特表 2022-539996 腫瘍変異負荷の増加を検出するための方法および遺伝子変異パターン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-14

(54)【発明の名称】腫瘍変異負荷の増加を検出するための方法および遺伝子変異パターン

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20220907BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220907BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z ZNA

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576337

(86)(22)【出願日】2020-07-10

(85)【翻訳文提出日】2022-01-28

(86)【国際出願番号】 EP2020069639

(87)【国際公開番号】W WO2021005233

(87)【国際公開日】2021-01-14

(31)【優先権主張番号】19185822.4

(32)【優先日】2019-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514306342

【氏名又は名称】バイオカーティス エヌベー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100124453

【弁理士】

【氏名又は名称】資延 由利子

(74)【代理人】

【識別番号】100135208

【弁理士】

【氏名又は名称】大杉 卓也

(74)【代理人】

【識別番号】100183656

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 晃

(74)【代理人】

【識別番号】100224786

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 卓之

(74)【代理人】

【識別番号】100225015

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 彩夏

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン デ ヴェルデ，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】デ クレーヌ，ブラム

(72)【発明者】

【氏名】ズウォリンスカ，アレクサンドラ，カタルジーナ

(72)【発明者】

【氏名】ザオ，フーイ

(72)【発明者】

【氏名】ランブレヒト，ディエザー

(72)【発明者】

【氏名】メルテンス，ゲールト

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA08

4B063QA17

4B063QQ08

4B063QQ43

4B063QR08

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明の分野は、一般にがんに関し、がんの診断、予後、および治療のための方法を含む。特に、本発明の分野は、シトシンまたはグアニジンの変化を含む点突然変異のユニークなセットの新規変異パターン、ならびに、腫瘍変異負荷(TMB)が増加した腫瘍サンプルを同定するための新規変異パターンに基づく方法、システム、およびそのコンポーネントに関する。該変異パターンと該方法、システム、およびそのコンポーネントの両方を利用して、免疫チェックポイント阻害療法に効果的に反応するがん患者、特にマイクロサテライト安定がん患者を特定することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

患者から得られたサンプルにおける腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を分析するための方法であって、該方法はシトシンまたはグアニンの他の核酸塩基への変化の存在についてＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの少なくとも４つの異なるゲノム部位を試験することを含むものであって、該変化の少なくとも１つの存在の検出は腫瘍変異負荷（TMB）の増加を示す、方法。

【請求項2】

表１からの少なくとも４つの異なるゲノム部位は、
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置
から選択されるものである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

表１からのchr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

表１からのchr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

表１からのchr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；または
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置の２つの部位のうち少なくとも１つでの変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

表１からのchr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置; および
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置の２つの部位の両方での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

表１からのchr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

表１からのchr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

表１からのchr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置での変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

表１からの以下の部位：
chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置；
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；
chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置、
における変化の存在を試験することを含む、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

表１からの以下の部位：
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置；
chr9 5968511、KIAA2026遺伝子内に位置；
chrX 74519615、UPRT遺伝子内に位置；
chr6 31779382、HSPA1L遺伝子内に位置；
chr19 52825339、ZNF480遺伝子内に位置；
chr3 370022、CHL1遺伝子内に位置；
chr18 53017619、TCF4遺伝子内に位置；
chr6 101296418、ASCC3遺伝子内に位置；
chr2 9098719、MBOAT2遺伝子内に位置；
chr19 12501557、ZNF799遺伝子内に位置；
chr18 54281690、TXNL1遺伝子内に位置；
chr16 68598492、ZFP90遺伝子内に位置；
chr10 128908585、DOCK1遺伝子内に位置；
chr1 78428511、FUBP1遺伝子内に位置；
chrX 119678368、CUL4B遺伝子内に位置；
chr8 53558288、RB1CC1遺伝子内に位置、
における１以上の変化の存在を試験することをさらに含む、請求項２～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

表１からの以下の部位：
chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置；
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；
chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置；
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置、
における変化の存在を試験することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

POLEのホットスポット P286R変異またはホットスポット V411L変異の存在を試験することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

患者から得られたサンプルにおける腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を分析するための方法であって、該方法は表１からのGRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる以下の異なるゲノム部位：
chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置；
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；
chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；
chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
の少なくとも４つにおいて、POLEのホットスポットP286R変異またはホットスポットV411L変異の存在、およびシトシンまたはグアニンのその他の核酸塩基への変化の存在について前記サンプルを試験することを含むものであって、
該変化の少なくとも１つの存在の検出、または、いずれかのPOLEのホットスポット変異の存在の検出は腫瘍変異負荷（TMB）の増加を示す、方法。

【請求項15】

表１からの以下の部位：
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置；
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置、
における１以上の変化の存在を試験することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

POLEのさらなる変異の存在、および／またはEXO1および／またはMUTYHの変異の存在についてサンプルを試験することをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

POLEのさらなる変異が以下の１つ以上である： T1104M、A1967V、H144Q、S1644L、A456P、R1233、T2202M、P436R、R705W、S459F、S297F、A189T、P436R、L1235I、R1371、D213A、P135S、A456P、K777N、F367S、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

サンプル中のマイクロサテライト不安定性（MSI）の存在を分析することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

サンプルがマイクロサテライト安定（MSS）である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

サンプルが免疫療法に対するレスポンダーとして得られた患者を分類する工程をさらに含み、好ましくは、PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、および／またはLAG3から選択される少なくとも１つに対して特異的な抗体による治療を含む免疫療法である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

DNAサンプルにおいて、GRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの４つ以上のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの他の核酸塩基への変化を検出することを含む方法であって、検出は、ＤＮＡサンプルの少なくとも一部を増幅し、および増幅された部分を配列決定して変化を検出することを含む、方法。

【請求項22】

以下の４つのゲノム部位：
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置、
における変化を検出することを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

変化の検出が、
(a) DNAサンプルを増幅して、以下の４つのゲノム部位：
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置、
を含むDNAアンプリコンを調製すること、ならびに
(b) 変化を検出するためにDNAアンプリコンを配列決定すること、
を含む、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項24】

DNAサンプルは、がん患者から得られるものであり、および、がん治療のために患者に投与することをさらに含み、任意で、免疫療法で患者に投与することを含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

DNAサンプルにおいて、ＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの４つ以上のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの任意の他の核酸塩基への変化を検出するための試薬を含むシステムであって、該試薬は、DNAサンプルの少なくとも一部を増幅するためのコンポーネント、および変化を検出するために増幅された部分を配列決定するための試薬を含む、システム。

【請求項26】

試薬が、以下の４つのゲノム部位：
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置、
を含むDNAサンプルの少なくとも一部を増幅するためのコンポーネント、および、該ゲノム部位を配列決定するためのコンポーネントを含む、請求項２５に記載のシステム。

【請求項27】

（ｉ）システムへのサンプルの受け取りおよび／または輸送、
（ｉｉ）１つ以上のコンポーネント、試薬、および／またはツールをサンプルに追加すること（例えば、表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のPCRおよび／または配列決定を実行するための１つ以上のコンポーネント、試薬、および／またはツール）、
（ｉｉｉ）サンプルのPCRを実行すること、
（ｉｖ）PCR産物（例えば、表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のPCR産物）の検出、
（ｖ）表１にリストされている少なくとも４つ以上のゲノム部位の配列決定、および
（ｖｉ）表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のヌクレオチドを示すレポートを作成すること、
から選択される１つ以上のタスクを実行するためのシステムの機械的コンポーネントを実行および／または作動させるようにプログラムされたハードウェアプロセッサをさらに含む、請求項２５または２６に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野は、一般にがんに関し、がんの診断、予後、および治療のための方法を含む。特に、本発明の分野は、シトシンまたはグアニジンの変化を含む点突然変異のユニークなセットの新規変異パターン（signature）、ならびに、腫瘍変異負荷（tumor mutationalburden (TMB)）が増加した腫瘍サンプルを同定するための新規変異パターンに基づく方法、システム、およびそのコンポーネントに関する。該変異パターンと該方法、システム、およびそのコンポーネントの両方を利用して、免疫チェックポイント阻害療法に効果的に反応するがん患者、特にマイクロサテライト安定がん患者（microsatellite stable-cancer patient）を特定することができる。

【背景技術】

【0002】

免疫チェックポイント阻害（ICB: immune checkpoint blockade）療法抗体、例えば、プログラム細胞死タンパク質1 (PD-1)、そのリガンド (PD-L1)、および／または細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4) を標的とするもの、での治療は、印象的な奏効率（response rate）と持続的な病気の寛解をもたらす可能性があることが示されたが、残念ながら、がん患者の一部のみであった。さらに、ICBに効果的に奏功する患者の多くは毒性を経験する可能性がある(非特許文献１)。このように、転移性メラノーマ(非特許文献２)、非小細胞肺がん（NSCLC）(非特許文献３)、尿路上皮がん(非特許文献４)、腎細胞がん(非特許文献５)、および他の多くを含むさまざまな種類のがん患者の全生存率を高めることにICBが目覚ましい成功を収めたにもかかわらず、その潜在的に高い毒性と重篤な副作用のために、効果的に奏功する患者を予測できるアプローチの必要性が高まっている。現在、この必要性は、免疫療法薬の高額な費用と、多くの医療保険会社が処方箋の前払いや払い戻しに消極的であることからもさらに裏付けられている。上記の理由から、ICBへのレスポンダーを特定するためのさまざまな検査や予測アルゴリズムが提案されている。

【0003】

免疫組織化学(IHC)によるPD-L1の検出は、抗PD（L）-1治療の予測因子として広く研究されており、NSCLC、胃／胃食道接合部腺癌、子宮頸癌および尿路上皮癌におけるペムブロリズマブ（pembrolizumab）の食品医薬品局（FDA）承認のコンパニオン診断試験で目の当たりにされたように、特定の状況で有効なバイオマーカーであると考えられており、頭頸部がんや小細胞肺がんなど、他の種類のがんでもある程度の予測能力を示している。しかしながら、PD-L1 IHCは、不完全なマーカーであり、多くの状況で免疫療法の奏功を予測するには決定的ではないと見なされていた(非特許文献６およびそのなかの参考文献)。このため、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の存在(非特許文献７)、Ｔ細胞で炎症を起こした遺伝子発現プロファイル(非特許文献８)、免疫遺伝子発現変異パターン（immune gene expression signature）、または腸内細菌叢の評価 さえも(非特許文献９)を含む代替バイオマーカーが評価されている。

【0004】

がんは、体細胞変異の蓄積と選択が腫瘍の成長と進化を促進する遺伝性疾患であることが現在知られている(非特許文献１０)。問題は、すべての種類のがん、さらにはすべての個々のがんが固有の遺伝的プロファイルを持っていることであり(非特許文献１１) 、そして、特定のアプローチによってそれ自体で標的化可能である、KRAS、BRAF、またはEGFR遺伝子のような検出可能なドライバー変異がしばしば蔓延しているにもかかわらず、それらの検出は通常、がんがICBによる患者の免疫系の活性化にどれほど効果的に反応するかを予測しません。

【0005】

免疫系が正常細胞と形質転換されたがん細胞を区別し、後者を効果的に標的化することを可能にする特に強力なクラスの抗原が、正常なヒトゲノムに完全に存在しないペプチドによって形成されることが蓄積された証拠から示されており、これらの抗原は一般に「ネオアンチゲン（neoantigen）」と呼ばれる。ウイルスの病因を持たないヒト腫瘍の大規模なグループの場合、そのようなネオアンチゲンは、腫瘍特異的な遺伝的変化の発現にのみに起因する(非特許文献１２)。しかしながら、腫瘍DNAの体細胞変異のごく一部のみを翻訳およびプロセシングして、主要組織適合抗原（MHC）分子に負荷され、がん細胞表面に提示され得ると考えられており、Ｔ細胞によって認識され得る体細胞変異はさらに少ないと思われる(非特許文献１３)。したがって、すべてのネオペプチドが事実上免疫原性であるわけではなく(非特許文献１４)、また、少なくともメラノーマでは、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞応答の大部分は、所与の単一の特定の腫瘍に本質的に固有であるペプチドに向けられており、さらに、細胞の形質転換において主要な役割を果たす可能性は低いようである(非特許文献１５)。結論として、この状況のユニークさのため、ネオアンチゲンプロファイリングに基づいてICBへの応答を予測するマーカーを確立することは非常に困難である。しかし、収集されたデータから、腫瘍が一般に蓄積する体細胞変異が多いほど、免疫系に形成されて存在する可能性が高いT細胞誘導抗原が多いというこの概念を確認することは一貫性がある。その結果、腫瘍ゲノム内に蓄積された体細胞の遺伝的ミスの数の一般的な推定は、腫瘍ネオアンチゲン負荷の有用な推定を表すものとして現在広く認識されている。

【0006】

２０１８年、マイクロサテライト不安定性（MSI）の存在または腫瘍変異負荷（TMB、腫瘍変異ロードまたはTMLとしても知られる）の増加のいずれかとして現れる、この腫瘍特異的な遺伝的ミスの蓄積の重要性は、いくつかのがんにおける免疫療法の優れた指標としてそれらをマークすることにより、FDAによって認められた(非特許文献１６)。重要なことに、いわゆるマイクロサテライト不安定性高（MSI-H）がん患者における抗PD-1療法のFDA承認は、組織にとらわれない最初の薬剤承認であり、汎がん治療のための初めてのFDA承認のコンパニオンバイオマーカーアッセイだった。これは、組織特異的な治療の焦点から、個別化された遺伝的適応症に依存し、適応症が存在する事実上すべてのがんに適用できる、よりグローバルなアプローチへのがん分野における特に重要なパラダイムシフトを示している。

【0007】

MSIは、DNAミスマッチ修復（MMR）機構の障害に起因する多数のDNA複製エラーのゲノムワイドな蓄積である。これらのエラーは、繰り返し単位の欠失または挿入（別名「インデル（indel）」）による、単一およびジヌクレオチド反復配列、たとえば（A）nまたは（CA）n内のヌクレオチド数の変化として具体的に観察できる。それは結腸直腸癌（CRC）症例の実質的なサブセットで観察されるものであって、MMR遺伝子の欠損は、腫瘍形成と疾患の進行にとって極めて重要であることが知られている。事実、MSI-H CRCを患う単一のスーパーレスポンダーの発見は、MSI HまたはMMR欠損固形腫瘍の患者におけるペムブロリズマブの臨床試験の成功と、このバイオマーカーで定義された（以前はそうであったように、組織で定義されたものではない）患者グループにおけるペムブロリズマブの迅速な承認にすぐにつながった。 (非特許文献１７)。

【0008】

効果的な免疫療法の指標としてのMSI-Hの信頼性は、MSI特異的なゲノム内のインデル型変異の蓄積の増加が、ネオアンチゲン配列をコードする新規のオープンリーディングフレームの生成と相関するという発見によってさらに裏付けられている(非特許文献１８)。後者は、MSI-H腫瘍が自然に高いリンパ球浸潤を示し、その結果、少なくとも５つの免疫チェックポイント分子の増加したレベルの発現を選択する理由を説明する可能性があり(非特許文献１９)、それは治療チェックポイント阻害剤の正確な標的である。これと、腫瘍のMSI検出に利用できる試験と診断標準が存在するという事実には、たとえば、最初のベセスダパネル（Bethesda panel）とその派生物、または新規の短いホモポリマーマーカー(特許文献１および特許文献２に記載)に基づく、より最近の非常に高感度で高速なDNAベースのBiocartis NVによるIdylla（商標）MSIアッセイが含まれ、これにより、MSIは、MSI-H腫瘍が比較的頻繁に発生する結腸直腸がんおよび子宮内膜がんだけでなく、他の多くの種類のがんに対しても推奨される一次スクリーニングツールの現在のポジションになった。

【0009】

多くのMSI-H腫瘍の別の組織病理学的特徴は、一般的に腫瘍変異負荷またはロード（TMBまたはTML）の増加である。TMBは、MMRとは異なる可能性のあるDNAサーベイランス経路を無効にする腫瘍による選択に起因する非常に興味深い現象である。その結果、マイクロサテライト安定性（MSS）である多くのがん、特にメラノーマおよび非小細胞肺癌（NSCLC）で観察されている。例えば、MSI-H固形腫瘍の患者の大多数もTMBが高いが、TMBが高い患者の16％のみがMSI-Hであると推定された(非特許文献２０)。重要なことに、TMBはネオアンチゲン負荷を推定するのに非常に有用と考えられており、したがって、患者、特に、MSI検査では特定できない高TMBのMSS腫瘍を患う患者でも、効果的に免疫療法の恩恵を受ける患者を特定する大きな可能性を秘めている(非特許文献２１)。

【0010】

例えば、MSI-HはNSCLCでは非常にまれで、TMBの上昇が比較的頻繁に観察されるが、MSI-H腫瘍の変異数の中央値ほど高くはなく、エクソームあたり数千に達することがよくある(非特許文献２２)。小細胞肺がん（SCLC）、NSCLS、および尿路上皮がんの所見の比較から、ICBの良好なレスポンダーを選択するためのTMBの閾値は、約200のミスセンス変異であり、Foundation One試験ではメガベースあたり10以上の変異（mut/Mb）に相当し、またはMSK-IMPACT試験では≧7 mut/Mbに相当することが示される(非特許文献２３; 非特許文献２４; 非特許文献２５)。興味深いことに、NSCLCにおいてアテゾリズマブ治療に16.2 mut/Mbに等しいTMBのより高い閾値を適用するか(非特許文献２６) 、またはイピリムマブ／ニボルマブ治療に15 mut/Mbを適用しても(非特許文献２７)有効性は増大しなかったが、これは、腫瘍におけるICB応答性抗原の選択の機能的背景を示唆している。上記を考慮すると、MSS腫瘍におけるTMBの増加は、良好なレスポンダーを特定するために大規模である必要はなく、より高いTMBで免疫に有効なネオアンチゲンを表示する可能性が高いことを示す兆候が存在する(非特許文献２８)。

【0011】

ICBレスポンダーを定義するために正確なTMB閾値を設定するためのがん治療分野における現在の主な課題の１つは、サービスプロバイダーと使用されるTMB推定方法に応じて、TMBカウントが大幅に異なることです。当初、TMBは、生殖細胞系列の変異（variation）を除外し、腫瘍が獲得した体細胞変異のみを捕捉するために、正常なDNAと一致する腫瘍DNAの全エクソームシーケンシング（WES）によって決定された(非特許文献２９)。結果は体細胞変異の総数として報告され、インデルが含まれる場合と含まれない場合がある。WESは、エクソンのTMBを測定する最良の方法であると今でも信じられているが、残念ながら、そのコストと複雑さのため、臨床診療では、多かれ少なかれ厳密な近似アプローチにとってかわられ、研究だけの調査ツールにとどまっている。例えば、臨床での一般的なアプローチには、Foundation MedicineのF1CDxパネルやMSKCC MSK-IMPACTパネルなどの標的NGSパネルの使用が含まれ、これらは両者とも、さまざまな公開された研究でICBの予測能力を示し、その結果、米国FDAによって承認されている。F1CDxは、TMBを、例えば、パブリックおよびプライベート変異データベースとの比較による生殖細胞系列イベントの除外を含む、さまざまなフィルターやその他の数学関数を適用した後、パネル遺伝子のコーディング部分でキャプチャされた置換の数に基づいて、同義(synonymous)変異および非同義変異(non-synonymous mutation)／メガベース（mut/Mb）の総数として定義する。MSK-IMPACTは、腫瘍と生殖細胞系列の両方のDNAからのパネル遺伝子のシーケンスからのデータを使用して、非同義変異に焦点を当てている。より多くのアプローチが存在し、それらはすべて、NGS標的遺伝子パネルでカバーされるゲノムサイズ、シーケンスの深度、カバーされる変異タイプ、読み取りの長さ、カットポイントまたはフィルター、および変異コーリング（variant calling）中に適用されるその他の数学関数、アライナー（aligner）の選択などの変数が異なる。この変動性の結果として、最終的に報告されるTMBレベルは、使用される推定方法に応じて必然的かつ頻繁に非常に大幅に変動する。

【0012】

上記、およびさらにいくつかの分析前の要因（サンプル固定アーティファクトおよびNGSライブラリー調製戦略などを含む）がTMBカウントの最終報告に影響を与える可能性があるという事実から、現在、特に臨床的に関連する可能性のあるより低いTMB範囲では、TMB評価に大きな矛盾が存在します。その結果、TMB分類に統一された一般的に適用可能な意味のある閾値を設定することは現在不可能に近い。望ましい代替案は、TMB表現型を直接引き起こす遺伝子の突然変異の存在を直接試験することである。残念ながら、考えられるすべての根本的なメカニズムに関する知識の現状は、我々が関与していると信じている遺伝子においては言うまでもなく、プロセスに関与している可能性のあるすべての遺伝子を定義することは不十分である可能性があり、表現型を引き起こす的確な突然変異については、まだ多くの情報が欠落している。例えば、p53経路やポリメラーゼεおよびδ(非特許文献３０; 非特許文献３１)、DNA校正機構、前述のMMRを含む、DNA複製の忠実度の維持に関与するメカニズムに加えて、メラノーマのUV光から、NSCLCのタバコ発がん物質(非特許文献３２)、APOBECシチジンデアミナーゼファミリーに関連する変異(非特許文献３３)まで、または、耐性のある創発腫瘍（emergent tumor）サブクローンにおける細胞毒性化学療法後に発生するもの(非特許文献３４)など、TMBの原因と報告されている他の要因が多数存在する。その結果、TMB関連の基礎となる経路の予想される多要素の性質と複雑さ、および関与する正確な原因となる突然変異を考えると(非特許文献３５)、この分野は、MSIの既存の試験の原則と同様に、TMBの影響を受けた免疫療法レスポンダーのごく一部を捕捉するためのより具体的で定義された「ホットスポット」変異パターンの提供から大きな恩恵を受けるだろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】PCT/EP2013/057516

【特許文献2】PCT/EP2019/051515

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Yuan et al., 2016, J ImmunoTher of Canc

【非特許文献2】Hodi et al., 2010, N Eng J Med

【非特許文献3】Borghaei et al., 2015, N Eng J Med

【非特許文献4】Rosenberg et al., 2016, Lancet

【非特許文献5】Motzer et al., 2015, N Eng J Med

【非特許文献6】Chan et al., 2018, Annals Onc

【非特許文献7】Tumeh et al., 2014, Nature

【非特許文献8】Cristescu et al., 2018, Science

【非特許文献9】Routy et al., 2018, Science; Gopalakrishnanet al., 2018, Science

【非特許文献10】Hanahan and Weinberg, 2011, Cell

【非特許文献11】Ciriello et al., 2013, Nat Gen

【非特許文献12】Schumacher and Schreiber, 2015, Science

【非特許文献13】Coulie et al., 2014, Nat Rev Cancer

【非特許文献14】Snyder and Chan, 2015, Curr Opin Genet Dev

【非特許文献15】Gubin et al., 2014, Nature

【非特許文献16】Goodman et al., 2017, Mol Canc Therap

【非特許文献17】Le et al., 2015, N Eng J Med; Le et al.,2017, Science

【非特許文献18】Turajlic et al., 2017, Lancet

【非特許文献19】Llosa et al., 2014, Canc Discov

【非特許文献20】Chalmers et al., 2017, Genome Med

【非特許文献21】Rizvi et al., 2015, Science; Hugo et al.,2016, Cell

【非特許文献22】Middha et al., 2017, JCO Precis Oncol

【非特許文献23】Antonia et al., 2017, World Conf on LungCanc; Abstract OA 07.03a

【非特許文献24】Kowanetz rt al., 2016, Ann Oncol

【非特許文献25】Powleset al., 2018, Genitourinary Canc Symp

【非特許文献26】Kowanetz et al., J Thoracic Oncol

【非特許文献27】Ramalingam et al., 2018, AACR Ann Meeting,Abstract #1137

【非特許文献28】Segal et al., 2008, Cancer Res

【非特許文献29】Li et al., 2017, J Mol Diagn

【非特許文献30】Korona et al., 2011, Nucl Acids Res

【非特許文献31】Skoneczna et al. 2015, FEMS Microbiol Rev

【非特許文献32】Jamal-Hanjani et al., 2017, N Engl J Med

【非特許文献33】McGranahan et al., 2016, Science

【非特許文献34】Murugaesu et al., 2015, Cancer Discov

【非特許文献35】Chalmers et al., 2017, Genome Med

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

上記の考察された欠点に対処するために、ICBまたは他の免疫療法アプローチの恩恵を受ける可能性のある腫瘍変異負荷が増加した患者の少なくとも一部を捕捉するためのパネルおよびそれに基づく方法を我々はここに初めて提案する。本明細書で提案する方法の利点は、MSI/MMR欠損アッセイや、特定のホットスポットPOLE/POLD1変異を対象とした補完的な試験などの既存の標準アッセイでは見逃される可能性がある、マイクロサテライト安定（MMS）患者における（ポリメラーゼεの触媒サブユニットをコードする）POLE遺伝子機能の欠損を連想させるゲノム瘢痕変異パターン暗示（genomic scarring signature reminiscent）を示す腫瘍サンプルを捕捉することである。さらに、本明細書で提示された変異パターンは、EXO1遺伝子およびMUTYH遺伝子の突然変異など、他の修復メカニズムの摂動に起因する可能性のあるTMBの増加を伴うケースも捕捉する。そしてまた、TMBが上昇した症例が検出されたが、修復欠損の明らかな根本的なメカニズムは示されていない。これらおよび他の特徴および利点は、本明細書でさらに説明される。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本明細書では、患者から得られたサンプル中の腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を分析するための方法、システム、およびそのコンポーネントが開示される。前記開示された方法およびシステムは、典型的には、シトシンまたはグアニンの任意の他の核酸塩基への変化の存在について、表１のＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる少なくとも４つの異なるゲノム部位を試験するために利用されるものであって、変化の少なくとも１つの存在の検出は、腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を示す。

【0017】

前記開示された方法、システム、およびコンポーネントは、さらに、本明細書で定義されるように腫瘍変異負荷が増加しているがん患者などの患者を治療するために利用され得る。治療法には、抗PD1、抗PD-L1、および／または抗細胞毒性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）療法などの免疫療法の実施、化学療法の実施、放射線療法の実施、および／または患者の腫瘍組織の手術または切除の実施が含まれてよい。

【0018】

例として、患者から得られたサンプルにおける腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を分析するための方法、システム、およびコンポーネントを提示する。前記方法、システム、およびコンポーネントは、ゲノム試験部位において、シトシンまたはグアニンのアデニンまたはチミンなどの他の核酸塩基への変化の存在について前記サンプルを試験することを含む。いくつかの実施態様において、前記開示された方法、システム、およびコンポーネントは、ＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされ、および表１にリストされる、少なくとも４つの異なるゲノム部位、例えば、
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置、
における変化の存在について前記サンプルを試験することを含むものであって、シトシンまたはグアニンの少なくとも１つの変化の存在の検出は、腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を示す。

【0019】

異なるゲノム部位でのヌクレオチドの同一性を決定する試薬とサンプルを反応させることにより、異なるゲノム部位の少なくとも１つにおける変化の存在についてサンプルを試験することができる。適切な試薬には、変化の部位に隣接する配列でハイブリダイズし、および変化を含むポリヌクレオチドサンプルを増幅および調製するために使用することができるプライマーが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、前記プライマーを利用して、変化部位を含み、および長さが少なくとも約50、100、150、200、または250ヌクレオチドのサイズを有する（または、長さ50～150ヌクレオチドのような、これらの値のいずれかによって制限される範囲内のサイズを有する）アンプリコンを調製することができる。

【0020】

適切な試薬は、ヌクレオチドサンプルを配列決定し、異なるゲノム部位でヌクレオチドを同定するためのプライマーを含み得る。適切なプライマーは、シトシンまたはグアニンの変化の部位に隣接する位置で、例えば、変化の上流（または下流）の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100ヌクレオチドの位置で（または、変化の上流または下流の10～50ヌクレオチドのような、これらの値のいずれかで囲まれた範囲内の位置で）ハイブリダイズしてよい。

【0021】

さらなる例において、前記開示された方法、システム、およびコンポーネントは、TMBの増加を示す可能性がある、本明細書に開示される追加のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの変化の存在についてサンプルを試験することを含む。

【0022】

さらなる例において、前記開示された方法、システム、およびコンポーネントは、マイクロサテライト安定性（MSS）としての腫瘍サンプルのMSIステータス試験を決定するために、腫瘍サンプルを試験することを含む。さらなる態様において、前記開示された方法、サンプル、およびコンポーネントは、腫瘍サンプルを試験すること、および該腫瘍サンプルがＰ２８６ＲおよびＶ４１１Ｌから選択されるＰＯＬＥホットスポット変異を含むかもしくは欠くかを決定することを含む。

【0023】

本明細書に開示されたシステムは、本明細書に開示される方法を実行するためのコンポーネントを含む自動化されたシステムを含み得る。任意で、開示されたシステムは、本明細書に開示された方法を実行するための適切な構造および／または試薬に適合され、および／またはそれらを含む器具およびカートリッジを含む。同様に、開示された方法を実行するための試薬を含み、およびそのような自動化されたシステムの一部として動作可能なカートリッジがさらに提供される。

【0024】

さらなる態様において、TMB検出における開示された方法、カートリッジ、およびシステムの使用がさらに開示される。

【0025】

さらに別のこれに限定されない態様において、本明細書に提示される方法、カートリッジ、およびシステムの追加の使用は、腫瘍サンプルが得られた患者ががん免疫療法治療を受けるべきかどうかを決定する際に提供される。後者の例としては、PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、またはLAG3の標的の少なくとも１つに特異的な抗体を含む免疫チェックポイント阻害（ICB）療法があり得る。すなわち、前記開示された方法、システム、およびコンポーネントは、それを必要とする患者にがん免疫療法治療を施すことを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0026】

より完全な理解のために、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照されたい。

【0027】

【図1】図１は、さまざまなカテゴリーのTCGA-UCEC腫瘍のTMBを示す。赤い丸は、POLD1変異があるが、POLE変異がない３つのサンプルを示す。

【図2】図２は、さまざまなカテゴリーのTCGA-COAD腫瘍のTMBを示す。３つのPOLD1変異サンプルには、ベースラインTMBがある。

【図3】図３は、さまざまなカテゴリーのTCGA-COAD腫瘍のTMBを示す。３つのPOLD1変異サンプルには、ベースラインTMBがある。

【図4】図４は、さまざまなカテゴリーのTCGA-non-UCECおよびnon-COAD腫瘍のTMBを示す。

【図5】図５は、さまざまなカテゴリーのTCGA-UCEC腫瘍のTMBを示す。丸は、TCGAのすべてのUCECサンプルに最初の３４マーカーパネルを遡及的に適用することによって同定された８つのMSS POLE非ホットスポット変異サンプルをカバーしていることを示す。

【図6】図６は、最初に同定された３４マーカーの間の共出現、たとえばRB1CC1およびBRWD3は、１つの共出現を有することを示す。

【図7】図７は、データセット内のサンプルを取得する機能（function）に応じた、ランダムに選択された４つのマーカーの10,000個のサブセットの分布ヒストグラムを示す。ランダムに選択された４つのマーカーパネルの場合、観察されるサンプルの最大数は1回で４３であり、中央値は３０である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本明細書に記載される実際の用途は、腫瘍変異負荷（TMB）が増加した腫瘍サンプルを同定することができる、POLE機能欠損の変異パターンを検出するためのマーカーパネルの同定に基づいており、したがって、腫瘍サンプルの由来となった患者が、免疫チェックポイント阻害（ICB）免疫療法などのがん免疫療法に効果的に反応する可能性があるかどうかの指標も提供する。本明細書に提示されるマーカーパネルおよび方法の利点は、たとえTMBが増加したサンプルがマイクロサテライト安定（MSS）であるか、および／またはホットスポットPOLE変異がないとしても、TMBが増加したサンプルを効果的に同定すると考えられる事実に由来する。その結果、本明細書に提示されたパネルおよび方法は、ICBの恩恵を受けることができるが、他の現在利用可能なスクリーニング検査では見逃されている少なくともいくらかの患者を同定するための入り口を開くと見なすことができる。

【0029】

本明細書に提示されたパネルは、TCGAデータベースにリストされた全エクソームシーケンシング（WES）の結果から入手可能なMSS POLEホットスポットが確認された子宮内膜がん（UCEC）記録からの３４の再発性（recurrent）の高い遺伝的変異の初期同定に基づいている。３４の再発性変異体は、シトシンまたはグアニンのチミンまたはアデニンまたはおそらく他の任意の核酸塩基への変化（すなわち、突然変異）を含み、以下の表１に提供されるものにリストされるものであって、それらは、GRCh37/hg19ヒトゲノムアセンブリ（例えば、UCSCゲノムブラウザhttps://genome.ucsc.edu/を介して現在アクセス可能である）を参照することにより、それらの位置（本明細書でさらに使用される「部位」）によって定義される。明確にするために、グループまたはパネル、または本明細書に開示される３４の再発性変異体（または単に「変異体」）の少なくとも１つ以上を指す場合、分子生物学およびバイオテクノロジーの分野で使用されるそれらの標準的な意味に沿って、本明細書では異なる同義語を使用することができる。これらの同義語には、任意の１つの「変異（mutation）」または「変異（mutations）」（後者は、おそらく説明付き、例えば、「再発性変異」、「新たに同定された変異」、「本明細書に開示された変異」など）、「マーカー（marker）」または「マーカー（markers）」（後者はおそらく説明付き）、「シトシンまたはグアニンの変化の部位(site)」または「シトシンまたはグアニンの変化の部位(sites)」（後者はおそらく説明付き）、「シトシンまたはグアニンの変化(change)」または「シトシンまたはグアニンの変化(changes)」（後者はおそらく説明付き）、または単に、 「変化(change)」または「変化(changes)」（後者は、おそらく説明付き）への言及が含まれる。これらの新たに同定された変異をより明確に定義するために、表１には、変異体を定義する変化部位が位置する遺伝子の名前、および変化が遺伝子産物に引き起こす突然変異のタイプも示されている。例えば、「ストップ獲得(stopgain)」は、中途の(premature)終止コドンをもたらす変異のタイプを指し、すなわち、「ストップが獲得された(a stop was gained)」ものであり、翻訳の終了を意図する。このように、「非同義SNV」と記された変異のタイプは、ミスセンス変異、すなわち、産物タンパク質に異なるアミノ酸が生成されるようにコドンを変化させる核酸塩基変異によって引き起こされる一塩基多型（singlenucleotide variant :SNV）を指す。さらに、表１は、（最も一般的なmRNA変異体の開始コドンから開始する）遺伝子のコード配列（CDS）における正確な核酸塩基またはヌクレオチド（nt）変異の変化、遺伝子のタンパク質産物（「X」はトランケーションを示す）のアミノ酸（aa）変異、および、最後の列では、変異が発生した部位に隣接する野生型（WT）ゲノム配列（変化部位のntは太字でマークされている）を示す。本明細書では、核酸塩基およびヌクレオチドという用語は、大部分が同義であると見なすことができ、変異変化を受ける可能性のある核酸内の生化学的単位を指す。それらの意味は純粋に生化学的観点からの微妙な差違であり、核酸塩基は核酸の窒素含有複素環式塩基、例えば、アデニン（A）またはグアニン（G）などの二重環プリン、または例えば、チミン（T）、ウラシル（U）、シトシン（C）などの単一環状ピリミジンのいずれかである。逆に、ヌクレオチドは、例えばDNAまたはRNAの核酸バイオポリマー分子鎖を構築する実際のモノマーであり、各ヌクレオチドは、核酸塩基、5炭素ペントース糖（DNAのデオキシリボースまたはRNAのリボース）、および リン酸基から構成される。表１の最後の列では、変異した変異体の位置にあるWT塩基は、常にヌクレオチド数20で示され、すなわち、変化部位の上流に19 nt（ヌクレオチド）が提供され、および下流に20 ntが提供される。注目すべきことに、CDSのnt変化の詳細を示す列からわかるように、影響を受ける核酸塩基は常にシトシン（C）またはその相補的なペアリング核酸塩基グアニン（G）である。さらに珍しいことに、再発性変異体はすべて、非常に類似した配列コンテキストでのCまたはG変異で構成されている。すなわち、同定された34の再発性変異体のうち33は、トリヌクレオチド配列TTCまたはその相補的GAA内で発生する（配列は常に5 '-> 3'方向に提供され、再発性変異体で変異するヌクレオチドに下線）。さらに、それらの23は、TTCGAまたはその相補鎖TCGAAの同じ5 ntストリップシーケンス内で発生する（変化部位に下線）。この発見は、POLE欠損の変異パターンに関する従前の報告と一致し (Shinbrot et al.,2014, Genome Res) および本明細書で同定されたPOLE瘢痕変異パターンの変異体の特異性を強調する。興味深いことに、変化の79.4％は、シトシンからチミンへの変化に関するものであり（C-> T、DNAではグアニンからアデニン（G-> A）への変化と同じであり、変異が与えられたどちらのDNA鎖が読み取られるかに応じる）、一方、残りの20.6％は、C-> AまたはG-> Tに関係している（変異が読み取られるDNA鎖に応じる）。

【表1】

【0030】

次に、TCGA-MSS-UCECサンプルで最初に同定されたシトシンまたはグアニンの再発性34の変化は、TCGAデータベース内のすべての腫瘍記録に対して試験され、詳細については、実施例のセクションで続けて説明する。この分析の結果、さまざまな腫瘍から82のサンプルが取得され、詳細は、表２に提供される （表中、「MSS」 =マイクロサテライト安定；「MSI-L」または「MSI-H」= MSI 陽性； 「ホットスポット(Hotspot)」- POLEホットスポット変異の存在；「POLE」= POLE 非ホットスポット変異の存在；「EXO1」= EXO1変異の存在；「MUTYH」 = MUTYH変異の存在、 「NA」= データなし、すなわち、TCGAに示されない目的の変異の存在；インデルを含まない、置換/Mbとして表されるTMB）。

【0031】

興味深いことに、これらのサンプルのうち56個は、TCGAでTMB>300置換/メガベース(subst/Mb)として注釈が付けられ、ハイパーミューテーター(hyper-mutator)表現型またはhyperTMB（「HYPER」）を持っているとラベル付けした。さらに、64個はTMB > 200 subst/Mb (上限の高(upper-end high)TMBまたは「high +」以上)、72個はTMB > 100 subst/Mb (中領域高(medium-range high)または「high」以上)、および 7個はTMB < 50 subst/Mb (TMBの増分が中増加および低増加（medium and low increment）と分類された；「med incr」および「low incr」)。サンプルのうち55個はMSS、66個はPOLE遺伝子に変異があり（そのうち44個のサンプルはPOLEホットスポット(Hotspot)変異があった）、6個はEXO1変異が陽性であったが、4個はMUTYH変異が陽性だった。上記のすべては、DNAサーベイランスメカニズムのいずれかで摂動(perturbation)のあるサンプル、特にMSI試験またはホットスポットPOLE変異の試験では検出できないサンプルを検出するための有望な特異性を示唆する。注目すべきことに、パネルのマーカーは、多くの場合MSSサンプルであり、高いサンプル、特にhyperTMBの影響を受けたサンプルを同定するのに驚くほど効率的であるように見え、現在のスクリーニング試験では見逃されるであろうICBに対する有効なレスポンダーの割合を同定するための大きな可能性を秘めている。特に、変異した変異体の数とTMBのレベルの間に相関関係がないように見えるが（図２で後述）、これは、各変異マーカーは、それ自体ですでにサンプル中のTMBの増加を予測することができることを意味する。

【表2】

【0032】

TMBの増加に特に関連する34個の一塩基多型の発見は予想外である。TMBの増加は、DNAの複製と修復の欠陥によって引き起こされると予想され、変異はがん細胞のゲノム全体にランダムに広がり、散在すると予想される。今日、TMBの増加は、約1Mbのカバレッジで数百のアンプリコンを配列決定することによって評価する必要があり(Buettner et al., 2019, ESMO Open Canc Horiz)、大きなシーケンス容量を必要とする。したがって、34個のSNVのそれぞれがそれ自体でTMBの上昇を予測するという発見は驚くべきことであり、複製および修復の欠損の好ましい標的として34個の遺伝子座、例えば、POLE、EXO1、MUTYH、およびこれまでに同定されていない他のメカニズムを示す。変異パターンはMSSサンプルで観察されるため、MSIまたは欠損MMRとは無関係である。特に、34個のSNVで見つかったTMBレベルの中央値は612 mut/Mbと同等であり、MSIサンプルのTMB中央値と比較して大幅に高く、平均で約47変異/Mbであると報告された(Fabrizio et al., 2018, JGastrointest Oncol)。さらに、TCGAでTMB<10のサンプル数は3529であり、そのうち2つは表１の34個のSNVのうちの１つに対して陽性だった。これは、34マーカーのそれぞれがTMBの増加と非常に高い特異性と強い関連性を持っていることを示唆しており、その結果、さらに臨床使用への応用を提唱する。標的の数が少ないため、本明細書で同定されたマーカーは、さまざまな診断アプリケーションでTMBの増加の検出に効率的に使用できる。これらには特に、免疫療法への応答の主要な候補であると予想される、増加したTMBが陽性のがん患者を同定するために、はるかに高いNGS容量を必要とせずに、PCRベースの検出または既存のNGSパイプラインへの34遺伝子座の追加が含まれる 。

【0033】

上記を考慮して、患者から得られたサンプル中の腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を分析するための方法、システム、およびコンポーネントが提供され、GRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１のゲノム部位の少なくとも１つに、シトシンまたはグアニンの他の核酸塩基（たとえば、チミンまたはアデニン）への変化が含まれており、そのような変化の少なくとも１つの存在の検出は、腫瘍変異負荷（TMB）の増加を示すものである場合、該方法、システム、およびコンポーネントは、腫瘍変異負荷（TMB）を有するものとしてサンプルを分類することを含むものである。可能な実施態様において、シトシンまたはグアニンから他の核酸塩基への変化は、シトシンからチミンまたはアデニンへの変化、およびグアニンからアデニンまたはチミンへの変化から選択される。さらなる態様において、シトシンまたはグアニンから他の核酸塩基への変化は、シトシンからチミンへの変化およびグアニンからアデニンへの変化から選択される。

【0034】

例えば、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、患者から得られたサンプル中の腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在について分析することを含んでよい。いくつかの態様において、該方法、システム、およびコンポーネントは、変異の少なくとも１つの存在の検出は、腫瘍変異負荷（TMB）の増加を示す、シトシンまたはグアニンのその他の核酸塩基（例えば、チミンまたはアデニン）への変化の存在について、表１のGRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる少なくとも４つの異なるゲノム部位を試験することを含んでよい。可能な実施態様において、シトシンまたはグアニンから他の核酸塩基への変化は、シトシンからチミンまたはアデニンへの変化、およびグアニンからアデニンまたはチミンへの変化から選択される。さらなる実施態様において、シトシンまたはグアニンから他の核酸塩基への変化は、シトシンからチミンへの変化およびグアニンからアデニンへの変化から選択される。

【0035】

本明細書において使用されるTMBの増加という用語は、正常な、すなわち非腫瘍サンプル、通常は同じ患者からの正常な組織適合サンプルを参照した、腫瘍変異負荷または腫瘍突然変異ロード（それぞれ、TMBまたはTML）の増加として解釈されるべきである。TMB値は、使用する推定方法に大きく依存するため（WESまたは標的が強化されたNGSも、推定に含まれる変異および機能に依存する）、本明細書で提供される例示的な値は、TCGAから取得された注釈と一致しており、同義および非同義の置換/Mbを含むが、インデルは含まない。TCGAで定義されているTMBに関して、本明細書で提示されている方法は、4.5を超える置換/Mbを示すものとして定義されるTMBの増加の存在を示すことができると想定することができる。しかしながら、表１から選択された変異体および様々なスクリーニング閾値の状況依存の適用に応じて、可能な実施態様では、TMBの増加は、10を超える置換/Mb、50を超える置換/Mb、またはおそらく100を超える置換/Mbを示すと定義することができる。一つの実施態様では、200を超えるまたは300を超える置換/Mbを示すと定義することができる。

【0036】

表１からの４つのマーカーの例示的な選択は、表２からのすべてのサンプルの以下の数をカバーすることを可能にする。PTEN(i)、BMT2、ATP2B1およびGRM5の場合、44/82の約54％をカバーし、7は高（high）、36はハイパー（hyper）、および1は低増加（low increment）TMBの神経膠芽腫サンプルである。 UCECサンプルの65％がカバーされている。PTEN(i)、BMT2、ATP2B1およびNF1の場合、 82のうち43のサンプルがカバーされる（高（high）9、ハイパー（hyper）34）。またUCECサンプルの65％がカバーされている。上記に沿って、そしてすべての変異体マーカーの個々の強さの推定に基づいて、非常によく一緒に機能する例示的な４つのマーカーが、BMT2遺伝子、ATP2B1遺伝子、NF1遺伝子、およびchr10 89720744に位置するPTEN遺伝子（PTENで２つの再発性変異体が同定されたため、PTEN（i）と呼ばれる）に位置するものであることが見出された。

【0037】

したがって、いくつかの実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、表１の４つ以上の異なるゲノム部位での変化を検出することを含み得るものであり、任意で、表１の少なくとも４つの異なるゲノム部位は、
chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置;
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置;
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置、および .
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置、から選択される。

【0038】

PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1、およびGRM5またはUGT8のいずれかで作られた５つのマーカーパネルの例示的な選択により、表２から50/82サンプルを取得できる（約61％）。詳細には、PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1、およびGRM5のパネルは、高（high）9、ハイパー（hyper）40、低増加（low increment）1（神経膠芽腫）を含む50/82のカバレッジを提供する。この組み合わせのUCECカバレッジは72％である。PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1、およびUGT8の場合、トータルのカバレッジは50/82であり、高（high）11、ハイパー（hyper）39、およびUCECの70%のカバレッジである。したがって、別の可能な実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位：chr11 88338063、 GRM5遺伝子内に位置、での変化の存在をさらに試験することが含まれる。

【0039】

次に、６つのマーカーパネル、例えば、PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1に加えてGRM5、UTG8、HTR2A、またはZNF678のいずれかのパフォーマンスは以下のとおりである。PTEN(i)、BMT2、ATP2B1、NF1、GRM5およびUGT8の場合は、equals 55/82であり、高（high）11、ハイパー（hyper）43、および低増加（low increment）1、 UCECカバレッジは74%である。PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1、GRM5およびHTR2Aの場合、55/82、高（high）10、ハイパー（hyper）42、低（low）2、中（med） 1、UCECカバレッジは78%。PTEN（i）、BMT2、ATP2B1、NF1、UGT8およびHTR2Aの場合は、56/82、高（high）12、ハイパー（hyper）42、低（low）1、中（med）1、およびUCECカバレッジは78%。したがって、別の可能な実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位：chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置、での変化の存在をさらに試験することが含まれる。

【0040】

さらなる実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での変化の存在をさらに試験することが含まれる：
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置、
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置。
上記および他の例示的な７つのマーカーパネルは、以下のカバレッジを有する。(PTEN（ii）と呼ばれるさらなる変異体は、部位：chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置での変異を示す)。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) GRM5 UGT8 HTR2A、60/82、高（high）12、ハイパー（hyper）45、低（low）2 、中（med）1、および全UCECの80%。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) GRM5 UGT8PTEN(ii)、60/82、高（high）11 、ハイパー（hyper）47、低（low）1、中（med）1、UCEC 78%。NF1 BMT2ATP2B1 PTEN(i) GRM5 UGT8 ZNF678、59/82、高（high）12、ハイパー（hyper）46、低（low）1、UCEC 80%。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) GRM5 HTR2APTEN(ii)、59/82、高（high）10、ハイパー（hyper）45、低（low）2、中（med）2、UCEC 80%。NF1 BMT2ATP2B1 PTEN(i) GRM5 HTR2A ZNF678、59/82、高（high）11、ハイパー（hyper）45、低（low） 2、中（med）1 、UCEC 83%。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) GRM5 PTEN(ii) ZNF678、60/82、高（high）10、ハイパー（hyper）48、低（low）1、中（med）1、UCEC 83%。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) UGT8 HTR2APTEN(ii)、60/82、高（high）12、ハイパー（hyper）45、低（low）1、中（med）2 、UCEC 80%。NF1 BMT2ATP2B1 PTEN(i) UGT8 HTR2A ZNF678、59/82、高（high）13、ハイパー（hyper）44 、低（low）1、中（med）1、UCEC 83%。NF1 BMT2 ATP2B1 PTEN(i) UGT8 PTEN(ii) ZNF678、60/82、高（high）12、ハイパー（hyper）47、中（med）1、UCEC 83%。NF1 BMT2ATP2B1 PTEN(i) HTR2A PTEN(ii) ZNF678、58/82、高（high）11、ハイパー（hyper）43、低（low）1、中（med）2、全UCECの80% 。

【0041】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、表１からの次の部位での変化の存在についての試験をさらに含む：chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置 (上記の変異体でPTEN（ii）とさらに呼ばれる)。

【0042】

上記の算出からわかるように、毎回１つのマーカーを追加するたびに、表２のサンプルのカバレッジが向上する。表２のすべてのサンプルをカバーするには、最初に特定された34マーカーではなく19マーカーで十分であることがわかった。この所見によると、代替のパネル（、直接上記の例示的なパネルよりも毎回１つ多いマーカー）は、表２のすべてのサンプルをカバーする19マーカー以上のパネルが達成されるまで、本発明のさらなる例示的な実施形態として提供することができる。

【0043】

次の一実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での変化の存在を試験することがさらに含まれる：chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置。

【0044】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での変化の存在を試験することがさらに含まれる：chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置。

【0045】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での変化の存在を試験することがさらに含まれる：
chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置；
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；
chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置。

【0046】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での１以上の変化の存在を試験することがさらに含まれる：
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置；
chr9 5968511、KIAA2026遺伝子内に位置；
chrX 74519615、UPRT遺伝子内に位置；
chr6 31779382、HSPA1L遺伝子内に位置；
chr19 52825339、ZNF480遺伝子内に位置；
chr3 370022、CHL1遺伝子内に位置；
chr18 53017619、TCF4遺伝子内に位置；
chr6 101296418、ASCC3遺伝子内に位置；
chr2 9098719、MBOAT2遺伝子内に位置；
chr19 12501557、ZNF799遺伝子内に位置；
chr18 54281690、TXNL1遺伝子内に位置；
chr16 68598492、ZFP90遺伝子内に位置；
chr10 128908585、DOCK1遺伝子内に位置；
chr1 78428511、FUBP1遺伝子内に位置；
chrX 119678368、CUL4B遺伝子内に位置；
chr8 53558288、RB1CC1遺伝子内に位置。

【0047】

次の可能な実施態様において、表２にリストされているすべてのサンプルをカバーする19マーカーパネルが使用される。この実施態様によれば、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での変化の存在を試験することが含まれる：
chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置；
chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；
chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置；
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置。

【0048】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、POLEのホットスポット P286R変異またはホットスポット V411L変異の存在を試験することが含まれる。

【0049】

さらに別の一実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、POLE ホットスポット変異を試験することが含まれる。このように、一つの可能性のある実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、患者から得られたサンプルの腫瘍変異負荷（TMB）の増加の有無を分析することが含まれる。開示された方法、システム、およびコンポーネントは、前記サンプルを試験して、表１のGRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる以下の異なるゲノム部位の少なくとも４つにおいて、POLEのホットスポットP286R変異またはホットスポットV411L変異の存在、およびシトシンまたはグアニンのその他の核酸塩基への変化の存在を試験することを含んでよい：chr10 89720744、PTEN遺伝子(PTEN(i)変異体) 内に位置；chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；chr11 88338063、GRM5遺伝子内に位置；chr4 115544340、UGT8遺伝子内に位置；chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；およびchr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；ここで、表１のゲノム部位のいずれかまたはホットスポットPOLE変異のいずれかにおける変化の少なくとも１つの存在の検出は、腫瘍変異負荷（TMB）の増加を示す。

【0050】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１の次の部位での１以上の変化の存在を試験することが含まれてよい：
chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置；
chr10 89624245、PTEN遺伝子内に位置；
chr13 47409732、HTR2A遺伝子内に位置；
chr1 227843477、ZNF678遺伝子内に位置；
chr19 47424921、ARHGAP35遺伝子内に位置；
chr8 121228689、COL14A1遺伝子内に位置；
chr18 50832017、DCC遺伝子内に位置；
chr7 39745749、RALA遺伝子内に位置；
chr11 60468341、MS4A8遺伝子内に位置；
chrX 110970087、ALG13遺伝子内に位置；
chr18 74635035、ZNF236遺伝子内に位置；
chrX 79942391、BRWD3遺伝子内に位置；
chr2 113417110、SLC20A1遺伝子内に位置；
chrX 99662008、PCDH19遺伝子内に位置。

【0051】

代替の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、表１のマーカーの以下の組み合わせのいずれかを使用して、２つのPOLEホットスポット変異P286RまたはV411Lのいずれか１つを試験することが含まれる。カバレッジのそれぞれの結果も提供される：
BMT2 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）10 、ハイパー（hyper）47(73%超え )、57 (75% ) 15超えおよび85 % UCEC。
BMT2 + NF1 + ATP2B1 + PTEN(i) + 2 POLEホットスポット：高（high） 12ハイパー（hyper） 47 (76%超え)、59 (78%) 15超え、 89% UCEC。
NF1 + BMT2 + UGT8 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）14 ハイパー（hyper）46(77% 超え)、60 (79%) 15超え、85 % UCEC
NF1 + BMT2 + GRM5 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）12ハイパー（hyper）47低（low）1 (76%超え)、59 (78%) 15超え、85 %UCEC
BMT2 + NF1 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high） 12ハイパー（hyper） 48(77% 超え)、60 (79%) 15、87 % UCEC
BMT2 + ALG13 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）11 ハイパー（hyper） 48中（med） 1 (77% 超え)、60 (79%) 15超え、85 %UCEC
BMT2 + GRM5 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）10 ハイパー（hyper） 49低（low） 1 (76% 超え)、59 (78%) 15超え、85 % UCEC
BMT2 + BRWD3 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）12 ハイパー（hyper） 48(77% 超え)、60 (79%) 15超え、 85 % UCEC
BMT2 + RB1CC1 + SLC20A1 + PTEN(i) + 2 POLE ホットスポット：高（high）12 ハイパー（hyper） 48(77% 超え)、60 (79%) 15超え、85 % UCEC

【0052】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、POLEのさらなる変異の存在、および／またはEXO1および／またはMUTYHの変異の存在についてサンプルを試験することを含む。

【0053】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、POLEのさらなる変異が以下の１つ以上であるPOLEのさらなる変異の試験を含む： T1104M、A1967V、H144Q、S1644L、A456P、R1233、T2202M、P436R、R705W、S459F、S297F、A189T、P436R、L1235I、R1371、D213A、P135S、A456P、K777N、F367S。

【0054】

いくつかの実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、T1104M、A1967V、H144Q、S1644L、A456P、R1233、T2202M、P436R、R705W、S459F、S297F、A189T、P436R、L1235I、R1371、D213A、P135S、A456P、K777N、F367Sを含むこれらの他のPOLE変異のいずれかを試験することを含み、検出された変異の存在は、TMBの増加を示す。

【0055】

いくつかの実施態様において、開示された方法、システム、および／またはコンポーネントは、サンプルを試験し、サンプル内のゲノム部位でヌクレオチドを同定するためのオリゴヌクレオチド試薬を含み、および／または利用する。適切なオリゴヌクレオチド試薬は、試験されるゲノム部位を含むポリヌクレオチドサンプルを増幅するためのプライマーまたはプライマー対を含み得る。

【0056】

いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド試薬は、ポリヌクレオチドサンプルのゲノム部位に隣接し、ポリヌクレオチドサンプルを増幅し、ゲノム部位（例えば、表１のゲノム部位）を含むアンプリコンを調製するために利用され得るポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするプライマー対を含む。プライマー対は、ゲノム部位を含み、適切なサイズ、例えば、少なくとも約50、100、150、200、または250ヌクレオチド、または50～150ヌクレオチドなどのこれらの値のいずれかで囲まれたサイズ範囲を有するアンプリコンを調製するために、選択された隣接部位でゲノム部位に隣接するポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る。適切なオリゴヌクレオチド試薬は、表１の複数のゲノム部位を増幅するためのプライマー対のセット、例えば、ポリヌクレオチドサンプル中の表１の４つ以上のゲノム部位を増幅するための４つ以上のプライマー対を含み得る。

【0057】

いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド試薬は、ゲノム部位（例えば、表１のゲノム部位）を含むポリヌクレオチドサンプルを配列決定するためのプライマーを含む。このように、プライマーは、ゲノム部位の上流のポリヌクレオチド配列、例えば、ゲノム部位の少なくとも約10、20、30、40、または50ヌクレオチド上流の配列、またはゲノム部位の30～50ヌクレオチド上流の配列など、これらの値のいずれかで囲まれた範囲内にハイブリダイズし得る。その後、プライマーを利用して、ポリヌクレオチドサンプルを配列決定し、ゲノム部位でのヌクレオチドの同定を決定することができる。適切なオリゴヌクレオチド試薬は、表１の複数のゲノム部位を配列決定するためのプライマーのセット、例えば、ポリヌクレオチドサンプル中の表１の４つ以上のゲノム部位を配列決定するための４つ以上のプライマーを含み得る。

【0058】

いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド試薬は、ゲノム部位（例えば、表１のゲノム部位）にハイブリダイズするプローブを含む。適切なプローブには、ゲノム部位での変異にハイブリダイズするプローブ、および／またはゲノム部位の野生型配列または制御配列にハイブリダイズするプローブが含まれ得る。あるいは、適切なプローブは、おそらくゲノム部位の野生型配列または制御配列にハイブリダイズするプローブと一緒に提供される、ゲノム部位での変異にハイブリダイズするプローブを含み得る。適切なオリゴヌクレオチド試薬は、表１の複数のゲノム部位にハイブリダイズするためのプローブのセット、例えば、ポリヌクレオチドサンプル中の表１の４つ以上のゲノム部位にハイブリダイズするための４つ以上のプローブを含み得る。

【0059】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントには、１つ以上の変異の存在についてサンプルを試験することは、前記少なくとも１つ以上の変異とハイブリダイズするのに特異的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを使用して実施されるものであることが含まれる。オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブであり得る。ＮＧＳ代替物に対する本明細書で提供される方法の利点は、限られた数のマーカーであるため、本発明の方法は、プライマー（例えば、Taqmanプライマー）や検出プローブなどの変異特異的オリゴヌクレオチドを含むＰＣＲベースのアッセイを使用して潜在的に実行され得る。別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、マルチプレックスPCRを実行するためのオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプライマーおよびプローブ）を含む。この実施態様によれば、そのような方法は、１つ以上の反応チューブまたはチャンバー、例えば、統合された検出カートリッジのチャンバーでマルチプレックスＰＣＲを実施することを含み得る。

【0060】

いくつかの実施態様において、開示された方法は、ポリヌクレオチドサンプル（例えば、ゲノムDNAサンプル）において、GRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの４つ以上のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの他の核酸塩基（おそらくアデニンまたはチミン）への変化を検出することを含むものであり、検出は、ＤＮＡサンプルの少なくとも一部を増幅し、増幅された部分を配列決定して変化を検出することを含む。いくつかの実施態様において、開示された方法は、次の４つのゲノム部位での変化を検出することを含んでよい：chr10 89720744、PTEN 遺伝子内に位置; chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置; chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; およびchr17 29677227、NF1遺伝子内に位置。任意で、該開示された方法は以下を含んでよい：（ａ）DNAサンプルを増幅して、次の４つのゲノム部位：chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置； chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置；chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置； およびchr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；を含むDNAアンプリコンを調製すること、ならびに（ｂ）変化を検出するためにDNAアンプリコンを配列決定すること。さらなる実施態様において、本発明の方法は、上記と同様に、表１にリストされている部位でのさらなる１つ以上の変化を検出することを含み得る。任意で、ＤＮＡサンプルは、がん患者から得られ、本発明の方法は、がん治療のために患者に投与すること(任意で、例えば、化学療法、放射線療法、および／または手術（例えば、腫瘍切除）などの患者への免疫療法および／または患者への非免疫療法での投与を含む) をさらに含む。

【0061】

いくつかの実施態様において、開示されたシステムは、DNAサンプル中のＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの４つ以上のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの任意の他の核酸塩基への変化を検出するための試薬を含み、任意で、該試薬は、DNAサンプルの少なくとも一部を増幅するためのコンポーネントと、変化を検出するために増幅された部分を配列決定するための試薬を含む。さらに可能性のある実施態様において、該システムは、上記と同様に、表１にリストされている部位でのさらなる１つ以上の変化を検出するための試薬を含み得る。いくつかの実施態様において、該試薬は、以下の４つのゲノム部位：chr10 89720744、PTEN遺伝子内に位置; chr7 112461939、BMT2遺伝子内に位置; chr12 89985005、ATP2B1遺伝子内に位置; および chr17 29677227、NF1遺伝子内に位置；を含むDNAサンプルの少なくとも一部を増幅するためのコンポーネント、および該ゲノム部位を配列決定するためのコンポーネントを含む。任意で、該システムは、少なくとも部分的に自動化されており、および／または（ｉ）システムへのサンプルの受け取りおよび／または輸送、（ｉｉ）１つ以上のコンポーネント、試薬、および／またはツールをサンプルに追加すること（例えば、表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のPCRおよび／または配列決定を実行するための１つ以上のコンポーネント、試薬、および／またはツール）、（ｉｉｉ）サンプルのPCRを実行すること、（ｉｖ）PCR産物（例えば、表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のPCR産物）の検出、（ｖ）表１にリストされている少なくとも４つ以上のゲノム部位の配列決定、および（ｖｉ）表１にリストされている４つ以上のゲノム部位のヌクレオチドを示すレポートを作成すること、から選択される１つ以上のタスクを実行するためのシステムの機械的コンポーネントを実行および／または作動させるようにプログラムされたハードウェアプロセッサを含んでよい。

【0062】

開示されたシステムおよびコンポーネントは、１つ以上のカートリッジを含んでよい。本明細書で使用される用語「カートリッジ」は、チャンバーおよび／またはチャネルの自己完結型のアセンブリとして理解されるべきであり、それは、そのようなカートリッジを受け入れるまたは接続するのに適したより大きな器具の内側または外側に１つのフィッティングとして移送（transfer）または移動（move）できる単一の物体として形成されるものである。カートリッジおよびその機器は、自動化されたプラットフォーム、さらにいえば自動化されたプラットフォームを形成していると見なすことができる。カートリッジに含まれる一部の部品はしっかりと接続されていてよく、他の部品はカートリッジの他のコンポーネントに対して柔軟に接続されて移動できてよい。同様に、本明細書で使用される用語「流体カートリッジ」は、流体、好ましくは液体を処置、処理、排出、または分析するのに適した少なくとも１つのチャンバーまたはチャネルを含むカートリッジとして理解されるべきである。そのようなカートリッジの一つの例は、WO2007004103に記載されている。有利には、流体カートリッジは、マイクロ流体カートリッジであってよい。概して、本明細書で使用される「流体」またはあるときは「マイクロ流体」という用語は、少なくとも１つまたは２つの寸法（例えば、幅および高さまたはチャネル）で、小さい、典型的にはサブミリメートルスケールで幾何学的に制約される流体の挙動、制御、および操作を扱うシステムおよび配置を指す。そのような少量の流体は、小さなサイズと低エネルギー消費を必要とするマイクロスケールで移動、混合、分離、またはその他の方法で処理される。マイクロ流体システムには、マイクロ空気圧システムなど（圧力源、液体ポンプ、マイクロバルブなど）およびマイクロ、ナノ、およびピコリットルの量を処理するためのマイクロ流体構造など（マイクロ流体チャネルなど）の構造が含まれる。本発明に関連して例示的かつ非常に適切な流体システムがEP1896180、EP1904234、および EP2419705に記載された。上記に沿って、用語「チャンバー」は、流体またはマイクロ流体アセンブリ内の任意の幾何学的形状の任意の機能的に特徴づけられた区画であり、少なくとも１つの壁によって特徴づけられ、および、この区画に起因する機能を実行するために必要な手段を含む区画として理解されるべきである。これらの文脈に沿って、「増幅チャンバー」は、（マイクロ）流体アセンブリ内の区画であって、核酸の増幅を行うために前記アセンブリに意図的に設けられ、実行に適している区画と理解されるべきである。増幅チャンバーの例としては、ＰＣＲチャンバーおよびｑＰＣＲチャンバーが含まれる。上記に従うと、代替の実施態様では、そのようなカートリッジおよび／または統合システムは、ＧＲＣ３７ヒトゲノムアセンブリにマッピングされる表１からの４つ以上のゲノム部位でシトシンまたはグアニンの変化の少なくとも１つを含む配列にハイブリダイズするのに特異的な１つ以上のオリゴヌクレオチドを含むように提供される。任意で、開示されたカートリッジは、表１にリストされる１つ以上のゲノム部位を増幅および／または配列決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含んでよい。このようなプライマーは、表１からの４つ以上のゲノム部位でのシトシンまたはグアニンの変化を挟むように、上流または下流の適切なヌクレオチド範囲内で設計でき（ヌクレオチドの例示的な範囲は上述のとおり）、または、プライマーは、例えば、ARMSプライマーアプローチが望まれる場合は、表１からのシトシンまたはグアニンの変化をカバーするように設計することができる。

【0063】

さらなる実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、MSIステータスとは無関係にTMBの影響を受けたサンプルを同定することを含む。開示された方法、システム、およびコンポーネントは、サンプル中のマイクロサテライト不安定性（MSI）の存在について分析することを含んでよい。

【0064】

別の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、試験サンプルを評価して、試験サンプルがマイクロサテライト安定であるかどうかを決定することを含む。この実施態様によれば、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、サンプルがマイクロサテライト安定（MSS）であると決定することを含んでよい。

【0065】

別の実施態様において、マーカースクリーニング法を特定の起源組織の腫瘍に限定するのではなく、汎用のがんアプローチに焦点を当てたがん分野のパラダイムシフトを考慮して、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、任意のタイプのがんサンプル、すなわち、任意の組織タイプに由来するがんサンプルを評価するために利用することができる。これは特に、ICBは特定のがん組織タイプに限定されない汎用のがん治療法として考えられていることから、ほとんどの商業的に利用可能な方法では同定できないICBレスポンダーを本発明の方法で同定できる可能性があるという事実と一致する。代替の実施態様において、開示された方法、システム、およびコンポーネントは、表２にリストされている組織に由来する任意の腫瘍サンプルを評価するために利用されてよく、任意で、子宮内膜がん（UCEC）サンプルおよび／または結腸直腸がん（COAD）サンプルに対して実行される。

【0066】

本明細書全体ですでに述べたように、本明細書で提示された方法の主な利点は、MSIの試験などの他のより一般的に利用可能な方法では見逃される可能性のあるICBレスポンダーを同定する有望な可能性があることである。したがって、有利な実施態様において、サンプルが免疫療法に対するレスポンダーとして得られた患者を分類する工程をさらに含む方法が提供され、好ましくは、PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、および／またはLAG3から選択される少なくとも１つに対して特異的な抗体による治療を含む免疫療法である。したがって、開示された方法は、PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、および／またはLAG3から選択される標的に対して免疫療法（例えば、PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、および／またはLAG3に対する抗体療法）を行うなど、それを必要とする患者に治療を行う工程を含み得る。

【0067】

上記に沿って、TMB試験および免疫療法のための患者の分類における本明細書に記載の方法、カートリッジおよびシステムの使用を想定することもでき、前記療法はICB治療を含み、最も好ましくはPD-1、PD-L1、CTLA4、TIM-3、および／またはLAG3に特異的な任意の抗体でのICB治療を含む。

【実施例】

【0068】

1. TCGAからの子宮内膜腫瘍（UCEC）におけるポリメラーゼイプシロン（POLE）瘢痕変異パターンの同定

【0069】

DNA複製の忠実度の維持は、ポリメラーゼδおよびεによる固有のエラー間の微妙なバランス (Korona et al., 2011,Nucl Acids Res)、プルーフリーディングとMMR間の平衡状態、ならびにラギング鎖およびリーディング鎖合成中のヌクレオチド処理の差異(Lujan et al., 2016, Crit Rev in Biochem and Molec Biol) に依存すると考えられている。酵母モデルでの広範な研究により、PolδおよびPolεホモログのエキソヌクレアーゼドメインの変異がミューテーター（mutator）表現型を引き起こす可能性があることが示されている(Skonecznaet al. 2015, FEMS Microbiol Rev)。

【0070】

上記に基づき、POLE遺伝子およびPOLD1遺伝子（それぞれポリメラーゼεおよびδの触媒サブユニットをコードする）の欠損を検出するための可能性のあるマーカーのセットを同定するために、The Cancer Genome Atlas（TCGA）データベースを利用して発見データセット（discovery data set）を定義することにした。 従前にThe CancerGenome Atlas Research Networkによって報告された(Levine et al.,2013, Nature) 、POLEおよびPOLD1変異を比較的頻繁に有する、子宮内膜がん（UCEC）サンプルに焦点を当てることを選択した。分析の時点で、TCGAには合計524のUCECサンプルが含まれていた。TCGAによって提供されたマイクロサテライト不安定性（MSI）注釈に基づいて、165個のサンプルがMSI陽性（MSI-LまたはMSI-H、つまりMSIが低いまたはMSIが高い、として注釈が付けられている）サンプルだった。我々の発見では、MSI陽性腫瘍はMSSPOLE欠損腫瘍とは異なる特徴を共有すると考えられているため、現在、MSI陽性サンプルを検出するための効率的な方法が存在するという事実により、残りの359個のマイクロサテライト安定（MSSとして注釈が付けられている）TCGA-UCECサンプルのみに焦点を当てた。

【0071】

359のTCGA-UCEC-MSSサンプルの中で、2つのPOLEホットスポット変異（P286RおよびV411L）の１つを含む32のサンプル、他のPOLE変異を含む13のサンプル、およびPOLD1変異を含む12のサンプルを同定した。POLD1変異を持つ12のサンプルのうち9つには、POLE変異も含まれていた。次に、コーディングMbあたりの体細胞置換の数（腫瘍対マッチした正常なサンプル、WES変異体コーリング、同義変異および非同義変異の両方を含むが、インデルは含まない）として定義された腫瘍変異負荷（TMB）値をプロットした。次のサンプルグループの結果を図１に示す：MSI陽性 UCECサンプル (「MSI」、MSI-LおよびMSI-Hの両者を含む)、POLE P286R変異またはV411L 変異を含むMSS UCECサンプル(「POLE ホットスポット」)、POLE 非ホットスポット変異を含むMSSUCECサンプル(「POLE その他」)、POLD1変異を含むMSS UCECサンプル (「POLD1」)、およびPOLEまたはPOLD1のいずれか一方の変異がないMSS UCEC サンプル。

【0072】

図１からわかるように、3つのPOLD1変異POLE非変異サンプル（追加された円の内側にマーク）は、POLEまたはPOLD1変異のないサンプルと同様のTMBを持っており、これは、POLD1変異だけではハイパーミューテーター表現型を引き起こさないことを示す。その結果、残りのマーカー分析は、POLEホットスポット変異を含む32個のUCEC-MSSサンプルを使用して実行された。

【0073】

再発性マーカー変異体を検出するため、POLEホットスポット変異を持つ32個のTCGA-UCEC-MSSサンプルのエクソームシーケンシングからの体細胞変異体リストをダウンロードした。これらすべての変異体について、再発性のものを検出するために次の分析手順を実行した。最初に（１）、32のサンプルからすべての変異体をプールした。続いて、（２）、314個の非POLE変異サンプルのいずれにも存在する変異体を除外した。次に、（３）、1000人ゲノムデータベース（v.2015 Aug）、dbsnp（v.138）、Kaviarデータベース（v.20150923）、およびhrcr1データベース（最初のリリース）を含むパブリックデータベースの既知の変異体を除外した。その後、（４）、非同義変異／ストップ獲得エクソン変異に注釈を付けた。そして最後に、（５）、32個のサンプルのうち6個以上で生じている再発性変異体を選択した（頻度> 0.18）。

【0074】

その結果、表３にリストされる34の再発性変異体マーカーが同定された

【表3】

【0075】

検出された40個のPOLE欠損TCGA-UCEC-MSSサンプル（ホットスポット変異のある32個と他の変異のある8個を含む）について、ピアソン相関を使用して、スコアリングされた陽性マーカーの数とTMBレベル/サンプルを相関させた結果が図２に示される。相関係数は0.31であり、相関が有意でないことを示す。相関関係は見つからなかったが、同定されたセットのすべての単一の変異が、それ自体でTMBの増加に特異的に関連していることを示しているため、実験結果は興味深いものである。

【0076】

2. TCGAからの結腸直腸腫瘍（COAD）およびTCGAからの追加の他のMSS-POLE-ホットスポット腫瘍におけるPOLE瘢痕変異パターンの検索

【0077】

次に、TCGAで利用可能なTCGAからの結腸直腸428結腸直腸サンプル（COAD）を利用して同じ分析を実行した。これらのサンプル間で、72個のサンプルにMSI-Hとして注釈が付けられ、356個のサンプルにMSSとして注釈が付けられていた。356個のTCGA-COAD-MSSサンプルのうち、4個のサンプルにはPOLEホットスポット変異が含まれ、7個のサンプルには少なくとも１つの他のPOLE変異（非ホットスポット）が含まれ、3個のサンプルにはPOLD1変異が含まれていた。次に、上記のように、UCECサンプルの場合と同様に、さまざまなカテゴリーのサンプルでTMBレベルをプロットした。その結果は図３に示される。

【0078】

UCEC MSSサンプル分析と同様に、POLD1変異POLE非変異COADサンプルはTMBの上昇を示さず、POLD1変異のみではハイパーミューテーター表現型を引き起こさないという以前の観察結果を確認した。

【0079】

再発性変異体検索は、POLEホットスポット変異を含む４つの同定されたTCGA-COAD-MSSサンプルを使用して、上記のように実行された。これらのサンプルには再発性の変異は見られなかったが、分析に使用されたサンプルの数が非常に少ないことに起因する可能性がある。

【0080】

TCGA-COAD-MSS-POLE-ホットスポットサンプルで再発性変異を同定しなかったことから、TCGAデータベース内の他のすべてのがんタイプの中から（すなわち、TCGA-UCECおよびTCGA-COADを除く）、POLE-ホットスポット変異を含む他のMSS腫瘍サンプルを検索した。図4の「POLEホットスポット」グループに示されているとおり、TCGAはそのうちの8つをリストしていることがわかった。それらの中で、４つのサンプルはP286Rホットスポット変異を持ち、以下を含んだ：直腸がん（READ）から1サンプル、膵臓がん（PAAD）から1サンプル、膀胱がん（BLCA）から1サンプル、乳がん（BRCA）から1サンプル。残りの４つはV411Lホットスポットを持ち、以下を含んだ：1 READ、1胃がん（STAD）、1神経膠芽腫（GBM）、および1子宮頸がん（CESC）。さらに、TCGAには、図４の「POLE その他」グループに示す、ホットスポットではない他のPOLE変異を持つ140個のMSS非UCECおよび非COADがんサンプルが含まれ、そのうちのいくつかはTMBが上昇していた。

【0081】

上記の8つのTCGA非UCECおよびTCGA非COAD MSSPOLEホットスポットサンプルすべてに、上記の発見アプローチを適用したが、再発性変異を同定することはできなかった。

【0082】

3. すべてのUCEC TCGAレコードのUCEC-POLEホットスポット変異サンプルで同定されたPOLE変異パターンマーカーパネルの遡及的適用

【0083】

COADまたは他のがんの非UCECサンプルに再発性変異がないことを考慮して、UCEC腫瘍で同定された34個の再発性変異を、TCGAレコードでPOLE欠損腫瘍を検出するための最初の34個のPOLE変異パターンマーカーパネルとして定義した。

【0084】

最初に、最初の34マーカーパネルを524個のTCGA-UCECサンプルすべてに適用して、その感度と特異性を推定した。各サンプルについて、34マーカーパネルをその変異体リストと重ね合わせ（overlapped）、34個の潜在的なマーカーのうちサンプルごとに検出できる変異体の数を確認した。特定のサンプルで１つの変異体（すなわち、１つのマーカー）が検出された場合、そのサンプルはこの変異体に対して陽性であると見なされる。

【0085】

結果として、少なくとも１つの陽性マーカーを持つ47のTCGA-UCECサンプルを検出した。これらのサンプルをPOLE欠損サンプルと定義した。検出された47個のPOLE欠損サンプルは以下を含む：（ｉ）最初の34マーカーパネルを定義するために使用されるPOLEホットスポット変異を持つ32サンプルすべて、（ｉｉ）POLEホットスポット変異を持つ１つのMSI-Hサンプル、（ｉｉｉ）他のPOLE変異を持つ6つのMSI-Hサンプル、（ｉｖ）他のPOLE変異を持つ8つのMSSサンプル。この分析ではMSI-Hサンプルには関心がなかったため、他のPOLE変異を持つ8つのMSSサンプルをさらに調査した。サンプルの詳細を以下の表４に示す （表中、「MSS」 =マイクロサテライト安定；「MSI-L」または「MSI-H」 =MSI 陽性; 「ホットスポット(Hotspot)」 - POLE ホットスポット変異の存在； 「POLE」= POLE 非ホットスポット変異の存在；「EXO1」= EXO1変異の存在； 「MUTYH」= MUTYH変異の存在、「NA」 = TCGAに示されない目的の変異の存在；インデルを含まない、置換/Mbとして表されるTMB）。

【表4】

【0086】

さらに図５に示されるとおり、同定された8つのUCEC MSSサンプル（図5でまるく囲まれている）はすべてTMBが上昇しており、観察された最小TMBは188.4置換／Mbだった。これらのサンプルのさらなる詳細と、それらに見られる正確なPOLE非ホットスポット変異のリストを以下の表５に示す。注目すべきことに、サンプルTCGA-DF-A2KVで観察された188.4置換／Mbの上記の最低TMBは、POLEホットスポットを含むMSSサンプルTCGA-EY-A1GDおよびTCGA-QS-A5YQ（上記表４参照）で観察されたTMBよりもさらに高くなっており、これは本明細書でリストされたPOLE非ホットスポット変異がポリメラーゼεの適切な機能を効果的に無効にすることができることを強く示唆する。

【表5】

【0087】

上記の結果は、最初の34マーカーパネルが、POLEホットスポット変異を持つUCECサンプルの検出セットだけでなく、少なくとも188.4置換／MBを超える実質的に上昇したTMBを持つ他のPOLE欠損サンプルも検出できることを示す。上記は、異なるTMBレベル範囲ごとのTCGA内のすべてのMSS-UCECサンプルから34マーカーパネルによって検出されたMSS UCECサンプルの量を示す表６によってさらにサポートされる（すなわち、少なくとも１つの変異体が検出された場合）。

【表6】

【0088】

4. UCECサンプルを除くTCGAレコードのすべてのがんタイプに対するUCEC-POLEホットスポット変異サンプルで同定されたPOLE変異パターンマーカーパネルの適用

【0089】

次に、34マーカーパネルを、上記で分析したTCGA-UCECサンプルを除く14の異なるがんタイプに属するMSI陽性サンプルとMSSサンプルの両方を含むすべての7346 TCGAサンプルレコードに適用した。サンプルごとに同定できる陽性マーカーの数を試験するために、最初の34マーカーパネルを使用してすべてのサンプルの変異体リストをスクリーニングした。サンプルに少なくとも１つの（>0）陽性マーカーが含まれている場合、POLE欠損サンプルに固有の変異パターンを含むと見なした。

【0090】

合計で、10の異なるがんタイプにわたって35のサンプルを同定した。これらの35のサンプルでは、3つのサンプルがMSI-Hであり、11のサンプルがPOLEホットスポット変異の１つを含み、8つのサンプルが少なくとも１つの他のPOLE変異を含んでいた（8つのうち１つはMSI-Hサンプルであり、残りの7つは262.1から1846.8置換／MBの高いTMB範囲を持つMSSサンプル）；6つのサンプルにEXO1体細胞変異があった（6つのうち2つはEXO1変異であるが、POLE変異ではない）、および最後に、４つのサンプルにはMUYTHの体細胞変異があった（特にすべてPOLE変異もあり、3つにはPOLEホットスポット変異を含む）。検出されたサンプルの詳細情報は表７に示される (表中、「MSS」 =マイクロサテライト安定；「MSI-L」または「MSI-H」=MSI 陽性；ホットスポット(Hotspot)」- POLEホットスポット変異の存在；「POLE」= POLE 非ホットスポット変異の存在；「EXO1」= EXO1変異の存在；「MUTYH」 = MUTYH変異の存在、「NA」 =TCGAに示されない目的の変異の存在；インデルを含まない、置換/Mbとして表されるTMB)。

【表7】

【0091】

上記表７からもまた、34個のパネルが12個の非UCEC腫瘍サンプル（太字でマーク）を識別し、発見パネルの構築に使用されたサンプル（すなわち、サンプルTCGA-QS-A5YQ TMB = 132.4 置換／Mb、表４参照）が含まれるMSS UCEC POLEホットスポットの中で観察された最低TMBよりもTMBが低いこともわかる。これらのサンプルのうち2つはMSI-H（胃腺がんまたはSTADサンプルTCGA-VQ-A8PBおよびTCGA-VQ-A91E）であり、ここに示されている値にはインデルが含まれていないため、TMB値に割り当てられた低い値を説明できる。残りの10個のサンプルにはMSSの注釈が付けられており、TCGAレコードに基づくと、POLE、EXO1、MUTYHのいずれにも変異は含んでないが、メラノーマ（すなわち、SKCMサンプルTCGA-WE-A8K5、TCGA-D3-A51G、TCGA-FR-A3YOおよびTCGA-FS-A4F2）を除いて、原発性の、すなわちおそらく初期段階の腫瘍に由来する。TMB値が低く、主要なドライバー変異がないにもかかわらず、34パネルによるこれらのサンプルの検出は価値があると考えられ、ICBレスポンダーのステータスが良好であることを示唆する可能性がある。特に、上記で説明したように、TMB値はそれ自体では非常に信頼性が低く、使用する試験によって異なる。例えば、SCLC、NSCLS、および尿路上皮がんの所見では、ICBの良好なレスポンダーを選択するためのTMB閾値は、Foundation One試験ではメガベースあたり≧10変異（mut/Mb）、MSK-IMPACT試験では≧7mut/Mbに相当し(Antonia et al., 2017, WorldConf on Lung Canc; Abstract OA 07.03a; Kowanetz rt al., 2016, Ann Oncol;Powleset al., 2018, Genitourinary Canc Symp)；そして、16.2mut/Mb以上の高い閾値を適用することによって(Kowanetz et al., J ThoracicOncol)または15 mut/Mbの閾値を適用することによって (Ramalingam et al., 2018, AACR Ann Meeting, Abstract #1137)、異なる治療法の有効性を増加させなかった。したがって、これらのサンプルは、依然として良好なレスポンダーに由来する可能性があり、腫瘍がまだ初期段階にあるか、POLE欠損に関連するものとは別のDNAサーベイランスメカニズムに影響を受けているだけであると仮定する。後者は、これらのMSSサンプルの1/3以上が、変異獲得メカニズムがUV損傷によって引き起こされることが知られているメラノーマ（SKCMサンプル）であり、免疫反応性ネオアンチゲンを生成するためにTMBを高度に上昇させる必要はないという事実によってさらに裏付けられる可能性がある(Gubin et al., 2014, Nature)。

【0092】

次に、図４および図５に示すように、本明細書で提案された最初のパネルを適用することにより、TCGAデータベースでPOLEホットスポット変異を含む12個の非UCEC MSSサンプルも注目すべきことに同定された。詳細には、図３に示す４つのMSS POLEホットスポットCOADサンプルと図４に示す8つのMSS POLEホットスポット非COAD/非UCECサンプルがそれらに含まれていた。次に、これらの12個のサンプルのうち11個が、34個の最初の変異パターンマーカーパネルの少なくとも１つに対して陽性であることを確認した。おそらくTCGA注釈が不完全なため、12番目のサンプルを確認できなかった。

【0093】

さらに注目すべきは、POLE非ホットスポット変異を含む7つのMSS非UCECサンプルは、同定した34個のマーカーの最初のPOLE瘢痕変異パターンパネルを適用することにより、すべてのTCGAレコードから抽出され、すべて非常に高いTMB、すなわち、262.1から1846.8の置換/MBの範囲を示した。

【0094】

この知見は、34マーカーパネルをすべてのTCGA-UCECサンプルに適用して得られた結果と一致しており、ホットスポット変異以外のPOLEを含むTCGW-UCEC-MSSサンプルを抽出したところ、TMBが最小188.4置換/MBから1478.9置換/MBの範囲に大幅に上昇した。

【0095】

上記結果は、POLE依存性瘢痕を同定するための最初の34マーカーは、POLE変異を有するサンプルに非常に高感度で、POLEホットスポット変異または酵素の適切な機能に影響を与える別のPOLE変異のいずれかであり、これらはすべて腫瘍変異負荷が非常に高いことを示す。

【0096】

本明細書で同定された最初の34マーカーパネルによってMSSサンプルで選択されたPOLE非ホットスポット変異は、以下の表８（TCGA非UCECサンプルを示す）および上記の表５（TCGA-UCECサンプルを示す）に示される。

【表8】

【0097】

表８と表５にリストされているPOLE非ホットスポット変異を比較すると、これらの変異のいくつかは異なるサンプルおよびがんの種類の間で再発している（reoccurring）ことがわかる。例えば、４つのサンプル（2つのREAD、2つのUCEC）はPOLE S459F変異を持ち、４つのサンプル（１つのGBM、１つのCOAD、2つのUCEC）はA456P変異を持ち、2つのサンプルはS297F変異（１つのCESCと１つのUCEC）を示す。これは、これらの変異とその他の上記でリストされたPOLE非ホットスポット変異の機能的関連性およびTMB表現型増加におけるそれらの原因となる関与を示す可能性がある。

【0098】

表８と表５に示されているレコードから、最初に同定された34マーカーパネルが、TMBが大幅に増加したPOLE機能の欠損または障害サンプルを同定するために使用できることを示唆する。このことをさらにサポートするために、TCGAでMSIステータスを確実に示したCOAD、PAAD、STAD、READ MSSサンプルのデータをまとめて、異なるTMBレベルのカテゴリーごとに、34マーカーパネルによって検出された（すなわち、少なくとも１つの変異体が検出された）これらのサンプルの数を比較した。COAD、PAAD、STAD、READ MSSサンプルのデータを表９に示し、これらのサンプルとUCECサンプルをまとめたデータを以下の表１０に示す。

【表9】

【表10】

【0099】

5. 最初に同定された34マーカーパネルを使用した個々のマーカーの強度と冗長性のさらなる分析

【0100】

TMBレベルが上昇したサンプルの回収（recovering）において、どのマーカーが最も強いパフォーマンスを示したかを調査するために、詳細なコンピューター分析が開始された。この目的のために、マーカーのすべての組み合わせは、それらの組み合わせたパフォーマンスについて徹底的にスクリーニングされた。最高のパフォーマンスの組み合わせは差し控えられた。同時に、バイオマーカーの共起（co-occurrence）の計算を通じて、高レベルの冗長性を示すマーカーの同定が行われた。マーカー間の共起を図６に示す。遺伝子RB1CC1と遺伝子BRWD3のマーカーが1の共起を持つことを示す。他の強く相関するマーカーを表１１に示す。

【表11】

【0101】

これにより、すべてのサンプルをカバーする19個のマーカーからなる最小限の実験パネルを作成することができた。サブサンプリングされた（sub sampled）パネルあたりのマーカーの数をさらに削らし、マーカーのランダムサンプリングによって得られるサンプルセットよりも優れたサンプルセットを取得できる最小限のパネルが取得された。ランダムサンプリングを実行するために、ランダムに選択された10,000個のマーカーのサブセットを試験し、データセット内のサンプルを取得する能力を評価した。その結果を図７に示す。それらは、４つのマーカーパネルの場合、１回の観察サンプルの最大数は43であり、中央値は30であったことを示す。次に、４つのマーカーからなる最小限のパネルから始めて、19のマーカーのパネル中で最良のパフォーマンスを発揮するバイオマーカーを段階的に選択した。我々が同定した最高のパフォーマンスのパネルについては、上記の「詳細な説明」のセクションで説明した。PTEN（i）、BMT2、およびATPB1遺伝子のマーカー、およびNF1またはGRM5のいずれか１つのさらなるマーカーを含む、４つのマーカーでの２つの最高のパフォーマンスのパネルが見いだし、これは、GRM5を含むかどうかで、同定された82のうち43または44のサンプルを回収する。サンプリングシミュレーションの結果、この最小限のバイオマーカーのサブセットでも、ランダムサンプリングで同等の良いスコアが得られることは非常に稀であり（1/10000）、TMBが上昇したサンプルをピックアップするための、４つ以上のバイオマーカーの最小パネルで計算した予測性が浮き彫りになった。

【0102】

バイオマーカーに基づくパネルを確立することに加えて、上記と同じ方法で、バイオマーカーとPOLEホットスポット変異の有病率に基づく最小限のパネルも作成された。これらの計算の結果については、前述の「詳細な説明」セクションでも説明した。

【0103】

6. 子宮内膜がんのサンプルの実験的試験

【0104】

さらなる実験において、子宮内膜がん患者からの一連の腫瘍サンプルを分析して、少なくとも１つの変異が存在するかについて、表１のGRC37ヒトゲノムアセンブリにマッピングされるさまざまなゲノム部位の配列決定を含む方法を用いて、腫瘍変異負荷（TMB）の増加の存在を調べた。その結果は、最も一般的な21のがん遺伝子のホットスポット領域をカバーする75のアンプリコンのパネルと追加の25のMSIマーカーで構成されるルーチンの臨床シーケンシングパネルで使用される標準的な体細胞がんパネルで見つかったヌクレオチド変異体の数を含む配列決定された領域に存在する変異の総数と比較された。

【0105】

この目的を達成するために、表１の34のバリエーションをカバーする34のアンプリコンを使用して、36のホルマリン固定パラフィン包埋子宮内膜がんサンプルの配列決定を行った。DNAは、製造元の指示(Invitrogen（商標） K182002)に従って、Invitrogen PureLink（商標） Genomic DNA Mini Kitを使用して、腫瘍の病理学的に注釈が付けられた腫瘍性領域から抽出されたDNAによってサンプルから抽出された。次世代シーケンシングのためIon PGM（商標）を使用する、カスタムパネルを使用してターゲットシーケンスを実行した（合計134アンプリコン）、そして分析は配列決定および製造元の指示に従ったデータ分析用のTorrent Suite Software (ThermoFisher Scientific)を用いて行った。その結果は表１２に示される。このランダムに選択された一連の子宮内膜がんでは、10/36（27.8％;サンプル1、2、3、5、6、7、15、17、18、および34）が少なくとも１つのマーカーに対して陽性だった。配列決定で検出されたヌクレオチド変異体の幾何平均数は、１つ以上の表１マーカーを含むサンプルでは216だったが、変異体が検出されなかったサンプルでは32変異体の幾何平均だった。マーカーのいずれかを含むグループは、コントロールグループと比較して6.75倍の平均上昇TMBを持っていた。 これは、この変異パターンが上昇TMBをキャプチャすることを確証する。

【0106】

表１２にさらに示されているとおり、サンプル2、3、6、17、18、および34には2～7個のマーカーが含まれていた。上記で説明したように、34個のマーカーのセットからランダムに選択された２つ以上のマーカーがゲノムに出現する可能性は、事実上存在しない。したがって、これにより、独立した実際のサンプルセットで、マーカーがDNA修復の失敗メカニズムに関連づけられており、特定のがんで生じた瘢痕の変異パターンの一部である可能性があるというさらなる証拠が得られる。１つのマーカーが検出されたサンプル（サンプル1、5、7、および15）は、166の変異体の幾何平均数を示し、一方で、２つ以上のマーカーを持つものは257の幾何平均を示し、しかしながら、また、マーカーの１つだけが陽性のサンプルは、マーカーのないサンプルと比較して、明らかに増加した数の変異体を示した。

【0107】

さらに、表１２は、表１の16/34マーカーが10の子宮内膜がんサンプルで検出され、合計26のマーカーが表示されたことを示す。表１のいくつかのマーカーは、２つのサンプル（UPRT、ARHGAP35）または３つのサンプル（ASCC3、GRM5、HTR2A、MS4A8）に存在しており、したがって、子宮内膜がんにおける上昇したTMBの検出のための有望なマーカーである可能性がある。表１１に報告されているように、いくつかのマーカーが頻繁に一緒に発生する可能性があり、本実験でもASCC3とFUBP1がサンプル番号３で一緒に発生した。

【表12】

【0108】

図面の用語
substitutions/Mb置換／Mb
POLE hotspot POLEホットスポット
POLE others POLEその他
None なし
Nr of positive markers 陽性マーカーの数
Pearson Correlation ピアソン相関
Histogram of results 結果のヒストグラム
Frequency 頻度
results 結果

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】