特表 2022-540921 ＫＲＡＳまたはＨＲＡＳ変異若しくは増幅を有するがんを処置する際に有用な方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-20

(54)【発明の名称】ＫＲＡＳまたはＨＲＡＳ変異若しくは増幅を有するがんを処置する際に有用な方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/4192 20060101AFI20220912BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/4709 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/496 20060101ALI20220912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220912BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/17 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/565 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 33/24 20190101ALI20220912BHJP

   A61K 31/282 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/7076 20060101ALI20220912BHJP

   A61K 31/7068 20060101ALI20220912BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220912BHJP

【ＦＩ】

A61K31/4192

A61K31/517 ZNA

A61K31/4709

A61K31/496

A61P35/00

A61P35/02

A61K31/337

A61K45/00

A61K31/704

A61K31/17

A61K31/565

A61K33/24

A61K31/282

A61K31/675

A61K31/198

A61K31/513

A61K31/7076

A61K31/7068

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502559

(86)(22)【出願日】2020-07-15

(85)【翻訳文提出日】2022-03-11

(86)【国際出願番号】 US2020042162

(87)【国際公開番号】W WO2021011674

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】62/874,474

(32)【優先日】2019-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

３．ＭＡＴＬＡＢ

４．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100111501

【弁理士】

【氏名又は名称】滝澤 敏雄

(72)【発明者】

【氏名】ヘラー ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ホロスコ クリストファー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZB27

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA02

4C086BC28

4C086BC43

4C086BC45

4C086BC50

4C086BC60

4C086DA09

4C086DA35

4C086EA10

4C086EA17

4C086EA18

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA12

4C086HA12

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB27

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA53

4C206HA28

4C206JB16

4C206MA02

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA72

4C206MA86

4C206NA05

4C206ZB26

4C206ZB27

(57)【要約】

本技術はＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがん、腫瘍、および新生物に関して、がんを処置し、腫瘍の成長を遅くし、腫瘍の成長を後退させ、新生物の成長を遅くし、新生物の成長を後退させ、新生物の増殖を遅くし、および／または新生物の増殖を後退させる際に有用な方法であって、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象においてがんを処置する方法であって、対象に有効量の化合物を投与してがんを処置するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、がんがＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持し、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、方法。

【請求項2】

がんが、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

がんが、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

対象がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

化合物がダラプラジブである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

化合物がリラプラジブである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

化合物がＡＡ３９－２である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

化合物がＭＬ２５６である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

対象に有効量の化合物を経口投与してがんを処置するステップを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

対象において腫瘍の成長を遅くするまたは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が腫瘍の成長を遅くするまたは後退させるのに有効な量であり、腫瘍がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの腫瘍であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、前記方法。

【請求項16】

腫瘍が、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんから選択されるがんの腫瘍である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

腫瘍が、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含むがんの腫瘍である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

対象がヒトである、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

化合物がダラプラジブである、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

化合物がリラプラジブである、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

化合物がＡＡ３９－２である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

化合物がＭＬ２５６である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項26】

投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項27】

投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項28】

対象に有効量の化合物を経口投与するステップを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項29】

投与が、腫瘍内へのまたは腫瘍の近位への化合物の注射を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項30】

対象において新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または対象において新生物の増殖を遅くするもしくは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または新生物の増殖を遅くするもしくは後退させるのに有効な量であり、新生物がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの新生物であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、前記方法。

【請求項31】

新生物が、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんから選択されるがんの新生物である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

新生物が、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含むがんの新生物である、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

対象がヒトである、請求項３０に記載の方法。

【請求項34】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項35】

対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項36】

化合物がダラプラジブである、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

化合物がリラプラジブである、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

化合物がＡＡ３９－２である、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

化合物がＭＬ２５６である、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項41】

投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項42】

投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項43】

対象に有効量の化合物を経口投与するステップを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項44】

投与が、新生物内へのまたは新生物の近位への化合物の注射を含む、請求項３０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は２０１９年７月１５日付で出願された米国仮出願第６２／８７４，４７４号の利益および優先権を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（米国政府の権利）
本発明は国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により授与されたＨＤ０７５６９８、および全米科学財団（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）により授与された１７５２５０６の政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
（分野）
本技術は、ＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがん、腫瘍、および新生物に関して、がんを処置し、腫瘍の成長を遅くし、腫瘍の成長を後退させ、新生物の成長を遅くし、新生物の成長を後退させ、新生物の増殖を遅くし、および／または新生物の増殖を後退させる際に有用な方法であって、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ストレスに誘発される早期老化は、腫瘍形成を遅らせるかまたは中止する腫瘍抑制機構である。有糸分裂を促進するＭＡＰキナーゼカスケードの重要な構成成分であるＲＡＳ／ＲＡＦを介する構成的シグナル伝達は増殖遅延、アポトーシス^{1,2,3,4,5,6,7,8}およびＤＮＡ損傷応答⁹をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで^{7,10,11,12,13}引き起こすことができる。この過程は腫瘍の開始を抑制し得るが、発がん遺伝子に誘発される老化（ＯＩＳ）は生きている細胞が例えば、酸化的損傷および複製欠陥^{14,15,16,17,18}によってゲノム安定性を失うので有害である可能性がある。この考えと一致して、発生中のマウス胚における内因性変異によるＫＲＡＳ発現は前がん性の組織欠陥：老化、ｐ２１^waf1/cip1過剰発現、ＤＮＡ損傷応答、変異アレル、不安定性、および総体的発育不全^19,20,21,22を引き起こす。より最近になって、発がん遺伝子に誘発される損傷を再現するために上皮細胞および線維芽細胞が使用されている；例えば、先天的炎症遺伝子発現表現型（老化炎症応答ＳＩＲ、および老化関連分泌表現型ＳＡＳＰ）が記載されている^23,24。ＯＩＳは停止、局所炎症、および細胞外伝達の開始による細胞損傷に対する迅速な応答として起こると考えられる。トランスクリプトーム分析および組織学は、常に、ｒａｓ発がん遺伝子を保持する悪性の組織および細胞における保存された炎症性酵素である分泌ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）をコードする遺伝子の発現を示す。しかしながら、ｓＰＬＡ２酵素は古典的な白血球産物であり、がん生物学におけるそれらの役割は不明なままである。興味深いことに、証拠は、ｓＰＬＡ２酵素活性の産物、リゾリン脂質および関連種が細胞老化中に大量に生成する²⁵ことを示している。また、いくつかのｓＰＬＡ２は老化に直接関与する^26,27,28,29。

【発明の概要】

【0003】

ある態様では、本技術は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に有効量の化合物を投与してがんを処置するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、がんがＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持し、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、前記方法を提供する。本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。
ある態様では、本技術は、対象において腫瘍の成長を遅くするまたは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が腫瘍の成長を遅くするまたは後退させるのに有効な量であり、腫瘍がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの腫瘍であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、前記方法を提供する。本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。

【0004】

ある態様では、本技術は、対象において新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または対象において新生物の増殖を遅くするもしくは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または新生物の増殖を遅くするもしくは後退させるのに有効な量であり、新生物がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの新生物であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、方法を提供する。本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】図１は実施例における不死化されたマウス胚線維芽細胞においてＲＡＳにより誘発された損傷を示し、示されている濃度のドキシサイクリンの存在下での初期播種密度に対して付着細胞数の経時変化をプロットしたものである。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図2】図２は実施例においてドキシサイクリンを導入した２４時間後のベクター／ｉＫＲａｓ細胞の免疫ブロットを提供する。両側検定（ｎ＝３）：ドキシサイクリン対合ｉＫＲａｓおよびベクターの画素密度。ＴＢＰローディング対照またはホスホ／トータル比を使用して正規化した。

【図3】図３は実施例による細胞周期基質に対するベクター／ｉＫＲａｓの７２時間免疫ブロットを提供する。両側検定（ｎ＝３）；ドキシサイクリン対合ＭＥＦの画素強度。ＴＢＰを使用して正規化した。

【図4】図４は実施例によるγＨ２Ａ．Ｘ陽性シグナルを含有する免疫蛍光像からの積分強度の定量化を提供する。誤差は平均±ＳＥＭ（一方向ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３、各々２０×の１０撮像場）である。

【図5】図５は実施例によるＪＮＫ（上）またはＡＴＦ－２（下）に対するベクター／ｉＫＲａｓの２４時間および７２時間免疫ブロットを提供する。両側検定（ｎ＝３）；ドキシサイクリン対合したＭＥＦの画素強度。ホスホ／トータル比を使用して正規化した。

【図6】図６は実施例によるＳＡ－β－ガラクトシダーゼアッセイ（左、スケールバー＝３０μｍ）、およびＨＰ１γ核焦点に対する関節免疫蛍光（右、スケールバー＝１０μｍ）を提供する。β－Ｇａｌカラー画像をデコンボリューションし解析して、各々の条件（ｎ＝３×１０撮像視野、１０×倍率）に対して示される陽性％の平均±標準偏差を得た。％陽性ＳＡＨＦは５＋焦点核／全核（各々の条件に対して示された平均±標準偏差、ｎ＝３×１０撮像視野、４０×倍率）を用いて計算された。

【図7】図７は実施例による、ジヘプタノイルチオ－ＰＣ基質およびＤＴＮＢ色原体を用いた細胞溶解物または馴化培地のＰａｎ－ｓＰＬＡ２活性アッセイを提供する。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図8】図８は実施例による、チオ－ＰＡＦ基質およびＤＴＮＢ色原体を用いた細胞溶解物または馴化培地のＰａｎ－ＰＡＦ－ＡＨ活性アッセイを提供する。全てのサンプルは１０ｋＤａ膜を用いてスピンフィルターにかけた。エラーバーは標準偏差を表す（両側検定、ｎ＝３）。ＬＯＤ：検出限界。

【図9】図９は実施例による、ＰＬＡ２Ｇ７Ａ抗体で染色された（赤二次）ｉＫＲａｓまたはベクターの共焦点免疫蛍光イメージングの結果を提供する。青＝Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色。スケールバー＝１０μｍ。

【図10】図１０は実施例による、示されている不死化ＭＥＦ株に対するセンサー放射波長の定量化を提供する。エラーバーは標準偏差を表す（両側検定、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。

【図11】図１１は、実施例による、経路阻害剤またはＰＡＦ－ＡＨ誘導物質で処置された細胞における脂質リポーター応答を示し、２４時間処置された培養物からのリポーター放射波長を提供する。誤差は平均±ＳＤである（一方向ＡＮＯＶＡ対ビヒクル、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。各々の阻害剤の報告された標的の概要も含まれている。

【図12】図１２は、実施例による、経路阻害剤またはＰＡＦ－ＡＨ誘導物質で処置された細胞における脂質リポーター応答を示し、形質導入Ｋ－ｒａｓＧ１２Ｖを有するかまたは有しないＡｔｇ５ダブルノックアウトＳＶ４０ＬＴ ＭＥＦにおけるリポーター放射波長を提供する。別の実験において、細胞はプロテアーゼ阻害剤カクテル（２０μＭロイペプチン、２０μＭぺプスタチン、１０μＭ Ｅ－６４）に５時間曝露された。誤差は平均±ＳＤである（両側ｔ検定、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。

【図13】図１３は実施例による、リゾリン脂質に対する内膜リポーターアッセイの結果を提供し、誘導性増幅ｉＫＲａｓ株におけるセンサーからの放射中心波長が単一アレルノックイン株ｅＫＲａｓと比較されている。

【図14】図１４は、実施例による、経路阻害剤またはＰＡＦ－ＡＨ誘導物質で処置された細胞における脂質リポーター応答を示し、１００ｎＭデキサメタゾン塩で２４時間処置された培養物におけるリポーター放射波長を提供する。誤差は平均±ＳＤである（両側ｔ検定、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。

【図15】図１５は実施例による、リゾリン脂質に対する内膜リポーターアッセイの結果を提供し、２４時間のインキュベーション期間の間示されている薬剤：２０ｎＭバレスプラジブ、ＭＪ－３３、７５ｎＭ ＢＥＬ、５００ｎＭ ＭＡＦＰ、５０ｎＭダラプラジブ、リラプラジブ、ＭＬ２５６、ＡＡ３９－２、８００ｎＭ Ｐ１１、１μＭ ＴＳＩ－０１と共にインキュベートされたベクター／ｉＫＲａｓ細胞からのセンサー放射波長の定量化が示されている。エラーバーは標準偏差を表す（両側ｔ検定対ビヒクルまたはカッコにより示されている、一方向ＡＮＯＶＡ対ビヒクル、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。

【図16】図１６は実施例による、リゾリン脂質に対する内膜リポーターアッセイの結果を提供し、２４時間のインキュベーション期間の間２０μＭ±－α－トコフェロールと共にインキュベートしたベクター／ｉＫＲａｓ細胞からのセンサー放射中心波長が示されている。エラーバーは標準偏差を表す（両側ｔ検定、ｎ＝３×１２～１５撮像場）。

【図17】図１７はｉＫＲａｓの１２～２５，０００×イメージングからの電子顕微鏡写真（ｎ＝２５視野）の定量化を提供する。誤差は平均±ＳＤである（一方向ＡＮＯＶＡ対ベクター）。

【図18】図１８は５００ｎｍにおける定量化によるベクター対照およびｉＫＲａｓ細胞溶解物の全脂質ヒドロペルオキシドを提供する。エラーバーは標準偏差を表す（両側ｔ検定、ｎ＝３）。ＬＯＤ：検出限界。

【図19】図１９は図１８と同様であるがビヒクルまたはダラプラジブ（５０ｎＭ）で処置されたｉＫＲａｓ細胞に対する定量化を提供する。

【図20】図２０は、実施例による、グループ７のｓＰＬＡ２基質および生成物脂質の細胞増殖に対する効果を示し、培養培地中に加えた脂質濃度の関数として付着細胞数の変化を提供する。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図21】図２１は図２０と同様に、しかし１０μＭの各々の脂質に曝露されたｉＫＲａｓまたはｅＫＲａｓ細胞株に対して提供する。

【図22】図２２は１０μＭリゾＰＣまたはｃＰＡＦ脂質に２４時間曝露後のベクター／ｉＫＲａｓの免疫ブロットを提供する。両側ｔ検定（ｎ＝３）：対合したｉＫＲａｓおよびベクター処置条件の画素密度。ＴＢＰローディング対照またはホスホ／トータル比を使用して正規化した。ＰＡＦ－Ｒ：血小板活性化因子受容体。

【図23】図２３は、実施例による、グループ７のｓＰＬＡ２標的化の細胞生存に対する効果を示し、４５ｎＭ ｓｉＲＮＡに曝露後９６時間の付着細胞数の変化を提供する。エラーバーは標準偏差を表す（一方向ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３）。

【図24】図２４は、実施例による、グループ７のｓＰＬＡ２標的化の細胞生存に対する効果を示し、独立した実験からのＬＤＨ活性の変化を提供する。データは平均±ＳＥＭとして示す（一方向ＡＮＯＶＡ、ｎ＝３）。

【図25】図２５は、実施例による、グループ７のｓＰＬＡ２標的化の細胞生存に対する効果を示し、ダラプラジブに対する応答における幾つかの細胞株の生存率を提供する。Ｎ＝３反復；エラーバーは標準偏差を表す。

【図26】図２６は実施例による、ｅＫＲａｓおよび野生型（ＷＴ）ＭＥＦに対するダラプラジブの効果を示す。細胞は生存率試験に関して本文に記載されているように平板培養した。ダラプラジブはそのｉｎ ｖｉｔｒｏＥＣ₅₀（１０～１０００ｎＭ）を超える濃度で細胞培養中に滴定した。Ｎ＝３反復、誤差±ＳＤ；データはＳ字状の用量反応にフィットする。

【図27】図２７は、実施例による、グループ７のｓＰＬＡ２標的化の細胞生存に対する効果を示し、０日目にＫＰ生殖細胞を注射され、１日目（Ｄ１）または６日目（Ｄ６）に始めて毎日ビヒクルまたはダラプラディップ（Ｄａｒａｐ、１０ｍｇ／ｋｇ）を処置された（経口栄養補給）マウスの生存研究の結果を提供する。Ｎ（ビヒクル）＝８、Ｎ（Ｄａｒａｐ、Ｄ１）＝８、Ｎ（Ｄａｒａｐ、Ｄ６）＝９。

【発明を実施するための形態】

【0006】

下に定義される以下の用語が本明細書を通じて使用される。
本明細書中および添付の特許請求の範囲で要素を記載する際に（殊に後記特許請求の範囲との関連で）使用される「ａ」および「ａｎ」ならびに「ｔｈｅ」のような単数形態の冠詞および同様な指示対象は、本明細書中で他に示さないかまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数形態および複数形態の両方に及ぶと理解されたい。本明細書中値の範囲の記述は単に、本明細書中で他に断らない限り、その範囲内に入る各々別々の値に個々に言及するのを簡潔にした表現方法として役立たせることを意図したに過ぎず、各々別個の値は個別に本明細書中に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載されている方法は全て、本明細書中で他に断らないかまたはその他文脈により明らかに矛盾しない限り任意の適切な順序で行なうことができる。本明細書で提供される任意および全ての例、または代表的な言葉（例えば、「のような」）の使用は単に、実施形態の理解をより容易にすることを意図したに過ぎず、他に述べない限り特許請求の範囲の範囲に制限を課すものではない。本明細書中のいかなる言葉も特許請求の範囲に記載されていない要素を必須であるとして示すものと解釈するべきではない。

【0007】

本明細書で使用されるとき、「約」は当業者により理解され、使用される状況に応じてある程度変化する。当業者にとって明らかでない用語が使用されるならば、使用される状況を考えて、「約」は個々の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味し、例えば「約１０質量％」は「９質量％～１１質量％」を意味すると理解されよう。「約」がある用語に先行するとき、その用語は「約」が付いた用語ならびに「約」による修飾がない用語を開示していると解釈するべきであると理解され、例えば「約１０質量％」は「９質量％～１１質量％」を開示すると共に「１０質量％」を開示する。
本開示において使用される語句「および／または」は列挙されたメンバーのいずれか１つを個別に、またはそのいずれか２つもしくはそれ以上の組合せを意味すると理解され、例えば「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」は「Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ、またはＢおよびＣ」を意味するであろう。

【0008】

当業者には理解されるように、任意の、そしてあらゆる目的で、特に書面による明細を提供する観点からいって、本明細書に開示されている全ての範囲はまた、そのいずれかおよび全ての可能な部分的範囲ならびにそれらの部分的範囲の組合せも包含する。掲げられているいかなる範囲も、同じ範囲が少なくとも等しい二分の一、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一、等に分解されることを充分に記載し、可能にすると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各々の範囲は下側の三分の一、中央の三分の一および上側の三分の一、等に容易に分解することができる。また当業者には理解されるように、「以下」、「少なくとも」、「超」、「未満」などのような言葉はいずれも、列挙されている数を含み、後に上で論じたような部分的範囲にその分解することができる範囲を意味する。最後に、当業者には理解されるように、ある範囲は各々の個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の原子を有する基は１、２、または３個の原子を有する基を意味する。同様に、１～５個の原子を有する基は１、２、３、４、または５個の原子を有する基を意味する、など。

【0009】

本明細書に記載されている化合物の薬学的に許容される塩は本技術の範囲内であり、所望の薬理学的な活性を保持しており、生物学的に望ましくなくない酸または塩基付加塩を含む（例えば、塩は過度に毒性、アレルギー性、または刺激性であることがなく、生物学的に利用可能である）。本技術の化合物が例えばアミノ基のような塩基性の基を有するとき、薬学的に許容される塩は無機の酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、およびリン酸）、有機の酸（例えばアルギン酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、グルコン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸）または酸性アミノ酸（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）と共に形成することができる。本技術の化合物が、例えばカルボン酸基のような酸性の基を有するときは、アルカリおよびアルカリ土類金属（例えばＮａ⁺、Ｌｉ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、Ｚｎ²⁺）のような金属、アンモニアまたは有機のアミン（例えばジシクロヘキシルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）または塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リジンおよびオルニチン）と共に塩を形成することができる。かかる塩は、化合物の単離および精製中その場で、または別途遊離の塩基もしくは遊離の酸形態の精製された化合物をそれぞれ適切な酸もしくは塩基と反応させ、こうした形成された塩を単離することにより、調製することができる。

【0010】

当業者には分かるように、本技術の化合物は互変異性、立体配座異性、幾何異性および／または立体異性の現象を示し得る。本明細書および特許請求の範囲内の式の図は可能な互変異性、立体配座異性、立体化学または幾何学的な異性体形態の１つのみを表すことができるが、本技術は本明細書に記載されている有用性の１つまたは複数を有する化合物のあらゆる互変異性、立体配座異性体、立体化学および／または幾何学的異性体形態、ならびにこれらの様々な異なる形態の混合物を包含すると了解されたい。
「互変異性体」とは化合物の互いに平衡状態にある異性体形態を意味する。異性体形態の存在および濃度は化合物が見出される環境に依存し、例えば、化合物が固体であるか、または有機もしくは水溶液中にあるかどうかで異なり得る。例えば、水溶液中でキナゾリノンは次の異性体形態を示し得、これらは互いに互変異性体といわれる。

【0011】

【化1】

もう１つ別の例として、グアニジンはプロトン性の有機溶液（例えば、水）中で次の異性体形態を示し得、これらも互いに互変異性体といわれる。

【化2】

構造式により化合物を表すことの限界のため、本明細書に記載されている化合物の全ての化学式は化合物の全ての互変異性形態を表し、本技術の範囲内であることと理解されたい。

【0012】

化合物の立体異性体（光学異性体ともいわれる）は、特定の立体化学が明白に示されない限り、ある構造のキラル、ジアステレオマーおよびラセミ形態を全て含む。したがって、本技術で使用される化合物はその表現から明らかなようにいずれかまたは全ての不斉原子において富化または分割された光学異性体を含む。両方のラセミおよびジアステレオマー混合物、ならびに個々の光学異性体はそのエナンチオマーまたはジアステレオマー相手を実質的に含まないように単離または合成することができ、これらの立体異性体は全て本技術の範囲内である。

【0013】

本技術の化合物は溶媒和物、殊に水和物として存在し得る。水和物は化合物もしくは化合物を含む組成物の製造中に形成され得、または水和物は化合物の吸湿性に起因して時間と共に形成し得る。本技術の化合物はまた、中でもＤＭＦ、エーテル、およびアルコール溶媒和物を始めとする有機の溶媒和物としても存在し得る。いずれの個々の溶媒和物の同定および調製も合成有機または医薬品化学の通常の技術者の知識の範囲内である。
本開示を通じて、様々な刊行物、特許、および公表された特許明細書が同定する引用により言及される。また本開示内には、言及された引用を参照するアラビア数字もあり、その完全な書誌的詳細は特許請求の範囲の前に提供される。これらの刊行物、特許、および公表された特許明細書の開示は参照により本開示中に組み込まれる。参照により組み込まれる本文に含まれる定義は本開示内の規定と矛盾する範囲において排除される。

【0014】

本技術
ストレスに誘発される早期老化は、腫瘍形成を遅らせるかまたは中止する腫瘍抑制機構である。有糸分裂を促進するＭＡＰキナーゼカスケードの重要な構成成分であるＲＡＳ／ＲＡＦを介する構成的シグナル伝達は増殖遅延、アポトーシス^{1,2,3,4,5,6,7,8}およびＤＮＡ損傷応答⁹をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで^{7,10,11,12,13}引き起こすことができる。この過程は腫瘍の開始を抑制し得るが、発がん遺伝子に誘発される老化（ＯＩＳ）は生きている細胞が例えば、酸化的損傷および複製欠陥^{14,15,16,17,18}によってゲノム安定性を失うので有害である可能性がある。この考えと一致して、発生中のマウス胚における内因性変異によるＫＲＡＳ発現は前がん性の組織欠陥：老化、ｐ２１^waf1/cip1過剰発現、ＤＮＡ損傷応答、変異アレル、不安定性、および総体的発育不全^19,20,21,22を引き起こす。より最近になって、発がん遺伝子に誘発される損傷を再現するために上皮細胞および線維芽細胞が使用されている；例えば、先天的炎症遺伝子発現表現型（老化炎症応答ＳＩＲ、および老化関連分泌表現型ＳＡＳＰ）が記載されている^23,24。ＯＩＳは停止、局所炎症、および細胞外伝達の開始による細胞損傷に対する迅速な応答として起こると考えられる。トランスクリプトーム分析および組織学は、常に、ｒａｓ発がん遺伝子を保持する悪性の組織および細胞における保存された炎症性酵素である分泌ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）をコードする遺伝子の発現を示す。しかしながら、ｓＰＬＡ２酵素は古典的な白血球産物であり、がん生物学におけるそれらの役割は不明なままである。興味深いことに、証拠は、ｓＰＬＡ２酵素活性の産物、リゾリン脂質および関連種が細胞老化中に大量に生成する²⁵ことを示している。また、いくつかのｓＰＬＡ２は老化に直接関与する^26,27,28,29。これらの観察により本発明者は、最初は動物毒および炎症関節で研究された、心臓血管、脂質、および白血球シグナル伝達に不可欠の^30,31,32大きいセリンヒドロラーゼファミリーであるｓＰＬＡ２の発がん性のＲＡＳ誘発損傷における役割を評価することになった。

【0015】

この目的で、本発明者は発がん性ＲＡＳ誘発損傷のネズミモデルにおけるｓＰＬＡ２の関与を研究した。構成的ＫＲＡＳまたはＨＲＡＳが、Ｔｅｔ－ＯＮレトロウイルスプラスミド（増幅モデル、ｉＫＲａｓ）を用いて、またはマウス胚における内因性組換えにより（単一アレルモデル、ｅＫＲａｓ）²³ＳＶ４０マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に導入された。本発明者は発がん性ＲＡＳ増幅からの細胞損傷の程度を過増殖する内因性変異体と比較した。発がん遺伝子増幅株はｐ２１^waf1/cip1の特有の著しい過剰発現、ドキシサイクリン用量依存性停止、老化関連マーカー、ＤＮＡ損傷、およびＳＩＲ／ＳＡＳＰ遺伝子発現を示した。酵素およびリピドームアッセイ、ならびにエンドソーム脂質のナノセンサーを用いて本発明者は、グループ７ｓＰＬＡ２アイソフォーム（グループ７はｐｌａ２ｇ７、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２ともいわれるＰＬＡ２Ｇ７Ａおよびｐａｆａｈ２、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ２ともいわれるＰＬＡ２Ｇ７Ｂを含む）が、ＲＡＳ増幅に際して上方調節された活性を示したことを見出した。本発明者は、ＲＡＳ損傷が、動員されたグループ７ｓＰＬＡ２酵素の特化された酸化リン脂質クリアリングの役割と一致して脂質ヒドロペルオキシド化および内因性酸化剤の増大を引き起こしたことを見出した。細胞停止、ｐ２１^waf1/cip1、およびリン酸化ＥＲＫは非分解性のグループ７基質脂質への曝露の際に刺激された。グループ７ｓＰＬＡ２アイソフォームのノックダウンは選択的にＲＡＳ変異体を死滅させた。驚くべきことに、本発明者は、アテローム性動脈硬化症およびアルツハイマー病に対する臨床試験で以前に試験された有力な第二世代グループ７酵素阻害剤であるダラプラジブが、ＲＡＳ形質転換細胞においてリゾリン脂質蓄積を阻止し、発がん性のｒａｓ保持株を優先的に死滅させ、マウスでのＫｒａｓ^G12D/+／ｐ５３^-/-肺がんモデルにおいて生存を延ばしたことを見出した。

【0016】

したがって、ある態様では、本技術は、対象においてがんを処置する方法であって、対象に有効量の化合物を投与してがんを処置するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６（まとめてまたは個々に「本技術の化合物」などと称され、「本化合物」とも称される）のうちの少なくとも１種であり、がんがＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持し、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、前記方法を提供する。ダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、およびＭＬ２５６のそれぞれの構造式は下のスキーム１に示される。
スキーム１．

【0017】

【化3】

本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。

【0018】

ある態様では、本技術は、対象において腫瘍の成長を遅くするまたは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が腫瘍の成長を遅くするまたは後退させるのに有効な量であり、腫瘍がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの腫瘍であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、前記方法を提供する。本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。

【0019】

ある態様では、本技術は、対象において新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または対象において新生物の増殖を遅くするもしくは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または新生物の増殖を遅くするもしくは後退させるのに有効な量であり、新生物がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの新生物であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅である、前記方法を提供する。本明細書の任意の実施形態では、それは健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示すがんであり得る。

【0020】

「有効量」は所望の効果をもたらすのに必要とされる化合物または組成物の量を指す。本明細書で開示される任意の実施形態および／または態様では（簡潔にするために、以下では「本明細書で開示される任意の実施形態では」などと表現される）、有効量は対象に関連して決定され得る。本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」は、哺乳動物、例えばネコ、イヌ、齧歯類または霊長類である。典型的には対象はヒトであり、好ましくは、がん、腫瘍、および／または新生物を患っているまたは患っていると疑われるヒトである。用語「対象」および「患者」は互換的に使用され得る。有効量の一例は、これに限定されないが腫瘍量の減少を含む治療的（薬学的）使用のための許容される毒性およびバイオアベイラビリティレベルをもたらす量または投与量を含む。本明細書で開示される任意の実施形態では、有効量は、がんを処置する、腫瘍を処置する、腫瘍を縮小させる、新生物を処置する、新生物を縮小させる、および／または対象の生存期間を増加させるのに有効な量であり得る。例として、本技術の化合物を含む本明細書の任意の実施形態の有効量は、約０．０１μｇ～約２００ｍｇの化合物（例えば約１６０ｍｇの化合物）であり得る。別の例として、本技術の化合物の有効量（化合物の質量／患者の体重に換算して）は、１×１０^-5ｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇ、１×１０^-3ｇ／ｋｇ～１．０ｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、または好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇであってもよく、したがって、本明細書で開示される任意の実施形態では、本技術の化合物の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ／約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、またはこれらの値のうちの任意の２つを含むおよび／もしくはこれらの値のうちの任意の２つの間の任意の範囲であり得る（例えば約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなど）。

【0021】

本明細書で開示される任意の実施形態の方法は、医薬組成物を対象に投与するステップを含むことができ、医薬組成物は有効量の本技術の化合物および薬学的に許容される担体または１種もしくは複数の賦形剤、充填剤もしくは薬剤（特に指示および／または指定されない限り、以下ではまとめて「薬学的に許容される担体」と称される）を含む。したがって、本技術は、本明細書で開示される任意の実施形態の化合物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物および医薬も提供する。組成物は本明細書に記載の方法および処置において使用され得る（参照しやすいように、本技術の医薬および医薬組成物は、本明細書ではまとめて「組成物」または「本技術の組成物」などと称され得る）。医薬組成物は単位剤形でパッケージされ得る。単位剤形は、それを必要とする対象に投与されると、腫瘍を減少させることによって腫瘍を処置するのに有効である。一般的に、本技術の化合物を含む単位投与量は、患者の考慮事項に応じて変動する。そのような考慮事項は、例えば年齢、プロトコール、状態、性別、疾患の程度、禁忌、併用療法などを含む。これらの考慮事項に基づく例示的な単位投与量はまた、当技術分野の熟練医師によっても調整または修正され得る。例えば、本技術の化合物を含む患者のための単位投与量は、１×１０^-4ｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇまで、好ましくは１×１０^-3ｇ／ｋｇ～１．０ｇ／ｋｇまで変動し得る。本技術の化合物の投与量はまた（化合物の質量／患者の体重に換算して）１×１０^-5ｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇまで、１×１０^-3ｇ／ｋｇ～１．０ｇ／ｋｇまで、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇまで、０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇまで、または好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇまで変動してもよく、したがって、本明細書で開示される任意の実施形態では、投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ／約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、またはこれらの値のうちの任意の２つを含むおよび／もしくはこれらの値のうちの任意の２つの間の任意の範囲であり得る（例えば約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇなど）。適切な単位剤形は、これらに限定されないが、非経口液剤、経口液剤、散剤、錠剤、丸剤、ゲルカプセル剤、カプセル剤、トローチ剤、坐剤、貼付剤、鼻内スプレー剤、注射剤、埋込み可能な持続放出製剤、粘膜付着フィルム、局所ワニス、脂質複合体、液体などを含む。

【0022】

医薬組成物および医薬は、１種または複数の本技術の化合物を薬学的に許容される担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することによって調製され得る。そのような組成物は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁剤または液剤の形態であり得る。本組成物は、例えば、経口、非経口、局所、直腸、鼻、膣投与によるまたは埋込みリザーバーを介す様々な投与経路のために製剤化され得る。非経口または全身投与は、これらに限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、および筋肉内注射を含む。以下の剤形は、例として示されており、本技術を限定すると解釈されるべきでない。

【0023】

経口、口腔内、および舌下投与のために、散剤、懸濁剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、およびカプレットが固体剤形として許容される。これらは例えば、１種もしくは複数の本技術の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは互変異性体を少なくとも１種の添加剤、例えばデンプンもしくは他の添加剤と混合することによって調製され得る。適切な添加剤は、スクロース、ラクトース、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガントゴム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成もしくは半合成ポリマーまたはグリセリドである。経口剤形は、投与を補助するための他の成分、例えば、不活性希釈剤、または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、または保存剤、例えばパラベンもしくはソルビン酸、または抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、トコフェロールもしくはシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味料、香味剤または着香剤を含有してもよい。錠剤および丸剤は、当技術分野で公知の適切なコーティング材料でさらに処置され得る。
経口投与のための液体剤形は、不活性希釈剤、例えば水を含有し得る、薬学的に許容される乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、および液剤の形態であり得る。医薬製剤および医薬は、無菌液、例えばこれらに限定されないが、油、水、アルコール、およびこれらの組合せを使用する液体懸濁剤または液剤として調製され得る。薬学的に適切な界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤は、経口または非経口投与のために添加されてもよく、天然および修飾シクロデキストリン化合物を含んでもよい。

【0024】

上記の通り、懸濁剤は油を含み得る。そのような油は、これらに限定されないが、ラッカセイ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油およびオリーブ油を含む。懸濁調製物は、脂肪酸のエステル、例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドも含有し得る。懸濁製剤は、アルコール、例えばこれらに限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールを含み得る。エーテル、例えばこれらに限定されないがポリ（エチレングリコール）、石油炭化水素、例えば鉱物油およびワセリン；非プロトン溶媒、例えばジメチルスルホキシド；ならびに／または水も懸濁製剤において使用され得る。
注射可能な剤形は一般的に、適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して調製され得る水性懸濁剤または油性懸濁剤を含む。注射可能な形態は、溶液相であってもよくまたは懸濁剤の形態であってもよく、これらは溶媒または希釈剤で調製される。許容される溶媒またはビヒクルは、無菌水、リンゲル溶液、または等張生理食塩水溶液を含む。代替的に、無菌油が溶媒または懸濁化剤として用いられ得る。典型的には、油または脂肪酸は、天然または合成油、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドを含む不揮発性である。

【0025】

注射のために、医薬製剤および／または医薬は、上記の適当な溶液での復元に適した粉末であり得る。その例は、これらに限定されないが、凍結乾燥、回転乾燥もしくは噴霧乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、または粒状物を含む。注射のために、製剤は安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤およびこれらの組合せを含有してもよい。
本技術の化合物は、鼻または口を通す吸入により肺に投与され得る。吸入のための適切な医薬製剤は、任意の適当な溶媒ならびに任意で他の化合物、例えばこれらに限定されないが、安定剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤およびこれらの組合せを含有する、液剤、スプレー剤、乾燥散剤、またはエアゾール剤を含む。担体および安定剤は、特定の化合物の必要により変動するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無毒なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸、例えばグリシン、緩衝剤、塩、糖または糖アルコールを含む。水性および非水性（例えばフルオロカーボン噴射剤中）エアゾール剤は、吸入による本技術の化合物の送達に典型的に使用される。

【0026】

本技術の化合物の局所（口腔内および舌下を含む）または経皮投与のための剤形は、散剤、スプレー剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、および貼付剤を含む。活性成分は無菌条件下で、必要とされ得る、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と、および任意の保存剤、または緩衝剤と混合され得る。散剤およびスプレー剤は、例えば賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を用いて調製され得る。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤およびゲル剤も賦形剤、例えば、動物性および植物性脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物を含有し得る。吸収促進薬も皮膚を通した本技術の化合物のフラックスを増加させるために使用され得る。そのようなフラックスの速度は、速度制御膜（例えば経皮貼付剤の一部として）を設けることまたは化合物をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって制御され得る。

【0027】

それらの上記の代表的な剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤および担体は、当業者に一般的に公知であり、したがって本技術に含まれる。そのような賦形剤および担体は、例えば“Remingtons Pharmaceutical Sciences” Mack Pub. Co., New Jersey (1991)および“Remington: The Science and Practice of Pharmacy,” 20^th Edition, Editor: Alfonso R Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore (2000)に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
本技術の製剤は、下記の短期作用型、高速放出型、長期作用型、および持続放出型になるように設計され得る。したがって、医薬製剤は制御放出または低速放出用にも製剤化され得る。
本組成物は、例えばミセルもしくはリポソーム、もしくは何らかの他の封入形態も含んでもよく、または長期保存および／もしくは送達効果をもたらすために延長放出形態で投与されてもよい。したがって、医薬製剤および医薬は、ペレットまたは注射筒に圧縮され、デポー注射剤としてまたはインプラント、例えばステントとして筋肉内または皮下に埋め込まれ得る。そのようなインプラントは、公知の不活性物質、例えばシリコーンおよび生分解性ポリマーを用い得る。

【0028】

本明細書の任意の実施形態では、特定の投与量は、対象の疾患の状態、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、および食事、投与間隔、投与経路、排出速度、ならびに薬物の組合せに応じて調整され得る。有効量を含有する上記剤形のいずれもが十分に日常的な実験の範囲内であり、したがって、十分に本技術の範囲内である。当業者は、例えば対象において腫瘍量の減少があるまで、本技術の化合物を患者に漸増量で単に投与することによって、有効量を容易に決定することができる。本技術の化合物は、患者に１日当たり約０．１～約１，０００ｍｇの範囲の投与量レベル（上でさらに詳細に論じられている）で投与され得る。約７０ｋｇの体重を有する普通のヒト成人について、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．０１～約１００ｍｇの範囲の投与量は十分である（上でさらに詳細に論じられている）。しかし、使用される特定の投与量は、変動し得るまたは当業者によって適当と考えられるように調整され得る。例えば投与量は、患者の必要、腫瘍を伴うがんの重症度、および使用されている化合物の薬理学的活性を含むいくつかの因子に依存し得る。特定の患者のための最適な投与量の決定は当業者に周知である。本技術による処置の治療有効性を決定するために、様々なアッセイおよびモデルシステムが容易に用いられ得る。本技術の組成物（および有効量の決定）および方法の有効性も腫瘍量の減少、腫瘍の成長を遅くすること、および／または対象の生存期間が増加することによって実証され得る。本明細書に記載の適応状態のそれぞれについて、試験対象は、プラセボ処置または他の適切な対照対象と比較して、対象において障害によって引き起こされたまたは障害と関連する１種または複数の症状の１０％、２０％、３０％、５０％以上の減少、最大７５～９０％、または９５％以上の減少を示す。

【0029】

一態様では、本技術の化合物は、患者に、治療的使用に適した量または投与量（例えば本技術の任意の実施形態の医薬組成物に含まれる）で投与される。一般的に、本技術の化合物を含む単位投与量は、患者の考慮事項に応じて変動する。そのような考慮事項は、例えば年齢、プロトコール、状態、性別、疾患の程度、禁忌、併用療法などを含む。これらの考慮事項に基づく例示的な単位投与量はまた、当技術分野の熟練医師によっても調整または修正され得る。例えば、本技術の化合物を含む患者のための単位投与量は、１×１０^-4ｇ／ｋｇ～１ｇ／ｋｇまで、好ましくは１×１０^-3ｇ／ｋｇ～１．０ｇ／ｋｇまで変動し得る。本技術の化合物の投与量もまた、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇまで、または好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇまで変動し得る。

【0030】

本技術の化合物はまた、薬物動態特性、毒性またはバイオアベイラビリティ（例えばｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加）を改善するために、例えば有機部分またはコンジュゲートの共有結合によっても修飾され得る。コンジュゲートは、直鎖状または分岐状の親水性ポリマー基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。ポリマー基は、例えば薬物動態特性、毒性またはバイオアベイラビリティを改善するために当業者によって調整され得る分子量を含み得る。例示的なコンジュゲートは、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマーまたはポリビニルピロリドンおよび脂肪酸または脂肪酸エステル基を含んでもよく、これらのそれぞれは独立して約８～約７０個の炭素原子を含み得る。本技術の化合物と共に使用するためのコンジュゲートは、例えば任意の適切な置換基もしくは基、放射性標識（マーカーまたはタグ）、ハロゲン、タンパク質、酵素、ポリペプチド、他の治療剤（例えば医薬品または薬物）、ヌクレオシド、色素、オリゴヌクレオチド、脂質、リン脂質および／またはリポソームに対するリンカーとしても機能し得る。一態様では、コンジュゲートは、ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）、ポリグリシン、ＰＥＩとポリグリシンのハイブリッド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を含み得る。コンジュゲートは、本技術の化合物を例えば標識（蛍光または発光）またはマーカー（放射性核種、放射性同位体および／または同位体）にも連結して、本技術のプローブを含み得る。本技術の化合物と共に使用するためのコンジュゲートは、一態様ではｉｎ ｖｉｖｏ半減期を改善し得る。本技術の化合物と共に使用するための他の例示的なコンジュゲートならびにその適用および関連する技法は、米国特許第５，６７２，６６２号によって一般的に記載されているものを含み、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0031】

本明細書で開示される任意の実施形態では、がんは（および／または腫瘍は例えば以下のがんの腫瘍であってもよく、および／または新生物は例えば以下のがんの新生物であってもよい）扁平上皮癌、軟部組織肉腫、口腔黒色腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、エイズ関連がん、カポジ肉腫（軟部組織肉腫）、エイズ関連リンパ腫（リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、消化管カルチノイド腫瘍、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、皮膚の基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（ユーイング肉腫および骨肉腫および悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳がん、気管支腫瘍（肺がん）、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（消化管）、原発不明の癌腫、心臓（ｃａｒｄｉａｃ）（心臓（ｈｅａｒｔ））腫瘍、小児脳がん、胚細胞腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管がん（ＤＣＩＳ）、胎児性腫瘍、髄芽腫、子宮内膜がん（子宮がん）、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫（頭頸部がん）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼がん、網膜芽腫、卵管がん、骨の線維性組織球腫、骨肉腫、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（軟部組織肉腫）、胚細胞腫瘍、小児中枢神経系胚細胞腫瘍（脳がん）、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣がん、妊娠性絨毛性疾患、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓腫瘍、肝細胞（肝臓）がん、組織球症、ホジキンリンパ腫、眼内黒色腫、島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、腎臓（腎細胞）がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん（頭頸部がん）、白血病、口唇および口腔がん（頭頸部がん）、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、男性乳がん、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌（皮膚がん）、中皮腫、転移性がん、原発不明転移性扁平上皮頸部がん（頭頸部がん）、ｎｕｔ遺伝子変化を伴う正中線癌、口腔（ｍｏｕｔｈ）がん（頭頸部がん）、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症（リンパ腫）、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄白血病、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔がん（頭頸部がん）、鼻咽頭がん（頭頸部がん）、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔（ｏｒａｌ）がん、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、膵がん、膵神経内分泌腫瘍（島細胞腫瘍）、乳頭腫症（小児喉頭）、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん（頭頸部がん）、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん（頭頸部がん）、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫（肺がん）、妊娠および乳がん、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、再発性がん、腎細胞（腎臓）がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん（頭頸部がん）、肉腫、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫（骨がん）、カポジ肉腫、骨肉腫（骨がん）、セザリー症候群（リンパ腫）、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、皮膚の扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部がん、転移性（頭頸部がん）、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん（頭頸部がん）、口咽頭がん、下咽頭がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、気管気管支腫瘍（肺がん）、腎盂および尿管の移行細胞がん（腎臓（腎細胞）がん）、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、および／またはウィルムス腫瘍ならびに他の小児腎臓腫瘍であり得る。本明細書で開示される任意の実施形態では、がんは（腫瘍は例えば以下のがんの腫瘍であってもよく、新生物は例えば以下のがんの新生物であってもよい）膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんであり得る。本明細書で開示される任意の実施形態では、がんは（および／または腫瘍は以下を含むがんの腫瘍であってもよく、および／または新生物は以下を含むがんの新生物であってもよい）腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含み得る。

【0032】

本明細書の任意の実施形態では、投与するステップは、がん（例えば腫瘍）を含む対象における部位への本化合物の局所投与またはがん（例えば腫瘍）を含む対象における部位への組成物の局所投与を含み得る。本明細書の任意の実施形態では、投与するステップは、経口、直腸、鼻、膣、経皮、静脈内、筋肉内、または吸入投与を含み得る。本明細書の任意の実施形態では、投与するステップは、がん（例えば腫瘍）を含む対象における部位内へのまたはがん（例えば腫瘍）を含む対象における部位の近位への化合物の注射を含み得る。

【0033】

本技術の化合物はまた、患者に、腫瘍の処置またはワクチン接種において有用であり得る他の従来の治療剤と共に投与もされ得る。投与は経口投与、非経口投与、または鼻投与を含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、投与は皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、または筋肉内注射を含み得る。これらの実施形態のいずれかでは、投与は経口投与を含み得る。本技術の方法は、１種または複数の本技術の化合物、腫瘍の処置またはワクチン接種に潜在的にまたは相乗的に有効であり得る量の従来の治療剤を逐次的にまたは組み合わせて投与するステップも含み得る。本明細書の任意の実施形態では、投与するステップは、化学療法剤、例えばアルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、またはこれらの任意の２種以上の組合せの投与をさらに含み得る。本明細書の任意の実施形態では、投与するステップは、化学療法剤、例えばブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、またはこれらの任意の２種以上の組合せの投与をさらに含み得る。本明細書の任意の実施形態では、化学療法剤を投与するステップは、がんを含む対象における部位への化学療法剤の局所投与を含み得る。本明細書の任意の実施形態では、化学療法剤を投与するステップは、経口、直腸、鼻、膣、経皮、静脈内、筋肉内、または吸入投与を含み得る。本明細書の任意の実施形態では、化学療法剤を投与するステップは、がんを含む対象における部位へのまたはがんを含む対象における部位の近位への化学療法剤の注射を含み得る。

【0034】

本明細書の実施例は、本技術の利点を説明し、本技術の化合物および組成物を調製または使用することについて当業者をさらに支援するために提供される。本明細書の実施例は、本技術の好ましい態様をより完全に説明するためにも提示される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本技術の範囲を限定すると決して解釈されるべきでない。実施例は、上記の本技術の変形、態様、または実施形態のいずれも含み得るまたは組み込み得る。上記の変形、態様、または実施形態は、本技術の任意のまたは全ての他の変形、態様、または実施形態もさらにそれぞれ含み得るまたは組み込み得る。

【実施例】

【0035】

統計解析およびソフトウェア。全てのｐ値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用して、９５％信頼区間と共に両側の対応のないｔ検定を使用して算出した。多重比較は、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋによって補正した一元配置分散分析を使用して行った。反復数Ｎおよびエラーを各図において報告する。全体を通して、ｎｓ＝有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。増殖曲線はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３を使用して作成し、ガウス関数へのナノレポーター分布フィットを含む全ての他のデータは、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ９．０を使用して分析した。ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１４ａを使用して、カラーピクセルマップ、画像重ね合せ、および生レポーターデータの補正を作成した。ＩｍａｇｅＪまたはＦｉｊｉ（ＮＩＨ）を使用して、ウエスタンブロットフィルム密度を分析し、ブロットおよび免疫蛍光画像、β－ｇａｌ画像、ならびに広視野／共焦点画像（ＨＤＦ５／Ｂｉｏ－Ｆｏｒｍａｔｓプラグイン）を作成した。化学構造およびカートゥーンは、ＣｈｅｍＢｉｏＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ １３．０で設計した。図およびスキームのレイアウトは、Ａｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ ＣＳ６ ｖ１６．０．３で設計した。

【0036】

細胞株。初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）をＭＳＫＣＣのＬｏｗｅ研究室Ｃ５７ＢＬ／６マウスコロニーに由来する。ＳＶ４０ラージＴ抗原によってＭＥＦを不死化した。^82、83ｃＤＮＡプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ系によってパッケージされたレトロウイルスによって不死化ＭＥＦに形質導入した。レトロウイルスプラスミドベクターｐＴＲＥ－Ｔｉｇｈｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の修正バージョンを使用して、ｃＤＮＡインサート、空（スクランブル）ベクター、マウスＫ－ｒａｓ^G12V ４Ｂ、またはヒトＨ－ｒａｓ^G12VをＴｅｔ－ＯＮ ３Ｇ ｐＴＵＲＮ構築物⁸⁴の前にクローニングした。⁸⁵Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびウイルス量を増やすためのクロロキン／ＢＳＡ補充を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、プラスミドをレトロウイルスパッケージングプラスミドと共トランスフェクトし、１６時間後に新しい培地を添加し、トランスフェクションから２日後にウイルス上澄みを回収した。レトロウイルス形質導入は、６ｘ１０⁵個の標的細胞への０．４５μｍ濾過ＨＥＫ馴化培地（４μｇ／ｍＬポリブレン、Ｆｉｓｈｅｒ ＴＲ１００３Ｇを含む）の曝露により行った。ハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １０６８７－０１０）を選択のために使用した。ＳＶ４０ＬＴによる感染の前に自己切断レトロウイルスＣｒｅ組換え酵素^19、84、86でＫ－ｒａｓ^G12Dノックイン系を調製した。構成的Ａｋｔ１またはＰｔｅｎに対する構成的な短いガイドＲＮＡを保持するＳＶ４０ＬＴ ＭＥＦは以前に記載されている。⁸⁶ＳＶ４０ＬＴ Ａｔｇ５ノックアウト系⁸²はｐＴＵＲＮプラスミドによって形質導入した。全ての細胞株は、拡大増殖および保存の前にマイコプラズマについて試験した。ＲＡＷ ２６４．７マウスマクロファージ／単球は、ＡＴＣＣ（ＴＩＢ－７１）由来であり、本文に示されている通りであるが、１０％熱不活化ＦＢＳを添加した培地中で培養した。悪性細胞株は、同じ培地を使用して培養し、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの研究グループからの寄贈品であり、以下を含んだ：マウス由来のＫＰ肺、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／ｐ５３Ｒ２７０Ｈ浸潤性原発性肺腺癌；ヒトＰＡ－ＴＵ－８９８８Ｔ膵腺癌、ヒトＨＣＴ－１１６結腸癌、ヒトＡ５４９肺腺癌、ヒトＰａｎｃ－１膵管類上皮腺癌。

【0037】

細胞培養。細胞培養物を３７℃で、５％ＣＯ₂および周囲酸素でインキュベートした。この研究で使用した完全培養培地は、ピルビン酸塩補充ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １０３１３０２１）ならびに以下の最終濃度の添加剤：４．７５％ｖ／ｖ熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １００８２１４７）、８８．５Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５１４０１２２）、３．５４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３５０５００６１）、１．７７ｍＭ Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ２５０３００８１）、および３５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５６３００８０）からなった。日常的な継代培養は、ＴｒｙｐＬＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １２６０４０１３）を用いて行った細胞株は、液体窒素保存から取り出して７～８回の継代培養後には使用しなかった。液体窒素保存から取り出して少なくとも２回の継代培養後に実験を開始した。８０～９０％コンフルエントになる前に培養細胞を通常通りに分けた。脂溶性薬物を補充するために、ＤＭＳＯに溶解したストック化合物を適当な体積の３７℃完全培養培地とプレインキュベートし、１０分間穏やかに混合した。リポタンパク質欠損実験のために、ＦＢＳを同じ最終％ＬＰＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｓ５３９４）で置き換えた。全ての予め作製した溶液は滅菌濾過した（０．２２μｍ）。特に指示されない限り、ドキシサイクリン（５００ｎｇ／ｍＬ）を培地に、他の試験化合物と同時に添加した。脂肪酸を補充するために、１ｍＬ中６ｍＭストックを作製するのに必要な体積の脂肪酸油を、窒素ガスでパージした無菌エッペンドルフに移した。このチューブに、１ｍＬの１ｍＭ脱脂ＢＳＡ（フラクションＶ脂肪酸不含ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａ７０３０、ロット番号５ＬＢＱ０８７３Ｖ）を添加した。チューブをオートミキサーに、１０００ｒｐｍ、３７℃で３０分間入れた（エッペンドルフ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃ）。得られたストックＰＵＦＡ－ＢＳＡは、０．２２μｍ ＰＥＳ膜で滅菌濾過した。ストックを小分けし、窒素パージし、使用まで－２０℃で保存した。ＰＵＦＡミックスを補充した培養培地は、５μＭドコサヘキサエン酸（Ｓｉｇｍａ Ｄ２５３４）、５μＭアラキドン酸（ＥＭＤ １８１１９８）、ならびに各２．５μＭのリノール酸（ＬＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ１３７６）およびリノレン酸（ＡＬＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ２３７６）を含有した。脱脂ＢＳＡを対照条件に補充した。

【0038】

増殖アッセイ。増殖をアッセイするために、０日目～３／４日目まで６ｘ１０⁴個の細胞／ウェルを、完全培地を含む６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １４０６７５）に播種し、実験条件当たり３連のウェルを生成した。細胞を蒔いてから６～８時間後に、ウェルを新しい培地で簡単にリンスし、次いで適当に補充した試験培地で培養した。この時点で０日目のプレートを計数した。プレートを２４時間間隔で計数した。接着し、広がったＭＥＦは、トリパンブルー染色の欠如または切断されたカスパーゼ７もしくはＰＡＲＰについて陽性のウエスタンブロットの欠如（データは示していない）によって確認される通り、＞９５％生存可能である。⁸⁴接着した細胞を計数するために、培地を各ウェルから吸引し、次いで手動の撹拌を使用して、２回、室温（ＲＴ）の１×ＨＢＳＳ（ｗ／ｏ Ｃａ／Ｍｇ＋＋）中でリンスした。接着した細胞を１ｍＬ ＴｒｙｐＬＥでトリプシン処理した。イメージングサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ１０７９６、工場デフォルト設定）に２４μＬのトリプシン処理した細胞懸濁液を含有するチャンバースライド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｔ１０７９４）を載せた。１８個の視野をイメージングし、サイトメーター出力を細胞／ｍＬで得た。出力を細胞／粒子サイズについてゲーティングして最終計数が７μｍ以下の粒子を含まないようにし、これは培養からのバックグラウンド残屑を反映するために行った。上のゲーティング閾値を３４μｍに設定し、測定された１７μｍ平均の２倍のサイズを含むようにした。

【0039】

ハイパースペクトル顕微鏡検査。脂質レポーターイメージング実験のために、細胞を３５ｍｍガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐ．Ｐ３５Ｇ－１．５－１０－Ｃ）に播種し、約０．５～０．８ｘ１０⁶個の細胞がアッセイ日に存在するようにした。アッセイの２４時間前に、細胞を新しい培地で簡単にリンスし、記載の通りに培養した。アッセイ日に試験培地を無菌エッペンドルフに移動させ、ミニフュージでスピンし、細胞残屑をペレット化し、３７℃で保存した。接着した細胞をパルス培地（無血清完全培地）で簡単にリンスし、次いでナノレポーター（パルス培地中０．２μｇ／ｍＬ）に３０分間曝露させた。曝露後、余分なナノレポーターを、完全培地中でリンスすることによって取り除き、５時間のインキュベーション期間のために、保存した試験培地を培養皿に再び添加した。近赤外ハイパースペクトル顕微鏡検査⁸⁷を生きている接着細胞で行い、内膜小胞からの蛍光放射マップを得た。⁸⁸簡単に述べると、７３０ｎｍ連続波ダイオードレーザーを、ファイバーを通して１００×油対物レンズに供給し、接着した細胞内の蛍光レポーターを励起させた。回収した放射を１１００～１２００ｎｍに調整した符号化された波長のハイパースペクトルイメージングキューブとして保存した。キューブにおける各ピクセルの中心波長は、ＭＡＴＬＡＢにおいてローレンツ関数をフィッティングすることによって得た。１００×拡大のイメージング視野を表す、各キューブにおけるピクセルの全集団の中心波長は、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ９．０においてガウス関数でフィッティングした。得られたフィッティングした中心波長値を報告する。代表図のヒストグラムにおいて（＊）は、フィッティング分析に含まれなかった、細胞周囲に位置する固定されたセンサーからの放射値を表す。

【0040】

ウェルプレート分光法。特注の近赤外分光計で全体の分光測定を行った。⁸⁹脂質ストックをメタノールに予め溶解し、水性緩衝液中で３時間平衡化した後、センサーを添加した（１５０μＬ緩衝液中１μｇ／ｍＬのセンサー）。センサー－脂質混合物を５時間、３７℃でインキュベートし、次いで９６ウェルプレートに移した。各列は空のウェルを含んだ。試料ウェルをスーパーコンティニュームレーザーによって、５００ｎｍ～８３９ｎｍまで３ｎｍ刻みで、１秒の露光時間を使用して励起した。９３０ｎｍ～１３６８ｎｍの放射を取得し、データをＭＡＴＬＡＢにおいて補正し、ローレンツ関数にフィッティングし、ピーク強度および中心波長を生成した。

【0041】

免疫細胞化学。細胞をチャンバースライド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＺＧＳ０４１６／ＰＥＺＧＳ０８１６）に播種し、記載の通りに処置した。アッセイ時に、細胞を１５分間ＲＴで（４℃ ３７％ストックを使用して、温かい培養物に滴下添加する）３．７％パラホルムアルデヒドによって固定した。１×ＰＢＳ中７５ｍＭ塩化アンモニウムとの１０分のインキュベーションによって固定剤を不活化した。１×ＰＢＳで２回リンスした後、チャンバーを４℃で保存またはすぐに処理した（全ての試薬緩衝液は１×ＰＨＥＭ緩衝液：６０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＮａＣｌ、７０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ６．９を使用して調製した）：０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＷ２０）で５分間ＲＴでの透過処理、５％ＢＳＡ／０．３％ＴＷ２０で３時間ＲＴでのブロッキング、次いで穏やかに揺すりながら５％ＢＳＡ／０．３％ＴＷ２０中で一次抗体と４℃で終夜インキュベーション。各５分間の３回のＲＴ洗浄後、５％ヤギ血清（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ０１６２０１）の添加後に細胞を上記の通り１時間ＲＴでブロッキングした。蛍光二次抗体を５％ＢＳＡ／０．３％ＴＷ２０／５％ヤギ血清中へ希釈し、チャンバーを１時間ＲＴで、暗所でインキュベートした。一部の場合、３回の１０分ＲＴ洗浄後、希釈した核対比染色液（ＰＢＳ中のヘキスト、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ６２２４９）を２分間適用し、続いて２分間洗浄した。封入剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐ３６９６１）およびカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ １２５４４１８）を各スライドに適用した。標的に応じてＩＣＣプロトコールを修正した：核－二次インキュベーションを２時間に増やした；非核内膜－２％固定剤に減らし、１００％の－２０℃メタノール中で１０分間透過処理し、続いて１回リンスし、記載の通りにブロッキングした。以下の一次抗体を使用した：抗ＨＰ１γ（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２６１９Ｓ）、抗ホスホ－Ｈ２Ａ．Ｘ（１：３００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９７１８）、抗ＰＬＡ２ｇ７（１：５０、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ １５５２６－１－ＡＰ）、抗ＰＡＦＡＨ２（１：５０、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ １００８５－１－ＡＰ）；二次抗体は以下から選択した：Ａｌｅｘａ４８８／５６８ヤギ抗マウス、Ａｌｅｘａ５６８抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１１００１／Ａ１１００４＆Ａ１１０１１）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｓｕｐｅｒ Ｃｌｏｎａｌ ５５５／６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２７０４０／Ａ２７０３９）、またはヤギ抗ラットＩｇＧ５５５／６４７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１２４７／２１４３４）。

【0042】

イムノブロッティング。１００μＭペプスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ １１３５９０５３００１）を補充したプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ ７８４４６）をＲＩＰＡ緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ ８９９０１）またはエチルマレイミドを含まない変性免疫沈降（ＩＰ）緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ－４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、０．５％ＳＤＣ）中へ１：１００に希釈し、可溶性標的（ＲＩＰＡ）用または不溶性／膜結合性標的（ＩＰ緩衝液）用のワーキング細胞溶解緩衝液を作製した。細胞を２回冷たい１×ＨＢＳＳで洗浄した。氷冷溶解緩衝液を添加し、細胞をゴム製ポリスマンでこすり取った。溶解物を氷上のエッペンドルフにプールし、３０分間４℃で混合するように設定した。溶解物を２６Ｇ針により５フルストロークで均質化し、次いで１６，０００ｒｃｆで２０分間４℃の遠心分離機においてスピンさせた。ＲＴのブラッドフォード試薬（ＢｉｏＲａｄ ５０００２０５）を、ＢＳＡ標準物質または試料溶解物のいずれかを含有する、脱イオン水で希釈した試料と１：１で混合した。吸光度を５９５ｎｍでＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏプレートリーダーにおいて測定した。ローディング緩衝液は、１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液／２－メルカプトエタノール（ＢｉｏＲａｄ １６１０７４７／１６１０７１０）および必要に応じて脱イオン水からなった。最終ローディング試料を小分けし、使用まで－８０℃で保存した。凍結試料をすぐに８分間７５℃で（リン－タンパク質標的）または６分間９０℃で（全ての他の標的）加熱した。ＴＧＸプレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ ４５６８０９４、４～２０％）を、冷やした１×トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ １６１０７３２）を充填したＴｅｔｒａ Ｃｅｌｌ電気泳動装置（ＢｉｏＲａｄ １６５８００４）に載せた。１．５μＬ泳動ラダー（ＬＩ－ＣＯＲ ９２６９８０００）、１０～３０μＬ試料、または１０～３０μＬ空試料緩衝液を各レーンに注入した。電気泳動を１１０ボルト、ＣＶで８０分間または適当なラダー分離まで行った。ブロットサンドイッチは、緩衝液でぬらしたスタックペーパー（ＢｉｏＲａｄ）とゲルの間に保持された、メタノール、続いて転写緩衝液（ＢｉｏＲａｄ １００２６９３８）中でプレインキュベートした０．２μｍ ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ １６２０１７４）からなった。トランス－ブロットターボ転写システム（ＢｉｏＲａｄ １７０４１５０）を７分のミディ－ターボ設定で使用した。ブロット膜を切り取り、すぐに１×ＴＢＳ中でリンスし、次いでブロッキング溶液（１×ＴＢＳ－Ｔ中３％ｗ／ｖ ＢＳＡ）（ＢｉｏＲａｄ １７０６４３５；Ｓｉｇｍａ Ｐ１３７９）に移し、ＲＴで１．５時間撹拌した。一次抗体を１ｍＬのブロッキング緩衝液中へ希釈し、２枚のパラフィルムシートの間にこれを膜と共に挟んでから密封した。膜サンドイッチを終夜４℃で回転させながらインキュベートした。膜をパラフィルムから剥がし、１×ＴＢＳ－Ｔに入れ、１０分間ＲＴで撹拌しながら３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を十分なブロッキング溶液中で希釈し、撹拌しながら膜を１時間ＲＴで覆った。さらに３回の１０分洗浄の後、膜をＲＴの１×ＴＢＳ中でリンスし、次いでＨＲＰ基質（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＷＢＬＵＲ０５００）中で１分間インキュベートした。フィルムを感光させるために、湿った膜をＸ線カセット内のプラスチックインサート内に入れた。抗体は以下の通りであった：抗Ｃｏｘ１（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９８９６）、抗Ｃｏｘ２（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １２２８２）、抗ｐ３８ ＭＡＰＫ（１：１３００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ８６９０）、抗ホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ Ｔ１８０／Ｙ１８２（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４５１１）、抗ＡＴＦ－２（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２２６）、抗ホスホ－ＡＴＦ－２ Ｔ６９／Ｔ７１（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ５１１２）、抗ＴＢＰ（１：１５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４４０５９）、抗ｃＰＬＡ₂（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ５２４９）、抗ホスホ－ｃＰＬＡ₂ Ｓ５０５（１：７５０、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ５３０４４）、抗ホスホ－ＩκＢα Ｓ３２（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２８５９）、抗ＩκＢα（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４８１２）抗ＮＦ－κＢ ｐ６５（１：１０００、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ．ｃｏｍ Ａ５０７５）、抗ホスホ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓ４６８（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３０３９）、抗ホスホ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓ５３６（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３０３３）、抗ＴＮＦ－α（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １１９４８）、抗ＩＬ－６（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １２９１２）、抗プロスタグランジンＥシンターゼ（１：１０００、Ａｂｃａｍ ａｂ１８０５８９）、抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４６９５）、抗ホスホ－ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９１０１）、抗ｐ１６（１μｇ、Ａｂｃａｍ １８９０３４）、抗ｐ２１^waf1/cip1（１．６μｇ、Ａｂｃａｍ １０９１９９）、抗ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９２５２）、抗ホスホ－ＳＡＰＫ／ＪＮＫ Ｔ１８３／Ｙ１８５（１：５００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ４６６８）、抗ｐ１９ＡＲＦ（１：１０００、Ａｂｃａｍ ａｂ８０）、抗ＰＬＡ２ｇ７（１：４００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ １５５２６－１－ＡＰ）、抗ＰＡＦＡＨ２（１：４００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ １００８５－１－ＡＰ）；二次抗体はＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ（１：２０００～１：５０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７４）であった。

【0043】

ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ染色。６ウェルプレートに蒔いた細胞を使用し、製造業者の使用説明書（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ９８６０）に従って染色を行った。処理後、濃縮したヘキスト色素溶液を各ウェルに添加し、核を対比染色し、高ゲイン蛍光イメージングで細胞質基質のブリードスルーを引き起こした。分析および報告のために、ＦｉｊｉのＣｏｌｏｒ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎプラグインを使用して、顕微鏡のカラーカメラによって取得したＲＧＢ画像を３種のＨ＆Ｅ ＤＡＢ成分にデコンボリューションした。（Ｒ＝０．６５０、Ｇ＝０．７０４、Ｂ：０．２８６）で表されるカラー１だけを分析に使用した。同一の閾値を、得られた単一カラー画像（８ビット）に適用し、バイナリーマスクを得た。これらのバイナリー画像は、β－Ｇａｌ陽性マスクであった。スケーリングを使用して細胞質基質のブリードスルーの強度を増加させた後、同じ視野から取得したＤＡＰＩ画像上でセグメンテーションプログラムを使用して、全細胞マスクを別々に生成した。マニュアルの検証は、セグメンテーションが正確であることを示した。各視野におけるβ－Ｇａｌ陽性細胞の割合（および報告された％）は、β－Ｇａｌと重なっているセグメント化された領域の数／核の合計数として算出した。技術的反復（１つの条件当たり５～１０回）を各生物学的反復と合わせ、これを使用して％陽性平均および標準偏差を決定した。各図の代表的な画像は、Ｆｉｊｉのアザン・マロリー設定を使用した、カラーデコンボリューションされた透過光画像であり、β－Ｇａｌ染色が強調されている。

【0044】

Ｐａｎ－ｓＰＬＡ２／ＰＡＦ－ＡＨ活性および全脂質ヒドロペルオキシド。発色アッセイのために、ｓＰＬＡ２（Ｃａｙｍａｎ ７６５００１）、ＰＡＦ－ＡＨアッセイ（Ｃａｙｍａｎ ７６０９０１）、または脂質ヒドロペルオキシド（ＬＰＯ）（Ｃａｙｍａｎ ７０５００３）用の市販の酵素活性ベースキットを製造業者の使用説明書に従って使用した。必要とされる水および溶媒はＬＣ－ＭＳグレードであった。簡単に述べると、アッセイ日に６ウェルプレートのウェルが９０％～１００％コンフルエントであるように細胞を誘導した。ｓＰＬＡ２アッセイについて、冷たい１０ｋＤａカットオフの膜デバイス（Ｓｉｇｍａ ＵＦＣ５０１０９６）を使用して、溶解物／培地を冷たいＰＢＳに対して２回スピン濾過した。

【0045】

リピドミクスおよび分析。収穫日に培養皿が９０～１００％コンフルエントであるように、１００ｍｍプレートに蒔き、成長させ、誘導した。培養培地はフェノールレッド不含であった。馴化培地を収穫するために、全体積をドライアイス／アルコールスラリー上のガラスバイアルに移し、回収した体積の１／４に等しい体積の新しい冷たいＰＢＳを使用して細胞をリンスし、この塊を回収し、プールした。溶解物を収穫するために、細胞の別の培養皿を３回冷たいＨＢＳＳで洗浄し、最後の洗浄で液体を吸引し、培養皿をドライアイス／アルコールスラリー上に置き、３０秒間凍結させた。１ｍＬの２：０．８部のメタノール：水ミックス（－８０℃に冷やし、ドライアイス上に保存）をプレートに添加した。培養皿をすぐに氷上に移し、ゴム製ポリスマンでこすり取った。溶解物を培養皿の底にプールし、次いで－８０℃保存までドライアイス上のガラスバイアルに移した。溶解物抽出物バイアルを窒素ガスで簡単にフラッシュした。修正したＢｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ抽出を専用のメタボロミクス研究室で行った。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＵＨＰＬＣ（グリセロリン脂質／スフィンゴ脂質について順相、ステロール／グリセロ脂質について逆相）と一体化したＡｇｉｌｅｎｔ ６４９０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳを使用した。定量は、ポジティブおよびネガティブエレクトロスプレーモードでのＭＲＭ法を使用した。生データは、Ｍｏｌ％、または質量分析計で検出された絶対全脂質存在量（ｎｇ／ｍＬ）に対して正規化した脂質種のｎｇ／ｍＬとして報告した。報告したデータは、Ｍｏｌ％を並列処置したプレートからの全接着細胞数で割ったものであり、対照に対する倍率変化として算出される：（ｉＫＲａｓ／ベクター）－１。

【0046】

共焦点顕微鏡検査。ＡｉｒｙＳｃａｎモジュール（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）、６３× １．４ＮＡ油対物レンズ、および適当なレーザー線およびフィルターを使用する点走査ＬＳＭ ８８０機器で高分解能共焦点走査を行った。固定細胞実験のために、試料に＃１．５カバーガラスを載せ、これを対物レンズと密着させた。露光時間および検出器ゲインは、実験中一定に保持した。
広視野顕微鏡検査。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ５１倒立顕微鏡およびＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７３（カラー）またはＸＭ１０（グレースケール）カメラで、透過光および免疫蛍光画像を取得した。Ｘ－Ｃｉｔｅシリーズ１２０Ｑ専用水銀蒸気ショートアーク励起ランプで照射した。適当なＥｘ／Ｅｍフィルターキューブが利用可能であった。露光時間および検出器ゲインは、実験中一定に保持した。

【0047】

ｓｉＲＮＡノックダウン。アッセイ日に８０～９０％コンフルエンスに到達するように標的細胞を播種することによって、ＭＥＦ細胞株の一過性ノックダウンを達成した。拡張実験のために、処置日に４０～５０％コンフルエンスに到達するように細胞を播種した。各ｓｉＲＮＡおよび標的ウェルについて、２つのエッペンドルフチューブそれぞれに１５０μＬの無血清および抗生物質不含ＤＭＥＭを充填した。標的ウェルにおける最終体積が４５ｎＭであるようにｓｉＲＮＡを一方のチューブに移すことによってトランスフェクションカクテルを作製した。他方のチューブに９μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ １３７７８）を添加した。ｓｉＲＮＡ体積をＲＮＡｉＭＡＸ体積に添加し、ピペット操作によって混合した。カクテルをＲＴで１０分間インキュベートし、次いで２ｍＬの新しい完全培地を含有する標的ウェルに滴下添加した。プレートを回転させて混合し、３７℃で４８時間インキュベートした。ｓｉＲＮＡへの最初の２４時間の曝露後、ドキシサイクリンおよび他の化合物を添加した：ウェルの内容物の１ｍＬのアリコートを取り出し、化合物と混合し、戻した。ｓｉＲＮＡは以下の通りであった：普遍的な陰性対照（Ｓｉｇｍａ ＳＩＣ００１／００２ ＷＤＡＡ）、ｐｌａ２ｇ７ ＃１（Ｓｉｇｍａ ＮＭ＿０１３７３７ ＳＡＳＩ＿Ｍｍ０１＿００１６２６７８）、ｐｌａ２ｇ７ ＃２（Ｓｉｇｍａ ＮＭ＿０１３７３７ ＳＡＳＩ＿Ｍｍ０１＿００１６２６７７）、ｐａｆａｈ２ ＃１（Ｓｉｇｍａ ＮＭ＿１３３８８０ ＳＡＳＩ＿Ｍｍ０１＿００１８０４３５）、ｐａｆａｈ２ ＃２（Ｓｉｇｍａ ＮＭ＿１３３８８０ ＳＡＳＩ＿Ｍｍ０１＿００１８０４３６）。

【0048】

乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）アッセイ。市販のキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃ２０３００）を使用して、培養馴化培地における乳酸脱水素酵素活性をアッセイした。簡単に述べると、細胞処置およびインキュベーション後の終点時に、プレートを手動で撹拌し、任意の遊離細胞を取り除いた。馴化培地を１５ｍＬチューブに移した。脱イオン水中９％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＴＸ１００）を各チューブに添加し、ボルテックスした。新しい完全培地を９％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００とボルテックスし、陰性対照を作製した。陽性対照（すなわち１００％溶解）を作製するために、接着細胞の１つのウェルをある体積の新しい陰性対照ミックスに曝露し、こすり取り、チューブに戻した。ボルテックスし、ＲＴで５分間インキュベートした後、全てのチューブを遠心分離した（ＲＴで７，０００ｒｃｆ）。得られた上澄みの適当な体積を製造業者の３８４ウェルフォーマットアッセイにおいて使用した。結果（死滅％）を各時点で算出し、死滅％比（最終／初期時）を報告する。

【0049】

ダラプラジブ処置後の細胞生存率。処置開始の１日前に、５，０００個の細胞／ウェルのドキシサイクリン誘導ｉＫＲａｓまたは標的マウス／ヒト細胞を９６ウェルプレートに蒔いた。実験日に漸増濃度のダラプラジブを三連で馴化培地に添加した。４８時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）放射アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ９６８１）を使用して細胞生存率を判定した。使用前に、復元したキット試薬を室温に平衡化した。細胞溶解を開始するために、５０μＬの試薬を各ウェルに添加した。プレートを１０分間室温で、オービタルシェーカー上で穏やかに混合しながらインキュベートした。Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）を使用して放射を測定した。アッセイからの結果を非処置対照のパーセンテージとして算出した。使用した細胞型および下流マーカーに応じて、ダラプラジブの報告されたＥＣ₅₀は１０～１０００ｎＭの範囲である。酵素ＩＣ₅₀は１～１０ｎＭの範囲である。
コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴｘＢ）標識。細胞をチャンバースライドまたはガラス底培養皿に播種した。細胞にＡｌｅｘａ６４７－ｓｓＤＮＡコーティングレポーターを単独でまたはコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴｘＢ、０．５μｇ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃ２２８４３）と組み合わせて以前に記載された通りにパルスした。培地を除去し、細胞を室温（ＲＴ）の１×ＨＢＳＳ中で３回リンスした。最終時点で、顕微鏡検査グレードのパラホルムアルデヒド（ＥＭＳ １５７１４－Ｓ）を培養培地に滴下添加し、穏やかに回転させて２％ｖ／ｖの最終濃度を生成することによって細胞をｉｎ ｓｉｔｕで固定した。一部の場合では、ストックからの１：１０希釈で核ヘキスト対比染色液を固定剤に添加した。イメージングは下に示される通りに進めた。内腔におけるＣＴｘＢおよびＡｌｅｘａ６４７で標識した小胞の相関する動きを示す共焦点動画を取得した（データは示していない）。

【0050】

トランスゴルジ網３８－ＧＦＰ融合発現。各３５ｍｍ培養皿について、２μｇのｃＤＮＡ、Ｔｇｏｌｎ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＭＧ５Ａ１１９３－ＡＣＧ）を、２μＬ ＰＬＵＳ試薬を含有する無血清および抗生物質不含ＤＭＥＭに添加した。８μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ １５３３８０３０）を無血清培地の別のチューブに添加した。チューブをピペット操作によって混合し、室温で１０分間放置インキュベートした。トランスフェクション日に５０～６０％コンフルエンスに到達するように細胞を播種した。Girotti M, Banting G. “TGN38-green fluorescent protein hybrid proteins expressed in stably transfected eukaryotic cells provide a tool for the real-time, in vivo study of membrane traffic pathways and suggest a possible role for ratTGN38.” Journal of cell science 109 (Pt 12), 2915-2926 (1996)を参照されたい。カクテルミックスを完全培地で成長している細胞に滴下添加した。培養皿を回転させ、次いで３７℃で３６時間インキュベートした。この期間の後、細胞を洗浄し、処置およびイメージングの前に２時間休めるようにした。

【0051】

電子顕微鏡検査。誘導細胞株を保持する６ウェルプレートを８０～９０％コンフルエンスに成長させ、１×ＨＢＳＳで２回洗浄し、許容されるＥＭ固定剤で固定した。調製およびイメージングのためにプレートをＷｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＣＬＣ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに運んだ。
ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡｓｅｑ）。十分な出発材料を確実にするために、ベクターおよびＫ－ｒａｓ^G12Vのそれぞれの２つの生物学的反復を６ウェルプレートにおいて成長させ、３つのウェルをそれぞれの反復専用にした。抽出日に培地を吸引し、５００μＬのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ １０２９６０１０）を各ウェルにピペットで入れた。プレートを氷上に置き、各ウェルの内容物を撹拌し、ゴム製ポリスマンでこすり取り、全ての材料が均質であることを確実にしてから予め冷却した２ｍＬエッペンドルフ（Ｆｉｓｈｅｒ ０５－４０２－２４Ｃ）に移した。試料をイソプロパノール／ドライアイススラリーにおいて瞬間凍結し、ＭＳＫＣＣ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（ＩＧＯ）による処理：抽出、ポリ－Ａ濃縮、品質管理、ライブラリー調製、およびシークエンシング（３～４千万リード数、ＨｉＳｅｑ－ＰＥ５０）まで－８０℃で保存した。アライメント、クラスタリング、Ｈｔｓｅｑカウント、および差次的発現のための標準デリバリーパイプラインを使用してＭＳＫＣＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｏｒｅ（ＢＩＣ）によって下流バイオインフォマティクスを行った。

【0052】

ＰＣ－ＳＵＶ小胞およびＡＮＳアッセイ。５００ｍｇのダイズホスファチジルコリン（Ｌｉｐｏｉｄ）を２００μＬのエタノールに溶解し、２５μＬのエタノール－脂質溶液を７５０μＬの脱イオン水に注入した。得られたＭＬＶ分散液を手動の押出し機で２００ｎｍ膜を通して４回押し出した。得られた小さいユニラメラ小胞（ＳＵＶ）のサイズは約１６０ｎｍであった。Portnoy E, et al. “Indocyanine Green Liposomes for Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Cerebral Malaria.” Theranostics 6, 167-176 (2016)を参照されたい。ＡＮＳアッセイのために、８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸アンモニウム塩（Ｓｉｇｍａ １０４１７－Ｆ）の１００μＭストックを脱イオン水に溶解した。ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ（Ｆｉｓｈｅｒ ＢＰ１６６－１００）のストック溶液を脱イオン水中で生成した。最初に過剰のワーキング濃度の２μＭ ＡＮＳを１μＭ ＳＵＶ（全脂質に基づく算出）と１×ＰＢＳ中で混合することによってアッセイを準備した。この混合物にビヒクルブランク、ＳＤＳ、またはレポーターを添加した。対照として、ＳＵＶの非存在下で、ＡＮＳをＳＤＳまたはレポーターと混合した。ＵＶ透過ハーフウェル９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６７９）を使用する３０分の卓上インキュベーション後、蛍光をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）で測定した。プログラムを３５０ｎｍ励起および４７０ｎｍ放射（５ｎｍバンド幅）に設定した。１２０の手動ゲインおよびモード１（４００Ｈｚ）での５０回のフラッシュで上方モードを使用した。待機時間は０ミリ秒であり、ｚポジションは２２３０３であった。

【0053】

メチレンブルー染色。２４時間の細胞株誘導後、１％ｗ／ｖストック溶液（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ２５４３１）を１×ＨＢＳＳで０．０５％ｖ／ｖに希釈することによってワーキング染色液を製造した。細胞を洗浄し、このワーキング溶液で覆い、次いで５分間３７℃でインキュベートした。その後のイメージングのために、細胞をＲＴの新しい１×ＨＢＳＳ中で完全にリンスし、維持した。画像取得のために、広視野顕微鏡、カラーカメラ、および１０×対物レンズを使用した。

【0054】

グループ７遺伝子に対するｓｈＲＮＡのレトロウイルス送達。ＲＴ３ＧＥＰＩＲ ｍｉＲ－Ｅベクターバックボーンを使用して、ウミシイタケルシフェラーゼ（ベクター対照）、ｐｌａ２ｇ７、またはｐａｆａｈ２に対するｓｈＲＮＡ標的化配列（遺伝子標的１つ当たり２つ）をクローニングした。ｓｈＲＮＡインサートは２２塩基長であった。プラスミドＤＮＡは、ｓｈＲＮＡ生成のためのアルゴリズムを一部使用してＭＳＫＣＣのＧｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｃｏｒｅによって生成され、供給された。Pelossof R, et al. “Prediction of potent shRNAs with a sequential classification algorithm.” Nature Biotechnology 35, 350-353 (2017)を参照されたい。１００ｍｍ ＬＢ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｌ１１１００２）に接種したＭａｃｈ１コンピテント細菌を使用してプラスミド増幅を行った。製造業者の使用説明書（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔ３００２）を使用して細菌ストックを最初に拡大増殖させ、続いて－８０℃で保存した。細菌へのプラスミドの形質転換を氷上で行い、２０μＬのコンピテントＭａｃｈ１を２５０ｐｇのＤＮＡと穏やかに混合した。この塊を、カルベニシリン（２００μｇ）を含む３７℃の予め温めた１００ｍｍ ＬＢ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｌ１０４６）にピペットで滴下し、続いてビーズ回転させた。プレートをドライ３７℃インキュベーターにおいて１８時間またはしっかりしたコロニーが形成されるまでインキュベートした。単一の形質転換体コロニーを、２００μｇカルベニシリンを含む３ｍＬ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｔ７５１０；１００μｇカルベニシリン、Ｆｉｓｈｅｒ ＡＡＪ６７１５９ＡＤを含む）に接種することによってコロニーを増幅した。蓋をゆるくはめた培養チューブを１５時間３７℃で振盪しながらインキュベートした（２２５ｒｐｍ）。保管のために、得られた濁ったブロスから９００μＬを取り出し、５０％無菌グリセロールと１：１混合し、－８０℃で凍結した。残りのブロス（または保管を行わない場合は全体積）をミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ ２７１０６）のために遠心沈殿した（６８００ｒｃｆ、３分、１５℃）。グリセロール中に保管したプラスミドの再増幅のために、無菌白金耳でグリセロールストックを少しこすり取り、カルベニシリン２００μｇを含む２つの１００ｍｍ ＬＢ寒天プレート全体に連続ストリーキングした。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ３２１３）に由来するＰｈｏｅｎｉｘ－ＡＭＰＨＯ細胞株を使用してレトロウイルスバッケージングを達成した。Ｐｈｏｅｎｉｘを拡大増殖させ、次いで３継代で小分けして液体窒素中で凍結し、使用するために２．５ｘ１０⁶個のＰｈｏｅｎｉｘ細胞を、６０ｍｍプレート上の１０％熱不活化ＦＢＳを補充したが抗生物質は含まない、別の場所に記載した基本成長培地中にトランスフェクションの２４時間前に解凍し、約８０％コンフルエンスを達成した。蒔いてから１２時間後に新しい培地と交換した。各６０ｍｍ培養皿を埋めるトランスフェクションカクテルは、６μｇプラスミドＤＮＡを、ＦＢＳ／抗生物質を含まない１ｍＬ成長培地、続いて１：１比のＤＮＡ：ＰＬＵＳ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５３３８１００）中へ希釈し、穏やかに混合したものであった。ミックスを室温で１０分間インキュベートし、続いて２０μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５３３８１００）を添加し、このミックスを２５分間室温でインキュベートした。トランスフェクションの準備ができたＰｈｏｅｎｉｘ培養皿からの２ｍＬの馴化培地を、抗生物質を含まない２ｍＬの新しい培地と混合した。２５μＭクロロキンをこの４ｍＬ体積に添加した。この混合した体積をトランスフェクトされるＰｈｏｅｎｉｘ培養皿に、単層を乱さないよう穏やかに移した。次いでトランスフェクションカクテルをＰｈｏｅｎｉｘ培養皿に滴下添加し、これを３７℃で９～１０時間インキュベートした。この時間の後、培地を吸引し、抗生物質および１０ｍｇ／ｍＬ滅菌濾過ＢＳＡ（１×ＰＢＳに溶解したＳｉｇｍａ Ａ１４７０）を補充した５ｍＬの新しい培地を各培養皿に穏やかに添加した。培養皿をインキュベーターに移し、Ｐｈｏｅｎｉｘ細胞の１００％コンフルエンスを仮定し、各遺伝子構築物を表すＰｈｏｅｎｉｘ馴化培地をプールし、無菌０．４５μｍフィルターを通して濾過することによって、少なくとも２４時間後にウイルス上澄み収穫を開始した。培地の酸性化ゆえに、濾過したウイルス上澄みを、１０％ｖ／ｖＨＥＰＥＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ １５６３０１０６）および２５％ｖ／ｖの新しい完全成長培地で緩衝した。濾過したウイルス上澄みを瞬間凍結し、密封したコニカルチューブに－８０℃で保存した。最初に１００ｍｍ培養皿当たり５ｘ１０⁵個の標的細胞を、５％ＦＢＳを含む完全培地に終夜播種することによって、標的ＭＥＦ細胞株にウイルスを感染させた。凍結したウイルス上澄みを３７℃の水浴中で迅速であるが不完全に解凍した。４ｍＬのウイルス上澄みを、５％ＦＢＳを補充した１ｍＬの新しい培地で希釈することによって形質導入カクテルを作製した。次いでポリブレンを４μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、カクテルを穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートした。形質導入カクテルを、吸引した標的細胞プレートに添加した。培養皿を３７℃で８時間インキュベートし、その後５％ＦＢＳを補充した新しい培地を添加して培養皿体積を１０ｍＬにした。インキュベーションをさらに３６時間または細胞が９０％コンフルエンスに到達するまで続けた。ＨＢＳＳおよび完全培地を使用して馴化培地を完全に洗い流し、次いで標的細胞を新しい培養皿に分け、２日後に８０～９０％コンフルエンスを達成し、二重の抗生物質選択を開始した。選択するために、完全成長培地に元のｐＴＵＲＮベクターの維持のための３０μｇ／ｍＬハイグロマイシン（死滅濃度約１５０μｇ／ｍＬ）およびｓｈＲＮＡ構築物を保持する細胞の選択のための３μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した。未感染および未処置の対照を並行して成長させた。抗生物質を含む完全培地を２日ごとに、対照培養物が死滅するまで標的細胞において交換した。選択中に増殖している細胞コロニーを拡大増殖させ、全ハイグロマイシン選択用量にさらに２日間曝露し、元の誘導性ｃＤＮＡの存在を確実にし、次いで保存またはイムノブロット分析のために収穫した。アッセイは、適当な株（ウミシイタケ対照に対してｉＫＲａｓ／ｍｉｒＧ７またはｉＫＲａｓ／ｍｉｒＡＨ２）がＲａｓＧ１２Ｖを過剰発現し、グループ７またはｐａｆａｈ２タンパク質の低下したレベルを有することを示したが、対照細胞株は、ナノセンサーによってアッセイすると上昇した炎症脂質含量を示し、キットでアッセイすると上昇したＰＡＦＡＨ活性を示した。ｉＫＲａｓ保持ノックダウン細胞株は、ナノセンサー応答の明確な変化を示さず、ＰＡＦＡＨのアッセイは、細胞溶解物および条件培養培地における上昇した活性を報告した（データは示していない）。これらの理由で、安定な誘導性ｓｈＲＮＡは報告されず、代わりに一過性ＲＮＡｉを使用した。

【0055】

分化マーカーのための免疫細胞化学。以下の一次抗体を間接的免疫蛍光に使用した：０．１μｇ／ｍＬ抗ビメンチンマウスモノクローナル（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ ＶＰＶ６８４）、１μｇ／ｍＬ抗ＳＭＡマウスモノクローナル（Ｓｉｇｍａ Ａ５２２８）、２．５μｇ／ｍＬ抗Ｅ－カドヘリンマウスモノクローナル（ＢＤ ６１０１８１）、１：３００抗シンタキシン６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ２８６９）、１：３００抗ＬＡＭＰ１（Ａｂｃａｍ ２５２４５）。結果は、ｉＫＲａｓが、ベクターにおけるバックグラウンド染色またはＥ－ｃａｄの陽性対照細胞株ＨＫ－２と比較すると、これらの最終分化マーカーのいずれも発現しないことを示した（データは示していない）。

【0056】

試薬および材料。ナノレポーターを記載の通りに調製した⁸⁸。簡単に述べると、未加工ナノチューブ（ＳＷＣＮＴ）を一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）配列５’－ＣＴＴＣＣＣＴＴＣ－３’（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と懸濁し、水性二相（ＡＴＰ）分離に供して（９，４）カイラリティを精製した。ストック溶液を４℃で維持した。共焦点イメージングのために、１μｍｏｌのＡｌｅｘａ６４７－ｓｓＤＮＡ（５’－ＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴ／ｉＳｐ１８／／３ＡｌｅｘＦ６４７Ｎ／－３’、ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してレポーターを生成した。１ｍｇの未加工ＳＷＣＮＴ（ＮａｎｏＩｎｔｅｇｒｉｓ、ＨｉＰｃｏ）と０．１Ｍ ＮａＣｌに溶解した１ｍｇ ｓｓＤＮＡとの分散を、この混合物を３０分間－２０℃のｃｏｌｄ ｂｌｏｃｋ内で超音波処理（２ｍｍ段階プローブ、Ｓｏｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｉｎｃ．、パルス：１分オン、１５秒オフ）することによって達成した。得られた懸濁液を１０分間３０，０００ｒｃｆで卓上遠心分離した。上澄みを３０分間１７１，１８０ｒｃｆで超遠心分離した。得られた上澄みを脱イオン水に対して３回スピン濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ、１００ｋＤａ）、再懸濁し、次いで１０分間、３０，０００ｒｃｆで遠心分離した。上澄みの上部９０％を回収し、ＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ分光光度法（Ｊａｓｃｏ Ｖ－６７０）によって測定した。濃度を算出するために使用した吸光係数はε（９１０ｎｍ）＝０．０２２５４Ｌ・ｍｇ^-1・ｃｍ^-1であった。ＰＢＳおよびＨＢＳＳはＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙによって調製された。ＤＭＳＯ（Ｆｌｕｋａ ＢＰ２３１１）をモレキュラーシーブ（Ｆｌｕｋａ ６９８３９）と共に保存した。この研究で使用した薬物および化合物は以下の通りであった：ドキシサイクリン塩酸塩溶液（Ｓｉｇｍａ Ｄ３０７２）、バレスプラジブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ１１１０）、ＭＪ－３３（Ｃａｙｍａｎ ９０００１８４４）、ＢＥＬ（Ｃａｙｍａｎ ７０７００）、ＭＡＦＰ（Ｃａｙｍａｎ ７０６６０）、ダラプラジブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７５２０）、リラプラジブ（ＭＣＥ ＨＹ－１０２００４／ＣＳ－００２２４４６）、ＭＬ２５６（寄贈品）、ＡＡ３９－２（寄贈品）、Ｐ１１（Ｃａｙｍａｎ １７５０７）、ＴＳＩ－０１（Ｃａｙｍａｎ １７６２８）、メチルカルバミルＰＡＦ Ｃ－１６（Ｃａｙｍａｎ ６０９０８）、（±）－α－トコフェロール（Ｓｉｇｍａ Ｔ３２５１）、ホスホコリンクロリドカルシウム塩四水和物（Ｓｉｇｍａ Ｐ０３７８）、リノール酸（Ｓｉｇｍａ Ｌ１３７６）、１－Ｃ１６エーテルＭＧ（Ａｖａｎｔｉ ９９９９７１）、１８：１ ＢＭＰ（Ｓ，Ｒ）（Ａｖａｎｔｉ ８５７１３３）、Ｃ１８ ＬＰＡ（Ａｖａｎｔｉ ８５７２２８）、１８：１スフィンゴシン－１－リン酸（Ａｖａｎｔｉ ８６０４９２）、１８：０ ＰＡ（Ａｖａｎｔｉ ８３０８６５）、８：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５２７５）、１４：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５５７５）、１６：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５６７５）、Ｃ１６ ２：０ ＰＡＦ（Ａｖａｎｔｉ ８７８１１０）、１８：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５７７５）、１８：１ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８４５８７５）、２０：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５７７７）、２４：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５８００）、１４：０ ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５０３４５）、１６：０ ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５０３５５）、１８：０ ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５０３６５）、１６：０ ＬＰＳ（Ａｖａｎｔｉ ８５８１４２）、１６：０ ＰＳ（Ａｖａｎｔｉ ８４００３７）、１８：０ ＬＰＳ（Ａｖａｎｔｉ ８５８１４４）、１４：０ ＬＰＥ（Ａｖａｎｔｉ ８５６７３５）、１８：０ ＬＰＥ（Ａｖａｎｔｉ ８５６７１５）、１４：０ ＰＥ（Ａｖａｎｔｉ ８５０７４５）、１６：０ ＬＰＧ（Ａｖａｎｔｉ ８５８１２２）、１６：０ ＰＧ（Ａｖａｎｔｉ ８４０４５５）、１６：０ ＬＰＩ（Ａｖａｎｔｉ ８５０１０２）、１６：０ ＰＩ（Ａｖａｎｔｉ ８５０１４１）、ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ２７１１）、ＮＰ－４０（Ｓｉｇｍａ Ｉ８８９６）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ ４３６１４３）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）（Ｓｉｇｍａ Ｄ６７５０）、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ ＥＤＳ）、ＴＡＫ－６３２（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７２１９）、ＧＤＣ－０９４１（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ１０６５）、Ｔｏｒｉｎ１（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ２８２７）、トラメチニブ（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ２６７３）、ロスマピモド（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７２１５）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（２０ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ４９０１）、ＧＤＣ－０９９４（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７５４４）、酢酸デキサメタゾン（Ｃａｙｍａｎ ２２２８６）、ＢＱＵ５７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７６０７）、ＱＮＺ（ＥＶＰ４５９３）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ４９０２）、ロイペプチン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７３８０）、ペプスタチン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７３８１）、Ｅ－６４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７３７９）、１６：０ ＬＰＣ（Ａｖａｎｔｉ ８５５６７５）、ダラプラジブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ Ｓ７５２０）、ＡＡ３９－２（寄贈品）、ＬＰＤＳ（Ｓｉｇｍａ Ｓ５３９４）、脱脂ＢＳＡ（フラクションＶ脂肪酸不含ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ Ａ７０３０、ロット番号５ＬＢＱ０８７３Ｖ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｄ２５３４）、リノール酸（ＬＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ１３７６）、およびリノレン酸（ＡＬＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｌ２３７６）。

【0057】

ｉｎ ｖｉｖｏ生存研究。同系ＫＰ移植肺がんモデルを生成するために、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３－／－（ＫＰ）ＧＥＭＭ肺腫瘍に由来する細胞株にレトロウイルスルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）－ＧＦＰ構築物を感染させ、４００μＬのＰＢＳに再懸濁した５０００個のＫＰ腫瘍細胞を７週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈注射した。⁹⁰ビヒクルまたはダラプラジブでの処置前にマウスを様々な研究コホートに無作為化した。処置を強制経口投与によって１日１回月曜から金曜まで投与した。異種移植後７３日目までに疾患関連病的状態で死亡しなかったマウスをＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）での生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって腫瘍形成についてモニタリングし、それらの体重変化を評価した。生物発光陽性マウスは研究に留まり、生物発光陰性マウスは安楽死させ、それらの肺を組織学的検査のために収穫した。組織をリンスし、４℃の緩衝した４％パラホルムアルデヒドで２４～４８時間固定し、長期保存のために４℃ ７０％エタノールに移し、包埋し、切片化し、染色した（Ｈ＆Ｅ、抗ＧＦＰ一次抗体、抗Ｋｉ－６７一次抗体）。一部のマウスは注射された体積から腫瘍細胞がうまく播種されなかった可能性があるので、７３日目の生存群からのマウスを捕まえ、組織学的検査によって評価した。組織学的異形成について陰性の組織は最終研究分析から除外し、組織学的異形成について陽性の組織は最終研究分析に留めた。各コホートのＮ値は、最終分析前の組織学的検査の結果を反映するように調整した。生物発光陰性の１匹の処置コホートマウスは、疾患関連病的状態なしの非常に早期の死亡（２４日目）ゆえに最終分析において外れ値として標識し、肺生物発光陽性の１匹の処置コホートマウスは、疾患関連死前であっても体重が減った時点で安楽死させ（９１日目）、妥当な研究タイムラインを維持した。

【0058】

ヒト発現分析。ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ａｔｌａｓ Ｓｔｕｄｉｅｓ⁹¹からのヒトデータは、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを介してアクセスした。⁹²ｐｌａ２ｇ７、ｐａｆａｈ２、ｋｒａｓ、およびｈｒａｓ遺伝子の検索を行った。出力データは、線形またはｌｏｇ２スケールの発現量中央値によってランク付けされたＲＮＡｓｅｑ Ｖ２である。

【0059】

結果
発がん性ＲＡＳ増幅は老化関連ストレスおよび損傷を誘導する。
Ｔｅｔ誘導性Ｋ－またはＨ－ｒａｓ^G12VｃＤＮＡ（ｉＫ／ＨＲａｓ）を安定に形質導入したＳＶ４０ラージＴ不死化マウス胚線維芽細胞におけるＲＡＳストレスおよび損傷の程度を判定した。ドキシサイクリンに曝露させたｉＫＲａｓ、ｉＨＲａｓ、またはベクター（対照）ＭＥＦの増殖を最初に測定した（図１）。比較のために、Ｃｒｅ組換え酵素によって前処理された胚から生成された内因性発がん性Ｋ－ｒａｓ（ｅＫＲａｓ）細胞を不死化し、対の野生型ＭＥＦと共に増殖について試験した。ベクター対照、可逆性Ｔｅｔ－ＯＮ系、および内因性変異体の間で増殖の明らかな差異があった。ＫＲＡＳ増幅は細胞を停止させたが、内因性ＫＲＡＳは過剰増殖を促進した。

【0060】

これらの２種のモデルにおけるシグナル伝達変化を調べるために、細胞溶解物に２４時間イムノブロットを行った（図２）。イムノブロットは、ｉＫＲａｓ細胞において発がん性ＲＡＳ過剰発現および下流ＥＲＫ１／２リン酸化を示した。特に、ホスホ－ｐ５３は有意な増加を示さなかったが、ｐ２１^waf1/cip1発現は上昇し、ドキシサイクリン処置にわたり発現を維持した（図３）。増幅ＲＡＳ細胞と比較して、ｅＫＲａｓ内因性ＲＡＳ細胞において、ＥＲＫリン酸化は検出可能でなく、ｐ２１^waf1/cip1はわずかに検出可能であった。発がん性ＲＡＳストレスの他の重要な属性が存在するかどうかを決定するために、ＤＮＡ損傷応答を試験した。図４は、鋭敏な二本鎖切断マーカーγＨ２Ａ．Ｘからの免疫蛍光の定量を示す。同様に、遺伝毒性ストレスマーカーであるホスホ－ＪＮＫおよびホスホ－ＡＴＦ－２についてのアッセイを行った（図５）。全てのストレスマーカーは、ｉＫＲａｓ細胞において上昇したが、ｅＫＲａｓでも対照でも上昇しなかった。

【0061】

発がん性ＲＡＳ量と早期老化の関係を確認するために、本発明者らは、ＲＡＳ変異細胞が老化マーカーの差異を示すかどうかを判定した。ストレス誘導性老化についての２種のマーカーの最小値を踏まえて、本発明者らは老化関連β－ガラクトシダーゼおよびヘテロクロマチン病巣（ＨＰ１γ）についてアッセイした。これらのアッセイの両方が、培養７２時間後にｉＫＲａｓ細胞においてのみ上昇した老化関連マーカー発現を報告した（図６）。ｅＫＲａｓ細胞の場合、β－Ｇａｌシグナルは確率的であった。ｉＫＲａｓ細胞によって発現される明らかな発がんストレス表現型を考慮して、本発明者らはそれらが鋭敏なＳＩＲ／ＳＡＳＰ炎症発現プロファイルを生成するかどうかを調査した。２４時間誘導した細胞培養物のＲＮＡシークエンシングならびに代表的なＳＩＲ／ＳＡＳＰマーカーのイムノブロットは、生得的炎症応答の上方調節を報告した。長期細胞培養からのＳＩＲおよびＳＡＳＰ表現型の以前の知見に基づいて^{23、28、33、34、35、36、37}、本発明者らのプロファイリングは、ｉＫＲａｓ細胞が、増幅された発がん性ＲＡＳに対するストレスおよび損傷応答のモデルとなるが、ｅＫＲａｓ細胞はモデルとならないことを示した。

【0062】

発がん性ＲＡＳストレスはグループ７ ｓＰＬＡ２活性を引き起こす。
ｉＫＲａｓおよびｅＫＲａｓ細胞におけるｓＰＬＡ２アイソフォームの活性を調べた。２種の脂質基質：現在までに知られているほとんどのがん関連ｓＰＬＡ２アイソフォームの基質であるジヘプタノイル－ホスファチジルコリン（ＰＣ）、またはグループ７および８ ｓＰＬＡ２アイソフォームの基質である血小板活性化因子（ＰＡＦ）（血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、ＰＡＦ－ＡＨとしても公知）を使用して発色酵素アッセイを行った。増幅ｉＫＲａｓモデル、ベクター対照細胞、または過形成性ｅＫＲａｓからの細胞溶解物および馴化培地を調製し、チオール化ＰＣまたはＰＡＦとインキュベートし、ＤＴＮＢ（エルマン試薬）と混合した。精製した酵素、ハチ毒由来グループ３ ｓＰＬＡ２（ＰＣが基質である）、またはヒトＰＡＦ－ＡＨ（ＰＡＦが基質である）を陽性アッセイ対照として試料に加えた。ｉＫＲａｓ細胞においてＰＣ特異的活性は観察されなかったが（図７）、上昇したＰＡＦ－ＡＨ特異的活性は観察され、対照もｅＫＲａｓ溶解物も検出限界を上回る活性を含有しなかった（図８）。これらの結果は、細胞内グループ７および／または８ ｓＰＬＡ２アイソフォームが増幅ＲＡＳ誘導損傷によって誘導されたことを証明した。

【0063】

細胞内タンパク質発現が、測定されたグループ７ ｓＰＬＡ２活性と一致するかどうかを判定するために、共焦点顕微鏡検査を行い、ｍＲＮＡ配列データを分析した。抗ＰＬＡ２グループ７Ａ抗体を使用する免疫細胞化学は、ｉＫＲａｓ細胞が７Ａアイソフォームの内因性過剰発現および点状（小胞状）局在を含有することを示した（図９）。ストレス中に細胞質基質からＥＲ／ゴルジに移った³⁸ｓＰＬＡ２ グループ７ＢアイソフォームがｉＫＲａｓ細胞において散在性に、低い強度で染色されたことが見出された。これらの結果は、グループ７ＢがｉＫＲａｓ細胞における細胞内ＰＡＦ－ＡＨ活性の主な原因でないことを証明する。さらに、結果はｐｌａ２ｇ７ ＲＮＡの３２倍の増幅と一致していた。グループ７Ｂ酵素およびグループ８酵素は、ｉＫＲａｓ細胞において同様に過剰発現しなかった。

【0064】

ｉＫＲａｓ内膜における脂質調節不全は、ＰＬＡ２Ｇ７活性および酸化したリン脂質に起因する。
グループ７Ａ ｓＰＬＡ２は、動物血清リポタンパク質の正常な成分であるので、本発明者らはｉＫＲａｓ細胞が、この循環酵素の内因性活性に関連する調節不全の細胞内脂質代謝を示し得ることを推測した。生細胞のエンドソーム内腔における近赤外放射のより小さい（より青色の）値へのシフトによって可溶性脂質を測定する、以前に検証されたナノセンサーを使用して^39、40、細胞のエンドソーム細胞小器官における脂質調節不全を判定した。本発明者らは最初にセンサーがｓＰＬＡ２酵素の基質／生成物に応答するかどうかを検索した³⁹。レポーターは、ｐＨ非感受性および膜二重層非透過性であることが確認された。幅広い範囲の内因性界面活性剤クラス（水溶性）種を表す個々の脂質に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのセンサー応答を最初に探索し、レポーターの色応答がリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、およびリゾホスファチジルセリン（ｌｙｓｏＰＳ）に最も感受性であることが見出された。例えば超長鎖ｌｙｓｏＰＣおよびＰＣに対する追加の感受性が、それらの内因性臨界ミセル濃度をはるかに上回る脂質濃度で観察された（ｐＭ～ｎＭ、この点を上回ると自由な溶解性はごくわずかである）。

【0065】

生細胞における脂質調節不全を判定するために、脂質ナノセンサーをＲＡＳまたはベクター形質転換細胞株の培養培地に導入した。近赤外ハイパースペクトル顕微鏡検査を利用して、ｉＫＲａｓ、ｉＨＲａｓ、ｅＫＲａｓ、ベクター対照細胞、および並列するＰＩ３Ｋ経路における変異を保持するＭＥＦ内でナノセンサーの蛍光スペクトルを空間的に取得した。データをフィッティングして、ナノセンサー放射バンドの中心波長を決定し、次いでこれを細胞の明視野画像上にマッピングし戻し、ヒストグラムにプロットした。この方法を使用して、発がん性ＲＡＳ誘導後２４時間および７２時間の平均センサー放射波長を測定した。ミリストイル化（構成的）Ａｋｔ１（ｍｙｒＡｋｔ１）またはＰｔｅｎをノックアウトするための短いガイドＲＮＡを保持する不死化ＭＥＦを培養してから２４時間後の平均センサー放射波長も測定した（図１０）。構成的ＲＡＳ変異体だけが、ベクターまたはシグナル伝達対照細胞のいずれかと比較して有意な青色シフト応答を示すことが見出された。ｅＫＲａｓ細胞は、ｉＫＲａｓ細胞におけるシフトより有意に少ないわずかな青色シフトを示した。ＭＡＰＫ経路エフェクター、例えばＲＡＦ、ＭＥＫ、およびＥＲＫの薬理学的阻害剤（それぞれＴＡＫ－６３２、トラメチニブ、およびＧＤＣ－０９９４）は、センサー応答に影響を及ぼさない、ｍＴＯＲ／ＡＫＴ経路エフェクターの薬理学的阻害剤と比較して、ベクターに対してｉＫＲａｓにおいて脂質ナノセンサー応答を有意に低下させた（図１１）。小胞分解経路の阻害剤は、同様にナノセンサー応答を抑止しなかった（図１２）。これらの結果は、発がん性ＲＡＳ増幅による損傷が、１種の内膜輸送経路のいずれかに固有でないエンドソーム／内膜脂質調節不全を直接的に誘導することを示す。
次にこの細胞内レポーター応答が、リゾリン脂質および関連脂質種のｓＰＬＡ２媒介生成に感受性であるかどうかを測定した。一連のＰＬＡ２阻害剤で細胞を処置してから２４時間後にナノセンサーを使用して脂質蓄積を測定した。ナノセンサー応答は、ｉＫＲａｓ細胞における脂質調節不全がグループ７ ｓＰＬＡ２（ＰＬＡ２Ｇ７Ａ／Ｂ）酵素活性の阻害剤によってのみ防止されることを示した（図１３）。阻害剤は、以下の順序でレポーター応答を減弱した：ダラプラジブ＞リラプラジブ≒ＭＬ２５６＞ＡＡ３９－２。ダラプラジブおよびリラプラジブは、強力な可逆性ＰＬＡ２Ｇ７Ａ阻害剤であるが、ＭＬ２５６はＰＬＡ２Ｇ７Ａの共有結合阻害剤であり、ＡＡ３９－２はＰＬＡ２Ｇ７Ｂの共有結合阻害剤である。^41、42ｉＫＲａｓ細胞において脂質レポーター応答を減弱することができなかった他のＰＬＡ２阻害剤は、ＰＬＡ２Ｇ２／５／１０／１２アイソフォームを阻害するバレスプラジブ、ＰＲＤＸ６およびＰＬＡ２Ｇ１５を不活化すると報告されている、アラキドン酸⁴³の遷移状態アナログであるＭＪ－３３、ＰＬＡ２Ｇ６の阻害剤であるＢＥＬ、細胞質型ＰＬＡ２Ｇ４の阻害剤であるＭＡＦＰ、ＰＬＡ２Ｇ８の阻害剤であるＰ１１、およびＰＡＦ生合成の阻害剤であるＴＳＩ－０１を含んだ。ＲＡＳ損傷細胞におけるグループ７活性と一致して、ＰＬＡ２Ｇ７Ａ刺激因子および抗炎症薬デキサメタゾン⁴⁴は、ベクター系においてレポーター応答を増加させた（図１４）。これらの結果は、グループ７ ｓＰＬＡ２（ＰＬＡ２Ｇ７Ａ／Ｂ）活性が、内膜脂質調節不全を誘導するが、広範なｓＰＬＡ２活性はそれを誘導せず、発がん性ＲＡＳ増幅による損傷はこの調節不全を著しく悪化させることを証明する。

【0066】

ｉＫＲａｓ脂質調節不全が、膜リン脂質酸化によって潜在的に引き起こされるかどうかも調べた。最初に、ｉＫＲａｓ細胞の酸化環境を判定するために、生細胞培養物を酸化還元色素メチレンブルーで染色し、これは上昇した細胞染色を示す。この結果は、上昇した細胞内酸化環境を裏付ける。ｉＫＲａｓ細胞を次いで、一般的な膜抗酸化剤である脂溶性α－トコフェロール（ビタミンＥ）とインキュベートした。⁴⁵レポーター応答は、ビタミンＥとプレインキュベートした細胞において抑止され（図１５）、これは脂質調節不全が、可溶性リゾリン脂質の放出をもたらす、膜への酸化損傷から生じることを示唆する。
次に、エンドソーム脂質調節不全が、グループ７基質ＰＡＦ⁴⁶および酸化リン脂質（ＰＡＦ－アナログ）の合成に必要である、血清リポタンパク質の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）成分を必要とするかどうかを調べた。２種の必須ＰＵＦＡ：アラキドン酸（ＡＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）ありまたはなしでリポタンパク質欠損血清中で細胞をプレインキュベートした。脂質レポーター応答がＰＵＦＡ枯渇時に抑止されるが、ＰＵＦＡ補充後に救済されることが観察され（図１６）、これはこの脂質調節不全がグループ７ ｓＰＬＡ２酵素の多価不飽和脂肪酸基質も必要としたことを示した。

【0067】

発がん性ＲＡＳ増幅細胞の電子顕微鏡検査を行って、脂質調節不全表現型をさらに調べた。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）は、ｉＫＲａｓおよびｉＨＲａｓ株における異常なラメラ様構造の存在を示した（図１７）。これらの構造は層状体に似ているようである。⁴⁷これらの画像はエンドソームおよび／または分泌型内膜区画の内腔内の脂質調節不全をさらに裏付け、これらの画像は発がん性ＲＡＳ誘導損傷の重要な成分としてのＰＬＡ２Ｇ７の細胞内保持も裏付ける。
これまでに提示されたレポーターデータに基づいて、内膜への直接的損傷が、ＰＡＦ－アナログ基質およびグループ７ ｓＰＬＡ２酵素の作用によるリゾリン脂質の産生を増加させる、ワーキングモデルを試験した。

【0068】

ＲＡＳ増幅媒介脂質酸化は、ＰＬＡ２Ｇ７により細胞のリゾリン脂質を増強する。
ワーキングモデルを扱うために、ｉＫＲａｓ細胞によって産生された脂質種がグループ７ ｓＰＬＡ２酵素からの活性と一致するかどうかを調べた。全膜脂質ヒドロペルオキシド発色アッセイをｉＫＲａｓに行い、グループ７ ｓＰＬＡ２酵素基質の存在について試験した。アッセイ（図１８）は、ｉＫＲａｓ細胞が対照に対して上昇した脂質ヒドロペルオキシドレベルを含有することを示し、これはグループ７ 酵素基質の増加した産生を裏付けた。
ｉＫＲａｓ代謝がグループ７ ｓＰＬＡ２活性と一致する脂質シグネチャーを産生したかどうかを決定するために、ｉＫＲａｓ細胞溶解物および馴化培地をグリセロリン脂質、ステロール、グリセロ脂質、およびスフィンゴ脂質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳのために調製した。ｌｙｓｏＰＡＦおよびｌｙｓｏＰＣ種が、ベクター対照と比較して、変異培養物の馴化培地において濃縮されたことが見出された。ｉＫＲａｓ細胞溶解物は、ベクター対照より少ない全飽和／不飽和リン脂質、プラズマローゲンリン脂質、およびエーテルリン脂質を含有したが、より多くのリゾリン脂質を含有した。これらの結果は、増加した脂質調節不全がｓＰＬＡ２生成物を含むという結論を裏付ける。

【0069】

本発明者らは、ｉＫＲａｓ細胞における飽和／不飽和リン脂質の低下およびリゾリン脂質の上昇は、直接的な酸化修飾、酵素作用、または両方の働きに起因し得ることを推論した。グループ７ ｓＰＬＡ２活性が実際にリン脂質調節不全の一因となったかどうかを理解するために、ｉＫＲａｓ細胞をグループ７酵素阻害剤ダラプラジブで処置した後に脂質代謝を判定した。リピドミクスデータは、リゾリン脂質レベル、特にｌｙｓｏＰＣだけでなく、ｌｙｓｏＰＥ、ｌｙｓｏＰＩ、およびｌｙｓｏＰＳのような他のＰＵＦＡ保持クラスの有意な減弱を示し（図１９）、これはグループ７酵素活性がｉＫＲａｓにおけるリゾリン脂質生成の少なくとも部分的な原因であることを示唆した。追加のリピドーム分析は、ｉＫＲａｓ細胞溶解物および培地における脂質種の全般的な低下を見出し、これはｉＫＲａｓ表現型が広範に異化作用であり、ならびに／または損傷および脂質の修飾がリン脂質クラスに特有でないことを証明した。

【0070】

グループ７ ｓＰＬＡ２基質および生成物脂質は、細胞増殖に異なる影響を及ぼす。
ｓＰＬＡ２酵素アイソフォームは腫瘍抑制因子および腫瘍促進因子の両方として記載されているので^{48、49、50、51、52、53}、２種の代表的な脂質、グループ７ ｓＰＬＡ２基質および生成物を使用してｉＫＲａｓ細胞を探索した。最初に、ベクター対照細胞を漸増濃度のグループ７ ｓＰＬＡ２生成物である１６：０ ｌｙｓｏＰＣ、および基質である１６：０メチルカルバミルＰＡＦ（ｃＰＡＦ）とインキュベートした。ｌｙｓｏＰＣ生成物がベクター対照細胞増殖（図２０）をｌｙｓｏＰＣ臨界ミセル濃度（ＣＭＣ、約８～１０μＭ）付近で停止させることが見出された。この濃度での停止は、直接的な洗浄剤様効果を示唆した。一方、グループ７ ｓＰＬＡ２基質であるｃＰＡＦは、亜臨界および臨界ミセル濃度（ｌｙｓｏＰＣと同様のＣＭＣ）の両方において対照細胞増殖に対する軽い刺激効果を示した。したがって、ベクター対照細胞において、グループ７ ｓＰＬＡ２生成物の細胞内蓄積は、酵素基質より大きい程度に増殖に影響を及ぼした。ｉＫＲａｓおよびｅＫＲａｓ細胞を臨界ミセル濃度の同じ脂質で探索すると、ｌｙｓｏＰＣはごくわずかな停止効果または減少した停止効果を促進したが、ｃＰＡＦはｉＫＲａｓおよびｅＫＲａｓ細胞の両方に対して強力な停止効果を促進した（図２１）。したがって、これらの研究からのデータは、グループ７基質の細胞内蓄積が生成物脂質より顕著に腫瘍抑制性であることを裏付ける。加えて、ｅＫＲａｓ細胞は、顕著なＲＡＳ関連損傷またはグループ７活性の非存在下で基質脂質にはるかに感受性であった。

【0071】

グループ７とＲＡＳ媒介細胞停止の分子的関連を調べるために、グループ７基質／生成物の細胞膜負荷が内因性ｐ２１^waf1/cip1に影響を及ぼすかどうかを判定した。ベクターおよびｉＫＲａｓ細胞をｌｙｓｏＰＣまたはｃＰＡＦ脂質と２４時間インキュベートした。イムノブロットは、ホスホ－ＥＲＫおよびｐ２１^waf1/cip1発現が、ＰＬＡ２Ｇ７基質であるｃＰＡＦへの曝露時に増加したが、ｌｙｓｏＰＣ生成物の場合は増加しなかったことを示し（図２２）、これはこの脂質基質の蓄積が発がん性ＲＡＳ誘導停止に関与していることを裏付けた。
この脂質基質関連停止が発がん性ＲＡＳ増幅により内因的に刺激されたかどうかを判定するために、本発明者らは、ＰＡＦアナログの存在下で下方調節される細胞内標的であるＰＡＦ受容体（ＰＡＦ－Ｒ）についてイムノブロットした。ＰＡＦ－ＲはｃＰＡＦに曝露したベクター細胞において下方調節されたが、ｉＫＲａｓ細胞におけるＰＡＦ－Ｒ状態は、脂質負荷と独立していることが見出された（図２２）。グループ７基質の細胞負荷は、発がん性ＲＡＳの増幅後に観察された停止を引き起こしたので、データは、ＲＡＳ損傷自体がこれらの細胞増殖抑制性／細胞傷害性脂質種を生成することを裏付ける。

【0072】

グループ７ ｓＰＬＡ２ノックダウンは発がん性ＫＲＡＳ保持細胞を死滅させる。
グループ７ ｓＰＬＡ２の機能が、有害なＰＡＦ－アナログ脂質種を除去することであるかどうかを判定するために、本発明者らはグループ７のノックダウンがｐ２１^waf1/cip1発現をモジュレートするかどうかを判定した。グループ７ ｓＰＬＡ２遺伝子を標的化する市販のｓｉＲＮＡをｉＫＲａｓ細胞とインキュベートした。本発明者らは、溶解物をイムノブロットし、停止に対する遺伝子ノックダウンの影響を判定し、ホスホ－ＥＲＫおよびｐ２１^waf1/cip1発現が消失したことが見出され、発がん遺伝子誘導停止がグループ７発現を必要とすることを裏付けた。しかし、グループ７酵素の除去は、損傷誘導性ＰＡＦアナログのより多くの蓄積を可能にするはずであり、ｃＰＡＦ脂質基質単独がホスホ－ＥＲＫおよびｐ２１^waf1/cip1発現を促進するという知見と一見一致しない予想である。

【0073】

この研究の過程において行われた観察は、ｉＫＲａｓ表現型が血清ロットおよび細胞ＰＵＦＡ負荷に依存することを本発明者らに示唆した。ホスホ－ＥＲＫおよびｐ２１^waf1/cip1発現がＰＵＦＡに依存するかどうかを決定するために、本発明者らはｓｉＲＮＡペアを一緒にプールし、培養培地に１５μＭ ＰＵＦＡミックス（各５μＭのアラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、およびリノール酸／リノレン酸）を補充した後に上の実験を繰り返した。得られたイムノブロットは、ホスホ－ＥＲＫ／ｐ２１^waf1/cip1発現が、添加したＰＵＦＡの存在下でノックダウン後に持続することを示した。同様に、ＰＵＦＡの存在下でのＰＬＡ２Ｇ７アイソフォームの薬理学的遮断はホスホ－ＥＲＫ／ｐ２１^waf1/cip1発現を増加させ、基質が細胞内に蓄積することを可能にするこれらの酵素のノックダウンと一致する。この酵素経路へのＰＵＦＡ負荷の重要性は、ＰＵＦＡの存在へのグループ７ ｓＰＬＡ２タンパク質発現の依存性から推測された。したがって、ＰＵＦＡ由来基質の存在は、酵素誘導および損傷媒介停止の両方の重要な上流のメディエーターであると結論付けられた。

【0074】

グループ７ ｓＰＬＡ２酵素は細胞増殖抑制性／細胞傷害性リン脂質を一掃するので、本発明者らはグループ７ノックダウンが細胞増殖および生存に影響するかどうかを判定した。前述の通り、ＰＵＦＡおよびｓｉＲＮＡを補充した培養培地において細胞を維持した。ドキシサイクリン処置の７２時間後に接着細胞数を計数した。グループ７ノックダウンはベクター対照細胞増殖を刺激するが、ｉＫＲａｓ細胞増殖を刺激しないことが見出された（図２３）。細胞死を判定するために、培養培地を７２時間で取り出し、細胞破断関連乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性について試験した（図２４）。ノックダウンはｉＫＲａｓ細胞における増加したＬＤＨ活性をもたらしたが、ベクター対照細胞ではもたらさず、ｉＫＲａｓ培養物における細胞死の増加を示した。
グループ７ ｓＰＬＡ２の最も開発された薬理学的阻害剤に対する発がん性ＲＡＳ保持がん細胞の応答を判定するために、いくつかの腫瘍由来細胞株を、本来心血管疾患を処置するために開発された薬物であるダラプラジブで探索した。ｉＫＲａｓ細胞ならびに肺、膵臓、および結腸直腸腫瘍に由来する細胞株をダラプラジブとインキュベートし、生存率についてアッセイし（図２５）、全てのＲＡＳ保持株が低マイクロモル濃度のダラプラジブで死滅した。高レベルのグループ７ ｓＰＬＡ２を自然に発現する対照細胞株ＲＡＷ ２６４．７マウスマクロファージは、処置によってほとんど影響を受けなかった。ＲＡＷ ２６４．７細胞はグループ７ ｓＰＬＡ２酵素を発現するので、これらの結果は、顕著な膜損傷の存在が薬物感受性の根底にあることを示唆する。ダラプラジブがＲＡＳ変異細胞を選択的に死滅させ得るかどうかを決定するために、ｅＫＲａｓ（わずかな発がんストレスを有し、大した７Ａアイソフォームを有しない）または野生型ＳＶ４０ ＭＥＦを薬物に曝露した。生存率データは、ダラプラジブが野生型細胞に対してｅＫＲａｓを死滅させるのに２倍強力であることを示した（図２６）。

【0075】

本発明者らは次に、グループ７阻害がＲＡＳ保持マウスがんモデルの発症に影響を及ぼすかどうかを判定した。非小細胞肺がんの同系ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３－／－（ＫＰ）移植モデルを使用した。^54、55ＧＥＭＭ肺腫瘍に由来するルシフェラーゼ化細胞をＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内投与した。最初の異種移植注射後の２つの異なる時点から開始する強制経口投与によって、マウスをビヒクルまたはダラプラジブで処置し、がん発生に対する処置の効果を判定した。ダラプラジブで処置されたマウスの肺がん関連死および病的状態の両方において顕著な遅延が観察された（図２７）。加えて、本発明者らは、ビヒクル処置コホートの他の臓器において非原発性腫瘍を認めたが、ダラプラジブコホートでは認めなかった。
最後に、がん全体でのこの標的の組織およびヒトの関連を調べるために、本発明者らは２種のグループ７アイソフォームについての発現情報のＴＣＧＡデータベースを探索し、膵がんの２つの研究からの回顧的データを分析した。本発明者らは、グループ７転写物が、膵がんを含む多種多様なヒトがんにおいて発現され、増幅されることを見出した。ＲＡＳの点変異型および構成型を保有することが多い組織を含めてほぼ全てのこれらのがんが、ｋｒａｓおよびｈｒａｓ転写物の過剰発現および増幅を示す。

【0076】

考察
この実施例セクションにおいて、ＲＡＳ変異腫瘍における細胞生存の一因となる炎症関連脂質調節不全を調べた。様々なｓＰＬＡ２アイソフォームが、発がん性ｒａｓを保持する悪性細胞および組織において発見されているが^{48、49、50、51、52、53}、これらの炎症メディエーターとＲＡＳの直接的な関係は、非白血球モデルにおける研究の新生の分野である。胚細胞株モデルにおいて、本発明者らは、全体で発生中のマウスにおける発がん性ＲＡＳの遺伝子増幅とｉｎ ｖｉｖｏ発がん性の関連を裏付ける、著しく上昇したｐ２１^waf1/cip1、早期老化マーカー、ならびにＤＮＡ損傷およびストレスのマーカー（γＨ２Ａ．Ｘ、ホスホ－ＪＮＫ、およびホスホ－ＡＴＦ－２）を見出した。^{19、20、21、22}老化マーカーの上方調節と相まって、ＳＩＲ／ＳＡＳＰ遺伝子およびタンパク質上方調節は、ｉＫＲａｓ細胞が炎症表現型のモデルになることを示した。^{23、28、35、56、57}特に、単一対立遺伝子過剰増殖性変異細胞株であるｅＫＲａｓは、ｐ２１^waf1/cip1発現のわずかな上昇以外はｉＫＲａｓ細胞と同じ損傷サインを示さなかった。

【0077】

不偏の生化学プロファイリングは、本発明者らが広範な分泌型Ｐｌａ２遺伝子ファミリーＰＬＡ２Ｇ７の固有の生体活性酵素アイソフォームを損傷のメディエーターとして同定することを可能にした。共焦点イメージングは、グループ７Ａ ｓＰＬＡ２の実質的な過剰発現を示し、ＲＮＡｓｅｑはＰｌａ２ｇ７遺伝子発現の３２倍の上昇を報告したが、そのホモログであるＰａｆａｈ２（グループ７Ｂ）の上昇は報告しなかった。生細胞のエンドソーム内腔における脂質を検出するナノセンサーを使用して、本発明者らはこのシステムにおける脂質調節不全を調査した。脂質蓄積を評価するための蛍光ナノセンサーを使用して、本発明者らは、発がん性ＲＡＳ増幅が、細胞内エンドソーム区画における実質的な脂質調節不全および内膜輸送欠陥を誘導することを見出した。グループ７ ｓＰＬＡ２およびＲＡＳ－ＥＲＫシグナル伝達の特定の阻害剤だけが脂質調節不全を抑止した。ナノセンサーを使用して、本発明者らは、内因性変異体であるｅＫＲａｓにおける部分的な細胞内脂質調節不全を見出したが、ｅＫＲａｓは顕著なストレス応答もグループ７Ａ発現も示さなかった。これらの知見は、この発がん遺伝子の量依存性に類似しているだけでなく、重要なことに、構成的ＲＡＳシグナル伝達は酸化性物質を直接生成し得るので^{14、18、58、59}、これらの知見は、ｅＫＲａｓにおける部分的脂質表現型およびｐ２１^waf1/cip1の軽い上方調節が、グループ７Ａを誘発するのに不十分である酸化したリン脂質基質生成を反映することを裏付ける。ｐ２１^waf1/cip1発現、細胞老化、および酸化損傷フィードバックの関連が示されている。^60、61ストレスおよび炎症誘導性グループ７Ａアイソフォームは、発現のためにＲＡＳ増幅の高度に上昇したストレスを必要とし得るが、これらのアイソフォームは、直接的な酸化攻撃によって逆説的に不活化される。⁶²

【0078】

本発明者らは、異常な蓄積に関与する脂質の源および正体をさらに調べた。培養培地由来の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が細胞内脂質調節不全に必要であることが見出されたが、Ｐｌａ２ファミリーの膜活性酵素はＰＵＦＡ放出において重要な役割を果たす一方^46、63、グループ７酵素は酸化したＰＵＦＡを伴う膜脂質を選択的に攻撃するので^{64、65、66、67}、このことは予期される。ＰＵＦＡ負荷および脂溶性抗酸化剤処置に対する細胞内脂質調節不全の感受性は、グループ７酵素の膜損傷応答の役割と一致する。
グループ７ ｓＰＬＡ２酵素触媒作用の主な生成物は、可溶性リゾリン脂質および酸化した脂肪酸であり、この触媒活性は、酵素が分解された場合に止まるはずである。しかし、エンドリソソーム分解を阻止する本発明者らの試みは、脂質調節不全に一切影響を有しなかった（図２３）。理論に縛られるものではないが、これは、グループ７酵素が酸不安定性であり、酸性ｐＨで不活化されるが^68、69、Ｒａｓ形質転換線維芽細胞における内膜区画はアルカリ性であり⁷⁰、酵素活性を支持するという事実によって説明できる。
非分解性ＰＡＦ－アナログ基質脂質を使用して炎症性グループ７Ａ活性とＲＡＳ媒介生存の関連を試験した。本発明者らは、発がん遺伝子誘導成長遅延の重要なマーカーｐ２１^waf1/cip1とこの細胞増殖抑制性基質脂質クラスの細胞内蓄積の関連を証明した。グループ７遺伝子サイレンシングはｐ２１^waf1/cip1発現を抑止しなかったが、利用可能なグループ７酵素の化学的阻害はｐ２１^waf1/cip1発現を促進したので、生存のために細胞傷害性基質脂質が膜から一掃されなければならないモデルに基づいて、この開示で考察されるデータは実際にこのことを裏付けた。重要なことに、本発明者らは、グループ７遺伝子サイレンシングがＲＡＳ損傷細胞を選択的に死滅させるが、対照細胞を死滅させないことを示した。

【0079】

胚性細胞株を含む線維芽細胞は、ｒａｓ形質転換およびごく最近では老化関連ストレスによって誘導されるＳＩＲ／ＳＡＳＰ現象を研究するためによく使用されるモデルシステムである。線維芽細胞は、特定の条件下で標準のＰＡＦを合成することができるか、または臨界ミセル濃度の外因性ＰＡＦ脂質の存在下でＩＬ－６を生成することができる。^71、72ここで本発明者らは、ＲＡＳ過剰発現が細胞溶解物における上昇したＩＬ－６レベルをもたらすことを見出し、これは発がん性ＲＡＳ増幅による損傷が、保存された炎症応答を刺激することを裏付けた。白血球における損傷関連分子パターン⁷³および紫外線照射からのＤＮＡ損傷シグナル伝達^74、75も、酸化修飾が鍵となる特徴であるグループ７／ＰＡＦ／ｐ２１^waf1/cip1経路に影響を与えることに注目することは興味深い。本発明者らは、この細胞状況におけるグループ７活性化または転写の下流の詳細を探索しなかったが、ＲＡＳ発がん中のＮＲＦ２活性化および抗酸化性遺伝子発現の研究からの最近の証拠は、低レベルの酸化を維持することを含む、酸化ストレスおよび損傷と闘うことは、内因性ＲＡＳ変異細胞の生存および増殖に重要な事象であることを示唆する。⁷⁶重度の損傷は細胞成長を止める可能性がより高く、したがって、この損傷を修復する機構は攻撃的な細胞を選択する。

【0080】

ＰＬＡ２Ｇ７Ａは、白血球からほとんど誘導される可溶性リポタンパク質関連セリン加水分解酵素であるが、ＰＬＡ２Ｇ７Ｂ（ｐａｆａｈ２）は細胞質基質からＥＲ膜に移動し、肝臓^65、77、赤血球⁷⁸、および酵母の分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）⁶⁴における酸化性物質除害剤として初めて記載された。両方の酵素は、ほとんどの基質が位置する膜－水界面の水性側で作用すると考えられているが、細胞質基質に対する活性が関連することが可能である。この活性の少なくとも一部は、エンドソーム区画に局在する内膜である。

【0081】

可溶性リゾリン脂質の出現がグループ７活性と関連するというナノセンサーおよびリピドミクスの知見に基づいて、本発明者らはグループ７ ｓＰＬＡ２酵素の阻害剤を調べた。グループ７阻害剤がＲＡＳ過剰発現細胞を選択的に死滅させ得ることが見出された。これらのストレス酵素のための最も開発された化合物は、グループ７Ａおよび７Ｂ阻害剤であるダラプラジブであり、これは第３相試験に到達した後に、その意図された心血管臨床エンドポイントを満たせなかった。ダラプラジブはｉｎ ｖｉｖｏにおいて安全で明らかに副作用がない一方で、ほとんどの細胞はグループ７Ｂ酵素を、そのハウスキーパー酵素機能のために保持している。したがって、全面的な阻害は、膜損傷が顕著である、または代謝回転が遅い細胞型に選択的に影響を及ぼし得る。多くのヒト新生物は、構成的シグナル伝達に至る点変異を含めて、ＲＡＳを過剰発現または増幅する。

【0082】

参考文献：

【0083】

いくつかの実施形態を例示し記載して来たが、当業者は、以上の明細書を読んだ後、本技術の化合物または本明細書に上記したその塩、医薬組成物、誘導体、プロドラッグ、代謝産物、互変異性体、もしくはラセミ混合物に対して変化、等価物の置換およびその他のタイプの変更を加えることができる。上記した各々の局面および実施形態はまた、他の局面および実施形態のいずれかまたは全てに関して開示されたかかる変形または局面を包含し、本明細書に組み込むこともできる。
本技術はまた、本技術の個々の局面のそれぞれの実例として意図される本明細書に記載された特定の局面に関して制限されない。当業者には明らかなように本技術の思想および範囲から逸脱することなく本技術の多くの修正および変形をなすことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能上等価な方法は以上の記載から当業者には明らかであろう。かかる改変および変形は添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図されている。本技術は、当然変化することができる特定の方法、試薬、化合物、組成物、標識された化合物または生物系に限定されないと理解されたい。また、本明細書で使用されている用語は個々の局面を記載する目的のみのものであり、限定することを意図していないと理解されたい。したがって、本明細書は模範的のみと考えられると意図され、本技術の広がり、範囲および思想は添付の特許請求の範囲、本明細書内の定義およびそのあらゆる等価物によってのみ示される。

【0084】

実例として本明細書に記載されている実施形態は本明細書に具体的に開示されていないいずれか１つまたは複数の要素または限定の不在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」等は広く、制限なしに読むべきである。加えて、本明細書で使用されている用語および表現は限定ではなく説明の用語として使用されており、かかる用語および表現の使用において示され記載されている等価物またはその部分を除外する意図はなく、特許請求の範囲に記載の技術の範囲内で様々な改変が可能であると認識される。さらに、語句「から本質的になる」は具体的に列挙されている要素および特許請求の範囲に記載の技術の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない付加的な要素を含むと理解される。語句「からなる」は規定されてない要素を除外する。
さらに、開示の特徴または局面がＭａｒｋｕｓｈグループで記載されている場合、当業者は、その開示がＭａｒｋｕｓｈグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていると認識するであろう。属の開示内に入るより狭い種および亜属グループの各々も本発明の一部を構成する。これは、除かれるものが具体的に列挙されているかいないかに関わらず、いずれかの主題を属から除去するという条件または否定的な制限と共に本発明の属の記載を含む。

【0085】

当業者により理解されるように、いずれかおよびあらゆる目的のため、特に書面による明細を提供することに関して、本明細書に開示されている全ての範囲はまたいずれかおよび全ての可能な部分的範囲ならびにその部分的範囲の組合せを包含する。掲げられているあらゆる範囲は同じ範囲を十分に記載し、その同じ範囲が少なくとも等しい二分の一、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一、等に分解され得るとして容易に認識することができる。非限定例として、本明細書で論じられている各々の範囲は下側の三分の一、中央の三分の一および上側の三分の一、等に容易に分解することができる。また当業者により理解されるように、「以下」、「少なくとも」、「超」、「未満」などのような全ての言葉は列挙されている数を含み、上で論じられたようにさらに部分的範囲に分解することができる範囲を意味する。最後に、当業者に理解されるように、ある範囲は各々個々のメンバーを含む。

【0086】

本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、発行された特許、およびその他の文書（例えば、雑誌、論文および／または教科書）は参照により、各々個々の刊行物、特許出願、発行された特許、またはその他の文書が参照によりその全体が組み込まれると具体的かつ個別に示されているかのように本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた本文中に含有される定義は、本開示内の定義と矛盾する限りにおいて除外される。

【0087】

本技術は、これらに限定されないが、以下の文字付きの段落に記載されている特徴および特徴の組合せを含むことができ、以下の段落は、本明細書に添付されている特許請求の範囲を限定するとも、全てのそのような特徴がそのような特許請求の範囲に必ず含まれなければならないことを義務付けるとも解釈されるべきでないことが理解される。
Ａ．対象においてがんを処置する方法であって、対象に有効量の化合物を投与してがんを処置するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、がんがＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持し、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、方法。
Ｂ．がんが、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんである、段落Ａに記載の方法。
Ｃ．がんが、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含む、段落Ａまたは段落Ｂに記載の方法。
Ｄ．対象がヒトである、段落Ａ～Ｃのいずれか１つに記載の方法。
Ｅ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落Ａ～Ｄのいずれか１つに記載の方法。
Ｆ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落Ａ～Ｅのいずれか１つに記載の方法。
Ｇ．前記化合物がダラプラジブである、段落Ａ～Ｆのいずれか１つに記載の方法。
Ｈ．前記化合物がリラプラジブである、段落Ａ～Ｆのいずれか１つに記載の方法。
Ｉ．前記化合物がＡＡ３９－２である、段落Ａ～Ｆのいずれか１つに記載の方法。
Ｊ．前記化合物がＭＬ２５６である、段落Ａ～Ｆのいずれか１つに記載の方法。

【0088】

Ｋ．投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落Ａ～Ｊのいずれか１つに記載の方法。
Ｌ．投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落Ａ～Ｋのいずれか１つに記載の方法。

【0089】

Ｍ．投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、段落Ａ～Ｌのいずれか１つに記載の方法。
Ｎ．対象に有効量の化合物を経口投与してがんを処置するステップを含む、段落Ａ～Ｍのいずれか１つに記載の方法。
Ｏ．対象において腫瘍の成長を遅くするまたは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が腫瘍の成長を遅くするまたは後退させるのに有効な量であり、腫瘍がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの腫瘍であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、方法。

【0090】

Ｐ．腫瘍が、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんから選択されるがんの腫瘍である、段落Ｏに記載の方法。
Ｑ．腫瘍が、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含むがんの腫瘍である、段落Ｏまたは段落Ｐに記載の方法。
Ｒ．対象がヒトである、段落Ｏ～Ｑのいずれか１つに記載の方法。
Ｓ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落Ｏ～Ｒのいずれか１つに記載の方法。
Ｔ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落Ｏ～Ｓのいずれか１つに記載の方法。

【0091】

Ｕ．前記化合物がダラプラジブである、段落Ｏ～Ｔのいずれか１つに記載の方法。
Ｖ．前記化合物がリラプラジブである、段落Ｏ～Ｔのいずれか１つに記載の方法。
Ｗ．前記化合物がＡＡ３９－２である、段落Ｏ～Ｔのいずれか１つに記載の方法。
Ｘ．前記化合物がＭＬ２５６である、段落Ｏ～Ｔのいずれか１つに記載の方法。
Ｙ．投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落Ｏ～Ｘのいずれか１つに記載の方法。

【0092】

Ｚ．投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落Ｏ～Ｙのいずれか１つに記載の方法。

【0093】

ＡＡ．投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、段落Ｏ～Ｚのいずれか１つに記載の方法。
ＡＢ．対象に有効量の化合物を経口投与するステップを含む、段落Ｏ～ＡＡのいずれか１つに記載の方法。
ＡＣ．投与が、腫瘍内へのまたは腫瘍の近位への化合物の注射を含む、段落Ｏ～ＡＢのいずれか１つに記載の方法。
ＡＤ．対象において新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または対象において新生物の増殖を遅くするもしくは後退させる方法であって、対象に有効量の化合物を投与するステップを含み、前記化合物がダラプラジブ、リラプラジブ、ＡＡ３９－２、またはＭＬ２５６のうちの少なくとも１種であり、有効量が新生物の成長を遅くするもしくは後退させるおよび／または新生物の増殖を遅くするもしくは後退させるのに有効な量であり、新生物がＫＲＡＳまたはＨＲＡＳの一方または両方の構成的に活性な変異を保持するがんの新生物であり、前記構成的に活性な変異が機能獲得変異、重複、または遺伝子増幅であり、がんが健全な対照細胞と比較してＰＬＡ２Ｇ７ＡおよびＰＡＦＡＨ２のうちの少なくとも１種の上昇した発現および／または活性を示してもよい、方法。
ＡＥ．新生物が、膵がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、胆管がん、軟部組織肉腫、血液もしくは造血細胞がん、乳がん、肺がん、子宮もしくは子宮頸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎臓がん、胃がん、卵巣がん、脳がん、中皮腫がん、皮膚がん、頭頸部がん、神経内分泌がんもしくは新生物、食道がん、精巣がん、前立腺がん、または胸腺がんから選択されるがんの新生物である、段落ＡＤに記載の方法。
ＡＦ．新生物が、腺腫、腺癌、子宮癌、扁平上皮癌、小細胞癌、移行性癌、漿液性癌、明細胞癌、粘液腺癌、未分化癌、脱分化癌、漿液性腺癌、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、異形成病変、またはこれらの任意の２種以上の組合せを含むがんの新生物である、段落ＡＤまたは段落ＡＥに記載の方法。

【0094】

ＡＧ．対象がヒトである、段落ＡＤ～ＡＦのいずれか１つに記載の方法。
ＡＧ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落ＡＤ～ＡＧのいずれか１つに記載の方法。
ＡＩ．対象に（化合物の質量／対象の体重に換算して）約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの化合物を投与するステップを含む、段落ＡＤ～ＡＨのいずれか１つに記載の方法。
ＡＪ．前記化合物がダラプラジブである、段落ＡＤ～ＡＩのいずれか１つに記載の方法。
ＡＫ．前記化合物がリラプラジブである、段落ＡＤ～ＡＩのいずれか１つに記載の方法。
ＡＬ．前記化合物がＡＡ３９－２である、段落ＡＤ～ＡＩのいずれか１つに記載の方法。
ＡＭ．前記化合物がＭＬ２５６である、段落ＡＤ～ＡＩのいずれか１つに記載の方法。
ＡＮ．投与が、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗エストロゲン薬、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン薬、ＬＨＲＨアゴニスト、コルチコステロイドホルモン、ＤＮＡアルキル化剤、タキサン、ビンカアルカロイド、微小管毒、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落ＡＤ～ＡＭのいずれか１つに記載の方法。

【0095】

ＡＯ．投与が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、八面体白金（ＩＶ）化合物、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、テモゾロミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５－フルオロウラシル、カペシタビン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）、フルダラビン、ペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド（ＶＰ－１６）、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、デキサメタゾン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ダクチノマイシン、サリドマイド、トレチノイン、イマチニブ（グリベック）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、イピリムマブ、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、酢酸メゲストロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、およびこれらの任意の２種以上の組合せからなる群から選択される化学療法剤の投与をさらに含む、段落ＡＤ～ＡＮのいずれか１つに記載の方法。

【0096】

ＡＰ．投与が、経口投与、静脈内投与、または筋肉内投与を含む、段落ＡＤ～ＡＯのいずれか１つに記載の方法。
ＡＱ．対象に有効量の化合物を経口投与するステップを含む、段落ＡＤ～ＡＰのいずれか１つに記載の方法。
ＡＲ．投与が、新生物内へのまたは新生物の近位への化合物の注射を含む、段落ＡＤ～ＡＱのいずれか１つに記載の方法。
以下の特許請求の範囲において、そのような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、他の実施形態が記載される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

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【国際調査報告】