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特表2022-540716プローブの組合せを用いたゲノム配列の検出、プローブ分子、および生物の特異的検出用のプローブを含むアレイ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-16
(54)【発明の名称】プローブの組合せを用いたゲノム配列の検出、プローブ分子、および生物の特異的検出用のプローブを含むアレイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6837 20180101AFI20220909BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220909BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20220909BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220909BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20220909BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6837 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6813 Z
C12N15/09 Z
C12N15/09 200
C12Q1/689 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503578
(86)(22)【出願日】2020-07-17
(85)【翻訳文提出日】2022-03-18
(86)【国際出願番号】 EP2020070308
(87)【国際公開番号】W WO2021013736
(87)【国際公開日】2021-01-28
(31)【優先権主張番号】62/876,413
(32)【優先日】2019-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/004,664
(32)【優先日】2020-04-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518213606
【氏名又は名称】セイフガード バイオシステムズ ホールディングズ リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｓａｆｅｇｕａｒｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｑｕａｄｒａｎｔ Ｈｏｕｓｅ， Ｆｌｏｏｒ ６， ４ Ｔｈｏｍａｓ Ｍｏｒｅ Ｓｑｕａｒｅ， Ｌｏｎｄｏｎ Ｅ１Ｗ １ＹＷ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】100114890
【弁理士】
【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト
(74)【代理人】
【識別番号】100098501
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 拓
(74)【代理人】
【識別番号】100116403
【弁理士】
【氏名又は名称】前川 純一
(74)【代理人】
【識別番号】100134315
【弁理士】
【氏名又は名称】永島 秀郎
(74)【代理人】
【識別番号】100162880
【弁理士】
【氏名又は名称】上島 類
(72)【発明者】
【氏名】ホルガー クラップロート
(72)【発明者】
【氏名】ソーニャ ベトナー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR39
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR84
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
異なる生物由来のゲノム配列に異なる結合をするプローブの組合せを利用して、サンプル中に存在し得る相同ゲノム配列を同定する方法、相同ゲノム配列を識別するためのアレイ、相同ゲノム配列を識別するためのシステム、ならびにその方法、アレイおよびシステムに有用な細菌結合プローブ分子。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、前記プローブ分子が前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、前記第１のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸および前記第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸への前記プローブ分子のハイブリダイズにより、前記第１のゲノムに対応する前記標的核酸と前記第２のゲノムに対応する前記標的核酸とを区別することができる、仮想プローブで試験サンプルをプローブすることと、（ｂ）前記仮想プローブ中の前記プローブ分子と、もしあれば、前記試験サンプル中の核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを検出および／または定量化し、それにより、第１の生物または第２の生物が、前記試験サンプルまたは初期サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは前記試験サンプルを調製した初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
【請求項2】
前記第１のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、前記第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、前記仮想プローブ中の各プローブ分子が、前記第１のアンプリコンセットおよび／または前記第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、前記プローブ分子が前記第１のアンプリコンセットの前記アンプリコンおよび前記第２のアンプリコンセットの前記アンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって、前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットの前記アンプリコンへの前記プローブ分子のハイブリダイズにより、前記第１のアンプリコンセットと前記第２のアンプリコンセットとを区別することができる、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記第１のゲノムおよび前記第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて前記初期サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行い、前記第１のゲノムおよび第２のゲノムが前記初期サンプル中に存在する場合に前記第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、前記試験サンプルを調製することをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項4】
前記ＰＣＲプライマーが２つ以上のプライマー対を含み、前記第１のアンプリコンセットが複数の第１のアンプリコンを含み、かつ／または前記第２のアンプリコンセットが複数の第２のアンプリコンを含む、請求項３記載の方法。
【請求項5】
前記複数の第１のアンプリコンが前記第１のゲノム中の異なる領域に対応し、かつ／または前記複数の第２のアンプリコンが前記第２のゲノム中の異なる領域に対応する、請求項４記載の方法。
【請求項6】
前記ＰＣＲプライマーが単一のプライマー対を含み、前記第１のアンプリコンセットが単一の第１のアンプリコンからなり、前記第２のアンプリコンセットが単一の第２のアンプリコンからなる、請求項３記載の方法。
【請求項7】
前記仮想プローブの前記プローブ分子が、アレイ上に存在する、それぞれが前記アレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子である、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項9】
前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
前記第１の生物および第２の生物が微生物である、請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項11】
前記微生物が同じ目、科、属または群のメンバーである、請求項１０記載の方法。
【請求項12】
前記微生物が細菌である、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項13】
前記第１の生物および第２の生物が細菌であり、前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項14】
前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項16】
前記第１のアンプリコンセットおよび前記第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１３から１５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項17】
（ａ）前記第１の微生物がコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種であり、かつ前記第２の微生物がコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種であるか、（ｂ）前記第１の微生物がストレプトコッカス・ゴルドニイであり、かつ前記第２の微生物がストレプトコッカス・アンギノーサスであるか、または
（ｃ）前記第１の微生物がストレプトコッカス・ミティスであり、かつ前記第２の微生物がストレプトコッカス・ニューモニエである、請求項１２から１６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項18】
（ａ）第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、前記１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、前記第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、仮想プローブと、（ｂ）任意に、１つ以上の対照プローブ分子と
を含む、アドレス可能なアレイ。
【請求項19】
少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）またはＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むプローブ分子を含む、請求項１８記載のアドレス可能なアレイ。
【請求項20】
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、前記プローブ分子が前記第１および第２のゲノムに対応する前記標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、前記第１のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸および前記第２のゲノムに対応する前記１つ以上の標的核酸への前記プローブ分子のハイブリダイズにより、前記第１のゲノムに対応する前記標的核酸と前記第２のゲノムに対応する前記標的核酸とを区別することができる、請求項１８または１９記載のアレイで試験サンプルをプローブすることと、（ｂ）非結合核酸分子を前記アレイから洗い流すことと、
（ｃ）前記アレイ上の各プローブ分子位置でのシグナルを検出および／または定量化することと、
（ｄ）前記シグナルが、
（ｉ）前記アレイの前記プローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が前記試験サンプル中に存在することを示す場合、前記シグナルを分析して、前記第１のゲノムに対応する標的核酸もしくは前記第２のゲノムに対応する標的核酸が前記サンプル中に存在するかを決定し、それにより、前記第１の生物もしくは第２の生物が初期サンプルもしくは前記試験サンプル中に存在するかを決定すること、または
（ｉｉ）前記仮想プローブの前記プローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）において生成しないことを示す場合、その初期サンプルもしくは試験サンプルが前記第１の生物もしくは前記第２の生物を含有しないと決定し、それにより、前記第１の生物もしくは第２の生物が前記初期サンプルもしくは前記試験サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは前記試験サンプルが由来する初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
【請求項21】
（ａ）請求項１８または１９記載のアレイの各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）前記光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブについて前記シグナルデータを分析するように構成され、かつ
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサと
を備える、生物がサンプル中に存在するかを決定するためのシステム。
【請求項22】
ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）またはＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
【請求項23】
（ａ）仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有し、かつ前記仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有するか、（ｂ）前記仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有し、かつ前記仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有するか、または
（ｃ）前記仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有し、前記仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有し、かつ前記仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、
複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブ。
【請求項24】
それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子の群を含むアドレス可能なアレイであって、前記プローブ分子の群が請求項２２記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、アレイ。
【請求項25】
請求項２３記載の仮想プローブを含むアドレス可能なアレイであって、前記仮想プローブ中の各プローブ分子が前記アレイ上の別々の位置にある、アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願の相互参照
本願は、２０１９年７月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／８７６，４１３号明細書および２０２０年４月３日に出願された米国特許仮出願第６３／００４，６６４号明細書の優先権の利益を主張し、それらの内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。
本願は、２０１９年７月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／８７６，４１３号明細書および２０２０年４月３日に出願された米国特許仮出願第６３／００４，６６４号明細書の優先権の利益を主張し、それらの内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。
【0002】
２．配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に援用するものとする。２０２０年７月１４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＳＧＢ－００６ＷＯ＿ＳＴ２５という名前であり、１５８１バイトのサイズである。
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に援用するものとする。２０２０年７月１４日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＳＧＢ－００６ＷＯ＿ＳＴ２５という名前であり、１５８１バイトのサイズである。
【0003】
３．背景
感染性病原体の特定は、個体の適切な診断および治療方針を決定する上で重要であることが多い。感染因子の誤認は、不適切または非効果的な治療方針につながる恐れがある。シークエンシング技術の改善により、多数の病原菌のゲノムの一部または全体の配列が決定されている。近縁の細菌種は、非常に高度の配列同一性を有するゲノム配列を含むことが多い。近縁種の区別には、２つ以上の相同ゲノム配列の違いを検出する高感度の正確な方法が必要とされる。単一のオリゴヌクレオチドプローブ分子を用いた相同ゲノム配列の区別は、不可能ではないにせよ、場合によっては実際的でないことがある。
感染性病原体の特定は、個体の適切な診断および治療方針を決定する上で重要であることが多い。感染因子の誤認は、不適切または非効果的な治療方針につながる恐れがある。シークエンシング技術の改善により、多数の病原菌のゲノムの一部または全体の配列が決定されている。近縁の細菌種は、非常に高度の配列同一性を有するゲノム配列を含むことが多い。近縁種の区別には、２つ以上の相同ゲノム配列の違いを検出する高感度の正確な方法が必要とされる。単一のオリゴヌクレオチドプローブ分子を用いた相同ゲノム配列の区別は、不可能ではないにせよ、場合によっては実際的でないことがある。
【0004】
このため、微生物の近縁種を区別する新たな方法が必要とされる。
【0005】
４．発明の概要
本開示は、サンプル中に存在し得るゲノム配列を特定し、かつ／または相同ゲノム配列を区別する方法を提供する。この方法は、微生物の近縁種に由来する相同ゲノム配列を個別に区別することはできないが、集合的に区別することができ、また、サンプル中に存在する可能性が高いゲノム配列を特定し得るプローブ分子の組合せを利用するものである。このようなプローブ分子の組合せを本明細書では便宜上、「仮想プローブ」と称する。
本開示は、サンプル中に存在し得るゲノム配列を特定し、かつ／または相同ゲノム配列を区別する方法を提供する。この方法は、微生物の近縁種に由来する相同ゲノム配列を個別に区別することはできないが、集合的に区別することができ、また、サンプル中に存在する可能性が高いゲノム配列を特定し得るプローブ分子の組合せを利用するものである。このようなプローブ分子の組合せを本明細書では便宜上、「仮想プローブ」と称する。
【0006】
仮想プローブは、複数（例えば２つ、３つまたは４つ以上）の個々のプローブ分子を含み得る。ゲノムＤＮＡ（またはゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物）と個々のプローブ分子とのハイブリダイゼーションは、特にゲノムＤＮＡを増幅するために関連種における保存配列を標的とするユニバーサルプライマーを使用する場合、シークエンシングがなければ、ゲノムＤＮＡと、同じサンプル中に存在する可能性がある遺伝的に関連する種の相同ゲノムＤＮＡとを識別するには十分でない可能性がある。しかしながら、ゲノムＤＮＡまたは対応するＰＣＲアンプリコンを、２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブでプローブする場合、仮想プローブに対するハイブリダイゼーションパターンの違いにより、２つの関連種に由来するゲノムＤＮＡまたはそれから増幅された相同アンプリコンを識別することができる。
【0007】
したがって、複数のプローブ分子（例えば、区別可能なシグナルを有するプローブ分子）を含むことにより、本開示の仮想プローブは、組み合わせて、ゲノム配列と相同ゲノム配列（またはそれから調製されたアンプリコン）とを区別し、生体サンプル中に存在する微生物種を特定することができる。例えば、本開示の方法に従い、２つまたは３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子の組合せは、組み合わせて、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）等の関連種に由来するアンプリコンを区別する仮想プローブを形成することができる。このため、サンプルを、例えばＰＣＲ反応において鋳型ＤＮＡの供給源として使用する場合、得られる任意のＰＣＲ産物と仮想プローブとのハイブリダイゼーションにより、２つの種のいずれがサンプル中に存在するかを決定することができる。
【0008】
本明細書に開示される仮想プローブを用いて相同ゲノム配列を特定する方法は、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来する配列を用いて設計された種特異的オリゴヌクレオチドプローブ分子が異なる種間で交差反応性を示すことが認識された後に開発された。ゲノムのこの領域の配列間の多様性が小さいことから、種特異的プローブ分子を設計することができなかった。しかしながら、それにもかかわらず、単独では個別に異なる種を区別することができない複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を組み合わせた仮想プローブとのハイブリダイゼーションによるシグナルを分析することによって異なる種を区別し得ることが発見された。
【0009】
一態様では、本開示は、第１の生物（または対応する第１のゲノム）および／または第２の生物（または対応する第２のゲノム）がサンプル中に存在するかを決定する方法を提供する。
【0010】
かかる方法は、第１の生物および第２の生物に対する仮想プローブでサンプルをプローブし、第１のゲノムまたは第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸の有無を決定することを含み得る。標的核酸は、例えばゲノム断片またはＰＣＲ等のＤＮＡ増幅反応において生成するアンプリコンであり得る。仮想プローブは、それぞれが第１のゲノムに対応する標的核酸の１つ以上および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な２つ以上のプローブ分子を含む。プローブ分子が第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に異なってハイブリダイズするため、仮想プローブは、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる。
【0011】
例示的な方法は、以下の工程を含む：
（ａ）サンプル中に存在する場合に第１および第２のゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能な１対以上のＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を行う工程。プライマーの各セットは、好ましくはサンプル中に存在する可能性がある各生物に特有のアンプリコンセットを生じさせる。このため、増幅により、第１のゲノムが存在する場合に第１のアンプリコンセットが生じ、第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に第２の異なるアンプリコンセットが生じる。ＰＣＲプライマーが１対のみ使用される場合、各アンプリコンセットは、単一のアンプリコンのみを含み、複数のＰＣＲプライマー対が使用される場合、アンプリコンセットは、２つ以上のアンプリコン（例えば、複数の単一のアンプリコン）を含み得る。
（ｂ）工程（ａ）に続いて、得られる任意のＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を決定する工程。仮想プローブが、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットに異なった形で特異的にハイブリダイズすることが可能な２つ以上のプローブ分子（例えば、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含むため、仮想プローブは、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。各仮想プローブ内のプローブ分子は、異なる標識（例えば、蛍光標識、例えば異なる蛍光標識で標識された分子ビーコン）を有するか、またはアレイ上の別々の位置に配置されるために区別することができる。
（ａ）サンプル中に存在する場合に第１および第２のゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能な１対以上のＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応を行う工程。プライマーの各セットは、好ましくはサンプル中に存在する可能性がある各生物に特有のアンプリコンセットを生じさせる。このため、増幅により、第１のゲノムが存在する場合に第１のアンプリコンセットが生じ、第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に第２の異なるアンプリコンセットが生じる。ＰＣＲプライマーが１対のみ使用される場合、各アンプリコンセットは、単一のアンプリコンのみを含み、複数のＰＣＲプライマー対が使用される場合、アンプリコンセットは、２つ以上のアンプリコン（例えば、複数の単一のアンプリコン）を含み得る。
（ｂ）工程（ａ）に続いて、得られる任意のＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を決定する工程。仮想プローブが、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットに異なった形で特異的にハイブリダイズすることが可能な２つ以上のプローブ分子（例えば、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含むため、仮想プローブは、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。各仮想プローブ内のプローブ分子は、異なる標識（例えば、蛍光標識、例えば異なる蛍光標識で標識された分子ビーコン）を有するか、またはアレイ上の別々の位置に配置されるために区別することができる。
【0012】
したがって、ＰＣＲ反応のＰＣＲ増幅産物と仮想プローブとのハイブリダイゼーションによって、第１および第２のゲノムを区別し、それによりサンプルにおける第１および／または第２の生物の存在を特定することができる。本明細書で使用される場合、サンプルにおける生物の存在への言及は、サンプルが生きた生物を有していたことを意味するのではなく、検出されるか、またはＰＣＲ反応等の増幅反応の鋳型となるのに十分な、生物に由来するゲノムＤＮＡがサンプル中に存在していたことを単に意味する。同様に、サンプルにおけるゲノムの存在への言及は、サンプルが無傷のゲノムを有していたことを意味するのではなく、検出されるか、またはＰＣＲ反応等の増幅反応の鋳型となるのに十分な、ゲノムに由来するＤＮＡがサンプル中に存在していたことを単に意味する。
【0013】
第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットは、例えばＰＣＲ増幅反応においてプライマーの単一セットを使用する場合、それぞれ１つのアンプリコン（それぞれ「第１のアンプリコン」および「第２のアンプリコン」と称される）を含み得る。代替的には、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットは、例えばＰＣＲ増幅反応において２セット以上のプライマーを使用する場合、２つ以上のアンプリコン（「第１のアンプリコン」と称される第１のアンプリコンセットの各アンプリコンおよび「第２のアンプリコン」と称される第２のアンプリコンセットの各アンプリコン）を含み得る。相同ゲノム配列に由来する相同アンプリコンを区別するための更なる例示的な方法は、以下のセクション６．２、ならびに番号付き実施形態１～８６、実施形態１３０～１３２および実施形態１３５に記載される。
【0014】
本開示は、相同ゲノム配列を区別するためのアレイ、相同ゲノム配列を区別するためのシステム、ならびに例えば本開示の方法、アレイおよびシステムにおいて有用なオリゴヌクレオチドプローブ分子をさらに提供する。
【0015】
一態様では、本開示は、第１のゲノムに由来する第１のゲノム配列と第２のゲノムに由来する第２の相同ゲノム配列とを区別するためのアドレス可能なアレイを提供する。本開示のアドレス可能なアレイは、例えば本明細書に記載される方法において使用することができる。本開示のアドレス可能なアレイは、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み得るが、オリゴヌクレオチドプローブ分子の群の各プローブ分子は、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む。アドレス可能なアレイは、任意に１つ以上の対照プローブ分子をさらに含んでいてもよい。
【0016】
本開示の例示的なアドレス可能なアレイは、以下のセクション６．３、ならびに番号付き実施形態８７～１２９および実施形態１５３～１５５に記載される。
【0017】
別の態様では、本開示は、サンプル中に存在する場合に第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するためのシステムを提供する。例示的なシステムは、
（ａ）本開示のアレイの各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブ（例えば、本明細書に記載されるような特徴を有する仮想プローブ）についてシグナルデータを分析するように構成され、かつ
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサと
を備え得る。
（ａ）本開示のアレイの各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブ（例えば、本明細書に記載されるような特徴を有する仮想プローブ）についてシグナルデータを分析するように構成され、かつ
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサと
を備え得る。
【0018】
例示的なシステムは、以下のセクション６．４、ならびに番号付き実施形態１３３および実施形態１３４に記載される。
【0019】
別の態様では、本開示は、仮想プローブへの使用に適した例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子、およびかかるオリゴヌクレオチドプローブ分子を２つ以上含むキットを提供する。本開示のオリゴヌクレオチドプローブ分子は、本開示のアドレス可能なアレイ上に含まれ、かつ／または本開示の方法に使用され得る。例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子および仮想プローブは、以下のセクション６．２．４および番号付き実施形態１３６～１５２に記載される。例示的なキットは、以下のセクション６．５および番号付き実施形態１５６～１６７に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＧｅｎＢａｎｋから入手した幾つかのスタフィロコッカス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から作成した樹状図（図１Ａおよび図１Ｂに分けられる）である。ＣＬＣ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを用いてツリーを構築し、ブートストラップ分析によってデータの信頼性を示した。スタフィロコッカス群の各種を、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって示される２つの配列を用いて表す。ツリーの各ノードのブートストラップ値（整数）は、反復試験間のデータの信頼性のパーセンテージを定義するものである。ブートストラップ値が高いほど、それぞれの分類群のデータがより支持される。それぞれの種の横線は、ブランチと呼ばれ、その種における遺伝子変化の量を表す。ブランチの長さの単位は、配列の長さで除算した変化または置換の数として示される。
【図2】１６ｓ ｒＲＮＡおよび１６ｓ－２３ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の多重アラインメントから作成されたストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridians）群の種の樹状図（図２Ａおよび図２Ｂに分けられる）である。Ｉ－ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）群、ＩＩ－ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）群、ＩＩＩ－ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）群、ＩＶ－ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）群、およびＶ－ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）群。数字は、データセットの信頼性のパーセンテージを示すブートストラップ値を表す。アラインメントパターンおよびそれらの病因的重要性に応じて、種をＩ、ＩＩおよびＩＩＩの３つの群として扱う。
【図3】１６Ｓ ｒＲＮＡおよび１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳゲノム配列、ならびに１６Ｓフォワード（１６Ｓ Ｆｗ）、１６Ｓリバース（１６Ｓ Ｒｖ）、ＩＴＳフォワード（ＩＴＳ Ｆｗ）およびＩＴＳリバース（ＩＴＳ Ｒｖ）プライマーの図である。
【図4】非伸長プライマー（対称ＰＣＲプロセスに使用される従来のプライマーであり得る）と、標的核酸に相補的な「Ａ」領域、「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復または逆方向反復を含む「Ｂ」領域、ならびにスペーサー配列および／または制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一部もしくは全体を含み得る任意の「Ｃ」領域から構成される伸長プライマーとを含む、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ法に有用なプライマー対を示す図である。
【図5A】「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子間ハイブリダイゼーションを示す図である。「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近くにあるのが好ましい。
【図5B】「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子間ハイブリダイゼーションを示す図である。「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近くにあるのが好ましい。
【図5C】「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復を含む場合に生じる伸長プライマーの分子内ハイブリダイゼーションを示す図である。「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性領域は、「Ａ」領域の５’末端またはその近くにあるのが好ましい。
【図6】セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応における変性工程を示す図である。変性工程では、ＰＣＲ反応混合物（通例、標的核酸を含有するか、または含有するリスクがある生体サンプル、非対称プライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ試薬を含む）を標的核酸の融点を超えるまで加熱し、標的核酸（存在する場合）および非対称プライマー対の伸長プライマーの変性を引き起こして、一本鎖を形成する。
【図7】非伸長プライマーの融解温度未満で生じる、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的増幅期のアニーリング工程を示す図である。非対称プライマー対の非伸長プライマーおよび伸長プライマーの両方が、それらのそれぞれの相補鎖にハイブリダイズする。図７には、ＰＣＲの初回サイクルにおいて生じる標的ＤＮＡへのアニーリング（ハイブリダイゼーションまたは結合とも称される）を示すが、その後のサイクルでは、プライマーとＰＣＲ産物中の相補配列との間でアニーリングが生じる可能性が高い。伸長プライマー内の「Ｂ」領域および任意の「Ｃ」領域のために、ＰＣＲ産物は、図８Ｂおよび図９に示されるように、これらの配列またはそれらの相補体を有する。
【図8A】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として用いてプライマーＤＮＡを伸長させる、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的増幅期の伸長工程を示す図である。伸長領域を破線で示す。鋳型は標的ＤＮＡの鎖である。
【図8B】耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡを鋳型として用いてプライマーＤＮＡを伸長させる、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の指数関数的増幅期の伸長工程を示す図である。伸長領域を破線で示す。鋳型は、非対称プライマー対および標的ＤＮＡを用いて生成したＰＣＲ産物の鎖である。
【図9】ＰＣＲ産物鎖２を鋳型として用いた、非伸長プライマーの融解温度超かつ伸長プライマーの融解温度未満で生じる、セクション６．２．３．４に記載される非対称ＰＣＲ反応の線形増幅期の同時のアニーリングおよび伸長工程を示す図である。これによりＰＣＲ産物鎖２の非対称増幅が生じ、ＰＣＲ反応の終了時までにＰＣＲ産物鎖１分子に対して過剰なＰＣＲ産物鎖２分子が得られる。
【図10A】コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス（ＣＮＳ）に対する仮想プローブにおいて２つのプローブ分子がどのように用いられ得るかを示す図である。ＰＣＲ増幅産物と２つのプローブ分子とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、ブール演算子を用いて組み合わせ、ＣＮＳがサンプル中に存在するかを決定することができる。
【図10B】コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス（ＣＮＳ）に対する仮想プローブにおいて３つのプローブ分子がどのように用いられ得るかを示す図である。ＰＣＲ増幅産物と３つのプローブ分子とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、ブール演算子を用いて組み合わせ、ＣＮＳがサンプル中に存在するかを決定することができる。
【図11A】ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナルを示す図である。
【図11B】ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナルを示す図である。
【図12】ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）に由来するＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す図である。
【図13】サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）およびエシェリキア・コリ（Escherichia coli）に由来するＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す図である。
【図14】クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）およびクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）に由来するＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す図である。
【図15】エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）に由来するＰＣＲアンプリコンに結合した場合の様々なオリゴヌクレオチドプローブ分子のシグナル強度を示す図である。
【0021】
６．詳細な説明
６．１．定義
アンプリコン：アンプリコンは、ＰＣＲ増幅反応によって生成する核酸分子である。
６．１．定義
アンプリコン：アンプリコンは、ＰＣＲ増幅反応によって生成する核酸分子である。
【0022】
非対称プライマー対：伸長プライマーと非伸長プライマーとからなるプライマー対。
【0023】
対応する：配列同一性を有するか、または相補的な異なる長さの２つの核酸鎖に関して、「対応する」という用語は、文脈により指示されるような両方の鎖に存在する配列の重複または相補性の領域を指す。
【0024】
直接反復：伸長プライマーの「Ｂ」領域との関連で、「直接反復」は、「Ａ」領域の一部に対して直接相補体である（すなわち、同じ５’から３’の順序で相補配列を有する）ヌクレオチド配列を意味する。
【0025】
伸長プライマー：（ａ）標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性または標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列相補性を有する、その３’末端の「Ａ」領域；（ｂ）「Ａ」領域の少なくとも一部と相補的な配列を含む、その５’末端の「Ｂ」領域；および（ｃ）「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間に位置する任意の「Ｃ」領域を有するＰＣＲプライマー。
【0026】
相同ゲノム配列：相同ゲノム配列は、共通の祖先を有するが、ヌクレオチド配列が同一でない異なる種または株に見られるゲノム配列である。例示的な相同ゲノム配列としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子および１６Ｓ－２３Ｓ内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ）配列が挙げられる。
【0027】
逆方向反復：伸長プライマーの「Ｂ」領域との関連で、「逆方向反復」は、「Ａ」領域の一部に対して逆相補体である（すなわち、逆の５’から３’の順序で相補配列を有する）ヌクレオチド配列を意味する。
【0028】
融解温度（Ｔｍ）：ＤＮＡ二重鎖の半分が解離して一本鎖となる温度。デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構成される線状プライマーのＴｍは、一般に「パーセントＧＣ」法（PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications, Innis et al. eds., Academic Press (San Diego, Calif. (USA)) 1990）または「２（Ａ＋Ｔ）プラス４（Ｇ＋Ｃ）」法（Wallace et al., 1979, Nucleic Acids Res. 6 (11): 3543-3557）または「最近傍」法（Santa Lucia, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1460-1465；Allawi and Santa Lucia, 1997, Biochem. 36: 10581-10594）によって算出されている。特許請求の範囲の目的上、ＤＮＡのＴｍは「最近傍」法に従って算出され、非自然発生塩基（例えば、２－デオキシイノシン）はアデニンとして扱われる。
【0029】
ＰＣＲ産物鎖１：ＰＣＲ産物鎖１は、非対称プライマー対の非伸長プライマーに相補的な、標的核酸および非対称プライマー対から生成した二本鎖ＰＣＲ産物中の鎖を指す。
【0030】
ＰＣＲ産物鎖２：ＰＣＲ産物鎖１は、非対称プライマー対の伸長プライマーに相補的な、標的核酸および非対称プライマー対から生成した二本鎖ＰＣＲ産物中の鎖を指す。
【0031】
ＰＣＲ試薬：文脈上他の指示がない限り、「ＰＣＲ試薬」という用語は、鋳型核酸、耐熱性ポリメラーゼおよびプライマー以外のＰＣＲ反応の構成要素を指す。ＰＣＲ試薬は通例、ｄＮＴＰ（非標識ｄＮＴＰに加えて標識、例えば蛍光標識ｄＮＴＰを含んでいてもよい）、バッファー、および二価カチオンを有する塩（例えば、ＭｇＣｌ２）を含む。
【0032】
プライマー：その３’末端に遊離ヒドロキシル基を有する、少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチド。プライマーは、自然発生および非自然発生ヌクレオチド（例えば３－ニトロピロール、５－ニトロインドールまたは２－デオキシイノシン等のユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、２－デオキシイノシンが好ましい）を含み得る。文脈上他の指示がない限り、「プライマー」という用語は、混合塩基がプライマー設計および構築に含まれ、プライマー分子が標的核酸分子中の変異体配列にハイブリダイズすることを可能とする場合に生じるプライマー分子の混合物も指す。標的配列変異体は、種間または種内変異体であり得る。混合塩基の標準命名法を表１に示す：
好ましくは、各プライマーは、標的核酸に対する相補性の領域に３つ以下の混合塩基を含む。幾つかの実施形態では、プライマーは、標的核酸に対する相補性の領域に０、１つ、２つまたは３つの混合塩基を含む。
【表1】
【0033】
プライマー対：５０００塩基対未満の領域内で同じ核酸分子の異なる鎖にハイブリダイズするとともに、そこからＤＮＡ重合反応を開始することが可能なフォワードおよびリバースプライマー対（それぞれ標的配列の考え得る変動に相当する配列変動を有するプライマーの混合物であり得る）。或る特定の実施形態では、プライマー対は、２５００塩基対未満または１５００塩基対未満の領域内で同じ核酸分子の異なる鎖にハイブリダイズするとともに、そこからＤＮＡ重合反応を開始することが可能である。
【0034】
サンプル：「サンプル」という用語は、本明細書で使用される場合、対象の核酸、例えばゲノム、ゲノム断片、ゲノムの領域に対応するアンプリコン、または別の標的核酸を含有するか、または含有する疑いがある任意のサンプルを指す。サンプルは、１つ以上のプロセスに供してからも「サンプル」とみなすことができる。例えば、ＰＣＲ増幅反応に供されるサンプルは、ＰＣＲ増幅反応後も「サンプル」のままである。
【0035】
単一のアンプリコン：「単一のアンプリコン」という用語は、本明細書で使用される場合、単一のプライマー対を用いた単一の生物からのＰＣＲ増幅反応によって生成する核酸分子または核酸分子の群を指す。通例、「単一のアンプリコン」は、特有の配列を有するＰＣＲ産物を指すが、例えば生物が増幅される配列についてヘテロ接合である場合に、特有の配列の群、例えば対を有するＰＣＲ産物を指すこともある。
【0036】
特異的：「特異的」という用語は、プローブ分子とアンプリコンとの結合に関して本明細書で使用される場合、プローブ分子が、その標的アンプリコンに対して他の非相同アンプリコンよりも大きな親和性、通例、はるかに大きな親和性を有することを意味するが、プローブ分子がその標的に対して完全に特異的である必要はない。このため、プローブ分子は例えば、第１のゲノム配列を含むアンプリコンおよび第１のゲノム配列と１つ以上のヌクレオチドが異なる第２の相同ゲノム配列を含むアンプリコンにハイブリダイズし得る可能性がある。
【0037】
標的鎖１：標的鎖１は、非対称プライマー対の非伸長プライマーが相補的な二本鎖標的核酸の鎖を指す。
【0038】
標的鎖２：標的鎖２は、非対称プライマー対の伸長プライマー中の「Ａ」領域が相補的な二本鎖標的核酸の鎖を指す。
【0039】
非伸長プライマー：標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性または標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列相補性を有するヌクレオチド配列から本質的になるＰＣＲプライマー。非伸長プライマーに関して、「から本質的になる」という用語は、ヌクレオチド配列が、標的配列に対して（少なくとも７５％の）相補性の領域の５’に３つ以下の付加的なヌクレオチドを含み得ることを意味する。
【0040】
６．２．仮想プローブを用いて相同ゲノム配列を区別する方法
本開示は、第１の生物に由来する第１のゲノム配列と第２の生物に由来する第２の相同ゲノム配列とを区別する方法を提供する。この方法は、仮想プローブを用いたサンプル中に存在する生物の特定を可能にする。ゲノム配列に対する仮想プローブは概して、例えばアドレス可能なアレイ上のそれらの別々の位置のために、または例えば異なる蛍光部分での差次標識によって区別することができる２つ以上のプローブ分子を含む。便宜上、仮想プローブ内の個々のプローブ分子からの読出しが、本明細書で「シグナル」と称されることがある。明確にするために、プローブ分子は、「シグナル」を生成するために標識する必要はない。例えば、蛍光標識アンプリコンへのハイブリダイゼーションの欠如が「シグナル」となり得る。
本開示は、第１の生物に由来する第１のゲノム配列と第２の生物に由来する第２の相同ゲノム配列とを区別する方法を提供する。この方法は、仮想プローブを用いたサンプル中に存在する生物の特定を可能にする。ゲノム配列に対する仮想プローブは概して、例えばアドレス可能なアレイ上のそれらの別々の位置のために、または例えば異なる蛍光部分での差次標識によって区別することができる２つ以上のプローブ分子を含む。便宜上、仮想プローブ内の個々のプローブ分子からの読出しが、本明細書で「シグナル」と称されることがある。明確にするために、プローブ分子は、「シグナル」を生成するために標識する必要はない。例えば、蛍光標識アンプリコンへのハイブリダイゼーションの欠如が「シグナル」となり得る。
【0041】
ゲノム配列に対する各仮想プローブは、ゲノム配列に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な（仮想プローブを構成する複数のプローブ分子の）少なくとも１つのプローブ分子を含む。場合によっては、仮想プローブ中の２つ以上のプローブ分子が、ゲノム配列に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）にハイブリダイズすることが可能である。関連するゲノム配列に由来する異なる標的核酸（例えば、アンプリコン）に対する仮想プローブのプローブ分子のハイブリダイゼーションパターンは、関連するゲノム配列に由来する標的核酸を区別し、例えば第１のゲノムに由来する第１のアンプリコンセットと相同ゲノム配列を有する第２のゲノムに由来する第２のアンプリコンセットとを区別するように十分に異なる。この方法を用いて、例えばプローブするアンプリコンが増幅されたサンプル中の細菌の特定の種または株の存在を、直接（例えば、サンプルがＰＣＲに直接用いられる場合）または間接的に（例えば、セクション６．２．１に記載のビーズビーティング法等の中間精製または富化工程によって）決定することができる。本明細書に開示される様々な実施形態は、ＰＣＲ反応等のＤＮＡ増幅反応の産物を仮想プローブでプローブすることを説明するものであるが、代替的には非増幅ゲノムＤＮＡを検出することが可能な方法を用いてプロービングを行うことができると理解すべきである。非増幅ゲノムＤＮＡを検出する例示的な方法は、Detection of Non-Amplified Genomic DNA, 2012, Spoto and Corradini (eds) doi.org/10.1007/978-94-007-1226-3に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。かかる方法としては、光学的検出法（例えば、Li and Fan, 2012, “Optical Detection of Non-amplified Genomic DNA,” pp. 153-183 in Detection of Non-Amplified Genomic DNAを参照されたい）、電気化学的検出法（例えば、Marin and Merkoci, 2012, “Electrochemical Detection of DNA Using Nanomaterials Based Sensors,” pp. 185-201 in Detection of Non-Amplified Genomic DNAを参照されたい）、圧電検知法（例えば、Minunni, 2012, “Piezoelectric Sensing for Sensitive Detection of DNA,” pp. 203-233 in Detection of Non-Amplified Genomic DNAを参照されたい）、表面プラズモン共鳴ベースの方法（例えば、D’Agata and Spoto, 2012, “Surface Plasmon Resonance-Based Methods,” pp. 235-261 in Detection of Non-Amplified Genomic DNAを参照されたい）、および並列光学・電気化学的方法（例えば、Knoll et al., 2012, “Parallel Optical and Electrochemical DNA Detection,” pp. 263-278 in Detection of Non-Amplified Genomic DNAを参照されたい）が挙げられる。このため、幾つかの実施形態では、サンプルのプロービングは、ＤＮＡ増幅工程なしに行われる（例えば、サンプルがゲノム断片である標的核酸を含有するか、または含有する疑いがある場合）。
【0042】
第１の生物に由来する第１のゲノムまたは第２の生物に由来する第２のゲノムの存在を決定する方法は、いずれかがサンプル中に存在する場合、第１のゲノムおよび第２のゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅反応（例えば、セクション６．２．３に記載される）をサンプルに対して行う工程を含み得る。第１のゲノムがサンプル中に存在する場合の第１のゲノムからの増幅は、第１のアンプリコンセットを生じる。第２のゲノムがサンプル中に存在する場合の第２のゲノムからの増幅は、第２のアンプリコンセットを生じる。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットの有無を決定することができる。プロービングは、ＰＣＲ増幅反応中に（例えば、リアルタイムＰＣＲを、例えばセクション６．２．３．５に記載されるように用いる場合）またはＰＣＲ増幅反応後に（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ分子を含むアレイを、例えばセクション６．３に記載されるように使用することによって）行うことができる。プロービングをＰＣＲ反応後に、例えばアレイ上で行う場合、蛍光標識ヌクレオチドをＰＣＲ混合物に加え、得られるＰＣＲアンプリコンを標識することが有用である。アドレス可能なアレイ上の蛍光標識の位置および場合によってはその強度が、仮想プローブを構成するプローブ分子のシグナルとなり得る。
【0043】
第１のアンプリコンセットが存在することが決定された場合、サンプルが第１のゲノムを含有すると結論付けることができる。同様に、第２のアンプリコンセットが存在することが決定された場合、サンプルが第２のゲノムを含有すると結論付けることができる。仮想プローブを使用して、関連する微生物、例えばコアグラーゼ陰性およびコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種（例えば、セクション６．２．５．１に記載される）、Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）（例えば、セクション６．２．５．２に記載される）、またはＳ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）（例えば、６．２．５．３に記載される）から調製された第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。
【0044】
サンプルは、例えば生体サンプル、環境サンプルまたは食品であり得る。幾つかの実施形態では、サンプルは、１つ以上の微生物に感染しているか、または感染のリスクがある。例示的なサンプルは、セクション６．２．１に記載される。
【0045】
任意の相同ゲノム配列（および相同ゲノム配列に対応するアンプリコン）を区別するための本開示の方法の使用が企図される。細菌の種または細菌の関連種がサンプル中に存在する可能性が高いかを決定する場合、ｒＲＮＡ（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡまたは２３Ｓ ｒＲＮＡ）をコードするゲノム配列、またはｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ－２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子間スペーサー領域）に対応する標的核酸（例えば、アンプリコン）を区別することが可能な仮想プローブを使用することができる。本開示の方法によって区別することができる例示的な相同ゲノム配列の特徴は、セクション６．２．２に記載される。
【0046】
本開示の方法に従って仮想プローブでプローブされるアンプリコンは、第１の生物のゲノムおよび第２の生物のゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、第１の生物および／または第２の生物を含有するか、または含有する疑いもしくはリスクがあるサンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行うことによって生成することができる。ＰＣＲ増幅反応は、プライマーの単一セット（第１および第２の生物がサンプル中に存在する場合、第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンのそれぞれを生成するはずである）を用いて行うことができる。代替的には、第１および第２の生物がそれぞれサンプル中に存在する場合に、２セット以上のプライマーを用いてＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムに対応する複数のアンプリコンおよび第２のゲノムに対応する複数のアンプリコンを生成することができる。本開示の方法に用いることができる例示的なＰＣＲ増幅反応は、セクション６．２．３に記載される。ＰＣＲ以外の核酸増幅法（例えば、等温増幅法）、例えばループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いてアンプリコンを調製することもできる（例えば、Fakruddin et al., 2013, J Pharm Bioallied Sci.5(4): 245－252を参照されたい）。このため、ＰＣＲ増幅産物に適用可能として本明細書に記載される実施形態が、代替的な増幅法を用いて生成した増幅産物にも同様に適用可能であると理解すべきである。
【0047】
仮想プローブに使用することができるプローブ分子の例示的な特徴および仮想プローブの例示的な特徴は、それぞれセクション６．２．４およびセクション６．２．５に記載される。
【0048】
幾つかの実施形態では、ＰＣＲ増幅産物のプロービングは、ＰＣＲ増幅産物を、例えばセクション６．３に記載されるアレイに接触させる工程と、非結合核酸分子をアレイから洗い流す工程と、アレイ上の各プローブ分子位置での標識（例えば、蛍光標識）のシグナル強度を測定する工程とを含む。
【0049】
他の実施形態では、ＰＣＲ増幅産物のプロービングは、リアルタイムＰＣＲ反応に使用されるオリゴヌクレオチドプローブ分子からのシグナルを測定することを含む。
【0050】
本開示の方法を行うために使用することができるシステムは、セクション６．４に記載される。
【0051】
本開示の方法に使用することができるキットは、セクション６．５に記載される。
【0052】
６．２．１．サンプル
本開示の方法に使用されるサンプルは、ＰＣＲ増幅に適した状態にあるか、またはその状態で調製されるゲノムＤＮＡを含有する任意のタイプまたは形態のサンプルであり得る。或る特定の実施形態では、サンプルは１つ以上の微生物、例えば１つ以上の種の微生物による感染のリスクがある。他の実施形態では、サンプルは１つ以上の微生物、例えば１つ以上の種の微生物に感染している疑いがある。サンプルは、例えば生体サンプル、環境サンプルまたは食品であり得る。
本開示の方法に使用されるサンプルは、ＰＣＲ増幅に適した状態にあるか、またはその状態で調製されるゲノムＤＮＡを含有する任意のタイプまたは形態のサンプルであり得る。或る特定の実施形態では、サンプルは１つ以上の微生物、例えば１つ以上の種の微生物による感染のリスクがある。他の実施形態では、サンプルは１つ以上の微生物、例えば１つ以上の種の微生物に感染している疑いがある。サンプルは、例えば生体サンプル、環境サンプルまたは食品であり得る。
【0053】
サンプルの例として、様々な液状サンプルが挙げられる。場合によっては、サンプルは被験体からの体液サンプルであり得る。サンプルは、被験体から採取された組織を含んでいてもよい。サンプルは、被験体の体液、分泌物および／または組織を含んでいてもよい。サンプルは生体サンプルであってもよい。生体サンプルは体液、分泌物および／または組織サンプルであり得る。生体サンプルの例としては、血液、血清、唾液、尿、胃液および消化液、涙液、糞便、精液、膣液、腫瘍性組織に由来する間質液、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、爪、皮膚細胞、血漿、鼻腔スワブまたは鼻咽頭洗浄液、髄液、脳脊髄液、組織、咽頭スワブ、創傷スワブ、生検材料、胎盤液、羊水、臍帯血、リンパ液、体腔液、痰、膿または他の創傷滲出液、創傷清拭または切除によってサンプリングした感染組織、脳脊髄液、洗浄液、白血球生成試料、腹膜透析液、乳汁および／または他の排泄物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
被験体がサンプルを提供してもよく、かつ／またはサンプルを被験体から採取してもよい。被験体は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。サンプルは、生きているまたは死んだ被験体から採取することができる。動物は、家畜（例えばウシ、ブタ、ヒツジ）、競技用動物（例えば、ウマ）または愛玩動物（例えば、イヌまたはネコ）等の哺乳動物であり得る。被験体は患者、臨床被験体または前臨床被験体であり得る。被験体は診断、治療、および／または疾病管理、または生活様式もしくは予防的なケアを受けていてもよい。被験体は、医療専門家の保護下にあっても、またはそうでなくてもよい。
【0055】
幾つかの実施形態では、サンプルは環境サンプルであり得る。環境サンプルの例としては、空気サンプル、水サンプル（例えば地下水、地表水または廃水）、土壌サンプルおよび植物サンプルが挙げられる。
【0056】
付加的なサンプルとしては、食品、飲料、製造材料、織物、化学物質および療法剤が挙げられる。
【0057】
幾つかの実施形態では、サンプルは病原体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subsp paratuberculosis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（メチシリン感受性およびメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）を含む）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Staphylococcus maltophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘモフィラス・パラインフルエンザエ（Haemophilus parainfuluezae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター種、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、バチルス・アンシラシス（Bacillus anthracis）、ノカルディア種、アクチノマイセス種、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumonia）、レジオネラ種、ニューモシスチス・イロベジイ（Pneumocystis jiroveci）、Ａ型インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、アシネトバクター・バウマンニイ（Acinetobacter baumannii）、コリネバクテリウム・アミコラツム（Corynebacterium amycolatum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）ＣＩ ４４１３、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、ステノトロホモナス（キサントモナス）・マルトフィリア（Stenotrophomonas(Xanthomonas) maltophilia）およびサルモネラ種の１つ以上を含有するか、または含有する疑いがあるサンプルである。幾つかの実施形態では、サンプルは、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）またはエンテロバクター・ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）等の腸内細菌科群の細菌を含有するか、または含有する疑いがあるサンプルである。
【0058】
ＰＣＲ増幅を行う前にサンプルを前処理することができる。このため、本開示の方法においてＰＣＲ増幅に供されるサンプルは例えば、本セクションまたは本開示の他の部分に記載されるいずれかのタイプのサンプルから処理、抽出または分画されたサンプル（例えば尿、痰、創傷スワブ、血液または腹膜透析液から処理、抽出または分画されたサンプル）であり得る。
【0059】
用いることができる前処理工程の例としては、本明細書で論考するかまたは別に当該技術分野で既知のように、濾過、蒸留、抽出、濃度、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加等が挙げられる。
【0060】
ＰＣＲの前に、対象の細胞型からのゲノムＤＮＡの回収率を最大化するために不要な細胞型および粒子状物質を生体サンプルから除去することが特に有利であり得る。
【0061】
生体サンプル中の細菌を検出することが意図される場合、微粒子および非細菌細胞がフィルター上に保持される一方で、細菌細胞（必要に応じて、それらの芽胞を含む）が通過するようにフィルターを通して生体サンプルを前処理することが望ましい場合がある。「フィルター」は、本明細書で使用される場合、サイズに基づく粒子および分子の差別的通過を可能にする膜またはデバイスである。これは通例、特定の公称サイズの細孔をフィルターに設けることによって達成される。例えば、細菌検出用途にとって特に関心が持たれるフィルターは、細菌の通過を可能にするのに十分に大きいが、対象のサンプル中に存在する真核細胞の通過を防ぐのに十分に小さな細孔を有する。概して、細菌細胞は直径０．２～２μｍ（マイクロメートルまたはミクロン）の範囲であり、殆どの真菌細胞は直径１～１０μｍの範囲であり、血小板は直径およそ３μｍであり、殆どの有核哺乳動物細胞は通例、直径１０～２００μｍである。したがって、細菌の検出が意図される場合、２μｍ未満または１μｍ未満のフィルター細孔径が、非細菌細胞を生体サンプルから除去するのに特に適している。
【0062】
濾過工程に加えてまたはその代わりに、生体サンプルを遠心分離に供して、細胞および残屑をサンプルから除去することができる。真核細胞を沈殿させるが細菌細胞を沈殿させない遠心分離パラメーターは、当該技術分野で既知である。次いで、上清を必要に応じて濾過することができる。
【0063】
サンプルは、当該技術分野で既知のＰＣＲのためのゲノムＤＮＡを含むサンプルを調製する様々なプロセスのいずれかを用いて（例えば、上記の前処理工程の１つ以上に従って）、ＰＣＲ増幅のために調製することができる。幾つかの実施形態では、市販のＤＮＡ抽出試薬、キットおよび／または機器、例えばＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）、ＭａｇＭＡＸ（商標） ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｋｉｔ（ThermoFisher Scientific）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標） ＲＳＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Promega）等を使用することができる。
【0064】
幾つかの実施形態では、例えば米国特許第１０，０３６，０５４号明細書（その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする）に記載されるビーズビーティングを含むプロセスによってＰＣＲのためにサンプルを調製する。血液を市販の血液採取チューブに採取した後、例えばビーズビーティングビーズを採取チューブに添加し、採取チューブを撹拌に供することによって直接ビーズビーティングに供することができる。血液サンプルの採取に使用することができる市販の採取チューブの例としては、ＥＤＴＡを含むラベンダートップチューブ、クエン酸ナトリウムを含むライトブルートップチューブ、シュウ酸カリウムを含むグレートップチューブまたはヘパリンを含むグリーントップチューブが挙げられる。
【0065】
６．２．２．相同ゲノム配列
本開示の方法を用いて、第１および第２の相同ゲノム配列（ならびに第１および第２の相同ゲノム配列に対応するアンプリコン等の標的核酸）を特定および／または区別することができる。相同ゲノム配列は、共通の祖先を有するが、ヌクレオチド配列が同一でない種または株に見られるゲノム配列である。このため、相同ゲノム配列は例えば、細菌の近縁種または株に見られる。
本開示の方法を用いて、第１および第２の相同ゲノム配列（ならびに第１および第２の相同ゲノム配列に対応するアンプリコン等の標的核酸）を特定および／または区別することができる。相同ゲノム配列は、共通の祖先を有するが、ヌクレオチド配列が同一でない種または株に見られるゲノム配列である。このため、相同ゲノム配列は例えば、細菌の近縁種または株に見られる。
【0066】
第１のゲノム配列および第２のゲノム配列は概して、第１の微生物および第２の微生物（例えば細菌、ウイルスまたは真菌）に由来するゲノム配列である。第１および／または第２の微生物は、例えばヒト病原体および／または動物病原体であり得る。微生物は同じ目、同じ科、同じ属、同じ群、またはさらには同じ種であってもよい。好ましい実施形態では、第１および第２の微生物は細菌である。
【0067】
シークエンシング技術の進歩により、米国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）等の多数の公開データベースリポジトリにおいて利用可能な全細菌ゲノム配列の数が大幅に増加しており、かかるデータベースを用いて相同ゲノム配列を特定することができる。
【0068】
近縁の微生物における相同ゲノム配列は、ｒＲＮＡをコードする遺伝子およびｒＲＮＡをコードする遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域に見られることが多い。細菌種の配列比較は長年、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の遺伝子を用いて行われてきた。１６Ｓ リボソームＲＮＡ遺伝子は、タンパク質産生に関与するタンパク質／ＲＮＡ複合体である細菌リボソームの３０Ｓ小サブユニットの１６Ｓ ＲＮＡ要素をコードする。この遺伝子は、９つの超可変領域（Ｖ１～Ｖ９）が組み入れられた高度保存配列の領域を含む。超可変領域における配列変動により、近縁種間で観察可能な差異の殆どが可能となる。これらの遺伝子間で観察される配列進化の速度が遅いことから、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、多数の細菌種について系統樹の構築に使用されている。ＧｅｎＢａｎｋから入手した幾つかのスタフィロコッカス種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子から作成した例示的な系統樹を図１に示す。
【0069】
細菌ゲノムは、第２のリボソームｒＲＮＡ遺伝子である２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を含む。１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、１６Ｓ－２３Ｓ内部転写スペーサー領域（ＩＴＳ）または１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域として知られるスペーサー領域によって互いに隔てられている。１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域は、特定の細菌種を区別および特定するために用いることができる種および種間特異的配列を含む超可変領域を含む（K. Okamura, et al., 2012）。１６ｓ ｒＲＮＡおよび１６ｓ－２３ｓ ｒＲＮＡゲノム配列の多重アラインメントによって作成したストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridians）群の例示的な系統樹を図２に示す。
【0070】
本開示の方法の幾つかの実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子間の遺伝子間スペーサー領域のヌクレオチド配列を含む。
【0071】
微生物が細菌である実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含み得る。幾つかの実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第１のゲノム配列および第２のゲノム配列はそれぞれ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ゲノム配列は、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に見られるヌクレオチド配列を含む。
【0072】
或る特定の具体的な実施形態では、第１のゲノム配列および／または第２の相同ゲノム配列は、ヒトの血液、尿または腹腔液に見られ得る病原体、例えば細菌、ウイルスまたは真菌に由来するゲノム配列である。かかる病原体の例としては、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subsp paratuberculosis）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（メチシリン感受性およびメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）を含む）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、スタフィロコッカス・マルトフィリア（Staphylococcus maltophilia）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Streptococcus agalactiae）、ヘモフィラス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ヘモフィラス・パラインフルエンザエ（Haemophilus parainfuluezae）、モラクセラ・カタラリス（Moraxella catarrhalis）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター種、ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）、バチルス・アンシラシス（Bacillus anthracis）、ノカルディア種、アクチノマイセス種、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumonia）、レジオネラ種、ニューモシスチス・イロベジイ（Pneumocystis jiroveci）、Ａ型インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、アシネトバクター・バウマンニイ（Acinetobacter baumannii）、コリネバクテリウム・アミコラツム（Corynebacterium amycolatum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）ＣＩ ４４１３、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、ステノトロホモナス（キサントモナス）・マルトフィリア（Stenotrophomonas(Xanthomonas) maltophilia）およびサルモネラ種が挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
６．２．３．ＰＣＲ増幅
本開示の方法の幾つかの実施形態では、サンプル中に存在し得るゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ増幅反応は、「対称」ＰＣＲ反応とすることができ、すなわち、互いに等しいかまたは数℃以内の「融解温度」または「Ｔｍ」を有するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することで、反応により鋳型ＤＮＡの二本鎖コピーを作製する。一般的に使用されているプライマー設計用のコンピューターソフトウェアプログラムは、高いＴｍ差を回避するようユーザーに警告し、自動Ｔｍ整合機能を有する。一本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製することができる「非対称」ＰＣＲ反応を用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ反応を用いることもできる。ＰＣＲ増幅反応との関連では、反応によって増幅したゲノム配列は、「標的」核酸、「鋳型」核酸等と称されることがある。
本開示の方法の幾つかの実施形態では、サンプル中に存在し得るゲノムにハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してＰＣＲ増幅を行う。ＰＣＲ増幅反応は、「対称」ＰＣＲ反応とすることができ、すなわち、互いに等しいかまたは数℃以内の「融解温度」または「Ｔｍ」を有するように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーを利用することで、反応により鋳型ＤＮＡの二本鎖コピーを作製する。一般的に使用されているプライマー設計用のコンピューターソフトウェアプログラムは、高いＴｍ差を回避するようユーザーに警告し、自動Ｔｍ整合機能を有する。一本鎖ＤＮＡアンプリコンを作製することができる「非対称」ＰＣＲ反応を用いてもよい。リアルタイムＰＣＲ反応を用いることもできる。ＰＣＲ増幅反応との関連では、反応によって増幅したゲノム配列は、「標的」核酸、「鋳型」核酸等と称されることがある。
【0074】
ＰＣＲ増幅反応には、単一のプライマーセットまたは複数のプライマーセット（例えば、ＰＣＲ増幅がマルチプレックスＰＣＲである場合）を使用することができる。マルチプレックスＰＣＲは、例えば第１のゲノム配列（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）に対応するアンプリコンおよび／または第２のゲノム配列（例えば、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）に対応する異なるアンプリコンを生成するのに有用であり得る。マルチプレックスＰＣＲの代替として、異なるプライマーセットを用いて行われた別個のＰＣＲ増幅反応によって生成したアンプリコンを、その後の分析のためにプールすることができる。有利には、単一のプライマーセットを用いて、例えば同じ属のメンバーであってもよい複数の株または種、例えば２つ、３つ、４つまたは５つ以上の種のゲノムに見られる相同ゲノム配列に対応するアンプリコンを作製することができる。
【0075】
ＰＣＲ増幅条件は、例えばＤＮＡ増幅産物が１００～１０００ヌクレオチドの長さとなるように選択することができる（対称または非対称、シングルプレックスまたはマルチプレックスを問わない）。幾つかの実施形態では、ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ増幅産物が３００～８００ヌクレオチドの長さとなるように選択される。他の実施形態では、ＰＣＲ条件は、ＤＮＡ増幅産物が４００～６００ヌクレオチドの長さとなるように選択される。
【0076】
幾つかの実施形態では、本開示の方法に用いられるＰＣＲ増幅反応は、測定可能なシグナルを生じる標識を、反応によって生成する任意のアンプリコンに組み込むものである。標識は、例えば蛍光標識、電気化学的標識または化学発光標識であり得る。蛍光標識は、ＰＣＲ中の蛍光標識ヌクレオチドの取込みおよび／またはＰＣＲへの標識プライマーの使用によって達成することができる。電気化学的標識は、ＰＣＲ中のレドックス活性標識ヌクレオチドの取込みおよび／またはＰＣＲへのレドックス活性標識プライマーの使用によって達成することができる（例えば、Hocek and Fojta, 2011, Chem. Soc. Rev., 40: 5802-5814; Fojta, 2016, Redox Labeling of Nucleic Acids for Electrochemical Analysis of Nucleotide Sequences and DNA Damage. In: Nikolelis D., Nikoleli GP. (eds) Biosensors for Security and Bioterrorism Applications. Advanced Sciences and Technologies for Security Applications. Springer, Chamを参照されたい）。化学発光標識は、例えばＰＣＲにビオチン標識プライマーを使用し、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲートを結合した後、化学発光１，２－ジオキセタン基質とインキュベートすることによって達成することができる。
【0077】
好適な蛍光部分の例としては、ＦＩＴＣ、ＥＤＡＮＳ、テキサスレッド、６－ｊｏｅ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ａｌｅｘａ ５３２、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５６４、ＢＯＤＩＰＹ ５８１、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、テキサスレッドおよびｘ－ローダミンが挙げられる。
【0078】
蛍光部分をｄＮＴＰ、特にシトシンを塩基として含むもの（シチジル酸、シチジン５’－リン酸、シチジン５’－二リン酸、シチジン５’－三リン酸、またはそれらのポリマー、またはシチジル酸を含有するポリマー）に付着させることができる。
【0079】
ｄＮＴＰ標識の位置は塩基（アミノ基）、リン酸基（ＯＨ基）またはデオキシリボース部分（２’－または３’－ＯＨ基）であり得る。好ましい位置は塩基である。
【0080】
他のヌクレオチドと同様、蛍光標識ｄＮＴＰをＰＣＲアンプリコンの両鎖のランダムな部位、通例、ｄＣ部位に組み込み、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長することができる。
【0081】
蛍光ｄＮＴＰは、高濃縮形態で市販されており、各非標識ｄＮＴＰの濃度を調整することなくＰＣＲ反応混合物に添加することができる。殆どのＰＣＲ増幅について、ｄＮＴＰと蛍光ｄＮＴＰとの典型的な比率は、１００：１～１０００：１である。このため、蛍光標識ｄＮＴＰを非標識ｄＮＴＰの（モル）量の０．１％～１％でＰＣＲ試薬に加えることができる。
【0082】
蛍光標識ＰＣＲ産物の検出は、プローブ分子、例えばマイクロアレイに結合したプローブ分子へのハイブリダイゼーションによって達成することができる。好適なマイクロアレイシステムは、米国特許第９，７３８，９２６号明細書（その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする）に記載される三次元架橋ポリマーネットワークを利用したものである。
【0083】
６．２．３．１．プライマー
ＰＣＲ反応において用いられるプライマーは、所与の核酸鋳型の配列、例えば標的ゲノム配列を認識し、それにハイブリダイズするように設計される。プライマーおよび標的核酸鋳型の配列におけるミスマッチは、ＰＣＲ反応の効率の低下および／または所望の配列以外の配列の増幅を引き起こす恐れがある。上首尾のプライマー設計のためのパラメーターは、当該技術分野で既知であり（例えば、Dieffenbach, et al., 1993を参照されたい）、プライマー長、融解温度、ＧＣ含量等が含まれる。ＰＣＲプライマーは、所与の標的核酸鋳型と１００％の配列同一性を有する必要はなく、標的配列と少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％または９９．５％の同一性を有するＰＣＲプライマーが、標的配列にハイブリダイズし、その増幅を可能にするように機能し得る。
ＰＣＲ反応において用いられるプライマーは、所与の核酸鋳型の配列、例えば標的ゲノム配列を認識し、それにハイブリダイズするように設計される。プライマーおよび標的核酸鋳型の配列におけるミスマッチは、ＰＣＲ反応の効率の低下および／または所望の配列以外の配列の増幅を引き起こす恐れがある。上首尾のプライマー設計のためのパラメーターは、当該技術分野で既知であり（例えば、Dieffenbach, et al., 1993を参照されたい）、プライマー長、融解温度、ＧＣ含量等が含まれる。ＰＣＲプライマーは、所与の標的核酸鋳型と１００％の配列同一性を有する必要はなく、標的配列と少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％または９９．５％の同一性を有するＰＣＲプライマーが、標的配列にハイブリダイズし、その増幅を可能にするように機能し得る。
【0084】
本開示は、高い特異性および良好な増幅効率を有する特有のプライマー系を作製するのに適した付加的なパラメーターを提供する。プライマーは通例、１８～２４塩基長であるが、より長く、例えば２５～５０塩基長、例えば２５～４５塩基長、例えば３０～４５塩基長、例えば３５～４５塩基長、例えば４０～４５塩基長、または例えば４０～５０塩基長であってもよい。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、対で設計されることが多く、一方のプライマーが「フォワード」プライマーと称され、一方のプライマーが「リバース」プライマーと称される。本開示のフォワードプライマーは、Ｇおよび／またはＣ残基を３’末端に有し、「ＧＣクランプ」を生じるように設計することができる。ＧおよびＣヌクレオチド対は、Ａ－Ｔヌクレオチド対よりも強い水素結合を示すため、プライマーの３’末端のＧＣクランプは、配列特異性を高め、ハイブリダイゼーションの可能性を高め、ＰＣＲ反応の全体的効率を高めるのに役立ち得る。
【0085】
プライマーのセットは、２つのゲノム領域を増幅するように設計することができ、例えば、プライマーのセットは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的な１つのプライマー対および１６Ｓ－２３Ｓ ｒＲＮＡ ＩＴＳ領域に特異的な第２のプライマー対を含み得る（図３を参照されたい）。かかるプライマーセットは、例えば単一のＰＣＲ反応において複数のアンプリコンを生成するために使用することができる。
【0086】
ＰＣＲプライマー対は、多数の種間で保存されている配列を増幅し、例えば複数の細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するように設計することができる。このため、単一のＰＣＲプライマー対を用いて相同ゲノム配列に対応するアンプリコンを生成することが可能な場合があり、これは、可能性がある多数の生物の１つを含有するか、または含有する疑いがあるサンプルに対してＰＣＲを行う場合に有利である。保存配列を増幅するように設計されたプライマーのパラメーターは、様々な種間で保存されている領域を特定すること、任意に保存領域における任意の配列の差異が正確であると証明すること（例えば、公開された配列が正確であるかが不確かである場合）、および配列間で少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％、またはさらには１００％保存されている配列を選択することを含み得る。１００％未満の配列同一性を示すプライマーは、単に所与の鋳型と異なる１つ以上の単一のヌクレオチド塩基を含んでいてもよく、すなわち、調製物中の全てのプライマーが互いに同じ配列を含む。代替として、プライマーは、配列の特定の位置に代わりのヌクレオチド残基を有するように作製することができる。例えば、幾つかの種の１６Ｓ 領域の増幅のためのリバースプライマーは、オリゴヌクレオチドのプールを含むことができ、そのうち或るパーセンテージ、例えば５０％がプライマーの或る位置に第１のヌクレオチドを有し、或るパーセンテージ、例えば５０％がその位置に第２のヌクレオチドを有する。
【0087】
幾つかの実施形態では、本開示の方法において用いられるプライマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）で標識される。例えば、幾つかの実施形態では、少なくとも１つのプライマーが５’蛍光標識される。他の実施形態では、２つ以上のプライマーが５’蛍光標識される。プライマーの標識に適した蛍光標識は、当該技術分野で既知であり、Ｃｙ５、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡが含まれる。
【0088】
６．２．３．２．対称ＰＣＲ増幅
本開示の方法に用いることができる典型的な三段階ＰＣＲプロトコル（PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications, Innis et al. eds., Academic Press (San Diego, Calif. (USA)) 1990, Chapter 1を参照されたい）は、９３～９５℃で５秒超の変性、すなわち鎖融解、５５～６５℃で１０～６０秒のプライマーアニーリング、およびポリメラーゼが高活性である温度、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについては７２℃で１５～１２０秒のプライマー伸長を含み得る。典型的な二段階ＰＣＲプロトコルは、プライマーアニーリングとプライマー伸長とが同じ温度、例えば６０℃または７２℃であることが異なり得る。三段階ＰＣＲまたは二段階ＰＣＲのいずれについても、増幅は、反応混合物に上述の一連の工程を多数回、通例、２５～４０回繰り返すことを含む。反応の過程で、反応の個々の工程の回数および温度は、サイクル間で変化しないままであってもよく、または効率を上げるか、もしくは選択性を高めるために、反応の過程の１つ以上の時点で変化させてもよい。
本開示の方法に用いることができる典型的な三段階ＰＣＲプロトコル（PCR PROTOCOLS, a Guide to Methods and Applications, Innis et al. eds., Academic Press (San Diego, Calif. (USA)) 1990, Chapter 1を参照されたい）は、９３～９５℃で５秒超の変性、すなわち鎖融解、５５～６５℃で１０～６０秒のプライマーアニーリング、およびポリメラーゼが高活性である温度、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについては７２℃で１５～１２０秒のプライマー伸長を含み得る。典型的な二段階ＰＣＲプロトコルは、プライマーアニーリングとプライマー伸長とが同じ温度、例えば６０℃または７２℃であることが異なり得る。三段階ＰＣＲまたは二段階ＰＣＲのいずれについても、増幅は、反応混合物に上述の一連の工程を多数回、通例、２５～４０回繰り返すことを含む。反応の過程で、反応の個々の工程の回数および温度は、サイクル間で変化しないままであってもよく、または効率を上げるか、もしくは選択性を高めるために、反応の過程の１つ以上の時点で変化させてもよい。
【0089】
プライマー対および標的核酸に加えて、ＰＣＲ反応混合物は通例、典型的には等モル濃度の４つのデオキシリボヌクレオチド５’三リン酸（ｄＮＴＰ）のそれぞれ、耐熱性ポリメラーゼ、二価カチオン（通例、Ｍｇ２＋）および緩衝剤を含有する。かかる反応の容量は通例、２０～１００μｌである。複数の標的配列を同じ反応において増幅することができる。特定のＰＣＲ増幅のサイクル数は、ａ）出発物質の量、ｂ）反応の効率、ならびにｃ）産物の検出またはその後の分析の方法および感度を含む幾つかの要因によって決まる。典型的なサイクル増幅反応のためのサイクル条件、試薬濃度、プライマー設計および適切な装置は、当該技術分野で既知である（例えば、Ausubel, F. Current Protocols in Molecular Biology (1988) Chapter 15: “The Polymerase Chain Reaction,” J. Wiley (New York, N.Y. (USA))を参照されたい）。
【0090】
６．２．３．３．非対称ＰＣＲ増幅
例示的な非対称ＰＣＲ法は、Gyllensten and E.lich, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)およびGyllensten and Erlichの１９９１年の米国特許第５，０６６，５８４号明細書に記載されている。従来の非対称ＰＣＲは、プライマーの一方を限定量、通例、他方のプライマーの濃度の１／１００～１／５で添加する点で対称ＰＣＲと異なる。対称ＰＣＲと同様、二本鎖アンプリコンが初期の温度サイクル中に蓄積するが、一方のプライマーが出発鋳型の数に応じて、通例１５～２５回のＰＣＲサイクル後に枯渇する。一方の鎖の線形増幅が、その後のサイクルにおいて枯渇していないプライマーを用いて行われる。文献に報告されている非対称ＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、対称ＰＣＲに使用されることが知られるものと同じプライマーであることが多い。Poddar（Poddar, 2000, Mol. Cell Probes 14: 25-32）は、４０回の熱サイクルを含むエンドポイントアッセイによってアデノウイルス基質の増幅について対称および非対称ＰＣＲを比較した。Poddarは、５０：１のプライマー比が最適であり、非対称ＰＣＲアッセイがより良好な感度を有するが、より少数の標的分子を含有すると推定される希薄基質溶液については顕著に低下することを報告している。
例示的な非対称ＰＣＲ法は、Gyllensten and E.lich, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988)およびGyllensten and Erlichの１９９１年の米国特許第５，０６６，５８４号明細書に記載されている。従来の非対称ＰＣＲは、プライマーの一方を限定量、通例、他方のプライマーの濃度の１／１００～１／５で添加する点で対称ＰＣＲと異なる。対称ＰＣＲと同様、二本鎖アンプリコンが初期の温度サイクル中に蓄積するが、一方のプライマーが出発鋳型の数に応じて、通例１５～２５回のＰＣＲサイクル後に枯渇する。一方の鎖の線形増幅が、その後のサイクルにおいて枯渇していないプライマーを用いて行われる。文献に報告されている非対称ＰＣＲ反応に使用されるプライマーは、対称ＰＣＲに使用されることが知られるものと同じプライマーであることが多い。Poddar（Poddar, 2000, Mol. Cell Probes 14: 25-32）は、４０回の熱サイクルを含むエンドポイントアッセイによってアデノウイルス基質の増幅について対称および非対称ＰＣＲを比較した。Poddarは、５０：１のプライマー比が最適であり、非対称ＰＣＲアッセイがより良好な感度を有するが、より少数の標的分子を含有すると推定される希薄基質溶液については顕著に低下することを報告している。
【0091】
６．２．３．４．改良非対称ＰＣＲ増幅
改良非対称ＰＣＲ法は、米国特許第１０，５１３，７３０号明細書に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。改良非対称ＰＣＲ法は、指数関数的増幅期および線形増幅期の両方を含む。指数関数的増幅期において、標的核酸の両方の鎖が増幅される。線形増幅期において、鎖の一方のみが増幅され、標的核酸の単一鎖が過剰となる。
改良非対称ＰＣＲ法は、米国特許第１０，５１３，７３０号明細書に記載されており、その内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。改良非対称ＰＣＲ法は、指数関数的増幅期および線形増幅期の両方を含む。指数関数的増幅期において、標的核酸の両方の鎖が増幅される。線形増幅期において、鎖の一方のみが増幅され、標的核酸の単一鎖が過剰となる。
【0092】
改良非対称ＰＣＲ法は、異なる長さおよび融解温度のプライマー対の使用にもかかわらず単一鎖の過剰を達成し、長い方のプライマーは「伸長プライマー」と称され、短い方のプライマーは「非伸長プライマー」と称される。伸長プライマーは、非伸長プライマーよりも高い融解温度を有し、非伸長プライマーの融解温度よりも高いが、伸長プライマーの融解温度よりも低い温度でアニーリング工程を行うＰＣＲサイクルを用いて、標的核酸の単一鎖を選択的に増幅するために使用することができる。選択的増幅により、その後の検出アッセイにおいてプローブすることができる標的鎖に富んだＰＣＲ産物の混合物が生じる。
【0093】
伸長プライマーは、標的核酸に相補的な配列に加えて、同じプライマーの標的結合部分に相補的な配列を有する５’伸長を有する。理論に束縛されるものではないが、５’伸長の使用が、伸長プライマー分子の分子内または分子間ハイブリダイゼーションを可能にし、ＰＣＲ反応の開始時にＰＣＲ反応中に存在するＤＮＡ分子へのこれらのより長いプライマーの任意のまたは非特異的な結合を防ぐと考えられる。これにより、非特異的なＤＮＡ増幅が妨げられ、生体サンプル中に少量で存在する標的を増幅する際に問題となり得るＰＣＲ産物中の「ノイズ」が妨げられる。
【0094】
初期ＰＣＲ反応混合物は、
・核酸サンプルと、
・非対称プライマー対と、
・耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
・ＰＣＲ試薬と
を含む。
・核酸サンプルと、
・非対称プライマー対と、
・耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと、
・ＰＣＲ試薬と
を含む。
【0095】
ＰＣＲ反応における伸長プライマーおよび非伸長プライマーの初期濃度は、それぞれ２００ｎＭ～８μＭの範囲とすることができる。伸長プライマーおよび非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において等モル量、例えばそれぞれ約２００ｎＭ～１μＭの範囲の濃度、例えばそれぞれ５００ｎＭの濃度で含まれ得る。代替的には、伸長プライマーおよび非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において非等モル量で含まれ得る。或る特定の実施形態では、伸長プライマーの初期濃度は、好ましくは非伸長プライマーの濃度より過剰であり、例えば約２倍～３０倍モル過剰である。したがって、或る特定の態様では、伸長プライマーの濃度は、約１μＭ～８μＭの範囲であり、非伸長プライマーの濃度は、約５０ｎＭ～２００ｎＭの範囲である。
【0096】
非対称プライマー対は、任意の供給源からの核酸を増幅するように設計することができ、診断用途では、セクション６．２．１で特定されるような病原体に由来するＤＮＡを増幅するように非対称プライマー対を設計することができる。
【0097】
非対称プライマー対は、多くの種に存在する相同核酸配列、例えば細菌において高度に保存された１６Ｓ リボソーム配列を同時に増幅することが可能なように設計することができる。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：本開示の非対称ＰＣＲ反応に使用することができる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｖｅｎｔ（Ｔｌｉ／サーモコッカス・リトラリス（Thermoccus Literalis））、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｔａｑ（サームス・エクアティカス（Thermus aquaticus））、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）、ＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒａｓｅ（商標） ｄＨＰＬＣ、９° Ｎｍ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、ＯｎｅＴａｑ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ Ｉ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ、Ｍ－ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）、Ｔｔｈ（サームス・サーモフィラス（Thermos termophilus）ＨＢ－８）、Ｔｆｌ、Ａｍｌｉｔｈｅｒｍ（商標）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）、Ｐｆｕ（ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus））、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏｔ、Ｐｆｕｎｄｓ、ＲｅｐｒｏＦａｓｔ、ＰｙｒｏＢｅｓｔ（商標）、ＶｅｒａＳｅｑ、Ｍａｋｏ、Ｍａｎｔａ、Ｐｗｏ（ピロコッカス・ウーゼイ（pyrococcus woesei））、ＥｘａｃｔＲｕｎ、ＫＯＤ（サーモコッカス・コダカラエンシス（thermococcus kodakkaraensis））、Ｐｆｘ、ＲｅｐｒｏＨｏｔ、Ｓａｃ（スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、Ｓｓｏ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus））、Ｔｒｕ（サームス・ルバー（Thermus ruber））、Ｐｆｘ５０（商標）（サーモコッカス・ジリジイ（Thermococcus zilligi））、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標） ＧＣ－Ｒｉｃｈ（ピロロブス・フマリイ（Pyrolobus fumarius））、ピロコッカス種ＧＢ－Ｄ、Ｔｆｉ（サームス・フィリフォルミス（Thermus filiformis））、Ｔｆｉ ｅｘｏ－、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）、Ｔａｃ（サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum））、Ｍｔｈ（Ｍ．テルモオートトロフィカム（M. thermoautotrophicum））、Ｐａｂ（パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi））、Ｐｈｏ（ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikosihi））、Ｂ１０３（ピコウイルス亜科バクテリオファージＢ１０３）、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））、Ｂｓｔ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ２．０、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ、Ｂｓｕ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＩＩＩおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）またはＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）等のＴａｑポリメラーゼである。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ：本開示の非対称ＰＣＲ反応に使用することができる耐熱性ポリメラーゼとしては、Ｖｅｎｔ（Ｔｌｉ／サーモコッカス・リトラリス（Thermoccus Literalis））、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ－、Ｔａｑ（サームス・エクアティカス（Thermus aquaticus））、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）、ＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒａｓｅ（商標） ｄＨＰＬＣ、９° Ｎｍ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、ＯｎｅＴａｑ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ Ｉ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ、Ｍ－ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）、Ｔｔｈ（サームス・サーモフィラス（Thermos termophilus）ＨＢ－８）、Ｔｆｌ、Ａｍｌｉｔｈｅｒｍ（商標）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）、Ｐｆｕ（ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus））、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏｔ、Ｐｆｕｎｄｓ、ＲｅｐｒｏＦａｓｔ、ＰｙｒｏＢｅｓｔ（商標）、ＶｅｒａＳｅｑ、Ｍａｋｏ、Ｍａｎｔａ、Ｐｗｏ（ピロコッカス・ウーゼイ（pyrococcus woesei））、ＥｘａｃｔＲｕｎ、ＫＯＤ（サーモコッカス・コダカラエンシス（thermococcus kodakkaraensis））、Ｐｆｘ、ＲｅｐｒｏＨｏｔ、Ｓａｃ（スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、Ｓｓｏ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus））、Ｔｒｕ（サームス・ルバー（Thermus ruber））、Ｐｆｘ５０（商標）（サーモコッカス・ジリジイ（Thermococcus zilligi））、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標） ＧＣ－Ｒｉｃｈ（ピロロブス・フマリイ（Pyrolobus fumarius））、ピロコッカス種ＧＢ－Ｄ、Ｔｆｉ（サームス・フィリフォルミス（Thermus filiformis））、Ｔｆｉ ｅｘｏ－、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ（商標）、Ｔａｃ（サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum））、Ｍｔｈ（Ｍ．テルモオートトロフィカム（M. thermoautotrophicum））、Ｐａｂ（パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi））、Ｐｈｏ（ピロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikosihi））、Ｂ１０３（ピコウイルス亜科バクテリオファージＢ１０３）、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））、Ｂｓｔ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ２．０、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ、Ｂｓｕ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） ＩＩＩおよびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標） Ｔが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑ（商標）またはＳｕｐｅｒＴａｑ（商標）等のＴａｑポリメラーゼである。
【0098】
改良非対称方法に用いられる非対称サイクルの例示的なセットを表２に示す。
【表2】
【0099】
表２に示すサイクル数の範囲は、任意の非対称プライマー対に用いることができ、最適なサイクル数は、初期ＰＣＲ混合物中の標的ＤＮＡのコピー数によって決まる：初期コピー数が大きいほど、線形増幅期の鋳型とするのに十分な量のＰＣＲ産物を生成するために指数関数的増幅期において必要とされるサイクル数がより少なくなる。サイクル数の最適化は、当業者にとって日常的である。
【0100】
表２に示す温度は、伸長プライマーのＴｍが７２℃より高く（例えば、７５～８０℃）、非伸長プライマーのＴｍが５８℃を超えるが７２℃未満（例えば、６０～６２℃）である場合、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが７２℃で活性である場合に特に有用である。
【0101】
サイクル時間、特に伸長時間は、プライマーの融解温度およびＰＣＲ産物の長さに応じて変化させることができ、より長いＰＣＲ産物は、より長い伸長時間を必要とする。大体の目安は、伸長工程をアンプリコン１０００塩基当たり少なくとも６０秒とすることである。伸長工程は、アニーリングに追加の時間を取るために線形増幅期において延長することができる。
【0102】
６．２．３．４．１．伸長プライマー
伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。さらに他の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有する。
伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。或る特定の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。さらに他の実施形態では、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有する。
【0103】
別の言い方をすれば、様々な実施形態において、伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖２の対応する領域の相補体に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％の配列同一性を有する。通例、プライマー配列と標的配列との間の任意のミスマッチがより５’側に位置するほど、それらがＰＣＲ反応中に許容される可能性が高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、それでも標的ＤＮＡを効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計することができる。
【0104】
「Ａ」領域の少なくとも一部に相補的な「Ｂ」領域の配列は、直接反復または逆方向反復であり得る。「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部の直接反復を有する場合、図５Ｂに示すように、異なる伸長プライマー分子が互いに分子間でハイブリダイズすることができる。「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部の逆方向反復を有する場合、伸長プライマー分子は、図５Ｃに示すように分子内で、または図５Ａに示すように互いに分子間でハイブリダイズすることができる。
【0105】
「Ｂ」領域の配列が相補的な「Ａ」領域の部分は、好ましくは「Ａ」領域の５’末端またはその近く（例えば、５’末端から１、２または３ヌクレオチド以内）であり、すなわち、「Ａ」領域が「Ｂ」領域（または「Ｃ」領域が存在する場合に「Ｃ」領域）に隣接する箇所またはその近くである。
【0106】
伸長プライマーの「Ｂ」領域は、好ましくは６～１２ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、伸長プライマーの「Ｂ」領域は、８～１０ヌクレオチド長であり、すなわち８、９または１０ヌクレオチド長である。
【0107】
「Ｃ」領域は、伸長プライマー中に存在する場合、好ましくは１～６ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは１、２、３、４、５または６ヌクレオチド長である。
【0108】
伸長プライマーのＴｍは、好ましくは（必ずしもというわけではない）およそ６８℃～およそ８０℃である。特定の実施形態では、非伸長プライマーのＴｍは、およそ７２℃～およそ７８℃、例えばおよそ７２℃、およそ７３℃、およそ７４℃、およそ７５℃、およそ７６℃、およそ７７℃またはおよそ７８℃である。
【0109】
領域「Ａ」および「Ｂ」の間に位置する任意の領域「Ｃ」は、「Ａ」領域および「Ｂ」領域の間のスペーサーとして働くことができ、伸長プライマーがヘアピンループを形成し、かつ／または制限エンドヌクレアーゼ配列（好ましくは６－カッター配列）をＰＣＲ産物に導入することが可能となる。制限エンドヌクレアーゼ配列は、その全体が「Ｃ」領域内にあっても、または「Ｃ」領域の全てもしくは一部と、「Ｂ」領域および「Ａ」領域のそれぞれの隣接５’および／または３’配列とから形成されていてもよい。標的核酸とのハイブリダイゼーションへの干渉を最小限に抑えるために、「Ｃ」領域は、標的鎖１または標的鎖２に相補的でないのが好ましい。
【0110】
伸長プライマーのＴｍは、好ましくは非伸長プライマーのＴｍよりも少なくともおよそ６℃高い。好ましくは、伸長プライマーは、非伸長プライマーのＴｍよりもおよそ１５℃～３０℃高いＴｍを有する。
【0111】
伸長プライマーの「Ａ」領域のＴｍは、好ましくは標的に（少なくとも７５％）相補的な非伸長プライマーの部分（任意の５’伸長を除く）のＴｍよりもおよそ３℃超高くまたは低くならず、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマーの領域のＴｍは、好ましくは標的にハイブリダイズするリバースプライマーの領域のＴｍよりもおよそ３℃超高くまたは低くならず、逆の場合も同じである。
【0112】
伸長プライマーの「Ａ」領域は、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長であり、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１４～２５ヌクレオチドの範囲である。或る特定の実施形態では、伸長プライマーの「Ａ」領域は１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
【0113】
６．２．３．４．２．非伸長プライマー
非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。或る特定の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。或る特定の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態では、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【0114】
別の言い方をすれば、様々な実施形態において、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域の相補体に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。通例、プライマー配列と標的配列との間の任意のミスマッチがより５’側に位置するほど、それらがＰＣＲ反応中に許容される可能性が高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、それでも標的ＤＮＡを効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計することができる。
【0115】
非伸長プライマーは、１、２または３ヌクレオチドの５’テールをさらに有していてもよい。
【0116】
非伸長プライマーのＴｍは、好ましくは（必ずしもというわけではない）およそ５０℃～およそ６２℃である。特定の実施形態では、非伸長プライマーのＴｍは、およそ５９℃～およそ６２℃、例えばおよそ５９℃、およそ６０℃、およそ６１℃またはおよそ６２℃である。
【0117】
非伸長プライマーのＴｍは、好ましくは伸長プライマーのＴｍよりも少なくともおよそ６℃低い。好ましくは、非伸長プライマーは、伸長プライマーのＴｍよりもおよそ１５℃～３０℃低いＴｍを有する。
【0118】
標的に（少なくとも７５％）相補的な非伸長プライマーの領域（任意の５’伸長を除く）のＴｍは、好ましくは伸長プライマーの「Ａ」領域のＴｍよりもおよそ３℃超高くまたは低くならず、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマーの領域のＴｍは、好ましくは標的にハイブリダイズするリバースプライマーの領域のＴｍよりもおよそ３℃超高くまたは低くならず、逆の場合も同じである。
【0119】
非伸長プライマーは、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド長であり、好ましくは１２～３０ヌクレオチド、より好ましくは１４～２５ヌクレオチドの範囲である。或る特定の実施形態では、非伸長プライマーは１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド長である。
【0120】
６．２．３．４．３．汎用プライマー
幾つかの非対称ＰＣＲ法では、例えば米国特許第８，７３５，０６７号明細書に記載されるように、フォワードおよびリバースプライマー対に加えて、プライマーの一方に付加した５’オリゴヌクレオチドテールと同様の配列を有する第３の「汎用」プライマーが使用される。汎用プライマーは、初期ＰＣＲサイクル後に増幅反応に関与し、多重増幅反応における異なる標的の増幅効率の「バランスを取る」ことを意図したものである。
幾つかの非対称ＰＣＲ法では、例えば米国特許第８，７３５，０６７号明細書に記載されるように、フォワードおよびリバースプライマー対に加えて、プライマーの一方に付加した５’オリゴヌクレオチドテールと同様の配列を有する第３の「汎用」プライマーが使用される。汎用プライマーは、初期ＰＣＲサイクル後に増幅反応に関与し、多重増幅反応における異なる標的の増幅効率の「バランスを取る」ことを意図したものである。
【0121】
理論に束縛されるものではないが、改良非対称ＰＣＲ法との関連では伸長プライマーの「Ｂ」領域の配列から本質的になる配列を有する、米国特許第８，７３５，０６７号明細書に記載されるような汎用プライマー（かかる汎用プライマーを本明細書で「汎用プライマー」と称する）の組入れは、本明細書に記載される非対称プライマー対を用いた増幅効率を低下させると考えられる。したがって、本明細書に記載される改良非対称ＤＮＡ増幅法は、好ましくは汎用プライマーの非存在下で行われる。
【0122】
関連の実施形態では、本明細書に記載される改良非対称ＤＮＡ増幅法は、標的領域１つ当たり単一の非対称プライマー対を利用することができる、すなわち、個々のプライマーが、混合塩基をプライマーの或る特定の位置に組み入れることによって生じる密接に関連した配列を有するプライマー分子の混合物であり得ることを認めた上で、任意の付加的なプライマーを含まない。明確にし、誤解を避けるために、本実施形態は、単一の非対称プライマー対が各アンプリコンに使用される限りにおいて、多重増幅反応への複数の非対称プライマー対の使用を除外するものではない。
【0123】
６．２．３．５．リアルタイムＰＣＲ増幅
本開示の方法に用いられるＰＣＲ増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ増幅反応であってもよい。
本開示の方法に用いられるＰＣＲ増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ増幅反応であってもよい。
【0124】
リアルタイムＰＣＲは、増幅ＤＮＡ産物の蓄積を反応の進行とともに、通例、ＰＣＲサイクル毎に１回測定することができる、成長している一連の手法を指す。経時的な産物の蓄積のモニタリングにより、反応の効率を決定するとともに、ＤＮＡ鋳型分子の初期濃度を推定することが可能である。リアルタイムＰＣＲに関する大まかな詳細については、Real-Time PCR: An Essential Guide, K. Edwards et al., eds., Horizon Bioscience, Norwich, U.K. (2004)を参照されたい。
【0125】
現在、増幅ＤＮＡの存在を示す幾つかの異なるリアルタイム検出化学が存在している。これらの殆どが、ＰＣＲプロセスの結果として特性を変化させる蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学には、二本鎖ＤＮＡへの結合後に蛍光効率が高まるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ等）が含まれる。他のリアルタイム検出化学には、色素の蛍光効率が別の光吸収部分またはクエンチャーとの近接性に強く依存する現象である蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が利用される。これらの色素およびクエンチャーを通例、ＤＮＡ配列特異的プローブまたはプライマーに付着させる。ＦＲＥＴベースの検出化学には、加水分解プローブおよび立体構造プローブが含まれる。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等）は、ポリメラーゼ酵素を用いて、オリゴヌクレオチドプローブに付着したクエンチャー色素分子からレポーター色素分子を切断する。立体構造プローブ（分子ビーコン等）は、オリゴヌクレオチドに付着した色素を利用し、標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの立体構造変化によって蛍光発光が変化する（例えば、Tyagi S et al., 1996, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 14, 303-308を参照されたい）。
【0126】
リアルタイムＰＣＲは、対称または非対称であり、例えば、セクション６．２．３．３またはセクション６．２．３．４に記載される対称または非対称ＰＣＲ増幅反応の反応混合物中の加水分解プローブ分子を用いて行うことができる。
【0127】
リアルタイムＰＣＲを行うために使用することができる市販の機器は多数ある。利用可能な機器の例としては、Applied BiosystemsのＰＲＩＳＭ ７５００、Bio-RadのｉＣｙｌｃｅｒおよびRoche DiagnosticsのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ２．０が挙げられる。
【0128】
６．２．４．プローブ分子
本開示は、ＰＣＲ反応において生成するアンプリコンの配列特異的検出に適したプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブ分子を提供する。
本開示は、ＰＣＲ反応において生成するアンプリコンの配列特異的検出に適したプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブ分子を提供する。
【0129】
上首尾のオリゴヌクレオチドプローブ分子設計のためのパラメーターは、当該技術分野で既知であり、プローブ分子長、クロスハイブリダイゼーション効率、融解温度、ＧＣ含量、自己アニーリング、および二次構造を形成する能力が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、マイクロアレイ、例えばアドレス可能なアレイへのオリゴヌクレオチドプローブ分子の使用を提供し、この場合、プローブ分子が基板、例えば膜、例えばガラス基板、例えばプラスチック基板、例えばポリマーマトリックス基板に固定され、同様ないし同一の配列、例えば少なくとも７５％、例えば８０％、例えば８５％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９６％、例えば９７％、例えば９８％、例えば９９％、またはさらには１００％の類似性または同一性を有する配列を有するアンプリコンとのオリゴヌクレオチドプローブ分子のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で核酸に曝露される。
【0130】
幾つかの実施形態では、本開示の方法に使用されるオリゴヌクレオチドプローブ分子は、第１のゲノム配列および／または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％（例えば、９０％～９５％または９５％～１００％）相補的なヌクレオチド配列を含む。
【0131】
例示的なオリゴヌクレオチドプローブ分子は、実施例に記載され、配列番号１～７のヌクレオチド配列を含むプローブ分子が含まれる。
【0132】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ分子は、アレイ上に存在する。各プローブ分子は、オリゴヌクレオチドプローブ分子がアレイ上に存在する位置的にアドレス可能なプローブ分子となるように、アレイ上の別々の位置にあり、アレイ上のその位置によって区別可能とすることができる。
【0133】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ分子は、ポリチミジンテール、例えば最大１０個のヌクレオチドを含むポリチミジンテール、または例えば最大１５個のヌクレオチドを含むポリチミジンテール、または例えば最大２０個のヌクレオチドを含むポリチミジンテールを含む。一実施形態では、ポリチミジンテールは、１０～２０個のヌクレオチド、例えば１５個のヌクレオチドを含む。ポリチミジンテールは、プローブ分子をアレイに付着させる場合に有用な可能性があり、ポリチミジンテールは、アレイ基板と、標的配列に対して部分的または完全な相補性を有するプローブ分子の領域との間のスペーサーとして働く。
【0134】
オリゴヌクレオチドプローブ分子は標識されていても、または非標識であってもよい。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ分子は標識されている。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ分子は非標識である。オリゴヌクレオチドプローブ分子は、例えばセクション６．２．３またはセクション６．２．３．１に記載されるような蛍光色素であり得る蛍光レポーターで標識することができる。標識オリゴヌクレオチドプローブ分子は、例えばリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。リアルタイムＰＣＲ用の標識オリゴヌクレオチドプローブ分子は、プローブ分子の一方の端に蛍光レポーターを含み、プローブ分子の他方の端にレポーターの蛍光を消光するクエンチャー部分を含んでいてもよい。ＰＣＲ中に、プローブ分子がアニーリング段階でその標的配列にハイブリダイズすることができ、ポリメラーゼが伸長段階でプローブ分子に達した後、その５’－３’エキソヌクレアーゼがプローブを分解し、蛍光レポーターとクエンチャーとを物理的に分離することで、蛍光が増加し、これを測定することができる。
【0135】
プローブ分子上の蛍光標識およびクエンチャー部分の位置は、２つの部分の間でＦＲＥＴが生じ得るようなものであってもよい。蛍光標識を、例えばプローブ分子の５’末端またはその近くとし、クエンチャー部分をプローブの３’末端またはその近くとすることができる。幾つかの実施形態では、蛍光標識とクエンチャーとの間の分離距離は、約１４～約２２ヌクレオチドであるが、約６、約８、約１０または約１２ヌクレオチドのような他の距離を用いてもよい。用いることができる付加的な距離としては、約１４、約１６、約１８、約２０または約２２ヌクレオチドが挙げられる。
【0136】
リアルタイムＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプローブ分子に使用することができる例示的な蛍光標識は、ＦＡＭまたは６－ＦＡＭであり、代表的なクエンチャー部分はＭＧＢである。レポーター部分の他の非限定的な例としては、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａおよびテキサスレッドが挙げられ、クエンチャーまたはアクセプター蛍光部分の非限定的な例としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（ブラックホールクエンチャー）、ＬＣ ＲＥＤ ６４０、およびＣＹ５等のシアニン色素が挙げられる。当業者には理解されるように、レポーターおよびクエンチャー／アクセプター部分の任意の対を、それらがドナーからクエンチャー／アクセプターへの伝達が起こり得るように適合する限りにおいて使用することができる。さらに、好適なドナーおよびクエンチャー／アクセプターの対は、当該技術分野で既知であり、本明細書で提供される。対の選択は、当該技術分野で既知の任意の手段によって行うことができる。特注のリアルタイムＰＣＲプローブ分子が、例えばThermoFisher Scientific、Sigma-Aldrich等から市販されている。
【0137】
６．２．５．仮想プローブ
便宜上、本セクション（および本開示の他のセクション）では、仮想プローブでプローブすることができるアンプリコンおよびアンプリコンセットに言及する。しかしながら、仮想プローブを同様にゲノム断片等の非増幅標的核酸を含有するか、または含有する疑いがあるサンプルをプローブするために使用することができると理解すべきである。
便宜上、本セクション（および本開示の他のセクション）では、仮想プローブでプローブすることができるアンプリコンおよびアンプリコンセットに言及する。しかしながら、仮想プローブを同様にゲノム断片等の非増幅標的核酸を含有するか、または含有する疑いがあるサンプルをプローブするために使用することができると理解すべきである。
【0138】
第１のアンプリコンセット（第１のゲノム中の領域に対応する単一の第１のアンプリコンまたは第１のゲノム中の異なる領域に対応する複数の第１のアンプリコンを含む）と第２のアンプリコンセット（第２のゲノム中の領域に対応する単一の第２のアンプリコンまたは第２のゲノム中の異なる領域に対応する複数の第２のアンプリコンを含む）との間のヌクレオチドミスマッチの数は、比較的小さいことがあり、個々のオリゴヌクレオチドプローブ分子は、第１および第２のアンプリコンセットを個別に区別することができない可能性がある。本発明者らは予期せぬことに、それにもかかわらず、仮想プローブを用いることにより、かかる状況で第１および第２のアンプリコンセットを区別し得ることを発見した。仮想プローブのプローブ分子は、第１および第２のアンプリコンセットを仮想プローブのプローブ分子でプローブした場合に観察される異なるハイブリダイゼーションパターンにより、２つのアンプリコンセットを個別に区別することはできないが、集合的に区別することができる。
【0139】
プローブ分子が第１のアンプリコンセットにハイブリダイズした場合およびプローブ分子が第２のアンプリコンセットにハイブリダイズした場合に（例えば、アレイ上でまたはリアルタイムＰＣＲ反応中に）、仮想プローブを構成する２つ以上のプローブ分子のシグナルパターンに違いが見られるように、第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンのヌクレオチド配列は、仮想プローブに使用されるプローブ分子が結合し得るアンプリコンの領域に少なくとも１つ（例えば１つ、少なくとも２つ、２つ、少なくとも３つまたは３つ）のヌクレオチドミスマッチを有する必要がある。シグナルパターンの違いを用いて、第１および第２のアンプリコンセットを特定および／または区別することができる。仮想プローブを用いて第１のアンプリコンセットが存在することが決定された場合、第１のアンプリコンセットが作製されたサンプルが第１のアンプリコンセットに対応するゲノム（さらに言うと、ゲノムがサンプル中に含まれる生物）を含有すると結論付けることができる。同様に、仮想プローブを用いて第２のアンプリコンセットが存在することが決定された場合、第２のアンプリコンセットが作製されたサンプルが第２のアンプリコンセットに対応するゲノム（さらに言うと、ゲノムがサンプル中に含まれる生物）を含有すると結論付けることができる。
【0140】
ＰＣＲ増幅産物にハイブリダイズした際の仮想プローブの個々のプローブ分子のシグナル（例えば、アレイ上の位置によって区別可能であるか、または異なる蛍光標識に対応するシグナル）を、例えば１つ以上のブール演算子、１つ以上の関係演算子、または１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって任意の組合せで組み合わせて、第１および第２のアンプリコンセットを区別することができる。幾つかの実施形態では、シグナルを１つ以上のブール演算子によって組み合わせる。他の実施形態では、シグナルを１つ以上の関係演算子によって組み合わせる。さらに他の実施形態では、シグナルを１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせる。
【0141】
場合によっては、ブール演算子「ＡＮＤ」、「ＯＲ」および「ＮＯＴ」を用いて仮想プローブの個々のプローブ分子からのシグナルを組み合わせ、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。一例として、２つの相同アンプリコン（この例では、「アンプリコンＡ」および「アンプリコンＢ」）に対する仮想プローブは、２つのプローブ分子（この例では、「プローブ１」および「プローブ２」）からなる。プローブ１およびプローブ２はどちらもアンプリコンＡに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ１はアンプリコンＢに特異的にハイブリダイズすることが可能であるが、プローブ２はそうではない。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、ＰＣＲ増幅産物に対するプローブ１のハイブリダイゼーションによるシグナルおよびプローブ２のハイブリダイゼーションによるシグナルがどちらも陽性である場合（ブール演算子「ＡＮＤ」を用いて「プローブ１ＡＮＤプローブ２」と表すことができる）、アンプリコンＡがＰＣＲ増幅産物中に存在すると決定することができる。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、ＰＣＲ産物に対するプローブ１のハイブリダイゼーションによるシグナルが陽性であり、ＰＣＲ産物に対するプローブ２のハイブリダイゼーションによるシグナルが陽性でない場合（ブール演算子「ＮＯＴ」を用いて「プローブ１ＮＯＴプローブ２」と表すことができる）、アンプリコンＢがＰＣＲ増幅産物中に存在すると決定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションシグナルがバックグラウンドレベルを超える場合、ハイブリダイゼーションシグナルを陽性であるとみなすことができる。例えば、シグナルが観察されないか、または観察されたシグナルがバックグラウンドレベルを超えない場合、ハイブリダイゼーションシグナルを陽性でないとみなすことができる。
【0142】
場合によっては、関係演算子「より大きい」（「＞」）および「より小さい」（「＜」）を用いて仮想プローブの個々のプローブ分子からのシグナルを組み合わせ、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる。一例として、２つの相同アンプリコン（この例では、「アンプリコンＣ」および「アンプリコンＤ」）に対する仮想プローブは、２つのプローブ分子（この例では、「プローブ３」および「プローブ４」）からなる。プローブ３およびプローブ４はどちらもアンプリコンＣおよびアンプリコンＤに特異的にハイブリダイズすることが可能である。プローブ３およびプローブ４がアンプリコンＣにハイブリダイズする場合、プローブ３のシグナルは、プローブ４のシグナルよりも大きい（「より大きい」関係演算子を用いて「プローブ３＞プローブ４」と表すことができる）。一方、プローブ３およびプローブ４がアンプリコンＤにハイブリダイズする場合、プローブ３のシグナルは、プローブ４のシグナルよりも小さい（「より小さい」関係演算子を用いて「プローブ３＜プローブ４」と表すことができる）。このため、ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、プローブ３のシグナルがプローブ４のシグナルよりも大きい場合、アンプリコンＣがＰＣＲ増幅産物中に存在すると決定することができ、プローブ３のシグナルがプローブ４のシグナルよりも小さい場合、アンプリコンＤがＰＣＲ増幅産物中に存在すると決定することができる。
【0143】
ハイブリダイゼーションシグナルを組み合わせる場合、シグナルは例えば、絶対シグナル、正規化シグナルまたは微量シグナルであり得る（例えば、仮想プローブに使用されるプローブ分子のシグナルの値は、例えば実施例３に記載されるような所定の関数を用いてスケーリングすることができる）。プローブ分子のシグナルは、例えば所定のカットオフを超える場合に陽性であるとみなすことができる。カットオフを例えば、所与のプローブ分子について観察されるバックグラウンドシグナル（例えば、非特異的なハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナル）でまたはそのバックグラウンドシグナルを超えて設定することができる。このため、例えば、プローブ分子のシグナルが観察されるが、シグナルがバックグラウンドレベルを超えない場合、シグナルを陽性でないとみなすことができる。
【0144】
一実施形態では、仮想プローブは、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子（例えば、２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含む。別の実施形態では、仮想プローブは、３つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子（例えば、３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子または４つのオリゴヌクレオチドプローブ分子）を含む。
【0145】
幾つかの実施形態では、第１の生物および第２の生物に対する仮想プローブは、２つのプローブ分子からなる。一実施形態では、２つのプローブ分子は、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン（第１の生物に対応する）および第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン（第２の生物に対応する）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、第２のアンプリコンセットのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であるが、第１のアンプリコンセットのアンプリコンにはハイブリダイズすることができない第２のプローブ分子とを含む。かかる実施形態では、サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性でない場合に第１の生物がサンプル中に存在すると決定することができる。一方、ＰＣＲ増幅産物をプローブした際に第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合、第２の生物がサンプル中に存在すると決定することができる。
【0146】
幾つかの実施形態では、第１の生物および第２の生物に対する仮想プローブは、３つのプローブ分子からなる。一実施形態では、３つのプローブ分子は、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン（第１の生物に対応する）および第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン（第２の生物に対応する）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、第１のプローブとは異なる第２のプローブ分子と、第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、第１および第２のプローブ分子とは異なる第３のプローブ分子とを含む。かかる実施形態では、ＰＣＲ増幅産物をプローブする際に観察される３つのプローブ分子の相対シグナルを用いて、ＰＣＲ増幅産物の調製に使用されたサンプルが第１の生物または第２の生物を含有するかを決定することができる。
【0147】
仮想プローブを用いて相同ゲノム配列を区別することができるため、近縁の生物、例えば近縁の微生物を区別するために仮想プローブを使用することができる。例えば、仮想プローブを用いて同じ目、同じ科、同じ属、同じ群、またはさらには同じ種（例えば、同じ種の異なる株）の微生物を区別することができる。例えば、仮想プローブを用いてラクトバチルス種とリステリア種とを区別し、コリネバクテリウム種とプロピオニバクテリウム種とを区別し、ミクロコッカス種とコクリア種とを区別し、パスツレラ種とヘモフィラス種とを区別し、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種とコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種とを区別し、ストレプトコッカス種（例えば、Ｓ．アンギノーサス（S. anginosus）、Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）、Ｓ．ミティス（S. mitis）、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）、Ｓ．アガラクティアエ（S. agalactiae）、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）、Ｓ．ガロリティカス（S. gallolyticus）、Ｓ．インファンタリウス（S. infantarius）、Ｓ．ベスティブラリス（S. vestibularis）、Ｓ．サリバリウス（S. salivarius）、Ｓ．ハイオインテスティナリス（S. hyointestinalis）、Ｓ．コンステラタス（S. constellatus）、Ｓ．インターメディウス（S. intermedius）、Ｓ．オラリス（S. oralis）、Ｓ．サングイニス（S. sanguinis）、Ｓ．パラサングイニス（S. parasanguinis））を区別し、スタフィロコッカス種（例えば、Ｓ．ルグドゥネンシス（S. lugdunensis）、Ｓ．エピデルミディス（S. epidermidis））を区別し、エンテロコッカス種（例えば、Ｅ．フェカーリス（E. fecalis）、Ｅ．フェシウム（E. faecium））を区別し、クロストリジウム種（例えば、Ｃ．パーフリンゲンス（C. perfringens）、Ｃ．クロストリディオフォルメ（C. clostridiiforme）、Ｃ．イノキュウム（C. innocuum））を区別し、バチルス種（例えば、Ｂ．セレウス（B. cereus）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans））を区別し、シュードモナス種（例えば、Ｐ．エルジノーサ（P. aeruginosa）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．スタッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｐ．メンドシナ（P. mendocina））を区別し、アシネトバクター種（例えば、Ａ．バウマンニイ（A. baumannii）、Ａ．ルヴォフィイ（A. lwoffii）、Ａ．ウルシンギイ（A. ursingii）、Ａ．ヘモリティカス（A. haemolyticus）、Ａ．ジュニイ（A. junii））を区別することができる。
【0148】
セクション６．２．５．１～６．２．５．３およびセクション７の実施例１～５に、異なるタイプの近縁の細菌を特定および／または区別するための例示的な仮想プローブを記載する。
【0149】
６．２．５．１．コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する仮想プローブ
本開示は、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種を含むサンプルと、コアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むか、またはそれからなる。配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を有するプローブ分子は、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
本開示は、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種を含むサンプルと、コアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むか、またはそれからなる。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むか、またはそれからなる。配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を有するプローブ分子は、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
【0150】
サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、第１のオリゴヌクレオチドプローブ（「プローブ１」）のシグナルが陽性であり、かつ第２のオリゴヌクレオチドプローブ（「プローブ２」）のシグナルが陽性でない場合（「ＮＯＴ」演算子を用いて「プローブ１ＮＯＴプローブ２」と表すことができる）、サンプルがコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種を含有すると決定することができる。コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する例示的な仮想プローブは、実施例１にさらに記載される。
【0151】
６．２．５．２．ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）およびストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）に対する仮想プローブ
本開示は、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）またはストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）を含むサンプルとストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子は、Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
本開示は、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）またはストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）を含むサンプルとストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むか、またはそれからなる。配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子は、Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
【0152】
サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、第１のプローブ（「プローブ１」）のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ（「プローブ２」）のシグナルが陽性でない場合（「ＮＯＴ」演算子を用いて「プローブ１ＮＯＴプローブ２」と表すことができる）、サンプルがＳ．ゴルドニイ（S. gordonii）を含有すると決定することができる。サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、プローブ１のシグナルが陽性であり、かつプローブ２のシグナルが同様に陽性である場合（「ＡＮＤ」演算子を用いて「プローブ１ＡＮＤプローブ２」と表すことができる）、サンプルがＳ．アンギノーサス（S. anginosus）を含有すると決定することができる。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する例示的な仮想プローブは、実施例２にさらに記載される。
【0153】
６．２．５．３．ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）に対する仮想プローブ
本開示は、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）を含むサンプルとストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第３の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。配列番号５、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号５、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブ分子は、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
本開示は、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）がサンプル中に存在するかを決定するために使用することができ、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）を含むサンプルとストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を含むサンプルとを区別するために使用することができる仮想プローブを提供する。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第１の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第２の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むか、またはそれからなる。Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する仮想プローブに使用することができる第３の例示的なプローブ分子は、ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むか、またはそれからなる。配列番号５、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列は、１６Ｓ ＲＮＡアンプリコンをプローブするように設計される。このため、配列番号５、配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列を有するプローブ分子は、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）の１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム配列を増幅するように設計されたプライマーを用いて行われるＰＣＲ増幅反応によって生成するアンプリコンをプローブするために使用することができる。プローブ分子は例えば、アレイ上に含まれるか、またはリアルタイムＰＣＲ反応に使用することができる。
【0154】
サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、第２のプローブ（「プローブ２」）および／または第３のプローブ（「プローブ３」）のシグナルが、スケーリングされた第１のプローブ（「プローブ１」）のシグナルよりも小さい場合、サンプルがＳ．ミティス（S. mitis）を含有すると決定することができる。サンプルがＳ．ミティス（S. mitis）を含有するかを決定するためのシグナル間の関係は、ブール演算子および関係演算子を用いて「（プローブ２ＯＲプローブ３）＜（プローブ１）／ｎ」と表すことができ、ここで、ｎはプローブ１のシグナルのスケーリングに使用される所定の値である。サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、プローブ２および／またはプローブ３のシグナルが、スケーリングされたプローブ１のシグナルよりも大きい場合、サンプルがＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有すると決定することができる。サンプルがＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有するかを決定するためのシグナル間の関係は、ブール演算子および関係演算子を用いて「（プローブ２ＯＲプローブ３）＞（プローブ１）／ｎ」と表すことができる。「ｎ」の好適な値は例えば、Ｓ．ミティス（S. mitis）を含有することが知られるサンプルから作製されたＰＣＲ産物をプローブし、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有することが知られるサンプルからのＰＣＲ産物をプローブすることによって決定することができる。
【0155】
代替的には、サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、プローブ１のシグナルで除算したプローブ３のシグナルが、所定の値「ｎ」よりも小さい場合、サンプルがＳ．ミティス（S. mitis）を含有すると決定することができる。サンプルから調製されたＰＣＲ増幅産物をプローブした際に、プローブ１のシグナルで除算したプローブ３のシグナルが「ｎ」よりも大きい場合、サンプルがＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有すると決定することができる。「ｎ」の好適な値は例えば、Ｓ．ミティス（S. mitis）を含有することが知られるサンプルから作製されたＰＣＲ産物をプローブし、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有することが知られるサンプルからのＰＣＲ産物をプローブすることによって決定することができる。
【0156】
Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に対する例示的な仮想プローブは、実施例３にさらに記載される。
【0157】
６．３．アレイ
本開示は、それぞれが第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するのに有用であり得る１つ以上の仮想プローブを含むアドレス可能なアレイを提供する。
本開示は、それぞれが第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するのに有用であり得る１つ以上の仮想プローブを含むアドレス可能なアレイを提供する。
【0158】
本開示のアドレス可能なアレイは、本明細書に記載される方法に使用することができる。本開示のアドレス可能なアレイは、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み得る。幾つかの実施形態では、仮想プローブを構成するオリゴヌクレオチドプローブ分子の群（通例、２つまたは３つの異なるプローブ分子）の各プローブ分子は、仮想プローブにより区別されることが意図される第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチド（例えば１５～２０個、１５～３０個、２０～４０個、２０～３０個または３０～４０個の連続したヌクレオチド）に９０％～１００％（例えば、９０％～９５％または９５％～１００％）相補的なヌクレオチド配列を含む。
【0159】
アドレス可能なアレイは任意に、１つ以上の対照プローブ分子（例えば、ＤＮＡ抽出および増幅工程の効率を評価するのに有用な抽出および増幅対照、ならびに／またはアレイへのＤＮＡハイブリダイゼーションの効率を評価するのに有用なハイブリダイゼーション対照）をさらに含み得る。
【0160】
幾つかの実施形態では、アレイのプローブ分子はポリチミジンテール、例えば最大１０個のヌクレオチドを含むポリチミジンテール、または例えば最大１５個のヌクレオチドを含むポリチミジンテール、または例えば最大２０個のヌクレオチドを含むポリチミジンテールを含む。幾つかの実施形態では、ポリチミジンテールは１０マー～２０マー、例えば１５マーである。
【0161】
幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、１２個以上のプローブ分子、例えば１２～１００個のプローブ分子、または例えば１２～５０個のプローブ分子、または例えば２５～７５個のプローブ分子、または例えば５０～１００個のプローブ分子を含む。幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、１２個のプローブ分子を含む。他の実施形態では、アドレス可能なアレイは、１４個のプローブ分子を含む。さらに他の実施形態では、アドレス可能なアレイは、８４個のプローブ分子を含む。
【0162】
幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、少なくとも２個の仮想プローブ、例えば少なくとも３個の仮想プローブ、もしくは例えば少なくとも５個の仮想プローブ、もしくは例えば少なくとも１０個の仮想プローブに対するオリゴヌクレオチドプローブを含み、または例えば、アドレス可能なアレイは、最大１０個もしくは最大１５個の仮想プローブに対するオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【0163】
仮想プローブは、プローブ分子が２つ以上の仮想プローブの構成要素であり得るように重複していてもよい。仮想プローブは、重複していなくてもよい。
【0164】
幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、少なくとも５個の異なるタイプの微生物、例えば細菌を区別することが可能な仮想プローブを含む。他の実施形態では、アドレス可能なアレイは、少なくとも１０個の異なるタイプ、例えば少なくとも２０個の異なるタイプ、例えば少なくとも３０個の異なるタイプ、例えば少なくとも４０個の異なるタイプ、または例えば最大５０個の異なるタイプの微生物、例えば細菌を区別することが可能な仮想プローブを含む。
【0165】
幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、それぞれがサンプル中に存在する可能性がある異なるタイプの微生物、例えば細菌、例えば異なる株または種の細菌を特定することが可能な、少なくとも５個の仮想プローブ、例えば少なくとも１０個の仮想プローブ、例えば少なくとも１５個の仮想プローブ、または例えば少なくとも２０個の仮想プローブを含む。
【0166】
幾つかの実施形態では、本開示のアドレス可能なアレイは、真正細菌の種に由来するゲノム配列と真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列とを識別するための１つ以上の仮想プローブを含む。幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、グラム陽性細菌に由来するゲノム配列とグラム陰性細菌に由来するゲノム配列とを識別するのに適した１つ以上の仮想プローブを含む。幾つかの実施形態では、アドレス可能なアレイは、異なる目の微生物に由来するゲノム配列を識別するのに適した１つ以上の仮想プローブを含む。幾つかの実施形態では、仮想プローブは、異なる科の微生物に由来するゲノム配列を識別するのに適している。幾つかの実施形態では、仮想プローブは異なる属、異なる群および／または異なる種の微生物に由来するゲノム配列を識別するのに適している。
【0167】
本開示のアレイの作製に使用することができる好適なマイクロアレイシステムは、米国特許第９，７３８，９２６号明細書および米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９号明細書に記載されており、それらの内容全体を参照により本明細書に援用するものとする。米国特許第９，７３８，９２６号明細書および米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９号明細書に記載されるマイクロアレイシステムは、三次元架橋ポリマーネットワークを利用するものである。このため、幾つかの実施形態では、本開示のアレイは、米国特許第９，７３８，９２６号明細書に記載されるアレイを含み、アレイのプローブ分子が本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含む。他の実施形態では、本開示のアレイは、米国特許出願公開第２０１８／０３６２７１９号明細書に記載されるアレイを含み、アレイのプローブ分子が本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含む。
【0168】
本開示の一態様では、本開示は、本開示のアレイを用いて第１の生物または第２の生物がサンプル中に存在するかを決定する方法を提供する。例示的な方法は、
第１の生物のゲノム（「第１のゲノム」）および第２の生物のゲノム（「第２のゲノム」）の両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、第１のゲノムおよび第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが生じ、ＰＣＲ増幅反応により、測定可能なシグナルを生じる標識が反応によって生成する任意のＰＣＲ増幅産物に組み込まれる工程と、
ＰＣＲ増幅産物を、それぞれが第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能である２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む１つ以上の仮想プローブを有する本開示のアレイに接触させる工程であって、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子が、第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる工程と、
非結合核酸分子をアレイから洗い流す工程と、
アレイ上の各プローブ分子位置での標識のシグナルを測定する工程と、
プローブ分子にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって生成することがシグナルにより示される場合、本明細書に記載されるようにシグナルを分析して、第１のアンプリコンセットもしくは第２のアンプリコンセットがＰＣＲ増幅反応によって生成するかを決定するか、またはプローブ分子の群にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって生成しないことがシグナルにより示される場合、そのサンプルが第１の生物もしくは第２の生物を含有しないと決定する工程とを含み、
これにより第１の生物または第２の生物がサンプル中に存在するかを決定する。
第１の生物のゲノム（「第１のゲノム」）および第２の生物のゲノム（「第２のゲノム」）の両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて、サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、第１のゲノムおよび第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に、それぞれ第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットが生じ、ＰＣＲ増幅反応により、測定可能なシグナルを生じる標識が反応によって生成する任意のＰＣＲ増幅産物に組み込まれる工程と、
ＰＣＲ増幅産物を、それぞれが第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能である２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む１つ以上の仮想プローブを有する本開示のアレイに接触させる工程であって、２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ分子が、第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる工程と、
非結合核酸分子をアレイから洗い流す工程と、
アレイ上の各プローブ分子位置での標識のシグナルを測定する工程と、
プローブ分子にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって生成することがシグナルにより示される場合、本明細書に記載されるようにシグナルを分析して、第１のアンプリコンセットもしくは第２のアンプリコンセットがＰＣＲ増幅反応によって生成するかを決定するか、またはプローブ分子の群にハイブリダイズするＰＣＲ増幅産物がＰＣＲ増幅反応によって生成しないことがシグナルにより示される場合、そのサンプルが第１の生物もしくは第２の生物を含有しないと決定する工程とを含み、
これにより第１の生物または第２の生物がサンプル中に存在するかを決定する。
【0169】
６．４．システム
本開示は、生物がサンプル中に存在するかを決定するためのシステムを提供する。システムは例えば、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ分子を有するアレイ（例えば、本開示のアレイ）の各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、（ｉｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、仮想プローブ（例えば、本明細書に記載されるような特徴を有する仮想プローブ）を用いてシグナルデータを分析するように構成され、分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサとを備えることができる。
本開示は、生物がサンプル中に存在するかを決定するためのシステムを提供する。システムは例えば、（ｉ）オリゴヌクレオチドプローブ分子を有するアレイ（例えば、本開示のアレイ）の各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、（ｉｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、仮想プローブ（例えば、本明細書に記載されるような特徴を有する仮想プローブ）を用いてシグナルデータを分析するように構成され、分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサとを備えることができる。
【0170】
本開示のシステムに使用することができる光学読取り装置としては、市販のマイクロプレートリーダー（例えば、ＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Promega）、ＡｒｒａｙＰｉｘ（商標）（Arrayit）、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標） ＬＵＸ（Thermo Scientific）、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） ２００ ＰＲＯ（Tecan））が挙げられる。
【0171】
システムは、シグナルデータの分析を実行するためのプロセッサ実行可能命令を含む非一時的記憶媒体（例えばハードディスク、フラッシュドライブ、ＣＤまたはＤＶＤ）を備えていてもよい。
【0172】
システムは、汎用または専用コンピューティングシステム環境または構成を含み得る。本開示のシステムとともに使用することができる既知のコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例としては、パーソナルコンピューター、サーバーコンピューター、スマートフォン、タブレット、ハンドヘルドまたはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースのシステム、ネットワークＰＣ、ミニコンピューター、メインフレームコンピューター、上記のシステムまたはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0173】
本開示のシステムは、プログラムモジュール等のコンピューター実行可能命令を実行することができる。概して、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行するか、または特定の抽象データタイプを実装するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造等を含む。幾つかの実施形態は、通信ネットワークを介して接続される遠隔処理デバイスによってタスクが実行される分散コンピューティング環境でも実施され得る。これらの分散システムは、企業コンピューティングシステムとして知られるものであってもよく、または幾つかの実施形態では、「クラウド」コンピューティングシステムであってもよい。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールは、メモリ記憶デバイスを含むローカルおよび／またはリモートコンピューター記憶媒体の両方に格納され得る。
【0174】
コンピューティング環境は、１つ以上の入力／出力デバイスを含み得る。幾つかのかかる入力／出力デバイスは、ユーザーインターフェースを提供し得る。ユーザーは、キーボード等の入力デバイスおよびマウス等のポインティングデバイスによってコンピューターにコマンドおよび情報を入力することができる。しかしながら、トラックボール、タッチパッドまたはタッチスクリーンを含む他の形態のポインティングデバイスを使用してもよい。
【0175】
本開示のシステムは、ユーザーインターフェースの一部を形成し得る出力デバイス、例えばモニターを含む１つ以上の出力デバイスを備えていてもよい。
【0176】
本開示のシステムは、１つ以上のリモートコンピューターとの論理的な接続を用いてネットワーク化環境で運用することができる。リモートコンピューターは、パーソナルコンピューター、サーバー、ルーター、ネットワークＰＣ、ピアデバイスまたは他の一般的なネットワークノードであり得る。論理的な接続には、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）および広域ネットワーク（ＷＡＮ）が含まれるが、他のネットワークが含まれることもある。かかるネットワーキング環境は、オフィス、企業規模のコンピューターネットワーク、イントラネットおよびインターネットにおいて一般的である。代替的または付加的には、ＷＡＮはセルラーネットワークを含んでいてもよい。
【0177】
ＬＡＮネットワーキング環境において使用する場合、本開示のシステムは、ネットワークインターフェースまたはアダプターを介してＬＡＮに接続することができる。ＷＡＮネットワーキング環境において使用する場合、システムは、インターネット等のＷＡＮ上で通信を確立するためのモデムまたは他の手段を備えていてもよい。
【0178】
ネットワーク化環境では、仮想プローブを用いてシグナルデータを分析するためのプログラムモジュールをリモートメモリ記憶デバイス（例えば、ハードドライブまたはフラッシュドライブ）に格納することができる。
【0179】
本開示のシステムは、ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、非結合核酸分子をアレイから洗い流すことができるプレートハンドリングロボットをさらに備えていてもよい。多数のプレートハンドリングロボットが市販されており、かかるロボットを本開示のシステムに使用することができる（例えば、TecanのＭＳＰ ９０００、ＭＳＰ ９２５０もしくはＭＳＰ ９５００、TecanのＣａｖｒｏ（登録商標） Ｏｍｎｉ Ｆｌｅｘ、TricontinentのＴｒｉＴｏｎ（ＸＹＺ）、またはAuroraのＶｅｒｓａ（商標））。
【0180】
６．５．キット
本開示は、本開示の方法への使用に適したキットを提供する。
本開示は、本開示の方法への使用に適したキットを提供する。
【0181】
キットは例えば、本明細書に記載されるリアルタイムＰＣＲ反応への使用に適した２個以上の標識プローブ分子（例えば、２～２０個のプローブ分子、２～１０個のプローブ分子、２～５個のプローブ分子、５～１０個のプローブ分子または１０～２０個のプローブ分子）のセットを含み得る。例えば、キットは、（１）ヌクレオチド配列が配列番号１を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むプローブ分子；（２）ヌクレオチド配列が配列番号３を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むプローブ分子；または（３）ヌクレオチド配列が配列番号５を含むプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むプローブ分子を含むことができる。幾つかの実施形態では、キットは（１）および（２）のプローブ分子の組合せを含む。他の実施形態では、キットは（１）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。他の実施形態では、キットは（２）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。さらに他の実施形態では、キットは（１）、（２）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。
【0182】
他の実施形態では、キットは例えば、本明細書に記載されるアレイ（例えば、非標識プローブ分子）での使用に適した２個以上のプローブ分子（例えば、２～２０個のプローブ分子、２～１０個のプローブ分子、２～５個のプローブ分子、５～１０個のプローブ分子または１０～２０個のプローブ分子）のセットを含み得る。例えば、キットは、（１）ヌクレオチド配列が配列番号１を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号２を含むプローブ分子；（２）ヌクレオチド配列が配列番号３を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号４を含むプローブ分子；または（３）ヌクレオチド配列が配列番号５を含むプローブ分子、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むプローブ分子およびヌクレオチド配列が配列番号７を含むプローブ分子を含むことができる。幾つかの実施形態では、キットは（１）および（２）のプローブ分子の組合せを含む。他の実施形態では、キットは（１）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。他の実施形態では、キットは（２）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。さらに他の実施形態では、キットは（１）、（２）および（３）のプローブ分子の組合せを含む。
【0183】
他の実施形態では、キットは本明細書に記載されるアレイを含み得る。
【0184】
本明細書に記載されるキットは、ＰＣＲ反応を行うための１つ以上の試薬、例えば相同ゲノム配列を増幅するための１つ以上（例えば、２つ）のプライマー、および／またはハイブリダイゼーション反応を行うための１つ以上の試薬、例えば洗浄バッファーをさらに含んでいてもよい。
【0185】
本明細書に記載されるキットは、ＰＣＲ増幅反応用のサンプルを調製するための１つ以上の試薬および／または１つ以上のデバイス、例えば溶解バッファーまたはビーズビーティングシステムをさらに含んでいてもよい。
【0186】
本明細書に記載されるキットは、キットの構成要素を用いて本明細書に記載される方法の工程の一部または全てを行うための１つ以上の容器および／または説明書をさらに含んでいてもよい。
【0187】
７．実施例
７．１．実施例１：コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス（ＣＮＳ）に対する仮想プローブ
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、コアグラーゼ陽性種であり、身体の微生物叢の通常のメンバーである。しかしながら、Ｓ．アウレウス（S. aureus）は日和見病原体となり、皮膚感染症、呼吸器感染症および食中毒を引き起こすことがある。このため、臨床サンプルにおいてＳ．アウレウス（S. aureus）と他のスタフィロコッカス種とを区別し得る試験が臨床的に必要とされている。他のコアグラーゼ陽性スタフィロコッカスも少数存在するが、通常は疾患において大きな役割を果たさないため、殆どの分析目的では無視することができる。
７．１．実施例１：コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス（ＣＮＳ）に対する仮想プローブ
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）は、コアグラーゼ陽性種であり、身体の微生物叢の通常のメンバーである。しかしながら、Ｓ．アウレウス（S. aureus）は日和見病原体となり、皮膚感染症、呼吸器感染症および食中毒を引き起こすことがある。このため、臨床サンプルにおいてＳ．アウレウス（S. aureus）と他のスタフィロコッカス種とを区別し得る試験が臨床的に必要とされている。他のコアグラーゼ陽性スタフィロコッカスも少数存在するが、通常は疾患において大きな役割を果たさないため、殆どの分析目的では無視することができる。
【0188】
スタフィロコッカス種を非特異的に特定するために使用することができるオリゴヌクレオチドプローブである「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ」（ヌクレオチド配列ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を有する）を作製した。言い換えると、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐは、属プローブ分子であり、単独ではサンプル中のＳ．アウレウス（S. aureus）とコアグラーゼ陰性種とを区別することができない。実施例に使用されるプローブ分子名に含まれる数字は、プローブ分子でプローブすることができるアンプリコンを作製するためのフォワードＰＣＲプライマーとプローブの開始点との間のヌクレオチド数での距離を指している。第２のオリゴヌクレオチドプローブである「Ｓａｕ－７１ｐ」（ヌクレオチド配列ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を有する）は、Ｓ．アウレウス（S. aureus）に由来するアンプリコンでは陽性シグナルを与えるが、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカスに由来するアンプリコンでは陽性シグナルを与えない１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ分子である。このため、臨床的に関連するコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種がＳ．アウレウス（S. aureus）のみである場合、コアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種に対する例示的な仮想プローブは、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐおよびＳａｕ－７１ｐからなり得る。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐのシグナルが陽性であり、かつＳａｕ－７１ｐのシグナルが陽性でない場合（「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６－ａｂｐ ＮＯＴ Ｓａｕ－７１ｐ」と表すことができる）、ＰＣＲ増幅産物が作製されたサンプルがコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種を含有すると決定することができる（図１０Ａを参照されたい）。より多くの種が関連する状況では、仮想プローブが付加的なプローブ分子を含んでいてもよい。例えば、ウシ、ウマおよびブタにおいて皮膚疾患を引き起こす恐れがあるＳ．ヒイカス（S. hyicus）が関連する場合、Ｓ．ヒイカス（S. hyicus）に特異的なプローブが同様に陽性でなければ（「ＡｌｌＳｔａｐｈ－１４６ａｂｐ ＮＯＴ Ｓａｕ７１Ｐ ＮＯＴ Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ」と表すことができる）、サンプルがコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種を含有すると決定することができる（図１０Ｂを参照されたい）。
【0189】
７．２．実施例２：ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）およびストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）を識別するための仮想プローブ
ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）は、ヒトの口腔内に通常見られる細菌である。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）は、通常は口腔内で無害であるが、血流に侵入すると急性細菌性心内膜炎を引き起こすことがある。ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）もヒト微生物叢のメンバーであり、免疫不全個体において感染症を引き起こすことが知られている。
ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）は、ヒトの口腔内に通常見られる細菌である。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）は、通常は口腔内で無害であるが、血流に侵入すると急性細菌性心内膜炎を引き起こすことがある。ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）もヒト微生物叢のメンバーであり、免疫不全個体において感染症を引き起こすことが知られている。
【0190】
サンプル中のＳ．アンギノーサス（S. anginosus）とＳ．ゴルドニイ（S. gordonii）とを区別するための仮想プローブに使用することができる２つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を作製した。ヌクレオチド配列ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子「Ｓｔａｎｇｏ８５ｐ」は、Ｓ．アンギノーサス（S. anginosus）およびＳ．ゴルドニイ（S. gordonii）のいずれかがサンプル中に存在する場合に陽性シグナルを生じ得る１６Ｓ ｒＲＮＡプローブ分子である。一方、ヌクレオチド配列ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を有するオリゴヌクレオチドプローブ分子「Ｓａｎｇ１５６ｐ」は、Ｓ．アンギノーサス（S. anginosus）に由来するアンプリコンでは陽性シグナルを与え、Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）に由来するアンプリコンでは陽性シグナルを与えない。Ｓ．ゴルドニイ（S. gordonii）およびＳ．アンギノーサス（S. anginosus）に対する例示的な仮想プローブは、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐおよびＳａｎｇ１５６ｐからなる。ＰＣＲ増幅産物を仮想プローブでプローブし、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐのシグナルが陽性であり、かつＳａｎ１５６ｐのシグナルが陽性でない場合（「Ｓｔａｎｇｏ８５ｐ ＮＯＴ Ｓａｎｇ１５６ｐ」と表すことができる）、ＰＣＲ増幅産物の調製に使用したサンプルがＳ．ゴルドニイ（S. gordonii）を含有すると決定することができ、Ｓｔａｎｇｏ８５ｐのシグナルが陽性であり、かつＳａｎ１５６ｐのシグナルが陽性である場合（「Ｓｔａｎｇｏ８５ｐ ＡＮＤ Ｓａｎｇ１５６ｐ」と表すことができる）、サンプルがＳ．アンギノーサス（S. anginosus）を含有すると決定することができる。
【0191】
７．３．実施例３：ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）を識別するための仮想プローブ
ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、どちらも病原性であり得るが、１６Ｓ ｒＲＮＡがほぼ同一であるため、１６Ｓ ｒＲＮＡ用の単一オリゴヌクレオチドプローブ分子を用いて２つの種を区別することは困難である。
ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）は、どちらも病原性であり得るが、１６Ｓ ｒＲＮＡがほぼ同一であるため、１６Ｓ ｒＲＮＡ用の単一オリゴヌクレオチドプローブ分子を用いて２つの種を区別することは困難である。
【0192】
Ｓ．ミティス（S. mitis）とＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）とを区別するための仮想プローブに使用することができる３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を作製した。ヌクレオチド配列ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を有する第１のプローブである「ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ」は、異なるストレプトコッカス種を区別することができない属プローブ分子である。ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を有する第２のプローブである「Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ」は、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に由来するゲノム配列を含むが、単独ではＳ．ミティス（S. mitis）とＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）とを区別するために使用することができない。ヌクレオチド配列ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を有する第３のプローブである「Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ」は、Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐと単一のヌクレオチドが異なり、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）のＳＮＰに相当する。
【0193】
Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンを、３つのプローブ分子を含むアレイに結合させると、３つのプローブ分子のそれぞれについて陽性シグナルが観察された（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。このため、３つのプローブ分子を個別に使用して、Ｓ．ミティス（S. mitis）とＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）とを区別することはできない。しかしながら、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に由来する１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンを３つのプローブでプローブした場合のシグナルパターンを評価することによって、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）に由来するアンプリコンを区別することができた。具体的には、Ｓ．ミティス（S. mitis）を含有するサンプルから作製されたＰＣＲ増幅産物をプローブすることで、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ ＯＲ Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ）＜（ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／３」と表すことができるシグナルパターンが生じ、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有するサンプルから作製されたＰＣＲ増幅産物をプローブすることで、「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｐ ＡＮＤ Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ）＞（ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／３」と表すことができるシグナルパターンが生じた。
【0194】
Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）を含有するサンプルによるハイブリダイゼーションデータの更なる分析から、Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐおよびＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐプローブについて「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）≦０．３９」のシグナルパターンがＳ．ミティス（S. mitis）の存在を示し、Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐおよびＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐプローブについて「（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）＞０．３９」のシグナルパターンがＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）の存在を示すことが決定された。
【0195】
このため、本実施例では仮想プローブの概念が実証される。
【0196】
７．４．実施例４：ストレプトコッカス・ビリダンス（Streptococcus viridians）群を検出するための仮想プローブ
ビリダンスストレプトコッカス群（ＶＧＳ）は、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）群、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）群、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）群およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）群の５つの部分群にまとめられる２４種超を含む、臨床的に関連するグラム陽性細菌の主要群の１つである。ＶＧＳ群細菌は、免疫不全患者において肺炎および敗血症を引き起こすことがある。
ビリダンスストレプトコッカス群（ＶＧＳ）は、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）群、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）群、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）群、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）群およびストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）群の５つの部分群にまとめられる２４種超を含む、臨床的に関連するグラム陽性細菌の主要群の１つである。ＶＧＳ群細菌は、免疫不全患者において肺炎および敗血症を引き起こすことがある。
【0197】
群としてのＶＧＳ種は、遺伝的に異質であるように見え、異なる種が単一のプローブで検出され得ることが示唆される。異なるＶＧＳ群細菌について複数のプローブを設計したが、幾つかの種が他のＶＧＳ部分群に対するプローブと交差反応性を示した（Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）とＳ．ミティス（S. mitis）プローブＳｍｉｔ－７９ｐとの交差反応性を示し、Ｓ．ミティス（S. mitis）およびＳ．オラリス（S. oralis）とＳ．ニューモニエ（S. pneumoniae）プローブＳｐｎｅｕ－２２９ｐおよびＳｐｎｅｕ－２２９ｂｐとの交差反応性を示す図１２を参照されたい）。交差反応性を考慮して、Ｓ．ニューモニエ（S. pneumoniae）とＳ．ミティス（S. mitis）／Ｓ．オラリス（S. oralis）とを区別することができる、Ｓ．ミティス（S. mitis）群細菌に対する仮想プローブを設計した：
Ｓ．ミティス（S. mitis）部分群＝（Ｓｐａｒ－２０５ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）ＯＲ（Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｈｙｏ－１９３ｐ）ＯＲ（Ｓｓａｎｇ－１９３ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｔｍｕ－８６ｐ）ＯＲ（Ｓｔａｎｇｏ－８５ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓａｎｇ－１５６ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ＞０．０１）ＡＮＤ ＩＦ Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＴＨＥＮ（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ≦３。
Ｓ．ミティス（S. mitis）部分群＝（Ｓｐａｒ－２０５ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）ＯＲ（Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｈｙｏ－１９３ｐ）ＯＲ（Ｓｓａｎｇ－１９３ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓｔｍｕ－８６ｐ）ＯＲ（Ｓｔａｎｇｏ－８５ｐ ＡＮＤ ＮＯＴ Ｓａｎｇ－１５６ｐ ＡＮＤ ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ＞０．０１）ＡＮＤ ＩＦ Ｓｍｉｔ－７９ｐ ＴＨＥＮ（Ｓｐｎｅｕ－２２９ｂｐ／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ）／ＡｌｌＳｔｒｅｐ－２６１ｐ≦３。
【0198】
７．５．実施例５：腸内細菌科群の種を検出するための仮想プローブ
腸内細菌科は、病原性種および非病原性種の両方を含むグラム陰性細菌の大きな科である。病原性の科のメンバーには、クレブシエラ種、エンテロバクター種、エシェリキア種、シトロバクター種、セラチア種およびサルモネラ種が含まれる。
腸内細菌科は、病原性種および非病原性種の両方を含むグラム陰性細菌の大きな科である。病原性の科のメンバーには、クレブシエラ種、エンテロバクター種、エシェリキア種、シトロバクター種、セラチア種およびサルモネラ種が含まれる。
【0199】
この科のメンバーの１６ｓ ｒＲＮＡ領域は、種間の遺伝子配列変動が最小であるため、種を区別することが可能な１６Ｓ プローブを設計することは困難である。しかしながら、１６Ｓ 配列の類似性を考慮して、プローブ「Ｅｎｔｂ－２９９ｐ」によって特定され得るパントエア種を除く殆どの科のメンバーを腸内細菌科として特定することができる共通プローブ「Ｅｎｔｂ－１３２ｐ」を設計した。
【0200】
１６Ｓ ｒＲＮＡゲノム領域における腸内細菌科種に由来する種のクラスタリングパターンに従って２つの群プローブを設計した。エンテロバクターおよびクレブシエラ属の種は、プローブ「Ｅｎｋｌｓｐｓｓ－９５ｐ」によって特定することができ、シトロバクター、サルモネラおよびエシェリキア属の種は、プローブ「ＳａＥｓＣｉ－９１ｐ」によって特定することができる。腸内細菌科種を区別することが可能な単一のプローブの設計が困難であることから、腸内細菌科種の階層的特定および識別のために１６Ｓ ｒＲＮＡおよびＩＴＳプローブの組合せを設計した（図１３および図１４を参照されたい）。
【0201】
１６ｓ－２３ｓ ＩＴＳ領域の使用により、Ｅ．クロアカエ（E. cloacae）、Ｅ．アスブリアエ（E. asburiae）およびＥ．ホルメシェイ（E. hormaechei）を含むエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）複合体の種を識別することが可能となった。「Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ」、「Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ」および「ＥＣＣ３－１７２９ｐ」の３つのプローブを組み合わせて使用することで、異なるエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）複合体種の特異的特定が可能となった（図１５を参照されたい）。
Ｅ．クロアカエ（E. cloacae）＝Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．アスブリアエ（E. asburiae）＝Ｅｎｃｌ０１８７１ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．ホルメシェイ（E. hormaechei）＝（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＡＮＤ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）ＮＯＴ Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ
Ｅ．クロアカエ（E. cloacae）＝Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．アスブリアエ（E. asburiae）＝Ｅｎｃｌ０１８７１ｐ ＮＯＴ（Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ ＯＲ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）
Ｅ．ホルメシェイ（E. hormaechei）＝（Ｅｎｃｌ－１８７１ｐ ＡＮＤ ＥＣＣ３－１７２９ｐ）ＮＯＴ Ｅｎｃｌ－１６５９ｐ
【0202】
８．具体的な実施形態
本開示を以下の具体的な実施形態によって例示する。
１．
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる、仮想プローブで試験サンプルをプローブすることと、
（ｂ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば、試験サンプル中の核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを検出および／または定量化し、それにより、第１の生物または第２の生物が、試験サンプルまたは初期サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは試験サンプルを調製した初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
２．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１記載の方法。
３．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて初期サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期サンプル中に存在する場合に第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態２記載の方法。
４．ＰＣＲプライマーが２つ以上のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが複数の第１のアンプリコンを含み、かつ／または第２のアンプリコンセットが複数の第２のアンプリコンを含む、実施形態３記載の方法。
５．（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーの第１のセットを用いて初期サンプルに対して第１のＰＣＲ増幅反応を行うこと、（ｂ）ＰＣＲプライマーの第１のセットとは異なり、第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーの第２のセットを用いて初期サンプルに対して第２のＰＣＲ増幅反応を行うこと、ならびに（ｃ）第１および第２のＰＣＲ反応において生成したアンプリコンを組み合わせ、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期サンプル中に存在する場合に、複数の第１のアンプリコンを含む第１のアンプリコンセットおよび複数の第２のアンプリコンを含む第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態２記載の方法。
６．複数の第１のアンプリコンが第１のゲノム中の異なる領域に対応し、かつ／または複数の第２のアンプリコンが第２のゲノム中の異なる領域に対応する、実施形態４または実施形態５記載の方法。
７．ＰＣＲプライマーが単一のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが単一の第１のアンプリコンからなり、第２のアンプリコンセットが単一の第２のアンプリコンからなる、実施形態３記載の方法。
８．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
９．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
１０．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも３つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
１１．ＰＣＲ増幅反応により、測定可能なシグナルを生じる標識を、反応によって生成する任意のアンプリコンに組み込む、実施形態３から１０までのいずれか１つ記載の方法。
１２．プライマーが標識される、実施形態３から１１までのいずれか１つ記載の方法。
１３．少なくとも１つのプライマーが５’蛍光標識される、実施形態１２記載の方法。
１４．２つ以上のプライマーが５’蛍光標識される、実施形態１２記載の方法。
１５．ＰＣＲ反応が蛍光標識デオキシヌクレオチドを含む、実施形態３から１４までのいずれか１つ記載の方法。
１６．各プローブ分子が、第１のゲノムおよび／または第２のゲノム中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態１から１５までのいずれか１つ記載の方法。
１７．仮想プローブが、互いに１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１から１６までのいずれか１つ記載の方法。
１８．仮想プローブが、互いに１つのヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１７記載の方法。
１９．仮想プローブが、互いに２つのヌクレオチドミスマッチを有するプローブ分子を含む、実施形態１７記載の方法。
２０．仮想プローブのプローブ分子が、アレイ上に存在する、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子である、実施形態１から１９までのいずれか１つ記載の方法。
２１．仮想プローブ中のプローブ分子とＰＣＲ増幅産物とのハイブリダイゼーションによるシグナルを検出および／または定量化することが、仮想プローブ中のプローブ分子の位置での標識を検出および／または定量化することを含む、実施形態２０記載の方法。
２２．工程（ｂ）が、
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物をアレイと接触させることと、
（ｉｉ）非結合核酸分子をアレイから洗い流すことと、
（ｉｉｉ）アレイ上の各プローブ分子位置での標識のシグナル強度を測定することと
を含む、実施形態２０または実施形態２１記載の方法。
２３．アレイが１つ以上の対照プローブ分子を含む、実施形態２０から２２までのいずれか１つ記載の方法。
２４．プローブ分子がオリゴヌクレオチドプローブ分子である、実施形態２０から２３までのいずれか１つ記載の方法。
２５．プローブ分子の１つ以上がポリチミジンテールを有する、実施形態２４記載の方法。
２６．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態２４記載の方法。
２７．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態２６記載の方法。
２８．ＰＣＲ増幅反応がリアルタイムＰＣＲ増幅反応である、実施形態３から１９までのいずれか１つ記載の方法。
２９．
（ａ）各プローブ分子が、区別可能な標識と、標識およびクエンチャー部分の両方がプローブに付着している場合に標識の検出を阻害するクエンチャー部分とを含み、
（ｂ）標識が、リアルタイムＰＣＲ増幅反応中のプローブ分子の切断により測定可能なシグナルを生じ、
（ｃ）各標識が互いに区別可能である、実施形態２８記載の方法。
３０．標識が蛍光標識である、実施形態２９記載の方法。
３１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態２から３０までのいずれか１つ記載の方法。
３２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態２から３１までのいずれか１つ記載の方法。
３３．第１の生物および第２の生物が微生物である、実施形態１から３２までのいずれか１つ記載の方法。
３４．微生物が同じ目のメンバーである、実施形態３３記載の方法。
３５．微生物が同じ科のメンバーである、実施形態３３記載の方法。
３６．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態３５記載の方法。
３７．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態３６記載の方法。
３８．微生物の１つ以上がヒト病原体または動物病原体である、実施形態３３から３７までのいずれか１つ記載の方法。
３９．微生物が細菌、ウイルスまたは真菌である、実施形態３３から３８までのいずれか１つ記載の方法。
４０．微生物が細菌である、実施形態３３から３９までのいずれか１つ記載の方法。
４１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４０記載の方法。
４２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４１記載の方法。
４３．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４１または実施形態４２記載の方法。
４４．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４０から４３までのいずれか１つ記載の方法。
４５．プローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、または（ｉｉｉ）１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせ、第１のゲノムと第２のゲノムとを区別することができる、実施形態１から４４までのいずれか１つ記載の方法。
４６．仮想プローブ中のプローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、または（ｉｉｉ）１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせ、第１のゲノムと第２のゲノムとを区別することをさらに含む、実施形態４５記載の方法。
４７．各ブール演算子が「ＡＮＤ」、「ＯＲ」および「ＮＯＴ」から独立して選択される、実施形態４５または実施形態４６記載の方法。
４８．各関係演算子が「より大きい」（「＞」）および「より小さい」（「＜」）から独立して選択される、実施形態４５から４７までのいずれか１つ記載の方法。
４９．シグナルを１つ以上のブール演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４７までのいずれか１つ記載の方法。
５０．シグナルを１つ以上の関係演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４８までのいずれか１つ記載の方法。
５１．シグナルを１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４８までのいずれか１つ記載の方法。
５２．仮想プローブが２つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１から５１までのいずれか１つ記載の方法。
５３．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であるが、第１の標的核酸にはハイブリダイズしない第２のプローブ分子とを含む、実施形態５２記載の方法。
５４．第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性でない場合に、第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態５３記載の方法。
５５．第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合に、第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態５３または実施形態５４記載の方法。
５６．第１の微生物がコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種であり、第２の微生物がコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
５７．第２の微生物がＳ．アウレウス（S. aureus）である、実施形態５６記載の方法。
５８．第１のプローブ分子が、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態５６または実施形態５７のいずれか１つ記載の方法。
５９．第２のプローブ分子が、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態５６から実施形態５８までのいずれか１つ記載の方法。
６０．第１の微生物がストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
６１．第１のプローブ分子が、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６０記載の方法。
６２．第２のプローブ分子が、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６０または実施形態６１記載の方法。
６３．第１および第２の微生物が腸内細菌科細菌である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
６４．第１および第２の微生物がエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）から選択される、実施形態６３記載の方法。
６５．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１の標的核酸および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第２のプローブ分子とを含む、実施形態５２記載の方法。
６６．第２のプローブ分子のシグナルで除算した第１のプローブ分子のシグナルが、所定のカットオフ値よりも小さい場合に、第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態６５記載の方法。
６７．第２のプローブ分子のシグナルで除算した第１のプローブ分子のシグナルが所定のカットオフ値よりも大きい場合に、第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態６５または実施形態６６記載の方法。
６８．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）である、実施形態６５から６７までのいずれか１つ記載の方法。
６９．第１のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６５から６８までのいずれか１つ記載の方法。
７０．第２のプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６５から６９までのいずれか１つ記載の方法。
７１．仮想プローブが３つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１から５１までのいずれか１つ記載の方法。
７２．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１のプローブ分子とは異なり、第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第２のプローブ分子と、（ｉｉｉ）第１および第２のプローブ分子とは異なり、第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第３のプローブ分子とを含む、実施形態７１記載の方法。
７３．
（ａ）第１のプローブ分子のシグナルが陽性であるか、または第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合、および
（ｂ）第１のプローブ分子のシグナルまたは第２のプローブ分子のシグナルが、第３のプローブ分子のシグナルまたはシグナルの適切な分数よりも小さい場合、
第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態７２記載の方法。
７４．
（ａ）第１のプローブ分子のシグナルおよび第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合、ならびに
（ｂ）第１のプローブ分子のシグナルおよび第２のプローブ分子のシグナルが、第３のプローブ分子のシグナルまたはシグナルの適切な分数よりも大きい場合、
第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態７２または実施形態７３記載の方法。
７５．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）である、実施形態６５から７４までのいずれか１つ記載の方法。
７６．第１のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５記載の方法。
７７．第２のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５または実施形態７６記載の方法。
７８．第３のプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５から７７までのいずれか１つ記載の方法。
７９．ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長となるようにＰＣＲ条件を選択する、実施形態３から７８までのいずれか１つ記載の方法。
８０．ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長となるようにＰＣＲ条件を選択する、実施形態７９記載の方法。
８１．初期サンプルまたは試験サンプルが、１つ以上の微生物による感染のリスクがある、実施形態３３から８０までのいずれか１つ記載の方法。
８２．初期サンプルまたは試験サンプルが、１つ以上の微生物に感染している疑いがある、実施形態３３から８１までのいずれか１つ記載の方法。
８３．初期サンプルまたは試験サンプルが生体サンプル、環境サンプルまたは食品である、実施形態１から８２までのいずれか１つ記載の方法。
８４．初期サンプルまたは試験サンプルが血液、血清、唾液、尿、胃液、消化液、涙液、糞便、精液、膣液、間質液、腫瘍性組織に由来する液体、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、爪、皮膚細胞、血漿、鼻腔スワブから得られる液体、鼻咽頭洗浄液から得られる液体、脳脊髄液、組織サンプル、咽頭スワブから得られる液体もしくは組織、創傷スワブから得られる液体もしくは組織、生検組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帯血、リンパ液、体腔液、痰、膿、微生物叢、胎便、母乳から選択される生体サンプル、または上記のいずれかから処理、抽出もしくは分画されたサンプルである、実施形態８３記載の方法。
８５．生体サンプルが、
（ａ）尿、痰、もしくは尿から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｂ）痰、もしくは痰から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｃ）創傷スワブ、もしくは創傷スワブから処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｄ）血液、もしくは血液から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；または
（ｅ）腹膜透析液、もしくは腹膜透析液から処理、抽出もしくは分画されたサンプル
である、実施形態８４記載の方法。
８６．初期サンプルまたは試験サンプルが土壌、地下水、地表水、廃水から選択される環境サンプル、または上記のいずれかから処理、抽出もしくは分画されたサンプルである、実施形態８３記載の方法。
８７．
（ａ）第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、仮想プローブと、
（ｂ）任意に、１つ以上の対照プローブ分子と
を含む、アドレス可能なアレイ。
８８．少なくとも２つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
８９．少なくとも３つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９０．少なくとも４つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９１．少なくとも５つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９２．少なくとも１０個の仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９３．最大１０個の仮想プローブを含む、実施形態８７から９１までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９４．最大１５個の仮想プローブを含む、実施形態８７から９２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９５．各仮想プローブが２つ～４つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態８７から９４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９６．各仮想プローブが２つまたは３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態９５記載のアドレス可能なアレイ。
９７．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態８７から９６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９８．１２～１００個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
９９．１２～５０個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１００．２５～７５個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０１．５０～１００個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０２．１２個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０３．１４個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０４．８４個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、それぞれ第１の微生物および第２の微生物に由来するゲノム配列である、実施形態８７から１０４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１０６．微生物が同じ目のメンバーである、実施形態１０５記載のアドレス可能なアレイ。
１０７．微生物が同じ科のメンバーである、実施形態１０５記載のアドレス可能なアレイ。
１０８．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態１０７記載のアドレス可能なアレイ。
１０９．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１０８記載のアドレス可能なアレイ。
１１０．プローブ分子の１つ以上がポリチミジンテールを含む、実施形態８７から１０９までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１１．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１１０記載のアドレス可能なアレイ。
１１２．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１１１記載のアドレス可能なアレイ。
１１３．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列がそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態８７から１１２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１４．ｒＲＮＡをコードする遺伝子が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である、実施形態１１３記載のアドレス可能なアレイ。
１１５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列がそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態８７から１１２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１６．少なくとも１つの仮想プローブが、真正細菌の種に由来するゲノム配列と真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列とを識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１５までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１７．少なくとも１つの仮想プローブが、グラム陽性細菌に由来するゲノム配列とグラム陰性細菌に由来するゲノム配列とを識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１８．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる目の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１７までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１９．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる科の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１８までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２０．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる属の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１９までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２１．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる群の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１２０までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２２．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる種の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１２１までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２３．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２４．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２３までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２５．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２６．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２５までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２７．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２８．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２７までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２９．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２８までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１３０．
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる、実施形態８７から１２９までのいずれか１つ記載によるアレイで試験サンプルをプローブすることと、
（ｂ）非結合核酸分子をアレイから洗い流すことと、
（ｃ）アレイ上の各プローブ分子位置でのシグナルを検出および／または定量化することと、
（ｄ）シグナルが、
（ｉ）アレイのプローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が試験サンプル中に存在することを示す場合、シグナルを分析して、第１のゲノムに対応する標的核酸もしくは第２のゲノムに対応する標的核酸がサンプル中に存在するかを決定し、それにより、第１の生物もしくは第２の生物が初期サンプルもしくは試験サンプル中に存在するかを決定すること、または
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）において生成しないことを示す場合、その初期サンプルもしくは試験サンプルが第１の生物もしくは第２の生物を含有しないと決定し、それにより、第１の生物もしくは第２の生物が初期サンプルもしくは試験サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは試験サンプルが由来する初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
１３１．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１３０記載の方法。
１３２．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて初期サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態１３１記載の方法。
１３３．
（ａ）実施形態８７から１２９までのいずれか１つ記載のアレイの各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブについてシグナルデータを分析するように構成され、かつ
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサと
を備える、生物がサンプル中に存在するかを決定するためのシステム。
１３４．ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、非結合核酸分子をアレイから洗い流すことができるプレートハンドリングロボットをさらに備える、実施形態１３３記載のシステム。
１３５．実施形態１３３または１３４のシステムを用いて行われる、実施形態１から８６または１３０から１３２までのいずれか１つ記載の方法。
１３６．ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３７．ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３８．ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３９．ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４０．ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４１．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４２．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４３．ポリチミジンテールを含む、実施形態１３６から１４２までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４４．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１４３記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４５．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１４４記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４６．標識を含む、実施形態１３６から１４５までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４７．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１４８．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１４９．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１５０．各オリゴヌクレオチドプローブ分子がポリチミジンテールを含む、実施形態１４７から１４９までのいずれか１つ記載の仮想プローブ。
１５１．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１５０記載の仮想プローブ。
１５２．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１５１記載の仮想プローブ。
１５３．
（ａ）実施形態１３６から１４６までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子の群と、
（ｂ）任意に、１つ以上の対照プローブ分子と
を含む、アドレス可能なアレイ。
１５４．実施形態１４７から１５２までのいずれか１つ記載の仮想プローブを含むアドレス可能なアレイであって、仮想プローブ中の各プローブ分子がアレイの別々の位置にある、アレイ。
１５５．１つ以上の対照プローブ分子をさらに含む、実施形態１５４記載のアドレス可能なアレイ。
１５６．ヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７を含むプローブ分子から選択される２つ以上のプローブ分子を含む、キット。
１５７．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１５８．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１５９．ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６０．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６１．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６２．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６３．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６４．プローブ分子が標識される、実施形態１５６から１６３までのいずれか１つ記載のキット。
１６５．プローブ分子が蛍光標識で標識される、実施形態１６４記載のキット。
１６６．プローブ分子が非標識である、実施形態１５６から１６３までのいずれか１つ記載のキット。
１６７．第１のゲノム配列および第２の相同ゲノム配列を増幅することが可能な１つ以上のＰＣＲプライマー対をさらに含む、実施形態１５６から１６６までのいずれか１つ記載のキット。
本開示を以下の具体的な実施形態によって例示する。
１．
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる、仮想プローブで試験サンプルをプローブすることと、
（ｂ）仮想プローブ中のプローブ分子と、もしあれば、試験サンプル中の核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを検出および／または定量化し、それにより、第１の生物または第２の生物が、試験サンプルまたは初期サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは試験サンプルを調製した初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
２．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１記載の方法。
３．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて初期サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期サンプル中に存在する場合に第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態２記載の方法。
４．ＰＣＲプライマーが２つ以上のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが複数の第１のアンプリコンを含み、かつ／または第２のアンプリコンセットが複数の第２のアンプリコンを含む、実施形態３記載の方法。
５．（ａ）第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーの第１のセットを用いて初期サンプルに対して第１のＰＣＲ増幅反応を行うこと、（ｂ）ＰＣＲプライマーの第１のセットとは異なり、第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーの第２のセットを用いて初期サンプルに対して第２のＰＣＲ増幅反応を行うこと、ならびに（ｃ）第１および第２のＰＣＲ反応において生成したアンプリコンを組み合わせ、第１のゲノムおよび第２のゲノムが初期サンプル中に存在する場合に、複数の第１のアンプリコンを含む第１のアンプリコンセットおよび複数の第２のアンプリコンを含む第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態２記載の方法。
６．複数の第１のアンプリコンが第１のゲノム中の異なる領域に対応し、かつ／または複数の第２のアンプリコンが第２のゲノム中の異なる領域に対応する、実施形態４または実施形態５記載の方法。
７．ＰＣＲプライマーが単一のプライマー対を含み、第１のアンプリコンセットが単一の第１のアンプリコンからなり、第２のアンプリコンセットが単一の第２のアンプリコンからなる、実施形態３記載の方法。
８．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
９．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも２つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
１０．第１のアンプリコンのヌクレオチド配列および第２のアンプリコンのヌクレオチド配列が、仮想プローブ中の少なくとも１つのプローブ分子にハイブリダイズすることが可能なアンプリコンの領域に少なくとも３つのヌクレオチドミスマッチを有する、実施形態７記載の方法。
１１．ＰＣＲ増幅反応により、測定可能なシグナルを生じる標識を、反応によって生成する任意のアンプリコンに組み込む、実施形態３から１０までのいずれか１つ記載の方法。
１２．プライマーが標識される、実施形態３から１１までのいずれか１つ記載の方法。
１３．少なくとも１つのプライマーが５’蛍光標識される、実施形態１２記載の方法。
１４．２つ以上のプライマーが５’蛍光標識される、実施形態１２記載の方法。
１５．ＰＣＲ反応が蛍光標識デオキシヌクレオチドを含む、実施形態３から１４までのいずれか１つ記載の方法。
１６．各プローブ分子が、第１のゲノムおよび／または第２のゲノム中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、実施形態１から１５までのいずれか１つ記載の方法。
１７．仮想プローブが、互いに１つ以上のヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１から１６までのいずれか１つ記載の方法。
１８．仮想プローブが、互いに１つのヌクレオチドミスマッチを有する２つのプローブ分子を含む、実施形態１７記載の方法。
１９．仮想プローブが、互いに２つのヌクレオチドミスマッチを有するプローブ分子を含む、実施形態１７記載の方法。
２０．仮想プローブのプローブ分子が、アレイ上に存在する、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子である、実施形態１から１９までのいずれか１つ記載の方法。
２１．仮想プローブ中のプローブ分子とＰＣＲ増幅産物とのハイブリダイゼーションによるシグナルを検出および／または定量化することが、仮想プローブ中のプローブ分子の位置での標識を検出および／または定量化することを含む、実施形態２０記載の方法。
２２．工程（ｂ）が、
（ｉ）ＰＣＲ増幅産物をアレイと接触させることと、
（ｉｉ）非結合核酸分子をアレイから洗い流すことと、
（ｉｉｉ）アレイ上の各プローブ分子位置での標識のシグナル強度を測定することと
を含む、実施形態２０または実施形態２１記載の方法。
２３．アレイが１つ以上の対照プローブ分子を含む、実施形態２０から２２までのいずれか１つ記載の方法。
２４．プローブ分子がオリゴヌクレオチドプローブ分子である、実施形態２０から２３までのいずれか１つ記載の方法。
２５．プローブ分子の１つ以上がポリチミジンテールを有する、実施形態２４記載の方法。
２６．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態２４記載の方法。
２７．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態２６記載の方法。
２８．ＰＣＲ増幅反応がリアルタイムＰＣＲ増幅反応である、実施形態３から１９までのいずれか１つ記載の方法。
２９．
（ａ）各プローブ分子が、区別可能な標識と、標識およびクエンチャー部分の両方がプローブに付着している場合に標識の検出を阻害するクエンチャー部分とを含み、
（ｂ）標識が、リアルタイムＰＣＲ増幅反応中のプローブ分子の切断により測定可能なシグナルを生じ、
（ｃ）各標識が互いに区別可能である、実施形態２８記載の方法。
３０．標識が蛍光標識である、実施形態２９記載の方法。
３１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態２から３０までのいずれか１つ記載の方法。
３２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態２から３１までのいずれか１つ記載の方法。
３３．第１の生物および第２の生物が微生物である、実施形態１から３２までのいずれか１つ記載の方法。
３４．微生物が同じ目のメンバーである、実施形態３３記載の方法。
３５．微生物が同じ科のメンバーである、実施形態３３記載の方法。
３６．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態３５記載の方法。
３７．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態３６記載の方法。
３８．微生物の１つ以上がヒト病原体または動物病原体である、実施形態３３から３７までのいずれか１つ記載の方法。
３９．微生物が細菌、ウイルスまたは真菌である、実施形態３３から３８までのいずれか１つ記載の方法。
４０．微生物が細菌である、実施形態３３から３９までのいずれか１つ記載の方法。
４１．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列および／または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４０記載の方法。
４２．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４１記載の方法。
４３．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４１または実施形態４２記載の方法。
４４．第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットがそれぞれ、１６Ｓ－２３Ｓ遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態４０から４３までのいずれか１つ記載の方法。
４５．プローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、または（ｉｉｉ）１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせ、第１のゲノムと第２のゲノムとを区別することができる、実施形態１から４４までのいずれか１つ記載の方法。
４６．仮想プローブ中のプローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションによるシグナルを、（ｉ）１つ以上のブール演算子、（ｉｉ）１つ以上の関係演算子、または（ｉｉｉ）１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせ、第１のゲノムと第２のゲノムとを区別することをさらに含む、実施形態４５記載の方法。
４７．各ブール演算子が「ＡＮＤ」、「ＯＲ」および「ＮＯＴ」から独立して選択される、実施形態４５または実施形態４６記載の方法。
４８．各関係演算子が「より大きい」（「＞」）および「より小さい」（「＜」）から独立して選択される、実施形態４５から４７までのいずれか１つ記載の方法。
４９．シグナルを１つ以上のブール演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４７までのいずれか１つ記載の方法。
５０．シグナルを１つ以上の関係演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４８までのいずれか１つ記載の方法。
５１．シグナルを１つ以上のブール演算子および１つ以上の関係演算子によって組み合わせることができる、実施形態４５から４８までのいずれか１つ記載の方法。
５２．仮想プローブが２つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１から５１までのいずれか１つ記載の方法。
５３．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であるが、第１の標的核酸にはハイブリダイズしない第２のプローブ分子とを含む、実施形態５２記載の方法。
５４．第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性でない場合に、第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態５３記載の方法。
５５．第１のプローブ分子のシグナルが陽性であり、かつ第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合に、第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態５３または実施形態５４記載の方法。
５６．第１の微生物がコアグラーゼ陰性スタフィロコッカス種であり、第２の微生物がコアグラーゼ陽性スタフィロコッカス種である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
５７．第２の微生物がＳ．アウレウス（S. aureus）である、実施形態５６記載の方法。
５８．第１のプローブ分子が、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態５６または実施形態５７のいずれか１つ記載の方法。
５９．第２のプローブ分子が、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態５６から実施形態５８までのいずれか１つ記載の方法。
６０．第１の微生物がストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
６１．第１のプローブ分子が、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６０記載の方法。
６２．第２のプローブ分子が、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６０または実施形態６１記載の方法。
６３．第１および第２の微生物が腸内細菌科細菌である、実施形態５３から５５までのいずれか１つ記載の方法。
６４．第１および第２の微生物がエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・アスブリアエ（Enterobacter asburiae）およびエンテロバクター・ホルメシェイ（Enterobacter hormaechei）から選択される、実施形態６３記載の方法。
６５．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１の標的核酸および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第２のプローブ分子とを含む、実施形態５２記載の方法。
６６．第２のプローブ分子のシグナルで除算した第１のプローブ分子のシグナルが、所定のカットオフ値よりも小さい場合に、第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態６５記載の方法。
６７．第２のプローブ分子のシグナルで除算した第１のプローブ分子のシグナルが所定のカットオフ値よりも大きい場合に、第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態６５または実施形態６６記載の方法。
６８．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）である、実施形態６５から６７までのいずれか１つ記載の方法。
６９．第１のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６５から６８までのいずれか１つ記載の方法。
７０．第２のプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態６５から６９までのいずれか１つ記載の方法。
７１．仮想プローブが３つのプローブ分子を含むか、またはそれからなる、実施形態１から５１までのいずれか１つ記載の方法。
７２．仮想プローブが、（ｉ）第１の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第１のアンプリコンセットの第１のアンプリコン）および第２の標的核酸（例えば、標的核酸がＰＣＲ産物である場合、第２のアンプリコンセットの第２のアンプリコン）に特異的にハイブリダイズすることが可能な第１のプローブ分子と、（ｉｉ）第１のプローブ分子とは異なり、第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第２のプローブ分子と、（ｉｉｉ）第１および第２のプローブ分子とは異なり、第１および第２の標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能な第３のプローブ分子とを含む、実施形態７１記載の方法。
７３．
（ａ）第１のプローブ分子のシグナルが陽性であるか、または第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合、および
（ｂ）第１のプローブ分子のシグナルまたは第２のプローブ分子のシグナルが、第３のプローブ分子のシグナルまたはシグナルの適切な分数よりも小さい場合、
第１の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態７２記載の方法。
７４．
（ａ）第１のプローブ分子のシグナルおよび第２のプローブ分子のシグナルが陽性である場合、ならびに
（ｂ）第１のプローブ分子のシグナルおよび第２のプローブ分子のシグナルが、第３のプローブ分子のシグナルまたはシグナルの適切な分数よりも大きい場合、
第２の生物が試験サンプルまたは初期サンプル中に存在すると決定することを含む、実施形態７２または実施形態７３記載の方法。
７５．第１の微生物がストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）であり、第２の微生物がストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）である、実施形態６５から７４までのいずれか１つ記載の方法。
７６．第１のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５記載の方法。
７７．第２のプローブ分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５または実施形態７６記載の方法。
７８．第３のプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有する、実施形態７５から７７までのいずれか１つ記載の方法。
７９．ＰＣＲ増幅産物が３００～８００ヌクレオチド長となるようにＰＣＲ条件を選択する、実施形態３から７８までのいずれか１つ記載の方法。
８０．ＰＣＲ増幅産物が４００～６００ヌクレオチド長となるようにＰＣＲ条件を選択する、実施形態７９記載の方法。
８１．初期サンプルまたは試験サンプルが、１つ以上の微生物による感染のリスクがある、実施形態３３から８０までのいずれか１つ記載の方法。
８２．初期サンプルまたは試験サンプルが、１つ以上の微生物に感染している疑いがある、実施形態３３から８１までのいずれか１つ記載の方法。
８３．初期サンプルまたは試験サンプルが生体サンプル、環境サンプルまたは食品である、実施形態１から８２までのいずれか１つ記載の方法。
８４．初期サンプルまたは試験サンプルが血液、血清、唾液、尿、胃液、消化液、涙液、糞便、精液、膣液、間質液、腫瘍性組織に由来する液体、眼液、汗、粘液、耳垢、油、腺分泌物、呼気、髄液、毛髪、爪、皮膚細胞、血漿、鼻腔スワブから得られる液体、鼻咽頭洗浄液から得られる液体、脳脊髄液、組織サンプル、咽頭スワブから得られる液体もしくは組織、創傷スワブから得られる液体もしくは組織、生検組織、胎盤液、羊水、腹膜透析液、臍帯血、リンパ液、体腔液、痰、膿、微生物叢、胎便、母乳から選択される生体サンプル、または上記のいずれかから処理、抽出もしくは分画されたサンプルである、実施形態８３記載の方法。
８５．生体サンプルが、
（ａ）尿、痰、もしくは尿から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｂ）痰、もしくは痰から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｃ）創傷スワブ、もしくは創傷スワブから処理、抽出もしくは分画されたサンプル；
（ｄ）血液、もしくは血液から処理、抽出もしくは分画されたサンプル；または
（ｅ）腹膜透析液、もしくは腹膜透析液から処理、抽出もしくは分画されたサンプル
である、実施形態８４記載の方法。
８６．初期サンプルまたは試験サンプルが土壌、地下水、地表水、廃水から選択される環境サンプル、または上記のいずれかから処理、抽出もしくは分画されたサンプルである、実施形態８３記載の方法。
８７．
（ａ）第１のゲノム配列と第２の相同ゲノム配列とを区別するための１つ以上の仮想プローブであって、各仮想プローブが、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なオリゴヌクレオチドプローブ分子の群を含み、１つ以上の仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のゲノム配列または第２のゲノム配列中の１５～４０個の連続したヌクレオチドに９０％～１００％相補的なヌクレオチド配列を含む、仮想プローブと、
（ｂ）任意に、１つ以上の対照プローブ分子と
を含む、アドレス可能なアレイ。
８８．少なくとも２つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
８９．少なくとも３つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９０．少なくとも４つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９１．少なくとも５つの仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９２．少なくとも１０個の仮想プローブを含む、実施形態８７記載のアドレス可能なアレイ。
９３．最大１０個の仮想プローブを含む、実施形態８７から９１までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９４．最大１５個の仮想プローブを含む、実施形態８７から９２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９５．各仮想プローブが２つ～４つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態８７から９４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９６．各仮想プローブが２つまたは３つのオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、実施形態９５記載のアドレス可能なアレイ。
９７．１２個以上のプローブ分子を含む、実施形態８７から９６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
９８．１２～１００個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
９９．１２～５０個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１００．２５～７５個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０１．５０～１００個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０２．１２個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０３．１４個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０４．８４個のプローブ分子を含む、実施形態９７記載のアドレス可能なアレイ。
１０５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列が、それぞれ第１の微生物および第２の微生物に由来するゲノム配列である、実施形態８７から１０４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１０６．微生物が同じ目のメンバーである、実施形態１０５記載のアドレス可能なアレイ。
１０７．微生物が同じ科のメンバーである、実施形態１０５記載のアドレス可能なアレイ。
１０８．微生物が同じ属のメンバーである、実施形態１０７記載のアドレス可能なアレイ。
１０９．微生物が同じ群のメンバーである、実施形態１０８記載のアドレス可能なアレイ。
１１０．プローブ分子の１つ以上がポリチミジンテールを含む、実施形態８７から１０９までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１１．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１１０記載のアドレス可能なアレイ。
１１２．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１１１記載のアドレス可能なアレイ。
１１３．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列がそれぞれ、ｒＲＮＡをコードする遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態８７から１１２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１４．ｒＲＮＡをコードする遺伝子が１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である、実施形態１１３記載のアドレス可能なアレイ。
１１５．第１のゲノム配列および第２のゲノム配列がそれぞれ、ｒＲＮＡ遺伝子の遺伝子間スペーサー領域に対応するヌクレオチド配列を含む、実施形態８７から１１２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１６．少なくとも１つの仮想プローブが、真正細菌の種に由来するゲノム配列と真正細菌の種ではない微生物のゲノム配列とを識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１５までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１７．少なくとも１つの仮想プローブが、グラム陽性細菌に由来するゲノム配列とグラム陰性細菌に由来するゲノム配列とを識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１８．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる目の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１７までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１１９．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる科の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１８までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２０．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる属の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１１９までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２１．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる群の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１２０までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２２．少なくとも１つの仮想プローブが、異なる種の微生物に由来するゲノム配列を識別するためのプローブ分子を含む、実施形態８７から１２１までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２３．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２２までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２４．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２３までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２５．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２４までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２６．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２５までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２７．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２６までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２８．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２７までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１２９．少なくとも１つの仮想プローブが、ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むプローブ分子を含む、実施形態８７から１２８までのいずれか１つ記載のアドレス可能なアレイ。
１３０．
（ａ）２つ以上のプローブ分子を含む仮想プローブを含み、各プローブ分子が、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および／または第２のゲノムに対応する１つ以上の相同標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１および第２のゲノムに対応する標的核酸に異なってハイブリダイズし、それによって、第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸および第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸へのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のゲノムに対応する標的核酸と第２のゲノムに対応する標的核酸とを区別することができる、実施形態８７から１２９までのいずれか１つ記載によるアレイで試験サンプルをプローブすることと、
（ｂ）非結合核酸分子をアレイから洗い流すことと、
（ｃ）アレイ上の各プローブ分子位置でのシグナルを検出および／または定量化することと、
（ｄ）シグナルが、
（ｉ）アレイのプローブ分子にハイブリダイズする標的核酸が試験サンプル中に存在することを示す場合、シグナルを分析して、第１のゲノムに対応する標的核酸もしくは第２のゲノムに対応する標的核酸がサンプル中に存在するかを決定し、それにより、第１の生物もしくは第２の生物が初期サンプルもしくは試験サンプル中に存在するかを決定すること、または
（ｉｉ）仮想プローブのプローブ分子にハイブリダイズする標的産物が工程（ａ）において生成しないことを示す場合、その初期サンプルもしくは試験サンプルが第１の生物もしくは第２の生物を含有しないと決定し、それにより、第１の生物もしくは第２の生物が初期サンプルもしくは試験サンプル中に存在するかを決定することと
を含む、第１のゲノムを有する第１の生物または第２のゲノムを有する第２の生物が、試験サンプルまたは試験サンプルが由来する初期サンプル中に存在するかを決定する方法。
１３１．第１のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第１のアンプリコンセットであり、第２のゲノムに対応する１つ以上の標的核酸が第２のアンプリコンセットであり、仮想プローブ中の各プローブ分子が、第１のアンプリコンセットおよび／または第２のアンプリコンセットの１つ以上のアンプリコンに特異的にハイブリダイズすることが可能であり、プローブ分子が第１のアンプリコンセットのアンプリコンおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンに異なってハイブリダイズし、それによって、第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットのアンプリコンへのプローブ分子のハイブリダイズにより、第１のアンプリコンセットと第２のアンプリコンセットとを区別することができる、実施形態１３０記載の方法。
１３２．第１のゲノムおよび第２のゲノムの両方にハイブリダイズするとともに、そこからＰＣＲ増幅を開始することが可能なＰＣＲプライマーを用いて初期サンプルに対してＰＣＲ増幅反応を行い、第１のゲノムおよび第２のゲノムがサンプル中に存在する場合に第１のアンプリコンセットおよび第２のアンプリコンセットをそれぞれ得ることによって、試験サンプルを調製することをさらに含む、実施形態１３１記載の方法。
１３３．
（ａ）実施形態８７から１２９までのいずれか１つ記載のアレイの各プローブ分子位置に対してシグナルデータを生成する光学読取り装置と、
（ｂ）少なくとも１つのプロセッサであって、
（ｉ）光学読取り装置からシグナルデータを受信するように構成され、
（ｉｉ）１つ以上の仮想プローブについてシグナルデータを分析するように構成され、かつ
（ｉｉｉ）分析の結果を出力するために記憶もしくは表示デバイスまたはネットワークへのインターフェースを有する、少なくとも１つのプロセッサと
を備える、生物がサンプル中に存在するかを決定するためのシステム。
１３４．ＰＣＲ増幅反応の産物をアレイに添加することができ、非結合核酸分子をアレイから洗い流すことができるプレートハンドリングロボットをさらに備える、実施形態１３３記載のシステム。
１３５．実施形態１３３または１３４のシステムを用いて行われる、実施形態１から８６または１３０から１３２までのいずれか１つ記載の方法。
１３６．ヌクレオチド配列がＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３７．ヌクレオチド配列がＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３８．ヌクレオチド配列がＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１３９．ヌクレオチド配列がＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４０．ヌクレオチド配列がＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４１．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４２．ヌクレオチド配列がＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含む、オリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４３．ポリチミジンテールを含む、実施形態１３６から１４２までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４４．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１４３記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４５．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１４４記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４６．標識を含む、実施形態１３６から１４５までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子。
１４７．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＣＡＧＴＣＴＴＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＡＹＣＣＡＣＧ（配列番号１）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＧ（配列番号２）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１４８．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＣＡＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＡＴ（配列番号３）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＴＡＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡ（配列番号４）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１４９．複数のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む仮想プローブであって、仮想プローブ中の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブ分子が、ＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴ（配列番号５）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＣＡＡ（配列番号６）を含むヌクレオチド配列を有し、仮想プローブ中の別のオリゴヌクレオチド分子が、ＧＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡ（配列番号７）を含むヌクレオチド配列を有する、仮想プローブ。
１５０．各オリゴヌクレオチドプローブ分子がポリチミジンテールを含む、実施形態１４７から１４９までのいずれか１つ記載の仮想プローブ。
１５１．ポリチミジンテールが１０マー～２０マーである、実施形態１５０記載の仮想プローブ。
１５２．ポリチミジンテールが１５マーである、実施形態１５１記載の仮想プローブ。
１５３．
（ａ）実施形態１３６から１４６までのいずれか１つ記載のオリゴヌクレオチドプローブ分子を含む、それぞれアレイ上の別々の位置に位置的にアドレス可能なプローブ分子の群と、
（ｂ）任意に、１つ以上の対照プローブ分子と
を含む、アドレス可能なアレイ。
１５４．実施形態１４７から１５２までのいずれか１つ記載の仮想プローブを含むアドレス可能なアレイであって、仮想プローブ中の各プローブ分子がアレイの別々の位置にある、アレイ。
１５５．１つ以上の対照プローブ分子をさらに含む、実施形態１５４記載のアドレス可能なアレイ。
１５６．ヌクレオチド配列が配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７を含むプローブ分子から選択される２つ以上のプローブ分子を含む、キット。
１５７．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１５８．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１５９．ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６０．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６１．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６２．ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６３．ヌクレオチド配列が配列番号１を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号２を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号３を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号４を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号５を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号６を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子と、ヌクレオチド配列が配列番号７を含むオリゴヌクレオチドプローブ分子とを含む、実施形態１５６記載のキット。
１６４．プローブ分子が標識される、実施形態１５６から１６３までのいずれか１つ記載のキット。
１６５．プローブ分子が蛍光標識で標識される、実施形態１６４記載のキット。
１６６．プローブ分子が非標識である、実施形態１５６から１６３までのいずれか１つ記載のキット。
１６７．第１のゲノム配列および第２の相同ゲノム配列を増幅することが可能な１つ以上のＰＣＲプライマー対をさらに含む、実施形態１５６から１６６までのいずれか１つ記載のキット。
【0203】
９．参照文献の引用
本願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献がそれぞれ、あらゆる目的で参照により援用されることが個別に示される場合と同じ程度に、それらの全体をあらゆる目的で参照により本明細書に援用するものとする。本明細書に援用される１つ以上の参照文献の教示と本開示との間に矛盾が見られる場合、本明細書の教示が意図される。
本願に引用される全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文献がそれぞれ、あらゆる目的で参照により援用されることが個別に示される場合と同じ程度に、それらの全体をあらゆる目的で参照により本明細書に援用するものとする。本明細書に援用される１つ以上の参照文献の教示と本開示との間に矛盾が見られる場合、本明細書の教示が意図される。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】