特表 2022-540057 新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ及びその阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-14

(54)【発明の名称】新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ及びその阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20220907BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220907BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220907BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20220907BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20220907BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220907BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20220907BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220907BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20220907BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/655 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20220907BHJP

   A61K 31/216 20060101ALI20220907BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220907BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220907BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220907BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20220907BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N5/10 ZNA

C12N15/63 Z

C12N9/24

A23L33/10

C12N15/113 Z

C12N15/115 Z

C12N15/13

A01K67/027

C12Q1/06

A61K45/00

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/711

A61K38/02

A61K39/395 D

A61K31/655

A61K31/517

A61K31/216

A61P13/12

A61P43/00 105

A61P3/10

A61P9/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021577918

(86)(22)【出願日】2020-06-25

(85)【翻訳文提出日】2021-12-27

(86)【国際出願番号】 KR2020008283

(87)【国際公開番号】W WO2020262983

(87)【国際公開日】2020-12-30

(31)【優先権主張番号】10-2019-0076979

(32)【優先日】2019-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0076635

(32)【優先日】2020-06-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516331627

【氏名又は名称】インダストリアル コーオペレーション ファウンデーション チョンブク ナショナル ユニバーシティー

(71)【出願人】

【識別番号】521567424

【氏名又は名称】ディーエヌティー カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】キム，ウ－ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】ナム，テ－シク

【テーマコード（参考）】

4B018

4B050

4B063

4B065

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B018LB08

4B018MD90

4B018ME02

4B018MF14

4B050CC03

4B050DD11

4B050KK15

4B050LL01

4B050LL03

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ30

4B063QR41

4B063QS32

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BD38

4B065BD39

4B065CA27

4B065CA41

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA17

4C084BA03

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZA42

4C084ZA81

4C084ZB21

4C084ZC35

4C085AA13

4C085BB11

4C085BB31

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC46

4C086DA30

4C086EA16

4C086GA07

4C086GA09

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA42

4C086ZA81

4C086ZB21

4C086ZC35

4C206AA01

4C206AA02

4C206DB20

4C206DB56

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA42

4C206ZA81

4C206ZB21

4C206ZC35

(57)【要約】

本発明は、新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含む、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。また、本発明は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断用組成物に関する。本発明の組成物は、アンジオテンシンＩＩによる新しいＡＤＰ－リボシルシクラーゼの発現又は活性増加による腎臓細胞内カルシウム増加を抑制する効果があり、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患、特に腎臓疾患の治療剤として有用に利用可能である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＤＰＲＣ）又はその天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体。

【請求項2】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、種間変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ ｖａｒｉａｎｔｓ）、種の相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ）、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）、対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）、立体配列による変異体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ）、スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）及び点突然変異変異体（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ）からなる群から選ばれる天然的に発生した変異体であることを特徴とする、請求項１に記載のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体。

【請求項3】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両棲類及び魚類からなる群から選ばれる生物から発生したことを特徴とする、請求項１に記載のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体。

【請求項4】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、配列目録第２配列～第２１配列からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体。

【請求項5】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその変異体は、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させることを特徴とする、請求項１に記載のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体。

【請求項6】

請求項１のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体をコードする核酸分子。

【請求項7】

請求項６の核酸分子を含むベクター。

【請求項8】

請求項７のベクターを含む宿主細胞。

【請求項9】

請求項１のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体、請求項６の核酸分子又は請求項７のベクターを含む、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる触媒組成物。

【請求項10】

配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含む、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物。

【請求項11】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒｉｂｏｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ及びＰＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。

【請求項12】

前記ｓｉＲＮＡは、配列目録第２２配列のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の薬剤学的組成物。

【請求項13】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の活性抑制剤は、化合物、ペプチド、ペプチド類似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。

【請求項14】

前記化合物は、４，４’－ジヒドロキシアゾベンゼン（４，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ）、２－（１，３－ベンゾオキサゾール－２－イルアミノ）－１－メチルキナゾリン－４（１Ｈ）－オン（２－（１，３－ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）－１－ｍｅｔｈｙｌｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ－４（１Ｈ）－ｏｎｅ）及びジカフェオイルキナ酸（Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤学的組成物。

【請求項15】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患は、腎臓疾患であることを特徴とする、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。

【請求項16】

前記腎臓疾患は、腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、腎症（ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）又は腎臓硬化症（ｎｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬剤学的組成物。

【請求項17】

前記腎不全は、慢性腎不全（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、急性腎不全（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、又は透析前の軽度腎不全であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬剤学的組成物。

【請求項18】

前記腎症は、腎症症候群（Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リポイド腎症（Ｌｉｐｏｉｄ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性腎症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、免疫グロビンＡ腎症（ＩｇＡ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、鎮痛剤腎症（Ａｎａｌｇｅｓｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）又は高血圧性腎症（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬剤学的組成物。

【請求項19】

配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含む、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は改善用食品組成物。

【請求項20】

請求項１のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＤＰＲＣ）又はその天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体のヘテロタイプ（ｈｅｔｅｒｏ ｔｙｐｅ）遺伝子欠損したヒト以外の動物モデル。

【請求項21】

下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患有無の確認方法：
（ａ）請求項２０の動物モデル及び野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）動物モデルに特定疾患を誘導する段階；及び
（ｂ）前記動物モデル間の差異を確認する段階。

【請求項22】

下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断に関する情報提供方法：
１）被検体から分離された試料内配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現又は活性レベルを測定する段階；及び、
２）前記段階１）のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現又は活性レベルを正常対照群と比較し、シクラーゼ媒介疾患にかかる危険を持つ個体と判断する段階。

【請求項23】

配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断用組成物。

【請求項24】

配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断キット。

【請求項25】

下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療物質のスクリーニング方法：
１）配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体を発現させる細胞に候補物質を処理する段階；
２）前記候補物質の処理により、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルを測定する段階；及び
３）前記遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルが、候補物質を処理しない対照群と比較して減少した場合に、前記候補物質をＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療物質として選別する段階。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボースに変換させる新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ及びその阻害剤に関する。

【0002】

〔背景技術〕
ＡＤＰＲＣは、ＮＡＤ^＋からサイクリックＡＤＰリボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）を合成し、ＮＡＤＰ^＋からニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＮＡＡＤＰ）を合成する酵素で、植物から哺乳動物までに至って広範に存在する。このＡＤＰＲＣは、細胞内カルシウム貯蔵庫から細胞質にカルシウムを遊離させることによって、細胞の様々な機能を調節するものと知られている［Ｂｅｒｒｉｄｇｅ ＭＪ，Ｂｏｏｔｍａｎ ＭＤ，Ｒｏｄｅｒｉｃｋ ＨＬ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４，５１７－５２９，２００３；Ｌｅｅ ＨＣ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２ ３１７－３２３，２００６］。

【0003】

安定した状態では細胞内カルシウム濃度は１０^－７Ｍ以下と、基底値に維持される。しかしながら、細胞が活性化した状態では、細胞内カルシウム濃度が基底値の１０倍程度まで増加し、病的な状態においてカルシウム濃度が続けて高く維持される場合には細胞の多くの機能が影響を受け、結果的に細胞の正常機能を消失してしまう。

【0004】

高血圧又は高血圧を伴った糖尿病、肥満、痴呆、虚熱、細胞増殖を伴った疾患においても、細胞内のカルシウム代謝調節に異常が生じ、細胞内のカルシウム濃度が正常よりも高く維持される［Ｒｅｓｎｉｃｋ ＬＭ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．６：１２３Ｓ－１３４Ｓ，１９９３］。

【0005】

一例として、高血圧のような慢性疾患者について説明すると、様々な遺伝的、環境的或いはある疾病の二次的な原因により、血管平滑筋細胞内のカルシウム濃度が持続して正常値よりも高い数値を示し、その結果、血管平滑筋の収縮を誘発させて末梢血管の抵抗が増加し、このため、血圧が正常血圧よりも上昇した状態が続き、高血圧をもたらす。

【0006】

このように上昇した血圧は、二次的に血管平滑筋細胞及び線維組織の増殖と肥大を招き、結果として、末梢血管抵抗及び血圧をさらに増加させ、心血管系、脳及び腎臓などの臓器機能を阻害することにより、心筋梗塞、狭心症、中風及び慢性心不全症などで死亡に至らせるものと知られている［Ｃｏｗｌｅｙ ＡＷ Ｊｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．７２：２３１－３００，１９９２］。

【0007】

膵臓からのインスリン分泌には、ＡＤＰＲＣの一種であるＣＤ３８活性による、すなわちｃＡＤＰＲによる、カルシウム増加が重要な役割を果たすと知られている。また、糖尿病誘発はアンジオテンシンの生成を増加させるが、このペプチドホルモンは、腎臓疾患、高血圧及び心臓病を誘発させる他、ＡＤＰＲＣを活性化させることもよく知られている。

【0008】

したがって、ＡＤＰＲＣは、免疫細胞、心臓筋細胞、膵臓ベータ細胞、腎臓筋細胞及び神経細胞などに存在しながら様々なホルモンの受容体と関連付いて細胞内カルシウム濃度の増加及び様々な生理活性を調節するところ、このＡＤＰＲＣの発現又は活性調節に異常があると、生理現象（免疫、腎臓機能、インスリン分泌、心血管機能）調節に異常が起きることがある。

【0009】

このようなＡＤＰＲＣは、様々なホルモンによって活性化し、この酵素は、基質ＮＡＤ^＋から産物であるｃＡＤＰＲを生成するが、このｃＡＤＰＲは、大部分の臓器で細胞内カルシウムを増加させる。また、ＡＤＰＲＣの活性によるカルシウムの異常増加は、インスリン分泌（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）［Ｋｉｍ ＢＪ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｙｉｍ ＣＹ，Ｔａｋａｓａｗａ Ｓ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ｈ，Ｉｍ ＭＪ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５７：８６８－８７８，２００８］、細胞肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）［Ｇｕｌ Ｒ，Ｐａｒｋ ＪＨ，Ｋｉｍ ＳＹ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｃｈｅａ ＪＫ，Ｋｏ ＪＫ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．８１：５８２－５９１，２００９］、細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｒａｈ ＳＹ，Ｋｉｍ ＳＨ，Ｐａｒｋ ＳＫ，Ｉｍ ＭＪ，Ｋｗｏｎ ＨＪ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９４：Ｆ９８９－Ｆ９８９，２００８］などの様々な生体病理に要因として知られてきた。

【0010】

現在まで最もよく研究されたＡＤＰＲＣは、Ｔ－細胞表面抗原であるＣＤ３８であり、該分子は免疫細胞の他にも様々な臓器に広く発現している。

【0011】

しかしながら、心臓、腎臓、脳にはＣＤ３８とは異なるＡＤＰＲＣが発現することが明らかにされた［Ｐａｒｔｉｄａ－Ｓａｎｃｈｅｚ Ｓ，Ｃｏｃｋａｙｎｅ ＤＡ，Ｍｏｎａｒｄ Ｓ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＥＬ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ Ｎ，Ｇａｒｖｙ Ｂ，Ｋｕｓｓｅｒ Ｋ，Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｓ，Ｈｏｗａｒｄ Ｍ，Ｈａｒｍｓｅｎ Ａ，Ｒａｎｄａｌｌ ＴＤ，Ｌｕｎｄ ＦＥ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ７：１２０９－１６，２００１］。

【0012】

したがって、組織特異的ＡＤＰＲＣの発現調節は、細胞内カルシウム増加によって誘発された病気を治療するのに役立つであろう。しかし、ＡＤＰＲＣの活性機序はまだ知られていない。

【0013】

上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に関する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならない。

【0014】

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者は、哺乳動物から知られている既存のＡＤＰＲＣ（ＣＤ３８、ＣＤ１５７）ではなく新しい種類のＡＤＰＲＣの酵素を発見してその活性を確認し、本発明を完成するに至った。

【0015】

したがって、本発明の目的は、新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＤＰＲＣ）又はその天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体を提供することにある。

【0016】

本発明の他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体をコードする核酸分子を提供することにある。

【0017】

本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。

【0018】

本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。

【0019】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体、これをコードする核酸分子又は前記核酸分子を含むベクターを含む、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる触媒組成物を提供することにある。

【0020】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

【0021】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は改善用食品組成物を提供することにある。

【0022】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体のヘテロタイプ（ｈｅｔｅｒｏ ｔｙｐｅ）遺伝子欠損した動物モデルを提供することにある。

【0023】

本発明のさらに他の目的は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断に関する情報提供方法を提供することにある。

【0024】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断用組成物を提供することにある。

【0025】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断キットを提供することにある。

【0026】

本発明のさらに他の目的は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療物質のスクリーニング方法を提供することにある。

【0027】

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面から、より明確になる。

【0028】

〔課題を解決するための手段〕
本発明の一態様によれば、本発明は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＤＰＲＣ）又はその天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体を提供する。

【0029】

本発明者は、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に転換させる酵素であって、従来に知られたＡＤＰ－リボシルシクラーゼの他に新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼを発掘しようと鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。

【0030】

本明細書において用語“ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ”又は“ＡＤＰＲＣ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ）”とは、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる酵素を意味する。

【0031】

本明細書において用語“ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの変異体”とは、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの一部のアミノ酸配列が天然的又は人工的に置換、欠失、添加された変異体を意味し、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる触媒の活性を有しているＡＤＰ－リボシルシクラーゼの変異体を意味する。

【0032】

明細書において用語“ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体”とは、前記配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体で、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる触媒の活性を有しているＡＤＰ－リボシルシクラーゼの変異体のことを意味する。

【0033】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、種間変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ ｖａｒｉａｎｔｓ）、種の相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｓ）、アイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）、対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ）、立体配列による変異体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔｓ）、スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ）及び点突然変異変異体（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ）からなる群から選ばれる天然的に発生した変異体である。

【0034】

本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼと好ましくは５０％以上の相同性、より好ましくは６０％以上の相同性、さらに好ましくは７０％以上の相同性、特に好ましくは８０％以上の相同性、最も好ましくは９０％以上の相同性を有する。

【0035】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両棲類及び魚類からなる群から選ばれる生物から発生したものである。

【0036】

本発明の一実施例によれば、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼと比較して、哺乳類は７０％以上、鳥類、爬虫類及び両棲類は６０％以上、魚類は５０％以上の相同性を有することが確認された。

【0037】

本発明の一実施例によれば、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼと比較して、ヒト及びラットは９６％、チンパンジーは９３％、ギニアピッグ及びウマは９１％、イヌ、ヤギ及びヒツジは９０％、ウサギは８９％、ブタは８８％、ウシは７８％、ニワトリは７０％、カエルは６３％、シチメンチョウは６２％の高い相同性を示し、種間保存的配列の比重が非常に高い酵素であることを確認した（図４）。

【0038】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの天然的に発生した変異体は、配列目録第２配列～第２１配列で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を含む。

【0039】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体をコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0040】

本発明の核酸分子は、単離したもの又は組み換えられたものでよく、単一鎖及び二重鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡの他、対応する相補性配列も含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸の単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドは、このような手順から生成された核酸の単離した核酸分子として理解されてよい。単離した核酸分子は、別個断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を示す。核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時に“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダ（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合にポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合にコーディング配列に作動可能に連結され、又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される時にコーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダの場合、隣接して同一のリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位においてライゲイションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、通常の方法によって使用する。

【0041】

本発明の好ましい具現例によれば、前記核酸分子は、ｃＤＮＡである。

【0042】

本明細書において用語“ベクター”は、核酸配列を複製可能な細胞への導入のために核酸配列を挿入し得る伝達体を意味する。核酸配列は、外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であってよい。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は、標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。

【0043】

本明細書において、用語“発現ベクター”は、転写される遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合では、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドとして翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列が含まれてよい。転写及び翻訳を調節する調節配列と共にベクター及び発現ベクターには、さらに他の機能も提供する核酸配列が含まれてもよい。

【0044】

本明細書において用語“宿主細胞”は、真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか、或いはベクターによってコードされる遺伝子を発現できる任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は、前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）されてよく、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。

【0045】

本発明の宿主細胞は、好ましくは、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、イースト（ｙｅａｓｔ）、動物又はヒト細胞（ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＳ１３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＯＰ５細胞、Ａ５４９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等）を挙げることができるが、これに制限されるものではない。

【0046】

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体、これをコードする核酸分子又は前記核酸分子を含むベクターを含む、ＮＡＤ^＋をサイクリックＡＤＰ－リボース（ｃｙｃｌｉｃ ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ；ｃＡＤＰＲ）に変換させる触媒組成物を提供する。

【0047】

本発明の触媒組成物は、ＮＡＤ^＋がｃＡＤＰＲに変換される過程を効率的に触媒する。

【0048】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を含む組成物を提供する。

【0049】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物である。

【0050】

本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記発現抑制剤又は活性抑制剤；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。

【0051】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は改善用食品組成物である。

【0052】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記薬剤学的組成物の薬剤学的有効量を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0053】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、治療用途に使用するための（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を提供する。

【0054】

本発明が予防又は治療しようとするＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の種類は制限されず、好ましくは、糖尿病又は腎臓疾患であり、より好ましくは、腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）、腎症（ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎臓線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）又は腎臓硬化症（ｎｅｐｈｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）である。

【0055】

本発明の好ましい具現例によれば、前記腎不全は、慢性腎不全（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、急性腎不全（Ａｃｕｔｅ Ｒｅｎａｌ Ｆａｉｌｕｒｅ）、又は透析前の軽度腎不全である。

【0056】

本発明の好ましい具現例によれば、前記腎症は、腎症症候群（Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、リポイド腎症（Ｌｉｐｏｉｄ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性腎症（Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、免疫グロビンＡ腎症（ＩｇＡ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、鎮痛剤腎症（Ａｎａｌｇｅｓｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）又は高血圧性腎症（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）である。

【0057】

本発明の一実施例によれば、本発明の組成物は、体重対比腎臓重さの有意味な減少、クレアチン掃除率の有意味な増加、小便アルブミン量の有意味な減少から、慢性腎不全や糖尿病性腎症を含む腎臓疾患治療剤の候補としての可能性を確認し（図６）；さらにＡＤＰ－リボシルシクラーゼ活性及びｃＡＤＰＲの濃度を正常レベルに下げ（図７）；ＴＧＦ－β１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶの発現量を正常レベルに下げ（図８）；糸球体肥厚、炎症細胞の浸潤、異型上皮細胞の形成を正常レベルに回復させ、腎臓の病理組織学的変化を回復させる能力も保有し（図９）；高血圧モデルにおいてもクレアチン掃除率が有意に増加し、高血圧性腎症への適用可能性も確認したところ（図１１Ｂ）、腎臓機能異常又は損傷によって発生する種々の腎臓疾患治療剤としての可能性を有する。

【0058】

本明細書において用語“発現抑制剤”とは、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの発現を抑制する物質を意味し、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの構造及び機能から通常の技術者は、これを容易に作製することができる。

【0059】

本発明の発現抑制剤は、制限されないが、好ましくは、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒｉｂｏｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ及びＰＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選ばれるいずれか一つである。

【0060】

本発明の好ましい具現例によれば、前記ｓｉＲＮＡは、配列目録第２２配列のヌクレオチド配列を含むものである。

【0061】

本明細書において用語“活性抑制剤”とは、前記発現したＡＤＰ－リボシルシクラーゼタンパク質の活性を抑制する物質を意味し、好ましくは、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体タンパク質に特異的に結合する化合物、ペプチド、ペプチド類似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、アプタマー及び抗体からなる群から選ばれるいずれか一つである。

【0062】

本発明の好ましい具現例によれば、前記化合物は、４，４’－ジヒドロキシアゾベンゼン（４，４’－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ）、２－（１，３－ベンゾオキサゾール－２－イルアミノ）－１－メチルキナゾリン－４（１Ｈ）－オン（２－（１，３－ｂｅｎｚｏｘａｚｏｌ－２－ｙｌａｍｉｎｏ）－１－ｍｅｔｈｙｌｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ－４（１Ｈ）－ｏｎｅ）及びジカフェオイルキナ酸（Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＣＱＡ）からなる群から選ばれるものである。

【0063】

本発明の４，４’－ジヒドロキシアゾベンゼンは、好ましくは、下記化学式１で表示されてよい：

【0064】

【化1】

【0065】

本発明の２－（１，３－ベンゾオキサゾール－２－イルアミノ）－１－メチルキナゾリン－４（１Ｈ）－オンは、好ましくは、下記化学式２で表示されてよい：

【0066】

【化2】

【0067】

本発明のジカフェオイルキナ酸（Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＣＱＡ）は、下記化学式３～８（１，４－ＤＣＱＡ、３，４－ＤＣＱＡ、３，５－ＤＣＱＡ、４，５－ＤＣＱＡ、１，３－ＤＣＱＡ及び１，５－ＤＣＱＡ）からなる群から選ばれるいずれか一つの化合物で表示されてよい：

【0068】

【化3】

【0069】

【化4】

【0070】

【化5】

【0071】

【化6】

【0072】

【化7】

【0073】

【化8】

【0074】

本発明の一実施例によれば、本発明に係る新しいＡＤＰ－リボシルシクラーゼに対する発現抑制剤又は活性抑制剤は、ＡＤＰＲＣの発現又は活性を調節する機序を経て腎臓疾患を抑制するのに寄与することが確認された。

【0075】

したがって、本発明の新しいＡＤＰ－リボシルシクラーゼに対する発現抑制剤又は活性抑制剤は、臨床的に有用な各細胞別選択的抑制剤、さらに腎臓内疾病予防、改善及び／又は治療剤として使用することができる。

【0076】

本発明の組成物は、有効成分である新しいＡＤＰＲＣの発現抑制剤又は活性抑制剤の他、既存に公知されたＡＤＰＲＣ関連疾患の治療剤も共に使用可能である。

【0077】

本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体と共に適宜の形態で剤形化されてよい。‘薬剤学的に許容される’とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるときに、通常、胃腸障害、目眩などのようなアレルギー反応又はこれと類似の反応を起こさない担体のことを指す。

【0078】

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

【0079】

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは、非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。

【0080】

本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、希望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。

【0081】

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造したり又は多回容量容器内に内入させて製造することができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

【0082】

本発明の組成物が食品組成物として製造される場合に、有効成分として、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼに対する発現抑制剤又は活性抑制剤の他、食品製造時に通常添加される成分も含み、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤及び香味剤を含む。上述した炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び、ポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物［例えば、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど］）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。

【0083】

例えば、本発明の食品組成物がドリンク剤として製造される場合には、本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼに対する発現抑制剤又は活性抑制剤の他にも、クエン酸、液状果糖、砂糖、ブドウ糖、酢酸、リンゴ酸、果汁、杜沖抽出液、ナツメ抽出液、甘草抽出液などをさらに含めることができる。

【0084】

本発明の食品組成物は、腎臓関連の様々な病理的形態関連因子の調節（体重対比腎臓重さの有意味な減少、クレアチン掃除率の有意味な増加、小便アルブミン量の有意味な減少；ＴＧＦ－β１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶの発現量を正常レベルに減少；糸球体肥厚、炎症細胞の浸潤、異型上皮細胞の形成を正常レベルに回復）によって腎臓疾患を改善することに非常に優れた作用を有する。

【0085】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｙｌ ｃｙｃｌａｓｅ；ＡＤＰＲＣ）又はその天然的に発生した（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ）変異体のヘテロタイプ（ｈｅｔｅｒｏ ｔｙｐｅ）遺伝子欠損した動物モデルを提供する。

【0086】

本発明の好ましい具現例によれば、前記動物は、ヒト以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両棲類又は魚類である。

【0087】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患有無の確認方法を提供する：（ａ）前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体のヘテロタイプ遺伝子欠損動物モデルと野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）動物モデルに特定疾患を誘導する段階；及び、（ｂ）前記動物モデル間の差異を確認する段階。

【0088】

前記動物モデルを用いると、特定疾患（例えば、糖尿病、腎臓疾患、高血圧、肥満など）がＡＤＰ－リボシルシクラーゼと媒介して発生したものか、それともＡＤＰ－リボシルシクラーゼに関係なく発生したものかを、前記動物モデル間の差異（例えば、体重、腎臓重さ、血圧、クレアチン掃除率、血糖、炎症、糸球体の肥厚程度などの差異）を用いて確認することができる。

【0089】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断に関する情報提供方法を提供する：
１）被検体から分離された試料内配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現又は活性レベルを測定する段階；及び
２）前記段階１）のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現又は活性レベルを正常対照群と比較し、シクラーゼ媒介疾患にかかる危険を持つ個体として判断する段階。

【0090】

本明細書において用語“診断”は、病理状態の存在又は特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ関連又は媒介疾患が現在発病したか又は発病する可能性を確認するものである。

【0091】

ＡＤＰ－リボシルシクラーゼは様々なホルモンによって活性化され、この酵素は基質ＮＡＤ^＋から産物であるｃＡＤＰＲを生成するが、このｃＡＤＰＲは大部分の臓器で細胞内カルシウムを増加させる。また、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの活性によるカルシウムの異常増加は、インスリン分泌（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）、細胞肥大（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）、細胞増殖などの様々な生体病理の要因として知られている。したがって、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼの発現又は活性レベルの測定により、細胞内カルシウム増加から誘発されたＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断に対する有用な情報の提供が可能である。

【0092】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断用組成物を提供する。

【0093】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の遺伝子発現レベルを測定する製剤は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体をコードする遺伝子に特異的に結合するプライマー又はプローブである。

【0094】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明のタンパク質レベルを測定する製剤は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片である。

【0095】

前記抗体又はその抗原結合断片は、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体に特異的に結合するので、これを用いると、サンプル中に含まれたＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の量を正確に測定可能である。

【0096】

本発明の診断用組成物を用いると、抗原抗体結合反応を用いて前記抗体に対する抗原を分析することにより、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の量を定量でき、前記抗原抗体結合反応は、通常のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｎｏａｓｓａｙ）、サンドウィッチ測定法（Ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、ポリアクリルアミドゲル上のウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）、免疫ブロット分析（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）及び免疫組織化学染色方法（Ｉｍｍｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）からなる群から選ばれることが好ましいが、これに制限されない。

【0097】

抗原－抗体結合反応のための固定体には、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、ポリビニル（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ）樹脂又はポリスチレン（Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）樹脂で合成されたウェルプレート（Ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）及びガラスからなるスライドガラス（Ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）からなる群から選ばれるものを用いることができるが、これに制限されるものではない。

【0098】

２次抗体は、発色反応をする通常の発色剤で標識されることが好ましく、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、アルカリ性リン酸分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、コロイドゴールド（Ｃｏｌｏｉｄ ｇｏｌｄ）、ＦＩＴＣ（Ｐｏｌｙ Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ－Ｂ－ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などの蛍光物質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）及び色素（Ｄｙｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つの標識体が用いられてよい。発色を誘導する基質は、発色反応をする標識体に応じて使用することが好ましく、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｂｅｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ［２，２’－ａｚｉｎｏ－ｂｉｓ（３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］及びＯＰＤ（ｏｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つを使用することが好ましいが、これに制限されない。

【0099】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断キットを提供する。

【0100】

本発明の診断キットは、分析方法に適する１種又はそれ以上の他の構成成分組成物、溶液又は装置、さらにはそれに対する使用説明書を含んで構成されてよい。

【0101】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療物質のスクリーニング方法を提供する：
１）配列目録第１配列のアミノ酸配列を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体を発現させる細胞に候補物質を処理する段階；及び
２）前記候補物質の処理により、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルを測定する段階；及び
３）前記遺伝子発現レベル又はタンパク質レベルが、候補物質を処理しない対照群と比較して減少した場合に、前記候補物質をＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療物質として選別する段階。

【0102】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルの測定は、これに制限されないが、好ましくは、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）及び流細胞分析法（ＦＡＣＳ）からなる群から選ばれる１種以上の方法で測定される。

【0103】

前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体のタンパク質レベルの測定は、これに制限されないが、好ましくは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選ばれる１種以上の方法で測定される。

【0104】

〔発明の効果〕
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、新規のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の発現抑制剤又は活性抑制剤を有効成分として含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

【0105】

（ｉｉ）また、本発明は、前記ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ又はその天然的に発生した変異体の遺伝子発現レベルを測定する製剤又はタンパク質レベルを測定する製剤を含むＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患の診断用組成物を提供する。

【0106】

（ｉｉｉ）本発明の組成物は、アンジオテンシンＩＩによる新しいＡＤＰ－リボシルシクラーゼの発現又は活性増加による腎臓細胞内カルシウム増加を抑制する効果があり、ＡＤＰ－リボシルシクラーゼ媒介疾患、特に、腎臓疾患の治療剤として有用に用いることができる。

【0107】

〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ＨＥＫ２９３細胞とＭＥＳ１３細胞において新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤ－グリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を測定した図である。

【0108】

〔図２〕精製されたＦＬＡＧ－ＡＤＰＲＣのｃＡＤＰＲ合成能を評価した図である。

【0109】

〔図３〕ＭＥＳ１３細胞においてアンジオテンシンＩＩで刺激をしたとき、新しいＡＤＰＲＣによる細胞内ｃＡＤＰＲ生成を測定した図である。

【0110】

〔図４〕本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの種間配列の相同性をアラインメントを用いて比較した結果である（マウスを基準に、ヒト（９６％）、ラット（９６％）、イヌ（９０％）、ブタ（８８％）、ウサギ（８９％）、ヒツジ（９０％）、ニワトリ（７０％）、ウシ（７８％）、チンパンジー（９３％）、ウマ（９１％）、カエル（６３％）、ヤギ（９０％）、シチメンチョウ（６２％）、ギニアピッグ（９１％）、エキノコックスグラヌロスス（２７％）、ヘマトビウム住血吸虫（２２％）、トリキネラスピラリス（２２％）、ショウジョウバエ（１９％）、ゼブラフィッシュ（５６％））。

【0111】

〔図５〕新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤグリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を抑制する新しい抑制剤の効果を測定した図である。

【0112】

〔図６〕糖尿病性腎臓疾患マウスモデルの血糖（図６Ａ）、腎臓重さ（ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ）と体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）の比率（図６Ｂ）、クレアチニン掃除率（図６Ｃ）及び小便アルブミン量（図６Ｄ）でジカフェオイルキナ酸（Ｄｉｃａｆｆｅｏｌｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＣＱＡ）の効果を測定した図である。

【0113】

〔図７〕糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＡＤＰＲＣの活性（図７Ａ）及びｃＡＤＰＲ濃度（図７Ｂ）に対するＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【0114】

〔図８〕糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＴＧＦ－β１、フィブロネクチン及びコラーゲンＩＶの発現変化に対するＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【0115】

〔図９〕糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）染色を用いて病理組織学的変化を観察した図である。

【0116】

〔図１０〕正常マウスとＡＤＰＲＣヘテロ（ＡＤＰＲＣ（＋／－））マウスの糖尿病性腎臓疾患モデルの血糖（図１０Ａ）、腎臓重さと体重の比率（図１０Ｂ）及びクレアチニン掃除率（図１０Ｃ）を測定した図である。

【0117】

〔図１１〕正常マウスと高血圧マウスモデルの血圧（図１１Ａ）及びクレアチニン掃除率（図１１Ｂ）においてＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【0118】

〔発明を実施するための形態〕
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者には明らかであろう。

【0119】

〔実施例〕
実施例１：新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤ－グリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）酵素活性
配列目録第１配列のＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰＲＣ）の活性を確認するために、前記ＡＤＰＲＣをコードするｃＤＮＡ配列をＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２ベクターにライゲイションしてＦＬＡＧ－ＡＤＰＲＣプラスミドを作り、これを、ＨＥＫ２９３細胞又はＭＥＳ１３細胞に形質感染試薬（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて新しいＡＤＰＲＣの過発現を誘導した。該過発現した新しいＡＤＰＲＣを、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で溶解させた。溶解した試料４５μｌに２ｍＭ ε－ＮＡＤ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ １，Ｎ６－ｅｔｈｅｎｏａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）５μｌを処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、１０％三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を５０μｌ処理し、酵素－基質反応を止まらせた。１０分間遠心分離によって上澄液８０μｌを７２０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に入れた後、励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）２９７ｎｍ、放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）４１０ｎｍにおいて蛍光分析機で吸光度を測定した。その結果を図１に示した。

【0120】

実施例２：新しいＡＤＰＲＣのｃＡＤＰＲ合成能評価
前記ＡＤＰＲＣのｃＡＤＰＲ合成能評価は、Ｇｒａｅｆｆ Ｒ等［Ｇｒａｅｆｆ Ｒ，Ｌｅｅ ＨＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：３７９－３８４，２００２］によって報告された方法によって製造した。

【0121】

具体的には、ＨＥＫ２９３細胞にＦＬＡＧ－ＡＤＰＲＣプラスミドを形質感染試薬を用いて過発現させた後、溶解緩衝液で溶解させた。溶解した試料を、ＦＬＡＧ－アガロースカラムを用いて過発現のＦＬＡＧ－ＡＤＰＲＣを精製した。精製された試料に１００μＭ β－ＮＡＤを処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を最終濃度０．６Ｍになるように処理してｃＡＤＰＲを抽出した後、０．１ｍｌの抽出物と０．１ｍｌのｃＡＤＰＲ標準溶液に、ＡＤＰＲシクラーゼ（０．３μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｎｄｅ，３０ｍＭ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１００ｍＭ）の混合溶液５０ｕｌを入れ、常温で３０分間反応させた。

【0122】

この混合液にエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ，２％）、アルコールジヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，１００μｇ／ｍｌ）、レサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ，２０μＭ）、ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ，１０μｇ／ｍｌ）、ＦＭＮ（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，０．１ｍｇ／ｍｌ）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ）を入れ、２～４時間反応させた。反応物は、５４４ｎｍ～５９０ｎｍの範囲の蛍光分光光度計を用いて吸光度を測定した。その結果を図２に示した。

【0123】

実施例３：ＭＥＳ１３細胞においてＡＤＰＲＣによる細胞内ｃＡＤＰＲ濃度の変化
前記ＡＤＰＲＣによる細胞内ｃＡＤＰＲ濃度変化は、Ｇｒａｅｆｆ Ｒ等［Ｇｒａｅｆｆ Ｒ，Ｌｅｅ ＨＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１：３７９－３８４，２００２］によって報告された方法によって製造した。

【0124】

具体的には、ＭＥＳ１３細胞に、新しいＡＤＰＲＣの小さい干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、配列目録第２２配列）を形質感染試薬として、ＡＤＰＲＣの発現を抑制した。ＡＤＰＲＣの発現を抑制した細胞に、１５０ｎＭのアンジオテンシンＩＩを６０秒間処理した後、０．６Ｍ三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を用いてｃＡＤＰＲを抽出した後、０．１ｍｌの抽出物と０．１ｍｌのｃＡＤＰＲ標準溶液にＡＤＰＲシクラーゼ（０．３μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｎｄｅ，３０ｍＭ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１００ｍＭ）の混合溶液５０μｌを入れ、常温で３０分間反応させた。

【0125】

この混合液に、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ，２％）、アルコールジヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，１００μｇ／ｍｌ）、レサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ，２０μＭ）、ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ，１０μｇ／ｍｌ）、ＦＭＮ（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，０．１ｍｇ／ｍｌ）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ）を入れ、２～４時間反応させた。反応物は、５４４ｎｍ～５９０ｎｍの範囲の蛍光分光光度計を用いて吸光度を測定した。その結果を図３に示した。

【0126】

実施例４：新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤグリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を抑制する新しい抑制剤の効果
配列目録第１配列の新しいＡＤＰ－リボシルシクラーゼ（ＡＤＰＲＣ）の活性を抑制する抑制剤を見出すために、４，４’－ジヒドロキシアゾベンゼン（４－ＤＨＡＢ，ＴＣＩ（日本））、２，２’－ジヒドロキシアゾベンゼン（２－ＤＡＢ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））、２－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－３，５，７－ジヒドロキシクロメン－４－オン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国））、Ｓａｎ４８２５（ｋａｎｎｔ Ａ等［Ｋａｎｎｔ Ａ，Ｓｉｃｋａ Ｋ，Ｋｒｏｌｌ Ｋ，Ｋａｄｅｒｅｉｔ Ｄ，Ｇｏｇｅｌｅｉｎ Ｈ．Ｎａｕｎｙｎ．Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ．Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３８５：７１７－７２７，２０１２］、合成（中国））と化合物スクリーニングを用いて新しく発見した２－（１，３－ベンゾオキサゾール－２－イルアミノ）－１－ミチルキナゾリン－４（１Ｈ）－オン（２－ＢＭＱ、合成（中国））、１，４－ジカフェオイルキナ酸（１，４－ＤＣＱＡ，Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙ（中国）、以下、ＤＣＱＡ）を、新しいＡＤＰＲＣ ４０μｌに、抑制剤５μｌを冷やした水で１５分間反応させた。反応後、２ｍＭ ε－ＮＡＤ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ １，Ｎ６－ｅｔｈｅｎｏａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）５μｌを処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、１０％三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を５０μｌ処理して酵素－基質反応を止まらせた。１０分間遠心分離によって上澄液８０μｌを、７２０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に入れた後、励起２９７ｎｍ、放出４１０ｎｍにおいて蛍光分析機で吸光度を測定した。その結果を図５に示した。図５に示すように、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と対比して、４－ＤＨＡＢは４２．４０％、２－ＢＭＱは３６．４９％、そしてＤＣＱＡは何と７９．６４％の割合でＮＡＤグリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を抑制することが確認できた。

【0127】

実施例５：腎臓疾患マウスモデルの血糖、腎臓重さと体重との比率、クレアチン掃除率及び小便アルブミン量においてＤＣＱＡの効果
腎臓疾患マウスモデルにおける血糖、腎臓と体重との比率、クレアチニン掃除率及び小便アルブミン量の測定は、Ｋｉｍ ＳＹ等［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｆ２９１－Ｆ２９７，２００９］によって報告された方法によって行われた。

【0128】

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．８）を０．２ｍｌずつ腹腔注射した群（対照群及びＤＣＱＡ群）と、５０ｍＭクエン酸緩衝液にストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）））を５ｍｇ／ｍｌで溶かした後、２００μｌずつ腹腔注射した群（ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群）とに分けた。ＳＴＺ注射後２日目から血糖を測定し、血糖数値が３００ｍｇ／ｄＬであるマウスを、ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群に分類して使用した。血糖が上がったマウスに、前記実施例５で新規したＡＤＰＲＣに対する抑制効果に最も優れているＤＣＱＡをジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に９ｍｇ／ｍｌで溶かした後、食塩水に９μｇ／ｍｌに希釈させた後、１００μｌずつ６週間毎日腹腔注射した。６週最終日にマウスをメタボリックケージに入れ、２４時間に小便を得た。

【0129】

２４時間に小便を得た後、マウスの体重を測定し、血糖を測定した（図６Ａ）。また、腎臓疾患治療剤としての可能性を確認するために、痲酔剤を用いて犠牲させた後に、血清を得、腎臓を摘出した。摘出した腎臓を用いて腎臓重さ（ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ）と体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）との比率を測定後（図６Ｂ）に、一部の腎臓は、蛍光染色及びＨ＆Ｅ染色のために１０％ホルマリンに入れて固定し、残りの腎臓は、多数の切片ＡＤＰＲシクラーゼ活性及びｃＡＤＰＲ濃度を測定した。小便と血清のクレアチニンをクレアチニン測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を用いて測定してクレアチニン掃除率を計算し（図６Ｃ）、小便アルブミン量をアルブミン測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を用いて測定した（図６Ｄ）。その結果を図６に示した。

【0130】

図６に見られるように、ＳＴＺによって誘発された糖尿病マウスモデルにおいて、ＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群は、対照群（ＳＴＺ）に比べて血糖は減少しなかったにもかかわらず（図６Ａ）、体重対比腎臓重さの有意味な減少（図６Ｂ）、クレアチン掃除率の有意味な増加（図６Ｃ）、小便アルブミン量の有意味な減少（図６Ｄ）を示し、慢性腎不全や糖尿病性腎症のような腎臓疾患治療剤の候補としての可能性を確認した。

【0131】

実施例６：腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＡＤＰＲＣの活性及びｃＡＤＰＲ濃度に対するＤＣＱＡの効果
腎臓疾患マウスモデルの腎臓組織におけるのＡＤＰＲＣ活性及びｃＡＤＰＲ濃度の測定は、Ｋｉｍ ＳＹ等［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｆ２９１－Ｆ２９７，２００９］によって報告された方法によって行われた。

【0132】

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．８）を０．２ｍｌずつ腹腔注射した群（対照群及びＤＣＱＡ群）と、５０ｍＭクエン酸緩衝液にストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）））を５ｍｇ／ｍｌで溶かした後に２００μｌずつ腹腔注射した群（ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群）とに分けた。ＳＴＺ注射後２日目から血糖を測定し、血糖数値が３００ｍｇ／ｄＬであるマウスを、ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群に分類して使用した。血糖が上がったマウスに、前記実施例５において新規のＡＤＰＲＣに対する抑制効果に最も優れていたＤＣＱＡをジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に９ｍｇ／ｍｌで溶かした後、食塩水に９μｇ／ｍｌに希釈して１００μｌずつ６週間毎日腹腔注射した。腎臓疾患治療剤としての可能性を確認するために、痲酔剤を用いて犠牲させた後に、血清を得、腎臓を摘出した。

【0133】

各群の摘出した腎臓組織の一部を溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）に溶解させた後、溶解した試料４５μｌに２ｍＭ ＮＧＤ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）５μｌを処理し、３７℃で１時間反応させた。反応後、１０％三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を５０μｌ処理し、酵素－基質反応を止まらせた。１０分間遠心分離によって上澄液８０μｌを７２０μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に入れた後、励起２９７ｎｍ、放出４１０ｎｍにおいて蛍光分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ、日本）で吸光度を測定した。

【0134】

また、各群の摘出した腎臓組織の一部に、０．６Ｍ三塩化酢酸（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）０．２ｍｌを処理してｃＡＤＰＲを抽出した後、０．１ｍｌの抽出物と０．１ｍｌのｃＡＤＰＲ標準溶液に、ＡＤＰＲシクラーゼ（０．３μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｎｄｅ，３０ｍＭ）、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，１００ｍＭ）混合溶液５０ｕｌを入れ、常温で３０分間反応させた。この混合液に、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ，２％）、アルコールジヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，１００μｇ／ｍｌ）、レサズリン（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ，２０μＭ）、ジアホラーゼ（ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ，１０μｇ／ｍｌ）、ＦＭＮ（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，０．１ｍｇ／ｍｌ）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ）を入れ、２～４時間反応させた。反応物は、５４４ｎｍ～５９０ｎｍの範囲の蛍光分光光度計を用いて吸光度を測定した。その結果を図７に示した。

【0135】

図７Ａに示すように、本願発明のＤＣＱＡは、ＳＴＺによって増加したＡＤＰ－リボシルシクラーゼ活性を対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）レベル以下に下げ、また、図７Ｂに示すように、本願発明のＤＣＱＡは、ＳＴＺによって増加したｃＡＤＰＲの濃度を対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）レベルに下げたところ、ＤＣＱＡが腎臓疾患と関連して腎臓の機能異常又は損傷によって発生するＡＤＰＲＣの活性及びｃＡＤＰＲの濃度を下げる能力を確認した。

【0136】

実施例７：腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＴＧＦ－β１、フィブロネクチン及びコラーゲンＩＶの発現変化に対する１，４－ＤＣＱＡの効果
腎臓疾患マウスモデルにおいて腎臓組織におけるＴＧＦ－β１、フィブロネクチン及びコラーゲンＩＶの発現変化は、Ｋｉｍ ＳＹ等［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｆ２９１－Ｆ２９７，２００９］によって報告された方法によって行われた。

【0137】

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．８）を０．２ｍｌずつ腹腔注射した群（対照群及びＤＣＱＡ群）と、５０ｍＭクエン酸緩衝液にストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）））を５ｍｇ／ｍｌで溶かした後に２００μｌずつ腹腔注射した群（ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群）とに分けた。ＳＴＺ注射後２日目から血糖を測定し、血糖数値が３００ｍｇ／ｄＬであるマウスをＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群として使用した。血糖が上がったマウスに、前記実施例５で新規のＡＤＰＲＣに対する抑制効果に最も優れていたＤＣＱＡをジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に９ｍｇ／ｍｌで溶かした後、食塩水に９μｇ／ｍｌに希釈させた後に１００μｌずつ６週間毎日腹腔注射した。腎臓疾患治療剤としての可能性を確認するために、痲酔剤を用いて犠牲させた後に、血清を得、腎臓を摘出した。摘出した腎臓の一部を１０％ホルマリンに入れて固定した。１０％ホルマリンに固定された腎臓組織を凍結組織切片器を用いてスライドガラスに腎臓組織切片を載せ、ＴＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）ｗｉｔｈ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で洗浄した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有のＴＴＢＳ緩衝液で１時間反応させる。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有のＴＴＢＳ緩衝液に、１次抗体（ＴＧＦ－β１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）、フィブロネクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）、コラーゲンＩＶ（Ａｂｃａｍ、英国））を１：２００に希釈させ、４℃で１２時間以上反応させた。ＴＴＢＳ緩衝液で１次抗体を反応させた組織を３回洗浄した後、ＦＩＴＣの付いている２次抗体を１：２００にＴＴＢＳ緩衝液に希釈させ、暗い場所の室温で１時間反応させた。２次抗体反応後にＴＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、マウンティング溶液を用いてカバーガラスを付ける。染色した腎臓組織を、緑色蛍光を観察する蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて観察した。その結果を図８に示した。

【0138】

図８に示すように、本願発明のＤＣＱＡは、ＳＴＺによって増加したＴＧＦ－β１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶの発現量を対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）レベルに下げたところ、ＤＣＱＡが腎臓疾患と関連して腎臓の機能異常又は損傷によって発生するＴＧＦ－β１、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶの発現量を下げる能力を確認した。

【0139】

実施例８：腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）染色を用いた病理組織学的変化
腎臓疾患マウスモデルにおいて腎臓組織における病理組織学的変化は、Ｓｈｕ Ｂ等［Ｓｈｕ Ｂ，Ｆｅｎｇ Ｙ，Ｇｕｉ Ｙ，Ｌｕ Ｑ，Ｗｅｉ Ｗ，Ｘｕｅ Ｘ，Ｓｕｎ Ｘ，Ｈｅ Ｗ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｄａｉ Ｃ．Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．４２：２４９－２５８，２０１８］によって報告された方法によって行われた。

【0140】

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．８）を０．２ｍｌずつ腹腔注射した群（対照群及びＤＣＱＡ群）と、５０ｍＭクエン酸緩衝液にストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）））を５ｍｇ／ｍｌで溶かした後に２００μｌずつ腹腔注射した群（ＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群）とに分けた。ＳＴＺ注射後２日目から血糖を測定し、血糖数値が３００ｍｇ／ｄＬであるマウスをＳＴＺ群及びＳＴＺ＋ＤＣＱＡ群として使用した。血糖が上がったマウスに、前記実施例５で新規のＡＤＰＲＣに対する抑制効果に最も優れていたＤＣＱＡをジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に９ｍｇ／ｍｌで溶かした後、食塩水に９μｇ／ｍｌに希釈させ、１００μｌずつ６週間毎日腹腔注射した。腎臓疾患治療剤としての可能性を確認するために、痲酔剤を用いて犠牲させた後に、血清を得、腎臓を摘出した。摘出した腎臓の一部を１０％ホルマリンに入れて固定した。１０％ホルマリンに固定された腎臓組織を、凍結組織切片器を用いてスライドガラスに腎臓組織切片を載せ、流水に５分間洗浄し、ヘマトキシリンに５分間染色させる。染色後、流水に５分間洗浄し、１５７ｍＭ塩酸に速く２回漬けてから取り出した後、流水に５分間洗浄する。０．２５％アンモニア水に１回速く漬けてから取り出した後、再び流水に５分間洗浄し、エオシンに約３０秒間染色させた後、７０％エタノール３０秒、８０％エタノール３０秒、９０％エタノール３０秒、１次１００％エタノール３０秒、２次１００％エタノール３０秒、３次１００％エタノール３０秒間反応させる。最後に、１次キシレンに５分間反応させ、２次キシレンに５分以上反応させた後、マウンティング溶液を用いてカバーガラスを付けた。染色した腎臓組織を光学顕微鏡（Ｌｉｅｃａ、ドイツ）で観察した。その結果を図９に示した。

【0141】

図９に示すように、本願発明のＤＣＱＡは、ＳＴＺによって増加した糸球体肥厚、炎症細胞の浸潤、異型上皮細胞の形成が、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に類似するレベルに回復したところ、ＤＣＱＡが腎臓疾患と関連して腎臓の機能異常又は損傷によって発生する腎臓の病理組織学的変化を回復させる能力を確認した。

【0142】

実施例９：正常マウスとＡＤＰＲＣヘテロ（ＡＤＰＲＣ（＋／－））マウスの腎臓疾患モデルの血糖、腎臓と体重との比率、及びクレアチニン掃除率の比較
腎臓疾患マウスモデルにおける血糖、腎臓と体重との比率、及びクレアチン掃除率の測定は、Ｋｉｍ ＳＹ等［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｆ２９１－Ｆ２９７，２００９］によって報告された方法によって行われた。

【0143】

具体的には、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪマウス（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ，ＷＴ）とＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国）から作製したＡＤＰＲＣヘテロノックアウト（ＡＤＰＲＣ（＋／－））マウスに、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ４．８）にストレプトゾトシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ（ＳＴＺ））を５ｍｇ／ｍｌで溶かした後、２００μｌずつ腹腔注射した。注射後２日目から血糖を測定し、血糖数値が３００ｍｇ／ｄＬであるマウスを使用した。血糖が上がってから６週後にマウスをメタボリックケージに入れ、２４時間小便を得た。

【0144】

２４時間小便を得た後、マウスの体重を測定し、血糖を測定した（図１０Ａ）。痲酔剤を用いて犠牲にさせた後に、血清を得、腎臓を摘出した。摘出した腎臓を用いて腎臓重さ（ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ）及び体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）の比率を測定した（図１０Ｂ）。小便と血清のクレアチニンをクレアチニン測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を用いて測定し、クレアチニン掃除率を計算した（図１０Ｃ）。その結果を図１０に示した。

【0145】

図１０に示すように、ＳＴＺによって誘発された糖尿病マウスモデルにおいて、対照群に比べて（ＡＤＰＲＣ（＋／－）血糖は減少していないが（図１０Ａ）、本願発明のＡＤＰＲＣ（＋／－）＋ＳＴＺ群の体重対比腎臓重さが、ＷＴ＋ＳＴＺ群に比べて有意味な減少を示した（図１０Ｂ）。また、ＳＴＺによるクレアチニン掃除率の減少がＡＤＰＲＣ（＋／－）＋ＳＴＺ群で減少していないところ（図１０Ｃ）、慢性腎不全や糖尿病性腎症のような腎臓疾患への新しいＡＤＰＲＣの重要性も確認した。

【0146】

実施例１０：正常マウスと高血圧マウスモデルの血圧及びクレアチニン掃除率においてＤＣＱＡの効果
高血圧マウスモデルにおける血圧及びクレアチニン掃除率測定は、Ａｌｌａｇｎａｔ等［Ａｌｌａｇｎａｔ Ｆ，Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ ＪＡ，Ｌａｍｂｅｌｅｔ Ｍ，Ｌｏｎｇｃｈａｍｐ Ａ，Ｂｅｒａｒｄ Ｘ，Ｍａｚｚｏｌａｉ Ｌ，Ｃｏｒｐａｔａｕｘ ＪＭ，Ｄｅｇｌｉｓｅ Ｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．５１：７３３－７４２，２０１６］とＫｉｍ ＳＹ等［Ｋｉｍ ＳＹ，Ｐａｒｋ ＫＨ，Ｇｕｌ Ｒ，Ｊａｎｇ ＫＹ，Ｋｉｍ ＵＨ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９６：Ｆ２９１－Ｆ２９７，２００９］によって報告された方法によって行われた。

【0147】

具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、８ｍｇ Ｌ－ＮＡＭＥ（Ｎω－ｎｉｔｒｏ－ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｍｅｔｈｙｌ－ｅｓｔｅｒ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を１ｍｌ食塩水に溶かした後、０．２ｍｌずつ毎日経口投与した。経口投与７日目と１４日目に、マウスの血圧を尾から測定し、血圧の上がったことを確認後に、前記実施例５で新規のＡＤＰＲＣに対する抑制効果に最も優れていたＤＣＱＡを、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に９ｍｇ／ｍｌで溶かした後、食塩水に９μｇ／ｍｌに希釈させ、該ＤＣＱＡを１００μｌずつ７日間に毎日腹腔注射し、Ｌ－ＮＡＭＥを経口投与した。ＤＣＱＡ処理６日後にマウスをメタボリックケージに入れ、２４時間において小便を得た。

【0148】

小便を２４時間得た後、マウスの血圧を測定した（図１１Ａ）。痲酔剤を用いて犠牲させて血清を得た。

【0149】

小便と血清のクレアチニンをクレアチニン測定キット（ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を用いて測定し、クレアチニン掃除率を計算した（図１１Ｂ）。その結果を図１１に示した。

【0150】

図１１Ａに示すように、ＤＣＱＡは、高血圧モデルでは血圧を下げる効果はないことが確認された。しかし、クレアチニン掃除率がＤＣＱＡによって増加したところ、高血圧性腎症のような腎臓疾患の治療剤の候補としての可能性も確認した（図１１Ｂ）。

【0151】

＜参考文献＞
1. Berridge MJ, Bootman MD, Roderick HL. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 4:517-529, 2003.
2. Lee HC. Structure and enzymatic functions of human CD38. Mol Med. 12:317-323, 2006.
3. Resnick LM. Ionic basis of hypertension, insulin resistance, vascular disease, and related disorders. The mechanism of “Syndrome X”. Am. J. Hypertens. 6:123S-134S, 1993.
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5. Kim BJ, Park KH, Yim CY, Takasawa S, Okamoto H, Im MJ, Kim UH. Generation of nicotininc acid adenine dinucleotide phosphate and cyclic ADP-ribose by glucagon-like peptide-1 evokes Ca²⁺signal that is essential for insuline secreation in mouse pancreatic islets. Diabetes. 57: 868-878, 2008.
6. Gul R, Park JH, Kim SY, Jang KY, Chea JK, Ko JK, Kim UH. Inhibition of ADP-ribosyl cyclase attenuates antiotensin II-induced cardiac hypertrophy. Cardiovasc. Res. 81: 582-591, 2009.
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8. Partida-Sanchez S, Cockayne DA, Monard S, Jacobson EL, Oppenheimer N, Garvy B, Kusser K, Goodrich S, Howard M, Harmsen A, Randall TD, Lund FE. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat Med 7:1209-1216, 2001.
9. Graeff R, Lee HC. A novel cycling assay for cellular cADP-ribose with nanomolar sensitivity. Biochem. J. 361:379-384, 2002.
10. Kim SY, Park KH, Gul R, Jang KY, Kim UH. Role of kidney ADP-ribosyl cyclase in diabetic nephropathy. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296:F291-F297, 2009.
11. Shu B, Feng Y, Gui Y, Lu Q, Wei W, Xue X, Sun X, He W, Yang J, Dai C. Blockade of CD38 diminishes lipopolysaccharide-induced macrophage classical activation and acute kidney injury involving NF-κB signaling suppression. Cell. Signal. 42:249-258, 2018.
12. Allagnat F, Haefliger JA, Lambelet M, Longchamp A, Berard X, Mazzolai L, Corpataux JM, Deglise S. Nitric oxide deficit drives intimal hyperplasia in mouse models of hypertension. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 51:733-742, 2016.
13. Kannt A, Sicka K, Kroll K, Kadereit D, Gogelein H. Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. 385:717-727, 2012.
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項及びその等価物によって定義されるといえよう。

【図面の簡単な説明】

【0152】

【図1】ＨＥＫ２９３細胞とＭＥＳ１３細胞において新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤ－グリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を測定した図である。

【図2】精製されたＦＬＡＧ－ＡＤＰＲＣのｃＡＤＰＲ合成能を評価した図である。

【図3】ＭＥＳ１３細胞においてアンジオテンシンＩＩで刺激をしたとき、新しいＡＤＰＲＣによる細胞内ｃＡＤＰＲ生成を測定した図である。

【図4】本発明のＡＤＰ－リボシルシクラーゼの種間配列の相同性をアラインメントを用いて比較した結果である（マウスを基準に、ヒト（９６％）、ラット（９６％）、イヌ（９０％）、ブタ（８８％）、ウサギ（８９％）、ヒツジ（９０％）、ニワトリ（７０％）、ウシ（７８％）、チンパンジー（９３％）、ウマ（９１％）、カエル（６３％）、ヤギ（９０％）、シチメンチョウ（６２％）、ギニアピッグ（９１％）、エキノコックスグラヌロスス（２７％）、ヘマトビウム住血吸虫（２２％）、トリキネラスピラリス（２２％）、ショウジョウバエ（１９％）、ゼブラフィッシュ（５６％））。

【図5】新しいＡＤＰＲＣのＮＡＤグリコヒドロラーゼ（ＮＡＤａｓｅ）活性を抑制する新しい抑制剤の効果を測定した図である。

【図6】糖尿病性腎臓疾患マウスモデルの血糖（図６Ａ）、腎臓重さ（ｋｉｄｎｅｙ ｗｅｉｇｈｔ）と体重（ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ）の比率（図６Ｂ）、クレアチニン掃除率（図６Ｃ）及び小便アルブミン量（図６Ｄ）でジカフェオイルキナ酸（Ｄｉｃａｆｆｅｏｌｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＤＣＱＡ）の効果を測定した図である。

【図7】糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＡＤＰＲＣの活性（図７Ａ）及びｃＡＤＰＲ濃度（図７Ｂ）に対するＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【図8】糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＴＧＦ－β１、フィブロネクチン及びコラーゲンＩＶの発現変化に対するＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【図9】糖尿病性腎臓疾患マウスモデル腎臓組織においてＨ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎ）染色を用いて病理組織学的変化を観察した図である。

【図10】正常マウスとＡＤＰＲＣヘテロ（ＡＤＰＲＣ（＋／－））マウスの糖尿病性腎臓疾患モデルの血糖（図１０Ａ）、腎臓重さと体重の比率（図１０Ｂ）及びクレアチニン掃除率（図１０Ｃ）を測定した図である。

【図11】正常マウスと高血圧マウスモデルの血圧（図１１Ａ）及びクレアチニン掃除率（図１１Ｂ）においてＤＣＱＡの効果を測定した図である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

2022540057000001.app

【国際調査報告】