特表 2022-539952 結腸・直腸がんを治療するための薬物の製造におけるＦＧＦ２１の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-14

(54)【発明の名称】結腸・直腸がんを治療するための薬物の製造におけるＦＧＦ２１の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/18 20060101AFI20220907BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220907BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20220907BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220907BHJP

【ＦＩ】

A61K38/18

A61P35/00

C07K14/50 ZNA

C12N15/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570517

(86)(22)【出願日】2020-12-16

(85)【翻訳文提出日】2022-01-20

(86)【国際出願番号】 CN2020136762

(87)【国際公開番号】W WO2021227493

(87)【国際公開日】2021-11-18

(31)【優先権主張番号】202010396043.1

(32)【優先日】2020-05-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】朱升龍

(72)【発明者】

【氏名】陳永泉

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084DB54

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA20

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、結腸・直腸がんを治療するための薬物の製造におけるＦＧＦ２１の使用を開示している。本発明に係るＦＧＦ２１タンパク質は、約２１０個のアミノ酸からなる分泌タンパク質である。本発明により、前記ＦＧＦ２１タンパク質が結腸直腸腫瘍を治療する効果を有することが発見され、細胞学的実験及び動物実験により、ＦＧＦ２１は、結腸直腸腫瘍細胞株の増殖、侵襲、転移を抑制することができ、マウスモデルにおいて腫瘍病巣の大きさを顕著に低下させることができることが示されている。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

結腸・直腸がんを予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造におけるＦＧＦ２１タンパク質の使用であって、前記ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１～１４のいずれかに示される、使用。

【請求項2】

前記ＦＧＦ２１タンパク質の有効用量が０．１～１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

結腸・直腸がんを治療する薬物であって、ＦＧＦ２１タンパク質を有効成分として、前記ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１～１４のいずれかに示される、薬物。

【請求項4】

さらに、薬学的に許容可能な担体又は補助材を含む、請求項３に記載の薬物。

【請求項5】

前記薬物の投与経路は、経口投与、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射又は筋肉注射を含む、請求項４に記載の薬物。

【請求項6】

結腸・直腸がんを治療する薬物のスクリーニングにおける薬物標的としての、ＦＧＦ２１遺伝子の使用。

【請求項7】

ＦＧＦ２１タンパク質の小分子活性化剤をスクリーニングする、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

腫瘍糖代謝及び／又はグルタミン代謝阻害剤の製造における、ＦＧＦ２１タンパク質の使用。

【請求項9】

ヘキソキナーゼ２、ピルビン酸キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼのうちの１種又は複数種である腫瘍糖代謝の重要なタンパク質を阻害する阻害剤を製造する、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

グルタミナーゼの阻害剤を製造する、請求項８に記載の使用。

【請求項11】

がんを予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造における、ＦＧＦ２１タンパク質の使用。

【請求項12】

前立腺がん、乳がん、食道がん、結腸・直腸がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、淡明細胞型腎がん、黒色腫、多発性骨髄腫のうちの１種又は複数種の疾患を予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造における使用である、請求項１１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、結腸・直腸がんを治療するための薬物の製造におけるＦＧＦ２１の使用に関し、特に、結腸・直腸がんを治療するための薬物の製造におけるヒトＦＧＦ２１の使用に関し、医薬技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

大腸がんは、臨床的に一般的な悪性腫瘍の１つであり、大腸がんは、結腸がん及び直腸がんを含み、中国で３番目に多い悪性腫瘍である。その発病率は、生活水準の向上に伴って増大する傾向があり、世界範囲内で、大腸がんは、毎年１０２３１５２症例の新規症例数で、一般的な悪性腫瘍発病率の第３位を占め、悪性腫瘍の総発症数の１０．３８％を占める。中国では、住民ライフスタイル及び食事構成の変化に伴い、結腸・直腸がんの発病率の上昇傾向が明らかになり、毎年に４％の速度で逓増し、年間増加速度は、世界範囲の速度より２％ポイント高い。

【0003】

現在、大腸がんの治療は、主に外科的根治手術を主とし、化学療法、放射線治療、漢方医薬治療及び生物学的治療をその補助的な治療手段とする。最初に診断された患者は、約三分の二が根治手術を受けるが、半分を超える患者には、再発又は遠隔転移が発生する。進行がん腫瘍又は広く転移したがん腫に対して、根治手術を行うことができないが、内科統合的治療法が、常に、主な治療手段となり、手術可能な患者では、大腸がん術後に依然として高い再発率がある。一般的な治療薬物は、一般的に広域スペクトル化学薬物であり、多くの副作用がある。したがって、腫瘍の成長及び再発を阻害すると同時に臓器を保護するという効果を有し、関連する顕著な副作用がなく、結腸・直腸がんを治療する安全な薬物の開発は、現在、開発の理想的な目的である。

【0004】

近年、大量の臨床調査結果は、結腸・直腸がんの発生及び発展が代謝異常に密接に関連付けられることを示す。大量の研究により、解糖、トリカルボン酸回路、脂肪酸代謝、グルタミド代謝などという代謝経路に、腫瘍細胞においていずれも再プログラム変化が発生し、腫瘍細胞が、様々な代謝経路の間の協調により、増殖に必要な脂肪酸、ヌクレオチド等を提供することができ、それによって、生体高分子の合成プロセスが腫瘍細胞の迅速な増殖に適することを発見した。特に指摘すべきものとして、代謝異常は、腫瘍が進行した結果のみではないが、腫瘍の開始及び進行過程に直接関与する可能性もある。現在、代謝の角度から抗腫瘍薬物を開発し、抗腫瘍薬物が既に多くの腫瘍において成功裏に応用され、例えば、最近の研究により、代謝酵素をコードするいくつかの遺伝子自体ががん遺伝子であることが発見され、例えば、フマル酸カルボキシラーゼの突然変異が腎臓がんの発生、進行に関連し、コハク酸カルボキシラーゼの突然変異がクロム親和性細胞腫の発生、進行に関し、イソクエン酸脱水素酵素の突然変異が代謝物小分子２ＨＧからＨＮＦ４αの発現を生じさせて、胆管がんなどを誘導する。以上の分析に基づいて腫瘍細胞の代謝を標的とすることが腫瘍細胞を死滅させる有効な方法の１つである可能性を示す。しかしながら、現在開発された薬物は、いずれもいくつかの小分子阻害剤であり、標的性が低く、副作用が高いが、生物学的タンパク質類薬物の吸収が速く、標的性が高い。したがって、結腸・直腸がんに対して新規な標的生物学的タンパク質類製剤を開発することは、現在の腫瘍研究のホットスポットである。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、数多くの研究により、糖類・脂質代謝ネットワークの複数の部分に関与する重要なメンバーであるヒト線維芽細胞成長因子２１は、結腸・直腸がんの発生及び進行及び転移を顕著に阻害可能なことを発見した。これに基づいて、本発明は、結腸・直腸がんを予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造におけるＦＧＦ２１タンパク質の新たな用途を提供する。

【0006】

本発明の第１の目的は、結腸・直腸がんを予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造におけるＦＧＦ２１タンパク質の使用を提供することである。

【0007】

一実施形態において、前記ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１～１４のいずれかに示される。

【0008】

一実施形態において、前記ＦＧＦ２１タンパク質の有効用量は、０．１～１０ｍｇ／ｋｇである。

【0009】

本発明の第２の目的は、結腸・直腸がんを治療する薬物を提供することであり、前記薬物の活性成分は、ＦＧＦ２１タンパク質を含む。

【0010】

一実施形態において、前記ＦＧＦ２１タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１～１４のいずれかに示される。

【0011】

一実施形態において、前記薬物は、薬学的に許容可能な担体又は補助材をさらに含む。

【0012】

一実施形態において、前記薬物の投与経路は、経口投与、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射又は筋肉注射を含む。

【0013】

本発明の第３の目的は、結腸・直腸がんを治療する薬物のスクリーニングにおける薬物標的としての、ＦＧＦ２１遺伝子の使用を提供する。

【0014】

一実施形態において、前記ＦＧＦ２１遺伝子のヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６～１０のいずれかに示される。

【0015】

一実施形態において、前記使用は、ＦＧＦ２１タンパク質の小分子活性化剤をスクリーニングすることである。

【0016】

本発明の第４の目的は、腫瘍糖代謝及び／又はグルタミン代謝阻害剤の製造におけるＦＧＦ２１タンパク質の使用を提供することである。

【0017】

一実施形態において、前記使用は、ＨＫ２、ＰＫＭ２、ＰＦＫＰ、ＰＤ、ＧＰＤのうちの１種又は複数種が腫瘍糖代謝の重要なタンパク質を阻害する阻害剤を製造することである。

【0018】

一実施形態において、前記使用は、グルタミド代謝関連タンパク質ＧＬＳの阻害剤の製造である。

【0019】

本発明は、さらに、前立腺がん、食道がん、結腸・直腸がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、淡明細胞型腎がん、黒色腫、多発性骨髄腫のうちの１種又は複数種の疾患を予防、緩和及び／又は治療する薬物の製造における前記ＦＧＦ２１タンパク質の使用を権利範囲として請求している。

【0020】

従来の技術に比べて、本発明は、以下の有利な効果を有する。

【0021】

（１）本発明は、ＦＧＦ２１遺伝子の新たな機能を発見し、それは、腫瘍代謝を顕著に変化させることができ、特に、腫瘍糖代謝及びグルタミド代謝過程の重要なタンパク質ＨＫ２、ＰＫＭ２及びＧＬＳを顕著に阻害し、結腸直腸腫瘍細胞系の増殖、侵襲、転移を抑制し、マウスモデルにおいて腫瘍病巣の大きさを顕著に低下させることができ、したがって、様々な剤形薬物の有効成分とすることができ、結腸・直腸がんの治療に対して極めて重大な意義を有する。

【0022】

（２）本発明は、ＦＧＦ２１タンパク質を注射することにより、結腸・直腸がんの発生及び進行を緩和し、結腸がんの生成及び転移を阻害することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、ヒト結腸・直腸がん移植腫瘍の成長速度へのＦＧＦ２１の影響であり、ここで、Ａは、腫瘍体積の変化であり、Ｂは、腫瘍質量の変化である。

【図2】図２は、ＦＧＦ２１ ＡＯＭ／ＤＳＳによって誘導されたマウス結腸・直腸がんの影響であり、ここで、Ａは、大腸腫瘍の数であり、Ｂは、大腸の形態である。

【図3】図３は、腫瘍代謝の重要なタンパク質へのＦＧＦ２１の影響であり、ここで、Ａは、腫瘍糖代謝経路の重要なタンパク質の変化であり、Ｂは、腫瘍グルタミド代謝の重要なタンパク質の変化である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

実験動物及び飼育：ヌードマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、上海ＳＬＡＣ会社から購入した。江南大学無錫医学院動物センタに飼育し、１２時間ごとに照明の点灯・消灯を繰り返し、温度は２０±２℃であった。

【0025】

細胞培養：結腸・直腸がん細胞株ＳＷ６２０は、中国科学院生物化学及び細胞生物学研究所により提供された。

【0026】

ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎは、博士徳社から購入し、ウシ胎児血清は、四季青社から購入した。アゾキシメタンは、ｓｉｇｍａ会社（ロット番号０９８ｋ１４８８）、デキストラン硫酸ナトリウムＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（ロット番号０２１６０１１０５０）から購入し、他の薬品は、国産分析純試薬であった。結腸・直腸がん細胞株を壁に付着させて１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培養液に成長させ、３７℃で、５％ＣＯ_２加湿インキュベーターで培養し、隔日継代した。

【0027】

実施例１：薬物の製造におけるＦＧＦ２１の使用
ＦＧＦ２１タンパク質は、微生物細胞を培養することにより製造され、製造方法は、登録番号ＣＮ１０６４３２５０９ Ｂの特許出願に開示されている。

【0028】

微生物細胞を製造して得られたＦＧＦ２１タンパク質を薬学的に許容可能な担体又は補助材と共に薬物の製造に用いて、前記薬学的に許容可能な担体又は補助材は、賦形剤、アジュバント及び／又は希釈剤等であってもよい。

【0029】

実施例２：ヒト結腸・直腸がん移植腫瘍の成長速度へのＦＧＦ２１の影響
実施例１の方法に応じてアミノ酸配列が例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるＦＧＦ２１タンパク質を製造した。

【0030】

ヒト結腸がん細胞ＳＷ６２０細胞を１×１０^６個の細胞／匹で６週齢の雄性ヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍が２００ｍｍ^３に成長すると、４群にランダムに分け、（１）生理食塩水群：等体積の生理食塩水を注射し、（２）低用量群：１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１を注射し、（３）中用量群：５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１を注射し、（４）高用量群：ＦＧＦ２１を１０ｍｇ／ｋｇ注射した。毎日に１回注射し、１５日間連続的に注射した。毎日に腫瘍体積を監視し、三週間後にマウスを屠殺し、腫瘍重量を秤量した。結果として、３種類の異なる用量のＦＧＦ２１は、いずれも移植腫瘍の体積及び最終腫瘍重量を阻害することができ、かつ用量依存性を示す。高用量のＦＧＦ２１（１０ｍｇ／ｋｇ）を注射した後、腫瘍の成長を完全に阻害することができ、腫瘍を５００ｍｍ^３に維持し、最終体積は、対照群の３０％であり、同様に腫瘍質量も約７０％低下し、１ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇ注射すると、それぞれ、腫瘍質量を３０％及び５０％低下させた（図１に示すとおりである）。

【0031】

実施例３：ＡＯＭ／ＤＳＳによって誘導されたマウス結腸・直腸がんへのＦＧＦ２１の影響
実施例１の方法に応じてアミノ酸配列が例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるＦＧＦ２１タンパク質を製造した。

【0032】

Ｃ５７マウスに第１週にアゾキシメタン１０ｍｇ／ｋｇを注射した同時に、２．５％のデキストラン硫酸ナトリウムの自由な食用周期を開始し、各周期は、３週間、即ち２１日間であり、第１週に、デキストラン硫酸ナトリウム含有の水を飲用させ、後の２週間に通常の水を飲用させ、３週間を１周期として、合計で３つの周期の処理を行った。第６週から、生理食塩水群及びＦＧＦ２１注射群に分け、ＦＧＦ２１注射群に注射量１０ｍｇ／ｋｇで注射し、生理食塩水群に同じ量の生理食塩水を注射し、毎日に１回注射し、４週間連続的に注射した。

【0033】

結果は、図２Ａに示すとおりであり、ＦＧＦ２１を注射した後に平均腫瘍病巣の数を４から１に減少させることができ、図２Ｂは、ＦＧＦ２１治療群と対照群の大腸の代表的な写真を示し、ＦＧＦ２１の治療効果を直感的に示すことができ、腫瘍の数を減少させ、腸がんの長さの短縮問題を改善し、結腸の長さを対照群よりも１０－２０ｍｍ増加させ、平均で１８ｍｍ増加させた。

【0034】

実施例４：腫瘍代謝の重要なタンパク質へのＦＧＦ２１の影響
実施例１の方法に応じてアミノ酸配列が例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるＦＧＦ２１タンパク質を製造した。

【0035】

Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ（タンパク質イムノブロット）により実施例３の腫瘍組織における腫瘍代謝関連タンパク質レベルを検出した。

【0036】

ａ）溶液の調製：
（１）１０％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウムＳＤＳ溶液：０．１ｇのＳＤＳ、及び１ミリリットルのＨ_２Ｏ脱イオン水で調製し、室温で保存した。

【0037】

（２）分離ゲル緩衝液：１．５ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．８）：１８．１５ｇのＴｒｉｓを８０ミリリットルの水で溶解し、ＨＣｌでｐＨを８．８に調節し、水を添加して１００ミリリットルの最終体積まで希釈した。

【0038】

（３）濃縮ゲル緩衝液：０．５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ６．８）：６．０５ｇのＴｒｉｓを８０ミリリットルの水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを６．８に調節し、水を添加して１００ミリリットルの最終体積まで希釈した。

【0039】

（４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液：ｐＨ６．８の０．５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液８ミリリットル、グリセリン６．４ミリリットル、１０％ＳＤＳ １２．８ミリリットル、メルカプトエタノール３．２ミリリットル、０．０５％ブロモフェノールブルー１．６ミリリットル、Ｈ_２Ｏ３２ミリリットルを均一に混合して使用に備えた。

【0040】

（５）Ｔｒｉｓ－グリシン電気泳動緩衝液：３０３ｇのＴｒｉｓ、１８８ｇのグリシン、１０ｇのＳＤＳを、蒸留水で１０００ミリリットルに溶解し、使用前に１０倍希釈した。

【0041】

（６）転写緩衝液：１４．４ｇのグリシン、６．０４ｇのＴｒｉｓを量り、２００ミリリットルのメタノールを加え、水を総量１Ｌまで添加した。

【0042】

（７）Ｔｒｉｓ緩衝塩溶液（ＴＢＳ）：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍｍｏｌ／Ｌ のＮａＣｌ。

【0043】

ｂ）具体的なステップについて、実施例２における一部の移植腫瘍細胞をＰＢＳで３回洗浄し、溶解液を添加し、５分間直接的に沸騰させ、氷上で冷却した後、１２０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、上澄液を－２０℃で保存して使用に備えた。

【0044】

（一）タンパク質の濃度測定
ＢＣＡ法によるタンパク質の濃度の測定：０．５ｍｇ／ｍＬの標準タンパク質のラダーをウェルプレートに加え、ＰＢＳで２０μＬまで補充し、適切な体積（３μＬ）のタンパク質サンプルをウェルプレートに加え、ＰＢＳで２０μＬまで補充し、各ウェルに２００μＬのＢＣＡ作動液を添加し（使用前に調製して使用に備える）、３７℃で３０分間、インキュベートし、波長５６２ｎｍでの吸光度を測定し、標準曲線及びサンプル体積によりタンパク質の濃度を算出した。

【0045】

（二）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動
（１）洗浄されたガラス板を整列させた後にクランプに入れて係止し、次にラックに垂直に係止されてゲルを注入した。

【0046】

（２）１０％の分離ゲルを配合し、ＴＥＭＥＤを加えた後に直ちに均一に振れば、ゲルを注入することができ、エタノールで液封し、ゲルが十分に凝固すると、ゲル上層のエタノールを除去し、吸水紙で吸い取って乾燥させた。

【0047】

（３）５％の濃縮ゲルを配合し、ＴＥＭＥＤを添加した後に直ちに均一に振れば、ゲルを注入した。残りの空間を濃縮ゲルで満たした後に、櫛を濃縮ゲルに挿入した。濃縮ゲルが凝固した後、それを垂直に上向きに軽く引き抜いた。

【0048】

（４）それを電気泳動槽に入れ、十分な電気泳動液を加えた後にサンプル注入の準備を開始する。タンパク質サンプルに対してタンパク質含有量を測定した後、５×ＳＤＳローディング緩衝液を、最終濃度が１×になるまで加え、沸騰水で３分間、煮て均一に混合した後に、総タンパク質量が３５μｇである。

【0049】

（５）定電圧８０Ｖで電気泳動を行い、サンプルが下層ゲルに入った後に、ブロモフェノールブルーがゲルの底部に達するまで定電圧１２０Ｖで電気泳動し、メンブレンに転写した。

【0050】

（三）メンブレン転写：
（１）ゲル切断：ガラス板を除去し、小さいガラス板を除去した後、濃縮ゲルを掻き取り、実験の需要に基づいてタンパク質の分子量に応じて、Ｍａｒｋｅｒを対照としてゲルを切断した。

【0051】

（２）メンブレンの準備：ＰＶＤＦメンブレンと濾紙を切断し、切断されたＰＶＤＦを８０％メタノール溶液に入れて３０秒間、活性化した。

【0052】

（３）メンブレンの装入：メンブレン転写用のクリップを開いて、黒面（負極）を水平に保持した。上面には１枚のスポンジパッドを敷いた。メンブレン転写溶液を加えて浸漬し、パッドに浸漬された濾紙を敷き、その後にゲル－ニトロセルロース膜－濾紙－スポンジパッドの順序に応じて重ねた。最後に、白色板（正極）をカバーしてメンブレン転写槽に入れた。

【0053】

（４）メンブレン転写：クリップを転写槽内に入れ、クリップの黒面を槽の黒面に向き合わせ、クリップの白面を槽の赤面に向き合わせた。４℃でメンブレンを転写し、定電流４００ｍＡとした。

【0054】

（５）転写した後にメンブレンを取り外し、１隅をマークづけた。

【0055】

（四）免疫反応
（１）密閉：メンブレンをＴＢＳＴで３回洗浄（各回５分間）を行った。洗浄後にニトロセルロース膜を５％の脱脂粉乳に入れ、室温でシェーカーで１時間、インキュベートした。

【0056】

（２）１次抗体の添加：密閉されたニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴを含有する洗浄シリンダに入れてシェーカーで３回洗浄（各回５分間）を行った。１次抗体を添加したシャーレに入れて４℃で一晩インキュベートした。

【0057】

（３）２次抗体の添加：１次抗体を回収し、ニトロセルロース膜を、ＴＢＳＴ洗浄シリンダで、シェーカーで室温で３回洗浄（各回５分間）を行い、その後に、洗浄されたニトロセルロース膜を２次抗体が添加されたシャーレに入れ、暗所で室温で４５分間、インキュベートした。インキュベートした後に、ニトロセルロース膜をＴＢＳＴ洗浄シリンダで３回洗浄（各回５分間）を行った。

【0058】

（五）化学発光
（１）Ａ及びＢの２種類の試薬を、小遠心分離管に、発光キットのプロトコールに応じて操作してそれを混合し、ニトロセルロース膜に加え、化学発光イメージャーで発色させた。

【0059】

腫瘍細胞は、主に代謝の変化により、その異常増殖及び転移に必要なエネルギーを維持するが、代謝速度の変化は、主に、代謝過程の重要な遺伝子発現レベルを調節することにより実現され、ここで、解糖代謝及びグルタミド代謝の変化は、特に重要である。図３から分かるように、ＦＧＦ２１注射後に、腫瘍糖代謝の重要なタンパク質ＨＫ２（ヘキソキナーゼ２）、ＰＫＭ２（ピルビン酸キナーゼ）、ＰＦＫＰ（ホスホフルクトキナーゼ）、ＰＤ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ酵素）、ＧＰＤ（グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）（図３Ａ）、グルタミド代謝関連タンパク質ＧＬＳ（グルタミナーゼ）（図３Ｂ）を顕著に阻害することができ、これらのタンパク質は、腫瘍の異常増殖において顕著に高発現し、様々な薬物がこれらのタンパク質を標的して阻害した後に、結腸がんを顕著に改善することができ、これらの重要なタンパク質の発現に対するＦＧＦ２１の阻害は、ＦＧＦ２１の結腸・直腸がんに対する治療効果をさらに示すとともに、結腸・直腸がん細胞に対するＦＧＦ２１の抗腫瘍効果が主に解糖とグルタミド代謝による阻害作用であることを示す。

【0060】

発明者らは、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～５に示されるＦＧＦ２１タンパク質の融合タンパク質の、結腸・直腸がんの治療における効果を研究し、その結果により、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２～５及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１～１４のいずれかに示されるＦＧＦ２１融合タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるＦＧＦ２１タンパク質に相当する効果を有することを示す。

【0061】

は以上のように本発明、好ましい実施例で開示されているが、それは、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、様々な修正及び改変を行うことができ、したがって、本発明の権利範囲は、特許請求の範囲によって規定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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【国際調査報告】