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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-16
(54)【発明の名称】糖原病（ＧＳＤ）の処置
(51)【国際特許分類】
A61K 38/47 20060101AFI20220909BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220909BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20220909BHJP
A61K 31/445 20060101ALI20220909BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220909BHJP
A61P 3/08 20060101ALI20220909BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220909BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220909BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20220909BHJP
C12N 15/83 20060101ALI20220909BHJP
C12N 9/26 20060101ALN20220909BHJP
【ＦＩ】
A61K38/47
A61K48/00
A61K31/137
A61K31/445
A61P25/00
A61P3/08
A61P43/00 121
A61K35/76
C12N15/56 ZNA
C12N15/83 Z
C12N9/26
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022501292
(86)(22)【出願日】2020-07-09
(85)【翻訳文提出日】2022-03-10
(86)【国際出願番号】 EP2020069432
(87)【国際公開番号】W WO2021005176
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】19305928.4
(32)【優先日】2019-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503197304
【氏名又は名称】ジェネトン
(71)【出願人】
【識別番号】500248467
【氏名又は名称】アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム）
(71)【出願人】
【識別番号】519365919
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・デヴリー－ヴァル－デソンヌ
【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’Ｅｖｒｙ－Ｖａｌ－ｄ’Ｅｓｓｏｎｎｅ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】ミンゴッツィ， フェデリコ
(72)【発明者】
【氏名】ロンジッティ， ジュゼッペ
(72)【発明者】
【氏名】コロー， ファニー
【テーマコード（参考）】
4B050
4C084
4C086
4C087
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B050LL01
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA01
4C084CA18
4C084DC22
4C084MA02
4C084MA66
4C084NA03
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC751
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC21
4C086GA16
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA03
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZB21
4C086ZC21
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA12
4C087MA02
4C087MA66
4C087NA03
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZB21
4C087ZC21
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA31
4C206KA01
4C206KA17
4C206MA02
4C206MA04
4C206MA86
4C206NA03
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZB21
4C206ZC21
4C206ZC75
(57)【要約】
【課題】糖原病（ＧＳＤ）の処置の提供。
【解決手段】本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、上記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、上記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツ。
【請求項2】
医薬としての使用のための、好ましくは糖原病（ＧＳＤ）の処置における使用のための、請求項１に記載のキット・オブ・パーツ。
【請求項3】
神経系の組織、好ましくは中枢神経系の組織、より好ましくは脊髄へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における使用のための、請求項１又は２に記載のキット・オブ・パーツ。
【請求項4】
ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における使用のための、請求項１に記載のキット・オブ・パーツ。
【請求項5】
（ｉ）ドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターとを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ又は使用のためのキット・オブ・パーツ。
【請求項6】
糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、組成物。
【請求項7】
ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、神経系の組織、好ましくは脊髄へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物。
【請求項8】
ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物。
【請求項9】
前記治療用ＧＡＡ処置が、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項６～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項10】
前記治療用ＧＡＡ処置が、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターであり、前記薬理学的シャペロンが、ドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩である、請求項６～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項11】
－ 前記ＤＮＪ誘導体が、Ｎ－メチル－ＤＮＪ、Ｎ－ブチル－ＤＮＪ、Ｎ－シクロプロピルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－（２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）エチルオキシ－ＤＮＪ、Ｎ－４－ｔ－ブチルオキシカルボニル－ピペリジニルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－Ｒ－テトラヒドロフラニルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－Ｒ－テトラヒドロフラニルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）エチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－メトキシエチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－エトキシエチル－ＤＮＪ、Ｎ－４－トリフルオロメチルベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－アルファ－シアノ－４－トリフルオロメチルベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－４－トリフルオロメトキシベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－４－ｎ－ペントキシベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－４－ｎ－ブトキシベンジル－ＤＮＪ若しくはＣｌ－ノニルＤＮＪから選択される、－ 前記ＤＮＪが、ドゥボグルスタット（ＣＡＳ番号１９１３０－９６－２）、ドゥボグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号７３２８５－５０－４）、ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）、若しくはミグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号２１０１１０－９０－０）である、及び／又は、
－ 前記ＡＢＸが、アンブロキソール塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）である、請求項１～４及び請求項６～９のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ、使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【請求項12】
前記ＧＳＤが、ＧＳＤＩ（フォン・ギールケ病）、ＧＳＤＩＩ（ポンペ病）、ＧＳＤＩＩＩ（コーリー病）、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶ、ＧＳＤＶＩ、ＧＳＤＶＩＩ、ＧＳＤＶＩＩＩ又は心臓の致死性の先天性糖原病から選択され、好ましくはＧＳＤＩ、ＧＳＤＩＩ又はＧＳＤＩＩＩ、より好ましくはＧＳＤＩＩ又はＧＳＤＩＩＩ、最も好ましくはＧＳＤＩＩである、請求項２～１１のいずれか一項に記載の使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【請求項13】
前記薬理学的シャペロンが、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の前、同時、及び／又は後に投与される、請求項１～５及び請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ、使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【請求項14】
前記核酸分子が、前記核酸分子を発現するための核酸構築物に挿入され、前記核酸構築物は、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又は、ＡＡＶベクター、例えば、一本鎖若しくは二本鎖自己相補的ＡＡＶベクターから選択されるウイルスベクターに挿入され、前記ウイルスベクターは、好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４カプシド、より特定的にはＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶベクターである、請求項１～５及び請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ、使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【請求項15】
前記核酸分子によってコードされる治療用ＧＡＡポリペプチドが、ＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含み、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７から選択され、好ましくは配列番号３であり、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６から選択され、好ましくは配列番号２７である、請求項１～５及び請求項９～１４のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ、使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【請求項16】
前記核酸分子が、配列番号８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７から選択され、好ましくは配列番号２５である、請求項１～５及び請求項９～１５のいずれか一項に記載のキット・オブ・パーツ、使用のためのキット・オブ・パーツ又は使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
糖原病（ＧＳＤ）は、典型的には筋肉及び／又は肝細胞内において、グリコーゲン合成、グリコーゲン分解又は解糖に影響を与える酵素の欠乏によって引起こされる代謝疾患である。ＧＳＤは、ＧＳＤ型０～ＧＳＤ型ＸＶまで、様々な型に分類される（表１）。
【0002】
【表1】
【0003】
ＧＳＤ ＩＩ又は酸性マルターゼ欠損症としても知られるポンペ病は、ライソゾーム酵素である酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）の欠損によって引起こされる常染色体劣性代謝性ミオパチーである。ＧＡＡは、ライソゾーム内でグリコーゲンをグルコースに加水分解するエキソ－１，４及び１，６－α－グルコシダーゼである。ＧＡＡの欠乏は、ライソゾーム内のグリコーゲン蓄積に至り、呼吸筋、心筋、及び骨格筋に進行性の損傷を引起こす。この疾病は、通常１～２歳までに致命的となる急速進行性の乳児型の経過から、小児及び成人に著しい罹患率及び早期死亡率を引起こす緩徐進行性の不均一な経過にまで及ぶ［１］及び［２］。
【0004】
中枢神経系（ＣＮＳ）障害、特に呼吸神経筋障害は、ＧＳＤ、特に早期及び後期発症型ポンペ病患者において顕著である。研究により、中枢神経系におけるグリコーゲンの蓄積は、ポンペ病を患っている患者に呼吸障害を引起こし、生後４～６か月で呼吸機能障害に至ることが分かっている［３］及び［４］。したがって、ポンペ病の呼吸障害の是正を改善する治療法、特にＧＳＤ患者の神経系の組織におけるグリコーゲンの病原性蓄積の是正を改善する治療法を開発することが重要である。
【0005】
ポンペ病を処置するための現在のヒト治療法は、いわゆる酵素補充療法（ＥＲＴ）と呼ばれる組換えヒトＧＡＡの投与を伴う。ＥＲＴは、重度の乳児型ＧＳＤ ＩＩに対する有効性を示している。しかしながら、ＥＲＴの利点は、頻繁な注入の必要性及び組換えｈＧＡＡに対する阻害抗体の発生によって限定される［５］。さらに、ＥＲＴは、おそらく末梢静脈送達後のタンパク質の不十分な生体内分布、いくつかの組織からの取込みの欠如、及び高い免疫原性の組合わせに起因して、全身を効率的に改善しない。特に、ＥＲＴはＣＮＳ障害の処置、特にＧＳＤ患者の神経系の組織におけるグリコーゲンの蓄積の是正を改善するのに効果が低いことが示されており、これは組換えＧＡＡが血液脳関門を通過しないためである［６］及び［７］。
【0006】
ポンペ病を処置するための遺伝子治療アプローチも研究されている。例えば、ＷＯ２０１８／０４６７７４は、ＧＡＡの組織取込みを改善するための、シグナルペプチドと融合された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の使用を開示している。しかしながら、グリコーゲン蓄積は中枢神経系において一部しかレスキューされていない。
【0007】
ポンペ病を処置するために開発された別のアプローチは、ＧＡＡの折りたたみを容易にし、ＧＡＡの安定性を高めるための薬理学的シャペロンの投与である。いくつかの薬理学的シャペロン、例えば、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体（ＷＯ２００６／１２５１４１）、特にＮＢ－ＤＮＪと称されるＤＮＪの誘導体（ＡＴ２２２１又はミグルスタット）が試験されている。ミグルスタットはまた、ＧＡＡ活性を促進し、筋肉機能を改善するために、組換えＧＡＡポリペプチドと組合せて試験されている［８］。しかしながら、ＤＮＪ又はその誘導体は、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させていない。
【0008】
ＡＢＸ又はＡＢＸとＤＮＪとの組合せもまた、ＧＡＡの変異型を発現するポンペ細胞モデルに対して試験されている［９］。しかしながら、ＡＢＸ又はＡＢＸ及びＤＮＪは、ＧＡＡの特に神経系の組織への組織取込みを増加させていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】ＷＯ２０１８／０４６７７４
【特許文献2】ＷＯ２００６／１２５１４１
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ．及びＲｅｕｓｅｒ，Ａ．Ｊ．２００１ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒ，Ｃ．Ｒ．、Ｂｅａｕｄｅｔ，Ａ．Ｌ．、Ｓｌｙ，Ｗ．Ｓ．＆Ｖａｌｌｅ，Ｄ．Ｅｄｓ．）、３３８９～３４１９ページ。ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３４０３～３４０５ページを参照。
【非特許文献2】Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇ及びＲｅｕｓｅｒ、２００８ Ｌａｎｃｅｔ ３７２：１３４２～１３５１
【非特許文献3】Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｕｔら、２００３、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ；１１２：３３２～３４０［ＰｕｂＭｅｄ：１２８９７２８３］
【非特許文献4】ＤｅＲｕｉｓｓｅａｕら、２００９；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０６：９４１９～９４２４。［ＰｕｂＭｅｄ：１９４７４２９５］
【非特許文献5】Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，Ａ．ら、２００１ Ｇｅｎｅｔ．Ｉｎ Ｍｅｄ．３：１３２～１３８
【非特許文献6】Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９９８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｃｉｄ ｍａｌｔａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｑｕａｉｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ；１０１：８２７～８３３［ＰｕｂＭｅｄ：９４６６９７８］
【非特許文献7】Ｒａｂｅｎら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；８０：１５９～１６９［ＰｕｂＭｅｄ：１４５６７９６５］
【非特許文献8】Ｘｕら、ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２０１９；４（５）：ｅ１２５３５８
【非特許文献9】Ｌｕｋａｓら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１５、第２３巻 第３号、４５６～４６４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
したがって、ポンペ病等のＧＳＤを処置するためのよりよい治療法を提供する必要性が未だある。特に、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させるため、ＧＳＤにおけるＣＮＳ障害を処置するため、ＧＳＤを有する対象における呼吸神経筋機能を改善するため、及び／又は、呼吸機能障害を減少させるためのよりよい治療法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
第１の態様において、本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。本発明に係るキット・オブ・パーツは、
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、及び／又は、
－ ＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法において、
使用されてもよい。
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、及び／又は、
－ ＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法において、
使用されてもよい。
【0013】
第２の態様において、本発明は、
－ 糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの治療における、
－ ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における、及び／又は、
－ ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象においてＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における、
使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、
前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物に関する。
－ 糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの治療における、
－ ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における、及び／又は、
－ ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象においてＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における、
使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、
前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＷＴマウスに関する研究の実験計画を示す図である。６～８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスに、ＰＢＳ又は分泌型ＧＡＡを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ－ＧＡＡ）を５×１０１１ｖｇ／ｋｇで静脈内注射した。ベクター注射から２か月後、マウスを未処置のままにした、又は飲料水に溶解した７つのシャペロン分子若しくはそれらの組合せで４週間処置した。処置の各週は、処置中の３日間と休薬中の４日間（ウォッシュアウト）とからなる。遺伝子治療処置から３か月後、マウスから血を抜き屠殺して組織を採取した。
【図2】シャペロン処置により、野生型マウスにおいて循環ＧＡＡレベルの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から３か月後、図１に示すように処置したマウスにおける血中ＧＡＡのレベルをウエスタンブロットにより測定した。データは、ヒトＧＡＡバンド強度と標準化に使用される非特異的バンド強度との比率として表された。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対３か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＤＮＪ－ＡＢＸ処置群（ｎ＝３）、ボグリボース及びアカルボース処置群（ｎ＝４）以外、群当たりｎ＝５、ＣＴＲＬは、ＰＢＳを注射し、ＡＡＶ－ＧＡＡを与えていないマウスを表す）。
【図3-1】シャペロン処置により、野生型マウスの組織へのＧＡＡの取込みの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から３か月後、図１に示すように処置したマウスの心臓（図３Ａ）及び三頭筋（図３Ｂ）においてライソゾームＧＡＡのレベルをウエスタンブロットにより測定した。データは、ヒトＧＡＡバンド強度と標準化に使用されるＧＡＰＤＨ強度との比率として表された。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対３か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＤＮＪ－ＡＢＸ処置群（ｎ＝３）、ボグリボース及びアカルボース処置群（ｎ＝４）以外、群当たりｎ＝５）。
【図3-2】シャペロン処置により、野生型マウスの組織へのＧＡＡの取込みの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から３か月後、図１に示すように処置したマウスの横隔膜（図３Ｃ）及び四頭筋（図３Ｄ）においてライソゾームＧＡＡのレベルをウエスタンブロットにより測定した。
【図3-3】シャペロン処置により、野生型マウスの組織へのＧＡＡの取込みの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から３か月後、図１に示すように処置したマウスの脳（図３Ｅ）及び脊髄（図３Ｆ）においてライソゾームＧＡＡのレベルをウエスタンブロットにより測定した。
【図4】ＧＡＡ欠損（ノックアウト）マウスに関する研究の実験計画を示す図である。３～４週齢のＧＡＡ欠損雄マウスに、ＰＢＳ又は、飲料水に溶解した薬理学的シャペロン（ＰＣ）と組合せて分泌型ＧＡＡを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ－ＧＡＡ）を１×１０１１ｖｇ／ｋｇで静脈内注射した。未処置のＧＡＡ野生型マウス及びＡＡＶ－ＧＡＡベクター又はＰＢＳを注射したＧＡＡ欠損マウスの２つの群をコントロールとして使用した。ＰＣ分子は、連続３日間の処置と、その後の飲料水のみによる連続４日間とからなる「３日オン／４日オフ」レジメンを使用してマウスに経口投与した。薬理学的シャペロンと組合せた遺伝子治療処置から２か月後、マウスから血を抜き屠殺して組織を採取した。
【図5】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの循環ＧＡＡレベルの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスにおいて血中ＧＡＡのレベルをウエスタンブロットにより測定した。データは、ヒトＧＡＡバンド強度と標準化に使用される非特異的バンド強度との比率として表された。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対２か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＡＢＸ処置群（ｎ＝７）以外、群当たりｎ＝８、ＧＡＡ＋／＋マウス（ＷＴ）及びＧＡＡ－／－マウス（ＫＯ）にはＰＢＳを注射し、通常の水を与えた）。
【図6】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの循環ＧＡＡ活性の改善が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスの血中における血中ＧＡＡ活性を測定した。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対２か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＡＢＸ処置群（ｎ＝７）以外、群当たりｎ＝８、ＧＡＡ＋／＋マウス（ＷＴ）及びＧＡＡ－／－マウス（ＫＯ）にはＰＢＳを注射し、通常の水を与えた）。
【図7-1】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの組織へのＧＡＡ取込みの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスを屠殺して組織を採取した。心臓（図７Ａ）及び横隔膜（図７Ｂ）で検出されたＧＡＡ活性の結果を示す。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対３か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＡＢＸ処置群（ｎ＝７）以外、群当たりｎ＝８）。
【図7-2】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの組織へのＧＡＡ取込みの改善が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスを屠殺して組織を採取した。三頭筋（図７Ｃ）及び四頭筋（図７Ｄ）で検出されたＧＡＡ活性の結果を示す。
【図8-1】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの組織におけるグリコーゲン蓄積の減少が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスを屠殺して組織を採取した。グリコーゲン含有量を心臓（図８Ａ）及び横隔膜（図８Ｂ）において測定した。エラーバーは平均標準偏差を表す。統計分析はＡＮＯＶＡによって実施した（＊＝ｐ＜０．０５対３か月目中に通常の水を与えたＡＡＶ－ＧＡＡ注射マウス、ＡＢＸ処置群（ｎ＝７）以外、群当たりｎ＝８）。
【図8-2】シャペロン処置により、ＧＡＡ ＫＯマウスの組織におけるグリコーゲン蓄積の減少が生じることを示す図である。ベクター注射から２か月後、図４に示すように処置したマウスを屠殺して組織を採取した。グリコーゲン含有量を三頭筋（図８Ｃ）及び四頭筋（図８Ｄ）において測定した。
【図9】ＧＡＡ欠損（ノックアウト）マウスに関する研究の実験計画を示す図である。３～４月齢のＧＡＡ欠損雄マウスを、飲料水に溶解した薬理学的シャペロン（ＰＣ）と組合せてＥＲＴ（アルグルコシダーゼアルファ、２０ｍｇ／ｋｇ）により静脈内処置した。未処置のＧＡＡ野生型マウス、未処置のＧＡＡ欠損マウス、及びＥＲＴのみで処置したＧＡＡ欠損マウスをコントロールとして使用した。ＥＲＴの３時間後に採血を実施した。
【発明を実施するための形態】
【0015】
定義
「薬理学的シャペロン」という用語は、すでに折りたたまれたタンパク質に結合し、熱変性及びタンパク質分解に対して安定化することによって、該タンパク質を安定化する小分子を指す。本発明によれば、薬理学的シャペロンは、塩、例えば、医薬的に許容される塩の形態であってもよい。
「薬理学的シャペロン」という用語は、すでに折りたたまれたタンパク質に結合し、熱変性及びタンパク質分解に対して安定化することによって、該タンパク質を安定化する小分子を指す。本発明によれば、薬理学的シャペロンは、塩、例えば、医薬的に許容される塩の形態であってもよい。
【0016】
本発明に係る「薬理学的シャペロン」という用語は、（ｉ）１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及び（ｉｉ）アンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体の両方を意味する。
【0017】
「医薬的に許容される塩」という用語は、治療における使用のための有効成分の調製におけるその使用で知られている酸又は塩基の塩を指す。アニオンの源として好適な医薬的に許容される酸の例としては、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ及びＣ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｚｕｒｉｃｈ：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ／ＶＨＣＡ、２００）に開示されるものが挙げられる。連邦若しくは州政府の監督官庁により承認されている、又は米国若しくは欧州薬局方若しくは動物及びヒトでの使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されている塩。例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、サイクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２－ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩及びキシナホ酸塩（ｘｉｎｏｆｏａｔｅ）が挙げられる。好適な塩基塩は、無毒性塩を形成する塩基から形成される。例としては、アルミニウム、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミン、及び亜鉛塩が挙げられる。酸及び塩基のヘミ塩、例えば、ヘミ硫酸塩及びヘミカルシウム塩も形成され得る。
【0018】
本発明に係る「ＤＮＪ」という用語は、１－デオキシノジリマイシン（ＣＡＳ番号１９１３０－９６－２、ＩＮＮドゥボグルスタット）を意味する。本発明に係る「ＤＮＪ誘導体」という用語は、ＤＮＪから誘導される化合物を意味する。ＤＮＪ誘導体は、Ｎ－メチル－ＤＮＪ、Ｎ－ブチル－ＤＮＪ、Ｎ－シクロプロピルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－（２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミド）エチルオキシ－ＤＮＪ、Ｎ－４－ｔ－ブチルオキシカルボニル－ピペリジニルメチル－ＤＮＪ（Ｎ－４－ｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ｐｉｐｅｒｉｄｎｙｌｍｅｔｈｙｌ－ＤＮＪ）、Ｎ－２－Ｒ－テトラヒドロフラニルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－Ｒ－テトラヒドロフラニルメチル－ＤＮＪ、Ｎ－（２－（２，２，２－トリフルオロエトキシ）エチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－メトキシエチル－ＤＮＪ、Ｎ－２－エトキシエチル－ＤＮＪ、Ｎ－４－トリフルオロメチルベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－アルファ－シアノ－４－トリフルオロメチルベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－４－トリフルオロメトキシベンジル－ＤＮＪ、Ｎ－４－ｎ－ペントキシベンジル－ＤＮＪ、及びＮ－４－ｎ－ブトキシベンジル－ＤＮＪ、又はＣｌ－ノニルＤＮＪから選択されてもよく、好ましくはＮ－ブチル－ＤＮＪ（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０、ＩＮＮミグルスタット）であってもよい。ＤＮＪ又はその誘導体は、例えば、ＷＯ２００６／１２５１４１に記載されるように、当該技術分野で既知の方法によって調製できる。ＤＮＪ又はその誘導体は、ＤＮＪ塩酸塩（ＣＡＳ番号７３２８５－５０－４）又はＮ－ブチル－ＤＮＪ塩酸塩（ＣＡＳ番号２１０１１０－９０－０）等の塩の形態であってもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＪは、ドゥボグルスタット（ＣＡＳ番号１９１３０－９６－２）、ドゥボグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号７３２８５－５０－４）、ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）、又はミグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号２１０１１０－９０－０）である。
【0019】
本発明に係る「ＡＢＸ」という用語は、アンブロキソール（ＣＡＳ番号１８６８３－９１－５）を意味する。「ＡＢＸ誘導体」という用語は、ＡＢＸから誘導される化合物を意味する。ＡＢＸ誘導体はブロムヘキシン（ＣＡＳ番号３５７２－４３－８）であってもよい。ＡＢＸ又はその誘導体は、ＡＢＸ塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）等の塩の形態であってもよい。ＡＢＸ又はその誘導体は、例えば、ＵＳ２００４／０２４２７００に記載されるように、当該技術分野で既知の方法によって調製できる。
一実施形態では、薬理学的シャペロンは、ドゥボグルスタット（ＣＡＳ番号１９１３０－９６－２）又はドゥボグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号７３２８５－５０－４）；及びアンブロキソール塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）である。別の実施形態では、薬理学的シャペロンは、ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）又はミグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号２１０１１０－９０－０）；及びアンブロキソール塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）である。
一実施形態では、薬理学的シャペロンは、ドゥボグルスタット（ＣＡＳ番号１９１３０－９６－２）又はドゥボグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号７３２８５－５０－４）；及びアンブロキソール塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）である。別の実施形態では、薬理学的シャペロンは、ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）又はミグルスタット塩酸塩（ＣＡＳ番号２１０１１０－９０－０）；及びアンブロキソール塩酸塩（ＣＡＳ番号２３８２８－９２－４）である。
【0020】
本発明に係る「ＮＡＣ」という用語は、Ｎ－アセチルシステイン（ＣＡＳ番号６１６－９１－１（Ｌ））を意味する。「ＮＡＣ誘導体」という用語は、ＮＡＣから誘導される化合物を意味する。ＮＡＣ誘導体は、アミノ酸とＮＡＣとの間にエステル、アミド、及び／又は混成結合を形成することによってＮＡＣをアミノ酸とカップリングさせることによって得られてもよい。任意のアミノ酸又はアミノ酸類似体が使用できる。
【0021】
「医薬的に許容される」という用語は、連邦若しくは州政府の監督官庁により承認されている、又は米国若しくは欧州薬局方若しくは動物及びヒトでの使用について一般的に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。「医薬組成物」とは、医薬的に許容される担体を含む組成物を意味する。例えば、担体は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルであってもよく、これらとともに治療薬が投与される。このような医薬担体は、滅菌された液体であり得て、例えば、水及び油、例えば、石油、動物、植物又は合成由来の油等、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。医薬組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。特に注射用溶液の場合、生理食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液も液体担体として採用され得る。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。医薬組成物が経口投与に適合される場合、錠剤又はカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、乳糖、微結晶性セルロース若しくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ）；崩壊剤（例えば、馬鈴薯デンプン若しくはデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の医薬的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製できる。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与用の液体調剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとり得る、又は、使用前に水若しくは別の好適なビヒクルで構成するための乾燥品として提供され得る。このような液体調剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水系ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別植物油）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）等の医薬的に許容される添加剤を用いて従来の手段により調製できる。調剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味料、着色料及び甘味料を含んでいてもよい。本発明に係る組成物は、好ましくは医薬組成物である。
【0022】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸配列、すなわちペプチド結合により連結されたアミノ酸の鎖を指す。治療用ＧＡＡポリペプチドのアミノ酸配列又はそのコード配列は、鳥類及び哺乳類種を含む任意の源に由来できる。本明細書で使用する「鳥類」という用語には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンショウ及びキジが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「哺乳動物」又は「哺乳類」という用語には、ヒト、サル及び他の非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ラゴモルフ等が含まれるが、これらに限定されない。本発明の実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチドは、ヒト、マウス、又はウズラ、特にヒトの、治療用ＧＡＡポリペプチドである。
【0023】
「酸性αグルコシダーゼ」又は「ＧＡＡ」という用語は、オリゴ糖のα－１，４及びα－１，６結合の両方を加水分解してグルコースを遊離させるエキソ－１，４－α－Ｄ－グルコシダーゼを意味する。ＧＡＡが不足すると、ポンペ病（ただし、この用語は正式には乳児発症型の疾病を指す）とも呼ばれる糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）が生じる。ＧＡＡは、分岐点で減速しながらグリコーゲンの完全な分解を触媒する。第１７番染色体上の２８ｋｂのヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子は、３．６ｋｂのｍＲＮＡをコードし、９５１アミノ酸ポリペプチドを生成する［１０］及び［１１］。この酵素は、小胞体において同時翻訳のＮ－結合型グリコシル化を受ける。それは１１０ｋＤａの前駆体型として合成され、広範なグリコシル化修飾、リン酸化、及び約９０ｋＤａのエンドソーム中間体を介したタンパク質プロセシングによって最終的なライソゾーム７６及び６７ｋＤａ型へと成熟する［１０］、［１２］；、［１３］及び［１４］。
【0024】
「糖原病」又は「ＧＳＤ」という用語は、グリコーゲン合成、グリコーゲン分解又は解糖に影響を与える酵素の欠乏によって引起こされる代謝疾患を指す。特に、糖原病は、表１に開示する１つ又は複数の型のＧＳＤであり得る。本発明によれば、ＧＳＤは、好ましくは、ＧＳＤＩ（フォン・ギールケ病）、ＧＳＤＩＩ（ポンペ病）、ＧＳＤＩＩＩ（コーリー病）、ＧＳＤＩＶ、ＧＳＤＶ、ＧＳＤＶＩ、ＧＳＤＶＩＩ、ＧＳＤＶＩＩＩ又は心臓の致死性の先天性糖原病である。より特定的には、糖原病は、ＧＳＤＩ、ＧＳＤＩＩ及びＧＳＤＩＩＩからなる群から、さらに特定的には、ＧＳＤＩＩ及びＧＳＤＩＩＩからなる群から選択される。より特定の実施形態では、糖原病はＧＳＤＩＩである。
【0025】
「ＧＡＡポリペプチド」という用語は、更なる厳密さを伴わずに、シグナルペプチドを有するＧＡＡ（すなわち、ＧＡＡ前駆体）及びシグナルペプチドを有さないＧＡＡを区別なく指す。それは野生型ＧＡＡポリペプチドであっても変異型ＧＡＡポリペプチドであってもよい。
【0026】
「野生型ＧＡＡポリペプチド」という用語は、ＧＡＡの天然型、例えば、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ_０００１４３．２に対応）を指す、又は配列番号３０は、野生型ヒトＧＡＡポリペプチド（ＧＡＡ受託番号Ｐ１０２５３のＵｎｉｐｒｏｔのエントリーでも見出される；ＧｅｎＢａｎｋＣＡＡ６８７６３．１に対応；配列番号３０）である。配列番号２及び配列番号３０内で、アミノ酸残基１～２７は、野生型ＧＡＡポリペプチドのシグナルペプチドに対応する。「野生型ＧＡＡポリペプチド」という用語は、更なる明確さなしに、シグナルペプチドを有するＧＡＡ（すなわち、ＧＡＡ前駆体）及びシグナルペプチドを有さないＧＡＡを不明瞭に指す。
【0027】
「変異型ＧＡＡポリペプチド」という用語は、野生型ＧＡＡポリペプチドと比較して、置換、欠失、又は付加等の少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＧＡＡポリペプチドを指す。例示的なバリアントＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５２５０６．１）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ８９５８３．１）及び配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＩ５３７１８．１）が挙げられる。
【0028】
その他の有用な変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら［１０］；Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［１５］に記載されるもの、及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ_００８０６４（マウス）が挙げられる。その他の変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、ＷＯ２０１２／１４５６４４、ＷＯ００／３４４５１及びＵＳ６，８５８，４２５に記載されるものが挙げられる。その他の有用な変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、Ｋｕｎｉｔａら［１６］によって記載されるＧＡＡ ＩＩ等、文献に記載されるものが挙げられ、ＧＡＡ多型及びＳＮＰは、Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，Ｒ及びＲｅｕｓｅｒ［１］によって記載されている。
【0029】
「治療用ＧＡＡポリペプチド」という用語は、ＧＳＤの処置において使用できるＧＡＡポリペプチドを指す。特に、本発明に係る治療用ＧＡＡポリペプチドは、野生型ＧＡＡポリペプチドの機能性を有する。野生型ＧＡＡの機能性は、オリゴ糖及び多糖、より特定的にはグリコーゲンのα－１，４結合及びα－１，６結合の両方を加水分解して、グルコースを遊離させることである。治療用ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２、３０、２９、３１、又は配列番号３２の野生型ＧＡＡポリペプチドと比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は少なくとも１００％のグリコーゲンに対する加水分解活性を有していてもよい。治療用ＧＡＡポリペプチドの活性は、さらに配列番号２、２９、３０、３１又は３２の野生型ＧＡＡタンパク質の活性の１００％超であってもよく、例えば、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、又はさらには１５０％超であってもよい。治療用ＧＡＡポリペプチドは、組換え細胞発現システム（例えば、哺乳類細胞若しくは昆虫細胞（米国特許第５，５８０，７５７号、第６，３９５，８８４号、第６４５８，５７４号、第６，４６１，６０９号、第２１０，６６６号、第６，０８３，７２５号、第６，４５１，６００号、第５，２３６，８３８号、及び第５，８７９，６８０号を参照）、ヒト胎盤、又は動物乳（米国特許第６，１８８，０４５号を参照）から精製されてもよい。ポンペ病の処置のために現在承認されている治療用ＧＡＡポリペプチドは、アルグルコシダーゼアルファ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，ＩｎｃによってＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）又はＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の商標名で販売されている）と称される組換えＧＡＡポリペプチドである。
【0030】
本発明に係る治療用ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチド部分、及び最終的には、該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含む。したがって、治療用ＧＡＡポリペプチドは、（ｉ）ＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含んでいてもよい、又は（ｉｉ）ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を有さないＧＡＡポリペプチド部分を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチドはまた、前記治療用ＧＡＡポリペプチドの生体内分布、安定性、及び／又は組織取込みを改善するための追加の配列を含んでいてもよい。
【0031】
「ＧＡＡポリペプチド部分」という用語は、シグナルペプチドを欠くＧＡＡポリペプチドを指す。それは、野生型ＧＡＡポリペプチド部分であっても変異型ＧＡＡポリペプチド部分であってもよい。
【0032】
「野生型ＧＡＡポリペプチド部分」という用語は、シグナルペプチドを欠く天然型ＧＡＡを指し、例えば、配列番号１及び配列番号３３はいずれも野生型ヒトＧＡＡポリペプチド部分である。
【0033】
「変異型ＧＡＡポリペプチド部分」という用語は、野生型ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、置換、欠失、又は付加等の少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＧＡＡポリペプチド部分を指す。変異型ＧＡＡポリペプチド部分を規定するための根拠として、任意の変異型ＧＡＡポリペプチドを使用できる。いくつかの実施形態では、変異型ＧＡＡポリペプチド部分は、切断型ＧＡＡポリペプチドである。
本発明の文脈において、「切断型ＧＡＡポリペプチド」とは、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端から切断された１つ又は複数の連続的なアミノ酸を含むＧＡＡポリペプチドを意味する。一実施形態では、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く野生型ＧＡＡポリペプチド、例えば、配列番号１又は配列番号３３で表されるシグナルペプチドを欠く野生型ヒトＧＡＡポリペプチドである。別の実施形態では、親ＧＡＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く変異型ＧＡＡポリペプチドである。シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドを定義するための根拠として、当該技術分野で既知の任意の変異型ＧＡＡポリペプチドを使用できる。例示的な変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５２５０６．１）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ８９５８３．１）及び配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＩ５３７１８．１）が挙げられる。その他の有用な変異型としては、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら［１０］、Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［１５］に記載されるもの及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ_００８０６４（マウス）が挙げられる。その他の変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、ＷＯ２０１２／１４５６４４、ＷＯ００／３４４５１及びＵＳ６，８５８，４２５に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列に由来する。より特定的には、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３３であり、好ましくは配列番号１である。
本発明の文脈において、「切断型ＧＡＡポリペプチド」とは、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドのＮ末端から切断された１つ又は複数の連続的なアミノ酸を含むＧＡＡポリペプチドを意味する。一実施形態では、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く野生型ＧＡＡポリペプチド、例えば、配列番号１又は配列番号３３で表されるシグナルペプチドを欠く野生型ヒトＧＡＡポリペプチドである。別の実施形態では、親ＧＡＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く変異型ＧＡＡポリペプチドである。シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドを定義するための根拠として、当該技術分野で既知の任意の変異型ＧＡＡポリペプチドを使用できる。例示的な変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、配列番号２９（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５２５０６．１）、配列番号３１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ８９５８３．１）及び配列番号３２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢＩ５３７１８．１）が挙げられる。その他の有用な変異型としては、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら［１０］、Ｖａｎ Ｈｏｖｅら［１５］に記載されるもの及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ_００８０６４（マウス）が挙げられる。その他の変異型ＧＡＡポリペプチドとしては、ＷＯ２０１２／１４５６４４、ＷＯ００／３４４５１及びＵＳ６，８５８，４２５に記載されるものが挙げられる。特定の実施形態では、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列に由来する。より特定的には、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３３であり、好ましくは配列番号１である。
【0034】
特に、本発明に係る切断型ＧＡＡポリペプチドは、そのシグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドと比較して、そのＮ末端において１～７５個の連続的なアミノ酸が切断されている。具体的には、切断型ＧＡＡポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドと比較して、特に配列番号１又は配列番号３３と比較して、そのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５個の連続的なアミノ酸が切断されていてもよい。好ましい実施形態では、切断型ＧＡＡポリペプチドは、そのシグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチドと比較して、そのＮ末端において６、７、８、９、１０、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６又は４７個の連続的なアミノ酸が切断されており、より特定的には、シグナルペプチドを欠く親ＧＡＡポリペプチド、特に配列番号１又は配列番号３３と比較して、そのＮ末端において８、４２又は４３個の連続的なアミノ酸が切断されている。特定の実施形態では、本発明の切断型ＧＡＡポリペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６に示される配列を有する。配列番号２７は、配列番号１と比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドに対応する。配列番号２８は、配列番号１と比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドに対応する。配列番号３４は、配列番号１と比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドに対応する。配列番号３５は、配列番号１と比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドに対応する。配列番号３６は、配列番号１と比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドに対応する。
【0035】
本発明に係る「シグナルペプチド部分」という用語は、野生型ＧＡＡポリペプチドの内因性（又は天然）シグナルペプチド、例えば、配列番号４（ｓｐ１と称される）の核酸配列によってコードされるシグナルペプチド、又は別のタンパク質の外因性シグナルペプチドを意味する。本発明で実施可能な特定の外因性シグナルペプチドとしては、キモトリプシノーゲンＢ２（配列番号３）ｓｐ７とも称される）からのアミノ酸１～２０、ヒトアルファ－１－アンチトリプシン（配列番号５、ｓｐ２とも称される）のシグナルペプチド、イズロン酸－２－スルファターゼ（配列番号６、ｓｐ６とも称される）からのアミノ酸１～２５、及びプロテアーゼＣ１阻害剤（配列番号７、ｓｐ８とも称される）からのアミノ酸１～２３が挙げられる。配列番号３及び配列番号５～配列番号７のシグナルペプチドは、その天然のシグナルペプチドを含むＧＡＡポリペプチドと比較した場合、インビトロ及びインビボの両方でキメラＧＡＡポリペプチドのより高い分泌を可能にする。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３～７に示される配列を有する、又は、得られる配列が機能的シグナルペプチド、すなわちＧＡＡタンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドに相当する限り、シグナルペプチドはその機能的誘導体である、すなわち、配列番号３～７に示される配列と比較して１～５つ、特に１～４つ、特に１～３つ、特に１～２つ、特に１つのアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換を含む配列である。特定の実施形態では、シグナルペプチド部分は、配列番号３～７からなる群から選択され、好ましくは配列番号３である。
【0036】
特定の実施形態では、ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７から選択され、ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６から選択される。
【0037】
本発明によれば、「核酸分子」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特にＤＮＡを指す。本発明によれば、核酸分子は、前述のように治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする。例えば、野生型ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号８に対応する。シグナルペプチドを欠く治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号８のヌクレオチド配列８２～２８５９、すなわち配列番号９であってもよい。
【0038】
治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、インビボでの治療用ＧＡＡポリペプチドの発現のために最適化できる。配列の最適化には、コドンの最適化、ＧＣ含量の増加、ＣｐＧアイランドの数の減少、代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数の減少、並びにスプライスドナー及びスプライスアクセプター部位の数の減少を含む、核酸配列の多くの変更が含まれ得る。遺伝コードの縮重のために、異なる核酸分子が同じタンパク質をコードし得る。異なる生物の遺伝コードが、他のものよりも同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンの一つを使用することに偏っていることが多いことも周知である。コドン最適化によって、所与の細胞状況に存在するコドンバイアスを利用した変化がヌクレオチド配列に導入されることにより、得られるコドン最適化ヌクレオチド配列が、非コドン最適化配列と比較して相対的に高レベルで、このような所与の細胞状況において発現される可能性がより高くなる。本発明の好ましい実施形態では、このような配列最適化ヌクレオチド配列は、例えば、ヒト特異的なコドン使用バイアスを利用することによって、切断型ＧＡＡポリペプチドをコードし、コドン最適化されて、同じ切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非コドン最適化ヌクレオチド配列と比較してヒト細胞におけるその発現を改善する。特定の実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、野生型ヒトＧＡＡポリペプチドコード配列のヌクレオチド８２～２８５９、例えば配列番号８の８２～２８５９と比較して、コドン最適化される、並びに／又は増加したＧＣ含量を有する、並びに／又は減少した代替オープンリーディングフレームの数を有する、並びに／又は減少したスプライスドナー及び／若しくはスプライスアクセプター部位の数を有する。配列番号８は、シグナルペプチドを有する野生型ヒトＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列である。配列番号９は、シグナルペプチドを欠く野生型ヒトＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列である。野生型ヒトＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列は、配列番号１０（ｈＧＡＡ ｃｏ１）又は配列番号１１（ｈＧＡＡ ｃｏ２）であってもよい。
特定の実施形態では、本発明に係る核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１２又は配列番号１３に示される配列；配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号４８又は配列番号４９に示される配列；配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号５０又は配列番号５１に示される配列；又は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号５２又は配列番号５３に示される配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１２又は配列番号１３に示される配列を含む。
特定の実施形態では、本発明に係る核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１２又は配列番号１３に示される配列；配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号４８又は配列番号４９に示される配列；配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号５０又は配列番号５１に示される配列；又は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号５２又は配列番号５３に示される配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１２又は配列番号１３に示される配列を含む。
【0039】
好ましい実施形態では、本発明に係るＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含む治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、以下のとおりである。
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２２；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２３；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２４；
－ 配列番号１２（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２５；
－ 配列番号４８（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２６
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号３７；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、配列番号３のシグナルペプチドとを含む、配列番号３８；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号３９；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４０；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４１；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４２；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４３；及び
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４４；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４５；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４６；及び
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４７。
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２２；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２３；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号５のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号２４；
－ 配列番号１２（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２５；
－ 配列番号４８（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２６
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号３７；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、配列番号３のシグナルペプチドとを含む、配列番号３８；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号３９；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４０；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４１；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４２；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４３；及び
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４４；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列（配列番号９の非最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４５；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４６；及び
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）と、（ｉｉ）配列番号３のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、配列番号４７。
【0040】
別の好ましい実施形態では、本発明に係るＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含む治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、以下のとおりである。
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列。
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする非最適化ヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から２９個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４３個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１２の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
－ （ｉ）配列番号１の親ｈＧＡＡと比較して、又は配列番号３３の親ｈＧＡＡと比較して、そのＮ末端から４７個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードする最適化ヌクレオチド配列（配列番号１３の最適化ヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列）、及び（ｉｉ）配列番号４、５、６又は７のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【0041】
好ましい実施形態では、核酸分子によってコードされる治療用ＧＡＡポリペプチドは、ＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含み、前記ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７から選択され、好ましくは配列番号３であり、前記ＧＡＡポリペプチド部分は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３５又は配列番号３６から選択され、好ましくは配列番号２７である。
【0042】
最も好ましくは、核酸分子は、配列番号８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６又は配列番号４７から選択され、好ましくは配列番号２５である。
【0043】
好ましくは、本発明に係るＧＡＡポリペプチド部分及び該ＧＡＡポリペプチド部分のＮ末端に融合されたシグナルペプチド部分を含む治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、以下のとおりである。
－ 配列番号１２（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と、配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２５、又は
－ 配列番号４８（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と、配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２６。
－ 配列番号１２（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において８個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と、配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２５、又は
－ 配列番号４８（配列番号１の親ＧＡＡポリペプチド部分と比較して、そのＮ末端において４２個の連続的なアミノ酸が切断された切断型ＧＡＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）と、配列番号５４（ｓｐ７をコードするヌクレオチド配列）とを含む、配列番号２６。
【0044】
本発明に係る治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、前記核酸分子（すなわち、導入遺伝子）を発現するための核酸構築物に挿入され得る。核酸構築物は、１つ又は複数の発現制御配列及び／又は核酸分子の発現を改善するその他の配列及び／又は治療用ＧＡＡポリペプチドの分泌を増強する配列及び／又は治療用ＧＡＡポリペプチドの組織取込みを増強する配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでいてもよい。本明細書で使用する「作動可能に連結された」という用語は、機能的な関係性におけるポリヌクレオチド因子の連結を指す。核酸が「作動可能に連結された」とは、それが別の核酸配列と機能的な関係性に置かれた場合である。例えば、プロモーター又は別の転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されている。このような発現制御配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、プロモーター、エンハンサー（例えば、シス調節モジュール（ＣＲＭ））、イントロン、ポリＡシグナル等が挙げられる。
【0045】
特に、核酸構築物は、核酸分子に作動可能に連結されたプロモーター及び、場合によってはイントロンを含む。プロモーターは、遍在性又は組織特異的プロモーター、特に、ＧＡＡ欠損患者においてＧＡＡ発現が望ましい細胞又は組織等、ＧＡＡの発現が望ましい細胞又は組織での発現を促進可能なプロモーターであればよい。特定の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的なプロモーター、例えば、アルファ－１アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）（配列番号１４）、トランスサイレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ＬＳＰプロモーター（甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター配列、２コピーのアルファ１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー配列、及びリーダー配列を含む［１７］等である。その他の有用な肝臓特異的なプロモーターが当該技術分野において既知であり、例えば、コールドスプリングハーバー研究所により編集された肝臓特異的な遺伝子プロモーターデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ／）に列挙されているものが挙げられる。本発明の文脈において好ましいプロモーターは、ｈＡＡＴプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、１つの目的の組織又は細胞（例えば、筋肉細胞）及び肝細胞における発現を指示するプロモーターである。例えば、ある程度、デスミン、Ｓｐｃ５－１２及びＭＣＫプロモーター等の筋肉細胞に特異的なプロモーターは、肝細胞への発現の多少のリークを呈し得るが、これは、本発明の核酸から発現されるＧＡＡポリペプチドに対する対象の免疫寛容を誘導するのに有利となり得る。その他の組織特異的又は非組織特異的プロモーターが、本発明の実施において有用となり得る。例えば、核酸構築物は、肝臓特異的なプロモーターとは異なるプロモーターである組織特異的プロモーターを含んでいてもよい。例えば、プロモーターは、筋肉特異的であってもよく、例えば、デスミンプロモーター（及び天然又は人工的なエンハンサーを含むデスミンプロモーター等のデスミンプロモーターバリアント）、ＳＰｃ５－１２又はＭＣＫプロモーター等であってもよい。別の実施形態では、プロモーターは、赤血球系統の細胞からのＧＡＡポリペプチドの発現のための、エリスロポエチンプロモーター等、他の細胞系統に特異的なプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは遍在性プロモーターである。代表的な偏在性プロモーターとしては、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ）、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター等が挙げられる。さらに、プロモーターは、アルブミンプロモーター又はＧＡＡプロモーター等の内因性プロモーターであってもよい。特定の実施形態では、プロモーターは、シス調節モジュール（ＣＲＭ）又は人工的なエンハンサー配列等のエンハンサー配列に関連する。例えば、プロモーターは、ヒトＡｐｏＥ制御領域（又はヒトアポリポタンパク質Ｅ／ＣＩ遺伝子座、肝制御領域ＨＣＲ－１ ― Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ３２５１０、配列番号１５に示す）等のエンハンサー配列に関連していてもよい。特定の実施形態では、ＡｐｏＥ配列等のエンハンサー配列は、上記に列挙したもの等の肝臓特異的なプロモーター、特にｈＡＡＴプロモーター等に関連する。本発明の実施において有用なその他のＣＲＭとしては、Ｒｉｎｃｏｎら［１８］、Ｃｈｕａｈら［１９］又はＮａｉｒら［２０］に記載されるものが挙げられる。別の実施形態では、プロモーターはハイブリッドプロモーターである。例えば、ハイブリッドプロモーターは、ｓｐＣ５－１２プロモーター、ＣＫ６プロモーター、ＣＫ８プロモーター、Ａｃｔａ１プロモーター等の短いサイズの筋肉選択的なプロモーターに作動可能に連結された肝臓選択的なエンハンサーで構成される。肝臓選択的なエンハンサーは、ＨＳ－ＣＲＭ１、ＨＳ－ＣＲＭ２、ＨＳ－ＣＲＭ３、ＨＳ－ＣＲＭ４、ＨＳ－ＣＲＭ５、ＨＳ－ＣＲＭ６、ＨＳ－ＣＲＭ７、ＨＳ－ＣＲＭ８、ＨＳ－ＣＲＭ９、ＨＳ－ＣＲＭ１０、ＨＳ－ＣＲＭ１１、ＨＳ－ＣＲＭ１２、ＨＳ－ＣＲＭ１３、及びＨＳ－ＣＲＭ１４から選択でき、これらは反復できる。ハイブリッドプロモーターの別の例としては、ＡｐｏＥエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーター及びｓｐＣ５．１２プロモーター（配列番号５５に示される）の組合せ；又は、ＡｐｏＥエンハンサー、ｈＡＡＴプロモーター及びＳｙｎプロモーターの組合せ；又はＡｐｏＥエンハンサー及びｓｐＣ５．１２プロモーターの組合せが挙げられる。
【0046】
別の特定の実施形態では、核酸構築物は、イントロン、特にプロモーターとＧＡＡコード配列との間に配置されたイントロンを含む。イントロンは、ｍＲＮＡ安定性及びタンパク質の産生を増加させるために導入され得る。更なる実施形態では、核酸構築物は、ヒトベータグロビンｂ２（又はＨＢＢ２）イントロン、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）イントロン、ＳＶ４０イントロン又はニワトリベータグロビンイントロンを含む。別の更なる実施形態では、本発明の核酸構築物は、前記イントロンに見出される代替オープンリーディングフレーム（ＡＲＦ）の数を減少させる又はさらには完全に除去するように設計された修飾イントロン（特に修飾ＨＢＢ２又は修飾ＦＩＸイントロン）を含有する。好ましくは、長さが５０ｂｐにわたり、開始コドンとインフレームである終始コドンを有するＡＲＦが除去される。ＡＲＦは、イントロンの配列を修飾することによって除去されてもよい。例えば、修飾は、ヌクレオチド置換、挿入又は欠失、好ましくはヌクレオチド置換によって行われてもよい。例示として、目的のイントロンの配列に存在するＡＴＧ又はＧＴＧ開始コドンにおける１つ又は複数のヌクレオチド、特に１つのヌクレオチドが置換えられてもよく、結果として非開始コドンが生じる。例えば、ＡＴＧ又はＧＴＧは、目的のイントロンの配列内で、開始コドンではないＣＴＧによって置換えられてもよい。
【0047】
核酸構築物で使用される古典的なＨＢＢ２イントロンは、配列番号１６に示される。例えば、このＨＢＢ２イントロンは、前記イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって修飾されてもよい。特定の実施形態では、構築物に含まれる修飾ＨＢＢ２イントロンは、配列番号１７に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なＦＩＸイントロンは、ヒトＦＩＸの第一イントロンに由来し、配列番号１８に示される。ＦＩＸイントロンは、前記イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって修飾されてもよい。特定の実施形態では、本発明の構築物に含まれる修飾ＦＩＸイントロンは、配列番号１９に示される配列を有する。核酸構築物に使用される古典的なニワトリベータグロビンイントロンは、配列番号２０に示される。ニワトリベータグロビンイントロンは、前記イントロン内の開始コドン（ＡＴＧ及びＧＴＧコドン）を排除することによって修飾されてもよい。特定の実施形態では、本発明の構築物に含まれる修飾ニワトリベータグロビンイントロンは、配列番号２１に示される配列を有する。好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物に使用されるイントロンは、修飾ＨＢＢ２イントロン（配列番号１７）である。
【0048】
特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の向きに、場合によってはエンハンサーが先行するプロモーター、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、又は別の天然に存在する若しくは人工的なポリアデニル化シグナル）を含む。特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の向きに、場合によってはエンハンサー（例えば、ＡｐｏＥ制御領域）が先行するプロモーター、イントロン（特に上記に定義するようなイントロン）、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリアデニル化シグナルを含む。更なる特定の実施形態では、本発明の核酸構築物は、５’から３’の向きに、ＡｐｏＥ制御領域等のエンハンサー、プロモーター、イントロン（特に、上記に定義するようなイントロン）、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明の更なる特定の実施形態では、核酸構築物は、５’から３’の向きに、ＡｐｏＥ制御領域、ｈＡＡＴ肝臓特異的なプロモーター、ＨＢＢ２イントロン（特に、上記に定義するような修飾ＨＢＢ２イントロン）、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。
【0049】
本発明によれば、核酸構築物は、ベクター、好ましくはウイルスベクターに挿入されてもよい。本発明に係る「ベクター」という用語は、タンパク質発現に好適であり、好ましくは遺伝子治療における使用に好適であるベクターを意味する。一実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。別の実施形態では、ベクターは、本発明の核酸分子、特に本発明のＧＡＡポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡを含有するナノ粒子である。別の実施形態では、ベクターは、本発明の核酸分子又は構築物の、標的細胞のゲノムへの組込みを可能にする、トランスポゾンに基づくシステムであり、例えば、機能亢進性（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ）Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポゾンシステム［２１］である。別の実施形態では、ベクターは、遺伝子治療に好適なウイルスベクターである。ベクターは、任意の目的の細胞、例えば、肝組織又は細胞、筋肉細胞、ＣＮＳ細胞（例えば、脳細胞若しくは脊髄細胞）、又は造血幹細胞、例えば、赤血球系統の細胞（例えば、赤血球）を標的化してもよい。この場合、本発明の核酸構築物は、当該技術分野において周知であるように、効率的なウイルスベクターを産生するために好適な配列も含有する。好ましい実施形態では、核酸構築物は、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又はＡＡＶベクター、例えば、一本鎖若しくは二本鎖自己相補的ＡＡＶベクターに挿入される。本発明の非常に好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、例えば、肝組織又は細胞を形質導入するのに好適なＡＡＶベクター等のＡＡＶベクターであり、より特定的には、ＡＡＶ－１、－２、及びＡＡＶ－２バリアント（例えば、Ｌｉｎｇら［２２］に開示される、Ｙ４４＋５００＋７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ変化を有する操作されたカプシドを含む四重変異体カプシド最適化ＡＡＶ－２）、－３及びＡＡＶ－３バリアント（例えば、Ｖｅｒｃａｕｔｅｒｅｎら［２３］に開示される、２つのアミノ酸変化Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖを有する操作されたＡＡＶ３カプシドを含むＡＡＶ３－ＳＴバリアント、－３Ｂ及びＡＡＶ－３Ｂバリアント、－４、－５、－６及びＡＡＶ－６バリアント（例えば、Ｒｏｓａｒｉｏら［２４］に開示される、三重変異したＡＡＶ６カプシドＹ７３１Ｆ／Ｙ７０５Ｆ／Ｔ４９２Ｖ形態を含むＡＡＶ６バリアント、－７、－８、－９、－１０、例えば、ｃｙ１０及び－ｒｈ１０、－ｒｈ７４、－ｄｊ、Ａｎｃ８０、ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、ブタＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６等の、ベクター又はレンチウイルスベクター及びアルファレトロウイルス等のレトロウイルスベクターである。当該技術分野において既知であるように、使用が考えられる特定のウイルスベクターに応じて、機能的なウイルスベクターを得るために、追加の好適な配列が本発明の核酸構築物に導入される。好適な配列としては、ＡＡＶベクターについてはＡＡＶ ＩＴＲ、又はレンチウイルスベクターについてはＬＴＲが挙げられる。したがって、本発明はまた、各側にＩＴＲ又はＬＴＲが隣接する、前述のような核酸構築物に関する。
【0050】
加えて、その他の非天然の操作されたバリアント及びキメラＡＡＶも有用であり得る。従来の分子生物学の技術を使用してＡＡＶウイルスを操作してもよく、それにより、これらの粒子を核酸配列の細胞特異的な送達、免疫原性の最小化、安定性及び粒子の寿命の調整、効率的な分解、核への正確な送達のために最適化することが可能である。ベクターへのアセンブリに望ましいＡＡＶフラグメントとしては、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び高度可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、並びにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。これらのフラグメントは、様々なベクターシステム及び宿主細胞で容易に利用され得る。Ｒｅｐタンパク質を欠如するＡＡＶベースの組換えベクターは、低効率で宿主のゲノムに組込まれ、主に安定な環状エピソームとして存在し、標的細胞に何年間も持続し得る。ＡＡＶ天然血清型を使用する代替として、人工的なＡＡＶ血清型が本発明の文脈において使用されてもよく、限定されることなく、天然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶが挙げられる。このような人工的なカプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質のフラグメント）を、異なる選択されたＡＡＶ血清型、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得られ得る異種配列と組合せて使用して、任意の好適な技術により生成され得る。人工的ＡＡＶ血清型は、限定されることなく、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであってもよい。
【0051】
本発明の文脈において、ＡＡＶベクターは、目的の標的細胞、特に肝細胞を形質導入可能なＡＡＶカプシドを含む。更なる特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはシュードタイプ化ベクターであり、すなわち、そのゲノム及びカプシドは、異なる血清型のＡＡＶに由来する。例えば、シュードタイプ化ＡＡＶベクターは、そのゲノムが上記のＡＡＶ血清型の１つに由来し、そのカプシドが別の血清型に由来するベクターであってもよい。例えば、シュードタイプ化ベクターのゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８血清型に由来するカプシドを有してもよく、そのゲノムは、異なる血清型に由来してもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４血清型、特にＡＡＶ８又はＡＡＶ９血清型、より特定的にはＡＡＶ８血清型のカプシドを有する。
【0052】
ベクターが導入遺伝子の筋肉細胞への送達の際の使用のためである、特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ７４からなる群から選択されてもよい。
【0053】
ベクターが導入遺伝子の肝細胞への送達の際の使用のためである、別の特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、とりわけ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０及びＡＡＶ３Ｂからなる群から選択されてもよい。
【0054】
別の実施形態では、カプシドは修飾カプシドである。本発明の文脈において、「修飾カプシド」とは、１つ又は複数の野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質に由来する１つ又は複数のバリアントＶＰカプシドタンパク質を含むキメラカプシド又はカプシドであってもよい。
特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはキメラベクターである、すなわち、そのカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰカプシドタンパク質を含む、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域若しくはドメインを組合せた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。肝細胞を形質導入するのに有用なこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、Ｓｈｅｎら［２５］及びＴｅｎｎｅｙら［２６］に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８カプシド配列と、ＡＡＶ８血清型とは異なるＡＡＶ血清型、例えば、具体的に上述されているもののいずれかの配列との組合せに由来し得る。別の実施形態では、ＡＡＶベクターのカプシドは、１つ又は複数の変異型ＶＰカプシドタンパク質、例えば、ＷＯ２０１５０１３３１３に記載されるもの、特にＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４及びＲＨＭ１５－６カプシドバリアントを含み、これらは高い肝臓指向性を呈する。
特定の実施形態では、ＡＡＶベクターはキメラベクターである、すなわち、そのカプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰカプシドタンパク質を含む、又は、少なくとも２つのＡＡＶ血清型に由来するＶＰタンパク質領域若しくはドメインを組合せた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。肝細胞を形質導入するのに有用なこのようなキメラＡＡＶベクターの例は、Ｓｈｅｎら［２５］及びＴｅｎｎｅｙら［２６］に記載されている。例えば、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８カプシド配列と、ＡＡＶ８血清型とは異なるＡＡＶ血清型、例えば、具体的に上述されているもののいずれかの配列との組合せに由来し得る。別の実施形態では、ＡＡＶベクターのカプシドは、１つ又は複数の変異型ＶＰカプシドタンパク質、例えば、ＷＯ２０１５０１３３１３に記載されるもの、特にＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４及びＲＨＭ１５－６カプシドバリアントを含み、これらは高い肝臓指向性を呈する。
【0055】
別の実施形態では、修飾カプシドはまた、エラープローンＰＣＲ及び／又はペプチド挿入により挿入されるカプシド修飾に由来し得る（例えば、Ｂａｒｔｅｌら［２７］又はＭｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒら［２８］に記載される。加えて、カプシドバリアントは、単一のアミノ酸変化、例えば、チロシン変異体（例えば、Ｚｈｏｎｇら［２９］に記載される）を含んでいてもよい。別の例としては、ＡＡＶ ＶＰ２カプシドタンパク質のＮ末端へのアントプロイリン－Ｂの融合［３０］が挙げられる。
【0056】
加えて、ＡＡＶベクターのゲノムは、一本鎖又は自己相補的二本鎖ゲノムのいずれであってもよい［３１］。自己相補的な二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復の１つからの末端解離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ；ｔｒｓ）を欠失させることによって生成される。複製ゲノムが野生型ＡＡＶゲノムの半分の長さであるこれらの修飾ベクターは、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向がある。
特に、ＡＶＶベクターは、ＡＡＶ由来のカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、バリアントＡＡＶ２、ＡＡＶ３、バリアントＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、バリアントＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、バリアントＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えば、ＡＡＶｃｙ１０及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、並びにブタＡＡＶ、例えば、ＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６カプシド、又はキメラカプシドを有する。
特に、ＡＶＶベクターは、ＡＡＶ由来のカプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、バリアントＡＡＶ２、ＡＡＶ３、バリアントＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、バリアントＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、バリアントＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、例えば、ＡＡＶｃｙ１０及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｄｊ、ＡＡＶ－Ａｎｃ８０、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ２ｉ８、並びにブタＡＡＶ、例えば、ＡＡＶｐｏ４及びＡＡＶｐｏ６カプシド、又はキメラカプシドを有する。
【0057】
好ましい実施形態では、本発明の実施において施行されるＡＡＶベクターは、一本鎖ゲノムを有し、さらに好ましくは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４カプシド、例えば、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９カプシド、より特定的にはＡＡＶ８カプシドを含む。特に好ましい実施形態では、本発明は、一本鎖又は二本鎖自己相補的ゲノム（例えば、一本鎖ゲノム）において、本発明の核酸構築物を含むＡＡＶベクターに関する。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４カプシド、例えば、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９カプシド、より特定的にはＡＡＶ８カプシドを含む。
【0058】
治療用ＧＡＡポリペプチド、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、又は核酸分子を発現するための核酸構築物は、当該技術分野において既知の方法によって調製され得る。例えば、ＷＯ２０１８／０４６７７４及びＷＯ２０１８／０４６７５は、治療用ＧＡＡポリペプチド、ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、及び核酸分子を発現するための核酸構築物を調製するための方法を提供する。
【0059】
本発明によれば、「ＧＡＡの取込み」又は「治療用ＧＡＡポリペプチドの取込み」という用語は、細胞又は組織によるＧＡＡの吸収を指す。一実施形態では、組織は、心臓、三頭筋、四頭筋、及び横隔膜等の筋肉である。別の実施形態では、組織は神経系の組織である。「神経系の組織」という用語は、例えば運動ニューロン、グリア細胞等の神経細胞を含有する組織を指す。換言すれば、神経系は、脳及び脊髄を含む中枢神経系からなり、末梢神経系は、分枝末梢神経を含み、例えば、本発明に係る中枢神経系の組織は、脳及び／又は脊髄である。ＧＡＡの取込みは、実施例に記載されるようなウエスタンブロット等、当該技術分野で既知の任意の手段により測定できる。
【0060】
本明細書で使用する「対象」、「患者」又は「個体」という用語は、ＧＳＤに罹患している又は罹患する可能性があるヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類（マウス、ラット）、ネコ、イヌ、又は霊長類）を指す。好ましくは、対象はヒトであり、男性又は女性である。
【0061】
「処置する」又は「処置」という用語は、該用語が適用される疾患若しくは状態、又は該疾患若しくは状態の１つ又は複数の症状を逆転させる、緩和する、その進行を阻害する、又は予防することを意味する。特に、疾患の処置は、ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置すること、好ましくは、対象における呼吸神経筋機能を改善すること、及び／又は呼吸機能障害を減少させることからなってもよい。
【0062】
キット・オブ・パーツ
本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。
本発明のキットは、
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、
－ 呼吸神経筋機能を改善するため、及び／若しくは、呼吸機能障害を減少させるための方法において、
－ ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法において、並びに／又は
－ 特にＧＳＤにおける神経系、好ましくは中枢神経系の組織、最も好ましくは脊髄へのＧＡＡの取込みを増加させる方法において、使用されてもよい。この実施形態では、方法はさらに、ＧＡＡをライソゾームに輸送するために適切なコンフォメーションで前記ＧＡＡを安定化させてもよい。
本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）ポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。
本発明のキットは、
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、
－ 呼吸神経筋機能を改善するため、及び／若しくは、呼吸機能障害を減少させるための方法において、
－ ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法において、並びに／又は
－ 特にＧＳＤにおける神経系、好ましくは中枢神経系の組織、最も好ましくは脊髄へのＧＡＡの取込みを増加させる方法において、使用されてもよい。この実施形態では、方法はさらに、ＧＡＡをライソゾームに輸送するために適切なコンフォメーションで前記ＧＡＡを安定化させてもよい。
【0063】
キット・オブ・パーツは、治療用ＧＡＡポリペプチドの使用（すなわちＥＲＴ）と治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の使用（すなわち遺伝子治療）との間で異なる形態で使用されてもよい。
【0064】
治療用ＧＡＡポリペプチドを使用するＥＲＴ
ＥＲＴは、注入によって治療用ＧＡＡポリペプチド、好ましくはシグナルペプチドを有さない治療用ＧＡＡポリペプチドを外因的に導入することによって、ＧＡＡポリペプチドの量を増加させる。注入後、外因性の治療用ＧＡＡポリペプチドは、非特異的又は受容体特異的なメカニズムを介して組織に取込まれることが予想される。
ＥＲＴは、注入によって治療用ＧＡＡポリペプチド、好ましくはシグナルペプチドを有さない治療用ＧＡＡポリペプチドを外因的に導入することによって、ＧＡＡポリペプチドの量を増加させる。注入後、外因性の治療用ＧＡＡポリペプチドは、非特異的又は受容体特異的なメカニズムを介して組織に取込まれることが予想される。
【0065】
本発明によれば、薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドは、同時に又は別々に投与されてもよい。以下に詳述するように、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドの前、同時、及び／又は後に投与されてもよい。
【0066】
薬理学的シャペロンは、例えば、ＧＳＤ患者におけるインビボでの治療用ＧＡＡポリペプチドの安定性を増加させることによって、及び／又は、ＧＳＤ患者においてインビボで、製剤若しくは組成物においてインビトロで、治療用ＧＡＡポリペプチドの組織取込みを増加させることによって、治療用ＧＡＡポリペプチドの有効性を増加させる。薬理学的シャペロンは、アルグルコシダーゼアルファによる処置等、従来のＥＲＴの処置効果を高めるのに有用である。
【0067】
薬理学的シャペロンは、経口投与、鼻腔投与、経皮投与により、又は、非経口注射、例えば、静脈内注入、皮下注射若しくは腹腔内注射、好ましくは経口投与又は静脈内注入により、より好ましくは経口投与により投与されてもよい。
【0068】
治療用ＧＡＡポリペプチドは、経口投与、鼻腔投与、経皮投与により、又は、非経口注射、例えば、静脈内注入、皮下注射若しくは腹腔内注射、好ましくは静脈内注入又は皮下注射により投与されてもよい。より好ましくは、治療用ＧＡＡポリペプチドは、注射用の滅菌溶液にて静脈内投与される。
【0069】
一実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチド及び薬理学的シャペロンは別々に製剤化される。この実施形態では、薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドは、同じ経路、例えば、静脈内注入により投与されてもよい、又は、好ましくは、異なる経路、例えば、治療用ＧＡＡポリペプチドについては静脈内注入、薬理学的シャペロンについては経口投与により投与されてもよい。治療用ＧＡＡポリペプチドは、任意の経路により投与されるが、好ましくは、投与は非経口的である。
【0070】
別の実施形態では、薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドは、単一の組成物に製剤化される。このような組成物は、貯蔵中及びインビボ投与における治療用ＧＡＡポリペプチドの安定性を高めることにより、コストを削減し、治療効果を増加させる。製剤は、好ましくは、静脈内、皮下及び腹腔内を含む非経口投与に好適であるが、経口、鼻腔内、又は経皮等、その他の投与経路に好適な製剤も企図される。
【0071】
薬理学的シャペロンは、同じ組成物に、又は別々に、好ましくは別々に製剤化されてもよい。例えば、薬理学的シャペロンの一方（ＤＮＪ又はＡＢＸ）及び治療用ＧＡＡポリペプチドは、一つの組成物に製剤化され、他方のシャペロン（ＤＮＪ又はＡＢＸ）は、別の組成物に製剤化されてもよい。別の例では、シャペロン（ＡＢＸ及びＤＮＪ）並びに治療用ＧＡＡポリペプチドは、３つの別個の組成物に製剤化される。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＤＮＪは、別個の組成物、例えば、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）（ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）に対応する）の名称で市販されている組成物に製剤化される。ＤＮＪを含む医薬組成物は、ＷＯ２００６／１２５１４１及びＷＯ２０１４／１１０２７０に記載されている。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＡＢＸは、別個の組成物、例えば、Ａｍｂｒｏｂｅｎｅ（登録商標）、Ａｐｏｎｏｖａ（登録商標）、Ｍｕｃｏａｎｇｉｎ（登録商標）、Ａｍｂｒｏｘｏｌ Ｍｙｌａｎ（登録商標）の名称で市販されている組成物に製剤化される。ＡＢＸを含む医薬組成物は、ＥＰ１５４３８２６に記載されている。
【0074】
いくつかの実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチドは、別個の組成物、例えば、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）又はＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）の名称で市販されている組成物に製剤化される。
【0075】
投与のタイミングは、限定されることなく、投与経路、処置されるＧＳＤ、又は対象の年齢を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与のタイミングを容易に決定できる。
【0076】
治療用ＧＡＡポリペプチド及び薬理学的シャペロンを別々に製剤化する場合、投与は同時に行われてもよい、又は、薬理学的シャペロンが治療用ＧＡＡポリペプチドの前若しくは後に投与されてもよい。例えば、治療用ＧＡＡポリペプチドが静脈内投与される場合、薬理学的シャペロンは、０時間～６時間後の期間中に投与されてもよい。あるいは、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドの０～６時間前に投与されてもよい。薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドが別々に投与され、薬理学的シャペロンが短い循環半減期｛例えば、小分子）を有する、好ましい実施形態では、薬理学的シャペロンは、循環の一定レベルを維持するために、連続的に、例えば、毎日、経口投与されてもよい。このような一定のレベルは、患者に対して無毒であり、非阻害性の治療効果を与えるために投与の時間中の治療用ＧＡＡポリペプチドとの相互作用に関して最適であるように決定されたレベルである。別の実施形態では、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドの代謝回転に必要な期間（これは、薬理学的シャペロンの投与によって延長される）中に投与される。
【0077】
それを必要とする対象に投与される治療用ＧＡＡポリペプチドの用量は、限定されることなく、投与経路、処置されるＧＳＤ又は対象の年齢を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定できる。現在の方法によれば、治療用ＧＡＡポリペプチドの濃度は、一般的に、体重の約０．０５～５０．０ｍｇ／ｋｇであり、通常、毎週又は隔週で投与される。治療用ＧＡＡポリペプチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与できる。このタンパク質の定期的な反復投与は、患者の生涯にわたって必要である。皮下注射は、治療用ＧＡＡポリペプチドへの全身曝露をより長期間維持する。皮下投与量は、好ましくは、隔週又は毎週、体重１ｋｇ当たり０．１～５．０ｍｇの治療用ＧＡＡポリペプチドである。治療用ＧＡＡポリペプチドはまた、例えば、静脈内ボーラス注射、スロープッシュ（ｓｌｏｗ ｐｕｓｈ）静脈内注射、又は連続的な静脈内注射により静脈内投与される。連続的なＩＶ注入（例えば、２～６時間を超える）は、血中における特定のレベルの維持を可能にする。例えば、アルグルコシダーゼアルファ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，ＩｎｃによってＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）又はＭｙｏｚｙｍｅ（登録商標）として販売されている）と称される、ポンペ病の処置に現在承認されているシグナルペプチドを有さない治療用ＧＡＡポリペプチドは、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの用量で静脈内注入により２週間毎に投与される。
【0078】
それを必要とする対象に投与される薬理学的シャペロンの用量は、限定されることなく、投与経路、処置されるＧＳＤ、対象の年齢又は対象に投与される治療用ＧＡＡポリペプチドの量を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定できる。
【0079】
糖原病の処置に有効となる薬理学的シャペロンの用量は、標準的な臨床技術により決定できる。加えて、最適な投与量範囲を予測するのを助けるために、インビボ及び／又はインビトロアッセイが、場合によっては採用されてもよい。製剤に採用される正確な用量は、投与経路及び疾病の重症度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。それを必要とする対象に投与される薬理学的シャペロンの投与量は、限定されることなく、投与経路、処置される特定の疾病、対象の年齢を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定できる。
【0080】
ＤＮＪ又はその誘導体、好ましくはＤＮＪを投与することを含む処置の場合、ＤＮＪ又はその誘導体の典型的な用量は、例えば、１～１０日間、好ましくは３～７日間１グラム（ｇ）、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ以上であり得る。処置は、処置なしの１～１０日、好ましくは３～７日により中断できる。中断の日の後に、前述のような以前の典型的な用量及び継続期間に従って処置を投与できる。例えば、典型的な用量は、３日間２．５ｇ及び４日間処置なし、例えば、３日間５ｇ及び４日間処置なし、又は、例えば、７日間５ｇ及び７日間処置なしである（臨床試験識別番号ＮＣＴ００６８８５９７）。
【0081】
ＡＢＸ又はその誘導体、好ましくはＡＢＸ塩酸塩の投与を含む処置の場合、ＡＢＸ又はその誘導体の典型的な用量は、５０～５００ｍｇ、好ましくは６０～４２０ｍｇであり得て、例えば、１日当たり３回反復され得る（臨床試験識別番号ＮＣＴ０２９４１８２２）。
【0082】
治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を使用する遺伝子治療
本発明はまた、ＧＳＤにおける遺伝子治療と組合せた薬理学的シャペロンの使用を企図する。このような組合せは、ＧＳＤ患者におけるインビボでの治療用ＧＡＡポリペプチドの発現レベルを増加させることによって、ＧＳＤ患者においてインビボで発現される治療用ＧＡＡポリペプチドの安定性を増加させることによって、及び／又は、ＧＳＤ患者においてインビボで発現される治療用ＧＡＡポリペプチドの組織取込みを増加させることによって、遺伝子治療の有効性を増強する。
本発明はまた、ＧＳＤにおける遺伝子治療と組合せた薬理学的シャペロンの使用を企図する。このような組合せは、ＧＳＤ患者におけるインビボでの治療用ＧＡＡポリペプチドの発現レベルを増加させることによって、ＧＳＤ患者においてインビボで発現される治療用ＧＡＡポリペプチドの安定性を増加させることによって、及び／又は、ＧＳＤ患者においてインビボで発現される治療用ＧＡＡポリペプチドの組織取込みを増加させることによって、遺伝子治療の有効性を増強する。
【0083】
本発明によれば、薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、同時に又は別々に投与されてもよい。以下に詳述するように、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の前、同時、及び／又は後に投与されてもよい。
【0084】
好ましい実施形態では、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の後に投与される。例えば、薬理学的シャペロンは、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の投与から１ヶ月、２ヶ月以上後に投与できる。この実施形態によれば、薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、別々に製剤化される。
患者への核酸分子の送達は、直接的であってもよく、この場合、患者は、核酸分子、核酸構築物若しくはベクター、例えば、ウイルスベクターに直接曝露される、又は、間接的であってもよく、この場合、細胞はまず核酸分子、核酸構築物若しくはベクター、例えば、ウイルスベクターによりインビトロで形質転換され、次に患者に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ及びエクスビボ遺伝子治療として既知である。肝細胞の送達の場合、前記細胞は、対象から予め採取され、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子又は核酸構築物をその中に導入することによって操作されることにより、前記治療用ＧＡＡポリペプチドを産生可能となる細胞であってもよい。
患者への核酸分子の送達は、直接的であってもよく、この場合、患者は、核酸分子、核酸構築物若しくはベクター、例えば、ウイルスベクターに直接曝露される、又は、間接的であってもよく、この場合、細胞はまず核酸分子、核酸構築物若しくはベクター、例えば、ウイルスベクターによりインビトロで形質転換され、次に患者に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ及びエクスビボ遺伝子治療として既知である。肝細胞の送達の場合、前記細胞は、対象から予め採取され、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子又は核酸構築物をその中に導入することによって操作されることにより、前記治療用ＧＡＡポリペプチドを産生可能となる細胞であってもよい。
【0085】
いくつかの実施形態では、核酸分子が、前記核酸分子を発現するための核酸構築物に挿入され、前記核酸構築物は、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又は、ＡＡＶベクター、例えば、一本鎖若しくは二本鎖自己相補的ＡＡＶベクターから選択されるウイルスベクターに挿入され、前記ウイルスベクターは、好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４カプシド、より特定的にはＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶベクターである。
【0086】
治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、核酸構築物又はウイルスベクターの投与は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路であるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、投与は、静脈内又は筋肉内経路を介する。治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子は、ベクター化されていてもいなくても、任意の簡便な経路により、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸管粘膜等）を通した吸収により投与されてもよい、及び、他の生物学的活性剤とともに投与されてもよい。投与は、全身性又は局所性であってもよい。具体的な実施形態では、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子、核酸構築物又はウイルスベクターを、治療を必要とする領域、例えば、肝臓に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、インプラントの手段により達成され、前記インプラントは、多孔性、非多孔性、又はゼラチン質の材料であり、例えば、膜、例えば、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜又は繊維が挙げられる。
【0087】
糖原病の処置に有効となる治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸構築物、ベクター分子、核酸構築物又はウイルスベクターの量は、標準的な臨床技術により決定できる。加えて、最適な投与量範囲を予測するのを助けるために、インビボ及び／又はインビトロアッセイが、場合によっては採用されてもよい。製剤に採用される正確な用量は、投与経路及び疾病の重症度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定されるべきである。それを必要とする対象に投与される治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸構築物、ベクター分子、核酸構築物、又はウイルスベクターの投与量は、限定されることなく、投与経路、処置される特定の疾病、対象の年齢、又は治療効果を達成するために必要な発現レベルを含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定できる。ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターを対象に投与することを含む処置の場合、ベクターの典型的な用量は、体重１キログラム当たり少なくとも１×１０８のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、例えば、少なくとも１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも１×１０１２ｖｇ／ｋｇ少なくとも１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。薬理学的シャペロンのおかげで、典型的な用量と比較して、本発明に係る治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸構築物、ベクター分子、核酸構築物又はウイルスベクターの用量を減少させ得る。
【0088】
本発明の一態様では、対象は、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の反復投与を受ける。この態様では、前記投与は、少なくとも一回以上反復されてもよく、さらには、例えば年一回等の周期的なスケジュールに従って行われることが考慮されてもよい。周期的なスケジュールはまた、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０年毎、又は１０年超毎に一回の投与を含み得る。別の特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターの各投与の投与は、各連続的な投与に異なるウイルスを使用して行われることにより、有効性の低下が回避され、その理由は、以前に投与されたウイルスベクターに対する免疫応答が可能であるためである。例えば、ＡＡＶ８カプシドを含むウイルスベクターの第１の投与が行われた後に、ＡＡＶ９カプシドを含むベクターの投与、又はさらには、ＡＡＶとは無関係のウイルス、例えば、レトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターの投与が行われてもよい。あるいは、一過性の免疫抑制を使用して、カプシドに対する免疫応答が回避できる。
【0089】
遺伝子治療の方法は当該技術分野で既知であり、いくつかの実施形態も上記の定義部分で詳述されている。
【0090】
薬理学的シャペロンは、経口投与、鼻腔投与、経皮投与により、又は、非経口注射、例えば、静脈内注入、皮下注射、腹腔内注射、好ましくは経口投与又は静脈内注入により、より好ましくは経口投与により投与されてもよい。
【0091】
薬理学的シャペロンは、同じ組成物に、又は別々に、好ましくは別々に、製剤化されてもよい。ＤＮＪは、別個の医薬組成物、例えば、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）（ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）に対応する）の名称で市販されている組成物に製剤化されてもよい。ＤＮＪを含む医薬組成物は、ＷＯ２００６／１２５１４１及びＷＯ２０１４／１１０２７０に記載されている。ＡＢＸは、別個の医薬組成物、例えば、Ａｍｂｒｏｂｅｎｅ（登録商標）、Ａｐｏｎｏｖａ（登録商標）、Ｍｕｃｏａｎｇｉｎ（登録商標）、Ａｍｂｒｏｘｏｌ Ｍｙｌａｎ（登録商標）の名称で市販されている組成物に製剤化されてもよい。ＡＢＸを含む医薬組成物は、ＥＰ１５４３８２６に記載されている。
【0092】
薬理学的シャペロンは、循環の一定レベルを維持するために、連続的に、例えば、毎日、経口投与されてもよい。このような一定のレベルは、患者に対して無毒であり、非阻害性の治療効果を与えるために投与の時間中に発現される治療用ＧＡＡポリペプチドとの相互作用に関して最適であるように決定されたレベルである。
【0093】
本発明に係る糖原病の処置において有効となり得る薬理学的シャペロンの用量は、上記の「治療用ＧＡＡポリペプチドを使用するＥＲＴ」に記載される。
【0094】
好ましい実施形態では、キット・オブ・パーツは、（ｉ）ドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターとを含む。
さらにより好ましい実施形態では、キット・オブ・パーツは、（ｉ）ドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩と、（ｉｉ）配列番号２５又は配列番号２６の核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターとを含む。
さらにより好ましい実施形態では、キット・オブ・パーツは、（ｉ）ドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩と、（ｉｉ）配列番号２５又は配列番号２６の核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターとを含む。
【0095】
組成物
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、組成物に関する。
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体及びアンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0096】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物に関する。いくつかの実施形態では、神経系の組織は、例えば、中枢神経系の組織、好ましくは脊髄である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ライソゾームへの輸送のために適切なコンフォメーションでＧＡＡを安定化させる。
【0097】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象における呼吸神経筋機能を改善する、及び／又は、呼吸機能障害を減少させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物に関する。
【0098】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、ＧＳＤにおける中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、組成物に関する。
【0099】
本発明によれば、組成物は、治療用ＧＡＡ処置を受ける対象に投与される。上に詳述するように、治療用ＧＡＡ処置は、治療用ＧＡＡポリペプチド（ＥＲＴ）、好ましくはシグナルペプチドを有さない治療用ＧＡＡポリペプチド、又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子（遺伝子治療）であってもよい。好ましくは、組成物は、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象に投与される。いくつかの実施形態では、核酸分子が、前記核酸分子を発現するための核酸構築物に挿入され、前記核酸構築物は、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又は、ＡＡＶベクター、例えば、一本鎖若しくは二本鎖自己相補的ＡＡＶベクターから選択されるウイルスベクターに挿入され、前記ウイルスベクターは、好ましくはＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶ２ｉ８カプシド、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ７４カプシド、より特定的にはＡＡＶ８カプシドを有するＡＡＶベクターである。
【0100】
本発明の組成物は、治療用ＧＡＡ処置の前、同時及び／又は後に、好ましくは治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子の前、同時及び／又は後に投与されてもよい。例えば、治療用ＧＡＡポリペプチドが静脈内投与される場合、組成物は、０時間～６時間後の期間中に投与されてもよい。本発明の組成物及び治療用ＧＡＡポリペプチドが別々に投与され、薬理学的シャペロンが短い循環半減期｛例えば、小分子）を有する、好ましい実施形態では、組成物は、循環の一定レベルを維持するために、連続的に、例えば、毎日、経口投与されてもよい。このような一定のレベルは、患者に対して無毒であり、非阻害性の治療効果を与えるために投与の時間中の治療用ＧＡＡポリペプチドとの相互作用に関して最適であるように決定されたレベルである。別の実施形態では、組成物は、治療用ＧＡＡポリペプチドの代謝回転に必要な期間（これは、薬理学的シャペロンの投与によって延長される）中に投与される。例えば、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子が静脈内又は筋肉内経路により投与される場合、本発明の組成物は、処置から２ヶ月後に投与されてもよく、循環の一定レベルを維持するために、連続的に、例えば、毎日、経口投与されてもよい。
本発明の組成物は、経口投与、鼻腔投与、経皮投与により、又は、非経口注射、例えば、静脈内注入、皮下注射、腹腔内注射、好ましくは経口投与又は静脈内注入により、より好ましくは経口投与により投与されてもよい。
組成物の各々の薬理学的シャペロンは、別々に又は同じ組成物に製剤化されてもよい。例えば、薬理学的シャペロンの一方であるＤＮＪは一つの組成物に製剤化され、他方のシャペロンであるＡＢＸは別の組成物に製剤化されてもよい。
本発明の組成物は、経口投与、鼻腔投与、経皮投与により、又は、非経口注射、例えば、静脈内注入、皮下注射、腹腔内注射、好ましくは経口投与又は静脈内注入により、より好ましくは経口投与により投与されてもよい。
組成物の各々の薬理学的シャペロンは、別々に又は同じ組成物に製剤化されてもよい。例えば、薬理学的シャペロンの一方であるＤＮＪは一つの組成物に製剤化され、他方のシャペロンであるＡＢＸは別の組成物に製剤化されてもよい。
【0101】
一実施形態では、ＡＢＸ及びＤＮＪは別々に製剤化される。この実施形態では、別個の組成物は、同じ経路により、又は異なる経路により、好ましくは同じ経路により、より好ましくは経口投与により投与されてもよい。
【0102】
別の実施形態では、ＡＢＸ及びＤＮＪは同じ組成物に製剤化される。この実施形態では、組成物は、経口、鼻腔内、又は経皮投与、好ましくは経口投与に好適である。
【0103】
ＤＮＪは、別個の医薬組成物、例えば、Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）（ミグルスタット（ＣＡＳ番号７２５９９－２７－０）に対応する）の名称で市販されている組成物に製剤化されてもよい。ＤＮＪを含む医薬組成物は、ＷＯ２００６／１２５１４１及びＷＯ２０１４／１１０２７０に記載されている。
【0104】
ＡＢＸは、別個の医薬組成物、例えば、Ａｍｂｒｏｂｅｎｅ（登録商標）、Ａｐｏｎｏｖａ（登録商標）、Ｍｕｃｏａｎｇｉｎ（登録商標）、Ａｍｂｒｏｘｏｌ Ｍｙｌａｎ（登録商標）の名称で市販されている組成物に製剤化されてもよい。ＡＢＸを含む医薬組成物は、ＥＰ１５４３８２６に記載されている。
【0105】
それを必要とする対象に投与される組成物中の薬理学的シャペロンの用量は、限定されることなく、投与経路、治療されるＧＳＤ、対象の年齢、又は治療用ＧＡＡ処置（例えば、ＥＲＴ若しくは遺伝子治療）を含むいくつかの要因に基づいて変わる。当業者であれば、当該分野における知識に基づいて、これらの要因等に基づいて必要とされる投与量範囲を容易に決定できる。例えば、本発明の組成物は、１ｇ、２ｇ、３ｇ、５ｇ、６ｇ以上のＤＮＪ又はその誘導体、及び５０～５００ｍｇ、例えば、６０～４２０ｍｇのＡＢＸ又はその誘導体を含み得る。
【0106】
好ましい実施形態では、組成物は、治療用ＧＡＡ処置を受ける対象におけるＧＳＤの処置における使用のためのドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩を含み、該治療用ＧＡＡ処置は、前記ＧＳＤを処置するための、治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子が挿入されたウイルスベクターである。
【0107】
さらに好ましい実施形態では、組成物は、ＧＳＤＩＩを処置するための、配列番号２５又は配列番号２６の核酸分子を発現するための核酸構築物が挿入されたウイルスベクターを受ける対象における前記ＧＳＤＩＩの処置における使用のためのドゥボグルスタット及びアンブロキソール塩酸塩を含む。
【0108】
処置の方法
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において前記ＧＳＤを処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において前記ＧＳＤを処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
【0109】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させるための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
【0110】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象における呼吸神経筋機能を改善するための、及び／又は、呼吸機能障害を減少させるための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
【0111】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において、ＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体及びＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
【0112】
薬理学的シャペロン及び治療用ＧＡＡ処置の投与に関する定義及び実施形態は、本明細書の上記、特に「キット・オブ・パーツ」の欄に記載される。
【0113】
その他の目的
本発明者らはまた、薬理学的シャペロンＤＮＪ、ＡＢＸ又はＮＡＣが、特にＧＳＤにおいて、組織へのＧＡＡの取込みを増加させることを証明した。
本発明者らはまた、薬理学的シャペロンＤＮＪ、ＡＢＸ又はＮＡＣが、特にＧＳＤにおいて、組織へのＧＡＡの取込みを増加させることを証明した。
【0114】
ＤＮＪ及び治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子
本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、及び／又は
－ 特にＧＳＤにおける、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法において、
使用されてもよい。
本発明は、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、
－ 医薬として、
－ 糖原病（ＧＳＤ）の処置において、及び／又は
－ 特にＧＳＤにおける、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法において、
使用されてもよい。
【0115】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0116】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0117】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、神経系、好ましくは中枢神経系の組織、より好ましくは脊髄へのＧＡＡの取込みを増加させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0118】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、ＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0119】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、呼吸神経筋機能を改善する、及び／又は、呼吸機能障害を減少させる方法における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0120】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において前記ＧＳＤを処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導体である、方法に関する。
【0121】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、神経系の組織へのＧＡＡの取込みを増加させるための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導である、方法に関する。
【0122】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、呼吸神経筋機能を改善するため、及び／又は、呼吸機能障害を減少させるための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導である、方法に関する。
【0123】
本発明はまた、ＧＳＤを処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において、ＧＳＤの中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＤＮＪ又はその誘導である、方法に関する。
【0124】
ＮＡＣ及び治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子
本発明はまた、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、特に糖原病（ＧＳＤ）の処置において、医薬として使用されてもよい。
本発明はまた、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、前記薬理学的シャペロンが、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、特に糖原病（ＧＳＤ）の処置において、医薬として使用されてもよい。
【0125】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、薬理学的シャペロンが、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0126】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子を受ける対象において前記ＧＳＤを処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＮＡＣ又はその誘導体である、方法に関する。
【0127】
ＡＢＸ及び治療用ＧＡＡポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子
本発明はまた、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、薬理学的シャペロンが、アンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、特に糖原病（ＧＳＤ）の処置において、医薬として使用されてもよい。
本発明はまた、（ｉ）薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩と、（ｉｉ）治療用ＧＡＡポリペプチド又は治療用ＧＡＡポリペプチドをコードする核酸分子とを含み、薬理学的シャペロンが、アンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、キット・オブ・パーツに関する。前記キット・オブ・パーツは、特に糖原病（ＧＳＤ）の処置において、医薬として使用されてもよい。
【0128】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用酸性アルファグルコシダーゼ（ＧＡＡ）処置を受ける対象における前記ＧＳＤの処置における使用のための、薬理学的シャペロン又はその医薬的に許容される塩を含む組成物であって、前記薬理学的シャペロンが、アンブロキソール（ＡＢＸ）又はその誘導体である、組成物に関する。
【0129】
本発明はまた、糖原病（ＧＳＤ）を処置するための治療用ＧＡＡ処置を受ける対象において前記ＧＳＤを処置するための方法であって、薬理学的シャペロンを含む組成物を対象に投与することを含み、薬理学的シャペロンが、ＡＢＸ又はその誘導体である、方法に関する。
【0130】
以下の図及び実施例により本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【0131】
実施例
実施例１：ＷＴマウスに関する研究
材料及び方法
治療用ヒトＧＡＡポリペプチド（ｈＧＡＡ）を発現するＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏＧＡＡベクターの構築
実施例１：ＷＴマウスに関する研究
材料及び方法
治療用ヒトＧＡＡポリペプチド（ｈＧＡＡ）を発現するＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏＧＡＡベクターの構築
【0132】
ＡＡＶベクター産生
アデノウイルスを含まない一過性トランスフェクション法（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、［３２］）を使用してＡＡＶ８ベクターを産生し、先に記載されるように精製した（Ａｙｕｓｏら、［３３］）。ＡＡＶベクターストックの力価は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後にＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色及びバンドデンシトメトリーを行うことによって確認した。核酸構築物は、ＡＡＶベクター、特に２つのＩＴＲとｂＧＨポリＡとを含む発現カセット配列に挿入されていた。前記核酸構築物は、５’から３’に、ＡｐｏＥ制御領域配列番号１５、ｈＡＡＴ肝臓特異的なプロモーター配列番号１４、修飾ＨＢＢ２イントロン配列番号１７及び核酸分子配列番号２５を含む。得られたＡＡＶ８ベクターをＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏ１ＧＡＡベクターと呼ぶ。
アデノウイルスを含まない一過性トランスフェクション法（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、［３２］）を使用してＡＡＶ８ベクターを産生し、先に記載されるように精製した（Ａｙｕｓｏら、［３３］）。ＡＡＶベクターストックの力価は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの後にＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色及びバンドデンシトメトリーを行うことによって確認した。核酸構築物は、ＡＡＶベクター、特に２つのＩＴＲとｂＧＨポリＡとを含む発現カセット配列に挿入されていた。前記核酸構築物は、５’から３’に、ＡｐｏＥ制御領域配列番号１５、ｈＡＡＴ肝臓特異的なプロモーター配列番号１４、修飾ＨＢＢ２イントロン配列番号１７及び核酸分子配列番号２５を含む。得られたＡＡＶ８ベクターをＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏ１ＧＡＡベクターと呼ぶ。
【0133】
インビボ研究
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１５００８Ｄ）。
６～８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウスを、５匹のマウスからなる９つの群に分けた。０日目に、覚醒している拘束された動物に尾静脈注射を介して５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏ１ＧＡＡベクターを静脈内投与した。ＡＡＶ処置から２か月後、７つの薬理学的シャペロン分子又はそれらの組合せを、「３オン／４オフ」レジメン（連続３日間の処置と、その後の飲料水のみによる連続４日間）を４週間使用してマウスに経口投与した。この４週間の期間の終わりに、すべてのマウスを屠殺し、異なる臓器及び筋肉（肝臓、心臓、脳、脊髄、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋）を採取した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＰＢＳ（ＣＴＲＬ）又は５×１０１１ｖｇ／ｋｇの分泌型治療用ｈＧＡＡポリペプチドを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ－ＧＡＡ）のいずれかを注射した。
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１５００８Ｄ）。
６～８週齢のＣ５７Ｂｌ／６雄マウスを、５匹のマウスからなる９つの群に分けた。０日目に、覚醒している拘束された動物に尾静脈注射を介して５×１０１１ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８－ｓｐ７－Δ８－ｃｏ１ＧＡＡベクターを静脈内投与した。ＡＡＶ処置から２か月後、７つの薬理学的シャペロン分子又はそれらの組合せを、「３オン／４オフ」レジメン（連続３日間の処置と、その後の飲料水のみによる連続４日間）を４週間使用してマウスに経口投与した。この４週間の期間の終わりに、すべてのマウスを屠殺し、異なる臓器及び筋肉（肝臓、心臓、脳、脊髄、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋）を採取した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＰＢＳ（ＣＴＲＬ）又は５×１０１１ｖｇ／ｋｇの分泌型治療用ｈＧＡＡポリペプチドを発現するＡＡＶ８ベクター（ＡＡＶ－ＧＡＡ）のいずれかを注射した。
【0134】
ベクター注射から２ヶ月後、飲料水に溶解した１００ｍｇ／ｋｇ／日（ｄｉｅ）のドゥボグルスタット（ＤＮＪ、ＡＸ６１Ｑ１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタットと２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソールとの組合せ（ＤＮＪ－ＡＢＸ）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩（ＡＢＸ、Ａ９７９７、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、２ｍｇ／ｋｇ／日のボグリボース（ＶＯＧＬＩＢＯＳＥ、Ｓ４１０１、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）、２０ｍｇ／ｋｇ／日のアカルボース（ＡＣＡＲＢＯＳＥ、Ｓ１２７１、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）、２ｍｇ／ｋｇ／日のミグリトール（ＭＩＧＬＩＴＯＬ、Ｓ２５８９、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）又は４２００ｍｇ／ｋｇ／日のＮ－アセチル－システイン（ＮＡＣ、Ａ７２５０、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によりマウスを４週間処置した（図１）。１つの群には通常の飲料水（水）を与えた。
【0135】
ベクター注射から３か月後、マウスを屠殺し、血液及び組織中のヒトＧＡＡ（ｈＧＡＡ）のレベルをウエスタンブロットにより分析した。
【0136】
血漿採取
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって、ベクター注射から３か月後に採取した。
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって、ベクター注射から３か月後に採取した。
【0137】
組織採取
研究の最後（注射後３ヶ月）に、ＣＯ２吸入により動物を屠殺した。肝臓、心臓、脳、脊髄、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋を採取し、生化学的分析のために液体窒素で瞬間凍結した。凍結サンプルは処理まで－８０℃で保存した。
研究の最後（注射後３ヶ月）に、ＣＯ２吸入により動物を屠殺した。肝臓、心臓、脳、脊髄、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋を採取し、生化学的分析のために液体窒素で瞬間凍結した。凍結サンプルは処理まで－８０℃で保存した。
【0138】
ウエスタンブロット分析
屠殺時にマウス組織を採取し、ＰＢＳでホモジナイズした。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してタンパク質濃度を決定した。血漿及び組織サンプルを水で１：２０に希釈した（サンプルを１：２００に希釈した脳を除く）。ＳＤＳ－ｐａｇｅ電気泳動法を４～１２％勾配ポリアクリルアミドゲルで行った。転写後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ緩衝液（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）でブロッキングし、抗ヒトＧＡＡ抗体（ウサギモノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（ウサギポリクローナル抗体、ＰＡ１－９８８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とインキュベートした。膜を洗浄し、適切な二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）とインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（９２５－３２２１３、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で可視化した。組織へのＧＡＡの取込みを測定するために、抗ＧＡＡ抗体により可視化した７０ＫＤａバンド（成熟型）を定量化し、ローディングコントロールとして使用したＧＡＰＤＨの発現レベルに対して標準化した。
薬理学的シャペロン処置の開始前に低い血漿中ＧＡＡレベルを呈した動物は、分析から除いた。
屠殺時にマウス組織を採取し、ＰＢＳでホモジナイズした。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してタンパク質濃度を決定した。血漿及び組織サンプルを水で１：２０に希釈した（サンプルを１：２００に希釈した脳を除く）。ＳＤＳ－ｐａｇｅ電気泳動法を４～１２％勾配ポリアクリルアミドゲルで行った。転写後、膜をＯｄｙｓｓｅｙ緩衝液（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）でブロッキングし、抗ヒトＧＡＡ抗体（ウサギモノクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（ウサギポリクローナル抗体、ＰＡ１－９８８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とインキュベートした。膜を洗浄し、適切な二次抗体（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）とインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（９２５－３２２１３、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）で可視化した。組織へのＧＡＡの取込みを測定するために、抗ＧＡＡ抗体により可視化した７０ＫＤａバンド（成熟型）を定量化し、ローディングコントロールとして使用したＧＡＰＤＨの発現レベルに対して標準化した。
薬理学的シャペロン処置の開始前に低い血漿中ＧＡＡレベルを呈した動物は、分析から除いた。
【0139】
結果
ウエスタンブロットにより測定した、ＤＮＪ及びＮＡＣで処置したマウスにおける循環ｈＧＡＡのレベルの有意な増加を観察した（図２）。組織において、取込み後、肝臓により分泌された未成熟型のｈＧＡＡが取込まれ、タンパク質切断により７０ＫＤａ形態に修飾された。７０ＫＤａ形態（成熟型）は、ライソゾーム中での前駆体のタンパク質消化後にのみ得られる。したがって、この形態は細胞内にあり、その定量化により、組織への取込みが推定できる。組織中の成熟ライソゾームの形態のｈＧＡＡの定量化（ウエスタンブロットのバンド濃度の測定による）により、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸで処置したマウスの横隔膜、三頭筋、及び脊髄における酵素レベルの増加が示されたが、それはＤＮＪ処置群についてのみ三頭筋で有意性に達した（図３）。
ウエスタンブロットにより測定した、ＤＮＪ及びＮＡＣで処置したマウスにおける循環ｈＧＡＡのレベルの有意な増加を観察した（図２）。組織において、取込み後、肝臓により分泌された未成熟型のｈＧＡＡが取込まれ、タンパク質切断により７０ＫＤａ形態に修飾された。７０ＫＤａ形態（成熟型）は、ライソゾーム中での前駆体のタンパク質消化後にのみ得られる。したがって、この形態は細胞内にあり、その定量化により、組織への取込みが推定できる。組織中の成熟ライソゾームの形態のｈＧＡＡの定量化（ウエスタンブロットのバンド濃度の測定による）により、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸで処置したマウスの横隔膜、三頭筋、及び脊髄における酵素レベルの増加が示されたが、それはＤＮＪ処置群についてのみ三頭筋で有意性に達した（図３）。
【0140】
心臓、四頭筋、及び脳では差異は認められなかった。
【0141】
興味深いことに、ＤＮＪとＡＢＸとの組合せは、ＤＮＪのみ又は水を飲んだマウスにおいて測定されたレベルと比較して、脊髄中のｈＧＡＡレベルの大幅な増加に至った（図３）。これらのデータは、遺伝子治療の有効性を高めるためのＤＮＪとＡＢＸとの併用投与の相乗効果を裏付けている。
【0142】
実施例２：ＧＡＡ ＫＯ（ノックアウト又は欠損）マウスに関する研究
材料及び方法
ＡＡＶベクター産生
実施例１に上述したようにＡＡＶ８ベクターを産生した。
材料及び方法
ＡＡＶベクター産生
実施例１に上述したようにＡＡＶ８ベクターを産生した。
【0143】
インビボ研究
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１７－１１－Ｂ ＃１３６４３）。
３～４月齢のＧＡＡ欠損雄マウスを６つの群に分け、１つのコントロール群を野生型同腹仔で構成した。各群は、飲料水に溶解した薬の投与を容易にするために、最大２つのケージに８匹のマウスで構成した。
０日目から開始して、ＧＡＡ欠損（ＫＯ）マウス（マウス系統Ｂ６；１２９－Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ）に、飲料水に溶解した異なる薬理学的シャペロン（ＰＣ）と組合せて、尾静脈注射を介して１×１０１１ｖｇ／ｋｇでＡＡＶ－ｈＧＡＡを注射した。並行して、未処置のＧＡＡ野生型マウス及びＡＡＶ－ｈＧＡＡベクター又はＰＢＳを注射したＧＡＡ欠損マウスの２つの群をコントロールとして使用した。図４に示すように、ＰＣ分子は、連続３日間の処置と、その後の飲料水のみによる連続４日間とからなる「３日オン／４日オフ」レジメンを使用してマウスに経口投与した。マウスは、飲料水に溶解した１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタット（ＤＮＪ、ＡＸ６１Ｑ１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタットと２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩との組合せ（ＤＮＪ－ＡＢＸ）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩（ＡＢＸ、Ａ９７９７、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、４２００ｍｇ／ｋｇ／日のＮ－アセチル－システイン（ＮＡＣ、Ａ７２５０、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（図４）又は通常の飲料水を受ける。
循環ｈＧＡＡの活性及びレベルを２ヶ月の期間にわたってモニターした。マウスを屠殺し、異なる臓器及び筋肉（心臓、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋）を採取して、組織へのＧＡＡの取込み及びグリコーゲンクリアランスを測定した。
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１７－１１－Ｂ ＃１３６４３）。
３～４月齢のＧＡＡ欠損雄マウスを６つの群に分け、１つのコントロール群を野生型同腹仔で構成した。各群は、飲料水に溶解した薬の投与を容易にするために、最大２つのケージに８匹のマウスで構成した。
０日目から開始して、ＧＡＡ欠損（ＫＯ）マウス（マウス系統Ｂ６；１２９－Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ）に、飲料水に溶解した異なる薬理学的シャペロン（ＰＣ）と組合せて、尾静脈注射を介して１×１０１１ｖｇ／ｋｇでＡＡＶ－ｈＧＡＡを注射した。並行して、未処置のＧＡＡ野生型マウス及びＡＡＶ－ｈＧＡＡベクター又はＰＢＳを注射したＧＡＡ欠損マウスの２つの群をコントロールとして使用した。図４に示すように、ＰＣ分子は、連続３日間の処置と、その後の飲料水のみによる連続４日間とからなる「３日オン／４日オフ」レジメンを使用してマウスに経口投与した。マウスは、飲料水に溶解した１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタット（ＤＮＪ、ＡＸ６１Ｑ１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタットと２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩との組合せ（ＤＮＪ－ＡＢＸ）、２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩（ＡＢＸ、Ａ９７９７、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、４２００ｍｇ／ｋｇ／日のＮ－アセチル－システイン（ＮＡＣ、Ａ７２５０、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（図４）又は通常の飲料水を受ける。
循環ｈＧＡＡの活性及びレベルを２ヶ月の期間にわたってモニターした。マウスを屠殺し、異なる臓器及び筋肉（心臓、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋）を採取して、組織へのＧＡＡの取込み及びグリコーゲンクリアランスを測定した。
【0144】
血漿採取
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって採取した。
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって採取した。
【0145】
組織採取
研究の最後（注射後２ヶ月）に、ＣＯ２吸入により動物を屠殺した。心臓、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋を採取し、生化学的分析のために液体窒素で瞬間凍結した。凍結サンプルは処理まで－８０℃で保存した。
研究の最後（注射後２ヶ月）に、ＣＯ２吸入により動物を屠殺した。心臓、横隔膜、四頭筋、及び三頭筋を採取し、生化学的分析のために液体窒素で瞬間凍結した。凍結サンプルは処理まで－８０℃で保存した。
【0146】
ＧＡＡ活性の測定
ｐＨ４．３における４－メチル－ウンベリフェリル－α－ｄ－グルコシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）切断の測定により、血漿及び組織中のＧＡＡ活性を評価した。この目的のために、屠殺時に採取したマウス組織をＰＢＳでホモジナイズした。不溶性タンパク質を遠心分離により除去した。得られた溶解物のタンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。血漿及び組織サンプルを水で希釈し、各サンプル１０μＬを再構成した基質２０μＬと３７℃で１時間インキュベートした。反応を停止した後、放出された蛍光をＥＮ－ＳＰＩＲＥ（登録商標）蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により測定した。ＧＡＡ活性は、総タンパク質含有量又は血漿量に対して標準化した。
ｐＨ４．３における４－メチル－ウンベリフェリル－α－ｄ－グルコシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）切断の測定により、血漿及び組織中のＧＡＡ活性を評価した。この目的のために、屠殺時に採取したマウス組織をＰＢＳでホモジナイズした。不溶性タンパク質を遠心分離により除去した。得られた溶解物のタンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。血漿及び組織サンプルを水で希釈し、各サンプル１０μＬを再構成した基質２０μＬと３７℃で１時間インキュベートした。反応を停止した後、放出された蛍光をＥＮ－ＳＰＩＲＥ（登録商標）蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により測定した。ＧＡＡ活性は、総タンパク質含有量又は血漿量に対して標準化した。
【0147】
ウエスタンブロット分析
屠殺時にマウス組織を採取し、ＰＢＳでホモジナイズした。実施例１に記載した方法に従ってウエスタンブロット分析を行った。
屠殺時にマウス組織を採取し、ＰＢＳでホモジナイズした。実施例１に記載した方法に従ってウエスタンブロット分析を行った。
【0148】
グリコーゲン含有量の分析
グリコーゲン含有量を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）での完全消化後に放出されるグルコースとして、組織ホモジネートにおいて間接的に測定した。サンプルを９５℃で５分間インキュベートし、次に４℃で冷却した。次に、０．１Ｍ酢酸カリウムｐＨ５．５で１：５０に希釈した２５μｌのアミログルコシダーゼを各サンプルに添加した。アミログルコシダーゼなしのコントロール反応を各サンプルについて調製した。サンプル反応及びコントロール反応の両方を３７℃で９０分間インキュベートした。サンプルを９５℃で５分間インキュベートすることによって反応を停止させた。放出されたグルコースは、グルコースアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、得られる吸光度を５４０ｎｍでＥｎＳｐｉｒｅアルファプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）にて測定することによって決定した。
グリコーゲン含有量を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｎｉｇｅｒアミログルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）での完全消化後に放出されるグルコースとして、組織ホモジネートにおいて間接的に測定した。サンプルを９５℃で５分間インキュベートし、次に４℃で冷却した。次に、０．１Ｍ酢酸カリウムｐＨ５．５で１：５０に希釈した２５μｌのアミログルコシダーゼを各サンプルに添加した。アミログルコシダーゼなしのコントロール反応を各サンプルについて調製した。サンプル反応及びコントロール反応の両方を３７℃で９０分間インキュベートした。サンプルを９５℃で５分間インキュベートすることによって反応を停止させた。放出されたグルコースは、グルコースアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、得られる吸光度を５４０ｎｍでＥｎＳｐｉｒｅアルファプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）にて測定することによって決定した。
【0149】
結果
ウエスタンブロットにより測定した、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸの組合せで処置したマウスにおける循環ｈＧＡＡのレベルの有意な増加を観察した（図５）。これらの結果は、循環ＧＡＡ活性の結果と一致している（図６）。組織において、ＧＡＡ活性測定により、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸで処置したマウスの心臓、横隔膜、三頭筋、及び四頭筋で酵素活性の増加が示されたが、それは、ＤＮＪ及びＡＢＸの両方で処置したマウスの群においてのみ有意性に達した（図７Ａ～図７Ｄ）。ＡＢＸのみ又はＮＡＣを注射したマウスでは有意差は認められなかった。
ウエスタンブロットにより測定した、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸの組合せで処置したマウスにおける循環ｈＧＡＡのレベルの有意な増加を観察した（図５）。これらの結果は、循環ＧＡＡ活性の結果と一致している（図６）。組織において、ＧＡＡ活性測定により、ＤＮＪ及びＤＮＪ－ＡＢＸで処置したマウスの心臓、横隔膜、三頭筋、及び四頭筋で酵素活性の増加が示されたが、それは、ＤＮＪ及びＡＢＸの両方で処置したマウスの群においてのみ有意性に達した（図７Ａ～図７Ｄ）。ＡＢＸのみ又はＮＡＣを注射したマウスでは有意差は認められなかった。
【0150】
ＧＡＡ欠損マウスにおいて得られたこれらのデータは、野生型マウスにおいて以前に得られたデータを確定し、遺伝子治療の有効性を高めるためのＤＮＪとＡＢＸとの併用投与の相乗効果を裏付けている。
【0151】
ＧＡＡ活性により、組織、特に、グリコーゲンレベルが野生型マウスで観察されたのと酷似していた心臓において、グリコーゲン蓄積の減少が生じた（図８Ａ）。グリコーゲン含有量の部分的な標準化が他の組織において観察された（図８Ｂ－Ｄ）。ＤＮＪ－ＡＢＸで処置したマウスがＡＡＶのみで処置したマウスよりも低いグリコーゲンレベルを呈したとしても、その差は有意に達さなかった。
【0152】
実施例３：アルグルコシダーゼアルファ（ＥＲＴ）と組合せた薬理学的シャペロンの効果の研究
材料及び方法
材料及び方法
【0153】
インビボ研究
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１７－１１－Ｂ ＃１３６４３）。
３～４月齢のＧＡＡ欠損雄マウスを３つの群に分け、１つのコントロール群を野生型同腹仔で構成した。
－２日目から開始して、ＧＡＡ欠損（ＫＯ）マウスの１つの群（マウス系統Ｂ６；１２９－Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ）は、図９に示すように、飲料水に溶解した薬理学的シャペロン（ＰＣ）処置を受けた。マウスは、１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタット（ＤＮＪ、ＡＸ６１Ｑ１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩（ＡＢＸ、Ａ９７９７、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との組合せを受けた。並行して、ＧＡＡ野生型マウス及びＧＡＡ欠損マウスの２つの群を、通常の飲料水を与えるコントロールとして使用した。０日目に、ＰＣで処置したＧＡＡ欠損マウス及びＧＡＡ欠損マウスの１つのコントロール群に、尾静脈注射を介して２０ｍｇ／ｋｇでアルグルコシダーゼアルファ（ＥＲＴ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を注射した。循環ＧＡＡの活性及びレベルをＥＲＴの３時間後にモニターした。
標準的な動物の管理及び飼育は、国のガイドラインに従った。動物実験は、欧州指令２０１０／６３／ＥＵに従って、ＣＥＲＦＥの倫理委員会によって承認された（承認番号：２０１７－１１－Ｂ ＃１３６４３）。
３～４月齢のＧＡＡ欠損雄マウスを３つの群に分け、１つのコントロール群を野生型同腹仔で構成した。
－２日目から開始して、ＧＡＡ欠損（ＫＯ）マウスの１つの群（マウス系統Ｂ６；１２９－Ｇａａｔｍ１Ｒａｂｎ／Ｊ）は、図９に示すように、飲料水に溶解した薬理学的シャペロン（ＰＣ）処置を受けた。マウスは、１００ｍｇ／ｋｇ／日のドゥボグルスタット（ＤＮＪ、ＡＸ６１Ｑ１、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と２５ｍｇ／ｋｇ／日のアンブロキソール塩酸塩（ＡＢＸ、Ａ９７９７、Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との組合せを受けた。並行して、ＧＡＡ野生型マウス及びＧＡＡ欠損マウスの２つの群を、通常の飲料水を与えるコントロールとして使用した。０日目に、ＰＣで処置したＧＡＡ欠損マウス及びＧＡＡ欠損マウスの１つのコントロール群に、尾静脈注射を介して２０ｍｇ／ｋｇでアルグルコシダーゼアルファ（ＥＲＴ、Ｍｙｏｚｙｍｅ、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を注射した。循環ＧＡＡの活性及びレベルをＥＲＴの３時間後にモニターした。
【0154】
血漿採取
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって採取した。
血液サンプルは、ヘパリン処置した毛細管チューブへの後眼窩からの採血の後に血漿分離を行うことによって採取した。
【0155】
ＧＡＡ活性の測定
ｐＨ４．３における４－メチル－ウンベリフェリル－α－ｄ－グルコシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）切断の測定により、血漿及び組織中のＧＡＡ活性を評価した。この目的のために、屠殺時に採取したマウス組織をＰＢＳでホモジナイズした。不溶性タンパク質を遠心分離により除去した。得られた溶解物のタンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。血漿及び組織サンプルを水で希釈し、各サンプル１０μＬを再構成した基質２０μＬと３７℃で１時間インキュベートした。反応を停止した後、放出された蛍光をＥＮ－ＳＰＩＲＥ（登録商標）蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により測定した。ＧＡＡ活性は、総タンパク質含有量又は血漿量に対して標準化した。
ｐＨ４．３における４－メチル－ウンベリフェリル－α－ｄ－グルコシド（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）切断の測定により、血漿及び組織中のＧＡＡ活性を評価した。この目的のために、屠殺時に採取したマウス組織をＰＢＳでホモジナイズした。不溶性タンパク質を遠心分離により除去した。得られた溶解物のタンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により定量化した。血漿及び組織サンプルを水で希釈し、各サンプル１０μＬを再構成した基質２０μＬと３７℃で１時間インキュベートした。反応を停止した後、放出された蛍光をＥＮ－ＳＰＩＲＥ（登録商標）蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）により測定した。ＧＡＡ活性は、総タンパク質含有量又は血漿量に対して標準化した。
【0156】
ウエスタンブロット分析
実施例１に記載した方法に従ってウエスタンブロット分析を行った。
実施例１に記載した方法に従ってウエスタンブロット分析を行った。
【0157】
結果
組換えｈＧＡＡ（ＥＲＴ）の半減期は比較的短い。このため、レベル及び活性の測定は、注入の３時間後に行った。ＥＲＴのみで処置したマウスと比較して、ＤＮＪ－ＡＢＸの組合せで同時処置したマウスでは循環ＧＡＡレベル及び活性の増加を観察した（図１０）。
これらのデータは、ＧＡＡのバイオアベイラビリティを高めるためのＤＮＪとＡＢＸとの併用投与の相乗効果を裏付けている。さらに、本発明のシャペロンが、アルグルコシダーゼアルファによる処置等の従来のＥＲＴの処置有効性を高めるのに有用であることを証明している。
組換えｈＧＡＡ（ＥＲＴ）の半減期は比較的短い。このため、レベル及び活性の測定は、注入の３時間後に行った。ＥＲＴのみで処置したマウスと比較して、ＤＮＪ－ＡＢＸの組合せで同時処置したマウスでは循環ＧＡＡレベル及び活性の増加を観察した（図１０）。
これらのデータは、ＧＡＡのバイオアベイラビリティを高めるためのＤＮＪとＡＢＸとの併用投与の相乗効果を裏付けている。さらに、本発明のシャペロンが、アルグルコシダーゼアルファによる処置等の従来のＥＲＴの処置有効性を高めるのに有用であることを証明している。
【0158】
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【0159】
配列表
【表2-1】
【0160】
【表2-2】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】