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特表2022-540291線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物、組成製品及びその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-15
(54)【発明の名称】線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物、組成製品及びその応用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7048 20060101AFI20220908BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220908BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220908BHJP
A61K 31/56 20060101ALI20220908BHJP
A61K 31/165 20060101ALI20220908BHJP
A61K 31/357 20060101ALI20220908BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20220908BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220908BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220908BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220908BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20220908BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220908BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220908BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220908BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220908BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20220908BHJP
A61P 17/18 20060101ALI20220908BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7048
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K31/56
A61K31/165
A61K31/357
A61K38/21
A61P11/00
A61P9/00
A61P1/16
A61P1/18
A61P13/12
A61P17/00
A61P7/00
A61P29/00
A61P39/06
A61P17/18
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021568677
(86)(22)【出願日】2020-04-16
(85)【翻訳文提出日】2022-01-06
(86)【国際出願番号】 CN2020085111
(87)【国際公開番号】W WO2020228477
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】201910409332.8
(32)【優先日】2019-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518232320
【氏名又は名称】沈陽福洋医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＹＡＮＧ ＦＵＹＡＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】何紅偉
(72)【発明者】
【氏名】姜恩鴻
(72)【発明者】
【氏名】赫衛清
(72)【発明者】
【氏名】姜勲東
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA44
4C084DA21
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB21
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA15
4C086EA14
4C086GA13
4C086GA15
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA36
4C086ZA51
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZB21
4C086ZC37
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206GA02
4C206GA30
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA04
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZB21
4C206ZC75
(57)【要約】
線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物において、前記薬物の有効成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含む。更に、線維化を予防、緩和及び／又は治療するための組成物製品に関する。前記組成製品は第１薬剤を含む。前記第１薬剤の活性成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含む。更に、線維化の予防、緩和及び／又は治療における上記の薬物及び組成物の応用に関する。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物であって、前記薬物の有効成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含むことを特徴とする薬物。
【請求項2】
前記薬物は医学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする請求項１に記載の線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物。
【請求項3】
線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物であって、前記薬物の有効成分は、
カリマイシンの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
イソバレリルスピラマイシンＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
及び、イソバレリルスピラマイシンＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、のうちの１種類又は複数種類から選択されることを特徴とする薬物。
【請求項4】
線維化を治療するための組成製品であって、前記組成製品は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の有効成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含むことを特徴とする組成製品。
【請求項5】
前記組成製品は更に第２薬剤を含み、前記第２薬剤は、線維化を予防、緩和及び／又は治療するための関連薬物のうちの少なくとも１種類を含むことを特徴とする請求項４に記載の線維化を治療するための組成製品。
【請求項6】
前記線維化を予防、緩和及び／又は治療するための関連薬物は、コルチコステロイドホルモン、コルヒチン、シリマリン、インターフェロンを含むことを特徴とする請求項５に記載の線維化を治療するための組成製品。
【請求項7】
線維化を治療するための組成製品であって、前記組成製品は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の有効成分は、
カリマイシンの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
イソバレリルスピラマイシンＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、
及び、イソバレリルスピラマイシンＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、のうちの１種類又は複数種類から選択されることを特徴とする組成製品。
【請求項8】
前記線維化には、肺線維化、心臓線維化、肝線維化、膵臓線維化、腎臓線維化、骨髄線維化及び皮膚線維化が含まれ、好ましくは、前記肺線維化には、新型コロナウイルス感染によりもたらされる肺線維化が含まれることを特徴とする請求項１又は２に記載の薬物、或いは請求項３に記載の薬物、或いは請求項４～６のいずれか１項に記載の組成製品、或いは請求項７に記載の組成製品。
【請求項9】
線維化の予防、緩和及び／又は治療における請求項１又は２に記載の薬物、或いは請求項３に記載の薬物、或いは請求項４～６のいずれか1項に記載の組成製品、或いは請求項７に記載の組成製品の応用。
【請求項10】
炎症又は脂質過酸化の抑制、線維芽細胞の増殖及び活性化の抑制、コラーゲン分解の促進における請求項１又は２に記載の薬物、或いは請求項３に記載の薬物、或いは請求項４～６のいずれか1項に記載の組成製品、或いは請求項７に記載の組成製品の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は医薬化学の分野に属し、具体的には、線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物、組成製品及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
線維化とは病理学的変化の一種であり、線維芽細胞の活性化や増殖、組織・器官内における線維性結合組織の増加、実質細胞の減少として現れ、進行が続くと、組織・器官の構造破壊及び機能喪失が招来され得る。重要な臓器の線維化は患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）に深刻な影響を及ぼし、ひいては生命を脅かすことになる。全世界的に、組織の線維化は、多くの疾病における後遺症及び死亡の主な原因となっている。米国の関連統計データによれば、同国において各種疾病のために死亡した患者のうち、約４５％は組織線維増殖性疾患に分類可能なことが証明されている。現在のところ、この疾病を対象とした治療手段や薬物は非常に欠如しており、予後の状況が大変悪い。よって、線維化を効果的に治療可能な新たな薬物を開発することが非常に重要且つ切実な仕事となっている。
【0003】
カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）（ビテスピラマイシン（Ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、シェンジマイシン（Ｓｈｅｎｇｊｉｍｙｃｉｎ）とも称される）は、中国医学科学院生物技術研究所と本願の出願人とが協力し、遺伝子組み換え技術によりカルボマイシン産生菌の４’’イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（４’’－Ｏ－ｉｓｏｖａｌｅｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）をスピラマイシン産生菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｉｒａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）にクローニングしたあと、スピラマイシンの４’’－ＯＨを指向的にアシル化し、４’’位にイソバレリル基の側鎖を導入することで形成した４’’位のイソバレリルスピラマイシンを主成分とする新型の抗生物質である。
【0004】
カリマイシンの主成分の構造式は式（１）に示す通りである。ただし、立体配座は示していない。
【0005】
【化1】
【0006】
Ｒ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２の場合にはイソバレリルスピラマイシンＩとなり、Ｒ＝ＣＯＣＨ３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２の場合にはイソバレリルスピラマイシンＩＩとなり、Ｒ＝ＣＯＣＨ２ＣＨ３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２の場合にはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩとなる。
【0007】
カリマイシンは、主な活性成分であるイソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）の総含有量が６０％以上、アシル化スピラマイシンの総含有量が８０％以上であり、薬学的に許容可能な薬物組成物である。中心構造は、１６員環のラクトンが、ホロサミン分子、ミカミノース分子及びミカローゼ分子と接続してなる。また、主成分であるイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、ミカローゼの４’’位に接続される基がヒドロキシ基ではなくイソバレリル基である点でスピラマイシン構造と異なっている。式（１）に示すように、化学構造は全部で十数種類の成分を含んでいる。現在、カリマイシン製品の成分基準は、薬物中のイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ≧３０％、イソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩの合計比率≧６０％、アシル化スピラマイシンの合計比率≧８０％、その他の未知の成分の合計≦５％となっている。
【0008】
カリマイシンは１６員環マクロライド系抗生物質に属し、活性基であるカルボキシル基、アルコキシ基、エポキシ基、ケトン基及びアルデヒド基と、一対の共役のＣ＝Ｃを有しており、分子量は約８８４～９８２である。カリマイシンとマクロライド系抗生物質は類似の化学構造を有することから、エステル類、アセトン、クロロホルム、アルコール類等の大多数の有機溶媒に対しては易溶、石油エーテルに対しては微溶、水に対しては難溶であったり、分子構造に２つのジメチルアミノ基を含んで弱アルカリ性を示し、酸性水溶液に対し易溶であったり、温度の上昇に伴って溶解度が低下する「負の溶解度」性質を有したり、といった多くの共通点を持つ。カリマイシンの主成分であるイソバレリルスピラマイシンの４’’位の炭素鎖は比較的長く、親水性に劣るため、水への溶解度はスピラマイシンや４’’－アセチルスピラマイシンよりも小さい。
【0009】
当該薬は親油性に優れ、組織への浸透能力が強く、経口吸収が速い。また、体内維持時間が長く、持続的な抗生物質後効果（ＰＡＥ）を有する。薬効及び化学的立体配座の関係から、マクロライド系抗生物質は、４’’位をアシル化すると親油性及びｉｎ ｖｉｖｏ活性が向上するとともに、ｉｎ ｖｉｖｏ抗菌活性及び臨床治療効果の双方が顕著に向上する。また、抗生物質のｉｎ ｖｉｖｏ安定性は４’’ヒドロキシエステルの炭素鎖の伸長に伴って強化される。即ち、イソバレリルスピラマイシン＞ブチリルスピラマイシン＞プロピオニルスピラマイシン＞アセチルスピラマイシンとなる。
【0010】
初歩的なｉｎ ｖｉｖｏ／ｉｎ ｖｉｔｒｏの薬効試験より、当該薬は、複数のＧ＋菌に対し比較的良好な抗菌活性を有するだけでなく、一部のＧ－菌に対しても一定の作用を奏することが明らかとなっている。また、アジスロマイシン、エリスロマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシンよりも各技術指標が明らかに優れており、特に、肺炎マイコプラズマに対する抗菌活性に最も優れている。また、エリスロマイシン耐性菌、淋菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、ヘモフィルスインフルエンザ菌、バクテロイデスフラジリス、レジオネラ、多列桿菌及びウェルシュ菌に対しても一定の抗菌活性を有するほか、臨床においては、エリスロマイシン耐性の黄色ブドウ球菌に対し極めて僅かな交差耐性のみを有する。カリマイシンは、主にグラム陽性菌感染症、特に上部呼吸器の感染治療への適用が見込まれているほか、泌尿器系の感染等に適用される可能性もある。
【0011】
薬物動態学の研究結果より、カリマイシン中の活性を有する有効成分は、主としてイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩであることが分かっている。カリマイシンは体内に入ると代謝される。元のイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩと代謝物であるスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩのＡＵＣ０－ｔの合計から計算すると、経口投与時の絶対的バイオアベイラビリティは平均９１．６％となる。また、１回服用時のカリマイシンの減衰は比較的緩やかであり、Ｔ１／２βは２３～２７時間の間である。
【0012】
２０１９年末から２０２０年１月にかけて、一部の地域で原因不明の肺炎が発生した。そこで、患者の気管支肺胞洗浄標本を次世代シーケンスで検査したところ、新型コロナウイルスが発見された。２０２０年２月１２日、ＷＨＯは、当該新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によりもたらされる疾病をＣｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）と命名した。新型コロナウイルス感染に伴う肺部の損傷には肺の線維化が含まれることから、有効な治療薬や肺部症状改善薬の探索が一刻を争う事態となっている。
【0013】
これまでのところ、カリマイシンで線維化を治療したとの記載及び報告は見られない。
【0014】
上記に鑑みて、本発明を提案する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術の瑕疵を解消するために、線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物を提供することである。当該薬物は、線維化を効果的に予防、緩和及び治療可能なため、重要な社会的利益と経済効果を有する。
【課題を解決するための手段】
【0016】
上記の技術的課題を解決するために、本発明は以下の技術方案を用いる。
【0017】
線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物において、前記薬物の有効成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含む。
【0018】
更に、前記薬物は医学的に許容可能な担体を含む。
【0019】
更に、前記薬物は、医学的に許容可能なタブレット、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤及び各種微粒子投与システムとして製造される。
【0020】
線維化を予防、緩和及び／又は治療するための薬物において、前記薬物の有効成分は、カリマイシンの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、イソバレリルスピラマイシンＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、及び、イソバレリルスピラマイシンＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、のうちの１種類又は複数種類から選択される。
【0021】
線維化を治療するための組成製品において、前記組成製品は第１薬剤を含む。前記第１薬剤の有効成分は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの１種類か、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩのうちの２種類又は３種類の組み合わせを含む。
【0022】
更に、前記組成製品は第２薬剤を含む。前記第２薬剤は、線維化を予防、緩和及び／又は治療するための関連薬物のうちの少なくとも１種類を含む。
【0023】
更に、上記の線維化を予防、緩和及び／又は治療するための関連薬物は、コルチコステロイドホルモン、コルヒチン、シリマリン、インターフェロンを含む。
【0024】
線維化を治療するための組成製品において、前記組成製品は第１薬剤を含む。前記第１薬剤の有効成分は、カリマイシンの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、イソバレリルスピラマイシンＩＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、及び、イソバレリルスピラマイシンＩの誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体、のうちの１種類又は複数種類から選択される。
【0025】
本発明における前記線維化には、肺線維化、心筋線維化、肝線維化、膵臓線維化、腎臓線維化、骨髄線維化及び皮膚線維化が含まれる。
【0026】
好ましくは、前記肺線維化には、新型コロナウイルス感染によりもたらされる肺線維化が含まれる。本願における薬物及び組成製品は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染によりもたらされる肺部の線維化に対し改善作用を有する。
【0027】
肺線維化は、複数の原因により肺の損傷が引き起こされると、間質がコラーゲンを分泌して修復を行うが、修復が過剰であった場合に、線維芽細胞が過度に増殖し、細胞外基質が大量に凝集することで形成される。
【0028】
心筋線維化では、心臓の間質線維芽細胞が過度に増殖し、コラーゲンが過度に蓄積及び異常分布する。
【0029】
肝線維化とは、各種の病原性因子によって肝内結合組織が異常に増殖し、肝内びまん性細胞外基質が過剰に蓄積される病理過程である。例えば、ウイルス感染、炎症反応、酸化ストレス及びアルコール依存症等の複数の要因が肝線維化を引き起し得る。
【0030】
膵臓線維化では、膵腺房細胞がタンパク質を大量に分泌するが、膵管細胞から分泌される液体及び炭酸水素塩は増加しない。膵臓線維化は、膵腺房細胞から分泌されるリトスタチン（Ｌｉｔｈｏｓｔａｔｈｉｎｅ）及びＧＰ２（円柱（ｃａｓｔ）を形成し得るタンパク質）の濃度が低下するとともに、膵管内に沈殿することで形成される。
【0031】
腎臓線維化とは、細胞外基質及び不適切な結合組織が腎臓に凝集する結果、腎臓構造の変化と機能損傷がもたらされる病理過程である。
【0032】
骨髄線維化とは、骨髄の造血組織内でコラーゲンが増殖し、その繊維組織が造血機能に深刻な影響を及ぼすことで引き起こされる骨髄増殖性疾患である。
【0033】
皮膚線維化とは、外傷等を受けた場合に、線維芽細胞が分裂・増殖して損傷部位に遊走し、細胞外基質を産生して瘢痕組織を形成することによる外傷の修復である。瘢痕の形成とは、肉芽組織が次第に線維化する過程のことである。
【0034】
本発明は、更に、線維化の予防、緩和及び／又は治療における上記いずれかで記載した薬物及び組成製品の応用を提供する。
【0035】
本発明は、更に、炎症又は脂質過酸化の抑制、線維芽細胞の増殖及び活性化の抑制、コラーゲン分解の促進における上記いずれかで記載した薬物又は組成製品の応用を提供する。
【発明の効果】
【0036】
上記の技術方案を用いることで、本発明は、従来技術と比較して以下の利点を有する。
【0037】
本発明で提供する薬物及び組成製品は、線維化の治療において良好な治療効果を奏するため、重要な社会的利益と経済効果を有する。
【0038】
以下に、図面を組み合わせて、本発明の具体的実施形態につき更に詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図3】図３は、ＴＧＦβ１で誘導したＬＸ－２細胞内の線維化主要マーカーであるｍＲＮＡレベルに対するＨＢ（カリマイシン）及びＨＹ（イソバレリルスピラマイシンＩ）の影響をリアルタイムＰＣＲで測定したものである。
【図4】図４は、ＴＧＦβ１で誘導したＬＸ－２細胞内の線維化主要マーカーであるタンパク質レベルに対するＨＢ（カリマイシン）及びＨＹ（イソバレリルスピラマイシンＩ）の影響をウエスタンブロットで測定したものである。
【図5】図５は、ラットの肝組織の病理構造に対するＨＢ（カリマイシン）の影響を示しており、図中のｓｈａｍは、偽手術群のラットの肝組織のＨ＆Ｅ染色切片の結果であり、ＢＤＬは、ＢＤＬモデル群のラットの肝組織のＨ＆Ｅ染色切片の結果であり、ＨＢは、カリマイシン投与群のラットの肝組織のＨ＆Ｅ染色切片の結果である。
【図6】図６は、ラットの線維化度合に対するＨＢ（カリマイシン）の影響を示しており、図中のｓｈａｍは、偽手術群のラットの肝組織のマッソン染色切片の結果であり、ＢＤＬは、ＢＤＬモデル群のラットの肝組織のマッソン染色切片の結果であり、ＨＢは、カリマイシン投与群のラットの肝組織のマッソン染色切片の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0040】
説明すべき点として、これらの図面及び文字記載は何らかの方式で本発明の構想の範囲を制限するとの意図ではなく、特定の実施例を参照して当業者に本発明の概念を説明するためのものである。
【0041】
本発明における実施例の目的、技術方案及び利点をより明確とすべく、以下では、本発明の実施例にかかる図面を組み合わせて、実施例の技術方案につき明瞭簡潔に述べる。なお、以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【0042】
実施例１：薬物Ｃ錠
規格：２００ｍｇ／３５０ｍｇ
素錠の処方：
薬物Ｃ ２００ｇ
マイクロクリスタリンセルロース １１０ｇ
カルボキシメチルスターチナトリウム ２２ｇ
ポビドンＫ３０（５％） １５ｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１０００錠製造
コーティング液の処方：
オパドライＩＩ ２１ｇ
蒸留水 適量
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１０５ｍＬ製造
規格：２００ｍｇ／３５０ｍｇ
素錠の処方：
薬物Ｃ ２００ｇ
マイクロクリスタリンセルロース １１０ｇ
カルボキシメチルスターチナトリウム ２２ｇ
ポビドンＫ３０（５％） １５ｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１０００錠製造
コーティング液の処方：
オパドライＩＩ ２１ｇ
蒸留水 適量
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１０５ｍＬ製造
【0043】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0044】
製造工程：
素錠の製造：主薬と補助剤をそれぞれ１００メッシュのふるいにかけ、処方量の薬物Ｃ、マイクロクリスタリンセルロース及び処方量の１／２のカルボキシメチルスターチナトリウムを均一に混合した。次に、５％ポビドンＫ３０水溶液を添加して軟質材料とし、１８メッシュのふるいにかけて造粒してから、湿潤粒子を６０℃の通風条件で２ｈ乾燥させた。そして、乾燥後に１８メッシュのふるいにかけて整粒し、再び処方量の１／２のカルボキシメチルスターチナトリウムとステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合したあと、直径１１ｍｍの窪みの浅いパンチ・ダイを用いて打錠することで、重量３５０ｍｇ、硬度６．５ｋｇの薬含有素錠を製造した。
素錠の製造：主薬と補助剤をそれぞれ１００メッシュのふるいにかけ、処方量の薬物Ｃ、マイクロクリスタリンセルロース及び処方量の１／２のカルボキシメチルスターチナトリウムを均一に混合した。次に、５％ポビドンＫ３０水溶液を添加して軟質材料とし、１８メッシュのふるいにかけて造粒してから、湿潤粒子を６０℃の通風条件で２ｈ乾燥させた。そして、乾燥後に１８メッシュのふるいにかけて整粒し、再び処方量の１／２のカルボキシメチルスターチナトリウムとステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合したあと、直径１１ｍｍの窪みの浅いパンチ・ダイを用いて打錠することで、重量３５０ｍｇ、硬度６．５ｋｇの薬含有素錠を製造した。
【0045】
コーティング液の調合：必要量のオパドライＩＩ（白色）を調合容器内に量り、必要量の水を添加した。水は何回かに分けて添加し、全量を添加し終わったあと、撹拌速度を低下させることで渦を消失させてから、引き続き３０ｍｉｎ攪拌することでコーティング液を取得した。
【0046】
フィルムコーティング錠の製造：素錠をコーティングパン内に配置し、主機の速度を２０ｒ／ｍｉｎ、給気温度を４０℃、排気温度を３０℃、スプレー圧力を０．０２ＭｐＣ、スプレー流量を１ｍｌ／ｍｉｎとしてコーティングを行うようコーティング条件を決定した。そして、安定化後に、錠剤の表面が滑らか且つ色合いが均一となり、フィルムコーティングの検査基準を満たすまで、１．５ｈのスプレーコーティングを継続した。コーティングによる重量増加は５％程度であった。
【0047】
実施例２：薬物Ｃの素錠（１００００錠あたりで計算）
処方：
薬物Ｃ原粉末 １０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％） ９２．５ｇ
デンプングリコール酸ナトリウム（３％） ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％） １８．５ｇ
デンプン 総重量－その他の原料・補助剤の重量 ８５０ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００錠製造
処方：
薬物Ｃ原粉末 １０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％） ９２．５ｇ
デンプングリコール酸ナトリウム（３％） ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％） １８．５ｇ
デンプン 総重量－その他の原料・補助剤の重量 ８５０ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００錠製造
【0048】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0049】
製造工程：適量のデンプンを量り、濃度１５％に希釈してから、ペースト状となるまで加熱して結合剤を製造した。次に、主薬である薬物Ｃ、補助剤であるデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムをそれぞれ１００メッシュのふるいにかけ、処方量に基づき必要量の主薬及び補助剤を計量した。そして、薬物Ｃ、デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを十分均一に混合したあと、デンプン濃度１５％のデンプン糊を用いて軟質材料を作製した。これを１４メッシュのふるいにかけて造粒し、５０～６０℃で乾燥させ、水分を３～５％に制御した。また、これを１４メッシュのふるいにかけて整粒し、デンプングリコール酸ナトリウムとステアリン酸マグネシウムを添加して混合したあと、粒子の含有量を測定した。そして、粒子の含有量から錠剤の重量を求め、打錠（Φ９ｍｍの窪みの浅いパンチ・ダイ）したあと、錠剤重量の差異を検出し、検査に合格したあと包装した。
【0050】
実施例３：薬物Ｃのカプセル剤（１００００錠あたりで計算）
処方：
薬物Ｃ １０００ｇ
デンプン １０８０－薬物Ｃの重量
薬用３号カプセル １０００粒
流動パラフィン ５０ ｍｌ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００錠製造
処方：
薬物Ｃ １０００ｇ
デンプン １０８０－薬物Ｃの重量
薬用３号カプセル １０００粒
流動パラフィン ５０ ｍｌ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００錠製造
【0051】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0052】
製造工程：主薬である薬物Ｃと補助剤であるデンプンを工程配合量に基づきそれぞれ計量したあと、混合器に投入して１．５～２時間かけて十分に混合した。このとき、サンプリングによる含有量測定で取得したデータは理論上のデータとほぼ一致している必要があった（カプセルあたりの充填重量が約０．１０５ｇ）。次に、検査に合格した薬用３号カプセルと混合済みの充填対象原料を全自動カプセル充填機の操作要求に基づいてそれぞれ充填機に投入し、充填を行った。充填済みのカプセルの差異を検査した結果（±１０％以内，＜０．３ｇ）、溶出度は要求を満たしていた。そして、検査後に要求を満たしていたカプセルを艶出機に投入して流動パラフィンを添加し、１５～２０分間の艶出しを行った。その後、これを取り出して完成品パッケージの検査を行った。
【0053】
実施例４：薬物Ｃのドライシロップ（１００００包あたりで計算）
処方：
薬物Ｃ原粉末 １２５０ｇ
クエン酸（０．５％） １５ｇ
ショ糖 総重量－その他の原料・補助剤
総重量 約５００ｇ
色素（クルクミン） 約１ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００包製造
処方：
薬物Ｃ原粉末 １２５０ｇ
クエン酸（０．５％） １５ｇ
ショ糖 総重量－その他の原料・補助剤
総重量 約５００ｇ
色素（クルクミン） 約１ｇ
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００包製造
【0054】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0055】
製造工程：高速気流粉砕機を用い、薬物Ｃの原粉末、クエン酸、ショ糖をそれぞれ粒子の８５％が３００メッシュを通過し、１５％が１８０メッシュを通過するまで粉砕した。次に、粉砕した細い粉末を処方量に従って計量し、１～１．５時間かけて十分に混合してから、含有量を計測して充填量を求めた（理論上の充填量は１包あたり５００ｍｇ）。そして、混合物を分包機に投入し、アルミ箔を設置したあと、分包機の操作要求に基づいて分包した。充填量の差は±５％以内とし、充填後に検査に合格したものを包装した。
【0056】
実施例５：薬物Ｃの顆粒剤（１００００包あたりで計算）
処方：
薬物Ｃ原粉末 １２５０ｇ
粉糖 ２００００ｇ
デキストリン ９０００ｇ
５％ＰＶＰ－Ｋ３０ 適量
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００包製造
処方：
薬物Ｃ原粉末 １２５０ｇ
粉糖 ２００００ｇ
デキストリン ９０００ｇ
５％ＰＶＰ－Ｋ３０ 適量
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
１００００包製造
【0057】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0058】
製造工程：薬物Ｃ、粉糖、デキストリンを１２０メッシュのふるいにかけたあと、処方量に基づいて、薬物Ｃ、粉糖、デキストリンを計量し、均一に混合した。次に、均一に混合した上記の材料を５％ＰＶＰ－Ｋ３０糊を用いて軟質材料とし、揺動により顆粒剤を造粒したあと、７０℃で乾燥させて整粒した。そして、検査に合格後に分包した。
【0059】
実施例６：薬物Ｃの凍結乾燥粉末注射剤
製造工程：薬物Ｃを５００ｍｇと、等モルのアジピン酸を計量し、均一に混合したあと５ｍｌの水中に溶解することで淡黄色の透明溶液を取得した。ｐＨは４．６～５．６の間であった。次に、マンニトール４０ｍｇを凍結乾燥サポート剤として添加し、低温で９ｈ急速冷凍することで凍結乾燥させ、淡黄色の膨軟状物を取得した。そして、使用前にこれを１０ｍｌの滅菌水で溶解した。
製造工程：薬物Ｃを５００ｍｇと、等モルのアジピン酸を計量し、均一に混合したあと５ｍｌの水中に溶解することで淡黄色の透明溶液を取得した。ｐＨは４．６～５．６の間であった。次に、マンニトール４０ｍｇを凍結乾燥サポート剤として添加し、低温で９ｈ急速冷凍することで凍結乾燥させ、淡黄色の膨軟状物を取得した。そして、使用前にこれを１０ｍｌの滅菌水で溶解した。
【0060】
薬物Ｃは、カリマイシン、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ、又はイソバレリルスピラマイシンＩのうちの1種類又は複数種類か、それに対応する誘導体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、代謝産物、立体異性体、互変異性体、結晶多形、薬物前駆体のうちの１種類又は複数種類とした。
【0061】
実験例１：抗肝線維化における薬物Ｃの作用
本発明では、ヒト肝星細胞系ＬＸ－２を生体外研究の対象とし、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロットを研究方法として、ＴＧＦβ１で誘導したＬＸ－２細胞内の線維化主要マーカーであるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに対する薬物Ｃの阻害作用を実証した。また、薬物Ｃの抗線維化作用を更に特定するために、本発明では、総胆管結紮ラット線維化モデルを利用して、薬物Ｃの経口投与後におけるラットの肝組織の病理学的変化を測定した。その結果、薬物Ｃは、胆管結紮によりもたらされたラットの肝臓の病理学的変化及び線維化度合を効果的に緩和可能なことが示された。
本発明では、ヒト肝星細胞系ＬＸ－２を生体外研究の対象とし、リアルタイムＰＣＲ、ウエスタンブロットを研究方法として、ＴＧＦβ１で誘導したＬＸ－２細胞内の線維化主要マーカーであるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに対する薬物Ｃの阻害作用を実証した。また、薬物Ｃの抗線維化作用を更に特定するために、本発明では、総胆管結紮ラット線維化モデルを利用して、薬物Ｃの経口投与後におけるラットの肝組織の病理学的変化を測定した。その結果、薬物Ｃは、胆管結紮によりもたらされたラットの肝臓の病理学的変化及び線維化度合を効果的に緩和可能なことが示された。
【0062】
１．薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるＣＯＬ１Ａ１プロモーター－ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性抑制
作製したＩ型コラーゲンα１のプロモーターＣＯＬ１Ａ１Ｐを安定的に発現するモノクローナル細胞ＬＸ２－ＣＯＬを、１ウェルあたり２×１０４細胞で９６ウェルホワイトプレートにプレーティングした。そして、細胞のコンフルエンシーが約９０％になったあと、異なる濃度の薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）を添加した。なお、実験群ごとに４つの複数ウェルを設けた。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の説明書の操作手順に従って、２４ｈ後に培地を除去し、任意の培地を５０μｌ／ウェル添加した。次に、ルシフェラーゼ基質を５０μｌ／ウェル添加し、２ｍｉｎ後に測定を行った。その結果、薬物Ｃの濃度が上昇するほど蛍光強度が低下することが示された。また、双方ともに、濃度が４０μＭの場合に蛍光強度の低下が最も明らかとなった（図１）。図１は、Ｉ型コラーゲンα１のプロモーター活性に対するカリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ）の阻害作用を示す。この結果から明らかなように、カリマイシン及びその単一成分であるイソバレリルスピラマイシンＩは、ＣＯＬ１Ａ１のプロモーター活性に対し明らかな阻害作用を有していた。
作製したＩ型コラーゲンα１のプロモーターＣＯＬ１Ａ１Ｐを安定的に発現するモノクローナル細胞ＬＸ２－ＣＯＬを、１ウェルあたり２×１０４細胞で９６ウェルホワイトプレートにプレーティングした。そして、細胞のコンフルエンシーが約９０％になったあと、異なる濃度の薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）を添加した。なお、実験群ごとに４つの複数ウェルを設けた。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）の説明書の操作手順に従って、２４ｈ後に培地を除去し、任意の培地を５０μｌ／ウェル添加した。次に、ルシフェラーゼ基質を５０μｌ／ウェル添加し、２ｍｉｎ後に測定を行った。その結果、薬物Ｃの濃度が上昇するほど蛍光強度が低下することが示された。また、双方ともに、濃度が４０μＭの場合に蛍光強度の低下が最も明らかとなった（図１）。図１は、Ｉ型コラーゲンα１のプロモーター活性に対するカリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ）の阻害作用を示す。この結果から明らかなように、カリマイシン及びその単一成分であるイソバレリルスピラマイシンＩは、ＣＯＬ１Ａ１のプロモーター活性に対し明らかな阻害作用を有していた。
【0063】
２．薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるヒト肝細胞ＨｅｐＧ２及びヒト肝星細胞ＬＸ－２の増殖抑制
ヒト肝臓癌ＨｅｐＧ２細胞及びヒト肝星細胞ＬＸ－２を１ウェルあたり４×１０３細胞で９６ウェルホワイトプレートにプレーティングし、２４時間後に異なる濃度の薬物Ｃ（カリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ）を採用）を添加した。なお、実験群ごとに３つの複数ウェルを設けた。薬物処理から２４時間後又は４８時間後にスルホローダミン（ＳＲＢ）法で染色し、酵素結合免疫測定装置（ｅｎｚｙｍｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で５１５ｎｍの吸光値を測定して、半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。その結果、カリマイシン及びその単一成分であるイソバレリルスピラマイシンＩが、ＨｅｐＧ２及びＬＸ－２細胞に対して一定の増殖抑制作用を有することが示された。これらのＩＣ５０は、いずれも１０～１００μＭの間であった（図２）。
ヒト肝臓癌ＨｅｐＧ２細胞及びヒト肝星細胞ＬＸ－２を１ウェルあたり４×１０３細胞で９６ウェルホワイトプレートにプレーティングし、２４時間後に異なる濃度の薬物Ｃ（カリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ）を採用）を添加した。なお、実験群ごとに３つの複数ウェルを設けた。薬物処理から２４時間後又は４８時間後にスルホローダミン（ＳＲＢ）法で染色し、酵素結合免疫測定装置（ｅｎｚｙｍｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で５１５ｎｍの吸光値を測定して、半数阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。その結果、カリマイシン及びその単一成分であるイソバレリルスピラマイシンＩが、ＨｅｐＧ２及びＬＸ－２細胞に対して一定の増殖抑制作用を有することが示された。これらのＩＣ５０は、いずれも１０～１００μＭの間であった（図２）。
【0064】
３．薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるＴＧＦβ１誘導ＬＸ－２細胞内の線維化主要マーカーの発現抑制
ＴＧＦβ１によるＬＸ－２細胞の誘導と、薬物Ｃ（カリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ））の投与処理：１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を含むＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ１０５６６０１６）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＬＸ－２を培養した。次に、１ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４ｈ培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つ薬物Ｃを投与して処理）を設けた。
ＴＧＦβ１によるＬＸ－２細胞の誘導と、薬物Ｃ（カリマイシン（ＨＢ）及びイソバレリルスピラマイシンＩ（ＨＹ））の投与処理：１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を含むＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ１０５６６０１６）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＬＸ－２を培養した。次に、１ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４ｈ培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（２ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つ薬物Ｃを投与して処理）を設けた。
【0065】
２４ｈ培養を継続したあと、培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌの説明書の操作手順に従ってＬＸ－２細胞の総ＲＮＡを抽出した。そして、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ）の説明書の操作手順に従って、ＬＸ－２の総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、取得したｃＤＮＡ、滅菌水、ファストスタートユニバーサルプローブマスター（ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ）（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ）及びＴａｑＭａｎプローブ（ＡＢＩ）（ＧＡＰＤＨ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２）を配合して２０μｌの反応系とし、７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＢＩ）を使用して測定した。ＧＡＰＤＨを内部参照として結果を分析したところ、データより、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩの投与量が増加するほど、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２の発現量は低下することが示された。且つ、２０μｍｏｌ／Ｌの場合に、ｍＲＮＡレベルにおいて、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２の発現抑制効果が最良となった（図３）。
【0066】
ＴＧＦβ１による誘導後、２４ｈ培養を継続してから、６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１ｍｌのＲｉｐａ溶解液（１％ ＰＭＳＦを含む）を添加してタンパク質を抽出し、ＢＣＡ法でタンパク質濃度を測定した。１ウェルあたり２５μｇ／２０μｌでサンプル投入し、電気泳動、転写、５％スキムミルクによるブロッキング、抗体インキュベーションを行ったあと、５２００イメージングシステム（天能（Ｔａｎｏｎ））を使用して所望のタンパク質バンドを取得した。その結果、カリマイシン濃度が上昇するほど、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦβ１、α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎの発現量は低下し、２０μｍｏｌ／Ｌの場合に上記マーカータンパク質の発現を顕著に抑制可能なことが示された（図４）。
【0067】
４．ＳＤラットの総胆管結紮線維化誘導モデルの作製
体重１８０～２２０ｇのＳＤ雄ラットを１２匹選別し、偽手術群、モデル群、薬物Ｃ投与群にランダムに分けた。各群は４匹ずつとした。動物実験に先立ち、１２ｈの絶食・非絶水を実施してから、イソフルランで動物を麻酔して手術を行った。モデル群と投与群については総胆管結紮（ＢＤＬ）術を実施した。当該手術では、無菌操作台で上腹部の中央を切開し、肝臓の縁を持ち上げて十二指腸を押し退け、総胆管を２～３ｃｍ分離した。そして、十二指腸付近と肝門付近において、０００番の手術用縫合糸をそれぞれ用いて２箇所を結紮し、中央から総胆管を切断した。偽手術群については、上腹部中央の切開と縫合のみを行い、総胆管結紮は実施しなかった。麻酔覚醒後、動物は正常に摂食・摂水した。また、自由に摂水させた。術後２日目から、胃内投与を開始した。１日１回、１４日間連続で、生理食塩水（偽手術群、ＢＤＬモデル群）と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを２００ｍｇ／ｋｇ（薬物Ｃ投与群）それぞれ投与した。
体重１８０～２２０ｇのＳＤ雄ラットを１２匹選別し、偽手術群、モデル群、薬物Ｃ投与群にランダムに分けた。各群は４匹ずつとした。動物実験に先立ち、１２ｈの絶食・非絶水を実施してから、イソフルランで動物を麻酔して手術を行った。モデル群と投与群については総胆管結紮（ＢＤＬ）術を実施した。当該手術では、無菌操作台で上腹部の中央を切開し、肝臓の縁を持ち上げて十二指腸を押し退け、総胆管を２～３ｃｍ分離した。そして、十二指腸付近と肝門付近において、０００番の手術用縫合糸をそれぞれ用いて２箇所を結紮し、中央から総胆管を切断した。偽手術群については、上腹部中央の切開と縫合のみを行い、総胆管結紮は実施しなかった。麻酔覚醒後、動物は正常に摂食・摂水した。また、自由に摂水させた。術後２日目から、胃内投与を開始した。１日１回、１４日間連続で、生理食塩水（偽手術群、ＢＤＬモデル群）と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを２００ｍｇ／ｋｇ（薬物Ｃ投与群）それぞれ投与した。
【0068】
５．ＢＤＬ誘導ラットにおける肝臓の病理学的構造変化に対する薬物Ｃ（カリマイシンを採用）の改善作用
サンプリング前に１２ｈの絶食・非絶水を実施してからラットを殺処理し、肝組織を採取した。そして、肝臓の大葉組織片を切り取り、１０％ホルマリン内で固定した。続いて、脱水、パラフィン包埋、切断、切片の乾燥等を経てパラフィン切片を作製した。これをヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色液で染色し、顕微鏡でラットの肝組織における病理学的構造変化の状況を観察した。その結果、偽手術群のラットの肝組織は肝細胞が整然と並んでおり、肝小葉構造が完全であって、胆管の増殖は見られなかった。これに対し、ＢＤＬ術後のラットの肝組織は、病理学的構造に明らかな変化が生じており、胆管の増殖が非常に明らかであった。且つ、組織の壊死が明らかに増加していた。一方、カリマイシン投与群のラットの肝組織は、構造の病理学的変化が緩和されており、胆管の増殖状況が抑制されていた。また、組織の壊死の度合が著しく低下していた（図５）。上記より、カリマイシンがＢＤＬラットの肝組織の病理学的変化を明らかに改善可能なことが示された。
サンプリング前に１２ｈの絶食・非絶水を実施してからラットを殺処理し、肝組織を採取した。そして、肝臓の大葉組織片を切り取り、１０％ホルマリン内で固定した。続いて、脱水、パラフィン包埋、切断、切片の乾燥等を経てパラフィン切片を作製した。これをヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色液で染色し、顕微鏡でラットの肝組織における病理学的構造変化の状況を観察した。その結果、偽手術群のラットの肝組織は肝細胞が整然と並んでおり、肝小葉構造が完全であって、胆管の増殖は見られなかった。これに対し、ＢＤＬ術後のラットの肝組織は、病理学的構造に明らかな変化が生じており、胆管の増殖が非常に明らかであった。且つ、組織の壊死が明らかに増加していた。一方、カリマイシン投与群のラットの肝組織は、構造の病理学的変化が緩和されており、胆管の増殖状況が抑制されていた。また、組織の壊死の度合が著しく低下していた（図５）。上記より、カリマイシンがＢＤＬラットの肝組織の病理学的変化を明らかに改善可能なことが示された。
【0069】
６．ＢＤＬ誘導ラットの線維化に対する薬物Ｃ（カリマイシンを採用）の阻害作用
パラフィン切片をマッソン染色液で染色し、ラットの肝臓の線維化について変化の状況を観察した。その結果、ＢＤＬ術後のラットは肝臓の線維化度合が明らかに増加しており、コラーゲン蓄積が深刻であった。これに対し、カリマイシン投与後は、線維化及びコラーゲン蓄積状況が明らかに抑制されていた（図６）。上記より、カリマイシンがＢＤＬ誘導ラットの線維化を明らかに抑制可能なことが示された。
パラフィン切片をマッソン染色液で染色し、ラットの肝臓の線維化について変化の状況を観察した。その結果、ＢＤＬ術後のラットは肝臓の線維化度合が明らかに増加しており、コラーゲン蓄積が深刻であった。これに対し、カリマイシン投与後は、線維化及びコラーゲン蓄積状況が明らかに抑制されていた（図６）。上記より、カリマイシンがＢＤＬ誘導ラットの線維化を明らかに抑制可能なことが示された。
【0070】
実験例２：肺線維化抑制における薬物Ｃの作用
一、薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるＴＧＦβ１誘導肺線維芽細胞ＭＲＣ－５内の線維化主要マーカーの発現抑制
ＴＧＦβ１による肺線維芽細胞ＭＲＣ－５の誘導と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩの投与処理：１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液、１％非必須アミノ酸を含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１０９５－０８０）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＭＲＣ－５を培養した。次に、１ウェルあたり３×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４ｈ培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（３ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩを投与して処理）を設けた。
一、薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおけるＴＧＦβ１誘導肺線維芽細胞ＭＲＣ－５内の線維化主要マーカーの発現抑制
ＴＧＦβ１による肺線維芽細胞ＭＲＣ－５の誘導と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩの投与処理：１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液、１％非必須アミノ酸を含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ １１０９５－０８０）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＭＲＣ－５を培養した。次に、１ウェルあたり３×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４ｈ培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（３ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩを投与して処理）を設けた。
【0071】
２４時間培養を継続したあと、培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌの説明書の操作手順に従ってＭＲＣ－５細胞の総ＲＮＡを抽出した。そして、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）の説明書の操作手順に従って、ＬＸ－２の総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、取得したｃＤＮＡ、滅菌水、ファストスタートユニバーサルプローブマスター（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ）及びＴａｑＭａｎプローブ（ＡＢＩ）（ＧＡＰＤＨ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２、ＭＭＰ２）を配合して２０μｌの反応系とし、７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用して測定した。ＧＡＰＤＨを内部参照として結果を分析したところ、データより、カリマイシンの投与量が増加するほど、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２、ＭＭＰ２の発現量は低下することが示された。且つ、４０μｍｏｌ／Ｌの場合に、ｍＲＮＡレベルにおいて、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２の発現抑制効果が最良となった。また、イソバレリルスピラマイシンＩの投与量が増加するほどＣＯＬ１Ａ１の発現量は低下し、４０μｍｏｌ／Ｌの場合に、ｍＲＮＡレベルにおいてＣＯＬ１Ａ１の発現抑制効果が最良となった（図７）。
【0072】
二、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染によりもたらされる肺炎（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９，ＣＯＶＩＤ－１９）に伴う肺部線維化に対するカリマイシンの改善作用
被験者の年齢は１８～７５歳であり、新型コロナウイルス感染による肺炎診断基準（第５版）を満たしていた。患者は、（１）再発熱又は臨床症状の重症化、（２）咽頭ぬぐい核酸検出で陰性から陽性に変化、（３）臨床症状に改善が見られない、又は核酸検出陽性の持続、（５）胸部ＣＴにより肺炎症状又は線維化の進行が認められる、のいずれかを満たしていた。また、ＳＯＦＡスコアは１点～１３点であった。
被験者の年齢は１８～７５歳であり、新型コロナウイルス感染による肺炎診断基準（第５版）を満たしていた。患者は、（１）再発熱又は臨床症状の重症化、（２）咽頭ぬぐい核酸検出で陰性から陽性に変化、（３）臨床症状に改善が見られない、又は核酸検出陽性の持続、（５）胸部ＣＴにより肺炎症状又は線維化の進行が認められる、のいずれかを満たしていた。また、ＳＯＦＡスコアは１点～１３点であった。
【0073】
１．治療方法
軽症：カリマイシン錠を毎回０．４ｇ、１日１回、食後に服用させた。連続７日間投与を行い、治療終了後に３０日間の経過観察期間に入った。
軽症：カリマイシン錠を毎回０．４ｇ、１日１回、食後に服用させた。連続７日間投与を行い、治療終了後に３０日間の経過観察期間に入った。
【0074】
中等症：カリマイシン錠を毎回０．４ｇ、１日１回、食後に服用させた。１０日間投与を行い、治療終了後に３０日間の経過観察期間に入った。
【0075】
重症、重篤：カリマイシン錠を毎回０．４ｇ、１日１回、食後に服用させた。連続１４日間投与を行った。なお、服用が不可能な者については経鼻チューブから投与を行った。治療終了後は、３０日間の経過観察期に入った。
【0076】
２．主な治療効果の指標
（１）解熱期間（日）。
（２）肺部症状消失期間（ＨＲＣＴ）（日）。
（３）治療終了から３日後、７日後の咽頭ぬぐいによる新型コロナウイルス陰性化率（％）。
（１）解熱期間（日）。
（２）肺部症状消失期間（ＨＲＣＴ）（日）。
（３）治療終了から３日後、７日後の咽頭ぬぐいによる新型コロナウイルス陰性化率（％）。
【0077】
３．症例の全体状況
ウイルスの「再陽性化」又は治療経験患者４７例のうち、軽症は１１例、中等症は２７例、重症は３例、重篤は６例であった。また、前期治療後に、ウイルス核酸が依然として陽性だった患者は４０例、核酸陰性となった患者は７例であった。
ウイルスの「再陽性化」又は治療経験患者４７例のうち、軽症は１１例、中等症は２７例、重症は３例、重篤は６例であった。また、前期治療後に、ウイルス核酸が依然として陽性だった患者は４０例、核酸陰性となった患者は７例であった。
【0078】
４．主な治療効果の評価
（１）４０例のウイルス核酸陽性患者のうち、１６例の患者については３日間で核酸陰性に転じた。また、１３例の患者については７日間で陰性化し、１例の患者については１５日間で陰性化した。残り１０例の患者は群分け直後であり、核酸再検査は行われなかった。
（１）４０例のウイルス核酸陽性患者のうち、１６例の患者については３日間で核酸陰性に転じた。また、１３例の患者については７日間で陰性化し、１例の患者については１５日間で陰性化した。残り１０例の患者は群分け直後であり、核酸再検査は行われなかった。
【0079】
（２）群分け時に肺部に炎症のあった患者１９例（核酸陰性７例、核酸陽性１２例）について、７日間における肺部炎症の顕著な改善率は７３．７％であった（１４／１９）。
【0080】
（３）群分け時に発熱のあった患者５例（核酸陰性３例、核酸陽性２例）について、３日間での体温回復率は６０％（３／５）、７日間での体温回復率は１００％（５／５）であった。
【0081】
５．主な症例における肺部症状の改善状況
肺線維化のＣＴ所見には、以下が存在した。
肺線維化のＣＴ所見には、以下が存在した。
【0082】
１．病変の分布が周縁的であり、胸膜下に見られた。
【0083】
２．肺線維化のＣＴ所見は時期によって明らかに異なっていた。初期のＨＲＣＴ所見では、下肺におけるまだらな磨りガラス状の陰影が可逆性病変である活動性病変を示していた。また、この時期の間質性病変の変化は不明瞭であった。
【0084】
３．肺線維化に至るまで進行した場合、ＣＴではグリッド状の陰影として現れた。また、ＨＲＣＴでは、小葉の間隔が不規則且つ分厚く示され、壁が分厚くなったことで、小葉内の細小血管が目立つようになった。末期になると、ＣＴでは広範な蜂の巣状の陰影が示され、小葉構造が変形した。また、肺線維化によって気管支が拡張し得ることから、広範な蜂の巣状の陰影は中下肺の胸膜下において最も鮮明となった。
【0085】
４．磨りガラス状の陰影：肺線維化の重要な徴候の１つとして、このような陰影が存在する場合には、病変が活動期にあって、積極的な治療が必要なことを意味していた。病変は、間質性又は実質性病変であり得た。
【0086】
５．蜂の巣状の陰影：比較的小さな袋状の陰影であり、大多数が数ｍｍから１０ｍｍ、わずかに数ｃｍに達するものがあった。分厚い辺縁と鮮明な繊維壁を有しており、多くが肺の周縁及び胸膜下に見られた。蜂の巣状の陰影が鮮明な部位では正常な構造がねじれており、小葉構造を判別不可能であった。通常は、蜂の巣状の陰影とつながる胸膜がわずかに分厚くなっており、末期の間質線維化を示していた。
【0087】
新型コロナウイルス感染による肺炎患者にカリマイシン治療を施したところ、肺部の症状及び線維化の状況が改善された。具体的には、以下の通りとなった。
【0088】
図８は、症例１のカリマイシン治療前後における肺部のＣＴ画像である。図から明らかなように、カリマイシン治療から５日後、１０日後に肺部の症状は明らかに改善された。
【0089】
図９は、症例２の肺部ＣＴ画像の変化状況を示している。図中の（Ａ）は罹患１日目のＣＴスキャン画像、（Ｂ）は罹患５日目のＣＴスキャン画像、（Ｃ）は罹患６日目のＣＴスキャン画像（カリマイシン治療開始日）、（Ｄ）は罹患８日目のＣＴスキャン画像、（Ｅ）は罹患１１日目のＣＴスキャン画像である。カリマイシン服用治療を継続した結果、肺部の状況は改善された。
【0090】
図１０は、症例３のＣＴ画像の変化状況を示している。具体的に、患者は７２歳の女性であった。入院後は鼻腔カニューレから酸素吸入を行いながら、カリマイシンを０．４ｇ、１日１回服用させた。入院後から２日目に患者の一般状態は好転し、咳及び呼吸困難が明らかに好転した。また、酸素飽和度は９８％まで上昇した。血液ガス分析による酸素分圧は１３０ｍｍＨｇまで上昇し、カリマイシン治療から３日目、６日目における２回の咽頭ぬぐい核酸検出ではいずれも陰性となった。ＣＴ画像（図１０）は、経過６日目（カリマイシン服用の１日前）を示している。このときには、両側の肺紋理が増強しており、右肺下野に不規則な磨りガラス様の病巣が認められた。また、左側にまだら状の陰影が散在していた（矢印Ａで示す）。経過９日目（カリマイシン服用から３日後）には、両側の肺紋理が鮮明となり、右肺下野の不規則な磨りガラス様病巣が明らかに吸収された（矢印Ｂで示す）。経過１２日目（カリマイシン服用から５日後）には、右肺の病巣が明らかに吸収され（矢印Ｃで示す）、少量の線維化が形成されていた。カリマイシン服用治療を継続した結果、線維化状況は改善された。
【0091】
実験例３：皮膚線維化抑制における薬物Ｃの作用
１．薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるｍＲＮＡレベルにおけるＴＧＦβ１誘導皮膚線維芽細胞ＣＣＣ－ＥＳＦ－１内の線維化主要マーカーの発現抑制
ＴＧＦβ１による皮膚線維芽細胞ＣＣＣ－ＥＳＦ－１の誘導と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩの投与処理：１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を含むＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ１０５６６０１６）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＣＣＣ－ＥＳＦ－１細胞を培養した。次に、１ウェルあたり５×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４時間培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩを投与して処理）を設けた。
１．薬物Ｃ（カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを採用）によるｍＲＮＡレベルにおけるＴＧＦβ１誘導皮膚線維芽細胞ＣＣＣ－ＥＳＦ－１内の線維化主要マーカーの発現抑制
ＴＧＦβ１による皮膚線維芽細胞ＣＣＣ－ＥＳＦ－１の誘導と、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩの投与処理：１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液を含むＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ１０５６６０１６）培地において、３７℃、５％ ＣＯ２条件でＣＣＣ－ＥＳＦ－１細胞を培養した。次に、１ウェルあたり５×１０５細胞で６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、２４時間培養したあと、真空ポンプで６ウェルマイクロプレート内の元の培地を除去した。そして、１０％ウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭ培地を添加して、２４ｈ飢餓培養したあと、ＴＧＦ－β１（５ｎｇ／ｍｌ）を添加して誘導するとともに、異なる濃度勾配のカリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩを添加した。濃度はそれぞれ２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌとした。また、対照群（ＴＧＦ－β１を添加せずに誘導）、ＴＧＦ－β１誘導群（ＴＧＦ－β１のみを添加して誘導）及びＴＧＦ－β１誘導投与群（ＴＧＦ－β１を添加して誘導、且つカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩを投与して処理）を設けた。
【0092】
２４時間培養を継続したあと、培地を除去し、ＴＲＩｚｏｌの説明書の操作手順に従ってＬＸ－２細胞の総ＲＮＡを抽出した。そして、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）の説明書の操作手順に従って、ＬＸ－２の総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。続いて、取得したｃＤＮＡ、滅菌水、ファストスタートユニバーサルプローブマスター（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ）及びＴａｑＭａｎプローブ（ＡＢＩ）（ＧＡＰＤＨ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２、ＭＭＰ２）を配合して２０μｌの反応系とし、７５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ）を使用して測定した。ＧＡＰＤＨを内部参照として結果を分析したところ、データより、カリマイシン及びイソバレリルスピラマイシンＩのいずれであっても、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＧＦＢ１、ＡＣＴＡ２及びＭＭＰ２の発現量を顕著に抑制可能なことが示された（図１１）。なお、イソバレリルスピラマイシンＩは、４０μｍｏｌ／Ｌの濃度下で、ＣＣＣ－ＥＳＦ－１細胞に対する毒性が明らかであった。
【0093】
以上の記載は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を何らかの形式に制限するものではない。本発明については好ましい実施例によって上記のように開示したが、本発明を限定するとの主旨ではない。本発明の技術方案を逸脱しない範囲において、当業者が上記で提示した技術内容を用いて実施可能なわずかな変形或いは補足は、同等に変形された等価の実施例とみなされ、いずれも本発明の技術方案の内容を逸脱するものではない。また、本発明の技術的本質に基づいて上記の実施例に加えられる任意の簡単な修正、同等の変形及び補足は、いずれも本発明の方案の範囲内とされる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】