特表 2022-540275 テトラメチルピラジンニトロンの結晶形、製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-15

(54)【発明の名称】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形、製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 241/12 20060101AFI20220908BHJP

   A61K 31/4965 20060101ALI20220908BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220908BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220908BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220908BHJP

【ＦＩ】

C07D241/12 CSP

A61K31/4965

A61P25/00

A61P9/00

A61P43/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021558685

(86)(22)【出願日】2019-07-31

(85)【翻訳文提出日】2021-11-09

(86)【国際出願番号】 CN2019098724

(87)【国際公開番号】W WO2020199440

(87)【国際公開日】2020-10-08

(31)【優先権主張番号】201910255805.3

(32)【優先日】2019-04-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521378521

【氏名又は名称】グゥアンヂョウ マグパイ ファーマシューティカルズ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＭＡＧＰＩＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ Ｆ６１０， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ， Ｎｏ． ３ Ｌａｎｙｕｅ Ｒｏａｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｐｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リウ ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】スン イェウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン ユーチァン

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086AA04

4C086BC48

4C086GA15

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA03

4C086ZA01

4C086ZA36

4C086ZC52

(57)【要約】

本開示は、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形、製造方法及びその応用に関し、ＸＲＰＤスペクトルが１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２３．８１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを提供する。前記結晶形Ａは、結晶転位が発生するリスクが低く、安定性が高く、製剤の製造及び保管中の安定性に有利であり、製剤における結晶形の含有量の一貫性を効果的に確保し、安全で効果的であり、品質管理が可能であり、また、高い生物活性及び良好な創薬可能性を有し、生物学的利用能が高く、効果発現が速く、生物活性が高い。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＸＲＰＤスペクトルが１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２３．８１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示し、好ましくは、ＸＲＰＤスペクトルが１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１３．５１±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２１．２２±０．２、２３．８１±０．２、２５．２３±０．２、２７．０８±０．２の２θ角度位置に特徴的な回折ピークを示すことを特徴とする、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａ。

【請求項2】

図１と基本的に同じＸＲＰＤスペクトルを有することを特徴とする、請求項１に記載の結晶形Ａ。

【請求項3】

融点が７６℃～７８℃であることを特徴とする、請求項１に記載の結晶形Ａ。

【請求項4】

ＤＳＣスペクトルが図３に示されるものと基本的に同じであり、ＴＧＡスペクトルが図７に示されるものと基本的に同じであり、赤外線スペクトルが図９に示されるものと基本的に同じであることを特徴とする、請求項１に記載の結晶形Ａ。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶形Ａの製造方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする製造方法。
工程（１）：テトラメチルピラジンニトロン粗体を有機溶媒と混合し、水浴にて６０～８０℃まで加熱し、撹拌して濾過し、濾液を冷却して結晶化させ、結晶性固形分を得、
工程（２）：工程（１）で得られた結晶性固形分をｎ－ヘプタンと混合し、加熱して溶解させ、冷却して結晶化させ、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得る。

【請求項6】

工程（１）における前記有機溶媒は酢酸エチル、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン及びシクロヘキサンから選択される一種又は複数種であり、更に好ましくは、有機溶媒はｎ－ヘキサン又はｎ－ヘプタンである、又は、前記有機溶媒は、ｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶媒であり、工程（１）においてテトラメチルピラジンニトロン粗体と有機溶媒との重量体積比は１：５～２０であり、好ましくは１：８～１２であり、工程（１）において冷却して結晶化させる温度は２～１２℃から選択され、より好ましくは３～１０℃であり、最も好ましくは３～５℃であり、工程（２）においてテトラメチルピラジンニトロン粗体とｎ－ヘプタンとの重量体積比は好ましくは１：１～５であり、最も好ましくは１：１～３であり、工程（２）において結晶性固形分をｎ－ヘプタンと混合して加熱する温度は６０～８０℃であり、好ましくは６５～７５℃であり、冷却して結晶化させる温度は２～１２℃から選択され、より好ましくは４～１０℃である、ことを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。

【請求項7】

ＸＲＰＤスペクトルが８．９１±０．２、１１．４６±０．２、１４．２９±０．２、１７．６０±０．２、２１．１９±０．２、２２．０２±０．２、２３．１９±０．２、２４．３０±０．２、２４．９２±０．２、２９．２０±０．２、３１．４１±０．２の２θ角度位置に特徴的な回折ピークを示し、好ましくは、ＸＲＰＤスペクトルが８．９１±０．２、１１．４６±０．２、１２．００±０．２、１４．２９±０．２、１７．６０±０．２、１９．５０±０．２、２１．１９±０．２、２２．０２±０．２、２３．１９±０．２、２４．３０±０．２、２４．９２±０．２、２６．７０±０．２、２９．２０±０．２、３１．４１±０．２、３６．２０±０．２の２θ角度位置に特徴的な回折ピークを示すことを特徴とする、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物。

【請求項8】

融点が３７～４０℃であることを特徴とする、請求項７に記載の二水和物。

【請求項9】

請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶形Ａ又は請求項７～８のいずれか一項に記載の二水和物を含む、薬物組成物。

【請求項10】

神経系疾患、心血管・脳血管疾患及び変性老化疾患の治療用の薬物の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶形Ａ又は請求項７～８のいずれか一項に記載の二水和物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬化学の分野に関し、具体的には、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形、その製造方法及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

テトラメチルピラジンニトロン（ＴＢＮと略称される）は、テトラメチルピラジン（ＴＭＰ）のニトロン誘導体であり、テトラメチルピラジンの構造にニトロンファーマコフォアを付加して化学合成された新しい化合物である。その化学名は（シス）－２－メチル－Ｎ－［（３，５，６－トリメチルピラジン－２－）メチン］２－プロピルアミンオキシド、分子式はＣ_１２Ｈ_１９Ｎ_３Ｏ、分子量は２２１．３０であり、次の式に示される化学構造を有する。

【0003】

【化1】

【0004】

テトラメチルピラジンニトロンは、虚血による神経細胞の酸化的損傷を抑制することにより、神経細胞を保護するという役割を果たし、脳塞栓に伴う神経症状及び機能障害を軽減することができる。臨床的には、神経系疾患、心血管・脳血管疾患、及び変性老化疾患などの治療に用いることができる。

【発明の概要】

【0005】

本発明の目的は、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形、その製造方法及びその使用を提供することである。

【0006】

本発明の１つの目的は、ＸＲＰＤスペクトルが１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２３．８１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを提供することである。

【0007】

一つの具体的な実施形態において、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、そのＸＲＰＤスペクトルが１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１３．５１±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２１．２２±０．２、２３．８１±０．２、２５．２３±０．２、２７．０８±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す。

【0008】

一つの具体的な実施形態において、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、明細書の図１と基本的に同じＸＲＰＤスペクトルを有する。

【0009】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａには、針状、塊状、棒状という３つの結晶状態があり、その顕微鏡写真を図５及び図６に示す。

【0010】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、その融点がそれぞれ７６℃～７８℃である。

【0011】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、基本的に図３と同じのＤＳＣスペクトルを有する。

【0012】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形ＡのＴＧＡスペクトルを図７に示す。

【0013】

更に、本発明は、図９に示すような、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの赤外線スペクトルを提供する。

【0014】

本発明は系統的な結晶形スクリーニング実験により得られるものである。当該スクリーニング方法は、蒸発結晶化法（単一溶媒法と混合溶媒法）、加熱溶解・冷却沈殿法及び懸濁・スラリー化法などを含む。スクリーニング用溶媒には、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、トルエン、アセトン、ジオキサン、イソプロパノール、石油エーテル、ｎ－ヘキサン、酢酸イソプロピル、イソオクタン及び酢酸イソブチルなどの溶媒を含む。スクリーニング結果はすべて結晶形Ａである。

【0015】

更に、本発明は、以下の工程を含むテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの製造方法も提供する。
工程（１）：テトラメチルピラジンニトロン粗体を有機溶媒と混合し、水浴にて６０～８０℃まで加熱し、撹拌して濾過し、濾液を冷却して結晶化させ、結晶性固形分を得、
工程（２）：工程（１）で得られた結晶性固形分をｎ－ヘプタンと混合し、加熱して溶解させ、冷却して結晶化させ、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得る。

【0016】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（１）における前記有機溶媒は酢酸エチル、ｎ－ヘキサン、ｎ－ヘプタン及びシクロヘキサンから選択される一種又は複数種であり、更に好ましくは、有機溶媒はｎ－ヘキサン又はｎ－ヘプタンである、又は、前記有機溶媒として、ｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶媒を選択する。出願人は、好ましい有機溶媒を選択することにより、不純物の含有量を顕著に低減できることを見出した。

【0017】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（１）においてテトラメチルピラジンニトロン粗体と有機溶媒との重量体積比は１：５～２０であり、好ましくは１：８～１２である。

【0018】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（１）において冷却して結晶化させる温度は２～１２℃から選択され、より好ましくは３～１０℃であり、最も好ましくは３～５℃である。出願人は、冷却して結晶化させる温度が最も好ましい範囲にあると、不純物の含有量を顕著に低減できることを見出した。

【0019】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（２）においてテトラメチルピラジンニトロン粗体とｎ－ヘプタンとの重量体積比は好ましくは１：１～５であり、最も好ましくは１：１～３である。

【0020】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（２）において結晶性固形分をｎ－ヘプタンと混合して加熱する温度は６０～８０℃であり、好ましくは６５～７５℃である。

【0021】

更に、本発明に記載された製造方法では、工程（２）において冷却して結晶化させる温度は２～１２℃から選択され、より好ましくは４～１０℃である。

【0022】

本発明の別の目的は、ＸＲＰＤスペクトルが８．９１±０．２、１１．４６±０．２、１４．２９±０．２、１７．６０±０．２、２１．１９±０．２、２２．０２±０．２、２３．１９±０．２、２４．３０±０．２、２４．９２±０．２、２９．２０±０．２、３１．４１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物を提供することである。

【0023】

一つの具体的な実施形態において、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、そのＸＲＰＤスペクトルが８．９１±０．２、１１．４６±０．２、１２．００±０．２、１４．２９±０．２、１７．６０±０．２、１９．５０±０．２、２１．１９±０．２、２２．０２±０．２、２３．１９±０．２、２４．３０±０．２、２４．９２±０．２、２６．７０±０．２、２９．２０±０．２、３１．４１±０．２、３６．２０±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す。

【0024】

一つの具体的な実施例において、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、明細書の図２と基本的に同じＸＲＰＤスペクトルを有する。

【0025】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、その融点が３７～４０℃である。

【0026】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの二水和物のＤＳＣスペクトルは図４と基本的に同じである。

【0027】

更に、本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、そのＴＧＡスペクトルが図８に示される。

【0028】

本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、その温度が融点（約３７～４０℃）に達すると、重量が減少し始め、重量減少率は１３．６７％である。

【0029】

本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、テトラメチルピラジンニトロンを飽和エタノール水溶液の二成分系において冷却沈殿させたものであり、エタノール水溶液におけるエタノールの体積百分率は好ましくは５～５０％であり、より好ましくは５～２０％である。

【0030】

別の態様では、本発明は、本発明の結晶形Ａ又は二水和物を一種又は複数種含む薬物組成物を提供する。前記薬物組成物は、任意に、薬学的に許容される担体、賦形剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、流動促進剤及び／又は媒体などをさらに含んでもよい。

【0031】

別の態様では、本発明に記載された結晶形Ａ及び／又は二水和物、あるいは本発明に記載された薬物組成物は、経口又は注射などの投与経路により投与することができる。

【0032】

別の態様では、本発明は、本発明の結晶形Ａ及び／又は二水和物を含む剤形をさらに提供する。剤形は、錠剤、カプセル剤、粉末注射剤、分散剤などを含むが、それらに限定されず、好ましくは錠剤及び粉末注射剤である。

【0033】

別の態様では、本発明は、神経系疾患、心血管・脳血管疾患及び変性老化疾患の治療用薬物の製造における、本発明に記載された結晶形Ａ及び／又は二水和物、あるいは薬物組成物の使用をさらに提供する。

【0034】

本発明の有益な効果は以下のとおりである。
（１）本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａ及びテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、製造方法が簡単であり、大規模な工業生産が容易である。

【0035】

（２）本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、熱間処理、機械的処理及び加速試験（５０℃、７５％ＲＨ）において結晶形Ａとして安定しており、結晶転位が発生するリスクが低く、安定性が高く、製剤の製造及び保管中の安定性に有利であり、製剤における結晶形の含有量の一貫性を効果的に確保し、安全で効果的であり、品質管理が可能である。

【0036】

（３）本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、ほとんどの溶媒（例えばアセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン及び酢酸エチルなど）に溶解しやすく、水に非常に溶解しやすく、高い生物活性及び良好な創薬可能性を有し、生物学的利用能が高く、効果発現が速く、生物活性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形ＡのＸＲＤスペクトルである。

【図2】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａと二水和物の比較ＸＲＤスペクトルである。

【図3】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形ＡのＤＳＣスペクトルである。

【図4】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａと二水和物のＤＳＣスペクトルである。

【図5】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの生物顕微鏡画像である。

【図6】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの結晶状態観察図である。

【図7】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形ＡのＴＧＡスペクトルである。

【図8】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａと二水和物の比較ＴＧＡスペクトルである。

【図9】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの赤外線スペクトルである。

【図10】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを一週間懸濁してスラリー化した後のＸＲＤスペクトルである。

【図11】テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを１０分間研磨した後のＸＲＤスペクトルである。

【図12】テトラメチルピラジンニトロンの二水和物を１０分間研磨した後のＸＲＤスペクトルである。

【図13】結晶形Ａの打錠処理試験後のＸＲＰＤ分析スペクトルである。

【図14】水和物の打錠処理試験後のＸＲＰＤ分析スペクトルである。

【図15】結晶形Ａの冷間処理後のＤＳＣスペクトルである。

【図16】結晶形Ａの冷間処理後のＸＲＰＤスペクトルである。

【図17】結晶形Ａの熱間処理後のＤＳＣスペクトルである。

【図18】結晶形Ａの熱間処理後のＸＲＰＤスペクトルである。

【図19】テトラメチルピラジンニトロン水和物の熱間処理後のＤＳＣスペクトルである。

【図20】テトラメチルピラジンニトロン水和物の熱間処理後のＸＲＰＤスペクトルである。

【図21】結晶形Ａの７日間の加速試験後のＸＲＰＤスペクトルである。

【図22】ＳＤラットにテトラメチルピラジンニトロンを静脈内投与した（３０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６、雌雄半々）後の組織分布結果である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

以下に実施例を参照して本発明を更に説明する。本明細書に記載される具体的な実施例は本発明を解釈するためのものに過ぎず、本発明を限定するためのものではないと理解すべきである。本発明の構想の範囲内で本発明の製造方法について行う簡単な改良は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。以下の実施例において具体的な条件が示されていない実験方法は、通常本分野の公知の手段に準じる。以下の実施例で用いられる試験材料は、特に説明しない限り、いずれも通常の生化学試薬店から入手されたものである。

【0039】

以下の実施例及び図面では、特に説明しない限り、ＴＢＮという略称は本発明に記載されたテトラメチルピラジンニトロンを意味する。

【0040】

以下の実施例では、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａ及びテトラメチルピラジンニトロンの二水和物のＸＲＤスペクトルにおける特徴的な回折ピークは、以下の実験条件で測定された。

【0041】

粉末Ｘ線回折分析装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ２ＰＨＡＳＥＲ）を用いた。電圧及び管電流はそれぞれ３０ＫＶ及び１０ｍＡであり、サンプルの２θスキャン角度は３°～４０°であり、スキャンステップは０．０２°である。

【実施例1】

【0042】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）、及びシクロヘキサン（１００ｍｌ）と酢酸エチル（２ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0043】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例2】

【0044】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）、及びｎ－ヘキサン（１００ｍｌ）と酢酸エチル（２ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0045】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例3】

【0046】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）及びシクロヘキサン（１００ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0047】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例4】

【0048】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）及びｎ－ヘキサン（１００ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0049】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例5】

【0050】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）及びｎ－ヘプタン（１００ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0051】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例6】

【0052】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）及びｎ－ヘキサン（１００ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて１０℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0053】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【実施例7】

【0054】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、テトラメチルピラジンニトロン粗体（１０ｇ）及びｎ－ヘキサン（１００ｍｌ）を添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、続いて熱いうちに濾過し、橙黄色の溶液を得た。濾液を静置し、周囲温度（１０℃）まで冷却し、続いて４℃の冷蔵室に入れて静置し、濾過し、濾過ケーキをｎ－ヘキサンで洗浄し、溶媒を減圧除去し、淡黄色の結晶性固形分を得た。

【0055】

２５０ｍｌの丸底フラスコに、上記テトラメチルピラジンニトロン粗体の固形分及びその２倍体積のｎ－ヘプタンを添加し、回転数を１４０±５ｒｐｍに調節し、水浴にて７０℃まで加熱し、持続的に撹拌し、橙黄色の清澄溶液を得た。水浴を外し、引き続き撹拌し、１０℃まで冷却して結晶化させ、吸引濾過し、固体をｎ－ヘプタンで洗浄し、乾燥重量減少率が１．０％未満になるように３８℃で２４時間真空乾燥し、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを得た。

【0056】

本発明の実施例１～７で製造されたテトラメチルピラジンニトロンの結晶形ＡのＸＲＤスペクトルを図１及び表１に示す。前記結晶形ＡのＸＲＤスペクトルは、１０．６０±０．２、１１．０３±０．２、１５．３１±０．２、１５．５５±０．２、１７．１４±０．２、１７．９３±０．２、２３．８１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す。ＤＳＣスペクトルには、図３に示されるように、融解ピークである１つの吸熱ピークがあり、その融点は７６℃～７８℃である。図５及び図６の顕微鏡写真から分かるように、テトラメチルピラジンニトロンには、針状、塊状、棒状という３つの結晶状態がある。ＴＧＡスペクトルを図７に示す。赤外線スペクトルを図９に示す。

【実施例8】

【0057】

テトラメチルピラジンニトロンを飽和エタノール水溶液（エタノールの体積百分率が９％である）の二成分系において冷却沈殿させ、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物を得た。製造された二水和物のＸＲＤスペクトルは、図２及び表１に示されるように、８．９１±０．２、１１．４６±０．２、１４．２９±０．２、１７．６０±０．２、２１．１９±０．２、２２．０２±０．２、２３．１９±０．２、２４．３０±０．２、２４．９２±０．２、２９．２０±０．２、３１．４１±０．２の２θ角度位置において特徴的な回折ピークを示す。ＤＳＣスペクトルを図４に示し、図４では、テトラメチルピラジンニトロンの二水和物の融点は３７～４０℃である。ＴＧＡスペクトルは図８に示す。

【0058】

【表1】

【0059】

製造方法の調査：
１、溶媒のテトラメチルピラジンニトロン最終生成物の収率及び品質への影響について調査した結果を表２に示す。

【0060】

【表2】

【0061】

２、結晶化温度のテトラメチルピラジンニトロン最終生成物の収率及び品質への影響について調査した結果を表３に示す。

【0062】

【表3】

【0063】

効果の調査：
１、安定性の調査
１．１ 懸濁による結晶転位試験
（１）テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを石油エーテル（１．０ｍＬ）中に室温条件で７日間懸濁してスラリー化した後、懸濁液を遠心分離し、固体サンプルを収集し、ＸＲＰＤ特性評価を行った。

【0064】

その結果、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは、石油エーテル中に一週間懸濁してスラリー化した後、依然として結晶形Ａのままであった。そのＸＲＤスペクトルを図１０に示した。

【0065】

１．２ 機械的処理による安定性試験
（２）テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａ及びテトラメチルピラジンニトロンの二水和物をそれぞれ１０分間研磨し、処理後のサンプルをＸＲＰＤにより分析した。

【0066】

その結果、本発明に記載された結晶形Ａは、１０分間研磨した後、そのＸＲＰＤスペクトルにおける特徴的なピークが変化しなかった。テトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、１０分間研磨した後、その結晶形が変化しなかった。これらのスペクトルを図１１及び図１２に示した。

【0067】

１．３ 打錠処理試験
（３）結晶形Ａ及びテトラメチルピラジンニトロンの二水和物を、圧力２トンで２分間打錠処理し、錠状に加圧した後にＸＲＰＤにより分析した。

【0068】

その結果、図１３及び１４に示すように、結晶形Ａ及びテトラメチルピラジンニトロンの二水和物は、圧力２トンで２分間加圧した後、その結晶形がいずれも変化しなかった（結晶化度がいずれも小さくなった）。

【0069】

１．４ 冷間・熱間処理による安定性実験
（４）結晶形Ａを－５５℃まで冷却してから、２５℃まで昇温させた。その結果、図１５及び１６に示すように、結晶形Ａは変化しなかった。

【0070】

（５）結晶形Ａを１１０℃（分解点未満）まで加熱した後、２５℃まで冷却し、黄色の油状液体を得、撹拌した後、白色の固体が析出した。ＸＲＰＤ特性評価の結果、図１７及び１８に示すように、結晶形Ａであった。

【0071】

（６）テトラメチルピラジンニトロン水和物を１１０℃（分解点未満）まで加熱した後、２５℃まで冷却し、黄色の油状液体を得、撹拌した後、白色の固体が析出した。ＸＲＰＤ特性評価の結果、図１９及び２０に示すように、結晶形Ａであった。

【0072】

１．５ 加速の影響に関する実験
結晶形Ａを４０℃、ＲＨ＝７５％の環境で７日間加速させた。ＸＲＰＤ特性評価の結果、図２１に示すように、結晶形Ａであった。

【0073】

２、生物活性の調査
カニクイザルの脳卒中動物モデルの薬力学研究を行うと同時に、カニクイザルの脳脊髄液におけるテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの薬物動態研究も行った。２回目投与（３０ｍｇ／ｋｇで１回目静脈内投与してから６時間後に、３０ｍｇ／ｋｇで投与する）してから１０分、３０分、６０分、１２０分後にそれぞれ０．５ｍｌの脳脊髄液を採取し、薬物動態試験を行った。

【0074】

【表4】

【0075】

表４の実験結果によれば、２回目の投与をしてから１０分後の脳脊髄液におけるテトラメチルピラジンニトロンの濃度は１７６μＭであり、血漿中の薬物濃度（１９５μＭ）とほぼ等しく、インビトロ細胞実験におけるテトラメチルピラジンニトロンの有効保護濃度である３０μＭを超えていることが示された。この結果から明らかなように、テトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａは血液脳関門を通過し、有効保護濃度に達することができる。

【0076】

３、代謝データのクリアランス
ＳＤラットに静脈内注射によりテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａを３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、各組織におけるテトラメチルピラジンニトロンの結晶形Ａの分布状況を調査した。

【0077】

実験結果を図２２に示す。結果によれば、テトラメチルピラジンニトロンが３０ｍｇ／ｋｇでオスとメスのラットに静脈内投与された後、血漿とほぼ同時に全ての組織に迅速で広く分布し、２４時間後に血漿とほぼ同時にインビトロで排出され、テトラメチルピラジンニトロンが試験対象組織に蓄積する傾向がないことが示された。投与してから０．２５時間後の脳組織におけるテトラメチルピラジンニトロン濃度は血漿中濃度の０．６～０．７倍であり、４時間後には血漿中濃度の０．８～１．１倍であり、２４時間後には血漿中と同様にテトラメチルピラジンニトロンが完全に除去された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【国際調査報告】