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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-14
(54)【発明の名称】細胞培養方法および組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20220907BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20220907BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20220907BHJP
C12N 5/0793 20100101ALI20220907BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20220907BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20220907BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220907BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/077
C12N5/079
C12N5/0793
C12Q1/02
C12Q1/68
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021576869
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(85)【翻訳文提出日】2022-02-17
(86)【国際出願番号】 AU2020050656
(87)【国際公開番号】W WO2020257867
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】10201905939W
(32)【優先日】2019-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＦＩＲＥＷＩＲＥ
２．ＴＨＵＮＤＥＲＢＯＬＴ
３．ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ
４．ＡＮＤＲＯＩＤ
５．ＵＮＩＸ
(71)【出願人】
【識別番号】507335687
【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール
(71)【出願人】
【識別番号】518224495
【氏名又は名称】モグリファイ リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】594202523
【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ラッカム，オーウェン
(72)【発明者】
【氏名】ペトレット，エンリコ
(72)【発明者】
【氏名】カマラジ，ウマ
(72)【発明者】
【氏名】ポロ，ジョセ
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ジョセフ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ43
4B063QR51
4B063QS10
4B063QS14
4B063QS28
4B063QS32
4B063QS39
4B065AA90X
4B065AB10
4B065AC20
4B065BA21
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、細胞維持および細胞変換のための細胞培養因子を同定するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための方法であって、－ 細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと、
－ 前記ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップと、
－ 前記ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって前記細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、前記目的の細胞の前記細胞同一性と関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 前記目的の細胞を、前記細胞の前記細胞同一性と関連付けられた前記因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 前記細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持する、方法。
【請求項2】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持する方法であって、ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、前記タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴の維持を促進するために、前記目的の細胞を少なくとも２つの因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．前記細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持する、方法。
【請求項3】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持する方法であって、ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、前記タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴の維持を促進するために、前記目的の細胞を１つもしくは複数の因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．前記細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持する、方法。
【請求項4】
前記目的の細胞が、分化した細胞、分化している細胞、未分化細胞または分化転換した細胞である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記目的の細胞が組織である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記目的の細胞が、外胚葉、中胚葉および内胚葉の胚葉に由来する細胞から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記目的の細胞が、星状膠細胞、ニューロスフェア、心筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞、メラニン細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、および単核細胞、または表２に記載された細胞もしくは組織のいずれかからなる群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞同一性に関連付けられた前記因子が、表２に記載された前記因子のいずれか１つまたは複数である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記目的の細胞が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日またはそれ以上の間、前記細胞を培養することを含む、前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で、培養される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の前記微分幅が、－ 前記目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 前記細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての平均遺伝子ピーク幅スコアとの差を計算し、それによって前記目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップが、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾が存在するゲノムの領域を最初に定義し、それらの領域をヒストン修飾参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）と定義することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＲＰＬが、全ての細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られ、好ましくは、マージされる前記ピーク領域が重複するピーク領域である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
各タンパク質コード遺伝子についての前記遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子を除外することを含み、前記遺伝子がポイズド遺伝子として同定される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップが、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持するための前記因子が、細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対、好ましくは前記受容体－リガンド対のリガンド、転写因子、およびエピジェネティックリモデリング因子からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対をコードする前記細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持するのに必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子が、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従ってランク付けされ、前記受容体に関連付けられた各リガンドが、そのＤＢＳスコアに従ってランク付けされて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得、前記組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するための前記リガンドを同定する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞同一性遺伝子が、ＷＮＴ、ＮＯＴＣＨ、Ｈｅｇｄｅｈｏｇ、Ｈｉｐｐｏ、ＧＰＣＲ、インテグリン、ＴＧＦＢファミリー（ＢＭＰ、アクチビン、ＴＧＦＢ受容体）、受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＭＥＴ、ＭＳＴ、ＳＣＦ－ＫＩＴ、インスリン受容体、ＥＲＢＢ２、ＮＴＲＫなど）、非受容体チロシンキナーゼ（ＰＴＫ６）、ＭＴＯＲ、およびレチノイン酸によるシグナル伝達などの細胞シグナル伝達経路に関与する受容体－リガンド対をコードする、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項19】
転写因子をコードする前記細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで前記目的の細胞を維持するのに必要な前記転写因子を同定するステップをさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ネットワークスコアを決定するステップが、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しないタンパク質コード遺伝子をタンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞を、２つ以上の因子の発現を増加させる作用物質と接触させることによって、前記目的の細胞が因子の２つ以上と接触する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
作用物質が、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマーおよび小分子ならびにそれらの類似体またはバリアントからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法を実施することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法。
【請求項24】
細胞の少なくとも５％が前記目的の細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法によって産生される、細胞の集団。
【請求項25】
前記集団における前記細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、前記目的の細胞の少なくとも１つの特徴を示す、請求項２４に記載の細胞の集団。
【請求項26】
前記目的の細胞を個体に投与するステップ、または請求項２２もしくは２３に記載の細胞の集団を個体に投与するステップをさらに含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する方法であって、－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、前記ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子（ＤＢＳ）についての前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコアを得るステップと、
－ 前記ソース細胞の前記ＤＢＳと前記標的細胞の前記ＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についての前記ソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾における前記差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 前記細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて前記ソース細胞型から前記標的細胞型への変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、前記ネットワークが、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 前記細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて前記標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、前記標的細胞についての前記細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、前記標的細胞の前記細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞への前記ソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下で前記ソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換し、任意選択により、１つまたは複数の因子の量を増加させることは、ｉ）前記ソース細胞を、因子もしくは前記細胞によって前記因子の発現を増加させる作用物質と接触させること、またはｉｉ）前記因子をコードする核酸を前記ソース細胞にトランスフェクトし、前記細胞において前記核酸を発現させることを含む、方法。
【請求項28】
変換する方法が、分化、再プログラミングまたは分化転換する方法である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ソース細胞が、分化した細胞、分化している細胞、未分化細胞または分化転換した細胞である、請求項２７に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞維持および細胞変換についての細胞培養因子を同定するための方法に関する。
関連出願
本出願は、シンガポール特許出願１０２０１９０５９３９Ｗからの優先権を主張し、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
関連出願
本出願は、シンガポール特許出願１０２０１９０５９３９Ｗからの優先権を主張し、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
胚性幹細胞が最初に単離されて以来、細胞状態を培養し、制御する能力が高まっている。しかしながら、この分野において最も困難な領域の１つは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための理想的な細胞培養条件を見つけることである。正確な条件が利用されない場合、細胞は異なる細胞状態に形質転換するか、または死滅する。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで可能な限り厳密にｉｎ ｖｉｖｏ微小環境条件を模倣するための重要な必要性が存在する。細胞型に対する培地の特異性を増加させるために、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分、成長因子および他の環境要因のような細胞特異的因子の付加が必要とされる。
【0003】
さらに、細胞療法の進歩における主要な課題は、化学的に定義された細胞培養条件についての要件であり、様々な細胞型を維持するための無血清培地を開発するための試みが行われている。同様に、分化に関して、細胞療法のための細胞を得るために無血清の化学的に定義されたプロトコールを決定するための多くの試みがなされている。これらのプロトコールは、自然な発達過程、例えば、内皮細胞、ミクログリアおよび心筋細胞の分化を模倣するシグナル伝達分子のような外部要因を使用する。さらに、ＶＥＧＦのようなシグナル伝達分子は、内皮分化においてマスター調節遺伝子の遺伝子座でエピジェネティックランドスケープを再構築することが示されている。このことは、シグナル伝達分子が、細胞状態を維持するか、または分化するためにエピジェネティック調節を開始できることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
４００を超える公知のヒト細胞型が存在し、単一細胞シークエンシング技術の最近の進歩により、感覚ニューロン型および血液細胞型などの、より多くの新しい細胞型が胚発生の間に同定されている。したがって、任意のヒト細胞型についての細胞培養条件および／または分化刺激を体系的に同定するための満たされていない必要性が存在している。転写因子（ＴＦ）媒介性分化転換は十分に研究された分野であり、ＣｅｌｌＮｅｔ、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ ＡＣらおよびＭｏｇｒｉｆｙなどの遺伝子発現データを使用してＴＦを予測するために開発されたデータ駆動型計算アプローチがますます増えている。しかしながら、現在、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持または多数の細胞型にわたる細胞変換についてのシグナル伝達分子を体系的に同定するための計算アプローチは存在しない。
【0005】
培養中の細胞を維持し、細胞を異なる細胞型に変換するための因子を同定するための新たな方法についての必要性が存在する。
本明細書におけるあらゆる先行技術への言及は、この先行技術が、任意の管轄において共通の一般知識の一部を形成すること、またはこの先行技術が、当業者によって理解されるか、先行技術の他の部分に関連するとみなされるか、および／もしくは他の部分と組み合わされることが合理的に予測され得るとの承認または示唆ではない。
本明細書におけるあらゆる先行技術への言及は、この先行技術が、任意の管轄において共通の一般知識の一部を形成すること、またはこの先行技術が、当業者によって理解されるか、先行技術の他の部分に関連するとみなされるか、および／もしくは他の部分と組み合わされることが合理的に予測され得るとの承認または示唆ではない。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｒｅａｄｔｈ）を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上のタンパク質コード遺伝子の各々のタンパク質産物間の相互作用に基づいてタンパク質コード遺伝子の各々についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅およびネットワークスコアの組合せに基づいてタンパク質コード遺伝子の各々についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従ってタンパク質コード遺伝子の各々に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｒｅａｄｔｈ）を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上のタンパク質コード遺伝子の各々のタンパク質産物間の相互作用に基づいてタンパク質コード遺伝子の各々についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅およびネットワークスコアの組合せに基づいてタンパク質コード遺伝子の各々についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従ってタンパク質コード遺伝子の各々に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
【0007】
本発明は、目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅およびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅およびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
【0008】
本発明はまた、目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｒｏａｄｎｅｓｓ ｓｃｏｒｅ）（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞におけるタンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｒｏａｄｎｅｓｓ ｓｃｏｒｅ）（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞におけるタンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
【0009】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞型を維持するのに必要な因子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を同定する、方法を提供する。
【0010】
任意の実施形態では、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅は、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るために目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得、細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子幅スコアの中央値との差を計算し、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定することによって決定され得る。
【0011】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され得、より好ましくは、情報は、エピゲノムＲｏａｄｍａｐ、ＢＬＵＥＰＲＩＮＴまたはＥＮＣＯＤＥデータベースのいずれかから得られる。任意の実施形態では、遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定することは、最初に、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾（ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座、またはＲＰＬ）が存在するゲノムの領域を定義することを含む。好ましくは、ＲＰＬは、全ての細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られる。好ましくは、マージされるピーク領域は、重複するピーク領域である。
【0012】
好ましくは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅は、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され、任意選択により、情報は、ＣＵＴ＆ＲＵＮ、ｓｃＣｈＩＣ－ｓｅｑなどのＨ３Ｋ４ｍｅ３プロファイリング方法から導かれ、より好ましくは、情報は、ＥＮＣＯＤＥデータベースから得られる。
【0013】
好ましい実施形態では、各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定することは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子（すなわち、ポイズド遺伝子（ｐｏｉｓｅｄ ｇｅｎｅ））を除外することを含み得る。
【0014】
任意の実施形態では、ＤＢＳを決定することは、各タンパク質コード遺伝子についての（対照／バックグラウンド細胞と比較した）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に関する情報を、幅のその差の有意性と組み合わせることを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＳを決定することは、幅の差および差の有意性を乗算、正規化または加算することを含み得、好ましくは、ＤＢＳは、ピーク幅の差と差の有意性とを加算することによって決定される。より好ましくは、ＤＢＳは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ピーク幅の差と有意性の－ｌｏｇ１０値とを加算することによって決定される。
【0015】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差の有意性は、任意の標準的な統計的方法によって決定され得る。一例では、使用される方法は一標本ウィルコクソン検定である。
任意の実施形態では、目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定することは、各タンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳに関する情報、遺伝子の出次数ノードの数、およびネットワークにおける遺伝子の関連性のレベルを組み合わせることを含む。好ましい実施形態では、ネットワークスコアは、関連する遺伝子のＤＢＳを合計することによって決定され、ネットワークにおける関連するタンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳの加重和を得るために、遺伝子の出次数ノードの数および関連性のレベルについて加重される。
任意の実施形態では、目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定することは、各タンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳに関する情報、遺伝子の出次数ノードの数、およびネットワークにおける遺伝子の関連性のレベルを組み合わせることを含む。好ましい実施形態では、ネットワークスコアは、関連する遺伝子のＤＢＳを合計することによって決定され、ネットワークにおける関連するタンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳの加重和を得るために、遺伝子の出次数ノードの数および関連性のレベルについて加重される。
【0016】
典型的に、タンパク質間相互作用ネットワークは、ＳＴＲＩＮＧデータベースであるが、所与の細胞型内のタンパク質の相互作用に関連する情報を含む、本明細書で言及される任意のサブネットワークが使用されてもよい。
【0017】
細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）は、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標であることは理解される。
任意の実施形態では、ＲｅｇＤＢＳを決定することは、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含み得る。
任意の実施形態では、ＲｅｇＤＢＳを決定することは、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含み得る。
【0018】
任意の実施形態では、各タンパク質コード遺伝子についてのＲｅｇＤＢＳを決定することは、ＤＢＳスコアと、目的の細胞における全ての遺伝子にわたって正規化されたネットワークスコアとを加算することを含み得る。好ましくは、ＤＢＳとネットワークスコアとの加算は、２：１、１：１、３：１、４：１、５：１、および１：２の係数でネットワークスコアに対してＤＢＳを加重することをさらに含む。より好ましくは、ＲｅｇＤＢＳは、ネットワークスコアに対して２の係数でＤＢＳスコアを加重することによって決定される。
【0019】
任意の実施形態では、そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップは、ＲｅｇＤＢＳ値に基づいて遺伝子を順序付けすることを含み得る。
好ましい実施形態では、方法は、受容体－リガンド対をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子は、細胞シグナル伝達に関与する細胞表面受容体またはリガンドからなる群から選択される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を決定することは、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従って細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子をランク付けすることを含む。この方法は、各リガンドについてのＤＢＳスコアに基づいて受容体に関連付けられたリガンドに優先順位を付けて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得るステップであって、組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、ステップをさらに含み得る。
好ましい実施形態では、方法は、受容体－リガンド対をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子は、細胞シグナル伝達に関与する細胞表面受容体またはリガンドからなる群から選択される。好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を決定することは、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従って細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子をランク付けすることを含む。この方法は、各リガンドについてのＤＢＳスコアに基づいて受容体に関連付けられたリガンドに優先順位を付けて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得るステップであって、組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、ステップをさらに含み得る。
【0020】
さらなる実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための因子は、転写因子、またはエピジェネティックリモデリング因子を含み得る。したがって、方法は、転写因子をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な転写因子を同定するステップをさらに含み得る。
【0021】
したがって、本発明はまた、目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞（ｘ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ 目的の細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコア（Δピーク幅ｘ ｇ）の正規化された差、およびその差の有意性（Ｐｖａｌ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅とＰｖａｌ値とを加算して、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）に関する情報を組み合わせることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコア（Ｎｘ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）の加重和は、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 目的の細胞（ｘ）における全てのタンパク質コード遺伝子（ｇ）にわたってネットワークスコアＮｅｔｘ ｇを正規化するステップと、
－ 微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）およびネットワークスコア（Ｎｅｔｘ ｇ）の組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳｘ ｇは、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳｘ ｇに従って各遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞（ｘ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ 目的の細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコア（Δピーク幅ｘ ｇ）の正規化された差、およびその差の有意性（Ｐｖａｌ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅とＰｖａｌ値とを加算して、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）に関する情報を組み合わせることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコア（Ｎｘ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）の加重和は、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 目的の細胞（ｘ）における全てのタンパク質コード遺伝子（ｇ）にわたってネットワークスコアＮｅｔｘ ｇを正規化するステップと、
－ 微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）およびネットワークスコア（Ｎｅｔｘ ｇ）の組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳｘ ｇは、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳｘ ｇに従って各遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法を提供する。
【0022】
好ましくは、ネットワークにおける実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、遺伝子ノード間の相互作用が選択される。
さらなる実施形態では、ネットワークスコアを決定することは、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しないタンパク質コード遺伝子をタンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む。
さらなる実施形態では、ネットワークスコアを決定することは、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しないタンパク質コード遺伝子をタンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む。
【0023】
好ましくは、目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けすることは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ
ｇ）と遺伝子についての正規化されたネットワークスコア（Ｎｅｔｘ
ｇ）とを加算することを含み、より好ましくは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ
ｇ）は、正規化されたネットワークスコア（Ｎｅｔｘ
ｇ）に対して少なくとも２の係数によって加重される。
【0024】
本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ ソース細胞および標的細胞型におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、タンパク質コード遺伝子の各々についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上のタンパク質コード遺伝子の各々のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞におけるタンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞におけるタンパク質コード遺伝子の各々についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従ってタンパク質コード遺伝子の各々に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
－ ソース細胞および標的細胞型におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型におけるタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、タンパク質コード遺伝子の各々についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上のタンパク質コード遺伝子の各々のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞におけるタンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞におけるタンパク質コード遺伝子の各々についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従ってタンパク質コード遺伝子の各々に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
【0025】
本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子（ＤＢＳ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコアを得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せ基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子（ＤＢＳ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコアを得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せ基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
【0026】
本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子について細胞変換ΔＤＢＳを得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコア（ＲｅｇΔＤＢＳ）を決定するステップと、
－ その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子について細胞変換ΔＤＢＳを得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコア（ＲｅｇΔＤＢＳ）を決定するステップと、
－ その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法を提供する。
【0027】
任意の実施形態では、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅は、各細胞型における各遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るためにソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得ること、ならびに細胞型における各タンパク質コード遺伝子の遺伝子ピーク幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコアの中央値との差を計算することによって決定され、それによってソースおよび標的細胞の両方における各遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定する。
【0028】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅はＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され得、より好ましくは、その情報は、エピゲノムＲｏａｄｍａｐ、ＢＬＵＥＰＲＩＮＴまたはＥＮＣＯＤＥデータベースのいずれかから得られる。任意の実施形態では、遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定することは、最初に、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾（ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座、またはＲＰＬ）が存在するゲノムの領域を定義することを含む。好ましくは、ＲＰＬは、全てに細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られる。好ましくは、マージされるピーク領域は、重複するピーク領域である。
【0029】
好ましくは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅はＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され、より好ましくは、その情報はＥＮＣＯＤＥデータベースから得られる。
好ましい実施形態では、各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定することは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子（すなわち、ポイズド遺伝子）を除外することを含む。
好ましい実施形態では、各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定することは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子（すなわち、ポイズド遺伝子）を除外することを含む。
【0030】
任意の実施形態では、ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳを決定することは、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の差（バックグラウンドＨ３Ｋ４ｍｅ３幅と比較した）に関する情報を、その差の有意性と組み合わせることを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＢＳを決定することは、ピーク幅の差とその差の有意性とを乗算、正規化または加算することを含み得、好ましくは、ＤＢＳは、ピーク幅の差とその差の有意性とを加算することによって決定される。より好ましくは、ＤＢＳは、ピーク幅の差と有意性の－ｌｏｇ１０値とを加算することによって決定される。
【0031】
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差の有意性は、任意の標準的な統計的方法によって決定され得る。一例では、使用される方法は一標本ウィルコクソン検定である。
好ましい実施形態では、ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得ることは、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞のＤＢＳを、各遺伝子についての標的細胞のＤＢＳから減算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得ることを含む。各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳは、ソース細胞と標的細胞との間の所与のタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差の尺度を提供する。
好ましい実施形態では、ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得ることは、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞のＤＢＳを、各遺伝子についての標的細胞のＤＢＳから減算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得ることを含む。各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳは、ソース細胞と標的細胞との間の所与のタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差の尺度を提供する。
【0032】
好ましくは、ソース細胞から標的細胞への細胞変換についてのネットワークスコアは、ネットワークにおける関連する遺伝子の細胞変換ΔＤＢＳの加重された組合せである。例えば、細胞変換についてのネットワークスコアを決定することは、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳ、遺伝子の出次数ノードの数、およびネットワークにおける遺伝子の関連性のレベルに関する情報を組み合わせることを含み得る。好ましい実施形態では、ネットワークスコアは、関連する遺伝子の細胞変換ΔＤＢＳを合計することによって決定され、ネットワークにおける関連する遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳの加重和を得るために、遺伝子の出次数ノードの数および関連性のレベルについて加重される。
【0033】
典型的に、タンパク質間相互作用ネットワークは、ＳＴＲＩＮＧデータベースであるが、所与の細胞型内のタンパク質の相互作用に関する情報を含む、本明細書で言及される任意のサブネットワークが使用されてもよい。
【0034】
細胞変換同一性スコア（細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳ）は、細胞の同一性の変化に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標であると理解される。
任意の実施形態では、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定することは、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含み得る。
任意の実施形態では、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定することは、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含み得る。
【0035】
任意の実施形態では、各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定することは、細胞変換ΔＤＢＳスコアと、全てのタンパク質コード遺伝子にわたる正規化された細胞変換ネットワークスコアとを加算することを含む。好ましくは、細胞変換ΔＤＢＳと細胞変換ネットワークスコアとを加算することは、２：１、１：１、３：１、４：１、５：１、および１：２の係数によって細胞変換ネットワークスコアに対して細胞変換ΔＤＢＳを加重することをさらに含む。より好ましくは、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳは、ネットワークスコアに対して２の係数によって細胞変換ΔＤＢＳスコアを加重することによって決定される。
【0036】
任意の実施形態では、その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップは、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳ値に基づいて遺伝子を順序付けることを含む。
【0037】
好ましい実施形態では、細胞変換因子は、転写因子、またはエピジェネティックリモデリング因子を含む。したがって、方法は、転写因子をコードする遺伝子を選択し、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な転写因子を同定するステップをさらに含み得る。好ましくは、変換は、分化した標的細胞への分化したソース細胞の分化転換である。
【0038】
代替の実施形態では、方法は、受容体－リガンド対をコードするタンパク質コード遺伝子を選択し、それによって標的細胞へのソース細胞の変換に必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む。好ましくは、標的細胞へのソース細胞の変換に必要な因子は、細胞表面受容体または細胞シグナル伝達に関与するリガンドからなる群から選択される。好ましくは、標的細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定することは、その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳスコアに従って細胞表面受容体をコードする各遺伝子をランク付けすることを含む。方法は、各リガンドについての細胞変換ΔＤＢＳスコアに基づいて受容体に関連付けられたリガンドに優先順位を付けて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得るステップであって、組み合わせたランク付けは、標的細胞へのソース細胞の変換のための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、ステップをさらに含み得る。好ましくは、変換は、多能性ソース細胞から分化した標的細胞への指向性分化である。
【0039】
したがって、本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞（Ｓ）、および標的細胞（Ｔ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ ソース細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを示す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｓ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ 標的細胞と、バックグラウンド遺伝子幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子幅スコアの中央値との間の遺伝子幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｔ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＴ ｇ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅Ｓ ｇとＰｖａｌＳ ｇ値とを加算して、ソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を得るステップと、
－ Δピーク幅Ｔ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）を得るステップと、
－ 標的細胞における同じ遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）からソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を減算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳ（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を組み合わせることによって標的細胞における各遺伝子についてのネットワークスコア（ＮＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）の加重和が、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 全てのタンパク質コード遺伝子にわたって細胞変換ネットワークスコアＮｅｔＴ－Ｓ ｇを正規化するステップと、
－ 細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）と細胞変換ネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）の組合せに基づいて各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換調節微分幅広スコア（ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇは、ソース細胞と比較した標的細胞に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の差の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定する、方法を提供する。
－ 目的の細胞（Ｓ）、および標的細胞（Ｔ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ ソース細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを示す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｓ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ 標的細胞と、バックグラウンド遺伝子幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子幅スコアの中央値との間の遺伝子幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｔ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＴ ｇ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅Ｓ ｇとＰｖａｌＳ ｇ値とを加算して、ソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を得るステップと、
－ Δピーク幅Ｔ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）を得るステップと、
－ 標的細胞における同じ遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）からソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を減算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳ（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を組み合わせることによって標的細胞における各遺伝子についてのネットワークスコア（ＮＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）の加重和が、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 全てのタンパク質コード遺伝子にわたって細胞変換ネットワークスコアＮｅｔＴ－Ｓ ｇを正規化するステップと、
－ 細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）と細胞変換ネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）の組合せに基づいて各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換調節微分幅広スコア（ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇは、ソース細胞と比較した標的細胞に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の差の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定する、方法を提供する。
【0040】
好ましくは、ネットワークにおける実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、遺伝子ノード間の相互作用が選択される。
さらなる実施形態では、ネットワークスコアを決定することは、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しない遺伝子を、タンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む。
さらなる実施形態では、ネットワークスコアを決定することは、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しない遺伝子を、タンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む。
【0041】
好ましくは、目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けすることは、微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ
ｇ）と、遺伝子についてのネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ
ｇ）とを加算することを含み、より好ましくは、微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ
ｇ）は、ネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ
ｇ）に対して少なくとも２の係数によって加重される。
【0042】
上記の態様の任意の実施形態では、方法は、転写因子をコードするタンパク質コード遺伝子のサブセットを選択し、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な転写因子を同定するステップを含む。好ましくは、同定される因子は、分化した標的細胞への分化したソース細胞の分化転換のためである。
【0043】
上記の態様のさらなる実施形態では、方法は、受容体－リガンド対をコードするタンパク質コード遺伝子を選択し、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む。好ましくは、同定される因子は、分化した標的細胞への多能性ソース細胞の指向性分化のためである。
【0044】
さらなる実施形態では、方法は、受容体をコードする遺伝子および受容体－リガンド対における受容体リガンドをコードする遺伝子の組み合わせたランクを決定するステップであって、ランク付けは、受容体およびリガンドのそれぞれについてのＲｅｇＤＢＳ、およびＤＢＳに基づき、それによって細胞維持に必要な受容体－リガンド対を同定する、ステップをさらに含む。
【0045】
上記の態様のさらなる実施形態では、方法は、転写的に冗長なＴＦを、各細胞型からのランク付けしたリストから除去するステップをさらに含む。
なおさらに、上記の方法のいずれかにおいて、方法は、続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するか、または標的細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換するように、目的の細胞の集団、またはソース細胞を、同定された因子の１つまたは複数と接触させるステップを含み得る。あるいは、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するか、または標的細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換するように、目的のソース細胞の細胞に、１つまたは複数の因子をコードする核酸をトランスフェクトするステップを含み得る。
なおさらに、上記の方法のいずれかにおいて、方法は、続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するか、または標的細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換するように、目的の細胞の集団、またはソース細胞を、同定された因子の１つまたは複数と接触させるステップを含み得る。あるいは、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するか、または標的細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換するように、目的のソース細胞の細胞に、１つまたは複数の因子をコードする核酸をトランスフェクトするステップを含み得る。
【0046】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に目的の細胞の集団を提供するステップと、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じ遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＲｅｇＤＢＳを決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳは細胞同一性についての各タンパク質コード遺伝子の重要性の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードするステップと、
－ 目的の細胞の集団を、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子のうちの１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に目的の細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する、方法を提供する。
－ 細胞培養中に目的の細胞の集団を提供するステップと、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じ遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＲｅｇＤＢＳを決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳは細胞同一性についての各タンパク質コード遺伝子の重要性の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードするステップと、
－ 目的の細胞の集団を、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子のうちの１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に目的の細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する、方法を提供する。
【0047】
ある特定の実施形態では、細胞を因子と接触させることは、因子をコードする１つまたは複数の核酸分子を細胞にトランスフェクトし、細胞内で因子を発現することを含み得る。あるいは、接触させることは、細胞を、１つまたは複数の因子の発現を増加させる作用物質と接触させることを含み得る。
【0048】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する方法であって、順に以下のステップ：
－ 細胞培養中に星状膠細胞の集団を提供するステップと、
－ 星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、星状膠細胞の集団を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントから選択される因子のセットと接触させるステップと、
－ 細胞培養中に星状膠細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で星状膠細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する、方法を提供する。
－ 細胞培養中に星状膠細胞の集団を提供するステップと、
－ 星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、星状膠細胞の集団を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントから選択される因子のセットと接触させるステップと、
－ 細胞培養中に星状膠細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で星状膠細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する、方法を提供する。
【0049】
好ましくは、因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【0050】
ある特定の実施形態では、方法は、星状膠細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３のうちの１つもしくは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つと接触させるステップを含む。
【0051】
好ましい実施形態では、方法は、星状膠細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３と接触させるステップを含む。
【0052】
一実施形態では、方法は、星状膠細胞を、少なくともＦＮ１、ＬＡＭＢ１またはＣＯＬ１Ａ２と接触させるステップ（任意選択により、星状膠細胞を、ＦＮ１およびＬＡＭＢ１またはＦＮ１およびＣＯＬ１Ａ２またはＦＮ１、ＬＡＭＢ１およびＣＯＬ１Ａ２の３つ全てと接触させるステップ）を含む。任意選択により、ＣＯＬ４Ａ１、ＡＤＡＭ１２、およびＥＤＩＬ３のうちの１つまたは複数もまた、星状膠細胞と接触させるために使用される。
【0053】
任意の実施形態では、因子、例えば、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３のいずれか１つの機能的バリアントが使用されてもよい。
【0054】
本明細書に記載される任意の方法では、その方法は、本方法に従って作製された星状膠細胞、または細胞集団を個体に投与するステップをさらに含み得る。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に心筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 心筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、心筋細胞の集団を、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に心筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で心筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する、方法を提供する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に心筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 心筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、心筋細胞の集団を、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に心筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で心筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する、方法を提供する。
【0055】
好ましくは、因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【0056】
ある特定の実施形態では、方法は、心筋細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２のうちの１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上または９つと接触させるステップを含む。
【0057】
好ましい実施形態では、方法は、心筋細胞を、少なくともＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１（コラーゲンＩＩＩ）、ＴＦＰ１、ＦＧＦ７およびＡＰＯＥ、またはそれらの機能的バリアントと接触させるステップを含む。
【0058】
さらなる好ましい実施形態では、方法は、心筋細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２と接触させるステップを含む。
【0059】
任意の実施形態では、因子、例えば、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２のいずれか１つの機能的バリアントが使用されてもよい。
【0060】
本明細書に記載される任意の方法では、その方法は、本方法に従って作製された心筋細胞、または細胞集団を個体に投与するステップをさらに含み得る。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に平滑筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 平滑筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、平滑筋細胞の集団を、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に平滑筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で平滑筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持する、方法を提供する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に平滑筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 平滑筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、平滑筋細胞の集団を、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に平滑筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で平滑筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持する、方法を提供する。
【0061】
好ましくは、因子は、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【0062】
ある特定の実施形態では、方法は、平滑筋細胞を、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１のうちの１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、または９つ以上と接触させるステップを含む。
【0063】
好ましい実施形態では、方法は、平滑筋細胞を、コラーゲン４、ＮＩＤ１、コラーゲン６、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、コラーゲン１およびＴＨＢＳ１と接触させるステップを含む。
【0064】
任意の実施形態では、因子、例えば、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１のいずれか１つの機能的バリアントが使用されてもよい。
【0065】
本明細書に記載される任意の方法では、その方法は、本方法に従って作製された平滑筋細胞、または細胞集団を個体に投与するステップをさらに含み得る。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、内皮細胞、好ましくは大動脈内皮細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に内皮細胞の集団を提供するステップと、
－ 内皮細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、内皮細胞の集団を、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に内皮細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で内皮細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞の集団を維持する、方法を提供する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、内皮細胞、好ましくは大動脈内皮細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に内皮細胞の集団を提供するステップと、
－ 内皮細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、内皮細胞の集団を、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１から選択される１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に内皮細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で内皮細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞の集団を維持する、方法を提供する。
【0066】
好ましくは、因子は、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【0067】
ある特定の実施形態では、方法は、内皮細胞を、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、または９つ以上と接触させるステップを含む。
【0068】
好ましい実施形態では、方法は、内皮細胞を、ＢＭＰ６、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１と接触させるステップを含む。
任意の実施形態では、因子、例えば、ＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１のいずれか１つの機能的バリアントが使用されてもよい。
任意の実施形態では、因子、例えば、ＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１のいずれか１つの機能的バリアントが使用されてもよい。
【0069】
本明細書に記載される任意の方法では、その方法は、本方法に従って作製された内皮細胞、または細胞集団を個体に投与するステップをさらに含み得る。
目的の細胞を維持するための上記の方法のいずれかにおいて、その方法は、分化転換している細胞、未分化細胞、分化した細胞および分化転換した細胞を維持する方法を含み得る。
目的の細胞を維持するための上記の方法のいずれかにおいて、その方法は、分化転換している細胞、未分化細胞、分化した細胞および分化転換した細胞を維持する方法を含み得る。
【0070】
本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換方法であって、
－ 本明細書に記載される任意の方法によって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定するステップと、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞を、標的細胞へのソース細胞の変換のために同定された因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する、方法を提供する。
－ 本明細書に記載される任意の方法によって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定するステップと、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞を、標的細胞へのソース細胞の変換のために同定された因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する、方法を提供する。
【0071】
本発明はまた、標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換方法であって、
－ 本明細書に記載される任意の方法によって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定するステップと、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞を、標的細胞へのソース細胞の変換のための同定された１つまたは複数の因子と接触させるか、またはそれらの因子の量を増加させるステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する、方法を提供する。
－ 本明細書に記載される任意の方法によって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定するステップと、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞を、標的細胞へのソース細胞の変換のための同定された１つまたは複数の因子と接触させるか、またはそれらの因子の量を増加させるステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する、方法を提供する。
【0072】
好ましい実施形態では、ソース細胞はＨ９胚性幹細胞であり、標的細胞型は表３に記載された細胞型のいずれかである。
量を「増加させる」は、ソース細胞において１つまたは複数の因子をコードする核酸を発現させること、またはソース細胞を、細胞によって因子の発現を増加させるための作用物質と接触させることを含み得る。
量を「増加させる」は、ソース細胞において１つまたは複数の因子をコードする核酸を発現させること、またはソース細胞を、細胞によって因子の発現を増加させるための作用物質と接触させることを含み得る。
【0073】
本発明は、ソース細胞を分化させるための方法であって、ソース細胞を、１つもしくは複数の因子またはそのバリアントと接触させるステップ、あるいはソース細胞において１つもしくは複数の因子またはそのバリアントのタンパク質発現を増加させるステップであって、ソース細胞は標的細胞の少なくとも１つの特徴を示すように分化する、ステップを含み、
－ ソース細胞は多能性幹細胞または前駆細胞であり、標的細胞は表３に記載された細胞のいずれかであり、
－ 因子は、所与の標的細胞型についての表３に記載された因子から選択される、方法を提供する。任意選択により、表３に記載された因子の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、または９つ以上、または１０個以上、または１１個以上、または１２個以上、または１３個以上、または１４個以上が、この方法に使用される。
－ ソース細胞は多能性幹細胞または前駆細胞であり、標的細胞は表３に記載された細胞のいずれかであり、
－ 因子は、所与の標的細胞型についての表３に記載された因子から選択される、方法を提供する。任意選択により、表３に記載された因子の２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、または９つ以上、または１０個以上、または１１個以上、または１２個以上、または１３個以上、または１４個以上が、この方法に使用される。
【0074】
本発明は、ソース細胞を分化させるための方法であって、ソース細胞において１つもしくは複数の因子またはそのバリアントのタンパク質発現を増加させるステップであって、ソース細胞は標的細胞の少なくとも１つの特徴を示すように分化する、ステップを含み、
－ ソース細胞は多能性幹細胞または前駆細胞であり、標的細胞は星状膠細胞であり、
－ 因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３から選択される、方法を提供する。
－ ソース細胞は多能性幹細胞または前駆細胞であり、標的細胞は星状膠細胞であり、
－ 因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３から選択される、方法を提供する。
【0075】
本発明は、多能性幹細胞または前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する方法であって、
－ ソース細胞において、多能性幹細胞または前駆細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントから選択される因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 星状膠細胞への分化を可能にするのに十分な時間および条件下で多能性幹細胞または前駆細胞を培養し、それによって多能性幹細胞または前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
－ ソース細胞において、多能性幹細胞または前駆細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントから選択される因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 星状膠細胞への分化を可能にするのに十分な時間および条件下で多能性幹細胞または前駆細胞を培養し、それによって多能性幹細胞または前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【0076】
本発明はまた、多能性幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、または前駆細胞を分化するための方法であって、幹細胞において、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントのうちの１つまたは複数のタンパク質発現を増加させるステップであって、幹細胞は、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示すように分化する、ステップを含む、方法を提供する。
【0077】
本発明は、多能性幹細胞、好ましくは胚性幹細胞、または前駆細胞を、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞に分化するための方法であって、ｉ）多能性幹細胞もしくは前駆細胞、または多能性幹細胞もしくは前駆細胞を含む細胞集団を準備するステップと、ｉｉ）前記多能性幹細胞に、星状膠細胞の細胞同一性に重要な１つまたは複数の因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸をトランスフェクトするステップと、ｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、任意選択により、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴について細胞または細胞集団をモニタリングするステップであって、好ましくは、多能性幹細胞もしくは前駆細胞を星状膠細胞に分化するための因子、または星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、ステップとを含む、方法を提供する。
【0078】
ある特定の実施形態では、前駆細胞は、好ましくは、神経前駆細胞または神経前駆細胞の集団から得られた細胞である。
好ましくは、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。
好ましくは、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。
【0079】
本発明は、胚性幹細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する方法であって、
－ 胚性幹細胞において、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントのうちのいずれか１つまたは複数の量を増加させるステップと、
－ 星状膠細胞に分化するのに十分な時間および条件下で胚性幹細胞を培養し、それによって胚性幹細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
－ 胚性幹細胞において、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントのうちのいずれか１つまたは複数の量を増加させるステップと、
－ 星状膠細胞に分化するのに十分な時間および条件下で胚性幹細胞を培養し、それによって胚性幹細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法を提供する。
【0080】
ある特定の実施形態では、上記に列挙した因子の１つまたは複数の量を増加させることは、ソース細胞（すなわち、幹細胞）において因子の１つまたは複数をコードする核酸を発現させることを含む。あるいは、因子は、細胞培養培地によって細胞に直接提供され得る。
【0081】
典型的に、細胞分化を標的とするのに好適な条件は、十分な時間および好適な培地中で細胞を培養することを含む。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日であり得る。好適な培地は表４に示されるものであり得る。
【0082】
好ましくは、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つもしくは複数の星状膠細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、当業者に公知である。星状膠細胞についての例示的なマーカーには、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ４４およびＧＬＡＳＴ１、または表１に記載されたマーカーのいずれかが含まれる。
【0083】
好ましくは、心筋細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つもしくは複数の心筋細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、当業者に公知である。心筋細胞についての例示的なマーカーには、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ＡＣＴＮ１、ＣＤＨ２およびＧＪＡ１、または表１に記載されたマーカーのいずれかが含まれる。
【0084】
好ましくは、平滑筋細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つもしくは複数の平滑筋細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、当業者に公知である。平滑筋細胞についての例示的なマーカーには、ＳＭ２２およびα－ＳＭＡ、または表１に記載されたマーカーのいずれかが含まれる。
【0085】
好ましくは、内皮細胞の少なくとも１つの特徴は、任意の１つもしくは複数の内皮細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、当業者に公知である。内皮細胞についての例示的なマーカーには、ＣＤ３１およびＶＷＦ、または表１に記載されたマーカーのいずれかが含まれる。
【0086】
本発明はまた、本明細書に記載される方法によって産生された、星状膠細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、または内皮細胞のうちの少なくとも１つの特徴を示す細胞を提供する。
本明細書に記載される任意の方法において、その方法は、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を増殖させて、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す集団における細胞の割合を増加させるステップをさらに含み得る。細胞を増殖させるステップは、以下に記載されるように細胞の集団を生成するのに十分な時間および条件下で培養中であり得る。
本明細書に記載される任意の方法において、その方法は、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を増殖させて、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す集団における細胞の割合を増加させるステップをさらに含み得る。細胞を増殖させるステップは、以下に記載されるように細胞の集団を生成するのに十分な時間および条件下で培養中であり得る。
【0087】
本明細書に記載される任意の方法において、その方法は、心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を増殖させて、心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す集団における細胞の割合を増加させるステップをさらに含み得る。細胞を増殖させるステップは、以下に記載されるように細胞の集団を生成するのに十分な時間および条件下で培養中であり得る。
【0088】
本明細書に記載される任意の方法において、その方法は、星状膠細胞、心筋細胞、平滑筋細胞または内皮細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞、または細胞を含む細胞集団を個体に投与するステップをさらに含み得る。
【0089】
本発明はまた、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持するため、または（ｉｉ）多能性幹細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための因子のセットを含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントから選択される因子のセットを含む。好ましくは、因子のセットは、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。ある特定の実施形態では、組成物は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２、ＷＮＴ５Ａ、ＣＯＬ１Ａ２およびＥＤＩＬ３、またはそれらのバリアントのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つを含み得る。一実施形態では、組成物は、少なくともＦＮ１、ＬＡＭＢ１またはＣＯＬ１Ａ２（任意選択により、ＦＮ１およびＬＡＭＢ１またはＦＮ１およびＣＯＬ１Ａ２または３つ全て）を含む。任意選択により、組成物は、ＣＯＬ４Ａ１、ＡＤＡＭ１２、およびＥＤＩＬ３のうちの１つまたは複数をさらに含む。
【0090】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持するための因子のセットを含む組成物を提供する。好ましくは、組成物は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２、またはそれらのバリアントから選択される因子のセットを含む。好ましくは、因子のセットは、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２、またはそれらのバリアントを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。ある特定の実施形態では、組成物は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２、またはそれらのバリアントのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、または９つを含み得る。最も好ましくは、因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１（コラーゲンＩＩＩ）、ＴＦＰ１、ＦＧＦ７およびＡＰＯＥを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【0091】
任意の態様では、組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養中の細胞の成長または維持を支持するための１つまたは複数の成分をさらに含み得る。
任意の態様では、組成物は、細胞培養培地であってもよい。
任意の態様では、組成物は、細胞培養培地であってもよい。
【0092】
任意の態様では、組成物は、因子（すなわちタンパク質）または因子をコードする核酸を含み得る。
本発明はまた、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持するため、（ｉｉ）多能性幹細胞もしくは前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するため、または（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持するため、（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持するため、または（ｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞の集団を維持するための細胞培養培地を産生する方法であって、
本明細書に記載される組成物を細胞培養培地に添加するステップを含む、方法を提供する。
本発明はまた、（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持するため、（ｉｉ）多能性幹細胞もしくは前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するため、または（ｉｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持するため、（ｉｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで平滑筋細胞の集団を維持するため、または（ｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞の集団を維持するための細胞培養培地を産生する方法であって、
本明細書に記載される組成物を細胞培養培地に添加するステップを含む、方法を提供する。
【0093】
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が本明細書に記載される方法によって産生される、細胞の集団を提供する。好ましくは、集団内の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す。
【0094】
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が本明細書に記載される方法によって産生される、細胞の集団を提供する。好ましくは、集団内の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す。
【0095】
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が、平滑筋細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が本明細書に記載される方法によって産生される、細胞の集団を提供する。好ましくは、集団内の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、平滑筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す。
【0096】
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が本明細書に記載される方法によって産生される、細胞の集団を提供する。好ましくは、集団内の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、内皮細胞の少なくとも１つの特徴を示す。
【0097】
本発明はまた、本明細書に開示されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持する際に使用するためのキットに関する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される因子またはそのバリアントをコードする１つまたは複数の核酸配列を有する１つまたは複数の核酸を含む。あるいは、キットは、本明細書に記載される使用のための細胞培養培地を補充するための１つまたは複数のタンパク質因子を含む。好ましくは、キットは、培養中に星状膠細胞、心筋細胞、平滑筋細胞または内皮細胞を維持するために使用され得る。一部の実施形態では、キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞、好ましくは、星状膠細胞、心筋細胞、平滑筋細胞または内皮細胞を維持するための使用説明書をさらに含む。
【0098】
本発明はまた、標的細胞、好ましくは、本明細書に開示される星状膠細胞または心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を産生するためのキットに関する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される因子またはそのバリアントをコードする１つまたは複数の核酸配列を有する１つまたは複数の核酸を含む。あるいは、キットは、本明細書に記載される指向性分化に使用するための培地を補充するための１つまたは複数のタンパク質を含み得る。好ましくは、キットは、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴または心筋細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を産生するために使用され得る。好ましくは、キットは、胚性幹細胞と共に使用され得る。一部の実施形態では、キットは、本明細書に開示される方法に従って標的細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換するための使用説明書をさらに含む。好ましくは、本発明は、本明細書に記載される本発明の方法に使用される場合にキットを提供する。
【0099】
好ましい実施形態
以下の記述は本発明の好ましい実施形態に関する。
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための方法であって、
－ 細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって前記細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性と関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 前記目的の細胞を、前記細胞の細胞同一性と関連付けられた因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
以下の記述は本発明の好ましい実施形態に関する。
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための方法であって、
－ 細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ 前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップと、
－ ＤＢＳおよびネットワークスコアの組合せに基づいて前記細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって前記細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性と関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 前記目的の細胞を、前記細胞の細胞同一性と関連付けられた因子の１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
【0100】
２．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持する方法であって、
ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、前記目的の細胞を少なくとも２つの因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、前記目的の細胞を少なくとも２つの因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
【0101】
３．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持する方法であって、
ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、前記目的の細胞を１つもしくは複数の因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
ｉ．細胞培養中に目的の細胞を提供するステップと、
ｉｉ．前記細胞の維持を促進する因子またはそのバリアントをコードするタンパク質コード遺伝子を同定するステップであって、タンパク質コード遺伝子は、少なくとも１つのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含む、ステップと、
ｉｉｉ．前記細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、前記目的の細胞を１つもしくは複数の因子またはそのバリアントと接触させるステップと、
ｉｖ．細胞培養中に前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で前記目的の細胞を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持する、方法。
【0102】
４．目的の細胞が、分化した細胞、分化している細胞、未分化細胞または分化転換した細胞である、記述１から３のいずれか一つに記載の方法。
５．目的の細胞が組織である、記述１から４のいずれか一つに記載の方法。
５．目的の細胞が組織である、記述１から４のいずれか一つに記載の方法。
【0103】
６．目的の細胞が、外胚葉、中胚葉および内胚葉の胚葉に由来する細胞から選択される、記述１から５のいずれか一つに記載の方法。
７．目的の細胞が、星状膠細胞、ニューロスフェア、心筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞、メラニン細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、および単核細胞、または表２に記載された細胞もしくは組織のいずれかからなる群から選択される、記述１から６のいずれか一つに記載の方法。
７．目的の細胞が、星状膠細胞、ニューロスフェア、心筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞、メラニン細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、および単核細胞、または表２に記載された細胞もしくは組織のいずれかからなる群から選択される、記述１から６のいずれか一つに記載の方法。
【0104】
８．細胞同一性に関連付けられた因子が、表２に記載された因子のいずれか１つまたは複数である、記述１から７のいずれか一つに記載の方法。
９．目的の細胞が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日またはそれ以上の間、細胞を培養することを含む、前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で培養される、記述１から８のいずれか一つに記載の方法。
９．目的の細胞が、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日またはそれ以上の間、細胞を培養することを含む、前記細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で培養される、記述１から８のいずれか一つに記載の方法。
【0105】
１０．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅が、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての平均遺伝子ピーク幅スコアとの差を計算し、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述１から９のいずれか一つに記載の方法。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての平均遺伝子ピーク幅スコアとの差を計算し、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述１から９のいずれか一つに記載の方法。
【0106】
１１．遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップが、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾が存在するゲノムの領域を最初に定義し、それらの領域をヒストン修飾参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）と定義することを含む、記述１０に記載の方法。
【0107】
１２．ＲＰＬが、全ての細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られ、好ましくは、マージされるピーク領域が重複するピーク領域である、記述１０に記載の方法。
【0108】
１３．各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子を除外することを含み、遺伝子がポイズド遺伝子として同定される、記述９から１２のいずれか一つに記載の方法。
【0109】
１４．細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップが、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含む、記述１から１３のいずれか一つに記載の方法。
【0110】
１５．ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための因子が、細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対、好ましくは受容体－リガンド対のリガンド、転写因子、およびエピジェネティックリモデリング因子からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【0111】
１６．細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む、記述１から１５のいずれか一つに記載の方法。
【0112】
１７．細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子が、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従ってランク付けされ、受容体に関連付けられた各リガンドが、そのＤＢＳスコアに従ってランク付けされて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得、組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、記述１６に記載の方法。
【0113】
１８．細胞同一性遺伝子が、ＷＮＴ、ＮＯＴＣＨ、Ｈｅｇｄｅｈｏｇ、Ｈｉｐｐｏ、ＧＰＣＲ、インテグリン、ＴＧＦＢファミリー（ＢＭＰ、アクチビン、ＴＧＦＢ受容体）、受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＭＥＴ、ＭＳＴ、ＳＣＦ－ＫＩＴ、インスリン受容体、ＥＲＢＢ２、ＮＴＲＫなど）、非受容体チロシンキナーゼ（ＰＴＫ６）、ＭＴＯＲ、およびレチノイン酸によるシグナル伝達などの細胞シグナル伝達経路に関与する受容体－リガンド対をコードする、記述１６または１７に記載の方法。
【0114】
１９．転写因子をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な転写因子を同定するステップをさらに含む、記述１から１８のいずれか一つに記載の方法。
【0115】
２０．ネットワークスコアを決定するステップが、タンパク質間相互作用ネットワークからの関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しないタンパク質コード遺伝子を除去することを含む、記述１から１９のいずれか一つに記載の方法。
【0116】
２１．細胞を、２つ以上の因子の発現を増加させる作用物質と接触させることによって、目的の細胞が因子の２つ以上と接触する、記述１から２０のいずれか一つに記載の方法。
【0117】
２２．作用物質が、ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマーおよび小分子ならびにそれらの類似体またはバリアントからなる群から選択される、記述２１に記載の方法。
２３．記述１から２２のいずれか一つに記載の方法を実施することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法。
２３．記述１から２２のいずれか一つに記載の方法を実施することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法。
【0118】
２４．細胞の少なくとも５％が目的の細胞の少なくとも１つの特徴を示し、それらの細胞が、記述１から２２のいずれか一つに記載の方法によって産生される、細胞の集団。
２５．集団における細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、目的の細胞の少なくとも１つの特徴を示す、記述２４に記載の細胞の集団。
２５．集団における細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、目的の細胞の少なくとも１つの特徴を示す、記述２４に記載の細胞の集団。
【0119】
２６．目的の細胞を個体に投与するステップ、または請求項２２もしくは２３に記載の細胞の集団を個体に投与するステップをさらに含む、記述１から２３のいずれか一つに記載の方法。
【0120】
２７．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する方法であって、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾における差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークが、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと、
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換し、任意選択により、１つまたは複数の因子の量を増加させることは、ｉ）ソース細胞を、因子もしくは細胞によって因子の発現を増加させる作用物質と接触させること、またはｉｉ）因子をコードする核酸をソース細胞にトランスフェクトし、細胞において核酸を発現させることを含む、方法。
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾における差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークが、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと、
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換し、任意選択により、１つまたは複数の因子の量を増加させることは、ｉ）ソース細胞を、因子もしくは細胞によって因子の発現を増加させる作用物質と接触させること、またはｉｉ）因子をコードする核酸をソース細胞にトランスフェクトし、細胞において核酸を発現させることを含む、方法。
【0121】
２８．変換する方法が、分化、再プログラミングまたは分化転換する方法である、記述２７に記載の方法。
２９．ソース細胞が、分化した細胞、分化している細胞、未分化細胞または分化転換した細胞である、記述２７に記載の方法。
２９．ソース細胞が、分化した細胞、分化している細胞、未分化細胞または分化転換した細胞である、記述２７に記載の方法。
【0122】
３０．ソース細胞が胚性幹細胞であり、標的細胞が表３に記載された細胞の１つである、記述２７に記載の方法。
３１．ソース細胞が胚性幹細胞であり、ソース細胞を変換するための因子が表３に記載されている、記述３０に記載の方法。
３１．ソース細胞が胚性幹細胞であり、ソース細胞を変換するための因子が表３に記載されている、記述３０に記載の方法。
【0123】
本明細書で使用される場合、文脈上別段の必要がある場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などのその用語の変形は、さらなる付加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図しない。
【0124】
本発明のさらなる態様および前述の段落に記載される態様のさらなる実施形態は、例として、および添付の図面を参照して与えられた以下の説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0125】
【図1-1】Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾により細胞同一性遺伝子をマークする。（Ａ）この研究に使用した細胞型の数を示すベン図である。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑによるヒストン修飾データならびにＥＮＣＯＤＥリポジトリから得たＲＮＡ－ｓｅｑによる遺伝子発現データ。（Ｂ）ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅およびピーク高さを定義する図である。（Ｃ）細胞型の代表的なＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルに対する遺伝子注釈の図である。ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングし、細胞型間のピークを比較するために、本発明者らは、全ての細胞型にわたってＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルをマージすることによって参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を定義した。この表は、各ＲＰＬに割り当てられた遺伝子ならびに各遺伝子座における計算したピーク幅（Ｂ）および高さ（Ｈ）の値をまとめている。（Ｄ）４０の共通の細胞型にわたる関連付けられたＨ３Ｋ４ｍｅ３ピーク幅および遺伝子発現によって順序付けられた遺伝子による細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子セットについてのエンリッチメントの図である。ｘ軸は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３幅の値または降順でランク付けされた遺伝子発現レベルによる遺伝子の累積ビンからなり、累積ビンは１パーセンタイル間隔で増加する。エンリッチメントスコアは、ＦＥＴ（フィッシャーの正確検定）を使用してコンピューターで計算する。（Ｅ）同様に、１１１の細胞型にわたって、細胞同一性遺伝子セットについての最も高いエンリッチメントスコアが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３幅の値によってランク付けされ、ピーク幅分布の８７％超の関連付けられたＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有する遺伝子について達成される図である。ｎは細胞型の数を指す。
【図1-2】Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾により細胞同一性遺伝子をマークする。（Ａ）この研究に使用した細胞型の数を示すベン図である。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑによるヒストン修飾データならびにＥＮＣＯＤＥリポジトリから得たＲＮＡ－ｓｅｑによる遺伝子発現データ。（Ｂ）ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅およびピーク高さを定義する図である。（Ｃ）細胞型の代表的なＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルに対する遺伝子注釈の図である。ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングし、細胞型間のピークを比較するために、本発明者らは、全ての細胞型にわたってＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルをマージすることによって参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を定義した。この表は、各ＲＰＬに割り当てられた遺伝子ならびに各遺伝子座における計算したピーク幅（Ｂ）および高さ（Ｈ）の値をまとめている。（Ｄ）４０の共通の細胞型にわたる関連付けられたＨ３Ｋ４ｍｅ３ピーク幅および遺伝子発現によって順序付けられた遺伝子による細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子セットについてのエンリッチメントの図である。ｘ軸は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３幅の値または降順でランク付けされた遺伝子発現レベルによる遺伝子の累積ビンからなり、累積ビンは１パーセンタイル間隔で増加する。エンリッチメントスコアは、ＦＥＴ（フィッシャーの正確検定）を使用してコンピューターで計算する。（Ｅ）同様に、１１１の細胞型にわたって、細胞同一性遺伝子セットについての最も高いエンリッチメントスコアが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３幅の値によってランク付けされ、ピーク幅分布の８７％超の関連付けられたＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有する遺伝子について達成される図である。ｎは細胞型の数を指す。
【図2-1】細胞同一性遺伝子の同定および細胞維持についてのシグナル伝達分子の予測。（Ａ）関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを使用して細胞同一性遺伝子をモデル化するために開発されたデータ駆動型方法の概略図である。各遺伝子について、微分幅広スコア（ＤＢＳ）を、目的の標的細胞型とバックグラウンド細胞型との間の幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の値を比較することによってコンピューターで計算する。ＤＢＳは、関連付けられた幅の値の差（Δピーク幅）およびこの差の有意性（Ｐ値）として計算された集成値である。タンパク質コード遺伝子をＤＢＳによってランク付けする。（Ｂ）調節作用を用いて遺伝子に優先順位を付けるために、各遺伝子について、調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を、遺伝子のＤＢＳおよびタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークにおける関連する遺伝子のＤＢＳの加重和としてコンピューターで計算する図である。（ｉ）細胞同一性遺伝子および（ｉｉ）細胞維持についてのシグナル伝達分子を予測するために細胞特異的ＲｅｇＤＢＳを使用する。（Ｃ）ピーク幅の値（ピーク幅）、ＤＢＳおよびＲｅｇＤＢＳによってランク付けされた遺伝子などの異なるスコアリングメトリックによる細胞同一性遺伝子セットについてのエンリッチメントを、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント分析）によってコンピューターで計算する図である。各スコアリングメトリックについて、全ての細胞型にわたるＧＳＥＡエンリッチメントスコアの合計（ＮＥＳ＊－ｌｏｇ１０ｐ値）を示す。（Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持についての受容体およびリガンドのようなシグナル伝達分子のＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測の図である。受容体は目的の細胞型によって産生されるが、リガンドは、細胞型自体または支持細胞型によって産生され得る。受容体およびリガンド対を、受容体のＲｅｇＤＢＳおよび対応するリガンドのＤＢＳ値に基づいてランク付けする。ランク付けした受容体－リガンド対からの上位の予測リガンドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持のために培養条件に加える。
【図2-2】細胞同一性遺伝子の同定および細胞維持についてのシグナル伝達分子の予測。（Ａ）関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを使用して細胞同一性遺伝子をモデル化するために開発されたデータ駆動型方法の概略図である。各遺伝子について、微分幅広スコア（ＤＢＳ）を、目的の標的細胞型とバックグラウンド細胞型との間の幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の値を比較することによってコンピューターで計算する。ＤＢＳは、関連付けられた幅の値の差（Δピーク幅）およびこの差の有意性（Ｐ値）として計算された集成値である。タンパク質コード遺伝子をＤＢＳによってランク付けする。（Ｂ）調節作用を用いて遺伝子に優先順位を付けるために、各遺伝子について、調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を、遺伝子のＤＢＳおよびタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークにおける関連する遺伝子のＤＢＳの加重和としてコンピューターで計算する図である。（ｉ）細胞同一性遺伝子および（ｉｉ）細胞維持についてのシグナル伝達分子を予測するために細胞特異的ＲｅｇＤＢＳを使用する。（Ｃ）ピーク幅の値（ピーク幅）、ＤＢＳおよびＲｅｇＤＢＳによってランク付けされた遺伝子などの異なるスコアリングメトリックによる細胞同一性遺伝子セットについてのエンリッチメントを、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント分析）によってコンピューターで計算する図である。各スコアリングメトリックについて、全ての細胞型にわたるＧＳＥＡエンリッチメントスコアの合計（ＮＥＳ＊－ｌｏｇ１０ｐ値）を示す。（Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持についての受容体およびリガンドのようなシグナル伝達分子のＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測の図である。受容体は目的の細胞型によって産生されるが、リガンドは、細胞型自体または支持細胞型によって産生され得る。受容体およびリガンド対を、受容体のＲｅｇＤＢＳおよび対応するリガンドのＤＢＳ値に基づいてランク付けする。ランク付けした受容体－リガンド対からの上位の予測リガンドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持のために培養条件に加える。
【図2-3】細胞同一性遺伝子の同定および細胞維持についてのシグナル伝達分子の予測。（Ａ）関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを使用して細胞同一性遺伝子をモデル化するために開発されたデータ駆動型方法の概略図である。各遺伝子について、微分幅広スコア（ＤＢＳ）を、目的の標的細胞型とバックグラウンド細胞型との間の幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の値を比較することによってコンピューターで計算する。ＤＢＳは、関連付けられた幅の値の差（Δピーク幅）およびこの差の有意性（Ｐ値）として計算された集成値である。タンパク質コード遺伝子をＤＢＳによってランク付けする。（Ｂ）調節作用を用いて遺伝子に優先順位を付けるために、各遺伝子について、調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を、遺伝子のＤＢＳおよびタンパク質間相互作用（ＰＰＩ）ネットワークにおける関連する遺伝子のＤＢＳの加重和としてコンピューターで計算する図である。（ｉ）細胞同一性遺伝子および（ｉｉ）細胞維持についてのシグナル伝達分子を予測するために細胞特異的ＲｅｇＤＢＳを使用する。（Ｃ）ピーク幅の値（ピーク幅）、ＤＢＳおよびＲｅｇＤＢＳによってランク付けされた遺伝子などの異なるスコアリングメトリックによる細胞同一性遺伝子セットについてのエンリッチメントを、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント分析）によってコンピューターで計算する図である。各スコアリングメトリックについて、全ての細胞型にわたるＧＳＥＡエンリッチメントスコアの合計（ＮＥＳ＊－ｌｏｇ１０ｐ値）を示す。（Ｄ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持についての受容体およびリガンドのようなシグナル伝達分子のＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測の図である。受容体は目的の細胞型によって産生されるが、リガンドは、細胞型自体または支持細胞型によって産生され得る。受容体およびリガンド対を、受容体のＲｅｇＤＢＳおよび対応するリガンドのＤＢＳ値に基づいてランク付けする。ランク付けした受容体－リガンド対からの上位の予測リガンドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持のために培養条件に加える。
【図3-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の細胞維持。Ａ）星状膠細胞の初代細胞培養および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の予測リガンドを補充してから３日後の細胞数の図である。対照は補充なしであり、マトリゲルをゴールデンスタンダードとして使用する。Ｂ）予測因子を補充してから３日後に細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した、初代星状膠細胞および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の細胞増殖率の図である。Ｃ）指定した培養条件下での初代星状膠細胞上のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）などの星状膠細胞特異的マーカーについての免疫蛍光（ＩＦ）画像である。（Ｄ）同様に、指定した培養条件下での神経幹細胞に由来する星状膠細胞上の星状膠細胞特異的マーカーについてのＩＦ画像である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図3-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の細胞維持。Ａ）星状膠細胞の初代細胞培養および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の予測リガンドを補充してから３日後の細胞数の図である。対照は補充なしであり、マトリゲルをゴールデンスタンダードとして使用する。Ｂ）予測因子を補充してから３日後に細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した、初代星状膠細胞および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の細胞増殖率の図である。Ｃ）指定した培養条件下での初代星状膠細胞上のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）などの星状膠細胞特異的マーカーについての免疫蛍光（ＩＦ）画像である。（Ｄ）同様に、指定した培養条件下での神経幹細胞に由来する星状膠細胞上の星状膠細胞特異的マーカーについてのＩＦ画像である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図3-3】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の細胞維持。Ａ）星状膠細胞の初代細胞培養および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の予測リガンドを補充してから３日後の細胞数の図である。対照は補充なしであり、マトリゲルをゴールデンスタンダードとして使用する。Ｂ）予測因子を補充してから３日後に細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した、初代星状膠細胞および神経幹細胞に由来する星状膠細胞の細胞増殖率の図である。Ｃ）指定した培養条件下での初代星状膠細胞上のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）などの星状膠細胞特異的マーカーについての免疫蛍光（ＩＦ）画像である。（Ｄ）同様に、指定した培養条件下での神経幹細胞に由来する星状膠細胞上の星状膠細胞特異的マーカーについてのＩＦ画像である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図4】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の細胞維持。Ａ）心筋細胞の予測リガンドを補充してから３日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックス（Ｇｅｌｔｒｅｘ）のみを有する条件である。Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した心筋細胞の細胞増殖率の図である。Ｃ）全ての条件についての心筋細胞マーカーＧＡＴＡ４＋およびＮＫＸ２．５＋細胞についての蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の図である。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図5-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の細胞維持。（Ａ）ＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の予測リガンドを補充してから３日および６日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックスのみを有する条件である。（Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した平滑筋細胞の細胞増殖率の図である。（Ｃ）全ての条件についての平滑筋細胞特異的マーカーα－ＳＭＡ＋細胞についての蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の図である。（Ｄ）指定した培養条件下での平滑筋細胞上のＳＭ２２（緑）などの平滑筋細胞特異的マーカーについての免疫蛍光画像である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。スケール＝５０μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図5-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の細胞維持。（Ａ）ＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の予測リガンドを補充してから３日および６日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックスのみを有する条件である。（Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した平滑筋細胞の細胞増殖率の図である。（Ｃ）全ての条件についての平滑筋細胞特異的マーカーα－ＳＭＡ＋細胞についての蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の図である。（Ｄ）指定した培養条件下での平滑筋細胞上のＳＭ２２（緑）などの平滑筋細胞特異的マーカーについての免疫蛍光画像である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。スケール＝５０μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図5-3】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の細胞維持。（Ａ）ＨＰＡＳＭＣ平滑筋細胞の予測リガンドを補充してから３日および６日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックスのみを有する条件である。（Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した平滑筋細胞の細胞増殖率の図である。（Ｃ）全ての条件についての平滑筋細胞特異的マーカーα－ＳＭＡ＋細胞についての蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の図である。（Ｄ）指定した培養条件下での平滑筋細胞上のＳＭ２２（緑）などの平滑筋細胞特異的マーカーについての免疫蛍光画像である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。スケール＝５０μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図6-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＡｏＥＣ内皮細胞の細胞維持。ＨＡｏＥＣ内皮細胞の予測リガンドを補充してから３日および６日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックスのみを有する条件である。（Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した内皮細胞の細胞増殖率の図である。（Ｃ）全ての条件についての内皮細胞特異的マーカーＶＷＦ＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｄ）全ての条件についての内皮細胞特異的マーカーＣＤ３１（緑）についてのＩＦの図である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。スケール＝５０μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図6-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＡｏＥＣ内皮細胞の細胞維持。ＨＡｏＥＣ内皮細胞の予測リガンドを補充してから３日および６日後の細胞数の図である。陰性対照は追加のリガンドを有しない条件であり、陽性対照はゲルトレックスのみを有する条件である。（Ｂ）予測リガンドを補充してから３日後の細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵ）によって検出した内皮細胞の細胞増殖率の図である。（Ｃ）全ての条件についての内皮細胞特異的マーカーＶＷＦ＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｄ）全ての条件についての内皮細胞特異的マーカーＣＤ３１（緑）についてのＩＦの図である。細胞をＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。スケール＝５０μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１およびｎｓは有意ではない。
【図7-1】ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ：細胞変換因子の予測。（Ａ）ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、細胞同一性の変化を、ソース細胞型と標的細胞型との間のＤＢＳ値の差としてコンピューターで計算する図である。次いで細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを、遺伝子のΔＤＢＳとタンパク質間相互作用ネットワークスコアの合計として計算する。（ｉ）指向性分化または細胞変換についてのシグナル伝達分子および（ｉｉ）分化転換についての転写因子を予測するために遺伝子を細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳによってランク付けする。（Ｂ）ｘ数の細胞変換について、（ｉ）ＪＳＤによって予測された上位１００のＴＦ、（ｉｉ）Ｍｏｇｒｉｆｙによる冗長なＴＦセットならびに（ｉｉｉ）ＪＳＤおよびＭｏｇｒｉｆｙの両方によって予測された共通のＴＦに対するＴＦのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測リストのエンリッチメントを、ＧＳＥＡを使用して計算する図である。グラフは、各場合、有意なエンリッチメントを伴う細胞変換のパーセンテージを示す。（Ｃ）線維芽細胞（ソース細胞型）から、選択された１０種の標的細胞型への分化転換に関して、表が、同じｉｎ ｖｉｔｒｏ分化転換についてのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測ＴＦと、以前に公開されたＴＦとの重複をまとめている図である。各分化転換について、公開されたＴＦのリコールのパーセンテージおよびそれらのそれぞれのランクを示す。
【図7-2】ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ：細胞変換因子の予測。（Ａ）ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、細胞同一性の変化を、ソース細胞型と標的細胞型との間のＤＢＳ値の差としてコンピューターで計算する図である。次いで細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを、遺伝子のΔＤＢＳとタンパク質間相互作用ネットワークスコアの合計として計算する。（ｉ）指向性分化または細胞変換についてのシグナル伝達分子および（ｉｉ）分化転換についての転写因子を予測するために遺伝子を細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳによってランク付けする。（Ｂ）ｘ数の細胞変換について、（ｉ）ＪＳＤによって予測された上位１００のＴＦ、（ｉｉ）Ｍｏｇｒｉｆｙによる冗長なＴＦセットならびに（ｉｉｉ）ＪＳＤおよびＭｏｇｒｉｆｙの両方によって予測された共通のＴＦに対するＴＦのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測リストのエンリッチメントを、ＧＳＥＡを使用して計算する図である。グラフは、各場合、有意なエンリッチメントを伴う細胞変換のパーセンテージを示す。（Ｃ）線維芽細胞（ソース細胞型）から、選択された１０種の標的細胞型への分化転換に関して、表が、同じｉｎ ｖｉｔｒｏ分化転換についてのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測ＴＦと、以前に公開されたＴＦとの重複をまとめている図である。各分化転換について、公開されたＴＦのリコールのパーセンテージおよびそれらのそれぞれのランクを示す。
【図8-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの星状膠細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。１４日後、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）＋神経前駆細胞を選択し、細胞を異なる予測条件下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）およびＲＮＡ－ｓｅｑ分析を実施した。（Ｂ）全ての条件についての星状膠細胞マーカーＣＤ４４＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）マトリゲルのみおよび全てのリガンド条件での２１日目のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）のＩＦの図である。（Ｄ）ＩＦを実施して、全ての条件においてＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ星状膠細胞マーカーを有するＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージを得た図である。ε星状膠細胞特異性（星状膠細胞転写シグネチャー）を示す遺伝子の群について、ＴＰＭにおける遺伝子発現プロファイルの平均ｚスコアを、各時点および条件で配列決定した３つの試料にわたって計算する。星状膠細胞転写シグネチャーは、（ｉ）Ｈ９ ＥＳＣと本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た初代星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、ＦＡＮＴＯＭ５（Ｆ５）データベースから得た大脳皮質由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、Ｆ５データベースから得た小脳由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子であり、（ｉｖ）ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮ（遺伝子調節ネットワーク）は、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する初代星状膠細胞の細胞同一性遺伝子および調節される最初の隣接までのＳＴＲＩＮＧネットワーク上の関連する遺伝子を含む遺伝子セットであり、（ｖ）ＨｕｍａｎＢａｓｅ ＧＲＮは、ＨｕｍａｎＢａｓｅデータベースから得た星状膠細胞特異的ネットワークである。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎｓは有意ではない。
【図8-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの星状膠細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。１４日後、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）＋神経前駆細胞を選択し、細胞を異なる予測条件下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）およびＲＮＡ－ｓｅｑ分析を実施した。（Ｂ）全ての条件についての星状膠細胞マーカーＣＤ４４＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）マトリゲルのみおよび全てのリガンド条件での２１日目のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）のＩＦの図である。（Ｄ）ＩＦを実施して、全ての条件においてＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ星状膠細胞マーカーを有するＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージを得た図である。ε星状膠細胞特異性（星状膠細胞転写シグネチャー）を示す遺伝子の群について、ＴＰＭにおける遺伝子発現プロファイルの平均ｚスコアを、各時点および条件で配列決定した３つの試料にわたって計算する。星状膠細胞転写シグネチャーは、（ｉ）Ｈ９ ＥＳＣと本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た初代星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、ＦＡＮＴＯＭ５（Ｆ５）データベースから得た大脳皮質由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、Ｆ５データベースから得た小脳由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子であり、（ｉｖ）ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮ（遺伝子調節ネットワーク）は、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する初代星状膠細胞の細胞同一性遺伝子および調節される最初の隣接までのＳＴＲＩＮＧネットワーク上の関連する遺伝子を含む遺伝子セットであり、（ｖ）ＨｕｍａｎＢａｓｅ ＧＲＮは、ＨｕｍａｎＢａｓｅデータベースから得た星状膠細胞特異的ネットワークである。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎｓは有意ではない。
【図8-3】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの星状膠細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。１４日後、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）＋神経前駆細胞を選択し、細胞を異なる予測条件下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）およびＲＮＡ－ｓｅｑ分析を実施した。（Ｂ）全ての条件についての星状膠細胞マーカーＣＤ４４＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）マトリゲルのみおよび全てのリガンド条件での２１日目のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）のＩＦの図である。（Ｄ）ＩＦを実施して、全ての条件においてＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ星状膠細胞マーカーを有するＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージを得た図である。ε星状膠細胞特異性（星状膠細胞転写シグネチャー）を示す遺伝子の群について、ＴＰＭにおける遺伝子発現プロファイルの平均ｚスコアを、各時点および条件で配列決定した３つの試料にわたって計算する。星状膠細胞転写シグネチャーは、（ｉ）Ｈ９ ＥＳＣと本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た初代星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、ＦＡＮＴＯＭ５（Ｆ５）データベースから得た大脳皮質由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、Ｆ５データベースから得た小脳由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子であり、（ｉｖ）ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮ（遺伝子調節ネットワーク）は、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する初代星状膠細胞の細胞同一性遺伝子および調節される最初の隣接までのＳＴＲＩＮＧネットワーク上の関連する遺伝子を含む遺伝子セットであり、（ｖ）ＨｕｍａｎＢａｓｅ ＧＲＮは、ＨｕｍａｎＢａｓｅデータベースから得た星状膠細胞特異的ネットワークである。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎｓは有意ではない。
【図8-4】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの星状膠細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの星状膠細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。１４日後、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）＋神経前駆細胞を選択し、細胞を異なる予測条件下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）およびＲＮＡ－ｓｅｑ分析を実施した。（Ｂ）全ての条件についての星状膠細胞マーカーＣＤ４４＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）マトリゲルのみおよび全てのリガンド条件での２１日目のＧＦＡＰ（赤）およびＳ１００ｂ（緑）のＩＦの図である。（Ｄ）ＩＦを実施して、全ての条件においてＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ星状膠細胞マーカーを有するＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージを得た図である。ε星状膠細胞特異性（星状膠細胞転写シグネチャー）を示す遺伝子の群について、ＴＰＭにおける遺伝子発現プロファイルの平均ｚスコアを、各時点および条件で配列決定した３つの試料にわたって計算する。星状膠細胞転写シグネチャーは、（ｉ）Ｈ９ ＥＳＣと本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た初代星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、ＦＡＮＴＯＭ５（Ｆ５）データベースから得た大脳皮質由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、Ｆ５データベースから得た小脳由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子であり、（ｉｖ）ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮ（遺伝子調節ネットワーク）は、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する初代星状膠細胞の細胞同一性遺伝子および調節される最初の隣接までのＳＴＲＩＮＧネットワーク上の関連する遺伝子を含む遺伝子セットであり、（ｖ）ＨｕｍａｎＢａｓｅ ＧＲＮは、ＨｕｍａｎＢａｓｅデータベースから得た星状膠細胞特異的ネットワークである。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１およびｎｓは有意ではない。
【図9-1】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの心筋細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。３日後、Ｈ９ ＥＳＣを、異なる予測条件および陽性対照マトリゲルのみの下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を１２日および２０日に実施した。（Ｂ）全ての条件についての心臓マーカーＣＤ８２＋およびＣＤ１３＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）ＩＦを実施して、ｃＴｎＴ心臓マーカーを有するＤＡＰＩ＋領域のパーセンテージを得た図である。（Ｄ）全ての条件についての２１日目のｃＴｎＴ（緑）のＩＦの図である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、およびｎｓは有意ではない。
【図9-2】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの心筋細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。３日後、Ｈ９ ＥＳＣを、異なる予測条件および陽性対照マトリゲルのみの下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を１２日および２０日に実施した。（Ｂ）全ての条件についての心臓マーカーＣＤ８２＋およびＣＤ１３＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）ＩＦを実施して、ｃＴｎＴ心臓マーカーを有するＤＡＰＩ＋領域のパーセンテージを得た図である。（Ｄ）全ての条件についての２１日目のｃＴｎＴ（緑）のＩＦの図である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、およびｎｓは有意ではない。
【図9-3】ｉｎ ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の指向性分化。（Ａ）Ｈ９胚性幹細胞（Ｈ９ ＥＳＣ）からの心筋細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化の概略図である。３日後、Ｈ９ ＥＳＣを、異なる予測条件および陽性対照マトリゲルのみの下で播種した。免疫蛍光（ＩＦ）および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を１２日および２０日に実施した。（Ｂ）全ての条件についての心臓マーカーＣＤ８２＋およびＣＤ１３＋細胞についてのＦＡＣＳの図である。（Ｃ）ＩＦを実施して、ｃＴｎＴ心臓マーカーを有するＤＡＰＩ＋領域のパーセンテージを得た図である。（Ｄ）全ての条件についての２１日目のｃＴｎＴ（緑）のＩＦの図である。細胞をＤＡＰＩで対比染色した。スケール＝２５μｍ。予測条件を対照と比較するために対応のない片側ｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、およびｎｓは有意ではない。
【図10】本明細書に記載される方法の実施形態および／または特徴を実装するための１つの種類のコンピューター処理システム６００のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【0126】
本明細書に開示され、定義される本発明は、言及されたまたは本文もしくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替の組合せに及ぶことは理解される。これらの異なる組合せの全ては本発明の様々な代替の態様を構成する。
【0127】
ここで、参照が本発明のある特定の実施形態に対して詳細になされる。本発明は実施形態と併せて記載されるが、その意図は、本発明をそれらの実施形態に限定することではないことは理解される。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る、全ての代替、修飾、および等価物を包含することを意図する。
【0128】
当業者は、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載されるものと同様または等価の多くの方法および材料を認識する。本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本明細書に開示され、定義される本発明は、言及されたまたは本文もしくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替の組合せに及ぶことは理解される。これらの異なる組合せの全ては本発明の様々な代替の態様を構成する。
【0129】
本明細書を説明する目的のために、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆も同様である。
本発明者らは、無血清の化学的に定義された細胞維持および分化培地の開発を容易にする因子を体系的に同定することを目的とした。細胞維持または細胞変換のための因子を同定するために、細胞の同一性または細胞性の同一性の変化をそれぞれモデル化する必要があった。
本発明者らは、無血清の化学的に定義された細胞維持および分化培地の開発を容易にする因子を体系的に同定することを目的とした。細胞維持または細胞変換のための因子を同定するために、細胞の同一性または細胞性の同一性の変化をそれぞれモデル化する必要があった。
【0130】
本発明は、利用可能なエピジェネティックデータベース（例えば、ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐコンソーシアムによる）を利用し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストン修飾を使用して細胞のエピジェネティック状態をモデル化する新たなコンピューターによる計算アプローチ（ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ）を提供する。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、データ駆動型の閾値、統計を使用し、細胞性の同一性を調節する（それによって所与の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する）重要な遺伝子に優先順位を付けるためにタンパク質間相互作用ネットワーク情報を組み込む。本発明の方法は、多数の細胞型における細胞維持および指向性分化についてのシグナル伝達分子を体系的に予測する。さらに、本発明の方法はまた、細胞維持または細胞変換についての転写因子（ＴＦ）またはエピジェネティックリモデラーなどの他のタンパク質クラスに優先順位を付けることができる。
【0131】
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙアルゴリズム
本発明は、細胞型についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 細胞同一性に対するタンパク質コード遺伝子の作用に従って細胞型におけるタンパク質コード遺伝子の優先順位に基づいてタンパク質コード遺伝子のサブセットを選択するステップ
を含み、所与のタンパク質コード遺伝子についての優先順位は、各タンパク質コード遺伝子のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報と、タンパク質コード遺伝子産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との調節作用に関する情報との組合せに基づく、方法を提供する。
本発明は、細胞型についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 細胞同一性に対するタンパク質コード遺伝子の作用に従って細胞型におけるタンパク質コード遺伝子の優先順位に基づいてタンパク質コード遺伝子のサブセットを選択するステップ
を含み、所与のタンパク質コード遺伝子についての優先順位は、各タンパク質コード遺伝子のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報と、タンパク質コード遺伝子産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との調節作用に関する情報との組合せに基づく、方法を提供する。
【0132】
本発明の方法（本明細書では「ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ」と記載される）は、細胞同一性、細胞維持および細胞変換に重要な因子を予測するために細胞のエピジェネティック状態をモデル化する。アルゴリズムの主なセクションは、
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座を定義すること、
（ｉｉ）細胞同一性および細胞維持因子の同定、
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
を含む。
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座を定義すること、
（ｉｉ）細胞同一性および細胞維持因子の同定、
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
を含む。
【0133】
このアプローチは、エピジェネティックヒストン修飾、例えば、周知の転写活性化因子マークである、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を活用することによって細胞状態をモデル化することを目的とする。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（リプレッサーマーク）ヒストン修飾プロファイルについてのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータは、ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐコンソーシアムデータリポジトリからを含む、様々なヒト細胞型に利用可能である。
【0134】
ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの幅は、塩基対（ｂｐ）でのヒストン修飾デポジション（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を伴うゲノム領域の長さとして定義され得、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの高さは、ヒストン修飾またはシグナル値の平均エンリッチメントとして定義され得る。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、狭いピークから広いピークまでの範囲であり得、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さは、短いピークから高いピークの範囲であり得ることは理解される。
【0135】
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座の定義
各細胞型について、試料を、細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために一緒にプールすることができる。細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、典型的に、試料にわたるピーク領域と、全ての試料にわたる最大ピーク高さによって計算されたピーク高さとをマージすることによって計算される。様々な細胞型にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑを比較するために、本発明者らは、全ての細胞型にわたる代表的なピークを組み合わせることによって得られる領域のセットである参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を定義した。
各細胞型について、試料を、細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために一緒にプールすることができる。細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、典型的に、試料にわたるピーク領域と、全ての試料にわたる最大ピーク高さによって計算されたピーク高さとをマージすることによって計算される。様々な細胞型にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑを比較するために、本発明者らは、全ての細胞型にわたる代表的なピークを組み合わせることによって得られる領域のセットである参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を定義した。
【0136】
ｎを細胞型の数とする。ｘ１、ｘ２、．．ｘｎの範囲の各細胞型について、ｂを細胞型のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅とし、ｈをＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さとする。参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）のゲノム位置は、全ての細胞型にわたるピーク領域をマージすることによって得られる。ＲＰＬにおける各遺伝子座Ｒ１、Ｒ２、．．Ｒｎについて、ピーク幅（ｂ）は、細胞型にわたる重複するピークをマージすることによって計算され、ピーク高さ（ｈ）は、重複するピークの最大ピーク高さによって与えられる。
【0137】
【数1】
【0138】
タンパク質コード遺伝子は、ピークのゲノム位置および遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に基づいてＲＰＬに割り当てられ得る。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾は周知のプロモーターマークであるため、ピークが遺伝子のプロモーター領域（ＴＳＳから５００ｂｐ）と重複する場合、遺伝子は典型的にピーク遺伝子座に割り当てられる。しかしながら、ＲＰＬは、そのＴＳＳに対して遺伝子の別の領域に位置することができる（ＴＳＳから１０００ｂｐ、２０００ｂｐまたはそれ以上を含む、ＴＳＳから５００ｂｐを超えて領域を拡大することを含む）ことは理解される。
【0139】
好ましくは、各細胞型（ｘ）において、遺伝子（ｇ）のピーク幅スコア（Ｂ）は、遺伝子に注釈が付けられたｎ個のピークのピーク幅の合計として計算される。一方、遺伝子のピーク高さの値は、遺伝子に注釈が付けられたｎ個のピークの最大高さとして計算される。
【0140】
【数2】
【0141】
は、ＲＰＬ（参照ピーク遺伝子座）での所与の細胞型ｘのピーク幅プロファイルである。
【0142】
【数3】
【0143】
（ｉｉ）細胞同一性遺伝子および細胞維持因子の同定
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態をモデル化するためにＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を利用する。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態をモデル化するためにＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を利用する。
【0144】
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞型に特異的な因子を同定するために３段階のアプローチを使用する。第１に、微分幅広スコアが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に基づいて各ＲＰＬにおいてコンピューターで計算される。第２に、各遺伝子の調節作用が、タンパク質間相互作用ネットワーク上の関連する遺伝子の値に基づいて決定される。最後に、細胞同一性遺伝子が、ランク付けされたタンパク質コード遺伝子に基づいて予測され、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態維持についてのシグナル伝達分子を予測する。
【0145】
本明細書で使用される場合、タンパク質コード遺伝子に関して「各」という用語は、所与の細胞型における複数のタンパク質コード遺伝子を指す場合がある。複数は、細胞型における全てのタンパク質コード遺伝子を含み得る。あるいは、複数は、細胞型におけるタンパク質コード遺伝子のサブセットを含み得る。したがって、「各タンパク質コード遺伝子」は、「細胞型における各タンパク質コード遺伝子」または「遺伝子のサブセットのみを含むようにさらに改良された細胞型における各タンパク質コード遺伝子」を含み得る。
【0146】
さらに、本発明の方法が、「目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定すること」を必要とし、遺伝子がＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域を含まない場合、関係のある遺伝子は、さらなる分析から除外されることは理解される。したがって、本発明は、少なくともＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾が存在する遺伝子の評価に限定される。
【0147】
ある特定の実施形態では、複数のタンパク質コード遺伝子のサブセットは、方法のステップの１つまたは複数において除外され得る。例えば、遺伝子のＴＳＳにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の両方のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークが存在するポイズド遺伝子は、好ましくは、ＤＢＳを計算する前にモデルから取り除かれる。
【0148】
当業者は、分析に含まれるタンパク質コード遺伝子の数が多くなるほど、細胞同一性因子の予測がより強固になることを理解する。さらに、当業者は、これと、また、細胞同一性に関する最大の情報を提供するタンパク質コード遺伝子（ＴＳＳにおいて、またはＴＳＳ付近にＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のみを含むそれらのタンパク質コード遺伝子など）を含めることを考慮する必要性とのバランスを取る必要性を認識する。
【0149】
さらに、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ法の後のステップにおいて、微分Ｈ３Ｋ４ｍｅ３幅が決定されるそれらの遺伝子もまた、後のネットワーク分析に含まれることは理解される。言い換えると、方法の最初のステップ（微分幅広スコアを決定するステップ）において考慮された遺伝子は、典型的に、後のネットワークスコアの計算においても考慮される。
【0150】
ステップ１：微分幅広スコアの計算
標的細胞型特異的ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために、目的の標的細胞型が、群内のバックグラウンド細胞型のセットと比較され得る。例えば、目的の標的細胞型が初代細胞型である場合、バックグラウンドにおける細胞型は初代および幹細胞型のままである。
標的細胞型特異的ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために、目的の標的細胞型が、群内のバックグラウンド細胞型のセットと比較され得る。例えば、目的の標的細胞型が初代細胞型である場合、バックグラウンドにおける細胞型は初代および幹細胞型のままである。
【0151】
バックグラウンドセットにおける細胞型が標的細胞型と類似していない場合、モデリングの統計的有意性が改善される。したがって、好ましい実施形態では、ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルと標的細胞型とのスピアマンの相関が０．９未満である場合にのみ、バックグラウンド細胞型が選択される。
【0152】
目的の標的細胞型（ｘ）において、１つより多い参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）が遺伝子（ｇ）に割り当てられる場合、遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）が、割り当てられたＲＰＬのピーク幅（ｂ）の値の和集合によって与えられる。ＢＧｘ
ｇは、遺伝子ｇにおけるバックグラウンド細胞型の遺伝子ピーク幅スコアのセットであり、バックグラウンド細胞型は、標的細胞型（ｘ）との弁別性に基づいて選択される。Δピーク幅ｘ
ｇは、標的細胞型と、バックグラウンド細胞型の平均遺伝子ピーク幅スコアとの間の遺伝子幅スコアの正規化された差である。アプローチの数は、Δピーク幅ｘ
ｇを決定するために遺伝子ピーク幅スコアを平均化するために採用され得ることは理解される。中央値がこの例で使用されるが、当業者は、また、平均、最頻値または平均の他の指標を使用することができる場合もあることを理解する。
【0153】
この差の有意性（ｐ値）は、当業者に公知の任意の好適な統計的方法によって推定され得る（１つの例は一標本ウィルコクソン検定である）。細胞型（ｘ）および遺伝子（ｇ）の微分幅広スコア（ＤＢＳ）は、以下に示されるように、正規化されたΔピーク幅およびＰｖａｌの合計として測定され得るが、ピーク幅の差、およびその差の有意性を組み合わせるための任意の数の方法が使用され得ることは理解される（乗算、減算、正規化またはそれらの組合せを含む）。
【0154】
【数4】
【0155】
ステップ２：調節微分幅広スコアの計算
細胞型の細胞同一性遺伝子、ＳＴＲＩＮＧ Ｖ１０、タンパク質間相互作用ネットワークに対する遺伝子の調節作用をコンピューターで計算するために、情報が含まれる。
細胞型の細胞同一性遺伝子、ＳＴＲＩＮＧ Ｖ１０、タンパク質間相互作用ネットワークに対する遺伝子の調節作用をコンピューターで計算するために、情報が含まれる。
【0156】
ＳＴＲＩＮＧなどのタンパク質間相互作用ネットワークは、相互作用を予測する情報の供給源に関する情報を提供する。例えば、相互作用は、実験データもしくはｉｎ ｓｉｌｉｃｏデータ、またはそれらの両方に基づき得る。ＳＴＲＩＮＧでは、これらの相互作用もスコア付けされ、予測された相互作用の信頼性の尺度を提供する。本発明のある特定の実施形態では、ネットワークにおいて提供される実験スコアがゼロより大きく、組み合わされたスコアが５００より大きい場合、遺伝子ノード間の相互作用が選択される。これにより、実験的証拠がある高品質のネットワークを使用して、遺伝子の調節作用を決定することが確実にされる。
【0157】
ＳＴＲＩＮＧネットワークにおける全ての遺伝子（Ｖ）について、ネットワークスコアは、遺伝子のサブネットワーク（Ｖｇ）における関連する遺伝子（ｒ）のＤＢＳの組合せに基づいてコンピューターで計算され得、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および関連性のレベル（Ｌ）を補正され得る。細胞特異的ネットワークを得るために、ＳＴＲＩＮＧネットワークからの関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを有しない遺伝子は取り除かれ得る。関連する遺伝子のＤＢＳスコアの加重和は、関連性の第３のレベルまで計算され得る。
【0158】
【数5】
【0159】
細胞型ｘにおける全てのタンパク質コード遺伝子Ｇにわたる正規化されたネットワークスコア（Ｎｅｔ）
【0160】
【数6】
【0161】
ＤＢＳとＮｅｔスコアの異なる組合せが、細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するために使用され得る。好ましい実施形態では、以下に示されるように、２：１の比のＤＢＳ対ネットワークスコア（Ｎｅｔ）が使用される。
【0162】
【数7】
【0163】
ステップ３：細胞同一性遺伝子および細胞維持因子の予測
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）に基づいて遺伝子をランク付けすることによって細胞の同一性を示すタンパク質コード遺伝子を予測する。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）に基づいて遺伝子をランク付けすることによって細胞の同一性を示すタンパク質コード遺伝子を予測する。
【0164】
タンパク質間相互作用ネットワークが、遺伝子それ自体の連結性よりむしろ、タンパク質コード遺伝子の産物（すなわち、タンパク質）の連結性に関する情報を提供することは理解される。さらに、当業者は、タンパク質コード遺伝子の１つより多い「産物」が存在し得ることを理解する。したがって、本発明の方法において、タンパク質コード遺伝子の産物は、所与のタンパク質コード遺伝子からの全ての産物のいずれか一つ、または全ての組合せを含むと理解される。
【0165】
細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞成長および生存に不可欠な受容体およびリガンドなどのシグナル伝達分子を予測する。本発明者らは、リガンドの約３分の２が自己分泌様式で細胞によって産生され、リガンドの残りが、微小環境を模倣するために支持細胞型によって産生されることを認識している。したがって、これを現在のモデルに組み込むために、細胞特異的ＲｅｇＤＢＳに基づいて受容体に優先順位を付けることができる。なぜならそれらは、細胞特異的であるはずであり、目的の細胞型に対する調節作用を有するはずの両方であるからである。次いでＤＢＳに基づいて目的の細胞型および支持細胞型からのリガンドに優先順位を付けることができる。最後に、受容体－リガンド対は次に、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって優先順位を付けることができる。このアプローチにより、細胞培養条件を補充する際に使用するための予測される受容体－リガンド対のリガンドの同定および優先順位付けが可能になる。
【0166】
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換因子を同定するために３段階アプローチを利用する。第１に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、微分幅広スコアの変化がコンピューターで計算される。次いで細胞状態の変化に及ぼす遺伝子の調節作用が決定される。最後に、転写因子が分化転換について予測され、シグナル伝達分子が指向性分化について予測される。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換因子を同定するために３段階アプローチを利用する。第１に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、微分幅広スコアの変化がコンピューターで計算される。次いで細胞状態の変化に及ぼす遺伝子の調節作用が決定される。最後に、転写因子が分化転換について予測され、シグナル伝達分子が指向性分化について予測される。
【0167】
簡潔に記載すると、細胞変換微分幅広スコアは以下によって計算される。
【0168】
【数8】
【0169】
式中、Ｓはソース細胞型であり、Ｔは標的細胞型である。第１に、微分幅広スコア（ＤＢＳ）は、ソース細胞型および標的細胞型の両方についてコンピューターで計算される。次いで、細胞変換ΔＤＢＳを得るために、ソースＤＢＳスコアと標的ＤＢＳスコアとの差がコンピューターで計算される。
【0170】
次に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換についての調節ネットワークスコア（Ｎ）が、関連するノードの細胞変換ΔＤＢＳスコアの加重和としてコンピューターで計算される。細胞特異的ＲｅｇＤＢＳの計算と同様に、細胞変換ＲｅｇＤＢＳは、２：１の比で細胞変換ΔＤＢＳおよび正規化されたネットワークスコア（Ｎｅｔ）の集成値として計算される。
【0171】
【数9】
【0172】
各細胞変換について、タンパク質コード遺伝子は、ＲｅｇΔＤＢＳ値によってランク付けされる。分化転換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＴＦＣｌａｓｓ分類に基づいて定義されたタンパク質コード遺伝子のサブセットである転写因子（ＴＦ）を予測する。指向性分化について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、受容体およびリガンド対などのシグナル伝達分子を予測する。受容体は細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳによって優先順位を付けられ、対応するリガンドは細胞変換ΔＤＢＳによって優先順位を付けられる。最後に、受容体－リガンド対は、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって優先順位を付けられる。予測される受容体－リガンド対におけるリガンドは分化プロトコールに補充され得る。
【0173】
要約すると、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾特性をモデル化し、細胞同一性タンパク質コード遺伝子、細胞維持についてのシグナル伝達分子、指向性分化についてのシグナル伝達分子、および分化転換についてのＴＦを予測する。
【0174】
定義
本明細書で使用される場合、培養中の細胞を維持するための「因子」またはソース細胞を標的細胞へ変換するための因子は、タンパク質、小分子または細胞培養培地を補充する際に使用するための他の作用物質を含み得る。好ましくは、因子はタンパク質である。タンパク質は、同種受容体に、好ましくは細胞表面上で結合し、細胞型の少なくとも１つの特徴を維持するために、細胞内でシグナル伝達カスケードを誘発するリガンドを含む、シグナル伝達分子であり得る。あるいは、因子は、細胞同一性に関連付けられた遺伝子の発現を促進し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞型の維持を容易にする転写因子であり得る。因子が転写因子である場合、転写因子は、細胞に直接提供され得るか、または代替として、核酸発現ベクターなどによって細胞内で発現され得る。
本明細書で使用される場合、培養中の細胞を維持するための「因子」またはソース細胞を標的細胞へ変換するための因子は、タンパク質、小分子または細胞培養培地を補充する際に使用するための他の作用物質を含み得る。好ましくは、因子はタンパク質である。タンパク質は、同種受容体に、好ましくは細胞表面上で結合し、細胞型の少なくとも１つの特徴を維持するために、細胞内でシグナル伝達カスケードを誘発するリガンドを含む、シグナル伝達分子であり得る。あるいは、因子は、細胞同一性に関連付けられた遺伝子の発現を促進し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞型の維持を容易にする転写因子であり得る。因子が転写因子である場合、転写因子は、細胞に直接提供され得るか、または代替として、核酸発現ベクターなどによって細胞内で発現され得る。
【0175】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書で同定された因子の動作を複製するか、または本明細書に記載される因子の量を増加させるため（例えば、因子をコードする遺伝子の転写を増加させるため）に細胞に対して動作する小分子の使用を含む。
【0176】
ある特定の実施形態では、因子は、例えば、培養培地に補充するために組換えタンパク質または合成タンパク質／ペプチドの形態で、外因的に提供され得る。さらなる実施形態では、因子はパラクリン様式で提供されてもよく、例えば、因子は、異なる細胞から目的の細胞に分泌される。なおさらに、因子は自己分泌形式で提供されてもよく、目的の細胞は、因子の発現／産生（例えば、場合によっては、目的の細胞またはソース細胞による、因子をコードする核酸分子またはベクターの発現）を誘導するように処理される。因子を提供するための外因性、パラクリンおよび自己分泌アプローチの組合せが利用されてもよいことも理解される。
【0177】
本明細書で使用される場合、「Ｈ３Ｋ４」修飾とは、遺伝子発現の調節に影響を及ぼすクロマチンのエピジェネティック修飾を指す。Ｈ３Ｋ４とは、ヒストンＨ３タンパク質上のリジン４へのメチル基の付加を指す。したがって、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とは、３メチル基の付加（同じリジン残基でのトリメチル化）を指す。ヒストンＨ３タンパク質は、真核細胞においてＤＮＡをパッケージ化するために使用され、ヒストンに対する修飾は、転写のための遺伝子の接近性を変更する。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、通常、近くの遺伝子の転写の活性化に関連付けられる。Ｈ３Ｋ４トリメチル化は、ＮＵＲＦ複合体によるクロマチンリモデリングを介して遺伝子発現を調節する。二価クロマチンにおいて、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、遺伝子調節を制御するために抑制性修飾Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３と共局在化し得る。
【0178】
本発明の方法は、目的の細胞の細胞維持もしくは目的の細胞の収集、分化転換、再プログラミング、指向性分化および／または標的細胞へのソース細胞の変換に使用するための因子を同定する際に有用性が見られる。
【0179】
「ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持すること」は、細胞が主要な形態学的および生物物理学的特徴を保持するような細胞培養条件で細胞を培養することを含み得ることは理解される。これは、例えば、目的の細胞に関連付けられたマーカーが、細胞培養の数回の継代後に保持されることを確認することによって測定され得る。「目的の細胞を維持すること」および「主要な形態学的および生物物理学的特徴を保持すること」は、培養中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上の生存率を維持することを含み得ることは理解される。好ましくは、細胞は、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、またはそれ以上の間、維持される。さらに、「主要なおよび生物物理学的特徴を保持すること」は、本発明の方法に従って培養中に維持される細胞が、目的の細胞と関連付けられたマーカーの少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を保持することを意味すると理解され得る。好ましくは、細胞は、培養期間の間、マーカーの少なくとも７０％を保持する。さらに、「主要なおよび生物物理学的特徴を保持すること」はまた、本発明の方法に従って培養中に維持される細胞が、目的の細胞と関連付けられた形態学的特性の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％を保持することを意味すると理解され得る。好ましくは、細胞は、培養期間の間、目的の細胞と関連付けられた形態学的特性の少なくとも７０％を保持する。
【0180】
「細胞変換」（例えば、ソース細胞から標的細胞への）という用語は、脱分化、分化転換、再プログラミングまたは指向性分化を指すことができると理解される。
本明細書で使用される場合、脱分化とは、最終的に分化した細胞を、それ自体の系統内からのより未分化の段階に戻し、これによりそれを増殖させることを可能にする方法を指す。指向性分化とは、多能性細胞状態（例えば、幹細胞）から特定の型の分化した標的細胞への分化を指す。
本明細書で使用される場合、脱分化とは、最終的に分化した細胞を、それ自体の系統内からのより未分化の段階に戻し、これによりそれを増殖させることを可能にする方法を指す。指向性分化とは、多能性細胞状態（例えば、幹細胞）から特定の型の分化した標的細胞への分化を指す。
【0181】
分化転換とは、典型的に、細胞が、系統を切り替えることができるか、または２つの異なる細胞型の間で直接発生することもできる時点に修飾されるプロセスを指す。
細胞の再プログラミングとは、典型的に、成熟した特殊化した細胞を人工多能性幹細胞に戻すプロセスを指す。
細胞の再プログラミングとは、典型的に、成熟した特殊化した細胞を人工多能性幹細胞に戻すプロセスを指す。
【0182】
本明細書で使用される場合、目的の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するための因子（受容体／リガンド対、リガンド、転写因子または他の作用物質を含む）を同定する必要がある任意の細胞である。目的の細胞は、３つの胚性胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉の胚葉のいずれかに見出される任意の細胞であり得る。本明細書で使用される場合、外胚葉とは、皮膚、爪などの体外組織を指し、中胚葉とは、筋肉などの組織を指すが、血液も含まれ、内胚葉とは、消化管細胞などの内側内層を指す。様々な目的の細胞の例は表２に提供される。中胚葉に由来する目的の細胞の例には、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、および脾臓の細胞が含まれる。内胚葉に由来する細胞の例には、胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱の細胞；尿道、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸の内層が含まれる。外胚葉に由来する細胞の例には、中枢神経系、網膜および水晶体、頭蓋および感覚、神経節および神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、および乳腺の細胞が含まれる。
【0183】
「目的の細胞」は、組織培養中に維持するのに好適な任意の細胞を含み得る。目的の細胞の非限定的な例には、表２に記載された細胞が含まれる。より具体的には、本明細書で使用される場合、「目的の細胞」または「ソース細胞」は、初代細胞（非不死化細胞）であり得るか、または細胞株に由来する細胞（不死化細胞）であり得るか、または個体から単離された組織であり得る。目的の細胞はまた、前駆細胞、例えば、神経前駆細胞、造血前駆細胞、筋原性前駆細胞、内皮前駆細胞、および一般的なリンパ球または骨髄性前駆細胞であり得る。目的の細胞は、細胞の集団、例えば、組織または組織から得られた細胞などの細胞の混合集団を指す場合もある。一部の実施形態では、目的の細胞またはソース細胞は未分化細胞である。他の実施形態では、目的の細胞またはソース細胞は、分化転換した細胞または分化転換している細胞である。分化転換した細胞は、分化転換の過程、すなわち、体細胞の表現型を別の体細胞に変化させる過程から生成された細胞である。本明細書で使用される場合、「体細胞」は、胚葉（外胚葉、内胚葉または中胚葉）の１つに由来する細胞である。分化転換している細胞は分化転換の過程を経ている細胞である。すなわち、体細胞の表現型が別の体細胞の表現型に対して変化しており、最終的な体細胞のマーカーがまだ完全に確立されていない。他の実施形態では、目的の細胞またはソース細胞は、特殊化した細胞型である分化した細胞である。
【0184】
本明細書で使用される場合、ソース細胞または目的の細胞は、体細胞または罹患細胞を含む、本明細書に記載される任意の細胞型であり得る。体細胞は、成体細胞、または成体もしくは非胚性細胞の１つもしくは複数の検出可能な特徴を示す成体に由来する細胞であり得る。ソース細胞の他の例には、造血細胞、例えば、リンパ球、骨髄細胞などの前駆細胞；頬粘膜細胞、表皮細胞、間葉細胞、ケラチノサイト、肝細胞、胚性細胞、幹細胞または幹細胞の１つもしくは複数の特徴を有するように処理されている細胞が含まれる。罹患細胞の場合、罹患細胞は、疾患または状態の１つまたは複数の検出可能な特徴を示す細胞であり得、例えば、罹患細胞は、がんの１つまたは複数の臨床的または生化学的マーカーを示すがん細胞であり得る。
【0185】
ソース細胞または目的の細胞はまた、多能性幹細胞、好ましくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、幹細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られている）は、受精中に融合して、接合子と呼ばれる細胞を産生し、そこから哺乳動物の胚全体が発達する精子および卵子である。精子および卵子、それらが生成される細胞（生殖母細胞）および未分化の幹細胞を除いて、哺乳動物の体における全ての他の細胞型は、体細胞：内臓器官、皮膚、骨、血液、および結合組織であり、これらの全ては体細胞から構成されている。一部の実施形態では、体細胞は、「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないか、または胚から得られず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は、「成体体細胞」であり、これは、胚もしくは胎児以外の生物に存在するか、もしくはその生物から得られるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。体細胞は、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることによって、細胞の無制限供給を提供するために不死化され得る。例えば、ＴＥＲＴのレベルは、内因性遺伝子からＴＥＲＴの転写を増加させることによって、または任意の遺伝子送達方法もしくはシステムを介して導入遺伝子を導入させることによって増加され得る。
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られている）は、受精中に融合して、接合子と呼ばれる細胞を産生し、そこから哺乳動物の胚全体が発達する精子および卵子である。精子および卵子、それらが生成される細胞（生殖母細胞）および未分化の幹細胞を除いて、哺乳動物の体における全ての他の細胞型は、体細胞：内臓器官、皮膚、骨、血液、および結合組織であり、これらの全ては体細胞から構成されている。一部の実施形態では、体細胞は、「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないか、または胚から得られず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は、「成体体細胞」であり、これは、胚もしくは胎児以外の生物に存在するか、もしくはその生物から得られるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでこのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。体細胞は、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることによって、細胞の無制限供給を提供するために不死化され得る。例えば、ＴＥＲＴのレベルは、内因性遺伝子からＴＥＲＴの転写を増加させることによって、または任意の遺伝子送達方法もしくはシステムを介して導入遺伝子を導入させることによって増加され得る。
【0186】
別段の指示がない限り、体細胞を変換するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で実施され得る（ｉｎ ｖｉｖｏの場合、体細胞が対象内に存在する場合に実施され、ｉｎ ｖｉｔｒｏの場合、培養中に維持される単離された体細胞を使用して実施される）。
【0187】
胚性幹細胞などの胚性細胞は、胚性細胞株に由来する細胞であり得、胚または胎児に直接由来しない細胞であり得る。あるいは、胚性細胞は胚または胎児に由来し得るが、その細胞は、胚もしくは胎児を破壊せずに、または胚もしくは胎児の発達に悪影響を与えずに得られるか、または単離される。
【0188】
本発明はまた、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の使用を企図する。
ヒト、個体を含む、胎児、新生児、若年または成体の霊長類由来の細胞を含む、分化した体細胞は、本発明の方法における好適なソース細胞（または目的の細胞）である。好適な体細胞には、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸細胞、間葉細胞、骨髄前駆細胞および脾臓細胞が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、体細胞は、それ自体で増殖し、血液幹細胞、筋肉／骨幹細胞、脳幹細胞および肝幹細胞を含む、他の細胞型に分化することができる細胞であり得る。好適な体細胞は、転写因子をコードする遺伝物質を含む転写因子の取り込みに対して、受容性であるか、または科学文献において一般に公知の方法を使用して受容性にすることができる。取り込みを増強する方法は細胞型および発現系に応じて異なり得る。好適な形質導入効率を有する受容性のある体細胞を調製するために使用される例示的な条件は当業者に周知である。開始体細胞は約２４時間の倍加時間を有し得る。
ヒト、個体を含む、胎児、新生児、若年または成体の霊長類由来の細胞を含む、分化した体細胞は、本発明の方法における好適なソース細胞（または目的の細胞）である。好適な体細胞には、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、ケラチノサイト、肝細胞、腸細胞、間葉細胞、骨髄前駆細胞および脾臓細胞が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、体細胞は、それ自体で増殖し、血液幹細胞、筋肉／骨幹細胞、脳幹細胞および肝幹細胞を含む、他の細胞型に分化することができる細胞であり得る。好適な体細胞は、転写因子をコードする遺伝物質を含む転写因子の取り込みに対して、受容性であるか、または科学文献において一般に公知の方法を使用して受容性にすることができる。取り込みを増強する方法は細胞型および発現系に応じて異なり得る。好適な形質導入効率を有する受容性のある体細胞を調製するために使用される例示的な条件は当業者に周知である。開始体細胞は約２４時間の倍加時間を有し得る。
【0189】
本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、最初に見出された生物またはそのような細胞の子孫から除去された細胞を指す。任意選択により、細胞は、例えば、他の細胞の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されている。任意選択により、細胞は、後で第２の生物に導入されるか、またはそれが単離された生物（またはそれが由来する細胞）に再導入される。
【0190】
本明細書で使用される場合、細胞の単離された集団に関して「単離された集団」という用語は、混合または不均一な細胞の集団から除去され、分離された細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮された不均一な集団と比較して実質的に純粋な細胞の集団である。
【0191】
特定の細胞集団に関して、「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に対して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。これに対して、標的細胞の集団に関して、「実質的に純粋」または「本質的に精製された」という用語は、約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、または１％未満の、本明細書の用語によって定義される標的細胞またはそれらの子孫ではない細胞を含有する細胞の集団を指す。
【0192】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」に対する言及は、標的細胞または標的細胞型と本明細書で称される細胞のいずれか１つまたは複数に対する言及であり得る。
標的細胞は、３つの胚性胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかを表す細胞であり得る。例えば、標的細胞は、典型的に、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、および脾臓（中胚葉）；胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿道、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸の内層（内胚葉）；または中枢神経系、網膜および水晶体、頭蓋および感覚、神経節および神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、乳腺（外胚葉）に見出される細胞である。
標的細胞は、３つの胚性胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかを表す細胞であり得る。例えば、標的細胞は、典型的に、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、および脾臓（中胚葉）；胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿道、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸の内層（内胚葉）；または中枢神経系、網膜および水晶体、頭蓋および感覚、神経節および神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、乳腺（外胚葉）に見出される細胞である。
【0193】
ソース細胞は、それが標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す場合、本発明の方法によって、標的細胞に変換されるか、または標的様細胞になると決定される。例えば、ヒト線維芽細胞は、細胞が標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す場合、ケラチノサイト用細胞に変換されると同定される。典型的に、細胞は、標的細胞型の１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上の特徴を示す。例えば、標的細胞がケラチノサイト細胞である場合、細胞は、いずれか１つもしくは複数のケラチノサイトマーカーの上方制御および／または細胞形態の変化が検出可能である場合、ケラチノサイト様細胞であると同定されるか、または決定され、好ましくは、ケラチノサイトマーカーには、ケラチン１、ケラチン１４およびインボルクリンが含まれ、細胞形態は敷石様外観である。本発明のいずれかの態様において、標的細胞の特徴は、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、または分化能の分析によって決定され得る。特徴またはマーカーの例には、本明細書に記載されるものおよび当業者に公知のものが含まれる。関連するマーカーの他の例には、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）へのケラチノサイトの変換に関して：ＣＤ４５（汎造血マーカー）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１４／１５（骨髄）、ＣＤ３４（前駆細胞／ＳＣマーカー）、ＣＤ９０（ＳＣ）およびアルファ－インテグリン（ＨＳＣによって発現されないケラチノサイトマーカー）；造血幹細胞へのヒト胚性幹細胞に関して：Ｒｕｎｘ１（ＧＦＰ）、ＣＤ４５（汎造血マーカー）、ＣＤ１９／２０（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ１４／１５（骨髄）、ＣＤ３４（前駆細胞／ＳＣマーカー）、ＣＤ９０（ＳＣ）、Ｔｒａ－１－１６０（ＨＳＣにおいて発現されないＥＳＣマーカー）；高齢または成体ＨＳＣの若返りに関して：若いおよび高齢のヒトＨＳＣの転写シグネチャーの比較（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑの使用）、ならびに若返った細胞を動物に移植し、次いで１、３および６カ月後に評価して、骨髄バイアスを決定することによる「若返ったＨＳＣ」の機能的特徴（骨髄バイアスの消失は「若返った」ＨＳＣを示す）が含まれる。本明細書に記載される変換の多くについてのマーカーの例は以下の表１に示される。
【0194】
【表1】
【0195】
【表2-1】
【0196】
【表2-2】
【0197】
【表2-3】
【0198】
【表2-4】
【0199】
【表2-5】
【0200】
【表2-6】
【0201】
【表2-7】
【0202】
【表2-8】
【0203】
特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するために、表２に記載された因子（リガンド）の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、またはそれ以上が、目的の細胞に加えられるか、または目的の細胞と接触させるために使用される。他の実施形態では、表２に記載された因子（リガンド）の６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個もしくはそれ以上、２０個もしくはそれ以上、２５個もしくはそれ以上、３０個もしくはそれ以上、または３５個もしくはそれ以上が、目的の細胞に加えられるか、または目的の細胞と接触させるために使用される。
【0204】
本発明はまた、標的細胞へソース細胞を変換するための方法を提供する。このような変換に使用するための因子を同定するための方法は本明細書でさらに説明される。本文書のいずれかの箇所で概説されている実施形態に加えて、ある特定の実施形態では、ソース細胞は胚性幹細胞であり、標的細胞へ胚性幹細胞を変換するための因子は以下の表に提供される通りである：
【0205】
【表3-1】
【0206】
【表3-2】
【0207】
【表3-3】
【0208】
【表3-4】
【0209】
【表3-5】
【0210】
特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的細胞へソース細胞を変換するために、表３に記載された因子の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ、またはそれ以上が、ソース細胞に加えられるか、またはソース細胞と接触させるために使用される。代替の実施形態では、例えば、本明細書にさらに記載されるように、細胞を、上記因子の１つまたは複数の発現を増加させるために作用物質と接触させる。他の実施形態では、表３に記載された因子（リガンド）の６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個もしくはそれ以上、２０個もしくはそれ以上、２５個もしくはそれ以上、３０個もしくはそれ以上、または３５個もしくはそれ以上が、標的細胞へ変換するために、ソース細胞に加えられるか、またはソース細胞と接触させるために使用される。
【0211】
当業者は、上記の表２および３に示されるリガンド／因子の各々に精通している。いくつかの特に好ましい例を以下にさらに提供する。
本明細書で使用される場合、ＦＮ１とは、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する細胞外マトリクスの高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質である、タンパク質フィブロネクチンを指す。ＦＮ１はまた、ＣＩＧ、ＥＤ－Ｂ、ＦＩＮＣ、ＦＮ、ＦＮＺ、ＧＦＮＤ、ＧＦＮＤ２、ＬＥＴＳ、ＭＳＦ、フィブロネクチン１、ＳＭＤＣＦとしても知られている。フィブロネクチンの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０２７５１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１１５４１４によって例示される核酸配列によってコードされる。
本明細書で使用される場合、ＦＮ１とは、インテグリンと呼ばれる膜貫通受容体タンパク質に結合する細胞外マトリクスの高分子量（約４４０ｋＤａ）糖タンパク質である、タンパク質フィブロネクチンを指す。ＦＮ１はまた、ＣＩＧ、ＥＤ－Ｂ、ＦＩＮＣ、ＦＮ、ＦＮＺ、ＧＦＮＤ、ＧＦＮＤ２、ＬＥＴＳ、ＭＳＦ、フィブロネクチン１、ＳＭＤＣＦとしても知られている。フィブロネクチンの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０２７５１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１１５４１４によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0212】
本明細書で使用される場合、ＣＯＬ４Ａ１とは、コラーゲンアルファ－１（ＩＶ）鎖（ＨＡＮＡＣ、ＩＣＨ、ＰＯＲＥＮ１、アレステン、ＢＳＶＤ、ＲＡＴＯＲ、コラーゲンＩＶ型アルファ１、コラーゲンＩＶ型アルファ１鎖、ＢＳＶＤ１としても知られている）を指す。ＣＯＬ４Ａ１の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０２４６２に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１８７４９８によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0213】
本明細書で使用される場合、ＣＯＬ１Ａ２とは、コラーゲンアルファ－２（Ｉ）鎖（ＯＩ４、コラーゲンＩ型アルファ２、コラーゲンＩ型アルファ２鎖、ＥＤＳＣＶ、ＥＤＳＡＲＴＨ２としても知られている）を指す。ＣＯＬ１Ａ２の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０８１２３に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１６４６９２によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0214】
本明細書で使用される場合、ＥＤＩＬ３とは、ヒトにおいてＥＤＩＬ３遺伝子によってコードされるタンパク質である、「ＥＧＦ様リピートおよびジスコイジンドメイン３」を指す。この遺伝子によってコードされるタンパク質はインテグリンリガンドである。これは、血管新生を媒介するのに重要な役割を果たし、血管壁の再構築および発達に重要であり得る。これはまた、内皮細胞の挙動にも影響を及ぼす。ＥＤＩＬ３の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＯ４３８５４に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１６４１７６によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0215】
本明細書で使用される場合、ＡＤＡＭ１２とは、ヒトにおいてＡＤＡＭ１２遺伝子によってコードされる酵素である、ジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（以前はメルトリン）を指す。ＡＤＡＭ１２は２つのスプライスバリアントを有し、長い形態のＡＤＡＭ１２－Ｌは膜貫通領域を有し、短いバリアントのＡＤＡＭ１２－Ｓは可溶性であり、膜貫通および細胞質ドメインを欠く。ＡＤＡＭ１２はまた、ＡＤＡＭ１２－ＯＴ１、ＣＡＲ１０、ＭＣＭＰ、ＭＣＭＰＭｌｔｎａ、ＭＬＴＮ、ＭＬＴＮＡ、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２としても知られている。ＡＤＡＭ１２の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＯ４３１８４に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１４８８４８によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0216】
本明細書で使用される場合、ＷＮＴ５Ａ（ｈＷｎｔファミリーメンバー５Ａとしても知られている）は、ヒトにおいてＷＮＴ５Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｗｎｔ５ａの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ４１２２１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１１４２５１によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0217】
本明細書で使用される場合、ＬＡＭＢ１とは、ラミニンサブユニットベータ－１をコードする遺伝子を指す。このタンパク質はまた、ＣＬＭ、ＬＩＳ５、およびラミニン、ベータ１としても知られている。細胞外マトリクス糖タンパク質のファミリーである、ラミニンは、基底膜の主要な非コラーゲン構成成分である。それらは、細胞接着、分化、遊走、シグナル伝達、神経突起伸長および転移を含む、多種多様な生物学的プロセスに関与している。ラミニンは、３つの同一ではない鎖である、ラミニンアルファ、ベータおよびガンマ（以前はそれぞれＡ、Ｂ１、およびＢ２）から構成され、それらは、各々異なる鎖によって形成される３つの短いアーム、および全て３つの鎖から構成される長いアームからなる十字構造を形成する。ＬＡＭＢ１の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０７９４２に提供され、アクセッションＥＮＳＧ００００００９１１３６によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0218】
本明細書で使用される場合、ＣＯＬ３Ａ１とは、ホモトリマー、または各々がＩＩＩ型コラーゲンのアルファ１鎖と呼ばれる３つの同一のペプチド鎖（モノマー）から構成されるタンパク質である、ＩＩＩ型コラーゲンを指す。正式には、モノマーは、コラーゲンＩＩＩ型、アルファ－１鎖と呼ばれ、ヒトにおいてＣＯＬ３Ａ１遺伝子によってコードされる。ＩＩＩ型コラーゲンは、タンパク質が、長く、柔軟性がない、三重らせんドメインを有する線維状コラーゲンの１つである。ＣＯＬ３Ａ１はまた、識別子によってＥＤＳ４Ａ、コラーゲンＩＩＩ型アルファ１、コラーゲンＩＩＩ型アルファ１鎖、ＥＤＳＶＡＳＣ、およびＰＭＧＥＤＳＶとも称される。ＣＯＬ３Ａ１の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０２４６１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１６８５４２によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0219】
本明細書で使用される場合、ＴＦＰＩとは、第Ｘａ因子（Ｘａ）を可逆的に阻害することができる一本鎖ポリペプチドである、組織因子経路阻害剤を指す。Ｘａは阻害されるが、Ｘａ－ＴＦＰＩ複合体は、その後、ＦＶＩＩａ－組織因子複合体も阻害することができる。ＴＦＰＩはまた、識別子によってＥＰＩ、ＬＡＣＩ、ＴＦＩ、ＴＦＰＩ１とも称される。ＴＦＰＩの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ１０６４６に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００００３４３６によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0220】
本明細書で使用される場合、ＦＧＦ７（ＨＢＧＦ－７またはＫＧＦとしても知られている）とは、ヒトにおいてＦＧＦ７遺伝子によってコードされるタンパク質である、ケラチノサイト成長因子を指す。ＦＧＦファミリーのメンバーは、広範な分裂促進的および細胞生存活性を有し、胚発生、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍成長および浸潤を含む、様々な生物学的プロセスに関与する。このタンパク質は強力な上皮細胞特異的成長因子であり、その分裂促進的活性は、ケラチノサイトにおいて主に示されるが、線維芽細胞および内皮細胞では示されない。ＦＧＦ７の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ２１７８１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１４０２８５によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0221】
本明細書で使用される場合、ＦＧＦ１０とは、ヒトにおいてＦＧＦ１０遺伝子によってコードされるタンパク質である、線維芽細胞成長因子１０を指す。ＦＧＦファミリーのメンバーは、広範な分裂促進的および細胞生存活性を有し、胚発生、細胞成長、形態形成、組織修復、腫瘍成長および浸潤を含む、様々な生物学的プロセスに関与する。線維芽細胞成長因子１０は、肢芽および器官形成の発達において最初に見られるパラクリンシグナル伝達分子である。ＦＧＦ１０シグナル伝達は上皮分岐に必要とされる。したがって、肺、皮膚、耳および唾液腺などの全ての分岐モルフォゲン器官は、ＦＧＦ１０の一定の発現を必要とした。このタンパク質は、表皮細胞を角質化するための分裂促進的活性を示すが、本質的に線維芽細胞に対する活性はなく、これはＦＧＦ７の生物活性と同様である。ＦＧＦ１０の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＯ１５５２０に提供され、アクセッションＣＣＤＳ３９５０．１によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0222】
本明細書で使用される場合、ＡＰＯＥとは、体内の脂肪の代謝に関与するタンパク質である、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＤ２、ＡＰＯ－Ｅ、ＬＤＬＣＱ５、ＬＰＧ、ＡｐｏＥ４としても知られている）を指す。ＡＰＯＥの例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０２６４９に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１３０２０３によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0223】
本明細書で使用される場合、Ｃ３とは、補体系において中心的な役割を果たし、先天性免疫に寄与するタンパク質である、補体成分３を指す。このタンパク質はまた、識別子によってＡＨＵＳ５、ＡＲＭＤ９、ＡＳＰ、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、ＣＰＡＭＤ１、ＨＥＬ－Ｓ－６２ｐ、および補体成分３とも称され得る。Ｃ３の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０１０２４に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１２５７３０によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0224】
本明細書で使用される場合、ＳＥＲＰＩＮＥ１とは、ヒトにおいてＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子によってコードされるタンパク質である、内皮プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターまたはセルピンＥ１としても知られているプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター－１（ＰＡＩ－１）を指す。ＰＡＩ－１は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）、プラスミノーゲンのアクチベーター、したがって線維素溶解（血栓の生理学的分解）の主要な阻害剤として機能するセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）である。これはセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）タンパク質（ＳＥＲＰＩＮＥ１）である。ＳＥＲＰＩＮＥ１の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ０５１２１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１０６３６６によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0225】
本明細書で使用される場合、ＣＯＬ６Ａ３とは、ヒトにおいてＣＯＬ６Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質である、コラーゲンアルファ－３（ＶＩ）鎖を指す。この遺伝子は、ほとんどの結合組織に見出されるビーズ状のフィラメントコラーゲンである、ＶＩ型コラーゲンの３つのアルファ鎖のうちの１つである、アルファ３鎖をコードする。ＶＩ型コラーゲンのアルファ３鎖は、アルファ１および２鎖よりもはるかに大きい。このサイズの違いは、大部分は、全てのアルファ鎖のアミノ末端球状ドメインに見出される、フォンヴィレブランド因子Ａ型ドメインと同様にサブドメインの数の増加に起因する。完全長の転写産物に加えて、様々なサイズのＮ末端球状ドメインを有するタンパク質をコードする４つの転写産物バリアントが同定されている。ＣＯＬ６Ａ３の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ１２１１１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１６３３５９によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0226】
本明細書で使用される場合、ＣＸＣＬ１２とは、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１２、ＩＲＨ、ＰＢＳＦ、ＳＣＹＢ１２、ＳＤＦ１、ＴＬＳＦ、ＴＰＡＲ１、およびＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１２としても知られている、ストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ１）を指す。ＣＸＣＬ１２をコードする遺伝子は、選択的スプライシングによって７つのアイソフォームを産生する。ＣＸＣＬ１２の例示的なアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔアクセッションＰ４８０６１に提供され、アクセッションＥＮＳＧ０００００１０７５６２によって例示される核酸配列によってコードされる。
【0227】
本明細書で使用される場合、ＴＧＦＢ２およびＴＧＦＢ３とは、それぞれ、トランスフォーミング成長因子ベータ２およびトランスフォーミング成長因子ベータ３を指す。両方のタンパク質は、細胞分化、胚形成および発生に関与するサイトカインである。ＴＧＦＢ２についての例示的なアクセッション番号はＰ６１８１２である。ＴＧＦＢ３についての例示的なアクセッション番号はＰ１０６００である。
【0228】
本明細書で使用される場合、ＧＤＦ５とは、成長／分化因子５を指し、ＧＤＦ５遺伝子によってコードされる。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーに密接に関連しており、ＴＧＦ－ベータスーパーファミリーのメンバーである。ＧＤＦ５についての例示的なアクセッション番号はＰ４３０２６である。
【0229】
本明細書で使用される場合、ＮＩＤ１とは、以前はエンタクチンとして知られている、ニドゲン－１（ＮＩＤ－１）を指し、ヒトにおいてＮＩＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ニドゲン－１およびニドゲン－２の両方は、ＩＶ型コラーゲン、プロテオグリカン（ヘパラン硫酸およびグリコサミノグリカン）、ラミニンおよびフィブロネクチンなどの他の成分と並んで基底膜の必須成分である。ＮＩＤ１についての例示的なアクセッション番号はＰ１４５４３である。
【0230】
本明細書で使用される場合、ＴＨＢＳ１とは、ＴＨＢＳ１と略されるトロンボスポンジン１を指し、ヒトにおいてＴＨＢＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。トロンボスポンジン１は、ジスルフィド結合したホモトリマータンパク質のサブユニットである。このタンパク質は、細胞間および細胞－マトリクス間の相互作用を媒介する接着性糖タンパク質である。このタンパク質は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンＶ型およびＶＩＩ型ならびにインテグリンアルファ－Ｖ／ベータ－１に結合することができる。ＴＨＢＳ１についての例示的なアクセッション番号はＰ０７９９６である。
【0231】
本明細書で使用される場合、ＢＭＰ４およびＢＭＰ６とは、それぞれ、骨形成タンパク質４および骨形成タンパク質６を指す。これらの遺伝子によってコードされるタンパク質は、ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーである。骨形成タンパク質は、骨および軟骨の成長を誘導するそれらの能力について知られている。ＢＭＰ４は進化的に高度に保存されている。ＢＭＰ４は、腹側辺縁帯ならびに眼、心臓血液および耳胞における初期胚発生に見出される。ＢＭＰ６は、間葉幹細胞において全ての骨形成マーカーを誘導することができる。ＢＭＰ６についての例示的なアクセッション番号はＰ１２６４４である。ＢＭＰ６についての例示的なアクセッション番号はＰ２２００４である。
【0232】
本明細書で使用される場合、ＣＴＧＦとは、ＣＣＮ２または結合組織成長因子としても知られていると称され、細胞外マトリクス関連ヘパリン結合タンパク質のＣＣＮファミリーのマトリクス細胞タンパク質である（ＣＣＮ細胞間シグナル伝達タンパク質も参照のこと）。ＣＴＧＦは、細胞接着、遊走、増殖、血管新生、骨格の発達、および組織創傷修復を含む、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、線維症およびがんのいくつかの形態に決定的に関与する。ＣＴＧＦについての例示的なアクセッション番号はＰ２９２７９である。
【0233】
本明細書で使用される場合、ＰＤＧＦＢとは、血小板由来成長因子サブユニットＢを指し、ヒトにおいてＰＤＧＦＢ遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、血小板由来成長因子ファミリーのメンバーである。このファミリーの４つのメンバーは、間葉起源の細胞についての分裂促進因子であり、８つのシステインのモチーフによって特徴付けられる。この遺伝子産物は、ホモ二量体（ＰＤＧＦ－ＢＢ）として、または血小板由来成長因子アルファ（ＰＤＧＦＡ）ポリペプチドとのヘテロ二量体（ＰＤＧＦ－ＡＢ）として存在することができ、二量体はジスルフィド結合によって連結されている。ＰＤＧＦＢについての例示的なアクセッション番号はＰ０１１２７である。
【0234】
好ましい例では、目的の細胞を維持するための関連する因子（リガンド）は、細胞が関連する因子と「接触される」ように細胞に直接提供され得ることは理解される。さらに、本明細書で使用される場合、「接触する」、「接触される」、「接触している」、「処理する」、「処理している」、または「導入している」という用語は、交換可能に使用することができ、細胞を、外因性ＤＮＡのトランスフェクションまたは細胞への作用物質の導入などの任意の種類のプロセスまたは条件に供することを意味する。
【0235】
例えば、培養培地に、関連する因子を直接補充することができる。代替の実施形態では、関連する因子をコードする核酸分子（または関連する因子の１つもしくは複数をコードするベクター）を細胞にトランスフェクトすることができ、それによってその後、因子は細胞によって発現される。
【0236】
さらに、細胞は、細胞において関連する因子の量を増加させるような方法で処理され得る。再び、これは、細胞培養培地の直接補充によってもよいか、または細胞において内因性遺伝子の発現を増加させるための組換え方法によってもよいか、または関連する因子をコードする核酸の外因性供給源を提供し、核酸を発現させ、それによって細胞において因子の量を増加させることによってもよい。
【0237】
同様に、細胞を変換する方法に関して（分化転換および指向性分化の方法に関する場合を含む）、変換するための因子は、培養中に直接提供されてもよいか、または代替として、標的細胞への変換を促進するためにソース細胞において発現されてもよい。
【0238】
タンパク質である因子（転写因子および他の調節因子を含む）は、本明細書に記載される方法に従って細胞に提供され得ることが理解される。あるいは、因子のバリアントが、同じ結果を達成するように提供され得る。
【0239】
ポリペプチドに言及した際の「バリアント」という用語は、全長ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。本発明は、本明細書に記載される因子のバリアントの使用を企図する。バリアントは、全長ポリペプチドの断片または天然に存在するスプライスバリアントであってもよい。バリアントは、ポリペプチドの断片に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドであってもよく、断片は、全長野生型ポリペプチドまたはそのドメインが、標的細胞型へのソース細胞型の変換を促進する能力などの目的の機能的活性を有する限り、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。一部の実施形態では、ドメインは、配列のいずれかのアミノ酸位置から始まって、Ｃ末端に伸長し、長さが少なくとも１００、２００、３００、または４００アミノ酸である。タンパク質の活性を排除するか、または実質的に減少させるような当該技術分野において知られる変動は、好ましくは回避される。一部の実施形態では、バリアントは、全長ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端部分を欠き、例えば、いずれかの末端から、最大１０、２０、または５０アミノ酸を欠く。一部の実施形態では、ポリペプチドは、成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、これは、正常な細胞内タンパク質分解プロセシング中に（例えば、同時翻訳または翻訳後プロセシング中に）除去されたシグナルペプチドなどの１つまたは複数の部分を有するポリペプチドを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質が産生される一部の実施形態では、タンパク質はキメラポリペプチドであり、これは、そのタンパク質が２つまたはそれ以上の異なる種に由来する部分を含有することを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質が産生されるいくつかの実施形態では、タンパク質は誘導体であり、これは、これらの配列がタンパク質の生物活性を実質的に減少させない限り、タンパク質に関連しないさらなる配列を、タンパク質が含むことを意味する。当業者は、特定のポリペプチドバリアント、断片、または誘導体が、当該技術分野において公知のアッセイを使用して機能的であるかどうかについて知るか、または容易に確認することができる。例えば、実施例において本明細書に開示されるようなアッセイを使用して、転写因子のバリアントが、ソース細胞を標的細胞型に変換する能力が評価され得る。他の簡便なアッセイには、ルシフェラーゼなどの検出可能なマーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された転写因子結合部位を含有するレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することが含まれる。本発明のある特定の実施形態では、機能的バリアントまたは断片は、全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上を有する。
【0240】
因子の量を増加させることに関して「の量を増加させる」という用語は、目的の細胞（例えば、星状膠細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞または標的細胞へ変換するためのソース細胞など）において因子の量を増加させることを指す。一部の実施形態では、因子の量が、対照（例えば、前記発現カセットのいずれも導入されていない細胞）に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である場合、因子の量は、目的の細胞（例えば、１つまたは複数の転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現を指示する発現カセットが導入されている細胞）において「増加している」。しかしながら、転写因子（またはそれをコードするプレｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）の転写、翻訳、安定性または活性の量、割合または効率を増加させるいずれかの方法を含む、転写因子の量を増加させるいずれかの方法が企図される。さらに、転写発現の負の調節因子の下方制御または干渉、存在する転写の効率の増加（例えば、ＳＩＮＥＵＰ）も考慮される。
【0241】
細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合、「外因性」という用語は、人工的もしくは天然手段によって、細胞もしくは生物内に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸、もしくはポリヌクレオチドを指すか、または細胞に関連して使用される場合、人工的もしくは天然手段によって、単離され、続いて他の細胞もしくは生物に導入されている細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞に由来していてもよいか、または生物もしくは細胞内に天然に存在する１つもしくは複数のさらなる核酸のコピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物由来であってもよいか、または同じ生物由来であってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞のものと異なる染色体位置にあるものであるか、またはそうでなければ、天然に見られるものとは異なる核酸配列によって隣接されている。外因性核酸はまた、エピソームベクターなどの染色体外であってもよい。
【0242】
本開示の方法は、プレートあたり２４、４８、９６または３８４ウェルなどのマルチウェルプレート、マイクロチップまたはスライドを含むが、これらに限定されない、小型化のいずれかの許容可能な方法を通じて、アッセイ系において「小型化」されてもよい。アッセイは、マイクロチップ支持体上で行えるようにサイズを減少させてもよく、これには、有利には、より少ない量の試薬および他の材料が含まれる。ハイスループットスクリーニングにつながるプロセスのいかなる小型化も本発明の範囲内である。
【0243】
本発明のいずれかの方法において、標的細胞は、ソース細胞が得られた同じ哺乳動物内に移行されてもよい。言い換えると、本発明の方法に使用されるソース細胞は、自己細胞であってもよく、すなわち、標的細胞が投与される同じ個体から得られてもよい。あるいは、標的細胞は、別の個体内に同種間で移行されてもよい。好ましくは、細胞は、個体における医学的状態を治療するか、または予防する方法において、対象に対して自己である。
【0244】
本明細書で言及される場合、「細胞培養培地」（本明細書において「培養培地」または「培地」とも称される）という用語は、細胞生存性を維持し、増殖を補助する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、適切な組合せで以下のいずれかを含有してもよい：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清置換物、およびペプチド成長因子などの他の構成要素。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は当業者に公知である。本発明の方法に使用するための例示的な細胞培養培地は表４に示される。
【0245】
「発現」という用語は、適用可能である場合、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾およびプロセシングを含むが、これらに限定されない、ＲＮＡおよびタンパク質を産生し、必要に応じて、タンパク質を分泌する際に関与する細胞プロセスを指す。
【0246】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリペプチドの場合、天然供給源に見られるような核酸もしくはポリペプチドと共に存在し、および／または細胞によって発現されるか、もしくは分泌ポリペプチドの場合、分泌される場合に、核酸もしくはポリペプチドと共に存在するであろう、少なくとも１つの他の構成要素（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸もしくはポリペプチド、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳を使用して合成されたものは、「単離された」と見なされる。
【0247】
「ベクター」という用語は、宿主またはソース細胞内に導入するためにＤＮＡ配列が挿入され得るキャリアＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、連結されている核酸の自律複製および／または発現が可能であるものである。これらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。したがって、「発現ベクター」は、宿主細胞において、目的の遺伝子の発現に必要とされる必要な調節領域を含有する特殊化ベクターである。一部の実施形態では、目的の遺伝子は、ベクター中の別の配列に作動可能に連結されている。ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターは複製欠損であることが好ましく、これは例えば、複製のためにコードする全てのウイルス核酸を除去することによって達成され得る。複製欠損ウイルスベクターは、なおその感染特性を保持し、複製するアデノウイルスベクターと類似の様式で細胞に侵入するが、一度細胞に受け入れられたら、複製欠損ウイルスベクターは、複製も増殖もしない。ベクターはまた、リポソームおよびナノ粒子、ならびにＤＮＡ分子を細胞に送達する他の手段も包含する。
【0248】
「作動可能に連結された」という用語は、コード配列の発現に必要な調節配列が、コード配列の発現を達成するように、コード配列に関して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同じ定義はときに、発現ベクターにおけるコード配列および転写制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、および終結エレメント）の配置に適用される。「機能可能に連結された」という用語には、発現しようとするポリヌクレオチド配列の直前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有し、発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現、およびポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にする正しいリーディングフレームを維持することが含まれる。
【0249】
「ウイルスベクター」という用語は、細胞への核酸構築物の担体としての、ウイルス、またはウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、感染または細胞内への形質導入のための、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはその他のような非複製性の欠損ウイルスゲノム内に、組み込まれ、パッケージングされてもよい。ベクターは、細胞のゲノム内に取り込まれてもよく、または取り込まれなくてもよい。構築物には、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列も含まれてもよい。あるいは、構築物は、エピソーム複製可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクター内に取り込まれてもよい。
【0250】
本明細書で使用される場合、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルス科のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムから構成される、中程度の大きさ（９０～１００ｎｍ）の非エンベロープ（裸の）正二十面体ウイルスである。
【0251】
本明細書で使用される場合、「非組込みウイルスベクター」という用語は、宿主ゲノム内に組み込まれないウイルスベクターを指し、ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現は一時的である。宿主ゲノム内への組込みはほとんどまたはまったくないため、非組込みウイルスベクターは、ゲノムにおいて、ランダムな点で挿入することによるＤＮＡ突然変異を産生しない利点を有する。例えば、非組込みウイルスベクターは、染色体外に留まり、その遺伝子を宿主ゲノム内に挿入せず、潜在的に内因性遺伝子の発現を破壊することがない。非組込みウイルスベクターには、以下：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれ得るが、これらに限定されない。これらのウイルスベクターは、これらのいずれも、一部の稀な状況においては、ウイルス核酸を宿主細胞のゲノム内に組み込み得る可能性があるにもかかわらず、この用語が本明細書で使用される場合、「非組込み」ウイルスベクターである。重要なことは、本明細書に記載される方法で使用されるウイルスベクターは、利用される条件下で、一般に、またはそれらの生活環の主な部分として、宿主細胞のゲノム内にそれらの核酸を組み込まないことである。
【0252】
療法において使用するための安全性を増加させ、所望の場合、選択および濃縮マーカーを含み、含有するヌクレオチド配列の発現を最適化するために、科学文献に一般的に知られる方法を使用して、本明細書に記載されるベクターを構築し、操作することができる。ベクターには、ベクターがソース細胞型において自己複製することを可能にする、構造的構成要素が含まれなければならない。例えば、公知のエプスタイン・バーｏｒｉＰ／核抗原－１（ＥＢＮＡ－Ｉ）の組合せ（例えば、その全体が本明細書に示されたかのように参照により組み込まれる、Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．およびＢ．Ｓｕｇｄｅｎ、Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｏｆ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｃｅｎｓｅｄ，ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ、Ｐｌａｓｍｉｄ ５８：１（２００７）を参照されたい）は、ベクター自己複製を支持するために十分であり、哺乳動物、特に霊長類の細胞において機能することが知られている他の組み合わせも利用されてもよい。本発明で使用するために適した発現ベクターの構築のための標準的な技術は、当業者に周知であり、その全体が示されるかのように参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」、（第３版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．２００１）などの刊行物に見出され得る。
【0253】
本発明の方法において、変換に必要な関連する因子をコードする遺伝材料は、１つまたは複数の細胞変換ベクターを介してソース細胞内に送達される。各因子は、ソース細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動し得る異種プロモーターに作動可能に連結された因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子として、ソース細胞内に導入され得る。
【0254】
好適な細胞変換ベクターは、感染性または複製適合性ウイルスを生じさせるために十分なウイルスゲノムの全てまたは一部をコードしない、プラスミドなどのエピソームベクターを含む、本明細書に記載されるいずれかのものであるが、ベクターは、１つまたは複数のウイルスから得られる構造エレメントを含有してもよい。１つまたは複数の細胞変換ベクターが単一のソース細胞内に導入されてもよい。１つまたは複数の導入遺伝子が、単一の細胞変換ベクター上に提供されてもよい。１つの強い構成的転写プロモーターが、発現カセットとして提供されてもよい、複数の導入遺伝子のための転写制御を提供してもよい。ベクター上の別個の発現カセットが、別個の強い構成的プロモーターの転写制御下にあってもよく、これらのプロモーターは、同じプロモーターのコピーであってもよく、または異なるプロモーターであってもよい。様々な異種プロモーターが当該技術分野において公知であり、転写因子の所望の発現レベルなどの要因に応じて使用されてもよい。以下に例示されるように、ソース細胞において、異なる強度を有する異なるプロモーターを使用して、別個の発現カセットの転写を制御することが有利であり得る。転写プロモーターの選択における別の考慮は、プロモーターをサイレンシングする割合である。当業者は、遺伝子の産物が、細胞変換法において、その役割を完了したか、または実質的に完了した後、１つまたは複数の導入遺伝子または導入遺伝子発現カセットの発現を減少させることが有利であり得ることを理解する。例示的なプロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、ならびに他の種由来の対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞において、ＥＦ１αおよびＣＭＶはどちらも、強いプロモーターであるが、ＣＭＶプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現が、ＥＦ１αプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現よりも早期に停止されるように、前者は後者よりも効率的にサイレンシングされる。転写因子は、細胞変換効率をモジュレートするために変動され得る相対比で、ソース細胞内で発現され得る。好ましくは、複数の導入遺伝子が単一の転写産物上にコードされる場合、内部リボソーム侵入部位が、転写プロモーターから遠位の、導入遺伝子の上流に提供される。因子の相対比は、送達される因子に応じて変動し得るが、本開示を把握している当業者は、因子の最適な比を決定することができる。
【0255】
当業者は、複数のベクターを介するよりも、単一のベクターを介して、全ての因子を導入する方が有利に効率的であることを理解する。したがって、本発明は、単一のベクター（または少ない数のベクター）の使用を企図し、単一または少ない数のベクターは、場合により、変換、または細胞維持に必要な複数の因子をコードする。
【0256】
変換ベクターを導入した後、かつソース細胞が変換されている間、ベクターは標的細胞中に存在し続けることが可能であり、この間、導入された導入遺伝子が転写され、翻訳される。導入遺伝子発現は、標的細胞型に変換されている細胞においては、有利に下方制御されるか、または停止されてもよい。細胞変換ベクターは、染色体外に留まってもよい。極端に低い効率で、ベクターは、細胞のゲノム内に組み込まれ得る。以下の例は、本発明を例示することを意図し、いかなる意味でも限定することを意図しない。
【0257】
本発明と共に使用するための、細胞、組織または生物の形質転換のための核酸送達に好適な方法には、本明細書に記載されるような、または当業者に公知であるような、核酸（例えば、ＤＮＡ）が細胞、組織または生物内に導入され得る、実質的にいずれかの方法が含まれると考えられる（例えば、ＳｔａｄｔｆｅｌｄおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３２９～３３０（２００９）；Ｙｕｓａら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６：３６３～３６９（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ４５８、７６６～７７０（２００９年４月９日））。このような方法には、限定されないが、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションによるなどのＤＮＡの直接送達（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１３４４～１３４６、１９８９、ＮａｂｅｌおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７１１～７１３、１９８７）が含まれ、任意選択的に、脂質に基づくトランスフェクション試薬、例えば、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いても、注入（各々、本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）によってもよく、これにはマイクロインジェクション（本明細書に参照により組み込まれる、ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０１：１０９４～１０９９、１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号）が含まれ；エレクトロポレーション（本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第５，３８４，２５３号；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６：７１６～７１８、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１６１～７１６５、１９８４）によってもよく；リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６～４６７、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７（８）：２７４５～２７５２、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０：６８９～６９５、１９９０）によってもよく；ＤＥＡＥ－デキストランを使用した後、ポリエチレングリコールを使用することによってもよく（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：１１８８～１１９０、１９８５）；直接超音波装填（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：８４６３～８４６７、１９８７）によってもよく；リポソーム媒介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７２１：１８５～１９０、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：３３４８～３３５２、１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１４９：１５７～１７６、１９８７；Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ、１０：８７～９４、１９８０；Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５～３７８、１９８９；Ｋａｔｏら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：３３６１～３３６４、１９９１）、および受容体媒介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：８８７～８９２、１９８８；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９～４４３２、１９８７）によってもよく；ならびにこのような方法のいずれかの組合せによってもよく、これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる。
【0258】
会合する分子の細胞内への導入を媒介することができるいくつかのポリペプチドが以前に記載されており、本発明に適応可能である。例えば、Ｌａｎｇｅｌ（２００２）Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓを参照のこと。膜を渡る輸送を増進するポリペプチド配列の例には、限定されないが、ショウジョウバエホメオタンパク質のアンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：１１２１～３４、１９９１；Ｊｏｌｉｏｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８６４～８、１９９１；Ｌｅ Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：９１２０～４、１９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ ８８：２２３～３３、１９９７）；ＨＩＶ－１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ ５５：１１７９～１１８８、１９８８；ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、Ｃｅｌｌ ５５：１ ２８９～１１９３、１９８８）；カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン－４（ＰＴＤ４）；ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン－１０；核局在化配列、ＰＥＰ－Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；米国特許第６，７３０，２９３号に記載されるような送達増進輸送体（限定されないが、少なくとも５～２５もしくはそれ以上の連続アルギニン、または３０、４０、もしくは５０アミノ酸の連続セット中に５～２５またはそれ以上のアルギニンを含むペプチド配列を含む；限定されないが、十分な、例えば少なくとも５つのグアニジノまたはアミジノ部分を有するペプチドを含む）；ならびに商業的に入手可能なペネトラチン（商標）１ペプチド、およびフランス、パリのＤａｉｔｏｓ Ｓ．Ａ．より入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットホームのＤｉａｔｏｓペプチドベクター（「ＤＰＶ」）が含まれる。ＷＯ／２００５／０８４１５８およびＷＯ／２００７／１２３６６７、ならびにそれらに記載されているさらなる輸送体もまた参照のこと。これらのタンパク質は細胞膜を通過可能であるだけでなく、本明細書に記載される転写因子などの他のタンパク質を付着させると、これらの複合体の細胞取り込みを刺激するのに十分である。
【0259】
【表4-1】
【0260】
【表4-2】
【0261】
分化方法に関して、上記の関連する細胞型培地が分化を容易にするために使用され得る。細胞維持に関して、細胞維持のために本明細書に同定される因子のみを使用して細胞を培養することが可能である。例えば：
－ 正常ヒト星状膠細胞（ＮＨＡ）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を解凍し、１継代をマトリゲル中に維持する。（マトリゲルは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造され、販売されているＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物についての商標名である。Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．は、Ｃｕｌｔｒｅｘ ＢＭＥという商標名でそれらの独自のバージョンを販売している。マトリゲルは多くの組織に見出される複雑な細胞外環境に似ており、細胞を培養するための基質（基底膜マトリクス）として細胞生物学者によって使用される）。続いてＡｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を継代し、それぞれの条件で播種する：基質なし、マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）、ＬＡＭＢ１（ＬＮ２２１）、ＡＤＡＭ１２、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）、ＥＤＩＬ３および全ての因子（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。
－ 正常ヒト星状膠細胞（ＮＨＡ）（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を解凍し、１継代をマトリゲル中に維持する。（マトリゲルは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造され、販売されているＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質混合物についての商標名である。Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．は、Ｃｕｌｔｒｅｘ ＢＭＥという商標名でそれらの独自のバージョンを販売している。マトリゲルは多くの組織に見出される複雑な細胞外環境に似ており、細胞を培養するための基質（基底膜マトリクス）として細胞生物学者によって使用される）。続いてＡｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を継代し、それぞれの条件で播種する：基質なし、マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）、ＬＡＭＢ１（ＬＮ２２１）、ＡＤＡＭ１２、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）、ＥＤＩＬ３および全ての因子（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。
【0262】
－ 初代ヒト心筋細胞の細胞培養物の解凍および維持培地は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）から購入することができる。細胞を、２％のウシ胎仔血清、ＥＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ２（２ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍｌ）およびインスリン（０．５μｇ／ｍｌ）を補充した筋細胞成長培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２２０１１）中で培養する。続いて０．０４％のトリプシン／０．０３％のＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を使用して細胞を継代し、それぞれの条件で播種する：基質なし、ゲルトレックス（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）（Ｐｒｏｓｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ）、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子－７）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ）。ＲｅＮ ＶＭ細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％のヘパリン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＦＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中に維持した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を継代し、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で被覆したフラスコに播種した。星状膠細胞に分化させるために、培養物を星状膠細胞培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｎ２、１０％ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）に２週間移行する。表面マーカーＣＤ４４（１０３０２８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して細胞を単離し、それぞれの条件で再び播種する：基質なし、マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲンＩＶ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＡＭＢ１（ラミニン２２１）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、ＡＤＡＭ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＤＩＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全てのリガンド（マトリゲルを含まない上述の基質と分泌リガンドの組合せ）。細胞を継代２（継代の３および６日目）で分析する。
【0263】
－ 初代肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）およびヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）培養物の解凍および維持培地は、それぞれ、Ｇｉｂｃｏ（Ｃ００９５Ｃ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）およびＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｃ－１２２７１、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）から購入することができる。平滑筋細胞を、ウシ胎仔血清：４．９％ｖ／ｖ、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（２ｎｇ／ｍｌ）、ヒト表皮成長因子（０．５ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒトインスリン様成長因子－Ｉ（０．０１μｇ／ｍｌ）およびＢＳＡ（０．２μｇ／ｍｌ）を補充した培地２３１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）中で培養する。続いてＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を継代し、それぞれの条件で播種する：基質なし、ゲルトレックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＩＤ１（ニドゲン－１）（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲンＩ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＯＬ６Ａ１（コラーゲン６）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）（Ｍｅｒｃｋ）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞成長因子－１０）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子－７）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ）。
【0264】
－ 内皮細胞を、ウシ胎仔血清（０．０５ｍｌ／ｍｌ）、表皮成長因子（組換えヒト）（５ｎｇ／ｍｌ）、塩基性線維芽細胞成長因子（組換えヒト）（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン様成長因子（Ｌｏｎｇ Ｒ３ ＩＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）、血管内皮成長因子（組換えヒト）（０．５ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（１μｇ／ｍｌ）およびヒドロコルチゾン（０．２μｇ／ｍｌ）を含有するサプリメントミックスを補充した内皮細胞成長培地ＭＶ２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２２０２２）中で培養する。続いてＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を継代し、それぞれの条件で播種する：基質なし、ゲルトレックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）（Ｍｅｒｃｋ）、ＣＴＧＦ（結合組織成長因子）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰＤＧＦＢ（血小板由来成長因子サブユニットＢ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＹＲ６１（システインリッチ血管新生誘導因子６１）（Ｎｏｖｕｓ）、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＢＭＰ６（骨形成タンパク質６）（Ｍｅｒｃｋ）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ）。
【0265】
－ Ｈ９胚性幹細胞を、ビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ）で被覆したフラスコ内に維持し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養する。
－ Ｈ９幹細胞から神経前駆細胞を介した星状膠細胞の分化のために、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ビタミンＡサプリメントを含まないＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％の２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、０．６６％のウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍｌのＬＤＮ１９３１８９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する神経系誘導培地中で５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にてマトリゲルで被覆したフラスコに１４日間播種する。続いて細胞をＮＣＡＭ＋細胞（抗ｐＳＡ－ＮＣＡＭ抗体、１３０－１１５－８０９、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃを含む）について選別し、マトリゲルで被覆したフラスコにさらに７日間、再び播種する。１週間の増殖後、細胞を継代し、星状膠細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）中でそれぞれの条件で再び播種する：マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＡＭＢ１（ＬＮ２２１）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、マトリゲル＋ＡＤＡＭ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、マトリゲル＋ＥＤＩＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全ての因子（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。次いで細胞を１４日目および２１日目に分析する。
－ Ｈ９幹細胞から神経前駆細胞を介した星状膠細胞の分化のために、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ビタミンＡサプリメントを含まないＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％の２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、０．６６％のウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％の非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、１００ｎｇ／ｍｌのＬＤＮ１９３１８９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する神経系誘導培地中で５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にてマトリゲルで被覆したフラスコに１４日間播種する。続いて細胞をＮＣＡＭ＋細胞（抗ｐＳＡ－ＮＣＡＭ抗体、１３０－１１５－８０９、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃを含む）について選別し、マトリゲルで被覆したフラスコにさらに７日間、再び播種する。１週間の増殖後、細胞を継代し、星状膠細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）中でそれぞれの条件で再び播種する：マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＡＭＢ１（ＬＮ２２１）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、マトリゲル＋ＡＤＡＭ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、マトリゲル＋ＥＤＩＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全ての因子（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。次いで細胞を１４日目および２１日目に分析する。
【0266】
－ 心臓分化のために、細胞を、条件に応じてマトリゲルまたはＣＯＬ１Ａ２で被覆したプレートにＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｇｉｂｃｏ）中で５×１０４細胞／ｃｍ２の密度にて－３日目に播種する。０日目に、培地を、インスリンを含まないＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２１３ｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．６６％のウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）と、毎日培地を交換しながら５日間置き換える。０～２日目に、３μＭのＣＨＩＲも培養物に補充する。３日目に、ＣＨＩＲを回収する。４および５日目に、５μＭのＩＷＲを培養物に補充する。５日後、続いて培養培地を、Ｂ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２１３ｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．６６％のウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）に、毎日培地を交換しながら２日ごとに交換する。分化の間、細胞を、分化培地を用いてそれらのそれぞれの条件に供する：マトリゲル（対照）、ＦＧＦ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、２０１３）、ＴＧＦＢ３（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｄａｈｌｉｎら、２０１４）、ＴＧＦＢ２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＧＤＦ５（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および全てのリガンド（ＣＯＬ１Ａ２被覆プレートを含む上述の基質と分泌リガンドの組合せ）。別段の言及がない限り、基質およびリガンドは製造業者の推奨に基づいて適用される。
【0267】
コンピューター実装方法
本明細書に記載される方法の実施形態は、コンピューター処理システムに実装され得る。したがって、さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれか１つの実施形態を実施するのに適応されたコンピューター処理システムを提供する。
本明細書に記載される方法の実施形態は、コンピューター処理システムに実装され得る。したがって、さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示される方法のいずれか１つの実施形態を実施するのに適応されたコンピューター処理システムを提供する。
【0268】
図１０は、本明細書に記載される方法の実施形態および／または特徴を実装するためのコンピューター処理システム６００の１つの種類のブロック図を提供する。システム６００は汎用コンピューター処理システムである。図１０は、コンピューター処理システムの全ての機能的または物理的構成要素を例示しているわけではないことは理解される。例えば、電源または電源インターフェースは示されていない。しかしながら、システム６００は、電源を搭載しているか、または電源に接続するように構成されているかのいずれか（または両方）である。また、特定の種類のコンピューター処理システムが、適切なハードウェアおよびアーキテクチャを決定し、本発明の態様を実装するに好適な代替のコンピューター処理システムが、追加、代替、または示されたものよりも少ない構成要素を有してもよいことは理解される。
【0269】
コンピューター処理システム６００は、少なくとも１つの処理ユニット６０２を備える。処理ユニット６０２は、単一のコンピューター処理デバイス（例えば、中央処理ユニット、グラフィック処理ユニット、または他のコンピューター計算デバイス）であってもよいか、または複数のコンピューター処理デバイスを備えてもよい。一部の例では、全ての処理は処理ユニット６０２によって実施されるが、他の例では、処理はまた、システム６００によってアクセス可能で使用可能な（共有または専用のいずれかの様式で）リモート処理デバイスによって実施されてもよい。
【0270】
通信バス６０４を介して、処理ユニット６０２は、処理システム６００の動作を制御するための命令および／またはデータを格納する１つまたは複数の機械可読ストレージ（メモリ）デバイスとデータ通信する。この場合、システム６００は、システムメモリ６０６（例えば、ＢＩＯＳ）、揮発性メモリ６０８（例えば、１つまたは複数のＤＲＡＭモジュールなどのランダムアクセスメモリ）、および不揮発性メモリ６１０（例えば、１つまたは複数のハードディスクまたはソリッドステートドライブ）を備える。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に使用されるデータソースのいずれか１つまたは複数は不揮発性メモリ（例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報を格納するデータベース、タンパク質間相互作用ネットワークデータ、遺伝子配列データベース）に格納され得る。
【0271】
システム６００はまた、概して６１２によって示される１つまたは複数のインターフェースを備え、それを介してシステム６００は様々なデバイスおよび／またはネットワークと連結する。一般的に言えば、他のデバイスは、システム６００と一体であってもよく、または別個であってもよい。デバイスがシステム６００から分離されている場合、デバイスとシステム６００との間の接続は、有線または無線のハードウェアおよび通信プロトコールを介してであってもよく、直接または間接（例えば、ネットワーク化された）接続であってもよい。
【0272】
他のデバイス／ネットワークとの有線接続は、任意の適切な標準または独自のハードウェアおよび接続プロトコールによってでもよい。例えば、システム６００は、ＵＳＢ；ＦｉｒｅＷｉｒｅ；ｅＳＡＴＡ；Ｔｈｕｎｄｅｒｂｏｌｔ；Ｅｔｈｅｒｎｅｔ；ＯＳ／２；Ｐａｒａｌｌｅｌ；Ｓｅｒｉａｌ；ＨＤＭＩ（登録商標）；ＤＶＩ；ＶＧＡ；ＳＣＳＩ；ＡｕｄｉｏＰｏｒｔのうちの１つまたは複数による他のデバイス／通信ネットワークとの有線接続のために構成されてもよい。もちろん、他の有線接続も可能である。
【0273】
他のデバイス／ネットワークとの無線接続も同様に、任意の適切な標準または独自のハードウェアおよび通信プロトコールによってでもよい。例えば、システム６００は、赤外線；ＢｌｕｅＴｏｏｔｈ；ＷｉＦｉ；近距離無線通信（ＮＦＣ）；Ｇｌｏｂａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｂｉｌｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（ＧＳＭ）、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｄａｔａ ＧＳＭ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＥＤＧＥ）、ロングタームエボルーション（ＬＴＥ）、広帯域符号分割多元接続（Ｗ－ＣＤＭＡ）、符号分割多元接続（ＣＤＭＡ）のうちの１つまたは複数を使用して他のデバイス／通信ネットワークとの無線接続のために構成されてもよい。もちろん、他の無線接続も可能である。
【0274】
一般的に言えば、有線または無線手段であるかにかかわらず、システム６００が接続するデバイスは、処理ユニット６０２によって処理するためにデータをシステム６００に入力／システム６００によって受信することができる１つまたは複数の入力デバイス、およびデータをシステム６００によって出力することができる１つまたは複数の出力デバイスを備える。デバイスの例を以下に記載するが、全てのコンピューター処理システムが言及された全てのデバイスを含むわけではないこと、ならびに言及されたものに対する追加および代替のデバイスが十分に使用されてもよいことは理解される。
【0275】
例えば、システム６００は１つまたは複数の入力デバイスを備えてもよいか、またはそれらに接続されてもよく、それらによって情報／データがシステム６００に入力（システム６００によって受信）される。このような入力デバイスには、キーボード、マウス、トラックパッド、マイクロホン、加速度計、近接センサ、ＧＰＳデバイスなどが含まれ得る。システム６００はまた、情報を出力するためにシステム６００によって制御される１つまたは複数の出力デバイスを備えてもよいか、またはそれらに接続されてもよい。このような出力デバイスには、ＣＲＴディスプレイ、ＬＣＤディスプレイ、ＬＥＤディスプレイ、プラズマディスプレイ、タッチスクリーンディスプレイ、スピーカー、振動モジュール、ＬＥＤ／他のライト、および同様のものなどのデバイスが含まれ得る。システム６００はまた、入力および出力デバイスの両方として作動することができるデバイス、例えば、システム６００がデータを読み取ることができ、および／またはデータを書き込むことができるメモリデバイス（ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ディスクドライブ、コンパクトフラッシュ（登録商標）カード、ＳＤカードなど）、ならびにデータを表示し（出力し）、タッチシグナルを受信（入力）することの両方ができるタッチスクリーンディスプレイを備えてもよいか、またはそれらに接続されてもよい。
【0276】
システム６００はまた、ネットワークデバイスにデータを通信し、ネットワークデバイスからデータを受信するために１つまたは複数の通信ネットワーク（例えば、インターネット、ローカルエリアネットワーク、広域ネットワーク、パーソナルホットスポットなど）に接続することができ、そのネットワークデバイスは、それ自体で他のコンピューター処理システムであってもよい。
【0277】
システム６００は、非限定的な例として、サーバーコンピューターシステム、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、ネットブックコンピューター、タブレットコンピューターデバイス、モバイル／スマートフォン、パーソナルデジタルアシスタント、パーソナルメディアプレーヤー、セットトップボックス、ゲームコンソールなどの任意の好適なコンピューター処理システムであってもよい。
【0278】
典型的には、システム６００は、少なくともユーザー入力および出力デバイス６１４（タッチスクリーンディスプレイなど）およびネットワーク１５０と通信するための通信インターフェース６１６を備える。
【0279】
システム６００は、処理ユニット６０２によって実行されると、データを受信、処理、および出力するようにシステム６００を構成する、コンピュータープログラム／ソフトウェア（例えば、命令およびデータ）を格納するか、またはそれらにアクセスできる。このようなプログラムには、典型的に、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｅ ＯＳＸ、Ａｐｐｌｅ ＩＯＳ、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｕｎｉｘ、またはＬｉｎｕｘ（登録商標）などのオペレーティングシステムが含まれる。
【0280】
システム６００はまた、処理ユニット６０２によって実行されると、上記の様々な実施形態に従って様々なコンピューター実装プロセス／方法を実施するようにシステム６００を構成する、命令およびデータ（すなわち、ソフトウェアアプリケーション）を格納するか、またはそれらにアクセスできる。一部の場合、所与のコンピューター実装方法の一部または全ては、システム６００自体によって実施されるが、他の場合、処理は、システム６００とのデータ通信において他のデバイスによって実施されてもよいことは理解される。
【0281】
命令およびデータは、システム６００にアクセス可能な非一時的機械可読媒体に格納される。例えば、命令およびデータは、非一時的メモリ６１０に格納されてもよい。命令は、（例えば）有線または無線ネットワーク接続によって有効にされた送信チャネルにおいてデータ信号を介してシステム６００に送信／システム６００によって受信されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に使用されるデータソースのいずれか１つまたは複数は、リモートデータストレージまたはサーバーシステムに格納されてもよい。このような場合、データは、有線または無線ネットワーク接続によって有効にされた送信チャネルにおいてデータ信号を介してシステム６００に提供されてもよい。例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報を格納するデータベース、タンパク質間相互作用ネットワークデータ、遺伝子配列データベースは、システム６００から離れて位置してもよく、コンピューターネットワーク、例えば、本明細書に記載される方法の実施を可能にするインターネットを介してアクセスされてもよい。
【0282】
本発明は以下の非限定的な実施例を含む。
【実施例】
【0283】
実施例１
データ前処理：ヒストン修飾ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータ
初代細胞、幹細胞および組織からなる全ての利用可能なヒト細胞型のヒストン修飾データを、ＥＮＣＯＤＥリポジトリから得た。２０１７年４月２０日に１１６種の細胞型を表す３１６個の試料のＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータをダウンロードし、２０１８年１月２０日に９１種の細胞型を表す２０８個の試料のＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータをダウンロードした。ＥＮＣＯＤＥにデポジットした処理したＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、異なる処理パイプラインパラメーターを使用することによって得たか、または異なるヒトゲノムバージョン（ｈｇ１９またはｈｇ３８）にマッピングした。したがって、一貫性およびまとまりのあるＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ処理を確実にするために、ヒストンＣｈＩＰ－ｓｅｑおよび対応する制御／入力ＣｈＩＰ－ｓｅｑシークエンシングファイルを、ｂａｍフォーマットでダウンロードし、ＢＷＡを使用してシークエンシングリードをｈｇ３８ヒトゲノムおよびアノテーションバージョンＶ２５と再整列させた。Ｒｏａｄｍａｐプロジェクトによって利用可能になったデータセットに関して、ｔａｇＡｌｉｇｎ ＦＡＳＴＡフォーマット済みファイルをｂａｍファイルの代わりに提供し、ｔａｇＡｌｉｇｎ ＦＡＳＴＡファイルをｈｇ３８ヒトゲノムと整列させた。試料の品質および断片サイズを、ファントムピーククアルツール（ｐｈａｎｔｏｍｐｅａｋｑｕａｌｔｏｏｌｓ）を使用して決定した。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを、入力（抗体を含まない対照）に対する試料（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体による処理）におけるシークエンシングリードの相対的エンリッチメントに基づいて検出した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの両方に関して、入力試料と比較したヒストン抗体による試料におけるリードのエンリッチメントについての０．１のｑ値の閾値でＭＡＣＳ２を使用して広いピークを呼び出した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに関して、体系的なピーク品質フィルタリング閾値を、ｑ値のストリンジェンシーの増加を伴う破棄されたピークの割合に基づいて特定し、１０－５のｑ値において破棄されたピークの割合は全ての試料にわたって１０％未満に低下したことが見出された。したがって、１０－５のｑ値を使用して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの低品質のピークを除去した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに関して、ｑ値のストリンジェンシーが０．０１に増加すると、多くの試料が破棄されたので、０．１のデフォルトのｑ値の閾値を使用した。さらに、１０，０００個未満のピークを有する低品質の試料も取り除かれて、高品質の試料が細胞型をモデル化するために使用されることを確実にした。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータのそれぞれについて１１１および８１種の細胞型が存在した（図１Ａ）。
データ前処理：ヒストン修飾ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータ
初代細胞、幹細胞および組織からなる全ての利用可能なヒト細胞型のヒストン修飾データを、ＥＮＣＯＤＥリポジトリから得た。２０１７年４月２０日に１１６種の細胞型を表す３１６個の試料のＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータをダウンロードし、２０１８年１月２０日に９１種の細胞型を表す２０８個の試料のＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータをダウンロードした。ＥＮＣＯＤＥにデポジットした処理したＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、異なる処理パイプラインパラメーターを使用することによって得たか、または異なるヒトゲノムバージョン（ｈｇ１９またはｈｇ３８）にマッピングした。したがって、一貫性およびまとまりのあるＣｈＩＰ－ｓｅｑデータ処理を確実にするために、ヒストンＣｈＩＰ－ｓｅｑおよび対応する制御／入力ＣｈＩＰ－ｓｅｑシークエンシングファイルを、ｂａｍフォーマットでダウンロードし、ＢＷＡを使用してシークエンシングリードをｈｇ３８ヒトゲノムおよびアノテーションバージョンＶ２５と再整列させた。Ｒｏａｄｍａｐプロジェクトによって利用可能になったデータセットに関して、ｔａｇＡｌｉｇｎ ＦＡＳＴＡフォーマット済みファイルをｂａｍファイルの代わりに提供し、ｔａｇＡｌｉｇｎ ＦＡＳＴＡファイルをｈｇ３８ヒトゲノムと整列させた。試料の品質および断片サイズを、ファントムピーククアルツール（ｐｈａｎｔｏｍｐｅａｋｑｕａｌｔｏｏｌｓ）を使用して決定した。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを、入力（抗体を含まない対照）に対する試料（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３抗体による処理）におけるシークエンシングリードの相対的エンリッチメントに基づいて検出した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの両方に関して、入力試料と比較したヒストン抗体による試料におけるリードのエンリッチメントについての０．１のｑ値の閾値でＭＡＣＳ２を使用して広いピークを呼び出した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに関して、体系的なピーク品質フィルタリング閾値を、ｑ値のストリンジェンシーの増加を伴う破棄されたピークの割合に基づいて特定し、１０－５のｑ値において破棄されたピークの割合は全ての試料にわたって１０％未満に低下したことが見出された。したがって、１０－５のｑ値を使用して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの低品質のピークを除去した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに関して、ｑ値のストリンジェンシーが０．０１に増加すると、多くの試料が破棄されたので、０．１のデフォルトのｑ値の閾値を使用した。さらに、１０，０００個未満のピークを有する低品質の試料も取り除かれて、高品質の試料が細胞型をモデル化するために使用されることを確実にした。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータのそれぞれについて１１１および８１種の細胞型が存在した（図１Ａ）。
【0284】
実施例２
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙアルゴリズム
「ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ」と呼ばれるコンピューターによる計算方法が開発された。この方法は、細胞同一性、細胞維持および細胞変換に重要な因子を予測するために細胞のエピジェネティック状態をモデル化する。アルゴリズムの主なセクションは以下の通りである：
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座の定義
（ｉｉ）細胞同一性および細胞維持因子の同定
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座の定義
各細胞型について、試料を一緒にプールして、細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得た。細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を、試料にわたるピーク領域をマージすることによって計算し、ピーク高さを、全ての試料にわたる最大ピーク高さによって計算した。様々な細胞型にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを比較するために、定義した参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を、全ての細胞型にわたる代表的なピークを組み合わせることによって得られる領域のセットであると定義した（図１Ｃ）。ｎを細胞型の数とする。ｘ１、ｘ２、．．．ｘｎの範囲の各細胞型について、ｂを細胞型のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅とし、ｈをＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さとする。参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）のゲノム位置を、全ての細胞型にわたるピーク領域をマージすることによって得る。ＲＰＬにおける各遺伝子座Ｒ１、Ｒ２．．．Ｒｎについて、ピーク幅（ｂ）を、細胞型にわたる重複するピークをマージすることによって計算し、ピーク高さ（ｈ）を、重複するピークの最大ピーク高さによって与える。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙアルゴリズム
「ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ」と呼ばれるコンピューターによる計算方法が開発された。この方法は、細胞同一性、細胞維持および細胞変換に重要な因子を予測するために細胞のエピジェネティック状態をモデル化する。アルゴリズムの主なセクションは以下の通りである：
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座の定義
（ｉｉ）細胞同一性および細胞維持因子の同定
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
（ｉ）ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座の定義
各細胞型について、試料を一緒にプールして、細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得た。細胞型を表すＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を、試料にわたるピーク領域をマージすることによって計算し、ピーク高さを、全ての試料にわたる最大ピーク高さによって計算した。様々な細胞型にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを比較するために、定義した参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）を、全ての細胞型にわたる代表的なピークを組み合わせることによって得られる領域のセットであると定義した（図１Ｃ）。ｎを細胞型の数とする。ｘ１、ｘ２、．．．ｘｎの範囲の各細胞型について、ｂを細胞型のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅とし、ｈをＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さとする。参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）のゲノム位置を、全ての細胞型にわたるピーク領域をマージすることによって得る。ＲＰＬにおける各遺伝子座Ｒ１、Ｒ２．．．Ｒｎについて、ピーク幅（ｂ）を、細胞型にわたる重複するピークをマージすることによって計算し、ピーク高さ（ｈ）を、重複するピークの最大ピーク高さによって与える。
【0285】
【数10】
【0286】
タンパク質コード遺伝子を、ピークのゲノム位置および遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に基づいてＲＰＬに割り当てることができる。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾は周知のプロモーターマークであるため、ピークが遺伝子のプロモーター領域（ＴＳＳから５００ｂｐ）と重複する場合、遺伝子は典型的にピーク遺伝子座に割り当てられる。しかしながら、ＲＰＬは、そのＴＳＳに対して遺伝子の別の領域に位置することができる（ＴＳＳから１０００ｂｐ、２０００ｂｐまたはそれ以上を含む、ＴＳＳから５００ｂｐを超えて領域を拡大することを含む）ことは理解される。
【0287】
好ましくは、各細胞型（ｘ）において、遺伝子（ｇ）のピークピーク幅の値（Ｂ）は、遺伝子に注釈が付けられたｎ個のピークのピーク幅の合計として計算される。一方、遺伝子のピーク高さの値は、遺伝子に注釈が付けられたｎ個のピークの最大高さとして計算される。
【0288】
【数11】
【0289】
は、ＲＰＬ（参照ピーク遺伝子座）での所与の細胞型ｘのピーク幅プロファイルである。
【0290】
【数12】
【0291】
（ｉｉ）細胞同一性遺伝子および細胞維持因子の同定
広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ＣｈＩＰ－ｓｅｑ幅に関連付けられた遺伝子は、細胞同一性遺伝子が豊富にあることが観察されたので、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態をモデル化するためにＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を利用する。遺伝子のＴＳＳにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の両方のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークが存在するポイズド遺伝子は、このモデルから取り除く。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞型に特異的な因子を同定するために３段階のアプローチを使用する（図２）。第１に、微分幅広スコアを、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に基づいて各ＲＰＬにおいてコンピューターで計算する。第２に、遺伝子の調節作用を、タンパク質間相互作用ネットワーク上の関連する遺伝子の値に基づいて決定する。最後に、細胞同一性遺伝子を、ランク付けしたタンパク質コード遺伝子に基づいて予測し、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態維持についてのシグナル伝達分子を予測する。
広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ＣｈＩＰ－ｓｅｑ幅に関連付けられた遺伝子は、細胞同一性遺伝子が豊富にあることが観察されたので、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態をモデル化するためにＨ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅を利用する。遺伝子のＴＳＳにおいてＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の両方のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークが存在するポイズド遺伝子は、このモデルから取り除く。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞型に特異的な因子を同定するために３段階のアプローチを使用する（図２）。第１に、微分幅広スコアを、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に基づいて各ＲＰＬにおいてコンピューターで計算する。第２に、遺伝子の調節作用を、タンパク質間相互作用ネットワーク上の関連する遺伝子の値に基づいて決定する。最後に、細胞同一性遺伝子を、ランク付けしたタンパク質コード遺伝子に基づいて予測し、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞状態維持についてのシグナル伝達分子を予測する。
【0292】
ステップ１：微分幅広スコアの計算
初代細胞および幹細胞は均一な細胞集団であるが、組織は不均一な細胞集団から構成されている。したがって、比較のために、初代細胞および幹細胞を１つの群として処理し、組織細胞型を別の群として処理した。標的細胞型特異的ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために、標的細胞型を群内のバックグラウンド細胞型のセットと比較した。例えば、標的細胞が初代細胞型である場合、バックグラウンドにおける細胞型は残りの初代および幹細胞型になる。バックグラウンドセットにおける細胞型は標的細胞型と類似してはならないので、ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルと標的細胞型とのスピアマンの相関が０．９未満である場合にのみ、バックグラウンド細胞型を選択した。
初代細胞および幹細胞は均一な細胞集団であるが、組織は不均一な細胞集団から構成されている。したがって、比較のために、初代細胞および幹細胞を１つの群として処理し、組織細胞型を別の群として処理した。標的細胞型特異的ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルを得るために、標的細胞型を群内のバックグラウンド細胞型のセットと比較した。例えば、標的細胞が初代細胞型である場合、バックグラウンドにおける細胞型は残りの初代および幹細胞型になる。バックグラウンドセットにおける細胞型は標的細胞型と類似してはならないので、ＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルと標的細胞型とのスピアマンの相関が０．９未満である場合にのみ、バックグラウンド細胞型を選択した。
【0293】
目的の標的細胞型（ｘ）において、１つより多い参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）が遺伝子（ｇ）に割り当てられる場合、遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）が、割り当てられたＲＰＬのピーク幅（ｂ）の値の合計によって与えられる。ＢＧｘ
ｇは、遺伝子ｇにおけるバックグラウンド細胞型の遺伝子ピーク幅スコアのセットであり、バックグラウンド細胞型を、標的細胞型（ｘ）との弁別性に基づいて選択する。Δピーク幅ｘ
ｇは、標的細胞型と、バックグラウンド細胞型の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差である。この差の有意性（ｐ値）を、一標本ウィルコクソン検定によって推定する。細胞型（ｘ）および遺伝子（ｇ）の微分幅広スコア（ＤＢＳ）を、正規化されたΔピーク幅およびＰｖａｌの合計として測定する。
【0294】
【数13】
【0295】
ステップ２：調節微分幅広スコアの計算
次に、細胞型の細胞同一性遺伝子、ＳＴＲＩＮＧ Ｖ１０、タンパク質間相互作用ネットワークに対する遺伝子の調節作用をコンピューターで計算するために、情報を含めた。実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、遺伝子ノード間の相互作用を選択した。これにより、実験的証拠がある高品質のネットワークを使用して、遺伝子の調節作用を決定することを確実にする。Ｍｏｇｒｉｆｙで使用したように、類似のネットワークスコア（Ｎｅｔ）の計算を使用した。ＳＴＲＩＮＧネットワークにおける全ての遺伝子（Ｖ）について、ネットワークスコアを、遺伝子のサブネットワーク（Ｖｇ）における関連する遺伝子（ｒ）のＤＢＳの合計に基づいてコンピューターで計算し、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および関連性のレベル（Ｌ）を補正した。細胞特異的ネットワークを得るために、ＳＴＲＩＮＧネットワークからの関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを有しない遺伝子を取り除いた。関連する遺伝子のＤＢＳスコアの加重和を、関連性の第３のレベルまで計算した。
次に、細胞型の細胞同一性遺伝子、ＳＴＲＩＮＧ Ｖ１０、タンパク質間相互作用ネットワークに対する遺伝子の調節作用をコンピューターで計算するために、情報を含めた。実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、遺伝子ノード間の相互作用を選択した。これにより、実験的証拠がある高品質のネットワークを使用して、遺伝子の調節作用を決定することを確実にする。Ｍｏｇｒｉｆｙで使用したように、類似のネットワークスコア（Ｎｅｔ）の計算を使用した。ＳＴＲＩＮＧネットワークにおける全ての遺伝子（Ｖ）について、ネットワークスコアを、遺伝子のサブネットワーク（Ｖｇ）における関連する遺伝子（ｒ）のＤＢＳの合計に基づいてコンピューターで計算し、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および関連性のレベル（Ｌ）を補正した。細胞特異的ネットワークを得るために、ＳＴＲＩＮＧネットワークからの関連付けられた幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ピークを有しない遺伝子を取り除いた。関連する遺伝子のＤＢＳスコアの加重和を、関連性の第３のレベルまで計算した。
【0296】
【数14】
【0297】
細胞型ｘにおける全てのタンパク質コード遺伝子Ｇにわたる正規化されたネットワークスコア（Ｎｅｔ）
【0298】
【数15】
【0299】
細胞型特異的ネットワークを構築するために、ピーク幅が、その幅の閾値（８７％）未満である遺伝子を取り除いた（図１Ｅ）。ＤＢＳとＮｅｔスコアの異なる組合せを細胞同一性遺伝子のエンリッチメントについて試験し、２：１の比のＤＢＳ対ネットワークスコア（Ｎｅｔ）が、細胞同一性遺伝子について最も高いエンリッチメントを示すことを決定した。
【0300】
【数16】
【0301】
ステップ３：細胞同一性遺伝子および細胞維持因子の予測
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＲｅｇＤＢＳに基づいて遺伝子をランク付けすることによって細胞の同一性を示すタンパク質コード遺伝子を予測する。細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞成長および生存に不可欠な受容体およびリガンドなどのシグナル伝達分子を予測する。受容体－リガンド相互作用対を研究から得、これらの対を異なる細胞型にわたる遺伝子発現に基づいて同定した。リガンドの約３分の２が自己分泌様式で細胞によって産生され、リガンドの残りが、微小環境を模倣するために支持細胞型によって産生されることがわかった。したがって、これを現在のモデルに組み込むために、細胞特異的ＲｅｇＤＢＳに基づいて受容体に優先順位を付けた。なぜならそれらは、細胞特異的であるはずであり、目的の細胞型に対する調節作用を有するはずの両方であるからである。次いでＤＢＳに基づいて目的の細胞型および支持細胞型からのリガンドに優先順位を付けた。最後に、受容体－リガンド対を、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって優先順位を付けた。予測された受容体－リガンド対のリガンドを細胞培養条件に補充することができる。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＲｅｇＤＢＳに基づいて遺伝子をランク付けすることによって細胞の同一性を示すタンパク質コード遺伝子を予測する。細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞成長および生存に不可欠な受容体およびリガンドなどのシグナル伝達分子を予測する。受容体－リガンド相互作用対を研究から得、これらの対を異なる細胞型にわたる遺伝子発現に基づいて同定した。リガンドの約３分の２が自己分泌様式で細胞によって産生され、リガンドの残りが、微小環境を模倣するために支持細胞型によって産生されることがわかった。したがって、これを現在のモデルに組み込むために、細胞特異的ＲｅｇＤＢＳに基づいて受容体に優先順位を付けた。なぜならそれらは、細胞特異的であるはずであり、目的の細胞型に対する調節作用を有するはずの両方であるからである。次いでＤＢＳに基づいて目的の細胞型および支持細胞型からのリガンドに優先順位を付けた。最後に、受容体－リガンド対を、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって優先順位を付けた。予測された受容体－リガンド対のリガンドを細胞培養条件に補充することができる。
【0302】
（ｉｉｉ）指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の同定
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換因子を同定するために３段階アプローチを利用する。第１に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、微分幅広スコアの変化をコンピューターで計算する。次いで細胞状態の変化に及ぼす遺伝子の調節作用を決定する。最後に、転写因子を分化転換について予測し、シグナル伝達分子を指向性分化について予測する。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換因子を同定するために３段階アプローチを利用する。第１に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換に関して、微分幅広スコアの変化をコンピューターで計算する。次いで細胞状態の変化に及ぼす遺伝子の調節作用を決定する。最後に、転写因子を分化転換について予測し、シグナル伝達分子を指向性分化について予測する。
【0303】
ステップ１：細胞変換微分幅広スコアの計算
細胞変換に関して、Ｓをソース細胞型とし、Ｔを標的細胞型とする。第１に、微分幅広スコア（ＤＢＳ）をソース細胞型および標的細胞型の両方についてコンピューターで計算する。次いで、細胞変換ΔＤＢＳを得るために、ソースＤＢＳスコアと標的ＤＢＳスコアとの差をコンピューターで計算する。
細胞変換に関して、Ｓをソース細胞型とし、Ｔを標的細胞型とする。第１に、微分幅広スコア（ＤＢＳ）をソース細胞型および標的細胞型の両方についてコンピューターで計算する。次いで、細胞変換ΔＤＢＳを得るために、ソースＤＢＳスコアと標的ＤＢＳスコアとの差をコンピューターで計算する。
【0304】
【数17】
【0305】
ステップ２：細胞変換調節微分幅広スコアの計算
次に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換についての調節ネットワークスコア（Ｎ）を、関連するノードの細胞変換ΔＤＢＳスコアの加重和としてコンピューターで計算する。細胞特異的ＲｅｇＤＢＳの計算と同様に、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを、２：１の比で細胞変換ΔＤＢＳおよび正規化されたネットワークスコアの集成値として計算する。
次に、ソース細胞型から標的細胞型への細胞変換についての調節ネットワークスコア（Ｎ）を、関連するノードの細胞変換ΔＤＢＳスコアの加重和としてコンピューターで計算する。細胞特異的ＲｅｇＤＢＳの計算と同様に、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを、２：１の比で細胞変換ΔＤＢＳおよび正規化されたネットワークスコアの集成値として計算する。
【0306】
【数18】
【0307】
ステップ３：指向性分化および分化転換についての細胞変換因子の予測
各細胞変換について、タンパク質コード遺伝子を、ＲｅｇΔＤＢＳ値によってランク付けする。分化転換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＴＦＣｌａｓｓ分類に基づいて定義されたタンパク質コード遺伝子のサブセットである転写因子（ＴＦ）を予測する。指向性分化について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、受容体およびリガンド対などのシグナル伝達分子を予測する。細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳによって受容体に優先順位を付け、細胞変換ΔＤＢＳによって対応するリガンドに優先順位を付ける。最後に、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって受容体－リガンド対に優先順位を付ける。予測される受容体－リガンド対のリガンドを分化プロトコールに補充することができる。
各細胞変換について、タンパク質コード遺伝子を、ＲｅｇΔＤＢＳ値によってランク付けする。分化転換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＴＦＣｌａｓｓ分類に基づいて定義されたタンパク質コード遺伝子のサブセットである転写因子（ＴＦ）を予測する。指向性分化について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、受容体およびリガンド対などのシグナル伝達分子を予測する。細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳによって受容体に優先順位を付け、細胞変換ΔＤＢＳによって対応するリガンドに優先順位を付ける。最後に、受容体およびリガンドの組み合わせたランクによって受容体－リガンド対に優先順位を付ける。予測される受容体－リガンド対のリガンドを分化プロトコールに補充することができる。
【0308】
要約すると、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、幅広いＨ３Ｋ４ｍｅ３ヒストン修飾特性をモデル化し、細胞同一性タンパク質コード遺伝子、細胞維持についてのシグナル伝達分子、指向性分化についてのシグナル伝達分子、および分化転換についてのＴＦを予測する。
【0309】
実施例３
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストン修飾の特徴
エピジェネティックヒストン修飾、すなわち、それぞれ周知の転写活性化因子およびリプレッサーマークである、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾を利用することによって細胞状態をモデル化することができる。様々なヒト細胞型のＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストン修飾プロファイルについてのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐコンソーシアムデータリポジトリから得た。異なる試料および実験にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットの一貫した下流処理を確実にするために、分析パイプラインを実装し、必要に応じて、データ駆動型閾値を使用して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３プロファイルにおける有意なピークを呼び出した。低品質のピークをフィルタリングした後、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルを有する１１１種の異なる細胞型（５１個の初代細胞、５３個の組織、７個の幹細胞）およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３プロファイルを有する８１種の細胞型（２８個の初代細胞、４５個の組織、８個の幹細胞）を表す試料（図１Ａ）を保持した。転写状態に対するヒストン修飾の効果を調査するために、１３７種の細胞型（６４個の初代細胞、６８個の組織、５個の幹細胞）からなるＥＮＣＯＤＥからの遺伝子発現プロファイルを使用した。エピジェネティック（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑによる）および転写（ＲＮＡ－ｓｅｑによる）データが利用可能な４０種の共通の細胞型が存在する。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの幅を、塩基対（ｂｐ）でのヒストン修飾デポジションを伴うゲノム領域の長さと定義し、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの高さを、ヒストン修飾またはシグナル値の平均エンリッチメントとして定義した（図１Ｂ）。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、狭いピークから広いピークまでの範囲であり、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さは、短いピークから高いピークまでの範囲であり、分布は全ての細胞型にわたる。さらに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３と比較して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、より多くの数の狭いおよび広いＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを有し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、遺伝子間領域およびサイレント遺伝子に存在することが知られている。
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストン修飾の特徴
エピジェネティックヒストン修飾、すなわち、それぞれ周知の転写活性化因子およびリプレッサーマークである、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾を利用することによって細胞状態をモデル化することができる。様々なヒト細胞型のＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ヒストン修飾プロファイルについてのＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを、ＥＮＣＯＤＥおよびＲｏａｄｍａｐコンソーシアムデータリポジトリから得た。異なる試料および実験にわたるＣｈＩＰ－ｓｅｑデータセットの一貫した下流処理を確実にするために、分析パイプラインを実装し、必要に応じて、データ駆動型閾値を使用して、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３プロファイルにおける有意なピークを呼び出した。低品質のピークをフィルタリングした後、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルを有する１１１種の異なる細胞型（５１個の初代細胞、５３個の組織、７個の幹細胞）およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３プロファイルを有する８１種の細胞型（２８個の初代細胞、４５個の組織、８個の幹細胞）を表す試料（図１Ａ）を保持した。転写状態に対するヒストン修飾の効果を調査するために、１３７種の細胞型（６４個の初代細胞、６８個の組織、５個の幹細胞）からなるＥＮＣＯＤＥからの遺伝子発現プロファイルを使用した。エピジェネティック（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑによる）および転写（ＲＮＡ－ｓｅｑによる）データが利用可能な４０種の共通の細胞型が存在する。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの幅を、塩基対（ｂｐ）でのヒストン修飾デポジションを伴うゲノム領域の長さと定義し、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの高さを、ヒストン修飾またはシグナル値の平均エンリッチメントとして定義した（図１Ｂ）。ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、狭いピークから広いピークまでの範囲であり、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク高さは、短いピークから高いピークまでの範囲であり、分布は全ての細胞型にわたる。さらに、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３と比較して、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、より多くの数の狭いおよび広いＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを有し、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、遺伝子間領域およびサイレント遺伝子に存在することが知られている。
【0310】
次に、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルのゲノム位置の優先度を全ての細胞型にわたって決定した。タンパク質コード遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）周辺の２０００ｂｐのウィンドウ内のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの頻度を評価した。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークとは対照的に、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３は、ＴＳＳから５００ｂｐ内により高い頻度のピークを有したことがわかった。
【0311】
次に、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑプロファイルについてタンパク質コード遺伝子に注釈をつけ、この目的のために、関連付けられたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅または高さに基づいて遺伝子の値を割り当てた。図１Ｃは、タンパク質コード遺伝子の注釈および割り当てられた遺伝子の値の詳細な概略図を示す。各細胞型について、細胞型を表すＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークプロファイルを、複数の試料または複製をマージすることによって得た（詳細については方法を参照のこと）。次に、参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）と呼ばれる参照ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域を定義し、これは、細胞型にわたる重複するピークをマージすることによって得た。各ＲＰＬについて、遺伝子のプロモーター領域が遺伝子座と重複する場合、遺伝子座に対するタンパク質コード遺伝子に注釈を付けた。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３マークに関して、プロモーター領域を遺伝子のＴＳＳから５００ｂｐと定義した。なぜならこの領域により高い頻度のＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークの存在が見られたからである。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークに関して、遺伝子イントロンでのＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークを考慮することを除外するために、プロモーター領域を遺伝子のＴＳＳから－５００ｂｐと定義した。図１Ｃの表は、ＲＰＬに対する遺伝子注釈の例ならびに各細胞型についてのＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅および高さに基づくそれぞれの遺伝子の値を示す。
【0312】
実施例４
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルをモデル化して細胞同一性遺伝子を同定するためのデータ駆動型アプローチ
細胞の同一性をモデル化するための最適な特性を決定するために、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅および高さのようなヒストン修飾特性、ならびに遺伝子発現レベルのような転写特性を試験した。まず、タンパク質コード遺伝子を、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅および高さの分布、ならびに遺伝子発現に基づいて５パーセンタイルビンに分類した。次に、ヒストン修飾または遺伝子発現特性のいずれかが、細胞同一性遺伝子のみに豊富にあるかどうかを推定した。細胞同一性遺伝子を、細胞型に関連するＧＯ生物学的プロセスのテキストマイニングによって定義し、エンリッチメントの有意性をフィッシャーの正確検定（ＦＥＴ）によって計算した。全ての細胞型にわたって、遺伝子発現が高いビンは、細胞同一性遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の両方についてエンリッチメントのより高い有意性を示したことを観察した。高いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークはハウスキーピング遺伝子が豊富にあるが、広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークは、以前の研究に示されるように、細胞同一性遺伝子が顕著に豊富にあることが見出された。予想されるように、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３リプレッサーマークでは、全ての細胞型にわたって細胞同一性またはハウスキーピング遺伝子が豊富になかった。遺伝子発現が高いまたは広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを有する遺伝子には、細胞同一性遺伝子が顕著に豊富にあるので、これらの特性を、最適なメトリック（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、ＲＮＡ－ｓｅｑ発現またはその両方）を同定して細胞同一性遺伝子をモデル化するためにさらに調べた。４０種の共通の細胞型に関して、それらの遺伝子発現またはＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に基づいて遺伝子を降順に並べ、遺伝子を１パーセンタイルずつ増加する累積ウィンドウに分類した（図１Ｄ）。各累積ウィンドウに関して、共通の細胞型にわたる細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子についてのエンリッチメントの有意性をコンピューターで計算した。高い遺伝子発現は細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子の両方と関連付けられ、一方、広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークによって示される遺伝子には、細胞同一性遺伝子のみが豊富であったことが見出された（図１Ｄ）。次に、細胞同一性遺伝子を効率的に同定することができるＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅の閾値を決定するために、細胞同一性遺伝子についてのエンリッチメントの有意性を調べた。ピーク幅の分布の８７パーセンタイルを超えるＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、１１１種の細胞型にわたってエンリッチメントの最も高い有意性を有することが見出された（図１Ｅ）。各細胞型に関して、この閾値（８７パーセンタイル）は、３，６１１～１５，０３５塩基対の範囲のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に対応する。まとめると、これらの分析により、広いＨ３Ｋ４３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、細胞性の同一性に関連付けられる特性があることが示唆される。
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルをモデル化して細胞同一性遺伝子を同定するためのデータ駆動型アプローチ
細胞の同一性をモデル化するための最適な特性を決定するために、ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅および高さのようなヒストン修飾特性、ならびに遺伝子発現レベルのような転写特性を試験した。まず、タンパク質コード遺伝子を、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅および高さの分布、ならびに遺伝子発現に基づいて５パーセンタイルビンに分類した。次に、ヒストン修飾または遺伝子発現特性のいずれかが、細胞同一性遺伝子のみに豊富にあるかどうかを推定した。細胞同一性遺伝子を、細胞型に関連するＧＯ生物学的プロセスのテキストマイニングによって定義し、エンリッチメントの有意性をフィッシャーの正確検定（ＦＥＴ）によって計算した。全ての細胞型にわたって、遺伝子発現が高いビンは、細胞同一性遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の両方についてエンリッチメントのより高い有意性を示したことを観察した。高いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークはハウスキーピング遺伝子が豊富にあるが、広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークは、以前の研究に示されるように、細胞同一性遺伝子が顕著に豊富にあることが見出された。予想されるように、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３リプレッサーマークでは、全ての細胞型にわたって細胞同一性またはハウスキーピング遺伝子が豊富になかった。遺伝子発現が高いまたは広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークを有する遺伝子には、細胞同一性遺伝子が顕著に豊富にあるので、これらの特性を、最適なメトリック（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、ＲＮＡ－ｓｅｑ発現またはその両方）を同定して細胞同一性遺伝子をモデル化するためにさらに調べた。４０種の共通の細胞型に関して、それらの遺伝子発現またはＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に基づいて遺伝子を降順に並べ、遺伝子を１パーセンタイルずつ増加する累積ウィンドウに分類した（図１Ｄ）。各累積ウィンドウに関して、共通の細胞型にわたる細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子についてのエンリッチメントの有意性をコンピューターで計算した。高い遺伝子発現は細胞同一性およびハウスキーピング遺伝子の両方と関連付けられ、一方、広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピークによって示される遺伝子には、細胞同一性遺伝子のみが豊富であったことが見出された（図１Ｄ）。次に、細胞同一性遺伝子を効率的に同定することができるＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅の閾値を決定するために、細胞同一性遺伝子についてのエンリッチメントの有意性を調べた。ピーク幅の分布の８７パーセンタイルを超えるＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、１１１種の細胞型にわたってエンリッチメントの最も高い有意性を有することが見出された（図１Ｅ）。各細胞型に関して、この閾値（８７パーセンタイル）は、３，６１１～１５，０３５塩基対の範囲のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅に対応する。まとめると、これらの分析により、広いＨ３Ｋ４３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅は、細胞性の同一性に関連付けられる特性があることが示唆される。
【0313】
次に、広いＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク特性を体系的に分析することによって細胞状態をモデル化し、細胞特異的遺伝子を同定するためにデータ駆動型方法および「遺伝子スコア」を開発した。細胞特異的遺伝子を同定するために、目的の標的細胞型をバックグラウンド細胞型と比較した。バックグラウンド細胞型を、スピアマンの相関によって計算した標的細胞型との弁別性に基づいて選択した。図２Ａは、細胞特異的遺伝子に優先順位を付けるために使用したアプローチの概略図を示す。各細胞型およびタンパク質コード遺伝子に関して、微分幅広スコア（ＤＢＳ）をコンピューターで計算した。これは、標的細胞型とバックグラウンドとの間のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅の差、およびこの差の有意性によって計算した集成値である。ＤＢＳによってランク付けしたタンパク質コード遺伝子は細胞特異的遺伝子であり、細胞に対して調節作用を与える細胞特異的遺伝子に優先順位を付けるために、調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳ）をコンピューターで計算した（図２Ｂ）。ＲｅｇＤＢＳは、遺伝子のＤＢＳおよびタンパク質間相互作用ネットワークスコアによって計算した集成値である。このアプローチを使用すると、１１１種の細胞型について細胞特異的タンパク質コード遺伝子に体系的に優先順位を付けることが可能であり、各遺伝子をＲｅｇＤＢＳスコアによってランク付けした。
【0314】
この方法は、以前の研究と比較して細胞同一性遺伝子を検出する精度を改善するかどうかが求められた。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ ＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅をモデル化する異なるスコアリングメトリックを、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント分析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ））を使用して細胞同一性遺伝子についてのエンリッチメントを測定することによって比較した（図２Ｃ）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク幅のみによるタンパク質コード遺伝子のランク付けと比較すると、ＤＢＳは、細胞同一性遺伝子についてそれぞれ、２．５、３．５および３．５倍高いエンリッチメントを示すことが見出された。ＲｅｇＤＢＳは、全ての細胞型にわたって細胞同一性遺伝子について最も高いエンリッチメントを有し、ピーク幅によって順序を付けた遺伝子と比較してエンリッチメントが約５．３倍増加し、ＤＢＳと比較して１．５倍増加した。これにより、本発明の方法が、細胞性の同一性に関連付けられたオントロジーを有する遺伝子を同定する際により精度が高いことが確認される。特に、調節ネットワーク情報を利用するＲｅｇＤＢＳスコアを使用して細胞特異的遺伝子に優先順位を付けることができる。
【0315】
実施例５
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば星状膠細胞についての因子を予測する
本発明の方法は細胞同一性遺伝子に効率的に優先順位を付けることができるので、受容体およびリガンドのような優先順位を付けたシグナル伝達分子は、細胞生存および細胞状態の維持に不可欠であると仮定した。細胞維持についてのシグナル伝達分子を予測するためのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙのアプローチを図２Ｄに示す。ＲｅｇＤＢＳメトリックに基づいて受容体に優先順位を付けることによって、これらの受容体はそれらの調節作用によって加重されるので、細胞同一性遺伝子の活性化を誘発することができる受容体を同定することが可能であると仮定した。一方、これらの受容体で活性化するのに必要とされるリガンドは、自己分泌様式で標的細胞型によって、またはパラクリン様式で支持細胞型によって産生することができる。したがって、ＤＢＳによって対応するリガンドに優先順位を付け、標的細胞型に重要なランク付けした受容体－リガンド対を得た（図２Ｄ）。細胞をｉｎ ｖｉｖｏ系からｉｎ ｖｉｔｒｏ条件に移行すると、それらの細胞は必要な受容体を発現する。しかしながら、これらの受容体を活性化するのに必要なリガンドは喪失する可能性がある。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持培養培地に加えられ得るリガンドを予測することができると仮定した。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測の精度を評価するために、成長および維持についての予測リガンドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞に対して試験した。星状膠細胞は、ニューロンについての代謝的および構造的支持を提供し、ニューロン新生および脳の神経経路を調節する多機能細胞型であり、星状膠細胞のいくらかの機能障害は主要な神経疾患を引き起こす可能性がある。したがって、神経疾患を研究するために、星状膠細胞を増やし、維持する能力を改善することが不可欠である。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば星状膠細胞についての因子を予測する
本発明の方法は細胞同一性遺伝子に効率的に優先順位を付けることができるので、受容体およびリガンドのような優先順位を付けたシグナル伝達分子は、細胞生存および細胞状態の維持に不可欠であると仮定した。細胞維持についてのシグナル伝達分子を予測するためのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙのアプローチを図２Ｄに示す。ＲｅｇＤＢＳメトリックに基づいて受容体に優先順位を付けることによって、これらの受容体はそれらの調節作用によって加重されるので、細胞同一性遺伝子の活性化を誘発することができる受容体を同定することが可能であると仮定した。一方、これらの受容体で活性化するのに必要とされるリガンドは、自己分泌様式で標的細胞型によって、またはパラクリン様式で支持細胞型によって産生することができる。したがって、ＤＢＳによって対応するリガンドに優先順位を付け、標的細胞型に重要なランク付けした受容体－リガンド対を得た（図２Ｄ）。細胞をｉｎ ｖｉｖｏ系からｉｎ ｖｉｔｒｏ条件に移行すると、それらの細胞は必要な受容体を発現する。しかしながら、これらの受容体を活性化するのに必要なリガンドは喪失する可能性がある。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持培養培地に加えられ得るリガンドを予測することができると仮定した。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測の精度を評価するために、成長および維持についての予測リガンドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞に対して試験した。星状膠細胞は、ニューロンについての代謝的および構造的支持を提供し、ニューロン新生および脳の神経経路を調節する多機能細胞型であり、星状膠細胞のいくらかの機能障害は主要な神経疾患を引き起こす可能性がある。したがって、神経疾患を研究するために、星状膠細胞を増やし、維持する能力を改善することが不可欠である。
【0316】
星状膠細胞の細胞維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測される上位７つのシグナル伝達分子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１およびＣＯＬ１Ａ２のような細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の構成要素、ならびにＡＤＡＭ１２およびＥＤＩＬ３のような分泌リガンドである。ＬＡＭＢ１はラミニン三量体の一部であるので、ＬＡＭＡ２からなる星状膠細胞特異的ラミニン２１１複合体を使用し、ＬＡＭＢ１を予測し、ＬＡＭＣ１を予測した。予測された因子を、２つの異なる供給源から得た星状膠細胞：神経幹細胞から分化した星状膠細胞および初代星状膠細胞において試験した。星状膠細胞を、予測されたシグナル伝達分子を個々に、および一緒に補充することによって培養条件で培養した。追加のリガンドを含まなかった培養培地を、陰性対照として使用し、また、陽性対照としてマトリゲルと比較した。
【0317】
マトリゲルと比較してＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測因子での培養条件において細胞成長の有意な増加が見出された（図３Ａおよび３Ｂ）。次に、Ｓ１００ｂおよびＧＦＡＰなどの星状膠細胞マーカーについての免疫蛍光を実施し、成長速度の増加が、神経幹細胞から分化した星状膠細胞および初代星状膠細胞において両方のマーカーを発現する細胞で細胞性の同一性に影響を与えないことを確認した（図３Ｃおよび３Ｄ）。少しのシグナル伝達分子（ＦＮ１、ＣＯＬ１Ａ２またはＬＡＭＢ１など）のみを使用して、細胞維持を達成し、一部の場合、成長効率が、化学的に定義されていない複合体であるマトリゲルの使用と同等であることが示された。
【0318】
実施例６
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば、心筋細胞についての因子を予測する
心筋細胞（心臓細胞）維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測された上位７つのシグナル伝達分子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７およびＡＰＯＥであった。心筋細胞を、予測されたシグナル伝達分子を個々に、および一緒に補充することによって培養条件で培養した。追加のリガンドを含まなかった培養培地を陰性対照として使用し、また、陽性対照としてゲルトレックスと比較した。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば、心筋細胞についての因子を予測する
心筋細胞（心臓細胞）維持に関して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測された上位７つのシグナル伝達分子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７およびＡＰＯＥであった。心筋細胞を、予測されたシグナル伝達分子を個々に、および一緒に補充することによって培養条件で培養した。追加のリガンドを含まなかった培養培地を陰性対照として使用し、また、陽性対照としてゲルトレックスと比較した。
【0319】
ゲルトレックスと比較してＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測因子での培養条件において細胞成長の有意な増加が見出された（図４Ａおよび４Ｂ）。次に、ＧＡＴＡ４およびＮＫＸ２．５などの心筋細胞マーカーについての免疫蛍光を実施し、成長速度の増加が、両方のマーカーを発現する細胞で細胞性の同一性に影響を与えないことを確認した（図４Ｃ）。
【0320】
実施例７
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば、平滑筋細胞についての因子を予測する
次に、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件を、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏでの平滑筋細胞維持を促進することができるかどうかを決定するために試験した。平滑筋細胞における予測を試験するために、ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば、平滑筋細胞についての因子を予測する
次に、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件を、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏでの平滑筋細胞維持を促進することができるかどうかを決定するために試験した。平滑筋細胞における予測を試験するために、ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した。
【0321】
ＨＰＡＳＭＣについてのＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータが利用できなかったので、最も近い利用可能な細胞型である「組織：胃の平滑筋」のＨ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルを使用して、平滑筋細胞維持についてのリガンドを予測した。平滑筋細胞維持についてＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測される上位１３個のリガンドは、ＬＡＭＡ５、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＡ４、ＮＩＤ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ４Ａ６、ＣＯＬ４Ａ５、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、ＧＮＡＳ、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１およびＴＨＢＳ１である。これらの予測のいくつかは、予測されたサブユニットＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ６およびＣＯＬ４Ａ５を含む、コラーゲン４のような複合タンパク質のサブユニットであり、コラーゲン６はＣＯＬ６Ａ３から構成され、コラーゲン１はＣＯＬ１Ａ１から構成される。したがって、コラーゲン４、ＮＩＤ１、コラーゲン６、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ７、コラーゲン１およびＴＨＢＳ１を、平滑筋細胞の維持について試験した。平滑筋細胞を、予測されたリガンドを個々に、または全て一緒に補充することによって培養条件で培養し、追加のリガンドを含まなかった培養条件を陰性対照とし、化学的に定義されていない複合混合物（ゲルトレックス）を有する培養条件を陽性対照とした。
【0322】
予測の有効性を評価するために、各条件において細胞成長の代わりとして増殖率の評価と一緒に細胞の数をカウントした。陰性対照と比較して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測リガンド（全てのリガンドを合わせもの、コラーゲン６、コラーゲン１、ＮＩＤ１およびＦＧＦ７など）を用いた培養条件の間で増殖率の有意な増加が観察された（図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、全てのＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測を含有する維持条件における平滑筋細胞は、陰性対照と比較して有意に高いパーセンテージの平滑筋マーカーα－ＳＭＡを発現した（図５Ｃ）。次に、平滑筋マーカーＳＭ２２についての免疫蛍光を実施して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件が細胞の同一性を保持することを示した（図５Ｄ）。
【0323】
実施例８：Ｅｐｉｍｏｇｒｉｆｙは、細胞維持、例えば、内皮細胞についての因子を予測する
内皮細胞における予測を試験するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）を培養した。ＨＡｏＥＣについてのＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータが利用できなかったので、最も近い利用可能な細胞型である「初代細胞：臍静脈の内皮細胞」のＨ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルを使用して、内皮細胞維持についてのリガンドを予測した。内皮細胞維持についてＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測される上位１０個のリガンドは、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１である。これらのうち、ＢＭＰ６、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１を、ＨＡｏＥＣ内皮細胞維持について試験した。
内皮細胞における予測を試験するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）を培養した。ＨＡｏＥＣについてのＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ－ｓｅｑデータが利用できなかったので、最も近い利用可能な細胞型である「初代細胞：臍静脈の内皮細胞」のＨ３Ｋ４ｍｅ３プロファイルを使用して、内皮細胞維持についてのリガンドを予測した。内皮細胞維持についてＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測される上位１０個のリガンドは、ＢＭＰ６、ＡＤＡＭ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＡ４、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１である。これらのうち、ＢＭＰ６、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢ、ＦＮ１およびＣＹＲ６１を、ＨＡｏＥＣ内皮細胞維持について試験した。
【0324】
平滑筋細胞について使用したものと同様の実験設計を利用して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件（組合せおよび個々）において内皮細胞を維持し、陰性および陽性対照（ゲルトレックス）の両方と比較した。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件（全てのリガンドを合わせたもの、ならびにＰＤＧＦＢ、ＴＨＢＳ１、ＣＴＧＦ、ＢＭＰ４、ＰＤＧＦＢおよびＣＹＲ６１などの個々の因子）は、陰性対照と比較して有意に向上した細胞数および増殖率を維持することができた（図６ＡおよびＢ）。さらに、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測条件は、内皮マーカーＣＤ３１およびＶＷＦを発現した（図６ＣおよびＤ）。陰性対照と比較してＶＷＦマーカーを発現した細胞の有意な増加はなかったが、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙで定義した条件（個々のリガンドおよび全てのリガンドを合わせたものを含む条件）において化学的に定義されていない複合体（ゲルトレックス）と比較してそのマーカーを発現する細胞の有意な増加があった。
【0325】
実施例９
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換、例えば、星状膠細胞についての因子を予測する
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは細胞状態を維持することができる因子を予測するので、細胞状態の変化をモデル化することによって、細胞変換に必要な因子を同定することができると仮定した。図７Ａは、ソース細胞型から標的細胞型への細胞状態の変化についての細胞変換スコア計算の詳細な概略図を示す。標的細胞型とソース細胞型との間の遺伝子のＤＢＳの差に基づいて細胞状態の変化に特異的な遺伝子に優先順位を付けることができる。次に、細胞状態の変化に影響を与える調節作用に基づいて各遺伝子を加重して、各遺伝子についてのＲｅｇΔＤＢＳスコアを導き出す。各細胞変換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＲｅｇΔＤＢＳによってランク付けされるタンパク質コード遺伝子（ＴＦおよびシグナル伝達分子を含む）に優先順位を付ける。ＣｅｌｌＮｅｔ、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ ＡＣら（Ｊｅｎｓｅｎ－Ｓｈａｎｎｏｎダイバージェンス統計を使用するので本明細書では「ＪＳＤ」とも称される）およびＭｏｇｒｉｆｙを含む、細胞の転写状態（または転写状態の変化）をモデル化し、細胞変換についてのＴＦを同定するための実験的に検証された少しの方法が存在する。エピジェネティックに基づくＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測を、転写に基づくコンピューターによる計算方法の予測と比較した。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙとＪＳＤとの間に２９種、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙとＭｏｇｒｉｆｙとの間に４３種、および３つ全ての方法の間に２５種の共通の細胞型が存在した。ＧＳＥＡを使用すると、共通の細胞変換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測されたＴＦは、ＪＳＤ（全ての変換の７６．４％）、Ｍｏｇｒｉｆｙ（６０．７％）、またはＪＳＤとＭｏｇｒｉｆｙの両方（６９．３％）によって予測されたＴＦに対して有意なエンリッチメントを有することが見出された（図７Ｂ）。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測ＴＦと他の方法との間の有意な重複が見出された。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測された上位１０個の中で公開されたＴＦの高い発生率により（図７Ｃ）、細胞変換についてＴＦを同定する際のＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの高い精度が示される。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換、例えば、星状膠細胞についての因子を予測する
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは細胞状態を維持することができる因子を予測するので、細胞状態の変化をモデル化することによって、細胞変換に必要な因子を同定することができると仮定した。図７Ａは、ソース細胞型から標的細胞型への細胞状態の変化についての細胞変換スコア計算の詳細な概略図を示す。標的細胞型とソース細胞型との間の遺伝子のＤＢＳの差に基づいて細胞状態の変化に特異的な遺伝子に優先順位を付けることができる。次に、細胞状態の変化に影響を与える調節作用に基づいて各遺伝子を加重して、各遺伝子についてのＲｅｇΔＤＢＳスコアを導き出す。各細胞変換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、ＲｅｇΔＤＢＳによってランク付けされるタンパク質コード遺伝子（ＴＦおよびシグナル伝達分子を含む）に優先順位を付ける。ＣｅｌｌＮｅｔ、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ ＡＣら（Ｊｅｎｓｅｎ－Ｓｈａｎｎｏｎダイバージェンス統計を使用するので本明細書では「ＪＳＤ」とも称される）およびＭｏｇｒｉｆｙを含む、細胞の転写状態（または転写状態の変化）をモデル化し、細胞変換についてのＴＦを同定するための実験的に検証された少しの方法が存在する。エピジェネティックに基づくＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの予測を、転写に基づくコンピューターによる計算方法の予測と比較した。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙとＪＳＤとの間に２９種、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙとＭｏｇｒｉｆｙとの間に４３種、および３つ全ての方法の間に２５種の共通の細胞型が存在した。ＧＳＥＡを使用すると、共通の細胞変換について、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測されたＴＦは、ＪＳＤ（全ての変換の７６．４％）、Ｍｏｇｒｉｆｙ（６０．７％）、またはＪＳＤとＭｏｇｒｉｆｙの両方（６９．３％）によって予測されたＴＦに対して有意なエンリッチメントを有することが見出された（図７Ｂ）。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測ＴＦと他の方法との間の有意な重複が見出された。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測された上位１０個の中で公開されたＴＦの高い発生率により（図７Ｃ）、細胞変換についてＴＦを同定する際のＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙの高い精度が示される。
【0326】
次に、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙを適用して、胚性幹細胞から星状膠細胞への指向性分化についてシグナル伝達分子に優先順位を付けた。予測されたシグナル伝達分子を分化プロトコールにおいて試験した。
【0327】
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ予測を、星状膠細胞分化について評価し、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２およびＷＮＴ５Ａなどの因子を同定した。星状膠細胞分化プロトコールをＨ９胚性幹細胞に適用し（図８Ａ）、分化の３５日目に、星状膠細胞マーカーＣＤ４４に陽性の細胞の有意な増加を、「全てのリガンド」条件（全ての予測因子の組合せ）において観察した。その後４２日目に、マトリゲル対照と比較して、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＬＡＭＢ１、ＣＯＬ１Ａ２および「全てのリガンド」で処理したＨ９細胞においてＣＤ４４を発現する細胞の有意な増加を観察した（図８Ｂ）。免疫蛍光を実施して、全ての条件においてＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ星状膠細胞マーカーを有するＤＡＰＩ＋細胞のパーセンテージを得た（図８Ｄ）。予測された条件下で、培養物はまた、４２日目に星状膠細胞マーカーＳ１００ｂおよびＧＦＡＰを発現し（図８Ｃ）、予測された因子が星状膠細胞分化の効率を増加させることが示唆される。
【0328】
星状膠細胞特異性（星状膠細胞転写シグネチャー）を示す遺伝子の群について、ＴＰＭにおける遺伝子発現プロファイルの平均ｚスコアを、各時点および条件でシークエンスした３つの試料にわたって計算する。星状膠細胞転写シグネチャーは、（ｉ）Ｈ９ ＥＳＣと本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た初代星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、ＦＡＮＴＯＭ５（Ｆ５）データベースから得た大脳皮質由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子、（ｉｉｉ）Ｈ９ ＥＳＣと、Ｆ５データベースから得た小脳由来の星状膠細胞との間の有意に上方制御した遺伝子であり、（ｉｖ）ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮ（遺伝子調節ネットワーク）は、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する初代星状膠細胞の細胞同一性遺伝子および調節される最初の隣接までのＳＴＲＩＮＧネットワーク上の関連する遺伝子を含む遺伝子セットであり、（ｖ）ＨｕｍａｎＢａｓｅ ＧＲＮは、ＨｕｍａｎＢａｓｅデータベースから得た星状膠細胞特異的ネットワークである（図８Ｄ）。
【0329】
実施例１０
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換、例えば、心筋細胞についての因子を予測する
次に、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙにより予測された変換条件を心筋細胞分化（ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子７）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）、ＴＧＦＢ３（トランスフォーミング成長因子ベータ３）、ＣＯＬ６Ａ３（コラーゲンＶＩ）、ＥＦＮＡ１（エフリンＡ１）、ＴＧＦＢ２（トランスフォーミング成長因子ベータ２）およびＧＤＦ５（成長分化因子５））について試験した。これを行うために、対照としてマトリゲルを使用して、リガンドを、分化の間、Ｈ９ ＥＳＣに対して個々に、および一緒に培養培地に補充した（図９Ａ）。分化の１２日目に、予測された条件（図９Ｂ）において初期心臓系統マーカーＣＤ８２およびＣＤ１３を発現する細胞の有意な増加を観察した。２０日目までに、残りの条件もまた、初期心臓系統マーカー発現を発現する細胞を生じたが、予測された条件は、マトリゲル対照と比較して１２および２０日目の両方において後期心臓マーカーであるｃＴＮＴの有意に高い発現を示した（図９Ｃ、Ｄ）。さらに、分化した心筋細胞の表現型を、分化した細胞が拍動する可能性に基づいて決定し、マトリゲルと比較して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙにより予測した条件（全ての予測因子の組合せ）を使用した場合、拍動する細胞を含むより多くの割合のプレートが存在することが示された。まとめると、これらのデータは、心臓の分化効率が増加し、より高い割合の機能的心筋細胞が生じることを示す。
ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙは、細胞変換、例えば、心筋細胞についての因子を予測する
次に、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙにより予測された変換条件を心筋細胞分化（ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子７）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）、ＴＧＦＢ３（トランスフォーミング成長因子ベータ３）、ＣＯＬ６Ａ３（コラーゲンＶＩ）、ＥＦＮＡ１（エフリンＡ１）、ＴＧＦＢ２（トランスフォーミング成長因子ベータ２）およびＧＤＦ５（成長分化因子５））について試験した。これを行うために、対照としてマトリゲルを使用して、リガンドを、分化の間、Ｈ９ ＥＳＣに対して個々に、および一緒に培養培地に補充した（図９Ａ）。分化の１２日目に、予測された条件（図９Ｂ）において初期心臓系統マーカーＣＤ８２およびＣＤ１３を発現する細胞の有意な増加を観察した。２０日目までに、残りの条件もまた、初期心臓系統マーカー発現を発現する細胞を生じたが、予測された条件は、マトリゲル対照と比較して１２および２０日目の両方において後期心臓マーカーであるｃＴＮＴの有意に高い発現を示した（図９Ｃ、Ｄ）。さらに、分化した心筋細胞の表現型を、分化した細胞が拍動する可能性に基づいて決定し、マトリゲルと比較して、ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙにより予測した条件（全ての予測因子の組合せ）を使用した場合、拍動する細胞を含むより多くの割合のプレートが存在することが示された。まとめると、これらのデータは、心臓の分化効率が増加し、より高い割合の機能的心筋細胞が生じることを示す。
【0330】
実施例１１
実験方法
細胞カウントアッセイ
ＲｅＮ星状膠細胞および初代星状膠細胞の５×１０３細胞を、それぞれの条件で４８ウェルプレートに播種した：基質なし、マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲンＩＶ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＡＭＢ１（ラミニン２２１）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、ＡＤＡＭ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＤＩＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全てのリガンド（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。３日後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を解離し、ＥＶＥ自動セルカウンター（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ Ｉｎｃ．）を使用してカウントした。
実験方法
細胞カウントアッセイ
ＲｅＮ星状膠細胞および初代星状膠細胞の５×１０３細胞を、それぞれの条件で４８ウェルプレートに播種した：基質なし、マトリゲル、ＦＮ１（フィブロネクチン）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲンＩＶ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＬＡＭＢ１（ラミニン２２１）（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、ＡＤＡＭ１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＤＩＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および全てのリガンド（マトリゲルを含まない上述の基質と成長因子の組合せ）。３日後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を解離し、ＥＶＥ自動セルカウンター（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ Ｉｎｃ．）を使用してカウントした。
【0331】
初代心筋細胞について、５×１０４細胞／ウェルを、それぞれの条件で１２ウェルプレートに播種した：基質なし、ゲルトレックス、ＦＮ１（フィブロネクチン）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲンＩ）、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害剤）、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子－７）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ。７２時間後、０．０４％トリプシン／０．０３％ＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を使用して細胞を解離し、ＬＵＮＡ－ＩＩ（商標）自動セルカウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）を使用してカウントした。
【0332】
平滑筋細胞について、５×１０４細胞／ウェルを、それぞれの条件で１２ウェルプレートに播種した：基質なし、ゲルトレックス、ＮＩＤ１（ニドゲン－１）、ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲンＩ）、ＣＯＬ４Ａ１（コラーゲン４）、ＣＯＬ６Ａ１（コラーゲン６）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞成長因子－１０）、ＦＧＦ７（線維芽細胞成長因子－７）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ。内皮細胞について：基質なし、ゲルトレックス、ＦＮ１（フィブロネクチン）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＣＴＧＦ（結合組織成長因子）、ＰＤＧＦＢ（血小板由来成長因子サブユニットＢ）、ＣＹＲ６１（システインリッチ血管新生誘導因子６１）、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）、ＢＭＰ６（骨形成タンパク質６）および全てのリガンド（ゲルトレックスを含まない上述の基質とリガンドの組合せ。７２時間後、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞を解離し、ＬＵＮＡ－ＩＩ（商標）自動セルカウンター（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）を使用してカウントした。
【0333】
ＢｒｄＵ増殖アッセイ
ＲｅＮ星状膠細胞および初代星状膠細胞の５×１０３細胞を、底が透明な９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。１２時間後、ＢｒｄＵ標識を、製造業者の推奨（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（化学発光）、Ｒｏｃｈｅ）に従ってウェルに加えた。７２時間後、細胞を固定し、抗ＢｒｄＵ抗体で標識化し、続いて基質反応を行い、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析した。初代心筋細胞について、ＢｒｄＵ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．）を、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に説明すると、示した細胞を、５×１０３細胞／ウェルで９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。７２時間後、ＢｒｄＵ溶液を各アッセイウェルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。増殖細胞によって取り込まれたＢｒｄＵを、酵素結合免疫吸着測定法によって検出した。
ＲｅＮ星状膠細胞および初代星状膠細胞の５×１０３細胞を、底が透明な９６ウェル黒色プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。１２時間後、ＢｒｄＵ標識を、製造業者の推奨（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（化学発光）、Ｒｏｃｈｅ）に従ってウェルに加えた。７２時間後、細胞を固定し、抗ＢｒｄＵ抗体で標識化し、続いて基質反応を行い、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析した。初代心筋細胞について、ＢｒｄＵ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．）を、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に説明すると、示した細胞を、５×１０３細胞／ウェルで９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。７２時間後、ＢｒｄＵ溶液を各アッセイウェルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。増殖細胞によって取り込まれたＢｒｄＵを、酵素結合免疫吸着測定法によって検出した。
【0334】
平滑筋細胞および内皮細胞の両方について、ＢｒｄＵ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ．）を、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔に説明すると、示した細胞を、５×１０３細胞／ウェルで９６ウェル組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種した。７２時間後、ＢｒｄＵ溶液を各アッセイウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。増殖細胞によって取り込まれたＢｒｄＵを、酵素結合免疫吸着測定法によって検出した。
【0335】
フローサイトメトリー
分化実験について、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して培養物を解離し、４００×ｇで５分間ペレット化した。次いで細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）中のＡＰＣ－Ｃｙ７ ＣＤ４４抗体（１０３０２８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；またはＰＥ－Ｃｙ７ ＣＤ１３（５６１５９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＥ ＣＤ８２（３４２１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、分析のために４００×ｇで５分間ペレット化した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞の生存率を決定した。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＬＳＲ ＩＩａアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。
分化実験について、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して培養物を解離し、４００×ｇで５分間ペレット化した。次いで細胞を、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）中のＡＰＣ－Ｃｙ７ ＣＤ４４抗体（１０３０２８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；またはＰＥ－Ｃｙ７ ＣＤ１３（５６１５９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＥ ＣＤ８２（３４２１０４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液をＰＢＳで洗浄し、分析のために４００×ｇで５分間ペレット化した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して細胞の生存率を決定した。ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＬＳＲ ＩＩａアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を分析した。
【0336】
初代心筋細胞、平滑筋細胞および内皮細胞について、０．０４％トリプシン／０．０３％ＥＤＴＡ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を使用して細胞を解離し、３００×ｇで５分間ペレット化した。次いで細胞を室温で４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で懸濁して固定し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ）中で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。心筋細胞についての一次抗体は、ウサギ抗ヒトＮｋｘ２．５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびウサギ抗ヒトＧＡＴＡ－４（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であった。平滑筋細胞および内皮細胞に使用した一次抗体は、それぞれ、アルファ平滑筋アクチンに対するマウスモノクローナル（Ａｂｃａｍ）およびフォンヴィレブランド因子に対するウサギポリクローナル（Ａｂｃａｍ）であった。使用した二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ウサギ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれる。細胞を、３０分間室温で、一次抗体で染色した。２回洗浄した後、細胞を二次抗体とインキュベートし、２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳ－Ｆｏｒｔｅｓｓａ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリー分析のためにＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁した。
【0337】
免疫蛍光
培養細胞を、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間固定し、次いで０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で透過処理した。次いで培養物を、一次抗体、続いて二次抗体とインキュベートした（以下の希釈を参照のこと）。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：１０００）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて、細胞核を可視化した。画像を倒立蛍光顕微鏡および付属カメラ（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）で撮影した。この研究に使用した一次抗体は、抗Ｓ１００ｂ（６６７３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２００）、抗ＧＦＡＰ（ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ、１：５００）、ｃＴＮＴ（ＭＳ－２９５－Ｐ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：１００）であった。この研究に使用した二次抗体（全て１：４００）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（Ａ２１２０２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａ３１５７２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａ２８１７５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。
培養細胞を、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間固定し、次いで０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で透過処理した。次いで培養物を、一次抗体、続いて二次抗体とインキュベートした（以下の希釈を参照のこと）。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（１：１０００）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて、細胞核を可視化した。画像を倒立蛍光顕微鏡および付属カメラ（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）で撮影した。この研究に使用した一次抗体は、抗Ｓ１００ｂ（６６７３、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２００）、抗ＧＦＡＰ（ａｂ７２６０、Ａｂｃａｍ、１：５００）、ｃＴＮＴ（ＭＳ－２９５－Ｐ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１：１００）であった。この研究に使用した二次抗体（全て１：４００）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（Ａ２１２０２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａ３１５７２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａ２８１７５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。
【0338】
内皮細胞および平滑筋細胞について、培養細胞を、ＰＢＳ中の４％ＰＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間固定し、次いで０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で透過処理した。次いで培養物を、一次抗体、続いて二次抗体とインキュベートした（以下の希釈を参照のこと）。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１：１０００）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて、細胞核を可視化した。画像を倒立蛍光顕微鏡で撮影した。内皮細胞および平滑筋細胞に使用した一次抗体は、それぞれ、抗ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ、１：２００）および抗－Ａｎｔｉ－ＴＡＧＬＮ／トランスジェリン（Ａｂｃａｍ、１：２００）であった。この研究に使用した二次抗体（全て１：４００）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ヤギ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。
【0339】
ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製および分析
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２７個の試料（Ｈ９ ＥＳＣ、初代星状膠細胞ならびに星状膠細胞分化の間の７、１４および２１日目からの細胞）から全ＲＮＡを単離した。８．５～１０のＲＩＮを有する１００～２００ｎｇの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってポリＡ ｍＲＮＡエンリッチメントおよびＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（９６ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐａｉｒｓ）と組み合わせたＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩディレクショナルＲＮＡライブラリー調製キットを使用してＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製のために誘導した。過剰なプライマーおよびアダプター二量体を取り除くために、ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＰＣＲ産物を２回精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００チップ（Ｄｕｋｅ－ＮＵＳ Ｇｅｎｏｍｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用してライブラリーの品質を評価し、ＫＡＰＡライブラリー定量化キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して各ライブラリーのモル濃度を決定した。３つのプールしたライブラリー（各々３０ｕＬ中に８ｎＭのプールした濃度で９個の試料を含有する）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００（ＮｏｖｏｇｅｎｅＡＩＴ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）でのシークエンシングのために送った。
ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２７個の試料（Ｈ９ ＥＳＣ、初代星状膠細胞ならびに星状膠細胞分化の間の７、１４および２１日目からの細胞）から全ＲＮＡを単離した。８．５～１０のＲＩＮを有する１００～２００ｎｇの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従ってポリＡ ｍＲＮＡエンリッチメントおよびＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（９６ Ｕｎｉｑｕｅ Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐａｉｒｓ）と組み合わせたＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩディレクショナルＲＮＡライブラリー調製キットを使用してＲＮＡ－ｓｅｑライブラリー調製のために誘導した。過剰なプライマーおよびアダプター二量体を取り除くために、ＳＰＲＩビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＰＣＲ産物を２回精製した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ １０００チップ（Ｄｕｋｅ－ＮＵＳ Ｇｅｎｏｍｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用してライブラリーの品質を評価し、ＫＡＰＡライブラリー定量化キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して各ライブラリーのモル濃度を決定した。３つのプールしたライブラリー（各々３０ｕＬ中に８ｎＭのプールした濃度で９個の試料を含有する）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ４０００（ＮｏｖｏｇｅｎｅＡＩＴ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）でのシークエンシングのために送った。
【0340】
Ｈ９ ＥＳＣ、初代星状膠細胞からの上記のＲＮＡ－ｓｅｑデータについて、星状膠細胞分化の間の異なる時点（７、１４および２１日目）ならびに対照マトリゲルおよびＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙによって予測された全てのリガンドを含む条件での遺伝子発現解析。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３９を使用してシークエンシングリードをトリミングし、このリードを、ＳＴＡＲ ｖ２．７．３を使用してＧＲＣｈ３８ヒトゲノムに整列させた。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓ ｖ１．６．０を使用して試料についての遺伝子発現プロファイルを生成し、ＤＥＳｅｑ２ ｖ１．２６．０を使用して差次的遺伝子発現プロファイルをコンピューターで計算した。本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑデータの遺伝子発現プロファイルを星状膠細胞転写シグネチャーと比較するために、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＴＰＭ）正規化を使用してデータを正規化した。次に、初代星状膠細胞において発現した５，４７５個の遺伝子（ＴＰＭ＞１）を選択し、これらの遺伝子について本発明者らは、全ての試料（異なる時点および条件でのＨ９ ＥＳＣ、初代星状膠細胞および分化した星状膠細胞）にわたって遺伝子ｚスコアを計算した。星状膠細胞転写シグネチャーを得るために、Ｈ９ ＥＳＣと小脳における星状膠細胞との間、およびＨ９と大脳皮質における星状膠細胞との間の差次的遺伝子発現プロファイルを、ＦＡＮＴＯＭ５遺伝子発現アトラスから得た。ＥｐｉＭｏｇｒｉｆｙ ＧＲＮは、正のＲｅｇＤＢＳスコアを有する遺伝子である星状膠細胞の細胞同一性遺伝子、およびＳＴＲＩＮＧネットワーク上のこれらの細胞同一性遺伝子と直接関連する遺伝子からなる。ＨｕｍａｎＢａｓｅ星状膠細胞特異的ＧＲＮをデータベースから得た。
【0341】
本明細書に開示され、定義される本発明は、言及されたまたは本文もしくは図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の全ての代替の組合せに及ぶことは理解される。これらの異なる組合せの全ては本発明の様々な代替の態様を構成する。
【0342】
本発明の記述および実施形態
ｉ．目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅とネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法。
ｉ．目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップと、
－ Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅および少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 微分幅とネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法。
【0343】
ｉｉ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定するステップが、目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定することを含み、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じ遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、記述ｉに記載の方法。
【0344】
ｉｉｉ．ネットワークスコアを決定するステップが、ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用に基づく、記述ｉｉに記載の方法。
【0345】
ｉｖ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞型を維持するのに必要な因子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を同定する、方法。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な因子を同定する、方法。
【0346】
ｖ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅が、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子幅スコアの中央値との差を計算し、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分ピーク幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述ｉからｉｖのいずれか一つに記載の方法。
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞における各遺伝子の遺伝子幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子幅スコアの中央値との差を計算し、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分ピーク幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述ｉからｉｖのいずれか一つに記載の方法。
【0347】
ｖｉ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅がＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され、好ましくは、情報はＥＮＣＯＤＥデータベースから得られる、記述ｉからｖのいずれか一つに記載の方法。
【0348】
ｖｉｉ．遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップが、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾が存在するゲノムの領域を最初に定義し、それらの領域をヒストン修飾参照ピーク遺伝子座（ＲＰＬ）と定義することを含む、記述ｖまたはｖｉに記載の方法。
【0349】
ｖｉｉｉ．ＲＰＬが、全ての細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られ、好ましくは、マージされるピーク領域は重複するピーク領域である、記述ｖｉｉに記載の方法。
【0350】
ｉｘ．各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子を除外することを含み、遺伝子がポイズド遺伝子として同定される、記述ｖからｖｉｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0351】
ｘ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む、記述ｉからｉｘのいずれか一つに記載の方法。
ｘｉ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ＤＢＳ）を決定するステップが、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に関する情報を、幅のその差の有意性と組み合わせることを含む、記述ｉｉからｉｘのいずれか一つに記載の方法。
ｘｉ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ＤＢＳ）を決定するステップが、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に関する情報を、幅のその差の有意性と組み合わせることを含む、記述ｉｉからｉｘのいずれか一つに記載の方法。
【0352】
ｘｉｉ．ＤＢＳが、ピーク幅の差と、差の有意性とを加算することによって決定され、好ましくは、ＤＢＳが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ピーク幅の差と、有意性の－ｌｏｇ１０Ｐ値とを加算することによって決定される、記述ｘｉに記載の方法。
【0353】
ｘｉｉｉ．目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップが、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ＤＢＳ）に関する情報、遺伝子の出次数ノードの数、およびネットワークにおける遺伝子の関連性のレベルを組み合わせることを含む、記述ｉからｘｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0354】
ｘｉｖ．ネットワークスコアが、関連する遺伝子のＤＢＳを合計することによって決定され、遺伝子の出次数ノードの数および関連性のレベルについて加重されて、ネットワークにおける関連するタンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳの加重和を得る、記述ｘｉｉｉに記載の方法。
【0355】
ｘｖ．タンパク質間相互作用ネットワークがＳＴＲＩＮＧデータベースである、記述ｉからｘｉｖのいずれか一つに記載の方法。
ｘｖｉ．細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）が、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、記述ｉからｘｖのいずれか一つに記載の方法。
ｘｖｉ．細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）が、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、記述ｉからｘｖのいずれか一つに記載の方法。
【0356】
ｘｖｉｉ．細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップが、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含む、記述ｉからｘｖｉのいずれか一つに記載の方法。
【0357】
ｘｖｉｉｉ．各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）を決定するステップが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅（ＤＢＳ）スコアと、目的の細胞における全ての遺伝子にわたって正規化されたネットワークスコアとを加算することを含む、記述ｉからｘｖｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0358】
ｘｉｘ．ＤＢＳとネットワークスコアとの加算が、２：１の係数によってネットワークスコアに対してＤＢＳを加重することを含む、記述ｘｖｉｉｉに記載の方法。
ｘｘ．その細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）に従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップが、ＲｅｇＤＢＳ値に基づいて遺伝子を順序付けすることを含む、記述ｉからｘｉｘのいずれか一つに記載の方法。
ｘｘ．その細胞同一性スコア（ＲｅｇＤＢＳ）に従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップが、ＲｅｇＤＢＳ値に基づいて遺伝子を順序付けすることを含む、記述ｉからｘｉｘのいずれか一つに記載の方法。
【0359】
ｘｘｉ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための因子が、細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対、好ましくは、受容体－リガンド対のリガンド、転写因子、およびエピジェネティックリモデリング因子からなる群から選択される、記述ｉからｘｘのいずれか一つに記載の方法。
【0360】
ｘｘｉｉ．細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要なシグナル伝達分子を同定するステップを含む、記述ｉからｘｘｉのいずれか一つに記載の方法。
【0361】
ｘｘｉｉｉ．細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子が、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従ってランク付けされ、受容体に関連付けられた各リガンドが、そのＤＢＳスコアに従ってランク付けされて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得、組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、記述ｘｘｉｉに記載の方法。
【0362】
ｘｘｉｖ．転写因子をコードする細胞同一性遺伝子を選択し、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するのに必要な転写因子を同定することをさらに含む、記述ｉからｘｘｉのいずれか一つに記載の方法。
【0363】
ｘｘｖ．目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を決定する方法であって、
－ 目的の細胞（ｘ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ 目的の細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコア（Δピーク幅ｘ ｇ）の正規化された差、およびその差の有意性（Ｐｖａｌ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅とＰｖａｌ値とを加算することによって、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）に関する情報を組み合わせることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコア（Ｎｅｔｘｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）の加重和は、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 目的の細胞（ｘ）における全てのタンパク質コード遺伝子（Ｇ）にわたってネットワークスコアＮｅｔｘ ｇを正規化するステップと、
－ 微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）とネットワークスコア（Ｎｅｔｘ ｇ）の組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けすることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳｘ ｇは、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳｘ ｇに従って各遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法。
－ 目的の細胞（ｘ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子ピーク幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ 目的の細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコア（Δピーク幅ｘ ｇ）の正規化された差、およびその差の有意性（Ｐｖａｌ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅とＰｖａｌ値とを加算することによって、細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）に関する情報を組み合わせることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコア（Ｎｅｔｘｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）の加重和は、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 目的の細胞（ｘ）における全てのタンパク質コード遺伝子（Ｇ）にわたってネットワークスコアＮｅｔｘ ｇを正規化するステップと、
－ 微分幅広スコア（ＤＢＳｘ ｇ）とネットワークスコア（Ｎｅｔｘ ｇ）の組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けすることによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての調節微分幅広スコア（ＲｅｇＤＢＳｘ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳｘ ｇは、細胞の同一性に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳｘ ｇに従って各遺伝子に優先順位を付けるステップと
を含み、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定する、方法。
【0364】
ｘｘｖｉ．タンパク質間ネットワークにおける実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、タンパク質コード遺伝子産物のノード間の相互作用が、ネットワークスコアの計算に含まれるように選択される、記述ｉからｘｘｖのいずれか一つに記載の方法。
【0365】
ｘｘｖｉｉ．ネットワークスコアを決定するステップが、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しないタンパク質コード遺伝子をタンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む、記述ｉからｘｘｖｉのいずれか一つに記載の方法。
【0366】
ｘｘｖｉｉｉ．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法。
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾の差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型へ変換するためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法。
【0367】
ｘｘｉｘ．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への細胞変換のためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコア（ＲｅｇΔＤＢＳ）を決定するステップと、
－ その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法。
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への細胞変換のためのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物と他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコア（ＲｅｇΔＤＢＳ）を決定するステップと、
－ その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する、方法。
【0368】
ｘｘｘ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅が、
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、各細胞型における各遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞型における各タンパク質コード遺伝子の遺伝子ピーク幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコアの中央値との差を計算し、それによってソース細胞および標的細胞の両方における各遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｉｘのいずれか一つに記載の方法。
－ ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅に関する情報を得て、各細胞型における各遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を得るステップと、
－ 細胞型における各タンパク質コード遺伝子の遺伝子ピーク幅スコアと、異なる型の細胞の集団にわたる同じ遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコアの中央値との差を計算し、それによってソース細胞および標的細胞の両方における各遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップと
によって決定される、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｉｘのいずれか一つに記載の方法。
【0369】
ｘｘｘｉ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅がＣｈＩＰ－ｓｅｑ情報に基づいて決定され、好ましくは、情報がＥＮＣＯＤＥデータベースから得られる、記述ｘｘｖｉｉからｘｘｘのいずれか一つに記載の方法。
【0370】
ｘｘｘｉｉ．遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップが、有意なＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾（ヒストン修飾参照ピーク遺伝子座、またはＲＰＬ）が存在するゲノムの領域を最初に定義することを含む、記述ｘｘｘからｘｘｘｉのいずれか一つに記載の方法。
【0371】
ｘｘｘｉｉｉ．ＲＰＬが、全ての細胞型にわたって、得られたＣｈＩＰ－ｓｅｑピーク領域をマージすることによって得られ、好ましくは、ピーク領域は重複するピーク領域である、記述ｘｘｘｉｉに記載の方法。
【0372】
ｘｘｘｉｖ．各タンパク質コード遺伝子についての遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３修飾領域が同定される遺伝子を除外することを含み、遺伝子はポイズド遺伝子として同定される、記述ｘｘｘからｘｘｘｉｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0373】
ｘｘｘｖ．Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｘｉｖのいずれか一つに記載の方法。
ｘｘｘｖｉ．ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳを決定するステップが、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の差に関する情報を、その差の有意性と組み合わせることを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｘｖのいずれか一つに記載の方法。
ｘｘｘｖｉ．ソース細胞および標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＤＢＳを決定するステップが、各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３幅の差に関する情報を、その差の有意性と組み合わせることを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｘｖのいずれか一つに記載の方法。
【0374】
ｘｘｘｖｉｉ．ＤＢＳを決定するステップが、ピーク幅の差および差の有意性を乗算、正規化または加算することを含み、好ましくは、ＤＢＳは、ピーク幅の差と差の有意性とを加算することによって決定される、記述ｘｘｘｖｉに記載の方法。
【0375】
ｘｘｘｖｉｉｉ．ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得るステップは、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞のＤＢＳを、各遺伝子についての標的細胞のＤＢＳから減算して、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳを得ることを含み、各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳは、ソース細胞と標的細胞との間の所与のタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差の尺度を提供する、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｘｖｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0376】
ｘｘｘｉｘ．ソース細胞から標的細胞への細胞変換についてのネットワークスコアが、ネットワークにおける関連する遺伝子の細胞変換ΔＤＢＳの加重された組合せである、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｘｘｖｉｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0377】
ｘｘｘｘ．細胞変換についてのネットワークスコアを決定するステップが、各遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳに関する情報、遺伝子の出次数ノードの数、およびネットワークにおける遺伝子の関連性のレベルを組み合わせることを含む、記述ｘｘｘｉｘに記載の方法。
【0378】
ｘｌｉ．ネットワークスコアが、関連する遺伝子の細胞変換ΔＤＢＳを合計することによって決定され、遺伝子の出次数ノードの数および関連性のレベルについて加重されて、ネットワークにおける関連する遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳの加重和を得る、記述ｘｌに記載の方法。
【0379】
ｘｌｉｉ．タンパク質間相互作用ネットワークがＳＴＲＩＮＧデータベースである、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｉのいずれか一つに記載の方法。
ｘｌｉｉｉ．細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定するステップが、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｉｉのいずれか一つに記載の方法。
ｘｌｉｉｉ．細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定するステップが、調節因子をコードするタンパク質コード遺伝子を優先的に加重することを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0380】
ｘｌｉｖ．各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳを決定するステップが、細胞変換ΔＤＢＳスコアと、全てのタンパク質コード遺伝子にわたって正規化された細胞変換ネットワークスコアとを加算することを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0381】
ｘｌｖ．細胞変換ΔＤＢＳおよび細胞変換ネットワークスコアの加算が、２：１の係数によって細胞変換ネットワークスコアに対して細胞変換ΔＤＢＳを加重することをさらに含む、記述ｘｌｉｖに記載の方法。
【0382】
ｘｌｖｉ．その細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けるステップが、細胞変換ＲｅｇΔＤＢＳ値に基づいて遺伝子を順序付けすることを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｖのいずれか一つに記載の方法。
【0383】
ｘｌｖｉｉ．細胞変換因子が、受容体－リガンド対、転写因子、またはエピジェネティックリモデリング因子からなる群から選択される、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｖｉのいずれか一つに記載の方法。
【0384】
ｘｌｖｉｉｉ．転写因子である因子のサブセットを選択し、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な転写因子を同定するステップであって、好ましくは、変換は、分化した標的細胞への分化したソース細胞の分化転換である、ステップをさらに含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｖｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0385】
ｘｌｉｘ．細胞シグナル伝達に関与する受容体－リガンド対である因子のサブセットを選択し、それによって標的細胞へのソース細胞の変換に必要なシグナル伝達分子を同定するステップであって、好ましくは、同定される因子は、分化した標的細胞への多能性ソース細胞の指向性分化のためである、ステップを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｘｌｖｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0386】
ｌ．細胞表面受容体をコードする各タンパク質コード遺伝子が、そのＲｅｇＤＢＳスコアに従ってランク付けされ、受容体に関連付けられた各リガンドは、そのＤＢＳスコアに従ってランク付けされて、受容体およびリガンドの組み合わせたランク付けを得、組み合わせたランク付けは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで目的の細胞を維持するための培養培地を補充する際に使用するためのリガンドを同定する、記述ｘｌｉｘに記載の方法。
【0387】
ｌｉ．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を決定する方法であって、
－ 目的のソース細胞（Ｓ）、および標的細胞（Ｔ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ ソース細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｓ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ 標的細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｔ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅Ｓ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、ソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を得るステップと、
－ Δピーク幅Ｔ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）を得るステップと、
－ 標的細胞における同じ遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）からソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を減算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳ（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を組み合わせることによって標的細胞における各遺伝子についてのネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）の加重和が、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 全てのタンパク質コード遺伝子にわたって細胞変換ネットワークスコアＮｅｔＴ－Ｓ ｇを正規化するステップと、
－ 細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）と細胞変換ネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）の組合せに基づいて各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換調節微分幅広スコア（ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇは、ソース細胞と比較した標的細胞に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の差の指標である、ステップと、
－ その細胞同一性スコア、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ細胞に従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定する、方法。
－ 目的のソース細胞（Ｓ）、および標的細胞（Ｔ）における各タンパク質コード遺伝子（ｇ）についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３遺伝子ピーク幅スコア（Ｂ）を決定するステップであって、遺伝子幅スコアは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３修飾を含む各タンパク質コード遺伝子のプロモーターにおける領域の長さの合計である、ステップと、
－ ソース細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子ピーク幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｓ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ 標的細胞と、バックグラウンド遺伝子ピーク幅スコアを表す細胞の集団の遺伝子幅スコアの中央値との間の遺伝子ピーク幅スコアの正規化された差（Δピーク幅Ｔ ｇ）、およびその差の有意性（ＰｖａｌＳ ｇ）を決定するステップと、
－ Δピーク幅Ｓ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、ソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を得るステップと、
－ Δピーク幅Ｔ ｇとＰｖａｌＴ ｇ値とを加算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）を得るステップと、
－ 標的細胞における同じ遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＴ ｇ）からソース細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳＳ ｇ）を減算して、標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換ΔＤＢＳ（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を得るステップと、
－ ネットワークにおける関連する遺伝子（ｒ）の細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を組み合わせることによって標的細胞における各遺伝子についてのネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ネットワークは、細胞における各タンパク質コード遺伝子の産物間の相互作用の情報を含み、微分幅広スコアは、遺伝子の出次数ノードの数（Ｏ）および遺伝子の関連性のレベル（Ｌ）を補正され、好ましくは、細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）の加重和が、関連性の第３のレベルまで計算される、ステップと、
－ 全てのタンパク質コード遺伝子にわたって細胞変換ネットワークスコアＮｅｔＴ－Ｓ ｇを正規化するステップと、
－ 細胞変換微分幅広スコア（ΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）と細胞変換ネットワークスコア（ＮｅｔＴ－Ｓ ｇ）の組合せに基づいて各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって各タンパク質コード遺伝子についての細胞変換調節微分幅広スコア（ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ）を決定するステップであって、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇは、ソース細胞と比較した標的細胞に対する各タンパク質コード遺伝子の調節作用の差の指標である、ステップと、
－ その細胞同一性スコア、ＲｅｇΔＤＢＳＴ－Ｓ ｇ細胞に従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換に必要な因子を同定する、方法。
【0388】
ｌｉｉ．ネットワークにおける実験スコアがゼロより大きく、組み合わせたスコアが５００より大きい場合、タンパク質間相互作用ネットワークにおけるタンパク質コード遺伝子産物のノード間の相互作用が選択される、記述ｘｘｖｉｉｉからｌｉのいずれか一つに記載の方法。
【0389】
ｌｉｉｉ．ネットワークスコアを決定するステップが、関連付けられたピークＨ３Ｋ４ｍｅ３幅を有しない遺伝子をタンパク質間相互作用ネットワークから除去することを含む、記述ｘｘｖｉｉｉからｌｉｉのいずれか一つに記載の方法。
【0390】
ｌｉｖ．転写的に冗長なＴＦを、各細胞型からのランク付けしたリストから除去するステップをさらに含む、記述ｘｌｖｉｉｉに記載の方法。
ｌｖ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に目的の細胞の集団を提供するステップと、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じ遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＲｅｇＤＢＳを決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳは細胞同一性についての各タンパク質コード遺伝子の重要性の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 目的の細胞の集団を、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子のうちの１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に目的の細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する、方法。
ｌｖ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に目的の細胞の集団を提供するステップと、
－ 目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についての微分幅広スコア（ＤＢＳ）を決定するステップであって、ＤＢＳは、異なる細胞型の集団における同じ遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の中央値と比較した全てのタンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の幅の差に基づく、ステップと、
－ ＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、各タンパク質コード遺伝子の産物と、細胞における他のタンパク質コード遺伝子産物との間の相互作用の情報を含む、ステップと、
－ ＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子をスコア付けし、それによって目的の細胞における各タンパク質コード遺伝子についてのＲｅｇＤＢＳを決定するステップであって、ＲｅｇＤＢＳは細胞同一性についての各タンパク質コード遺伝子の重要性の指標である、ステップと、
－ そのＲｅｇＤＢＳに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付け、それによって目的の細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 目的の細胞の集団を、目的の細胞の細胞同一性に関連付けられた因子のうちの１つまたは複数と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に目的の細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で細胞の集団を培養するステップと
を含み、それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞の集団を維持する、方法。
【0391】
ｌｖｉ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する方法であって、順に以下のステップ：
－ 細胞培養中に星状膠細胞の集団を提供するステップと、
－ 星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、星状膠細胞の集団を、１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に星状膠細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で星状膠細胞の集団を培養するステップと
を含み、
因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＥＤＩＬ３、ＷＮＴ５Ａ、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２およびＣＯＬ１Ａ２から選択され、
それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する、方法。
－ 細胞培養中に星状膠細胞の集団を提供するステップと、
－ 星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、星状膠細胞の集団を、１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に星状膠細胞の維持を可能にするのに十分な時間および条件下で星状膠細胞の集団を培養するステップと
を含み、
因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＥＤＩＬ３、ＷＮＴ５Ａ、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２およびＣＯＬ１Ａ２から選択され、
それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで星状膠細胞の集団を維持する、方法。
【0392】
ｌｖｉｉ．因子が、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＥＤＩＬ３、ＷＮＴ５Ａ、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２およびＣＯＬ１Ａ２を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、記述ｌｖｉに記載の方法。
【0393】
ｌｖｉｉｉ．星状膠細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＥＤＩＬ３、ＷＮＴ５Ａ、ＬＡＭＢ１、ＡＤＡＭ１２およびＣＯＬ１Ａ２のうちの１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上と接触させるステップを含む、記述ｌｖｉまたはｌｖｉｉに記載の方法。
【0394】
ｌｉｘ．星状膠細胞を個体に投与するステップをさらに含む、記述ｌｖｉからｌｉｘのいずれか一つに記載の方法。
ｌｘ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に心筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 心筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、心筋細胞の集団を、１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に心筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で心筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、
因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２から選択され、
それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する、方法。
ｌｘ．ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する方法であって、
－ 細胞培養中に心筋細胞の集団を提供するステップと、
－ 心筋細胞の少なくとも１つの特徴を維持するために、心筋細胞の集団を、１つまたは複数の因子と接触させるステップと、
－ 細胞培養中に心筋細胞を維持するのに十分な時間および好適な条件下で心筋細胞の集団を培養するステップと
を含み、
因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２から選択され、
それによってｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞の集団を維持する、方法。
【0395】
ｌｘｉ．因子が、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、記述ｌｘに記載の方法。
【0396】
ｌｘｉｉ．心筋細胞を、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３およびＣＸＣＬ１２のうちの１つまたは複数、任意選択により、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰＩ、ＦＧＦ７、ＡＰＯＥ、Ｃ３、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＸＣＬ１２のうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上と接触させるステップであって、好ましくは、因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＦＰ１、ＦＧＦ７およびＡＰＯＥである、ステップを含む、記述ｌｘまたはｌｘｉに記載の方法。
【0397】
ｌｘｉｉｉ．心筋細胞、または細胞集団を個体に投与するステップをさらに含む、記述ｌｘからｌｘｉｉのいずれか一つに記載の方法。
ｌｘｉｖ．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する方法であって、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾における差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークが、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換し、任意選択により、１つまたは複数の因子の量を増加させることは、ｉ）ソース細胞を、因子もしくは細胞によって因子の発現を増加させる作用物質と接触させること、またはｉｉ）因子をコードする核酸をソース細胞にトランスフェクトし、細胞において核酸を発現させることを含む、方法。
ｌｘｉｖ．標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換する方法であって、
－ ソース細胞を準備するステップと、
－ ソース細胞および標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾領域の微分幅を決定して、ソースおよび標的細胞型における各タンパク質コード遺伝子についてのＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾のスコア（ＤＢＳ）を得るステップと、
－ ソース細胞のＤＢＳと標的細胞のＤＢＳとの差を計算して、各タンパク質コード遺伝子についてのソース細胞と標的細胞との間のＨ３Ｋ４ｍｅ３修飾における差の尺度（細胞変換ΔＤＢＳ）を得るステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳおよび少なくとも１つのネットワーク上の各タンパク質コード遺伝子のタンパク質産物間の相互作用に基づいてソース細胞型から標的細胞型への変換についてのネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークが、細胞における各タンパク質コード遺伝子産物と他の遺伝子産物との相互作用の情報を含む、ステップと、
－ 細胞変換ΔＤＢＳとネットワークスコアの組合せに基づいて標的細胞における各タンパク質コード遺伝子についての細胞同一性変換スコアを決定するステップと、
－ その細胞同一性変換スコアに従って各タンパク質コード遺伝子に優先順位を付けて、標的細胞についての細胞同一性遺伝子を同定するステップであって、各細胞同一性遺伝子は、標的細胞の細胞同一性に関連付けられた因子をコードする、ステップと、
－ 標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へのソース細胞の変換を可能にするのに十分な時間および条件下でソース細胞を培養するステップと
を含み、それによって標的細胞型の少なくとも１つの特徴を示す細胞へソース細胞を変換し、任意選択により、１つまたは複数の因子の量を増加させることは、ｉ）ソース細胞を、因子もしくは細胞によって因子の発現を増加させる作用物質と接触させること、またはｉｉ）因子をコードする核酸をソース細胞にトランスフェクトし、細胞において核酸を発現させることを含む、方法。
【0398】
ｌｘｖ．ソース細胞を分化するための方法であって、ソース細胞において、１つもしくは複数の因子またはそのバリアントのタンパク質発現を増加させるステップであって、ソース細胞は、標的細胞の少なくとも１つの特徴を示すように分化される、ステップを含み、
－ ソース細胞は多能性幹細胞であり、標的細胞は星状膠細胞であり、
－ 因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａのうちの１つまたは複数である、方法。
－ ソース細胞は多能性幹細胞であり、標的細胞は星状膠細胞であり、
－ 因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａのうちの１つまたは複数である、方法。
【0399】
ｌｘｖｉ．多能性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する方法であって、
－ ソース細胞において、多能性幹細胞または神経前駆細胞を、因子ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａのうちの１つもしくは複数、またはそれらのバリアントと接触させるステップと、
－ 星状膠細胞への分化を可能にするのに十分な時間および条件下で多能性幹細胞または神経前駆細胞を培養し、それによって多能性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法。
－ ソース細胞において、多能性幹細胞または神経前駆細胞を、因子ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａのうちの１つもしくは複数、またはそれらのバリアントと接触させるステップと、
－ 星状膠細胞への分化を可能にするのに十分な時間および条件下で多能性幹細胞または神経前駆細胞を培養し、それによって多能性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法。
【0400】
ｌｘｖｉｉ．多能性幹細胞、好ましくは、胚性幹細胞または神経前駆細胞を、星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞に分化するための方法であって、ｉ）多能性幹細胞、または多能性幹細胞もしくは神経前駆細胞を含む細胞集団を準備するステップと、ｉｉ）前記多能性幹細胞または神経前駆細胞に、星状膠細胞の細胞同一性に重要な１つまたは複数の因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸をトランスフェクトするステップと、ｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、任意選択により、星状膠細胞の細胞の少なくとも１つの特徴について細胞または細胞集団をモニタリングするステップとを含み、
多能性幹細胞を星状膠細胞へ分化するための因子、または星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、方法。
多能性幹細胞を星状膠細胞へ分化するための因子、または星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するための因子は、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、方法。
【0401】
ｌｘｖｉｉｉ．胚性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成する方法であって、
－ 胚性幹細胞または神経前駆細胞において、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａ、またはそれらのバリアントのうちのいずれか１つまたは複数の量を増加させるステップと、
－ 星状膠細胞に分化するのに十分な時間および条件下で胚性幹細胞を培養し、それによって胚性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法。
－ 胚性幹細胞または神経前駆細胞において、ＦＮ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＥＤＩＬ３、ＡＤＡＭ１２、ＬＡＭＢ１およびＷＮＴ５Ａ、またはそれらのバリアントのうちのいずれか１つまたは複数の量を増加させるステップと、
－ 星状膠細胞に分化するのに十分な時間および条件下で胚性幹細胞を培養し、それによって胚性幹細胞または神経前駆細胞から星状膠細胞の少なくとも１つの特徴を示す細胞を生成するステップと
を含む、方法。
【0402】
ｌｘｉｘ．因子の１つまたは複数の量を増加させるステップが、ソース細胞において因子の１つまたは複数をコードする核酸を発現させることを含む、記述ｌｘｖｉｉｉに記載の方法。
【0403】
ｌｘｘ．星状膠細胞の少なくとも１つの特徴が、いずれか１つもしくは複数の星状膠細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化であり、好ましくは、星状膠細胞マーカーは、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＡＬＤＨ１Ｌ１、ＣＤ４４およびＧＬＡＳＴ１から選択される、記述ｌｘｉｖからｌｘｉｘのいずれか一つに記載の方法。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10】
【国際調査報告】