトアビジンと組み合わせて混合物を提供する。
b）ストレプトアビジンへの干渉の結合を促進するために混合物を混合する。と
c）診断アッセイを実施する。
それにより、診断アッセイにおける干渉の量をブロックまたは低減し、
【請求項19】
診断アッセイ中の干渉を低減するための方法。この方法は、以下を含む。a）サンプルをストレプトアビジンを含む粒子と組み合わせて混合物を提供する。
b）ストレプトアビジンへの干渉の結合を促進するために混合物を混合する。
c）粒子をサンプルから分離する。と
d）診断アッセイを実施する。
これにより、干渉の量を除去または削減します。
【請求項20】
結合、混合、および存在する場合は分離ステップが、診断アッセイの分析段階の前に行われる、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
診断アッセイがサンドイッチイムノアッセイである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
診断アッセイが競合イムノアッセイである、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
追加の捕捉部分が、追加の捕捉部分を遮断、除去、または低減する、請求項５または１０に記載の方法。異好性干渉。
【請求項24】
追加の捕捉部分が異種抗体であり、異好性干渉がヒト抗動物抗体干渉である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
追加の捕捉部分が交差反応性干渉を遮断、除去、または低減する、請求項５または１０に記載の方法。
【請求項26】
追加の捕捉部分がウイルス抗原またはその抗原性部分である、請求項２３に記載の方法。
【請求項27】
ウイルス抗原またはその抗原性部分が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルス由来のコロナウイルスエピトープを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ストレプトアビジンを5：1から11：1の範囲のモル過剰のビオチンに曝露するステップを含むプロセスによって作製されたビオチン飽和ストレプトアビジン（ QSAv）。
【請求項29】
モル過剰が７：１から８：１である、請求項２８に記載のＱＳＡｖ。
【請求項30】
非特異的に結合したビオチンを除去するための熱アルカリ緩衝液洗浄をさらに含む、請求項２８または２９のＱＳＡｖ、
【請求項31】
凝集を軽減するためにストレプトアビジンを遮断するステップをさらに含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載のＱＳＡｖ、
【請求項32】
前記ブロッキングが、熱アルカリ性緩衝液洗浄に界面活性剤を含むことを含む、請求項３１に記載のＱＳＡｖ。
【請求項33】
ブロッキングが、分取ブロッキング試薬による共有結合修飾を含む、請求項３１または３２に記載のＱＳＡｖ。
【請求項34】
ペグ化を含む、請求項３３に記載のＱＳＡｖ 、
【請求項35】
アビジンを4：1から8：1の範囲のモル過剰のビオチンに曝露するステップを含むプロセスによって作製されたビオチン飽和ストレプトアビジン結合微粒子（QSAvビーズ）。
【請求項36】
非特異的に結合したビオチンを除去するための熱水洗浄をさらに含む、請求項３５に記載のＱＳＡｖビーズ。
【請求項37】
ＱＳＡｖまたはＱＳＡｖビーズに結合させることをさらに含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載のＱＳＡｖまたはＱＳＡｖビーズ。
【請求項38】
ストレプトアビジンが追加の捕捉部分に結合しているストレプトアビジン結合微粒子。
【請求項39】
前記追加の捕捉部分がビオチン化され、ビオチン飽和ステップの前または最中にストレプトアビジンまたはストレプトアビジン結合微粒子に曝露される、請求項３７または３８に記載のＱＳＡｖ、ＱＳＡｖビーズ、またはストレプトアビジン結合微粒子。
【請求項40】
ビオチン飽和ステップの前、最中、または後に、追加の捕捉部分がストレプトアビジンまたはストレプトアビジン結合微粒子に共有結合している、請求項３７または３８に記載のＱＳＡｖ、 ＱＳＡｖビーズ、またはストレプトアビジン結合微粒子。
【請求項41】
前記ＱＳＡｖまたはＱＳＡｖビーズを、＜１２００ｐｇ ／ｍＬの遊離ビオチンを含む緩衝液に保存することをさらに含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載のＱＳＡｖまたはＱＳＡｖビーズ。
【請求項42】
微粒子が磁性である、請求項３５～４１に記載のＱＳＡｖビーズ、またはストレプトアビジン結合微粒子。
【請求項43】
ストレプトアビジンに対する遊離ビオチンの比率が50μgのストレプトアビジンに対する1ngの遊離ビオチンを超えないQSAv溶液またはQSAvビーズ懸濁液。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連アプリケーションへの相互参照
この出願は、2020年4月7日に出願された米国仮出願第63/ 006,630号および2019年6月25日に出願された62 / 866,318に優先権の利益を主張し、その全内容はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
この出願は、2020年4月7日に出願された米国仮出願第63/ 006,630号および2019年6月25日に出願された62 / 866,318に優先権の利益を主張し、その全内容はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
9分ごとに、誤った診断または遅れた診断のために誰かが死亡します[1]、医師は治療を導くために診断検査に頼っていますが、血液または尿への複数の干渉（例えば、血液中のビオチン）のために検査の2％以上が不正確になる可能性がありますテスト）[2]。
【0003】
ビオチンは、ビタミンB7、ビタミンH、コエンザイムRとも呼ばれ、市販の栄養補助食品、マルチビタミン、出生前のビタミンに高用量で含まれることが多い水溶性ビタミンです。ビオチンは、髪、肌、爪の成長、減量などの健康と美容のために販売されています。また、多発性硬化症などの特定の病状を治療するために、高治療用量の患者に投与されます。ただし、ビオチンは特定のラボテストを大幅に妨害し、誤ったテスト結果を引き起こし、検出されない可能性があり、誤診や治療の遅延につながる可能性があります[3-13]。
【0004】
2017年、有害事象の数が不正確な試験結果とビオチン補給に関連しているため、FDAは安全警告を発しました[14]。2019年6月13日、FDAは「ビオチン干渉の試験」に関するガイダンス文書草案の通知を発表しました。invitro診断装置」[15]。
【0005】
In vitro診断（IVD）企業は、ビオチン干渉を軽減するため、またはビオチン干渉のしきい値を上げて、テストを妨害するためにはるかに高いビオチン濃度を必要とするように、テストを再設計または再編成するために積極的に取り組んでいます。ただし、これらのビオチンベースのテストは、患者によるビオチンまたはビオチンの使用に関連する二次干渉メカニズム、または抗ビオチン干渉[16-17]、およびテスト設計でのストレプトアビジンの使用に関連する干渉メカニズムの影響を受けやすくなっています。抗体、タンパク質、抗原に結合したビオチン、または抗ストレプトアビジン干渉を捕捉するため[18-26]。
【0006】
抗ビオチンおよび抗ストレプトアビジン抗体およびタンパク質は、特定のラボテストを大幅に妨害し、誤ったテスト結果を引き起こす可能性があります。アッセイの設計と形式に応じて、テスト信号の減少と患者の誤った低または高の結果を引き起こすビオチン干渉と同様に、抗ビオチンおよび抗ストレプトアビジン干渉もテスト信号の減少をもたらしますが、メカニズムが異なるため、ビオチン干渉と間違えられます[16-26]。
【0007】
FDAは最近、IVD企業がClinical＆LaboratoryStandards Institute（CLSI）標準の推奨事項と一致する最大1200 ng / mLの濃度でビオチン干渉をテストし、ビオチン消費の現在の傾向を反映するようにガイダンスを提供しましたが、FDAはヒト抗ストレプトアビジンまたはヒト抗ストレプトアビジン干渉による不正確な検査結果に関連する有害事象に対する安全警告はまだ出されていません[15]。ヒト抗ストレプトアビジンおよびヒト抗ビオチン干渉は文献で報告されていますが、これらの特定の干渉メカニズムを検出および確認したり、ビオチン干渉と区別したりすることは困難です。
【0008】
結合表面（すなわち、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、ナノ粒子、マイクロタイターパイエート/ウェル、キュベット、スライド、センサー、チップ、ロッド、フィルター、膜、チューブ、またはサンプルの処理に使用されるその他の固相）によるサンプルの前処理）固定化または共有結合して捕捉部分または干渉特異的標的を使用して、診断テストの前にサンプル干渉またはバイオマーカーを枯渇、濃縮、および/または特性評価して、テスト結果の品質と精度を向上させることができます[27]。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
IVDアッセイの大部分は、ストレプトアビジン-ビオチン結合を利用しています。これらのアッセイは、遊離ビオチンおよびアッセイ試薬とストレプトアビジンまたはビオチン（抗ストレプトアビジン抗体および抗ビオチン抗体を含む）との間の結合を競合または妨害する薬剤からの異好性干渉を受けやすい。アッセイ試薬とストレプトアビジンまたはビオチンとの間の結合を妨害する物質は、その物質が抗体であるかどうかにかかわらず、本明細書では抗ビオチンまたは抗ストレプトアビジンと呼ばれる。ここに開示されているのは、1）これらの異なるタイプの干渉を検出または定量化するため、および2）アッセイ試薬、サンプル、または反応混合物に存在する可能性のある干渉物質を除去または枯渇させるために使用できる試薬（ビーズ）です。正確なアッセイ結果が得られる場合があります。これらの試薬を作成および使用する方法も提供されています。
【0010】
本明細書に開示される試薬のいくつかは、ストレプトアビジンビーズを形成するためにストレプトアビジンでコーティングされたナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンのいくつかまたはすべては、ナノ粒子に共有結合されている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は磁性であり、貯蔵溶液および処理されたサンプル、アッセイ試薬などからのビーズの分離を容易にする。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は磁性である場合もそうでない場合もあり、貯蔵溶液および処理されたサンプルからのビーズの分離が達成される。沈降（遠心分離など）またはろ過による。他の実施形態は、遊離（または可溶性）ストレプトアビジンを含む。遊離またはコーティングされたビーズのいずれかのタイプの実施形態において、ストレプトアビジンは、最小限の過剰ビオチンで飽和（またはクエンチ）され、好ましくは飽和され、その結果、ストレプトアビジンは、ビオチン化アッセイ試薬分子間を橋渡しできず、異好性干渉の原因となる。飽和とは、ストレプトアビジン上のすべてのアクセス可能なビオチン結合部位がビオチンによって占められていることを意味します。遊離ビオチン飽和ストレプトアビジンは、例えば、アッセイ反応混合物に添加（存在）することができる抗ストレプトアビジン異好性干渉遮断試薬としての使用に適している。ビオチン飽和ストレプトアビジンコーティングビーズは、抗ストレプトアビジン異好性干渉洗浄試薬としての使用に適しており、たとえば、分析対象の生体液または抽出物（サンプル）に添加し、サンプルを添加する前に除去することができます。アッセイ反応混合物に。いくつかの用途では、洗浄試薬をアッセイ試薬または部分的なアッセイ反応混合物に添加し、アッセイ反応混合物を完了してアッセイ反応を開始する前に除去することができる。
【0011】
ストレプトアビジンを利用する実施形態は、本開示を通して記載される。しかしながら、脱グリコシル化されたアビジンなどの代替物を含むさらなる実施形態アビジン（ニュートラブルジン）、 CaptAvidin 、単量体アビジンも企図されている。ストレプトアビジンの天然および組換えバージョン、およびその代替物も企図されている。これらの試薬は、ビオチンを結合するための手段または抗ストレプトアビジン干渉を結合するための手段と呼ばれることがあります。
【0012】
ストレプトアビジン活性ビオチン結合部位をクエンチまたは飽和させるためにビオチンを利用する実施形態は、本開示を通して記載される。しかし、ビオチン-PEGn-COOHまたはビオチン-PEGn-CH3またはビオチン-PEGn-OHまたは他のビオチン-R-（非反応性末端化学）などのビオチン化剤を使用するさらなる実施形態（Rは炭素鎖またはリング構造も考えられる。ビオチンおよびビオチンのこれらの修飾形態は、ストレプトアビジンに結合するための手段または抗ビオチン干渉に結合するための手段と呼ばれることがある。
【0013】
アビジンまたはクエンチされたストレプトアビジンは、 （抗ストレプトアビジン干渉）。これらの実施形態の一態様では、追加の捕捉部分は、ビオチン飽和ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合したビオチンであり、抗ビオチン異好性干渉洗浄試薬としての使用にさらに適している。これらの実施形態のさらなる態様では、追加の捕捉部分はルテニウム（元素）である。ルミノール、アクリジニウムエステル、ABEIまたは環状ABEI（ビオチン、有機小分子など）。または、シグナル生成酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどのタンパク質。ストレプトアビジン;抗体、例えば、非ヒト種からの抗体。または抗原。さらに別の態様では、捕捉部分は、任意の非抗体ペプチドまたはタンパク質であり得る。これらすべての場合において、追加の捕捉部分は、ストレプトアビジン被覆ビーズまたはビオチン飽和ストレプトアビジン被覆ビーズを、結合分子に関連する異好性または交差反応性干渉を除去または枯渇させるための洗浄試薬としての使用に適したものにする。いくつかの実施形態は、具体的には、１つまたは複数の捕捉部分を含む。いくつかの実施形態は、１つまたは複数の捕捉部分を具体的に除外する。例えば、いくつかの実施形態では、追加の捕捉部分はビオチンではない。
【0014】
ストレプトアビジン（可溶性、またはビーズ結合、ビオチン飽和または非飽和）への結合を達成するために、いくつかの化学物質が利用可能です。コンジュゲーションは、アミン反応性試薬を使用して進行し、ストレプトアビジンの第一級アミン、通常はエステル、たとえばNHS修飾化合物またはタンパク質への結合を形成します。あるいは、ストレプトアビジンの第一級アミンはチオール化されていてもよい。標準的なチオール化試薬は当技術分野で知られているが、スクシンイミジルトランス-4-（マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）およびスクシンイミジル3-（2-ピリジルジトビオ）プロピオネート（SPDP）を含む。次に、結合は、マレイミド修飾化合物またはタンパク質などのチオールまたはスルフヒドリル反応性試薬を使用して実行することができます。別の代替案では、ストレプトアビジンの第一級アミンは、標準的なエステル-マレイミドヘテロ二官能性架橋剤を使用してマレイミドと反応します。次に、チオールまたはスイフヒドリルで修飾された（または含有する）化合物またはタンパク質を使用して、結合を行うことができる。これらの化学物質および関連する試薬は、結合の手段と呼ばれる場合があり、反応自体は結合のステップと呼ばれる場合があります。
【0015】
ビオチン飽和ストレプトアビジン被覆ビーズ、ストレプトアビジンまたはクエンチされたストレプトアビジンへの追加の捕捉部分の結合は、ヘテロ二官能性リンカーの使用を伴う。ストレプトアビジンへの共有結合を形成するリンカーの一端の官能基と、追加の捕捉部分への共有結合を形成する他端の官能基。特定の官能基の化学的性質については、以下で説明します。いくつかの実施形態では、リンカーに結合した捕捉部分が市販されている場合があります。いくつかの実施形態は、特定の官能基または
官能基のセット。いくつかの実施形態は、特定の官能基または官能基のセットを具体的に除外し、いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性リンカーの中央部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含む。この実施形態の態様では、リンカーは、ＰＥＯのＰＥＧの複数のユニット、例えば、ＰＥＧｎまたはＰＥＯｎを含み得、ここで、 ｎは、１から３６までの任意の整数である。 、三官能性PEG、4アームPEG、8アームPEG、ヘテロ二官能性PEG、ホモ二官能性PEG、線形単官能性PEGの代わり。他のリンカーは、本明細書で以下に開示される。
官能基のセット。いくつかの実施形態は、特定の官能基または官能基のセットを具体的に除外し、いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性リンカーの中央部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含む。この実施形態の態様では、リンカーは、ＰＥＯのＰＥＧの複数のユニット、例えば、ＰＥＧｎまたはＰＥＯｎを含み得、ここで、 ｎは、１から３６までの任意の整数である。 、三官能性PEG、4アームPEG、8アームPEG、ヘテロ二官能性PEG、ホモ二官能性PEG、線形単官能性PEGの代わり。他のリンカーは、本明細書で以下に開示される。
【0016】
ビオチンをビオチン飽和ストレプトアビジンに結合させる様々な方法を本明細書で以下に開示する。ただし、他の捕捉試薬は、ストレプトアビジンに類似して結合させることができます（ビオチンが飽和しているかどうか、ビーズに結合しているかどうか）。
【0017】
代替の実施形態において、追加の捕捉部分は共有結合されないが、ビオチンリンカーを使用して付着される。いくつかの実施形態において、追加の捕捉部分はビオチンであり、リンカーは、各末端にビオチン分子、例えば、ビオチン－ＰＥＧｎ－ビオチンを有する。このような実施形態では、ビス－ビオチンリンカーは、ストレプトアビジン飽和手順で使用されるビオチンのわずかなパーセンテージとして添加される（ビーズ間の架橋を回避するため）。したがって、一方の端のビオチンはストレプトアビジンに結合し、もう一方の端のビオチンは自由に捕捉部分として機能します。他の実施形態では、一端にビオチンを有し、他端に任意の他の捕捉部分を有するリンカー、例えば、ビオチン－（ＰＥＧ）ｎ－ルテニウムが使用される。さらなる実施形態では、ストレプトアビジンをビオチン－（ＰＥＯ）ｎ－ルテニウムおよびビオチン－（ＰＥＯ）ｎ－アイカリンホスファターゼで同時コーティングするなど、２つ以上の異なる捕捉部分をこのアプローチを介して導入することができ、これらの実施形態では、潜在的により大きな割合であるストレプトアビジン飽和手順で使用されるビオチンの内、ビーズ間のブリッジングは問題にならないため、捕捉部分に結合したビオチンである可能性があります。ただし、キャプチャ部分のサイズとiinkerの長さに基づく立体的な考慮事項は、比率を制限する要因になる可能性があります。
【0018】
いくつかの実施形態は、液体の生物学的サンプルにおける干渉を軽減する方法である。他の実施形態は、診断アッセイにおける干渉を低減する方法である。いくつかの実施形態において、ビオチン飽和ストレプトアビジン（ビオチンクエンチストレプトアビジン；ＱＳＡｖ ）は、液体生物学的サンプルと組み合わされて混合物を形成し、混合物は、干渉を遮断または低減するためにストレプトアビジンへの干渉の結合を促進するために混合される。いくつかの実施形態は、診断アッセイを実施することをさらに含む。いくつかの実施形態において、組み合わせおよび混合は、アッセイの分析段階の前に行われる。本明細書で使用される場合、「アッセイの分析段階」という用語は、サンプルが分析物を捕捉または検出するため、および／または分析物の存在を示すまたは定量する信号を生成するために試薬と混合されるときに始まり、信号の測定まで続く。
【0019】
他の実施形態（干渉を軽減または低減するため）では、ビオチンクエンチされているかどうかにかかわらず、ストレプトアビジンを含む粒子を液体生物学的サンプルと組み合わせて混合物を形成し、混合物を混合してストレプトアビジンへの干渉の結合を促進し、粒子を分離する干渉を除去または低減するためにサンプルから。いくつかの実施形態は、診断アッセイを実施することをさらに含む。いくつかの実施形態において、結合、混合、および分離は、アッセイの分析段階の前に行われる。これらの方法の一態様では、粒子は磁性であり、粒子をサンプルから分離することは、混合物を磁石に曝し、液体サンプルを収集することを含む。さらなる態様では、サンプルは希釈されておらず、サンプルの損失はほとんどまたはまったくない。
【0020】
干渉を軽減または低減するためのこれらの方法のいくつかの実施形態では、サンプルはサンドイッチイムノアッセイで使用される。他の実施形態では、サンプルは競合イムノアッセイで使用される。
【0021】
いくつかの実施形態は、クエンチされたストレプトアビジンを作製する方法である。これらの実施形態のいくつかは、ストレプトアビジンを最小モル過剰の遊離ビオチンに曝露することを含む。一態様では、これは、ビオチン溶液をストレプトアビジン溶液と組み合わせるための定量的添加を含むことができる。これらの実施形態のいくつかは、クエンチされたストレプトアビジンを熱緩衝液で洗浄することを含む。一態様では、これは、ダイアフィルトレーションを含むことができる。いくつかの実施形態は、凝集体の形成を回避するためにストレプトアビジンを遮断することを含む。いくつかの実施形態は、追加の捕捉部分をクエンチされたストレプトアビジンに結合させることを含む。いくつかの実施形態は、これらの方法のいずれかによって作製されたクエンチされたストレプトアビジンを含む。
【0022】
いくつかの実施形態は、粒子結合ストレプトアビジンを作製する方法である。これらの実施形態のいくつかは、粒子結合ストレプトアビジンを最小モル過剰の遊離ビオチンに曝露することを含み、一態様では、これは、ビオチン溶液を粒子結合ストレプトアビジン懸濁液と組み合わせるための定量的添加を含むことができる。これらの実施形態のいくつかは、急冷されたストレプトアビジンを熱水で洗浄することを含む。一態様では、これは、粒子の磁気分離を含むことができる。他の態様では、これは、濾過または沈降による粒子の分離を含み得る。いくつかの実施形態は、追加の捕捉部分を、ビオチンクエンチされているかどうかにかかわらず、粒子結合ストレプトアビジンに結合させることを含む。いくつかの実施形態は、これらの方法のいずれかによって作製された、ビオチンクエンチされているかどうかにかかわらず、粒子結合ストレプトアビジンを含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【図2A】図2A-Bは、ストレプトアビジンとの30分間のインキュベーション後の（2A）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズのサイズ分布を示しています。ビーズの凝集は、1,441.3nmと6,641nmにピークがあり、多分散度指数は173.3％で、（2B）ストレプトアビジンとの4時間のインキュベーション後にビオチン化100BSストレプトアビジンビーズが発生しました。ビーズの凝集は、1,512.6nmと14,536nmにピークがあり、多分散度指数は242.8％でした。
【図2B】同上。
【0025】
【0026】
【図4A】図4A-Cは、抗ビオチン抗体の（4A）SEC-HPLC標準曲線を示しています。矢印で示されたデータポイントは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズで前処理して抗ビオチン抗体を枯渇させた後のサンプルに残っているピーク面積と抗ビオチン抗体（μg/mL）に対応します。 4B-Cは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズによる枯渇前および枯渇後（4C）の抗ビオチン抗体（4B）のSEC-HPLC分析を示しています。抗ビオチン抗体の枯渇後、ピーク面積は1,384から318に減少し、抗ビオチン濃度は205μg/ mLから44.62μg/ mLに減少しました。
【図4B】同上。
【図4C】同上。
【0027】
【図5AB】図5A-Dは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを使用したHPLC-SEC枯渇アッセイの処理前後のクロマトグラムです。図５Ａは、ビーズによるアフィニティー精製されたヤギＩｇＧの枯渇がないことを示している。図５Ｂは、ビーズによるビオチン化アフィニティー精製ヤギＩｇＧの枯渇がないことを示している。SCは、ビーズによるヤギ抗ビオチンAbの枯渇を示しています。 SDは、ビーズによるヤギの抗ストレプトアビジンの枯渇を示しています。すべての場合において、未処理および処理済みのプロファイルは、ラベル付きの矢印で示されています。
【図5CD】
【0028】
【0029】
【0030】
【発明を実施するための形態】
【0031】
詳細な説明
アッセイ干渉を引き起こす化合物の同定または枯渇に対する既存のアプローチにもかかわらず、患者サンプル中の抗ビオチンおよび抗ストレプトアビジン干渉を検出および軽減するための高速で使いやすい製品ソリューションの臨床的必要性が残っています。このような製品ソリューションは、臨床医や臨床検査医学の専門家がこれらの干渉のリスクが最も高い患者と患者集団をよりよく理解するのに役立つ有病率調査も容易にします。
アッセイ干渉を引き起こす化合物の同定または枯渇に対する既存のアプローチにもかかわらず、患者サンプル中の抗ビオチンおよび抗ストレプトアビジン干渉を検出および軽減するための高速で使いやすい製品ソリューションの臨床的必要性が残っています。このような製品ソリューションは、臨床医や臨床検査医学の専門家がこれらの干渉のリスクが最も高い患者と患者集団をよりよく理解するのに役立つ有病率調査も容易にします。
【0032】
アッセイ製剤中の抗ストレプトアビジン干渉に特異的なブロッキング試薬を使用することにより、患者サンプルにおける抗ストレプトアビジン干渉を軽減する臨床的必要性もあります。この製品ソリューションは、抗ストレプトアビジン干渉が診断テストの設計によって軽減されるため、ラボのワークフローへの影響も最小限に抑えられます。
【0033】
分析物の誤った高レベルまたは低レベルの報告につながる可能性があります。干渉の1つのタイプは、信号の生成と観測に関連しています。これらには、濁度、溶血、消光、およびシグナル生成酵素の阻害などの要因が含まれます。一般に、これらの干渉は直接観察可能であるか、特殊な試薬なしでテストできます。本明細書で開示される実施形態は、そのような信号生成／観測干渉に対処せず、本明細書での干渉への一般的な言及は、そのような干渉を含まない。
【0034】
分析物の捕捉と物理的検出に関連しています。これらには、分析物と捕捉または検出試薬との間の相互作用を阻害する干渉、または分析物の存在（または不在）に関係なく捕捉および検出試薬の会合を引き起こす干渉が含まれます。このタイプの干渉は異好性干渉と呼ばれます。本明細書で使用される場合、「干渉」は、文脈上別段の指示がない限り、異好性干渉を意味すると理解されるべきである。本明細書に開示される実施形態は、様々な特定の異好性干渉に対処する。一般に、異好性干渉は直接観察することはできず、標準的なアッセイ試薬でそれらの存在を容易に示すこともできません。本明細書に開示される実施形態のいくつかは、特定の存在を実証するため、または特定のものを定量化するために使用することができる。異好性干渉。異好性干渉には、ビオチン、抗ビオチン、抗ストレプトアビジン、および抗異種抗体干渉、ならびに成分に結合する干渉が含まれます。 信号発生システム（酵素、繊維など）を分析します。抗異種抗体干渉には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、および/またはヤギの免疫グロブリンを認識するヒト抗体が含まれます。
【0035】
別のタイプのイムノアッセイ干渉は、交差反応性抗体に関連しています。抗原間の交差反応性は、ある特定の抗原に対する抗体が別の異なる抗原との結合に成功したときに発生します。言い換えれば、交差反応性は、抗体によるその免疫原以外の抗原への結合を伴う。これは、例えば、細菌またはウイルスの特定の株からの抗原を認識する抗体を検出することを目的としたイムノアッセイにおいて、特に問題となる可能性がある。このようなアッセイは、対象が問題の病原体または病原体に曝露された（感染した）かどうかを判断するために一般的に使用されます。対象が以前に関連株に曝露されたことがある場合、それらは、アッセイが検出することを意図している株からの抗原と交差反応する抗体を有し、したがって偽陽性の結果を生成する可能性がある。
【0036】
本明細書で使用される場合、「イムノアッセイ」は、一般に、分析物の検出または定量が、分析物に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体）の使用を使用するアッセイを指す。しかしながら、分析物に特異的に結合することができる非抗体剤が抗分析物抗体と同様に使用されるアッセイを設計することも可能であり、いくつかの実施形態では、分析物に特異的に結合することができる非抗体剤はアプタマーである。または分子インプリントポリマー。したがって、いくつかの実施形態において、「イムノアッセイ」は、非抗体剤が、典型的には抗体によって供給される分析物特異的結合活性を提供するアッセイを包含することができる。様々な実施形態は、分析物特異的結合活性として抗体または非抗体剤を具体的に含むかまたは除外する。いくつかの実施形態は、アプタマーまたは分子インプリントポリマーを具体的に含むかまたは除外する。イムノアッセイは、コンポーネントの技術と物理的配置に基づいてクラスに分類できます。アッセイフォーマット。 1つのクラスは、アッセイ反応が行われるマイクロチューブやマイクロタイタープレートなどの容器内で、サンプル（分析物を含む可能性がある）と検出および/または信号生成試薬を組み合わせることを含みます。試薬は、アッセイの過程で容器に追加したり、容器から取り外したりすることができます。（いくつかの変形例では、アッセイ成分の一部が最初の容器から取り出され、アッセイが進行する第２の容器に加えられる。）そのようなアッセイは、本明細書では「ポット」アッセイと呼ばれるものとする。別のクラスでは、検出および／または信号生成試薬のいくつかは、固体基板またはマトリックス、例えば膜の特定の領域に固定されている。サンプル（分析物を含む可能性がある）は、固体基板またはマトリックスを含む装置の特定の場所に適用され、試薬が固定されている領域に、しばしば横方向の流れによって移動することによって、固定された試薬に遭遇します。追加のアッセイ試薬は移動相とともに移動します。このようなアッセイは、本明細書では「ゾーン」アッセイと呼ばれる。ポットアッセイのためにアッセイ反応が起こる容器にサンプルが加えられる点から、またはゾーンアッセイのために固体基質またはマトリックスを含む装置の特定の場所にサンプルが加えられる点から、生成された信号の測定を通じて、アッセイの分析段階と呼ばれます。多くの実施形態において、本明細書に開示される干渉洗浄またはブロッキング試薬は、分析段階の前にサンプルに添加され、洗浄試薬に関して除去される。すなわち、これらの実施形態では、干渉低減試薬が「前処理」として使用される。
【0037】
健康と美容のために高用量のビオチン（1日あたり5,000～20,000 mcg）または治療（1日あたり100,000～300,000 mcg）を消費する患者は、方法に応じて、血中のビオチンの循環濃度が1,000ng / mL以上になる可能性があります。ビオチンの摂取から長い間、患者固有のビオチンクリアランス時間、および患者が腎疾患または腎機能の低下を患っている場合、ビオチンクリアランスを損ない、ビオチンの循環レベルを上昇させる可能性があります。血液、血清、血漿サンプルを採取する前、または尿サンプルを収集する前に、患者の遊離ビオチンがまだテスト固有のビオチン干渉しきい値を下回っていない場合、サンプル中のビオチンはテスト固有のビオチン干渉しきい値を超えています抗ビオチン捕捉部分（すなわち、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン、モノマーアビジン、CaptAvidin 、または抗体、抗体フラグメント/ Fab / F（ab） '2、アプタマー、およびビオチンに特異的な分子インプリントポリマーと競合して結合します）その後、アッセイ製剤で使用されるビオチン化抗体、タンパク質、または抗原の結合を妨害します。これにより、偽の低アッセイシグナルが発生し、アッセイ形式に応じて、偽の低用量（サンドイッチアッセイ）または偽の高用量（競合阻害アッセイ）が生じます。
【0038】
ストレプトアビジンは約52,000～55,000 KDaのタンパク質であり、4つの同一のポリペプチド鎖で構成されています。本明細書で使用される場合、単量体ストレプトアビジンは、非凝集ストレプトアビジンタンパク質を指し、解離したストレプトアビジンポリペプチド鎖を指すものではない。ストレプトアビジンへのビオチンの結合（10-14または10-15としてさまざまに報告されています 文献のmol / L）は、自然界で知られている最も強力な非共生相互作用の1つです。組換えストレプトアビジンは、免疫学および分子診断におけるユニバーサルテストシステムを可能にするための適切なツールであり、ビオチン化抗体、タンパク質、および抗原を捕捉するため、またはさまざまな生体分子を互いにまたは固体に付着させるためのイムノアッセイなどの診断テストで一般的に使用されますマイクロプレート、ビーズ、マイクロアレイなどのサポート。ストレプトアビジンを使用することで、アッセイ開発者は、実証済みの抗ビオチン遅延キャプチャーアッセイフォーマットを利用して、アッセイの反応速度、精度、および
感度、STATアッセイのアッセイインキュベーション時間の短縮とターンアラウンドタイム（TAT）の高速化を促進します。
感度、STATアッセイのアッセイインキュベーション時間の短縮とターンアラウンドタイム（TAT）の高速化を促進します。
【0039】
サンプルにストレプトアビジンに対する特異性の干渉が含まれている場合、ストレプトアビジンがビオチン化抗体であるタンパク質に自由に結合できなくなった場合、抗ストレプトアビジン干渉はストレプトアビジンまたはそのポリペプチド鎖に結合し、結合ビオチンがストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するのを立体的にブロックまたは損なう可能性があります、またはテストデザインまたはアッセイ形式で使用される抗原は、ビオチン干渉と同様に、抗ストレプトアビジン干渉は誤った低用量（サンドイッチアッセイ）または誤った高用量（競合阻害アッセイ）をもたらす可能性があります。同様に、サンプルにビオチンへの特異性の干渉が含まれている場合、抗ビオチン干渉はビオチンに結合し、結合したビオチンがストレプトアビジンのビオチン結合部位に結合するのを大幅にブロックまたは損なう可能性があります。ビオチン化抗体、タンパク質、または抗原などからのビオチンがテスト設計またはアッセイ形式で使用される場合、抗ビオチン干渉は誤った低アッセイ信号をもたらし、再び誤った低用量（サンドイッチアッセイ）をもたらす可能性があります。偽の高用量（競合阻害アッセイ）。いくつかの実施形態は、抗ストレプトアビジン干渉に対処する。いくつかの実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチン干渉の両方に対処する。
【0040】
ビオチン-ストレプトアビジン相互作用はイムノアッセイメカニズムの捕捉部分で一般的に使用されますが、異好性干渉は一般的な検出コンポーネントとの相互作用によっても発生する可能性があります。このような成分には、フルオレセインや元素ルテニウムなどのフッ素が含まれます。ルミノール、アクリジニウムエステル、ABEi 、環状ABEIなどの化学発光。 ！などのbioiuminescentsウシフェリン;アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、これらの信号生成分子に結合する干渉は、分析物に結合する検出抗体（または他の検出試薬）と偽の高信号をもたらさないものとの間の架橋を引き起こす可能性があります。いくつかの実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗シグナル生成分子干渉の両方に対処する。
【0041】
イムノアッセイは通常、抗血清、ポリクローナル抗体、または非ヒト種のモノクローナル抗体を利用します。血清または他のアッセイサンプルには、これらの異種抗体を認識する干渉が含まれている場合があります。これは、ヒト抗動物抗体（HAAA）と呼ばれることもあります。特に、人間は多種多様な動物種に対する抗体を産生します。一般的に、これらは、マウス、牛、馬、犬、猫、山羊、ウサギ、羊など、最も多くの相互作用が発生する種です。それらの中で、マウス、ヤギ、ウサギ、およびヒツジからの抗体、特にIgGは、臨床免疫化学的アッセイシステムで非常に一般的に使用されています。ただし、同様の異好性干渉は、人間以外の被験者からのサンプルで発生する可能性があります。このような抗抗体干渉は、不在下で捕捉抗体と検出抗体の間に架橋を引き起こす可能性があります
結合した分析物の、または分析物に結合した検出抗体と結合していない検出抗体との間の架橋により、偽の高または偽の低信号が生じる。いくつかの実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗異種抗体干渉の両方に対処する。
結合した分析物の、または分析物に結合した検出抗体と結合していない検出抗体との間の架橋により、偽の高または偽の低信号が生じる。いくつかの実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗異種抗体干渉の両方に対処する。
【0042】
イムノアッセイの干渉に対処するには、ブロッキングとクリーニングの2つのモードがあります。本明細書で使用される場合、ブロッキング試薬は、アッセイ反応に存在し、干渉物質との相互作用を通じて、干渉を防止または低減する。いくつかの実施形態は、可溶性のビオチン飽和ストレプトアビジンを含むか、またはそれを利用し、抗ストレプトアビジン干渉を遮断するのに適している。たとえば、ビオチン、シグナル生成分子、または異種抗体。第２の干渉標的分子と結合した可溶性のビオチン飽和ストレプトアビジンを含むかまたはそれを利用する実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗第２の分子干渉の両方を遮断するのに適している。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に含む。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に除外する。ブロッキング試薬は、アッセイの分析段階で追加することも、分析前の段階で追加して分析段階にとどめることもできます。いくつかの実施形態において、ブロッキング試薬はまた、横流アッセイなどのゾーンアッセイの分析段階中に遭遇することができ、またはそのようなアッセイの特定のゾーンに保持され得る。本明細書で使用される場合、アッセイの分析段階は、分析物の捕捉、検出、および定量化が行われる、アッセイまたはアッセイシステムの時間的および／または物理的部分を指す。
【0043】
「ブロック」および「ブロッキング」という用語は、本明細書では、概念的に関連しているが、複数の意味で使用されていることに留意されたい。本明細書に開示される試薬の調製において、「ブロッキング」などは、化学的に反応性の部位の反応性および特異的および／または非特異的結合部位の有効な親和性を妨害または低減することを説明するために使用される。これは、分取ブロッキングと呼ばれることがあります。したがって、本明細書に開示されたストレプトアビジン被覆ビーズのコアナノ粒子への反応および／または非特異的結合、またはタンパク質の凝集を防ぐために本明細書で使用される界面活性剤および高分子ブロッキング試薬は、「ブロッキング」および「ブロッキング」のこの意味に関連する。ストレプトアビジンのビオチンによる飽和は、どのビオチンがブロッキング試薬であるかという分取ブロッキングの一形態と見なすこともできます。分取ブロッキングは、明確な機能であるアッセイ干渉を防止または低減するブロッキングと混同しないでください。
【0044】
本明細書で使用される場合、洗浄試薬は、血清または他の生物学的サンプル（またはイムノアッセイ反応混合物の他の成分）に添加され、次に、イムノアッセイ反応混合物の成分を一緒に混合する前に、サンプルまたは他の成分から除去される。
つまり、洗浄試薬は、アッセイの分析前段階で使用および除去され、分析段階には存在しません。サンプルおよび/または他のアッセイ試薬から干渉物質を枯渇または除去することにより、干渉を防止または低減します。いくつかの実施形態は、磁性ナノ粒子、ビオチン飽和ストレプトアビジンビーズ上にコーティングされたビオチン飽和ストレプトアビジンを含むか、またはそれらを利用する。そのようなビオチン飽和ストレプトアビジンビーズは、ストレプトアビジン干渉を洗浄するのに適しており、いくつかの実施形態では、ビーズのビオチン飽和ストレプトアビジンは、干渉物質、例えば、ビオチン、シグナル生成分子、異種抗体によって結合されることを条件として第２の分子と結合している。または抗原。ストレプトアビジンが第２の干渉標的分子と結合しているビオチン飽和ストレプトアビジンビーズを含むまたは利用する実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗第２の分子干渉の両方を洗浄するのに適している。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に含む。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に除外する。
つまり、洗浄試薬は、アッセイの分析前段階で使用および除去され、分析段階には存在しません。サンプルおよび/または他のアッセイ試薬から干渉物質を枯渇または除去することにより、干渉を防止または低減します。いくつかの実施形態は、磁性ナノ粒子、ビオチン飽和ストレプトアビジンビーズ上にコーティングされたビオチン飽和ストレプトアビジンを含むか、またはそれらを利用する。そのようなビオチン飽和ストレプトアビジンビーズは、ストレプトアビジン干渉を洗浄するのに適しており、いくつかの実施形態では、ビーズのビオチン飽和ストレプトアビジンは、干渉物質、例えば、ビオチン、シグナル生成分子、異種抗体によって結合されることを条件として第２の分子と結合している。または抗原。ストレプトアビジンが第２の干渉標的分子と結合しているビオチン飽和ストレプトアビジンビーズを含むまたは利用する実施形態は、抗ストレプトアビジンおよび抗第２の分子干渉の両方を洗浄するのに適している。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に含む。いくつかの実施形態は、第２の干渉標的分子の１つまたは複数の属または種を具体的に除外する。
【0045】
ビオチン飽和ストレプトアビジンビーズは、保存バッファーから磁気的に分離し、保存バッファーを除去してから、洗浄するサンプルまたは試薬をビーズに追加することができます。これにより、サンプルまたは試薬は、洗浄プロセスで希釈されません。可溶性ブロッキング試薬の使用。他の実施形態では、ビーズは、濾過または沈降によって液相から分離される。
【0046】
テストの設計、形式、または処方でストレプトアビジンを使用するテストでは、サンプルの抗ストレプトアビジン干渉を軽減するために、アッセイバッファーの特定のブロッカー、添加剤、または成分としてネイティブストレプトアビジンを使用することはできません。テストでブロッカーとして使用する場合、ストレプトアビジンはまた、ビオチン化抗体、タンパク質、オリゴマー、または抗原と競合して結合し、偽の低アッセイシグナルと偽の低用量（サンドイッチアッセイ）または偽の高用量（競合阻害アッセイ）をもたらします。これは、ストレプトアビジンがビオチンに対して非常に強い結合定数と親和性を持っているため、特に懸念されます。一部のテストでは、テストで使用するストレプトアビジンの総量または総濃度を上げることで、抗ストレプトアビジン干渉の力価または濃度を下げることができますが、これはテスト固有およびアッセイ形式固有であり、テストにコストがかかります。これは、サンプルに高力価またはテスト固有のストレプトアビジン干渉しきい値を超えるレベルの抗ストレプトアビジン干渉が含まれている場合にも機能しない可能性があります。
【0047】
ＱＳＡｖ ）とも呼ばれるビオチン飽和ストレプトアビジンに基づく。 QSAvは、主に非凝集、つまり単量体ストレプトアビジンタンパク質に基づいている必要があります。いくつかの局面において、主に非凝集QSAvは、サイズ排除クロマトグラフィーHPLCによる5％未満の凝集、1％未満を有する
二量体または凝集体。ここで、単量体ピークの平均観察分子量は52～55KDです。他の態様では、 ＱＳＡｖは、少なくとも８０、９０、９５、９７、９８、９９％の単量体、またはこれらの値によって制限される任意の範囲である。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンは、それを単量体の非凝集状態に維持するために、例えば、界面活性剤またはポリマー遮断試薬で遮断される。ＱＳＡｖは、抗ストレプトアビジン干渉を遮断するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンは、１つ以上の追加の捕捉部分によるビオチン飽和の前、最中、または後に改変され得る。捕捉部分は、ビオチン飽和プロセスの前または後にストレプトアビジンに共有結合し得る。あるいは、捕捉部分をビオチン化し、ビオチン飽和プロセスの前または最中にビオチン-アビジン結合を介してストレプトアビジンに結合させることができます。ただし、追加の捕捉部分がビオチンである場合（たとえば、ビス-ビオチンリンカーを使用して達成される場合）、過剰な遊離ビオチンの存在下、つまり飽和時にストレプトアビジンに結合する必要があります。１つまたは複数の追加の捕捉部分で修飾されたストレプトアビジンを含む実施形態を使用して、抗ストレプトアビジン干渉および１つまたは複数の捕捉部分に結合する薬剤による干渉を遮断することができる。
二量体または凝集体。ここで、単量体ピークの平均観察分子量は52～55KDです。他の態様では、 ＱＳＡｖは、少なくとも８０、９０、９５、９７、９８、９９％の単量体、またはこれらの値によって制限される任意の範囲である。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンは、それを単量体の非凝集状態に維持するために、例えば、界面活性剤またはポリマー遮断試薬で遮断される。ＱＳＡｖは、抗ストレプトアビジン干渉を遮断するために使用することができる。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンは、１つ以上の追加の捕捉部分によるビオチン飽和の前、最中、または後に改変され得る。捕捉部分は、ビオチン飽和プロセスの前または後にストレプトアビジンに共有結合し得る。あるいは、捕捉部分をビオチン化し、ビオチン飽和プロセスの前または最中にビオチン-アビジン結合を介してストレプトアビジンに結合させることができます。ただし、追加の捕捉部分がビオチンである場合（たとえば、ビス-ビオチンリンカーを使用して達成される場合）、過剰な遊離ビオチンの存在下、つまり飽和時にストレプトアビジンに結合する必要があります。１つまたは複数の追加の捕捉部分で修飾されたストレプトアビジンを含む実施形態を使用して、抗ストレプトアビジン干渉および１つまたは複数の捕捉部分に結合する薬剤による干渉を遮断することができる。
【0048】
ストレプトアビジン化ビーズを形成するために微粒子（またはナノ粒子）に結合されたストレプトアビジンに基づく。ビーズ、特に磁気ビーズを使用すると、損失や希釈なしにサンプルまたはアッセイ試薬の洗浄が容易になります。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンはビオチンで飽和しているが、他の実施形態ではそうではない。ビオチンで飽和されたストレプトアビジンを含む実施形態は、抗ストレプトアビジン干渉を除去または低減するための洗浄試薬として使用することができる。ビオチンで飽和されていないストレプトアビジンを含む実施形態は、ビオチン干渉および抗ストレプトアビジン干渉の両方を除去または低減するための洗浄試薬として使用することができ、いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、ビオチン飽和の前、最中、または後に、以上の追加のキャプチャ部分。捕捉部分は、ビオチン飽和プロセスの前または後にストレプトアビジンに共有結合し得る。あるいは、捕捉部分をビオチン化し、ビオチン飽和プロセスの前または最中にビオチン-アビジン結合を介してストレプトアビジンに結合させることができます。 １つまたは複数の追加の捕捉部分で修飾されたストレプトアビジンを含む実施形態を使用して、抗ストレプトアビジン干渉および１つまたは複数の捕捉部分に結合する薬剤による干渉を遮断することができる。１つまたは複数の捕捉部分は、ビオチン飽和ストレプトアビジンを利用するそれらの実施形態においてビオチンを含むことができる。
【0049】
追加の捕捉部分がビオチンであってはならないことを除いて、異好性または交差反応性の干渉を引き起こす任意の物質であり得る。いくつかの実施形態では、追加の捕捉 部分はルテニウム（元素）です。ルミノール、アクリジニウムエステル、ABEIまたは環状ABEI（ビオチン、有機小分子など）。または、シグナル生成酵素、例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどのタンパク質。ストレプトアビジン;抗体、例えば、非ヒト種からの抗体。または抗原。いくつかの実施形態において、抗原は、免疫アッセイの捕捉部分として使用される抗原と交差反応することができる抗体によって認識され得るものであり、様々な実施形態において、洗浄または遮断試薬において捕捉部分として使用される抗原、またはアッセイにおいて、アレルゲン、病原体由来の抗原、またはピーナッツアレルゲン、単純ヘルペスウイルス抗原、および既知の自己抗体干渉問題を伴う心臓トロポニンＩまたはＴＳＨなどの自己免疫原などの疾患または障害に関連する抗原である。病原体由来の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、原生動物抗原です。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ＭＥＲＳウイルス、ＳＡＲＳウイルス、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外の他のコロナウイルスに対する交差反応性抗体を除去する。いくつかの実施形態は、これらの属または種の捕獲部分の１つまたは複数を具体的に含む。いくつかの実施形態は、これらの属または種の捕獲部分の１つまたは複数を具体的に除外する。
【0050】
ビオチンリンカー、またはコンジュゲートビオチンは、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、オリゴマー、抗原、および小分子（コンジュゲートビオチン）へのビオチンの共有結合のために、さまざまなリンカータイプと長さ、およびさまざまな官能基で構築または購入できます。ビオチンとともに使用される一般的なリンカーおよび官能基（例えば、NHSエステル、TFPエステル、ヒドラジド、マレイミド、チオールなど）は、NHS-ビオチン、NHS-LC-ビオチン、TFP-LC-ビオチン、NHS-LC-LC-ビオチンです。、NHS-クロマリンク-ビオチン、NHS- PECVビオチン、 NHS-（PEO） n-ビオチン、 TFP- （PEO） n-ビオチン、ヒドラジド-ビオチン、ヒドラジド-LC-ビオチン、ヒドラジド-PECU-ビオチン、マレイミド-（PEG）n-ビオチン、およびSH-（PEO） n-ビオチン。ビオチン標識試薬は、アミン反応性、カルボキシル反応性、カルボニル反応性、水溶性、および切断可能である可能性があります。例としては、アミン反応性、カルボニル反応性、カルボキシル反応性、切断可能なビオチン、クリックケミストリー、デスチオビオチン、スルフヒドリル反応性、テトラジンライゲーション、ビオチンアルコール、ビス-ビオチン-PEG、およびD-ビオチン-PEG-サリドマイドがあります。
【0051】
サンプルにビオチン特異性の干渉が含まれている場合、抗ビオチン干渉は、テストデザインまたはアッセイ形式で使用される結合ビオチンに結合し、結合ビオチンのアクセスをブロックまたは損ない、ストレプトアビジン固相または他の抗-ビオチン捕捉部分。ビオチン干渉や抗ストレプトアビジン干渉のように、結合ビオチンが抗ビオチン捕捉部分に自由に結合できなくなった場合、抗ビオチン干渉は誤った低アッセイシグナルをもたらし、誤った低用量（サンドイッチアッセイ）をもたらす可能性があります。偽の高用量（競合阻害アッセイ）。
【0052】
テストデザイン、フォーマット、または製剤でビオチンコンジュゲートを使用するテストでは、サンプル中の抗ビオチン干渉を軽減するために、アッセイバッファーの特定のブロッカー、添加剤、または成分としてビオチンまたはコンジュゲートビオチンを使用することはできません。試験でブロッカーとして使用される場合、ビオチンは試験で使用されるストレプトアビジンと競合して結合し、偽の低用量および偽の低用量（サンドイッチアッセイ）または偽の高用量（競合阻害アッセイ）をもたらす可能性があります。テスト固有のビオチン干渉しきい値を下回る低濃度のビオチンを使用して抗ビオチン干渉をブロックできますが、患者のサンプルに干渉しきい値までのビオチン干渉用量が含まれている場合、サンプルビオチンの組み合わせまたは合計が問題になる可能性があります（内因性ビオチン）およびテストビオチン（ブロッカーとしてのビオチン）は、テスト固有のビオチン干渉しきい値を超え、誤った低アッセイ信号および誤った低用量（サンドイッチアッセイ）または誤った高用量（競合阻害アッセイ）をもたらす可能性があります。
【0053】
ストレプトアビジンはビオチンに非常に迅速かつ非常に強く結合します（結合定数は10-14または10-15としてさまざまに報告されています） 文献ではmol / L）。いくつかの研究は、4つの結合部位へのビオチンのタンパク質構造変化または協調的結合があることを示していますが[28-29]、他の研究は、四量体の4つのサブユニットに結合したビオチンに対する協調的結合がないと結論付けています[30-31]。ストレプトアビジンがモル過剰の遊離ビオチンにさらされると、4つの結合部位すべてへのビオチンの非常に高速で強力な結合相互作用が起こり、すべてのビオチン結合部位の100％ビオチン飽和（100BS）が生じます。自然界で知られている最も強い非共結合結合相互作用、および通常の生理学的条件とpHでのストレプトアビジンからのビオチンの非常に遅いオフレートにより、100BSストレプトアビジンは追加のビオチンまたはビオチン化抗体などの結合ビオチンに結合する可能性が非常に低くなります、診断テストにおけるタンパク質、オリゴマーおよび抗原。本明細書で使用される場合、飽和とは、ストレプトアビジン上のビオチン結合部位をビオチンでブロックすることを指す。これはビオチン化ではなく、ビオチンのストレプトアビジンへの共有結合です。飽和ストレプトアビジンは抗ストレプトアビジン物質に結合できますが、ビオチン含有物質に結合したり架橋したりすることはありません。ビオチン飽和ストレプトアビジンは、クエンチストレプトアビジン（QSAv ）と呼ばれることもあります。
【0054】
ストレプトアビジンをビオチン（すなわちD-ビオチン）で飽和させて、抗ストレプトアビジン干渉を軽減および管理するためのブロッカーとして使用する100BSストレプトアビジンを調製することができます。他の実施形態において、ストレプトアビジン活性ビオチン結合部位のクエンチングは、代わりに、ストレプトアビジンを、ビオチン－ＰＥＧ（ｎ）－ＣＯＯＨまたはビオチン－ＰＥＧ（ｎ）－ＣＨ３またはビオチン－ＰＥＧ（ｎ）－などの溶解したビオチン化剤に曝露することによって達成され得る。GHまたは他のビオチン-R- （非反応性末端化学）ここで、Rは炭素鎖または環構造です。飽和は、ストレプトアビジンのモル過剰のビオチンへの曝露を含み、様々な実施形態において、ビオチン対ストレプトアビジンのモル比は、５：１から１１：１、または７：１から１１：１、または７：の範囲である。1から8：1。いくつかの実施形態では、モル比は７．４：１である。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、単一のバッチで記載されたモル比を構成するすべての飽和ビオチンに曝露される。他の実施形態では、飽和は、それぞれが総ビオチンの一部を含み、バッチの合計が記載されたモル比を構成する反復バッチを介して進行する。たとえば、biot ！n：streptavidinの比率が6：1である単一のバッチではなく、2：1である3つの反復バッチを使用する場合があります。ビオチン：ストレプトアビジンの比率は、各反復バッチで同じである必要はありません。いくつかの実施形態において、ビオチン溶液およびストレプトアビジン溶液は、Ｙコネクタを介した定量的添加によって組み合わされる。いくつかの実施形態では、Ｙコネクタの出口に接続されたチューブ内にインラインミキサーがあり、迅速、即時、および完全な混合を確実にする。ポンプ速度とチューブの長さの組み合わせを使用して、飽和プロセスの総相互作用時間を決定できます。いくつかの実施形態において、９容量のビオチン溶液は、１容量のストレプトアビジン溶液と組み合わされる。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジンおよびビオチン溶液は、トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ８．５で調製される。一態様では、開始ストレプトアビジン濃度は、０．１から１０．０ｍｇ／ ｍＬの範囲であり、したがって、 ＱＳＡｖの適切な溶液は、０．０１から１．０ｍｇ ／ ｍＬ、好ましくは０．０２から０．０５ｍｇ ／ ｍＬの範囲のストレプトアビジン濃度を有する。このような条件は、ビオチン結合部位の飽和を促進し、ストレプトアビジンへのビオチンの非特異的結合を軽減します。
【0055】
、いくつかの実施形態では、 ＱＳＡｖは、例えば、中空繊維フィルターでの希釈を使用して、ＱＳＡｖを繰り返し濃縮および再希釈することによって、一連のホットバッファー洗浄にかけられる。洗浄は、過剰で非特異的に結合したビオチンを除去するために使用されるため、QSAvを干渉遮断試薬として使用した場合、干渉の原因にはなりません。いくつかの実施形態では、例えば、4～6回以上の洗浄が使用されます。、5回洗浄した後、最終濃縮ステップを実行して容量を減らし、目的の濃度（たとえば、0.1～30 mg / mL、または1～10 mg / mL）に到達させます。一態様では、体積を、ＱＳＡｖ溶液の元の体積の５～２０％、例えば１０％に減らすことができる。いくつかの実施形態では、ホットウォッシュの温度は、１５℃から６０℃、好ましくは４０℃から５５℃であるが、より好ましくは４５℃から５０℃である。いくつかの実施形態において、熱洗浄緩衝液は、７．５から１１、または８から９の範囲、例えば、８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ホットウォッシュ緩衝液は、１０から５００ｍＭ、または２０から１５０ｍＭ、または２５から７５ｍＭの範囲のＮａＣｌ濃度を有する。いくつかの実施形態において、緩衝液は、１０ｍＭのトリス、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌである。洗浄と最終濃縮ステップの後、遊離ビオチン濃度は<1200pg / mL、たとえば<1000、<800、<700、または<600 pg / mLである必要があります。いくつかの実施形態では、洗浄されたＱＳＡｖ溶液は、１～６ｐｇの遊離ビオチン／ ｐｇのストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態において、最終的な透析からの流出は、適切に濃縮されたＰＢＳとの定量的添加によって組み合わされて、ＰＢＳ中のＱＳＡｖを提供する。サンプルを洗浄するためのいくつかの実施形態では、ある量のＱＳＡｖが４００μｌのサンプルに添加されるので、その量は、＜４８０ｐｇの遊離ビオチンを含むべきである。
【0056】
いくつかの実施形態では、飽和プロセスからの流出は、後の洗浄のために収集され、他の実施形態では、飽和プロセスからの流出は、中空繊維フィルター装置に直接供給される。飽和プロセスからの流出を分割して、複数の中空糸フィルターに供給し、容量を増やし、過度の背圧を回避することができます。
【0057】
これらのストレプトアビジン溶液は比較的希薄で、やや凝集しやすい傾向があります。これは、ビーズ結合ストレプトアビジンでは発生しない問題です。これが、 QSAvを生成するための飽和および洗浄手順でアルカリ緩衝液が使用される理由です。 （対照的に、ビーズ結合ストレプトアビジンの類似の洗浄では水が使用されます。）洗浄バッファーに0.01-1％w/ v TWEEN 20または別の界面活性剤を含めることにより、凝集をさらに軽減できます。凝集は、ビオチンで飽和させる前に、例えばストレプトアビジンのPEG化によって、分取ブロッキング試薬による共有結合修飾によってさらに軽減することができます。したがって、いくつかの実施形態では、ＱＳＡｖは、ブロックされた、単量体の、ビオチン飽和ストレプトアビジンである。いくつかの実施形態において、単量体ＱＳＡｖは、サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣによる５％未満の凝集体である。他の実施形態では、単量体ＱＳＡｖは１％未満の凝集体である。
【0058】
一実施形態では、１００ＢＳストレプトアビジン（ ＱＳＡｖ）を、サンプル中の抗ストレプトアビジン干渉を標的にして枯渇させるためのブロッキング試薬またはタンパク質ブロッカーとして使用することができる。 100BSストレプトアビジンをアッセイバッファー、ブロッキングバッファー、または検出抗体などのテスト製剤で使用されるテストコンポーネント、またはそれらの任意の組み合わせに追加して、抗ストレプトアビジン干渉に対するテストの感受性を軽減することができます。別の実施形態では、ストレプトアビジンは微粒子結合表面に共有結合し、続いてモル過剰のビオチンとインキュベートして、100BSストレプトアビジンビーズを調製しました。100BSストレプトアビジンビーズを使用してサンプルを前処理し、診断テストの前に抗ビオチン干渉を標的にして枯渇させることができます。
【0059】
本明細書に開示される干渉洗浄試薬は、ストレプトアビジン結合ビーズに基づく。いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、コア粒子に付着した後、ビオチンでクエンチ（飽和）され、いくつかの実施形態では、ストレプトアビジンは、例えば、本明細書に記載のＱＳＡｖを使用して、コア粒子に付着する前にビオチンでクエンチされる。いくつかの実施形態では、コア粒子は磁性である。いくつかの実施形態では、コア粒子は、直径が５００ｎｍ以上、または約０．５μｍであり、したがって、ナノ粒子またはマイクロ粒子のいずれかと呼ぶことができ、いくつかの実施形態では、コア粒子は、１－エチル－ 3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド化学。受動的に吸着されたものを取り除くにはストレプトアビジン、およびさらなる調製ステップでのビーズへの非特異的結合を防ぐため、および干渉洗浄試薬として使用する場合、ビーズ表面はストリッピング試薬（塩、洗剤、低および高pH）で調整され、ビーズは洗剤を使用してブロックされますおよび高分子ブロッキング試薬。これはまた、ナノ粒子の単分散とコロイドの安定性を促進します。100BSストレプトアビジンビーズを生成するために、ストレプトアビジンのビオチンクエンチングは、上記の10BSストレプトアビジン（ QSAv ）の生成と同様に実行できます。飽和には、ビーズ結合ストレプトアビジンをモル過剰のビオチンに曝露することが含まれます。上記のように、ストレプトアビジン活性ビオチン結合部位の飽和は、代わりに、ビオチン-ペグ（n）-COOHまたはビオチン-ペグ（n）-CH3またはビオチン-ペグ（n）-OHなどの溶解したビオチン化剤にストレプトアビジンを曝露することによって達成することができる。または他のビオチン-R-（非反応性末端化学）ここで、Rは炭素鎖または環構造である。様々な実施形態において、ビオチン対ストレプトアビジンのモル比は、4：1から6：1の範囲、例えば5：である。1.1。ビオチンの有効モル過剰は、コア粒子による立体障害のためにビオチン結合部位の一部にアクセスできないため、この正式な比率よりもいくらか高くなります。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジン化ビーズは懸濁され、ビオチン溶液は、ＰＢＳ、ｐＨ６．８で構成される。いくつかの実施形態において、ビオチン溶液およびビーズ懸濁液は、容器内で組み合わされ、例えば、室温で１時間混合される。いくつかの実施形態において、ストレプトアビジン化ビーズ懸濁液およびビオチン溶液は、本質的に上記のＱＳＡｖの生成において記載されるように、定量的添加によって組み合わされる。
【0060】
いくつかの実施形態において、ビオチン飽和ストレプトアビジン化ビーズは、受動的に吸着されたビオチンを除去するために熱洗浄に供され、その結果、それは使用中に浸出せず、干渉源となる。上記の100BSストレプトアビジンとは異なり、100BSストレプトアビジンビーズの洗浄では、ダイアフィルトレーションの代わりに、ろ過、沈降、または磁気分離を利用できます。洗浄は、バッファーの代わりに高温のアイカリン（pH≧7.5）水を使用するという点で、100BSストレプトアビジン洗浄とは異なる場合があります。洗浄懸濁液も超音波処理され、いくつかの実施形態では、洗浄された１００ＢＳストレプトアビジンビーズの懸濁液は、＜１０００ｐｇ／ ｍＬ、例えば、＜１０００、＜８００、＜６００、＜４００、または＜２００ｐｇ ／ ｍＬの遊離ビオチン濃度を有する。いくつかの実施形態において、洗浄された１００ＢＳストレプトアビジンビーズの懸濁液は、５～３０ｐｇの遊離ビオチン／μｇストレプトアビジンを含む。サンプルを洗浄するためのいくつかの実施形態では、１００ＢＳストレプトアビジンビーズの容量が４００ｍＬのサンプルに添加されるので、その容量は、＜４８０ｐｇの遊離ビオチンを含むべきである。
【0061】
100BSストレプトアビジンまたは100BSストレプトアビジンビーズ保存溶液、アッセイバッファー、またはテストコンポーネントに遊離ビオチン（すなわちD-ビオチン）を添加して、100BSストレプトアビジンまたは100BSストレプトアビジンビーズの安定性を改善し、ストレプトアビジンを100％飽和状態に保つこともできます。時間の経過に伴うビオチン、一実施形態では、貯蔵溶液、アッセイ緩衝液、または過剰のビオチンを含む試験成分中の１００ＢＳストレプトアビジンを、単一のブロッキング試薬で抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチン干渉メカニズムの両方を標的とするブロッキング試薬として使用することができる。一実施形態では、ブロッキング試薬を試験の前に使用してサンプルを前処理し、それによって抗ストレプトアビジンおよび／または抗ビオチン干渉メカニズムをブロッキングすることができる。一実施形態では、ブロッキング試薬は、診断試験またはアッセイ設計内で、例えば、アッセイ緩衝液または試薬緩衝液中で使用して、試験中の干渉メカニズムを遮断および軽減することができ、一実施形態では、遊離ビオチンを１００ＢＳストレプトアビジンに添加することができる。または100BSストレプトアビジン-最大1,100pg/ mLの生理学的範囲内の濃度のビーズ。別の実施形態において、遊離ビオチンは、１００ＢＳストレプトアビジンまたは１００ＢＳストレプトアビジンビーズに、１００，０００ｐｇ／ ｍＬ （ １００ｎｇ ／ ｍＬ）または１０，０００，０００ｐｇ ／ ｍＬ（１，０００ｎｇ ／ ｍＬ）などの高濃度で添加することができる。 100BSストレプトアビジンまたは100BSストレプトアビジンビーズを遊離ビオチンを含む溶液に保存した場合、ストレプトアビジンから解離するビオチンは、非常に強い結合により保存溶液に添加されたビオチンから別のビオチンに即座に置き換えられるため、100BSストレプトアビジンのままになります。ストレプトアビジンのビオチンへの一定かつ速いオンレート。したがって、100BSストレプトアビジンまたはビオチンクエンチストレプトアビジンは、安定性のために準生理学的ビオチン濃度も含むアッセイバッファーに100BSストレプトアビジンを添加するストレプトアビジンベースのテストまたはイムノアッセイのブロッキング試薬として使用できます。ストレプトアビジンブロッカーからビオチンが解離した場合、それはアッセイバッファーに添加されたビオチンに置き換えられ、このアッセイバッファーからサンプルまたは試験反応に続いて添加されるビオチンの量は最小限であり、生理学的ビオチン濃度範囲内にあります。
【0062】
IVD企業は、ビオチン干渉の影響を受けやすい各アッセイについて、パッケージインサート（PI）または使用説明書（IFU）でテスト固有のビオチン干渉しきい値をテストして提供します[9、14-15]、ビオチン干渉しきい値が51ng /未満のテスト閾値2.4ng / mLのOrthoClinical Diagnostics Vitros心臓TnlテストなどのmLは、ハイリスクテストまたは脆弱な免疫測定および競合法と見なされます[9]が、ビオチンは100BSストレプトアビジンまたは100BSストレプトアビジンに追加できます。安定性を改善し、経時的に100％の飽和を確保するためのビーズ保存溶液、保存溶液に添加されたビオチンからの試験干渉を軽減するために、最終遊離ビオチン濃度は試験固有のビオチン干渉閾値より低くなければなりません。一実施形態では、100BSストレプトアビジンまたは100BSストレプトアビジンビーズは、ビオチン濃度が生理的範囲内、つまり1,100pg / mL未満のビオチン溶液に保存されているため、テストに干渉しません。別の実施形態では、１００ＢＳストレプトアビジンビーズは、２、５、１０、２０、３０、５０、１００、２５０または５００ｎｇ／ ｍＬビオチンなどのビオチン＞ １，１００ｐｇ ／ ｍＬを含むビオチン溶液である。その後、100BSストレプトアビジンビーズをろ過、遠心分離、または磁気分離します サンプルまたはそれらの組み合わせから、サンプルを100BSストレプトアビジンビーズに添加する前に、100BSストレプトアビジンビーズからビオチン貯蔵溶液を除去します。100BSストレプトアビジンビーズを使用する直前にビオチン保存溶液を除去すると、遊離ビオチン濃度が1,100 pg / mL未満、500 pg / mL未満、または好ましくは100pg / mL未満に減少し、遊離ビオチンが確保されます。濃度がテストのビオチン干渉しきい値を下回っています。
【0063】
100BSストレプトアビジンおよび100BSストレプトアビジンビーズの第一級アミン（R-NH2）は、NHS-ビオチン、NHS-LC-ビオチン、NHS-LG-LC-ビオチン、NHS-などのアミン反応性ビオチン標識試薬を使用してビオチンに共有結合させることができます。chromaiink-ビオチン、NHS-PECU-ビオチン、およびNHS-（PEO） n-ビオチン、TFP-（PEO） n-ビオチン（アミン反応性手段）および結合を軽減するためにモル過剰の遊離ビオチンでビオチン結合を実行することによってストレプトアビジンビオチン結合部位によるビオチン標識試薬の捕捉、一実施形態では、ストレプトアビジンは、mlcroparticuiateに共有結合している 結合表面、微粒子結合表面は、共有結合したストレプトアビジンのみが残るように調整（ブロックおよびストリッピング）され、ストレプトアビジン結合微粒子結合表面は、モル過剰の遊離ビオチン（D-ビオチン）に曝露されて100BSストレプトアビジンを調製します-ビーズ、モル過剰の遊離ビオチンを100BSストレプトアビジン-PBSpH 7.4などのビーズ保存溶液に添加し、100BSストレプトアビジンの第一級アミンをNHS-PEO 4-ビオチンに結合させて、ビオチン化100BSストレプトアビジン-ビーズを調製します。ストレプトアビジン結合ビーズのビオチン化は、磁性粒子（またはその上のストレプトアビジン）へのビオチンの共有結合を指し、ストレプトアビジンのビオチン結合部位の飽和と混同または同一視されるべきではありません。ビオチン化ストレプトアビジンビーズは、（抗ストレプトアビジン物質に加えて）抗ビオチン物質に結合することができます。ストレプトアビジンを飽和させるために使用されるビオチンは、ビオチン分子の必要な部分がストレプトアビジンと結合しているため、一般に最も問題のある抗ビオチン物質に結合しません。別の実施形態では、１００ＢＳストレプタビジンまたは１００ＢＳストレプタビジンビーズは、スクシンイミジルなどの当技術分野で知られている標準的なチオ化化学を使用して、ストレプトアビジン第一級アミン（Ｒ－ＮＨ２）のチオ化を介してストレプトアビジンに導入されたチオール基（スルフヒドリル基、またはＲ－ＳＨ）を有する。トランス-4-（マイエイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシエート（SMCC）、スクシンイミジル3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）、SPDP-PEG（4、6、8、12、24、または36） -NHSエステル、SPDP NHSエステル、SPDP-C6-NHSエステル、SPDP-C6-スルホ-NHSエステル、PCSPDP-NHSカーボネートエステル、およびSPDP-C8-Gly-Leu-NHSエステル（チオイエーションの意味）。 SPDPを使用する場合、ストレプトアビジンに結合したSPDPはTCEPとEDTAを使用して切断され、SPDP脱離基は洗浄、脱塩、または透析されて、SH-R結合100BSストレプトアビジンのみが残ります。100BSチオール化を準備した後 ビオチンがモル過剰のストレプトアビジン、100BSストレプトアビジンおよび100BSストレプトアビジンビーズのチオール（R-SH）は、マレイミド-PEG（ 2、3、6）などのチオール反応性またはスルフヒドリル反応性ビオチン標識試薬を使用してビオチンに共有結合させることができます、または11） -ビオチンおよびビオチン-SPDP（チオールまたはスルフヒドリル反応性手段）。スルフヒドリル反応性ビオチン標識は、EDTA（最大2mM）、TCEP（<1 mM）、およびモル過剰の遊離ビオチンを含むPBS pH 6.8バッファーで実行され、チオールを還元してジスルフィド結合または架橋を軽減します。2）ストレプトアビジンビオチン結合部位によるビオチン標識試薬の結合と捕捉を軽減する。マレイミド基は、 pH 6.5～7.5のアミンよりも遊離スルフヒドリルに対して1000倍反応性が高く、pH>8.5のマレイミド基は第一級アミンに有利であるため、第一級アミンに対する反応を最小限に抑えるために、マレイミド抱合はpH6.8で実行されます。 SPDPの代替として、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）に基づく類似の試薬を使用できます。
【0064】
別の実施形態では、１００ＢＳストレプタビジンまたは１００ＢＳストレプタビジンビーズは、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメヒ）シクロヘキサン－１などの当技術分野で知られている標準的なエステル－マレイミドヘテロ二官能性交差インク化学を使用して、ストレプタビジン第一級アミン（Ｒ－ＮＨ２ ）に導入されたマレイミド基を有する。 -カルボキシレート（SMCC）、マレイミド-PEG-NHSエステル、マイエイミド-PEO（1、2、3、4、5、e、8または12） -N HSエステル、またはマレイミド-PEG （1、2、3 、4、5、または6） -PFP（マレイミド化の意味）。モル過剰のD-ビオチンを含む100BSマレイミドストレプトアビジンを調製した後、100BSストレプトアビジンおよび100BSストレプトアビジンビーズのマレイミドを、ビオチン-PEG-SHまたはビオチン-PEG-チオールなどのマレイミド反応性ビオチン標識試薬を使用してビオチンに共有結合させることができます、ここで、PEGnまたはPEOnは、n = 1、2、3、4、5、6、8、または12などの異なる長さにすることができます。マレイミド反応性ビオチン標識は、EDTA（最大2mM）を含むPBS pH6.8バッファーで実行されます。 ）、TCEP（<1 mM）、およびモル過剰の遊離ビオチンは、1）チオールを還元し、ビオチン標識試薬のジスルフィド結合または架橋を軽減し、2）ビオチン標識試薬の結合と捕捉を軽減します。ストレプトアビジンビオチン結合部位。マレイミド基は、pH 6.5～7.5のアミンよりも遊離スルフヒドリルに対して1000倍反応性が高く、pH> 8.5のマレイミド基は第一級アミンに有利であるため、マレイミドビオチン結合はpH6.8で実行されます。
【0065】
同様のエステル、チオール、またはマレイミドの化学的性質は、ストレプトアビジンがビオチンで飽和されていない実施形態にも適用可能である。例えば、ルテニウムエステルはストレプトアビジンの第一級アミンと反応させることができます。
【0066】
特定の実施形態では、1）ストレプトアビジンは微粒子結合表面に共有結合している。2）微粒子結合表面は、微粒子結合表面に共有結合しているストレプトアビジンのみが残り、表面の非特異的結合が非常に低いように調整されている。3）ストレプトアビジン結合微粒子結合表面
100BSストレプトアビジンビーズを調製するためにモル過剰の遊離ビオチン（D-ビオチン）に曝露されます。4）100BSストレプトアビジンビーズは、モル過剰の遊離ビオチンの存在下でビオチン標識試薬を使用してビオチンに共有結合されます5）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズをろ過、遠心分離、または磁気分離してバッファーと過剰なビオチンを除去します。6）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを50°Cウェーハの複数サイクルで洗浄し、保存溶液に再懸濁して完成した試薬に到達します。。
100BSストレプトアビジンビーズを調製するためにモル過剰の遊離ビオチン（D-ビオチン）に曝露されます。4）100BSストレプトアビジンビーズは、モル過剰の遊離ビオチンの存在下でビオチン標識試薬を使用してビオチンに共有結合されます5）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズをろ過、遠心分離、または磁気分離してバッファーと過剰なビオチンを除去します。6）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを50°Cウェーハの複数サイクルで洗浄し、保存溶液に再懸濁して完成した試薬に到達します。。
【0067】
特定の実施形態では、1）ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを濾過、遠心分離、または磁気的に分離して貯蔵溶液を除去する、2）抗ストレプトアビジン干渉、抗ビオチン干渉、または両方の干渉を含むサンプルをビオチン化100BSに加えるストレプトアビジン-サンプルを前処理するためのビーズ、7）サンプル干渉が枯渇するか、アッセイブロッキングしきい値（ABT）またはテスト干渉しきい値を下回ります。8）ビオチン化100BSストレプトアビジン-ビーズがろ過、遠心分離、またはサンプルから磁気的に分離されます。9）本質的にビーズを含まないサンプル上清を吸引し、診断テストでテストして、正確なテスト結果を報告します。
【0068】
特定の実施形態では、１００ＢＳストレプトアビジンビーズを使用して、サンプルを前処理して、抗ストレプトアビジン干渉を結合し、診断試験の前に、アッセイ遮断閾値（ＡＢＴ）未満または試験干渉閾値未満で抗ストレプトアビジン干渉を枯渇させる。別の実施形態では、ビオチン化１００ＢＳストレプトアビジンビーズを使用して、サンプルを前処理して抗ビオチン干渉を結合し、診断試験の前に、アッセイブロッキング閾値（ＡＢＴ）未満または試験干渉閾値未満で抗ビオチン干渉を枯渇させる。別の実施形態では、ビオチン化１００ＢＳストレプトアビジンビーズを使用して、サンプルを前処理して、同じサンプルからの抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチン干渉の両方を同時に結合し、診断の前に、アッセイブロッキング閾値（ＡＢＴ）または試験干渉閾値未満で両方の干渉を枯渇させる。テスト。
【0069】
特定の実施形態では、ストレプトアビジン-ビーズ（ビーズ1）、100BSストレプトアビジン-ビーズ（ビーズ2）、およびビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ（ビーズ3）を体系的または順次に使用して、サンプルに存在する1つまたは複数の干渉メカニズムを検出および決定できます。干渉が疑われるサンプルは、きちんとテストされ（ビーズは追加されていません）、コントロールの結果です。サンプルの3つの異なるアリコートを、それぞれビーズ1（アリコート1）、ビーズ2（アリコート2）、およびビーズ3（アリコート3）で処理します。前処理された3つのアリコートが再テストされ、各ビーズタイプのテスト結果がコントロールテスト結果と比較されます（表1）。コントロールのテスト結果がビーズ1、2、および3の前処理のテスト結果と類似している場合、サンプルの干渉は起こりそうになく、除外することができます。ただし、Bead1の前処理結果が対照結果と大幅に異なる場合は、ビオチン干渉および/または抗ストレプトアビジン干渉の可能性が高く、サンプル干渉を除外できます。ビーズ2の前処理結果が対照結果と大幅に異なる場合は、抗ストレプトアビジン干渉の可能性が高く、サンプル干渉を除外できます。ビーズ3の前処理結果が対照結果と大幅に異なる場合は、抗ストレプトアビジン干渉および/または抗ビオチン干渉の可能性が高く、サンプル干渉を除外できます。ビーズ1の前処理結果がコントロールの結果と大幅に異なるが、ビーズ2とビーズ3の前処理の結果がコントロールと類似している場合は、ビオチンの干渉を除外できます。ビーズ1およびビーズ2の前処理の結果が対照の結果と類似しているが、ビーズ3の結果が対照の結果と大幅に異なる場合は、抗ビオチン干渉を除外できます。ビーズ1、ビーズ2、およびビーズ3の前処理結果がすべて対照結果と大幅に異なる場合は、抗ストレプトアビジン干渉を除外できます。
【表1】
【0070】
遊離（または可溶性）ビオチン飽和ストレプトアビジン（クエンチされたスフレプアビジン; QSAv ）の生成は、ビオチン飽和ストレプトアビジン結合ビーズの生成とほぼ同じです。さらに、ストレプトアビジンを追加の部分に結合させて、捕捉部分として機能させるか、ストレプトアビジンの凝集を促進する可能性のある部位をブロックすることができます。このようなコンジュゲーションは、クエンチの前または後に実行できます（追加のキャプチャ部分がビオチンである場合を除きます。この場合、クエンチ後にのみ実行できます）。ビオチンとストレプトアビジンのモル比は、ビーズの最小飽和手順で使用される5：1の比よりも、約7～8とやや高くなっています。これは、ビーズ結合ストレプトアビジンのビオチン結合部位の一部が立体的に妨害されるため、有効比率が正式な比率よりもいくらか高くなるためです。
【0071】
ＱＳＡｖは、好ましくは、主にモノマーである。様々な実施形態において、ＱＳＡｖは、少なくとも８０、９０、９５、９７、９８、９９％の単量体、またはそれらの値によって制限される任意の範囲である。試薬が単量体であり、凝集体を形成しないことを保証するために、ストレプトアビジンを界面活性剤または高分子ブロッキング試薬でブロッキングすることができます。ブロッキングにはPEG化が含まれる可能性があります。さまざまなeommercially-availabieがあります ThermoFisherScientific、 Broadpharm 、Quanta Biodesign 、CreativePegworksなどのさまざまなサイズと化学修飾のPEG化試薬。一例として、NHS-エステル-PEG（4）-OHがあります。他の例には、TFP-（PEO ）n -OHまたはTFP-（PEG）n-OH（Quanta Biodesign ）が含まれます。これらは、NHS-エステル化学を介してストレプトアビジン上の露出したリジン残基に共有結合することができます。あるいは、TFP-（PEG）n -CQOHまたはNHS-（PEG）n-COOHは、EDC化学によってリジン残基に結合することができます。他の多くの選択肢は、当業者によく知られているであろう。単量体QSAvの調製は、尿素、イミダゾール、トレハロースなどのコスモトロピック試薬を含むバッファー内でビオチンをクエンチすることによっても達成できます。
【実施例】
【0072】
以下の非限定的な例は、現在企図されている代表的な実施形態のより完全な理解を容易にするためにのみ、例示の目的で提供されている。これらの例は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかを限定するものと解釈されるべきではない。
例1
ビオチン化ストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子またはビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを調製する方法。
【0073】
550-600 nmの磁性カルボン酸ナノ粒子をEDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）化学を使用してストレプトアビジンに共有結合させ、ビーズ表面をストリッピング試薬（塩、洗剤、低および高pH）で調整して除去しました受動的に吸収されたストレプトアビジン、および非特異的結合を減少させ、ナノ粒子の単分散とコロイド安定性を促進するために、洗剤と高分子ブロッキング試薬を使用してビーズをブロックしました。ビーズに共有結合したストレプトアビジンの総濃度は、修正マイクロBCA総タンパク質アッセイを使用して1ミリグラムあたり17.69マイクログラム（μg/mg）であると決定されました。最終的なビーズ濃度は重量測定で決定され、PBS、2 mM EDTA、pH 6.8で1ミリリットルあたり10.0ミリグラムのビーズ（mg/ mL）に調整されました。
【0074】
PBS、pH7.4中のD-ビオチンの10.0mg/ mLストック溶液（Sigma、部品番号B4601-100MG、ロットSLBS8478、MW 244.31）は、DMSO中のD-ビオチンの100 mg /mL濃縮ストック溶液を作成することによって調製しました。 （ベイカー、部品番号9224-01、ロット0000217025）、または10 mgのD-ビオチンを100μLのDMSOに添加し、混合しました。D-ビオチンがDMSOに完全かつ均一に溶解したら、 900μLのPBS、pH 7.4を添加および混合して、10.0 mg / mLのD-ビオチンの1.0mL90:10（PBS：DMSO）ストック溶液を調製しました。
【0075】
合計2.5mLのストレプトアビジン磁性ナノ粒子を分注し、合計442.25μgのストレプトアビジンに対応する反応バイアルに分注しました：[（25mgビーズ）x（17.69μgストレプトアビジン/ mgビーズ）]。合計442.25μgのストレプトアビジンは0.00804mMのストレプトアビジンに対応します：[（442.25μgのストレプトアビジン）/（55,000μgのストレプトアビジン/μMのストレプトアビジン）。
【0076】
ストレプトアビジン総モル数の1000倍モル過剰のD-ビオチンは、17.69μgストレプトアビジン/ mgビーズの25mgストレプトアビジン結合磁性粒子または442.25μgストレプトアビジンに1,964.475μgD-ビオチンを添加することによって調製されました：[（0.00804μMx1000）x（244.31μgビオチン/μM）]。 1000倍モル過剰のD-ビオチンを0.00804μmolストレプトアビジンに加えるために、200μLの10.0mg / mL D-ビオチンストック溶液、または2,000μgのD-ビオチンを25mgのストレプトアビジン磁性ナノ粒子に17.69μgで加えました。 PBS、2mM EDTA、pH6.8中のストレプトアビジン/ mgビーズ。ストレプトアビジン磁性ナノ粒子をD-ビオチンと室温で1時間混合しながらインキュベートし、ストレプトアビジンビオチン結合部位をビオチンで100％飽和させ、100BSストレプトアビジンビーズを調製しました。
【0077】
100BSストレプトアビジンビーズを1モル過剰のD-ビオチンでビオチンに共有結合させるには、100倍モル過剰のNHS-PEG4-ビオチン（ Broadpharm 、部品番号20566、ロットB93-039、MW 588,7）、または500μgのNHS-PEG4-ビオチンを25mgのストレプトアビジン結合磁性粒子に17.69μgのストレプトアビジン/mgビーズで添加したか、442.25μgのストレプトアビジンまたは0.00804μMのストレプトアビジンを添加しました。そして混合して、DMSO中のNHS-PEG4-ビオチンの50.0mg/ mLストック溶液を調製しました。 100フォイドモル過剰のNHS- PEGa-ビオチン、または473.315μgNHS- PEG4-ビオチン[（0,804μMNHS-PEG4-ビオチン）x100）x（588.7μgビオチン/μM）]を100BSストレプトアビジン-に添加しました。DMSO中のNHS-PEG4-ビオチンの50.0mg / mLストック溶液10.0μLを100BSストレプトアビジンビーズ25mgに添加することによるビーズ飽和ステップからの過剰なD-ビオチンを室温で1時間混合しました。ビオチン化された100BSストレプトアビジンビーズをPBS、pH7.4で4回洗浄して、過剰なNHS- PEG4-ビオチンを洗い流しました。
【0078】
100BSストレプトアビジンビーズが異なるビーズ上の結合ビオチンのストレプトアビジン媒介結合（すなわち、ビーズの架橋）からのビーズ凝集なしにビオチンにうまく結合したことを確認するために、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズをAntonを使用した粒子サイズ測定によって分析しましたパールLitesizer500アナライザー。平均サイズ分布は883.9nmでした（図1）。
【0079】
ビオチンが100BSストレプトアビジンビーズ上のストレプトアビジンにうまく結合したことを示すために、制限量の天然ストレプトアビジンをビオチン化100BSストレプトアビジンビーズに添加して、ストレプトアビジンを介したビーズの架橋によるビーズの凝集を促進しました。合計50μgのストレプトアビジンを25mgのビオチン化100BSストレプトアビジンビーズに添加し、室温で4時間インキュベートしました。ビーズは、ストレプトアビジン添加の30分後に凝集を示し、1,441.3nmと6,641nmにピークがあり、多分散度指数は173.3％（図2A）、1,512.6nmと14,536nmにピークがあり、多分散度指数は242.8％でした（図2B）。
【0080】
ストレプトアビジンと同様の親和性で結合ビオチンを認識するが、ストレプトアビジンよりも100万倍低い親和性で遊離ビオチンを認識する抗ビオチン結合モノクローナル抗体、またはビオチン結合体のビオチンに特異的に結合する抗体を使用して、同様のビーズ凝集を行った。遊離ビオチンよりもビオチンコンジュゲートのビオチンに対して高い親和性を示します（WO2020/ 028776; VeraBindBiotin TM、 Veravas ）。抗体をビオチン化100BSストレプトアビジンビーズに添加し、室温で一晩インキュベートしました。ビーズは、2,148nmのピークと316.2％の多分散度指数で凝集を示しました（図3）。
例2
ビオチン化ストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子、またはビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを使用して、サンプルから抗ビオチン抗体を枯渇させる方法。
例2
ビオチン化ストレプトアビジン被覆磁性ナノ粒子、またはビオチン化100BSストレプトアビジンビーズを使用して、サンプルから抗ビオチン抗体を枯渇させる方法。
【0081】
100％ビオチン飽和ストレプトアビジン結合磁性ナノ粒子または100BSストレプトアビジンビーズのビオチン化の成功を実証するために、結合ビオチンに特異的なモノクローナル抗ビオチン抗体を含む凍結乾燥マウス腹水をメロンゲル精製キット（ThermoFisher 、部品番号45214）を使用して精製しました。コンディショニングバッファー（ ThermoFisher 、部品番号45219、ロットTB283120）をアサイト化し、Zeba Spin Desalting Columns、40K MWCO（ ThermoFisher 、部品番号87770）を使用してPBS pH7.2で脱塩します。抗ビオチン抗体の最終濃度は0.205mg/ mLで、ガラスHPLVバイアル中の950μLのPBS、pH 7.4に50μLの抗ビオチン抗体または10.25μgの抗ビオチン抗体を添加して、 10.25μg/ mLの抗ビオチンストック溶液。 100μL、50μL、25μL、および10μLの抗ビオチンストック溶液を、 Phenomenex s4000 SECHPLCカラム、流速1.0 mL / min、移動相PBS pH 7.4に順次注入し、ピーク面積を測定しました。ピーク面積（Y軸）対抗体濃度（X軸）の検量線を生成するために注入された抗体の各濃度：y= 8.6466x + 21.4286、R 2 = 1.0000（図4A）。
【0082】
次に、0.255mg / mLの抗ビオチン抗体750μLを、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズで次のように前処理しました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスします。
2.チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまで、空の2mL SarstedtMicroチューブをVeraMag400 TM磁気分離器に入れます。
3.よく混合した試薬750μLまたは7.5mgビーズを10.0mg/ mLで2mL SarstedtMicroチューブに分注します。
4.少なくとも30秒待って、磁性ナノ粒子のペレットを乱さずに、上澄みを注意深く吸引して廃棄します。
5.よく混合した抗ビオチン抗体750μLを0.205mg/ mLで分注します。
6.チューブに蓋をして、中速で最低10秒間サンプルをボルテックスします。
7.チューブを中速で回転ミキサーに置き、RTで30分間インキュベートします。
8.スクリューキャップを緩め、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをVeraMag400に配置します。
9.ナノ粒子をサンプルから5分間磁気的に分離させます。
10.磁性ナノ粒子のペレットを乱さずにサンプルを注意深く吸引し、きれいなチューブに分注します。このステップを注意深く実行すれば、すべてのサンプルを吸引できます。注：磁性ナノ粒子のいずれかが誤って吸引された場合は、混合物をチューブに戻し、チューブに蓋をして、ステップ9に戻ります。
11.これで、調整されたサンプルを分析する準備が整いました。
12.0.2ミクロンの酢酸セルロースシリンジフィルターを使用してサンプルをろ過します。このフィルターを使用した平均タンパク質損失は16.5μgでした。
のサンプルをPhenomenexs4Q00SEC HPLCカラム、流速1.0 mL / min、移動相（50 mMリン酸カリウム、250 mM塩化カリウム、pH 6.8）に注入し、保持時間でのピーク面積を決定します。～9.6～9.9分。
14.検量線の式に基づいて、抗体ピークのピーク面積（y）を使用してx（μg/mL抗体）を解きます。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスします。
2.チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまで、空の2mL SarstedtMicroチューブをVeraMag400 TM磁気分離器に入れます。
3.よく混合した試薬750μLまたは7.5mgビーズを10.0mg/ mLで2mL SarstedtMicroチューブに分注します。
4.少なくとも30秒待って、磁性ナノ粒子のペレットを乱さずに、上澄みを注意深く吸引して廃棄します。
5.よく混合した抗ビオチン抗体750μLを0.205mg/ mLで分注します。
6.チューブに蓋をして、中速で最低10秒間サンプルをボルテックスします。
7.チューブを中速で回転ミキサーに置き、RTで30分間インキュベートします。
8.スクリューキャップを緩め、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをVeraMag400に配置します。
9.ナノ粒子をサンプルから5分間磁気的に分離させます。
10.磁性ナノ粒子のペレットを乱さずにサンプルを注意深く吸引し、きれいなチューブに分注します。このステップを注意深く実行すれば、すべてのサンプルを吸引できます。注：磁性ナノ粒子のいずれかが誤って吸引された場合は、混合物をチューブに戻し、チューブに蓋をして、ステップ9に戻ります。
11.これで、調整されたサンプルを分析する準備が整いました。
12.0.2ミクロンの酢酸セルロースシリンジフィルターを使用してサンプルをろ過します。このフィルターを使用した平均タンパク質損失は16.5μgでした。
のサンプルをPhenomenexs4Q00SEC HPLCカラム、流速1.0 mL / min、移動相（50 mMリン酸カリウム、250 mM塩化カリウム、pH 6.8）に注入し、保持時間でのピーク面積を決定します。～9.6～9.9分。
14.検量線の式に基づいて、抗体ピークのピーク面積（y）を使用してx（μg/mL抗体）を解きます。
【0083】
100μLの抗ビオチンAbサンプルのピーク面積は1,384であり（図4B）、このピーク面積が検量線上で対応する濃度は205μg/ mLです（図4A）。前処理および枯渇した抗ビオチンサンプルの100μLのピーク面積は318であり（図4C）、このピーク面積が検量線上で対応する濃度は44.62μg/ mLでした（図4A）。枯渇試薬で前処理した抗体の開始容量は750μLであったため、これは33.465μgの抗体に相当します：[44.62μg/ mLx0.750 mL]、16.5μgの抗体が0.2ミクロンの酢酸セルロースシリンジフィルターに失われたため、サンピー前処理後の残りの抗体の合計は49.965μg抗体でした：[33.465μg+16.5μg]。前処理した抗ビオチン抗体の開始量は153,75μg抗体でした：[205μg/mLx 0.750 mL]、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズによって捕捉および枯渇した抗ビオチン抗体の割合は67.5％でした：[（ （153.75μg-49.965μg）/153.75μg）x100％]。
【0084】
この研究は、ビオチン化された100BSストレプトアビジンビーズが103.785μgの抗体を枯渇させることができることを示しました：（153.75μg-49.965μg）。これは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ1mgあたり13.838μgの抗ビオチン抗体の結合能力に相当します：[（103.785μg抗体）/（7.5mgビーズ）]。
例3
低モル過剰のビオチンを使用したビオチン化100BSストレプタブスジンビーズの調製。
例3
低モル過剰のビオチンを使用したビオチン化100BSストレプタブスジンビーズの調製。
【0085】
、ビオチンとストレプトアビジンまたはビーズとの非特異的会合を引き起こす可能性があります。特に関連するビオチンは、100BSストレプトアビジンビーズから浸出または解離する可能性があり、アッセイでビオチン干渉を引き起こす可能性があります。この非特異的ビオチン結合を除去または軽減するためのいくつかのアプローチが調査されました。これには、磁性ナノ粒子に結合する前のストレプトアビジンの飽和、飽和後のさまざまな洗浄手順が含まれます。低モル過剰のビオチンの使用;およびさまざまなビオチンリンカーモル過剰。最終的に、低モル過剰のビオチンと特定の洗浄条件の組み合わせにより、遊離ビオチン浸出の問題のない製品が生成されました。
【0086】
ストレプトアビジンを磁性ナノ粒子に結合させた後、ビオチン化の前に、ストレプトアビジンビーズを5倍モル過剰の遊離ビオチン（つまり、5：1のモル比のビオチンストレプトアビジンまたは5：4の比のビオチン：ビオチン）に曝露しました。結合部位）。次に、飽和ビーズを超音波処理しながら50℃の水で洗浄した。（ビオチンとビーズの結合部位の有効な比率は、ストレプトアビジンのビーズへの結合がいくつかのビオチン結合部位の立体障害につながるため、いくらか高くなります。
【0087】
ビオチン化は、4、25、および50倍モル過剰のビオチン化試薬（ビオチン-PEG4-NHSリンカー）を使用して実行されました。50フォイドのモル過剰が最適な結果をもたらすことがわかった。
【0088】
れ、次のプロトコルに従って血清サンプルを前処理するために使用されたときにビーズ自体が干渉を引き起こさなかったことを実証しました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.694）をVeraMagTMマグネット（ Veravas ）に、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまで挿入します。
4.200μLのよく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに分注し、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200μL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンピー/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.694）をVeraMagTMマグネット（ Veravas ）に、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまで挿入します。
4.200μLのよく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに分注し、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200μL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンピー/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
【0089】
次に、前処理したサンプルを、サンドイッチイムノアッセイの例としてRoche Elecsys TSHアッセイで使用し、競合イムノアッセイの例としてRoche Elecsys FT4アッセイで使用しました（表2を参照）。両方のアッセイでテストされたすべてのサンプルについて、処理済みと未処理の結果に分析的または臨床的な有意差はありませんでした。
例4
検証ロットの準備
【表2】
検証ロットの準備
【0090】
３ロットのビーズは、本質的に実施例３に記載されるように、すなわち、飽和のためのビオチン対ストレプトアビジンの５：１のモル比、５０倍モル過剰のビオチン－ＰＥＧ４ － ＮＨＳリンカー、および５０℃で調製された。ストレプトアビジンのさまざまなソースを使用して、超音波処理で洗浄します。 1つのロットFSAvは、新鮮なストレプトアビジンを使用しました。 1つのロットRSAvは、以前のビーズコーティング反応から再生されたストレプトアビジンを使用しました。1つのロットMSAvは、80％の再生ストレプトアビジンと20％の新鮮なストレプトアビジンの混合物を使用しました。 3つのロットのストレプトアビジン含有量は、ロットFSAvでは35μg/mgビーズ、RSAvでは30μg/ mgビーズ、 MSAvでは19μg / mgビーズでした。次に、3つのロットを、以下の例5～8で説明する検証研究で使用しました。
【0091】
ナノ粒子への結合は、過剰のストレプトアビジンを使用します。未消費の試薬を廃棄するのではなく、ろ過、脱塩、濃縮することで回収できます。このような再生ストレプトアビジンは、安定性や性能に影響を与えることなく、機能する製品に組み込むことができます。
例5
製造中の凝集の指標としての粒子サイズ
例5
製造中の凝集の指標としての粒子サイズ
【0092】
初期の品質管理として、完成したビーズは、製造中に凝集をチェックするようにサイズ設定されました。 5uLのビーズを使い捨てキュベットで1mLのdiH2Oと混合し、AntonPaarで読み取りました。 短時間のボルテックス（5～10秒）、混合（ミキサーで10分）、および30～60秒の超音波処理（使用する場合）後のLitesizerTM100粒子サイズアナライザー。 3つのロットのいずれも、超音波処理前または超音波処理後の生産からの凝集を示していません（表3および4）。平均して、凝集体の多分散度はモノマーの多分散度よりも大きくなります。
例8
ビオチン浸出のテスト
【表3】
【表4】
ビオチン浸出のテスト
【0093】
pg / ml未満のビオチン濃度で血清に懸濁しました。400μLの血清を0.5mgのビーズ（200μL-2.5mg/ mL）で、RTのミキサーで10分間処理し、次のプロトコルに従って磁気的に分離しました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットMSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.894）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.よく混合した試薬（ビーズ）200μLを空のチューブに分注して分離します
試薬ペレットを形成するために、磁石上で30秒以上試薬を使用します。
5.試薬ペレットを乱さずに、ストレージバッファーの上清（約200mL）を注意深く吸引し、廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットMSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.894）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.よく混合した試薬（ビーズ）200μLを空のチューブに分注して分離します
試薬ペレットを形成するために、磁石上で30秒以上試薬を使用します。
5.試薬ペレットを乱さずに、ストレージバッファーの上清（約200mL）を注意深く吸引し、廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
【0094】
処理された血清は、IDKBIOTIN ELISAアッセイ（ ImmundiagnostikAG ）でテストされました。 IDKビオチンELISAは競合イムノアッセイです。サンプル中のビオチンは、生成されるシグナルを低減します。ビオチンの濃度は、検量線との比較によって決定されます。テストした3つのロットのそれぞれで検量線を作成しました。すべての場合において、ビオチンは1200pg / ml未満のレベルで検出され、ビーズからのビオチンの浸出は、標準的なイムノアッセイで異好性干渉を引き起こさないレベルであったことを示しています（表5）。
例7
HPLC枯渇アッセイ
【表5】
HPLC枯渇アッセイ
【0095】
3ロットのビオチン飽和および結合ストレプトアビジンコーティングビーズを枯渇アッセイで使用して、抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチン干渉を特異的に除去する能力にアクセスしましたが、他の干渉は除去しませんでした。この目的のために、一連の4つのHPLC枯渇研究が実行されました。
SAvおよび抗Bt抗体のみに対する産物の特異性を測定するために、ビオチンに結合したアフィニティー精製ヤギIgGおよびアフィニティー精製ヤギIgGを使用したHPLC枯渇アッセイ。
2）試薬の結合能力を定量化するための抗ストレプトアビジン抗体を使用したHPLC枯渇アッセイ。
3）試薬の結合能を定量化するために、抗ビオチン抗体を使用したHPLC枯渇アッセイを実施します。
4）試薬の多重化能力と特異性を実証するためのA）抗ビオチン抗体と抗ストレプトアビジン抗体、およびB）抗ストレプトアビジン抗体とアフィニティー精製ヤギIgGの混合物を使用したHPLC枯渇アッセイ。
SAvおよび抗Bt抗体のみに対する産物の特異性を測定するために、ビオチンに結合したアフィニティー精製ヤギIgGおよびアフィニティー精製ヤギIgGを使用したHPLC枯渇アッセイ。
2）試薬の結合能力を定量化するための抗ストレプトアビジン抗体を使用したHPLC枯渇アッセイ。
3）試薬の結合能を定量化するために、抗ビオチン抗体を使用したHPLC枯渇アッセイを実施します。
4）試薬の多重化能力と特異性を実証するためのA）抗ビオチン抗体と抗ストレプトアビジン抗体、およびB）抗ストレプトアビジン抗体とアフィニティー精製ヤギIgGの混合物を使用したHPLC枯渇アッセイ。
【0096】
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH 7.4中の、さまざまな抗体（Ab）および抗体-ビオチン（Ab- Bt ）コンジュゲートの濃度を測定しました。各サンプルについて、200μlのビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズ懸濁液（2.5mg / ml）をチューブに分注し、磁気的に分離し、保存バッファーを除去しました。 400μlの各AbまたはAb - Btコンジュゲートをビーズを含むチューブに加え、ボルテックスし、ミキサーで10分間インキュベートしました。ビーズを再び磁気的に分離し、処理したサンプルの上清を抜き取り、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析用のHPLCチューブ用のマイクロチューブインサートにロードしました。前処理の詳細なプロトコルは次のとおりです。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットMSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.894）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.200μLのよく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに分注し、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200mL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.試薬ペレットが入っているチューブに400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットMSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.894）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.200μLのよく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに分注し、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200mL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.試薬ペレットが入っているチューブに400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
【0097】
未処理の抗体も、コントロールとしてSECで実行されました。 SECバッファーは、50 mMリン酸カリウム、250 mM塩化カリウム、pH 8、8で、5μg/100μlの注入を使用して、G4000カラム7.8mm x 30cmに1ml / minで20分間ポンプで送液しました。 220nmおよび280nmでの吸光度をモニターし、A280をピーク分析に使用しました。結果を表6に示します。
表6.枯渇とビーズ容量の定量
α- 「は「反」を象徴します。「AP」は「アフィニティー精製抗体」を表し、「 Bt 」は「ビオチン化抗体」を表します）
表6.枯渇とビーズ容量の定量
α- 「は「反」を象徴します。「AP」は「アフィニティー精製抗体」を表し、「 Bt 」は「ビオチン化抗体」を表します）
【表6-1】
【表6-2】
【0098】
ビーズは特に抗ビオチンまたは抗ストレプトアビジンではない抗体に対して中性であることが意図されているため、アフィニティー精製されたヤギIgGをコントロールとして実行してバックグラウンドの枯渇を確立しました。 3つのロットはすべて、このコントロールの結合が最小限またはまったくないことを示しています（処理後も抗体の92.56％～96.78％が存在します。図5Aは、MSAvロットでの結果を示しています）。
【0099】
ビオチンに結合したアフィニティー精製ヤギIgGは、バックグラウンドの枯渇を確立するためのさらなるコントロールとして実行されました。これも、ビーズは、ビオチン化されている場合でも、特に抗ビオチンまたは抗ストレプトアビジンではない抗体に対して中性であることが意図されているためです。3つのロットはすべて、このコントロールの結合が最小限またはまったくないことを示しています（処理後に98.91％～100％の抗体が存在します。図5Bは、MSAvロットでの結果を示しています）。
【0100】
3つのロットはすべて、抗ビオチン抗体のビーズ1mgあたり10μgを超える枯渇を示しています（12、34.4、および21μg/ mgの枯渇。表6を参照。図5Cは、 MSAvロットでの結果を示しています）。3つのロットすべてが、抗SAv抗体のビーズ1 mgあたり20μgを超える枯渇を示しています（31、33.5、および27.6μg/ mgの枯渇。表6を参照）。MSAvロット）。
抗ストレプトアビジン抗体と抗ビオチン抗体の混合物を、 MSAvロットのビーズを使用してテストし、ビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズの多重化能力を実証しました。また、試薬による結合の特異性を実証するために、抗ストレプトアビジン抗体とAPヤギIgG抗体の混合物をテストしました。データは、ビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズがタンデムに存在する場合（存在する23.4μgのうち19.1μgが枯渇）、抗ストレプトアビジン抗体と抗ビオチン抗体の両方を枯渇させ、製品が抗ストレプトアビジンのみを特異的に除去することを示していますAPヤギIgGと混合した場合の抗体（存在する23.8μgのうち10.9μgが枯渇）。以前のデータはAPヤギIgGの個別の結合を示さなかったため（治療後もAbの97％がまだ存在）、混合物の約半分（46％）の枯渇は、抗ストレプトアビジンAbのみが枯渇したことを示していると安全に推測できます。
例8
分析物の検出に対する処理の影響
抗ストレプトアビジン抗体と抗ビオチン抗体の混合物を、 MSAvロットのビーズを使用してテストし、ビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズの多重化能力を実証しました。また、試薬による結合の特異性を実証するために、抗ストレプトアビジン抗体とAPヤギIgG抗体の混合物をテストしました。データは、ビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズがタンデムに存在する場合（存在する23.4μgのうち19.1μgが枯渇）、抗ストレプトアビジン抗体と抗ビオチン抗体の両方を枯渇させ、製品が抗ストレプトアビジンのみを特異的に除去することを示していますAPヤギIgGと混合した場合の抗体（存在する23.8μgのうち10.9μgが枯渇）。以前のデータはAPヤギIgGの個別の結合を示さなかったため（治療後もAbの97％がまだ存在）、混合物の約半分（46％）の枯渇は、抗ストレプトアビジンAbのみが枯渇したことを示していると安全に推測できます。
例8
分析物の検出に対する処理の影響
【0101】
ビオチン飽和およびコンジュゲートストレプトアビジンコーティングビーズ（ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズ）の中性は、血清副甲状腺ホルモンの市販アッセイでテストされました。 DRG PTHインタクトELISA（DRGInternational、Inc。、部品番号EIA3645）は、ホルモンの異なる部分を認識する2つの異なるヤギ抗PTHポリクローナル抗体を使用したサンドイッチELISAアッセイです。抗体の1つはビオチン化されており、キャプチャーとして機能します
試薬ともう一方は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、検出試薬として機能します。
試薬ともう一方は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、検出試薬として機能します。
【0102】
2つの血清サンプル（QC1およびQC3）のそれぞれ400μlを0.5mgのビーズで処理しました
（ 2.5 mg/ mLで200ul ）、次のプロトコルに従って、磁気的に分離されたRTのミキサーで10分間：
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.694）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.200m■をディスペンスします。よく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに入れ、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200μL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
（ 2.5 mg/ mLで200ul ）、次のプロトコルに従って、磁気的に分離されたRTのミキサーで10分間：
1.ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズロットSAv、 FSAv 、またはRSAv試薬バイアルを保管場所から取り出し、中速で最低10秒間ボルテックスして十分に混合し、試薬を再懸濁します。
2.試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入します。
3.空のマイクロチューブ2ml（SARSTEDT注文番号72.694）を、チューブのカラーが磁石フレームに接触するまでVeraMag磁石に挿入します。
4.200m■をディスペンスします。よく混合された試薬（ビーズ）を空のチューブに入れ、磁石上で試薬を30秒以上分離して、試薬ペレットを形成します。
5.試薬ペレットを乱さずに、すべての保存バッファー上清（～200μL）を注意深く吸引して廃棄します。
6.400μLの十分に混合された血清または血漿サンプルを試薬ペレットを含むチューブに分注します。
7.チューブのスクリューキャップを締め、磁石からチューブを取り外し、中速で最低10秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬をサンプルに再懸濁します。
8.チューブを中速で実験用ミキサーに置き、室温で10分間インキュベートします。
9.スクリューキャップを緩めて取り外し、チューブのカラーがマグネットフレームに接触するまでチューブをマグネットに挿入します。
10.試薬を4分以上磁気的に分離して、試薬ペレットを形成します。
11.試薬ペレットを乱さずにサンプル上清を注意深く吸引し、テストのためにサンプルをトランスファーチューブに分注します。注：このステップを注意深く実行すると、すべてのサンプル上清（～400μL）を吸引できます。試薬のいずれかが誤って吸引された場合は、サンプル/試薬混合物をチューブに戻し、ステップ10に戻ります。
12.これで、サンプルをテストする準備が整いました。
【0103】
次に、処理された血清をDRGPTHELISAアッセイで試験した。 QC1は、100 pg / mL未満のビオチン（PTHアッセイの仕組みには影響しません）と約190pg / mLのPTHを含む社内QCサンプルです。 QC3は、約250,000pgビオチン/ mL（PTHアッセイのメカニズムに影響を与えます-アッセイはひどく低下した結果をもたらします）および約190pg / mLPTHを含む社内QCサンプルです。異なるロットのそれぞれで処理されたQC1血清は、PTH結果に有意な偏差を示さず（100.6、101.2、および106.1％の検出）、100BSストレプトアビジンビーズは遊離ビオチンに結合しないため、QC3サンプルはすべて予想どおりにひどく低下した結果をもたらします（表7） 。これらのデータは、100BSストレプトアビジンビーズビーズの中性を示しています。
表7.中性のPTHELISAデータ
表7.中性のPTHELISAデータ
【表7】
【0104】
抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体干渉物質を含むサンプルの処理後の分析物の検出が決定されました。これは、アフィニティー精製された抗ストレプトアビジンおよび抗ビオチンヤギ抗体を血清QC1にスパイクし、処理済みサンプルと未処理サンプルからの分析物検出結果を比較することによって達成されました。
【0105】
各血清サンプルの400μlアリコート（QC1、およびQC1に16.5μg/mLの抗ビオチン抗体を添加）を、3つのロットすべてから異なる量のビーズ（2.5 mg / mLで100～400 mI ）で10分間処理しました。 RTでミキサー上で数分間、磁気的に分離し、処理した血清をDRGPTHELISAアッセイでテストしました。 QC1は、100 pg / mL未満のビオチン（PTHアッセイの仕組みには影響しません）と約190 pg / mLのPTHを含む社内QCサンプルです。QC1にスパイクされた抗ビオチン抗体の濃度は、PTHアッセイの仕組みを妨害し、ひどく落ち込んだ結果を引き起こします。
【0106】
MSAvビーズは、すべての抗Bt抗体（抗BtA by）を正常に枯渇させ、200μlのサンプルあたり1 mgのビーズ（16.5μg/ mLの抗BtAbyコーン）で正しいPTH結果を復元することができました。FSAvとRSAvは、はるかに少ない量で同じ結果を達成することができました。FSAvの場合は0.25 mg、 RSAvの場合は0.375mgです。抗BtAbyを添加し、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズで処理しなかったQC1サンプルでは、予想どおり、対照の2.7％に過ぎない、ひどく落ち込んだ結果が得られました（表8および9）。MSAvロットの容量が少ないことは、例7（上記）で観察された結果と一致しています。
表8。 抗ビオチンAbを添加し、ロットMSAvのビーズで処理した血清中の分析物の検出
表9。 抗BtAbyを添加し、ロットFSAvおよびRSAvのビーズで処理した血清中の分析物の検出
表8。 抗ビオチンAbを添加し、ロットMSAvのビーズで処理した血清中の分析物の検出
【表8】
【表9】
【0107】
同様に、各血清サンプルの200μlアリコート（QC1、およびQC1に抗ストレプトアビジンAby（抗SAv Aby）を16.5μg/ mLにスパイク、または抗SAvAby /抗BtAbyマルチプレックス混合物を16.5μg/ mLにスパイク、各8.25μg/ mL）、2.5 mg / mLのビーズ100μlでRTのミキサーで10分間処理し、磁気的に分離し、処理した血清をDRGPTHELISAアッセイでテストしました。前述のように、QC1は、100 pg / mL未満のビオチン（PTHアッセイの仕組みには影響しません）と約190pg / mLのPTHを含む社内GCサンプルです。抗SAvAbyおよび抗BtAbyは、PTHアッセイのメカニズムを妨害し、結果を大幅に低下させます。
【0108】
使用した濃度（16.5μg/mL）では、予想通り、抗SAv Abyはひどく落ち込んだ結果を引き起こしました（ベースラインの29％）。マルチプレックス混合物も同様でした（ベースラインの21％）。ロットRSAvのビーズは、抗SAvAbyを正常に枯渇させ、サンプル200μlあたり0.25 mgのビーズでPTH検出を回復し始め、ベースライン値の最大82％の読み取り値をもたらし、このサンプル200μlあたり0.5mgに処理すると、値はベースラインの104％に戻りました。サンプル200μlあたり0.25mgのビーズを含むロットFSAvのビーズは、PTHレベルをベースラインの91％に戻しました。このサンプル200μlあたり0.375mgのロットMSAvのビーズは、PTH値をベースラインの92％に戻しました。すべてのロットで、0.5mgのビーズ（ RSAv -104％; FSAv -101％; MSAv 100％）で正しいPTH結果を正常に復元できました（表10）。
表10。 抗SAvAby、または抗SAvAbyと抗BtAbyを添加し、3つのロットすべてのビーズで処理した血清中の分析物の検出
表10。 抗SAvAby、または抗SAvAbyと抗BtAbyを添加し、3つのロットすべてのビーズで処理した血清中の分析物の検出
【表10-1】
【表10-2】
【0109】
MSAvを使用した上記のPTH検出実験の結果の要約を図8に示します。ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズは、干渉物を使用しない場合、またはビオチンが干渉物である場合は効果がありませんでしたが、抗ビオチンと抗ストレプトアビジン干渉物質、個別にまたは一緒に混合。
【0110】
具体的には、図8の「なし」とラベル付けされた左端のバーのグループでは、干渉物スパイクサンプルに干渉物が追加されていません。つまり、ベースラインサンプルの再分析であり、PTHの濃度が検出されました。わずか-0.1％の違い。干渉なし（なし）のビオチン飽和および結合ストレプトアビジンコーティングビーズによるベースラインサンプルの処理は、ベースラインサンプルとわずか+1.3％の違いであり、ベースラインサンプルの再実行（干渉なし）とわずか+ 1.4％の違いでした。スパイク）。これらの結果は、このPTH ELISAの精度プロファイルとよく一致しており、試薬の中性を示しており、サンプルの処理によって希釈やマトリックス効果が導入されなかったことを示しています。ビオチンスパイクは、このPTHELISAアッセイで重大な干渉を引き起こし、検出が87％減少しました。ビオチンスパイクサンプルをビーズで処理した場合、結果は大きく変化せず、わずか-2.3％の違いであり、ベースラインの結果よりも88％低かった。ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズは遊離ビオチンに結合せず、この干渉メカニズムを緩和しないため、これは予想されます。Anti- Bt Abyスパイクは、このPTH ELISAアッセイで重大な干渉を引き起こし、検出が97％減少しました。 Anti - Bt Abyスパイクを処理すると、結果が大幅に変化し、+3,546％の違いがありましたが、ベースラインの結果とは-1.5％の違いしかありませんでした。ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズは、抗ビオチン干渉を結合および枯渇させ、抗ビオチン干渉なしのベースライン結果と同様の正確な結果を報告するように設計されているため、これは予想されます。Anti -SAv Abyスパイクも、このPTH ELISAアッセイに重大な干渉を引き起こし、検出が74％減少しました。Anti -SAv Abyスパイクを処理すると、結果が大幅に変化し、+ 253％の違いがありましたが、ベースラインの結果とは-8.2％しか違いませんでした。これは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズが抗ストレプトアビジン干渉を結合および枯渇させ、Anti-SAvAby干渉なしのベースライン結果と同様の正確な結果を報告するように設計されているためです。最後に、Anti -SAvAbyとAnti- BtAbyの1：1混合スパイクは、このPTHELISAアッセイで重大な干渉を引き起こし、検出が81％減少しました。 Anti -SAvAbyおよびAnti- BtAbyスパイクを処理した場合、結果は大幅に変化し、+379％の違いがありましたが、ベースラインの結果とは-9.9％の違いしかありませんでした。これらの結果は、このPTHELISAの精度プロファイルに含まれています。ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズは、抗ビオチンと抗ストレプトアビジンの両方の干渉を結合および枯渇させ、抗ビオチンおよび抗ストレプトアビジン干渉のないベースライン結果と同様の正確な結果を報告するように設計されているため、これは予想されます。これらのデータは、ビオチン化100BSストレプトアビジンビーズが同じサンプルから両方の干渉メカニズムを同時に結合および枯渇させる能力も示しています。
例9
可溶性ストレプトアビジンのビオチン飽和
例9
可溶性ストレプトアビジンのビオチン飽和
【0111】
トリス緩衝生理食塩水、pH 8.5（TBS）中の希釈ストレプトアビジン（ SAv ）（または修飾SAvまたはブロックSAv ）溶液を約200μgSAv /mLで調製します。TBS中のビオチンの希釈溶液も約0.50～1.00μgで調製します。ビオチン/ mL。 2つの溶液は一緒に計量され、たとえばYで会合するシリコンチューブ（PN96440-13（Cole Parmer）など）を介してポンピングすることにより、1 Volume SAv / TBSと9Volumes Biotin /TBSの比率で一列に混合されます。 -コネクタ（ Masterflex PN 30614-08（Cole Parmer）など）およびすぐにインラインミキサー（インラインミキサーPNHT-40-3.18-12-PP（ SfaMixCo ）など）と出口で混合するチューブ（図7）、 SAv溶液は2 mL / minでポンプでき、ビオチン溶液は、たとえば蠕動ポンプ（Masterflex EZ！oad2モデル07522-20（Coleパーマー））。ビオチンとストレプトアビジンを含む溶液を30～120分間混合します。
【0112】
他の濃度のビオチンとSAv 、他のバッファーシステム、および他のポンプ速度を使用することもできますが、 SAv濃度に対するビオチン濃度の比率および計量添加比を維持する必要があります。9容量のビオチン溶液には、 SAv溶液中のストレプトアビジン1モルあたり7.4モルのビオチンが含まれている必要があります。これは、ビーズ結合SAvの最小飽和手順で使用されるよりもいくらか高いビオチン対ストレプトアビジン比であることに注意してください。ストレプトアビジンの分子量を52000とすると、300mLの200μg/ mlSAv 溶液には1.1538μmolのストレプトアビジンが含まれています。ビオチンの分子量を244.31、8.53072pmoiesのビオチン（7.4：1のモル比の場合）は2084μgのビオチンであるため、9つのボリュームでのビオチン濃度は772 ng / mLです。
【0113】
非特異的に結合したビオチンを除去するために、ビオチン飽和ストレプトアビジンを透析および洗浄にかけた。湯煎に精製水を入れ、50℃に加熱した。 2番目の温水浴に10mMトリス、50～150 mM NaClのバッファーを充填し、50℃に加熱しました。 （あるいは、このバッファーには0.01-1％w/ v TWEEN 20または他の界面活性剤を含めることもできます）。ビオチン飽和ストレプトアビジンを含むリザーバーを最初の温水浴に入れました。分子量カットオフ10kDのMiniKrosサンプラー中空糸フィルター（Repiigen ; PN S04-E010-05-N; mPes ; 0.5 mm）などの中空糸フィルターを使用して、チューブをインラインフローポート（上部と下部）に取り付けました。）および片側ポート。 2番目のサイドポートには上限がありました。サイドポートチューブはろ液を廃棄物容器に導きました。リザーバーからつながるチューブは、蠕動ポンプを通って中空糸フィルターに進みました。インラインフローアウトレットポートからつながるチューブは、保持液をリザーバーに戻します（図8）。水浴とリザーバーが50°Cに達したとき、蠕動ポンプをオンにし、保持液チューブに湿らせて背圧を発生させ、ろ過を行い、ビオチン飽和ストレプトアビジン溶液の量を減らし、タンパク質を濃縮しました。保持液の流量は約360ml/ min、ろ液の流量は約95 ml / minでした。貯水池が元の容量の約15％（またはそれ以下）に達したときに、2番目の水浴からのバッファーを貯水池に追加して元の容量に戻しました。（品質管理のためのサンプルは、ボリューム復元の直前に取得されました）。ろ過と容量の回復を合計で少なくとも5回繰り返しました。必要に応じて、追加の洗浄サイクルを追加できます。ボリュームの最終的な復元に続いて、保持液は元のボリュームの約10％に濃縮されました（必要に応じて、他のボリュームを使用できます）。最終的な保持液中の遊離ビオチンは1200pg/ ml未満である必要があります。濃縮されたビオチン飽和ストレプトアビジンを0.2μmフィルターでろ過しました。
【0114】
可溶化ストレプトアビジンの存在下での遊離ビオチンは、ビオチンクエンチプロセスが完了した証拠と見なされます。ただし、遊離ビオチン自体が干渉を引き起こす可能性があるため、ストレプトアビジンやその他の干渉をブロックするブロッキング試薬では望ましくないため、除去する必要があります。各洗浄後の保持液および最終保持液（重複）を、ELISAビオチンアッセイ（ Immundiagnostik 、PN KR8141）を使用して遊離ビオチン含有量についてアッセイし、表11に示す結果を得た。
表11.QSAv調製品質管理サンプル中の遊離ビオチンの定量（およびキャリブレーション）
表11.QSAv調製品質管理サンプル中の遊離ビオチンの定量（およびキャリブレーション）
【表11】
【0115】
最終的な保持液には700pg/ mL未満の遊離ビオチンが含まれており、1200 pg / mL未満の要件を大幅に下回っています。最終的な保持液の濃度は201μgストレプトアビジン/ mLであったため、約3.16～3.33pgの遊離ビオチン/μgストレプトアビジンが含まれていました。
【0116】
不完全にクエンチされたストレプトアビジンを除去するためのさらなるステップを追加することができる。この目的には、アガロースに結合した2-イミノビオチン（Sigma Aldrich PN I4507-5ML）を使用できます。
2-イミナビオチンはアルカリ性条件下でSAvに可逆的に結合します。結合はpH10～11で最も強くなります。SAvはpH4.0などの酸性条件下で放出されます。ビオチンですでにクエンチされているSAvは結合しないはずです。したがって、アルカリ性2-イミノビオチン-アガロースのカラムからのクエンチされたSAvのフロースルーは、ビオチンでクエンチされたSAvのみである必要があります。ビオチンクエンチされていないSAvはカラムに付着するはずです。カラムは、pH4バッファーで後で再利用するために再生することができます。
例10
マウスと結合したストレプトアビジンビーズによるヤギ抗マウス抗体の除去
IgG
2-イミナビオチンはアルカリ性条件下でSAvに可逆的に結合します。結合はpH10～11で最も強くなります。SAvはpH4.0などの酸性条件下で放出されます。ビオチンですでにクエンチされているSAvは結合しないはずです。したがって、アルカリ性2-イミノビオチン-アガロースのカラムからのクエンチされたSAvのフロースルーは、ビオチンでクエンチされたSAvのみである必要があります。ビオチンクエンチされていないSAvはカラムに付着するはずです。カラムは、pH4バッファーで後で再利用するために再生することができます。
例10
マウスと結合したストレプトアビジンビーズによるヤギ抗マウス抗体の除去
IgG
【0117】
直径500～600nmの磁性ナノ粒子（ビーズ）をストレプトアビジンでコーティングしました。 2つのアフィニティー精製マウスIgG調製物を、 NHSesier - Peg（ 4）-Bioiinと共有結合でビオチン化しました。マウスIgG＃1は、ポリクローナル非特異的マウスIgGでした。マウスIgG＃2はモノクローナルマウスIgGでした。ビーズをビオチン化マウスIgGに曝露すると、約30μgのIgGが各mgのビーズに付着しました。ビーズは、ポリクローナルマウスIgGのみ、モノクローナルマウスIgGのみ、および2つのマウスIgG調製物の混合物で作成されました。これらのマウス抗体は、特異的アフィニティー精製または異好性のいずれかの抗マウスIgG抗体の捕捉部分として機能し、これらの抗体に曝露されます。次に、これらのマウスIgG結合ストレプトアビジンビーズを使用して、アフィニティー精製したヤギ抗マウス抗体（Lampire Biological Laboratories）を添加したサンプル（この場合はバッファー）を洗浄しました。次に、サンプルのアリコートを、IgG含有量についてHPLCサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。
【0118】
ビオチン化を使用することに関する考えられる懸念は、洗浄手順の過程で捕捉試薬がストレプトアビジンから解離する程度まで、ビオチンの親和性が遊離ビオチンの親和性よりも低くなる可能性があることです。これを確認するために、洗浄手順を通常どおり、20μg/ mLの遊離ビオチン（ストレプトアビジンよりも200倍以上モル過剰）の存在下で実施しました。ビオチン化IgGがストレプトアビジンでコーティングされたビーズから解離すると、過剰な遊離ビオチンの存在下で再結合できなくなり、その結果、ビーズとともに除去されるヤギ抗マウス抗体の量が減少します。あるいは、ビオチン化IgGの解離が有意な程度に起こっていない場合、ヤギ抗マウスIgGの量は、遊離ビオチンの有無にかかわらずサンプル間で有意に変化しません。
【0119】
マウスIgG結合ストレプトアビジンビーズ（IgG＃1、IgG＃2、および2つの混合物を含む）のそれぞれの1つのアリコートを、ストレージバッファー（TBS）から磁気的に分離し、20μg/mlビオチンを含むTBSと混合しました。 。ヤギ抗マウスIgGは、a）TBSおよびb） 20μg/ mlビオチンを含むTBSで200μg/ mLに希釈されました。3つのマウスIgG結合ストレプトアビジンビーズのそれぞれの2つのアリコート（ 1つはビオチンが露出し、もう1つは露出していません）をバッファーから磁気的に分離しました。ヤギ抗マウスIgG1mLあたり2.5mgのビーズを使用して、ビオチンに曝露されていないビーズにTBS中のヤギ抗マウスIgGを添加し、20μg/ mlビオチンを含むTBS中のヤギ抗マウスIgGを添加しました。にさらされていたビーズに追加されました
ビオチン。これらの混合物を10秒間ボルテックスしてビーズを懸濁し、一晩混合しました。得られた混合物はビーズを磁気的に分離し、次に上澄みサンプルを、ヤギIgGに対応するピークの280nmでの吸光度の曲線下面積を使用してHPLC-SECによって分析した。結果を表12に示します。
表12.ヤギ抗マウスIgGの除去
ビオチン。これらの混合物を10秒間ボルテックスしてビーズを懸濁し、一晩混合しました。得られた混合物はビーズを磁気的に分離し、次に上澄みサンプルを、ヤギIgGに対応するピークの280nmでの吸光度の曲線下面積を使用してHPLC-SECによって分析した。結果を表12に示します。
表12.ヤギ抗マウスIgGの除去
【表12】
【0120】
これらのデータは、マウスIgG結合ストレプトアビジンビーズがビーズ1 mgあたり26.0～60.1μgの抗マウス抗体を除去できることを示しています。これらのデータはさらに、ビオチン化捕捉試薬（マウスIgG）の付着が、大過剰の遊離ビオチンの存在下でも、洗浄手順の条件下で安定していることを示しました。最後に、これらのデータは、これらの手順が、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体、および2つの混合物である捕捉部分で効果的であることを示しました。
実施例11.マウスSqGと結合したストレプトアビジンビーズによるビオチンの除去
実施例11.マウスSqGと結合したストレプトアビジンビーズによるビオチンの除去
【0121】
の３つのマウスＩｇＧ結合ストレプトアビジンビーズ調製物（ポリクローナルマウスＩｇＧ、モノクローナルマウスＩｇＧ、およびポリクローナルマウスＩｇＧとモノクローナルマウスＩｇＧの混合物）もまた、サンプルから遊離ビオチンを除去するそれらの能力について試験された。上記と本質的に同じプロトコルを使用して、0.75 mgのビーズを200μLのQC3、約250,000pgビオチン/ mL、50 ngビオチンを含む社内QCサンプルと組み合わせ、10分間インキュベートし、5分間磁気的に分離し、収集されたサンプル上清。処理されたサンプルは、IDK BIOTIN ELISAアッセイ（Immundiagnostik AG;実施例6を参照）でテストされました。 3つのビーズ調製物はすべて、これらの条件下で、250ngビオチン/ mL（合計50ngビオチン）または66.3ngビオチン/ mgビーズで0.200mLのGC3から少なくとも49.7ngビオチンを除去し、ビオチン濃度を250,000 pg/ mLから300pg / ml未満。
【0122】
投薬において、本明細書の態様は特定の実施形態を参照することによって強調されるが、当業者は、これらの開示された実施形態が本明細書に開示される主題の原理の例示にすぎないことを容易に理解するであろう。したがって、開示される主題は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および／または試薬などに決して限定されないことを理解されたい。したがって、本明細書の精神から逸脱することなく、本明細書の教示に従って、開示された主題の様々な修正または変更または代替の構成を行うことができる。最後に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、正確に示され、説明されたものに限定されない。
【0123】
本発明を実施するために発明者に知られている最良の様式を含む、本発明の特定の実施形態が本明細書に記載されている。もちろん、これらの説明された実施形態の変形は、前述の説明を読むと、当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待し、本発明は、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての修正および同等物を含む。さらに、すべての可能な変形における上記の実施形態の任意の組み合わせ。 それらは、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって他の方法で著しく矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【0124】
本発明の代替の実施形態、要素、またはステップのグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、または本明細書に開示される他のグループメンバーと任意の組み合わせで参照および請求することができる。グループの1つまたは複数のメンバーは、利便性および/または特許性の理由から、グループに含まれるか、グループから削除される可能性があると予想されます。そのような包含または削除が発生した場合、明細書には変更されたグループが含まれていると見なされ、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのMarkushグループの書面による説明が満たされます。
【0125】
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特性、品目、数量、パラメータ、特性、用語などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって変更されると理解されるべきである。本明細書で使用される「約」という用語は、そのように修飾された特性、品目、数量、パラメータ、特性、または用語が、記載された特性、品目、数量、パラメータの値の上下10パーセントの範囲を含むことを意味する、プロパティ、または用語。したがって、反対に示されない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、変動する可能性のある近似値である。少なくとも、均等論の適用をクレームの範囲に限定する試みとしてではなく、各数値表示は、少なくとも報告された有効桁数に照らして、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲および値は近似値であるにもかかわらず、特定の例に示される数値範囲および値は、可能な限り正確に報告される。ただし、数値範囲または値には、それぞれのテスト測定で見つかった標準偏差に必然的に起因する特定のエラーが本質的に含まれています。本明細書における値の数値範囲の列挙は、単に、範囲内にある個々の個別の数値を個別に参照するための簡略化された方法として役立つことを意図している。本明細書で別段の指示がない限り、数値範囲の個々の値は、本明細書で個別に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。
【0126】
本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の指示対象は、別段の定めがない限り、単数形および複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本書に示されているか、文脈によって明らかに矛盾している。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。発明であり、他の方法でクレームされた発明の範囲に制限を課すことはありません。本明細書のいかなる文言も、本発明の実施に不可欠なクレームされていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【0127】
本明細書に開示される特定の実施形態は、言語からなるか、または本質的に言語からなることを使用して、特許請求の範囲においてさらに限定され得る。クレームで使用される場合、出願されたものであれ、補正ごとに追加されたものであれ、「からなる」移行用語は、クレームで指定されていない要素、ステップ、または成分を除外します。移行用語は、「本質的に、クレームの範囲を特定の材料またはステップ、および基本的および新規の特性に実質的に影響を与えないものに限定することからなる。そのように請求された本発明の実施形態は、本質的または明示的に記載され、本明細書で可能にされる。
【0128】
本明細書で参照および識別されるすべての特許、特許刊行物、および他の刊行物は、例えば、使用される可能性のあるそのような刊行物に記載される組成物および方法論を説明および開示する目的で、参照によりその全体が個別に明示的に本明細書に組み込まれる。本発明に関連して。これらの刊行物は、本出願の出願日より前の開示のためにのみ提供されている。この点に関して、発明者が先行発明またはその他の理由によりそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文書の日付または内容に関するすべての記述は、申請者が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性についての承認を構成するものではありません。
参照：
1. Society toimprove Diagnosis in Medicine (SIDM); https://betterdiagnosis.org/
2. Frequencythat Laboratory Tests influence Medical Decisions;
http://jalm.aaccjnls.Org/content/1/4/410
3. Frame, I.J.,et al. (2019) Susceptibility of Cardiac Troponin Assays to Biotin interference.
Am J ClinPathol. 151: 488-493.
4. Wild, David.(2018) Biotin interference: answering questions, reducing the risk.
http://captodayoniine.com/biotin-interference-answering-questions-reducing-the-risk/
5. Katzman,B.M., et al. (2018) Prevalence of biotin supplement usage in outpatients andplasma biotin concentrations in patients presenting to the emergencydepartment. Clinical Biochemistry. 60:11-16
6. Colon, P.J.,Green, D.N. (2018) Biotin interference in Clinical immunoassays. JALM.
02(06):941-951.
7. Kirkwood,Julie. (2018) Meeting the Biotin Challenge. Clinical Laboratory News. January,2018.
8. Chun, KellyY. (2017) Biotin Interference in Diagnostic Tests. Clinical Chemistry. 63:619-620
9.Samarasinghe, S., et al. (2017). Biotin interference with Routine Clinicalimmunoassays: Understand the Causes and Mitigate the Risks. Endocr Pract,23(8): 989-998.
10. Lam L .,Kyle C.V. (2017). A simple method to detect biotin interference onimmunoassays.
Clin Chem LabMed. 55(6): e104-e1G6.
11. Trambas C.,et al. (2017). Depletion of biotin using streptavidin-coated microparticles: avalidated solution to the problem of biotin interference in streptavidin-biotinimmunoassays. Ann Clin Biochem. 55(2): 216-226.
12. Piketty,M.L., et al. (2017) High-dose biotin therapy leading to false biochemicalendocrine profiles: validation of a simple method to overcome biotininterference. Clin. Chem. Lab Med. 55(6):817-825.
13. Barbesino, G.(2016) The Unintended Consequences of Biotin Supplementation: SpuriousImmunoassay Results Lead to Misdiagnoses. Clinical Laboratory News, BenchMatters, December: 1-3.
14. The FDAWarns that Biotin May interfere with Lab Tests: FDA Safety Communication;
https://www.fda.gov/medical-devices/safety-communications/fda-warns-biotin-may-interfere-lab-tests-fda-safety-communication
15. Testing forBiotin Interference in In Vitro Diagnostic Devices;
https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-biotin-interference-vitro-diagnostic-evices
16. Tytgat,H.L.P., et al. (2015), Endogenous biotin binding proteins: an overlooked factorcausing false positives in streptavidin based protein detection. MicrobBiotechnol. 8(1): 164-168.
17. Chen, T.,et al. (2012). Biotin IgM Antibodies in Human Blood: A Previously UnknownFactor Eliciting False Results in Biotinyiation-Based immunoassays. PLoS One.7(8): e42376.
18. Favresse, J.,et al., (2018). Interferences with thyroid function immunoassays: clinicalimplications and detection algorithm. Endocrine Reviews. 39(5): 830-850.
19. FavresseJ., et al. (2018). Antistreptavidin antibodies mimicking heterophilicantibodies in thyroid function tests. Clin Chem Lab Med. 56(7): e160-e163.
20. Lam, L. etal. (2018). Apparent Hyperthyroidism Caused by Biotin-Like interference fromIgM Anti-Streptavidin Antibodies, Thyroid. 28(8): 1063- 1067
21. HarschI.A., et al. (2017). Implausible elevation of peripheral thyroid hormonesduring therapy with a protein supplement. Clin Chem Lab Med. 55(9): e197-e198.
22. Peltier L.,et al. (2016). Anti-streptavidin interferences in Roche thyroid immunoassays: acase report, Ciinicai chemistry and laboratory medicine. 54(1): e11- 14.
23. RulanderN.J., et al. (2013). Interference from antistreptavidin antibody. Archives ofpathology & laboratory medicine. 137(8): 1141-1146.
24. Wouters etal (2020). Alarmed by misleading interference in free T3 and free T4 assays:
a new case ofanti-streptavidin antibodies. Clin Chem Lab Med. 58(3): e89-e71.
25. Robier etal. (2020). Anti-streptavidin antibodies as a cause of false-positive resultsof streptavidin-based autoantibody assays. Clin Chem Lab Med. 58(1):e5-e7.
26.Verougstaete et al. (2019). Interference of anti-streptavidin antibodies inimmunoassays:
a very rarephenomenon or a more common finding? Clin Chem Lab Med. 20191064, elSSN1437-4331, ISSN 1434-6621.
27. U.S. patentapplication publication no. 2019/0137484
28. Waner M.J.,et al. (2019). Streptavidin cooperative allosterism upon binding biotinobserved by differential changes in intrinsic fluorescence. Biochem BiophysRep. 17: 127- 131.
29. Sano T.,Cantor C.R. (1990). Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoreticbehavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea. JBiol Chem.
265(6):3369-3373.
30. Song, J.,et al. (2015). Functional loop dynamics of the streptavidin-biotin complex. SciRep. 5: 7906
31. Deng, L, etal. (2013). Dissociation kinetics of the streptavidin-biotin interactionmeasured using direct eiectrospray ionization mass spectrometry analysis. J AmSoc Mass Spectrom. 24(1): 49-56.
参照：
1. Society toimprove Diagnosis in Medicine (SIDM); https://betterdiagnosis.org/
2. Frequencythat Laboratory Tests influence Medical Decisions;
http://jalm.aaccjnls.Org/content/1/4/410
3. Frame, I.J.,et al. (2019) Susceptibility of Cardiac Troponin Assays to Biotin interference.
Am J ClinPathol. 151: 488-493.
4. Wild, David.(2018) Biotin interference: answering questions, reducing the risk.
http://captodayoniine.com/biotin-interference-answering-questions-reducing-the-risk/
5. Katzman,B.M., et al. (2018) Prevalence of biotin supplement usage in outpatients andplasma biotin concentrations in patients presenting to the emergencydepartment. Clinical Biochemistry. 60:11-16
6. Colon, P.J.,Green, D.N. (2018) Biotin interference in Clinical immunoassays. JALM.
02(06):941-951.
7. Kirkwood,Julie. (2018) Meeting the Biotin Challenge. Clinical Laboratory News. January,2018.
8. Chun, KellyY. (2017) Biotin Interference in Diagnostic Tests. Clinical Chemistry. 63:619-620
9.Samarasinghe, S., et al. (2017). Biotin interference with Routine Clinicalimmunoassays: Understand the Causes and Mitigate the Risks. Endocr Pract,23(8): 989-998.
10. Lam L .,Kyle C.V. (2017). A simple method to detect biotin interference onimmunoassays.
Clin Chem LabMed. 55(6): e104-e1G6.
11. Trambas C.,et al. (2017). Depletion of biotin using streptavidin-coated microparticles: avalidated solution to the problem of biotin interference in streptavidin-biotinimmunoassays. Ann Clin Biochem. 55(2): 216-226.
12. Piketty,M.L., et al. (2017) High-dose biotin therapy leading to false biochemicalendocrine profiles: validation of a simple method to overcome biotininterference. Clin. Chem. Lab Med. 55(6):817-825.
13. Barbesino, G.(2016) The Unintended Consequences of Biotin Supplementation: SpuriousImmunoassay Results Lead to Misdiagnoses. Clinical Laboratory News, BenchMatters, December: 1-3.
14. The FDAWarns that Biotin May interfere with Lab Tests: FDA Safety Communication;
https://www.fda.gov/medical-devices/safety-communications/fda-warns-biotin-may-interfere-lab-tests-fda-safety-communication
15. Testing forBiotin Interference in In Vitro Diagnostic Devices;
https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-biotin-interference-vitro-diagnostic-evices
16. Tytgat,H.L.P., et al. (2015), Endogenous biotin binding proteins: an overlooked factorcausing false positives in streptavidin based protein detection. MicrobBiotechnol. 8(1): 164-168.
17. Chen, T.,et al. (2012). Biotin IgM Antibodies in Human Blood: A Previously UnknownFactor Eliciting False Results in Biotinyiation-Based immunoassays. PLoS One.7(8): e42376.
18. Favresse, J.,et al., (2018). Interferences with thyroid function immunoassays: clinicalimplications and detection algorithm. Endocrine Reviews. 39(5): 830-850.
19. FavresseJ., et al. (2018). Antistreptavidin antibodies mimicking heterophilicantibodies in thyroid function tests. Clin Chem Lab Med. 56(7): e160-e163.
20. Lam, L. etal. (2018). Apparent Hyperthyroidism Caused by Biotin-Like interference fromIgM Anti-Streptavidin Antibodies, Thyroid. 28(8): 1063- 1067
21. HarschI.A., et al. (2017). Implausible elevation of peripheral thyroid hormonesduring therapy with a protein supplement. Clin Chem Lab Med. 55(9): e197-e198.
22. Peltier L.,et al. (2016). Anti-streptavidin interferences in Roche thyroid immunoassays: acase report, Ciinicai chemistry and laboratory medicine. 54(1): e11- 14.
23. RulanderN.J., et al. (2013). Interference from antistreptavidin antibody. Archives ofpathology & laboratory medicine. 137(8): 1141-1146.
24. Wouters etal (2020). Alarmed by misleading interference in free T3 and free T4 assays:
a new case ofanti-streptavidin antibodies. Clin Chem Lab Med. 58(3): e89-e71.
25. Robier etal. (2020). Anti-streptavidin antibodies as a cause of false-positive resultsof streptavidin-based autoantibody assays. Clin Chem Lab Med. 58(1):e5-e7.
26.Verougstaete et al. (2019). Interference of anti-streptavidin antibodies inimmunoassays:
a very rarephenomenon or a more common finding? Clin Chem Lab Med. 20191064, elSSN1437-4331, ISSN 1434-6621.
27. U.S. patentapplication publication no. 2019/0137484
28. Waner M.J.,et al. (2019). Streptavidin cooperative allosterism upon binding biotinobserved by differential changes in intrinsic fluorescence. Biochem BiophysRep. 17: 127- 131.
29. Sano T.,Cantor C.R. (1990). Cooperative biotin binding by streptavidin. Electrophoreticbehavior and subunit association of streptavidin in the presence of 6 M urea. JBiol Chem.
265(6):3369-3373.
30. Song, J.,et al. (2015). Functional loop dynamics of the streptavidin-biotin complex. SciRep. 5: 7906
31. Deng, L, etal. (2013). Dissociation kinetics of the streptavidin-biotin interactionmeasured using direct eiectrospray ionization mass spectrometry analysis. J AmSoc Mass Spectrom. 24(1): 49-56.
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5AB】
【図5CD】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】