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特表2022-540781抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む製剤、その調製方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-20
(54)【発明の名称】抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む製剤、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220912BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220912BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220912BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20220912BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220912BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20220912BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220912BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20220912BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220912BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220912BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N ZNA
A61P43/00 111
A61P35/02
A61P35/00
A61P37/06
A61P29/00
A61P31/00
A61P35/04
A61K9/08
A61K47/22
A61K47/26
A61K9/19
C07K16/28
C07K16/46
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021577124
(86)(22)【出願日】2020-06-24
(85)【翻訳文提出日】2022-01-28
(86)【国際出願番号】 CN2020098172
(87)【国際公開番号】W WO2020259605
(87)【国際公開日】2020-12-30
(31)【優先権主張番号】201910554231.X
(32)【優先日】2019-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202010550660.2
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】519274183
【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】チュー シンコイ
(72)【発明者】
【氏名】マー イートン
(72)【発明者】
【氏名】ワン インチュエ
(72)【発明者】
【氏名】チョウ カイソン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB13
4C076BB16
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC29
4C076CC31
4C076DD08E
4C076DD38Q
4C076DD49
4C076DD51Q
4C076DD60Z
4C076DD67Q
4C076EE23E
4C076FF15
4C076FF61
4C076FF63
4C085AA14
4C085AA16
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG04
4H045AA11
4H045AA30
4H045AA40
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA30
(57)【要約】
本発明は、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む製剤に関し、特に抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体、緩衝剤、安定剤及び界面活性剤を含む医薬製剤に関する。また、本発明は、疾患を治療又は予防するためのこれらの製剤の使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）緩衝剤と、（iii ）安定剤と、（iv）界面活性剤と、任意に、（ｖ）金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）と、を含む液体抗体製剤であって、前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は三本鎖抗体であり、前記三本鎖抗体が、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、PD-L1と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨを、単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位としてそれぞれ含み、或いは第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨを、単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位としてそれぞれ含み、好ましくは、前記液体抗体製剤のｐＨ値が約６．４‐７．０、例えば、約６．４、６．５、６．８、又は７．０である、液体抗体製剤。
【請求項2】
前記液体抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約１‐２００ｍｇ／ｍLであり、好ましくは約５‐１５０ｍｇ／ｍＬであり、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍｇ／ｍLである、請求項１に記載の液体抗体製剤。
【請求項3】
前記液体抗体製剤における緩衝剤は、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン及びこれらの組合せから選ばれ、前記緩衝剤の濃度は好ましくは約１‐３０ｍＭであり、そしてより好ましくは約５‐２５ｍＭであり、例えば、約５、１０、１５、２０、又は２５ｍＭである、請求項１又は２に記載の液体抗体製剤。
【請求項4】
前記安定剤は、ソルビトール、スクロース、トレハロース、アルギニン、塩酸アルギニン及びこれらの任意の組合せから選ばれ、そして好ましくはスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンであり；前記安定剤の濃度は好ましくは約５０‐５００ｍＭであり、そしてより好ましくは約１００‐４００ｍＭであり、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、又は４００ｍＭである、請求項１‐３の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項5】
前記液体抗体製剤は、塩酸アルギニンを安定剤として含み、好ましくは塩酸アルギニンが約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｍＭ）の量で存在し、及び／又は前記液体抗体製剤は、スクロースを安定剤として含み、好ましくはスクロースが約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｍＭ）の量で存在する、請求項１‐４の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項6】
前記液体抗体製剤における界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤から選ばれ、そして好ましくはポリソルベート８０である、請求項１‐５の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項7】
前記界面活性剤の濃度は約０．１‐１ｍｇ／ｍLであり、好ましくは約０．２‐０．８ｍｇ／ｍLであり、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、又は０．８ｍｇ／ｍＬである、請求項１‐６の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項8】
前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば、約０．００２‐０．２ｍｇ／ｍL金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、好ましくは約０．０１‐０．１ｍｇ／ｍL、例えば約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、又は０．１ｍｇ／ｍL金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含む、請求項１‐７の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項9】
前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対が第１抗原結合部位として、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来するＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ ＣＤＲ２及びＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ ＣＤＲ３、又は前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位が共にＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧ（配列番号１７）に示されるＣＤＲ１、ＩＥＳＤＧＳＴ（配列番号１８）に示されるＣＤＲ２及びＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹ（配列番号１９）に示されるＣＤＲ３、又は前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、 より好ましくは、前記第１ポリペプチド鎖及び前記第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対が第１抗原結合部位として、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来する配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、そして前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位が共に配列番号１５及び／又は配列番号１６に示される配列、又はこれらと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含み、最も好ましくは、前記三本鎖抗体が、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４又は配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、或いは前記配列の何れかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む、請求項１に記載の液体抗体製剤。
【請求項10】
前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞において組換え発現される、請求項１‐９の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項11】
前記液体製剤は注射剤であり、好ましくは皮下注射又は静脈内注射に使用されるものであり、或いは輸注剤であり、例えば静脈内輸注に使用されるものである、請求項１‐１０の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項12】
（ｉ）約１‐２００ｍｇ／ｍLの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約１‐３０ｍＭのヒスチジン及び／又は塩酸ヒスチジンと、（iii ）約５０‐５００ｍＭのスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンと、（iv）約０．１‐１ｍｇ／ｍLのポリソルベート８０と、を含み、任意に、０．００２‐０．２ｍｇ／ｍLの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含む液体抗体製剤であって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５であり、例えば、前記液体抗体製剤は、（ｉ）約５０‐１５０ｍｇ／ｍLの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約３‐２５ｍＭのヒスチジン及び／又は塩酸ヒスチジンと、（iii ）約１５０‐３００ｍＭのスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンと、（iv）約０．２‐０．８ｍｇ／ｍLポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、約０．０１‐０．１ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含み、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５であり、或いは、前記液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍLの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２０ｍＭヒスチジンと、（iii ）約１８０ｍＭ塩酸アルギニンと、（iv）約０．２ｍｇ／ｍLポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍLのＥＤＴＡを更に含み、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５であり、或いは、前記液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２０ｍＭヒスチジンと、（iii ）約１００ｍＭ塩酸アルギニン及び４％スクロースと、（iv）約０．２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを更に含み、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５であり、或いは、前記液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２．５２ｍｇ／ｍＬヒスチジン及び約０．７９ｍｇ／ｍＬ塩酸ヒスチジンと、（iii ）約３７．９２ｍｇ／ｍＬ塩酸アルギニンと、（iv）約０．５ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０と、を含み 任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを更に含み、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である、請求項１‐１１の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項13】
保存後に、例えば２‐８℃で少なくとも２４ヶ月保存した後に、又は室温で少なくとも３ヶ月保存した後に、又は４０℃±２℃で１ヶ月保存した後に、安定的であり、好ましくは、以下の：（ｉ）ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法により測定した結果、製剤は、９０％より大きい純度を有し、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％より大きい純度を有する、という特徴と、（ii）還元型又は非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により測定した結果、製剤は、８５％より大きい純度を有し、好ましくは８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、又は９２％より大きい純度を有する、という特徴と、（iii ）ｉＣＩＥＦ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、５０％以下であり、例えば、４８％、４６％、４４％、４２％、又は４０％以下である、という特徴と、（iv）ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、４０％以下であり、例えば、３８％、３６％、３４％、３２％、又は３０％以下である、という特徴と、（ｖ）ＥＬＩＳＡ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の相対結合活性は、７０％‐１３０％であり、例えば、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％である、という特徴の１つ又は複数を有する、請求項１‐１２の何れか１項に記載の液体抗体製剤。
【請求項14】
請求項１‐１３の何れか１項に記載の液体抗体製剤を固化させることで得られ、例えば、注射用の凍結乾燥粉末の形態である、固体抗体製剤。
【請求項15】
請求項１-１３の何れか１項に記載の液体抗体製剤、又は請求項１４に記載の固体抗体製剤を含む送達装置。
【請求項16】
請求項１-１３の何れか１項に記載の液体抗体製剤、又は請求項１４に記載の固体抗体製剤を含み、静脈内注射又は筋肉内注射に使用される薬剤充填済み注射器。
【請求項17】
ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する病的状態を治療、予防又は緩和するための医薬の製造のための請求項１‐１３の何れか１項に記載の液体抗体製剤又は請求項１４に記載の固体抗体製剤の使用であって、前記病的状態は、例えば、様々な固形腫瘍及び血液疾患（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄瘤、例えば、多発性骨髄腫）、自己免疫疾患、急性及び慢性炎症性疾患、感染性疾患及び転移性病巣である前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は抗体製剤分野に関する。具体的には、本発明は、組換え抗表面抗原分類４７（ＣＤ４７）及び抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ‐Ｌ１）二重特異性抗体（抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体とも呼ばれる）を含む医薬製剤、特に安定的な高濃度抗体液体製剤、前記医薬製剤の調製方法、並びに治療及び／又は予防における前記医薬製剤の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＰＤ‐Ｌ１（表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７‐Ｈ１）とも呼ばれる）は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤ‐Ｌ１は、活性化したＴ細胞に存在するその受容体ＰＤ‐１と結合して、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートする（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔａｌ．，２００１ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１‐８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４‐４３）。ヒト肺がん、卵巣がん、結腸がん、多数の骨髄腫など、多くのがんでＰＤ‐Ｌ１発現が認められ、しかもＰＤ‐Ｌ１発現はがんの予後不良に関係する場合が多い（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２） ＰＮＡＳ ９９：１２２９３‐７；Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７‐５３；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎ． １９：８１３‐２４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６６：３３８１‐５）。ＰＤ１とＰＤ‐Ｌ１の局所的相互作用を抑制することによって一部の腫瘍患者において免疫抑制を逆転することが提案されている。エフ・ホフマン・ラ・ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社によって研究・開発された抗ＰＤ‐Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、独メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）及び米ファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ）が共同で開発した抗ＰＤ‐Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂ、アストラゼネカ社によって研究・開発されたＤｕｒｖａｌｕｍａｂは一部の腫瘍患者に治療効果を表している。他の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖及び軽鎖の可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載の配列番号２０及び２１で表されている）及びＷＯ２００７／００５８７４に開示されている抗ＰＤ‐Ｌ１抗体などを含む。
【0003】
表面抗原分類４７（ＣＤ４７）はインテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）とも呼ばれ、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーである。ＣＤ４７は、主にマクロファージ及び樹状細胞が発現させた、そのリガンドとしての細胞表面免疫グロブリンＳＩＲＰαと互いに作用して、一連のカスケード反応を産生し、それにより、ＣＤ４７を発現させた細胞に対するマクロファージ及び樹状細胞の取り込み及び貪食作用が抑制される。腫瘍ではＣＤ４７の過剰発現が観察された。ところが、ＣＤ４７が多数の正常な組織でも発現されるため、ＣＤ４７だけを標的とする抗体は、通常、正常な血液系における細胞に非特異的に結合されて、抗原シンク（ａｎｔｉｇｅｎ ｓｉｎｋ）の現象をもたらす。
【0004】
抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体は、ＣＤ４７及び腫瘍細胞上のＰＤ‐Ｌ１を同時に標的とし、腫瘍細胞上のＰＤ‐Ｌ１との特異的結合により、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の、腫瘍細胞に対する選択的結合が促進され、多数の正常な組織で発現させたＣＤ４７との結合が回避されるため、抗腫瘍作用を強化すると共に副作用を減少させる優位性を有する。
【0005】
ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１２３８８６のＰＣＴ特許出願（出願日：２０１８年１２月２６日）には、新規抗体形態が開示されると共に、前記新規抗体形態を有する抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体が構築・発現された。Ｒａｊｉ‐ＰＤ‐Ｌ１細胞をＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスに接種することで作成された担腫瘍マウスに抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を投与した結果によれば、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及び抗ＰＤ‐Ｌ１モノクローナル抗体を投与した場合と比較すれば、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を投与した場合は、明らかに向上された抗腫瘍活性を有し、腫瘍の成長を明らかに抑制し、更に腫瘍を完全に消すことができる。また、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体は明らかに低減した血細胞凝集作用を示したため、臨床治療において明らかに低減した副作用を有する。本分野では、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する様々な疾患を治療、予防又は緩和できる抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤が必要とする。
【0006】
抗体製剤は抗体が対象に対する投与に適用できる方法で調製するだけでなく、その安定性が保存及びその後の使用期間で維持できる方法で調製する必要がある。例えば、抗体が液体において適切に調製されていない場合、当該抗体は液体溶液において分解、凝集又は予期せぬ化学修飾などが生じる傾向がある。抗体製剤における抗体の安定性は、製剤に使用される緩衝剤、安定剤及び界面活性剤などによって決定される。
【0007】
本分野では、幾つかの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体が知られているにも関わらず、対象に対する投与に適用できる十分に安定的な抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む新規医薬製剤について依然として必要とされる。従って、疾患を治療又は予防するために、適切な抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤が必要とされる。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、ＣＤ４７及びＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む医薬製剤を提供することで、上記の要件を満たす。
【0009】
一態様において、本発明は、（ｉ）抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、（ii）緩衝剤と、（iii ）安定剤と、（iv）界面活性剤と、を含む液体抗体製剤を提供する。
【0010】
本発明の抗体製剤に含まれる抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は三本鎖抗体であり、前記三本鎖抗体が、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、PD-L1と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨを、単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位としてそれぞれ含み、或いは第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨを、単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位としてそれぞれ含む。幾つかの実施形態において、前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、少なくとも約１０7Ｍ‐1、好ましくは約１０8Ｍ‐1、より好ましくは約１０9Ｍ‐1又はそれよりも高い親和力定数で、腫瘍細胞表面のＣＤ４７と結合することで、ＣＤ４７とマクロファージ表面のＳＩＲＰαとの結合を遮断して、腫瘍組織浸潤領域のマクロファージによる腫瘍細胞への貪食作用を促進することができ、更に、少なくとも約１０7Ｍ‐1、好ましくは約１０8Ｍ‐1、より好ましくは約１０9Ｍ‐1又はそれよりも高い親和力定数で腫瘍細胞表面のＰＤ‐Ｌ１と結合することで、Ｔ細胞におけるＰＤ‐１と腫瘍細胞表面のＰＤ‐Ｌ１との結合を抑制して、Ｔ細胞の活性化を誘導して抗腫瘍作用を発揮させることができる。
【0011】
一実施形態において、前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１２３８８６のＰＣＴ特許出願（出願日：２０１８年１２月２６日）により開示された組換え抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質である。本願の目的のために、当該ＰＣＴ特許出願の全内容がここに参考として本明細書に組み込まれる。一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は三本鎖抗体であり、前記三本鎖抗体が、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第１ＶＨＨを単一ドメイン第２抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第２ＶＨＨを単一ドメイン第３抗原結合部位として含むものであって、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対が第１抗原結合部位として、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来するＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ ＣＤＲ２及びＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ ＣＤＲ３、又は前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して1個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位が共にＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧ（配列番号１７）に示されるＣＤＲ１、ＩＥＳＤＧＳＴ（配列番号１８）に示されるＣＤＲ２及びＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹ（配列番号１９）に示されるＣＤＲ３、又は前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含む。 一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、前記第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対が第１抗原結合部位として、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来する配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、そして前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン第２抗原結合部位及び単一ドメイン第３抗原結合部位が共に配列番号１５及び／又は配列番号１６に示される配列、又はそれらと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む（但し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＥＨＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＴＧＳＡＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＶＳＦＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＱＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＧＮＡＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）である）。
【0012】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４又は配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、或いは前記配列の何れかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む（但し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＥＨＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＴＧＳＡＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＶＳＦＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１４）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２２）である）。
【0013】
一実施形態において、前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞において組換え発現される抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質である。
【0014】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約１‐２００ｍｇ／ｍＬである。別の実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約５‐１５０ｍｇ／ｍＬである。他の実施形態において、本発明の液体抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の濃度は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍｇ／ｍＬである。
【0015】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約１‐３０ｍMである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約５‐２５ｍＭであり、例えば、約５、１０、１５、２０、又は２５ｍＭである。
【0016】
一実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン及びこれらの組合せから選ばれる。
【0017】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における安定剤の濃度は、約５０‐５００ｍＭである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における安定剤の濃度は、約１００‐４００ｍＭであり、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭである。
【0018】
一実施形態において、前記安定剤は、ソルビトール、スクロース、トレハロース、アルギニン、塩酸アルギニン及びこれらの任意の組合せから選ばれ、そして好ましくはスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンである。一実施形態において、前記液体抗体製剤は、塩酸アルギニンを安定剤として含み、好ましくは塩酸アルギニンが約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｍＭ）の量で存在し、及び／又は前記液体抗体製剤は、スクロースを安定剤として含み、好ましくはスクロースが約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００ｍＭ）の量で存在する。
【0019】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤の濃度は、約０．１‐１ｍｇ／ｍＬである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤の濃度は、約０．２‐０．８ｍｇ／ｍＬであり、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬである。
【0020】
一実施形態において、前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。一実施形態において、前記界面活性剤は、ポリソルベート界面活性剤から選ばれる。具体的な一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における界面活性剤は、ポリソルベート８０である。
【0021】
幾つかの実施形態において、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば、約０．００２‐０．２ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含む。一実施形態において、前記液体製剤は、約０．０１‐０．１ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．１ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含む。
【0022】
一実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約６．４‐７．０である。幾つかの実施形態において、前記液体製剤のｐＨ値は、約６．４‐７．０の任意値、例えば、約６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０である。
【0023】
一実施形態において、前記液体製剤は、医薬製剤であり、好ましくは注射剤であり、より好ましくは皮下注射剤又は静脈内注射剤である。一実施形態において、前記液体製剤は、静脈輸注剤である。
【0024】
一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、（ｉ）約１‐２００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約１‐３０ｍＭのヒスチジン及び／又は塩酸ヒスチジンと、（iii ）約５０‐５００ｍＭのスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンと、（iv）約０．１‐１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、０．００２‐０．２ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含むものであって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である。
【0025】
好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、（ｉ）約５０‐１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約３‐２５ｍＭのヒスチジン及び／又は塩酸ヒスチジンと、（iii ）約１５０‐３００ｍＭのスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンと、（iv）約０．２‐０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、約０．０１‐０．１ｍｇ／ｍＬの金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を更に含むものであって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である。
【0026】
好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２０ｍＭのヒスチジンと、（iii ）約１８０ｍＭの塩酸アルギニンと、（iv）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを更に含むものであって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である。
【0027】
好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２０ｍＭのヒスチジンと、（iii ）約１００ｍＭの塩酸アルギニン及び４％のスクロースと、（iv）約０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、を含み、任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを更に含むものであって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である。
【0028】
好ましい一実施形態において、本発明の液体抗体製剤は、（ｉ）約１００ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、 （ii）約２．５２ｍｇ／ｍＬのヒスチジン及び約０．７９ｍｇ／ｍＬの塩酸ヒスチジンと、（iii ）約３７．９２ｍｇ／ｍＬの塩酸アルギニンと、（iv）約０．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、を含み、 任意に、前記液体製剤は、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、例えば約０．０２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡを更に含むものであって、前記液体製剤のｐＨ値は約６．４‐７．０であり、好ましくは約６．５である。
【0029】
別の態様において、本発明は本発明の液体抗体製剤に対して固化処理を行うことで得られた固体抗体製剤を提供する。前記固化処理は、例えば、結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法により実施された。好ましい一実施形態において、前記固体抗体製剤は、例えば、注射用の凍結乾燥粉末の形態である。固体抗体製剤が使用前に適切な溶媒に再構成されることで、本発明の再構成製剤が形成される。前記再構成製剤は本発明の液体抗体製剤でもある。一実施形態において、前記適切な溶媒は、注射用水、注射用有機溶媒（注射用油、エタノール、プロピレングリコールなど、又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されない）から選ばれる。
【0030】
本発明の液体製剤は、例えば少なくとも２４ヶ月又はそれ以上の期間で長期的且つ安定的に保存することができる。一実施形態において、本発明の液体製剤は、約‐８０℃～約４５℃、例えば、‐８０℃、約‐３０℃、約‐２０℃、約０℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３８℃、約４０℃、約４２℃又は約４５℃の条件で、少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、少なくとも３６ヶ月、又はそれ以上の期間で安定的に保存することができる。
【0031】
一実施形態において、本発明の液体製剤は少なくとも２４ヶ月安定的に保存することができる。更に別の一実施形態において、本発明の液体製剤は少なくとも４０℃で安定的である。更に別の一実施形態において、本発明の液体製剤は約２℃‐８℃で少なくとも１２ヶ月、好ましくは少なくとも２４ヶ月安定的に保持する。一実施形態において、本発明の液体製剤は室温又は例えば約２５℃で少なくとも３ヶ月、好ましくは少なくとも６ヶ月安定的に保持する。更に別の一実施形態において、本発明の液体製剤は約４０℃で少なくとも１ヶ月安定的に保持する。
【0032】
一実施形態において、製剤の外観、視認できる異物、タンパク質含有量、純度、及び／又は電荷変異体の変化を測定することで、保存後製剤の安定性を示すことができる。一実施形態において、高温苛酷試験で、例えば、４０℃±２℃で少なくとも１週間、２週間又は好ましくは１ヶ月保存した後、或いは２５℃±２℃で少なくとも１ヶ月又は２ヶ月保存した後に、本発明の液体製剤の安定性を測定することができる。
【0033】
一実施形態において、保存後に目視検査により本発明の液体製剤の安定性を確認した結果、本発明の液体製剤は外観上で澄明又は薄い乳白光を呈し、無色又は薄い黄色の液体であり、異物がない。一実施形態において、透明度測定器で目視検査により確認した結果、製剤には視認できる異物がない。一実施形態において、保存後にタンパク質含有量の変化を、例えば、紫外線分光光度（ＵＶ）法により測定することで、本発明の液体製剤の安定性を検査した結果、保存０日目の初期値に対するタンパク質含有量の変化率は、２０％以下であり、好ましくは１０％以下であり、例えば７～８％であり、好ましくは５％以下である。一実施形態において、保存後に本発明の液体製剤の濁度変化を、例えば、ＯＤ350nm法により測定することで、本発明の液体製剤の安定性を検査した結果、保存０日目の初期値に対する変化値は、０．０４以下であり、より好ましくは０．０３以下であり、より好ましくは０．０２以下である。一実施形態において、保存後に本発明の液体製剤の純度変化を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ）により測定することで、本発明の液体製剤の安定性を検査した結果、保存０日目の初期値に対する単量体純度の変化値は、１０％以下であり、例えば、５％、４％、３％以下であり、例えば、１‐２％であり、好ましくは１％以下である。一実施形態において、保存後に本発明の液体製剤の純度変化を、非還元型及び／又は還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（ＣＥ‐ＳＤＳ）法により測定することで、本発明の液体製剤の安定性を検査した結果、単量体純度の変化値の低下は、１０％以下であり、例えば、９．５％、８．５％、７．５％、６．５％以下である。一実施形態において、保存後に本発明の液体製剤の安定性を画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により測定した結果、保存０日目の初期値に対する抗体の電荷変異体（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、５０％以下であり、例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％以下である。一実施形態において、保存後に本発明の液体製剤の安定性をカチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法）により測定した結果、保存０日目の初期値に対する抗体の電荷変異体（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、４０％以下であり、例えば、３８％、３６％、３４％、３２％、３０％以下である。
【0034】
一実施形態において、製剤は保存後に、例えば、２‐８℃で少なくとも２４ヶ月保存した後に、又は室温で少なくとも３ヶ月保存した後に、又は４０℃±２℃で１ヶ月保存した後に、安定的であり、好ましくは、以下の：（ｉ）ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法により測定した結果、製剤は、９０％より大きい純度を有し、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％より大きい純度を有する、という特徴と、（ii）還元型又は非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により測定した結果、製剤は、８５％より大きい純度を有し、好ましくは８６％、８７％、８８％、又は８９％より大きい純度を有する、という特徴と、（iii ）ｉＣＩＥＦ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、５０％以下であり、例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、又は２５％以下である、という特徴と、（iv）ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の各成分（主成分、酸性成分及び塩基性成分）の変化値の合計は、４０％以下であり、例えば、３８％、３６％、３４％、３２％、又は３０％以下である、という特徴と、（ｖ）ＥＬＩＳＡ法により測定した結果、保存０日目の初期値に対する製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の相対結合活性は、７０％‐１３０％であり、例えば、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％である、という特徴の１つ又は複数を有する。
【0035】
一態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を含む送達装置を提供する。一実施形態において、本発明の送達装置は、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を含む薬剤充填済み注射器の形態で提供され、例えば、静脈内、皮下、皮内又は筋肉内注射、静脈内輸注に用いられる。
【0036】
更に別の態様において、本発明は、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤を対象に投与する工程を含む、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を例えば哺乳類などの対象に送達する方法を提供する。前記送達は、例えば、薬剤充填済み注射器を利用する送達装置により実施される。
【0037】
更に別の態様において、本発明は、対象におけるＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する病的状態を治療、予防又は緩和するための送達装置（例えば、薬剤充填済み注射器）又は薬物の調製における、本発明の液体抗体製剤又は固体抗体製剤の使用を提供する。前記病的状態は、例えば、様々な血液疾患及び固形腫瘍であり、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、乳がん、胃がん、肺がん、食道がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫、黒色腫及びその他の固形腫瘍、例えば、アレルギー性喘息又は潰瘍性結腸炎などの自己免疫疾患及び炎症性疾患、非ヒト組織移植物（異種移植片）の拒絶を含む細胞又は組織又は器官移植物の拒絶を含むが、これらに制限されない。
【0038】
本発明の他の実施形態は後述する具体的な説明を参考にすることで明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0039】
以下の図面を参照して閲覧すれば、次に詳細に説明される本発明の好ましい実施形態をよりよく理解できる。本発明を説明するために、図面に好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は図面に示される実施形態の特定の配置又は手段に制限されていないことは理解できる。
【0040】
【図1】抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の構造を例示するものであり、第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖がペアリングをして第１抗原結合部位を形成し、第３ポリペプチド鎖が単一ドメイン第２抗原結合部位と単一ドメイン第３抗原結合部位を含み、且つ第３ポリペプチド鎖の単一ドメイン第２抗原結合部位と単一ドメイン第３抗原結合部位との間に可動性リンカーがある。
【図2】抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤をｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０及び４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法に測定した各試料におけるタンパク質純度のトレンド図を示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、２Ｗが２週間を、１Ｍが１ヶ月を示す。
【図3】抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤をｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０及び４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により測定した各試料におけるタンパク質純度のトレンド図を示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、２Ｗが２週間を、１Ｍが１ヶ月を示す。
【図4】抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤をｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０及び４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ｉＣＩＥＦ法により測定した各試料における電荷変異体主成分のトレンド図をを示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、２Ｗが２週間を、１Ｍが１ヶ月を示す。
【図5】異なる安定剤を含む抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤（処方２‐５）を４０℃±２℃で０日間、１週間、２週間及び４週間保存した後に、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法に測定したメインピーク純度の経時変化図を示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、１Ｗが１週間を、２Ｗが２週間を、４Ｗが４週間を示す。
【図6】異なる安定剤を含む抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤（処方２‐５）を４０℃±２℃で０日間、１週間、２週間及び４週間保存した場合に、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により測定したメインピーク純度の経時変化図を示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、１Ｗが１週間を、２Ｗが２週間を、４Ｗが４週間を示す。
【図7】異なる安定剤を含む抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤（処方２‐５）を４０℃±２℃で０日間、１週間、２週間及び４週間保存した場合に、ｉＣＩＥＦ法により測定した電荷変異体主成分の経時変化図を示す。図において、横軸におけるＴ０が０日間を、１Ｗが１週間を、２Ｗが２週間を、４Ｗが４週間を示す。
【発明を実施するための形態】
【0041】
本発明は本明細書における特定方法及び実験条件が変更可能であるため、これらの方法及び条件に限定されるものではない。本発明の詳細な説明を行う前に、上記のことについて理解すべきである。なお、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を加えるものではない。
【0042】
定義別に定義しない限り、本願に用いられる全ての技術と科学用語は何れも、当業者が通常に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。
【0043】
用語「約」は数値と共に使用される時、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
【0044】
用語「及び／又は」が２つ又は複数の選択可能オプションを接続するために用いられる時、選択可能オプションの何れか１項又は選択可能オプションの何れか２項又は複数項を指すと理解すべきである。
【0045】
本願に使用される場合、用語「包含する」又は「含む」とは、前記要素、整数又は工程を含むが、他の要素、整数又は工程を排除しないことを意味する。本願において、用語「包含する」又は「含む」を用いる場合、特記しない限り、述べられた要素、整数又は工程からなる場合を含む必要がある。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことを言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことを指す。
【0046】
本願において、用語「抗体」は、最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体を含み、三本鎖抗体、完全抗体及び抗体の抗原結合断片を含むが、これらに制限されない。
【0047】
用語「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」及び「完全な抗体」の何れも、本出願において、ジスルフィド結合を介して互いに接続される少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質を交換可能に指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、更に分けられると、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と、その間に挿入されているより保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））がある。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端までは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示している。
【0048】
用語「抗体製剤」は、活性成分として使える抗体の生物学的活性が効果的に発揮できる形態であると共に、当該製剤の投与を受ける対象にとって許容されない毒性を有するその他の成分を含まない調製物を指す。これらの抗体製剤は一般的に無菌のものである。抗体製剤は一般的に薬用賦形剤を含む。「薬用」賦形剤は、製剤に使用される活性成分が有効投与量で対象に送達されるように、対象哺乳類に適切に投与できる試薬である。賦形剤の濃度は投与方式に適用できるものであり、例えば、注射に許容されるものである。
【0049】
用語「抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤」は、本明細書で「本発明の抗体製剤」とも略称され、活性成分とする抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と薬用賦形剤とを含む調製物を指す。抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と薬用賦形剤を組合せた後、活性成分とする抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質はヒト又は非ヒト動物に対する治療用又は予防用投与に適する。本発明の抗体製剤は、例えば即席タイプ薬剤充填済み注射器などの水性形態の液体製剤として調製してもよく、或いは使用直前に生理的に許容される溶液に溶解及び／又は懸濁させることで再構成（即ち、再溶解）された凍結乾燥製剤として調製してもよい。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤は液体製剤形態である。
【0050】
「安定的な」抗体製剤は、製剤における抗体が一定条件で保存した後に許容される程度の物理的安定性及び／又は化学的安定性を保持する抗体製剤を指す。一定時間で保存した後に抗体製剤に含まれる抗体の化学構造が１００％維持できなくても、一般的に一定時間で保存した後に抗体構造又は機能が約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％維持できれば、抗体製剤が「安定的」であると考えられる。幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤は製造、調製、輸送及び長期保存の段階で測定できないほどの低い抗体の凝集、分解又は化学修飾を示し、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の生物学的活性の損失が僅か又はないほどの高度安定性を示している。幾つかの実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤は、保存後にその物理的及び化学的安定性を実質的に保持している。好ましくは、本発明の液体製剤は室温又は４０℃で少なくとも１ヶ月、及び／又は２‐８℃で少なくとも２４ヶ月安定的に保持することができる。
【0051】
本分野では複数の解析技術がタンパク質安定性の測定に利用できることが知られている。例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７‐３０１， Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ （１９９１） ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０： ２９‐９０ （１９９３）を参照する。選定された温度及び選定された保存時間で安定性を測定できる。例えば、予期する製剤棚期間によって保存時間を選択できる。必要に応じて、加速安定性試験を採用できる。幾つかの実施形態において、抗体製剤に対して様々な苛酷試験を実施することで安定性を測定する。これらの試験は、調製された抗体製剤の製造、保存又は輸送期間で遭遇可能な苛酷条件、或いは製造、保存又は輸送以外の期間で抗体製剤における抗体の不安定性を加速させる条件を示している。例えば、調製された抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤をガラス瓶に充填して、高温苛酷における抗体安定性を測定することができる。
【0052】
一定時間保存した後に、製剤が凝集、沈殿、混濁及び／又は変性を示さず、或いは非常に少ない凝集、沈殿、混濁及び／又は変性を示すのであれば、製剤における抗体が「その物理的安定性を保持している」と考えられる。製剤における抗体の凝集によって患者の免疫反応を潜在的に増加させるため、安全性の問題が引き起こされる。従って、製剤における抗体の凝集を最小化にする、又は凝集を防止する必要がある。光散乱法は製剤における視認できる凝集物の測定に使用できる。ＳＥＣは製剤における可溶性凝集物の測定に使用できる。また、目視検査により製剤の外観、色及び／又は清澄度を確認、ＯＤ350nm法により製剤の濁度を測定、或いは非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により製剤の純度を測定することで、製剤の安定性を示すことができる。一実施形態において、一定温度で一定時間保存した後に製剤における抗体単量体のパーセンテージを測定することで、製剤の安定性を測定し、製剤における抗体単量体のパーセンテージが大きくなれば、製剤の安定性が高くなる。
【0053】
「許容される程度の」物理的安定性は、一定温度で一定時間保存した後に少なくとも約９２％の製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質単量体が測定できることを示す。幾つかの実施形態において、一定温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月又はそれ以上の期間保存した後に、許容される程度の物理的安定性は、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質単量体として示される。物理的安定性を評価する際に、医薬製剤を保存するための一定温度は約‐８０℃～約４５℃の任意温度であってもよく、例えば、約‐８０℃、約‐３０℃、約‐２０℃、約０℃、約４℃‐８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃又は約４５℃で保存する。例えば、約４０℃±２℃で１ヶ月又は４週間保存した後に、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質単量体が測定できれば、医薬製剤が安定的であると考えられる。約２５℃で２ヶ月保存した後に、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質単量体が測定できれば、医薬製剤が安定的であると考えられる。約５℃で９ヶ月保存した後に、少なくとも約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質単量体が測定できれば、医薬製剤が安定的であると考えられる。
【0054】
一定時間保存した後に、製剤における抗体が明らかな化学的変化を示さないのであれば、製剤における抗体が「その化学的安定性を保持している」と考えられる。ほとんどの化学的不安定性は抗体が形成された共有結合修飾形態（例えば、抗体の電荷変異体）に由来する。例えば、アスパラギン酸異性化、Ｎ及びＣ末端修飾により塩基性変異体が形成され、脱アミド化、シアル酸化及び糖化により酸性変異体が形成される。化学的安定性は抗体の化学的変化形態を測定及び／又は定量的にすることで評価される。例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又は画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）により製剤における抗体の電荷変異体を測定することができる。一実施形態において、一定温度で一定時間保存した後に製剤における抗体の電荷変異体パーセンテージ変化値を測定することで、製剤の安定性を測定し、当該変化値が小さくなれば、製剤の安定性が高くなる。
【0055】
「許容される程度」の化学的安定性は、一定温度で一定時間保存した後に製剤における電荷変異体（例えば、主成分、酸性成分又は塩基性成分）のパーセンテージ変化値が３０％以下であり、例えば２０％であることを示す。幾つかの実施形態において、一定温度で少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月又はそれ以上の期間保存した後に、許容される程度の化学的安定性は、酸性成分電荷変異体のパーセンテージ変化値が約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、又は１％以下であることとして示される。化学的安定性を評価する際に、医薬製剤を保存するための温度は約‐８０℃～約４５℃の任意温度であってもよく、例えば、約‐８０℃、約‐３０℃、約‐２０℃、約０℃、約４℃‐８℃、約５℃、約２５℃又は約４５℃で保存する。例えば、５℃で２４ヶ月保存した後に、酸性成分電荷変異体のパーセンテージ変化値が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％より少なければ、医薬製剤が安定的であると考えられる。２５℃で２ヶ月保存した後に、酸性成分電荷変異体のパーセンテージ変化値が約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％より少なければ、医薬製剤が安定的であるとも考えられる。４０℃で１ヶ月保存した後に、酸性成分電荷変異体のパーセンテージ変化値が約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％より少なければ、医薬製剤が安定的であるとも考えられる。
【0056】
用語「凍結乾燥製剤」は、液体製剤の冷凍乾燥処理により得られた又は得られる可能性のある組成物を指す。好ましくは、水含有量が５％より少ない、好適的には３％より少ない固体組成物である。
【0057】
用語「再構成製剤」は、固体製剤（例えば、凍結乾燥製剤）を生理的に許容される溶液に溶解及び／又は懸濁させることで得られた液体製剤を指す。
【0058】
明細書で使用される用語「室温」は１５℃～３０℃の温度を指し、好ましくは２０℃～２７℃の温度であり、より好ましくは２５℃の温度である。
【0059】
「苛酷条件」は化学的及び／又は物理的に抗体タンパク質にとって不利な環境を指し、前記環境により許容されない抗体タンパク質の安定喪失が発生される。「高温苛酷」は抗体製剤を室温又は更に高い温度（例えば４０℃±２℃）で一定時間保存することを指す。高温苛酷加速試験により抗体製剤の安定性を測定することができる。
【0060】
本明細書で使用される用語「非経口投与」は経腸投与及び局所投与以外の投与方式を指し、一般的に注射又は輸注による方式であり、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心筋内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、嚢下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外、胸骨内の注射及び輸注を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の安定的な抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤が対象に非経口投与される。一実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤が皮下、皮内、筋肉内又は静脈内注射方式により対象に投与される。
【0061】
Ｉ．抗体製剤本発明は、（ｉ）抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質と、（ii）緩衝剤と、（iii ）安定剤と、（iv）界面活性剤と、を含み、任意に、（ｖ）その他の賦形剤を更に含み、ｐＨ値が約６．４‐７．０である安定的な液体抗体製剤を提供する。好ましい一形態において、本発明の液体抗体製剤は注射製剤形態である。
【0062】
（ｉ）抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質本発明の抗体製剤における「抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質」は三本鎖抗体であり、前記三本鎖抗体が、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第１ＶＨＨを単一ドメイン第２抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖におけるＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第２ＶＨＨを単一ドメイン第３抗原結合部位として含み、或いは、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対を第１抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合する第１ＶＨＨを単一ドメイン第２抗原結合部位として、第３ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合する第２ＶＨＨを単一ドメイン第３抗原結合部位として含む。前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、少なくとも約１０7Ｍ‐1、好ましくは約１０8Ｍ‐1、より好ましくは約１０9Ｍ‐1又はそれよりも高い親和力定数で、ＣＤ４７と結合すると共に、少なくとも約１０7Ｍ‐1、好ましくは約１０8Ｍ‐1、より好ましくは約１０9Ｍ‐1又はそれよりも高い親和力定数で、ＰＤ‐Ｌ１と結合することで、前記抗体が、ＣＤ４７分子及びＰＤ‐Ｌ１分子を二重特異性標的とする治療剤及び／又は予防剤として使用できる。
【0063】
前記ＰＤ‐Ｌ１又はＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対に関しては、従来技術で報告されていた任意の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び将来研究・開発される抗ＰＤ‐Ｌ１抗体のＶＨ／ＶＬ対に由来する６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、或いは、従来技術で報告されていた任意の抗ＣＤ４７抗体及び将来研究・開発される抗ＣＤ４７抗体のＶＨ／ＶＬ対に由来する６個のＣＤＲ又は前記６個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含む。
【0064】
前記ＰＤ‐Ｌ１又はＣＤ４７と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨに関しては、共に天然の軽鎖欠如抗体の重鎖可変ドメイン（例えばラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）物種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン）に由来する。第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨは同じもの又は異なるものであってもよい。前記第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨは、ラクダ科の種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）で産生される抗体から由来してもよい。ラクダ科以外の種も天然の軽鎖欠如重鎖抗体を産生できるが、このようなＶＨＨも本発明の抗体タンパク質の範囲内である。前記第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨは、従来技術で報告されていた任意の抗ＰＤ‐Ｌ１抗体及び将来研究・開発される抗ＰＤ‐Ｌ１抗体のＶＨＨに由来する３個のＣＤＲ又は前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含み、或いは、従来技術で報告されていた任意の抗ＣＤ４７抗体及び将来研究・開発される抗ＣＤ４７抗体のＶＨＨに由来する３個のＣＤＲ又は前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含む。 一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、前記第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対が、中国特許出願番号ＣＮ２０１７１０７５９８２８．９で報告されていた抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来するＧＳＩＥＨＹＹＷＳ（配列番号３）に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号４）に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＡＲＧＫＴＧＳＡＡ（配列番号５）に示されるＶＨ ＣＤＲ３、ＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡ（配列番号１０）に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）に示されるＶＬ ＣＤＲ２及びＱＱＴＶＳＦＰＩＴ（配列番号１２）に示されるＶＬ ＣＤＲ３、又は前記６個ＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含む。
【0065】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨが共にＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧ（配列番号１７）に示されるＣＤＲ１、ＩＥＳＤＧＳＴ（配列番号１８）に示されるＣＤＲ２及びＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹ（配列番号１９）に示されるＣＤＲ３、又は前記３個のＣＤＲのうちの１個以上のＣＤＲに対して１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）を有する配列を含む。
【0066】
用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」（本明細書において超可変領域「ＨＶＲ」と切り替えて使用する）は、抗体可変領域において主に抗原エピトープと結合することを担当するアミノ酸領域である。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ‐末端から順に番号付ける。既定のＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨアミノ酸配列にそのＣＤＲ配列を定めるための複数の方案が本分野では周知される。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列変異性に基づいて定められるものであると共に、最もよく用いられるものである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは構造リングの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１‐９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造リングとの間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触性」（Ｃｏｎｔａｃｔ）ＨＶＲが、取得可能な複雑な結晶構造の分析に基づいたものである。ＨＶＲは、参照ＣＤＲ配列（例えば、本明細書により開示された例示的なＣＤＲ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて定めることができる。
【0067】
前記アミノ酸変異、例えば、アミノ酸置換は、好ましくは保守的なアミノ酸置換である。「保守的なアミノ酸置換」は、あるアミノ酸を化学的に類似なアミノ酸に置換することを引き起こすアミノ酸変化を指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、本分野で公知の内容として提供される。本発明の何れか１つの実施形態において、好ましい一態様において、保守的な置換残基は、以下の保守的な置換表Ａに由来し、好ましくは表Ａに示される好ましい置換残基である。
【0068】
【表1-1】
【0069】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、前記第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖における、ＣＤ４７と特異的に結合するＶＨ／ＶＬ対は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ‐２９３４１に由来する配列番号２／９の対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列、又は前記対となる重鎖可変領域配列／軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。
【0070】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の、前記第３ポリペプチド鎖における、ＰＤ‐Ｌ１と特異的に結合する第１ＶＨＨ及び第２ＶＨＨは、配列番号１５及び／又は配列番号１６に示される配列、又はこれら配列と実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む。
【0071】
抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖における免疫グロブリンの重鎖定常領域のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域と実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列である。より好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域、又はこの領域と実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列である。
【0072】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）に使用される重鎖定常領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）に使用される重鎖定常領域を含む。例えば、三本鎖抗体の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域、及び／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃを含み（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号」に従う）、それによって、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成することで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖との正確なペアリングを安定化させる。
【0073】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインにおいて抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸変異を含む。具体的な一実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施形態において、前記アミノ酸変異は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに存在し、例えば、前記抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び／又は第３ポリペプチド鎖の第２３４位及び第２３５位（ＥＵ番号）におけるアミノ酸置換を含む。具体的な一実施形態において、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである（以下、「ＬＡＬＡ変異」という）。
【0074】
別の実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の第２ポリペプチド鎖は、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。
【0075】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインには、突起（「ノブ（ｋｎｏｂ）」）又は空洞（「ホール（ｈｏｌｅ）」）を含み、且つ第１ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記突起又は空洞は、それぞれ第３ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記空洞又は突起に置いてもよく、それによって、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖は、互いに「ノブ‐イン‐ホール（ｋｎｏｂ‐ｉｎ‐ｈｏｌｅ）」のように安定的に会合する。一実施形態において、前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、一方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、且つ前記第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖のうち、他方の鎖には、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号）を含む。それによって、一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことで、第１ポリペプチド鎖と第３ポリペプチド鎖が正確にペアリングをすることができる。
【0076】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインのそれぞれには、突起又は空洞を含み、且つＣＨ１ドメインの前記突起又は空洞をそれぞれＣＬドメインの前記空洞又は突起に置くことができるため、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ‐イン‐ホール」のように安定的に会合する。
【0077】
一実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列の何れかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む。
【0078】
別の実施形態において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号２２に示される第３ポリペプチド鎖、又は前記配列の何れかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一）である配列を含む。
【0079】
本明細書において、「配列同一性」は、比較ウィンドウでヌクレオチド又はアミノ酸を１つずつ比較してその配列が同じであることの割合を指す。以下の方式によって「配列同一性パーセント」を計算することができ、２本の最適に照合する配列を比較ウィンドウで比較して、マーチング位置の数を得るように２本の配列における同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓとＭｅｔ）の存在する位置の数を確定して、マーチング位置の数を比較ウィンドウにおける総位置数（即ち、ウィンドウの大きさ）で割り、その結果を１００に乗じて、配列同一性パーセントを生成する。配列同一性パーセントを確定するための最適な照合は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ‐２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公開されているパソコンソフトウェアを使用するように本分野に既知の様々な方式に従って実現することができる。当業者は、比較している全長配列範囲内又は目標配列領域内の最大の照合に必要とする如何なるアルゴリズムを含む配列を照合するための適切なパラメータを確定することができる。
【0080】
本発明の抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＰＤ‐Ｌ１及びＣＤ４７タンパク質と同時に結合でき、且つ各親抗体の親和力定数を維持することから、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及びＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路を遮断できるため、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及び／又はＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する様々な疾患又は病的状態を治療、予防又は緩和するために利用される。
【0081】
好ましい一実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１２３８８６のＰＣＴ特許出願（出願日：２０１８年１２月２６日）により開示された組換え抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質であり、配列番号１に示される第１ポリペプチド鎖、配列番号８に示される第２ポリペプチド鎖、及び配列番号１４に示される第３ポリペプチド鎖を有する。一実施形態において、当該抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞の組換え発現により産生されて、更に精製される。好ましくは、本発明の液体製剤における前記抗体は明らかな抗腫瘍活性を示している。Ｒａｊｉ‐ＰＤ‐Ｌ１細胞をＮＯＤ‐ＳＣＩＤマウスに接種することで作成された担腫瘍マウスに抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を投与した結果によれば、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及び抗ＰＤ‐Ｌ１モノクローナル抗体を投与した場合と比較すれば、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を投与した場合は、明らかに向上された抗腫瘍活性を有し、腫瘍成長阻害率が約９０％又はそれ以上、例えば１００％であり、及び／又は腫瘍消去比率が５０％以上である。また、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体は明らかに低減した血細胞凝集作用を示したため、臨床治療において明らかに低減した副作用を有する。
【0082】
本発明の抗体製剤に含まれる抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の量は、製剤の特定目的特性、特定環境、及び使用製剤の特定目的によって変更する。幾つかの実施形態において、抗体製剤は液体製剤であり、約５‐１５０ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含んでもよい。
【0083】
（ii）緩衝剤緩衝剤は溶液のｐＨ値を許容される範囲に維持することができる試薬である。幾つかの実施形態において、本発明の製剤に使用される緩衝剤は、本発明の製剤のｐＨ値を約６．４‐７．０のｐＨ値範囲、例えば、約６．５のｐＨ値に制御することができる。幾つかの具体的な実施形態において、本発明の抗体製剤は、約６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０のｐＨ値である。
【0084】
幾つかの実施形態において、本発明の製剤に使用される緩衝剤は、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン及びこれらの組合せから選ばれる。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約１‐３０ｍMである。一実施形態において、本発明の液体抗体製剤における緩衝剤の濃度は、約５‐２５ｍＭであり、例えば、約５、１０、１５、２０、２５ｍＭである。
【0085】
一実施形態において、本発明の製剤に使用される緩衝剤は、約１６．３ｍＭのヒスチジンと約３．７７ｍＭの塩酸ヒスチジンとの組合せである。
【0086】
（iii ）安定剤本発明に使用される適切な安定剤は糖、ポリオール、アミノ酸及びこれらの組合せから選ばれてもよい。安定剤とする糖はスクロース及びトレハロースを含むが、これらに限定されない。安定剤とするポリオールはソルビトールを含むが、これらに限定されない。安定剤とするアミノ酸はアルギニン、塩酸アルギニンを含むが、これらに制限されない。幾つかの実施形態において、前記安定剤は本発明の液体製剤において約５０‐５００ｍＭ、より好ましくは約１００‐４００ｍＭ、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｍＭの濃度で存在する。
【0087】
一実施形態において、本発明の液体製剤は安定剤としてスクロースを含む。本発明の液体製剤におけるスクロースの量は約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ）であってもよい。
【0088】
一実施形態において、本発明の液体製剤は安定剤としてアルギニン及び／又は塩酸アルギニンを含む。本発明の液体製剤におけるアルギニン及び／又は塩酸アルギニンの量は約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ）であってもよい。
【0089】
一実施形態において、本発明の液体製剤は安定剤としてスクロース、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンの組合せを含む。当該組合せにおいて、スクロースは約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ）の量で存在してもよい。当該組合せにおいて、アルギニン及び／又は塩酸アルギニンは約５０‐２５０ｍＭ、好ましくは約１００‐２００ｍＭ（例えば、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ｍＭ）の量で存在してもよい。
【0090】
（iv）界面活性剤本明細書で使用される用語「界面活性剤」は、両親媒性構造を有する有機物質を指し、即ち、これらが反対の溶解性傾向を持つ原子団からなり、一般的に油溶性の炭化水素鎖及び水溶性のイオン原子団である。
【0091】
一実施形態において、本発明の液体製剤における界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、例えば、アルキルポリ（オキシレン）である。本発明の製剤における特定の非イオン性界面活性剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０などのポリソルベート、及びプルロニックなどを含む。好ましい一実施形態において、本発明の液体製剤は界面活性剤としてポリソルベート８０を含む。
【0092】
本発明の抗体製剤に含まれる界面活性剤の量は製剤の特定目的特性、特定環境、及び使用製剤の特定目的によって変更する。幾つかの好ましい実施形態において、製剤は、約０．１‐１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．２‐０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８ｍｇ／ｍＬのポリソルベート界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）を含んでもよい。
【0093】
（ｖ）その他の賦形剤本発明の抗体液体製剤はその他の賦形剤を含む又は含まないのどちらでもよい。
【0094】
一実施形態において、本発明の抗体液体製剤は賦形剤として金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はその塩）を含む。別の実施形態において、本発明の抗体液体製剤は金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はその塩）を含まない。一実施形態において、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はその塩）を添加していない製剤と比較すれば、金属キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ又はその塩）を添加した本発明の抗体液体製剤はより高い安定性を有する。
【0095】
その他の目的のために、本発明の製剤にその他の賦形剤を使用してもよい。前記賦形剤は、例えば、調味剤、抗微生物剤、甘味剤、静電気防止剤、酸化防止剤、ゼラチンなどを含む。これらの賦形剤、その他の既知の薬物賦形剤、及び／又は本発明の製剤に適用される添加剤は本分野で周知されるものであり、例えば、「Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ （２００３）」、及び「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （２００５）」に挙げられたものである。
【0096】
II．製剤の調製本発明は抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む安定的な製剤を提供する。本発明の製剤に使用される抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、本分野における既知の抗体生産用技術により調製してもよい。例えば、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を組換えにより調製してもよい。好ましい一実施形態において、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞において組換え発現されることにより調製され、例えば、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１２３８８６に記載されるように、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を組換えにより調製する。
【0097】
現在、抗体は薬物の活性成分として幅広く適用されている。治療性抗体を薬用レベルまで精製するための技術は本分野で周知されるものである。例えば、Ｔｕｇｃｕ ｅｔ ａｌ．，（Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｔｅｐｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９９ （２００８） ５９９‐６１３．）により、タンパク質Ａ捕獲工程後にイオン交換クロマトグラフィー（アニオンＩＥＸ及び／又はカチオンＣＥＸクロマトグラフィー）を利用する抗体３カラム精製法が記載されている。Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（Ｗｅａｋ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０１ （２００８） ５５３‐５６６）により、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの後に弱分配性アニオンで樹脂を交換する２カラム精製法が記載されている。
【0098】
一般的に、抗体製剤調製用として十分な繰返し性及び適切な純度を有する薬物物質を提供するために、組換えにより産生される抗体は通常の精製法により精製されてもよい。例えば、抗体が組換え発現細胞から培地に分泌された後に、例えばＡｍｉｃｏｎの限外濾過装置などのタンパク質濃縮濾過機の市販品により、当該発現系に由来する上清を濃縮させる。その後、例えば、クロマトグラフィー、透析、アフィニティー精製などの方法により抗体を精製してもよい。タンパク質ＡはアフィニティーリガンドとしてＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４型抗体の精製に適される。例えば、イオン交換クロマトグラフィーなどのその他の抗体精製法を使用してもよい。十分な純度の抗体を得た後に、本分野における既知の方法により抗体が含まれる製剤を調製してもよい。
【0099】
例えば、（１）発酵完了後に発酵液を清澄となるまで遠心分離し、細胞などの異物を除去して、上清を得る工程と、（２）アフィニティークロマトグラフィー（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４型抗体に対して特異的な親和力を有するタンパク質Ａカラム）により抗体を捕獲する工程と、（３）ウィルス不活性化を行う工程と、（４）（一般的にＣＥＸカチオン交換クロマトグラフィーにより）精製して、タンパク質から異物を除去する工程と、（５）ウィルスを濾過する（ウイルス力価を例えば４ｌｏｇ１０以上低下させる）工程と、（６）（タンパク質をその安定性に繋がる製剤緩衝液に置換して注射用として適切な濃度に濃縮させるために）限外濾過／浸透濾過する工程と、により調製してもよい。例えば、Ｂ． Ｍｉｎｏｗ，Ｐ． Ｒｏｇｇｅ，Ｋ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌ． １０，Ｎｏ． ６，２０１２，ｐｐ． ４８‐５７を参照する。
【0100】
III ．製剤の解析方法抗体製剤の保存段階において、抗体の凝集、分解又は化学修飾が発生することにより、抗体不均一性（サイズ不均一性及び電荷不均一性を含む）、凝集物及び断片などが発生するため、抗体製剤の品質に影響を与える。従って、抗体製剤の安定性を監視する必要がある。
【0101】
本分野では、抗体製剤の安定性を測定するための方法として複数あることが知られている。例えば、還元型ＣＥ‐ＳＤＳ、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ及びＳＥＣ‐ＨＰＬＣなどの方法により、抗体製剤の純度解析及び抗体の凝集レベル評価を行うことができると共に、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）などにより、抗体製剤における電荷変異体を解析することができる。また、目視検査により製剤の外観を確認することで、製剤の安定性を迅速に判断することができる。ＯＤ350nm法により製剤の濁度変化を測定することもできるが、当該方法は可溶性及び不溶性凝集物の量に関する情報を示すことができる。また、紫外線分光光度法（ＵＶ法）により製剤におけるタンパク質の含有量変化を測定することができる。
【0102】
非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法はキャピラリーを分離通路とするモノクローナル抗体純度の測定法である。ＣＥ‐ＳＤＳにおいて、タンパク質の移行がＳＤＳ結合による表面電荷により駆動されるが、当該表面電荷とタンパク質の分子量とが正比例をなす。全てのＳＤＳ‐タンパク質複合物が似たような質量電荷比を有するため、キャピラリーのモレキュラーシーブゲルマトリックスにおいて、分子大きさ又は流体動力学半径に基づいて電気泳動分離が実現される。当該方法は変性された完全抗体の純度の監視に幅広く適用されている。一般的に、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法において、供試品とＳＤＳ試料緩衝液及びヨードアセトアミドとを混合させる。その後、混合物を６８‐７２℃で約１０‐１５分間インキュベートして室温まで冷却した後に、遠心分離して得られた上清を解析する。紫外線検出器によりタンパク質の移行を測定して、電気泳動図を得た。抗体製剤の純度は、全てのピーク面積の合計に占めるＩｇＧメインピークのピーク面積のパーセンテージで算出できる。ＣＥ‐ＳＤＳ法に関する具体的な記載は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＥ ＳＤＳ ｇｅｌ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ‐ｂａｓｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００８， ２９， ３６１２‐３６２０を参照できる。
【0103】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー、即ち、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法は、モノクローナル抗体基準及び品質制御に使用される別の重要方法である。当該方法は主に分子大きさ又は流体動力学半径差異に基づいて分子を分離する。抗体は、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣにより、高分子量形態（ＨＭＭＳ）、メインピーク（主に抗体単量体）、及び低分子量形態（ＬＭＭＳ）の３種の主要形態に分離されることができる。抗体の純度は、クロマトグラフィーにおける全てのピーク面積の合計に占めるメインピーク面積のパーセンテージで算出できる。ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法により、製剤製品における抗体単量体のパーセンテージを測定して、可溶性凝集物及びせん断物の含有量情報を示している。ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法に関する具体的な記載は、例えば、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉｅｎ．， ８３：１６４５‐１６５０，（１９９４）；Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， １１：４８５（１９９４）；Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏ． Ａｎａｌ．， １５：１９２８（１９９７）；Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏ． Ａｎａｌ．， １４：１１３３‐１１４０（１９８６）を参照できる。また、例えば、Ｒ． Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｕｌｔｒａ‐ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＳＥ‐ＵＨＰＬＣ），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（２０１５），ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｐｂａ．２０１５．０２．０３２、及びＡｌｅｘａｎｄｒｅ Ｇｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉ‐Ｎｏｎ‐ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２０１７．０５．０１０も参照できる。
【0104】
画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）はモノクローナル抗体の電荷不均一性の解析に使用されることができる。当該方法は電荷変異体の定量的な分布状況を提供できる。ｉＣＩＥＦはｐＨ値勾配における分子の電荷差異（観察されたｐＩ値）に基づいて分子分離の目的が実現される。ｉＣＩＥＦにおいて、通常、分離カラムが短いキャピラリー（例えば、長さ５ｃｍ、内径１００μｍのシリカキャピラリー）であり、タンパク質が高電圧でキャピラリーカラムでフォーカシングするが、２８０ｎＭで操作される全カラムイメージング検出システムによりフォーカシングをオンラインでリアルタイム監視する。当該技術の利点として、当該全カラムイメージング検出システムにより抗体試料の各電荷変異体を同時に記録することができる。一般的に、ｉＣＩＥＦにおいて、試料と尿素及びｉＣＩＥＦ緩衝液とを混合させるが、前記緩衝液にメチルセルロース、ｐＩ分子量基準及びａｍｐｈｏｌｙｔｅｓが含まれる。次に、ｉＣＩＥＦアナライザー、例えばｉＣＥ２８０アナライザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａ）において、ｉＣＩＥＦカラム、例えばＰｒｏｔｉｏｎＳｉｍｐｌｅによって組立てられたｉＣＩＥＦカラムにより、試料フォーカシングの一定時間後に、２８０ｎｍの吸光度を測定して、ｍＡｂ電荷変異体にフォーカシングするクロマトグラフィーを得た。ｉＣＥＩＦクロマトグラフィーにおいて、メインピーク（即ち、主成分）の前で溶出されたタンパク質関連ピークは酸性成分に分類されるに対して、メインピークの後で溶出されたタンパク質関連ピークは塩基性成分に分類される。主成分、酸性成分及び塩基性成分の相対的な量はピーク総面積に占めるパーセンテージで示す。ｉＣＩＥＦに関する具体的な記載は、例えば、Ｓａｌａｓ‐Ｓｏｌａｎｏ Ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ ｏｆ ｉＣＩＥＦ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａｎ ｉｎｔｅｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ， Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ． ２０１２ Ｎｏｖ；３５（２２）：３１２４‐９． ｄｏｉ： １０．１００２／ｊｓｓｃ．２０１２００６３３． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ １５、及びＤａｄａ ＯＯ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ＩｇＧ１ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｎｏｎ‐ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＩＥＦ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． ２０１５ Ｎｏｖ；３６（２１‐２２）：２６９５‐２７０２． ｄｏｉ： １０．１００２／ｅｌｐｓ．２０１５００２１９． Ｅｐｕｂ ２０１５ Ｓｅｐ １８を参照できる。
【0105】
カチオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ）により抗体製剤における抗体の電荷変異体を測定することができる。当該測定法において、ＣＥＸ‐ＨＰＬＣカラムによりメインピークの保持時間よりも早く溶出されたピークは「酸性ピーク」と標識され、ＣＥＸ‐ＨＰＬＣカラムによりメインピークの保持時間よりも遅く溶出されたピークは「塩基性ピーク」と標識される。
【0106】
加速安定性の研究は、製品の安定性性質を測定するために利用され、安定的な医薬製剤形態の選別に繋がる。例えば、製剤試料を上昇された温度、例えば、約４０℃±２℃、２５℃±２℃の条件に置いて、加速安定性の研究を行うことができる。測定指標は、外観、視認できる異物、タンパク質含有量、濁度、純度（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法）及び電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法、ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法）を含む。
【0107】
また、抗体の効能又は生物学的活性を測定してもよい。例えば、製剤における抗体とその抗原分子（ＣＤ４７分子及びＰＤ‐Ｌ１分子）との結合能力を測定してもよい。当業者は、例えば、免疫測定試験、ＥＬＩＳＡなど、抗体と抗原との特異的結合を定量的にする複数の方法を知っている。
【0108】
本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤は安定的である。一実施形態において、約２５℃、３７℃、４０℃、又は４５℃で少なくとも１ヶ月又は２ヶ月保存した後に、例えば、４０℃±２℃で１ヶ月保存した後に、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又は非還元型ＣＳ‐ＳＤＳにより測定した結果、本発明の抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質純度は、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上である。一実施形態において、約２５℃、３７℃、４０℃、又は４５℃で少なくとも１ヶ月又は２ヶ月保存した後に、例えば、４０℃±２℃で１ヶ月保存した後に、例えば、ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法により測定した結果、本発明の抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％は、非塩基性及び非酸性形態（即ち、メインピーク又は主な電荷形態）である。
【0109】
IV．製剤の用途抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の抗体製剤は、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路及び／又はＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する様々な疾患又は病的状態を治療、予防又は緩和するために使用される。本明細書において、「ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路に関連する疾患又は病的状態」及び／又は「ＰＤ１／ＰＤ‐Ｌ１シグナル伝達経路に関連する疾患又は病的状態」は、本発明の抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質製剤により治療（例えば、改善）又は予防することができる疾患又は病的状態を指す。本発明の抗体製剤による治療から利益を得た任意の疾患又は病的状態は本発明に適する。
【0110】
一態様において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の製剤は、対象の様々な血液疾患及び固形腫瘍を予防又は治療することができるが、様々な血液疾患及び固形腫瘍が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、乳がん、胃がん、肺がん、食道がん、腸がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎臓がん、膵臓がん、膀胱がん、神経膠腫、黒色腫及びその他の固形腫瘍を含むが、これらに制限されない。また、ＳＩＲＰα／ＣＤ４７シグナル伝達経路を遮断することによりＮＯＤマウス系におけるヒト幹細胞移植（ＷＯ ２００９／０４６５４１）を促進することができるため、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の製剤は、ヒト幹細胞移植に利用できるという潜在的な利点もある。
【0111】
別の態様において、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を含む本発明の製剤は、ＳＩＲＰα＋細胞により介在された対象の自己免疫疾患及び炎症性疾患、例えば、アレルギー性喘息又は潰瘍性結腸炎を治療、予防又は診断するために使用されることができる。これらの病的状態には、急性及び慢性炎症性疾患、アレルギー反応及びアレルギー性疾患、自己免疫疾患、局所虚血性疾患、重度の感染症、非ヒト組織移植物（異種移植片）の拒絶などを含む細胞又は組織又は器官移植物の拒絶を含む。
【0112】
本発明は、薬物を調製するための、本発明の製剤の使用を提供する。前記薬物は、哺乳類に抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を送達するために使用され、或いは上記疾患及び病的状態の１種以上を治療、予防又は改善するために使用される。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【0113】
本発明の抗体製剤を複数の経路で対象又は患者に投与してもよい。例えば、投与は輸注又は注射器により行ってもよい。従って、一態様において、本発明は、本発明の抗体製剤（例えば、薬剤充填済み注射器）を含む送達装置（例えば、注射器）を提供する。患者は、主な活性成分として抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質を、有効量、即ち疾患又は病的状態を治療、改善又は予防するのに十分な量で受ける。
【0114】
治療効果は生理的な症状の軽減を含む。任意の特定対象に使用される抗体の最適な有効量及び濃度は、患者の年齢、体重、健康状態及び／又は性別、疾患の性質及び程度、特定抗体の活性、抗体に対する体のクリアランス、並びに、前記抗体製剤と組合せて投与するその他の任意の治療などの、複数の要素によって決定される。具体的な状況について、投与される有効量は、臨床医の判断範囲内で決定される。有効投与量は、治療対象の適応症によるが、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ体重～約２０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。この点に関して、既知の抗体に基づく薬物の適用はある程度で参考できる。投与量は単一投与量案又は複数投与量案であってもよい。
【0115】
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【0116】
略語ＣＥ‐ＳＤＳ：ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ：カチオン交換高速液体クロマトグラフィーＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法ＦＬＤ‐ＨＰＬＣ：蛍光検出‐高速液体クロマトグラフィーｉＣＩＥＦ：画像キャピラリー等電点電気泳動ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
【実施例】
【0117】
本願の発明者は、組換え抗表面抗原分類４７（ＣＤ４７）及び抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ‐Ｌ１）二重特異性抗体の注射液を長期的且つ安定的に保存する製剤処方を開発して、有効期間内（少なくとも２４ヶ月）で製品品質を制御可能にするために、処方の選別試験を設置して、異なる添加物の、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤の安定性に対する影響を考察した。試験に使用される材料及び方法は下記の通りである。
【0118】
材料及び方法１．１． 本発明の製剤研究に使用される材料
注記：Ｎ／Ａは「該当なし」（Ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）を示す。
【表1-2】
【0119】
１．２． 本発明の製剤研究に使用される機器
１．３．製剤安定性の測定項及び測定法抗体製剤に対して、（１）外観及び視認できる異物の有無を測定し、（２）紫外線法（ＵＶ法）により製剤におけるタンパク質含有量を測定し、（３）サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ‐ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ‐ＨＰＬＣ；ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピーク面積の合計に占める単量体面積のパーセンテージで示し、（４）還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（還元型ＣＥ‐ＳＤＳ）及び／又は非還元型ラウリル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動（非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ）により抗体製剤の純度を測定し、全てのピーク面積の合計に占める単量体面積のパーセンテージで示し、（５）画像キャピラリー等電点電気泳動法（ｉＣＩＥＦ法）により抗体製剤における電荷変異体を測定し、主成分、酸性成分及び塩基性成分のパーセンテージで示し、（６）免疫測定法、例えば、直接ＥＬＩＳＡ法により、ＣＤ４７抗原及びＰＤ‐Ｌ１抗原に対する抗体製剤における抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の相対結合活性を測定する。
【表1-3】
【0120】
視認できる異物の測定国家薬典委員会、中華人民共和国薬典（２０１５年版、四部通則０９０４「視認できる異物の測定法」）、北京中国医薬科技出版社、２０１５に記載されている方法に基づき、透明度測定器（天津天大天発製、型番ＹＢ‐２）により試料における視認できる異物を測定した。
【0121】
タンパク質含有量の測定紫外線分光光度計（日本島津製、型番ＵＶ‐１８００）により試料におけるタンパク質含有量を測定した。
【0122】
純度（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法）体積排除カラムにより分離するが、流動相がリン酸塩緩衝液（３．１２ｇリン酸二水素ナトリウム二水和物、８．７７ｇ塩化ナトリウム、３４．８４ｇアルギニンを秤量して、超純水で溶解させてから、塩酸でｐＨ値が６．８になるまで調節し、１０００ｍＬまで定容する）であり、カラム保護液が０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3であり、試料注入量が５０μｌであり、流速が０．５ｍＬ／分間であり、サンプリング時間が３０分間であり、カラム温度が２５℃であり、測定波長が２８０ｎｍである。被検試料を取り、超純水で２ｍｇ／ｍＬまで希釈させて、供試品溶液とする。製剤緩衝液を取り、上記同様の処理法で希釈させて、ブランク溶液とする。ブランク溶液、供試品溶液をそれぞれ５０μｌ取り、液体クロマトグラフ装置に注入して、測定を開始する。
【0123】
純度（還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法）キャピラリーゲル電気泳動法により測定した。キャピラリーはコーティング無しキャピラリーであり、内径５０μｍ、全長３０．２ｃｍ、有効長さ２０．２ｃｍである。電気泳動を実施する前に、それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。被検試料を適量の超純水で２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈させ、上記希釈された試料を５０μｌ取り１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、当該遠心分離管にそれぞれ４５μｌのｐＨ値６．５試料緩衝液（クエン酸一水和物０．３２ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．４５ｇを秤量して、４５ｍＬ超純水に溶解させてから、５０ｍＬまで定容して、クエン酸‐リン酸塩緩衝液を得て、当該緩衝液２００μｌを精確に秤量して、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム溶液８０μｌを入れ、１ｍＬまで水を入れ、均一に混合させて得る）、１μｌ内部標準液（１０ｋＤａタンパク質、５ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、製品番号：３９０９５３）、５μｌのβ‐メルカプトエタノールを入れて、十分均一に混合させた後に、７０±２℃で１０±２分間加熱し、室温まで冷却し、試料瓶に移して、供試品溶液とする。供試品と同じ体積の製剤緩衝液を取り、上記同様の操作方法でブランク溶液を得た。試料注入条件：-５ｋＶ ２０秒；分離電圧：-１５ｋＶ ３５分間。キャピラリーカラム温度を２５℃に制御し、測定波長が２２０ｎｍである。
【0124】
純度（非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法）キャピラリーゲル電気泳動法により測定した。キャピラリーはコーティング無しキャピラリーであり、内径５０μｍ、全長３０．２ｃｍ、有効長さ２０．２ｃｍである。電気泳動を実施する前に、それぞれ０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸、超純水、電気泳動ゲルにより７０ｐｓｉでキャピラリーカラムを洗浄した。被検試料を適量の超純水で２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈させ、上記希釈された試料を５０μｌ取り１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、当該遠心分離管にそれぞれ４５μｌのｐＨ値６．５試料緩衝液（クエン酸一水和物０．３２ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．４５ｇを秤量して、４５ｍＬ超純水に溶解させてから、５０ｍＬまで定容して、クエン酸‐リン酸塩緩衝液を得て、当該緩衝液２００μｌを精確に秤量して、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム溶液８０μｌを入れ、１ｍＬまで水を入れ、均一に混合させて得る）、１μｌ内部標準液（１０ｋＤａタンパク質、５ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、製品番号：３９０９５３）、５μｌの２５０ｍｍｏｌ／ＬＮＥＭ溶液（Ｎ‐エチルマレイミド６２ｍｇを秤量して、２ｍＬ超純水に溶解させる）を入れて、十分均一に混合させた後に、７０±２℃で１０±２分間加熱し、室温まで冷却し、試料瓶に移して、供試品溶液とする。供試品と同じ体積の製剤緩衝液を取り、上記同様の操作方法でブランク溶液を得た。試料注入条件：-５ｋＶ ２０秒；分離電圧：１５ｋＶ ３５分間。キャピラリーカラム温度を２５℃に制御し、測定波長が２２０ｎｍである。
【0125】
電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）画像キャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ法）により測定した。キャピラリー内径１００μｍ、全長５ｃｍである。試料に対して電気泳動を実施する前に、それぞれ０．５％メチルセルロース溶液（後述ではＭＣ溶液とも略す）、超純水でキャピラリーカラムを洗浄した。真空注入法により試料を５５秒注入するが、プレフォーカシング電圧及び時間が１．５ｋＶ及び１分間であり、フォーカシング電圧及び時間が３ｋＶ及び８分間であり、試料注入時間が５５秒であり、試料盤の温度が１０℃であり、キャピラリーカラム温度が室温であり、測定波長が２８０ｎｍである。陰極安定剤（Ｃａｔｈｏｄｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）が５００ｍｍｏｌ／Ｌアルギニン溶液であり、陽極安定剤（Ａｎｏｄｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）が２００ｍｍｏｌ／Ｌイミノ二酢酸であり、３ｍｏｌ／Ｌ尿素でタンパク質溶解性を向上させ、０．５％ＭＣ溶液でタンパク質とキャピラリーとの粘着を低下させる。供試品を水で０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈させ、上記希釈された供試品溶液を２０μｌ取り、その中に８３μｌ予混合液を入れて、十分均一に混合させて、被検試料溶液を得た。製剤緩衝液同様の操作方法でブランク溶液を得た。
【0126】
相対結合活性（直接ＥＬＩＳＡ法）１×ＰＢＳでストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ、製品番号：２１１２５）を１μｇ／ｍＬまで希釈させ、１００μｌ／ウェル、３７℃、２ｈで９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。プレートを洗浄した後に、密閉液（５％ ＦＢＳ、３００μｌ／ウェル）を３７℃で２ｈ密閉した。１×ＰＢＳでビオチン化した抗原（ＣＤ４７に対する抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の抗ＣＤ４７末端の相対結合活性を測定する場合、北京Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入したヒトＣＤ４７タンパク質（Ｈｉｓラベル）、製品番号：１２２８３‐Ｈ０８Ｈ‐２００を使用するが、ＰＤ‐Ｌ１に対する抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の抗ＰＤ‐Ｌ１末端の相対結合活性を測定する場合、ＡＣＲＯ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳから購入した組換えヒトＰＤＬ１／ＣＤ２７４タンパク質、製品番号：ＰＤ１‐Ｈ５２２９‐１ＭＧを使用する）を０．５μｇ／ｍＬまで希釈させ、１００μｌ／ウェル、３７℃、０．５ｈで９６ウェルマイクロプレートにコーティングした。２％ ＦＢＳで抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を１００μｌ／ウェルで４０μｇ／ｍＬまで希釈させ、４倍の濃度勾配で１２番目の濃度（０．０１～１００００ｎｇ／ｍＬ）まで希釈させる。勾配希釈された供試品を洗浄されたマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで入れて、３７℃の恒温インキュベーターで３０ｍｉｎインキュベートした。プレートを洗浄した後に、２％ ＦＢＳで希釈されたＨＲＰ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ‐Ｆｃ断片（アメリカ ＢＥＴＨＹＬ、製品番号Ａ８０‐１０４Ｐ）を二次抗体（３００００倍希釈、１００μｌ／ウェル）として入れ、３７℃で２０ｍｉｎ反応させた。プレートを洗浄した後に、１００μｌのＴＭＢ顕色液を入れ、１０ｍｉｎ発色させてから、１ウェル当たり１００μｌの１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ2ＳＯ4を入れて反応を終了させた。６２０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。各濃度勾配試料の濃度値を横軸とし、各濃度勾配試料のＯＤ４５０ｎｍ‐ＯＤ６２０ｎｍ値を縦軸として、Ｐｒｉｓｍの４つのパラメータからＥＣ50反応抗体と各抗原との結合活性をフィッティングにより算出した。
【0127】
実施例１． 抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体の調製及び精製ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１２３８８６に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社により購入）において抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣを組換え発現及び精製した。当該抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣの抗体は３本のポリペプチド鎖からなり、各ポリペプチド鎖がそれぞれＮ末端からＣ末端まで下記のアミノ酸配列を有する。
【0128】
ペプチド鎖＃１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＥＨＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＴＧＳＡＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１）前記ペプチド鎖＃１は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ２９３４１に由来するＶＨアミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＥＨＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＴＧＳＡＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２）と、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端における、ヒトＩｇＧ１に由来するＣＨ１アミノ酸配列：ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号６）と、前記ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端における、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ領域アミノ酸配列：ＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号７）と、を含む。
【0129】
ペプチド鎖＃２：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＶＳＦＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８）前記ペプチド鎖＃２は、抗ＣＤ４７抗体ＡＤＩ２９３４１に由来するＶＬアミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＲＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＶＳＦＰＩＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）と、前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端における、ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）のアミノ酸配列：ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１３）と、含む。
【0130】
ペプチド鎖＃３ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１４）前記ペプチド鎖＃３は、第１及び第２抗ＰＤ‐Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＡＹＴＩＳＲＮＳＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＧＶＡＡＩＥＳＤＧＳＴＳＹＳＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＰＫＶＧＬＧＰＲＴＡＬＧＨＬＡＦＭＴＬＰＡＬＮＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１６）と、前記第１及び第２抗ＰＤ‐Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列の間における接続ペプチドのアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０）と、前記第２抗ＰＤ‐Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列のＣ末端における、ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ領域アミノ酸配列：ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）と、を含む。
【0131】
実施例２． 製剤の安定性に対するｐＨ値影響試験その１本実施例は、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む製剤の、ｐＨ値５．０～６．５における安定性を考察した。４つのｐＨ値を設置した。それぞれ５．０、５．５、６．０及び６．５である。
【0132】
２．１ 実験工程１０ｍＭヒスチジン、５％（ｗ／ｖ）ソルビトール緩衝液を調製し、希塩酸でｐＨ値がそれぞれ５．０、５．５、６．０及び６．５となるように調節して、精製された抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣタンパク質（７．３ｍｇ／ｍＬ）を前記異なるｐＨ値の溶液に限外濾過置換した。置換完了後、試料における二重特異性抗体タンパク質含有量を約１００．０ｍｇ／ｍＬに調節してから、最終濃度が０．７０ｍｇ／ｍＬとなるようにポリソルベート８０を入れ、濾過した後に２Ｒバイアル瓶に分注して、プラグで蓋をした。各試料の安定性を４０℃±２℃の条件で考察した。具体的な実験案は表１に示す。
【0133】
【表1-4】
【0134】
２．２ 判定基準試料変化の有無を判断するために、製品に対する理解並びに機器と方法の精密度に応じて、試料測定指標値と初期値との比較による品質変化無しの判定基準が設定されるが、具体的に表２を参照する。
【0135】
【表2】
【0136】
２．３ 処方選別試験その１の実験結果（１）外観及び視認できる異物４０℃±２℃の条件で１ヶ月放置した後に、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０試料の外観は異なる程度で混濁及び沈殿物が現れ、ｐＨ６．５試料の外観及び視認できる異物だけは合格した。
【0137】
（２）タンパク質含有量ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、各試料のタンパク質含有量の測定結果は表３に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月放置した後に、ｐＨ６．５試料のタンパク質含有量は明らかな変化がない。
【0138】
【表3】
【0139】
（３）純度ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法により各試料のタンパク質純度を測定した。結果は表４に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後のｐＨ値６．５試料におけるタンパク質純度は、０日間の試料と比較すれば、４．１％低下した。
【0140】
【表4】
【0141】
ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法及び還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により各試料のタンパク質純度をそれぞれ測定した。結果は表５及び表６に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後のｐＨ値６．５試料におけるタンパク質純度は、０日間の試料と比較すれば、それぞれ７．７％及び３．７％低下した。
【0142】
【表5】
注記：Ｎ／Ａは試料外観不合格であるため測定していないことを示す。
【0143】
【表6】
【0144】
（４）電荷変異体ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ｉＣＩＥＦ法により各試料の電荷変異体を測定した。結果は表７に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後に、ｐＨ６．５試料の主成分及び酸性成分は明らかな変化がある。０日間の試料と比較すれば、酸性成分は３６．６％から６０．１％まで２３．５％増加し、主成分は６２．５％から３９．１％まで２３．４％減少し、塩基性成分は明らかな変化がない。
【0145】
【表7】
【0146】
（５）相対結合活性ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、直接ＥＬＩＳＡ法により各試料の相対結合活性を測定した。結果は表８に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後に、ＣＤ４７及びＰＤ‐Ｌ１に対する、ｐＨ６．５試料におけるタンパク質の抗ＣＤ４７末端及び抗ＰＤ‐Ｌ１末端の相対結合活性は変化がない。
【0147】
【表8】
【0148】
上記実験結果によれば、ｐＨ５．０、５．５、６．０、６．５製剤について、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質（例えば、Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣタンパク質）はｐＨ６．５において安定的である。ｐＨ６．５付近のｐＨ範囲内における製剤の安定性を研究するために、実験を更に実施した。
【0149】
実施例３． 製剤の安定性に対するｐＨ値影響試験その２本実施例は、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体製剤におけるタンパク質安定性に対するｐＨ６．２～７．０の影響を考察した。５つのｐＨ値を設置した。それぞれ６．２、６．４、６．５、６．８及び７．０である。
【0150】
３．１ 実験工程ｐＨ値の違い以外に、具体的な操作工程は実施例２の「２．１ 実験工程」と同様である。
【0151】
３．２ 判定基準実施例２の表２を参照する。
【0152】
３．３ 実験結果（１）外観及び視認できる異物４０℃±２℃の条件で１ヶ月放置した後に、ｐＨ６．２試料の外観だけは乳白色を呈し、ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料の外観及び視認できる異物は合格した。
【0153】
（２）タンパク質含有量ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、各試料のタンパク質含有量の測定結果は表９に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月放置した後に、ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料のタンパク質含有量は明らかな変化がない。
【0154】
【表9】
【0155】
（３）純度ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法により各試料のタンパク質純度を測定した。結果は表１０に示し、純度のトレンドは図２に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後のｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料の純度は低下したが、０日間と比較すれば、それぞれ３．０％、３．７％、４．９％及び５．６％低下した。
【0156】
【表10】
【0157】
ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法により各試料のタンパク質純度をそれぞれ測定した。結果は表１１に示し、純度のトレンドは図３に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後のｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料の純度は低下したが、０日間と比較すれば、それぞれ７．０％、６．１％、６．７％及び７．３％低下した。
【0158】
【表11】
【0159】
（４）電荷変異体ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、ｉＣＩＥＦ法により各試料の電荷変異体を測定した。結果は表１２に示し、純度のトレンドは図４に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後に、異なるｐＨ値試料の主成分及び酸性成分は変化がある。ｐＨ値が高いほど、主成分の低下が早く、酸性成分の上昇が早い。
【0160】
【表12】
【0161】
（５）相対結合活性ｐＨ６．４、６．５、６．８、７．０試料を４０℃±２℃で異なる期間放置した後に、直接ＥＬＩＳＡ法により各試料の相対結合活性を測定した。結果は表１３に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で１ヶ月考察した後に、ＣＤ４７及びＰＤ‐Ｌ１に対する、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５及びｐＨ７．０試料におけるタンパク質の抗ＣＤ４７末端及び抗ＰＤ‐Ｌ１末端の相対結合活性は明らかな変化がない。
【0162】
【表13】
【0163】
実施例２及び実施例３の、製剤の安定性に対するｐＨ値影響試験の結果によれば、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体（例えば、Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣ）タンパク質をｐＨ５．０～６．２、４０℃±２℃で１ヶ月放置した後に、時間の経過と共に、試料の外観は混濁又は乳白色の沈殿物が現れるが、ｐＨ６．４‐７．０、４０℃±２℃で１ヶ月放置した後に、試料の外観及び視認できる異物は合格し、タンパク質含有量は明らかな変化がなく、ＣＤ４７及びＰＤ‐Ｌ１に対する相対結合活性も明らかな変化がない。従って、後述した実施例において、ｐＨ６．４‐７．０からｐＨ６．５を選定して後続の実験を実施した。
【0164】
実施例４．処方選別試験４．１ 安定剤選別試験抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体を含む製剤の安定性に対する、ソルビトール、スクロース、トレハロース、塩酸アルギニンなどの異なる安定剤の影響を考察した。
【0165】
４．１．１ 安定剤選別試験工程５つの処方が設計されたが、具体的な処方情報は表１４を参照する。表１４により各処方の緩衝液を調製し、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣタンパク質（３．６ｍｇ／ｍＬ）をそれぞれの処方溶液に限外濾過置換した。置換完了後、各処方のタンパク質含有量を約１００．０ｍｇ／ｍＬに調節してから、ポリソルベート８０の最終濃度が０．２０ｍｇ／ｍＬとなるようにポリソルベート８０を入れ、濾過した後にバイアル瓶に分注して、プラグで蓋をした。各試料の安定性を４０℃±２℃の条件で考察した。具体的な案は表１５に示す。測定指標は、外観、視認できる異物、タンパク質含有量、純度（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法）及び電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）である。
【0166】
【表14】
【0167】
【表15】
【0168】
４．１．２ 判定基準判定基準は実施例２の表２を具体的に参照する。
【0169】
４．１．３ 安定剤選別試験（１）外観、視認できる異物４０℃±２℃の条件で４週間観察したが、処方１は考察１週間後に混濁又は沈殿物が現れ、その他の処方の試料の外観、視認できる異物は合格した。
【0170】
（２）タンパク質含有量４０℃±２℃の条件で４週間観察したが、タンパク質含有量の結果は表１６に示す。表１６によれば、４０℃±２℃の条件で４週間放置した後に、処方２、処方３、処方４及び処方５のタンパク質含有量は変化がない。
【0171】
【表16】
【0172】
（３）純度純度（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法）：４０℃±２℃の条件で４週間観察した結果は表１７に示し、純度トレンドは図５に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で４週間考察した後に、処方２、処方３、処方４及び処方５試料の純度は低下したが、０日間試料の純度と比較すれば、それぞれ２．６％、３．０％、０．７％及び０．７％低下した。
【0173】
【表17】
【0174】
純度（非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法）：４０℃±２℃の条件で４週間観察した結果は表１８に示し、純度トレンドは図６に示す。結果によれば、４０℃±２℃の条件で４週間考察した後に、各処方試料の純度は低下したが、０日間試料の純度と比較すれば、処方２、処方３、処方４及び処方５はそれぞれ６．８％、７．２％、９．１％及び９．２％低下した。
【0175】
【表18】
【0176】
（４）電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）４０℃±２℃の条件で４週間観察した後の電荷変異体の結果は表１９に示し、電荷変異体の主成分のトレンドは図７に示す。
【0177】
結果によれば、４０℃±２℃の条件で４週間考察した後に、各処方の電荷変異体の主成分及び酸性成分は明らかな変化があり、主成分が低下し、酸性成分が上昇するが、そのトレンドがほぼ一致する。
【0178】
【表19】
【0179】
安定剤選別試験結果によれば、処方２、処方３、処方４及び処方５を４０℃±２℃の条件で４週間放置した後に、試料外観、視認できる異物は合格し、タンパク質含有量は変化がなく、試料純度は若干低下したが、処方４及び処方５は純度（ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法）及び電荷変異体（ｉＣＩＥＦ法）について明らかな優位性を示した。
【0180】
４．２ 浸透圧試験４．２．１ 浸透圧試験工程マルチチャンネル浸透圧計で処方４及び処方５の０時間（Ｔ０）試料の浸透圧を測定した。各群試料を２回測定して、平均値を結果とする。
【0181】
４．２．２ 浸透圧試験結果処方４及び処方５の０時間（Ｔ０）試料の浸透圧測定結果は表２０に示す。
【0182】
【表20】
【0183】
ヒト血漿の浸透圧が約２８５‐３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであるため、処方４及び処方５の浸透圧は医薬製剤の許容される範囲内の浸透圧である。また、処方４の浸透圧がヒト血漿の浸透圧に最も近いため、好ましくは処方４の製剤を使用する。
【0184】
実施例５：製剤の安定性に対する金属キレート剤の影響ＥＤＴＡは代表的な金属キレート剤である。本実施例は、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣタンパク質の安定性に対するＥＤＴＡの影響を検討した。
【0185】
５．１ 製剤の安定性に対するＥＤＴＡの考察案２つの処方が設計されたが、処方６はＥＤＴＡを添加していない対照群であり、処方７は最終濃度が０．０２ｍｇ／ｍＬであるＥＤＴＡの群である。具体的な処方情報は表２１に示す。表２１により各処方の緩衝液を調製し、抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体Ｋｈ２ＮＦ‐ＰＣタンパク質をそれぞれの処方溶液に限外濾過置換した。置換完了後、各処方のタンパク質含有量を約１００．０ｍｇ／ｍＬに調節した。
【0186】
【表21】
【0187】
【表22】
【0188】
５．２実験結果４０℃±２℃の条件で４週間観察した結果は表２３に示す。
【0189】
【表23】
【0190】
表２３の結果では、電荷変異体（ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法）の測定結果によれば、処方７の電荷変異体メインピークは処方６と比較すれば、より良好な優位性を示し、ポリソルベート８０（ＦＬＤ‐ＨＰＬＣ法）の測定結果によれば、処方６のポリソルベート８０含有量は時間の経過と共に低下し、処方７に金属キレート剤ＥＤＴＡが添加されたため、金属イオンによるポリソルベート８０の分解が抑制された。上記の理由によって、処方７は処方６より優れた。ＥＤＴＡは金属キレート剤の一例として、金属イオンと結合することができ、少なくとも下記の２つの面から、ポリソルベート８０の分解を抑制することができる。その１の面として、細胞培養、精製などの関連操作工程を含むタンパク質の全製造過程において、金属イオンが多少導入されるため、酸素及び金属イオンが同時に存在する条件で、ポリソルベート８０の酸化分解が引き起こされる。その２の面として、処方におけるタンパク質に宿主細胞タンパク質が多少残留され、これらのタンパク質雑質にポリソルベート８０を分解させる関連酵素が存在する可能性があるが、酵素が触媒機能を発揮するための金属イオンを補因子として必要とされるため、処方に添加された金属キレート剤が金属イオンと結合することで、ポリソルベート８０の分解が抑制されて、処方の安定性が向上される。
【0191】
これにより、最も好ましい製剤案は、約１００．０ｍｇ／ｍＬ組換え抗表面抗原分類４７（ＣＤ４７）及び抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ‐Ｌ１）二重特異性抗体、約２．５２ｍｇ／ｍＬヒスチジン、０．７９ｍｇ／ｍＬ塩酸ヒスチジン、３７．９２ｍｇ／ｍＬ塩酸アルギニン、０．５０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、０．０２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５である。
【0192】
実施例６：５００Ｌ調製物の安定性考察実施例５の製剤案（約１００．０ｍｇ／ｍＬ組換え抗表面抗原分類４７（ＣＤ４７）及び抗プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ‐Ｌ１）二重特異性抗体、約２．５２ｍｇ／ｍＬヒスチジン、０．７９ｍｇ／ｍＬ塩酸ヒスチジン、３７．９２ｍｇ／ｍＬ塩酸アルギニン、０．５０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、０．０２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）で５００Ｌ調製物を調製して、安定性考察を実施した。
【0193】
６．１ 安定性考察用調製物及び考察案１０１．８ｍｇ／ｍＬ組換え抗ＣＤ４７／ＰＤ‐Ｌ１二重特異性抗体タンパク質、２．５２ｍｇ／ｍＬヒスチジン、０．７９ｍｇ／ｍＬ塩酸ヒスチジン、３７．９２ｍｇ／ｍＬ塩酸アルギニン、０．５０ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、０．０２ｍｇ／ｍＬ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５という調製物を５００Ｌ調製して、その安定性を考察した。
【0194】
【表24】
【0195】
【表25】
【0196】
２． ＳＥＣ‐ＨＰＬＣ法において、メインピーク＋ポリマー＋断片＝１００％であるため、メインピーク≧９５％であれば、残りの≦５％は断片とポリマーの量である。従って、断片とポリマーの量はそれぞれ報告データで提示する。下記同様。
【0197】
３． 非還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法において、メインピーク＋断片＝１００％であるため、メインピーク≧９０％であれば、残りの≦１０％は断片の量である。従って、断片の量は報告データで提示する。下記同様。
【0198】
４． 還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法において、重鎖及び軽鎖含有量＋非グリコシル化重鎖＋断片＝１００％であるため、重鎖及び軽鎖含有量≧９０％であれば、残りの≦１０％は非グリコシル化重鎖と断片の量である。従って、非グリコシル化重鎖の量と断片の量はそれぞれ報告データで提示する。下記同様。
【0199】
５． ＣＥＸ‐ＨＰＬＣ法において、主成分＋酸性成分＋塩基性成分＝１００％であるため、主成分の量≧４４．９％であれば、残りの≦５５．１％は酸性成分と塩基性成分の量である。従って、酸性成分の量と塩基性成分の量はそれぞれ報告データで提示する。下記同様。
【0200】
６． 前記規定は、『中華人民共和国薬典』（２０１５年版、三部）の関連規定である。下記同様。例えば、通則０９０４「視認できる異物の測定法」は視認できる異物の検査について規定した。
【0201】
６．２ 安定性考察結果５００Ｌ調製物に対する安定性考察結果は下記表に示す。
【0202】
【表26-1】
【表26-2】
【0203】
２． 還元型ＣＥ‐ＳＤＳ法において、メインピーク＋ＮＧＨＣCD47＋断片＝１００％であるため、メインピーク≧９０％であれば、残りの≦１０％はＮＧＨＣCD47鎖と断片の量である。従って、ＮＧＨＣCD47の量と断片の量はそれぞれ報告データで提示する。
【0204】
表２６の測定結果によれば、調製物は６ヶ月後に品質基準に満たす。
【0205】
【表27】
【0206】
表２７の測定結果によれば、加速安定性実験において、調製物は６ヶ月後に、各指標の基準に満たす。
【0207】
【表28-1】
【表28-2】
【0208】
表２８の測定結果によれば、強制安定性実験において、調製物は８週間後に、各指標の基準に満たす。
【0209】
要するに、上記実験によれば、本発明の製剤案は、生産の大規模化において製剤の安定性に対する要求に満たす。
【0210】
以上、本発明の例示的な実施形態について説明したが、これらの開示は例示に過ぎず、本発明の範囲内で様々な他の代替、適応、及び修正が可能であることは当業者に理解されたい。従って、本発明は、本明細書に列挙した特定の実施形態に限定されない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】