ホーム > 特許ランキング > セルトリオン， インク．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-16
(54)【発明の名称】球菌多糖類－タンパク質接合体を含む免疫原性組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/09 20060101AFI20220909BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220909BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20220909BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220909BHJP
【ＦＩ】
A61K39/09
A61P11/00
A61P31/04
A61K47/64
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503589
(86)(22)【出願日】2020-07-17
(85)【翻訳文提出日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 KR2020009474
(87)【国際公開番号】W WO2021010798
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】10-2019-0087004
(32)【優先日】2019-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＳＰＡＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515074983
【氏名又は名称】セルトリオン， インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】チョ、キョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】ラ、ワン グン
(72)【発明者】
【氏名】チャ、ジ ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ジョワ、ジュン ウォン
(72)【発明者】
【氏名】キム、パン キョム
(72)【発明者】
【氏名】イ、ス ヨン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC15
4C076DD22
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF02
4C085AA04
4C085AA38
4C085BA14
4C085BA38
4C085DD52
4C085DD86
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
(57)【要約】
本発明は、多価肺炎球菌多糖類－タンパク質接合体を含む免疫原性組成物に関するものである。各接合体は、運搬体タンパク質に接合された異なる肺炎球菌血清型の莢膜多糖類を含む。より具体的には、各々の接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含み、前記莢膜多糖類は、ａ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群より選択される１つ以上の血清型の莢膜多糖類；及びｂ）血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂからなる群より選択される少なくとも１つ以上の血清型の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物。本発明に係る多価免疫原性組成物は、既存のプレベナー１３に対比して、より様々な血清型に対する免疫反応を誘導することができる。特に、既存のプレベナー１３は、ヨーロッパ及び北米で頻発する血清型を中心に設計されているのに対し、本発明の免疫原性組成物は、ヨーロッパ及び北米だけでなく、アジア全域に対する高いカバレッジを有する免疫原性組成物である。したがって、本発明に係る多価免疫原性組成物は、乳幼児、小児及び成人の肺炎球菌による疾患を予防するために有用に使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多糖類－タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、各々の接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含み、前記莢膜多糖類は、
ａ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群より選択される少なくとも１つ以上の血清型の莢膜多糖類；及び
ｂ）血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂからなる群より選択される少なくとも１つ以上の血清型の莢膜多糖類を含む、
多価免疫原性組成物。
【請求項2】
前記ａ）莢膜多糖類は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる１３個の血清型であることを特徴とする、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項3】
前記運搬体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌由来不活性化毒素、シュードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来不活性化毒素及び細菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）からなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項4】
前記ジフテリアトキソイドは、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７３、ＣＲＭ２２８及びＣＲＭ４５からなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
前記莢膜多糖類と前記運搬体タンパク質との接合方法は、ＣＤＡＰ接合法、リダクティブアミネーション法及びチオール－マレミド（Ｔｈｉｏｌ－Ｍａｌｅｍｉｄｅ）法からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項7】
前記アジュバントは、アルミニウム塩であることを特徴とする、請求項６に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項8】
前記アルミニウム塩は、アルミニウムホスフェート、アルミニウムサルフェート及びアルミニウムヒドロキシドからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする、請求項７に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項9】
前記多価免疫原性組成物は、０．１～１００μｇの用量の多糖類を含む、請求項１に記載の多価免疫原性組成物。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の多価免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための、薬学組成物。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療方法。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載の多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、各々異なる多価肺炎球菌多糖類－タンパク質接合体を含む免疫原性組成物に関するものであり、各接合体は、運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎球菌由来の莢膜多糖類を含む。
【背景技術】
【0002】
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、以下、肺炎球菌）は、肺炎の主な原因菌である。統計庁の「２０１０年主要死亡原因別死亡率推移」によると、２０１０年の肺炎による死亡率は、１０万人当り１４．９人で、１０代の死亡原因の一つであり、２０００年対比８２．９％増加したことが分かった。また、２０１２年のＷＨＯによると、２００８年に全世界的にＨＩＶ陰性の５歳以下の子供４７６，０００人が肺炎球菌による感染で死亡し、５歳以下の子供の全死亡者の５％がこの菌による疾患で死亡した。
【0003】
肺炎球菌による疾患を予防するために、１９３１年にＨａｒｏｌｄ Ｊ．Ｗｈｉｔｅによって世界初の多糖類ワクチンが開発された。しかし、１９２９年に開発されたペニシリンにより、微生物感染疾患は抗生剤によって治療されたが、抗生剤耐性菌株の発生をもたらした。それにより、既存の抗生剤による治療の効果が得られなくなり、１９４７年にフランスのＭａｒｉｅ Ｍ．Ｄｒ Ｌａｐｉによって６価多糖類ワクチンが開発され、１９７７年にＤｒ．Ｒｏｂｅｒｔ Ａｕｓｔｒｉａｎによって１４価多糖類ワクチンが開発され、Ｍｅｒｃｋ、Ｗｙｅｔｈ、Ｐａｓｔｅｕｒによって１７価多糖類ワクチン類のワクチンが開発され、世界中で販売を始め、その後、２３価多糖類ワクチンに発展した。多価肺炎球菌多糖類ワクチンは、高齢者及びハイリスク患者における肺炎球菌疾患の予防に有用であると立証された。しかし、幼児及び小児は、ほとんどの肺炎球菌多糖類に対して免疫反応がよく起こらないが、これは、Ｔ－ｃｅｌｌ非依存的免疫反応現象のためである。このような現象は、他の微生物ワクチンでも同様に現れ、このような現象を克服して最初の多糖類－タンパク質接合ワクチンである脳髄膜炎ワクチン（Ｈｉｂ）が１９８７年に開発された。この後、脳髄膜炎（Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）と肺炎球菌、腸チフスなどの微生物ワクチンに接合技術が導入された。肺炎球菌接合ワクチンの場合、２０００年に７価肺炎球菌接合ワクチンが米国で発売される前に、開発会社であるＰｆｉｚｅｒ（Ｗｙｅｔｈ）は、１９９４年から２価肺炎球菌接合ワクチンの開発を始め、２０００年に７価形態まで開発した。７価肺炎球菌接合体ワクチン（プレベナー（登録商標））は、最も発生頻度の高い７つの血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ及び２３Ｆ由来の莢膜多糖類（Ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含む。２０００年に米国で最初に承認されて以降、幼児及び小児における侵襲性疾患及び中耳炎に対して免疫原性が高く効果的であることが立証された。このワクチンは、現在、全世界の約８０カ国で承認されている。プレベナーの導入以降に数年間蓄積された監視（Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）データでは、予想されるように、米国でプレベナーに含まれた血清型による侵襲性肺炎球菌疾患が明らかに減少した。しかし、一部の地域では血清型適用範囲に限界があり、プレベナーに含まれていない血清型による侵襲性肺炎球菌疾患は増加した。以後、Ｐｆｉｚｅｒでは７価血清型以後に侵襲性肺疾患を引き起こす主な６つの血清型を選定し、１３価肺炎球菌接合ワクチン（プレベナー１３）を２０１０年に発売した。以後、既存の７価肺炎球菌接合ワクチンの事例と同様の形態で、ワクチンに含まれていない血清型が流行する血清型の置換（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が発生していると報告されている。
【0004】
プレベナー１３に含まれていない血清型による肺炎球菌感染が増加するにつれて、肺炎球菌血清型の追加に関して研究を進行し続けていた。しかし、多価注射に接合体を組み合わせることにより、異なる構成成分の間で競合（免疫干渉効果）が起こることがあり、任意の個別接合体の免疫原性に不利な影響を及ぼす可能性もあるため、免疫原性組成物に接合体を追加することに大きな困難があった。
【0005】
免疫干渉効果は、多価ワクチン開発において大きな問題であって、主に肺炎球菌ワクチンの開発過程で提起されてきた。２０００年にＰＣＶ７が初めて発売された後、２０１０年に発売されたＰＣＶ１０の導入時に肺炎球菌ワクチンにおける免疫干渉効果が大きく問題となったことがある。ＰＣＶ１１が発売される予定であったが、免疫干渉効果によりＰｎ６Ｂは免疫反応が生じなかったため、６Ｂを除くＰＣＶ１０として発売をしたことがある。さらに、最近、Ｍｅｒｃｋで開発中であるＰＣＶ１５の臨床二相結果（ＨＵＭＡＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、２０１９、Ａｄｏｓｅ ｒａｎｇｉｎｇ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ２ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ １５－ｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ（ＰＣＶ１５） ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｆａｎｔｓ）を通じて、一部の血清型で陽性対照群であるＰＣＶ１３よりむしろ免疫原性が低下する結果が確認されたことがある。肺炎球菌ワクチンが多価（Ｍｕｌｔｉ－ｖａｌｅｎｔ）ワクチン形態で開発される現在の傾向の中で、個々の血清型の免疫原性を確保しながら、同時に免疫干渉効果のない多価ワクチン組成物はワクチン開発に必須である。
【0006】
このような免疫干渉現象は、多価ワクチンに含まれ得る接合体の数を制限する。したがって、多数の血清型に対する保護が相当な価値があるにもかかわらず、組成物中の接合体の数を制限しながら、これを達成することは非常に困難であったことが事実である。
【0007】
そこで、本発明者は、アジア大陸国（韓国、中国、日本、台湾、シンガポール、オーストラリア、インド）の流行血清型調査の結果に基づいて、アジア国家で流行する血清型として、１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂを最終選定し、既存のＰＣＶ１３に当該６種を追加したＰＣＶ１９の形態で開発し、当該免疫原性組成物の組み合わせが免疫干渉効果を生じさせないことを最終的に確認した。
【0008】
これは、既存のプレベナー１３製品がカバーできなかった血清型を最終補完することにより、ＰＣＶ１３が導入されていないか、ＮＩＰが導入されていない国及び血清型の置換が発生した国のＩＰＤ発生率を大幅に下げることができることを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
そこで、本発明者は、既存のプレベナー１３製品がカバーできなかった血清型をカバーすることができ、かつ免疫干渉のない免疫原性組成物の組み合わせを確認し、本発明を完成することになった。
【0010】
したがって、本発明が解決しようとする課題は、多糖類－タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、各々の接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の莢膜多糖類を含み、前記莢膜多糖類が１４価～１９価の血清型である多価免疫原性組成物を提供することである。
【0011】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記多価免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物を提供することである。
【0012】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療方法を提供することである。
【0013】
さらに、本発明が解決しようとする他の課題は、前記多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
前記課題を解決するために、本発明は、多糖類－タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、各々の接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型のストレプトコッカス・ニューモニエ由来の莢膜多糖類（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含み、前記莢膜多糖類は、ａ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる群より選択される１つ以上の血清型の莢膜多糖類；及びｂ）血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂからなる群より選択される少なくとも１つ以上の血清型の莢膜多糖類を含む多価免疫原性組成物を提供する。
【0015】
本発明に係る多価免疫原性組成物において、ａ）莢膜多糖類は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる１３個の血清型であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0016】
本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌由来不活性化毒素、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来不活性化毒素及び細菌外膜タンパク質（ＯＭＰ）からなる群より選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0017】
本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記ジフテリアトキソイドは、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ１７３、ＣＲＭ２２８及びＣＲＭ４５からなる群より選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の一具体例によれば、前記運搬体タンパク質はＣＲＭ１９７であってもよい。
【0018】
本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記莢膜多糖類と前記運搬体タンパク質との接合方法は、ＣＤＡＰ接合法、リダクティブアミネーション法及びチオール－マレミド（Ｔｈｉｏｌ－Ｍａｌｅｍｉｄｅ）法からなる群より選択されるいずれか一つであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0019】
本発明に係る多価免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含んでもよいし、例えば、アジュバントとしてアルミニウム塩を含んでもよい。前記アルミニウム塩は、アルミニウムホスフェート、アルミニウムサルフェート及びアルミニウムヒドロキシドからなる群より選択されてもよいし、好ましくは、アルミニウムホスフェートであってもよい。
【0020】
本発明の別の課題を解決するために、本発明は、多価免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物を提供する。
【0021】
一具現例において、前記薬学組成物は、２μｇの各糖類、但し、６Ｂは４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのアルミニウムホスフェート）アジュバント；賦形剤として塩化ナトリウム及びナトリウムサクシネート緩衝液を含有するように製剤化した免疫原性組成物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0022】
本発明の別の課題を解決するために、本発明は、前記の多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【0023】
さらに、本発明の別の課題を解決するために、本発明は、前記の多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療用途を提供する。
【発明の効果】
【0024】
本発明に係る多価免疫原性組成物は、既存のプレベナー１３に対比して、より様々な血清型に対する免疫反応を誘導することができる。特に、既存のプレベナー１３は、ヨーロッパ及び北米で頻発する血清型を中心に設計されて生産されているのに対し、本発明の免疫原性組成物は、ヨーロッパ及び北米だけでなく、アジア全域に対する高いカバレッジを有する免疫原性組成物である。したがって、本発明に係る多価免疫原性組成物は、乳幼児、小児及び成人の肺炎球菌による疾患を予防するために有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【0027】
しかし、本記載は、本発明の理解のためのものであり、いかなる意味でも本発明の範囲が本発明の詳細な説明に記載された事項によって限定されるものではない。
【0028】
血清型分布の地域間の偏差により、プレベナーの適用範囲が地域によって異なるという限界が提起された。したがって、既存の肺炎球菌接合体ワクチンからどの血清型も除く理由はなく、むしろ血清型を追加して適用範囲をさらに広げる必要性がある。
【0029】
プレベナー１３の血清型は、ヨーロッパ及び米国で流行する血清型で開発されており、プレベナー１３の導入以降、国ごとに血清型の置換現象が発生している。これは、アジアとヨーロッパ／米国との間で相違を示していると報告されている。本発明では、プレベナー１３の導入以降、アジアとヨーロッパ／米国とで流行している血清型を選定した。各国の肺炎球菌の発病率の基準は、１）５歳以下の子供、２）各国のプレベナー１３の導入以降の発病率の結果、３）流行／非流行血清型を調査し、国別の流行／非流行血清型を選定し、アジア／ヨーロッパ／米国の共通流行血清型を選定した。
【0030】
血清型の置換（Ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）は、年齢、国家、ワクチン導入時期、国家ワクチンプログラム（ＮＩＰ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ）導入の有無によって影響を受けると知られている。そこで、肺炎球菌ワクチン開発会社は、このような現象を克服するために、ＩＰＤ（侵襲性肺疾患）を引き起こす代表血清型を追加する戦略で新規ワクチンを開発しており、ＭｅｒｃｋのＰＣＶ１５は、ＰＣＶ１３に２２Ｆと３３Ｆを追加し、ＰｆｉｚｅｒのＰＣＶ２０は、ＰＣＶ１３に８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆ、３３Ｆを追加した形態で開発している。Ｍｅｒｃｋ及びＰｆｚｅｒの血清型選定基準を確認すると、米国とヨーロッパでＩＰＤを引き起こす流行血清型を選定しており、特に、Ｍｅｒｃｋの場合、米国／ヨーロッパの交集合血清型である２２Ｆ、３３Ｆを選定したことが特徴である。
【0031】
ワクチン先進国として評価されている日本の場合、ＰＣＶ７、ＰＣＶ１３が発売された直後、日本のＮＩＰに登録されており、登録後、ＰＣＶ１３に含まれる血清型は急激にＩＰＤ患者数が減少する現象が確認された。このような現象は、米国／ヨーロッパでも同様に現れる現象である。しかし、ＰＣＶ１３に含まれる血清型のＩＰＤ発生傾向は類似しているが、Ｎｏｎ－ＰＣＶ１３（ワクチン非含有血清型）で流行する血清型は、国別／大陸別の流行程度で相違を確認することができる。（出典１、Ｖａｃｃｉｎｅ ３４（２０１６）６７－７６、出典２、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ４（２０１６）、２０００－２０１４：Ａ Ｐｏｏｌｅｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ、出典３．Ｐｌｏｓ ｏｎｅ（２０１７）Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ）
【0032】
日本は、２０１０年にＰＣＶ７、２０１３年にＰＣＶ１３が導入され、ＰＣＶ１３ワクチン導入前／後の流行血清型で大きな相違を示すことが知られている。ＰＣＶ１３の導入初期である２０１１～２０１３年の期間には、ＰＣＶ１３含有血清の発生頻度が高かったが、ワクチン導入の２～３年後である２０１４～２０１６年から急激にｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（血清型の置換）現象が発生した。ＰＣＶ１３に含まれる血清型のうち最近まで発病している血清型は、３＞６Ａ、６Ｂ、１９Ｆ、２３Ｆの順に発生しているが、発生患者数はワクチン導入前と比べると１／１０水準である。ワクチン導入以降、ｎｏｎ－ＰＣＶ１３血清型が流行しており、２４Ｆ＞１５Ａ＞１２Ｆ＞１５Ｂ＞２２Ｆの順に発生している。
【0033】
例えば、米国の場合、前記日本の事例とは異なり、２２Ｆ、３３ＦがＰＣＶ１３の導入以降に流行しているが、日本を含むアジア大陸で３３Ｆは大きく流行してはいない。（出典１．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ ２０１６；２２：６０．ｅ９－６０．ｅ２９、出典２．ＷＨＯ ２０１１、Ｇｌｏｂａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ａｇｅ ａｎｄ ｒｅｇｉｏｎ、出典３．ＣＤＣ（ＵＳ）ｈｏｍｅｐａｇｅ）
【0034】
また、ヨーロッパの場合、ワクチン導入時期、ＮＩＰ導入時期が異なるが、英国／ドイツ／フランスの事例を参考にすると、ＰＣＶ１３の導入以降に流行する血清型は、８＞２２Ｆ＞３３Ｆ＞２４＞９Ｎであり、アジア大陸と相違を示す。（Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１９）。
【0035】
アジア大陸の流行血清型を確認するために、韓国、日本、台湾、中国、オーストラリア、シンガポール、インドの事例を調査しており、調査の基準として、５歳以下、６５歳以上、ＰＣＶ１３の導入以降によるＩＰＤ流行血清型を確認した。その結果、日本の場合、２０１３年にＰＣＶ１３が導入され、Ｎｏｎ－ＰＣＶ１３のうち流行血清型は、２４Ｆ＞１５Ａ＞１２Ｆ＞１５Ｂ＞２２Ｆと確認され、韓国の場合、１０Ａ＞１５Ａ、２３Ａ＞１５Ｂ、３５Ｂが流行しており、オーストラリアの場合、２３Ｂ＞２２Ｆ＞３５Ｂ＞３３Ｆが流行しており、台湾の場合、２３Ａ＞１５Ｂ＞１５Ａ＞２２Ｆ、１１Ａが流行していることを確認した。シンガポールの場合、該当事例が少ないが、１５Ｂ、１５ＡがＮｏｎ－ＰＣＶ１３のうち流行するものと報告されており、中国／インドの場合、両国ともＮＩＰ導入時期が遅く（２０１７年以降）、ＮＩＰ導入以降の疫学調査結果が出ていないため、流行血清型を算出することはできなかったが、先行国の流行血清型を参考にすると、中国／インドともに血清型の置換が発生する可能性が高く、ヨーロッパ／米国流行血清型と他のアジア流行血清型が流行する可能性が高いものと予想される。
【0036】
アジア国家の流行血清型を分析した結果、アジアで流行する血清型のうち、３カ国以上重複する血清型は、１５Ｂ、１５Ａ、２２Ｆ、２３Ａであり、そのうち、１５Ｂと１５Ａとは交差反応性（Ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｉｔｙ）があるという報告があり、１５Ｂの血清型のみを選定し、アジア国家で特異的な３５Ｂとアジアを含むヨーロッパ／米国で流行する１０Ａ、１１Ａとを含めて合計６種（１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂ）を選択した。
【0037】
韓国の場合、プレベナー１３が２０１０年に導入され、日本と同様に血清型の置換が急速に起こった。２０１６～２０１７年からｎｏｎ－プレベナー１３の増加傾向が生じている。プレベナー１３血清型のうち最近まで発病している血清型は１９Ｆ及び６Ａであり、この血清型も発生患者数及び頻度は、ワクチン導入前に比べて顕著に減少した。ｎｏｎ－プレベナー１３中ワクチン導入以降に流行する血清型は、１０Ａ＞１５Ａ、２３Ａ＞１５Ｂ、３５Ｂの順に発生している。
【0038】
オーストラリアの場合、プレベナー１３が２０１１年に導入された。２０１４年から血清型の置換を生じており、ｎｏｎ－プレベナー１３血清型の増加傾向が生じている。ｎｏｎ－プレベナー１３のうち、ワクチン導入以降に流行する血清型は、２３Ｂ＞２２Ｆ＞３５Ｂ＞３３Ｆの順に発生している。
【0039】
台湾の場合、プレベナー１３が２０１０年に導入された。２０１６年度から血清型の置換現象が現れている。ｎｏｎ－ＰＶ１３のうち、ワクチン導入以降に流行する血清型は、２３Ａ＞１５Ｂ＞１５Ａ＞２２Ｆ、１１Ａの順に発生している。
【0040】
シンガポールの場合、２０１１年にプレベナー１３が導入された。他のアジア国家のように、ワクチン導入以降、血清型の置換が発生した。ｎｏｎ－プレベナー１３のうち流行する血清型は、１５Ｂ＞１５Ａの順に発生している。
【0041】
インドの場合、プレベナー１３が２０１７年に導入された。インドの場合、プレベナー１３の導入以降の期間が１～２年しか経っていないため、血清型の置換が完全に進行されておらず、ワクチンの普及率の増加に伴い血清型の置換が増加するものと予想する。現在、報告された資料によると、ｎｏｎ－プレベナー１３のうち流行血清型は、２３Ａ＞２２Ｆ＞１５Ｂ＞６Ｄの順に発生している。
【0042】
中国の場合、プレベナー７は２００８年に、プレベナー１３は２０１６年に販売許可されているが、国家無料予防接種事業に含まれていないため、接種率及び普及率は顕著に低いと報告されている。しかし、中国の経済成長率に伴って健康に対する期待心理が高まり、ワクチンの普及率が上がるにつれて、血清型の置換現象は、他の国のように時間を置いて発生するものと予想する。
【0043】
アジア６カ国（韓国、日本、台湾、シンガポール、インド、オーストラリア）のプレベナー１３の導入以降、ｎｏｎ－プレベナー１３血清型の発生頻度を列挙した結果、１５Ｂがアジア６カ国で最も多く発病したことが確認され、その次に２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂの順に多く発生した。米国とヨーロッパの場合、共通して多く発生した血清型は２２Ｆ、３３Ｆであり、その次に発病した血清型は１０Ａ、１１Ａと報告されている。そこで、アジア流行血清型６種（１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂ）を追加し、ヨーロッパ及び米国の流行血清型４種（１０Ａ、１１Ａ、２２Ｆ、３５Ｂ）を追加して最終血清型の構成を選定した。
【0044】
そこで、本発明者は、アジア大陸国（韓国、中国、日本、台湾、シンガポール、オーストラリア、インド）の流行血清型調査結果に基づいて、アジア国家で流行する血清型を１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、３５Ｂと最終選定し、既存のＰＣＶ１３に当該６種を追加して最終的にＰＣＶ１９形態で開発した。
【0045】
ワクチンは、国家産業であるため、ワクチン接種率は、当該ワクチンが国家無料ワクチンプログラムに含まれるか否かが重要である。これは、各国の経済水準及び保健当局の立場によってワクチンプログラム（ＮＩＰ）に含まれるワクチンの種類と接種対象は大きな相違を示している。このうち、肺炎球菌接合ワクチンは、高価なワクチンに含まれるワクチンの一つであり、これを国家無料ワクチンプログラムに含めた国は世界中で一部の国に過ぎない。日本の場合、先進国に準ずる国家無料ワクチンプログラムを運営しており、米国／ヨーロッパと同様な水準の肺炎球菌接種率を示しており、結果としてヨーロッパ及び米国と同様の時期に血清型の置換が発生した。アジア国家間の血清型の置換の相違は、人種間の相違によるとも言える。しかし、血清型の置換の共通分母を見つけることができ、これは、ヨーロッパ及び米国のｎｏｎ－プレベナー１３流行血清型と相違を示す。ヨーロッパ及び米国で共通して流行する２２Ｆと３３Ｆ血清型のうち、３３Ｆ血清型の場合、血清型の置換が発生しているアジア国家のうち唯一オーストラリアのみで発生しており、韓国、日本、台湾、シンガポール及びインドでは発生していない。ヨーロッパ及び米国とは異なり、アジア国家では１５Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ及び２３Ａ血清型が流行しており、ヨーロッパ及び米国で流行する血清型とは相違を示している。
【0046】
本発明の新規血清型６種（１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂ）を含む１９価肺炎球菌接合体組成物は、肺炎球菌感染によって誘発される疾患に対して、ヒトにおいて機能的免疫反応を誘導する。より具体的には、一具現例において、ヒト対象は高齢者対象であり、疾患は肺炎または侵襲性肺炎球菌疾患である。より具体的には、一具現例において、高齢者対象は少なくとも５０歳である。より具体的には、一具現例において、高齢者対象は少なくとも５５歳である。より具体的には、一具現例において、高齢者対象は少なくとも６０歳である。
【0047】
より具体的には、一具現例において、ヒト対象は幼児であり、疾患は肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）、または急性中耳炎（ＡＯＭ）である。
【0048】
より具体的には、一具現例において、乳児は０～２歳、または、２～１５ヶ月齢である。
【0049】
他の実施形態において、ヒト対象は６週齢～１７歳であり、疾患は肺炎、侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）または急性中耳炎（ＡＯＭ）である。特定の実施形態において、ヒト対象は６週齢～５歳である。別の実施形態において、ヒト対象は５週齢～１７歳である。
【0050】
本発明は、プレベナー１３がワクチンに含まれた血清型を全て含み、さらに１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂからなる群より選択される１つ以上の血清型をさらに含む莢膜多糖類－タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物を提供する。すなわち、本発明は、生理学的に許容されるビヒクルと共に１４個以上の異なる多糖類－タンパク質接合体を含む多価免疫原性組成物であって、各々の接合体が運搬体タンパク質に接合された異なる血清型の肺炎球菌由来の莢膜多糖類を含む。
【0051】
莢膜多糖類は、当業者に公知の標準技術によって製造することができる。莢膜多糖類は、粘度を減少させるために、または活性化した莢膜多糖類の溶解度を増加させるために大きさを小さくすることができる。本発明の具体例において、莢膜多糖類は、肺炎球菌の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる１３個の血清型と、血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂからなる群より選択されるいずれか１つ以上の血清型の莢膜多糖類で製造される。
【0052】
この肺炎球菌接合体は、別の過程によって製造され、単一投与剤形に製剤化する。例えば、各肺炎球菌多糖類血清型を大豆－基剤培地で増殖させ、次いで個々の多糖類を遠心分離、沈殿、限外ろ過によって精製する。
【0053】
運搬体タンパク質は、好ましくは、非毒性で非反応原性であり、十分な量及び純度で得ることができるタンパク質である。運搬体タンパク質は、標準接合方法に適しなければならない。本発明に係る多価免疫原性組成物において、前記運搬体タンパク質はＣＲＭ１９７であってもよい。ＣＲＭ１９７は、カザミノ酸及び酵母抽出物－基剤培地で増殖させたコリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）菌株Ｃ７（β１９７）の培養物から分離されたジフテリア毒素の無毒性変異体である。ＣＲＭ１９７は、限外ろ過、アンモニウムサルフェート沈殿及びイオン交換クロマトグラフィーによって精製される。ＣＲＭ１９７は、米国特許第５，６１４，３８２号により、遺伝子組換えによって製造することができる。
【0054】
他のジフテリアトキソイドも運搬体タンパク質として使用することができる。他の適切な運搬体タンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びシュードモナス エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａのような不活性化細菌毒素が含まれる。細菌外膜タンパク質、例えば、外膜接合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシン（ａｄｈｅｓｉｎ）タンパク質（ＰｓａＡ）、グループＡまたはグループＢ連鎖球菌由来のＣ５ａペプチダーゼ、または、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）のような他のタンパク質も、運搬体タンパク質として使用することができる。ＣＲＭ１７３、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５のようなジフテリア毒素の変異体も運搬体タンパク質として使用することができる。
【0055】
運搬体タンパク質と多糖類とを接合するためには、既存の公知の接合方法を使用することができる。例として、リダクティブアミネーション法、ＣＤＡＰ接合法またはチオール－マレミド（Ｔｈｉｏｌ－Ｍａｌｅｍｉｄｅ）法を使用することができ、これに限定されない。運搬体タンパク質と反応することができる糖類を製造するために、精製された多糖類は化学的に活性化することができる。一旦、活性化すると、各莢膜多糖類を運搬体タンパク質に１つずつ接合させて糖接合体（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成する。一具現例において、各莢膜多糖類を同一の運搬体タンパク質に接合させる。多糖類の化学的活性化及び続く運搬体タンパク質への接合は公知の方法によって行うことができる（米国特許第４，６７３，５７４号、第４，９０２，５０６号など）。
【0056】
得られた多糖類－タンパク質接合体は、様々な方法によって精製することができる（すなわち、多糖類－タンパク質接合体の量を豊富にすることができる）。これらの方法の例としては、濃縮／透析ろ過工程、カラムクロマトグラフィー及び多層ろ過を含む。精製された多糖類－タンパク質接合体はそれぞれを混合して本発明の免疫原性組成物に製剤化し、それをワクチンとして使用することができる。当業界で認められた方法を使用して本発明の免疫原性組成物の製剤化を行うことができる。例えば、１４～１９個の個々の肺炎球菌接合体を生理学的に許容されるビヒクルと共に剤形化して組成物を製造することができる。このようなビヒクルの例としては、水、緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びデキストロース溶液が含まれるが、これに制限されるものではない。
【0057】
一具現例において、本発明の免疫原性組成物は１つ以上のアジュバントを含む。本願で定義される「アジュバント」とは、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を増加させるために使用される物質である。したがって、アジュバントは時々免疫反応をブーストするために提供され、当業者によく知られている。組成物の有効性を増加させるのに適合なアジュバントは以下のものを含むが、これに制限されるものではない。
【0058】
特定の具現例において、アルミニウム塩がアジュバントとして使用される。アルミニウム塩アジュバントは、アルミニウム－沈殿ワクチン（Ａｌｕｍ－ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ）であってもよいし、アルミニウム－吸着ワクチン（Ａｌｕｍ－ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ）であってもよい。アルミニウム塩には、水和されたアルミナ、アルミナ水和物、アルミナ三水和物（ＡＴＨ）などが含まれるが、これに制限されるものではない。塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の割合で混合すると、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェートが沈殿する。Ｈｉｇｈ Ｓｈｅａｒ Ｍｉｘｅｒを用いて沈殿物の大きさが２～８μｍとなるようにした後、生理食塩水で透析し、滅菌して製造する。一具現例において、商業的に利用可能なＡｌ（ＯＨ）３（例えば、アルハイドロゲルまたはＳｕｐｅｒｆｏｓ）を使用してタンパク質を吸着する。水酸化アルミニウム１ｍｇ当り５０～２００ｇのタンパク質を吸着することができ、この割合はタンパク質のｐＩと溶媒のｐＨによる。低いｐＩのタンパク質は、高いｐＩのタンパク質に比べて強く結合する。アルミニウム塩は、２～３週間徐々に抗原を放出する抗原デポーを形成し、非特異的に大食細胞、補体、先天性免疫メカニズムを活性化する。
【0059】
本発明は、前記多価免疫原性組成物の免疫学的有効量を含む、ストレプトコッカス・ニューモニエ莢膜多糖類接合体に対する免疫反応を誘導するための薬学組成物（例えば、ワクチン製剤）を提供する。
【0060】
本発明に係るワクチン製剤は、全身または粘膜経路に投与することによって、肺炎球菌に感染しやすい人を保護または治療するために使用することができる。本願で定義される「有効量」とは、肺炎球菌に感染する確率または感染の重症度を顕著に減少できる程度の抗体を誘発するのに必要な投与量をいう。投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を通じる注射；または、口腔／消化管、気道管または泌尿生殖管への粘膜投与を含んでもよい。一具現例において、肺炎または中耳炎の治療のために鼻腔内投与が使用され、これは、肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防し、初期段階で感染を弱化させることができるからである。
【0061】
各ワクチン用量における前記接合体の量は、重篤な副作用無しに免疫保護反応を誘導できる量が選択される。このような量は肺炎球菌の血清型に応じて異なり得る。一般的に、各用量は、０．１～１００μｇ、好ましくは、０．１～１０μｇ、より好ましくは、１～５μｇの多糖類を含んでもよいが、これに限定されるものではない。特定のワクチンに対する成分の最適量は、被験者における適切な免疫反応の観察を含む標準研究によって確認することができる。例えば、動物実験結果を外挿し、ヒトを対象としたワクチン接種用量を決定することができる。また、経験的に用量を決定することもできる。
【0062】
本発明の一具現例において、本発明のワクチン組成物は、それぞれＣＲＭ１９７に接合された血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ及び２３Ｆからなる１３個の血清型の莢膜多糖類と血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂとからなる群より選択されるいずれか１つ以上の血清型の莢膜多糖類とを含む滅菌液体剤形である。各０．５ｍＬの用量に、２μｇの各糖類、但し、６Ｂは４μｇ；約３４μｇのＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのアルミニウムホスフェート）アジュバント；賦形剤として塩化ナトリウム及びナトリウムサクシネート緩衝液が含有されるように製剤化することができる。前記液体は、保存剤無しに単一用量シリンジの中に充填することができる。振とうすると、すぐに筋肉内に投与できる均質な白色懸濁液のワクチンとなる。
【0063】
本発明の組成物は、単回投与用量のバイアル、複数回投与用量のバイアル、またはプレフィルドシリンジの形態で製剤化することができる。
【0064】
本発明の製剤（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、界面活性剤を含んでもよいし、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＳｐａｎ ８５のような界面活性剤の混合物を含んでもよい。
【0065】
本発明の一具現例において、本発明は、前記多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療方法を提供する。
【0066】
本発明の一具現例において、本発明は、前記多価免疫原性組成物を予防または治療学的に有効な量で投与するステップを含む、肺炎球菌関連疾患の予防または治療用途を提供する。
【0067】
プレベナー１３血清型の包含
北カリフォルニアでは、プレベナー１３血清型が幼児及び小児における侵襲性肺炎球菌疾患の全ての症例の９０％以上を占めた。さらに、西ヨーロッパでは、プレベナー１３血清型が幼児及び小児における侵襲性肺炎球菌疾患の全ての症例の７０％以上を占めた。米国とヨーロッパは最大のワクチン販売市場であるため、次世代肺炎球菌接合ワクチンからどのプレベナー１３血清型も除く理由がなく、むしろ血清型を追加して適用範囲をさらに広げることが好ましい。
北カリフォルニアでは、プレベナー１３血清型が幼児及び小児における侵襲性肺炎球菌疾患の全ての症例の９０％以上を占めた。さらに、西ヨーロッパでは、プレベナー１３血清型が幼児及び小児における侵襲性肺炎球菌疾患の全ての症例の７０％以上を占めた。米国とヨーロッパは最大のワクチン販売市場であるため、次世代肺炎球菌接合ワクチンからどのプレベナー１３血清型も除く理由がなく、むしろ血清型を追加して適用範囲をさらに広げることが好ましい。
【0068】
血清型６価の追加
プレベナー１３の血清型は、ヨーロッパ、米国で流行する血清型で開発され、プレベナー１３の導入以降、国ごとに血清型の置換現象が発生しており、これは、アジアとヨーロッパ、米国とで相違を示していると報告されている。本発明では、プレベナー１３の導入以降、アジアとヨーロッパ／米国とで流行している血清型を選定した。各国の肺炎球菌の発病率の基準は、１）５歳以下の子供、２）各国のプレベナー１３の導入以降の発病率の結果、３）流行／非流行血清型を調査し、各国別の流行／非流行血清型を選定し、アジア／ヨーロッパ／米国の共通流行血清型を選定した。
プレベナー１３の血清型は、ヨーロッパ、米国で流行する血清型で開発され、プレベナー１３の導入以降、国ごとに血清型の置換現象が発生しており、これは、アジアとヨーロッパ、米国とで相違を示していると報告されている。本発明では、プレベナー１３の導入以降、アジアとヨーロッパ／米国とで流行している血清型を選定した。各国の肺炎球菌の発病率の基準は、１）５歳以下の子供、２）各国のプレベナー１３の導入以降の発病率の結果、３）流行／非流行血清型を調査し、各国別の流行／非流行血清型を選定し、アジア／ヨーロッパ／米国の共通流行血清型を選定した。
【0069】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明の説明のためのものであり、これらの実施例によって本発明が制限されるものと解釈されてはならない。
【0070】
実施例１．肺炎球菌莢膜多糖類の製造及び精製
肺炎球菌の培養及び莢膜多糖類の精製は、当業者に公知の方法によって行った。肺炎球菌の各血清型は、受託機関（ＣＤＣ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）から入手することができる。莢膜と非運動性、グラム陽性、Ｌａｎｃｅｔ－ｓｈａｐｅｄ双球菌、血液寒天培地でアルファ溶血現象によって肺炎球菌を同定した。血清型は、特定の抗血清を用いたＱｕｅｌｌｕｎｇ Ｔｅｓｔに基づいて確認した。
肺炎球菌の培養及び莢膜多糖類の精製は、当業者に公知の方法によって行った。肺炎球菌の各血清型は、受託機関（ＣＤＣ、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）から入手することができる。莢膜と非運動性、グラム陽性、Ｌａｎｃｅｔ－ｓｈａｐｅｄ双球菌、血液寒天培地でアルファ溶血現象によって肺炎球菌を同定した。血清型は、特定の抗血清を用いたＱｕｅｌｌｕｎｇ Ｔｅｓｔに基づいて確認した。
【0071】
実施例１－１．細胞バンクの製造
１９種の各々異なる血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ及び３５Ｂ）を有する肺炎球菌を受託機関である米国ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＵＳ）から入手した。
１９種の各々異なる血清型（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ及び３５Ｂ）を有する肺炎球菌を受託機関である米国ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＵＳ）から入手した。
【0072】
肺炎球菌株を血液寒天培地に塗抹して単一コロニーを分離した。１０個以上の単一コロニーのうち成長のよい単一コロニーを選定した後、動物由来の成分を含まない液状培地に接種して培養した後、合成グリセロールを含有した研究用細胞バンク（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、ＲＣＢ）を製造した。
【0073】
固有の血清型を有する多糖類の発現が確認された研究用細胞バンクのうち１個のバイアルを取り出して動物由来の成分を含まない液状培地で細胞を増殖させた後、合成グリセロールを追加してマスター細胞バンクを製造し、マスター細胞バンクのうち１個のバイアルを取り出して動物由来の成分を含まない液状培地で細胞を増殖させた後、合成グリセロールを追加して製造用細胞バンクを製造した。製造された細胞バンクは、次のステップで使用するために－７０℃以下で保管して使用した。
【0074】
実施例１－２．発酵及び多糖類の分離
製造用細胞バンクのうち１個のバイアルを解凍し、動物由来の成分を含まない液状培地に接種して種発酵を始めた。一定の菌体濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ６００）に達して中間－指数増殖期の終末点に達するまで、無撹拌の状態で３７±２℃で種培養を行った。種培養で得た培養液を動物由来の成分を含まない液状培地を含有する発酵器に接種して主発酵（Ｍａｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を始めた。
製造用細胞バンクのうち１個のバイアルを解凍し、動物由来の成分を含まない液状培地に接種して種発酵を始めた。一定の菌体濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ６００）に達して中間－指数増殖期の終末点に達するまで、無撹拌の状態で３７±２℃で種培養を行った。種培養で得た培養液を動物由来の成分を含まない液状培地を含有する発酵器に接種して主発酵（Ｍａｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を始めた。
【0075】
次いで、３７±２℃で、水酸化カリウム溶液で培地のｐＨを調節しながら、本培養を行った。２時間ごとに最適の細胞密度と培地に含まれるグルコース濃度を測定した。発酵は、培地中のグルコースが枯渇すると終了した。
【0076】
発酵が終了した後、１２％ソジウムデオキシコレート（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）を最終０．１２％となるように培養物に１時間かけて加えて細胞を溶解させ、細胞に結合した多糖類を遊離させた。
【0077】
実施例１－３．莢膜多糖の精製
ソジウムデオキシコレートが処理されたサンプルにリン酸を加えた後、遠心分離を通じて上清液を回収した。回収した上清液をＤｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒに通した後、濃縮及びリン酸緩衝溶液でバッファー交換を行った。バッファー交換の後、サンプルを炭素活性炭フィルター（Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｂｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ）に通した後、下記のような２つの方法で不純物の除去を行った。
ソジウムデオキシコレートが処理されたサンプルにリン酸を加えた後、遠心分離を通じて上清液を回収した。回収した上清液をＤｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒに通した後、濃縮及びリン酸緩衝溶液でバッファー交換を行った。バッファー交換の後、サンプルを炭素活性炭フィルター（Ａｃｔｉｖｅ Ｃａｒｂｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ）に通した後、下記のような２つの方法で不純物の除去を行った。
【0078】
１７個の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｆ及び３５Ｂの場合、ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）とイオン結合が可能であるので、ＣＴＡＢ工程を行った。ＣＴＡＢ処理、遠心分離、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及びヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）処理及び遠心分離過程を行った。
【0079】
ＣＴＡＢと反応しない２個の血清型７Ｆ及び１４は、リン酸アルミニウムゲル（Ａｌｇｅｌ）溶液を加えて反応させた後、遠心分離を通じて得られた上清液を使用した。
【0080】
前記２つの形態の不純物の除去工程を完了したサンプルは、Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ及び限外ろ過（ＵＦ／ＤＦ）工程を経た後、エタノールと塩化ナトリウムの量を調節し、原末形態にして保管した。
【0081】
実施例１－４．莢膜多糖類の溶解及び加水分解
各血清型由来の莢膜多糖類原末を、最終濃度範囲が下記の範囲となるように注射用水に溶解し、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。
各血清型由来の莢膜多糖類原末を、最終濃度範囲が下記の範囲となるように注射用水に溶解し、０．４５μｍフィルターを通してろ過した。
【0082】
詳細には、血清型１、３及び４の場合、０．８～２．０ｍｇ／ｍｌの範囲で溶解し、血清型５、６Ｂ、９Ｖ、１８Ｃ及び１９Ｆの場合、４～８ｍｇ／ｍｌ、血清型６Ａ及び１９Ａは、８～１２ｍｇ／ｍｌ、血清型７Ｆ、１０Ａ、１１Ａ及び２３Ｆの場合、２～４ｍｇ／ｍｌで溶解してろ過を行った。また、血清型１５Ｂ、２２Ｆ及び３５Ｂの場合、２～５ｍｇ／ｍｌの範囲に溶解してろ過を行った。
【0083】
血清型ごとに、下記のｐＨ及び温度範囲で溶液を恒温処理して行った。詳細には、血清型１、３、５、６Ｂ、７Ｆ、１０Ａ、１１Ａ、１４及び２３Ｆの場合、一晩７０～８０℃、血清型６Ａ及び１９Ｆの場合、１～４時間の間７０～８０℃、血清型９Ｖ及び１８Ｃの場合、リン酸溶液を用いて１～３時間の間ｐＨ２．０、６５～８０℃で恒温処理過程を行った。血清型２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂの場合、一晩７５～８５℃、血清型４、１５Ｂ、１９Ａの場合、加水分解は行っていない。次いで２１～２４℃に冷却し、６．０±１．０の目標のｐＨで水酸化ナトリウムを加えることによって加水分解を中止した。
【0084】
実施例２．肺炎球菌莢膜多糖類とＣＲＭ１９７タンパク質運搬体との接合及び精製
実施例２－１．ＣＲＭ１９７タンパク質運搬体の準備
ＣＲＭ１９７タンパク質運搬体は、米国のワイス（Ｗｙｅｔｈ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）から購入して準備した。
実施例２－１．ＣＲＭ１９７タンパク質運搬体の準備
ＣＲＭ１９７タンパク質運搬体は、米国のワイス（Ｗｙｅｔｈ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）から購入して準備した。
【0085】
実施例２－２．莢膜多糖類とＣＲＭ１９７との接合
全ての血清型に塩化ナトリウム粉末を加えて２Ｍ ＮａＣｌ多糖類溶液を製造した。各血清ごとに適切なＣＤＡＰ（１－Ｃｙａｎｏ－４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）を５０／５０アセトニトリル／注射用水（ｖ／ｖ）溶液１００ｍｌ当りＣＤＡＰ１ｇの割合で溶解した。詳細には、血清型６Ａ及び１４の場合、多糖対比ＣＤＡＰ１ｗ／ｗ％を、血清型４の場合、２ｗ／ｗ％を、血清型１、３、６Ｂ、７Ｆ１５Ｂ及び１９Ａの場合、３ｗ／ｗ％を、その他の血清型の場合、４ｗ／ｗ％の重量比率で溶解し、各々の多糖類溶液に加えた。次いで、１～３分後に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ９．４～９．７に上昇させた後、多糖類のヒドロキシル基がＣＤＡＰによって十分活性化できるように３～７分間撹拌した。多糖対比ＣＲＭ１９７０．５－１．０ｗ／ｗ％を各血清型の多糖溶液に加えて１時間～４時間の間に接合反応を行い、ＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いて反応転化率を測定し、必要に応じてＣＤＡＰをさらに投入した。
全ての血清型に塩化ナトリウム粉末を加えて２Ｍ ＮａＣｌ多糖類溶液を製造した。各血清ごとに適切なＣＤＡＰ（１－Ｃｙａｎｏ－４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）を５０／５０アセトニトリル／注射用水（ｖ／ｖ）溶液１００ｍｌ当りＣＤＡＰ１ｇの割合で溶解した。詳細には、血清型６Ａ及び１４の場合、多糖対比ＣＤＡＰ１ｗ／ｗ％を、血清型４の場合、２ｗ／ｗ％を、血清型１、３、６Ｂ、７Ｆ１５Ｂ及び１９Ａの場合、３ｗ／ｗ％を、その他の血清型の場合、４ｗ／ｗ％の重量比率で溶解し、各々の多糖類溶液に加えた。次いで、１～３分後に水酸化ナトリウム溶液を加えてｐＨ９．４～９．７に上昇させた後、多糖類のヒドロキシル基がＣＤＡＰによって十分活性化できるように３～７分間撹拌した。多糖対比ＣＲＭ１９７０．５－１．０ｗ／ｗ％を各血清型の多糖溶液に加えて１時間～４時間の間に接合反応を行い、ＨＰＬＣ－ＳＥＣを用いて反応転化率を測定し、必要に応じてＣＤＡＰをさらに投入した。
【0086】
実施例２－３．接合反応の終了
全ての血清型に対して加えたＣＤＡＰ１モル当量に対して３～６モル当量のグリシン溶液を加え、ｐＨを９．０に調整して反応を終結した。接合溶液を２１～２４℃で１時間撹拌した後、２～８℃の低温で一晩保管した。
全ての血清型に対して加えたＣＤＡＰ１モル当量に対して３～６モル当量のグリシン溶液を加え、ｐＨを９．０に調整して反応を終結した。接合溶液を２１～２４℃で１時間撹拌した後、２～８℃の低温で一晩保管した。
【0087】
実施例２－４．限外ろ過
希釈した接合混合物を最低２０容量の緩衝液を用いて限外ろ過フィルターに濃縮及び透析ろ過した。ここで、緩衝液はｐＨ５．５～６．５の範囲を維持し、０．９％塩化ナトリウムを含む緩衝液を使用した。限外ろ過フィルターの分画分子量は、全ての血清型において３００ｋＤａを使用して実施し、透過液は廃棄した。
希釈した接合混合物を最低２０容量の緩衝液を用いて限外ろ過フィルターに濃縮及び透析ろ過した。ここで、緩衝液はｐＨ５．５～６．５の範囲を維持し、０．９％塩化ナトリウムを含む緩衝液を使用した。限外ろ過フィルターの分画分子量は、全ての血清型において３００ｋＤａを使用して実施し、透過液は廃棄した。
【0088】
実施例２－５．除菌ろ過
透析ろ過後の残留液を、緩衝液を用いて多糖含有量濃度基準に０．４ｇ／Ｌ未満となるように希釈し、０．２２μｍフィルターを通してろ過した。ろ過された生成物に対して製造過程中で制御（糖類含有量、残留ＤＭＡＰ）を行った。ろ過された残留液に対して製造過程中で制御を行い、追加の濃縮、透析ろ過及び／または希釈が必要であるのか否かを決定した。
透析ろ過後の残留液を、緩衝液を用いて多糖含有量濃度基準に０．４ｇ／Ｌ未満となるように希釈し、０．２２μｍフィルターを通してろ過した。ろ過された生成物に対して製造過程中で制御（糖類含有量、残留ＤＭＡＰ）を行った。ろ過された残留液に対して製造過程中で制御を行い、追加の濃縮、透析ろ過及び／または希釈が必要であるのか否かを決定した。
【0089】
実施例３．１３価肺炎球菌ワクチンの製剤化及び免疫原性の研究
実施例３－１．１３価肺炎球菌ワクチンの製剤化
実施例２から得られた最終バルク（ｂｕｌｋ）濃縮物の最終容積は、バッチ（ｂａｔｃｈ）容積及びバルク糖類濃度に基づいて計算した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びサクシネート緩衝液を予備標識した剤形容器に加えた後、バルク濃縮物を加えた。その後、製剤を完全に混合し、０．２μｍの膜を用いて滅菌ろ過した。バルクアルミニウムホスフェートの添加過程中及び最終添加完了後の剤形化したバルクを穏やかに混合し、ｐＨを確認した後、必要に応じてそれを調整した。さらに、剤形化したバルク生成物は、２℃～８℃で最終貯蔵した。下記の表に製造した多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示す。
実施例３－１．１３価肺炎球菌ワクチンの製剤化
実施例２から得られた最終バルク（ｂｕｌｋ）濃縮物の最終容積は、バッチ（ｂａｔｃｈ）容積及びバルク糖類濃度に基づいて計算した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びサクシネート緩衝液を予備標識した剤形容器に加えた後、バルク濃縮物を加えた。その後、製剤を完全に混合し、０．２μｍの膜を用いて滅菌ろ過した。バルクアルミニウムホスフェートの添加過程中及び最終添加完了後の剤形化したバルクを穏やかに混合し、ｐＨを確認した後、必要に応じてそれを調整した。さらに、剤形化したバルク生成物は、２℃～８℃で最終貯蔵した。下記の表に製造した多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示す。
【0090】
【表1】
【0091】
（※シンフロリックスは、ＧＳＫ製品であって、１１価に該当）
【0092】
得られたワクチン組成物は、合計０．５ｍＬ中に、２μｇの各糖類、但し、６Ｂは４μｇ；約３５μｇ内外のＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのアルミニウムホスフェート）アジュバント；約４．２５ｍｇの塩化ナトリウム；約２９５μｇのサクシネート緩衝液；及び約１００μｇのポリソルベート８０を含有した。
【0093】
実施例３－２．血清型特異ＩｇＧ濃度ＥＬＩＳＡの測定
前記実施例で製造した各々の１３価の肺炎球菌ワクチン組成物がマウスにおいて免疫反応を誘発する能力を有するか否かを確認するために、以下のように実験した。当該免疫原性は、抗原－特異的ＥＬＩＳＡを通じて血清ＩｇＧ濃度を測定して確認した。
前記実施例で製造した各々の１３価の肺炎球菌ワクチン組成物がマウスにおいて免疫反応を誘発する能力を有するか否かを確認するために、以下のように実験した。当該免疫原性は、抗原－特異的ＥＬＩＳＡを通じて血清ＩｇＧ濃度を測定して確認した。
【0094】
製剤化した各々の多価肺炎球菌ワクチン組成物または対照群であるプレベナー１３（登録商標）を計画したヒト臨床用量（各多糖類４．４μｇ／ｍＬ、例外：６Ｂ８．８μｇ／ｍＬの場合を１００％として、必要に応じて一部の血清型の含有量を調節）で、０週目、２週目及び４週目にマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の筋肉内に免疫接種し、最後の接種後の１週後に各々の血清を採取した。採取した血清に対してＥＬＩＳＡを用いて血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した。
【0095】
これを詳細に説明すると、次の通りである。吸光度値が０．１７５未満に低下する各血清の希釈倍数を用いて分析した。血清型莢膜多糖質を９６－ウェル（ｗｅｌｌ）のイムノプレート（ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ）に５μｇ／ｍｌの濃度でコートした後、４℃で放置した。非特異的結合を遮断するために、５μｇ／ｍｌの細胞壁莢膜多糖質（ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ＣＷＰＳ）と２２Ｆとを用いて希釈した血清をコートしたプレート（ｐｌａｔｅ）に加え、２時間後、ＨＲＰが付着した二次抗体であるａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧを処理した後、１時間の間室温で放置した。１時間後、ＨＲＰと反応する基質（３，３′５，５′－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）を１０分間処理し、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた後、１０分後４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【0096】
【表2】
【0097】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認）
【0098】
本発明者は、多価混合ワクチンの作製に先立ち、既存の市販の１３価接合体の効果をプレベナー１３（Ｐｒｅｖｅｎａｒ １３）と比較した。その結果、１３価免疫原性組成物の濃度依存的なＩｇＧ力価と相関性のある血清型と、そうでない血清型を確認した。また、プレベナー１３と比較して、濃度にかかわらず同様なＩｇＧ力価を有することを確認した。（表２及び図１）
【0099】
実施例３－３．抗体機能オプソニン試験（ＭＯＰＡ検定法）
抗体機能は、ＭＯＰＡ検定により血清を試験することによって評価した。分析法は、既知の方法（肺炎球菌に対する抗体機能測定のためのｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＵＡＢ－ＭＯＰＡ）試験方法、２０１３）で行い、大概の実験方法は、以下の通りである。
抗体機能は、ＭＯＰＡ検定により血清を試験することによって評価した。分析法は、既知の方法（肺炎球菌に対する抗体機能測定のためのｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＵＡＢ－ＭＯＰＡ）試験方法、２０１３）で行い、大概の実験方法は、以下の通りである。
【0100】
貪食細胞が補体と抗体によって病原体を貪食する過程をオプソニン化（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）といい、ワクチン接種によって生成された血清型特異抗体の能力を確認するためにオプソニン化過程を用いた実験法であるＳｉｎｇｌｅ／Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｓｓａｙを通じて分析した。異なる抗生剤耐性を有する１個または２個以上の血清型の肺炎球菌と血清、補体及び貪食細胞をともに培養して貪食過程を誘導し、各血清型が耐性を有する抗生剤が加えられた寒天培地の上に塗抹して血清希釈倍数による群体数を測定する。対照群で菌株が１００％生存した群体数（０％ｋｉｌｌｉｎｇ）から菌株の５０％除去率（５０％ｋｉｌｌｉｎｇ）を測定し、各サンプルの５０％除去率を示す希釈倍率を通じてオプソニン化指数（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ；ＯＩ）を比較した。
【0101】
【表3】
【0102】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認／＋＋：対照群対比３～５倍の効果を確認／＋＋＋：対照群対比５～７倍の効果を確認／＋＋＋＋：対照群対比５～７倍効果）確認）
【0103】
その結果、全ての血清型において、プレベナー１３よりも高いまたは類似の抗体価及びＯＰＡ力価を確認し、１３価免疫原性組成物で大きい免疫干渉効果は確認されなかった。投与濃度及び血清型において低い力価を示す群が一部あったが、当該現象は、７価免疫原性組成物実験及び一部の論文で既によく知られている現象であることを確認した。先立つＥＬＩＳＡ力価分析では、プレベナー１３力価と類似の水準の力価が確認されているが、ＯＰＡ力価の場合、一部の血清型はプレベナー１３よりもはるかに高い血清型と類似の血清型が異なって分布していることを確認した。また、これにより、ＥＬＩＳＡ結果よりＯＰＡ結果で信頼度／弁別力がより高いことを確認した（表３及び図２）。
【0104】
実施例４．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化及び免疫原性の研究
実施例４－１．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化
実施例２から得られた最終バルク(Ｂｕｌｋ）濃縮物の最終容積は、バッチ（Ｂａｔｃｈ）容積及びバルク糖類濃度に基づいて計算した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びサクシネート緩衝液を予備標識した剤形容器に加えた後、バルク濃縮物を加えた。その後、製剤を完全に混合し、０．２μｍの膜を用いて滅菌ろ過した。バルクアルミニウムホスフェートの添加過程及び最終添加完了後の剤形化したバルクを穏やかに混合し、ｐＨを確認して必要に応じてそれを調整した。剤形化したバルク生成物を２～８℃で貯蔵した。下記の表に、４類型の多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示した。
実施例４－１．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化
実施例２から得られた最終バルク(Ｂｕｌｋ）濃縮物の最終容積は、バッチ（Ｂａｔｃｈ）容積及びバルク糖類濃度に基づいて計算した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）、ポリソルベート８０及びサクシネート緩衝液を予備標識した剤形容器に加えた後、バルク濃縮物を加えた。その後、製剤を完全に混合し、０．２μｍの膜を用いて滅菌ろ過した。バルクアルミニウムホスフェートの添加過程及び最終添加完了後の剤形化したバルクを穏やかに混合し、ｐＨを確認して必要に応じてそれを調整した。剤形化したバルク生成物を２～８℃で貯蔵した。下記の表に、４類型の多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示した。
【0105】
【表4】
【0106】
得られたワクチン組成物は、合計０．５ｍＬ中に、２μｇの各糖類、但し、６Ｂは４μｇ；約３５μｇ内外のＣＲＭ１９７運搬体タンパク質；０．１２５ｍｇのアルミニウム元素（０．５ｍｇのアルミニウムホスフェート）アジュバント；約４．２５ｍｇの塩化ナトリウム；約２９５μｇのサクシネート緩衝液；及び約１００μｇのポリソルベート８０を含有した。
【0107】
実施例４－２．血清型特異ＩｇＧ濃度ＥＬＩＳＡの測定
前記実施例で製造した各々の多価肺炎球菌ワクチン組成物がウサギにおいて免疫反応を誘導する能力を有するか否かを確認するため、以下のように実験を行った。当該免疫原性は、抗原特異的ＥＬＩＳＡを通じて血清ＩｇＧ濃度を測定して確認した。
前記実施例で製造した各々の多価肺炎球菌ワクチン組成物がウサギにおいて免疫反応を誘導する能力を有するか否かを確認するため、以下のように実験を行った。当該免疫原性は、抗原特異的ＥＬＩＳＡを通じて血清ＩｇＧ濃度を測定して確認した。
【0108】
製剤化した各々の多価肺炎球菌ワクチン組成物または対照群であるプレベナー１３（登録商標）を計画したヒト臨床用量（各多糖類４．４μｇ／ｍｌ、例外：６Ｂ８．８μｇ／ｍｌの場合を１００％として、必要に応じて一部血清型の含有量を調節）で、０週目、２週目及び４週目にニュージーランドホワイト（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ）ウサギの筋肉内に免疫接種し、接種後２週間の間隔で各々の血清を採取した。採取された血清に対してマルチプレックスビーズアッセイ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｂｅａｄ Ａｓｓａｙ）を用いて血清型特異的ＩｇＧ濃度を測定した。これを詳細に説明すると、次の通りである。
【0109】
磁性を有するビーズ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ）に、１３または１７種の多糖抗原を接合させた溶液を９６－ウェルプレートに入れて付着させた。各個体別の血清は、非特異的抗原－抗体反応を最小限にするために、ＣＷＰＳ多重溶液（ＣＷＰＳ ｍｕｌｔｉ（登録商標）、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１ｍｇ／ｍＬと常温で３０分間反応させて吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれた抗体希釈用緩衝液を用いて適宜な希釈倍数で希釈した。１３、１７、１８又は１９種の多糖抗原接合磁性ビーズが付着したプレートを洗浄用緩衝液で２回洗浄し、予め吸着及び希釈した血清５０μｌをプレートに入れた後、室温で３０分間反応させた。
【0110】
反応させたプレートを同じ方法で３回洗浄し、各ウェルにＲ－ＰＥゴート抗ラビットＩｇＧ（Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒ ｉｎ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）（１：５００）を入れた後、室温で３０分間反応させた。プレートを前記のような方法で３回洗浄し、各ウェルに緩衝液を８０μｌずつ入れた後、マルチプレックスリーダー（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｄｅｒ）を用いて蛍光を測定した。客観的な免疫原性評価のための対照群としてプレベナー１３（登録商標）を免疫化して採取した血液サンプルをともに分析した。
【0111】
【表5】
【0112】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認／＋＋：対照群対比３～５倍の効果を確認／＋＋＋：対照群対比５～７倍の効果を確認）
【0113】
その結果、ＰＣＶ１７－ＣＲＭ１９７は、全ての１７価血清型に対して優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示すことを確認した。ＰＣＶ１７－ＣＲＭ１９７の場合、プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い血清型－特異的ＩｇＧ濃度を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ及び２２Ｆの各々は、優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示した。
【0114】
２３Ａ、３５Ｂは、肺炎球菌多糖ワクチン（ＰＰＶ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ）であるＰＰＶ２３に含まれていない血清型であり、現在まで肺炎ワクチンに使用されていない血清型で、アジアとヨーロッパで、血清型の置換後に到来した血清型の一つである。
【0115】
２３Ａ、３５Ｂが含まれたＰＣＶ１８－ＣＲＭ１９７、ＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７は、全ての血清型に対して優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示すことを確認した。プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い血清型特異的ＩｇＧ濃度を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂの各々はいずれも、優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示すことを確認した。（表５）
【0116】
実施例４－３．抗体機能オプソニン試験（ＭＯＰＡ検定法）
抗体機能は、ＭＯＰＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ）検定により血清を試験することによって評価した。各菌株の濃度が約５０，０００ＣＦＵ／ｍＬとなるように、－７０℃以下で貯蔵した肺炎連鎖球菌ＭＯＰＡ株を相応する最終希釈度に希釈した。等価量の血清を各対象からサンプリングし、グループごとに集め、２０μｌの血清がＵ底プレートに残るように２倍連続希釈した。サンプルを希釈した後、各血清型に対して製造した１０μｌの菌株を希釈したサンプルと混合し、肺炎連鎖球菌と抗体がよく混合されるように混合物を室温で３０分間反応させた。予備分化させたＨＬ－６０細胞と補体との混合物を加え、ＣＯ２培養器（３７℃）で４５分間反応させた。温度を下げて食菌作用を中断し、１０μｌの反応溶液を３０～６０分間予備乾燥した寒天プレート上にスポット（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、乾燥するまで２０分間プレート上に吸収されるようにした。 ２５ｍｇ／ｍＬ ＴＴＣストック溶液を製造したオーバーレイ寒天（Ｏｖｅｒｌａｙ Ａｇａｒ）に加え、相応する菌株に適合な抗体をこれに加えた。混合物を完全に混合した後、約２５ｍＬの混合物をプレートに加え、約３０分間硬化させた。完全に硬化したプレートをＣＯ２培養器（３７℃）で１２～１８時間培養した後、コロニーを計数した。ＭＯＰＡ力価は、５０％死滅が観察される希釈率で表された。比較例として、商業的に利用可能な１３価ワクチン（プレベナー１３）を同一の過程に適用した。
抗体機能は、ＭＯＰＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ Ａｓｓａｙ）検定により血清を試験することによって評価した。各菌株の濃度が約５０，０００ＣＦＵ／ｍＬとなるように、－７０℃以下で貯蔵した肺炎連鎖球菌ＭＯＰＡ株を相応する最終希釈度に希釈した。等価量の血清を各対象からサンプリングし、グループごとに集め、２０μｌの血清がＵ底プレートに残るように２倍連続希釈した。サンプルを希釈した後、各血清型に対して製造した１０μｌの菌株を希釈したサンプルと混合し、肺炎連鎖球菌と抗体がよく混合されるように混合物を室温で３０分間反応させた。予備分化させたＨＬ－６０細胞と補体との混合物を加え、ＣＯ２培養器（３７℃）で４５分間反応させた。温度を下げて食菌作用を中断し、１０μｌの反応溶液を３０～６０分間予備乾燥した寒天プレート上にスポット（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、乾燥するまで２０分間プレート上に吸収されるようにした。 ２５ｍｇ／ｍＬ ＴＴＣストック溶液を製造したオーバーレイ寒天（Ｏｖｅｒｌａｙ Ａｇａｒ）に加え、相応する菌株に適合な抗体をこれに加えた。混合物を完全に混合した後、約２５ｍＬの混合物をプレートに加え、約３０分間硬化させた。完全に硬化したプレートをＣＯ２培養器（３７℃）で１２～１８時間培養した後、コロニーを計数した。ＭＯＰＡ力価は、５０％死滅が観察される希釈率で表された。比較例として、商業的に利用可能な１３価ワクチン（プレベナー１３）を同一の過程に適用した。
【0117】
【表6】
【0118】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認／＋＋：対照群対比３～５倍の効果を確認／＋＋＋：対照群対比５～７倍の効果を確認）
【0119】
その結果、全ての血清型がＰＣＶ１７－ＣＲＭ１９７において優れた水準の機能的免疫原性を示すことを確認した。ＰＣＶ１７－ＣＲＭ１９７の場合、プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より良好な機能的免疫原性を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ及び２２Ｆはそれぞれ、高い水準の機能的免疫原性を示した。
【0120】
２３Ａ及び３５Ｂの場合、肺炎球菌多糖ワクチンであるＰＰＶ２３に含まれていない血清型であるため、抗生剤耐性菌株が存在しないものと知られているが、そこで、抗生剤耐性菌株を作製してＭＯＰＡ分析に使用し、耐性菌株の作製は、ＵＡＢ抗生剤耐性菌株の製造方法（ＭＯＰＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に基づいて作製し、作製後に菌株特性化分析及び同定により各２３Ａ及び３５Ｂ血清型の特性を確認した。
【0121】
前記実験により、２３Ａ及び３５Ｂが含まれたＰＣＶ１８－ＣＲＭ１９７、ＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７は、全ての血清型に対して優れた水準の血清型機能的抗体を生成することを確認した。プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い機能的抗体を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ及び３５Ｂはそれぞれ優れた水準の機能的抗体を示した。
【0122】
さらに、前記結果から、ＰＣＶ１７、１８、１９組成物が陽性対照であるＰＣＶ１３に対して低下した免疫原性の血清型を示しておらず、ＰＣＶ１３に対して同様であるか、高い水準の力価を最終的に確認したので、ＰＣＶ１９組成物が免疫干渉効果のないことを最終的に確認した（表６）。
【0123】
実施例５．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化及び免疫原性の研究
実施例５－１．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化
前記実施例を参考にして、下記のような免疫原性組成物を作製し、下記表に各構成の多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示した。
実施例５－１．多価肺炎球菌ワクチンの製剤化
前記実施例を参考にして、下記のような免疫原性組成物を作製し、下記表に各構成の多価肺炎球菌接合体ワクチン剤形を示した。
【0124】
【表7】
【0125】
実施例５－２．血清型特異ＩｇＧ濃度ＥＬＩＳＡの測定
前記実施例のように、マウスから得られた血清を用いてＥＬＩＳＡを行い、その結果は、以下の通りである。
前記実施例のように、マウスから得られた血清を用いてＥＬＩＳＡを行い、その結果は、以下の通りである。
【0126】
【表8】
【0127】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認／＋＋：対照群対比３～５倍の効果を確認）
【0128】
その結果、ＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７ Ｆｕｌｌ ｄｏｓｅは、全ての１９種類の血清型に対して優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を生成することを確認した。ＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７の場合、プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い血清型特異的ＩｇＧ濃度を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆのそれぞれも優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示した。
【0129】
プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い血清型特異的ＩｇＧ濃度を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ並びに２３Ａ、３５Ｂのそれぞれも優れた水準の血清型特異的ＩｇＧ濃度を示すことを確認した（表８）。
【0130】
実施例５－３．抗体機能オプソニン試験（ＭＯＰＡ検定法）
前記実施例を参考にして、マウスから得られた血清を用いてＯＰＡ分析を行い、その結果は、以下の通りである。
前記実施例を参考にして、マウスから得られた血清を用いてＯＰＡ分析を行い、その結果は、以下の通りである。
【0131】
【表9】
【0132】
（※＋：対照群対比１～３倍の効果を確認／＋＋：対照群対比３～５倍の効果を確認／＋＋＋：対照群対比５～７倍の効果を確認）
【0133】
その結果、全ての血清型は、ＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７のＦｕｌｌ ｄｏｓｅ、１／４ ｄｏｓｅ、１／１６ ｄｏｓｅ全てのグループにおいて、プレベナー１３と同様であるか、より高い水準の機能的抗体力価を示すことを確認した。
【0134】
２３Ａ、３５Ｂが含まれたＰＣＶ１９－ＣＲＭ１９７のＦｕｌｌ ｄｏｓｅ、１／４ ｄｏｓｅ、１／１６ ｄｏｓｅグループにおいて、ほぼ全ての血清型に対して優れた水準の血清型機能的抗体を誘起することを確認した。プレベナー１３と共通の血清型は、プレベナー１３と同様であるか、より高い機能的抗体を示しており、新しく追加された血清型１０Ａ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆ並びに２３Ａ、３５Ｂのそれぞれも優れた水準の機能的抗体を示した。
【0135】
さらに、前記結果から、ＰＣＶ１９組成物が陽性対照群であるＰＣＶ１３に対して低下した免疫原性の血清型を示しておらず、ＰＣＶ１３に対して同様であるか、高い水準の力価を最終確認したので、ＰＣＶ１９組成物が免疫干渉効果のないことを再び確認した（表９）。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】