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特表2022-540202動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質および組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-14
(54)【発明の名称】動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質および組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20220907BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220907BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220907BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220907BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20220907BHJP
C07K 14/535 20060101ALI20220907BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20220907BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20220907BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20220907BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20220907BHJP
C12N 15/26 20060101ALN20220907BHJP
C12N 15/27 20060101ALN20220907BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
A61P35/00 ZNA
A61K38/17
A61K9/08
A61K47/36
C07K14/535
C07K14/55
C07K14/54
C12N15/24
C12N15/62 Z
C12N15/26
C12N15/27
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022501173
(86)(22)【出願日】2020-06-22
(85)【翻訳文提出日】2022-01-07
(86)【国際出願番号】 CN2020097441
(87)【国際公開番号】W WO2021008308
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】201910627990.4
(32)【優先日】2019-07-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522010484
【氏名又は名称】北京科諾科服生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】張晋宇
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB11
4C076CC27
4C076EE30G
4C076FF31
4C076GG41
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA23
4C084CA17
4C084CA53
4C084CA56
4C084DA12
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA04
4H045DA12
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質および組成物。融合タンパク質は、３つの異なる遺伝子断片を含む。融合タンパク質は、各種動物の固体腫瘍に対して良好な阻害効果を有し、腫瘍を縮小させることができ、または腫瘍を消失させることさえ可能である。融合タンパク質は、悪性腫瘍の転移をより良く阻害することができ、患者の生活の質を大幅に改善する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質。
【請求項2】
ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片がＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８遺伝子断片に連結している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片がネコまたはイヌから得られる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質およびキトサン溶液を含む、動物の腫瘍を処置するための組成物。
【請求項5】
３０体積％～７０体積％の融合タンパク質溶液および７０体積％～３０体積％のキトサン溶液を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
５０体積％の融合タンパク質溶液および５０体積％のキトサン溶液を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記キトサン溶液が、１重量％～１０重量％のキトサンを含む溶液である、請求項４に記載の組成物。
【請求項8】
前記キトサン溶液が、３重量％～８重量％のキトサンを含む溶液である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記キトサン溶液が、３重量％のキトサンを含む溶液である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗腫瘍薬の技術分野に関し、特に、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質および組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍は特定の細胞が局所組織において異常にクローン増殖し、様々な発がん因子の作用を受けて遺伝子レベルでの正常な増殖調節を失ったことによって形成された新しい有機体である。これらの新しい有機体はほとんどが占拠性の塊状突起であるため、新生物とも呼ばれる。
【0003】
近年、腫瘍を処置するための多くの新しい方法が登場している。現在、一般的で効果的な処置方法として、放射線療法、化学療法、手術、免疫療法などが含まれる。しかしながら、放射線治療および化学療法の重篤な有害反応、手術のリスクが高いこと、固形腫瘍に対する免疫療法の効果が乏しいことなど、まだ問題点もある。
【0004】
本出願人によって以前に出願された係属中の中国特許出願第CN201810104146.9号には、タンパク質ＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２を含み、ＩＬ１２タンパク質：ＧＭＣＳＦタンパク質：ＩＬ２タンパク質の質量比が０．１～１０：０．１～１０：０．１～１０である抗腫瘍薬組成物が開示されている。実用における組成物は様々な固形腫瘍患者の病態コントロールにおいて非常に良好な役割を果たし、一部の患者は完全寛解を達成することさえ可能である。処置中は、患者の体への刺激が少なく、有害反応も軽いため、患者の生活の質が大幅に向上する。ただし、３つのタンパク質の組成物を実用において使用しているため、実際の適用においては１つずつ成分を調製し、それらを割合で混合する必要がある。その結果、調製プロセスが複雑であること、品質管理が困難であること、コストが高いことなどの問題がある。
【0005】
したがって、良好な治癒効果を達成しながら、調製プロセスを減らし、品質管理を改善し、薬剤コストを低減するために、固形腫瘍の病態をより良好に制御する、または、完全にさえ緩和することができる単一成分の抗腫瘍タンパク質薬が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的の１つは、低コスト、高効率および簡便に、動物の腫瘍を処置することができる融合タンパク質を提供することである。
【0007】
上記目的は、以下の手段によって達成される。
【0008】
一態様において、本発明は、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質を提供する。融合タンパク質のアミノ酸配列において、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ、またはＩＬ２、ＩＬ１２およびＧＭＣＳＦ、またはＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２など、遺伝子断片間の連結の順序を変更可能である。３つの遺伝子断片は、直接連結し得るか、または当技術分野で一般的なリンカーと連結し得る。例えば、リンカーは、ＧＳＧＧＳＧ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧなどの柔軟な連結断片であり得る。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ネコまたはイヌから得られるＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片を連結することによって形成されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ネコまたはイヌから得られるＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２遺伝子断片を連結することによって形成されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２遺伝子断片は、ＩＬ１２ａおよびＩＬ１２ｂの２つのサブユニットからなる。一実施形態において、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片は、ネコまたはイヌから得られる。
【0009】
本技術的解決手段により、各種動物の固体腫瘍に対して良好な阻害効果を有する融合タンパク質が得られる。融合タンパク質は腫瘍を縮小させることができ、または腫瘍を消失させることさえ可能である。融合タンパク質は、悪性腫瘍の転移をより良く阻害することができ、患者の生活の質を大幅に改善する。
【0010】
第１の態様において、さらに好ましくは、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片がＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８遺伝子断片と連結される。例えば、いくつかの特定の実施形態において、融合タンパク質は、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ（配列番号１）、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２（配列番号２）、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ（配列番号３）、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２（配列番号４）、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ（配列番号５）、または、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ（配列番号６）である。
【0011】
ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８遺伝子断片は、腫瘍標的化を増強する能力を有する。本技術的解決手段により、融合タンパク質の腫瘍標的化効果をさらに増強することができる。
【0012】
さらに好ましくは、腫瘍は、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、肺がん、肝臓がん、骨肉腫（bone cancer）、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部がん、口腔がん、鼻咽頭がん、皮膚または眼の悪性黒色腫、子宮体がん、卵巣がん、直腸がん、肛門がん、胃がん、精巣がん、子宮がん（uterus cancer）、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、膣がん、外陰がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎臓または尿管がん、腎盂がん、中枢神経系腫瘍、中枢神経系原発悪性リンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、幹肉腫（trunk sarcoma）および基底細胞腫瘍からなる群から選択される１つ以上を含む。いくつかの好ましい実施において、腫瘍は、幹肉腫、基底細胞腫瘍および乳がんである。
【0013】
第２の態様において、上記の第１の態様の融合タンパク質およびキトサン溶液を含む、動物の腫瘍を処置するための組成物を提供する。好ましくは、組成物は、３０体積％～７０体積％の融合タンパク質溶液および７０体積％～３０体積％のキトサン溶液を含む。さらに好ましくは、組成物は、４０体積％～６０体積％の融合タンパク質溶液および６０体積％～４０体積％のキトサン溶液を含む。さらに好ましくは、組成物は、５０体積％の融合タンパク質溶液および５０体積％のキトサン溶液を含む。
【0014】
本技術的解決手段により、処置のために動物の腫瘍に直接注入し得る組成物を得ることができる。いかなる理論にも拘束されないが、組成物において、キトサンは主に増粘剤として作用し、これは融合タンパク質の放出速度を遅延しつつ、溶液の粘度を増加させる。これによって、主要な治療成分としての融合タンパク質の有効な作用時間を延長する。
【0015】
キトサン溶液は、１重量％～１０重量％のキトサンを含む溶液であることがさらに好ましく、２重量％～９重量％のキトサンを含む溶液であることがさらに好ましく、３重量％～８重量％のキトサンを含む溶液であることがさらに好ましい。特定の実施形態において、キトサン溶液中のキトサンの含有量が１重量％、２重量％、３重量％、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、またはそれらの間の任意の範囲もしくは任意の値（整数値または小数値を含むが、これらに限定されない）であり得る。
【0016】
キトサンの含有量の範囲を調整することにより、組成物の粘度および融合タンパク質の放出速度を調整することができるため、目的の処置を実行し得る。
【0017】
さらに好ましくは、融合タンパク質溶液は４０体積％～６０体積％であり、キトサン溶液は７０体積％～３０体積％である。より好ましくは、融合タンパク質溶液は５０体積％であり、キトサン溶液は５０体積％である。いくつかの実施形態では組成物において、融合タンパク質溶液は３０体積％、３１体積％、３２体積％、３３体積％、３４体積％、３５体積％、３６体積％、３７体積％、３８体積％、３９体積％、４０体積％、４１体積％、４２体積％、４３体積％、４４体積％、４５体積％、４６体積％、４７体積％、４８体積％、４９体積％、５０体積％、５１体積％、５２体積％、５３体積％、５４体積％、５５体積％、５６体積％、５７体積％、５８体積％、５９体積％、６０体積％、６１体積％、６２体積％、６２体積％、６４体積％、６５体積％、６６体積％、６７体積％、６８体積％、６９体積％、７０体積％、または、それらの間の任意の範囲もしくは任意の値であり得る。キトサン溶液は、３０体積％、３１体積％、３２体積％、３３体積％、３４体積％、３５体積％、３６体積％、３７体積％、３８体積％、３９体積％、４０体積％、４１体積％、４２体積％、４３体積％、４４体積％、４５体積％、４６体積％、４７体積％、４８体積％、４９体積％、５０体積％、５１体積％、５２体積％、５３体積％、５４体積％、５５体積％、５６体積％、５７体積％、５８体積％、５９体積％、６０体積％、６１体積％、６２体積％、６２体積％、６４体積％、６５体積％、６６体積％、６７体積％、６８体積％、６９体積％、７０体積％、または、それらの間の任意の範囲もしくは任意の値であり得る。
【0018】
キトサン溶液に対する融合タンパク質溶液の相対体積比を調整することにより、組成物の粘度および融合タンパク質の放出速度を調整することができるため、目的の処置を実行し得る。
【0019】
以上の本技術的解決手段により、本発明は以下の有利な効果を奏する。
【0020】
１）本発明の融合タンパク質は単一のタンパク質であり、その成分は非常に良好な相乗効果を有し、互いの効果を増強しながら、それらの成分それぞれの毒性および副作用も完全に阻害する。
【0021】
２）調製プロセスが簡便であり、プロセスの品質管理が容易であり、金額およびコストの面で有利である。
【0022】
３）本発明の融合タンパク質を各種の腫瘍の処置に使用するとき、主成分を薬剤溶液中で調製した後、腫瘍に直接注入する。これは、強い標的化効果を有し、有害反応はわずかまたは全くない。
【0023】
４）融合タンパク質は各種の固形腫瘍に対して良好な阻害効果を有し、腫瘍を縮小させることができ、または腫瘍を消失させることさえ可能である。融合タンパク質は、悪性腫瘍の転移をより良く阻害することができ、患者の生活の質を大幅に改善する。
【0024】
以下、本発明の好ましい実施形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。これらの添付の図面は例示の目的だけのものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを当業者であれば理解するのであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明のいくつかの具体的な実施形態について、添付の図面および実施例を参照して説明する。これらの実施例は本発明の解決手段がどのように実施され得るかを例示する目的だけのものであり、いかなる形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを当業者であれば理解するのであろう。
【0027】
一実施形態において、本発明は、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ遺伝子断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質を提供する。
【0028】
融合タンパク質において、ＩＬ１２はインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）の遺伝子断片であり、広範囲の生物学的活性を有するサイトカインであり、活性化炎症細胞により主に産生される。ＩＬ１２遺伝子断片のコード領域はＩＬ１２ａおよびＩＬ１２ｂの２つのサブユニットを含み、Ｔ２Ａ配列と連結し得る。ＩＬ１２は免疫系においてＴ細胞を制御する役割を担い、活性化Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり、身体の免疫応答、抗ウイルス感染などにおいて重要な役割を果たす。現在、ＩＬ１２は転移性黒色腫および腎細胞がんを含む特定のがんの処置について承認されている。しかしながら、現在、ＩＬ１２の単独適用にはいくつかの欠点がある。ＩＬ１２は発熱、嘔吐などの全身症状を引き起こすことがある。また、ＩＬ１２は、水および塩代謝の障害、ならびに、腎臓、肝臓、心臓、肺などの機能異常を導くこともある。もっとも一般的で重篤な結果は毛細血管漏出症候群であり、患者への処置を中断せざるを得ない。したがって、有害反応を軽減するために、通常は併用投与が必要である。
【0029】
融合タンパク質において、ＩＬ２はインターロイキン－２の遺伝子断片である。ＩＬ２は比較的強い抗腫瘍活性（ＩＬ１２よりも強い）を有し、副作用も比較的軽微である。しかしながら、本発明者が行った多数の実験において、ＩＬ２を単独で使用したときに、依然として多くの問題がある。例えば、ＩＬ２は用量依存性であり、一連の処置において比較的高用量のＩＬ２が必要となる。これは、高コストであり、貧血、血小板減少などを引き起こし易い。
【0030】
融合タンパク質において、ＧＭＣＳＦは顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子の遺伝子断片であり、骨髄幹細胞の成熟顆粒球への増殖および分化を刺激し、骨髄幹細胞の、顆粒球（好中球顆粒球および好酸性顆粒球を含む）、赤血球細胞、巨核球、骨髄性単球および単球の共通前駆細胞への分化を促進し、上記系列の造血幹細胞の増殖および成熟を促進する。しかしながら、好塩基性顆粒球に対しての作用は非自明であり、赤血球に発展する造血細胞（erythroid advanced hematopoietic cell）に対する作用はわずかであるという欠点が存在する。
【0031】
上記の理由から、有効な相乗効果を利用しつつ、毒性および副作用を減少させるために、種々のサイトカインを組み合わせることを本出願人は試みた。多くのスクリーニング作業を通して、上記３つのサイトカイン（すなわち、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ）を組み合わせることにより、それぞれの欠点を回避しつつ、非常に重要な腫瘍処置効果を達成することができることを本発明者は最終的に見出した。現在のメカニズムはまだ不明であるが、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦの間に非常に良好な相乗効果があることを本発明者は観察している。これは、組合せによって、病気の動物の免疫系を刺激して腫瘍細胞を認識して殺滅し、その結果、悪性腫瘍を阻害し、かくして腫瘍を縮小または腫瘍を消失さえさせ、同時に、副作用がほとんど観察されないという点を明らかにしている。
【0032】
この発見に基づき、本発明者は、出願人が先に出願した係属中の出願（中国特許出願第CN201810104146.9号）の内容を完成させた。さらに、本発明者はＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦを組成物に調製するとき、細胞を別々に調製し、それらを培養してそれぞれのタンパク質を得て、最後にタンパク質を混合する必要があることも認識した。これは、複雑な調製プロセス、プロセスの品質管理の困難性、および高コストの問題をもたらした。これに基づいて、本発明者はこれらの問題を解決するために、ＩＬ２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦを融合タンパク質に調製することを提案した。本発明は、この発見に基づいて創作される。
【0033】
以下、具体的な実施形態を参照して、本発明の好ましい実施形態をさらに詳細に説明する。これらの例示である実施例は例示の目的だけのものであり、いかなる形でも本発明を限定することを意図するものではないことを当業者であれば理解するのであろう。
【実施例】
【0034】
〔試薬〕
ＤＭＥＭ培地、１６４０培地およびウシ胎児血清をLife Technologiesから購入した。ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３無血清培地をThermoから購入した。細胞培養フラスコおよび培養プレートをCorningから購入した。ピューロマイシンをChemiconから購入した。制限酵素をTakaraおよびＮＥＢから購入した。リガーゼをＮＥＢから購入した。ＤＮＡポリメラーゼをTakaraから購入した。プラスミド抽出キットおよびゲル精製キット（gel recovery kit）をOmega Biotechから購入した。プライマー合成をSangon Biotech (Shanghai) Co,, Ltd.によって完了し、遺伝子合成および配列決定をLife Technologiesによって完了した。ＩＬ１２およびＩＬ２ ＥＬＩＳＡキットはThermoから購入した。ＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットはSigmaから購入した。キトサン（Ｐｒｏｔｏｓａｎ Ｇ ２１３）はNovaMatrixから購入した。組換えイヌＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２タンパク質ならびに組換えネコＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２タンパク質は、Novus Biologicalsから購入した。
ＤＭＥＭ培地、１６４０培地およびウシ胎児血清をLife Technologiesから購入した。ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３無血清培地をThermoから購入した。細胞培養フラスコおよび培養プレートをCorningから購入した。ピューロマイシンをChemiconから購入した。制限酵素をTakaraおよびＮＥＢから購入した。リガーゼをＮＥＢから購入した。ＤＮＡポリメラーゼをTakaraから購入した。プラスミド抽出キットおよびゲル精製キット（gel recovery kit）をOmega Biotechから購入した。プライマー合成をSangon Biotech (Shanghai) Co,, Ltd.によって完了し、遺伝子合成および配列決定をLife Technologiesによって完了した。ＩＬ１２およびＩＬ２ ＥＬＩＳＡキットはThermoから購入した。ＧＭＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットはSigmaから購入した。キトサン（Ｐｒｏｔｏｓａｎ Ｇ ２１３）はNovaMatrixから購入した。組換えイヌＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２タンパク質ならびに組換えネコＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２タンパク質は、Novus Biologicalsから購入した。
【0035】
〔実施例１〕ＩＬ１２発現細胞の構築
イヌＩＬ１２遺伝子のコード領域を合成した。当該コード領域は、Ｔ２Ａ配列と連結した２つのサブユニットであるＩＬ１２ａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003293）およびＩＬ１２ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003292）を含んだ。合成した遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＩＬ１２プラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量（final volume）まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＩＬ１２遺伝子断片を後の使用のために回収した。
イヌＩＬ１２遺伝子のコード領域を合成した。当該コード領域は、Ｔ２Ａ配列と連結した２つのサブユニットであるＩＬ１２ａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003293）およびＩＬ１２ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003292）を含んだ。合成した遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＩＬ１２プラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量（final volume）まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＩＬ１２遺伝子断片を後の使用のために回収した。
【0036】
発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのプラスミド、３μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、３０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ベクター断片を後の使用のために回収した。
【0037】
ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＩＬ１２と連結した。系は以下の通りであった：２μＬのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ、２μＬのＩＬ１２、１μＬのリガーゼバッファー、０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μＬの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定のために送り、構築が成功したことを確認した。発現ベクターはｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＩＬ１２－ＰＧＫ－ＰＵＲＯであった。
【0038】
調節ベクター（regulatory vector）を含むウイルスを調製した。当該方法を以下に示す。（１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の量は１０ｍｌであった。（２）翌晩、細胞状態を観察し、細胞状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μｍまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水および以下のプラスミド（５μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＩＬ１２－ＰＧＫ－ＰＵＲＯ）を総量１０４５μＬとして加えた。次に、１５５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μＬの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。（３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。（４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を５００μＬのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0039】
２９３細胞を以下の方法によりウイルスでトランスフェクトした。培養した２９３細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、調節ベクターを含むウイルス１０μＬを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続け、次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、細胞に適した濃度のピューロマイシンを加えて培地を続け、培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を３μｇ／ｍｌに維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞は調節タンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３（ＩＬ１２）と命名した。
【0040】
〔実施例２〕ＧＭＣＳＦ発現細胞の構築
イヌＧＭＣＳＦ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003245）遺伝子のコード領域を合成した。合成した遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＧＭＣＳＦプラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＧＭＣＳＦ遺伝子断片を後の使用のために回収した。
イヌＧＭＣＳＦ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003245）遺伝子のコード領域を合成した。合成した遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＧＭＣＳＦプラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＧＭＣＳＦ遺伝子断片を後の使用のために回収した。
【0041】
発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを消化した。系は以下の通りであった：２μｇのプラスミド、３μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、３０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ベクター断片を後の使用のために回収した。
【0042】
ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＧＭＣＳＦと連結した。系は以下の通りであった：２μＬのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ、２μＬのＧＭＣＳＦ、１μＬのリガーゼバッファー、０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μＬの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。次に、連結系をコンピテント大腸菌に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定のために送り、構築が成功したことを確認した。発現ベクターはｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＧＭＣＳＦ－ＰＧＫ－ＰＵＲＯであった。
【0043】
調節ベクターを含むウイルスを調製した。当該方法を以下に示す。（１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の量は１０ｍｌであった。（２）翌晩、細胞状態を観察し、細胞状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μｍまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水および以下のプラスミド（５μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＧＭＣＳＦ－ＰＧＫ－ＰＵＲＯ）を総量１０４５μＬとして加えた。次に、１５５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μＬの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。（３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。（４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を５００μＬのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0044】
２９３細胞を以下の手法によりウイルスでトランスフェクトした。培養２９３細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、調節ベクターを含むウイルス１０μＬを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続け、次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、細胞に適した濃度のピューロマイシンを加えて培養を続け、培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を３μｇ／ｍｌに維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞は調節タンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３（ＧＭＣＳＦ）と命名した。
【0045】
〔実施例３〕ＩＬ２発現細胞の構築
イヌＩＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003305）遺伝子のコード領域を合成した。合成された遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＩＬ２プラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＩＬ２遺伝子断片を後の使用のために回収した。
イヌＩＬ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：NM_001003305）遺伝子のコード領域を合成した。合成された遺伝子は２つの末端にそれぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有した。次に、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ酵素で当該遺伝子を消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのＩＬ２プラスミド、４μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、４０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ＩＬ２遺伝子断片を後の使用のために回収した。
【0046】
発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを消化した。系は以下の通りであった：２μｇのプラスミド、３μＬの酵素消化バッファー、１μＬのＢａｍＨＩ、１μＬのＸｈｏＩ、３０μＬの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μＬの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ベクター断片を後の使用のために回収した。
【0047】
ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＩＬ２と連結した。系は以下の通りであった：２μＬのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯ、２μＬのＩＬ２、１μＬのリガーゼバッファー、０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μＬの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。次に、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定のために送り、構築が成功したことを確認した。発現ベクターはｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＩＬ２－ＰＧＫ－ＰＵＲＯであった。
【0048】
調節ベクターを含むウイルスを調製した。当該方法を以下に示す。（１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の量は１０ｍｌであった。（２）翌晩、細胞状態を観察し、細胞状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μｍまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水および以下のプラスミド（５μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＩＬ２－ＰＧＫ－ＰＵＲＯ）を総量１０４５μＬとして加えた。次に、１５５μＬの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μＬの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。（３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。（４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を５００μＬのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0049】
２９３細胞を以下の手法によりウイルスでトランスフェクトした：培養２９３細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、調節ベクターを含むウイルス１０μＬを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続け、次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた；細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、細胞に適した濃度のピューロマイシンを加えて培養を続け、培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を３μｇ／ｍｌに維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞は調節タンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３（ＩＬ２）と命名した。
【0050】
〔実施例４〕タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦの発現
（４．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（４．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0051】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0052】
ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦをｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μｌのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μｌの遺伝子断片、１μｌのリガーゼバッファー、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μｌの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0053】
（４．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0054】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0055】
３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0056】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0057】
（４．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦと命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦと命名した。
【0058】
（４．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0059】
〔実施例５〕タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２の発現
（５．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２はそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（５．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２はそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0060】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0061】
ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２をｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μｌのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μｌの遺伝子断片、１μｌのリガーゼバッファー、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μｌの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0062】
（５．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0063】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0064】
３）３日目の朝に、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0065】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0066】
（５．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２と命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２と命名した。
【0067】
（５．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0068】
〔実施例６〕タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦの発現
（６．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（６．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0069】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0070】
ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦをｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μｌのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μｌの遺伝子断片、１μｌのリガーゼバッファー、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μｌの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0071】
（６．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0072】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0073】
３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0074】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0075】
（６．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦと命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦと命名した。
【0076】
（６．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0077】
〔実施例７〕タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２の発現
（７．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２はそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（７．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２はそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0078】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0079】
ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２をｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μＬのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μＬの遺伝子断片、１μＬのリガーゼバッファー、０．５μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μＬの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0080】
（７．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0081】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0082】
３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0083】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0084】
（７．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２と命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２と命名した。
【0085】
（７．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0086】
〔実施例８〕タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦの発現
（８．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（８．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0087】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0088】
ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦをｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μｌのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μｌの遺伝子断片、１μｌのリガーゼバッファー、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、および４．５μｌの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターであるｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0089】
（８．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0090】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0091】
３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0092】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0093】
（８．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦと命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦと命名した。
【0094】
（８．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0095】
〔実施例９〕タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦの発現
（９．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
（９．１ 発現ベクターの構築）
タンパク質分子ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦはそのフロントエンドに分泌シグナルペプチドを有し、精製を容易にするためにそのバックエンドに６×Ｈｉｓを加えた。遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、配列中のＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ部位を縮重コドンに変異させた。合成した配列のフロントエンドおよびバックエンドには、それぞれＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を与えた。標的遺伝子を有する合成プラスミドを消化させた。系は以下の通りであった：５μｇのプラスミド、４μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、４０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、４．４μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、断片を後の使用のために回収した。
【0096】
ベクターｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯをＥＰチューブ中で消化させた。系は以下の通りであった：２μｇのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯプラスミドベクター、３μｌの酵素消化バッファー、１μｌのＢａｍＨＩ、１μｌのＸｈｏＩ、３０μｌの最終量まで水を補充。混合物を３７℃において１２時間静置した。ＥＰチューブを取り出し、３．３μｌの１０×ローディングバッファーを加えた。そして、得られた混合物を１％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、ｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片を後の使用のために回収した。
【0097】
ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦをｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯと連結した。系は以下の通りであった：２μｌのｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯベクター断片、２μｌの遺伝子断片、１μｌのリガーゼバッファー、０．５μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および４．５μｌの水。混合物を室温に置き、４時間連結させた。そして、連結系をコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。２日目に、形質転換プレートから細菌コロニーを採集し、ＬＢ培地に接種し、シェーカーにおいて３７℃で一晩培養した。プラスミド抽出キットを使用して、培養した細菌からプラスミドを抽出した。酵素消化を行って、断片がベクターにうまく連結されたかどうかを決定し、次いで、正しいベクターを配列決定し、構築が成功したことを確認した。発現ベクターであるｐＬｅｎｔｉｓ－ＣＭＶ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ－ＩＲＥＳ－ＰＵＲＯを得た。
【0098】
（９．２ 発現ウイルスの調製）
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
１）培養した２９３ＦＴ細胞を消化させ、計数後、３×１０６細胞／ウェルを１０ｃｍ培養皿に広げ、培養液の体積は１０ｍｌであった。
【0099】
２）翌晩、細胞の状態を観察し、細胞の状態が良好であれば、細胞にトランスフェクトすることができた。クロロキンを培養プレートに最終濃度２５μＭまで加えた。１つの試験管を取り出し、滅菌水を加え、以下のプラスミド（６μｇのｐＭＤ２．Ｇ＋１５μｇのｐＳＰＡＸ２＋２０μｇの発現ベクター）を総量１０４５μｌとして加えた。次に、１５５μｌの２Ｍ ＣａＣｌ２を加え、均一に混合し、最後に１２００μｌの２×ＨＢＳを加えた。これらの成分を滴加しながら試験管を振動させた。滴加終了後、混合物を速やかに細胞培養ウェルに加え、穏やかに振盪させ、均一に混合した。
【0100】
３）３日目の朝、細胞状態を観察し、培地を１０ｍｌの新鮮なＤＭＥＭ培地に置換した。
【0101】
４）５日目の朝、細胞状態を観察した。培養皿中の上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過した後、高速遠心管に入れて、５００００ｇで２時間遠心分離した。上清を慎重に廃棄し、吸収紙で可能な限り液体を吸収させた後、沈殿物を２００μｌのＨＢＳＳで再懸濁し、２時間溶解させ、小さなチューブに充填し、－７０℃で保存した。
【0102】
（９．３ 発現細胞の調製）
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦと命名した。
培養した２９３Ａ細胞を消化させ、１ｍｌの培地量で、１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに播種した。２４時間後、上記標的遺伝子を発現するウイルス１０μｌを加え、インキュベーター中でさらに２４時間培養を続けた。次いで上清を廃棄し、培地を新鮮な培地に置き換えて培養を続けた。細胞が一杯になった後、細胞を培養フラスコに移し、３μｇ／ｍｌの最終濃度のピューロマイシンを加えて培養を続けた。培地を２日ごとに置き換え、ピューロマイシンの濃度を維持した。１週間のスクリーニング後、生存している細胞はタンパク質を安定して発現する細胞であり、２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦと命名した。
【0103】
（９．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【0104】
〔実施例１０〕ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦによるイヌ腫瘍の処置例
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。３つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。３つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0105】
注：「ｃ」は融合タンパク質がイヌタンパク質であることを示し、これは全文において同じであった。
【0106】
１０歳齢のディアドッグ（deer dog）は、６５ｍｍ×６５ｍｍ×５５ｍｍの大きさの右前肢肉腫を有していた（図１参照）。表１に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は８５％減少した。腫瘍体積は約９５％減少した（図２参照）。投与後、体温は正常で、その他の有害反応は観察されなかった。
【0107】
〔実施例１１〕ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２によるイヌの腫瘍の処置例
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルの量で充填した。混合物は使用直前に混合した。３つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルの量で充填した。混合物は使用直前に混合した。３つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0108】
【表1】
【0109】
１３歳齢のサモエドドッグ（samoyed dog）は甲状腺がんに罹患し、腫瘍の大きさは約１４０ｍｍ×９０ｍｍであった。表２に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は８０％減少した。投与後、体温は正常で、その他の有害反応は観察されなかった。
【0110】
〔実施例１２〕ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦによるネコ腫瘍の処置例
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0111】
【表2】
【0112】
注：「ｆ」は融合タンパク質がネコタンパク質であることを示し、これは全文において同じであった。
【0113】
１２歳齢の雑種猫は乳房基底細胞がんに罹患し、腫瘍の大きさは４５ｍｍ×３５ｍｍであった。表２に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は９５％減少した。投与後、体温は正常で、その他の有害反応は観察されなかった。
【0114】
〔実施例１３〕ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２によるネコ腫瘍の処置例
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルに充填した。混合物は使用直前に混合した。１つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注射し、腫瘍内注射を３０日に１回、３回連続して行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで、１ｍｌ／バイアルに充填した。混合物は使用直前に混合した。１つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注射し、腫瘍内注射を３０日に１回、３回連続して行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0115】
【表3】
【0116】
１１歳齢の雑種猫は舌根部が扁平上皮がんに罹患し、腫瘍の大きさは２５ｍｍ×２０ｍｍであった。表４に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は８０％減少した。投与後、体温は正常で、その他の有害反応は観察されなかった。
【0117】
〔実施例１４〕ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦによるイヌ腫瘍の処置例
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0118】
【表4】
【0119】
１２歳齢の雑種犬は乳がんに罹患し、腫瘍の大きさは７８ｍｍ×６０ｍｍであった。表３に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は８７％減少した。投与後、体温は正常で、発熱などの有害反応は観察されなかった。
【0120】
〔実施例１５〕ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦによるネコ腫瘍の処置例
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
精製したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ融合タンパク質溶液を、１：１の体積比で３％キトサンと混合し、次いで１ｍｌ／バイアルで充填した。混合物は使用直前に混合した。２つのバイアルの試薬を毎回腫瘍内に注入し、腫瘍内注入は１５日に１回、３回連続で行った。腫瘍の大きさは以下のように記録した。
【0121】
【表5】
【0122】
１３歳齢の雑種猫は乳がんに罹患し、腫瘍の大きさは５５ｍｍ×４５ｍｍであった。表４に示すように、３回の腫瘍内注入後、腫瘍面積は８８％減少した。投与後、体温は正常で、発熱などの有害反応は観察されなかった。
【0123】
実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を限定することを意図しない。明細書を読んだ後、当業者は必要に応じて実施例に創造的に寄与することなく改変し得るが、当該改変が本発明の特許請求の範囲内にある限り、当該改変は特許法によって保護される。
【図1】
【図2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-01-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質。
【請求項2】
ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片がＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ペプチド断片に連結している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片がネコまたはイヌから得られる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質およびキトサン溶液を含む、動物の腫瘍を処置するための組成物。
【請求項5】
３０体積％～７０体積％の融合タンパク質溶液および７０体積％～３０体積％のキトサン溶液を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
５０体積％の融合タンパク質溶液および５０体積％のキトサン溶液を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
前記キトサン溶液が、１重量％～１０重量％のキトサンを含む溶液である、請求項４に記載の組成物。
【請求項8】
前記キトサン溶液が、３重量％～８重量％のキトサンを含む溶液である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記キトサン溶液が、３重量％のキトサンを含む溶液である、請求項８に記載の組成物。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0008】
一態様において、本発明は、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質を提供する。融合タンパク質のアミノ酸配列において、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦ、またはＩＬ２、ＩＬ１２およびＧＭＣＳＦ、またはＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２など、ペプチド断片間の連結の順序を変更可能である。３つのペプチド断片は、直接連結し得るか、または当技術分野で一般的なリンカーと連結し得る。例えば、リンカーは、ＧＳＧＧＳＧ、ＧＳＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＧＳＧＧＧなどの柔軟な連結断片であり得る。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ネコまたはイヌから得られるＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片を連結することによって形成されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、融合タンパク質は、ネコまたはイヌから得られるＩＬ１２、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ２ペプチド断片を連結することによって形成されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２ペプチド断片は、ＩＬ１２ａおよびＩＬ１２ｂの２つのサブユニットからなる。一実施形態において、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片は、ネコまたはイヌから得られる。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0010】
第１の態様において、さらに好ましくは、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片がＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ペプチド断片と連結される。例えば、いくつかの特定の実施形態において、融合タンパク質は、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ（配列番号１）、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２（配列番号２）、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ（配列番号３）、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２（配列番号４）、ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ（配列番号５）、または、ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ＧＭＣＳＦ（配列番号６）である。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0011】
ＤｉａＮＨＳ７６Ｆ８ペプチド断片は、腫瘍標的化を増強する能力を有する。本技術的解決手段により、融合タンパク質の腫瘍標的化効果をさらに増強することができる。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0027】
一実施形態において、本発明は、ＩＬ１２、ＩＬ２およびＧＭＣＳＦペプチド断片を含む、動物の腫瘍を処置するための融合タンパク質を提供する。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0028】
融合タンパク質において、ＩＬ１２はインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）であり、広範囲の生物学的活性を有するサイトカインであり、活性化炎症細胞により主に産生される。ＩＬ１２のコード領域はＩＬ１２ａおよびＩＬ１２ｂの２つのサブユニットを含み、Ｔ２Ａ配列と連結し得る。ＩＬ１２は免疫系においてＴ細胞を制御する役割を担い、活性化Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり、身体の免疫応答、抗ウイルス感染などにおいて重要な役割を果たす。現在、ＩＬ１２は転移性黒色腫および腎細胞がんを含む特定のがんの処置について承認されている。しかしながら、現在、ＩＬ１２の単独適用にはいくつかの欠点がある。ＩＬ１２は発熱、嘔吐などの全身症状を引き起こすことがある。また、ＩＬ１２は、水および塩代謝の障害、ならびに、腎臓、肝臓、心臓、肺などの機能異常を導くこともある。もっとも一般的で重篤な結果は毛細血管漏出症候群であり、患者への処置を中断せざるを得ない。したがって、有害反応を軽減するために、通常は併用投与が必要である。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0029】
融合タンパク質において、ＩＬ２はインターロイキン－２である。ＩＬ２は比較的強い抗腫瘍活性（ＩＬ１２よりも強い）を有し、副作用も比較的軽微である。しかしながら、本発明者が行った多数の実験において、ＩＬ２を単独で使用したときに、依然として多くの問題がある。例えば、ＩＬ２は用量依存性であり、一連の処置において比較的高用量のＩＬ２が必要となる。これは、高コストであり、貧血、血小板減少などを引き起こし易い。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0030】
融合タンパク質において、ＧＭＣＳＦは顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子であり、骨髄幹細胞の成熟顆粒球への増殖および分化を刺激し、骨髄幹細胞の、顆粒球（好中球顆粒球および好酸性顆粒球を含む）、赤血球細胞、巨核球、骨髄性単球および単球の共通前駆細胞への分化を促進し、上記系列の造血幹細胞の増殖および成熟を促進する。しかしながら、好塩基性顆粒球に対しての作用は非自明であり、赤血球に発展する造血細胞（erythroid advanced hematopoietic cell）に対する作用はわずかであるという欠点が存在する。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0067】
（５．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２発現細胞２９３Ａ－ｃＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0076】
（６．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦ発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＩＬ２ＧＭＣＳＦを１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0085】
（７．４ タンパク質の発現および精製）
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
構築したｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２発現細胞２９３Ａ－ｆＩＬ１２ｂＩＬ１２ａＧＭＣＳＦＩＬ２を１５ｃｍ培養皿で継代培養した。細胞が一杯になった後、培地を３０ｍｌのＣＤＭ４ＨＥＫ２９３で置き換え、さらに５日間培養を続けた。次いで上清を回収し、０．４５μｍフィルターでろ過し、限外ろ過し、５０ｋｄのＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－１５で濃縮した。得られた濃縮タンパク質溶液をニッケルキレート磁性ビーズ（Beaver Biosciences Inc.）で精製し、指示書に従って操作フローを行った。得られた精製タンパク質溶液をＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ－０．５限外ろ過チューブで限外ろ過し、バッファーをＰＢＳで置き換えた。最終的に得られたタンパク質溶液のタンパク質濃度を、ＩＬ１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡキットを使用して検出した。ＰＢＳによりタンパク質濃度を２μｇ／μｌに調整した後、タンパク質溶液を充填し、－２０℃で保存した。
【国際調査報告】