特表 2022-540267 ＣＩＭＬ ＮＫ細胞及びそれについての方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-15

(54)【発明の名称】ＣＩＭＬ ＮＫ細胞及びそれについての方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0783 20100101AFI20220908BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220908BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220908BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220908BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0783

C12N5/10

A61K35/17 Z

A61P35/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021534175

(86)(22)【出願日】2019-07-08

(85)【翻訳文提出日】2021-06-14

(86)【国際出願番号】 US2019040889

(87)【国際公開番号】W WO2021006876

(87)【国際公開日】2021-01-14

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520393015

【氏名又は名称】イミュニティーバイオ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ロヒット、ダッガール

(72)【発明者】

【氏名】ランジート、シンハ

(72)【発明者】

【氏名】ウェンチャオ、リー

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン、アイザックソン

(72)【発明者】

【氏名】パトリック、スン－シオン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BB19

4B065BC12

4B065BD39

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB34

4C087BB37

4C087BB59

4C087BB64

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZB26

(57)【要約】

増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞が提示される。最も典型的には、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、末梢血又は臍帯血の単核球画分に由来する。さらに検討された態様では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、操作上の複雑性及び産生コストを実質的に低減する、収容される自動化された産生環境下で拡大され、誘導される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を産生する方法であって、
生体液から単核球の混合物を単離し、且つＮＫ細胞を拡大するため、前記単核球の前記混合物を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させるステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含む方法。

【請求項2】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を再刺激後、前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞をＮ－８０３と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記生体液が、全血又は臍帯血である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ＮＫ細胞を濃縮するため、単核球の前記混合物がさらに処理されない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記単核球の前記混合物が、約１００～５００×１０^６個の細胞を含有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記混合物を接触させるステップが、約１００～３００ｍｌの間の体積で、又は約１×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度で実施される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記混合物を接触させるステップにおける前記抗ＣＤ１６抗体が、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記混合物を接触させるステップにおける前記Ｎ－８０３が、０．１～１．０ｎＭの間の濃度で存在する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記混合物を接触させるステップが、前記単核球の前記混合物を抗ＣＤ３抗体と接触させるステップをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗ＣＤ３抗体が、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記刺激性サイトカイン組成物が、前記ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記刺激性サイトカイン組成物が、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の前記混合物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記刺激性サイトカイン組成物が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の前記混合物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＮＫ細胞が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数まで拡大される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記拡大されたＮＫ細胞を刺激性サイトカイン組成物と接触させる前記ステップが、前記ＮＫ細胞を拡大する前記ステップと同じ容器内で実施される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を形成するため、ＮＫ細胞を活性化する方法であって、
全血又は臍帯血の単核球から拡大された、拡大されたＮＫ細胞を準備するステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含む、方法。

【請求項17】

前記ＮＫ細胞が、全血から拡大される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＮＫ細胞が、臍帯血から拡大される、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記ＮＫ細胞が、前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体に対して自己である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記刺激性サイトカイン組成物が、前記ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記刺激性サイトカイン組成物が、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の前記混合物を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記刺激性サイトカイン組成物が、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の前記混合物を含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記拡大されたＮＫ細胞が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数を有する、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を有する、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ１６の低下した発現を有する、請求項１６～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＴＩＧＩＴの低下した発現を有する、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１の増加した発現を有する、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示す、増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞。

【請求項29】

Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ１６の低下した発現を有する、請求項２８に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項30】

Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＴＩＧＩＴの低下した発現を有する、請求項２８に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項31】

Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１の増加した発現を有する、請求項２８に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項32】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体に対して自己細胞である、請求項２８に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項33】

組換えＮＫ細胞である、請求項２８に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項34】

ＣＤ１６若しくはその変異体、ＩＬ－２若しくはその変異体、及び／又はＩＬ－１５若しくはその変異体を組換え核酸から発現する、請求項３３に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項35】

薬学的に許容できる担体を、請求項２８～３４のいずれか一項に記載のサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞と組み合わせて含む、医薬組成物。

【請求項36】

薬剤中での、請求項２８～３４のいずれか一項に記載のサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞の使用。

【請求項37】

がんの治療における、請求項２８～３４のいずれか一項に記載のサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞の使用。

【請求項38】

それを必要とする個体をサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞で治療する方法であって、請求項２８～３４のいずれか一項に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞を治療有効量で投与するステップを含む、方法。

【請求項39】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、前記個体の自己細胞である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、末梢血又は臍帯血由来ＮＫ細胞である、請求項３８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、活性化された免疫能細胞を作製及び／又は培養するための組成物、方法、及びデバイスに関し、特にそれは、臍帯血（ＣＢ）又は末梢血（ＰＢ）から産生されるメモリー様ＮＫ細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

背景説明は、本開示を理解するのに有用であってもよい情報を含む。本明細書に提供される情報のいずれもが先行技術であるか若しくは以前に請求された発明に関連すること、又は具体的若しくは暗黙的に参照されるいずれの刊行物も先行技術であることは、承認ではない。

【0003】

本明細書中のすべての刊行物及び特許出願は、あたかも各個別の刊行物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示された場合と同程度まで参照により援用される。援用された参考文献における用語の定義又は使用が矛盾があるか又は本明細書に提供されるその用語の定義に反する場合、本明細書に提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。

【0004】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫細胞のグループを成し、それらは、グラニュライシン及びパーフォリンの標的特異的放出を介して抗体依存性細胞毒性を示す細胞傷害性リンパ球として特徴づけられることが多い。大部分のＮＫ細胞が、様々な活性化及び阻害性受容体のコレクションに加えて、特異的な細胞表面マーカー特性（例えば、ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋、ＣＤ１６^＋、ＣＤ５７^＋、ＣＤ８^＋）を有する。より最近、ＮＫ細胞が特定のがん治療の有意な成分になっている一方で、ＮＫ細胞（及び特に自己ＮＫ細胞）の有意な量での産生は、全血中のＮＫ細胞の画分が比較的低いことから、有意な障害になっている。

【0005】

ＮＫ及びＮＫ様細胞を治療的有効量で得るため、ＮＫ細胞は、様々な前駆細胞から作製され得る。例えば、様々な幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５は、臍帯血由来サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞を誘導及び拡大するための様々なインビトロ手法において報告されている（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：３４９３－３５００（２０１０））。同様に、ＣＤ３４^＋造血細胞は、米国特許出願公開第２０１８／００４４６３６号明細書に報告されている通り、ＩＬ－１２及び他の作用剤に曝露され得る。さらに他の手法では、ヒト血球血管芽細胞は、国際公開第２０１１／０６８８９６号パンフレットに記載の通り、２つの異なるサイトカインカクテルに経時的に曝露され、国際公開第２０１２／１２８６２２号パンフレットに教示の通り、異なるサイトカインカクテルが後胚期の造血幹細胞とともに使用された。これら方法の少なくとも一部がＮＫ細胞の有意なｎ倍拡大をもたらす一方で、かかる拡大のための方法及び試薬は、いずれも時間及び資源への要求が厳しい。さらに、公知の方法の多くが、技術面及び規制面の視点から問題になることが多い、支持細胞層上でのＮＫ細胞培養も必要とすることは注目されるべきである。

【0006】

より単純な方法では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞は、ＴｐｏＲアゴニストに曝露されることで、ＡＭＬ細胞がＮＫ細胞を形成することを誘導し得る。しかし、かかる手法は、治療用細胞製剤における供給源として実行不能である可能性が高い。さらに、代替的方法は、国際公開第２０１１／１０３８８２号パンフレットに開示のように、末梢血液細胞を様々なインターロイキン、幹細胞因子、及びＦＬＴ３リガンドの存在下で培養することに依存している。さらに別の方法では、米国特許出願公開第２０１３／０２９５６７１号明細書は、既存のＮＫ細胞をサイトカインとともに抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ３抗体で刺激する方法を教示する。かかる方法は、手順的により簡単である一方で、該細胞の慎重な操作をさらに必要とし、特定の試薬が要求されることから多大なコストがかかる。

【0007】

さらに公知の方法では、米国特許出願公開第１０，１２５，３５１号明細書は、有核細胞を単離するための密度勾配分離が施され、次いでインターフェロン、インターロイキン、ＣＤ３抗体及びヒトアルブミンを含有する培地で培養される、細胞の供給源としての臍帯血又は末梢血の使用について記載している。最も有利には、かかる方法は、バイオリアクター内での灌流培養に適合可能であり、それ故、操作上の困難を有意に低減する。しかし残念ながら、ＮＫ細胞の収率は比較的低い。

【0008】

特定の産生方法と無関係に、培養されたＮＫ細胞は、典型的にはがん免疫療法にとって特に望ましいメモリー様特性を示さないことになる。メモリー様ＮＫ細胞を産生するための少なくともいくつかの試みでは、培養されたＮＫ細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８に曝露され、そのように曝露されたＮＫ細胞は、メモリー様表現型を示し、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＣＤ６９の発現並びにＣＤ５７及びＫＩＲの欠如と相関した（Ｂｌｏｏｄ（２０１２）Ｖｏｌ．１２０，Ｎｏ．２４；４７５１－４７６０を参照）。同様に、国際公開第２０１８／０８９４７６号パンフレットに記載の通り、メモリー様ＮＫ細胞は、様々な刺激性サイトカインを用いてＮＫ細胞を予備活性化し、続いて予備活性化された細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、又はＦＣ２１支持細胞と接触させることにより調製された。メモリー様ＮＫ細胞を作製するためのさらに別の手法では、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載の通り、新規に単離されたＮＫ細胞が、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体に曝露された。かかる方法により、典型的には少なくともいくつかのメモリー様特性を有するＮＫ細胞が産生された一方で、選択された標的細胞に対するかかる活性化ＮＫ細胞の細胞傷害性は、おそらくは特定の活性化受容体の欠如若しくは低発現及び／又は特定の阻害性受容体の発現に起因し、依然として最適未満であった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、たとえメモリー様ＮＫ細胞を作製する様々な方法が当該技術分野で公知であっても、それらのすべて又はほぼすべてが様々な不利益を被る。結果的に、メモリー様ＮＫ細胞、特に自己メモリー様ＮＫ細胞を有意な量で産生する改善されたシステム及び方法を提供することが求められる。さらに、改善されたシステム及び方法もまた、細胞培養及びＮＫ細胞活性化の自動化を可能にし、かかる方法を臨床的且つ商業的に実行可能にするための実質的に減少した試薬要件を有することになる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明者は、メモリー様ＮＫ細胞の作製及び拡大を概念的に単純且つ効率的な様式で可能にする組成物、方法、及びデバイスを発見している。有利には、メモリー様ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が所望される量まで拡大され、次いで拡大されたＮＫ細胞がサイトカインの混合物により誘導されることで、サイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞が形成されるという２ステッププロセスで作製可能である。ＮＫ細胞の拡大は、好ましくは、Ｎ－８０３及び抗ＣＤ１６アゴニスト抗体及び任意選択的には抗ＣＤ３抗体を使用する濃縮プロセス中に実施される。次に、メモリー様特性を得るための活性化は、刺激性サイトカインの組み合わせ、最も好ましくはＩＬ－１２／ＩＬ－１５／ＩＬ－１８又はＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体により実施される。

【0011】

意外にも、活性化マーカー及びＩＦＮ－γ分泌の上方制御に加えて、そのように活性化・拡大されたメモリー様ＮＫ細胞は、ＣＤ２５及びＮＫ活性化受容体ＤＮＡＭ－１の増強された発現、並びに阻害性受容体ＴＩＧＩＴの下方制御された発現を有し、それらはおそらくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の認められた増強された毒性に寄与したか又はその原因になった。最も注目すべきは、本明細書で提示されるＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、他のＮＫ抵抗性腫瘍細胞株ＭＳ－１に対して、比較的低いエフェクター対標的比で有意な細胞傷害性をさらに示した。

【0012】

本発明の主題の一態様では、発明者は、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を産生する方法であって、生体液から単核球の混合物を単離するステップと、ＮＫ細胞を拡大するため、単核球の混合物を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させる別のステップと、を含む方法を検討している。さらなるステップでは、拡大されたＮＫ細胞は、刺激性サイトカイン組成物（典型的には、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む）と接触され、それにより増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞が作製される。所望される場合、検討された方法は、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を再刺激後、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞をＮ－８０３と接触させるステップをさらに含んでもよい。

【0013】

好ましくは、必然ではないが、生体液は全血又は臍帯血であり、単核球の混合物は、ＮＫ細胞を濃縮するため、さらに処理されることはない。最も典型的には、単核球の混合物は、約１００～５００×１０^６個の細胞を含有し、及び／又は混合物を接触させるステップは、約１００～３００ｍｌの間の体積で、若しくは約１×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度で実施される。さらなる実施形態では、混合物を接触させるステップにおける抗ＣＤ１６抗体は、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌ間の濃度で存在してもよく、及び／又は混合物を接触させるステップにおけるＮ－８０３は、０．１～１．０ｎＭ間の濃度で存在してもよい。任意選択的には、混合物を接触させるステップは、単核球の混合物を抗ＣＤ３抗体と（例えば、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌ間の抗ＣＤ３抗体濃度で）接触させるステップをさらに含んでもよい。

【0014】

いくつかの態様では、刺激性サイトカイン組成物がＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む一方で、その他の態様では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物を含み、さらなる態様では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む。最も典型的には、ＮＫ細胞は、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数に拡大され、及び／又は拡大されたＮＫ細胞を刺激性サイトカイン組成物と接触させるステップは、ＮＫ細胞を拡大するステップと同じ容器内で実施される。

【0015】

したがって、異なる視点から眺めると、発明者はまた、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を形成するため、ＮＫ細胞を活性化させる方法を検討している。かかる方法は、拡大された（典型的には全血又は臍帯血の単核球から拡大された）ＮＫ細胞を準備するステップと、拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するさらなるステップと、を含むことになる。

【0016】

前記の通り、ＮＫ細胞が全血又は臍帯血から拡大されることが検討される。したがって、ＮＫ細胞は、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体と対照的に、自己であってもよい。好ましくは、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む。しかし、さらなる実施形態では、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい。典型的には、拡大されたＮＫ細胞は、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数を有する。

【0017】

さらに、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を有することになり、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ１６の低下した発現を有し、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、且つ／又は増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞がＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増強された発現を有することが検討される。

【0018】

したがって、発明者はまた、５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示す、増強された細胞傷害性を有するＣＩＭＬ ＮＫ細胞について検討している。さらなる態様では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ１６の低下した発現を有し、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、且つ／又はＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増強された発現を有する。

【0019】

本発明の主題に限定しない一方で、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、好ましくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体と対照的に自己細胞である。他の実施形態では、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞はまた、組換えＮＫ細胞であってもよい。例えば、かかる組換え細胞は、ＣＤ１６若しくはその変異体、ＩＬ－２若しくはその変異体、及び／又はＩＬ－１５若しくはその変異体を組換え核酸から発現してもよい。

【0020】

さらに検討された態様では、発明者はまた、薬学的に許容できる担体を本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞と組み合わせて含む医薬組成物について検討している。結果的に、薬剤における、また特にがんの治療における本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞の使用が検討される。

【0021】

したがって、発明者はまた、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞でそれを必要とする個体を治療する方法であって、本明細書で提示されるようなＣＩＭＬ ＮＫ細胞の治療有効量を個体に投与するステップを含む方法について検討している。好ましくは、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、個体の自己細胞であり、及び／又はＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、末梢血又は臍帯血由来ＮＫ細胞である。

【0022】

様々な目的、特徴、態様、及び利点は、数値に類するものが成分に類するものを表すような貼付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明白になるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体の例示的な模式図を示す。

【図2】自己ＰＢＭＣ及び特定抗体の選択された組み合わせを使用する末梢血ＮＫ細胞の拡大からの例示的結果を示す。

【図3】ＭＳ－１標的細胞に対する臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイからの例示的結果を示す。

【図4】臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞上での選択された表現型マーカーの発現についての例示的結果を示す。

【図5】ＭＳ－１標的細胞に対する末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイからの例示的結果を示す。

【図6】末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞上での選択された表現型マーカーの発現についての例示的結果を示す。

【図7】ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露後の臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の例示的な活性化クラスター表現型を示す。

【図8】ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露後の臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞上での例示的なＣＤ２５発現を示す。

【図9】臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の再刺激時の例示的な活性化クラスター表現型を示す。

【図10A】臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の、ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露から２４時間後の細胞殺傷活性についての例示的結果を示す。

【図10B】臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の、ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露から４８時間後の細胞殺傷活性についての例示的結果を示す。

【図10C】臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の、ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露から７２時間後の細胞殺傷活性についての例示的結果を示す。

【図11】単一ボックス培養環境下で培養された臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の細胞殺傷活性、及びかかる細胞からの活性化クラスター形成についての例示的結果を示す。

【図12】ＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露後の末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞上でのＮＫマーカー発現についての例示的結果を示す。

【図13】Ｋ５６２標的細胞に対するＩＬ－１８／１２ ＴｘＭ曝露後の末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイからの例示的結果を示す。

【図14】再刺激後の末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ染色についての例示的結果を示す。

【図15】Ｎ－８０３への曝露後の末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイからの例示的結果を示す。

【図16】再刺激後の臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞のＩＦＮ－γ染色についての例示的結果及びＮ－８０３への曝露後の細胞傷害性アッセイからの例示的結果を示す。

【発明の具体的説明】

【0024】

がんの治療における免疫療法では、様々な細胞に基づく成分の利用が増えており、より最近ではＮＫ細胞が有望なモダリティになっている。一部のＮＫ細胞が比較的高い量で現在利用可能である一方で、自己ＮＫ細胞及び／又はメモリー様ＮＫ細胞の治療的有効量での産生についての問題は、良くても未解決のままである。残念ながら、現在の方法の多くが、支持細胞層の使用又は単離されたＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）の分化を必要とし、双方ともに時間・資源集約的である。さらに、要求される様々な操作ステップに起因し、かかる方法は、典型的にはヒト相互作用を必要とし、易汚染性である。さらに、ＮＫ細胞のメモリー様表現型への変換により、少なくとも一部のプロトコルにおいて細胞傷害性が低下することがある、又はかかる細胞が十分な量で送達されないことがある。

【0025】

発明者は現在、メモリー様ＮＫ細胞に容易に変換可能なＮＫ細胞を治療的有効量（例えば、少なくとも０．５×１０^９個のＮＫ細胞）で、一旦単核球が生体液（例えば、全血、臍帯血）から得られると、完全に自動化することさえ可能である単純且つ有効な方法で作製するための様々なシステム、組成物、及び方法を発見している。有利には、かかるＮＫ細胞は、自己ＮＫ細胞であり得、メモリー様表現型に誘導され、増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞がもたらされ得る。特に、以下により詳細に説明される通り、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、他の（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞と比べて優位な細胞傷害性を有するだけでなく、ＭＳ－１細胞（メルケル細胞がん細胞）など、通常はＮＫ細胞の細胞傷害性に対して抵抗性又はさらに不活性である標的細胞に対して有意な殺傷能力を有することになる。

【0026】

いかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、発明者は、増強された細胞傷害性が、拡大条件に先立つ（ナイーブ）ＮＫ細胞の供給源、おそらくは拡大及びサイトカイン誘導の中断されない（例えば、培地、培養条件などの変更）性質に起因することがあり、それにより活性化因子の過剰発現及び阻害性受容体の過小発現が生じることがあると考えている。本明細書で提示されるＣＩＭＬ ＮＫ細胞の他の注目すべき特徴の中で、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、典型的には５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示すことになり、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴ（阻害性受容体）の低下した発現、及びＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１（活性化共受容体）の増加した発現を有することになる。したがって、用語「増強された細胞傷害性を有するＮＫ細胞」は、５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＴＩＧＩＴ（阻害性受容体）の低下した発現、及び／又はＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べてＣＤ２５及び／又はＤＮＡＭ１（活性化共受容体）の増加した発現を示すＮＫ細胞を指す。さらに、検討対象のＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、典型的にはＣＤ１６の低下した発現も示すことになる。最も典型的には、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、上記パラメータ（即ち、通常のＮＫ抵抗性細胞に対する細胞傷害性、活性化受容体の増加した発現、阻害性受容体の低下した発現）の３つすべてを示すことになる。

【0027】

本明細書で検討される１つの例示的プロセスでは、ＮＫ細胞は、第１ステップで、単核球を含有する生体液の画分から、好ましくは約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数まで拡大される。特に、かかる拡大は、支持細胞又は培養容器の変更を必要とする他の操作を必要とせず、比較的小さい体積の単一の反応器内で中等度の細胞密度まで（例えば、１００～３００ｍｌ又は約０．５～５．０×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞密度で）実施され得る。一旦所望されるＮＫ細胞量が達成されると、次にそのように拡大されたＮＫ細胞は、第２ステップで、ＮＫ細胞をメモリー様表現型に活性化するため、刺激性サイトカイン組成物と接触される。好ましくは、刺激性サイトカイン組成物は、図１に例示される通り、必ずしもＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含むことにならない。しかし、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含んでもよい。サイトカイン刺激は、典型的には、４～２４時間の期間にわたり実施されることになり、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、輸血前に（好ましくはＮ－８０３の存在下で）静止又は再刺激されてもよい。

【0028】

例えば、全血又は臍帯血は、単核球を得るために処理される出発物質として利用可能である。最も典型的には、通常の密度勾配遠心分離を使用して（例えば、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されたＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（商標）（親水性可溶性多糖、密度１．０７７ｇ／ｍＬ）を使用）、処理が実施され得る。一旦単核球が遠心管から分離されると、該細胞は洗浄され、活性化培地（例えば、１０％ヒトＡＢ血清を添加したＮＫ ＭＡＣＳ）中に再懸濁される。活性化培地は、約０．４ｎＭの濃度でのＮ－８０３、及び約１．０ｍｃｇ／ｍｌの濃度での抗ＣＤ１６抗体をさらに含み得る。

【0029】

最も典型的には、単核球は、約２００ｍｌの総体積中で１～２×１０^６個の細胞／ｍｌの密度を有し、且つ該細胞及び培地は、単一の容器内に存在する。約３～４日後、該細胞にＮ－８０３を含有する新しい培地が供給され、さらなる供給サイクルが、回収、迅速な拡大、及び培養達成を通じて約３日ごとに実施される。特に、かかるスキームにおけるＮＫ細胞拡大の成功は、図２に例示される通り、刺激性因子の適切な選択に有意に依存した。ここで、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１６モノクローナル抗体を使用するとき、０日目から２０，０００倍を超える著しい拡大が認められた一方で、抗ＣＤ１６抗体単独は、同様の著しい効果をもたらすことができなかった。特に、抗４－１ＢＢ抗体の存在は、ＮＫ細胞を早めに増殖し尽くすように思われた。

【0030】

次に、所望される量、典型的には約０．５～５．０×１０^９個の全細胞に達するとき、且つ／又は所望される拡大（例えば少なくとも１００倍の拡大）に達するとき、細胞培養が終結する。特に、明白な単純性にもかかわらず、そのようにして得られた細胞培養物は、約３週後、約８５％を超えるＮＫ細胞とともに、約８％未満のＮＫＴ細胞、及び約２．５％未満のＴ細胞、及び約１．２％未満の二重陰性（ＤＮ）Ｔ細胞を含有する。さらに、全培養プロセスは、培養ステップ中、汚染リスクを実質的に低減し、試薬及び細胞操作を取り除く、自己完結型バイオリアクター内部の単一容器内で実施されてもよいことは理解されるべきである。

【0031】

該細胞は、所望される細胞量に達するとき、その後のサイトカイン刺激を意図して、新しい培地に移すことができる。或いは、メモリー様表現型を作製するためのサイトカイン刺激は、典型的には、さらなる培地に、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体（又はＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物）を含む刺激性サイトカイン組成物を添加することにより、同じ培地中で実施され得る。ほとんどの場合、サイトカイン刺激は、約４～２４時間の間、より典型的には１２～１６時間の間の期間にわたり、実施されることになる。容易に理解されるであろうが、次に該細胞は、輸血前に輸血培地に移すことができる。さらに、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の表現型及び／又は細胞傷害性が判定されてもよく、例示的結果が以下により詳細に示される。

【0032】

好適な生体液に関しては、体液が、本明細書で提示される方法において単離されたＮＫ細胞を受けることになる個体に対して自己であり得ると一般に考えられている。したがって、特に好ましい生体液は、新しい全血、臍帯血（凍結又は新鮮）、及び白血球除去手順において分離された細胞を含む。しかし、生体液がまた、（典型的には他の細胞型の中の）ＮＫ細胞を含有する任意の体液であってもよいことは理解されるべきである。例えば、好適な代替的な生体液は、適合性ＭＨＣタイプに一致しても又は一致しなくてもよい、同種ドナーからの全血を含む。したがって、有効期限に近づいた血液バンク内のサンプルは、ＮＫ細胞レシピエント以外の個体により新規に供与された全血又は貯蔵された臍帯血と同様、使用に適すると思われる。さらに、生体液が臍帯血である場合、ＮＫ細胞レシピエントと十分なＭＨＣ一致後、臍帯血が一致され、供与されてもよいことは注目されるべきである。同様に、単核球を単離又は濃縮する方法が大幅に変化してもよく、当業者が単離及び濃縮の最適な方法を容易に理解するであろうことは注目されるべきである。例えば、生体液が全血又は臍帯血である場合、体液が任意の好適な培地（例えば、フィコール・ハイパック）を用いての勾配密度遠心分離を介して処理されることは好ましい。或いは、単核球は、患者から白血球除去により直接的に入手されてもよく、又は生体液は、抗体を用いる赤血球の除去が施されてもよい。さらなる方法では、単核球は、ビーズが単核球に結合する抗体にコーティングされるか又はそれ以外では共役される場合、磁気ビーズ分離を用いて単離されてもよい。

【0033】

同様に、活性化及び供給における培地の特定の性質がＮＫ ＭＡＣＳ培地に限られる必要がないが、ＮＫ細胞の成長を支持することが知られるすべての培地が本明細書での使用に適すると思われることは理解されるべきである。しかし、最も好ましくは、限定培地が使用され、それにヒトＡＢ血清が添加されてもよい。

【0034】

単核球の混合物中でのＮＫ細胞の増殖は、好ましくは抗ＣＤ１６抗体とＮ－８０３との組み合わせ、任意選択的には抗ＣＤ３抗体を用いて刺激及び支持される。当該技術分野で公知の／市販の抗ＣＤ１６抗体に対して様々な供給源が存在し、また特に好ましい抗ＣＤ１６抗体は、アゴニスト（活性化する）活性を有し、ヒトＣＤ１６に特異的である。しかし、抗ＣＤ１６抗体以外のアクチベーターもまた、本明細書での使用に適するとみなされ、抗ＣＤ１６抗体断片及び抗ＣＤ１６抗体断片との融合タンパク質を含む。追加的に又は代替的に、検討対象のアクチベーターはまた、特に、ＣＤ３１４又はＮＫＧ２Ｄ、天然細胞傷害性受容体ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）及びＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、短い細胞質側末端を保有するＣＤ１５８又はキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバー（ＫＩＲ２ＤＳ及びＫＩＲ３ＤＳ）、及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃを含む。

【0035】

抗ＣＤ１６抗体の濃度は、典型的には、ＮＫ細胞の活性化に対する当該技術分野で既知の場合に従うことになる。したがって、抗ＣＤ１６抗体に適した濃度は、約０．０１～５．０ｍｃｇ／ｍｌの間、より典型的には約０．０１～０．３ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約０．１～１．０ｍｃｇ／ｍｌの間、又は約１．０～５．０ｍｃｇ／ｍｌの間となる。抗ＣＤ１６抗体への曝露の持続時間に関しては、最も典型的には単核球が単離され、第１（及び／第２、及び／又は第３）の期間、活性化培地と接触されるとき、単核球の混合物が専ら単回、２回、又は３回用量の抗ＣＤ１６抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び用量を容易に理解できるであろう。最も典型的には、単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露は、単核球のＮ－８０３との曝露と同時的である。しかし、大して好ましくない実施形態では、単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露は、単核球のＮ－８０３との曝露に対して経時的である（ここでは最初に単核球の抗ＣＤ１６抗体への曝露が好ましい順序である）。

【0036】

所望される場合、増殖刺激／支持はまた、典型的には該細胞を抗ＣＤ１６抗体と接触させるのと同時に、細胞を抗ＣＤ３抗体と接触させることを含んでもよい。上記の通り、抗ＣＤ３抗体の濃度は、典型的にはＮＫ細胞の活性化に対する当該技術分野で既知の場合に従うことになる。したがって、抗ＣＤ３抗体に適した濃度は、約０．０１～１０．０ｎｇ／ｍｌの間、より典型的には約０．０１～０．１ｎｇ／ｍｌの間、又は約０．１～０．５ｎｇ／ｍｌの間、又は約０．３～１．０ｎｇ／ｍｌの間、又は約１．０～５．０ｎｇ／ｍｌの間となる。同様に、抗ＣＤ３抗体への曝露の持続時間に関しては、最も典型的には単核球が単離され、第１（及び／第２、及び／又は第３）の期間、活性化培地と接触されるとき、単核球の混合物が専ら単回、２回、又は３回用量の抗ＣＤ３抗体に曝露されると一般に考えられる。当業者は、ＮＫ細胞活性化を達成するための適切なスケジュール及び用量を容易に理解できるであろう。

【0037】

Ｎ－８０３に関しては、Ｎ－８０３（ヒト配列を有するＩＬ－１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ－１５ＲαＳｕ／ＩｇＧ１ Ｆｃ複合体；米国特許出願公開第２０１９／００２３７６６号明細書を参照、ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏから市販）が活性化及び供給培地中の薬剤として好ましいと考えられる。しかし、ＩＬ－１５活性を有する様々な代替的薬剤もまた、本明細書での使用に適すると思われる。これに関連し、またいかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、発明者は、Ｎ－８０３が連続的シグナル伝達のおかげでＮＫ細胞の成長及び拡大を可能にすると考えている。それに対し、単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５は、非常に短い寿命を有し、シグナル伝達活性は、典型的には非常に短期である。ここで単離されたサイトカインとしてのＩＬ－１５が成長培地に添加される場合、シグナル伝達は間欠的にパルス化されることになる。それに対し、Ｎ－８０３が提供される場合、ＩＬ－１５の安定性が劇的に延長され、シグナル伝達は連続的とみなされる。さらに、Ｎ－８０３が生理学的状況（即ちＩＬ－１５ Ｒ－α鎖）及びスーパーアゴニストとして作用するＮ７２Ｄ形態ももたらすことは理解されるべきである。したがって、任意の安定化したＩＬ－１５化合物についても、明示的に本明細書での使用に適すると思われる。

【0038】

例えば、ＩＬ－１５シグナル伝達をもたらすすべての化合物及び複合体は、単離された／組換え及び精製されたＩＬ－１５単独よりも長い血清半減期を有する限り、本明細書での使用に適すると思われるに。さらに、安定化したＩＬ－１５化合物がＩＬ－１５及び／又はＩＬ－１５Ｒαにおけるヒト配列の少なくとも一部を含むことは一般に好ましい。例えば、好適な化合物は、Ｐ２２３３９（ＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒα鎖のＳｕｓｈｉドメインとの複合体であって、その半減期を増強するため、ＩＬ－１５／Ｓｕｓｈｉドメイン複合体をＩｇＧ１ Ｆｃと連結するジスルフィド結合を有するもの；Ｎａｔｕｒｅ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：７６７５を参照）、及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃヘテロ二量体であるＸｍＡｂ２４３０６を含む（例えば、国際公開第２０１８／０７１９１９号パンフレットを参照）。

【0039】

さらに詳細に検討される実施形態では、単核球の混合物は、生体液からの単離後、ＮＫ細胞を活性化するため、抗ＣＤ１６（及び任意選択的には抗ＣＤ３）抗体及びＮ－８０３を含有する培地と一緒に、細胞培養容器に入れられる。最も好ましくは、容器は、細胞の形状、染色、及び／又は成長が顕微鏡又は他の光学機器により観察可能であるように光に対して透明な少なくとも１つの壁（又はその一部）を有する細胞培養フラスコである。したがって、該細胞がバイオリアクター内で継続的又は周期的に監視可能であり、且つそのようにして得られた測定値（例えば、細胞サイズ、細胞数、細胞分布など）が、バイオリアクターに論理的に共役された制御ユニットにおいて自動化された供給スケジュールを誘発又は変更するために使用可能であることは注目されるべきである。最も典型的には、また図２に示される通り、新しい培地へのＮ－８０３の供給は、好ましくは各供給がＮ－８０３を含むことで連続的なシグナル伝達を維持することになる場合、所定のスケジュールを用いて、典型的には３日ごとに実施され得る。下記例における比体積がＮＫ細胞を細胞成長に一致する細胞密度まで拡大するのに適する一方で、該体積が特定の成長パターンに順応するように調節されてもよいことは理解されるべきである。それを達成するため、供給が連続的であってもよいこと、又は所定の体積が容器内で観察される成長動力学に応答して変更されてもよいことも理解されるべきである。

【0040】

ほとんどの場合、培養終了時のＮＫ細胞の収率は、典型的には、すべての生細胞の少なくとも８０％、又は少なくとも８２％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも８８％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９４％となり、その残りはＮＫＴ細胞、ＤＮ Ｔ細胞、及びＴ細胞である。例えば、残存するＮＫＴ細胞は、典型的には、すべての生細胞の１０％以下、又は８％以下、又は７％以下、又は６％以下となり、残りのＴ細胞は、典型的には、すべての生細胞の５％以下、又は４％以下、又は３％以下、又は２％以下となり、且つ残りのＤＮ Ｔ細胞は、典型的には、すべての生細胞の３％以下、又は２％以下、又は１．５％以下、又は１％以下となる。

【0041】

したがって、異なる視点から眺めると、本明細書で検討されるシステム及び方法が、ＮＫ細胞を著しく高く拡大する能力があり、且つ典型的な拡大が、単核球の混合物中に最初に存在するＮＫ細胞の数に対して、少なくとも８０倍、又は少なくとも１００倍、又は少なくとも１２０倍、又は少なくとも１３０倍、又は少なくとも１４０倍であることは理解されるべきである。かかる拡大は、活性化及び培養の非常に単純な様式（ワンポットプロセス）の観点から特に注目すべきである。確かに、一旦単核球の混合物が細胞培養容器に入れられると、全体プロセスは、同じ容器内で連続し得、専ら培地の添加により持続的であり得る。したがって、複合体の処理及び高価な試薬は全体的に回避され、汚染におけるリスクは有意に低下する。

【0042】

既に上で認められた通り、ＮＫ細胞は、約０．１～１．０×１０^９個の細胞、又は約０．３～３．０×１０^９個の細胞、又は約０．５～５．０×１０^９個の細胞、又は約０．７～７．０×１０^９個の細胞、又は約１～１０×１０^９個の細胞、又はさらにそれ以上の全細胞数まで拡大され得る。拡大されたＮＫ細胞の正確な数は、典型的には、特に、ＮＫ細胞における特定の目的、培養条件、及び細胞の開始数に依存することになる。細胞が所望される量に達すると、サイトカイン刺激が拡大培地中で、典型的には刺激性サイトカイン組成物を含有する新しい培地を添加することにより実施されてもよい。

【0043】

ほとんどの場合、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などの１以上の活性化サイトカインと、より少ない程度であるが、ＩＬ－４及びＩＬ－７も含むことになる。当然ながら、また以下により詳細に検討される通り、好適なサイトカインはまた、上記サイトカインの誘導体であってもよく、特に好ましい誘導体は、融合複合体を含む。さらに、サイトカインの１以上がまた、適切な組換え核酸のトランスフェクション後、拡大されたＮＫ細胞において発現されてもよいこと（例えば、プラスミド又はウイルス発現ベクターからの一過性発現）は理解されるべきである。

【0044】

例えばいくつかの実施形態では、刺激性サイトカイン組成物は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含むことになり、特に好ましい融合タンパク質複合体は、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。かかる場合、融合タンパク質複合体は、３つのサイトカイン機能（ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８）をヒトＩｇＧのＦｃ部分へのそれらの共役を介した安定化形態で提供することは理解されるべきである。さらに、いかなる理論又は仮説によっても拘束されることを望んでいないが、融合タンパク質複合体のＦｃ部分は、さらなる刺激性シグナルを、おそらくは拡大されたＮＫ細胞上でのＣＤ１６との相互作用を通じて提供することがある。しかし、Ｎ－８０８に基づく他の融合タンパク質複合体についても本明細書で明示的に検討される。例えば、好適な融合タンパク質複合体は、標的化ｓｃＦｖ部分、又はＩＬ－１２及びＩＬ－１８以外の（又はそれらに加えての）サイトカイン部分を含んでもよい。当然ながら、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体が多くの場合に好ましい一方で、代替的なＴｘＭ融合タンパク質複合体も好適とみなされ、特に検討された融合複合体が、国際公開第２０１８／１６５２０８号パンフレットに記載のようなＩＬ１５／ＩＬ－１５Ｒα部分、並びにＩＬ－７、ＩＬ－１８、及びＩＬ－２１からなる群から選択される少なくとも１つの追加的なサイトカインを含むことになることは注目されるべきである。それ故、他の好適な選択肢の中で、検討されたＴｘＭ融合複合体は、ＩＬ－１８／ＩＬ－７ ＴｘＭ及び／又はＩＬ－１８／ＩＬ－２１ ＴｘＭを含む。

【0045】

したがって、それ以外の例では、刺激性サイトカイン組成物はまた、ＩＬ－１５の誘導体を含んでもよく、特に好ましい誘導体は、Ｎ－８０３に基づくものである。かかる誘導体は、有利には、ＩＬ－１５Ｒα鎖の存在に起因し、本質的にＩＬ－１５と比べて増強されたシグナル伝達効果を有することになり、代表的な好適な誘導体は、国際公開第２０１６／００４０６０号パンフレット及び国際公開第２０１８／０７５９８９号パンフレットに記載されている。最も典型的には、Ｎ－８０３又は類似の融合タンパク質が使用される場合、追加的なサイトカイン機能が個別のサイトカイン、特にＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１８によって与えられることになる。したがって、本発明の主題のさらに別の態様では、刺激性サイトカイン組成物はまた、個別のサイトカインとして、ＩＬ－７、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、及びＩＬ－１８を含んでもよい。したがって、他の選択肢の中で、かかる個別のサイトカインは、単独で又は他の個別のサイトカイン若しくはＴｘＭ構築物と組み合わせて添加されてもよく、それらの各々は、組換えであってもよい（又はさらに該細胞において組換え的に発現されてもよい）。

【0046】

したがって、刺激性サイトカインの１以上がまた、拡大されたＮＫ細胞にトランスフェクトされた組換え核酸から（一過性に）発現され得ることは理解されるべきである。例えば、好適なトランスフェクション方法は、組換え核酸がウイルス発現ベクターである場合のウイルストランスフェクションを含む。他方で、組換え核酸はまた、当該技術分野で周知の方法を用い、エレクトロポレーション又はリポフェクションを用いて、該細胞にトランスフェクトされてもよい。さらに、エレクトロポレーション又はリポフェクションが利用される場合、典型的には核酸がＲＮＡであることが好ましい（しかし、ＤＮＡもまた、本明細書での使用に適すると思われる）。

【0047】

特定タイプの刺激性サイトカイン組成物と無関係に、１以上のサイトカインが培地中にＮＫ細胞のメモリー様表現型を作製するのに有効な濃度で存在することが一般に検討される。したがって、好適な総サイトカイン濃度は、０．１ｎＭ～１．０ｎＭの間、又は０．５ｎＭ～５．０ｎＭの間、又は１．０ｎＭ～１０ｎＭの間、又は１０ｎＭ～５０ｎＭの間、また場合によってはさらに高い値となる。複数のサイトカインが使用される場合、サイトカインが実質的に等モル濃度で存在することが一般に好ましい（＋／－５０％偏差）。他方で、刺激性サイトカイン組成物がＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む場合、該複合体は、０．５ｎＭ～５．０ｎＭの間、又は１．０ｎＭ～１０ｎＭの間、又は１０ｎＭ～５０ｎＭの間、又はさらに高い値で存在してもよい。

【0048】

刺激性サイトカイン組成物のタイミングに関しては、ＮＫ細胞が、刺激性サイトカイン組成物への曝露前に所望される（典型的には最終）量まで最初に拡大されることが一般に好ましい。しかし、代替的態様では、刺激性サイトカイン組成物は、最終の所望される細胞量の約７０％から、又は最終の所望される細胞量の約８０％から、又は最終の所望される細胞量の約９０％から、拡大しているＮＫ細胞集団に添加され得る。本発明の主題のほとんどの態様では、刺激性組成物への曝露は、約２時間～４８時間の間、又は４時間～８時間の間、又は８時間～１２時間の間、又は１２時間～２４時間の間、また場合によってはさらに長い間、続くことになる。

【0049】

刺激性サイトカイン組成物への曝露は、培地と、典型的には新しい培地又は輸血に適した培地との交換により終結され得る。他方で、そのように作製されたＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、継続可能な次の使用に先立つ静止期間、０～４時間の間、４～１２時間の間、１２～２４時間の間、又は１～４日の間、及びさらに長い期間を経ることが可能であることも検討される。さらに容易に理解されるであろうが、ＣＩＭＬ ＮＫはまた、細胞傷害性をさらに増強するため、再刺激を受けてもよく、再刺激は、典型的には、ＩＬ２又はＩＬ－１５などの少なくとも１つの刺激性サイトカインを使用して実施されることになる。最も好ましくは、以下により詳細に示される通り、再刺激は、Ｎ－８０３が使用された場合、（本質的にＩＬ－１５と比べて）意外にも高い細胞傷害性をもたらした。さらに、再刺激が典型的には当該技術分野で周知の標準プロトコルに従うことになることは注目されるべきである

【0050】

ＣＩＭＬ ＮＫ細胞の最終処理と無関係に、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞がそれを必要とする個体への輸血に使用されることになり、最も典型的には個体ががんと診断されることになると考えられる。さらに容易に理解されるであろうが、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、個体が、癌ワクチン（例えば、組換え（アデノ）ウイルスワクチン、組換え酵母ワクチン、組換え細菌ワクチン）、化学療法剤、チェックポイント阻害剤、Ｎ－８０３又はＴｘＭに基づく治療薬、及び／又は標的化インターロイキン（例えば、ＮＨＳ－ＩＬ１２）を受けるような治療計画を形成してもよい。

【0051】

本発明の主題に限定するものでないが、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、継続的監視、ＣＯ_２及びＯ_２レベルの継続的管理、及び細胞密度（例えばコンフルエンス）を検出するための継続的監視を可能にする培養環境下で拡大及び／又は活性化されることがさらに検討される。かかる環境における他のオプションの中で特に好ましい環境は、例えば国際公開第２０１５／１６５７００号パンフレットに記載の通り、自動化された細胞培養及び収集装置である。かかる「ＧＭＢ－ｉｎ－ａ－ｂｏｘ」システムは、有利には、供給スケジュール、ガス調節に及ぶ制御を可能にし、細胞密度、成長（動力学）及び細胞ヘルスのリアルタイム検出を可能にするとともに、操作要求事項の有意な減少により、汚染の可能性を劇的に低減する。

【0052】

さらに検討された態様では、本明細書で提示されるシステム及び方法により、有利には、特にＮＫ細胞が末梢血から作製されるとき、ＣＤ５６^ｄｉｍ及びＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞の産生も可能になることは注目されるべきである。次に、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＮＫ細胞は、さらなる培養条件に応じて、ＣＤ５６^ｄｉｍ細胞に分化することがある。次に、かかる異なるＮＫ細胞集団は、異なる治療選択肢において、それらの異なる成熟及び細胞傷害性特性が理由で利用され得る。加えて、組成物、システム及び方法がまた、ＮＫＴ細胞を適切な刺激及び培養に応じて作製するのに適することは理解されるべきである。

【実施例】

【0053】

上記を考慮し、以下により詳細に提示される通り、１つの例示的方法は、単一のフィコール遠心分離ステップによりＣＢＭＣ又はＰＢＭＣを単離することと、その後の該細胞と、約０．４ｎＭのＮ－８０３及び約０．１ｍｃｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６抗体（例えば、クローンＢ７３．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから市販）、及び任意選択的には１０％ヒトＡＢ血清を有するＮＫ ＭＡＣＳ培地中の約０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体とのインキュベーションを伴った。典型的には、１００万個の細胞／ｍｌで１００～１５０ｍＬ（典型的には１３５ｍＬ）のＣＢＭＣを、上記試薬を有する出発物質として使用した。培地は、最終濃度０．４ｎＭに対応するＮ－８０３の濃度での既存の体積に対し、１：２及び１：１０のレジメンで週２回（３～５日間隔）のＮ－８０３による希釈用に使用した。拡大培養は、典型的には、拡大されたＮＫ細胞が全細胞の約９０％～９９％の間（例えば９８％）を形成するときに終結される。終結時、サイトカイン誘導は、以下により詳細に説明するように実施することができる。

【0054】

ＭＮＣを臍帯血又は末梢血から新規に単離した。それを完全ＮＫＭＡＣＳ培地（ＮＫＭＡＣＳ＋添加物＋１０％ｈｕ－ＡＢ－血清）で２回洗浄した。ＭＮＣを、ＧＭＰボックス（体積５００ｍＬ）内、１×１０^６個の細胞／ｍＬの密度を有する１５０ｍＬの培地に懸濁した。１５０ｍＬの細胞懸濁液に、抗ＣＤ１６抗体（１ｍｃｇ／ｍＬ）及びＮ－８０３（０．４ｎＭ）を添加した。ＧＭＰボックスでイメージングを開始し、予備プログラム化ステップに従い、細胞を増殖させた。ＧＭＰボックス内の細胞に、１０×サイトカイン培地又は２×サイトカイン培地を交互様式で添加した。ＮＫの濃縮（ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ１６発現における表現型）及び細胞ヘルス（細胞数、生存度、及び細胞密度）を定期的に監視し、プロットした。

【0055】

拡大されたＮＫ細胞からＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するためのサイトカイン誘導は、全細胞の９８％がＮＫ細胞であるポイントに達する際に開始した。そのため、５００ｍＬ及び２．３×１０^６個の細胞／ｍＬの密度を有するボックスを２つの別々のボックスに等しく分割した。したがって、５００ｍＬの細胞懸濁液が２つの各ボックスにおいて２５０ｍＬになり、細胞を新しい培地で１：１に希釈した。その後、ＩＬ１８／１２ ＴｘＭを最終濃度１０ｎＭに添加し（対照及び比較の場合、Ｎ－８０３は０．０７ｎＭの最終濃度で使用し）、該細胞をＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体とともに１６時間インキュベートし、そのようにしてＣＩＭＬ ＮＫ細胞を得た。さらに試験するため、該細胞を洗浄し、次に発現分析及び細胞傷害性アッセイを実施した。

【0056】

材料：臍帯血及び末梢血からのＭＮＣ、抗ＣＤ１６抗体、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；ＮＫ添加物を有するＮＫ ＭＡＣＳ培地、表現型を決定するための染色抗体（ａＣＤ３、ａＣＤ１６、ａＣＤ５６、ａＮＫｐ３０、ａＮＫｐ４４、ａＮＫｐ４６、ａＮＫＧ２Ａ、ａＮＫＧ２Ｄ、ａＴＩＧＩＴ、ａＣＤ３４、ａＴＲＡＩＬ、ａＣＤ５７、ａＣＸＣＲ３、及びａＣＣＲ５）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ヒトＡＢ血清、Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；Ｎ－８０３、ボックスキット内のＧＭＰ、Ｎａｎｔｂｉｏ Ｉｎｃ．Ｃｕｌｖｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ．。ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体はＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏから入手した。

【0057】

そのようにして作製したＣＩＭＬ ＮＫ細胞を細胞傷害性について試験し、表面マーカー発現について選択した。より詳細には、１つの実験セットにおいて、臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を、典型的にはＮＫ細胞傷害性に対して抵抗性を示すメルケル細胞がん細胞（ここではＭＳ－１細胞）に対して試験した。特に、図３中で明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、拡大及びＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への制御曝露後、有意な細胞傷害性を有した一方で、臍帯血細胞をＮ－８０３単独に曝露したときであっても、いくらかの細胞傷害性が認められた。図４は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体及びＮ－８０３に曝露された臍帯血由来細胞内での表面マーカー発現についての例示的結果を示す。明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＣＤ１６の低下した発現を有したが、ＣＤ２５、ＤＮＡＭ１の実質的に増加した発現、及びＩＦＮ－γの強力な分泌を有した。

【0058】

図５で明らかであるように、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を末梢血から誘導したとき、類似する結果が得られた。ここで、ＣＩＭＬ ＮＫ細胞は、ＭＳ－１細胞株に対する実質的な細胞傷害性を有し、末梢血からのＮ－８０３対照細胞もいくらかの細胞傷害性を示した。同様に、図６から解釈できるように、末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞における表面マーカーがＣＤ１６及びＴＩＧＩＴの低下した発現を示した一方で、ＣＤ２５、ＤＮＡＭ１、及びＩＦＮ－γ分泌における有意な増加を有した。特に、標準の培養プロトコルを用いてＮＫ細胞を培養したとき、又は新しいＮＫ細胞を使用した場合、ＭＳ－１細胞に対する有意な細胞傷害性は、メモリー様表現型を誘発するため、該細胞をＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８で誘導した場合であっても認められなかった。

【0059】

臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を活性化クラスター表現型についても試験し、図７は、Ｎ－８０３との制御曝露をＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露と比較した例示的結果を示す。画像から明らかであるように、Ｎ－８０３への曝露後の培養形態に対するＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への一晩曝露後の培養形態において著しい差異が生じる。これらのＣＩＭＬ ＮＫ細胞の選択された表面マーカーに注目すると、図８に示す通り、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露により、ＣＤ２５（公知の活性化関連受容体）の有意な増加がもたらされることがやはり明白であった。明らかに、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８機能によるサイトカイン刺激により、典型的には通常の新しいＮＫ細胞で認められない（少なくともその程度）、ＣＤ２５の提示が実質的に増強された。

【0060】

活性化受容体におけるかかる増加及び阻害性受容体における減少は、図９に示す通り、Ｋ５６２細胞に対する殺傷アッセイにおいて培養形態を観察するときも容易に明白であった。ここで、臍帯血由来ＣＩＭＬ細胞は、再刺激時、Ｎ－８０３とのインキュベーションと比べて実質的に増強された活性化クラスター形成を示した。

【0061】

さらなる実験では、発明者はまた、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後の各々の結果を示す図１０Ａ、図１０Ｂ、及び図１０Ｃに例示する通り、Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性の時間経過を検討した。最初の２４時間時点から（図１０Ａ）、試験したいずれのＴｘＭ濃度もＮ－８０３対照よりも低いＥＣ_５０を有することから、Ｋ５６２細胞に対する増強された殺傷能力の開始を見ることができる。４８時間時点で（図１０Ｂ）、ＴｘＭ処置サンプルによる増強された殺傷が見られるが、Ｎ－８０３対照の場合、それは低めであった。この時点で、Ｋ５６２の殺傷における増強は約３倍である。７２時間時点で（図１０Ｃ）、すべての条件でＫ５６２の殺傷に対する活性を失い始めているが、ＴｘＭ処置細胞は、対照と比べて約３倍の、それらの増強された殺傷を保持する。

【0062】

図１１は、拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞、Ｎ－８０３刺激を伴う拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞、及びＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体で刺激される拡大された臍帯血由来ＮＫ細胞における２４時間にわたる直接的比較を提供する。明らかであるように、全細胞における細胞傷害性は容易に明白であり、拡大されたＮＫ細胞は、％最大殺滅にわたりわずかな利点を有するが、ＣＩＭＬ細胞と比べて実質的により高いＥ；Ｔ比を必要とする。図１２は、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体で刺激される拡大された末梢血由来ＮＫ細胞に対するＮ－８０３刺激を伴う拡大された末梢血由来ＮＫ細胞の、選択されたマーカーの発現を示す。図１２から解釈できるように、活性化を意味している、ＴＩＧＩＴ（及びＣＤ１６）の有意な下方制御及びＣＤ２５の有意な上方制御が認められる。ＣＤ１６の下方制御がＡＤＣＣにおける減少を伴うことがあることは注目されるべきである。しかし、ＡＤＣＣにおける潜在的減少よりも、通常であればＮＫ細胞細胞傷害性に対して抵抗性を示す細胞株に対してのより高度な活性化及び細胞傷害性が重要である。図１３に示す通り、末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞で、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体による２４時間刺激後、類似する細胞傷害性結果が見出される。明確には、Ｋ５６２アッセイにおいて、１０ｎＭのＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体への曝露により、より十分な細胞死滅がもたらされた。

【0063】

末梢血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞におけるＩＦＮ－γの分泌を試験したが、図１４は、異なる条件を用いての例示的結果を示す。同じ細胞を細胞傷害性アッセイにおいても使用したが、図１５は例示的結果を示す。図１６から解釈できるように、類似する結果が臍帯血由来ＣＩＭＬ ＮＫ細胞においてもたらされる。特に、Ｎ－８０３によるサイトカイン誘導は、本質的にＩＬ－１５による誘導より優れる。したがって、多重サイトカイン誘導が上に示すように好ましい一方で、Ｎ－８０３による誘導も明示的に検討対象であることは注目されるべきである。

【0064】

本明細書で用いられるとき、医薬組成物又は薬剤を「投与する」という用語は、医薬組成物又は薬剤の直接及び間接投与の双方を指し、ここで医薬組成物又は薬剤の直接投与は、典型的には医療専門家（例えば、医師、看護師など）によって実施され、且つ間接投与は、医薬組成物又は薬剤を（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などを介する）直接投与における医療専門家に対して準備するか又は利用可能にするステップを含む。最も好ましくは、該細胞又はエキソソームは、皮下又は真皮下注射を介して投与される。しかし、他の検討された態様では、投与はまた、静脈内注射であってもよい。代替的に又は追加的に、抗原提示細胞が、患者の細胞から単離又は成長され、患者にインビトロで感染され、次いで輸血されてもよい。したがって、検討されたシステム及び方法は、高度に個別化されたがん治療における完全な創薬システム（例えば、創薬、治療プロトコル、検証など）と考えることができることは理解されるべきである。

【0065】

本明細書中の値の範囲の列挙は、あくまで個別に該範囲内に該当する別々の各値を指すような簡素化方法として役立つことが意図される。本明細書中で別段の指示がない限り、各個別の値は、あたかも本明細書中に個別に列挙されたように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書中で別段の指示がない限り、又はそうでなければ文脈上明らかに矛盾がない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書中の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、又は代表的な用語（例えば「など」）の使用は、あくまで本開示の全範囲をより十分に明示することが意図され、別途主張された本発明の範囲に対して限定することがない。本明細書中の用語は、請求項に係る発明の実施にとって必須である、任意の主張されない要素を示すものとして解釈されるべきではない。

【0066】

既に説明された修飾以外の多数のさらなる修飾が、本明細書で開示される概念の全範囲から逸脱することなく可能であることは、当業者にとって明白であることが理解されよう。したがって、開示された主題は、貼付の特許請求の範囲の範囲内を除き、限定されるべきでない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する場合、全ての用語は、文脈に一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的様式での要素、成分、又はステップを指し、参照される要素、成分、又はステップが、明示的に参照されない他の要素、成分、又はステップとともに存在してもよい、又は利用されてもよい、又は組み合わされてもよいことを示すように解釈されるべきである。本明細書の特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択されるものの少なくとも１つを指す場合、本文は、Ａ＋Ｎ又はＢ＋Ｎなどでない、グループから１つの要素のみを必要とするものとして解釈されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【手続補正書】

【提出日】2021-10-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を産生する方法であって、
生体液から単核球の混合物を単離し、且つＮＫ細胞を拡大するため、前記単核球の前記混合物を抗ＣＤ１６抗体及びＮ－８０３と接触させるステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含み、ここで前記ＮＫ細胞が、前記拡大の終了時、すべての生細胞の少なくとも８０％を構成する、方法。

【請求項2】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を再刺激後、前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞をＮ－８０３と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記生体液が、全血又は臍帯血である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ＮＫ細胞を濃縮するため、単核球の前記混合物がさらに処理されず、且つ前記単核球の前記混合物が、約１００～５００×１０ ^６ 個の細胞を含有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記混合物を接触させるステップにおける前記抗ＣＤ１６抗体が、０．０５～０．５ｍｃｇ／ｍｌの間の濃度で存在し、及び／又は前記混合物を接触させるステップにおける前記Ｎ－８０３が、０．１～１．０ｎＭの間の濃度で存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記混合物を接触させるステップが、前記単核球の前記混合物を抗ＣＤ３抗体と接触させるステップをさらに含み、且つ前記抗ＣＤ３抗体が、０．１～１．０ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記刺激性サイトカイン組成物が、前記ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＮＫ細胞が、約０．５～５．０×１０^９個の細胞の全細胞数まで拡大される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記拡大されたＮＫ細胞を刺激性サイトカイン組成物と接触させる前記ステップが、前記ＮＫ細胞を拡大する前記ステップと同じ容器内で実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞を形成するため、ＮＫ細胞を活性化する方法であって、
全血又は臍帯血の単核球から拡大された、拡大されたＮＫ細胞を準備するステップと；
前記拡大されたＮＫ細胞を、ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体、ＩＬ－１２、Ｎ－８０３、及びＩＬ－１８の混合物、又はＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８の混合物を含む刺激性サイトカイン組成物と接触させ、それにより増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を作製するステップと、
を含み、ここで前記拡大されたＮＫ細胞が、すべての生細胞の少なくとも８０％を構成する、方法。

【請求項11】

前記ＮＫ細胞が、全血から拡大される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＮＫ細胞が、臍帯血から拡大される、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記ＮＫ細胞が、前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞を含む輸血を受けている個体に対して自己である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記刺激性サイトカイン組成物が、前記ＩＬ－１８／ＩＬ－１２－ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含む、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ１６の低下した発現を有し、増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、並びに／又は増強された細胞傷害性を有する前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増加した発現を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

５以下のエフェクター対標的細胞比で少なくとも５０％殺傷する、ＭＳ－１細胞に対する細胞傷害性を示す、増強された細胞傷害性を有するサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞。

【請求項18】

Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ１６の低下した発現を有し、Ｎ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＴＩＧＩＴの低下した発現を有し、並びに／又はＮ－８０３単独と接触される拡大されたＮＫ細胞と比べて、ＣＤ２５及び／若しくはＤＮＡＭ１の増加した発現を有する、請求項１７に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項19】

ＣＤ１６若しくはその変異体、ＩＬ－２若しくはその変異体、及び／又はＩＬ－１５若しくはその変異体を組換え核酸から発現する組換えＮＫ細胞である、請求項１７に記載のＣＩＭＬ ＮＫ細胞。

【請求項20】

薬学的に許容できる担体を、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞と組み合わせて含む、医薬組成物。

【請求項21】

薬剤中での使用のための、薬学的に許容できる担体を、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ）ＮＫ細胞と組み合わせて含む、医薬組成物。

【請求項22】

がんの治療における使用のための、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、前記個体の自己細胞である、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記ＣＩＭＬ ＮＫ細胞が、末梢血又は臍帯血由来ＮＫ細胞である、請求項２１に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】