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特表2022-540918ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及びその医薬組成物並びに用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-20
(54)【発明の名称】ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及びその医薬組成物並びに用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220912BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220912BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220912BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220912BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220912BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220912BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220912BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220912BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220912BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220912BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220912BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220912BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220912BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C07K16/28
C07K14/705
C07K19/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P11/00
A61P9/12
A61P43/00 105
A61P9/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022502538
(86)(22)【出願日】2020-07-14
(85)【翻訳文提出日】2022-02-25
(86)【国際出願番号】 CN2020101857
(87)【国際公開番号】W WO2021008519
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】201910645466.X
(32)【優先日】2019-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516029492
【氏名又は名称】ジーエムエーエックス バイオファーム エルエルシー．
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】チェング ズハング
(72)【発明者】
【氏名】チェンジアング ヤオ
(72)【発明者】
【氏名】フア ズハング
(72)【発明者】
【氏名】クイアオフェング ワング
(72)【発明者】
【氏名】シュキアン ジング
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB11
4C085BB31
4C085CC02
4C085DD62
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が提供される。ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の医薬組成物も提供される。ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を使用することによって、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症、又は心血管線維症の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法がさらに提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、前記融合タンパク質がＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを含むことを構造的特徴とする融合タンパク質。
【請求項2】
前記ＥＴＡ抗体が、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される、請求項１又は請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５から選択される、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：配列番号７０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６から選択される、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＥＴＡ抗体が、以下のリスト：配列番号５０及び配列番号１１６、配列番号５０及び配列番号２０５、配列番号６２及び配列番号１２８、配列番号６２及び配列番号１３０、配列番号６４及び配列番号１３２、配列番号６６及び配列番号１３４、及び配列番号６８及び配列番号１３６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記ＥＴＡ抗体が、（ａ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０又は配列番号２０５；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６；
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１８；
（ｃ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２０；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２２；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４０；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１００；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２４；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６０；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２６；
（ｇ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２０又は配列番号２２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０４又は配列番号１０６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２８；
（ｈ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３０；
（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１０；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３２；
（ｊ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４；ｏｒ
（ｋ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号３０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号９０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３６
を含む、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記ＥＴＡ抗体が、軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４
を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４；及び
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、及び配列番号１９２
から選択される、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記ＥＴＡ抗体のポリヌクレオチドコード配列が、１又は２つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３；
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、及び配列番号１９１
から選択される、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
前記ＥＴＡ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８及び配列番号１６６、配列番号１４０及び配列番号１６８、配列番号１４２及び配列番号１７０、配列番号１４４及び配列番号１７２、配列番号１４６及び配列番号１７４、配列番号１４８及び配列番号１７６、配列番号１５０及び配列番号１７８、配列番号１５２及び配列番号１８０、配列番号１５４及び配列番号１８２、配列番号１５６及び配列番号１８４、配列番号１５８及び配列番号１８６、配列番号１６０及び配列番号１８８、配列番号１６２及び配列番号１９０、及び配列番号１６４及び配列番号１９２から独立して選択されるアミノ酸配列の組合せを含む、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項14】
前記ＥＴＡ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項15】
前記ＥＴＡ抗体が、以下のリスト：配列番号１６６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、及び配列番号１９２から独立して選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項16】
前記ＥＴＡ抗体が、以下のリスト：配列番号１３８及び配列番号１６６、配列番号１５０及び配列番号１７８、配列番号１５２及び配列番号１８０、配列番号１５４及び配列番号１８２、配列番号１５６及び配列番号１８４、配列番号１５８及び配列番号１８６、配列番号１６０及び配列番号１８８、配列番号１６２及び配列番号１９０、及び配列番号１６４及び配列番号１９２から独立して選択される軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列の組合せを含む、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項17】
前記ＥＴＡ抗体が、アミノ酸配列の配列番号１３８又は配列番号１６６を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項18】
前記ＥＴＡ抗体が、アミノ酸配列の配列番号１３８及び配列番号１６６の組合せを含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項19】
前記ＥＴＡ抗体が、アミノ酸配列の配列番号１６２又は配列番号１９０を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項20】
前記ＥＴＡ抗体が、アミノ酸配列の配列番号１６２及び配列番号１９０の組合せを含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項21】
前記ＥＴＡ抗体が、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖定常領域アミノ酸配列：配列番号１９４及び配列番号１９６；
ｂ．重鎖定常領域アミノ酸配列：配列番号１９８及び配列番号２０６
から選択される、請求項１～請求項２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項22】
前記ＥＴＡ抗体が、１つ又は複数の以下の特性：ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＫｄを提供すること；
ｂ．エンドセリンによるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡの活性化を阻害する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照ＥＴＡ抗体との結合に交差競合すること
を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項23】
前記ＥＴＡ抗体が、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照ＥＴＡ抗体との結合に交差競合する、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項24】
前記参照ＥＴＡ抗体が、請求項１～請求項２１のいずれか一項に記載の抗体を含む、請求項２２又は請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項25】
前記参照ＥＴＡ抗体が、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１３８及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１６６の組合せ、又は軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１６２及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１９０の組合せを含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【請求項26】
前記ＥＴＡ抗体が、マウスＥＴＡ抗体又はヒト化ＥＴＡ抗体を含む、請求項１～請求項２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項27】
前記ＥＴＡ抗体が、ＥＴＡモノクローナル抗体を含む、請求項１～請求項２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項28】
前記ＥＴＡ抗体が、ヒトエンドセリンシグナル伝達を軽減する際に、約１ｎＭ～２００ｎＭ又は１０ｎＭ～１００ｎＭのＩＣ５０値を有する、請求項１～請求項２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項29】
前記融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、１、２、３、４、５、６、７又は８つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びペプチドリンカー（リンカー）を含み；前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、前記ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結し、又は前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、前記ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する、請求項１～請求項２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項30】
前記融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、１、２、３又は４つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ、及びペプチドリンカー（リンカー）を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項31】
前記融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、２つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ、及び２つのペプチドリンカー（リンカー）を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項32】
前記融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ、及びペプチドリンカー（リンカー）を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項33】
前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する、請求項２９～請求項３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項34】
前記融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、前記ＥＴＡ抗体の重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する、請求項２９～請求項３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項35】
前記融合タンパク質が、以下のアミノ酸配列：配列番号８、配列番号３２、配列番号５０、配列番号２０５、配列番号７０、配列番号９２、及び配列番号１１６を含む、請求項２９～請求項３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項36】
前記融合タンパク質が、以下のアミノ酸配列：配列番号１６２、配列番号１９０、配列番号２０７、及び配列番号２１０を含む、請求項２９～請求項３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項37】
前記ＥＴＡ抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びペプチドリンカー配列が、以下の方法：（１）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端が、前記ＥＴＡ抗体の重鎖／軽鎖のカルボキシル末端と連結される：Ｎ’－Ｒ－リンカー－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－Ｃ’；及び
（２）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端が、前記ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と連結される：Ｎ’－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－リンカー－Ｒ－Ｃ’
のうちの１つで、融合されて、融合タンパク質を形成し；
ここで、Ｎ’が、ポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを表し、Ｒが、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す、請求項２９～請求項３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
前記ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、アミノ酸配列：配列番号２０７を含む、請求項１～請求項３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項39】
前記ペプチドリンカー（リンカー）配列がそれぞれ、独立して、以下のアミノ酸配列：配列番号２０８、配列番号２０９、及び配列番号２１０のうちの１つを含む、請求項２９～請求項３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項40】
前記ペプチドリンカー（リンカー）配列が、アミノ酸配列の配列番号２１０を含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項42】
請求項４１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項43】
請求項４２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項44】
請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項45】
肺動脈高血圧症を予防、改善、又は処置するための薬剤の調製における、請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項46】
肺高血圧症を予防、改善、又は処置するための薬剤の調製における、請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項47】
肺線維症を予防、改善、又は処置するための薬剤の調製における、請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項48】
心血管線維症を予防、改善、又は処置するための薬剤の調製における、請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項49】
肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症又は心血管線維症のうちの２つ以上の疾患を予防、改善、又は処置するための薬剤の調製における、請求項１～請求項４０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物の使用。
【請求項50】
前記薬剤が、静脈内に又は皮下に注入される、請求項４５～請求項４９のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が、本明細書において提供される。ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の医薬組成物も、本明細書において提供される。ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を使用することによって、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、又は肺線維症の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法が、本明細書においてさらに提供される。
【背景技術】
【0002】
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、肺動脈血圧の著しい上昇を特徴とする希少な進行性の疾患である。肺動脈高血圧症は、人の健康を脅かす重要な疾患になっている。データは、世界の様々なタイプの肺動脈高血圧症の年間発生率が、１００万人当たり約２．４～７．６人であり、その有病率は、１００万人当たり約１５～２６人であることを示す。肺動脈高血圧症は、虚血性心疾患及び高血圧症の後でのみ、３番目によく見られる心血管疾患になっている。肺動脈高血圧症の原因は、まだ完全に理解されていない。その潜行性発症のため、ほとんどの患者は、既に、肺動脈高血圧症の心機能のグレードＩＩＩ～ＩＶにある。肺動脈高血圧症の随伴症状は、通常、（特に運動時の）息切れ、胸痛、断続的な失神などを含む。さらに、この状態が続くにつれて、連続的な高い肺動脈圧により、右心室が肺に血液を連続的に供給することができなくなり、これが、最終的に右心不全を引き起こす。心不全は、肺動脈高血圧症を有する患者の最も多い死因である。
【0003】
現在のところ、肺動脈高血圧症には治療法がなく、薬物療法が、肺動脈高血圧症の維持療法の第１選択肢である。肺動脈高血圧症の治療のためにＦＤＡによって承認される薬物は、血管拡張剤であり、これは、機序に応じて、カルシウムチャネル遮断薬、プロスタサイクリン受容体作用薬、ホスホジエステラーゼタイプ５（ＰＤＥ５）阻害剤、エンドセリン受容体阻害剤などに分けられ得る。
【0004】
肺動脈高血圧症は、肺への心臓の血液供給が、肺における又は肺に関連する血管収縮により不十分である後、肺への心臓の血液供給の圧力の代償性増加によって引き起こされる。その微視的兆候は、肺細動脈の内膜の肥厚、及び血栓症によって引き起こされる血管収縮、リモデリング、硬化又は局所的閉塞を含み、それによって、肺血液循環に対する血管の抵抗を増大する（Ｓｉｍｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４３：５Ｓ－１２Ｓ；Ｂａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４３：４０Ｓ－４７Ｓ）。
【0005】
エンドセリン受容体（例えば、エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ又はＥＴＡＲ））阻害剤は、エンドセリンによって引き起こされる血管圧の上昇を効果的に阻止して、肺動脈高血圧症の症状を軽減し、患者の運動能力及び血行動態を改善することができる（Ｓｅｒａｓｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．５：１８４－９５）。
【0006】
いくつかの試験が、形質転換成長因子β１（ＴＧＦ－β１）が、様々な条件で、特に、心血管疾患において重要な役割を果たすことを示した。ＴＧＦ－β１は、細胞増殖、分化、遊走及びアポトーシスなどのプロセスに関与し、複数のシグナル経路を調節し、それによって、肺動脈高血圧症の発生及び進行を誘導することによって、平滑筋細胞増殖、細胞外基質の堆積及び内皮間葉移行（ＥｎｄＭＴ）などのプロセスを促進する（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，２２２：３６８－３７４；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２８：１３５４－１３６４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７７：１４１－１５４）。肺線維症の治療のための承認薬としてのピルフェニドンは、ＴＧＦ－βの発現を阻害し、線維芽細胞の増殖を減少させ、ＴＧＦ－βによって誘導されるα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを減衰することができる。
【0007】
ＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、ＴＧＦ－β２型受容体の細胞外末端から構成され、ＴＧＦ－β１又はＴＧＦ－β３に結合し、それによって、肺動脈高血圧症の過程における血管平滑筋細胞増殖及び分化、細胞外基質の堆積及び上皮間葉移行などのＴＧＦ－β媒介性プロセスを効果的に阻止することができる。ＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、肺細動脈の線維症及びリモデリングを軽減し、それによって、肺血液循環の抵抗を減少させ、右心の機能を改善することができる（Ｇｏｕｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０：ａ０２２２１０；Ｙｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，１９４：１１４０－１１５１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ＥＴＡ阻害性抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が、本明細書において提供される。一方では、ＥＴＡ阻害性抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、ＥＴＡシグナル伝達経路を阻止し、肺循環に対する血管の抵抗を減少させることができ；他方では、それは、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路を阻止し、肺細動脈の線維症及びリモデリングを軽減することができる。肺動脈高血圧症を処置し、右心の機能を改善する目的は、二重作用機序によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【0009】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が、本明細書において提供される。融合タンパク質を使用することによって、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症及び心血管線維症の１つ又は複数の症状を処置、予防、又は改善するための方法も、本明細書において提供される。
【0010】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、融合タンパク質がＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを含むことを構造的特徴とする融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0011】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、１、２、３、４、５、６、７又は８つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び対応する数のペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結し、又は融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結することを構造的特徴とする融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0012】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、１、２、３又は４つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び対応する数のペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結し、又は融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結することを構造的特徴とする融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0013】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、２つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び２つのペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結し、又は融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結することを構造的特徴とする融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0014】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、融合タンパク質が、ＥＴＡ抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結し、又は融合タンパク質が、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して連結することを構造的特徴とする融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0015】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質であって、ＥＴＡ抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びペプチドリンカー配列が、以下の方法：
（１）ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端が、ＥＴＡ抗体の重鎖／軽鎖のカルボキシル末端と連結される：Ｎ’－Ｒ－リンカー－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－Ｃ’；及び
（２）ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端が、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と連結される：Ｎ’－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－リンカー－Ｒ－Ｃ’
のうちの１つで、融合されて、融合タンパク質を形成することを構造的特徴とし；
ここで、Ｎ’が、ポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを表し、Ｒが、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
（１）ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端が、ＥＴＡ抗体の重鎖／軽鎖のカルボキシル末端と連結される：Ｎ’－Ｒ－リンカー－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－Ｃ’；及び
（２）ペプチドリンカー（リンカー）配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端が、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と連結される：Ｎ’－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－リンカー－Ｒ－Ｃ’
のうちの１つで、融合されて、融合タンパク質を形成することを構造的特徴とし；
ここで、Ｎ’が、ポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを表し、Ｒが、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す、融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0016】
本明細書に記載されるＥＴＡ抗体をコードするポリヌクレオチド及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が、本明細書において提供される。
【0017】
本明細書に記載されるＥＴＡ抗体をコードするポリヌクレオチド及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を含むベクターが、本明細書において提供される。
【0018】
本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞が、本明細書において提供される。
【0019】
本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【0020】
肺動脈高血圧症及び肺動脈高血圧症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0021】
肺高血圧症及び肺高血圧症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0022】
肺線維症及び肺線維症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0023】
心血管線維症及び心血管線維症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0024】
肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症又は心血管線維症のうちの２つ以上の疾患の１つ又は複数の症状を同時に処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0025】
肺動脈高血圧症及び肺動脈高血圧症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【0026】
肺高血圧症及び肺高血圧症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【0027】
肺線維症及び肺線維症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【0028】
心血管線維症及び心血管線維症関連疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【0029】
肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症又は心血管線維症のうちの２つ以上の疾患の１つ又は複数の症状を処置、予防又は改善するための方法であって、治療的に有効な用量の本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を被験体に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】ヒトＥＴＡによって媒介されるＣａ２＋変化を阻害する、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ（配列番号１６２、配列番号１９０、配列番号２０７、及び配列番号２１０を含む）の結果を示す。
【図2】ＴＧＦ－β１受容体を活性化することからＴＧＦ－β１をブロックする、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの結果を示す。
【図3】ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、肺線維症に対する有意に改善された効果を与えることを示す。
【図4】ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、肺線維症を有するマウスの生存率／生存期間を有意に改善し得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
定義
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
本明細書において特に定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって理解される意味を有するものとする。一般に、薬理学、生物学、生化学、細胞及び組織培養、生物学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及びタンパク質核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連する命名法及び技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。
【0032】
ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を示すために標準的な一文字又は三文字略語が本明細書において使用される。特に規定されない限り、ポリペプチド配列のアミノ末端は、左側にあり、そのカルボキシル末端は、右側にあり、一本鎖及び二本鎖核酸配列の上鎖（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｃｈａｉｎ）の５’末端が左側にあり、それらの３’末端が右側にある。ポリペプチドの特定の部分は、アミノ酸８０～１３０などのアミノ酸残基数によって表されるか、又はＬｙｓ８０～Ｌｙｓ１３０などの、その部位の実際の残基によって表され得る。特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、参照配列とのその相違を示すことによって表すこともできる。
【0033】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む分子を指す。これらの用語は、例えば、天然及び人工タンパク質、タンパク質フラグメント及びタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質、変異体及び融合タンパク質など）並びに翻訳後、或いは共有結合的に又は非共有結合的に修飾されたタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、モノマー又はポリマーであり得る。
【0034】
「ポリペプチドフラグメント」という用語は、対応する完全長タンパク質からのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端欠失を有するポリペプチドを指す。例えば、フラグメント長さは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０、又は２００アミノ酸であり得る。フラグメント長さは、例えば、最大で１０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、又は１０アミノ酸であり得る。フラグメントは、一方の末端又は両方において１つ又は複数のさらなるアミノ酸、例えば、異なる天然タンパク質からのアミノ酸配列（例えば、Ｆｃ又はロイシンジッパードメイン）又は人工アミノ酸配列（例えば、人工結合配列）をさらに含み得る。
【0035】
本明細書におけるポリペプチドは、任意の理由で及び任意の手段によって、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するように親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、（４）他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節するように修飾されたポリペプチドを含む。類似体は、ポリペプチドの突然変異タンパク質を含む。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（例えば、分子内接触を形成するポリペプチドのドメインの外部）。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである（例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列に特性を与えるか又はその機能のために必要である他の二次的な構造タイプに干渉すべきでない）。
【0036】
ポリペプチドの「変異体」は、別のポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸残基が挿入、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む。本明細書における変異体は、融合タンパク質を含む。
【0037】
ポリペプチドの「誘導体」は、ポリエチレングリコール、アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、リン酸化、及びグリコシル化などの、例えば他の化学部分への結合によって化学修飾されたポリペプチドである。
【0038】
特に記載しない限り、「抗体」という用語は、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む抗体、並びにそれらの誘導体、変異体、フラグメント、及び突然変異タンパク質を含み、その例は後述される。
【0039】
「抗体」という用語は、抗原結合部分、及び任意選択的に、抗原への抗体の結合を促進する立体配座を抗原結合部分が取るのを可能にする足場又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。抗体の例としては、インタクトな抗体、抗体フラグメント（抗体の抗原結合部分など）、抗体誘導体、及び抗体類似体が挙げられる。例えば、抗体は、グラフトされたＣＤＲ又はＣＤＲの誘導体を含む、代替的なタンパク質足場又は人工足場を含み得る。足場としては、限定はされないが、導入される抗体由来の足場、例えば、抗体の三次元構造を安定させるもの、及び例えば、生体適合性ポリマーのための完全に合成の足場が挙げられる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５３：１２１－１２９；Ｒｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４を参照されたい。さらに、足場としてフィブリンリガンドを使用する、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）及びこの抗体模倣体に基づく足場が使用され得る。
【0040】
抗体は、例えば、天然免疫グロブリンの構造を有し得る。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端は、主に抗原認識に関連している約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシル末端は、主にエフェクターの効果に関連している定常領域を画定する。ヒト抗体軽鎖は、κ及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、α、又はε重鎖に分類され、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥなどの抗原のアイソタイプを画定する。軽鎖及び重鎖内で、可変及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｐａｕｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）（この開示内容は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【0041】
天然免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとしても知られている、３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ基本構造を示す。Ｎ末端からＣ末端へと、軽鎖及び重鎖は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。各ドメイン中のアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１中の定義と一致している。
【0042】
特に規定されない限り、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、又は特異的結合についてインタクトな抗体と競合し得る、その抗原結合部分のいずれかを意味する。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、二重鎖抗体、三重鎖抗体、四重鎖抗体、及びポリペプチドに対する特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドを含む。
【0043】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインを有する一価フラグメントであり；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価フラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨ又はＶＬドメインを有し；ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、又はＶＨ若しくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（米国特許第６，８４６，６３４号明細書及び米国特許第６，６９６，２４５号明細書；米国特許出願公開第２００５／０２０２５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２０２９９５号明細書、米国特許出願公開第２００４／００３８２９１号明細書、米国特許出願公開第２００４／０００９５０７号明細書、及び米国特許出願公開第２００３／００３９９５８号明細書；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）。
【0044】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬ及びＶＨ領域がリンカー（例えば、合成アミノ酸残基配列）を介して結合されて、連続タンパク質を形成する抗体であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖がそれ自体で折り畳まれて、一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－８３を参照）。
【0045】
二重鎖抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であり、ポリペプチド鎖はそれぞれ、同じ鎖上の２つのドメインの対形成を可能にしないほど短いリンカーによって結合されたＶＨ及びＶＬドメインを含む。したがって、各ドメインが、別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対形成するのを可能にする（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－４８；及びＰｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－２３を参照）。二重鎖抗体が、２つの同一のポリペプチド鎖を有する場合、２つの同一のポリペプチド鎖の対形成から生じる二重鎖抗体は、同じ抗原結合部位を有する。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、異なる抗原結合部位を有する二重鎖抗体を作製することができる。同様に、三重鎖抗体及び四重鎖抗体は、それぞれ３つ及び４つのポリペプチド鎖を含む抗体であり、同じか又は異なり得る、それぞれ３つ及び４つの抗原結合部位を形成する。
【0046】
Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１に記載される方法を用いて、所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を同定することができる。１つ又は複数のＣＤＲを、共有結合的又は非共有結合的に分子中に組み込んで、それを抗体にし得る。抗体は、より大きいポリペプチド鎖をＣＤＲに組み込むことができる。ＣＤＲは、別のポリペプチド鎖に共有結合することができ、又はそれに非共有結合的に組み込むことができる。ＣＤＲは、抗体が、該当する特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【0047】
抗体は、１つ又は複数の結合部位を有し得る。２つ以上の結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても又は異なっていてもよい。例えば、天然ヒト免疫グロブリンは、通常、２つの同一の結合部位を有する一方、「二重特異性」又は「二機能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【0048】
「マウス抗体」という用語は、マウス免疫グロブリン配列に由来する１つ又は複数の可変及び定常領域を有する抗体を含む。
【0049】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス抗体分子の相補性決定領域の配列を、ヒト抗体可変領域のフレームワークにグラフトすることによって作製される抗体である。
【0050】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、又は「抗原結合部位」という用語は、抗原と相互作用し、抗原に対する抗体の特異性及び親和性に寄与するアミノ酸残基（又は他の部分）を含む抗体の部分である。それらの抗原に特異的に結合する抗体については、これは、ＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも一部を含む。
【0051】
「エピトープ」という用語は、（例えば、抗体によって）抗体に結合する分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列において隣接していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造において、抗体によって互いに結合されるのに十分に近いアミノ酸残基）を含み得る。
【0052】
２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ；ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の一部）デフォルトパラメータ比較配列を用いて決定される。
【0053】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、全文を通して同義的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸及び非天然ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡ又はＲＮＡ類似体並びにそれらのハイブリッドを含み得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。一実施形態において、本明細書における核酸分子は、本明細書において提供される抗体又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体をコードする隣接オープンリーディングフレームを含む。
【0054】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドの配列が逆平行に配置され得る場合、２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、互いに「相補的」であり、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、別のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であり、ギャップが導入されず、各配列の５’又は３’末端に対形成しないヌクレオチドが見られないようになっている。２つのポリヌクレオチドが、中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズし得る場合、一方のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと「相補的」である。したがって、一方のポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに相補的であり得るが、その相補配列でない。
【0055】
「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を細胞内に導入するのに使用され得る核酸である。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、さらなる核酸セグメントに結合可能な直鎖状又は環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノウイルス随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノム内に導入され得る。一部のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を含む細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。
【0056】
「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を指令し得るベクターのタイプである。
【0057】
制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時間、又は部位）に影響を及ぼす場合、ヌクレオチド配列は、制御配列に「操作可能に連結される」。「制御配列」は、それが操作可能に連結される核酸の発現（例えば、発現のレベル、時間、又は部位）に影響を及ぼす核酸である。制御遺伝子は、例えば、制御される核酸に対して直接、又は１つ又は複数の他の分子（例えば、制御配列及び／又は核酸に結合するポリヌクレオチド）を介して作用する。制御配列の例としては、プロモータ、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例が、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；及びＢａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５－０６などに記載され得る。
【0058】
「宿主細胞」という用語は、本明細書において提供されるものなどの核酸を発現するのに使用される細胞を指す。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得るか、又はそれは、真核生物、例えば、単細胞真核生物（例えば、酵母又は他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコ又はトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞又は昆虫細胞）又はハイブリドーマであり得る。通常、宿主細胞は、宿主細胞において後に発現され得るペプチドコード核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る培養細胞である。「組み換え宿主細胞」という語句は、予測される発現の核酸で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を示すのに使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が、核酸と操作可能に連結されるように宿主細胞中に導入されない限り、所望のレベルでその核酸を発現しない細胞であり得る。「宿主細胞」という用語が、特定の被験体の細胞だけでなく、その細胞の子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解されるべきである。続く世代で起こる特定の修飾、例えば、突然変異又は環境的影響のため、このような子孫は、実際に、親細胞と異なり得るが、なお、本明細書において使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
【0059】
エンドセリン受容体
エンドセリン受容体（ＥＴＡ）は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して１つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される７－膜貫通受容体ファミリーのＡサブファミリーに属する（Ｊｅｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６１４－１６１６，及びＳｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４：３０９－３１４）。本明細書において使用される際、「エンドセリン受容体」及び「ＥＴＡ」又は「ＥＴＡＲ」は、同義的に使用され得る。
エンドセリン受容体（ＥＴＡ）は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して１つ又は複数の細胞内シグナル伝達経路に結合される７－膜貫通受容体ファミリーのＡサブファミリーに属する（Ｊｅｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１６１４－１６１６，及びＳｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．４：３０９－３１４）。本明細書において使用される際、「エンドセリン受容体」及び「ＥＴＡ」又は「ＥＴＡＲ」は、同義的に使用され得る。
【0060】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、細胞において発現される膜結合エンドセリン受容体に結合し、エンドセリン受容体を介してエンドセリンシグナル伝達を阻害又は阻止するように選択され得る。一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合する。さらなる実施形態において、ヒトエンドセリン受容体に結合する抗体はまた、他の種、例えば、ラットのエンドセリン受容体に結合し得る。以下の実施例は、ヒト膜結合エンドセリン受容体に結合するマウス抗体の生成を提供し、さらなる実施形態において、マウス抗体はまた、他の種のエンドセリン受容体に結合する。
【0061】
いくつかの種のエンドセリン受容体のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列が知られている。配列番号１～配列番号６は、ヒト、サル及びラットの配列を示す。配列データは、米国国立生物工学情報センター（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手した。
【0062】
エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）の配列情報は、以下のとおりである：
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号１）；受託番号：Ｓ６３９３８；
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号２）；受託番号：ＡＡＢ２０２７８；
サル（カニクイザル）ポリヌクレオチド（配列番号３）；受託番号：ＪＶ６３５７７１；
サル（カニクイザル）アミノ酸（配列番号４）；受託番号：ＡＦＪ７１１１１；
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５）；受託番号：Ｍ６０７８６；
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））アミノ酸（配列番号６）；受託番号：ＡＡＡ４１１１４。
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））ポリヌクレオチド（配列番号１）；受託番号：Ｓ６３９３８；
ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））アミノ酸（配列番号２）；受託番号：ＡＡＢ２０２７８；
サル（カニクイザル）ポリヌクレオチド（配列番号３）；受託番号：ＪＶ６３５７７１；
サル（カニクイザル）アミノ酸（配列番号４）；受託番号：ＡＦＪ７１１１１；
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ポリヌクレオチド（配列番号５）；受託番号：Ｍ６０７８６；
ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））アミノ酸（配列番号６）；受託番号：ＡＡＡ４１１１４。
【0063】
エンドセリン受容体Ａ（ＥＴＡ）抗体
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；
ｂ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；
ｃ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；
ｄ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０；
ｅ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４；及び
ｆ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
【0064】
表１は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びにそれらの対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。表２は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列、並びにそれらの対応するポリヌクレオチドコード配列を列挙している。
【0065】
【表1】
【0066】
【表2】
【0067】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、５、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、４、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、３、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、２又は１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列の１つと異なる配列を含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、１つのアミノ酸付加、置換、及び／又は欠失が、表１及び２に列挙されるＣＤＲアミノ酸配列のものと異なる配列を含む。
【0068】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体（ＥＴＡ－１抗体）は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
【0069】
一態様において、ＥＴＡ－１抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
【0070】
別の態様において、ＥＴＡ－１抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
【0071】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体（ＥＴＡ－２抗体）は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
【0072】
一態様において、ＥＴＡ－２抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
【0073】
別の態様において、ＥＴＡ－２抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
【0074】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体（ＥＴＡ－３抗体）は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６
から選択される。
【0075】
一態様において、ＥＴＡ－３抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０
から選択される。
【0076】
別の態様において、ＥＴＡ－３抗体は、１又は２つのアミノ酸配列をさらに含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
ａ．軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８；及び
ｂ．重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４
から選択される。
【0077】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、ａ．以下のリスト：配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、及び配列番号３０から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
ｂ．以下のリスト：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
ｃ．以下のリスト：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、及び配列番号６８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．以下のリスト：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０から独立して選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
ｅ．以下のリスト：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４から独立して選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；及び
ｆ．以下のリスト：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６から独立して選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
ｂ．以下のリスト：配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；
ｃ．以下のリスト：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、及び配列番号６８から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列；
ｄ．以下のリスト：配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、及び配列番号９０から独立して選択される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；
ｅ．以下のリスト：配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、及び配列番号１１４から独立して選択される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列；及び
ｆ．以下のリスト：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６から独立して選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
を含む。
【0078】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下のリスト：配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、及び配列番号２０５から独立して選択される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下のリスト：配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、及び配列番号１３６から独立して選択される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【0079】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下のリスト：配列番号５０及び配列番号１１６、配列番号５０及び配列番号２０５、配列番号６２及び配列番号１２８、配列番号６２及び配列番号１３０、配列番号６４及び配列番号１３２、配列番号６６及び配列番号１３４、及び配列番号６８及び配列番号１３６から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【0080】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、
（ａ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０又は配列番号２０５；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６；
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１８；
（ｃ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２０；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２２；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４０；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１００；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２４；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６０；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２６；
（ｇ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２０又は配列番号２２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０４又は１０６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２８；
（ｈ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３０；
（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１０；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３２；
（ｊ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４；又は
（ｋ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号３０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号９０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３６
を含む。
（ａ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５０又は配列番号２０５；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１６；
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１１８；
（ｃ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２０；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号３８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号９８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２２；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４０；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号５８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号７８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１００；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２４；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号１８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４２；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６０；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２６；
（ｇ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２０又は配列番号２２；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８２；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０４又は１０６；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１２８；
（ｈ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２４；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４４；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６２；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８４；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１０８；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３０；
（ｉ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２６；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６４；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８６；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１０；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３２；
（ｊ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４；又は
（ｋ）軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号３０；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４８；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６８；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号９０；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１４；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３６
を含む。
【0081】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、
軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４
を含む。
軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号２８；
軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号４６；
軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号６６；
重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列：配列番号８８；
重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列：配列番号１１２；及び
重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列：配列番号１３４
を含む。
【0082】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、１又は２つのアミノ酸配列を含み、ここで、各アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：
ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；並びに
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される。
ａ．軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；並びに
ｂ．重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
から選択される。
【0083】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体のポリヌクレオチドコード配列は、１又は２つのポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリヌクレオチド配列が、独立して、以下に列挙されるポリヌクレオチド配列：
ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列；並びに
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、及び配列番号１９１、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
ａ．軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列；並びに
ｂ．重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列：配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８９、及び配列番号１９１、及びそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるポリヌクレオチド配列
から選択される。
【0084】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；並びに
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
を含む。
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；並びに
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列、並びにそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列
を含む。
【0085】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；並びに
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む。
ａ．以下のリスト：配列番号１３８（Ｌ１）、配列番号１４０（Ｌ２）、配列番号１４２（Ｌ３）、配列番号１４４（Ｌ４）、配列番号１４６（Ｌ５）、配列番号１４８（Ｌ６）、配列番号１５０（Ｌ７）、配列番号１５２（Ｌ８）、配列番号１５４（Ｌ９）、配列番号１５６（Ｌ１０）、配列番号１５８（Ｌ１１）、配列番号１６０（Ｌ１２）、配列番号１６２（Ｌ１３）、及び配列番号１６４（Ｌ１４）から独立して選択される軽鎖可変ドメインアミノ酸配列；並びに
ｂ．以下のリスト：配列番号１６６（Ｈ１）、配列番号１６８（Ｈ２）、配列番号１７０（Ｈ３）、配列番号１７２（Ｈ４）、配列番号１７４（Ｈ５）、配列番号１７６（Ｈ６）、配列番号１７８（Ｈ７）、配列番号１８０（Ｈ８）、配列番号１８２（Ｈ９）、配列番号１８４（Ｈ１０）、配列番号１８６（Ｈ１１）、配列番号１８８（Ｈ１２）、配列番号１９０（Ｈ１３）、及び配列番号１９２（Ｈ１４）から独立して選択される重鎖可変ドメインアミノ酸配列
を含む。
【0086】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下のリスト：配列番号１３８及び配列番号１６６（Ｌ１Ｈ１）、配列番号１４０及び配列番号１６８（Ｌ２Ｈ２）、配列番号１４２及び配列番号１７０（Ｌ３Ｈ３）、配列番号１４４及び配列番号１７２（Ｌ４Ｈ４）、配列番号１４６及び配列番号１７４（Ｌ５Ｈ５）、配列番号１４８及び配列番号１７６（Ｌ６Ｈ６）、配列番号１５０及び配列番号１７８（Ｌ７Ｈ７）、配列番号１５２及び配列番号１８０（Ｌ８Ｈ８）、配列番号１５４及び配列番号１８２（Ｌ９Ｈ９）、配列番号１５６及び配列番号１８４（Ｌ１０Ｈ１０）、配列番号１５８及び配列番号１８６（Ｌ１１Ｈ１１）、配列番号１６０及び配列番号１８８（Ｌ１２Ｈ１２）、配列番号１６２及び配列番号１９０（Ｌ１３Ｈ１３）、及び配列番号１６４及び配列番号１９２（Ｌ１４Ｈ１４）から独立して選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の組合せを含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、軽鎖及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列：配列番号１６２及び配列番号１９０（Ｌ１３Ｈ１３）の組合せを含む。
【0087】
「ＬｘＨｙ」という記号を用いて、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体を示すこともでき、ここで、「ｘ」が、軽鎖可変領域に対応し、「ｙ」が、重鎖可変領域に対応する。例えば、Ｌ２Ｈ１は、アミノ酸配列の配列番号１４０（Ｌ２）を含む軽鎖可変領域及びアミノ酸配列の配列番号１６６（Ｈ１）を含む重鎖可変領域を有する抗体を指す。
【0088】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、Ｌ１～Ｌ１４から選択される軽鎖可変領域又はＨ１～Ｈ１４から選択される重鎖可変領域、及びそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体を含む。
【0089】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下のリスト：配列番号１３８及び配列番号１６６、配列番号１５０及び配列番号１７８、配列番号１５２及び配列番号１８０、配列番号１５４及び配列番号１８２、配列番号１５６及び配列番号１８４、配列番号１５８及び配列番号１８６、配列番号１６０及び配列番号１８８、配列番号１６２及び配列番号１９０、及び配列番号１６４及び配列番号１９２から独立して選択される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の組合せを含む。
【0090】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１３８又は重鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１６６を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１３８及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１６６の組合せを含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、定常アミノ酸配列をさらに含み、ここで、各定常アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙されるアミノ酸配列：ａ．軽鎖定常アミノ酸配列：配列番号１９４及び配列番号１９６；並びにｂ．重鎖定常アミノ酸配列：配列番号１９８及び配列番号２０６から選択される。
【0091】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、定常アミノ酸配列をさらに含み、ここで、各定常アミノ酸配列が、独立して、以下に列挙される軽鎖及び重鎖定常アミノ酸配列の組合せ：
ａ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９４及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９８の組合せ；
ｂ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９４及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号２０６の組合せ；
ｃ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９６及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９８の組合せ；
ｄ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９６及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号２０６の組合せ
から選択される。
ａ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９４及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９８の組合せ；
ｂ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９４及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号２０６の組合せ；
ｃ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９６及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９８の組合せ；
ｄ．軽鎖定常アミノ酸配列の配列番号１９６及び重鎖定常アミノ酸配列の配列番号２０６の組合せ
から選択される。
【0092】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ及びＦＲ（フレームワーク）アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ３配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における軽鎖ＦＲ４配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ１配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ２配列を含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ３配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、本明細書における重鎖ＦＲ４配列を含む。
【0093】
一実施形態において、抗体のＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失が、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号５０及び配列番号１１６の組合せと異なる。別の実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失が、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号５０と異なる。別の実施形態において、抗体の軽鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失が、本明細書に列挙される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号５０と異なり、抗体の重鎖ＣＤＲ３配列は、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸付加、置換及び／又は欠失が、本明細書に列挙される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号１１６又は配列番号１１８と異なる。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つの組合せをさらに含む。別の実施形態において、抗体は、軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つの組合せをさらに含み、各配列は、単独で、６、５、４、３、２又は１つ以下のアミノ酸が、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列の配列番号５０及び配列番号１１６の組合せと異なる。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖可変領域ＣＤＲ及び重鎖可変領域ＣＤＲを含む。別の実施形態において、抗体は、本明細書に列挙される軽鎖及び重鎖ＣＤＲ配列の１、２、３、４、５及び／又は６つの組合せを含む。
【0094】
一実施形態において、抗体（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は、本明細書に列挙されるＬ１軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１軽鎖可変ドメイン配列との１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含み、ここで、各配列の相違が、独立して、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１軽鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ１ポリヌクレオチドコード配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ１軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補配列と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｌ１軽鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【0095】
一実施形態において、抗体（例えば、抗体又は抗体フラグメント）は、本明細書に列挙されるＨ１重鎖可変ドメイン配列を含む。別の実施形態において、可変ドメインは、Ｈ１重鎖可変ドメイン配列との１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つのアミノ酸の相違を有するアミノ酸配列を含み、ここで、各配列の相違が、独立して、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換である。別の実施形態において、重鎖可変ドメインは、Ｈ１重鎖可変ドメイン配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ１ポリヌクレオチドコード配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチドコード配列を含む。別の実施形態において、重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ１重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補配列と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列は、Ｈ１重鎖可変ドメインポリヌクレオチドコード配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。
【0096】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、又はＬ１４Ｈ１４、又はその所望の表現型（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、又はそのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体を含む。
【0097】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、Ｌ１Ｈ１、又はそのクラススイッチを有する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、又はそのＦａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの組合せを含む抗体を含む。
【0098】
本明細書に記載される抗体（例えば、抗体、抗体フラグメント、及び抗体誘導体）は、当該技術分野において公知の定常領域のいずれかを含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、κ又はλ軽鎖定常領域、例えば、マウスκ又はλ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域、例えば、マウスα、δ、ε、γ、又はμ重鎖定常領域であり得る。一実施形態において、軽鎖又は重鎖定常領域は、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、又は突然変異タンパク質である。
【0099】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、軽鎖κ又はλ定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。軽鎖定常領域配列及びそのポリヌクレオチドコード配列は、以下のように提供される：ポリヌクレオチド（κ）、（配列番号１９３）；アミノ酸（κ）、（配列番号１９４）；ポリヌクレオチド（λ）、（配列番号１９５）；アミノ酸（λ）、（配列番号１９６）。
【0100】
別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、重鎖定常ドメイン又はそのフラグメントをさらに含む。重鎖定常領域配列及びそのポリヌクレオチドコード配列は、以下のように提供される：ポリヌクレオチド（ＩｇＧ４）、（配列番号１９７）；アミノ酸（ＩｇＧ４）、（配列番号１９８）。
【0101】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重鎖抗体、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧｌ抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、及びＩｇＧ４抗体から選択される。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、ＥＴＡモノクローナル抗体である。別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、マウスＥＴＡ抗体である。本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、ヒト化ＥＴＡ抗体である。
【0102】
一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、モノクローナル抗体Ａ－１（配列番号１３８及び配列番号１６６を含む）、Ａ－７（配列番号１５０及び配列番号１７８を含む）、Ａ－８（配列番号１５２及び配列番号１８０を含む）、Ａ－９（配列番号１５４及び配列番号１８２を含む）、Ａ－１０（配列番号１５６及び配列番号１８４を含む）、Ａ－１１（配列番号１５８及び配列番号１８６を含む）、Ａ－１２（配列番号１６０及び配列番号１８８を含む）、Ａ－１３（配列番号１６２及び配列番号１９０を含む）、又はＡ－１４（配列番号１６４及び配列番号１９２を含む）である。
【0103】
抗体及び抗体フラグメント
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、インタクト抗体（完全長重鎖及び／又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、又はＦｄフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ－ＮＡＲ及びビス－ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６－１１３６を参照）。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、フィブロネクチンポリペプチドモノクローナル抗体を含む、（米国特許第６，７０３，１９９号明細書）に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号明細書）に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、インタクト抗体（完全長重鎖及び／又は軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む）である。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆｃ、又はＦｄフラグメントであり、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ－ＮＡＲ及びビス－ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６－１１３６を参照）。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、フィブロネクチンポリペプチドモノクローナル抗体を含む、（米国特許第６，７０３，１９９号明細書）に開示されるものなどの抗体ポリペプチドも含む。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、一本鎖ポリペプチドである、（米国特許出願公開第２００５／０２３８６４６号明細書）に開示される他の抗体ポリペプチドも含む。
【0104】
一実施形態において、ハイブリドーマ中の関連するモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域は、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成され得るか、又は商業的供給源から購入され得（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ａｎｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照）、これらの供給業者は、ＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ領域プライマーを含むマウス及びヒト可変領域プライマーを販売する。これらのプライマーは、それぞれＩＭＭＵＮＯＺＡＰＴＭＨ又はＩＬＬＬＦＦＬＵＮＯＺＡＰＴＭＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクターに後に挿入され得る重鎖又は軽鎖可変領域を増幅するのに使用され得る。次に、これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、又は哺乳動物に基づく発現系に導入され得る。ＶＨ及びＶＬドメインを含む大量の融合一本鎖タンパク質が、これらの方法を用いて産生され得る（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６を参照）。
【0105】
本出願に係る抗体産生細胞が、上記の免疫付与及び他の技術のいずれかを用いて得られた後、特定の抗体の遺伝子が、本明細書に記載される標準的な方法にしたがってそれから遺伝子を単離し、ＤＮＡ又はｍＲＮＡを増幅することによってクローニングされ得る。それから産生された抗体は、配列を決定され得、ＣＤＲが同定される。ＣＤＲをコードするＤＮＡが、本明細書に記載される他の抗体を産生するように、上述されるように操作され得る。
【0106】
本明細書に記載される抗体は、好ましくは、本明細書に記載される細胞に基づくアッセイ及び／又は本明細書に記載されるインビボアッセイにおいて、エンドセリンシグナル伝達を調節し、及び／又は本出願に記載される抗体の１つの結合をクロスブロックし（ｃｒｏｓｓ－ｂｌｏｃｋ）及び／又は本出願に記載される抗体の１つによるＥＴＡとの結合によってクロスブロックされ得る。したがって、本明細書に記載されるアッセイは、このような結合剤を同定するように使用され得る。
【0107】
ある実施形態において、抗体は、本明細書に記載される細胞に基づく及び／又はインビボアッセイにおいて、ＥＴＡを過剰発現する細胞に結合し、及び／又は中和し、及び／又は本出願に記載される抗体をクロスブロックし、及び／又は本出願に記載される抗体の１つによって、ＥＴＡとの結合によってクロスブロックされる抗体をまず同定することによって生成される。
【0108】
抗体などの特定のタンパク質が、様々な翻訳後修飾を受けることができることが、当業者によって理解されるべきである。これらの修飾のタイプ及び程度は、タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に左右される。このような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン（ｄｉｋｅｔｏｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ）形成、アスパラギン酸塩異性化及びアスパラギン脱アミド化の変化を含む。カルボキシペプチダーゼの作用による高頻度の修飾は、カルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の損失をもたらした（Ｈａｒｒｉｓ，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９－１３４に記載されるように）。
【0109】
マウスモノクローナル抗体の産生のための代替的な方法は、モノクローナル抗体を含有する腹水の形成を促進するように処理された（例えば、プリスタン初回免疫（ｐｒｉｓｔａｎｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ））同種マウス、例えば、マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を注入することである。モノクローナル抗体は、様々な確立した技術によって単離及び精製され得る。このような単離技術としては、プロテイン－Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ａｔ ｐａｇｅｓ ２．７．１－２．７．１２ ａｎｄ ｐａｇｅｓ ２．９．１－２．９．３；及びＢａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ ７９－１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照）。モノクローナル抗体は、抗体の特定の特性（例えば、重鎖又は軽鎖アイソタイプ、結合特異性など）に基づいて選択される適切なリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。固体担体上に固定される好適なリガンドの例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖又は重鎖）抗体、抗イディオタイプ抗体、及びＴＧＦ－β結合タンパク質、又はそのフラグメント若しくは変異体が挙げられる。
【0110】
Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１－５６７に記載されるように、抗体結合部位の中心における相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化は、増加した親和性を有する抗体、例えば、ｃ－ｅｒｂＢ－２に対する増加した親和性を有する抗体を単離するのに使用されている。したがって、このような技術は、ヒトエンドセリン受容体に対する抗体を調製するのに有用である。ヒトエンドセリン受容体に対する抗体が、例えば、インビトロ又はインビボのいずれかで、エンドセリン受容体の存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。
【0111】
抗体はまた、従来の技術のいずれかによって調製され得る。例えば、これらの抗体は、それらを天然で発現する細胞から精製され得るか（例えば、抗体は、それを産生するハイブリドーマから精製され得る）又は当該技術分野において公知の任意の技術を用いて組み換え発現系において産生され得る。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，（１９８０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）を参照されたい。これは、以下の核酸の節において説明されている。
【0112】
抗体は、任意の従来の技術によって、調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。いくつかの技術は、関連する抗体（例えば、抗エンドセリン受容体抗体）のポリペプチド鎖（又はその部分）をコードする核酸の単離及び組み換えＤＮＡ技術による核酸の操作に関連する。核酸は、別の関連する核酸と融合されるか、又は１つ又は複数のアミノ酸残基を付加、削除又は置換するように（例えば、誘発突然変異又は他の従来の技術によって）修飾され得る。
【0113】
上述されるＣＤＲの１つ又は複数を含有する本発明に係る抗体の親和性を向上させることが必要とされる場合、ＣＤＲの維持（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２－４０３）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５０－３６８）、ＤＮＡ再構成（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４－７３３）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７－８８）及びさらなるＰＣＲ技術（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８－２９１）を含む、いくつかの親和性成熟プロトコルが使用され得る。これらの親和性成熟方法の全ては、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５－５３９に記載されている。
【0114】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、抗エンドセリン受容体フラグメントである。フラグメントは、全体的に抗体由来配列からなり得、又はさらなる配列を含有し得る。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及びドメイン抗体が挙げられる。他の例が、Ｌｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００－０６において提供されている。
【0115】
一本鎖抗体は、単一ポリペプチド鎖を生じるように、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）によって重鎖及び軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントを連結することによって形成され得る。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬ及びＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードする融合ＤＮＡによって調製されている。得られるポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合モノマーを形成し得るか、又はそれらは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに応じて、ポリマー（例えば、二量体、三量体、又は四量体）を形成し得る（Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；及びＫｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５－１０８）。様々なＶＬ及びＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることによって、様々な表現型に結合するポリマーｓｃＦｖが形成され得る（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１－４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、
米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４６；ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９－８７に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖを含む、本明細書に記載される抗体に由来する一本鎖抗体が、本明細書の範囲に包含される。
米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４－５４６；ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９－８７に記載されるものが挙げられる。限定はされないが、可変ドメイン組合せＬ１Ｈ１を含むｓｃＦｖを含む、本明細書に記載される抗体に由来する一本鎖抗体が、本明細書の範囲に包含される。
【0116】
抗体に由来する抗原結合フラグメントはまた、従来の方法にしたがって、抗体のタンパク質分解的加水分解、例えば、インタクトな抗体のペプシン又はパパイン消化によって得られる。例として、抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれるＳＳフラグメントを生じる、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって、生成され得る。このフラグメントは、スルフヒドリル還元剤を用いてさらに切断されて、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントを生じ得る。任意のスキームは、スルフヒドリル保護基との切断反応を行って、ジスルフィド結合の切断を得ることであり；さらに、パパインを用いた酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇらの米国特許第４，３３１，６４７号明細書、Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １：４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）；及びＡｎｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｔｉｔｕｓ，Ｊ．Ａ．ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ）），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００３），ｐａｇｅｓ ２．８．１－２．８．１０ ａｎｄ ２．１０Ａ．１－２．１０Ａ．５によって記載されている。重鎖を調製して一価重鎖及び軽鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するなどの、抗体を切断するための他の方法、フラグメントの他の切断、又は他の酵素的、化学的、又は遺伝子学的技術も、フラグメントがインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用され得る。
【0117】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むペプチドである。ＣＤＲは、関連するＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、鋳型として抗体産生細胞のｍＲＮＡを用いて可変領域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いることによって調製され得る（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ－Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５を参照）。抗体フラグメントは、本明細書に記載される抗体の少なくとも１つの可変ドメインをさらに含み得る。したがって、例えば、Ｖ領域ドメインは、モノマー及びＶＨ又はＶＬドメインであり得、これは、独立して、後述されるように少なくとも１×１０－７Ｍ以下の又は親和性でエンドセリン受容体に結合し得る。
【0118】
可変領域ドメインは、任意の天然可変ドメイン又はその遺伝子学的に操作された形態であり得る。遺伝子学的に操作された形態とは、組み換えＤＮＡ操作技術により生成された可変領域ドメインを意味する。このような遺伝子学的に操作された形態は、例えば、特定の抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失、又は変化によって、特定の抗体可変領域から生成されるものを含む。具体的な例は、１つの抗体からの唯一のＣＤＲ及び任意選択的に１つ又は複数のフレームワークアミノ酸を含有する遺伝子学的に操作された可変領域ドメイン、及び別の抗体からの可変領域ドメインの残りの部分を含む。
【0119】
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも１つの他の抗体ドメイン又はそのフラグメントに共有結合され得る。したがって、例えば、可変領域ドメイン中に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメイン又はそのフラグメントに連結され得る。このように、例えば、抗体は、Ｆａｂフラグメントであり得、ここで、抗原結合ドメインは、そのＣ末端において、それぞれＣＨ１及びＣκドメインに共有結合的に連結される組み合わせたＶＨ及びＶＬドメインを含有する。ＣＨ１ドメインは、さらなるアミノ酸で拡張されて、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに見られるようなヒンジ領域又はヒンジ領域ドメインの部分を生じるか、又は抗体ＣＨ２及びＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを生じ得る。
【0120】
抗体の誘導体及び変異体
アミノ酸配列Ａ－１をコードするヌクレオチド配列Ｌ１及びＨ１が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド誘導性部位特異的突然変異誘発）によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４２：１３３；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ ３７：７３；Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２－１９；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；並びに米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び米国特許第４，７３７，４６２号明細書に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、エンドセリン受容体に対する親和性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）若しくは特異性の向上、インビボ若しくはインビトロ活性又は安定性の向上、又は生体内副作用の減少を有する、例えば、抗エンドセリン受容体抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
アミノ酸配列Ａ－１をコードするヌクレオチド配列Ｌ１及びＨ１が、例えば、ランダム突然変異誘発によって又は部位特異的突然変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチド誘導性部位特異的突然変異誘発）によって改変されて、非突然変異ポリヌクレオチドと比較して、１つ又は複数の特定のヌクレオチド置換、欠失、又は挿入を含む改変ポリヌクレオチドを生成し得る。このような改変を行うための技術の例が、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４２：１３３；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ ３７：７３；Ｃｒａｉｋ，１９８５，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３：１２－１９；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；並びに米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び米国特許第４，７３７，４６２号明細書に記載されている。これらの及び他の方法が、非誘導体化抗体と比較して、所望の特性、例えば、エンドセリン受容体に対する親和性、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）若しくは特異性の向上、インビボ若しくはインビトロ活性又は安定性の向上、又は生体内副作用の減少を有する、例えば、抗エンドセリン受容体抗体の誘導体を作製するのに使用され得る。
【0121】
当該技術分野における抗エンドセリン受容体抗体の他の誘導体は、他のタンパク質又はポリペプチドとともに、例えば、抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合された異種ポリペプチドを含む組み換え融合タンパク質の発現によって、抗エンドセリン受容体抗体又はそのフラグメントの共有結合的又は凝集性コンジュゲートを含む。例えば、共役ペプチドは、異種シグナル（又はリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母α－因子リーダーペプチド又はエピトープタグペプチドであり得る。融合タンパク質を含有する抗体は、抗体（例えば、ポリ－Ｈｉｓ）の精製又は同定を促進するために加えられるペプチドを含み得る。抗体はまた、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、及び米国特許第５，０１１，９１２号明細書に記載されるように、ＦＬＡＧペプチドに連結され得る。ＦＬＡＧペプチドは、高度に抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組み換えタンパク質の迅速なアッセイ及び容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合された融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。別の実施形態において、１つ又は複数の抗体を含有するオリゴマーが、エンドセリン受容体拮抗薬又はより高次のオリゴマーとして用いられ得る。オリゴマーは、共有結合的に連結された又は非共有結合的に連結された二量体、三量体、又はより高次のオリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗体を含むオリゴマーの使用が想定され、一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【0122】
一実施形態は、抗体に融合されたペプチド部分間の共有結合的又は非共有相互作用を介して結合された複数の抗体を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサ）、又はオリゴマー形成を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパー及び抗体に由来する特定のポリペプチドは、以下により詳細に記載されるように、抗体のオリゴマー形成を促進し得るペプチドである。
【0123】
特定の実施形態において、オリゴマーは、２～４つの抗体を含む。オリゴマーの抗体は、上述される形態のいずれか、例えば、変異体又はフラグメントなどの任意の形態であり得る。好ましくは、オリゴマーは、エンドセリン受容体を有する抗体を含む。
【0124】
一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを用いて調製される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製が、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１に記載されている。本明細書における一実施形態は、抗エンドセリン受容体抗体のエンドセリン結合フラグメントを、抗体のＦｃ領域に融合することによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に関する。二量体は、以下の方法で調製され得る：例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を、適切な発現ベクターに挿入し、組み換え発現ベクターを用いて形質転換された融合遺伝子を発現させ、発現された融合タンパク質によく似た抗体分子を組み立てさせることによって作製され得、その直後に、Ｆｃ部分間の鎖間ジスルフィド結合が、二量体を形成する。
【0125】
本明細書において使用される際の「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来する天然タンパク質及び突然変異タンパク質の形態のポリペプチドを含む。二量化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分（及びそれから形成されたオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム上でのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製の利点を提供する。
【0126】
ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号パンフレット（参照により本明細書に援用される）に記載される好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からＦｃ領域の天然Ｃ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号明細書及びＢａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２－４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化されており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化されており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化されていることを除いて、国際公開第９３／１０１５１号パンフレットに示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する低下した親和性を示す。他の実施形態において、抗エンドセリン受容体抗体の重鎖及び／又は軽鎖は、その重鎖及び／又は軽鎖の可変部分と置換され得る。
【0127】
或いは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサペプチド）を伴うか又は伴わずに複数の抗体を含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び米国特許第４，９３５，２３３号明細書に記載されるものがある。
【0128】
オリゴマー抗体を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、その後、様々な異なるタンパク質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量化又は三量化し得る天然ペプチド又はその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例が、ＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号パンフレットに記載され、肺表面活性剤タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１（参照により本明細書に援用される）に記載される。それに融合された異種タンパク質の安定した三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７－７８に記載される。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗エンドセリン受容体抗体フラグメント又はその誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞において発現され、可溶性オリゴマー抗エンドセリン受容体抗体フラグメント又はその誘導体が、培養上清から回収される。
【0129】
別の実施形態において、抗体誘導体は、本明細書に開示されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。例えば、１つ又は複数のＣＤＲは、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）に組み込まれるか、又はその半減期を増加させるために好適なビヒクルに共役され得る。好適なビヒクルとしては、限定はされないが、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリンなどが挙げられる。これらの及び他の好適なビヒクルは、当該技術分野において公知である。このようなＣＤＲ共役ペプチドは、モノマー、二量体、四量体、又は他の形態であり得る。一実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーが、１つ又は複数の特定の位置で、例えば、結合剤のアミノ末端で結合される。一例において、抗体誘導体は、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、又はポリプロピレングリコールを含む、１つ又は複数の水溶性ポリマー結合を含む。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号明細書、米国特許第４，４９６，６８９号明細書、米国特許第４，３０１，１４４号明細書、米国特許第４，６７０，４１７号明細書、米国特許第４，７９１，１９２号明細書、及び米国特許第４，１７９，３３７号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、誘導体は、モノメトキシ－ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ－（Ｎ－ビニルピロリドン）－ポリエチレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール、並びにこのようなポリマーの混合物のうちの１つ又は複数を含む。ある実施形態において、１つ又は複数の水溶性ポリマーは、１つ又は複数の側鎖にランダムに結合される。ある実施形態において、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療効果を向上させるように働き得る。いくつかのこのような方法が、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される米国特許第６，１３３，４２６号明細書に記載されている。
【0130】
抗体が結合特異性を保持する限り、本明細書に記載される抗体が、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得ることが理解されよう。したがって、抗体構造への修飾が、本明細書に記載される範囲内に包含される。これらの修飾は、抗体のエンドセリン受容体結合能を破壊しない、保存的又は非保存的であり得るアミノ酸置換を含み得る。保存的アミノ酸置換は、生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって典型的に組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらのアミノ酸残基は、アミノ酸部分のペプチド模倣薬及び他の逆又は反転形態を含む。保存的アミノ酸置換はまた、その位置においてアミノ酸残基の極性又は電荷に対する影響がほとんど又は全くないように、非天然残基による天然アミノ酸残基を置換することを含み得る。非保存的置換は、アミノ酸又はアミノ酸類似体のあるクラスのメンバーを、異なる物理的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、及び電荷）を有する別のクラスからのメンバーと交換することを含み得る。
【0131】
さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において１つのアミノ酸置換を含む、試験される変異体を生成し得る。変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。このような変異体は、好適な変異体についての情報を収集するのに使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないほど低下した、又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合、このような変化を有する変異体は、回避され得る。言い換えると、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独で又は他の突然変異と組み合わせて回避されるべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【0132】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。いくつかの実施形態において、当業者は、活性にとって重要でない領域を標的にすることによって、活性を破壊せずに変化され得る分子の好適な領域を特定し得る。ある実施形態において、類似のポリペプチドの中で、残基又は保存される分子の部分を特定することができる。ある実施形態において、生物学的活性又は構造にとって重要である領域でも、生物学的活性を破壊せずに、又はポリペプチド構造に悪影響を与えずに保存的アミノ酸置換に供され得る。さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である、類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造－機能試験を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測される重要なアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【0133】
当業者は、類似のポリペプチドにおける該当する構造に関連する三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアライメントを予測し得る。いくつかの実施形態において、当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基に根本的な変更を行わないことを選択してもよく、これは、このような残基が、他の分子との重要な相互作用に関与し得るためである。いくつかの科学出版物が、二次構造の予測をテーマにしている。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２－４２７；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２－２４５；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１－２２２；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５－１４８；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１－２７６及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７－３８４を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを支援するコンピュータプログラムが、現在入手可能である。例えば、３０％超の配列同一性、又は４０％超の類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、類似の高レベルの構造を有することが多い。タンパク質データバンク（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の折り畳みの潜在的な数を含む、二次構造の向上した予測可能性を提供した。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４－２４７を参照されたい。所与のポリペプチド又はタンパク質中に限られた数の折り畳みがあること、及び臨界数の構造が決定された後、構造予測が著しく正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９－３７６）。二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７－８７；及びＳｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５－１９）；「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４－１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６－１５９；及びＧｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８４：４３５５－４３５８、及び「進化学的関連性（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上記（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ、上記（１９９７）を参照）が挙げられる。ある実施形態において、抗体の変異体は、グリコシル化変異体を含み、ここで、グリコシル化部位の数及び／又はタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して改変されている。ある実施形態において、変異体は、天然タンパク質より多い又は少ない数のＮ－結合グリコシル化部位を含む。或いは、置換によるこのような配列の除去は、存在するＮ－結合炭水化物鎖を除去する。Ｎ－結合炭水化物鎖の再配列も提供され、ここで、１つ又は複数のＮ－結合炭水化物鎖部位（典型的に、天然に存在するもの）が削除され、１つ又は複数の新しいＮ－結合部位が生成される。さらなる好ましい抗体変異体は、システイン変異体を含み、ここで、１つ又は複数のシステイン残基は、親アミノ酸配列と比較して、欠失されるか、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換される。システイン変異体は、抗体が、（例えば、可溶性封入体の単離の後）生物学的に活性な立体配座に再度折り畳まれなければならない場合に有用であり得る。システイン変異体は、一般に、天然タンパク質より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数のシステインを有する。
【0134】
（保存的か又は非保存的かにかかわらず）所望のアミノ酸置換が、このような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。ある実施形態において、アミノ酸置換は、ヒトエンドセリン受容体抗体の重要な残基を同定するため、又は本明細書に記載されるヒトエンドセリン受容体抗体の親和性を増大若しくは低下させるために使用され得る。ある実施形態によれば、好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を改変し、（４）結合親和性を改変し、及び／又は（４）このようなポリペプチドにおける他の物理化学的又は機能的特性を与えるか又は調節するものである。ある実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（ある実施形態において、保存的アミノ酸置換）は、天然配列中で行われ得る（ある実施形態において、分子間接触を形成するドメインの外部のポリペプチドの部分において）。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的に、親配列の構造的特徴を実質的に変更することができない（例えば、アミノ酸の置換は、親配列に存在するヘリックスを破壊すべきでなく、又は親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造に干渉するべきではない）。当該技術分野において認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，（１９８４）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌ ａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９１）；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５に記載され、これらのそれぞれが、参照により本明細書に援用される。
【0135】
ある実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ポリマー、脂質、又は他の部分と化学結合され得る。抗原－結合剤は、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれる本明細書に記載されるＣＤＲの少なくとも１つを含み得る。一例において、生体適合性フレームワーク構造は、局在化した表面領域における抗原（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）に結合する１つ又は複数のアミノ酸配列を提示することができる、立体配座的に安定した構造的支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその部分を含む。このような構造は、天然ポリペプチド又はポリペプチド「折り畳み」（構造モチーフ）であり得るか、又は天然ポリペプチド又は折り畳みと比べて、アミノ酸の付加、欠失又は置換などの１つ又は複数の修飾を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、細菌又はウイルスなどの任意の種の（又は２つ以上の種の）ポリペプチドに由来し得る。典型的に、生体適合性フレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質足場又は骨格に基づいている。例として、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルジノスタチン、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガータンパク質、ＰＳＴ１、コイルドコイルタンパク質、ＬＡＣＩ－Ｄ１、Ｚドメイン及びテンダミスタットドメインに基づくそれらのタンパク質足場が使用され得る（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎ，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：４６３－４６９を参照）。
【0136】
さらに、当業者は、好適な結合剤が、本明細書に具体的に開示される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のうちの１つ又は複数などの、これらの抗体の部分を含むことを認識するであろう。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域の少なくとも１つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持する限り、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、結合剤は、ヒトＥＴＡに対する本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び／又は受容体を介したエンドセリンシグナル伝達の活性を阻害する。抗体の非ＣＤＲ部分は、非タンパク分子であり得、ここで、抗体は、競合結合アッセイにおいて、ヒトＥＴＡペプチドへの抗体Ａ－１／Ａ－２の少なくとも１つのものと類似の結合タイプを示し、及び／又はエンドセリンの活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え結合タンパク質又は合成ペプチドであり、組み換え結合タンパク質は、ヒトＥＴＡへの本明細書に開示される抗体の結合をクロスブロックし、及び／又はインビトロ又はインビボでエンドセリン活性を中和する。抗体の非ＣＤＲ部分は、アミノ酸から構成され得、ここで、抗体は、組み換え抗体であり、組み換え抗体は、競合結合アッセイにおいて、ヒトＥＴＡペプチドへの抗体Ａ－１／Ａ－２の少なくとも１つのものと類似の結合タイプを示し、及び／又はエンドセリンシグナル伝達を中和する。
【0137】
核酸
一態様において、単離核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、例えば、抗体の全て又は部分、例えば、本明細書に記載される抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド；ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマー；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及びそれらの相補配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び／又は１つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び／又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド、及びその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
一態様において、単離核酸分子が、本明細書において提供される。核酸分子は、例えば、抗体の全て又は部分、例えば、本明細書に記載される抗体、又はそのフラグメント、誘導体、突然変異タンパク質、若しくは変異体の一方又は両方の鎖をコードするポリヌクレオチド；ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分なポリヌクレオチド；ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、分析し、突然変異させ、又は増幅するためのＰＣＲプライマー又はシーケンシングプライマー；ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、及びそれらの相補配列を含む。核酸は、任意の長さであり得る。核酸は、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００又はそれ以上のヌクレオチド長であり得、及び／又は１つ又は複数のさらなる配列、例えば、制御配列を含み得、及び／又はより大きい核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡヌクレオチド、及びその人工変異体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。
【0138】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖又は軽鎖、可変ドメインのみ、又は完全長）をコードする核酸は、ＥＴＡ抗原で免疫付与されたマウスのＢ細胞から単離され得る。核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来の方法によって単離され得る。
【0139】
重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸配列が上に示される。当業者は、遺伝暗号の縮重により、本明細書に開示されるポリペプチド配列のそれぞれが、多数の他の核酸配列によってコードされ得ることを理解するであろう。本明細書に記載される抗体をコードする各縮重ヌクレオチド配列を本明細書において提供する。
【0140】
特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、Ａ－１／Ａ－２のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸）にハイブリダイズする核酸を本明細書においてさらに提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６を参照されたい。本明細書において定義されるように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％のホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予洗（ｐｒｅｗａｓｈｉｎｇ）溶液、５５℃のハイブリダイゼーション温度（又は４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％のホルムアミドを含有する溶液などの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、及び０．５×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中で６０℃の溶離条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、続いて、６８℃で０．１×ＳＳＣ及び０．２％のＳＤＳで１回以上洗浄する。さらに、当業者は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％類似であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的に、互いにハイブリダイズされたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大又は低下させるように、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を操作することができる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的パラメータ及び好適な条件を考案するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ １９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｈａｐｔｅｒｓ ９ ａｎｄ １１；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ ２．１０ ａｎｄ ６．３－６．４に記載されており、例えば、ＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。変化が、突然変異によって、核酸に導入され得、それによって、それがコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列の変化をもたらす。突然変異が、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて導入され得る。一実施形態において、１つ又は複数の特定のアミノ酸残基が、例えば、部位特異的突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。別の実施形態において、１つ又は複数のランダムに選択された残基が、例えば、ランダム突然変異誘発プロトコルを用いて変化される。それがいかに作製されても、突然変異体ポリペプチドは、発現され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。
【0141】
突然変異が、それがコードするポリペプチドの生物学的活性をそれほど変更せずに、核酸に導入され得る。例えば、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が行われ得る。一実施形態において、Ｌ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２について本明細書において提供されるヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、変異体、若しくは誘導体は、それがコードするアミノ酸配列が、本明細書に示されるＬ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２によってコードされるものと比較して、２つ以上の異なる残基を有する配列を生じるように、アミノ酸残基の１つ又は複数の欠失又は置換を含むように突然変異される。別の実施形態において、突然変異誘発は、２つ以上の異なる残基を有する配列を生じるように、本明細書に示されるＬ－１～Ｌ－２及びＨ－１～Ｈ－２の１つ又は複数のアミノ酸残基に隣接するアミノ酸を挿入する。或いは、１つ又は複数の突然変異が、核酸に導入され得、それがコードするポリペプチドの生物学的活性（例えば、ＥＴＡへの結合）を選択的に変化させる。例えば、突然変異が、生物学的活性を定量的に又は定性的に変化させ得る。定量的変化の例は、活性を増大させ、低下させ、又はなくすことを含む。定性的変化の例は、抗体の抗原特異性を変化させることを含む。
【0142】
別の態様において、本明細書における核酸配列の検出のためのプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子が、本明細書において提供される。本明細書における核酸分子は、本明細書における完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得るフラグメント又は本明細書におけるポリペプチドの活性部分（例えば、ＥＴＡ結合部分）をコードするフラグメントを含み得る。本明細書における核酸配列に基づくプローブを用いて、核酸又は類似の核酸、例えば、本明細書におけるポリペプチドをコードする転写産物を検出することができる。プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子を含み得る。このようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現する細胞を同定することができる。
【0143】
別の態様において、本明細書におけるポリペプチド又はその一部をコードする核酸を含むベクターが、本明細書において提供される。ベクターの例としては、限定はされないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター及び発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターが挙げられる。本明細書における組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本明細書における核酸を含み得る。組み換え発現ベクターは、予め発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいてスクリーニングされる１つ又は複数の制御配列を含む。制御配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモータ及びサイトメガロウイルスプロモータ）、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的制御配列、Ｖｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、及びＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７を参照、これらのそれぞれの開示内容は、全体が参照により本明細書に援用される）、及び特定の処理又は条件に応答して、ヌクレオチド配列の誘導性発現を指令するもの（例えば、哺乳類細胞におけるメタロチオネインプロモータ、及び原核生物細胞系及び真核生物細胞系の両方におけるｔｅｔ－応答性及び／又はストレプトマイシン応答性プロモータ（上記参照）を含む。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、及び所望のタンパク質の発現のレベルなどの要因に左右され得ることが、当業者によって理解されるべきである。本明細書における発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生し得る。
【0144】
別の態様において、発現ベクターが導入され得る宿主細胞を本明細書で提供する。宿主細胞は、任意の原核生物又は真核生物細胞であり得る。原核生物宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバシラス属（ｂａｃｉｌｌｉ）を含む。より高等な真核細胞は、昆虫細胞、酵母細胞、及び哺乳動物由来の樹立細胞系を含む。好適な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのそれらの誘導体及び無血清培地中で増殖する関連する細胞系（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照）又はＤＨＦＲが欠乏したＣＨＯ株ＤＸＢ－１１（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９８０，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７７：４２１６－２０を参照）を含む。さらなるＣＨＯ細胞系は、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ－１８６１）、及びＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ－１８６２）を含む。さらなる宿主細胞は、サル腎臓ＣＯＳ－７細胞系（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ－１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ－１６３）、ＡＭ－１／Ｄ細胞（米国特許第６，２１０，９２４号明細書に記載される）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ－１０）細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ－７０）（ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照）、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３などのヒト胚腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣ０１０２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、正常な２倍体細胞、初代組織、初代移植のインビトロ培養物に由来する細胞株、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞を含む。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主とともに使用するための適切なクローニング及び発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）によって記載されている。
【0145】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって、原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが、外来性ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの成分を同定し、スクリーニングするために、（例えば、抗生物質に対する耐性のために）選択可能なマーカーをコードする遺伝子が、一般に、該当する遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与えるものを含む。導入された核酸が安定にトランスフェクトされた細胞が、他の方法の中でも特に、薬剤スクリーニングによって同定され得る（例えば、選択可能な遺伝子を組み込んだ細胞は、生存するであろうが、他の細胞は死亡する）。
【0146】
形質転換された細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得、ポリペプチドは、従来のタンパク質精製方法によって回収され得る。１つのこのような精製方法が、以下の実施例に記載されている。本明細書において使用することが想定されたポリペプチドは、汚染性内因性物質を実質的に含まない実質的に均一な組み換え哺乳動物抗エンドセリン受容体抗体ポリペプチドを含む。
【0147】
抗体の活性
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、エンドセリン受容体に特異的に結合し、シグナル伝達を阻害し、治療的生物学的効果、例えば、動物モデルにおける肺動脈高血圧症の軽減を示す。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合し得るマウス抗体又はヒト化抗体である。このような抗体は、エンドセリンシグナル伝達を低減又は中和し得る拮抗又は中和抗体を含む。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、エンドセリン受容体に特異的に結合し、シグナル伝達を阻害し、治療的生物学的効果、例えば、動物モデルにおける肺動脈高血圧症の軽減を示す。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合し得るマウス抗体又はヒト化抗体である。このような抗体は、エンドセリンシグナル伝達を低減又は中和し得る拮抗又は中和抗体を含む。
【0148】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、約０．０１ｎＭ～１０００ｎＭ、０．１ｎＭ～５００ｎＭ、０．５ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭのＫｄ値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、約１ｎＭ～２００ｎＭのＫｄ値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、約１０ｎＭ～１００ｎＭのＫｄ値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭのＫｄ値を有する。
【0149】
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリンシグナル伝達を低減する際に、約０．０１ｎＭ～５００ｎＭ、０．１ｎＭ～２００ｎＭ、０．５ｎＭ～２００ｎＭ、１ｎＭ～２００ｎＭ、又は１０ｎＭ～１００ｎＭのＩＣ５０値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリンシグナル伝達を低減する際に、約１ｎＭ～２００ｎＭのＩＣ５０値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリンシグナル伝達を低減する際に、約１０ｎＭ～１００ｎＭのＩＣ５０値を有する。別の実施形態において、本明細書に記載される抗体は、ヒトエンドセリンシグナル伝達を低減する際に、約１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、又は１００ｎＭのＩＣ５０値を有する。
【0150】
一実施形態において、ＥＴＡ抗体は、１つ又は複数の以下の特性を有する：
ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なＫｄを提供すること；
ｂ．エンドセリンによるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡの活性化を阻害する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照抗体との結合に交差競合すること。
ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なＫｄを提供すること；
ｂ．エンドセリンによるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡの活性化を阻害する際に、参照抗体と同じか又はそれより良好なＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照抗体との結合に交差競合すること。
【0151】
別の実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、以下の特性の１つ又は複数を有する抗体である：
ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＫｄを提供すること；
ｂ．エンドセリンによるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡの活性化を阻害する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照ＥＴＡ抗体との結合に交差競合すること。
ａ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに結合する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＫｄを提供すること；
ｂ．エンドセリンによるヒトエンドセリン受容体ＥＴＡの活性化を阻害する際に、参照ＥＴＡ抗体と同じか又はそれより良好なＩＣ５０を提供すること；及び
ｃ．ヒトエンドセリン受容体ＥＴＡに対する参照ＥＴＡ抗体との結合に交差競合すること。
【0152】
一態様において、参照抗体は、軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１３８及び重鎖可変ドメインアミノ酸配列の配列番号１６６の組合せを含む。別の態様において、参照抗体は、モノクローナル抗体Ａ－１、Ａ－２、Ａ－７、Ａ－９、又はＡ－１２である。本明細書において、「実質的に同様」という用語は、本明細書に記載される抗体のＩＣ５０又はＫｄ値が、参照抗体のものと同等であるか、又は参照抗体のものと約２００％、１８０％、１６０％、１５０％、１４０％、１２０％、１１０％、１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、又は５０％であることを意味する。一実施形態において、参照抗体は、例えば、重鎖及び軽鎖組合せＬ１Ｈ１又はＬ２Ｈ２を有する抗体を含む。別の実施形態において、参照抗体は、ＥＴＡ抗体Ａ－１を含む。一実施形態において、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体は、ヒトエンドセリン受容体に特異的に結合し得、動物モデルにおいて肺動脈高血圧症を軽減し得る。一実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して２％軽減される。別の実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して約５％軽減される。別の実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して約１０％軽減される。別の実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して約１５％軽減される。別の実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して約２０％軽減される。別の実施形態において、肺動脈高血圧症は、非処置動物と比較して約２５％軽減される。肺動脈高血圧症の軽減の量は、用量によって制御される。動物又はヒト患者のための、治療的に有効な用量は、肺動脈高血圧症を正常範囲に低下させる用量である。
【0153】
ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ
一実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、ＴＧＦ－βの機能を阻止し得るタンパク質である。別の実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、アミノ酸配列：配列番号２０７を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ酸配列は、配列番号２０７である。
一実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、ＴＧＦ－βの機能を阻止し得るタンパク質である。別の実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐは、アミノ酸配列：配列番号２０７を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ酸配列は、配列番号２０７である。
【0154】
ペプチドリンカー（リンカー）
一実施形態において、本明細書に記載されるペプチドリンカー（リンカー）は、以下：配列番号２０８、配列番号２０９、及び配列番号２１０のうちの１つからそれぞれ独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本明細書に記載されるペプチドリンカー（リンカー）は、以下：配列番号２０８、配列番号２０９、及び配列番号２１０のうちの１つからそれぞれ独立して選択されるアミノ酸配列を含む。
【0155】
一実施形態において、本明細書に記載されるペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号２０８である。別の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号２０９である。別の実施形態において、本明細書に記載されるペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号２１０である。
【0156】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを含む。
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを含む。
【0157】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体、１、２、３、４、５、６、７又は８つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び同数のペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結し、又は融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。
【0158】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体、１、２、３又は４つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び同数のペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結し、又は融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。
【0159】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体、１又は２つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び同数のペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結し、又は融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。
【0160】
別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体、２つのＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及び２つのペプチドリンカー（リンカー）を含み；融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結し、又は融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。
【0161】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の軽鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端を、ＥＴＡ抗体の重鎖のカルボキシル末端と、ペプチドリンカー配列を介して連結する。
【0162】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、アミノ酸配列：配列番号１６２、配列番号１９０、配列番号２０７、及び配列番号２１０を含む。
【0163】
一実施形態において、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質が、本明細書において提供され、ここで、ＥＴＡ抗体、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びペプチドリンカー配列が、以下の方法：
（３）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端が、ＥＴＡ抗体の重鎖／軽鎖のカルボキシル末端と連結される：Ｎ’－Ｒ－リンカー－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－Ｃ’；及び
（４）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端が、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と連結される：Ｎ’－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－リンカー－Ｒ－Ｃ’
のうちの１つで、融合されて、融合タンパク質を形成し；
ここで、Ｎ’が、ポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを表し、Ｒが、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す。
（３）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのアミノ末端が、ＥＴＡ抗体の重鎖／軽鎖のカルボキシル末端と連結される：Ｎ’－Ｒ－リンカー－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－Ｃ’；及び
（４）ペプチドリンカー配列を介して、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐのカルボキシル末端が、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ末端と連結される：Ｎ’－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ－リンカー－Ｒ－Ｃ’
のうちの１つで、融合されて、融合タンパク質を形成し；
ここで、Ｎ’が、ポリペプチド鎖のアミノ末端を表し、Ｃ’が、ポリペプチド鎖のカルボキシル末端を表し、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐが、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐフラグメントを表し、Ｒが、ＥＴＡ抗体の軽鎖又は重鎖のアミノ酸配列であり、リンカーが、ペプチドリンカーを表す。
【0164】
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、アミノ酸配列：配列番号２１１又は配列番号２１２を含む。別の実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、アミノ酸配列：配列番号２１１及び配列番号２１２を含む。
【0165】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の生物学的活性
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の生物学的活性は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの生物学的活性及びＥＴＡ抗体の生物学的活性を含む。ＥＴＡの抗体阻害剤は、エンドセリンによって引き起こされる血管圧の上昇を有効に阻止して、肺動脈高血圧症の症状を軽減し、患者の運動能力及び血行動態を改善し得る。「ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの生物学的活性」は、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質がＴＧＦ－βにインビボで結合し、それによって引き起こされる細胞ストレス反応を阻止し、肺動脈高血圧症、肺高血圧症及び肺線維症の他の関連する症状などに対する治療効果の生物学的活性を示すことを意味する。上記の細胞ストレス反応としては、限定はされないが、肺動脈圧の低下、大動脈圧の低下、及び心血管及び肺血管リモデリングの関連する変化が挙げられる。ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びＥＴＡ抗体の生物学的活性を組み合わせることにより、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質を用いて、ＴＧＦ－β及びＥＴＡに関連する様々な病態及び疾患を処置することができる。融合タンパク質は、ＴＧＦ－β及び／又はＥＴＡに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質を用いて、「ＴＧＦ－β刺激の低減」又は「ＥＴＡ刺激の低減」に好都合に反応する病態及び疾患を有する被験体を処置することができる。これらの被験体は、「ＴＧＦ－β刺激を低減する必要がある」又は「ＥＴＡ刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれる。肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症及び心血管線維症の他の関連する症状が含まれる。
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の生物学的活性は、ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの生物学的活性及びＥＴＡ抗体の生物学的活性を含む。ＥＴＡの抗体阻害剤は、エンドセリンによって引き起こされる血管圧の上昇を有効に阻止して、肺動脈高血圧症の症状を軽減し、患者の運動能力及び血行動態を改善し得る。「ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの生物学的活性」は、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質がＴＧＦ－βにインビボで結合し、それによって引き起こされる細胞ストレス反応を阻止し、肺動脈高血圧症、肺高血圧症及び肺線維症の他の関連する症状などに対する治療効果の生物学的活性を示すことを意味する。上記の細胞ストレス反応としては、限定はされないが、肺動脈圧の低下、大動脈圧の低下、及び心血管及び肺血管リモデリングの関連する変化が挙げられる。ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ及びＥＴＡ抗体の生物学的活性を組み合わせることにより、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質を用いて、ＴＧＦ－β及びＥＴＡに関連する様々な病態及び疾患を処置することができる。融合タンパク質は、ＴＧＦ－β及び／又はＥＴＡに作用することによってその生物学的効果を発揮するため、本明細書に記載されるＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質を用いて、「ＴＧＦ－β刺激の低減」又は「ＥＴＡ刺激の低減」に好都合に反応する病態及び疾患を有する被験体を処置することができる。これらの被験体は、「ＴＧＦ－β刺激を低減する必要がある」又は「ＥＴＡ刺激を低減する必要がある」被験体と呼ばれる。肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症及び心血管線維症の他の関連する症状が含まれる。
【0166】
一実施形態において、ＥＴＡ抗体又はＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の生物学的活性の変化は、ＥＴＡを阻害し、ＴＧＦ－βをインビトロで阻止するＥＴＡ抗体又はＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の機能を定量するために、カルシウム流試験及びレポーター遺伝子検出方法によって検出される。
【0167】
医薬組成物
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
一実施形態において、本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質と、１つ又は複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
【0168】
一実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、静脈内に又は皮下に注射される。
【0169】
処置方法
一実施形態において、肺動脈高血圧症及び肺動脈高血圧症関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
一実施形態において、肺動脈高血圧症及び肺動脈高血圧症関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0170】
別の実施形態において、肺高血圧症及び肺高血圧症関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0171】
別の実施形態において、肺線維症及び肺線維症関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0172】
別の実施形態において、心血管線維症及び心血管線維症関連疾患を処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0173】
さらなる実施形態において、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症又は心血管線維症のうちの２つ以上の疾患を同時に処置、予防又は改善するための薬剤の調製における、本明細書に記載されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の使用が、本明細書において提供される。
【0174】
本明細書において、「被験体」という用語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、「患者」という用語と同義的に使用される。
【0175】
「処置」という用語は、疾患の少なくとも１つの症状又は他の側面の軽減、又は疾患重症度の軽減を含む。本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、有効な治療剤であるために、完治を提供し、又は疾患の全ての症状又は兆候を根絶する必要はない。関連分野において認識されるように、治療剤としての薬剤を用いて、所与の病態の重症度を低下させ得るが、有効な治療剤と見なされるために、疾患の全ての兆候をなくす必要はない。同様に、予防的投与処置は、有効な予防薬であるために、症状の発生を予防するのに完全に有効である必要はない。疾患の影響を低減すること（例えば、その症状の数若しくは重症度を低減することによって、又は別の治療効果を増加させることによって、又は別の有効な効果を生じることによって）、又は疾患が被験体において発生又は悪化する可能性を低下させることで十分である。本明細書における一実施形態は、特定の疾患の重症度を反映する指標のベースラインレベルを超える持続的改善を誘発するのに十分な量及び時間でＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を患者に投与することを含む方法に関する。
【0176】
ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の医薬組成物は、限定はされないが、非経口、局所又は吸入による投与を含む任意の好適な技術によって投与され得る。注入される場合、医薬組成物は、例えば、関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内又は皮下経路によって、急速注入又は持続注入として投与され得る。例えば、経皮投与及び埋め込み型製剤（ｉｍｐｌａｎｔ）の持続放出投与などの疾患又は損傷部位における局部的な投与が考えられる。吸入による投与としては、例えば、経鼻又は経口吸入、スプレー、エアロゾル形態の抗体の吸入などが挙げられる。他の代替例としては、錠剤、シロップ又はトローチ剤を含む経口製剤が挙げられる。
【0177】
生理学的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤などの１つ又は複数の他の成分を含む組成物の形態で本明細書において提供されるＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を投与することが有利である。組成物は、任意に、後述される１つ又は複数の生理学的に活性な薬剤をさらに含み得る。様々な特定の実施形態において、組成物は、本明細書において提供される抗体（マウス抗体又はヒト化抗体など）及びＴＧＦ－βの１つ又は複数の融合タンパク質以外の１、２、３、４、５又は６つの生理学的に活性な薬剤を含む。
【0178】
一実施形態において、医薬組成物は、本明細書において提供されるマウス抗体又はヒト化抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質、及び以下のものから選択される１つ又は複数の物質：抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質に好適なｐＨを有する緩衝液、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（１０個未満のアミノ酸を含むポリペプチドなど）、タンパク質、アミノ酸、デキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどの複合剤、グルタチオン、安定剤及び賦形剤を含む。適切な業界標準にしたがって、防腐剤も加えられ得る。組成物は、希釈剤として好適な賦形剤溶液を用いて、凍結乾燥粉末へと製剤化され得る。適切な成分は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無害である。医薬製剤に用いられ得る成分のさらなる例が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８０）ａｎｄ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００）に記載されている。Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙは、医師による使用のためのキットを提供し、キットは、本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの１つ又は複数の融合タンパク質、及びタグ又は本明細書に記載される疾患のいずれかを処置するための他の説明書を含む。一実施形態において、キットは、上記の組成物の形態で、１つ又は複数の管型瓶中の抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの１つ又は複数の融合タンパク質の滅菌製剤を含む。
【0179】
投与量及び投与の頻度は、以下の要因：投与経路、用いられる具体的な抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質、処置される疾患の性質及び重症度、症状が急性か慢性か、並びに患者の大きさ及び全身状態に応じて変化し得る。適切な用量は、当該技術分野において周知の方法、例えば、臨床試験における用量漸増試験によって決定され得る。
【0180】
本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、所定の期間にわたって一定の間隔で、例えば、１回又は数回投与され得る。特定の実施形態において、マウス抗体又はヒト化抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、少なくとも１ヶ月又はそれ以上の期間で１回、例えば、１、２、又は３ヶ月間にわたって、或いは無期限に投与される。慢性症状を処置するために、長期処置が、通常、最も有効である。しかしながら、急性症状を処置するために、例えば、１～６週間の短い期間にわたる投与で、十分である。一般に、ヒト抗体は、選択された兆候又は指標についてベースラインレベルを超える医学的に関連する改善が患者に見られるまで投与される。
【0181】
本明細書において提供される処置計画の一例は、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、肺線維症及び心血管線維症の症状を処置するために、適切な用量で、１週間又はそれ以上につき１回の、抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の皮下注入を含む。抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、所望の結果が得られるまで、例えば、患者の症状が治まるまで、週に１回又は月に１回投与され得る。処置は、必要に応じて再開してもよく、或いは、維持量が投与され得る。
【0182】
患者の肺動脈圧は、圧力の変化を検出するために、抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質による処置の前、その間、及び／又はその後にモニターされ得る。いくつかの疾患については、肺動脈圧の変化は、疾患の進行などの要因により変化し得る。肺動脈圧は、公知の技術を用いて決定され得る。
【0183】
本明細書において提供される方法及び組成物の特定の実施形態は、例えば、抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及び１つ又は複数のエンドセリンアンタゴニスト、本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの２つ以上の融合タンパク質、又は本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及び１つ又は複数の他のエンドセリンアンタゴニストの使用を含む。さらなる実施形態において、本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は、単独で、患者が罹患している症状を処置するための他の薬剤と組み合わせて投与される。これらの薬剤の例は、タンパク質及び非タンパク質薬剤を含む。複数の薬剤が組み合わせて投与される場合、その投与量は、当該技術分野において周知であるように、それ相応に調整されるべきである。「併用投与」併用療法は、同時投与に限定されず、少なくとも１つの他の治療剤を患者に投与することを含む処置の過程の間に抗原及びタンパク質が少なくとも１回投与される処置計画も含む。
【0184】
別の態様において、肺動脈高血圧症、肺高血圧症、及び肺線維症の症状を処置するための方法であって、上記の疾患の関連疾患の処置のために本明細書において提供される抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質及び薬学的に許容できる賦形剤の混合物を使用することを含む方法が、本明細書において提供される。薬剤の調製方法は、上述されるとおりである。
【0185】
ヒトＥＴＡ及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐに特異的に結合し得る抗体の融合タンパク質に関連する組成物、キット及び方法が、本明細書においてさらに提供される。ヒトＥＴＡ結合抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の全て又は一部をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸配列並びにその誘導体及びフラグメント、例えば、ヒトＥＴＡ結合抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の全て又は一部をコードする核酸配列が提供される。核酸配列を含むベクター、並びに核酸及び／又はベクターを含む細胞が、本明細書においてさらに提供される。提供される方法は、例えば、ヒトＥＴＡ結合抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を調製、同定又は単離するための方法であって、ヒトＥＴＡ結合抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質がＥＴＡに依然として結合し得るかどうかを決定するための方法、ヒトＥＴＡ結合抗体及びＴＧＦ－βをブロックするＴＧＦ－βの融合タンパク質によって引き起こされるシグナル伝達を決定するための方法、及び生物学的活性をインビボで測定するために、ヒトＥＴＡ結合抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質をモデル動物に投与するための方法を含む。
【0186】
本明細書に記載される技術的解決法をさらに例示するために、以下の具体的な実施例が使用される。
【0187】
本明細書において、特に規定されない限り、使用される原料、機器などは全て、市販されているか、又は当該技術分野において一般的に使用されるものである。以下の実施例における方法は全て、特に規定されない限り、当該技術分野における従来の方法である。
【実施例】
【0188】
１．抗体遺伝子のクローニング及びサブクローニング
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集し、ＱＩＡＧＥＮ ｍＲＮＡ抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出し、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡを抽出する。次に、抽出されたｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写する。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、重鎖逆転写プライマーは、（５’－ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ－３’）（配列番号１９９）であり、軽鎖逆転写プライマーは、（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（配列番号２００）及び（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（配列番号２０１）である。ＲＴ－ＰＣＲの反応条件は、以下のとおりである：２５℃、５分；５０℃、６０分；７０℃、１５分。逆転写されたｃＤＮＡを、５００μＬになるまで０．１ｍＭのＴＥで希釈し、限外ろ過遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５）に加え、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離し；ろ液を除去し、５００μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離し；ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離して、精製されたｃＤＮＡを得て；１０μＬの精製されたｃＤＮＡを鋳型として取り、４μＬの５倍のテーリングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）、４μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）及び１０Ｕ末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）を加え、十分に混合し、３７℃で５分間、次に６５℃で５分間インキュベートし；次に、ポリＡテイルを有するｃＤＮＡを、鋳型として使用し、ＰＣＲによって抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅する。上流プライマーは全て、ＯｌｉｇｏｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ－３’）（配列番号２０２）及び（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ－３’）（配列番号２０３）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’－ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ－３’）（配列番号２０４）である。ＰＣＲの反応条件は、以下のとおりである：９５℃、５分；９５℃、３０秒、５６℃、３０秒、７２℃、１分、４０サイクル；７２℃、７分。ＰＣＲ産物を、ＰＭＤ １８－Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、市販されている）に連結し、次に配列決定する。クローニングされた抗体のＣＤＲ配列が、表１及び表２に示される。
抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を収集し、ＱＩＡＧＥＮ ｍＲＮＡ抽出キットの製造業者のプロトコルにしたがって抽出し、ハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡを抽出する。次に、抽出されたｍＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写する。逆転写プライマーは、マウスの軽鎖及び重鎖定常領域に対して特異的なプライマーであり、重鎖逆転写プライマーは、（５’－ＴＴＴＧＧＲＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣ－３’）（配列番号１９９）であり、軽鎖逆転写プライマーは、（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（配列番号２００）及び（５’－ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ－３’）（配列番号２０１）である。ＲＴ－ＰＣＲの反応条件は、以下のとおりである：２５℃、５分；５０℃、６０分；７０℃、１５分。逆転写されたｃＤＮＡを、５００μＬになるまで０．１ｍＭのＴＥで希釈し、限外ろ過遠心分離管（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５）に加え、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離し；ろ液を除去し、５００μＬの０．１ｍＭのＴＥを加え、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離し；ろ液を除去し、調製管を、新しい遠心分離管に逆さに入れ、１０分間にわたって２０００ｇで遠心分離して、精製されたｃＤＮＡを得て；１０μＬの精製されたｃＤＮＡを鋳型として取り、４μＬの５倍のテーリングバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）、４μＬのｄＡＴＰ（１ｍＭ）及び１０Ｕ末端トランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）を加え、十分に混合し、３７℃で５分間、次に６５℃で５分間インキュベートし；次に、ポリＡテイルを有するｃＤＮＡを、鋳型として使用し、ＰＣＲによって抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の遺伝子を増幅する。上流プライマーは全て、ＯｌｉｇｏｄＴであり、重鎖下流プライマーは、（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣ－３’）（配列番号２０２）及び（５’－ＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣ－３’）（配列番号２０３）であり、軽鎖下流プライマーは、（５’－ＡＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＣＧＴＧ－３’）（配列番号２０４）である。ＰＣＲの反応条件は、以下のとおりである：９５℃、５分；９５℃、３０秒、５６℃、３０秒、７２℃、１分、４０サイクル；７２℃、７分。ＰＣＲ産物を、ＰＭＤ １８－Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、市販されている）に連結し、次に配列決定する。クローニングされた抗体のＣＤＲ配列が、表１及び表２に示される。
【0189】
ＰＣＲプライマーは、抗体の配列決定されたＤＮＡ配列に基づいて設計され、したがって、完全な軽鎖及び重鎖シグナルペプチド及び可変ドメイン及びマウスＩｇＧ１定常領域が、発現ベクターｐＴＭ５と連結される。
【0190】
２．抗体融合タンパク質の遺伝子のための発現プラスミドの調製
ヒトＴＧＦ－β Ｔｒａｐ（ｈＴＧＦ－β Ｔｒａｐ）遺伝子配列を、オーバーラッピングＰＣＲ方法によって、抗ＥＴＡ抗体の重鎖のＣ末端に融合する。Ｎｈｅ１制限酵素部位を、融合タンパク質の重鎖可変領域の５’末端に加え、Ｎｏｔ１制限酵素部位を、ＰＣＲプライマーによって融合タンパク質の３’末端に加え、完全な重鎖及びｈＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質遺伝子が発現ベクターｐＴＭ５にロードされるようにし；同様に、Ｎｈｅ１制限酵素部位を、軽鎖可変領域の５’末端に加え、Ｂｓｉｗ１制限酵素部位を、その３’末端に加え、完全な軽鎖可変領域配列が、軽鎖定常領域がロードされた発現ベクターｐＴＭ５に連結されるようにする。
ヒトＴＧＦ－β Ｔｒａｐ（ｈＴＧＦ－β Ｔｒａｐ）遺伝子配列を、オーバーラッピングＰＣＲ方法によって、抗ＥＴＡ抗体の重鎖のＣ末端に融合する。Ｎｈｅ１制限酵素部位を、融合タンパク質の重鎖可変領域の５’末端に加え、Ｎｏｔ１制限酵素部位を、ＰＣＲプライマーによって融合タンパク質の３’末端に加え、完全な重鎖及びｈＴＧＦ－β Ｔｒａｐ融合タンパク質遺伝子が発現ベクターｐＴＭ５にロードされるようにし；同様に、Ｎｈｅ１制限酵素部位を、軽鎖可変領域の５’末端に加え、Ｂｓｉｗ１制限酵素部位を、その３’末端に加え、完全な軽鎖可変領域配列が、軽鎖定常領域がロードされた発現ベクターｐＴＭ５に連結されるようにする。
【0191】
３．抗体融合タンパク質の一過性発現
５×１０５個／ｍＬの懸濁ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ発現細胞株を、振とうフラスコに接種し、３７℃で２４時間にわたって及び５％のＣＯ２で、１×１０６個／ｍＬの密度を達するまで回転下で培養し、次に、トランスフェクションに使用する。トランスフェクションプロセス中、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、トランスフェクション培地として使用し、ＤＮＡ（ＤＮＡの量は、１×１０６個の細胞当たり０．５μｇであり、ここで、抗体の軽鎖対重鎖の比率は、３：２である）と混合し、ここで、ＰＥＩ対ＤＮＡの好ましい比率は、３：１である。これら２つの混合物を、１５分間の静置インキュベーションの後、細胞培養物に加える。ＰＥＩ及びＤＮＡの混合物を受け取った後、細胞を、３７℃で２４時間にわたって及び５％のＣＯ２で、回転下で培養し、次に、０．５％のトリプトンを、発現のために必要とされる添加剤として細胞培養物溶液に加え、最後に、細胞上清を、発現の完了（９６時間超）後、抗体の精製及び分離のために収集する。
５×１０５個／ｍＬの懸濁ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ発現細胞株を、振とうフラスコに接種し、３７℃で２４時間にわたって及び５％のＣＯ２で、１×１０６個／ｍＬの密度を達するまで回転下で培養し、次に、トランスフェクションに使用する。トランスフェクションプロセス中、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、トランスフェクション培地として使用し、ＤＮＡ（ＤＮＡの量は、１×１０６個の細胞当たり０．５μｇであり、ここで、抗体の軽鎖対重鎖の比率は、３：２である）と混合し、ここで、ＰＥＩ対ＤＮＡの好ましい比率は、３：１である。これら２つの混合物を、１５分間の静置インキュベーションの後、細胞培養物に加える。ＰＥＩ及びＤＮＡの混合物を受け取った後、細胞を、３７℃で２４時間にわたって及び５％のＣＯ２で、回転下で培養し、次に、０．５％のトリプトンを、発現のために必要とされる添加剤として細胞培養物溶液に加え、最後に、細胞上清を、発現の完了（９６時間超）後、抗体の精製及び分離のために収集する。
【0192】
４．抗体融合タンパク質の精製及び分離
収集された細胞上清を、高速（８０００ｒｐｍ、１５分）で遠心分離して、細胞及び細胞残屑を除去し、次に、０．４５μｍのフィルタ膜を用いて、ろ過し、清澄化する。清澄化された上清を、精製に使用する。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させる。上清が、まず、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムを通って流れ、その間、上清に含まれる抗体は、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムのリガンドに結合し、カラム内に保持される。次に、低いｐＨ値（３．０以下）を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムを洗浄して、それに結合された抗体を解離させ、低いｐＨ値を有する収集された抗体溶離液を、１Ｍのトリス－ＨＣｌで直ぐに中和して、抗体を活性化から保護する。得られた抗体融合タンパク質溶離液を、１６時間の透析後にＰＢＳ緩衝系と取り換える。
収集された細胞上清を、高速（８０００ｒｐｍ、１５分）で遠心分離して、細胞及び細胞残屑を除去し、次に、０．４５μｍのフィルタ膜を用いて、ろ過し、清澄化する。清澄化された上清を、精製に使用する。精製プロセスを、クロマトグラフによって完了させる。上清が、まず、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムを通って流れ、その間、上清に含まれる抗体は、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーカラムのリガンドに結合し、カラム内に保持される。次に、低いｐＨ値（３．０以下）を有する溶出緩衝液を用いてクロマトグラフィーカラムを洗浄して、それに結合された抗体を解離させ、低いｐＨ値を有する収集された抗体溶離液を、１Ｍのトリス－ＨＣｌで直ぐに中和して、抗体を活性化から保護する。得られた抗体融合タンパク質溶離液を、１６時間の透析後にＰＢＳ緩衝系と取り換える。
【0193】
５．カルシウム流試験が、ＥＴＡをインビトロで阻止するＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質の生物学的活性を検出する
ｈＥＴＡ－イクオリンを共発現するＣＨＯ－ＤＨＦＲ細胞を、ウェル当たり２５０００個の細胞で、黒色の９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養する。翌日、細胞上清を除去し、５０μｌの基質セレンテランジンｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）を加え、暗所で２時間インキュベートし、次に、５０μｌの精製された抗体又は融合タンパク質を加え、３０分間インキュベートする。オートサンプラを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダーにおいてエンドセリン１をかん流させる。即座のカルシウム流変化が、４０秒以内に検出され、ピーク時間及びピーク値を記録する。図１に示されるように、ＥＴＡ抗体及びＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は両方とも、ヒトＥＴＡによって媒介される細胞内Ｃａ２＋変化を有効に阻害することができる。
ｈＥＴＡ－イクオリンを共発現するＣＨＯ－ＤＨＦＲ細胞を、ウェル当たり２５０００個の細胞で、黒色の９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養する。翌日、細胞上清を除去し、５０μｌの基質セレンテランジンｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ、市販されている）を加え、暗所で２時間インキュベートし、次に、５０μｌの精製された抗体又は融合タンパク質を加え、３０分間インキュベートする。オートサンプラを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダーにおいてエンドセリン１をかん流させる。即座のカルシウム流変化が、４０秒以内に検出され、ピーク時間及びピーク値を記録する。図１に示されるように、ＥＴＡ抗体及びＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質は両方とも、ヒトＥＴＡによって媒介される細胞内Ｃａ２＋変化を有効に阻害することができる。
【0194】
６．レポーター遺伝子実験が、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路をインビトロで阻止するＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を検出する
ＳＢＥ－ルシフェラーゼを安定的に発現する４Ｔ１細胞を、ウェル当たり３４０００個の細胞で、９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養する。２日目に、３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β１及び段階的に希釈されたＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を、室温で３０分間にわたって等体積でプレインキュベートする。プレインキュベーション期間の間、培地上清を、９６ウェル細胞培養プレートから除去し、細胞表面を、無血清培地で２回洗浄し、残りの液体を吸引する。１００μＬの予め反応された反応溶液を、９６ウェル細胞培養プレートに加え、混合物を３７℃で６時間インキュベートする。インキュベーションの後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、最後に、細胞溶解物を白色の９６ウェルプレートに移し、相対蛍光強度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において読み取る。図２は、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β１受容体の活性化からＴＧＦ－β１をブロックするＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を検出するレポーター遺伝子実験の阻害曲線を示す。
ＳＢＥ－ルシフェラーゼを安定的に発現する４Ｔ１細胞を、ウェル当たり３４０００個の細胞で、９６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で一晩培養する。２日目に、３ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β１及び段階的に希釈されたＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を、室温で３０分間にわたって等体積でプレインキュベートする。プレインキュベーション期間の間、培地上清を、９６ウェル細胞培養プレートから除去し、細胞表面を、無血清培地で２回洗浄し、残りの液体を吸引する。１００μＬの予め反応された反応溶液を、９６ウェル細胞培養プレートに加え、混合物を３７℃で６時間インキュベートする。インキュベーションの後、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ Ｇｌｏ化学発光基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、最後に、細胞溶解物を白色の９６ウェルプレートに移し、相対蛍光強度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において読み取る。図２は、ＥＴＡ抗体及びＴＧＦ－β１受容体の活性化からＴＧＦ－β１をブロックするＴＧＦ－β Ｔｒａｐの融合タンパク質を検出するレポーター遺伝子実験の阻害曲線を示す。
【0195】
７．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるブレオマイシン誘導性肺線維症における抗体融合タンパク質のインビボ活性
ブレオマイシン（ＢＬＭ）を、気管を介して投与して、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺線維症モデル（ＢＰＦ）を誘導し、これを用いて、このモデルの肺線維症の処置におけるｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの腹腔内注入の効果を評価する。マウスを、２％のイソフルランで麻酔し、仰臥位で実験台に固定し、留置針管を、その気管に迅速に挿入する。１００μＬのマイクロシリンジを、体重に応じて特定の量の生理食塩水溶液（正常な対照群）又はブレオマイシン溶液（２．５ｍｇ／ｋｇ）を抜き取るために入れ、留置針管を通して軟骨の環状腔に挿入して、医療用溶液を、５０μＬ／２０ｇの用量で気管にゆっくりと注入する。注入の後、マウスを迅速に直立させ、回転させて、医療用溶液を、肺内で均一に分配させる。動物を、その体重に応じて、ランダムに分け、正常群に１２匹、モデル群に２０匹、及びｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ低用量及び高用量群にそれぞれ１４匹である。ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ又はブランク製剤を、モデリングの１日後にプロトコルにしたがって投与し、３週間にわたって連続投与する。薬剤の有効性を、動物の生存及び肺の病変などの指標によって評価する。図３に示されるように、モデル群において、肺病変のＭａｓｓｏｎ染色によれば、胞状構造のほとんどが消失し、肺胞中隔が拡大し、大量の膠原線維が堆積し、これは、ブレオマイシンの気管投与が正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて肺線維症を上首尾に誘導することを示し；ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ低用量及び高用量群は、上記の肺線維症指標で有意な改善効果を示し、用量－効果の関係が明らかである。さらに、図４に示されるように、ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ処置は、マウスの生存期間を延長することができ、これは、この薬剤が肺線維症のプロセスを阻害し得ることを示している。
ブレオマイシン（ＢＬＭ）を、気管を介して投与して、正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺線維症モデル（ＢＰＦ）を誘導し、これを用いて、このモデルの肺線維症の処置におけるｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐの腹腔内注入の効果を評価する。マウスを、２％のイソフルランで麻酔し、仰臥位で実験台に固定し、留置針管を、その気管に迅速に挿入する。１００μＬのマイクロシリンジを、体重に応じて特定の量の生理食塩水溶液（正常な対照群）又はブレオマイシン溶液（２．５ｍｇ／ｋｇ）を抜き取るために入れ、留置針管を通して軟骨の環状腔に挿入して、医療用溶液を、５０μＬ／２０ｇの用量で気管にゆっくりと注入する。注入の後、マウスを迅速に直立させ、回転させて、医療用溶液を、肺内で均一に分配させる。動物を、その体重に応じて、ランダムに分け、正常群に１２匹、モデル群に２０匹、及びｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ低用量及び高用量群にそれぞれ１４匹である。ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ又はブランク製剤を、モデリングの１日後にプロトコルにしたがって投与し、３週間にわたって連続投与する。薬剤の有効性を、動物の生存及び肺の病変などの指標によって評価する。図３に示されるように、モデル群において、肺病変のＭａｓｓｏｎ染色によれば、胞状構造のほとんどが消失し、肺胞中隔が拡大し、大量の膠原線維が堆積し、これは、ブレオマイシンの気管投与が正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて肺線維症を上首尾に誘導することを示し；ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ低用量及び高用量群は、上記の肺線維症指標で有意な改善効果を示し、用量－効果の関係が明らかである。さらに、図４に示されるように、ｈ１５Ｆ３－（Ｇ４Ｓ）４－ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ処置は、マウスの生存期間を延長することができ、これは、この薬剤が肺線維症のプロセスを阻害し得ることを示している。
【0196】
上記の実施形態は、本発明の好ましい解決策であるに過ぎず、これは、本発明を限定するものと決して解釈されるものではなく、特許請求の範囲に規定される技術的解決策の範囲を逸脱しない限り、他の変形及び変更が存在する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2022-05-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】