▶ アプティミューン バイオロジクス、インコーポレイテッドの特許一覧 ▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシテイ オブ イリノイの特許一覧
特表2022-540139ブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてアフリカブタ熱ウイルスを増殖させる方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-14
(54)【発明の名称】ブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてアフリカブタ熱ウイルスを増殖させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/00 20060101AFI20220907BHJP
A61K 39/187 20060101ALI20220907BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20220907BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220907BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20220907BHJP
C12N 5/0786 20100101ALN20220907BHJP
【ＦＩ】
C12N7/00
A61K39/187
A61K39/39
A61P37/04
A61P31/20
C12N5/0786
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500830
(86)(22)【出願日】2020-07-13
(85)【翻訳文提出日】2022-03-07
(86)【国際出願番号】 US2020041762
(87)【国際公開番号】W WO2021007572
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】62/952,889
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/873,075
(32)【優先日】2019-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522008377
【氏名又は名称】アプティミューン バイオロジクス、インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】500436215
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシテイ オブ イリノイ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ザッカーマン、フェデリコ、エイ．
(72)【発明者】
【氏名】ディクソン、リンダ、キャスリーン
(72)【発明者】
【氏名】ポーチュガル、マリア ラケル、セイカ
(72)【発明者】
【氏名】ゴートリー、リネット、クレア
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065BB19
4B065CA43
4C085AA03
4C085AA38
4C085BA51
4C085CC04
4C085CC08
4C085CC11
4C085CC12
4C085CC13
4C085CC14
4C085CC15
4C085CC16
4C085DD06
4C085EE01
4C085FF24
4C085GG01
4C085GG08
(57)【要約】
アフリカブタ熱（ＡＳＦ）ウイルスの子孫を生成するための方法であって、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養される；細胞をＡＳＦウイルスに曝露すること；およびＡＳＦウイルスを細胞内で複製させること；それによってＡＳＦウイルスの子孫を生成することを含む方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アフリカブタ熱（ＡＳＦ）ウイルスの子孫を生成するための方法であって、前記ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、前記細胞は少なくとも５継代培養される；
前記細胞を前記ＡＳＦウイルスに曝露すること；および
前記ＡＳＦウイルスを前記細胞内で複製させること；
それによってＡ前記ＳＦウイルスの子孫を生成すること
を含む方法。
【請求項2】
前記細胞がＺＭＡＣ細胞またはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞が、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ＡＳＦワクチンを製造するための方法であって、ＡＳＦウイルスの改変生ウイルス（ＭＬＶ）株を提供すること、および
ＡＳＦ ＭＬＶ株を複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞において前記ＭＬＶ株を増殖させること
を含む方法。
【請求項8】
前記細胞が、初代細胞、細胞集団、細胞株、またはそれらのバリアントもしくは誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞がＺＭＡＣ細胞またはその誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞が、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
前記成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項14】
ＡＳＦウイルスを増殖させるための方法であって、ブタ胎仔対象を提供すること、前記対象から細胞を含有する気管支肺胞洗浄液試料を得ること、および前記試料からマクロファージ細胞を分離することを含む、ブタ胎仔肺からブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を単離すること；
前記細胞を培養すること；ならびに
ウイルス複製を可能にするために前記細胞を前記ＡＳＦウイルスと接触させること；
それによって前記ＡＳＦウイルスを増殖させること
を含む方法。
【請求項15】
前記培養することが、少なくとも５継代にわたって前記細胞を継代すること、または連続培養で少なくとも１０日間前記細胞を増殖させること、またはそれらの組合せを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記培養することが、前記細胞を成長因子組成物と接触させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞が少なくとも１０継代培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞が少なくとも２０継代培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞が細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が細胞株である、請求項７に記載の方法。
【請求項23】
前記培養することが、前記細胞を少なくとも２０継代にわたって継代することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項24】
ブタ対象におけるＡＳＦウイルスの存在を検出するための方法であって、前記ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、前記細胞は少なくとも５継代培養される；
前記細胞を試料と接触させること；
適切な条件下で前記細胞をインキュベートすること；および
前記細胞における前記ＡＳＦウイルスの存在を検出すること
を含む方法。
【請求項25】
前記細胞がＺＭＡＣ細胞またはその誘導体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項28】
前記成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、請求項２４に記載の方法。
【請求項30】
前記試料が、血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、鼻分泌物、糞便、尿、精液、痰、脳脊髄液、涙、粘液、汗、乳汁、および組織細胞からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項31】
前記組織細胞が、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、および扁桃からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記検出することが、血球吸着アッセイまたは免疫蛍光法を利用することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項33】
請求項１に記載のＡＳＦウイルスの子孫を担体中に含むワクチン。
【請求項34】
アジュバントをさらに含む、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項35】
ブタにおいてＡＳＦＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、有効量の請求項３３に記載のワクチンを前記ブタに投与することを含む方法。
【請求項36】
投与経路が、非経口、経口、鼻腔内、および粘膜からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，０７５号および２０１９年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９５２，８８９号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／８７３，０７５号および２０１９年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９５２，８８９号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当せず。
該当せず。
【背景技術】
【0003】
アフリカブタ熱（ＡＳＦ）は、家畜および野生ブタの非常に伝染性の高い出血性ウイルス性疾患であり、深刻な経済的および生産上の損失の原因となっている。ＡＳＦは、越境性動物疾患でもある。越境性動物疾患は、国境に関わりなく急速に広がり得る非常に伝染性の高い流行性疾患である。そのような疾患は、動物において高い死亡率および罹患率を引き起こし、それにより、牧畜農家の生計にとって絶えず脅威となる一方で、深刻な社会経済的および時には公衆衛生上の影響を及ぼす。ＡＳＦのアウトブレイクの場合、ブタの死亡率および罹患率が高くなる可能性があり、その結果、ブタからの食肉の量および品質が有意に低下し得る。ＡＳＦ疾患を制御することに対する主な制限は、ＡＳＦウイルスならびにＡＳＦ疾患に対処することができるワクチンおよび診断技術を実験するための利用可能で有効な細胞および方法の欠如である。
【発明の概要】
【0004】
一実施形態によれば、アフリカブタ熱（ＡＳＦ）ウイルスの子孫を生成する方法は、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養され得る；細胞をＡＳＦウイルスに曝露すること；およびＡＳＦウイルスを細胞内で複製させること；それによってＡＳＦウイルスの子孫を生成することを含み得る。
【0005】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ細胞またはその誘導体であり得る。
【0006】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択され得る。
【0007】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含み得る。
【0008】
いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態では、細胞は、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から入手し得る。
【0010】
いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも１０継代培養され得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも２０継代培養され得る。
【0012】
別の実施形態によれば、ＡＳＦワクチンを製造する方法は、ＡＳＦウイルスの改変生ウイルス（ＭＬＶ）株を提供すること、およびＡＳＦ ＭＬＶ株を複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてＭＬＶ株を増殖させることを含み得る。
【0013】
いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞、細胞集団、細胞株、またはそれらのバリアントもしくは誘導体であり得る。
【0014】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ細胞またはその誘導体であり得る。
【0015】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択され得る。
【0016】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含み得る。
【0017】
いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含み得る。
【0018】
いくつかの実施形態では、細胞は、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から入手し得る。
【0019】
いくつかの実施形態では、細胞は細胞株であり得る。
【0020】
別の実施形態によれば、ＡＳＦウイルスを増殖させる方法は、ブタ胎仔対象を提供すること、対象から細胞を含有する気管支肺胞洗浄液試料を得ること、および試料からマクロファージ細胞を分離することを含む、ブタ胎仔肺からブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を単離すること；細胞を培養すること；ならびにウイルス複製を可能にするために細胞をＡＳＦウイルスと接触させること；それによってＡＳＦウイルスを増殖させることを含み得る。
【0021】
いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも５継代にわたって細胞を継代すること、または連続培養で少なくとも１０日間細胞を増殖させること、またはそれらの組合せを含み得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、培養は、細胞を成長因子組成物と接触させることを含み得る。
【0023】
いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含み得る。
【0024】
いくつかの実施形態では、細胞は、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から入手し得る。
【0025】
いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも２０継代にわたって細胞を継代することを含み得る。
【0026】
別の実施形態によれば、ブタ対象におけるＡＳＦウイルスの存在を検出する方法は、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養され得る；細胞を試料と接触させること；適切な条件下で細胞をインキュベートすること；および細胞におけるＡＳＦウイルスの存在を検出することを含み得る。
【0027】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ細胞またはその誘導体であり得る。
【0028】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択され得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含み得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含み得る。
【0031】
いくつかの実施形態では、細胞は、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から入手し得る。
【0032】
いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、鼻分泌物、糞便、尿、精液、痰、脳脊髄液、涙、粘液、汗、乳汁、および組織細胞からなる群より選択され得る。
【0033】
いくつかの実施形態では、組織細胞は、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、および扁桃からなる群より選択され得る。
【0034】
いくつかの実施形態では、検出は、血球吸着アッセイまたは免疫蛍光を利用することを含み得る。
【0035】
別の実施形態によれば、ワクチンは、担体中に本開示のＡＳＦウイルスの子孫を含み得る。
【0036】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。
【0037】
別の実施形態によれば、ブタにおいてＡＳＦＶに対する免疫応答を誘発する方法は、有効量の本開示のワクチンをブタに投与することを含み得る。
【0038】
いくつかの実施形態では、投与経路は、非経口、経口、鼻腔内、および粘膜からなる群より選択され得る。
【0039】
この概要は、特許請求される主題の重要なまたは本質的な特徴を特定することを意図しておらず、特許請求される主題の範囲を限定する助けとして使用されることも意図していない。本開示のさらなる実施形態、形態、特徴、および態様は、本明細書と共に提供される説明および図面から明らかになるであろう。
【0040】
本開示のいくつかの実施形態の教示は、添付の図面と併せて記載される説明を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【発明を実施するための形態】
【0052】
本開示の概念は、様々な修正および代替形態を受け入れる余地があるが、その特定の実施形態を例として図面に示しており、本明細書で詳細に説明する。しかしながら、本開示の概念を開示される特定の形態に限定する意図はなく、逆に、その意図は、本開示および添付の特許請求の範囲と矛盾しない全ての修正、等価物、および代替物をカバーすることであることを理解されたい。
【0053】
本明細書における「いくつかの実施形態」、「１つの実施形態」、「一実施形態」、「例示的な実施形態」などへの言及は、記載される実施形態が特定の特徴、構造、または特性を含み得ることを示すが、全ての実施形態がその特定の特徴、構造、または特性を含んでもよく、または必ずしも含まなくてもよい。さらに、そのような語句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性が一実施形態に関連して説明される場合、明示的に記載されているか否かにかかわらず、他の実施形態に関連してそのような特徴、構造、または特性を達成することは当業者の知識の範囲内であると考えられる。
【0054】
本開示は、アフリカブタ熱（ＡＳＦ）ウイルスの子孫を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養され得る；細胞をＡＳＦウイルスに曝露すること；およびＡＳＦウイルスを細胞内で複製させること；それによってＡＳＦウイルスの子孫を生成することを含み得る。アフリカブタ熱は、本明細書ではＡＳＦとも呼ばれ得る。アフリカブタ熱ウイルスは、本明細書ではＡＳＦＶとも呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、細胞をＡＳＦＶに曝露することは、細胞をＡＳＦＶに感染させることを指し得る。
【0055】
本明細書で使用される場合、「ブタ」という用語は、いずれかの性別または任意の年齢のバビルサバビルサ（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ ｂａｂｙｒｕｓｓａ）またはゴールデンバビルサ（Ｇｏｌｄｅｎ Ｂａｂｉｒｕｓａ）、セレベスバビルサ（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ ｃｅｌｅｂｅｎｓｉｓ）またはスラウェシバビルサ（Ｓｕｌａｗｅｓｉ Ｂａｂｉｒｕｓａ）、トギアンバビルサ（Ｂａｂｙｒｏｕｓａ ｔｏｇｅａｎｅｎｓｉｓまたはＴｏｇｉａｎ Ｂａｂｉｒｕｓａ）、モリイノシシ（Ｈｙｌｏｃｈｏｅｒｕｓ ｍｅｉｎｅｒｔｚｈａｇｅｎｉまたはＧｉａｎｔ Ｆｏｒｅｓｔ Ｈｏｇ）、砂漠イボイノシシ（Ｐｈａｃｏｃｈｏｅｒｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｓ）またはケープイボイノシシ（Ｃａｐｅ Ｗａｒｔｈｏｇ）、ソマリアイボイノシシ（Ｓｏｍａｌｉ Ｗａｒｔｈｏｇ）または砂漠イボイノシシ（Ｄｅｓｅｒｔ Ｗａｒｔｈｏｇ）、アフリカイボイノシシ（Ｐｈａｃｏｃｈｏｅｒｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）またはイボイノシシ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｗａｒｔｈｏｇ）、コビトイノシシ（Ｐｏｒｃｕｌａ ｓａｌｖａｎｉａまたはＰｙｇｍｙ Ｈｏｇ）、カワイノシシ（Ｐｏｔａｍｏｃｈｏｅｒｕｓ ｌａｒｖａｔｕｓまたはＢｕｓｈｐｉｇ）、アカカワイノシシ（Ｐｏｔａｍｏｃｈｏｅｒｕｓ ｐｏｒｃｕｓまたはＲｅｄ Ｒｉｖｅｒ Ｈｏｇ）、パラワンイノシシ（Ｓｕｓ ａｈｏｅｎｏｂａｒｂｕｓまたはＰａｌａｗａｎ Ｂｅａｒｄｅｄ Ｐｉｇ）、ヒゲイノシシ（Ｓｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓまたはＢｅａｒｄｅｄ Ｐｉｇ）、ベトナムイボイノシシ（Ｓｕｓ ｂｕｃｃｕｌｅｎｔｕｓまたはＶｉｅｔｎａｍｅｓｅ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、ヴィサヤンヒゲイノシシ（Ｓｕｓ ｃｅｂｉｆｒｏｎｓまたはＶｉｓａｙａｎ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、セレベスヒゲイノシシ（Ｓｕｓ ｃｅｌｅｂｅｎｓｉｓまたはＣｅｌｅｂｅｓ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、フローレスイボイノシシ（Ｓｕｓ ｈｅｕｒｅｎｉまたはＦｌｏｒｅｓ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、ミンドロイボイノシシ（Ｓｕｓ ｏｌｉｖｅｒｉまたはＭｉｎｄｏｒｏ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、フィリピンイボイノシシ（Ｓｕｓ ｐｈｉｌｉｐｐｅｎｓｉｓまたはＰｈｉｌｉｐｐｉｎｅ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、イノシシ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａまたはＷｉｌｄ ＢｏａｒまたはＤｏｍｅｓｔｉｃ Ｐｉｇ）、スンダイボイノシシ（Ｓｕｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓまたはＪａｖａｎ Ｗａｒｔｙ Ｐｉｇ）、および他の任意の雄ブタ（ｂｏａｒ）、雌ブタ（ｓｏｗ）、仔ブタ、ブタ同腹仔（ｆａｒｒｏｗ）、乳離れ直後の仔ブタ（ｓｈｏａｔ）、未経産ブタ（ｇｉｌｔ）、去勢ブタ（ｂａｒｒｏｗ）、成豚（ｈｏｇ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、またはイノシシ属（ｓｕｓ）を含むがこれらに限定されない、生物学的な科であるイノシシ科（Ｓｕｉｄａｅ）に属するメンバーである、野生または家畜の任意の動物を指す。
【0056】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、当技術分野で理解されるような生物学的実体を指し得、初代細胞または細胞株として記載され得る特定の実体を包含することが意図されている。これらの用語のいくつかが本明細書で使用される場合、そのような使用は、単によく理解されている区別を強調するためにすぎないことが理解されるであろう。例えば、「細胞または細胞株」という語句は、元の一次分離株と、元の一次分離株の直接誘導体であり得る不死化バージョンとの間の対比を強調し得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞または細胞株は、本明細書に記載の初代細胞または細胞株の自発的不死化バリアント、意図的に形質転換された誘導体、他のバリアントまたは誘導体、および他の不死化バージョンの１つ以上であり得る。
【0057】
いくつかの実施形態では、本開示の細胞株は、ＡＳＦの増殖を支持することが可能であり得るブタ肺胞マクロファージ細胞株であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ブタ胎仔肺試料から入手し得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞はＺＭＡＣ細胞であり得る。ＺＭＡＣ細胞は、ＡＳＦＶの感染性および増殖を支持する能力を有すると特徴付けられ得る、および／または観察され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＺＭＡＣ－１として指定され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定されるまたはそれに由来する米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の寄託物として指定され得る。本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」という用語は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指し得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、ＺＭＡＣ１１０７－４として指定され得る。ＺＭＡＣ１１０７－４は、本明細書ではＺＭＡＣ－４とも呼ばれ得、そのような用語は、本明細書では互換的に使用される。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２０２，７１７号、同第８，６６３，９８４号、および同第９，１６９，４６５号に記載されている任意の細胞を含み得るか、または任意の細胞の特徴を有し得る。これらの先行特許と本開示との間に矛盾がある場合には、本開示が優先される。
【0058】
ブタ胎仔肺試料から得られる本開示の細胞を含む実施形態では、ブタ胎仔肺は、約２０～約８０日の妊娠期間を有するブタ胎仔に由来し得る。いくつかの実施形態では、ブタ胎仔肺は、約５０～約７０日の妊娠期間を有するブタ胎仔に由来し得る。いくつかの実施形態では、ブタ胎仔肺は、約３０～約９０日の妊娠期間を有するブタ胎仔に由来し得る。他の妊娠期間を有するブタ胎仔も本開示の範囲内にあることが企図されることを理解されたい。
【0059】
本明細書で使用される場合、「単離すること」、「単離する」、「単離された」などの用語は、天然の状態とは異なる、および／または出発物質に対して修飾されている、操作された状態を指し得、その場合、この用語は、精製されるという概念と一致することが意図されている。例えば、単離された初代細胞は、宿主生物における天然組織または他の供給源から切除され、元の供給源から離れて維持される。別の例として、細胞成分は、培養に入れるか、または肺洗浄液ベースの試料からさらに分離してもよく、したがって、比較的単離された細胞が得られる。
【0060】
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、出発物質に対して物質が相対的に濃縮、分離、および／または除去されている状態を指し得る。この用語は、少なくとも部分的な精製の状態を包含し得、必ずしも絶対的な純度の状態を意味しない。例えば、この用語は、ＡＳＦウイルスを複製することができ、混合培養物中に存在する細胞に適用され得、独立して、通常純粋培養物と見なされ得るものに適用され得る。この用語は、任意で混合培養物である初代細胞培養物に適用され得る。この用語は、細胞株に適用され得る。
【0061】
本明細書で使用される場合、「培養する」、「培養された」、「培養すること」という用語および同様の用語は、細胞が制御された条件下で、一般にそれらの自然環境の外側で増殖する過程を指す。いくつかの実施形態では、細胞を最初にブタから取り出し、その後好ましい人工環境で増殖させ得る。いくつかの実施形態では、細胞を組織から直接取り出し、培養前に酵素的または機械的手段によって解離させ得る。いくつかの態様では、細胞は、既に樹立されている細胞系または細胞株に由来し得る。
【0062】
本明細書で使用される場合、「継代」、「複数継代」、「継代された」、「継代すること」という用語および同様の用語は、培地の除去および前の培養物から新鮮な増殖培地への細胞の移入を含み、それによって細胞のさらなる増殖を可能にし得る、細胞の植え継ぎ培養を指す。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、少なくとも５継代培養され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、少なくとも１０継代培養され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、少なくとも１５継代培養され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、少なくとも２０継代培養され得る。いくつかの実施形態では、本開示の細胞は、少なくとも５０継代培養され得る。いくつかの実施形態では、培養は、本開示の細胞を少なくとも５継代にわたって継代すること、および／または本開示の細胞を連続培養で少なくとも１０日間増殖させることを含み得る。本開示は、他の継代間隔にわたって本開示の細胞を培養することを企図することを理解されたい。
【0063】
本開示の方法は、本開示の細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、成長因子組成物は、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含み得る。
【0064】
本開示はまた、ＡＳＦワクチンを製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＡＳＦウイルスの改変生ウイルス（ＭＬＶ）株を提供すること、およびＡＳＦ ＭＬＶ株を複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてＭＬＶ株を増殖させることを含み得る。
【0065】
本開示の方法および組成物に使用されるＡＳＦＶウイルスは、生きていてもよく、弱毒化されていてもよく、または不活性化されていてもよい。本明細書で使用される場合、「弱毒化された」、「改変生ウイルス」、「ＭＬＶ」などの用語は、もはやＡＳＦを引き起こすことができないが、依然として本開示の細胞において感染および複製することができるように改変されたＡＳＦＶの量を指し得る。本明細書で使用される場合、「不活性化された」、「死滅した」、「死んだ」という用語および同様の用語は、死滅したＡＳＦＶを指し得る。本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、投与するとＡＳＦＶに対する抗体産生を刺激するが、重篤な感染を引き起こすことができないＡＳＦＶのＭＬＶ株または死滅ＡＳＦＶ、またはＡＳＦＶの構造の一部を指し得る。
【0066】
本開示はまた、ＡＳＦウイルスを増殖させる方法を提供する。この方法は、ブタ胎仔対象を提供すること、対象から細胞を含有する気管支肺胞洗浄液試料を得ること、および試料からマクロファージ細胞を分離することを含む、ブタ胎仔肺からブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を単離すること；細胞を培養すること；ならびにウイルス複製を可能にするために細胞をＡＳＦウイルスと接触させること；それによってウイルスを増殖させることを含み得る。
【0067】
本開示はまた、ブタ対象におけるＡＳＦウイルスの存在を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養される；細胞を試料と接触させること；適切な条件下で細胞をインキュベートすること；および細胞におけるＡＳＦウイルスの存在を検出することを含み得る。そのような検出方法は、ＡＳＦを診断するために使用され得る。
【0068】
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、血液、血清、血漿、リンパ液、唾液、鼻分泌物、組織細胞、血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、涙、粘液、汗、乳汁、または脳抽出物を指し得る。身体組織は、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、または扁桃組織を含み得る。
【0069】
本明細書で使用される場合、本開示の細胞をインキュベートすることに関連して「適切な条件」という用語は、温度、湿度、環境中のガス混合物などの適切な条件を指し得る。いくつかの実施形態では、温度は３７℃（すなわち、摂氏）であり得る。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＡＳＦウイルスの存在を検出することは、血球吸着アッセイまたは免疫蛍光を利用することを含み得る。本開示は、ＡＳＦウイルスの存在を検出するために使用し得る他の技術を企図することを理解されたい。
【0071】
本開示はまた、担体中にＡＳＦウイルスの子孫を含むワクチンを提供する。ワクチンは、ＡＳＦＶに対する応答を開始するようにブタ対象の免疫系を調製することによって機能し得る。一実施形態では、ワクチンは、非毒性、非感染性、および／または非病原性形態でワクチン接種されるブタ対象の体内に導入され得る、本開示のＡＳＦＶの子孫またはその一部であり得る抗原を含み得る。本開示のワクチン中のＡＳＦＶ抗原は、抗原が由来するＡＳＦＶに対してブタ対象の免疫系を「プライミング」または「感作」させ得る。ＡＳＦＶへのブタ対象の免疫系のその後の曝露は、宿主ブタ対象内でＡＳＦＶが増殖し、十分な細胞に感染してまたは損傷を与えて疾患症状を引き起こすことができる前に、ＡＳＦＶを制御または破壊し得る迅速で強固な特異的免疫応答をもたらし得る。
【0072】
一実施形態では、ワクチンを有効にするのに十分な程度まで免疫系を刺激するために、すなわち免疫を付与するために、ワクチン中に存在する抗原に対する免疫応答を増強することが必要であり得る。この目的のために、ワクチン組成物中の抗原に対するインビボ免疫応答を増強し得るアジュバント（または免疫増強剤）として公知の添加剤が考案されている。いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。
【0073】
アジュバントは、本明細書に記載の抗原などの他の薬剤の効果を修飾する任意の組成物、薬理学的または免疫学的薬剤であり得る。アジュバントの例としては、マイコバクテリウム属菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）溶解物（ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）全血溶解物を含む）、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）全血溶解物を含む）、コレラ毒素Ｂサブユニットおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性変異型毒素が挙げられ得るが、これらに限定されない。アジュバントの他の例としては、進化的に保存された分子、いわゆるＰＡＭＰが挙げられ得、これには、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原の分子ケージ、細菌細胞壁の成分、ならびに二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡなどのエンドサイトーシスされた核酸が挙げられ得る。アジュバントのさらなる例としては、抗原が吸着され得る無機物（または水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウムなどの無機塩）の懸濁液を含み得るアルミニウム含有アジュバントが挙げられ得るが、これらに限定されない。アジュバントのさらなる例としては、任意のそのようなアルミニウム塩の非存在下で製剤化され得る、アルミニウム（ミョウバン）を含まないアジュバントが挙げられ得るが、これらに限定されない。ミョウバン不含アジュバントとしては、油エマルジョンおよび水エマルジョン、例えば油中水型、水油水型および水中油型（ならびに二重エマルジョンおよび可逆的エマルジョンを含むそれらの変形）、リポサッカリド、リポ多糖、免疫刺激性核酸（ＣｐＧオリゴヌクレオチドなど）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特にＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、ならびにそのような成分の様々な組合せが挙げられ得る。
【0074】
本開示のワクチンにおいて利用し得る担体の非限定的なリストには、水または生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、油、希釈剤、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル、合成ポリマー、エマルジョン、脂質で作られた固体粒子などが含まれ得るが、これらに限定されない。当技術分野で公知の任意の希釈剤を本開示に従って利用し得ることを理解されたい。本開示のいくつかの実施形態では、希釈剤は水溶性であり得る。本開示のいくつかの実施形態では、希釈剤は水不溶性であり得る。本明細書で使用される場合、「希釈剤」という用語は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、グリセロール、エタノール、緩衝酢酸ナトリウムまたは緩衝酢酸アンモニウム溶液など、およびそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【0075】
本開示はまた、ブタにおいてＡＳＦＶに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、有効量の本開示のワクチンをブタに投与することを含み得る。免疫応答は、ブタに対して防御的であり得る。
【0076】
本開示の方法を実施する際には、有効量のワクチンをブタに投与する。本明細書で使用される場合、投与の文脈における「有効量」という用語は、ブタに投与された場合にＡＳＦＶに対する免疫応答を生成するのに十分なワクチンの量を指す。そのような量は、ブタにおいて有害事象を全くまたはほとんどもたらさないべきである。同様に、そのような量は、毒性作用を全くまたはほとんどもたらさないべきである。ワクチンの量は、処置されるブタの種類、ブタの年齢、大きさ、体重および全身的な身体状態、ならびに投薬レジメンを含むがこれらに限定されない多くの要因に依存して変動し得ることを理解されたい。
【0077】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答であり得る。免疫応答は、抗原特異的中和抗体などの特異的抗体の産生をもたらすＢ細胞応答であり得る。免疫応答はまた、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答であり得る。いくつかの実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的であり得る（すなわち、「抗原特異的応答」）。免疫応答はまた、自然応答を含み得る。抗原が病原体に由来する場合、抗原特異的応答は「病原体特異的応答」である。「防御免疫応答」は、病原体の有害な機能もしくは活性を阻害する、病原体による感染を減少させる、または病原体による感染から生じる症状（死亡を含む）を減少させる免疫応答である。防御免疫応答は、例えば、プラーク減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ中和アッセイにおけるウイルス複製もしくはプラーク形成の阻害によって、またはインビボでの病原体チャレンジに対する耐性を測定することによって測定することができる。
【0078】
本開示の方法で利用されるワクチンは、経口、静脈内（「ＩＶ」）、皮下（「ＳＣ」）、筋肉内（「ＩＭ」）、腹腔内、皮内、眼内、肺内、鼻腔内、経皮、皮下、局所、粘膜、鼻、皮膚へのインプレッション、膣内、子宮内、頸管内、および直腸を含むがこれらに限定されない様々な適用可能経路を使用して投与し得ることを理解されたい。本開示のいくつかの実施形態では、鼻腔内投与経路は、鼻腔内点滴を含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、鼻腔内投与経路は、鼻腔内エアロゾル送達を含み得る。本開示のいくつかの実施形態では、鼻腔内エアロゾル送達は、鼻スプレー送達を含み得る。
【0079】
本開示は、本開示の細胞および方法を提供することによってＡＳＦ疾患の問題に対処する。インビボでのＡＳＦＶ複製のための主な標的細胞は、単球およびマクロファージである。ＡＳＦＶ複製のためのインビボ標的細胞に類似するブタマクロファージ細胞株の欠如は、ウイルス宿主相互作用に関する研究を制限し、弱毒生ワクチンの開発を制限し、ウイルス診断をより面倒にしている。ＶｅｒｏおよびＣＯＳ－１などのアフリカミドリザルの腎臓に由来する樹立された細胞株の使用は、研究目的のためのＡＳＦＶの増幅を可能にした。しかしながら、それらの使用は、ウイルスが最初にそのタイプの細胞株において増殖するように適合されることを必要とし、その使用を、細胞培養において効率的に増殖するために長期間の適合プロセスを通過していなければならない限られた数の実験室株に限定する。自然のアウトブレイクからの野生型ＡＳＦＶ分離株は、これらの従来のサル由来の樹立細胞培養物では複製しないことが認められているので、ブタ単球およびマクロファージは、ウイルスストックを増殖させ、自然のＡＳＦＶ感染を模倣するために選択されるインビトロ系である。これは研究目的には十分であり得るが、初代細胞の使用は、完全に認可された市販のワクチンを製造するための細胞基質としての、ＵＳＤＡ家畜用生物製剤センター（ＵＳＤＡ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）（ＣＶＢ）による規制上の承認には適していないため、市販のワクチンの開発には十分ではない。ＡＳＦＶの弱毒株を開発するために、樹立された細胞株を使用する試みがなされてきた。残念なことに、弱毒化ワクチン株を開発する目的でＶｅｒｏ細胞においてＡＳＦＶのＧｅｏｒｇｉａ ２００７野生型株を１１０回連続継代すると、ウイルスの弱毒化がもたらされたが、ワクチンの有効性の喪失ももたらされた。その結果、末梢血または骨髄のいずれかに由来するブタマクロファージの初代培養物において、野外分離株、さらには最近開発されたＧｅｏｒｇｉａ ２００７遺伝子欠失ＡＳＦＶワクチン候補の培養が行われている。対照的に、本開示に示されるように、野生型ＡＳＦＶ株Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１ならびにＡＳＦＶのいくつかの他の野生型および弱毒株は、ＺＭＡＣ細胞において容易かつ効率的に複製することができる。さらに、本開示に示されるように、ＺＭＡＣ細胞におけるＡＳＦＶ ＯＵＲＴ８８／３の弱毒株の１２継代は、毒性ウイルスによるチャレンジに対してブタの防御免疫を誘導する能力を低下させなかった。
【0080】
ウイルス感染に必要な特異的受容体の存在は、宿主細胞膜上に発現され、したがって、ウイルス向性および内在化の決定因子を構成する。より高い成熟および分化状態を有する単球／マクロファージは、ＡＳＦＶが選択的に感染する細胞サブセットであることが報告されている。これに関して、野生型ＡＳＦＶに感染している成熟単球／マクロファージのより高い割合は、ＣＤ１６３およびＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａのより高い発現と相関することが記載されている。ＣＤ１６３の細胞表面発現は、最初は細胞がＡＳＦＶに感染するために必要であると考えられたが、その後の研究は、ＣＤ１６３陰性単球がＡＳＦＶに感染し得ることを示すことによってこの観察を否定した。さらに、ＣＤ１６３を欠く遺伝子編集ブタ、ならびにそれらに由来する単球およびマクロファージは、ＡＳＦＶの野生型Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１株による感染に完全に感受性であった。したがって、ＣＤ１６３はＡＳＦＶ感染に必要ではないようである。ＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａの場合、単球およびマクロファージによるこの分子の発現の上方制御は、それらの分化およびマクロファージへの成熟に関連する。単球はＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａを発現せず、主にＡＳＦＶ感染に耐性である。これらの細胞は、成熟マクロファージに分化するにつれて、ＳＷＣ９／ＣＤ２３ａの発現を上方制御し、ＡＳＦＶ感染に感受性になる。本開示に示されるように、ＺＭＡＣ細胞はＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａを発現せず、したがって未熟なタイプのマクロファージと見なすことができる。したがって、ＺＭＡＣ細胞がＡＳＦＶの野生型株を効率的に複製する能力は、この細胞が未熟なマクロファージであると考えられ、ＡＳＦＶによる感染に対する感受性に関連している細胞表面分子（ＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａ）を発現しないので、予想外であった。さらに、ＺＭＡＣ細胞が野生型ＡＳＦＶを効率的に複製する能力は、Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ ｅｔ ａｌ．（Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ ＨＭ，Ｓａｂａｒａ Ｍ，Ｐａｓｉｃｋ Ｊ，ｖａｎ Ｍｏｏｒｌｅｈｅｍ Ｅ，Ｂａｂｉｕｋ Ｌ．）Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｐａｒｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００２；１０４（２）：２０３－２１６．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｓ０１６６－０９３４（０２）０００８５－ｘ）によって記載されたブタ肺胞マクロファージ細胞株３Ｄ４／２、３Ｄ４／２１および３Ｄ４／３が野生型ＡＳＦＶに非効率的に感染し、ＡＳＦＶの連続継代を支持しなかったので、異例である。本開示に記載されるように、ＺＭＡＣ細胞は、野生型ＡＳＦＶ株Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１の増殖を効率的に可能にし、高い力価をもたらした。
【0081】
本開示の他の部分で説明および提供される態様および実施形態に加えて、以下の実施形態の非限定的なリストも企図される。
【0082】
１．アフリカブタ熱（ＡＳＦ）ウイルスの子孫を生成する方法であって、
ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養される；
細胞をＡＳＦウイルスに曝露すること；および
ＡＳＦウイルスを細胞内で複製させること；
それによってＡＳＦウイルスの子孫を生成すること
を含む方法。
ＡＳＦウイルスを複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を提供すること、ここで、細胞は少なくとも５継代培養される；
細胞をＡＳＦウイルスに曝露すること；および
ＡＳＦウイルスを細胞内で複製させること；
それによってＡＳＦウイルスの子孫を生成すること
を含む方法。
【0083】
２．細胞が、ＺＭＡＣ、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）への寄託物、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、条項１に記載の方法。
【0084】
３．細胞が、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、条項１に記載の方法。
【0085】
４．細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含む、条項１に記載の方法。
【0086】
５．成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、条項４に記載の方法。
【0087】
６．細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、条項１に記載の方法。
【0088】
７．ＡＳＦワクチンを製造する方法であって、
ＡＳＦウイルスの改変生ウイルス（ＭＬＶ）株を提供すること、およびＡＳＦ ＭＬＶ株を複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてＭＬＶ株を増殖させること
を含む方法。
ＡＳＦウイルスの改変生ウイルス（ＭＬＶ）株を提供すること、およびＡＳＦ ＭＬＶ株を複製することができる単離または精製されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞においてＭＬＶ株を増殖させること
を含む方法。
【0089】
８．細胞が、初代細胞、細胞集団、細胞株、またはそれらのバリアントもしくは誘導体である、条項７に記載の方法。
【0090】
９．細胞が、ＺＭＡＣ、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）への寄託物、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、条項７に記載の方法。
【0091】
１０．細胞が、ＺＭＡＣ－１、ＺＭＡＣ－４、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託された細胞、および前述のいずれかの誘導体からなる群より選択される、条項７に記載の方法。
【0092】
１１．細胞を成長因子組成物と接触させることをさらに含む、条項７に記載の方法。
【0093】
１２．成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、条項１１に記載の方法。
【0094】
１３．細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、条項７に記載の方法。
【0095】
１４．ＡＳＦウイルスを増殖させる方法であって、
ブタ胎仔対象を提供すること、対象から細胞を含有する気管支肺胞洗浄液試料を得ること、および試料からマクロファージ細胞を分離することを含む工程によってブタ胎仔肺からブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を単離すること；
細胞を培養すること；ならびに
ウイルス複製を可能にするために細胞をＡＳＦウイルスと接触させること；
それによってウイルスを増殖させること
を含む方法。
ブタ胎仔対象を提供すること、対象から細胞を含有する気管支肺胞洗浄液試料を得ること、および試料からマクロファージ細胞を分離することを含む工程によってブタ胎仔肺からブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞を単離すること；
細胞を培養すること；ならびに
ウイルス複製を可能にするために細胞をＡＳＦウイルスと接触させること；
それによってウイルスを増殖させること
を含む方法。
【0096】
１５．培養することが、少なくとも５継代にわたって細胞を継代すること、および／または連続培養で少なくとも１０日間細胞を増殖させることを含む、条項１４に記載の方法。
【0097】
１６．培養することが、細胞を成長因子組成物と接触させることを含む、条項１４に記載の方法。
【0098】
１７．成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、条項１６に記載の方法。
【0099】
１８．細胞が、妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔対象から得られる、条項１４に記載の方法。
【0100】
１９．細胞が少なくとも１０継代培養される、条項１に記載の方法。
【0101】
２０．細胞が少なくとも２０継代培養される、条項１に記載の方法。
【0102】
２１．細胞が細胞株である、条項１に記載の方法。
【0103】
２２．細胞が細胞株である、条項７に記載の方法。
【0104】
２３．培養することが、細胞を少なくとも２０継代にわたって継代することを含む、条項１４に記載の方法。
【0105】
２４．ＡＳＦウイルスに感染することができるおよび／またはＡＳＦウイルスを複製することができ、少なくとも５継代培養される、単離されたブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞。
【0106】
２５．細胞が少なくとも１０継代にわたって培養で増殖される、条項２４に記載の細胞。
【0107】
２６．細胞が少なくとも２０継代にわたって培養で増殖される、条項２４に記載の細胞。
【0108】
２７．細胞が少なくとも５０継代にわたって培養で増殖される、条項２４に記載の細胞。
【0109】
２８．少なくとも１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項２４に記載の細胞。
【0110】
２９．少なくとも約３．１６×１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項２４に記載の細胞。
【0111】
３０．少なくとも約３．１６×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項２４に記載の細胞。
【0112】
３１．少なくとも約３．１６×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項２４に記載の細胞。
【0113】
３２．少なくとも約６．８１×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項２４に記載の細胞。
【0114】
３３．妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔に由来する、条項２４に記載の細胞。
【0115】
３４．ＡＳＦウイルスに感染することができるおよび／またはＡＳＦウイルスを複製することができる、ブタ胎仔肺胞マクロファージ細胞株。
【0116】
３５．少なくとも１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項３４に記載の細胞。
【0117】
３６．少なくとも約３．１６×１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項３４に記載の細胞。
【0118】
３７．少なくとも約３．１６×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項３４に記載の細胞。
【0119】
３８．少なくとも約３．１６×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項３４に記載の細胞。
【0120】
３９．少なくとも約６．８１×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項３４に記載の細胞。
【0121】
４０．妊娠期間の約３０日目～約９０日目のブタ胎仔の細胞に由来する、条項３４に記載の細胞株。
【0122】
４１．ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４として指定される米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）への寄託物によって代表されるかまたはそれに由来する、単離されたＺＭＡＣ－１細胞。
【0123】
４２．少なくとも１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項４１に記載の細胞。
【0124】
４３．少なくとも約３．１６×１０５ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項４１に記載の細胞。
【0125】
４４．少なくとも約３．１６×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項４１に記載の細胞。
【0126】
４５．少なくとも約３．１６×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項４１に記載の細胞。
【0127】
４６．少なくとも約６．８１×１０７ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価でＡＳＦウイルスを増殖させることができる、条項４１に記載の細胞。
【0128】
４７．ブタ胎仔肺から細胞を単離する方法であって、
ブタ胎仔対象を提供する工程；
対象から細胞含有試料を得る工程；
試料から細胞を分離する工程、および細胞を少なくとも５継代培養する工程、ここで、細胞はＡＳＦウイルスを複製することができる；
それによって細胞を単離する工程
を含む方法。
ブタ胎仔対象を提供する工程；
対象から細胞含有試料を得る工程；
試料から細胞を分離する工程、および細胞を少なくとも５継代培養する工程、ここで、細胞はＡＳＦウイルスを複製することができる；
それによって細胞を単離する工程
を含む方法。
【0129】
４８．ブタ胎仔肺から細胞を単離する方法であって、
ブタ胎仔対象を提供する工程；
対象から細胞含有試料を得る工程、ここで、細胞含有試料は気管支肺胞洗浄液試料である；および
試料から細胞を分離する工程、ここで、細胞はＡＳＦウイルスを複製することができる；
それによって細胞を単離する工程
を含む方法。
ブタ胎仔対象を提供する工程；
対象から細胞含有試料を得る工程、ここで、細胞含有試料は気管支肺胞洗浄液試料である；および
試料から細胞を分離する工程、ここで、細胞はＡＳＦウイルスを複製することができる；
それによって細胞を単離する工程
を含む方法。
【0130】
４９．分離工程が密度勾配遠心分離によるものである、条項４７に記載の方法。
【0131】
５０．細胞がマクロファージである、条項４７に記載の方法。
【0132】
５１．連続培養で少なくとも１０日間細胞を増殖させる工程をさらに含む、条項４７に記載の方法。
【0133】
５２．培養することが少なくとも１０、２０、または５０継代にわたる、条項４７に記載の方法。
【0134】
５３．ブタ胎仔対象が妊娠期間の約３０日目～約９０日目である、条項４７に記載の方法。
【0135】
５４．ブタ胎仔肺から細胞を単離する方法であって、ブタ胎仔対象に対象からの細胞含有試料を提供する工程、試料から細胞を分離する工程、および細胞をサブクローニングする工程、ここで、細胞はＡＳＦウイルスを複製することができる、それによって細胞を単離する工程を含む方法。
【0136】
５５．成長因子組成物を含む増殖培地で細胞を培養することをさらに含む、条項４７に記載の方法。
【0137】
５６．成長因子組成物が、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）または顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含む、条項５５に記載の方法。
【0138】
５７．成長因子組成物が５～１０ｎｇ／ｍＬの濃度でＭＣＳＦを含む、条項５５に記載の方法。
【0139】
５８．細胞がマクロファージである、条項４８に記載の方法。
【0140】
５９．細胞を少なくとも５継代培養する工程をさらに含む、条項４８に記載の方法。
【0141】
６０．ブタ胎仔対象が妊娠期間の約３０日目～約９０日目である、条項４８に記載の方法。
【0142】
６１．ＭＣＳＦまたはＧＭＣＳＦの成長因子組成物を含む増殖培地で細胞を培養することをさらに含む、条項４８に記載の方法。
【0143】
６２．細胞がマクロファージである、条項５４に記載の方法。
【0144】
６３．細胞を少なくとも５継代培養する工程をさらに含む、条項５４に記載の方法。
【0145】
６４．ブタ胎仔対象が妊娠期間の約３０日目～約９０日である、条項５４に記載の方法。
【0146】
６５．ＭＣＳＦまたはＧＭＣＳＦの成長因子組成物を含む増殖培地で細胞を培養することをさらに含む、条項５４に記載の方法。
【0147】
６６．マクロファージが肺胞マクロファージである、条項５０に記載の方法。
【0148】
６７．マクロファージが肺胞マクロファージである、条項５８に記載の方法。
【0149】
６８．マクロファージが肺胞マクロファージである、条項６２に記載の方法。
【0150】
６９．個々の動物から得られ、少なくとも５継代培養される、ＡＳＦウイルスを複製することができる単離された非サル細胞。
【0151】
７０．ＡＳＦウイルスに感染することができるおよび／またはＡＳＦウイルスを複製することができる、単離されたブタ胎仔肺細胞。
【0152】
７１．肺胞マクロファージ細胞である、条項７０に記載の細胞。
【0153】
７２．少なくとも５継代にわたって培養で増殖される、条項７０に記載の細胞。
【0154】
７３．少なくとも１０、２０、および／または５０継代にわたって培養で増殖される、条項７０に記載の細胞。
【0155】
７４．ブタ胎仔の肺から得られた、単離された初代細胞または細胞集団。
【0156】
７５．胎仔が妊娠期間の約３０日目～約９０日目である、条項７４に記載の細胞または細胞集団。
【0157】
７６．細胞が肺胞マクロファージであるか、または細胞集団が少なくとも１つの肺胞マクロファージ細胞を含む、条項７４に記載の細胞または細胞集団。
【0158】
７７．条項６９～７１および７４～７６のいずれか一条項に記載の細胞の不死化細胞バリアントまたは誘導体。
【0159】
７８．ＺＭＡＣとして指定される細胞または細胞株。
【0160】
７９．条項１に記載のＡＳＦウイルスの子孫を担体中に含むワクチン。
【0161】
８０．アジュバントをさらに含む、条項７９に記載のワクチン。
【0162】
８１．条項７９に記載のワクチンをブタに投与することを含む、ブタにおいてＡＳＦＶに対する免疫応答を誘発する方法。
【0163】
８２．ワクチンが非経口投与される、条項８１に記載の方法。
【0164】
８３．ワクチンが経口投与される、条項８１に記載の方法。
【0165】
８４．ワクチンが鼻腔内投与される、条項８１に記載の方法。
【0166】
８５．ワクチンが粘膜投与される、条項８１に記載の方法。
【0167】
例
本開示に関連する例を以下で説明する。いくつかの実施形態では、代替技術を使用することができる。例は、説明に役立つことを意図しており、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定または制限するものではない。
本開示に関連する例を以下で説明する。いくつかの実施形態では、代替技術を使用することができる。例は、説明に役立つことを意図しており、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定または制限するものではない。
【0168】
例１
細胞材料および細胞の増殖
細胞材料。ＺＭＡＣ－１として指定されるブタ肺胞マクロファージ細胞株からの細胞を調製し、ブダペスト条約の下で、広く認められている国際寄託当局（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に寄託した。アクセッション番号は、イノシシ科の動物（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）（ブタ／イノシシ）肺組織起源であると特徴付けられる細胞についてのＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４である。２００７年１２月７日付ＡＴＣＣ寄託証明書（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ Ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）；国際様式；第７．３規則に従って発行された原寄託および第１０．２規則に従って発行された生存の陳述の場合の受領書）によると、ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託指定ＰＴＡ－８７６４について、培養受領日は２００７年１１月１４日である。
細胞材料および細胞の増殖
細胞材料。ＺＭＡＣ－１として指定されるブタ肺胞マクロファージ細胞株からの細胞を調製し、ブダペスト条約の下で、広く認められている国際寄託当局（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に寄託した。アクセッション番号は、イノシシ科の動物（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）（ブタ／イノシシ）肺組織起源であると特徴付けられる細胞についてのＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－８７６４である。２００７年１２月７日付ＡＴＣＣ寄託証明書（特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ Ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）；国際様式；第７．３規則に従って発行された原寄託および第１０．２規則に従って発行された生存の陳述の場合の受領書）によると、ＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託指定ＰＴＡ－８７６４について、培養受領日は２００７年１１月１４日である。
【0169】
細胞の増殖。いくつかの実施形態では、ＺＭＡＣ－１細胞などの細胞をインビトロで培養する。一般に、哺乳動物細胞培養の原理が適用される。例えば、細胞を抗生物質の存在下で培養することができる；ゲンタマイシンが使用されるが、必ずしも必要ではない。
【0170】
細胞を以下のように調製する。培養培地は、１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号２５－０００－Ｃ１）、非必須アミノ酸（１倍；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２５－０２５－Ｃ１）およびゲンタマイシン（５０ｍｃｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１５７５０－０６０）を添加したＲＰＭＩ－１６４０である。細胞を約１～５×１０ｅ５／ｍｌの細胞濃度に維持する。これらの細胞は、一般に、懸濁状態で増殖する。緩く接着した細胞の個別のコロニーが発生し得るが、細胞の大部分は懸濁状態で増殖する。正常な培養物は、浮遊細胞塊を産生する。接着を減少させるために、好ましいタイプの培養フラスコは、ＰＥベントキャップ（カタログ番号８３．１８１３．５０２）を有する懸濁細胞用のＳａｒｓｔｅｄｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌａｓｋである。確立されたフラスコは、２／３の流体を除去し、新鮮な培養培地を添加して、４～５日ごとに収穫することができる。新しいフラスコは、Ｔ２５フラスコ中の２０ｍｌ容量に少なくとも３００万～６００万個の細胞（最低１．５×１０ｅ５細胞／ｍｌ）を添加することによって確立される。２～１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（マウス；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｍ９１７０）を添加することによって増殖を増強することができる。細胞凍結は、４００万～８００万細胞／ｍｌの等しい体積の細胞の氷冷懸濁液と氷冷凍結培地（９０％血清、１０％ＤＭＳＯ）とを混合することによって達成することができる。冷却したクライオバイアルに、凍結培地に懸濁した細胞を満たし、プロセス中、氷冷温度に維持する。
【0171】
ここで図１を参照すると、成長因子の存在下でのＺＭＡＣ－１細胞の増殖が示されている。１．２×１０５細胞／ｍｌのＺＭＡＣ－１細胞を、外因性成長因子なしで、または示されている濃度のマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）もしくは顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のいずれかの存在下で８日間培養した。細胞濃度は、培養の４日目および８日目に血球計を用いて決定した。ｙ軸は、細胞／ｍｌ（ｘ１０５）を示す。
【0172】
例２
細胞材料の作製およびウシ胎仔試料からの単離方法
さらなる組成物および方法を開発した。独立した試みにおいて、材料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｒｍのブタ群からの妊娠６０日目の雌ブタに由来した（雌ブタ番号５８５０として識別）。安楽死させた後、子宮を腹腔から無菌的に取り出し、細胞培養実験室に輸送した。操作は、一般に、無菌条件下で生物学的安全キャビネットを使用して行った。６匹の胎仔を子宮から無菌的に採取し、プラスチック製ペトリ皿に入れた。気管が無傷で肺に付着した肺器官を、心臓、食道および他の膜から切除した。肺の外側を滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で十分にすすいで、目に見える血液および他の混入残存組織を除去した。清潔な滅菌ペトリ皿に肺を置き、気道を１０ｍｌの滅菌ＨＢＳＳで満たすことによって、６匹の胎仔のそれぞれからの肺の気道内の細胞を気管支肺胞洗浄によって別々に単離した。気管の管腔を通して挿入した１０ｃｃシリンジおよび１インチの１８ｇ針を用いて、１０ｍｌのＨＢＳＳを肺内に押し進めた。流体を、ＨＢＳＳの逆流を防ぐために鉗子での圧迫によって拘束しながら、気管を通して穏やかに押し進め、その結果、肺が流体で目に見えて膨張した。その後、単に気管圧迫を解除することによって、肺洗浄液細胞を含む流体を肺から自己排出させた。ペトリ皿に収集した細胞懸濁液を滅菌１５ｍｌコニカルプラスチックチューブに移し、３～４ｍｌの温かいＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７を下に置いた。直後に、細胞懸濁液を等密度遠心分離（４００ｇ、室温で３０分間）によって精製した。
細胞材料の作製およびウシ胎仔試料からの単離方法
さらなる組成物および方法を開発した。独立した試みにおいて、材料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｒｍのブタ群からの妊娠６０日目の雌ブタに由来した（雌ブタ番号５８５０として識別）。安楽死させた後、子宮を腹腔から無菌的に取り出し、細胞培養実験室に輸送した。操作は、一般に、無菌条件下で生物学的安全キャビネットを使用して行った。６匹の胎仔を子宮から無菌的に採取し、プラスチック製ペトリ皿に入れた。気管が無傷で肺に付着した肺器官を、心臓、食道および他の膜から切除した。肺の外側を滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で十分にすすいで、目に見える血液および他の混入残存組織を除去した。清潔な滅菌ペトリ皿に肺を置き、気道を１０ｍｌの滅菌ＨＢＳＳで満たすことによって、６匹の胎仔のそれぞれからの肺の気道内の細胞を気管支肺胞洗浄によって別々に単離した。気管の管腔を通して挿入した１０ｃｃシリンジおよび１インチの１８ｇ針を用いて、１０ｍｌのＨＢＳＳを肺内に押し進めた。流体を、ＨＢＳＳの逆流を防ぐために鉗子での圧迫によって拘束しながら、気管を通して穏やかに押し進め、その結果、肺が流体で目に見えて膨張した。その後、単に気管圧迫を解除することによって、肺洗浄液細胞を含む流体を肺から自己排出させた。ペトリ皿に収集した細胞懸濁液を滅菌１５ｍｌコニカルプラスチックチューブに移し、３～４ｍｌの温かいＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７を下に置いた。直後に、細胞懸濁液を等密度遠心分離（４００ｇ、室温で３０分間）によって精製した。
【0173】
一実施形態では、細胞は、単離の日またはその後の時点、例えば１、２、または３週間後に、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７を使用する等密度遠心分離によって精製することができる。この精製手順は、元の調製物中に存在する赤血球などの特定の成分および潜在的に他の物質の除去を容易にし得ることが認識されている。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７と培地との間の界面での遠心分離後に得られた細胞のバンドを採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞を毎回遠心分離によって回収した。２回目の遠心分離後、各胎仔肺洗浄液から回収した細胞ペレットを、培養培地：１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号２５－０００－Ｃ１）、非必須アミノ酸（１倍；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２５－０２５－Ｃ１）を添加したＲＰＭＩ－１６４０に懸濁し、懸濁培養のために６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の１つのウェルに独立して入れた。６匹の胎仔のそれぞれから独立して精製した細胞を識別するために、各ウェルを１～６とラベル付けした。この試みでは、等密度遠心分離手順後にごくわずかで非常に小さい細胞（＜１００）が回収されたが、初期培養物の確立後１４日以内に、全てのウェルで有意な増殖が観察された。胎仔肺から採取したマクロファージ前駆細胞は見かけ上非常に小さく、１．０７７を超える密度を有する（したがって、等密度遠心分離中に密度培地を通過してチューブの底部に達する）ことができたので、胎仔Ｎｏ．１の場合、等密度遠心分離後に得られた赤血球ペレットも採取し、培養物に入れ、Ｐ１とラベル付けした。この場合、培養開始時の優勢な細胞型は赤血球からなったが、少数の非常に小さな単核細胞が観察された。培養開始後１６日目および２４日目に、胎仔Ｎｏ．４の肺洗浄液に由来する細胞の増殖は、６ウェルプレートの新しいウェルに分割するのに十分な増殖を示した。この培養物に由来する細胞をＺＭＡＣ１１０７－４と命名した。同様に、赤血球ペレットに由来するＰ１とラベル付けしたウェルにおける増殖は、培養開始後３６日目で明らかであり、やはり２つのウェルに分割した。この培養物に由来する細胞をＺＭＡＣ１１０７－Ｐ１と命名した。細胞の増殖は、クラスタ当たり２、４、８、１６個以上の細胞で構成される細胞クラスタの存在によって明らかであった。
【0174】
ＺＭＡＣ１１０７－４の培養開始後３７日目に、この細胞株の培養培地に１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（マウス；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｍ９１７０）を二つ組のウェルの一方に添加した。７日後、ＺＭＡＣ１１０７－４細胞の増殖は、成長因子の外因性添加によって培養のこの初期段階で有意に支援されたことが明らかであり、その後、全ての培養物の培地に５～１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦを添加した。細胞培養物の体積の半分を吸引によって除去し、成長因子を添加した新鮮な培地と交換することによって、４～６日ごとに培養物に栄養供給する。ＺＭＡＣ１１０７－４およびＺＭＡＣ１１０７－Ｐ１株の両方の堅固な増殖は、懸濁状態で増殖し、培養物表面に緩く付着した細胞コロニーの形成によって明らかであった。
【0175】
別の独立した試みでは、さらなる組成物および方法を開発した。妊娠５４日目に、Ｎｏ．９０９３として識別される雌ブタを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｒｍのブタ群から得た。安楽死させた後、子宮を腹腔から無菌的に取り出し、細胞培養実験室に輸送した。この時点以降の全ての操作は、無菌条件下で生物学的安全キャビネットの内部で行った。８匹の胎仔を子宮から無菌的に採取し、プラスチック製ペトリ皿に入れ、気管が無傷で肺に付着したそれらの肺を、心臓、食道および他の膜から切除した。肺の外側をＨＢＳＳで十分にすすいで、目に見える血液および他の混入残存組織を除去した。清潔な滅菌ペトリ皿に肺を置き、気道を１０ｍｌの滅菌ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で満たすことによって、８匹の胎仔のそれぞれからの肺の気道内の細胞を気管支肺胞洗浄によって別々に単離した。気管の管腔を通して挿入した１０ｃｃシリンジおよび１インチの１８ｇ針を用いて、１０ｍｌのＨＢＳＳを肺内に押し進めた。流体を、ＨＢＳＳの逆流を防ぐために鉗子で圧迫しながら、気管を通して穏やかに押し進め、その結果、肺が流体で目に見えて膨張した。その後、単に気管の圧迫を減らすことによって、肺洗浄液細胞を含む流体を肺から自己排出させた。場合によっては、残存する洗浄液を排出するのを助けるために、ハサミの鈍い端で肺を穏やかに押し下げた。ペトリ皿に収集した細胞懸濁液を滅菌１５ｍｌコニカルプラスチックチューブに移し、卓上臨床遠心機において１，５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。各胎仔肺洗浄液から回収した細胞ペレットを、培養培地：１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号２５－０００－Ｃ１）、非必須アミノ酸（１倍；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２５－０２５－Ｃ１）を添加したＲＰＭＩ－１６４０に懸濁し、懸濁培養のために６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の１つのウェルに独立して入れた。８匹の胎仔のそれぞれから独立して精製した細胞を識別するために、各ウェルを１～８とラベル付けした。各胎仔肺洗浄液から約１０，０００個の細胞を最初に培養に入れた。これらの培養物における増殖は、５日までに明らかであった。胎仔Ｎｏ．１、３、６、７および８に由来する培養物では、細胞の大きな塊が明らかであった。
【0176】
培養開始後１２日目に、８つ全ての胎仔肺洗浄液細胞培養物由来の非接着細胞および緩く接着した細胞を穏やかにピペッティングすることによって回収し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７を使用する等密度遠心分離によって精製した。細胞懸濁液を滅菌１５ｍｌコニカルプラスチックチューブに移すことによってこれを達成し、３～４ｍｌの温かいＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７を下に置き、次いで室温で３０分間、４００ｇで遠心分離した。Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ １０７７の間の界面での遠心分離後に、明確に目に見える細胞のバンドを得た。培地を採取し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、細胞を毎回遠心分離によって回収した。２回目の遠心分離後、各個々の胎仔肺洗浄液培養物から回収した細胞ペレットを、３ｍｌの培養培地：１０％ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号２５－０００－Ｃ１）、非必須アミノ酸（１倍；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２５－０２５－Ｃ１）を添加したＲＰＭＩ－１６４０に懸濁し、懸濁培養のために６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）の１つのウェルに独立して入れ、培養物の元のラベルに直接対応する１～８とラベル付けした。５日後、全ての細胞培養物に２ｃｃの新鮮な培養培地を供給した。９日後、３および６とラベル付けされた胎仔肺洗浄液細胞培養物由来の培養物では、懸濁液中の細胞および接着細胞の有意な増殖が明らかであり、有意な数の懸濁液中で増殖するマクロファージコロニーおよび緩く接着した円形マクロファージを示した。細胞冠のように見える構造を形成する小さなマクロファージに囲まれた多数の大きな球状合胞体細胞が観察された。培養開始後２６日目に、細胞培養物に５ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ（マウス；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｍ９１７０）を添加した新鮮培地を供給した。５日後、胎仔Ｎｏ．３、Ｎｏ．６およびＮｏ．８に由来する培養物において、懸濁液中で増殖するおよび培養プレートの表面に緩く接着した細胞マクロファージコロニーの活発な増殖が観察された。これらの株をそれぞれＺＭＡＣ１２０７－３、ＺＭＡＣ１２０７－６、およびＺＭＡＣ１２０７－８と命名し、数日後に、５～１０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦを添加した培養培地中でＴ７５フラスコに移すことによって拡大させた。
【0177】
例３
Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでのＺＭＡＣ細胞培養物の確立およびＡＳＦＶ感受性試験
Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（１００５ Ｎ．Ｗａｒｓｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ ３０５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１３２）によって提供されたＺＭＡＣ細胞のバイアルを液体窒素貯蔵から復活させた。手短に言えば、細胞を３７℃（すなわち摂氏）で急速に解凍し、１０ｍｌの温かい培養培地に添加し、３３０ｘｇおよび４℃で７分間遠心分離して凍結培地を除去し、次いで、Ｔ７５超低接着（ＵＬＡ）フラスコにおいて合計５０ｍｌの培地および５ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で培養した。３日後、培養物に新しい培地を１：２希釈で再供給し、Ｍ－ＣＳＦを総体積（１００ｍｌ）中５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。３～４日ごとに、培養物体積の１：２希釈で新鮮な培地（７日前未満に調製）のさらなる再供給を行い、最終５ｎｇ／ｍｌでＭ－ＣＳＦを添加した。Ｔ７５ ＵＬＡフラスコ中で培養物が約１５０ｍｌに達したときに、培養物を新しいフラスコに分割し、３～４日ごとに前回と同様に再供給した。この手順に従って、１ヶ月で、増殖中のＺＭＡＣ培養物を含む３つのＴ７５ ＵＬＡフラスコを確立した。３つのフラスコ中の細胞数は、フラスコあたり約３×１０６個の細胞を明らかにした。この時点から、細胞の一部を同じＴ７５ ＵＬＡフラスコに保持するか、または数個の新しいＴ７５ ＵＬＡに拡大させ、同じスキームに従って再供給した。フラスコ内で約１５０ｍｌの培養物体積に達したときに、細胞を遠心分離によって収集し、計数し、部分的に同じフラスコに再播種した（約４×１０４細胞／ｍｌで播種、フラスコあたり１．２～２×１０６細胞）。細胞の一部を、細胞の新しい凍結ストック（９０％ウシ胎仔血清および１０％ＤＭＳＯ中に３．５～５×１０６細胞／ｍｌを含む）を調製するため、または代替培養容器を試験するために使用した。ＺＭＡＣ培養開始から２ヶ月の間に、凍結細胞の８つのクライオバイアルを得ることができた。これらのうちの２つが首尾よく復活し、細胞が新しいフラスコに拡大し、細胞を凍結するために使用した条件が適切であったことを示した。
Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅでのＺＭＡＣ細胞培養物の確立およびＡＳＦＶ感受性試験
Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（１００５ Ｎ．Ｗａｒｓｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓｕｉｔｅ ３０５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ６３１３２）によって提供されたＺＭＡＣ細胞のバイアルを液体窒素貯蔵から復活させた。手短に言えば、細胞を３７℃（すなわち摂氏）で急速に解凍し、１０ｍｌの温かい培養培地に添加し、３３０ｘｇおよび４℃で７分間遠心分離して凍結培地を除去し、次いで、Ｔ７５超低接着（ＵＬＡ）フラスコにおいて合計５０ｍｌの培地および５ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ中で培養した。３日後、培養物に新しい培地を１：２希釈で再供給し、Ｍ－ＣＳＦを総体積（１００ｍｌ）中５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。３～４日ごとに、培養物体積の１：２希釈で新鮮な培地（７日前未満に調製）のさらなる再供給を行い、最終５ｎｇ／ｍｌでＭ－ＣＳＦを添加した。Ｔ７５ ＵＬＡフラスコ中で培養物が約１５０ｍｌに達したときに、培養物を新しいフラスコに分割し、３～４日ごとに前回と同様に再供給した。この手順に従って、１ヶ月で、増殖中のＺＭＡＣ培養物を含む３つのＴ７５ ＵＬＡフラスコを確立した。３つのフラスコ中の細胞数は、フラスコあたり約３×１０６個の細胞を明らかにした。この時点から、細胞の一部を同じＴ７５ ＵＬＡフラスコに保持するか、または数個の新しいＴ７５ ＵＬＡに拡大させ、同じスキームに従って再供給した。フラスコ内で約１５０ｍｌの培養物体積に達したときに、細胞を遠心分離によって収集し、計数し、部分的に同じフラスコに再播種した（約４×１０４細胞／ｍｌで播種、フラスコあたり１．２～２×１０６細胞）。細胞の一部を、細胞の新しい凍結ストック（９０％ウシ胎仔血清および１０％ＤＭＳＯ中に３．５～５×１０６細胞／ｍｌを含む）を調製するため、または代替培養容器を試験するために使用した。ＺＭＡＣ培養開始から２ヶ月の間に、凍結細胞の８つのクライオバイアルを得ることができた。これらのうちの２つが首尾よく復活し、細胞が新しいフラスコに拡大し、細胞を凍結するために使用した条件が適切であったことを示した。
【0178】
５０ｍｌ培地および５ｎｇ／ｍｌ ＭＣＳＦ中約１．２×１０６個の細胞（２．４×１０４細胞／ｍｌ）で開始した２５０ｍｌポリカーボナートエルレンマイヤー（Ｃｏｒｎｉｎｇ参照番号４３１１４）での培養は、これもＴ７５ ＵＬＡと同様の供給スキームを使用したＺＭＡＣ培養物のための良好な容器であることを明らかにし、細胞数は１３日間で４倍に増加し、最後の培養物体積は１２５ｍｌであった。
【0179】
ＺＭＡＣ細胞の培養および培養物のより大きな容器へのアップスケーリング後、ＺＭＡＣ培養物にこの時点から最低３日の間隔で栄養供給し、Ｍ－ＣＳＦ濃度を１０ｎｇ／ｍｌに増加させた。さらに、推奨されるＴ７５ ＵＬＡにおける初期播種細胞濃度は６×１０４／ｍｌである。これらの新しい説明書に従って、Ｔ７５ ＵＬＡ培養物および２５０ｍｌエルレンマイヤー中の細胞は、通常、７～９日間で３倍または４倍と観察された。さらなる約２ヶ月で、これらの増殖条件を使用して、細胞のさらなる８つのクライオバイアルおよび増殖困難後に新たな培養を再開するために使用する他の２つのバイアルを得ることができた。本発明者らは、本発明者らが増殖させたＺＭＡＣ細胞を含む合計１２のクライオバイアルを利用可能である。本発明者らはまた、５６℃で３０分間を超えるウシ胎仔血清（完全培養培地の成分）の不活性化がＺＭＡＣ培養物に有害であり、細胞増殖不良をもたらすことを観察した。したがって、本発明者らは現在、熱不活性化なしで推奨血清を使用している。
【0180】
ＺＭＡＣ細胞を、ＡＳＦＶに対する感受性を試験するために予備アッセイで使用し、ウイルス増殖を支持した。プレートあたり２．２×１０６個のＺＭＡＣ細胞（ウェルあたり２．３×１０４細胞）を含む通常の接着組織培養プレートまたはＵＬＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４５１５－９６ウェルスフェロイドマイクロプレート）のいずれかと、Ｍ－ＣＳＦを添加した完全培地とを使用して、異なるＡＳＦＶ分離株の力価測定を９６ウェルフォーマットで並行して実施した。比較のために、ＡＳＦＶの古典的力価測定法である、９６ウェル組織培養プレート上のブタ骨髄（ＰＢＭ）細胞を用いる同じ力価測定を行った。表１に示すように、通常の接着組織培養プレート中のＺＭＡＣ細胞と比較して、ＵＬＡプレート中のＺＭＡＣ細胞からは少なくとも１ ｌｏｇの力価の有意な増加があり、接着性ＺＭＡＣ細胞がＡＳＦＶに対するいくらかの感受性を喪失することを示唆した。ＵＬＡ容器内の力価も、ＺＭＡＣ細胞において２ ｌｏｇ高い力価を示したＮＨＶ分離株を除いて、ＰＢＭで得られたものにより近かった。
【表1】
【0181】
例４
ＺＭＡＣ細胞培養のスケールアップのための細胞培養条件の最適化
ＺＭＡＣ細胞株の最適な培養条件を特定するために、いくつかの種類の培養培地およびこれらの培地の成分の濃度の改変を検討した。グルコースおよびグルタミン濃度の増加からなるＲＰＭＩ－１６４０に対する改変は、ＺＭＡＣ細胞の増殖速度を最適化することが認められた。５～２０ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のマウス組換えマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および１：３の培養培地体積の希釈を達成するのに十分な体積の新鮮な培地の添加によって、４～５日ごとに細胞培養物を分割することが最適であることが分かった。これらの条件下で、希釈後の０．５～０．８×１０５／ｍｌの細胞濃度を分割時点で維持し、４～５日後に１．４～１．６×１０５／ｍｌの細胞濃度に達した。１０継代後の１ｎｇ／ｍｌのブタ組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の単回添加は、１０継代後の細胞の活発な増殖を維持するのを助けることが認められ、その後、少なくとも１０回のさらなる細胞継代の間、それらの増殖力を維持した。
ＺＭＡＣ細胞培養のスケールアップのための細胞培養条件の最適化
ＺＭＡＣ細胞株の最適な培養条件を特定するために、いくつかの種類の培養培地およびこれらの培地の成分の濃度の改変を検討した。グルコースおよびグルタミン濃度の増加からなるＲＰＭＩ－１６４０に対する改変は、ＺＭＡＣ細胞の増殖速度を最適化することが認められた。５～２０ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度のマウス組換えマクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）および１：３の培養培地体積の希釈を達成するのに十分な体積の新鮮な培地の添加によって、４～５日ごとに細胞培養物を分割することが最適であることが分かった。これらの条件下で、希釈後の０．５～０．８×１０５／ｍｌの細胞濃度を分割時点で維持し、４～５日後に１．４～１．６×１０５／ｍｌの細胞濃度に達した。１０継代後の１ｎｇ／ｍｌのブタ組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の単回添加は、１０継代後の細胞の活発な増殖を維持するのを助けることが認められ、その後、少なくとも１０回のさらなる細胞継代の間、それらの増殖力を維持した。
【0182】
ＺＭＡＣ細胞は接着性であり、組織培養処理した表面で培養した場合、細胞はしっかりと付着する。しかしながら、なんらかの不確定な理由のために、ＺＭＡＣ細胞の培養表面への堅固な付着は、細胞増殖の速度を有意に遅くする。対照的に、細胞が、それらの接着を促進する培養容器で培養された場合、ＺＭＡＣ細胞は緩く接着したコロニーとして効率的に増殖する。この特徴は、単に、非組織培養処理容器または懸濁培養用に設計された疎水性表面を有する容器（懸濁培養用のＳａｒｓｔｅｄｔフラスコ、カタログ番号８３．１８１０．５０２）を使用することによって達成することができる。本発明者らは、ＺＭＡＣ細胞の増殖を最適に促進する組織培養容器の種類がＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（ＵＬＡ）細胞培養フラスコであることを見出した。残念ながら、この容器は高価であり、製造されるフラスコの最大サイズが７５ｃｍ２の増殖面積を有するため、経済的で実用的なスケールアップには適していない。それにもかかわらず、本発明者らは、ＺＭＡＣ細胞の凍結アリコートから出発してＺＭＡＣ細胞培養を開始するための標準プロトコルを開発した。この場合、初期拡大およびこれらのフラスコのいくつかの製造のためにＣｏｒｎｉｎｇのＵＬＡフラスコを使用することが最適である。次いで、１７５ｃｍ２の増殖面積を有するＳａｒｓｔｅｄｔの懸濁培養フラスコなどのより大きな容器に移行することによって、中程度のスケールアップを達成することができる。
【0183】
４×１０６個を含有するＺＭＡＣ細胞の凍結アリコートから出発する典型的な生産操作は、最初に、１０％ウシ胎仔血清および５ｎｇ／ｍｌのマウスＭＣＳＦを添加した３５ｍｌ容量の改変ＲＰＭＩ－１６４０培養培地中で培養に入れたそのようなバイアルからの解凍細胞を含む７５ｃｍ２ ＵＬＡ組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を確立することからなった。細胞を拡大させた後、１６～２０日以内に、フラスコあたり１５０ｍｌの細胞懸濁液の総体積を含む２つのＵＬＡ ７５ｃｍ２フラスコを確立した。細胞培養物の体積のさらなる拡大を、通常の３００ｃｍ２組織培養フラスコを使用することによって達成し、これにより、フラスコあたり＞３００ｍｌの体積の培養が可能になった。しかしながら、この場合、細胞接着を最小限に抑えるために、フラスコの非組織培養処理側が下向きになるようにフラスコをインキュベータ内に配置し、細胞が重力によってフラスコの非組織培養処理された内面に沈降するようにした。ここで図２を参照すると、これらの条件下で、７回の細胞継代後、細胞数の１００倍の拡大が３８日以内に達成された。ｙ軸は総細胞数ｘ１０ｅ６を示し、ｘ軸は培養の日数を示す。４～５日ごとに１：３希釈で細胞を継代することによるその後の拡大は、細胞数の２～３倍の拡大をもたらすはずである。このようにして、細胞株のワーカー細胞シードストックから出発して細胞株の＞２０回の連続継代を可能にする培養方法の改善がなされてきた。より最近では、培養培地の処方に関するさらなる改良が、培養物の体積当たりの細胞収量の２倍の増加をもたらし、これは細胞増殖速度の対応する増加を伴う。この最新の改善は、生産コストを削減するだけでなく、工業規模のスケールアップのプロセスのための細胞培養方法の開発の間に培養工程のさらなる最適化が実現されるという指標も提供する。
【0184】
これに関して、いくつかの種類の細胞培養容器を、効率的なＺＭＡＣ細胞増殖を可能にするためのそれらの適合性について試験した。これらには、使い捨てバイオリアクタ、ＪＲＨポリエチレンバッグなどの細胞培養バッグ、および０．５～１０Ｌの範囲の体積容量を有するより大きな培養容器の使用が含まれた。撹拌培養対静置培養の必要性も調査した。これらの試験は、細胞が撹拌を必要としないことを明らかにした。むしろ、細胞を沈降させ、互いに密接に接触させたときに細胞が最も良好に増殖することは明らかである。これらの試験は、いくつかの安価な種類の容器が、少なくとも初期の中規模でのワクチンの商業生産を可能にするはずである、ＺＭＡＣ細胞の効率的な中規模培養に適していることを明らかにした。本発明者らは、ＺＭＡＣ細胞培養の連続的な方法を可能にするプロトタイプ培養系を有しており、この方法では、これらの確立された培養容器から細胞を採取し、次いで、ウイルス生産により適し、ワクチン製造と適合性の他の容器に移すことができる。確立された培養容器の再供給は、別の回の細胞採取のために、３～４日以内にＺＭＡＣ細胞集団の迅速な拡大を可能にする。現在、細胞が最適な培養条件下で維持されるならば、このプロセスを無期限に繰り返すことができるようである。
【0185】
例５
高レベルのアフリカブタ熱ウイルス複製を支持するブタマクロファージ細胞株
ブタにおけるＡＳＦＶ複製のための主な標的細胞は、単球マクロファージ系統のものであり、分化の中間段階から後期段階に典型的なマーカを発現する。これらの標的細胞を正確に表すブタ細胞株の欠如は、ウイルス宿主相互作用および弱毒生ワクチン株の開発に関する研究を制限する。本発明者らは、ここで、連続的に増殖する成長因子依存性ＺＭＡＣ－４ブタマクロファージ細胞株が、ＡＳＦＶの８つの異なる野外分離株による感染に感受性であることを示す。ＺＭＡＣ－４細胞における複製は、初代ブタ骨髄細胞と同様の動態および同様の高力価で起こった。さらに、本発明者らは、ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶの弱毒株ＯＵＲＴ８８／３の１２継代は、このウイルスが毒性ウイルスによるチャレンジに対して防御を誘導する能力を低下させなかったことを示した。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞は、ＡＳＦＶ複製のための初代細胞の代替物を提供する。
緒言
ＡＳＦＶは、家畜ブタおよび野生イノシシにおいて、ほとんど全ての感染動物の死亡をもたらし得る出血熱を引き起こす。この疾患は、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）科の唯一のメンバーであり、分離株間で異なる１７０～１９３ｋｂｐのゲノム長を有する大きなＤＮＡウイルスによって引き起こされる。ＡＳＦＶは、臨床徴候があったとしてもわずかで、持続的に感染する、イボイノシシおよびオルニトドロス種（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｓｐｐ）のヒメダニ媒介生物が関与する東アフリカの野生生物サイクルに存在する。２００７年にトランスコーカサス地域のＧｅｏｒｇｉａにＡＳＦＶが導入された後、この疾患はロシアに広がり、さらに西ヨーロッパへと広がって、さらに１１か国で感染が起こった（ＯＩＥ ＷＡＨＩＳ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｉｅ．ｉｎｔ／ｗａｈｉｓ＿２／ｐｕｂｌｉｃ／ｗａｈｉｄ．ｐｈｐ／Ｄｉｓｅａｓｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｄｉｓｅａｓｅｈｏｍｅ）。２０１８年に、最初のＡＳＦＶのアウトブレイクが中国で検出され、長距離にわたって急速に広がり、２０１９年の初頭までに全ての省に到達した。アジアのさらなる８か国にさらに拡大すると、世界的なリスクが高まり、アウトブレイクの経済的影響が拡大した。ワクチンが存在しないと、ＡＳＦＶの制御の選択肢が制限される。ワクチンを開発する努力は増加しているが、ウイルスおよび宿主とのその相互作用についての知識の欠如がこのプロセスを妨げている。
高レベルのアフリカブタ熱ウイルス複製を支持するブタマクロファージ細胞株
ブタにおけるＡＳＦＶ複製のための主な標的細胞は、単球マクロファージ系統のものであり、分化の中間段階から後期段階に典型的なマーカを発現する。これらの標的細胞を正確に表すブタ細胞株の欠如は、ウイルス宿主相互作用および弱毒生ワクチン株の開発に関する研究を制限する。本発明者らは、ここで、連続的に増殖する成長因子依存性ＺＭＡＣ－４ブタマクロファージ細胞株が、ＡＳＦＶの８つの異なる野外分離株による感染に感受性であることを示す。ＺＭＡＣ－４細胞における複製は、初代ブタ骨髄細胞と同様の動態および同様の高力価で起こった。さらに、本発明者らは、ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶの弱毒株ＯＵＲＴ８８／３の１２継代は、このウイルスが毒性ウイルスによるチャレンジに対して防御を誘導する能力を低下させなかったことを示した。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞は、ＡＳＦＶ複製のための初代細胞の代替物を提供する。
緒言
ＡＳＦＶは、家畜ブタおよび野生イノシシにおいて、ほとんど全ての感染動物の死亡をもたらし得る出血熱を引き起こす。この疾患は、アスファウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）科の唯一のメンバーであり、分離株間で異なる１７０～１９３ｋｂｐのゲノム長を有する大きなＤＮＡウイルスによって引き起こされる。ＡＳＦＶは、臨床徴候があったとしてもわずかで、持続的に感染する、イボイノシシおよびオルニトドロス種（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｓｐｐ）のヒメダニ媒介生物が関与する東アフリカの野生生物サイクルに存在する。２００７年にトランスコーカサス地域のＧｅｏｒｇｉａにＡＳＦＶが導入された後、この疾患はロシアに広がり、さらに西ヨーロッパへと広がって、さらに１１か国で感染が起こった（ＯＩＥ ＷＡＨＩＳ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｉｅ．ｉｎｔ／ｗａｈｉｓ＿２／ｐｕｂｌｉｃ／ｗａｈｉｄ．ｐｈｐ／Ｄｉｓｅａｓｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｄｉｓｅａｓｅｈｏｍｅ）。２０１８年に、最初のＡＳＦＶのアウトブレイクが中国で検出され、長距離にわたって急速に広がり、２０１９年の初頭までに全ての省に到達した。アジアのさらなる８か国にさらに拡大すると、世界的なリスクが高まり、アウトブレイクの経済的影響が拡大した。ワクチンが存在しないと、ＡＳＦＶの制御の選択肢が制限される。ワクチンを開発する努力は増加しているが、ウイルスおよび宿主とのその相互作用についての知識の欠如がこのプロセスを妨げている。
【0186】
ＡＳＦＶは、分化の中間段階から後期段階に典型的なマーカを発現する単球マクロファージ系統の細胞において主に複製する。これらの細胞の機能を操作することにより、ウイルスは感染に対する宿主の応答を妨げ、調節することができる。この相互作用をよりよく理解することは、ウイルスの免疫回避および病因の機序に関する情報を提供し、したがって、ワクチン開発の基礎となる。これらの研究を追求するための生物学的に関連する細胞株の利用可能性は、遺伝的に均一な細胞株を提供することによって研究を促進するであろう。さらに、この細胞株は、ＡＳＦＶの弱毒生ワクチンの生産のための選択肢、ならびに診断およびウイルス単離のための初代マクロファージ培養物の代替物を提供するであろう。Ｖｅｒｏ、Ｃｏｓ、およびＷＳＬを含む以前に確立された細胞株は、ＡＳＦＶを増殖させるために使用されてきたが、これらの細胞で複製するためのウイルスの適応が必要である。これは、ブタマクロファージまたはブタにおける複製を減少させ得るゲノムの改変をもたらし得る。さらに、これらの樹立された細胞は、感染に対する応答の仕方においてマクロファージとは多くの重要な点で異なる。
【0187】
ＺＭＡＣ－４ブタマクロファージ細胞株は、ブタ胎仔肺マクロファージに由来した。本発明者らはここで、ＡＳＦＶ分離株がＺＭＡＣ－４細胞株において、細胞株へのいかなる適応工程もなしに、初代ブタマクロファージと同様のレベルまで複製することを実証する実験を説明する。さらに、本発明者らは、ＺＭＡＣ－４細胞における生弱毒化ＡＳＦＶ株ＯＵＲＴ８８／３の継代が、毒性ウイルスＯＵＲＴ８８／１によるチャレンジに対してブタにおいて１００％の防御を誘導するこのウイルスの有効性を低下させなかったことを示す。これらの所見は、ＺＭＡＣ－４細胞株が、弱毒生ＡＳＦＶワクチンの研究、診断、および生産に適した細胞株を提供することを示している。
【0188】
材料および方法
ウイルスおよび細胞
ＯＵＲＴ８８／３およびＮＨ／Ｐ６８遺伝子型Ｉ非血球吸着性弱毒化ＡＳＦＶ株、毒性株遺伝子型Ｉ ＯＵＲＴ８８／１、Ｂｅｎｉｎ９７／１、Ｇｅｏｒｇｉａ遺伝子型ＩＩ、Ｍａｌａｗｉ ＬＩＬ ２０／１遺伝子型ＶＩＩＩ、および中等度毒性株であるＤｏｍｉｎｉｃａｎ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ株は以前に記載されている。使用した他のＡＳＦＶ分離株は、Ｔｈｅ Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの参照コレクションで入手可能であった。これらのウイルスは、家畜ブタにおけるアウトブレイクから得られたか、または野外のダニから単離し、最大３継代にわたって初代ブタ骨髄細胞培養で増殖させた。
ウイルスおよび細胞
ＯＵＲＴ８８／３およびＮＨ／Ｐ６８遺伝子型Ｉ非血球吸着性弱毒化ＡＳＦＶ株、毒性株遺伝子型Ｉ ＯＵＲＴ８８／１、Ｂｅｎｉｎ９７／１、Ｇｅｏｒｇｉａ遺伝子型ＩＩ、Ｍａｌａｗｉ ＬＩＬ ２０／１遺伝子型ＶＩＩＩ、および中等度毒性株であるＤｏｍｉｎｉｃａｎ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ株は以前に記載されている。使用した他のＡＳＦＶ分離株は、Ｔｈｅ Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの参照コレクションで入手可能であった。これらのウイルスは、家畜ブタにおけるアウトブレイクから得られたか、または野外のダニから単離し、最大３継代にわたって初代ブタ骨髄細胞培養で増殖させた。
【0189】
細胞株ＺＭＡＣ－４は、ブタ胎仔の肺に由来し、増殖にＭＣＳＦの存在を必要とする非形質転換食細胞からなる。増殖能の低下を示すことなく８ヶ月の期間にわたって７５回を超えて首尾よく継代するその能力によって実証されるように、細胞はオリゴクローナルで、安定である。ＺＭＡＣ－４細胞は、Ａｐｔｉｍｍｕｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．またはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手した。
【0190】
フローサイトメトリ
フローサイトメトリのためのＺＭＡＣ－４細胞の懸濁液の染色は、示されたｍＡｂを含有するＦｌｏｗ ＰＢＳ（ＰＢＳ、１．０％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中での３０分間の氷冷温度でのインキュベーションからなり、各工程は、Ｆｌｏｗ ＰＢＳでの１回の洗浄によって終了した。最初に、ＺＭＡＣ－４細胞を未処理のままにしたか、または示されたブタ分子を認識する以下のモノクローナル抗体の１つに別々に曝露した：ＣＤ１４（ｂｉＧ １０／１４）、ＣＤ１６３（２Ａ１０／１１）、ＣＤ１７２（７４－１２－５５）、ＣＤ２０３ａ（ＰＭ１８－７）、ＰＵ．１（Ｅ．３８８．３）。その後、細胞を、ＰＥに結合したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）および１００ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＦｌｏｗ ＰＢＳ中で連続的にインキュベートした。ＰＵ．１を検出するために、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、前述のように界面活性剤で透過処理した。食作用活性を検出するために、ＺＭＡＣ－４細胞を、Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ ＹＧミクロスフェア２．００マイクロメートル（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）の存在下に培養培地中３７℃で３０分間インキュベートした。対照として、ＺＭＡＣ－４細胞を、１％アジ化ナトリウムの存在下に氷冷温度で同じ粒子と共にインキュベートした。このアッセイにおけるバックグラウンド蛍光を、ミクロスフェアに曝露されていない細胞を使用して検出した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフローサイトメトリ分析を実施した。データ分析およびグラフ表示の作成は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて行った。
フローサイトメトリのためのＺＭＡＣ－４細胞の懸濁液の染色は、示されたｍＡｂを含有するＦｌｏｗ ＰＢＳ（ＰＢＳ、１．０％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中での３０分間の氷冷温度でのインキュベーションからなり、各工程は、Ｆｌｏｗ ＰＢＳでの１回の洗浄によって終了した。最初に、ＺＭＡＣ－４細胞を未処理のままにしたか、または示されたブタ分子を認識する以下のモノクローナル抗体の１つに別々に曝露した：ＣＤ１４（ｂｉＧ １０／１４）、ＣＤ１６３（２Ａ１０／１１）、ＣＤ１７２（７４－１２－５５）、ＣＤ２０３ａ（ＰＭ１８－７）、ＰＵ．１（Ｅ．３８８．３）。その後、細胞を、ＰＥに結合したヤギ抗マウスＩｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２％正常マウス血清（Ｓｉｇｍａ）および１００ｍｇ／ｍｌマウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＦｌｏｗ ＰＢＳ中で連続的にインキュベートした。ＰＵ．１を検出するために、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、前述のように界面活性剤で透過処理した。食作用活性を検出するために、ＺＭＡＣ－４細胞を、Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ ＹＧミクロスフェア２．００マイクロメートル（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）の存在下に培養培地中３７℃で３０分間インキュベートした。対照として、ＺＭＡＣ－４細胞を、１％アジ化ナトリウムの存在下に氷冷温度で同じ粒子と共にインキュベートした。このアッセイにおけるバックグラウンド蛍光を、ミクロスフェアに曝露されていない細胞を使用して検出した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてフローサイトメトリ分析を実施した。データ分析およびグラフ表示の作成は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【0191】
ウイルス感染および力価測定
ＡＳＦＶをブタ骨髄細胞の培養物中の限界希釈によって力価測定し、感染を血球吸着アッセイ（ＨＡＤ）によって、または以前に記載されたようにｐ３０／ｐＣＰ２０４Ｌタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光法によって検出した。ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶ増殖の評価を先に記載されたように実施した。Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１の感染多重度（ＭＯＩ）０．０５で感染させ、異なる感染時間後に細胞を－８０℃で凍結した。細胞を２回の凍結融解サイクルに供した後、同一ブタ由来のブタ骨髄細胞で並行して力価測定した。力価は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％組織培養感染量）として、本明細書に記載の免疫蛍光法によって得、ＨＡＤ力価は、ヘパリン処理したブタ血液から接種材料と共に収集した赤血球の添加によって得た。同じ培養継代からの細胞を使用して、力価測定（３つ組のウェルで）を並行して行った。
ＡＳＦＶをブタ骨髄細胞の培養物中の限界希釈によって力価測定し、感染を血球吸着アッセイ（ＨＡＤ）によって、または以前に記載されたようにｐ３０／ｐＣＰ２０４Ｌタンパク質に対するモノクローナル抗体を使用する免疫蛍光法によって検出した。ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶ増殖の評価を先に記載されたように実施した。Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１の感染多重度（ＭＯＩ）０．０５で感染させ、異なる感染時間後に細胞を－８０℃で凍結した。細胞を２回の凍結融解サイクルに供した後、同一ブタ由来のブタ骨髄細胞で並行して力価測定した。力価は、ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％組織培養感染量）として、本明細書に記載の免疫蛍光法によって得、ＨＡＤ力価は、ヘパリン処理したブタ血液から接種材料と共に収集した赤血球の添加によって得た。同じ培養継代からの細胞を使用して、力価測定（３つ組のウェルで）を並行して行った。
【0192】
ウイルスゲノムの検出
ＤＮＡを、先に記載されたようにＥＤＴＡに収集した全血または死後に収集した組織から抽出し、先に記載されたようにｑＰＣＲによって検出した。
ＤＮＡを、先に記載されたようにＥＤＴＡに収集した全血または死後に収集した組織から抽出し、先に記載されたようにｑＰＣＲによって検出した。
【0193】
動物実験
実験は、Ｔｈｅ Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳＡＰＯ４高度封じ込め施設で実施され、イギリスの動物（科学的処置）法１９８６（Ａｎｉｍａｌ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ ＵＫ １９８６）によって規制された。高い健康状態の飼育場からの８～９週齢（１８～２２ｋｇ）の大型ホワイトおよびランドレース交雑種ブタを実験に使用した。
実験は、Ｔｈｅ Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳＡＰＯ４高度封じ込め施設で実施され、イギリスの動物（科学的処置）法１９８６（Ａｎｉｍａｌ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ ＵＫ １９８６）によって規制された。高い健康状態の飼育場からの８～９週齢（１８～２２ｋｇ）の大型ホワイトおよびランドレース交雑種ブタを実験に使用した。
【0194】
結果
ＺＭＡＣ－４細胞の特徴
ここで図３のパネルＡを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の形態を評価した。ＺＭＡＣ－４細胞の生培養物を倒立位相差顕微鏡で画像化した。元の倍率は４０倍である。形態学的に、ＺＭＡＣ－４細胞は糸状仮足（ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）および葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の存在を示す。ここで図３のパネルＢを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の平均細胞直径および体積を、タイプＳカセットを使用してＭｏｘｉ Ｚ装置で決定した。ＺＭＡＣ－４細胞は、１５μＭの平均細胞直径および１．７ｐＬの平均細胞体積を有する。グラフは、７５，０００個の細胞の分析を表す。ここで図３のパネルＣを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の食作用活性を評価した。パネルＣは、未処理（ビーズなし）のままにしたか、または１％アジ化ナトリウムの存在下に３７℃もしくは氷冷温度で３０分間、ＹＧミクロスフェアに曝露した細胞のフローサイトメトリ分析の結果を示す。ＺＭＡＣ－４細胞の分析は、そのような細胞が食作用性であることを実証する。ここで図３のパネルＤを参照すると、示された分子に特異的な抗体と反応した初代ブタ肺胞マクロファージ（上段）またはＺＭＡＣ－４細胞（下段）のフローサイトメトリ分析が示されている。ＺＭＡＣ－４細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６３およびＣＤ１７２、ＡｓＧＭ１、ならびにＥ－２６（Ｅ２６）ファミリー転写因子ＰＵ．１を含むブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）に特徴的ないくつかの表面マーカを均一に発現する。ＰＵ．１は、正常な骨髄分化において極めて重要な役割を果たすＥ－２６（Ｅ２６）形質転換特異的ファミリーの転写因子である。これは骨髄細胞において最も顕著であり、Ｂ細胞、マクロファージおよび好中球の発生および成熟に関与する。したがって、ＰＵ．１の発現はマクロファージの特徴である。特に、ＺＭＡＣ－４細胞はＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａを発現しないようである。ＣＤ２０３ａの欠如は、ＺＭＡＣ－４細胞が初代肺胞マクロファージほど成熟しないことを示している可能性が高い。ＺＭＡＣ－４細胞は増殖することができるが、一次肺胞マクロファージは増殖しないため、これは予想される。以前の結果は、ＺＭＡＣ－４細胞が、ＰＡＭと同様の動態を有するポリＩＣに応答してＩＦＮ－αを産生することを示した。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞は、ＰＡＭに典型的ないくつかの特性を示す。
ＺＭＡＣ－４細胞の特徴
ここで図３のパネルＡを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の形態を評価した。ＺＭＡＣ－４細胞の生培養物を倒立位相差顕微鏡で画像化した。元の倍率は４０倍である。形態学的に、ＺＭＡＣ－４細胞は糸状仮足（ｆｉｌｉｐｏｄｉａ）および葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）の存在を示す。ここで図３のパネルＢを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の平均細胞直径および体積を、タイプＳカセットを使用してＭｏｘｉ Ｚ装置で決定した。ＺＭＡＣ－４細胞は、１５μＭの平均細胞直径および１．７ｐＬの平均細胞体積を有する。グラフは、７５，０００個の細胞の分析を表す。ここで図３のパネルＣを参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞の食作用活性を評価した。パネルＣは、未処理（ビーズなし）のままにしたか、または１％アジ化ナトリウムの存在下に３７℃もしくは氷冷温度で３０分間、ＹＧミクロスフェアに曝露した細胞のフローサイトメトリ分析の結果を示す。ＺＭＡＣ－４細胞の分析は、そのような細胞が食作用性であることを実証する。ここで図３のパネルＤを参照すると、示された分子に特異的な抗体と反応した初代ブタ肺胞マクロファージ（上段）またはＺＭＡＣ－４細胞（下段）のフローサイトメトリ分析が示されている。ＺＭＡＣ－４細胞は、ＣＤ１４、ＣＤ１６３およびＣＤ１７２、ＡｓＧＭ１、ならびにＥ－２６（Ｅ２６）ファミリー転写因子ＰＵ．１を含むブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）に特徴的ないくつかの表面マーカを均一に発現する。ＰＵ．１は、正常な骨髄分化において極めて重要な役割を果たすＥ－２６（Ｅ２６）形質転換特異的ファミリーの転写因子である。これは骨髄細胞において最も顕著であり、Ｂ細胞、マクロファージおよび好中球の発生および成熟に関与する。したがって、ＰＵ．１の発現はマクロファージの特徴である。特に、ＺＭＡＣ－４細胞はＳＷＣ９／ＣＤ２０３ａを発現しないようである。ＣＤ２０３ａの欠如は、ＺＭＡＣ－４細胞が初代肺胞マクロファージほど成熟しないことを示している可能性が高い。ＺＭＡＣ－４細胞は増殖することができるが、一次肺胞マクロファージは増殖しないため、これは予想される。以前の結果は、ＺＭＡＣ－４細胞が、ＰＡＭと同様の動態を有するポリＩＣに応答してＩＦＮ－αを産生することを示した。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞は、ＰＡＭに典型的ないくつかの特性を示す。
【0195】
ＡＳＦＶは、ＺＭＡＣ－４細胞において初代ブタ骨髄細胞と同様の力価まで複製する。
ＡＳＦＶの野外株による感染に対するＺＭＡＣ－４細胞の感受性を試験するために、これらの細胞における感染を、ブタ骨髄（ＰＢＭ）由来の初代マクロファージ培養物と比較した。ＡＳＦＶの野外分離株による感染感受性を評価するために、遺伝子型Ｉ、ＩＩ、ＶＩＩＩからのＡＳＦＶの８つの野外分離株（ＯＵＲＴ８８／３、ＮＨ／Ｐ６８、Ｂｅｎｉｎ １９９７／１、Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１、Ｍａｌａｗｉ ＬＩＬ ２０／１、Ｔｅｎｇａｎｉ、ＭＯＺ ９４／１、ＺＯＭ ２／８４、Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）の同じウイルスストックを、ＺＭＡＣ－４およびＰＢＭ細胞において並行して三つ組で力価測定した。表２の結果は、ＺＭＡＣ－４細胞の力価測定が、試験した全ての分離株について、ＰＢＭ細胞の力価測定と比較して同様のレベルに達したことを示した。これらの結果は、ＺＭＡＣ－４細胞が初代ブタマクロファージと同様に感染に感受性であることを示した。
ＡＳＦＶの野外株による感染に対するＺＭＡＣ－４細胞の感受性を試験するために、これらの細胞における感染を、ブタ骨髄（ＰＢＭ）由来の初代マクロファージ培養物と比較した。ＡＳＦＶの野外分離株による感染感受性を評価するために、遺伝子型Ｉ、ＩＩ、ＶＩＩＩからのＡＳＦＶの８つの野外分離株（ＯＵＲＴ８８／３、ＮＨ／Ｐ６８、Ｂｅｎｉｎ １９９７／１、Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１、Ｍａｌａｗｉ ＬＩＬ ２０／１、Ｔｅｎｇａｎｉ、ＭＯＺ ９４／１、ＺＯＭ ２／８４、Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）の同じウイルスストックを、ＺＭＡＣ－４およびＰＢＭ細胞において並行して三つ組で力価測定した。表２の結果は、ＺＭＡＣ－４細胞の力価測定が、試験した全ての分離株について、ＰＢＭ細胞の力価測定と比較して同様のレベルに達したことを示した。これらの結果は、ＺＭＡＣ－４細胞が初代ブタマクロファージと同様に感染に感受性であることを示した。
【表2】
【0196】
ＺＭＡＣ－４細胞における血球吸着による力価測定（ＨＡＤ／ｍｌ）の有効性を間接免疫蛍光法（ウイルス初期タンパク質Ｐ３０－ＴＣＩＤ５０／ｍｌに対する）と比較して決定するために、ＡＳＦＶ ＮＨ／Ｐ６８、Ｇｅｏｒｇｉａ ２００７／１およびＢｅｎｉｎ ９７／１の異なる野外分離株を、赤血球を培養培地に添加したＺＭＡＣ－４細胞で並行して力価測定した。ＴＣＩＤ５０力価については、細胞をＰ３０初期ウイルスタンパク質の免疫蛍光検出のために染色し、蛍光顕微鏡下で観察した；力価をＨＡＤ５０として決定するために、接種材料をブタ赤血球と共に細胞に添加し、異なる希釈度での血球吸着ロゼットの存在について光学顕微鏡下でスクリーニングした。細胞を、以前の力価測定と同様に接種の３日後に顕微鏡下で観察した。ここで図４を参照すると、異なる接種希釈度での血球吸着ロゼットの存在をスクリーニングしたところ、表３に示すように、得られた力価は、予想されたように血球吸着を誘発しなかった非血球吸着分離株ＮＨ／Ｐ６８を除いて、両方の力価測定技術を使用して同様の結果を示した。この分離株は、ＣＤ２ｖ／ＥＰ４０２ＲおよびＣ型レクチン／ＥＰ１５３Ｒ遺伝子をコードする遺伝子内に中断を有し、その非血球吸着表現型を説明する。図４に示すように、免疫蛍光法によって推定されたように細胞の最大８０％までの感染率が達成された。
【表3】
【0197】
ＰＢＭ細胞と比較したＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶ複製の動態。
ここで図５を参照すると、ＰＢＭ培養物およびＺＭＡＣ－４培養物への感染後のＡＳＦＶ子孫産生を比較した。図５のｙ軸は力価を示し、ｘ軸は感染後の時間を示す。０．５ｍｌの培養培地中の２×１０５個のＺＭＡＣ細胞を５ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２０６３）に移し、０．００１のＭＯＩでＡＳＦＶ－Ｇｅｏｒｇｉａを接種した。並行して、ウェルあたり０．５ｍｌの培地を含む２４ウェル組織培養プレート中のＰＢＭ培養物も同様のＭＯＩで接種した。両方の細胞型において低いＭＯＩ（０．０５）でＧｅｏｒｇｉａ ２００７／１の同じウイルスストックに感染させ、ＺＭＡＣ－４細胞では０、２４、４８、および７２時間目、ＰＢＭでは０および７２時間目にウイルス増殖を監視した。ＺＭＡＣ－４細胞の力価は徐々に増加し、７２時間後にＰＢＭ培養物に近い力価（ＺＭＡＣ－４では１．４７×１０７／ｍｌおよびＰＢＭでは６．８１×１０６／ｍｌ）に達し、ＡＳＦＶ感染およびウイルスの効果的な産生に対するＺＭＡＣ－４細胞の高い感受性を証明した。
ここで図５を参照すると、ＰＢＭ培養物およびＺＭＡＣ－４培養物への感染後のＡＳＦＶ子孫産生を比較した。図５のｙ軸は力価を示し、ｘ軸は感染後の時間を示す。０．５ｍｌの培養培地中の２×１０５個のＺＭＡＣ細胞を５ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５２０６３）に移し、０．００１のＭＯＩでＡＳＦＶ－Ｇｅｏｒｇｉａを接種した。並行して、ウェルあたり０．５ｍｌの培地を含む２４ウェル組織培養プレート中のＰＢＭ培養物も同様のＭＯＩで接種した。両方の細胞型において低いＭＯＩ（０．０５）でＧｅｏｒｇｉａ ２００７／１の同じウイルスストックに感染させ、ＺＭＡＣ－４細胞では０、２４、４８、および７２時間目、ＰＢＭでは０および７２時間目にウイルス増殖を監視した。ＺＭＡＣ－４細胞の力価は徐々に増加し、７２時間後にＰＢＭ培養物に近い力価（ＺＭＡＣ－４では１．４７×１０７／ｍｌおよびＰＢＭでは６．８１×１０６／ｍｌ）に達し、ＡＳＦＶ感染およびウイルスの効果的な産生に対するＺＭＡＣ－４細胞の高い感受性を証明した。
【0198】
ここで図６を参照すると、本発明者らはまた、ＺＭＡＣ－４培養物がＡＳＦＶ増殖をどれだけ長く維持できるかを評価した。図６のｙ軸は力価を示し、ｘ軸は感染後の日数を示す。０．０５の低いＭＯＩで感染させ、ウイルス子孫産生を５日間にわたって測定した。図６は、５日間にわたるＺＭＡＣ－４細胞でのＡＳＦＶ増殖を示す。子孫力価は、接種後、そのような力価が最大力価に達した培養４日目まで、３ Ｌｏｇ単位を超えて増加し（１．４８×１０４から６．７６×１０７ ＨＡＤ５０／ｍｌに）、５日目にわずかに減少した（２．３２×１０７ ＨＡＤ５０／ｍｌ）。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞で最大ウイルス収量を得るためには４日間の感染が最適であると考えられる。
【0199】
ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶ生弱毒株ＯＵＲＴ８８／３の継代は、ブタにおける毒性ＡＳＦＶによるチャレンジに対する防御応答の誘導を減少させない。
ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶの継代がブタにおけるウイルスの免疫原性を変化させるどうかを決定するために、低い感染多重度（０．１のＭＯＩ）を使用してＺＭＡＣ－４細胞で１２継代にわたって弱毒化遺伝子型Ｉ株ＯＵＲＴ８８／３を培養した。各継代で回収されたウイルスの力価は同様であった。第１２継代後に採取したウイルスを使用して、以下のようにブタを免疫した。
ＺＭＡＣ－４細胞におけるＡＳＦＶの継代がブタにおけるウイルスの免疫原性を変化させるどうかを決定するために、低い感染多重度（０．１のＭＯＩ）を使用してＺＭＡＣ－４細胞で１２継代にわたって弱毒化遺伝子型Ｉ株ＯＵＲＴ８８／３を培養した。各継代で回収されたウイルスの力価は同様であった。第１２継代後に採取したウイルスを使用して、以下のようにブタを免疫した。
【0200】
高い健康状態の飼育場から得られた６匹の非近交系ブタの群に、１０４ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）のＯＵＲＴ８８／３株をＳＡＰＯ４封じ込めでＩＡＨ－Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔにおいて筋肉内（ＩＭ）接種した。一方の群（第１群）には、継代前に１０４ ＴＣＩＤ５０の親ＯＵＲＴ８８／３分離株を筋肉内接種した。他方の群（第２群）には、ＺＭＡＣ－４細胞で１２回継代した１０４ ＴＣＩＤ５０のＯＵＲＴ８８／３分離株を、ＳＡＰＯ４封じ込めでＩＡＨ－Ｐｉｒｂｒｉｇｈｔにおいて筋肉内接種した。ブタを臨床徴候について毎日監視し、本発明者らが利用した基準（例えば、Ｋｉｎｇ Ｋ，Ｃｈａｐｍａｎ Ｄ，Ａｒｇｉｌａｇｕｅｔ ＪＭ，Ｆｉｓｈｂｏｕｒｎｅ Ｅ，Ｈｕｔｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｌｅｎｔ Ａｆｒｉｃａｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：４５９３－６００）に従ってスコア付けした。接種後２１日目に、第１群と第２群の両方のブタに、１０４ ＴＣＩＤ５０の毒性分離株ＯＵＲＴ８８／１を筋肉内投与した。ＯＵＲＴ８８／３で免疫化されていない３匹の対照ブタ（ナイーブ非免疫ブタ）の別の群（第４群）も毒性株ＯＵＲＴ８８／１でチャレンジした。ｑＰＣＲによるウイルス血症の測定のために、ＯＵＲＴ８８／１によるチャレンジ前に毎週、およびチャレンジ後３日間隔で血液試料を採取した。終了時に剖検を実施し、組織試料を収集した。
【0201】
ここで図７を参照すると、ＺＭＡＣ－４細胞で継代したＯＵＲＴ８８／３で免疫した全てのブタ（第２群）および第１群のブタはチャレンジを生き延び、チャレンジ後１６日目から１８日目の間に安楽死させた。臨床スコアは、第１群および第２群のブタについて免疫後非常に低かった。図７のｘ軸はチャレンジ後の日数を示し、ｙ軸は臨床スコアを示す。ここで図８を参照すると、ブタ１１は、免疫後３日目に４０度、免疫後１５日目に４０．２度の体温を有していた。他の４０．０℃を超える体温は観察されなかった。チャレンジ後、ブタ７は、チャレンジ後３日目に４１℃、チャレンジ後１０日目に４０．７℃の体温を示した。ブタ９は、チャレンジ後５日目に４０度の体温を有していた。ブタ１０は、チャレンジの日に４０．１度の体温を有し、ブタ１１は、チャレンジ後４日目に４０．１度、５日目に４０．５度の体温を有していた。全てのブタは、チャレンジ後１６日目から１８日目の終了時まで生存した。２匹のブタ（９および１１）は皮膚の腫脹または跛行を発症し、これらの問題を解決する抗生物質で処置された。ここで図９を参照すると、第１群および第２群のブタの剖検は、肉眼的病変を示さず（すなわち、出血性徴候なし）、ＡＳＦに典型的な脾臓の腫大も示さなかった（図９のＣおよびＤ参照）。
【0202】
図８に戻って参照すると、第１群および第２群のブタとは対照的に、対照非免疫ブタ（第４群）は全て、チャレンジ後４日目までに４０．５度を超える体温を示し、嗜眠および摂餌の減少または無摂餌を伴った。さらに、第４群の全てのブタは、耳周辺の皮膚発赤を示した。ここで図１１を参照すると、第４群（１９、２０および２１）の全てのブタをチャレンジ後５日目に安楽死させた。図７に戻って参照すると、第４群のブタは、感染後３～４日目にＡＳＦＶの典型的な臨床徴候を発症した。図９に戻って参照すると、第４群のブタの剖検は、いくつかのリンパ節における出血（図９のＡ参照）および腫大した出血性脾臓（図９のＢ参照）を含む急性ＡＳＦＶに典型的な徴候を明らかにした。
【0203】
ここで図１０を参照すると、ｙ軸は、毒性ＯＵＲＴ８８／１株によるチャレンジの前後の、ＺＭＡＣ細胞で継代したＯＵＲＴ８８／３で免疫したブタにおける全血１ｍｌ当たりのｌｏｇ １０スケールのゲノムコピーを示す（それぞれ７～１２とラベル付けされた三角形、菱形、円、「ｘ」、およびプラス記号（「＋」）を使用）。対照非免疫ブタにおけるレベルを示す（それぞれＣ１９、Ｃ２０、およびＣ２１とラベル付けされた円、正方形、および三角形を使用）。ｘ軸は、免疫後（ＰＩ）またはチャレンジ後（ＰＣ）の日数を示す。図８に戻って参照すると、ｙ軸は、チャレンジ後の異なる免疫ブタ（それぞれ７～１２とラベル付けされた三角形、菱形、円、「ｘ」、およびプラス記号（「＋」）を使用）ならびに対照非免疫ブタ（それぞれ１９～２１とラベル付けされた円、正方形、および三角形を使用）の直腸温度を示す。
【0204】
ウイルスの複製を監視するために、本明細書で述べるように、血液試料をチャレンジ前に毎週、およびチャレンジ後に３日間隔で採取して、ｑＰＣＲによってウイルスゲノムのレベルを測定した。ここで図１１を参照すると、結果は、ＺＭＡＣ－４細胞で継代したＯＵＲＴ８８／３で免疫した群（第２群）からの４匹のブタ（７、８、９、１０）が、チャレンジ前の血液中で低レベルのウイルスゲノム（１０２～１０４ゲノムコピー／ｍｌ）を有していたことを示した。ｘ軸は免疫後またはチャレンジ後の日数を示し、ｙ軸は血液１ｍｌ当たりのウイルスゲノムコピー数を示す。エラーバーは、４つの技術的複製物からの標準偏差を示す。同じブタ由来の試料を実線で結んでいる。正方形は第２群のブタを示し、星は第１群のブタを示し、三角形はＯＵＲＴ８８／３で免疫化されていない対照ブタ（第４群）を示す。チャレンジ後、４匹のブタが検出可能なウイルスゲノムを有していた。これらのブタのうちで、１２はチャレンジ後３日目に１０５を有しており、他の全ての陽性試料は１０３以下であった。脾臓および扁桃からの試料の分析は、免疫およびチャレンジしたブタ（第１群および第２群）のいずれからの組織においてもウイルスゲノムを検出しなかった。対照的に、対照群（第４群）のブタは、チャレンジ後３日目に血液中で高レベルのウイルスを発症し（３～８×１０６ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、チャレンジ後５日目または６日目までに８×１０７～２×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）に上昇した。対照ブタ（第４群）も、終了時に脾臓に高レベルのウイルスゲノムを有していた（５×１０３～２．７×１０４／ｍｇ）。結論として、ＺＭＡＣ－４細胞で継代したＯＵＲＴ８８／３で免疫したブタ（第２群）は全て、毒性分離株ＯＵＲＴ８８／１によるチャレンジから防御された。
【0205】
考察
ここで、本発明者らは、ＺＭＡＣ－４ブタマクロファージ細胞株がＡＳＦＶ野外分離株による感染に感受性であり、ウイルスが初代ブタマクロファージと同様の動態および同様の力価で複製することを示す。ＡＳＦＶ複製のためのインビボ標的細胞に類似するブタマクロファージ細胞株の欠如は、ウイルス宿主相互作用に関する研究を制限し、弱毒生ワクチンの開発を制限し、ウイルス診断をより複雑にしている。インビボでのＡＳＦＶ複製のための主な標的細胞は、単球およびマクロファージである。細胞培養では、分化の中間段階および後期段階に特徴的なマーカを発現する細胞は感染を受けやすい。ＣＤ１６３は感染に必要であると最初に示唆されたが、その後の試験は、ＣＤ１６３を発現しない単球も感染し得ることを示した。ＣＤ１６３を欠く遺伝子編集ブタは、感染に対して完全に感受性であった。これらのブタの単球およびマクロファージも感染に感受性であり、ＣＤ１６３が必要ではないことが証明された。適切なマクロファージ細胞株の利用可能性は、異なる非近交系ブタ由来の初代細胞に関連する大きな変動を回避する細胞の遺伝的に均一な供給源を提供することによって研究を促進するであろう。ウイルス複製および宿主防御の回避を含む宿主細胞機能のウイルス調節を制限する宿主因子の理解に向けた研究も促進されるであろう。
ここで、本発明者らは、ＺＭＡＣ－４ブタマクロファージ細胞株がＡＳＦＶ野外分離株による感染に感受性であり、ウイルスが初代ブタマクロファージと同様の動態および同様の力価で複製することを示す。ＡＳＦＶ複製のためのインビボ標的細胞に類似するブタマクロファージ細胞株の欠如は、ウイルス宿主相互作用に関する研究を制限し、弱毒生ワクチンの開発を制限し、ウイルス診断をより複雑にしている。インビボでのＡＳＦＶ複製のための主な標的細胞は、単球およびマクロファージである。細胞培養では、分化の中間段階および後期段階に特徴的なマーカを発現する細胞は感染を受けやすい。ＣＤ１６３は感染に必要であると最初に示唆されたが、その後の試験は、ＣＤ１６３を発現しない単球も感染し得ることを示した。ＣＤ１６３を欠く遺伝子編集ブタは、感染に対して完全に感受性であった。これらのブタの単球およびマクロファージも感染に感受性であり、ＣＤ１６３が必要ではないことが証明された。適切なマクロファージ細胞株の利用可能性は、異なる非近交系ブタ由来の初代細胞に関連する大きな変動を回避する細胞の遺伝的に均一な供給源を提供することによって研究を促進するであろう。ウイルス複製および宿主防御の回避を含む宿主細胞機能のウイルス調節を制限する宿主因子の理解に向けた研究も促進されるであろう。
【0206】
重要なことに、ブタマクロファージ細胞株の入手可能性はまた、ウイルスの診断および単離のための初代ブタ細胞の必要性を置き換えることができる。本発明者らは、ＺＭＡＣ－４細胞におけるウイルスの力価測定が初代ブタ骨髄細胞と同様の結果を提供すること、ならびにウイルス力価を決定するためのゴールドスタンダードである血球吸着アッセイおよび免疫蛍光法の両方がこれらの細胞と共に使用できることを示した。したがって、ＺＭＡＣ－４細胞は、ＡＳＦＶ感染のための初代マクロファージ培養物の使用の有効な代替法となり得る。本発明者らはまた、１２継代にわたるＺＭＡＣ－４細胞での生弱毒化ＡＳＦＶ株ＯＵＲＴ８８／３の継代は、並行して実施した試験における継代されなかったＯＵＲＴ８８／３ウイルスと比較して、またはＯＵＲＴ８８／３が同じ経路および用量によって送達された他の実験と比較して、免疫後またはチャレンジ後に生じる臨床徴候またはウイルス血症を増加させなかったことを実証した。ＯＵＲＴ８８／３およびいくつかの他のＡＳＦＶ野外株は、初代マクロファージで得られるものと同様に、適応プロセスなしで、ＺＭＡＣ－４細胞において高力価に増殖する。合わせると、結果は、ＺＭＡＣ－４細胞が、ＡＳＦＶ診断およびワクチン生産のための初代マクロファージまたは他の細胞株の代替物を提供することを証明する。
【0207】
本開示は、前述の図面および説明において詳細に図示および説明されているが、これは例示的なものであり、限定的なものではないと見なされるべきであり、その例示的な実施形態のみが示され、説明されており、本開示の精神の範囲内にある全ての変更および修正が保護されることが望ましいことが理解される。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】