特表2022-540287肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-15
(54)【発明の名称】肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/85 20060101AFI20220908BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220908BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220908BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220908BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220908BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20220908BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20220908BHJP
【ＦＩ】
C12N15/85 Z ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A01K67/027
C12N9/16 A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021566994
(86)(22)【出願日】2020-10-20
(85)【翻訳文提出日】2021-11-09
(86)【国際出願番号】 CN2020122228
(87)【国際公開番号】W WO2022027826
(87)【国際公開日】2022-02-10
(31)【優先権主張番号】202010764997.3
(32)【優先日】2020-08-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521491705
【氏名又は名称】ジェムファーマテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＧｅｍＰｈａｒｍａｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】１２ Ｘｕｅｆｕ Ｒｄ， Ｊｉａｎｇｂｅｉ Ｎｅｗ Ａｒｅａ， Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００００， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100087745
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 善廣
(74)【代理人】
【識別番号】100160314
【弁理士】
【氏名又は名称】西村 公芳
(74)【代理人】
【識別番号】100134038
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 薫央
(74)【代理人】
【識別番号】100150968
【弁理士】
【氏名又は名称】小松 悠有子
(72)【発明者】
【氏名】ジュ ツンシィァン
(72)【発明者】
【氏名】ジャ ドンジン
(72)【発明者】
【氏名】ヂャオ ジン
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD02
4B050KK20
4B050LL10
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
(57)【要約】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法を開示し、遺伝子工学および遺伝子改変の技術分野に関する。本開示のターゲティングベクターは、第１の発現カセットおよび第１の発現カセットの下流に位置する第２の発現カセットを含む。第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含む。第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含む。ターゲティングベクターで構築された肝障害マウスモデルは、自発的肝障害と誘導による肝障害の悪化という表現型を持ち、ハイブリッド子孫のマウス死亡率が低く、大規模繁殖に寄与できる。本開示は、肝疾患研究のための信頼できる肝損傷マウスモデルを提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイトへの前記ターゲット配列の挿入を媒介するための５’末端相同性アーム配列および３’末端相同性アーム配列と、を含み、前記ターゲット配列は、第１の発現カセットおよび前記第１の発現カセットの下流に位置する第２の発現カセットを含み、
前記第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含み、
前記第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含み、
前記肝臓特異的プロモーターは、前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターの発現を上流から下流に駆動し、前記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子の発現を下流から上流に駆動する
ことを特徴とする肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター。
【請求項2】
前記第１の発現カセットは、さらにエンハンサー配列を有し、前記エンハンサー配列は、前記肝臓特異的プロモーターの上流に位置することを特徴とする請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項3】
前記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、アポリポプロテインＥプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、α－Ｉ－アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＩＧＦ－ＩＩプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ＨＢＶ基本コアタンパク質プロモーター、ＨＢＶプレ－ｓ２タンパク質プロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、ＨＣＲ－Ａｐ０ＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼプロモーター、アポリポプロテインＨプロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、α－フィブリノーゲンおよびβ－フィブリノーゲンプロモーター、α－Ｉ－アンチキモトリプシンプロモーター、α－２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質プロモーター、補体Ｃ３アクチベータープロモーター、ヘモコングロビンプロモーターおよびα－Ｉ－酸糖タンパク質プロモーターのいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項4】
前記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項5】
前記エンハンサー配列は、アルブミンエンハンサーであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項6】
前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡおよびＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇのいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項7】
前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇであることを特徴とする請求項６記載のターゲティングベクター。
【請求項8】
前記第１のｐｏｌｙＡは、ＨＧＨｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項9】
前記第２の発現カセットにおいて、前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子と前記テトラサイクリン誘導性プロモーターの間にコザック配列が挿入されていることを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のターゲティングベクター。
【請求項10】
前記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３ＧおよびＴｅｔＯ６のいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項11】
前記テトラサイクリン誘導性プロモーターはＴＲＥ３Ｇであることを特徴とする請求項１０に記載のターゲティングベクター。
【請求項12】
前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子によってコードされるマウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項13】
前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６の位置１～１３０２に示されるものであり、またはその相補的配列であることを特徴とする請求項１２に記載のターゲティングベクター。
【請求項14】
前記第２のｐｏｌｙＡは、ウサギｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ｈＧＨｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項15】
前記ターゲットサイトは、Ｒｏｓａ２６サイトであることを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のターゲットベクター。
【請求項16】
前記５’末端相同性アーム配列は、配列番号４に示されるものであり、またはその相補的配列であり、前記３’末端相同性アーム配列は、配列番号５に示されるものであり、またはその相補的配列である
ことを特徴とする請求項１５に記載のターゲティングベクター。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクターと、前記ターゲットサイトでマウスゲノム配列に二本鎖切断を引き起こさせるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物とを含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを構築するための核酸組成物。
【請求項18】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１７に記載の核酸組成物。
【請求項19】
前記ｓｇＲＮＡのターゲット配列は、配列番号９に示されるものであることを特徴とする請求項１８記載の核酸組成物。
【請求項20】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクターを含むことを特徴とする組換え細胞。
【請求項21】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクター、または請求項１７～１９のいずれか一項に記載の核酸組成物を含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを構築するためのキット。
【請求項22】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクター、または請求項１７～１９のいずれか一項に記載の核酸組成物を使用して、ターゲットマウスのゲノム上の前記ターゲットサイトに前記ターゲット配列を挿入することを特徴とする肝障害のマウスモデルの構築方法。
【請求項23】
前記ターゲットマウスは、免疫不全マウスであることを特徴とする請求項２２に記載の構築方法。
【請求項24】
免疫不全マウスからの受精卵に前記核酸組成物を注射し、そして、前記受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、さらに前記偽妊娠雌マウスの子孫から、肝損傷マウスモデルである、ゲノムに前記ターゲット配列が挿入された陽性マウスをスクリーニングすることを含むことを特徴とする請求項２３に記載の構築方法。
【請求項25】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載の構築方法によって得られた肝損傷マウスモデルを、免疫不全の野生型マウスと交配させることを含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを繁殖させる方法。
【請求項26】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載の構築方法により得られた肝障害マウスモデル、または請求項２５に記載の育種法により得られた肝障害マウスモデルの肝疾患治療薬のスクリーニングへの非疾患の診断または治療目的の使用。
【請求項27】
ヒト肝細胞を前記肝障害マウスモデルに移植して肝臓をヒト化し、さらに肝臓がヒト化された前記肝障害マウスモデルを使用して薬物をスクリーニングすることを含むことを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【請求項28】
請求項２２～２４のいずれか一項に記載の構築方法により得られた肝障害マウスモデルまたは請求項２５に記載の育種法により得られた肝障害マウスモデルを提供し、前記肝障害マウスモデルにヒト肝細胞を移植して肝臓をヒト化し、
候補薬物を肝臓がヒト化された前記肝障害マウスモデルに投与する
ことを特徴とする肝疾患の治療のための薬をスクリーニングする方法。
【請求項29】
前記肝疾患は、ウイルス性肝炎、肝線維症、肝硬変、脂肪肝、薬物誘発性肝障害、および肝癌から選択されるものであることを特徴とする請求項２６または２７に記載の使用または請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
肝障害のマウスモデルの構築への使用のための請求項１～１６のいずれか一項に記載のターゲティングベクター。
【発明の詳細な説明】
【関係出願の相互参照】
【0001】
この出願は、２０２０年８月３日に中国専利局に提出された、出願番号が２０２０１０７６４９９７３であり、名称が「肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成および構築方法」である中国特許出願に基づいて優先権を主張し、その全ての内容が、参照により本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【0002】
本開示は、遺伝子工学および遺伝子改変の技術分野に関し、具体的には、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法に関する。
【背景技術】
【0003】
肝疾患は、人間の健康を脅かす最も深刻な疾患の１つであり、特にＢ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、肝硬変、肝がん、非アルコール性脂肪性肝（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、および薬物誘発性肝障害（ＤＩＬＩ）であり、それらの中で、ウイルス性肝炎が最も多い疾患である。ウイルス性肝炎は、肝指向性を有し、強い種特異性と組織特異性を持っている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスの自然宿主は、ヒトと少数の非ヒト霊長類（チンパンジー）に限定されており、宿主の肝臓組織のみが感染する。しかし、ウイルス性肝炎の研究のためのチンパンジーの使用は、倫理的および経済的に制限されている。ヒト肝疾患が複雑であり、適切な動物モデルが乏しいので、医学研究とヒト肝疾患の変容は限られている。キメラのヒト肝細胞により、ヒト化肝マウスモデルは、肝炎ウイルスによるヒト感染のプロセスをシミュレートすることができ、肝疾患をより深く研究することができるようになる。
【0004】
医薬品開発では、前臨床動物実験およびヒト実験の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）を利用して、医薬品が安全かどうかを判断し、医薬品の臨床試験の成功に重要な役割を果たしている。しかし、多くの薬物代謝酵素が種特異性を持ち、ラットやマウスの肝臓代謝機能がヒトの肝臓とは異なるので、ラットまたはマウスを用いる薬物ＰＫ／ＰＤテストは、ヒトにおける薬物の効果を真に反映することはできない場合がある。このため、人体に対する薬物の安全性に大きなリスクがある。人体の薬物代謝経路を明らかにするためには、ヒトの肝細胞に対して試験を行う必要がある。インビトロのヒト肝細胞代謝実験と比較すると、ヒト化肝マウスは、人体における薬物の代謝経路をより正確に反映することができる。
【0005】
ヒト化肝マウスの構築は、肝障害を有するマウスをレシピエントとして使用し、ヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞がマウス内で増殖し、機能的なヒト－マウスキメラ肝臓に発達する必要がある。現在、通常使用されている肝障害モデルは、ｕＰＡ－ＳＣＩＤ、Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－（ＦＲＧ）、ＴＫ－ＮＯＧおよびＡｌｂ－ｕＰＡなどを含む。これらのモデルのヒト肝臓キメラ現象率は、９０％に達する可能性があると報告されているが、これらのモデルにはまだいくつかの欠点があり、その使用が制限されている。例えば、ｕＰＡ－ＳＣＩＤ、Ａｌｂ－ｕＰＡ、およびＦＲＧモデルは、肝毒性のために周産期に子孫マウスが頻繁に死亡し、その結果、新生児マウスの死亡率が非常に高くなり、大規模な繁殖が困難になる。また、ＴＫ－ＮＯＧモデルマウスの雄性不稔性により、モデルを繁殖しにくく、モデルの使用が制限されている。また、ｕＰＡ－ＳＣＩＤマウスが再構築された後、相同組換えによるｕＰＡ遺伝子の欠失により、ヒト肝細胞（ｈ－ｈｅｐｓ）の置換指数が低下し、腎疾患が発生しやすくなる。Ｄｅｎｇ Ｈｏｎｇｋｕｉは、異なるベクターフラグメントを保有するマウスを使用してｕＰＡ遺伝子を保有するアデノウイルスをトランスフェクトするか、異なるベクターを保有する２つのモデルを介して、マウスでＴｅｔ ｏｎ－ｕＰＡ組換えシステムを実現した（ただし、育種プロセスが非常に面倒である）。理論的には、ｕＰＡ発現のタイミングを制御可能にすることによって、マウスの死亡を改善した。ただし、ｕＰＡ発現の維持にはアデノウイルス感染の繰り返しが必要であるため、宿主マウスが耐性を示しやすく、これはその後のアデノウイルス感染率に影響を及ぼし、ｕＰＡの発現を低下させ、肝細胞再構成の効率が低下した。さらに、このモデルは、アデノウイルスの注射後に自然免疫を活性化する可能性があり、肝炎ウイルスによって刺激される免疫応答の観察に影響を及ぼし、肝炎ウイルス感染の研究に適していない。
【0006】
以上により、当分野では、ヒト化肝臓の構築に適した肝損傷マウスモデル、およびその後の肝疾患研究および薬物スクリーニングのためのヒト化肝臓マウスモデルの使用が必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクターを提供する。上記ターゲティングベクターは、ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイトへのターゲット配列の挿入を媒介するための５’末端相同性アーム配列および３’末端相同性アーム配列を含み、上記ターゲット配列は、第１の発現カセットおよび上記第１の発現カセットの下流に位置する第２の発現カセットを含み、
上記第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含み、上記第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含み、
上記肝臓特異的プロモーターは、上記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターの発現を上流から下流に駆動し、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子の発現を下流から上流に駆動する。
上記第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含み、上記第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含み、
上記肝臓特異的プロモーターは、上記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターの発現を上流から下流に駆動し、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子の発現を下流から上流に駆動する。
【0008】
１つまたは複数の実施形態において、上記第１のｐｏｌｙＡは、１～３個の同一または異なるｐｏｌｙＡ結合から構成される。１つまたは複数の実施形態において、各ｐｏｌｙＡにおけるＡ（アデニル酸）の数は、５０～２００である。
【0009】
１つまたは複数の実施形態において、上記第２のｐｏｌｙＡは、１～３個の同一または異なるｐｏｌｙＡ結合から構成される。１つまたは複数の実施形態において、各ｐｏｌｙＡにおけるＡ（アデニル酸）の数は、５０～２００である。
【0010】
１つまたは複数の実施形態において、上記第１の発現カセットは、さらにエンハンサー配列を有し、上記エンハンサー配列は、肝臓特異的プロモーターの上流に位置する。
【0011】
１つまたは複数の実施形態において、上記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、アポリポプロテインＥプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、α－Ｉ－アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＩＧＦ－ＩＩプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ＨＢＶ基本コアタンパク質プロモーター、ＨＢＶプレ－ｓ２タンパク質プロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、ＨＣＲ－Ａｐ０ＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼプロモーター、アポリポプロテインＨプロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、α－フィブリノーゲンおよびβ－フィブリノーゲンプロモーター、α－Ｉ－アンチキモトリプシンプロモーター、α－２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質プロモーター、補体Ｃ３アクチベータープロモーター、ヘモコングロビンプロモーターおよびα－Ｉ－酸糖タンパク質プロモーターのいずれか１つから選択されるものである。
【0012】
１つまたは複数の実施形態において、上記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターである。
【0013】
１つまたは複数の実施形態において、上記エンハンサー配列は、アルブミンエンハンサーである。
【0014】
１つまたは複数の実施形態において、上記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、およびＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇのいずれか１つから選択されるものである。
【0015】
１つまたは複数の実施形態において、上記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇである。
【0016】
１つまたは複数の実施形態において、上記第１のｐｏｌｙＡは、ＨＧＨｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものである。
【0017】
１つまたは複数の実施形態において、上記第２の発現カセットにおいて、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子と上記テトラサイクリン誘導性プロモーターの間にＫｏｚａｋ配列が挿入されている。
【0018】
１つまたは複数の実施形態において、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３ＧおよびＴｅｔＯ６のいずれか１つから選択されるものである。
【0019】
１つまたは複数の実施形態において、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇである。
【0020】
１つまたは複数の実施形態において、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子によってコードされるマウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるものである。
【0021】
１つまたは複数の実施形態において、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６の１～１３０２位に示されるものであり、またはその相補的配列である。
【0022】
１つまたは複数の実施形態において、上記第２のｐｏｌｙＡは、ウサギｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ｈＧＨｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものである。
【0023】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲットサイトは、Ｒｏｓａ２６サイトである。
【0024】
１つまたは複数の実施形態において、上記５’末端相同性アーム配列は、配列番号４に示されるものであり、またはその相補的配列である。上記３’末端相同性アーム配列は、配列番号５に示されるものであり、またはその相補的配列である。
【0025】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するための核酸組成物を提供し、上記のターゲティングベクターと、前記ターゲットサイトでマウスゲノム配列に二本鎖切断を引き起こさせるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の組み合わせを含む。
【0026】
１つまたは複数の実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを含む。
【0027】
１つまたは複数の実施形態において、上記ｓｇＲＮＡのターゲット配列は、配列番号９に示されるものである。
【0028】
本開示は、上記のターゲティングベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0029】
本開示は、上記のターゲティングベクター、または上記の核酸組成物を含む肝障害のマウスモデルを構築するためのキットを提供する。
【0030】
本開示は、上記のターゲットベクターまたは上記の核酸組成物を使用して、ターゲットマウスのゲノム上の上記ターゲットサイトに上記ターゲット配列を挿入する肝障害のマウスモデルの構築方法を提供する。
【0031】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲットマウスは、免疫不全マウスである。
【0032】
１つまたは複数の実施形態において、上記方法は、免疫不全マウスからの受精卵に上記核酸組成物を注射し、そして、前記受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、さらに上記偽妊娠雌マウスの子孫から、肝損傷マウスモデルである、ゲノムに上記ターゲット配列が挿入された陽性マウスをスクリーニングすることを含む。
【0033】
本開示は、肝障害マウスモデルを繁殖させるための方法を提供し、上記の構築方法によって得られた肝障害マウスモデルを免疫不全の野生型マウスと交配させることを含む。
【0034】
本開示は、上記の構築方法によって得られた肝障害マウスモデル、または上記の育種方法によって得られた肝障害マウスモデルの肝疾患治療薬のスクリーニングへの非疾患の診断または治療目的の使用を提供する。
【0035】
１つまたは複数の実施形態において、ヒト肝細胞を上記肝障害マウスモデルに移植して肝臓をヒト化し、さらに肝臓がヒト化された前記肝障害マウスモデルを使用して薬物をスクリーニングすることを含む。
【0036】
本開示は、肝疾患の治療のための薬物をスクリーニングする方法を提供し、上記の構築方法により得られた肝障害マウスモデルまたは上記の育種法により得られた肝障害マウスモデルを提供し、上記肝障害のマウスモデルにヒト肝細胞を移植して肝臓をヒト化し、候補薬剤を肝臓がヒト化された上記肝損傷マウスモデルに投与することを含む。
【0037】
本開示は、上記の用途または上記の方法を提供し、上記肝疾患は、ウイルス性肝炎、肝線維症、肝硬変、脂肪肝、薬物誘発性肝障害、および肝癌から選択されるものである。
【0038】
本開示は、肝損傷のマウスモデルの構築への使用のための上記のターゲティングベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
本開示における実施例の技術案をより明瞭に説明するため、以下、実施例の説明に必要な図面を簡単に説明する。説明する図面は、本開示の一部の実施例を示すものにすぎず、範囲を限定するものではない。当業者は、発明能力を用いなくても、これらの図面に基づいて他の関連図面を得ることが可能である。
【図1】実施例１のターゲティングベクターのターゲット配列の構造の概略図である。
【図2】実施例２の中間ベクターを含む細菌液の一部のＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果の図である。
【図3】実施例２におけるいくつかの中間ベクターの酵素消化同定のゲル電気泳動結果の図である（ＤＬがＤＬ２０００標準（マーカー）に基づくものであり、バンドサイズがそれぞれ２０００、１０００、７５０、５００、２００、１００ｂｐであり、Ｔ１４がＥｃｏＴ１４Ｉ標準（マーカー）に基づくものであり、バンドサイズがそれぞれ１９３２９、７７４３、６２２３、４２５４、３４７２、２６９０、１８８２、１４８９ｂｐである）。
【図4】実施例２におけるターゲティングベクターを含む細菌液体のＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果の図である。
【図5】実施例２におけるターゲティングベクターの酵素消化同定のゲル電気泳動結果の図である。
【図6】実施例３における対照ターゲティングベクターの構造の概略図である。
【図7】実施例３における対照ターゲティングベクターを含む細菌液体のＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果の図である。
【図8】実施例３における対照ターゲティングベクターの酵素消化同定のゲル電気泳動結果の図である。
【図9】Ｆ１世代のＨ１１－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果の図である（ＡはＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの陽性およびｗｔの同定結果であり、ＢはＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのポジティブターゲティング配列の３’末端と５’末端の同定結果である）。
【図10】Ｆ１世代のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのＰＣＲ同定のゲル電気泳動結果の図である（Ａはマウス＃２でＰＣＲによって同定されたゲル電気泳動結果の図であり、Ｂはマウス＃１５でＰＣＲによって同定されたゲル電気泳動の結果図である）。
【図11】ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって誘発されたＨ１１－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの肝障害の結果である（ＡはＨ１１－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスにＤｏｘ水を与えて肝障害を誘発する場合の結果であり、ＢはＨ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡホモ接合マウスにＤｏｘ水または強制飼養（ＰＯ）を与えて肝障害を誘発する場合の結果である）。
【図12】自発性肝障害のあるＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性の測定結果である。
【図13】４週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのＨＥ染色結果であり、重度の肝障害を示している。
【図14】３～４週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのＤｏｘによる肝障害の悪化のテスト結果である（Ａは３～４週齢のマウスにＤｏｘ誘導を与えた後の血清ＡＬＴの変化を示し、Ｂは３～４週齢のマウスにＤｏｘ誘導を与えてから７日後、マウスの肝臓のＨＥ染色を示す）。
【図15】肝障害の悪化を誘発するためにＤｏｘを投与された６～８週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの試験結果である（Ａは６～８週齢のマウスにＤｏｘ誘導を与えた後の血清ＡＬＴの変化を示し、Ｂは６～８週齢のマウスにＤｏｘ誘導を与えてから７日後、マウスの肝臓のＨＥ染色を示す）。
【図16】異なる週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに対して緑色蛍光肝細胞を移植して１０週間後の肝臓形態である（緑色蛍光肝細胞が肝臓の５つの表面に均一に分布している）。
【図17】異なる週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに対して肝細胞を移植して１０週間後の緑色蛍光細胞の観察結果である。
【図18】ｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓプラスミドベクターマップである。
【図19】ＰＭＤ１８Ｔ－Ｈ１１－ＣＡＧ－ＦＬＰｏプラスミドベクターマップである。
【図20】Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡホモ接合マウスの自発性肝障害のＡＬＴ活性の測定結果である。
【図21】各要素の位置関係を示す（Ａは、２つの発現カセットがテールツーテールで接続される場合であり、Ｂは、２つの発現カセットがテールツーヘッドで接続される場合であり、Ｃは、２つの発現カセットがヘッドツーヘッドで接続され場合であり、Ｄは、緑色蛍光ＧＦＰプラスミドを発現する）。
【図22】ＧＦＰプラスミドがＨｅｐＧ２細胞にエレクトロポレーションされた後、細胞で緑色蛍光を発現できることを示す。
【図23】２つのカセット間の接続関係が異なるプラスミドをＨｅｐＧ２細胞にエレクトロポレーションした後の細胞への影響を示す。
【図24】ＧＦＰプラスミドを尾静脈に注射した後、マウスが肝細胞で緑色蛍光を発現できることを示す。
【図25】２つの発現カセット間の接続関係が異なるプラスミドによって引き起こされた肝障害のあるマウスのＡＬＴレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本開示の実施例の目的、技術案および利点をより明瞭にするため、以下、本開示の実施例の技術案を明瞭、完全に説明する。実施例において、具体的な条件が明記されていないものについて、従来の条件またはメーカーの勧めの条件下で行うことが可能である。使用する試剤または器械の、製造メーカーが明記されていないものが、市販の従来品を使用することが可能である。
【0041】
本開示の１つまたは複数の実施形態は、例えば、肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法を提供することを目的とする。本開示のターゲティングベクターを使用して構築された肝障害マウスモデルは、誘導物質を使用せずに肝障害を形成でき、つまり、自発的に肝障害を形成することができる。また、誘導物質を使用すると、肝障害の程度を高めることができる。さらに、この肝障害マウスモデルによる自発的肝障害の程度は、外因性肝細胞移植の要件を満たすことができるとともに、肝細胞移植後の再構築率も高い。また、この肝障害マウスモデルは、交雑により子孫肝障害マウスを繁殖させることができ、子孫マウスの死亡率が低く、大規模な繁殖に寄与できる。本開示は、肝疾患研究のための信頼できる肝損傷マウスモデルを提供する。
【0042】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクターを提供する。上記ターゲティングベクターは、ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイトへのターゲット配列の挿入を媒介するための５’末端相同性アーム配列および３’末端相同性アーム配列と、を含む。上記ターゲット配列は、第１の発現カセットおよび第１の発現カセットの下流に位置する第２の発現カセットを含む。
【0043】
上記第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含む。上記第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含む。
【0044】
ここで、上記肝臓特異的プロモーターは、テトラサイクリン転写活性化レギュレーターの発現を上流から下流に駆動し、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子の発現を下流から上流に駆動する。
【0045】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列の第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、それぞれのｐｏｌｙＡ接続によって接続され、すなわち、テールツーテール接続が形成される。
【0046】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列の第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、それぞれのｐｏｌｙＡ接続によって接続され、第１の発現カセットの転写方向は、第２の発現カセットの転写方向と反対である。
【0047】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列の第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、それぞれのプロモーターによって接続され、すなわち、ヘッドツーヘッド接続が形成される。
【0048】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列の第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、それぞれのプロモーターによって接続され、第１の発現カセットの転写方向は、第２の発現カセットの転写方向と反対である。
【0049】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列の第１の発現カセットおよび第２の発現カセットは、それぞれのプロモーターによって接続され、第１の発現カセットの転写方向は、第２の発現カセットの転写方向と同じであり、即ちテールツーヘッド接続が形成される。
【0050】
１つまたは複数の実施形態において、上記ターゲット配列は、順に配列された肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、第１のｐｏｌｙＡ、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを含む。
【0051】
本明細書では、「ｐｏｌｙＡ」は、ポリアデニンヌクレオチドとも呼ばれ、通常、複数のアデニンヌクレオチドから構成される鎖を指す。通常、ｐｏｌｙＡのアデニンヌクレオチドの数は５０－２００である。
【0052】
本開示のターゲティングベクターを使用して、上記のターゲット配列をマウスゲノムのターゲットサイトに挿入することができる。上記のターゲット配列における第１の発現カセットと第２の発現カセットとの間の接続関係は、テールツーテール方式で接続されていると理解することができる。本発明の発明者らは、驚くべきことに、上記の接続方式および要素を有する第１の発現カセットおよび第２の発現カセットのターゲット配列をゲノムに挿入されたマウスが、以下の予想以上の表現型または特徴を有することを発見した。それは、肝障害の理想的なマウスモデルとして使用できる。
【0053】
（１）誘導物質による誘発がなくても肝障害を形成でき、つまり、自発的に肝損傷を形成することができる。また、誘導物質を使用すると、肝損傷の程度を高めることができる。したがって、利用者は、移植に応じて選択的に誘発するかどうかを選択できるので、移植プロセスがより簡単になる。このような自発的な肝障害の表現型は、従来のＴｅｔ ｏｎシステムによるタンパク質の発現特性に対する調節の認識を破り、その表現型は、発明者の予想以上のものとなる。
【0054】
（２）この肝障害マウスモデルで自発的に形成された肝障害の程度は、外因性肝細胞の移植の要件を十分満足することができる。さらに誘発されると、肝障害の程度は、より深刻になり、外因性肝細胞の移植後の再構築率がより高くなる。
【0055】
（３）この肝障害マウスモデルは、交配によってより多くの子孫肝障害マウスを繁殖させることができ、その子孫マウスの死亡率は、従来の自発的な肝障害マウスモデルよりもはるかに低く、肝障害マウスモデルの大規模な繁殖に寄与でき、その表現型は、発明者の予想以上のものである。
【0056】
なお、いくつかの他の実施形態では、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットの位置を交換することができ、即ち第２の発現カセットを上流に位置させ、第１の発現カセットを下流に位置させ、要素の位置順序を対応して調整し、第２の発現カセットを下流即ち第１の発現カセットの方向に駆動し、第１の発現カセットを上流即ち第２の発現カセットの方向に駆動するように構成されることができる。この設置でも同様の効果が得られる。つまり、設置方向にかかわらず、２つの発現カセットのｐｏｌｙＡを隣接させ、２つの発現カセットが両端から中間方向へ発現を駆動すればよい。
【0057】
選択可能な実施形態において、上記第１の発現カセットは、エンハンサー配列を含み、エンハンサー配列が肝臓特異的プロモーターの上流に位置している。
【0058】
選択可能な実施形態において、上記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、アポリポプロテインＥプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、α－Ｉ－アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータープロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＩＧＦ－ＩＩプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ＨＢＶ基本コアタンパク質プロモーター、ＨＢＶ ｐｒｅ－ｓ２タンパク質プロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、ＨＣＲ－Ａｐ０ＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼプロモーター、アポリポプロテインＨプロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、α－フィブリノーゲンおよびβ－フィブリノーゲンプロモーター、α－Ｉ－アンチキモトリプシンプロモータープロモーター、α－２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質プロモーター、補体Ｃ３活性化因子プロモーター、造血プロモーターおよびα－Ｉ－酸糖タンパク質プロモーターのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。
【0059】
選択可能な実施形態において、上記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターである。
【0060】
選択可能な実施形態において、上記エンハンサー配列は、アルブミンエンハンサーを含むが、これに限定されない。
【0061】
選択可能な実施形態において、テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、およびＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇのいずれかから選択される。
【0062】
選択可能な実施形態において、上記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇである。
【0063】
選択可能な実施形態において、上記第１のｐｏｌｙＡは、ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡ、およびｒｂＧｌｏｂ ｐｏｌｙＡを含むが、これらに限定されない。
【0064】
選択可能な実施形態において、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３ＧおよびＴｅｔＯ６のいずれかから選択される。
【0065】
選択可能な実施形態において、上記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３Ｇｐである。
【0066】
選択可能な実施形態において、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子によってコードされるマウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列は、配列番号７に示されている。
【0067】
選択可能な実施形態において、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６の１～１３０２位またはその相補的配列に示されている。
【0068】
選択可能な実施形態において、上記第２のｐｏｌｙＡは、ウサギｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ、ｈＧＨ ｐｏｌｙＡ、ＢＧＨ ｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂ ｐｏｌｙＡを含むが、これらに限定されない。
【0069】
選択可能な実施形態において、上記第２の発現カセットにおいて、上記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子とテトラサイクリン誘導性プロモーターの間にＫｏｚａｋ配列が挿入されている。
【0070】
選択可能な実施形態において、上記ターゲットサイトはＲｏｓａ２６サイトである。
【0071】
上記のターゲット配列をＲｏｓａ２６サイトに挿入すると、ゲノム上の隣接する配列の干渉効果を回避でき、内因性遺伝子に損傷を与えることなく、マウスの正常な成長と正常な機能を保証する。さらに、他の一般的な挿入サイト（Ｈ１１など）と比較して、Ｒｏｓａ２６サイトに上記のターゲット配列を挿入すると、この肝障害マウスモデルは、独特の表現型を示す。つまり、自発的な肝障害の程度は、外来肝細胞の移植を満足することができる。さらに、肝障害マウスモデルは、誘導物質（Ｄｏｘなど）に対してより敏感であり、誘導後、肝損傷の程度が悪化するように見える。他のサイトにターゲット配列を挿入する場合、上記のような本開示の発明者の予想以上の技術的効果をもたらさなかった。
【0072】
選択可能な実施形態において、上記５’末端相同性アーム配列は、配列番号４またはその相補的配列に示されている。上記３’末端相同性アーム配列は、配列番号５またはその相補的配列に示されている。
【0073】
選択可能な実施形態において、上記ターゲティングベクターのバックボーンは、実際のニーズに応じて選択することができる。バックボーンベクターでターゲット配列をサポートすることができればよく、いずれも、本開示の保護範囲に属する。
【0074】
本開示は、上記のターゲティングベクターを含む組換え細胞を提供する。
【0075】
選択可能な実施形態において、組換え細胞は、大腸菌を含むが、これに限定されない。当業者は、上記のターゲティングベクターを保存または増幅するために、上記のターゲティングベクターを形質転換するための適切な宿主細胞を選択することができる。いずれにしても本開示の保護範囲に属する。
【0076】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するための核酸組成物を提供する。核酸組成物は、上記のいずれか１つに記載のターゲティングベクターと、ターゲットサイトでマウスゲノム配列に二本鎖切断を引き起こすためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物とを含む。
【0077】
選択可能な実施形態において、上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとを含む。
【0078】
選択可能な実施形態において、上記ｓｇＲＮＡのターゲット配列は、配列番号９に示されている。
【0079】
本明細書において、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物」とは、規則的なクラスター間隔の短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）とヌクレアーゼに基づく遺伝子編集システムを指す。通常、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、特定の遺伝子改変を実現できるｓｇＲＮＡ（小さなガイドＲＮＡ）とＣａｓ９タンパク質を含む。
【0080】
本開示は、上記のいずれか１つに記載のターゲットベクター、または上記のいずれか１つに記載の核酸組成物を含む、肝障害のマウスモデルを構築するためのキットを提供する。
【0081】
本開示は、上記のいずれか１つに記載のターゲティングベクター、または上記のいずれか１つに記載の核酸組成物を使用して、ターゲットマウスのゲノム上のターゲットサイトにターゲット配列を挿入する、肝障害のマウスモデルを構築するための方法を提供する。
【0082】
本開示は、肝損傷のマウスモデルを構築するための本明細書に記載のターゲティングベクターの使用を提供する。１つまたは複数の実施形態において、該使用は、ターゲットマウスのゲノム上のターゲットサイトにターゲット配列を挿入することを含む。
【0083】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するための本明細書に記載の核酸組成物の使用を提供する。１つまたは複数の実施形態において、該使用は、ターゲットマウスのゲノム上のターゲットサイトにターゲット配列を挿入することを含む。
【0084】
本開示は、肝損傷のマウスモデルを構築するための本明細書に記載のターゲティングベクターの使用を提供する。１つまたは複数の実施形態において、該使用は、ターゲットマウスのゲノム上のターゲットサイトにターゲット配列を挿入することを含む。
【0085】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するための本明細書に記載の核酸組成物の使用を提供する。１つまたは複数の実施形態において、該使用は、ターゲットマウスのゲノム上のターゲットサイトにターゲット配列を挿入することを含む。
【0086】
１つまたは複数の実施形態において、上記の使用は、本明細書に記載の構築方法によって得られた肝損傷マウスモデルを、免疫不全の野生型マウスと交配させることを含む。
【0087】
本開示の構築方法で構築された肝損傷マウスモデルは、誘導剤を使用せずに肝損傷を形成でき、つまり、自発的に肝損傷を形成することができる。また、誘導剤を使用すると、肝損傷の程度を高めることができる。さらに、この肝障害マウスモデルによる自発的肝障害の程度は、外因性肝細胞の移植の要件を満たすことができるとともに、移植後の再構築率も高い。また、肝障害マウスモデルは、交雑により子孫肝障害マウスを繁殖させることができ、子孫マウスの死亡率が低く、大規模な繁殖に寄与できる。
【0088】
本開示の肝損傷のマウスモデルを構築するための方法において、さらに、誘導剤でターゲットマウスを処理する。１つまたは複数の実施形態において、上記誘導剤は、Ｄｏｘである。
【0089】
選択可能な実施形態において、上記ターゲットマウスは、免疫不全マウス（ＮＣＧマウス）である。
【0090】
選択可能な実施形態において、上記方法は、免疫不全マウスからの受精卵に核酸組成物を注射し、そして、受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、偽妊娠雌マウスの子孫から、ゲノムにターゲット配列が挿入された陽性マウス、すなわち肝損傷マウスモデルをスクリーニングすることを含む。
【0091】
選択可能な実施形態において、上記受精卵の発育日数は、０．５日である。
【0092】
選択可能な実施形態において、上記偽妊娠雌マウスは、交尾成功から０．５日後の偽妊娠雌マウスである。
【0093】
本開示は、上記の構築方法によって得られた肝障害マウスモデルを免疫不全の野生型マウスと交配させることを含む、肝障害マウスモデルを繁殖させるための方法を提供する。
【0094】
上記の構築方法で得られた肝障害マウスモデルは、免疫不全の野生型マウスと交配でき、子孫マウスの死亡率は低く、親肝損傷マウスと同じ表現型の子孫肝損傷マウスを大規模に得ることが可能である。そのため、当業者は、上記の構築方法を繰り返して行う必要がなく、より単純なハイブリッド育種法によって理想的な肝損傷マウスモデルを大量に得ることができ、繁殖効率が大幅に向上し、肝障害マウスモデルの需要を効果的に満たすことができる。
【0095】
本開示は、肝疾患の治療のための薬物のスクリーニングにおける上記の構築方法または育種法によって得られた肝障害マウスモデルの使用を提供する。選択可能な実施形態において、上記使用は、非疾患の診断または治療を目的としている。他の選択可能な実施形態において、上記使用は、疾患の診断または治療を目的とする。
【0096】
本開示は、肝疾患の治療のための薬物のスクリーニングに使用するための上記の構築方法または育種方法によって得られた肝障害マウスモデルを提供する。
【0097】
選択可能な実施形態において、上記使用には、ヒト肝細胞を肝障害マウスモデルに移植して肝臓をヒト化し、さらに肝臓を介してヒト化された肝障害マウスモデルを使用して薬物をスクリーニングすることを含む。
【0098】
選択可能な実施形態において、上記肝疾患は、ウイルス性肝炎（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）、肝線維症、肝硬変、脂肪肝（例えば、アルコール性、非アルコール性脂肪性肝など）、薬物誘発性肝障害、肝がんから選択されるものを含むが、これらに限定されない。
【0099】
本開示のターゲティングベクターおよび構築方法を使用して得られた肝損傷マウスモデルは、例えばヒト幹細胞のような外因性肝細胞の移植、すなわち肝ヒト化が行われると、肝疾患を治療するための薬物をスクリーニングすることに使用されることが可能である。例えば、候補薬がヒト肝細胞などに有効か安全かを評価することができ、人体における候補薬の代謝をより正確に反映することができるので、より信頼性の高い薬を選別することができる。
【0100】
以下、実施例を参照しながら、本開示の特徴および性能をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【0101】
［実施例１］
本実施例は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクターを提供した。ターゲティングベクターは、ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイト（Ｒｏｓａ２６）へのターゲット配列の挿入を仲介するための５’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１）および３’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２）とを含む。各要素の位置関係は、図１に示されている。
本実施例は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクターを提供した。ターゲティングベクターは、ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイト（Ｒｏｓａ２６）へのターゲット配列の挿入を仲介するための５’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１）および３’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２）とを含む。各要素の位置関係は、図１に示されている。
【0102】
ここで、ターゲット配列は、第１の発現カセットおよび第１の発現カセットの下流の第２の発現カセットを、上流から下流への順に含む。
【0103】
第１の発現カセットは、アルブミンエンハンサー（Ａｌｂ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、アルブミンプロモーター（Ａｌｂ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ）および第１のｐｏｌｙＡ（ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ）を、順に直列に含む。図１において、発現は、左（上流）から右（下流）に駆動される。
【0104】
第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ（ウサギｐｏｌｙＡ、図１においてｐＡで示す）、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子（ｕＰＡ）、Ｋｏｚａｋ配列およびテトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）を、順に直列に含む。図１において、発現は、右（下流）から左（上流）に駆動される。
【0105】
Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１は、ターゲット配列の上流に位置し、Ｒｏｓａ２６ａｒｍ２は、ターゲット配列の下流に位置する。
【0106】
アルブミンプロモーター（Ａｌｂ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ）の発現を上流から下流に駆動し（図１の左側の曲がり矢印を参照）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）は、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子（ｕＰＡ）の発現を下流から上流に駆動する（図１の右側の曲がり矢印を参照）。
【0107】
本実施例のターゲティングベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物と組み合わせて使用され、マウスゲノムにおける５’末端相同性アーム配列および３’末端相同性アーム１０配列に対応する位置にターゲット配列を挿入した（図１を参照）。
【0108】
［実施例２］
本実施例は、実施例１のターゲティングベクターを構築するための方法を提供した。該方法は、以下のステップを含む。
本実施例は、実施例１のターゲティングベクターを構築するための方法を提供した。該方法は、以下のステップを含む。
【0109】
１．１ Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーターフラグメントの調製
表１におけるプライマーを使用して、Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーターターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。ＰＣＲ増幅の条件は、この分野の常識に従って設定されている。
表１におけるプライマーを使用して、Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーターターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。ＰＣＲ増幅の条件は、この分野の常識に従って設定されている。
【0110】
表１．Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーター増幅プライマーリスト
【表1】
【0111】
Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーターターゲットフラグメントの鎖のうちの１つのヌクレオチド配列（配列番号１）は、以下の通りである（５’－３’）。
【0112】
ｇｇｔｇｇｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｇｔｔｔｃｇａｇｇｇｇｇｔａｃａｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｔｃｔａｇａｔｃｇａａｔｔｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｃｃｃｇｇｇｇｔｔｇａｔａｇｇａａａｇｇｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｃａｇａａａｇａｃｔｃｇｃｔｃｔａａｔａｔａｃｔｔｃｔｔｔａａｃｃａａｔａａｃｔｇｔａｇａｔｃａｔｔａａｃｃａｔａｃｔｔａｃｃｔｃｇｃａｔｔｔｃａｔｔｇｇｔｔｃｃｔａｃｃｃｃａｔｔａｃａａａａｔｃａｔａｃｃａｔｃｔｔｔｇｃｃａａａａａｇｔｔｇｔｔｔｇａｃｔａａａｔｃｃｃｔｔｇｃｇｔａｔｇｔｔｔｇｃｃａｔｃｔｇｇａｇｃｔｇｔｔｃｃｃｃｔｃｔａａｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａｔｇｃａｃａａｇａｃｔｔｔｇｔｃｃａｔｔｃａｔｔａａａｇｔｔａｔｇｔａａａａｃａｇｃａａａｔｔｔｔａｃａｔａａｇａｇｃｔｔａａｔｃｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃｃａｔｔｔｇａｇｃａｔｔｔｃａｇｔｇｔｇｇｇｃｃｔｔｇｇｃａｔｇｇａａｇｃａｔｇｃｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｔｃｃｃａａｇｃｔｇｇａｇａａｃｇａｇｔｔｃａａｇｃｃａａｇｃｔｇｃａｃｃａｃｔｇｃｔｔｔｔｃａｃａｃａｃｔｃｔｔｃａｃｔｃｔｇｃａｔｃａｇｃｔｔａｇｔａｔｔｔｃｔｔａａｇａａａｔｔａａａａｇａｔｇｇｃａａａａｃａｃａｔｃｔａａａｃｔｇｔａｔｔａａｔａａａｇｔｇｃｔｔｃｔｔｔｃａｔａｔｔｔａａｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｇａｔａａａｇａａａａｃｔａｔｇａｔｇａａｔｇｃｃｔｇｃａｔｇｃｔｔａｔｃｔａｔｇｔｔｔｃａｔａｇａｔｃａｇｃａａｇｔａｇａａｔｇｔａｔａａａａｔｇｇａａｇｔｇｔｃａｇｔａａｔｔｃｔｇｃｔｃａｔａａｔｔａｔｔｇｃｔｇｃａｇａｔｔｇａａｔｔｃａｃｃｃｃｔａａｇｃａａａｔａｔａｃｃｔｃｔｇａａｃａｔｃｔｇｃｔｃａｃａｇｔｃｔｇｔａｔｇｔｔｃｔｃｃａｇａｃａｃａａｔｃｃａａａａｇａｃｔｔａｔｔａｔｃｔｇａａａｇａｔｔａａｔｇｔｃａｃａａａｇｃｃａｇａｇｃｔｔｔａｔａａｔｃｔｃｔｔａｔａａａａｃａｔａｇａｔｔｇｔａｇｃｃａｇｇｃａｇｔｇｇｔｇｇｃａｃａｔｇｃｔｔｔｔａａｔｃｃｔａｇｃａｃｔｔｇｃａａｇｇｃａｇａｇｇｃａａｇｃａｇａｔｃｔｃｔｇａｇｔｔｃａａｇａｃｃａａｃｃｔｇｇｔｃｔａｃａｇａｇｃａａｇｇｔｃｃａｇｇａｃａｇｃｃａａａｇｃｔａｇａｃａｇａａａａａａｃｔｇｔａｔｃｔｃａａａａｇａａａａｔａｇａｃａａｃａａａｔｔａｃａｔｔｇｔｔａｃａｇｃｔａａａａｔｔａｔｃｔｔａｔｇｔｔｇａａａｔｔｔｃｔｇｔａｇｃｔｃａａｃｔｔｔｇｇａａｔａｔｔｔｔｃａｔｔａｇａｇｇｇｔａａｔａｔｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｃａｃｔｔｃｔａａａａｃｔｔｔａｇａａｔｔｔａｔｔｇｔｔｔｔａｔａａｔｃｔｃｔｔｇｇｔｔｔｃａｇｔａｃｔｔａｃｃｔａａａａｔｔｔｔｃｃａａｃｃａｇｔｃａｃｃｃａｇｃｔａａａａｃｔｔａａａａｔａｔｔｔａａｇｔｃｃｔａｇａａｔｔｃｃａｇｔｔａｇｔｔｔｔｇｃａａｇｔａａｃｔａｔａａａｔｇｇｔａｔｔａｃａｇｔｇａｇａａａｔｇｇａｇｃａｔｃｔｇａｔｇｔｃｔａｃｔｃａｃａｔｇｔａａａｃｔｔｔａｃａｃａｔａｔｃａａａｔａｇａｔｇａｔｔｇｔｃｔａｔｇｇｔｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔｔｔｔａｇａｇｔａｔａｔａｇａｇｔａｔａｔａｇａｇａｔａｇａｔｔｃａｔｃｃａｔａａｔａａｇｃｔｃａａｔａａａｃａａａｔｇｔｔｔａａａａａｔｇａｔｔｇｔｔａｇａｔａｔｔａｔｔｇｇｇｔａｔａｔａａｇｔａｃｃｔａａｔｔａｔｔａａａａｔｔｇａｃｔｔｔｔｔｔａｔａａｃａｔｔｇａｇａｔａａａｔｔａａａａｔｔｃａｔｔｔａｔｔａａａａｔａａｔａｔａｔａｔｇａａｔｔｔｇａａｇｇｇｇｔｔｔｔｔｔｔｔｇｃａａａａｃａａｔｔｔｃａｇｃａａｇｃａａｔａｃｃａｔｇａｃａａａａｇｔｇｔｇｔａｔｔｃａａａｔｇｇａａｔｇｇｇａａａｃｇａａｔｇｔｃａｇｔａａｃｔｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｇｔｇｔａｃｔｃａｔｔｃｃｃａｇａｃａｔｇｃｃｔｇａｔｔｇｇｔａｇｃｔｇｔｇａｃａｇｃｔｃｃａｇｃｇｔａｃｔｔａａｃａｃｃａａｇａｃｔｔｔａａａｔａａｇｃｔｇｃｃａａａａａｔｇｔｇｔａａｇａｃｔｇｃｃａｔｔｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａｔｔｔｔｔａｔａｔｃｔａｔａｃｃｃｔｔｔｃｔａｃａｇｃｃａｃａｔａｃｔａａａｃｇｔａｇａｃａａｇｔｔｇｇｃｃｔｔｔｔｃｃｔａｔｔｇｃｔｔｔａａａｇｇｃａｇａｇｇａｃｔｇｔａｔｔｇａｔｃａｇｔｃｃａａａｃｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａｔｇｔａｃａｔｇｇａａａａｃｔｇｇｃｃａａｇｇｃａａａｃａｃｇｔｃｃｇｇａａｔｇａｔｇｇｔａｔｔｔａａｇａａｃａａａｃａｔｔｃｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａａｇｔａｃａｇｔｇｃｃｃｔｇｃｔｇａｃａｇａｇｃａｇｇａｇａｃａｃａａａｇｔａｃｃａｔｃｔｃｇｔｃｃｃｔａｔｇｔｔａａｇｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔｃａｔｇｃｔｃａａｇｇｇａｔａｃｔｇａｇｔｇｇａｔｇｃｔｇｔａａｃｇｃａｇｇｔｔａｔｔｔｔｃｔａｇｇｃｔｇｔｇａｇｇａｔａｃａａｇａａａａｔｇａａａｇｔａａｔｔａａａｇｔａｇａａｃａｔｔｇｃｔｃｔｇｔｇｃｔａｔｇｃｔｔｇｃａｇａａｔｇｔｇｔａｇｔｇｔａｇｔｃｔａｇｇａａｃａｇａｇａｇｇｇｇａａｇｇｔｔｃｔａａａｔｃａａａａａａａａｔｃａａｇｃｔｃａｔｇｃｃｔａａｇｇａｔｇｔｇｔｇｇｇｔｔｇｃｃａｃｃｔｃｔｔｔａｇｃｔａｃｃｔａｔｇｃｇａｔｃｃａａａｃａａｃｔａｔａａａａｃｔｔａｇａａｔｔｔａｔｔｔｔｃｔｃｔｇｇａｔｇａａｔｔｔｇｔｇｃｔｔｇｔｇｇａｇｃａａｔｇｔｔｇｇｔａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｔｃａｇｃｔｇｇａａａａｇｔｇｇａａｔｇａｇｃａａｇｃａｇａａａａｃｔｇａｇａｇａａｇｃａｇａａｇｃｔｔａｇｇａａｇａｔｇｇｇｔａａｔｔｔｃｃａａａａｇｔｔｔｃａｃａａａａｇａｔｃａａａｔｃａａａｇａａｇｔａａｇｃｔｃｃａｃｃｔｔａｇａａａａａａｇｔｇｇａａｃｇｔｃａｔｇｃｔａａｇｇａａｇｃｔａ。
【0113】
下線部分は、Ａｌｂプロモーターであり、非下線部分は、Ａｌｂエンハンサーである。
【0114】
１．２ Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ 融合フラグメントの調製
１．２．１ Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ フラグメントの調製
ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇをテンプレートとして、表２のプライマーを使用して、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。
１．２．１ Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ フラグメントの調製
ｐＣＭＶ－Ｔｅｔ３Ｇをテンプレートとして、表２のプライマーを使用して、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。
【0115】
表２．Ｔｅｔ Ｏｎ ３Ｇ フラグメント増幅プライマーリスト
【表2】
【0116】
Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇターゲットフラグメントの１つの鎖のヌクレオチド配列（配列番号２）は、以下の通り（５’－３’）であり、相補鎖は、コード配列である。
【0117】
Ｔｔａｃｃｃｇｇｇｇａｇｃａｔｇｔｃａａｇｇｔｃａａａａｔｃｇｔｃａａｇａｇｃｇｔｃａｇｃａｇｇｃａｇｃａｔａｔｃａａｇｇｔｃａａａｇｔｃｇｔｃａａｇｇｇｃａｔｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｃａｔｇｔｃｔａａｇｔｃａａａａｔｃｇｔｃａａｇｇｇｃｇｔｃｇｇｔｃｇｇｃｃｃｇｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃａｃｔｔｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｔｃｃａｇｇｃｃａｃａｔａｔｇａｔｔａｇｔｔｃｃａｇｇｃｃｇａａａａｇｇａａｇｇｃａｇｇｔｔｃｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇａａｃａｇｃｔｃａａｔｔｇｃｔｔｇｔｔｔｃａｇａａｇｔｇｇｇｇｇｃａｔａｇａａｔｃｇｇｔｇｇｔａｇｇｔｇｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｔｔｔｇｃｔａｃｔｔｇａｔｇｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｃｃａａｔａｃｇｃａｇｃｃｃａｇｔｇｔａａａｇｔｇｇｃｃｃａｃｇｇｃｇｇａｃａｇａｇｃｇｔａｃａｇｔｇｃｇｔｔｃｔｃｃａｇｇｇａｇａａｇｃｃｔｔｇｃｔｇａｃａｃａｇｇａａｃｇｃｇａｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃａｇｇｇｔｔｔｃｇｔａｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｔｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇａｇａｔｇｃａｃｔｔｔａｇｃｃｃｃｇｔｃｇｃｇａｔｇｔｇａｇａｇｇａｇａｇｃａｃａｇｃｇｇｔａｔｇａｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｃｇｃａｇａａａｇｔｃｔｔｇｃｃａｔｇａｃｔｃｇｃｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇｃａｇｇａｇｔｇｇｇｔａｔｇａｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｃａｔｃｔｃｇａｔｔｇｇｃａｇｇｇｃａｔｃｇａｇｃａｇｇｇｃｃｃｇｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃａｃｇｔｇｃｃａｇｔａｃａｇｇｇｔａｇｇｃｔｇｃｔｃａａｃｔｃｃｃａｇｃｔｔｔｔｇａｇｃｇａｇｔｔｔｃｃｔｔｇｔｃｇｔｃａｇｇｃｃｔｔｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃａｔｔｇａｇｔａａｔｔｃｃａｇａｇｃａｇａｇｔｔｔａｔｇａｃｔｔｔｇｃｔｃｔｔｇｔｃｃａｇｔｃｔａｇａｃａｔ。
【0118】
１．２．２ ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ フラグメントの調製
ｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓ－ＣＡＧ ＨＧＨをテンプレートとして使用し、表３のプライマーを使用して、ＨＧＨ ｐｏｌｙＡターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。
ｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓ－ＣＡＧ ＨＧＨをテンプレートとして使用し、表３のプライマーを使用して、ＨＧＨ ｐｏｌｙＡターゲットフラグメントを増幅し、回収しておく。
【0119】
表３．ＨＧＨ ｐｏｌｙＡフラグメント増幅プライマーリスト
【表3】
【0120】
ＨＧＨ ｐｏｌｙＡターゲットフラグメントの１つの鎖のヌクレオチド配列（配列番号３）は、以下の通りである（５’－３’）。
【0121】
Ｇｇｃｔｇｃａｇｇａａｔｔｃａａｃａｇｇｃａｔｃｔａｃｔｇａｇｔｇｇａｃｃｃａａｃｇｃａｔｇａｇａｇｇａｃａｇｔｇｃｃａａｇｃａａｇｃａａｃｔｃａａａｔｇｔｃｃｃａｃｃｇｇｔｔｇｇｇｃｃａｔｇｇｃａｇｇｔａｇｃｃｔａｔｇｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｇｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｔａｔａｇｔｔａｔｔｔｔａａａａｔｃａｇａａｇｇａｃａｇｇｇａａｇｇｇａｇｃａｇｔｇｇｔｔｃａｃｇｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａａｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｔｇｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇａｔｔａｇｇａｇｔｔｇｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｔａｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃｇｔｃｔｃｔａｃｃａａａａａａａｃａａａａａｔｔａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｇｃａｔｇｃｃｔｇｇａａｔｃｃｃａａｃａａｃｔｃｇｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇｃａｇｇａｇａａｔｃｇｃｔｔｇａａｃｃｃａｇｇａｇｇｃｇｇａｇａｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃａａｇａｔｔｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｔｃｃｃａａｔａｇａｃｃｃｃｇｃａｇｇｃｃｃｔａｃａｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｔｔｇｃｃｃｃｔｔｇｃｔｃｃａｔａｃｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔａａｔａｔｔａｔａｇａａｇｇａｃａｃｃｔａｇｔｃａｇａｃａａａａｔｇａｔｇｃａａｃｔｔａａｔｔｔｔａｔｔａｇｇａｃａａｇｇｃｔｇｇｔｇｇｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｇｃａａｃｔｔｃｃａｇｇｇｃｃａｇｇａｇａｇｇｃ１２ａｃｔｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃａｃａｇｇｇａｔｇｃｃａｃｃｃａｔｃ。
【0122】
１．２．３ Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ フラグメントの調製
表４のプライマーを使用し、テンプレートとしてＴｅｔ－Ｏｎ３ＧおよびＨＧＨ ｐｏｌｙＡを使用して、融合ＰＣＲによって、ターゲットフラグメントＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡを増幅し、回収した。
表４のプライマーを使用し、テンプレートとしてＴｅｔ－Ｏｎ３ＧおよびＨＧＨ ｐｏｌｙＡを使用して、融合ＰＣＲによって、ターゲットフラグメントＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡを増幅し、回収した。
【0123】
表４．Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ フラグメント融合ＰＣＲ プライマーリスト
【表4】
【0124】
Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ融合ターゲットフラグメントのストランドの１つのヌクレオチド配列は、以下の通りである（５’－３’）。
【0125】
ＧｇｃｔｇｃａｇｇａａｔｔｃａａｃａｇｇｃａｔｃｔａｃｔｇａｇｔｇｇａｃｃｃａａｃｇｃａｔｇａｇａｇｇａｃａｇｔｇｃｃａａｇｃａａｇｃａａｃｔｃａａａｔｇｔｃｃｃａｃｃｇｇｔｔｇｇｇｃｃａｔｇｇｃａｇｇｔａｇｃｃｔａｔｇｃｔｇｔｇｔｃｔｇｇａｃｇｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｔａｔａｇｔｔａｔｔｔｔａａａａｔｃａｇａａｇｇａｃａｇｇｇａａｇｇｇａｇｃａｇｔｇｇｔｔｃａｃｇｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａａｔｔｔｇｇｇａｇｇｃｃａａｇｇｔｇｇｇｔａｇａｔｃａｃｃｔｇａｇａｔｔａｇｇａｇｔｔｇｇａｇａｃｃａｇｃｃｔｇｇｃｃａａｔａｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃｇｔｃｔｃｔａｃｃａａａａａａａｃａａａａａｔｔａｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｇｃａｔｇｃｃｔｇｇａａｔｃｃｃａａｃａａｃｔｃｇｇｇａｇｇｃｔｇａｇｇｃａｇｇａｇａａｔｃｇｃｔｔｇａａｃｃｃａｇｇａｇｇｃｇｇａｇａｔｔｇｃａｇｔｇａｇｃｃａａｇａｔｔｇｔｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｔｃｃｃａａｔａｇａｃｃｃｃｇｃａｇｇｃｃｃｔａｃａｇｇｔｔｇｔｃｔｔｃｃｃａａｃｔｔｇｃｃｃｃｔｔｇｃｔｃｃａｔａｃｃａｃｃｃｃｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔａａｔａｔｔａｔａｇａａｇｇａｃａｃｃｔａｇｔｃａｇａｃａａａａｔｇａｔｇｃａａｃｔｔａａｔｔｔｔａｔｔａｇｇａｃａａｇｇｃｔｇｇｔｇｇｇｃａｃｔｇｇａｇｔｇｇｃａａｃｔｔｃｃａｇｇｇｃｃａｇｇａｇａｇｇｃａｃｔｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃａｃａｇｇｇａｔｇｃｃａｃｃｃａｔｃＴｔａｃｃｃｇｇｇｇａｇｃａｔｇｔｃａａｇｇｔｃａａａａｔｃｇｔｃａａｇａｇｃｇｔｃａｇｃａｇｇｃａｇｃａｔａｔｃａａｇｇｔｃａａａｇｔｃｇｔｃａａｇｇｇｃａｔｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｃａｔｇｔｃｔａａｇｔｃａａａａｔｃｇｔｃａａｇｇｇｃｇｔｃｇｇｔｃｇｇｃｃｃｇｃｃｇｃｔｔｔｃｇｃａｃｔｔｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｔｃｃａｇｇｃｃａｃａｔａｔｇａｔｔａｇｔｔｃｃａｇｇｃｃｇａａａａｇｇａａｇｇｃａｇｇｔｔｃｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇａａｃａｇｃｔｃａａｔｔｇｃｔｔｇｔｔｔｃａｇａａｇｔｇｇｇｇｇｃａｔａｇａａｔｃｇｇｔｇｇｔａｇｇｔｇｔｃｔｃｔｃｔｔｔｃｃｔｃｔｔｔｔｇｃｔａｃｔｔｇａｔｇｃｔｃｃｔｇｔｔｃｃｔｃｃａａｔａｃｇｃａｇｃｃｃａｇｔｇｔａａａｇｔｇｇｃｃｃａｃｇｇｃｇｇａｃａｇａｇｃｇｔａｃａｇｔｇｃｇｔｔｃｔｃｃａｇｇｇａｇａａｇｃｃｔｔｇｃｔｇａｃａｃａｇｇａａｃｇｃｇａｇｃｔｇａｔｔｔｔｃｃａｇｇｇｔｔｔｃｇｔａｃｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｔｔｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｇａｇａｔｇｃａｃｔｔｔａｇｃｃｃｃｇｔｃｇｃｇａｔｇｔｇａｇａｇｇａｇａｇｃａｃａｇｃｇｇｔａｔｇａｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｔｔｃｃｇｃａｇａａａｇｔｃｔｔｇｃｃａｔｇａｃｔｃｇｃｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇｃａｇｇａｇｔｇｇｇｔａｔｇａｔｇｃｃｔｇｔｃｃａｇｃａｔｃｔｃｇａｔｔｇｇｃａｇｇｇｃａｔｃｇａｇｃａｇｇｇｃｃｃｇｃｔｔｇｔｔｃｔｔｃａｃｇｔｇｃｃａｇｔａｃａｇｇｇｔａｇｇｃｔｇｃｔｃａａｃｔｃｃｃａｇｃｔｔｔｔｇａｇｃｇａｇｔｔｔｃｃｔｔｇｔｃｇｔｃａｇｇｃｃｔｔｃｇａｔａｃｃｇａｃｔｃｃａｔｔｇａｇｔａａｔｔｃｃａｇａｇｃａｇａｇｔｔｔａｔｇａｃｔｔｔｇｃｔｃｔｔｇｔｃｃａｇｔｃｔａｇａｃａｔ。
【0126】
下線部分は、ＨＧＨｐｏｌｙＡであり、非下線部分は、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇである。
【0127】
１．３ 中間ベクターの調製（Ｒｏｓａ２６ａｒｍ１－Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２フラグメントを含む）
１．３．１ ｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓプラスミド（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供、ベクター自体は、Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１とＲｏｓａ２６ａｒｍ２を含む。図１８は、マップを示す。）をＡｓｃＩで酵素消化し、ライゲーションベクターとして回収した。プラスミドは、Ｒｏｓａ２６ａｒｍ１およびＲｏｓａ２６ａｒｍ２配列を含む。
１．３．１ ｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓプラスミド（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供、ベクター自体は、Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１とＲｏｓａ２６ａｒｍ２を含む。図１８は、マップを示す。）をＡｓｃＩで酵素消化し、ライゲーションベクターとして回収した。プラスミドは、Ｒｏｓａ２６ａｒｍ１およびＲｏｓａ２６ａｒｍ２配列を含む。
【0128】
Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１の一本鎖のヌクレオチド配列（配列番号４）は、以下の通りである。
【0129】
ＴＴｇｇｃｃｇｇｔｇｃｇｃｃｇｃｃａａｔｃａｇｃｇｇａｇｇｃｔｇｃｃｇｇｇｇｃｃｇｃｃｔａａａｇａａｇａｇｇｃｔｇｔｇｃｔｔｔｇｇｇｇｃｔｃｃｇｇｃｔｃｃｔｃａｇａｇａｇｃｃｔｃｇｇｃｔａｇｇｔａｇｇｇｇａｔｃｇｇｇａｃｔｃｔｇｇｃｇｇｇａｇｇｇｃｇｇｃｔｔｇｇｔｇｃｇｔｔｔｇｃｇｇｇｇａｔｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｃｔｃｃｇａｇｃｇｔｇｇｔｇｇａｇｃｃｇｔｔｃｔｇｔｇａｇａｃａｇｃｃｇｇｇｔａｃｇａｇｔｃｇｔｇａｃｇｃｔｇｇａａｇｇｇｇｃａａｇｃｇｇｇｔｇｇｔｇｇｇｃａｇｇａａｔｇｃｇｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇｃａｇｃａａｃｃｇｇａｇｇｇｇｇａｇｇｇａｇａａｇｇｇａｇｃｇｇａａａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｇｇａｃｇｃｇｇｃｃａｔｇｇｃｔｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃａｇｃｇｇａｇｇａｇｃｇｃｔｔｃｃｇｇｃｃｇａｃｇｔｃｔｃｇｔｃｇｃｔｇａｔｔｇｇｃｔｔｃｔｔｔｔｃｃｔｃｃｃｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇａａａａｃａｃａａａｔｇｇｃｇｔｇｔｔｔｔｇｇｔｔｇｇｃｇｔａａｇｇｃｇｃｃｔｇｔｃａｇｔｔａａｃｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇｔｇｃｇｃａｇｃｃｇｃｃｇｇｃａｇｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｇｇｔｇｇｇｇｃｇｇｇａｇｇｔａｇｇｔｇｇｇｇｔｇａｇｇｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｔｇｃｇｇｇｃｇｃｇｇｔｃｇｇｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｇｇａｇｇｇｔｃａｇｃｇａａａｇｔａｇｃｔｃｇｃｇｃｇｃｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｃｃｃｔｔｃｃｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｔｃｇｔｔｔｔａｃｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｃｃｇｇｇｃｃｔｃｇｔｃｇｔｃｔｇａｔｔｇｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇｃｃｃａｇａａａａｃｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃｃａｔｔｇｇｃｔｃｇｔｇｔｔｃｇｔｇｃａａｇｔｔｇａｇｔｃｃａｔｃｃｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇａｇｇａｇｇｃｇｃｔｃｃｃａｇｇｔｔｃｃｇｇｃｃｃｔｃｃｃｃｔｃｇｇｃｃｃｃｇｃｇｃｃｇｃａｇａｇｔｃｔｇｇｃｃｇｃｇｃｇｃｃｃｃｔｇｃｇｃａａｃｇｔｇｇｃａｇｇａａｇｃｇｃｇｃｇｃｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇａｃｇｇｇｃａｇｔａｇｇｇｃｔｇａｇｃｇｇｃｔｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｔｇｃａａｇｃａｃｇｔｔｔｃｃｇａｃｔｔｇａｇｔｔｇｃｃｔｃａａｇａｇｇｇｇｃｇｔｇｃｔｇａｇｃｃａｇａｃｃｔｃｃａｔｃｇｃｇｃａｃｔｃｃｇｇｇｇａｇｔｇｇａｇｇｇａａｇｇａｇｃｇａｇｇｇｃｔｃａｇｔｔｇｇｇｃｔｇｔｔｔｔｇｇａｇｇｃａｇｇａａｇｃａｃｔｔｇｃｔｃｔｃｃｃａａａｇｔｃｇｃｔｃｔｇａｇｔｔｇｔｔａｔｃａｇｔａａｇｇｇａｇｃｔｇｃａｇｔｇｇａｇｔａｇｇｃｇｇｇｇａｇａａｇｇｃｃｇｃａｃｃｃｔｔｃｔｃｃｇｇａｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇａｇｔｇｔｔｇｃａａｔａｃｃｔｔｔｃｔｇｇｇａｇｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇａｇｇａｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇａｇａａｔｃｃｃｔｔｃｃｃｃｃｔｃｔｔｃｃｃｔｃｇｔｇａｔｃｔｇｃａａｃｔｃｃａｇｔｃｔｔｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｔａｃｔｔｃｃａａｇｃｔｃａｔｔａｇａｔｇｃｃａｔｃａｔｇｃｔｃｔｃａｃｔｇｃｃｔｃｃｔｃａｇｃｔｔｃａａｇａｇｇａａｔｃｔｇｇａａａａａｇｃａｇｔｃｃｃａｃｔｇｇｔｃａｇｇａａａｇｇａａｃａｃｔａｇｔｇｃａｃｔｔａｔｃ。
【0130】
Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２の一本鎖のヌクレオチド配列（配列番号５）は、以下の通りである。
【0131】
ｔｇｔｇｔｇｇｇｃｇｔｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇｇｇａａｔｔｇａａｃａｇｇｔｇｔａａａａｔｔｇｇａｇｇｇａｃａａｇａｃｔｔｃｃｃａｃａｇａｔｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｇｔｃｇｇｇａａｇｔｔｔｔｔｔａａｔａｇｇｇｇｃａａａｔａａｇｇａａａａｔｇｇｇａｇｇａｔａｇｇｔａｇｔｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｔｔｔａｔｇｃａｇｃａａａａｃｔａｃａｇｇｔｔａｔｔａｔｔｇｃｔｔｇｔｇａｔｃｃｇｃｃｔｃｇｇａｇｔａｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｇｇｔａｇａｔｔａａａｇａｃａｔｇｃｔｃａｃｃｃｇａｇｔｔｔｔａｔａｃｔｃｔｃｃｔｇｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔａｃｔａｃａｇｔａｔｇａａａｔｔａｃａｇｔｇｔｃｇｃｇａｇｔｔａｇａｃｔａｔｇｔａａｇｃａｇａａｔｔｔｔａａｔｃａｔｔｔｔｔａａａｇａｇｃｃｃａｇｔａｃｔｔｃａｔａｔｃｃａｔｔｔｃｔｃｃｃｇｃｔｃｃｔｔｃｔｇｃａｇｃｃｔｔａｔｃａａａａｇｇｔａｔｔｔｔａｇａａｃａｃｔｃａｔｔｔｔａｇｃｃｃｃａｔｔｔｔｃａｔｔｔａｔｔａｔａｃｔｇｇｃｔｔａｔｃｃａａｃｃｃｃｔａｇａｃａｇａｇｃａｔｔｇｇｃａｔｔｔｔｃｃｃｔｔｔｃｃｔｇａｔｃｔｔａｇａａｇｔｃｔｇａｔｇａｃｔｃａｔｇａａａｃｃａｇａｃａｇａｔｔａｇｔｔａｃａｔａｃａｃｃａｃａａａｔｃｇａｇｇｃｔｇｔａｇｃｔｇｇｇｇｃｃｔｃａａｃａｃｔｇｃａｇｔｔｃｔｔｔｔａｔａａｃｔｃｃｔｔａｇｔａｃａｃｔｔｔｔｔｇｔｔｇａｔｃｃｔｔｔｇｃｃｔｔｇａｔｃｃｔｔａａｔｔｔｔｃａｇｔｇｔｃｔａｔｃａｃｃｔｃｔｃｃｃｇｔｃａｇｇｔｇｇｔｇｔｔｃｃａｃａｔｔｔｇｇｇｃｃｔａｔｔｃｔｃａｇｔｃｃａｇｇｇａｇｔｔｔｔａｃａａｃａａｔａｇａｔｇｔａｔｔｇａｇａａｔｃｃａａｃｃｔａａａｇｃｔｔａａｃｔｔｔｃｃａｃｔｃｃｃａｔｇａａｔｇｃｃｔｃｔｃｔｃｃｔｔｔｔｔｃｔｃｃａｔｔｔａｔａａａｃｔｇａｇｃｔａｔｔａａｃｃａｔｔａａｔｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｇａｔｇｔｃｔｃｃｔｃｃｃｃｃａａｔａｔｔａｃｃｔｇａｔｇｔａｔｃｔｔａｃａｔａｔｔｇｃｃａｇｇｃｔｇａｔａｔｔｔｔａａｇａｃａｔｔａａａａｇｇｔａｔａｔｔｔｃａｔｔａｔｔｇａｇｃｃａｃａｔｇｇｔａｔｔｇａｔｔａｃｔｇｃｔｔａｃｔａａａａｔｔｔｔｇｔｃａｔｔｇｔａｃａｃａｔｃｔｇｔａａａａｇｇｔｇｇｔｔｃｃｔｔｔｔｇｇａａｔｇｃａａａｇｔｔｃａｇｇｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｃｔｔｔｃｃｔｇａｃｃｔａａｇｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｃｔｔｇｔａｔｔｔｔｔｔｃｔａｔｔｔａａｇｃａｇｔｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇｇａｃｔｇｇｃｔｔｇａｃｔｃａｔｇｇｃａｔｔｃｔａｃａｃｇｔｔａｔｔｇｃｔｇｇｔｃｔａａａｔｇｔｇａｔ。
【0132】
１．３．２ ＳＬＩＣライゲーション形質転換法を使用して、ライゲーション２×ＨＩＦＩ Ｍｉｘ、線形化ベクターｐＲｏｓａ２６－Ｃａｓ、上記のステップで調製したＡｌｂエンハンサー－ＡｌｂプロモーターフラグメントおよびＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨｐｏｌｙＡフラグメントを滅菌チューブに加え、さらに滅菌水を加え２０μＬにし、５０°Ｃで３０分間反応させて、Ｒｏｓａ２６ａｒｍ１－Ａｌｂエンハンサー－Ａｌｂプロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２フラグメントを含む中間ベクターを得た。そして、トップ１０の化学的コンピテントトランスフォーメーションを行い、さらにＳｐｅｃ耐性ＬＢ固形寒天培地のコーティングを行ったあと、３７℃で一晩倒置培養した。
【0133】
１．３．３ 中間ベクターの同定
プレートからクローンを１つ選び、Ｓｐｅｃ耐性を含む４ｍＬＬＢチューブで培養した。表５のプライマーを使用して、細菌溶液のＰＣＲ同定を実行し（その結果、図２を参照）、そして、ＰＣＲ同定によって得られた陽性クローンに対して酵素消化同定を行った（表６は、予想される酵素消化バンドを示す。図３は、その結果を示す。）。そのうち、同定により正しいと判定されたものは、中間ベクターである（Ａｌｂ－ｐｒｏによって表される）。ＰＣＲと酵素消化の結果は、次のとおりである。５＃と９＃は、Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１－Ａｌｂ エンハンサー－Ａｌｂ プロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２フラグメントを含む正しい中間ベクターであった。
プレートからクローンを１つ選び、Ｓｐｅｃ耐性を含む４ｍＬＬＢチューブで培養した。表５のプライマーを使用して、細菌溶液のＰＣＲ同定を実行し（その結果、図２を参照）、そして、ＰＣＲ同定によって得られた陽性クローンに対して酵素消化同定を行った（表６は、予想される酵素消化バンドを示す。図３は、その結果を示す。）。そのうち、同定により正しいと判定されたものは、中間ベクターである（Ａｌｂ－ｐｒｏによって表される）。ＰＣＲと酵素消化の結果は、次のとおりである。５＃と９＃は、Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１－Ａｌｂ エンハンサー－Ａｌｂ プロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２フラグメントを含む正しい中間ベクターであった。
【0134】
表５．Ａｌｂ－ｐｒｏバクテリア液体ＰＣＲ検証プライマー
【表5】
【0135】
表６．中間ベクターの酵素消化同定が行われた予想バンドサイズ
【表6】
【0136】
１．４ ｕＰＡ－ＴＲＥ３Ｇ 融合フラグメントの調製
１．４．１ ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ フラグメントの調製
Ａｌｂ－ｕＰＡ－ｔｅｔｏｎ－ｆｉｎａｌをテンプレートとして使用し、表７のプライマーを使用して、ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡフラグメントを増幅し、回収しておく。
１．４．１ ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ フラグメントの調製
Ａｌｂ－ｕＰＡ－ｔｅｔｏｎ－ｆｉｎａｌをテンプレートとして使用し、表７のプライマーを使用して、ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡフラグメントを増幅し、回収しておく。
【0137】
表７．ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡフラグメント増幅プライマーリスト
【表7】
【0138】
そのうち、ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ－Ｆプライマーの太字の下線が引かれた部分は、Ｋｏｚａｋ配列である。
【0139】
ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡターゲット断片の一本の鎖のヌクレオチド配列（配列番号６）は、以下の通りである。
【0140】
ａｔｇａａａｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇａｇｃｃｔｇｔｔｃｃｔｃｔｇｃｇｃｃｔｔｇｇｔｇｇｔｇａａａａａｃｔｃｔｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｔａｃｔｔｇｇａｇｃｔｃｃｔｇａｔｇａａｔｃａａａｃｔｇｔｇｇｃｔｇｔｃａｇａａｃｇｇａｇｇｔｇｔａｔｇｃｇｔｇｔｃｃｔａｃａａｇｔａｃｔｔｃｔｃｃａｇａａｔｔｃｇｃｃｇａｔｇｃａｇｃｔｇｃｃｃａａｇｇａａａｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａｇｃａｃｔｇｔｇａｇａｔａｇａｔｇｃａｔｃａａａａａｃｃｔｇｃｔａｔｃａｔｇｇａａａｔｇｇｔｇａｃｔｃｔｔａｃｃｇａｇｇａａａｇｇｃｃａａｃａｃｔｇａｔａｃｃａａａｇｇｔｃｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｃｇｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃｔｔｃａｇａａａｃｃｃｔａｃａａｔｇｃｃｃａｃａｇａｃｃｔｇａｔｇｃｔａｔｔａｇｃｃｔａｇｇｃｃｔｇｇｇｇａａａｃａｃａａｔｔａｃｔｇｃａｇｇａａｃｃｃｔｇａｃａａｃｃａｇａａｇｃｇａｃｃｃｔｇｇｔｇｃｔａｔｇｔｇｃａｇａｔｔｇｇｃｃｔａａｇｇｃａｇｔｔｔｇｔｃｃａａｇａａｔｇｃａｔｇｇｔｇｃａｔｇａｃｔｇｃｔｃｔｃｔｔａｇｃａａａａａｇｃｃｔｔｃｔｔｃｇｔｃｔｇｔａｇａｃｃａａｃａａｇｇｃｔｔｃｃａｇｔｇｔｇｇｃｃａｇａａｇｇｃｔｃｔａａｇｇｃｃｃｃｇｃｔｔｔａａｇａｔｔｇｔｔｇｇｇｇｇａｇａａｔｔｃａｃｔｇａｇｇｔｇｇａｇａａｃｃａｇｃｃｃｔｇｇｔｔｃｇｃａｇｃｃａｔｃｔａｃｃａｇａａｇａａｃａａｇｇｇａｇｇａａｇｔｃｃｔｃｃｃｔｃｃｔｔｔａａａｔｇｔｇｇｔｇｇｇａｇｔｃｔｃａｔｃａｇｔｃｃｔｔｇｃｔｇｇｇｔｇｇｃｃａｇｔｇｃｃｇｃａｃａｃｔｇｃｔｔｃａｔｔｃａａｃｔｃｃｃａａａｇａａｇｇａａａａｃｔａｃｇｔｔｇｔｃｔａｃｃｔｇｇｇｔｃａｇｔｃｇａａｇｇａｇａｇｃｔｃｃｔａｔａａｔｃｃｔｇｇａｇａｇａｔｇａａｇｔｔｔｇａｇｇｔｇｇａｇｃａｇｃｔｃａｔｃｔｔｇｃａｃｇａａｔａｃｔａｃａｇｇｇａａｇａｃａｇｃｃｔｇｇｃｃｔａｃｃａｔａａｔｇａｔａｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔｇａａｇａｔａｃｇｔａｃｃａｇｃａｃｇｇｇｃｃａａｔｇｔｇｃａｃａｇｃｃａｔｃｃａｇｇｔｃｃａｔａｃａｇａｃｃａｔｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃａａｇｇｔｔｔａｃｔｇａｔｇｃｔｃｃｇｔｔｔｇｇｔｔｃａｇａｃｔｇｔｇａｇａｔｃａｃｔｇｇｃｔｔｔｇｇａａａａｇａｇｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔａｔｃｔｃｔａｔｃｃａａａｇａａｃｃｔｇａａａａｔｇｔｃｃｇｔｃｇｔａａａｇｃｔｔｇｔｔｔｃｔｃａｔｇａａｃａｇｔｇｔａｔｇｃａｇｃｃｃｃａｃｔａｃｔａｔｇｇｃｔｃｔｇａａａｔｔａａｔｔａｔａａａａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃｔｇｃｇｇａｃｃｃａｇａｇｔｇｇａａａａｃａｇａｔｔｃｃｔｇｃａａｇｇｇｃｇａｔｔｃｔｇｇａｇｇａｃｃｇｃｔｔａｔｃｔｇｔａａｃａｔｃｇａａｇｇｃｃｇｃｃｃａａｃｔｃｔｇａｇｔｇｇｇａｔｔｇｔｇａｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇａｇｇａｔｇｔｇｃａｇａｇａａａａａｃａａｇｃｃｃｇｇｔｇｔｃｔａｃａｃｇａｇｇｇｔｃｔｃａｃａｃｔｔｃｃｔｇｇａｃｔｇｇａｔｔｃａａｔｃｃｃａｃａｔｔｇｇａｇａａｇａｇａａａｇｇｔｃｔｇｇｃｃｔｔｃｔｇａｇａｔｃｔｔｔｔｔｃｃｃｔｃｔｇｃｃａａａａａｔｔａｔｇｇｇｇａｃａｔｃａｔｇａａｇｃｃｃｃｔｔｇａｇｃａｔｃｔｇａｃｔｔｃｔｇｇｃｔａａｔａａａｇｇａａａｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔｇｃａａｔａｇｔｇｔｇｔｔｇｇａａｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｃｔｃｔｃａｃｔｃｇｇａａｇｇａｃａｔａｔｇｇｇａｇｇｇｃａａａｔｃａｔｔｔａａａａｃａｔｃａｇａａｔｇａｇｔａｔｔｔｇｇｔｔｔａｇａｇｔｔｔｇｇｃａａｃａｔａｔｇｃｃｃａｔａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｇａａｃａａａｇｇｔｔｇｇｃｔａｔａａａｇａｇｇｔｃａｔｃａｇｔａｔａｔｇａａａｃａｇｃｃｃｃｃｔｇｃｔｇｔｃｃａｔｔｃｃｔｔａｔｔｃｃａｔａｇａａａａｇｃｃｔｔｇａｃｔｔｇａｇｇｔｔａｇａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇｔｇｔｔａｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｔａａｃａｔｃｃｃｔａａａａｔｔｔｔｃｃｔｔａｃａｔｇｔｔｔｔａｃｔａｇｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇａｃｔａｃｔ。
【0141】
下線部分は、ｕＰＡのコード配列であり、非下線部分は、ウサギのｐｏｌｙＡ配列である。ｕＰＡのアミノ酸配列は、以下の配列番号７のものである。
【0142】
ｍｋｖｗｌａｓｌｆｌｃａｌｖｖｋｎｓｅｇｇｓｖｌｇａｐｄｅｓｎｃｇｃｑｎｇｇｖｃｖｓｙｋｙｆｓｒｉｒｒｃｓｃｐｒｋｆｑｇｅｈｃｅｉｄａｓｋｔｃｙｈｇｎｇｄｓｙｒｇｋａｎｔｄｔｋｇｒｐｃｌａｗｎａｐａｖｌｑｋｐｙｎａｈｒｐｄａｉｓｌｇｌｇｋｈｎｙｃｒｎｐｄｎｑｋｒｐｗｃｙｖｑｉｇｌｒｑｆｖｑｅｃｍｖｈｄｃｓｌｓｋｋｐｓｓｓｖｄｑｑｇｆｑｃｇｑｋａｌｒｐｒｆｋｉｖｇｇｅｆｔｅｖｅｎｑｐｗｆａａｉｙｑｋｎｋｇｇｓｐｐｓｆｋｃｇｇｓｌｉｓｐｃｗｖａｓａａｈｃｆｉｑｌｐｋｋｅｎｙｖｖｙｌｇｑｓｋｅｓｓｙｎｐｇｅｍｋｆｅｖｅｑｌｉｌｈｅｙｙｒｅｄｓｌａｙｈｎｄｉａｌｌｋｉｒｔｓｔｇｑｃａｑｐｓｒｓｉｑｔｉｃｌｐｐｒｆｔｄａｐｆｇｓｄｃｅｉｔｇｆｇｋｅｓｅｓｄｙｌｙｐｋｎｌｋｍｓｖｖｋｌｖｓｈｅｑｃｍｑｐｈｙｙｇｓｅｉｎｙｋｍＬｃａａｄｐｅｗｋｔｄｓｃｋｇｄｓｇｇｐｌｉｃｎｉｅｇｒｐｔｌｓｇｉｖｓｗｇｒｇｃａｅｋｎｋｐｇｖｙｔｒｖｓｈｆｌｄｗｉｑｓｈｉｇｅｅｋｇｌａｆ。
【0143】
１．４．２ ＴＲＥ３Ｇ フラグメントの調製
ｐＴＲＥ３Ｇをテンプレートとして使用し、表８のプライマーを使用して、ＴＲＥ３Ｇフラグメントを増幅し、回収しておく。
ｐＴＲＥ３Ｇをテンプレートとして使用し、表８のプライマーを使用して、ＴＲＥ３Ｇフラグメントを増幅し、回収しておく。
【0144】
表８．ＴＲＥ３Ｇフラグメント増幅プライマーリスト
【表8】
【0145】
ＴＲＥ３Ｇフラグメントのヌクレオチド配列（配列番号８）は、以下の通りである。
【0146】
ｇａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔｇａａｇａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔｇｃａｇａｃｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔａａｇｇａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔｇａｃｃａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔｃｔａｃａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔａｔｃｃａｇｔｔｔａｃｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａａｃｇｔａｔａａｇｃｔｔｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇｃｇｃｃｔａｔａａａａｇｃａｇａｇｃｔｃｇｔｔｔａｇｔｇａａｃｃｇｔｃａｇａｔｃｇｃｃｔｇｇａｇｃａａｔｔｃｃａｃａａｃａｃｔｔｔｔｇｔｃｔｔａｔａｃｃａａｃｔｔｔｃｃｇｔａｃｃａｃｔｔｃｃｔａｃｃｃｔｃｇｔａａａ。
【0147】
１．４．３ ＴＲＥ３Ｇ－ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ 融合フラグメントの調製
表９のプライマーを使用して、融合ＰＣＲによってｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡをＴＲＥ３Ｇと融合し、ターゲットバンドを回収しておく。
表９のプライマーを使用して、融合ＰＣＲによってｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡをＴＲＥ３Ｇと融合し、ターゲットバンドを回収しておく。
【0148】
表９．１ｕＰＡ－ＴＲＥ３ＧＰ融合フラグメントを増幅するためのプライマーのリスト
【表9】
【0149】
１６ＴＲＥ３Ｇ－ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ融合フラグメントの一本の鎖のヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【0150】
【0151】
ここで、下線部分の配列は、ＴＲＥ３Ｇ 配列であり、波線は、ｕＰＡヌクレオチド配列を表し、斜体は、ウサギのｐｏｌｙＡ配列を表す。
【0152】
１．５ ターゲティングベクターの調製
１．５．１ 上記のステップで調製した中間ベクター（Ａｌｂ－ｐｒｏ）を、ＡｓｃＩで酵素消化し、線形化して、ライゲーションベクターとする。
１．５．１ 上記のステップで調製した中間ベクター（Ａｌｂ－ｐｒｏ）を、ＡｓｃＩで酵素消化し、線形化して、ライゲーションベクターとする。
【0153】
１．５．２ ＳＬＩＣ法を使用して、２×ＨＩＦＩ Ｍｉｘ、ＲＥ３Ｇ－ｕＰＡ－ウサギｐｏｌｙＡ融合フラグメントおよび線形化中間ベクター（Ａｌｂ－ｐｒｏ）フラグメントを滅菌チューブに加え、さらに滅菌水を加え２０μＬにする。５０°Ｃで３０分間反応させて、Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１－Ａｌｂ エンハンサー－Ａｌｂ プロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－ウサギ１７ｐｏｌｙＡ－ｕＰＡ－ＲＥ３Ｇ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２フラグメント（Ａｌｂ最終ベクターと称する）を含むターゲティングベクターを得た。さらに、トップ１０の化学的コンピテントトランスフォーメーションを行い、そしてＳｐｅｃ耐性ＬＢ固形寒天培地のコーティングを行ったあと、３７℃で一晩倒置培養した。
【0154】
１．５．３ ターゲティングベクターの同定
プレートからクローンを１つ選び、Ｓｐｅｃ耐性を含む４ｍＬＬＢチューブで培養した。表１０のプライマーを使用して、細菌溶液のＰＣＲ同定を実行し、ＰＣＲによって陽性と同定されたクローン（図４を参照）に対して酵素消化同定を行った（表１１は、酵素消化同定の予想バンドサイズを示す）。図５は、その結果を示す。同定により正しいと判定されたものは、ターゲティングベクターであり、表１２のプライマーを使用して、正しいクローンを配列決定する（表１２は、配列決定に使用されるプライマーを示す）。
プレートからクローンを１つ選び、Ｓｐｅｃ耐性を含む４ｍＬＬＢチューブで培養した。表１０のプライマーを使用して、細菌溶液のＰＣＲ同定を実行し、ＰＣＲによって陽性と同定されたクローン（図４を参照）に対して酵素消化同定を行った（表１１は、酵素消化同定の予想バンドサイズを示す）。図５は、その結果を示す。同定により正しいと判定されたものは、ターゲティングベクターであり、表１２のプライマーを使用して、正しいクローンを配列決定する（表１２は、配列決定に使用されるプライマーを示す）。
【0155】
ＰＣＲ、酵素消化同定および配列決定を行い、その結果、３＃、７＃、および１０＃が、実施例１に記載の正しいターゲティングベクターであることを示した。
【0156】
表１０．ターゲティングベクターを含む細菌液同定プライマー
【表10】
【0157】
表１１．ターゲティングベクターの酵素消化同定スキーム
【表11】
【0158】
表１２．Ｒｏｓａ２６Ａｌｂ－ｔｅｔ３Ｇ－ｕｐＡ－エンハンサー－ｐｒｏ－ｔｅｔＯｎ３Ｇシーケンシングプライマー
【表12】
【0159】
図１は、構築後のターゲティングベクター上の各要素の位置関係の概略図を示す。
【0160】
［実施例３］
マウスゲノムＨ１１サイトをターゲット挿入サイトとする対照ターゲットベクターを構築する。図６は、その要素構造の概略図を示す。実施例１のターゲティングベクターと比較して、両者の相違点は、両端の相同アームの配列にある。
マウスゲノムＨ１１サイトをターゲット挿入サイトとする対照ターゲットベクターを構築する。図６は、その要素構造の概略図を示す。実施例１のターゲティングベクターと比較して、両者の相違点は、両端の相同アームの配列にある。
【0161】
対照ターゲティングベクターの構築方法は、以下の通りである。
【0162】
１ ベクター骨格の調製
ＰＭＤ１８Ｔ－Ｈ１１－ＣＡＧ－ＦＬＰｏ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供、図１９を参照）をテンプレートとして使用し、表１３のプライマーを使用して４９６５ ｂｐフラグメントを増幅し、回収し、さらに、バックボーンベクターとしてＢｇｌＩＩ酵素消化によって回収しておく。
ＰＭＤ１８Ｔ－Ｈ１１－ＣＡＧ－ＦＬＰｏ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より提供、図１９を参照）をテンプレートとして使用し、表１３のプライマーを使用して４９６５ ｂｐフラグメントを増幅し、回収し、さらに、バックボーンベクターとしてＢｇｌＩＩ酵素消化によって回収しておく。
【0163】
表１３．バックボーンベクター増幅プライマー
【表13】
【0164】
２ 実施例１の配列決定補正されたターゲティングベクターをＢａｍＨＩで酵素消化した。酵素消化後のフラグメントサイズは、それぞれ５８５１ｂｐおよび５１５９ｂｐであり、５８５１ｂｐフラグメントが回収された。
【0165】
３ Ｔ４リガーゼを使用して上記のバックボーンベクターと５８５１ｂｐフラグメントをライゲーションし、さらに、トップ１０の化学的コンピテントトランスフォーメーションを行い、そして、Ａｍｐ耐性ＬＢ固形寒天培地のコーティングを行ったあと、３７℃で一晩倒置培養した。
【0166】
プレートからクローンを１つ選び、Ａｍｐ耐性を含む４ｍＬＬＢ試験管で培養した。表１４のプライマーを使用して、細菌溶液のＰＣＲ同定を実行した。図７は、その結果を示す。さらに、ＰＣＲ陽性クローンに対して、酵素消化同定を行った（表１５は、酵素消化の予想されるバンドを示す）。図８は、その結果を示す。同定により正しいと判定されたクローンは、対照ターゲティングベクター（Ａｌｂ－Ｈ１１と称する）であった。ＰＣＲと酵素消化同定の結果は、１＃と７＃が正しいＡｌｂ－Ｈ１１プラスミドであることを示した。
【0167】
表１４．Ａｌｂ－Ｈ１１バクテリアリキッドＰＣＲ検証プライマー
【表14】
【0168】
表１５．Ａｌｂ－Ｈ１１プラスミド酵素消化検証スキーム
【表15】
【0169】
対照ターゲティングベクターにおいて、Ｈ１１ａｒｍ１の鎖の１つのヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【0170】
ｃｔｃａｇｃａｇａｃａｃｃｃａｇｇａｔａａｇｔｇｃａｃｔａｇｔｇｔｔｃｃｔｔｔｃｃｔｇａｃｃａｇｔｇｇｇａｃｔｇｃｔｔｔｔｔｃｃａｇａｔｔｃｃｔｃｔｔｇａａｇｃｔｇａｇｇａｇｇｃａｇｔｇａｇａｇｃａｔｇａｔｇｇｃａｔｃｔａａｔｇａｇｃｔｔｇｇａａｇｔａｃｃａｇａｃｔｇｃｃｃｔｇａｔｃｃａｃａｇｃｃａｇｇｔｔｔｔｇｃｔｇａａａａｇｔｇａｃｃａｇｔｔｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｃａｇｔａｇａｇｔｇｇｇｃａｇｃｔｇａａｇｇａｔｔａｔａａｔｃｔａｃｔｇｔｃａａｇａｃｔｔｇｇａｇｇｃｃｃｃｔｇｃａｇｔｃａａａｇｔｃｃａａｔａｇａａｔａｔｔａｔｇａａａｔｇｇａｇａａｔｇｇｃｔｔａｔｔｔｔａａｔｃｔｃｔａｔａｇｔｇｇａａｔｔａａａａｔａｇｃａｔｔｔａｔｇｇｃｃｃｃａｇａｔｃｃａｔａａｔｔａａｔｃｃａａｔｇａｃｔｇｇｔｃａａａｔｔａｇｃｔｔｇａａｃｃｔｇａｃｔｇａａａａａｃｃｔｇｃａａｔｃａｇｔａｔａｇｔａｔｃｔｔｔｃａｇａａｔｇｃｔｔｔａｃａｔｔｃａａｔｔｔａｔａａｔａｃｃａｇａｃｔｔｃａａｇｔｔｇｔａａｇｔｔａａｃａａｔｔｔｔｇａｇａｇａａａｃｔａａｔｇｃａｇｃａｇａｇｇｃａａｇｇｇａａａｇａｃｔｔａａａｔｔａａｔｇｔｇａｃｃａｔｔａａｔｔａｇｔｔｇｇａｇｔｃａｇｇｃｔｇｇａｔｔａａｃａｔｔｇｔｇｃｃａｇｔａａａｔｔｔｃａｇａａａａａｔｔａｃｔａｔａｔｇａｃｔｔｃｔｃｔｇｔａａａｃｔｔｔｇａｔｔｔｔｇｔａｇａｇｔａｔａａｔａｔｔｇａｔｔｃｃｔｔｇａｔａｃｔｔｇｃｃａｃａａｇｃｔａｃｔｔｔｃａｇｇｇｔｔａｇｔｃｃａｇｃｔｔａａａｃｔａａｔｇｃｔａｔｃａｇａａｃｔｔｔａｔｇｔｇｃａｇａａｇａａａｔｔｃｃａｇａａｇｔｃｃｔａａｇｇｔａａａａｔｔａａａａｃｇｔｇａａａｇｇａａｃｔｃａｔｔ１９ｔａｇａｃｔｇｔｃｔｔａｇｔｔｃａｔｇｇａａｇａａａｔａａａｃａｃａｇｔａｃｃａｇｃｃａｔａｔｃｇｔｔｃａｃａｃａｃｇｔｇｇｃａｔａｔｇｔａａｃｔｔｔｔａａｔａａａｃｃａａａａｇａａａａａｇｔｃｃｃａａａｔａｔｔｃａａｇｔｇａａａａａａａｔｃｃａａａｃａｇｔｔｇａｃａｃａａｇｃｃｔａａｃｔｇａｔａｇｔｔａｃｔｔｔａｔｇｔａｃａｇｃｔｇｔａｔｇｔａｔａａｇｔｔｃａａａａａａａｇｃｔａｃｃｃｔａｔｔｔｇｔａｔｇｔａｃａａａａｇｔｔｔａｔａｃａｃａｇｇｔｃｔｇｔａｃａｔａａｇｇｇｔｃｔａｔａｃａｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔｃａｇａａｃｃｃｔｔａｇｇｔｇｔｃａｃｃｔｃｔａｇａａｇａｃａｃｃａａｃａｃｔｔｃａｔｔｃａｃａｔａｔｔｔｔａｔａａａａｇａａａｇａｃｔｔｃｃａｇｇａｃｔｇａｃａａｔｃｔｔｇｔａｔｃｃｃｔｔｇｔａｔｔｔｇａａｃｃａｔｇｔａｇｇｔｔｃａｔｔｃｇａｔｔｔａａｃａｇｃｃｔｔｃｔｇｔｃａ。
【0171】
Ｈ１１ａｒｍ２の鎖の１つのヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【0172】
ｔａｇｃｔｃａｃｃｔｔｇａａａａｔｇｇａａａｃａｔｇｔｃｔｇａｃａａｇａｇｃｃｔｔｇａｇｃｔｇａａｔａｔｃａｔｃｃａｇａｇｔａｔｔｔｇｃｔａｇａｇａｃａｇｇｇｔｃｔｔａａｇｔｃｔｃａｔｔａａａｔｔｇｃｔｔａｇａａｇｔｇｔｇｔｔｔａｇｔｃｃｔａｔａａａｃｔａｔｇｔｃｔｃａｔｔｔｇｔｇｔｇｔｃｃｔｔｃａｃａａａｇａｇｃｇｃｔａｇｔｇｔｃｇａｔｃａｔｃｃａｔｔａｇｃｃｔａｇｃｃｔａｔａａａｇｇｔｇａｃａｃａａｃｃｔｇｇｔｃａｇｔｃｃｃｔｃｔｇｔａｔｇｔｃｔａｃｔａｔｔｔｃｃｃｃｔｔｃｔｇａｔｔｔｃｔａｃｔａｔｃｔｔｃｔｃａａｇａａｃｔｇｇｔｔｃｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｔｔｇｇｇａａａｔｇｔｃａｃｔｔｔｔｔａａｔｇａｔｇｔｇｔｇｔｔｔｔｇｃｔｔａｔｇｔａｔａｔｇｔｃｔａｃａｔａｃｔａｃｃｃａｔｇｔｇｃｔｔｇｇｔｃａｃｔｇｃａｇａｇｇｃｃａｇａａｇａｃｇｇｔｇｔｃａｇｇｔｇｃａｃｔｇｇａａｃｔａｇａｇｔｔａａｔｇａｃａｇａｔｇｔｇａｇｃｃａｔａｇｇｇｔｇｃｔｔｔｇｔｔｃａｃａｔｃｔｔｔｃｃａｇｔｃｃｃａａａｔｇｃｇｔｃｔａａａｃｔｔａｔｇｔｇａｔａｃａｔａｃｔａｇａｔｔａｃｃａｃａａａａｔｔｇｃｔｃｃａａａｇａｃａｃｃｔｔｔｃｔｃｃｃｔｃｔｇａｇａｔｇａａｔｃｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｃｔｔｇｃｔｃｔａｇｇｃａａｔｃｃｔｇｔｇｔｔｃａａｔｔｃａａｇｇａｃｔｇａａｔｔｔｇａｔｔａｃａｔｃｇｇｔａａｔｃｃａｇｔｇｃｃｃｃａｇｇｃａｔｔｔｃｔｇｃｔｔｔｔｔｃｔｇｔａａｇｇｔｔｃｔｔａｔｃｃｃｃｔｇｇａａｇａｃｔｇｔｔｔａｃｇｔａｔｔｃａｔｔｔｔｔｔｔｔｔｇａｇａｃｔａａｇｔｔｔｃａｇｇｔａｇａａａａａｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇａａｃｔｔｃａｃｔａｔａｔａｇｇｇｃｔｔａｔｃｔｔｇａａｃｔｃｔｔｇｔｇｇｇｔｃｔｔｃｃａｃｃｔｔｔｃｔｔｃａｇｔｔａｇｃｔｔｃｔｇｔａｃａｃｔｇｃｃａｇａｃａｔｇａａａａｔｃａｇａｔｃｃａｔｔｔａｔａｇａｔａｇａｔｇｇｔｃａｔｇａｇｃｃａｃｃａｔｇｔｇｇｇｔｇｔｃｔａａａａｔｔｇａｔｃｔｃａｇｇａｃｃｔｃｔｇａａａｇａｃｃａｇｃｔａｇｔｔｃｔｃｔｔａａｃｔｇｃｔｇａｇｃｃａｔｃｔｃｔｃｔａｇｃｇｔｇｔｃｔａｔａｃａｃａｔｔｔａａｔａｔｃｃｃｃｔｔｇｔｔｃｃｃｔｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｔｃｔｔｇｃｔｇａｔｃａｔｇａｔｔａｇｔｇｔｔｔｇｃｃｔｔｔｇｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｃａｔｃａｇｃｔｔｃａｇｃｃｔｇａａｇａｇｔａａｇｔａｇｔｔｃｔｃｔａｔｔｇｇｃａｇｔｔｔｇａｃａｃａｔｃｃｔｇｃｃｃｔｔａｃ。
【0173】
［実施例４］
以下の表に示すように、構築されたベクター（ターゲティングベクターまたはコントロールターゲティングベクター）とＣａｓ９システムで、注入システムを構成した。
以下の表に示すように、構築されたベクター（ターゲティングベクターまたはコントロールターゲティングベクター）とＣａｓ９システムで、注入システムを構成した。
【0174】
ターゲティングベクターで使用されるｓｇＲＮＡのターゲット配列は、ＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＴＴＡＡ（配列番号９）である。
【0175】
コントロールターゲティングベクターで使用されるｓｇＲＮＡのターゲット配列は、ＣＴＧＡＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡである。
【0176】
マイクロインジェクションによりＮＣＧ野生型マウスの０．５日（精子を卵培養皿に加えてから１２時間）受精卵（１－２ＰＬ／胚）に注射し、０．５日（雌ラットと結紮雄ラットの交配成功から１２時間（血栓摘出成功））偽妊娠雌マウスに胚を移植（卵管移植による胚着床）した。マウスが生まれた後、ターゲットマウスを遺伝的同定によってスクリーニングした。陽性マウスは、Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡ（実施例３の対照ターゲットベクターを使用して構築された）およびＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡと名付けられた（実施例１のターゲティングベクターを使用して構築された）。陽性のＦ０マウスとバックグラウンドマウス（ＮＣＧマウス）を戻し交配してＦ１を得、Ｆ１世代のマウスの尾を遺伝的に同定した。陽性のＦ１マウスを育成して、検証実験のためのシステムを構築した。
【0177】
表１６．Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウス識別プライマーリスト
【表16】
【0178】
図９の同定結果は、番号１４６＃、１４９＃、１５０＃、１５２＃、１５３＃、１５５＃、１５６＃、１５７＃、１５８＃、１６１＃、１６３＃、１６６＃、１６７＃、１６８＃、１７０＃、１７２＃がＦ１世代の陽性Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウス（ｋｉ／ｗｔ）であり、その他が野生型であることを示した。
【0179】
表１７．Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡＦ１世代のマウス識別プライマーリスト
【表17】
【0180】
図１０の同定結果は、Ｎｏ．１５のマウスが、Ｆ１世代陽性のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスであることを示した。
【0181】
［実施例５］
マウスの肝障害の規則性の測定
１ Ｈ１１－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウス肝障害の規則性の測定
６～８週齢のバックグラウンドマウス（ＷＴ）、Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスに、強制経口投与または飲用により２．０ｍｇ／ｍＬ Ｄｏｘを投与し、さまざまな時点で眼窩から血液を採取し、血清中のＡＬＴ活性のレベルを測定した。
マウスの肝障害の規則性の測定
１ Ｈ１１－ａｌｂ－ＴｅｔＯｎ３Ｇ－ｕＰＡマウス肝障害の規則性の測定
６～８週齢のバックグラウンドマウス（ＷＴ）、Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスに、強制経口投与または飲用により２．０ｍｇ／ｍＬ Ｄｏｘを投与し、さまざまな時点で眼窩から血液を採取し、血清中のＡＬＴ活性のレベルを測定した。
【0182】
図１１の実験結果は、Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスのいずれに対して、Ｄｏｘを投与した後、ＡＬＴマウスが増加したが、重度の肝障害のレベルに達しなかったことを示した。
【0183】
２ Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウス肝障害の規則性の測定
２週齢のＮＣＧバックグラウンドマウスとＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスに対して、それぞれ２、４、６、８、１０、１２、１４、１６週齢で眼窩から血液を採取し、血清中のＡＬＴ活性のレベルを測定した。驚いたことは、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスのＡＬＴ活性が、３～４週齢で増加し、週齡の増加とともに増加し、８～１０週齢で急激に減少した（図１２を参照）。
２週齢のＮＣＧバックグラウンドマウスとＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスに対して、それぞれ２、４、６、８、１０、１２、１４、１６週齢で眼窩から血液を採取し、血清中のＡＬＴ活性のレベルを測定した。驚いたことは、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスのＡＬＴ活性が、３～４週齢で増加し、週齡の増加とともに増加し、８～１０週齢で急激に減少した（図１２を参照）。
【0184】
４週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの肝臓を採取し、パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋し、切片化し、ＨＥ染色分析を行った。ＮＣＧバックグラウンドマウスと比較して、４週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスは、重度の肝障害になり、肝細胞バルーニング、局所壊死、および細胞質溶解が発生した（図１３を参照）。
【0185】
以上により、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスは、自発的に肝障害を起こす可能性があり、肝障害の程度は、外因性肝細胞の移植の要件を満たすことができる。Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡホモ接合マウスも、自発的に肝障害を起こす可能性がある（図２０を参照）。
【0186】
３ 様々な週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスは、いずれもＤｏｘに対して反応する。
【0187】
３～４週齢および６～８週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに対して、１～２ｍｇ／ｍＬのＤｏｘ水を与え、飲用後の０／３／５／７日目に採血し（３～４週齢）、および０／２／４／６／８日目（６～８週齢）に採血し、血清中のＡＬＴ活性を測定した。マウスは７日目または８日目に安楽死させた。マウスの肝臓を採取し、固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、ＨＥ染色を行って、肝細胞の損傷を分析した。
【0188】
図１４および図１５は、その結果を示す。Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスは、３～４週齢または６～８週齢にかかわらず、いずれもＤｏｘに対して応答できた。通常の飲料水を使用したＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスと比較して、Ｄｏｘ水を投与したマウスは、そのＡＬＴ活性が大幅に上昇し、肝障害が悪化した。
【0189】
以上により、Ｈ１１－ａｌｂ－Ｔｅｔ Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスと比較して、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスは、Ｄｏｘ応答に対してより敏感であり、自発的に損傷する可能性があることをわかった。したがって、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスは、肝障害後の肝臓の再構築に用いられることができる。
【0190】
［実施例６］
肝細胞移植試験
１ 緑色蛍光肝細胞の分離
５～６週齢のＢ６－Ｇ／Ｒ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より提供、系統番号がＴ００６１６３である）のオスのマウスを選択した。マウスを麻酔した後、アルコールで腹部を洗浄した。腹腔を露出するように切開し、下大静脈と門脈を露出させ、下大静脈から保持針を挿入した。前灌流が成功した後、門脈を切開した。予熱した灌流バッファー－Ｐ１（ＨＢＳＳで最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ溶液を調製）および酵素バッファー－Ｐ２（ＨＢＳＳで最終濃度５ｍＭのＣａＣｌ２溶液（ｐＨ７．２）を調製、使用前にコラゲナーゼを添加）を順次に灌流した。灌流が完了したあと、肝臓全体を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、Ｐ２溶液に入れた。肝臓のエンベロープをこすって、肝臓細胞をＰ２に入れ、細胞懸濁液をろ過した。ろ液に１０％ＦＢＳのＤＭＥＭを加え、４００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を除去した。
肝細胞移植試験
１ 緑色蛍光肝細胞の分離
５～６週齢のＢ６－Ｇ／Ｒ（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｊｉｃｕｉ Ｙａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．より提供、系統番号がＴ００６１６３である）のオスのマウスを選択した。マウスを麻酔した後、アルコールで腹部を洗浄した。腹腔を露出するように切開し、下大静脈と門脈を露出させ、下大静脈から保持針を挿入した。前灌流が成功した後、門脈を切開した。予熱した灌流バッファー－Ｐ１（ＨＢＳＳで最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡ溶液を調製）および酵素バッファー－Ｐ２（ＨＢＳＳで最終濃度５ｍＭのＣａＣｌ２溶液（ｐＨ７．２）を調製、使用前にコラゲナーゼを添加）を順次に灌流した。灌流が完了したあと、肝臓全体を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、Ｐ２溶液に入れた。肝臓のエンベロープをこすって、肝臓細胞をＰ２に入れ、細胞懸濁液をろ過した。ろ液に１０％ＦＢＳのＤＭＥＭを加え、４００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を除去した。
【0191】
上記のペレットにパーコール混合液（１０ｍＬのＤＭＥＭ＋１ｍＬの１０ｘＰＢＳ＋９ｍＬのパーコール）を加えて細胞を再懸濁し、４℃、１１００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去した。
【0192】
予冷したＤＭＥＭで細胞を洗浄し、細胞の生存率を確認した。カウント結果に基づいて、使用に適した濃度に細胞を希釈した。
【0193】
２ マウス脾臓からの同所性肝細胞移植
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスとＮＣＧマウスをランダムに以下のグループに分けた（表１８を参照）。脾臓内移植により、各マウスに新鮮な緑色蛍光肝細胞を注射した。移植手術終了後、３７℃の高温ステージで保温し、自然に目覚めた後、抗生物質を注射し、ケージに戻す。以下の表のように、通常の飲料水またはＤｏｘ水を与えた。マウスの肝細胞移植が完了してから１０週間後、すべてのマウスをエンドポイントとして選択した。マウスの緑色蛍光細胞の分布を観察するために、肝臓を固定し、包埋し、凍結切片にした。図１６および図１７は、その結果を示す。
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスとＮＣＧマウスをランダムに以下のグループに分けた（表１８を参照）。脾臓内移植により、各マウスに新鮮な緑色蛍光肝細胞を注射した。移植手術終了後、３７℃の高温ステージで保温し、自然に目覚めた後、抗生物質を注射し、ケージに戻す。以下の表のように、通常の飲料水またはＤｏｘ水を与えた。マウスの肝細胞移植が完了してから１０週間後、すべてのマウスをエンドポイントとして選択した。マウスの緑色蛍光細胞の分布を観察するために、肝臓を固定し、包埋し、凍結切片にした。図１６および図１７は、その結果を示す。
【0194】
表１８．マウス肝細胞移植および条件付き治療群
【表18】
【0195】
図１６および図１７の結果
（１）３～４週齢および６～８週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに肝細胞移植を行い、通常の飲料水を１週間与えた。外因性肝細胞がマウス肝臓の表面に均一に分布しており、再構築率が５０％に達することができる。
（１）３～４週齢および６～８週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに肝細胞移植を行い、通常の飲料水を１週間与えた。外因性肝細胞がマウス肝臓の表面に均一に分布しており、再構築率が５０％に達することができる。
【0196】
（２）３～４週齢および６～８週齢のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスに肝細胞移植を行い、Ｄｏｘ水を１週間与えた。緑色蛍光肝細胞は、肝臓の表面に均一に分布した。再構築率は、９０％であった。通常の飲料水グループと比較して、マウスにＤｏｘ水を与えるマウスは、外因性肝細胞のコロニー形成を大幅に改善できた。
【0197】
［実施例７］
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの生存率の測定
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスをＮＣＧバックグラウンドマウスと交配させて、実験用の子孫Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスを得た。これによって、１３３５匹のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスが得られ、周産期まで１２９９匹が生き延びた。生存率が９７％と高かった。Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡホモ接合およびヘテロ接合の生存率は、ほぼ同じであり、ｕＰＡ－ＳＣＩＤマウスの周産期生存率（７０％－７５％）と比較して、本開示の実施形態の方法によって、マウスの生存率を大幅に改善した。
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの生存率の測定
Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスをＮＣＧバックグラウンドマウスと交配させて、実験用の子孫Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスを得た。これによって、１３３５匹のＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡヘテロ接合マウスが得られ、周産期まで１２９９匹が生き延びた。生存率が９７％と高かった。Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡホモ接合およびヘテロ接合の生存率は、ほぼ同じであり、ｕＰＡ－ＳＣＩＤマウスの周産期生存率（７０％－７５％）と比較して、本開示の実施形態の方法によって、マウスの生存率を大幅に改善した。
【0198】
以上により、本開示の実施形態は、肝臓におけるｕＰＡの特異的発現を調節するためのＲｏｓａ２６サイトの相同性アームを運ぶＴｅｔ ｏｎシステムのベクター（実施例１）を提供し、このベクターをＲｏｓａ２６サイトに組み込むことができる。これらの要素の組み合わせによって構成されるベクターを使用して構築されたマウスモデルＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡは、ゲノム上の隣接配列の干渉効果を回避し、内因性遺伝子に損傷を与えず、マウスの正常な成長と発達を保証するとともに、マウスの機能も正常である。
【0199】
予想外のことは、このベクターを使用して構築されたマウスモデルＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡが、自発的な肝障害を引き起こし（肝障害が２～３週齢で発生し、ＡＬＴ値が８週齢で３００ ＩＵ／Ｌに達する）、また、自発的肝損傷のレベルが、外因性肝細胞の移植の要件を十分に満たす。つまり、外因性肝細胞のコロニー形成は、Ｄｏｘ誘導なしで達成できるため、移植ステップがより簡単になる。この自発的な肝障害の表現型は、Ｔｅｔ ｏｎシステムによるタンパク質発現の調節の特性の認識を破った。
【0200】
さらに、Ｒｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡは、自発的な肝障害を引き起こすとともに、さまざまな成長段階でＤｏｘに応答できる。つまり、Ｄｏｘ誘導を使用すると、マウスの肝障害のレベルを悪化させ、外因性肝細胞のコロニー形成率を高めることができる。
【0201】
自発的な肝障害を引き起こすとともに、Ｄｏｘ誘導によって肝障害を悪化させることができるＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスの特性によって、さまざまな週齡のマウスを自由に選択して、その自発的な肝障害の特性を利用して肝臓の再構築を実現することができる。または、Ｄｏｘ誘導により、外因性肝細胞のコロニー形成率を改善した。肝臓の再構築にＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスを使用すると、移植ウィンドウが週齡に制限されず、移植の再構築条件がより柔軟になった。
【0202】
なお、本開示の実施例によるＲｏｓａ２６－ａｌｂ－Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇ－ｕＰＡマウスのハイブリッド子孫の死亡率は、既存の自発的肝損傷マウスモデルの死亡率よりもはるかに低く、これは、肝障害マウスモデルの大規模な使用に寄与できる。
【0203】
［実施例８］
本実施例は、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２に対する第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の異なる接続関係の影響に関し、次のステップを含む。
本実施例は、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２に対する第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の異なる接続関係の影響に関し、次のステップを含む。
【0204】
実施例１のＲｏｓａ２６ ａｒｍ１－Ａｌｂ エンハンサー－Ａｌｂ プロモーター－Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ－ＨＧＨ ｐｏｌｙＡ－ウサギ ｐｏｌｙＡ－ｕＰＡ－ＲＥ３Ｇ－Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２をテンプレートとして使用して、第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の接続関係（テールツーテール（Ａ）、テールツーヘッド（Ｂ）、ヘッドツーヘッド（Ｃ））が異なる発現ベクターを調製し、発現ベクターは、ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイト（Ｒｏｓａ２６）へのターゲット配列の挿入を仲介するための５’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ１）および３’末端相同性アーム配列（Ｒｏｓａ２６ ａｒｍ２）を含む（図２１が各要素位置関係を示す）。
【0205】
（１）ＨｅｐＧ２細胞を回復させ増殖させる。
（２）ＨｅｐＧ２細胞に対するエレクトロポレーション
（２）ＨｅｐＧ２細胞に対するエレクトロポレーション
【0206】
ＤＰＢＳを培養皿に入れ細胞を洗浄し、上清を除去し、ＨｅｐｓＧ２細胞を消化して取得し、そして、細胞をカウントして２０等分（１．５ｘ１０６／パーツ）に分割し、エレクトロポレーション溶液と異なる接続関係のプラスミドを細胞に入れて、均一に混合し、さらに、エレクトロポレーションを実施するための電極カップに移動した。エレクトロポレーションが完了したあと、細胞懸濁液をすばやく吸引し、培養用のペトリ皿に入れた。
【0207】
（３）エレクトロポレーションが完了してから１２時間後、培地と浮遊死細胞を除去し、通常の培地を加えて１２時間培養を続けた。
【0208】
（４）エレクトロポレーションが完了してから２４時間後、表１９の処理方法に従って、通常の培地を入れ替えるか、Ｄｏｘ培地を加えて培養を続けた。
【0209】
表１９．ＨｅｐＧ２肝細胞癌細胞および条件付き治療のグループ化に対する異なる接続関係を持つ２つの発現カセットの効果
【表19】
【0210】
【0211】
（１）図２２に示すように、ＧＦＰプラスミドがＨｅｐｓＧ２細胞に電気変換されてから２４時間後および４８時間後に、ＨｅｐｓＧ２細胞が緑色蛍光を発現できる。これによってわかるように、エレクトロポレーションでプラスミドを細胞ゲノムに組み込んで発現させることができ、エレクトロポレーションで異なる接続関係を持つ発現ベクターをＨｅｐｓＧ２細胞に組み込んで発現させることができる。
【0212】
（２）図２３は、細胞エレクトロポレーションが完了してから２４時間後の状態を示す。他の接続関係を持つプラスミドと比較して、第１の発現カセットと第２の発現カセットのテールツーテール接続関係を持つプラスミドは、ＨｅｐｓＧ２細胞に対する損傷が最も大きく、接着細胞の数が他の接続関係を持つプラスミドエレクトロポレーション細胞よりも大幅に少なく、細胞はアポトーシス状態にある（赤い丸で囲まれた細胞形態が異常であり、アンテナは増加している）。これによって分かるように、第１の発現カセットと第２の発現カセットのテールツーテール接続関係を持つプラスミドは、Ｄｏｘ誘導なしでｕＰＡを発現でき、細胞損傷とアポトーシスを引き起こすことができる。この接続関係は、ｕＰＡの発現のリークを引き起こす可能性がある。
【0213】
（３）図２３は、Ｄｏｘを含む培地でＨｅｐｓＧ２細胞を２４時間培養した後の状態を示す。異なる接続関係を持つプラスミドに対してエレクトロポレーションを実施したＨｅｐｓＧ２細胞は、いずれも異常な形態を示し、アンテナが増加し、アポトーシス状態を示した。これによって分かるように、異なる接続関係を持つプラスミドは、いずれもＤｏｘ誘導に応答できる。
【0214】
［実施例９］
マウスの肝障害に対する第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の異なる接続関係の影響
流体力学に基づく方法は、肝臓に外来遺伝子を効率的に導入することができ、遺伝子機能の研究に広く利用されており、肝臓などの臓器疾患の治療選択肢となっている。高圧尾静脈から大量のＤＮＡを急速に注射すると、体内、特に肝細胞で非常に高レベルの外因性遺伝子発現が起こる可能性がある。しかし、高い油圧は肝臓に深刻な損傷を引き起こす可能性もある（ＡＬＴの増加）。
マウスの肝障害に対する第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の異なる接続関係の影響
流体力学に基づく方法は、肝臓に外来遺伝子を効率的に導入することができ、遺伝子機能の研究に広く利用されており、肝臓などの臓器疾患の治療選択肢となっている。高圧尾静脈から大量のＤＮＡを急速に注射すると、体内、特に肝細胞で非常に高レベルの外因性遺伝子発現が起こる可能性がある。しかし、高い油圧は肝臓に深刻な損傷を引き起こす可能性もある（ＡＬＴの増加）。
【0215】
本実施例は、マウスの肝障害に対する第１の発現カセットと第２の発現カセットの間の異なる接続関係の効果に関し、以下のステップを含む。
【0216】
上記で作製した異なる接続関係を持つ発現ベクターを高圧尾静脈急速注射によりマウスに注射するとともに、対照として緑色蛍光を発現できるＧＦＰ（Ｐｍａｘ－ＧＦＰ）プラスミドと生理食塩水を注射した。マウスにプラスミドを注射した後、Ｄｏｘ水（２ｍｇ／Ｌ）を与え、それぞれ１、３、５、７日目に眼窩から血液を採取し、血清中のＡＬＴ活性を測定した。表２０は、具体的なステップを示す。注射後１日目に、ＧＦＰプラスミドおよび生理食塩水群を注射したマウスの肝臓を固定して包埋し、凍結切片を行ってマウスの緑色蛍光細胞の分布を観察した。図２４は、その結果を示す。
【0217】
表２０．マウスの肝障害に対する異なる接続関係キャリアの効果に関する実験の条件付き治療グループ
【表20】
【0218】
【0219】
（１）ＧＦＰプラスミドを注射した後、マウスの肝臓は、緑色蛍光を発現することができる。これによって分かるように、尾静脈から注射されたプラスミドＤＮＡは、肝細胞において発現することができる。
【0220】
（２）異なる結合関係を持つプラスミドとＧＦＰプラスミドを注射し、マウスにＤｏｘ水を与えた場合、テールツーテールの結合関係を持つプラスミドのみを注射したマウスのＡＬＴが大幅に増加した。したがって、第１の発現カセットと第２の発現カセットのテールツーテールの接続関係を持つベクターは、Ｄｏｘ誘導でマウスに肝障害を引き起こすことができるので、他の接続方法よりも優れている。
【0221】
以上により、テールツーテールの接続関係を持つ２つの発現カセットは、顕著にＤｏｘに応答でき、他の接続関係よりも優れている。
【0222】
上記の記載は、本開示の好ましい実施例にすぎず、本開示を限定するものではない。当業者にとって、本開示に各種の変更や変化を有してもよい。本開示の精神および原理から逸脱しない限り、行った如何なる変更、均等置換、改良なども、本出願の保護範囲内に属する。
【産業上の利用可能性】
【0223】
本開示は、肝障害のマウスモデルを構築するためのターゲティングベクター、核酸組成物および構築方法を提供する。本開示のターゲティングベクターを使用して構築された肝障害マウスモデルは、誘導物質を使用せずに肝障害を形成することができ、つまり、自発的に肝障害を形成することができる。また、誘導物質を使用すると、肝障害の程度を高めることができる。さらに、この肝損傷マウスモデルによる自発的肝損傷の程度は、外因性肝細胞の移植の要件を満たすことができるとともに、肝細胞移植後の再構築率も高い。また、この肝障害マウスモデルは、交雑により子孫肝障害マウスを繁殖させることができ、子孫マウスの死亡率が低く、大規模な繁殖に寄与できる。本開示は、肝疾患研究のための信頼できる肝損傷マウスモデルを提供する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-11-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ターゲット配列と、マウスゲノムのターゲットサイトへの前記ターゲット配列の挿入を媒介するための５’末端相同性アーム配列および３’末端相同性アーム配列と、を含み、前記ターゲット配列は、第１の発現カセットおよび前記第１の発現カセットの下流に位置する第２の発現カセットを含み、
前記第１の発現カセットは、肝臓特異的プロモーター、テトラサイクリン転写活性化レギュレーター、および第１のｐｏｌｙＡを順に直列に含み、
前記第２の発現カセットは、第２のｐｏｌｙＡ、マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子、およびテトラサイクリン誘導性プロモーターを順に直列に含み、
前記肝臓特異的プロモーターは、前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターの発現を上流から下流に駆動し、前記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子の発現を下流から上流に駆動し、
前記ターゲットサイトは、Ｒｏｓａ２６サイトである
ことを特徴とする肝障害マウスモデルを構築するためのターゲティングベクター。
【請求項2】
前記第１の発現カセットは、さらにエンハンサー配列を有し、前記エンハンサー配列は、前記肝臓特異的プロモーターの上流に位置することを特徴とする請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項3】
前記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、アポリポプロテインＥプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーター、α－Ｉ－アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、α－フェトプロテインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ＩＧＦ－ＩＩプロモーター、第ＶＩＩＩ因子プロモーター、ＨＢＶ基本コアタンパク質プロモーター、ＨＢＶプレ－ｓ２タンパク質プロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、ＨＣＲ－Ａｐ０ＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子のエンハンサーエレメントと組み合わせたＡＡＴプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼプロモーター、アポリポプロテインＨプロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、α－フィブリノーゲンおよびβ－フィブリノーゲンプロモーター、α－Ｉ－アンチキモトリプシンプロモーター、α－２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質プロモーター、補体Ｃ３アクチベータープロモーター、ヘモコングロビンプロモーターおよびα－Ｉ－酸糖タンパク質プロモーターのいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項4】
前記肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項5】
前記エンハンサー配列は、アルブミンエンハンサーであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項6】
前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、ｔＴＡ、ｒｔＴＡおよびＴｅｔ－Ｏｎ３Ｇのいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項7】
前記テトラサイクリン転写活性化レギュレーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ３Ｇであることを特徴とする請求項６記載のターゲティングベクター。
【請求項8】
前記第１のｐｏｌｙＡは、ＨＧＨｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものであることを特徴とする請求項２に記載のターゲティングベクター。
【請求項9】
前記第２の発現カセットにおいて、前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子と前記テトラサイクリン誘導性プロモーターの間にコザック配列が挿入されていることを特徴とする請求項１～８のいずれか一項に記載のターゲティングベクター。
【請求項10】
前記テトラサイクリン誘導性プロモーターは、ＴＲＥ３ＧおよびＴｅｔＯ６のいずれか１つから選択されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項11】
前記テトラサイクリン誘導性プロモーターはＴＲＥ３Ｇであることを特徴とする請求項１０に記載のターゲティングベクター。
【請求項12】
前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子によってコードされるマウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸配列は、配列番号７に示されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項13】
前記マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号６の位置１～１３０２に示されるものであり、またはその相補的配列であることを特徴とする請求項１２に記載のターゲティングベクター。
【請求項14】
前記第２のｐｏｌｙＡは、ウサギｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ｈＧＨｐｏｌｙＡ、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙＡおよびｒｂＧｌｏｂｐｏｌｙＡから選択されるものであることを特徴とする請求項９に記載のターゲティングベクター。
【請求項15】
前記５’末端相同性アーム配列は、配列番号４に示されるものであり、またはその相補的配列であり、前記３’末端相同性アーム配列は、配列番号５に示されるものであり、またはその相補的配列である
ことを特徴とする請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のターゲティングベクターと、前記ターゲットサイトでマウスゲノム配列に二本鎖切断を引き起こさせるためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物とを含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを構築するための核酸組成物。
【請求項17】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組成物は、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１６に記載の核酸組成物。
【請求項18】
前記ｓｇＲＮＡのターゲット配列は、配列番号９に示されるものであることを特徴とする請求項１７記載の核酸組成物。
【請求項19】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のターゲティングベクターを含むことを特徴とする組換え細胞。
【請求項20】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のターゲティングベクター、または請求項１６～１８のいずれか一項に記載の核酸組成物を含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを構築するためのキット。
【請求項21】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のターゲティングベクター、または請求項１６～１８のいずれか一項に記載の核酸組成物を使用して、ターゲットマウスのゲノム上の前記ターゲットサイトに前記ターゲット配列を挿入することを特徴とする肝障害のマウスモデルの構築方法。
【請求項22】
前記ターゲットマウスは、免疫不全マウスであることを特徴とする請求項２１に記載の構築方法。
【請求項23】
免疫不全マウスからの受精卵に前記核酸組成物を注射し、そして、前記受精卵を偽妊娠雌マウスに移植し、さらに前記偽妊娠雌マウスの子孫から、肝損傷マウスモデルである、ゲノムに前記ターゲット配列が挿入された陽性マウスをスクリーニングすることを含むことを特徴とする請求項２２に記載の構築方法。
【請求項24】
請求項２１～２３のいずれか一項に記載の構築方法によって得られた肝損傷マウスモデルを、免疫不全の野生型マウスと交配させることを含むことを特徴とする肝障害のマウスモデルを繁殖させる方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】