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特表2022-541016免疫細胞によって合成され、分泌される機能的バインダー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-21
(54)【発明の名称】免疫細胞によって合成され、分泌される機能的バインダー
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220913BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20220913BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20220913BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20220913BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20220913BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0783
C07K16/28 ZNA
C07K19/00
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022502230
(86)(22)【出願日】2020-07-15
(85)【翻訳文提出日】2022-02-10
(86)【国際出願番号】 IB2020056659
(87)【国際公開番号】W WO2021009694
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】62/875,455
(32)【優先日】2019-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507335687
【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール
(74)【代理人】
【識別番号】100095832
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳徳
(74)【代理人】
【識別番号】100187850
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳弘
(72)【発明者】
【氏名】島崎 紀子
(72)【発明者】
【氏名】カンパナ，ダリオ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA11
4H045AA20
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン；結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン、並びにｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインをつなぐヒンジドメインを含むインビボ機能的リガンド（ＩＦＬ）に関する。ＩＦＬは、標的受容体に特異的に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）並びにサイトカイン刺激を引き起こすことが可能である。ＩＦＬは、自己切断ペプチドを介してキメラ抗原受容体につながれてもよい。ＩＦＬは、ナチュラルキラー細胞又はＴリンパ球などの免疫細胞において発現されてもよい。ＩＦＬを作製するためのベクター、宿主細胞、及び方法もまた、記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチドを発現する免疫細胞であって、前記ペプチドは、ａ）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン；
ｂ）結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；並びに
ｃ）前記ｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインをつなぐヒンジドメイン
を含む、免疫細胞。
【請求項2】
前記ｓｃＦｖドメインは、免疫グロブリン可変軽（ＶL）ドメイン、免疫グロブリン可変重（ＶH）ドメイン、並びに前記ＶL及びＶHドメインをつなぐリンカードメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項3】
前記リンカードメインは、（Ｇ4Ｓ）xであり、ｘは、１～１００の整数である、請求項２に記載の免疫細胞。
【請求項4】
前記リンカードメインは、（Ｇ4Ｓ）3である、請求項３に記載の免疫細胞。
【請求項5】
前記ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項6】
前記ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ２０に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項7】
前記ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項8】
前記Ｆｃドメインは、免疫グロブリン定常重２（ＣH２）ドメイン及び免疫グロブリン定常重３（ＣH３）ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項9】
前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項10】
前記ペプチドは、前記ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるシグナルペプチドをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項11】
前記ペプチドは、キメラ受容体に前記Ｆｃドメインをつなぐ自己切断ペプチドをさらに含み、前記キメラ受容体は、受容体ドメイン、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、並びに細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項12】
前記自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項13】
前記受容体ドメインは、ＣＤ１６である、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項14】
前記ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項15】
前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインである、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項16】
前記細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達である、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項17】
前記キメラ受容体は、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである、請求項１１に記載の免疫細胞。
【請求項18】
前記ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９又はＣＤ２０に結合する、前記Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、及び前記ヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジドメインである；前記ペプチドは、前記ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含む；前記ペプチドは、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζであるキメラ受容体をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項19】
前記ペプチドは、次の突然変異の１つ以上をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞：Ｓ２３９Ｄ；Ｓ２６７Ｅ；Ｈ２６８Ｆ；又はＩ３３２Ｅ。
【請求項20】
前記ペプチドは、次の突然変異の１つ以上をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞：Ｅ３４５Ｋ；Ｅ４３０Ｇ；又はＳ４４０Ｙ。
【請求項21】
前記ペプチドは、リンカーによって前記ＦｃドメインにつながれたＩＬ－１５をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項22】
前記ＦｃドメインにＩＬ－１５をつなぐ前記リンカーは、配列番号５１；Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａ；（ＥＡＡＡＫ）z；Ａ（ＥＡＡＡＫ）zＡ；及び（ＸＰ）wからなる群から選択される、ｚは、１～１００の整数である；Ｘは、任意のアミノ酸である、及びｗは、１～１００の整数である、請求項２１に記載の免疫細胞。
【請求項23】
前記ペプチドは、リンカーによって前記Ｆｃドメインにつながれた、４－１ＢＢ（ＣＤ３７）、ＣＤ２８、又はＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合するリガンドをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項24】
前記ＦｃドメインにＩＬ－１５をつなぐ前記リンカーは、配列番号５１；Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａ；（ＥＡＡＡＫ）z；Ａ（ＥＡＡＡＫ）zＡ；及び（ＸＰ）wからなる群から選択される、ｚは、１～１００の整数である；Ｘは、任意のアミノ酸である、及びｗは、１～１００の整数である、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項25】
前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項26】
前記免疫細胞は、Ｔリンパ球細胞である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／８７５，４５５号明細書の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照によって本明細書に援用される。
本出願は、２０１９年７月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／８７５，４５５号明細書の利益を主張する。上記の出願の全教示は、参照によって本明細書に援用される。
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイル中のデータの参照による援用
本出願は、本出願と同時に提出される以下のＡＳＣＩＩテキストファイル中に含有される配列表を参照によって援用する：
ａ）ファイル名：４４５９１１５４００１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ；２０２０年７月１５日に作成、サイズ３５ＫＢ。
本出願は、本出願と同時に提出される以下のＡＳＣＩＩテキストファイル中に含有される配列表を参照によって援用する：
ａ）ファイル名：４４５９１１５４００１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ；２０２０年７月１５日に作成、サイズ３５ＫＢ。
【背景技術】
【0003】
癌免疫療法は、概して、腫瘍細胞を選択的に攻撃するように免疫反応を誘導することに関する。癌を治療するための免疫療法のツールボックスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）誘導Ｔリンパ球の出現によってかなり充実したものになった。ＣＡＲ－Ｔ細胞による臨床経験は、Ｔリンパ球が、適切に活性化された場合に、化学療法に対する抵抗性を克服し、腫瘍量における大きな低下、疾患の安定、並びにＢ細胞白血病及びリンパ腫を有する患者の中には腫瘍根絶につながり得ることを実証する。18-26ＣＡＲ－Ｔ細胞において、Ｔ細胞の刺激は、抗体に似た特性を有するキメラ分子の発現を介して生じる。
【0004】
現在のＣＡＲ Ｔ細胞による手法は、免疫系が癌細胞を標的にする潜在能力を最大限には利用していない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン；結晶性断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）（Ｆｃ）ドメイン；並びにｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインをつなぐヒンジドメインを含むペプチドが、本明細書において記載される。本明細書において記載されるペプチドをコードする核酸；本明細書において記載されるペプチドをコードする核酸を含むベクター；本明細書において記載されるペプチドを発現する免疫細胞（例えばナチュラルキラー細胞及びＴ細胞）；並びに本明細書において記載されるペプチドを発現する免疫細胞を作製するための方法もまた、記載される。
【0006】
ｓｃＦｖドメインは、免疫グロブリン可変軽（ＶL）ドメイン、免疫グロブリン可変重（ＶH）ドメイン、並びにＶL及びＶHドメインをつなぐリンカードメインを含むことができる。リンカードメインは、（Ｇ4Ｓ）xとすることができ、ｘは、１～１００の整数である。リンカードメインは、（Ｇ4Ｓ）3とすることができる。
【0007】
ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６に結合することができる。
【0008】
Ｆｃドメインは、免疫グロブリン定常重２（ＣH２）ドメイン及び免疫グロブリン定常重３（ＣH３）ドメインを含むことができる。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインとすることができる。
【0009】
ペプチドは、ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるシグナルペプチドをさらに含むことができる。
【0010】
ペプチドは、キメラ受容体にＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチドをさらに含むことができ、キメラ受容体は、受容体ドメイン；ヒンジ及び膜貫通ドメイン；共刺激シグナル伝達ドメイン；並びに細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
【0011】
自己切断ペプチドは、２Ａペプチドとすることができる。受容体ドメインは、ＣＤ１６とすることができる。ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインとすることができる。共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとすることができる。細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達とすることができる。キメラ受容体は、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζとすることができる。
【0012】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９又はＣＤ２０に結合する；Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである；及びヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジドメインである；ベクターは、ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含む；並びにベクターは、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζであるキメラ受容体をさらに含む。
【0013】
ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）とすることができる。
【0014】
ペプチドは、リンカーによってＦｃドメインにつながれたＩＬ－１５をさらに含むことができる。ＦｃドメインにＩＬ－１５をつなぐリンカーは、配列番号５１；Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａ；（ＥＡＡＡＫ）z；Ａ（ＥＡＡＡＫ）zＡ；及び（ＸＰ）wからなる群から選択され、ｚは、１～１００の整数である；Ｘは、任意のアミノ酸である、及びｗは、１～１００の整数である。
【0015】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメイン；ＴＣＲβドメインにつながれた第１の結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；ＴＣＲαドメイン；ＴＣＲαドメインにＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチド；及びＴＣＲαドメインにつながれた第２のＦｃドメインを含むペプチドが、本明細書において記載される。ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメインにつながれたシグナルペプチドをさらに含むことができる。第１のＦｃドメインは、第２のＦｃドメインと同じものとすることができる。第１のＦｃドメインは、第２のＦｃドメインと異なるものとすることができる。ペプチドをコードする核酸及びペプチドをコードする核酸を含むベクターもまた、記載される。
【0016】
好都合なことに、本明細書において記載されるペプチドは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞などの免疫細胞によって分泌することができる。結果として、免疫細胞は、腫瘍細胞を標的にし、死滅させることができ、抗体の体外からの投与を必要としない。分泌されたペプチドが、ＮＫ細胞表面のＦｃ受容体に結合した場合、ＮＫ細胞は、抗体依存性細胞傷害を発揮することができる。Ｆｃ受容体を形質導入したＴ細胞もまた、抗体依存性細胞傷害を発揮することができる。さらに、ペプチドは、マクロファージの細胞表面のＦｃ受容体の相互作用を通して、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を引き起こすことができる。最終的に、ペプチドは、補体結合を誘発することによって、腫瘍細胞を死滅させることができる。
【0017】
前述のことは、同様の参照記号が様々な図の全体にわたって同じ部分を指す添付の図面において示されるように、例示の実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに、実施形態を示すことに重点を置いている。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1A-C】図１Ａ～Ｃは、インビボ機能的リガンド（ＩＦＬ）の設計及び発現を示す図である。図１Ａは、ＩＦＬ構築物の略図である。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変ドメインから構成される単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ＩｇＧ１ヒンジを通して免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の重鎖の３つの定常ドメインのうちの２つ（ＣＨ２、ＣＨ３）から構成される、修飾された結晶性断片ドメイン（Ｆｃ）と融合される。図１Ｂは、ＧＦＰのみ（「コントロール」、左のパネル）、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ遺伝子（「ａＣＤ２０ ＩＦＬ」、真ん中のパネル）、又は抗ＣＤ１９ ＩＦＬ遺伝子（「ａＣＤ１９ ＩＦＬ」、右のパネル）を形質導入したＮＫ細胞において、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体による細胞内染色によって検出されるＧＦＰ及びＩＦＬの発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットである。各四分画領域（ｑｕａｄｒａｎｔ）の細胞のパーセンテージを示す。図１Ｃは、形質導入されたＴリンパ球において図１Ｂと同じように染色している。
【図2】図２は、ＩＦＬがそれらの同系のバインダーに対して特異的であることを示す図である。図２は、ＧＦＰのみ（「コントロール」）、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、又は抗ＣＤ１９ ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞（上のパネル）又はＴ細胞（下のパネル）から得られた培養上清とインキュベーションしたインキュベーション後の、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２０－、ＣＤ１９－）、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ２０＋、ＣＤ１９＋）、及びＲＳ４；１１（ＣＤ２０－、ＣＤ１９＋）細胞の標識を示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。標的細胞の表面に結合したＩＦＬは、フィコエリトリンにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。
【図3A-C】図３Ａ～Ｃは、ＩＦＬの合成及びグリコシル化を示す図である。図３Ａは、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを形質導入した同じドナー由来のＮＫ細胞又はＴ細胞によって分泌されるＩＦＬのレベルを示すプロットである。各記号は、試験した３人のドナーのうちの１人の結果を示す。図３Ｂは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによるＮ－グリカンプロファイリングに従う、形質導入されたＮＫ細胞（左のパネル）又はＴ細胞（真ん中のパネル）から分泌されたＩＦＬのフコシル化グリカン（濃青色）及び非フコシル化グリカン（淡青色）のパーセンテージを示す円グラフである。リツキシマブによる結果を、比較のために示す。図３Ｃは、形質導入されたＮＫ細胞若しくはＴ細胞によって分泌されるＩＦＬにおける又はリツキシマブにおけるグリカンの種々のタイプのそれぞれの相対的強度のパーセンテージを示す棒グラフである。模式的な構造は、グリカンの種々のタイプを示す。
【図4A-B】図４Ａ～Ｂは、免疫細胞由来ＩＦＬによって媒介されるＣＤＣ及びＡＤＣＰを示す図である。図４Ａは、Ｒａｍｏｓ（左のパネル）及びＳＵＤＨＬ－４細胞（右のパネル）を０．０５μｇ／ｍＬのリツキシマブ又はＮＫ細胞若しくはＴ細胞由来のＩＦＬと、５％の補体の存在下又は非存在下においてインキュベートした時の結果を示す図である。細胞の死滅は、フローサイトメトリーによって生細胞をカウントすることによって測定した。図４Ｂは、ＮＫ細胞又はＴ細胞由来のＩＦＬ（０．１μｇ／ｍＬ）を、４８時間、ＴＨＰ－１細胞あり又はなしで共培養したＲａｍｏｓ細胞に追加した時の結果を示すプロットである。細胞の死滅は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅにより標的生細胞をカウントすることによって測定した。
【図5A-C】図５Ａ～Ｃは、免疫細胞由来ＩＦＬによって媒介されるＡＤＣＣを示す図である。図５Ａは、Ｒａｊｉ細胞を、ＧＦＰのみ（「ＮＫ－ＧＦＰ」）又は抗ＣＤ２０ ＩＦＬ（「ＮＫ－ＩＦＬ」）を形質導入したＮＫ細胞と、１：１のＥ：Ｔ比で培養した時の結果を示す図である。コントロールとして、Ｒａｍｏｓを、ＮＫ細胞なしで（「ｎｏ ＮＫ」）又は１μｇ／ｍｌのリツキシマブの存在下においてＮＫ－ＧＦＰと培養した。Ｒａｍｏｓ生細胞の数を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用して、７２時間、８時間毎にカウントした。図５Ｂは、ＲＳ４；１１、ＯＰ－１、及びＮａｌｍ－６に対する、ＧＦＰのみ又は抗ＣＤ１９ ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞の細胞傷害作用を示すプロットである。Ｅ：Ｔ ２：１比での４時間のアッセイについてのデータを示す。各記号は、１人のドナー由来のＮＫ細胞により得られた結果を示す；バーは、中央値に相当する。図５Ｃは、ＲＳ４；１１細胞を、４時間、Ｅ：Ｔ ２：１の比で、培地のみ又はＧＦＰのみ若しくは抗ＣＤ２０若しくは抗ＣＤ１９ ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞とインキュベートした時の結果を示すプロットである。各記号は、１人のドナー由来のＮＫ細胞により得られた結果を示す。
【図6A-D】図６Ａ～Ｄは、免疫細胞由来ＩＦＬによって媒介されるＡＤＣＣを示す図である。図６Ａは、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを有するＩＦＬを含有する遺伝子構築物の略図である。図６Ｂは、ＧＦＰのみ（「コントロール」）又はＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ（「ＩＦＬ＋ＣＤ１６Ｒ」）を形質導入したＴ細胞におけるＣＤ１６の表面発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットである。各四分画領域の細胞のパーセンテージを示す。図６Ｃは、同じ細胞において抗ヒトＩｇ Ｆｃ抗体により細胞内染色した後のＩＦＬの発現を示すフローサイトメトリーのドットプロットである。図６Ｄは、Ｒａｍｏｓ細胞を、示される種々の構築物を形質導入したＴ細胞あり又はなしで共培養した時の結果のグラフである。Ｒａｍｏｓ生細胞の数は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅによって７２時間、８時間毎にカウントした。
【図7A-B】図７Ａ～Ｂは、インビボにおけるＩＦＬの血漿濃度及び抗腫瘍活性を示す図である。図７Ａは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζを形質導入した２×１０7Ｔ細胞を静脈内注射した時の結果を示すグラフである。血漿におけるＩＦＬのレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した。図７Ｂは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウス（ｎ＝１８）が、ルシフェラーゼにより標識された２×１０5Ｄａｕｄｉの１回の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を受けた時の結果を示すグラフである。１２匹のマウスにおいて、発明者らは、Ｄａｕｄｉ注射の３及び６日後に、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ（ｎ＝６）又はＧＦＰのみ（ｎ＝６）を形質導入した２×１０7Ｔ細胞の２回のｉ．ｐ．注射剤を投与した；６匹のさらなるマウスに、培地のみを注射した。カプラン－マイヤー曲線は、様々な群における無病生存のパーセンテージを示す。
【図8A-E】図８Ａ～Ｅは、ＩＦＬ変異体の例を示す図である。図８Ａは、Ｆｃ受容体又は補体に対する親和性を増加させるための多型を有するＩＦＬの模式図である。図８Ｂは、六量体の形成を促進するための多型を有するＩＦＬの模式図である。図８Ｃは、リンカーを通してサイトカインと融合しているＩＦＬの模式図である。図８Ｄは、ＩＦＬについてのバインダーとしてのＴＣＲα及びβ鎖の細胞外ドメインの模式図である。図８Ｅは、共刺激分子に結合するリガンドと融合しているＩＦＬの模式図である。
【図9A-B】図９Ａ～Ｂは、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）に連結され（図８Ｃを参照）、免疫細胞によって分泌される抗ＣＤ２０ ＩＦＬによって媒介されるＡＤＣＣを示す図である。グラフは、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞Ｒａｍｏｓを、１：１ Ｅ：Ｔ比で、ＧＦＰのみ（「ＮＫ－ＧＦＰ」）、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ（「ＮＫ－ＩＦＬ」）、又はＩＬ－１５に連結された抗ＣＤ２０ ＩＦＬ（「ＮＫ－ＩＦＬ－ＩＬ１５」）を形質導入したＮＫ細胞と培養した実験の結果を示す。コントロールとして、Ｒａｍｏｓ細胞は、ＮＫ細胞なしで培養した（「ｎｏ ＮＫ」）。図９Ａの実験において、ＩＬ－２は追加しなかった；図９Ｂの実験において、培養は、４０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２で実行した。Ｒａｍｏｓ生細胞の数は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ機器により測定する生細胞イメージング（ｌｉｆｅ－ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して７２時間、８時間毎にカウントした。
【発明を実施するための形態】
【0019】
例示の実施形態の説明について以下に記す。
【0020】
モノクローナル抗体は、癌の最新治療に不可欠である。抗体は、細胞死の直接的な誘発、補体活性化、及び免疫細胞の関与を含むいくつかのメカニズムを介して抗腫瘍活性を発揮する。腫瘍細胞に結合した抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こすことができる。1-6ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面に発現されるＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の関与に起因するＡＤＣＣは7、抗体の臨床有効性において重要な役割を果たす；Ｆｃに対してより高い親和性を有する受容体につながる、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＦＣＲＧ３Ａ又はＣＤ１６）をコード化する遺伝子の多型は、患者においてより良好な抗腫瘍効果と関連した。2,8-16抗体の抗腫瘍活性の根底にある他の重要なメカニズムは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を通してのマクロファージ及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）による腫瘍細胞の排除を含む。7,17
【0021】
癌を治療するための免疫療法のツールボックスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）誘導Ｔリンパ球の出現によってかなり充実したものになった。ＣＡＲ－Ｔ細胞による臨床経験は、Ｔリンパ球が、適切に活性化された場合に、化学療法に対する抵抗性を克服し、腫瘍量における大きな低下、疾患の安定、並びにＢ細胞白血病及びリンパ腫を有する患者の中には腫瘍根絶につながり得ることを実証する。18-26ＣＡＲ－Ｔ細胞において、Ｔ細胞の刺激は、抗体に似た特性を有するキメラ分子の発現を介して生じる。27-31腫瘍特異的Ｔ細胞活性化につながる別のアプローチは、刺激及び共刺激シグナルを含むキメラ受容体の構成要素としての高親和性ＣＤ１６の発現を通してのものである。32そのような受容体は、抗体療法の抗腫瘍効果をかなり強化する可能性を有する。ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、それは、ＡＤＣＰ及びＣＤＣなどの、他の抗体媒介性のメカニズムと共同で働き、協調的な抗腫瘍効果をもたらす。さらに、わずかに発現された抗原に対して多数の抗体を使用することによって、活発なＴ細胞反応を誘起することができる。
【0022】
免疫細胞が、抗体に似た機能を有するバインダーを産生するのを可能にする方法が、本明細書において記載される。これらのインビボ機能的リガンド（ＩＦＬ）は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣ並びにサイトカイン刺激を引き起こすことが可能である。これらは、エフェクター機能を最適化するために、ＮＫ細胞及びＴ細胞において、ＣＤ１６キメラ受容体と一緒に発現させることができる。
【0023】
本明細書において記載される特定の実施例は、典型としてＣＤ２０＋及びＣＤ１９＋Ｂ細胞を標的にするが、このアプローチは、癌及び他の疾患の病因となる細胞のマーカーとなる他の抗原を標的にすることに適用可能である。
【0024】
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫並びにＣＤ２０及びＣＤ１９
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、リンパ性血液細胞の癌である。ＮＨＬは、不可避的に進行し、治療しなければ致命的となる。標準治療は、化学療法、抗体療法、チロシンキナーゼ阻害剤による療法、及び血液幹細胞移植術を含む。ＣＤ２０及びＣＤ１９は、Ｂ細胞ＮＨＬ（Ｂ－ＮＨＬとも称される）において広範囲に発現されるＢ細胞特異的抗原である。
Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、リンパ性血液細胞の癌である。ＮＨＬは、不可避的に進行し、治療しなければ致命的となる。標準治療は、化学療法、抗体療法、チロシンキナーゼ阻害剤による療法、及び血液幹細胞移植術を含む。ＣＤ２０及びＣＤ１９は、Ｂ細胞ＮＨＬ（Ｂ－ＮＨＬとも称される）において広範囲に発現されるＢ細胞特異的抗原である。
【0025】
本明細書において記載されるベクターは、修飾Ｔ細胞を産出するために使用することができ、これは、さらには、ＮＨＬの標的治療に使用することができる。本明細書において記載されるプロセスは、ＣＤ２０＋及びＣＤ１９＋Ｂ細胞を破壊するために標的にし、それにより、ＮＨＬを根絶する及び／又はその重症度を減少させることができるトランスジェニックＴ細胞を作り出すために使用することができる。
【0026】
急性リンパ性白血病及びＣＤ１９
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）はまた、リンパ系血球の癌である。ＡＬＬは、急速に進行し、治療しなければ致命的となる。標準治療は、化学療法及び血液幹細胞移植術を含む。ＣＤ１９は、ＡＬＬの大半の症例において、すべての白血病細胞上に発現されるＢ細胞特異性抗原である。
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）はまた、リンパ系血球の癌である。ＡＬＬは、急速に進行し、治療しなければ致命的となる。標準治療は、化学療法及び血液幹細胞移植術を含む。ＣＤ１９は、ＡＬＬの大半の症例において、すべての白血病細胞上に発現されるＢ細胞特異性抗原である。
【0027】
本明細書において記載されるベクターは、修飾Ｔ細胞を産出するために使用することができ、これは、さらには、ＡＬＬの標的治療に使用することができる。本明細書において記載されるプロセスは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を破壊するために標的にし、それにより、ＡＬＬを根絶する及び／又はその重症度を減少させることができるトランスジェニックＴ細胞を作り出すために使用することができる。
【0028】
核酸
本明細書において使用されるように、「核酸」という用語は、多数のヌクレオチドモノマー（たとえばリボヌクレオチドモノマー又はデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」は、たとえば、ＤＮＡ（たとえばゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、並びにＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子を含む。核酸分子は、天然に存在する、組換え、又は合成とすることができる。加えて、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖とすることができる。ある実施形態では、核酸分子は、修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子の一方又は両方の鎖を指すことができる。
本明細書において使用されるように、「核酸」という用語は、多数のヌクレオチドモノマー（たとえばリボヌクレオチドモノマー又はデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」は、たとえば、ＤＮＡ（たとえばゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、並びにＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド分子を含む。核酸分子は、天然に存在する、組換え、又は合成とすることができる。加えて、核酸分子は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖とすることができる。ある実施形態では、核酸分子は、修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子の一方又は両方の鎖を指すことができる。
【0029】
用語「ヌクレオチド」及び「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドモノマー並びに天然に存在しないその誘導体及びアナログを指す。したがって、ヌクレオチドは、たとえば天然に存在する塩基（たとえばアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、又はデオキシシチジン）を含むヌクレオチド及び当技術分野において知られている修飾塩基を含むヌクレオチドを含むことができる。
【0030】
本明細書において使用されるように、用語「配列同一性」は、配列が、パーセンテージとして表される最大レベルの同一性を達成するようにアライメントされた場合に、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。配列アライメント及び比較のために、典型的に、１つ配列が参照配列として指定され、これと試験配列を比較する。参照配列及び試験配列の間の配列同一性は、参照配列及び試験配列が最大レベルの同一性を達成するように参照配列及び試験配列をアライメントした際に同じヌクレオチド又はアミノ酸を共有する、参照配列の全長にわたる位置のパーセンテージとして表される。一例として、最大レベルの同一性を達成するようにアライメントした際に、試験配列が、参照配列の全長にわたって同じ位置の７０％に同じヌクレオチド又はアミノ酸残基を有する場合、２つの配列は、７０％の配列同一性を有するとみなされる。
【0031】
最大レベルの同一性を達成するための比較のための配列のアライメントは、適切なアライメント方法又はアルゴリズムを使用して、当業者によって容易に実行することができる。いくつかの場合では、アライメントは、最大レベルの同一性をもたらすために、導入されたギャップを含むことができる。例として、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、並びに目視検査（一般にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）を含む。
【0032】
配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、その後の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムにより、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した、試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。配列同一性パーセントを決定するために一般的に使用されるツールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈで入手可能なＰｒｏｔｅｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴＰ）である。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３－１０（１９９０））。
【0033】
様々な実施形態では、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列は、少なくとも、たとえば７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有することができる。本明細書において記載される１つ又はそれ以上の配列に対する配列同一性パーセントを確かめる場合、本明細書において記載される配列は参照配列となる。
【0034】
ベクター
「ベクター」、「ベクター構築物」、及び「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（たとえば外来遺伝子）を宿主細胞の中に導入することができる運搬手段を意味する。ベクターは、伝播性の物質であるＤＮＡを典型的に含み、この中に、タンパク質をコードする外来性ＤＮＡが、制限酵素技術によって挿入される。ベクターの一般的なタイプは、「プラスミド」であり、これは、一般に、追加の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの独立した分子であり、適した宿主細胞の中に容易に導入することができる。プラスミド及び真菌ベクターを含む多くのベクターは、様々な真核生物及び原核生物の宿主における複製及び／又は発現について記載されている。
「ベクター」、「ベクター構築物」、及び「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（たとえば転写及び翻訳）を促進するように、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（たとえば外来遺伝子）を宿主細胞の中に導入することができる運搬手段を意味する。ベクターは、伝播性の物質であるＤＮＡを典型的に含み、この中に、タンパク質をコードする外来性ＤＮＡが、制限酵素技術によって挿入される。ベクターの一般的なタイプは、「プラスミド」であり、これは、一般に、追加の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れることができる二本鎖ＤＮＡの独立した分子であり、適した宿主細胞の中に容易に導入することができる。プラスミド及び真菌ベクターを含む多くのベクターは、様々な真核生物及び原核生物の宿主における複製及び／又は発現について記載されている。
【0035】
「発現する」及び「発現」という用語は、遺伝子及びＤＮＡ配列中の情報が現れるのを可能にすること又は引き起こすこと、たとえば、対応する遺伝子又はＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞の機能を活性化することによってタンパク質を産生することを意味する。ＤＮＡ配列は、タンパク質などのような「発現産物」を形成するために、細胞中で又はそのそばで発現される。発現産物自体、たとえば結果として生じるタンパク質は、細胞によって「発現される」と言うこともできる。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、たとえば、それが、外来性の若しくは本来のプロモーターのコントロール下で外来性の宿主細胞において又は外来性のプロモーターのコントロール下で本来の宿主細胞において発現される又は産生される場合、組換えで発現される。遺伝子送達ベクターは、プロモーターに作動可能に連結される導入遺伝子（たとえば、酵素をコードする核酸）及びベクターが導入される宿主細胞における導入遺伝子の発現に必要とされる他の核酸エレメントを一般に含む。遺伝子発現に適したプロモーター及び送達構築物は、当技術分野において知られている。組換えプラスミドはまた、細胞における酵素の発現のための誘発性の又は調節可能なプロモーターを含むこともできる。
【0036】
様々な遺伝子送達運搬手段は、当技術分野において知られており、ウイルス及び非ウイルス（たとえばネイキッドＤＮＡ、プラスミド）ベクターを含む。遺伝子送達に適したウイルスベクターは、当業者らに知られている。そのようなウイルスベクターは、たとえば、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、及びマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来するベクターを含む。ウイルスベクターは、複製する又は複製しないウイルスベクターとすることができる。そのようなベクターは、本明細書において開示される若しくは引用される又はその他当業者らに知られている方法を使用して、多くの適切な宿主細胞の中に導入することができる。
【0037】
遺伝子送達のための非ウイルスベクターは、とりわけ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、トランスポゾン、及びｍＲＮＡを含む。非限定的な例は、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＲＳＥＴ又はｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）を含む。そのようなベクターは、本明細書において開示される若しくは引用される又はその他当業者らに知られている方法を使用して、多くの適切な宿主細胞の中に導入することができる。
【0038】
ある実施形態では、ベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、アンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｍｐ）などのような選択マーカーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙなどのような蛍光タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩの間のｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの中にサブクローニングするのに適している。いくつかの実施形態では、ベクターは、所望の遺伝子の挿入のためのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）を含有する。
【0039】
遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が多数のコドン（「シノニム」又は「同義」コドンと呼ばれる）によって表されるという点で縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度が、非ランダムであり且つ特定の三つ組コドンに偏っていることは、当技術分野において理解されている。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、特定のタイプの宿主細胞における発現のために最適化された（たとえばコドン最適化を通して）ヌクレオチド配列を含む。コドン最適化は、興味があるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドにおける特定のコドンを、同じアミノ酸をコードするが、核酸が発現されている宿主細胞において一般的に使用される／認識されるコドンと交換するように修飾されるプロセスを意味する。いくつかの態様では、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、Ｔ細胞における発現のためにコドン最適化される。
【0040】
インビボ機能的リガンド
図１Ａは、インビボ機能的リガンド（ＩＦＬ）構築物の略図である。ＩＦＬは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン、修飾された結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン、及びｓｃＦｖ及び修飾されたＦｃドメインをつなぐヒンジドメインを含む。好ましくは、ＩＦＬを分泌経路の方へ向け、最終的に、細胞によって分泌させるＮ末端シグナルペプチド（リーダーペプチド）が、含まれる。表面タンパク質のシグナルペプチドが、一般に適しており、例として、ＣＤ８αシグナルペプチドがある。
図１Ａは、インビボ機能的リガンド（ＩＦＬ）構築物の略図である。ＩＦＬは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン、修飾された結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン、及びｓｃＦｖ及び修飾されたＦｃドメインをつなぐヒンジドメインを含む。好ましくは、ＩＦＬを分泌経路の方へ向け、最終的に、細胞によって分泌させるＮ末端シグナルペプチド（リーダーペプチド）が、含まれる。表面タンパク質のシグナルペプチドが、一般に適しており、例として、ＣＤ８αシグナルペプチドがある。
【0041】
ｓｃＦｖドメインは、典型的に、免疫グロブリン可変軽（ＶL）ドメイン、免疫グロブリン可変重（ＶH）ドメイン、並びにＶL及びＶHドメインをつなぐリンカードメインを含む。ＶL及びＶHドメインの相対的な位置は逆にすることができるが、それらは、両方とも、図１Ａにおいて示されるように、修飾されたＦｃドメインに対してＮ’にある。
【0042】
ｓｃＦｖドメインは、腫瘍細胞の抗原などの、興味がある抗原を標的にする。本明細書において記載されるある特定のｓｃＦｖは、抗ＣＤ１９単鎖可変断片（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）である。本明細書において記載される別の特定のｓｃＦｖは、抗ＣＤ２０単鎖可変断片（抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ）である。
【0043】
本明細書において記載される実施形態は、抗ＣＤ１９構築物及び抗ＣＤ２０構築物に関するものであるが、同様のアプローチを、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ）－２、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６などの他の標的抗原に対する構築物を産出するために適用することができる。例えば、図５Ａにおける模式図に基づいて、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ部分は、様々な標的抗原に特異的に結合する様々なｓｃＦｖと交換することができる。ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６を含む他の標的が、適している。
【0044】
ヒンジドメインは、ｓｃＦｖ及び修飾されたＦｃドメインをつなぐが、いくつかの場合において、ヒンジドメインは、Ｆｃドメインの一部とみなされてもよい。ヒンジドメインの例は、ＩｇＧヒンジドメインである。構築物はまた、ＣＤ８αシグナルペプチドなどのようなＮ末端シグナルペプチドを含むこともできる（配列番号２１及び２２を参照）。
【0045】
ＶL及びＶHドメイン間の様々なリンカードメインが、適している。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）xとすることができ、ｘは、１～１００の整数である；好ましくは、ｘは、１～１０の整数である；さらにより好ましくは、ｘは、２～５の整数である。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、（Ｇ４Ｓ）3とすることができる。他の実施形態では、リンカードメインは、１つ又はそれ以上のグリシン残基（たとえば（Ｇ）yとすることができ、ｙは、２～１００の整数である。他の実施形態では、リンカードメインは、（ＥＡＡＡＫ）3、（Ｇ４Ｓ）x、（Ｇ４Ｓ）3、及び（Ｇ）yとすることができ、可動性リンカーの例となるが、（ＥＡＡＡＫ）3は、より剛性のリンカーの例となる。
【0046】
様々なヒンジドメインが、適している。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＩｇＧヒンジドメインとすることができる。いくつかの実施形態では、ヒンジは、複数のアミノ酸残基とすることができる。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＣＤ８α由来のヒンジドメインとすることができる。
【0047】
いくつかの実施形態において、構築物は、図６Ａにおいて示されるように、キメラ受容体もコードするバイシストロニックベクターである。キメラ受容体は、受容体ドメイン、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、並びに細胞質シグナル伝達ドメインを含むことができる。図６Ａの構築物において、キメラ受容体は、自己切断ペプチドである２Ａペプチドによって、修飾されたＦｃドメインとつながれる。ｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインとキメラ受容体をつなぐことによって、両方のタンパク質の同時発現を、単一のベクターから発現させることができる。２Ａペプチドの例は、Ｐ２Ａ（配列番号４３及び４４）、Ｔ２Ａ（配列番号４５及び４６）、Ｅ２Ａ（配列番号４７及び４８）、並びにＦ２Ａ（配列番号４９及び５０）であるが、他の２Ａペプチドが当技術分野において知られている。
【0048】
ＩＦＬの設計に対する修飾
本研究において試験されるＩＦＬ構築物の設計は、いくつかのその機能を増強する及び／又はその特異性の範囲を広げるために、さらに修飾することができる。例えば、修飾されたＦｃは、ＮＫ細胞及びマクロファージにおけるＦｃ受容体に対するその親和性を増加させ、したがってＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを増強するために並びに／又は補体に結合するその能力を増加させるために、さらに改変することができる。41-43
本研究において試験されるＩＦＬ構築物の設計は、いくつかのその機能を増強する及び／又はその特異性の範囲を広げるために、さらに修飾することができる。例えば、修飾されたＦｃは、ＮＫ細胞及びマクロファージにおけるＦｃ受容体に対するその親和性を増加させ、したがってＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを増強するために並びに／又は補体に結合するその能力を増加させるために、さらに改変することができる。41-43
【0049】
ある修飾において（図８Ａ）、ＦｃのＣH２ドメイン中に導入された２つの突然変異の例（２３９位においてアスパラギン酸の代わりにセリン、Ｓ２３９Ｄ；及び３３２位においてグルタミン酸の代わりにイソロイシン、Ｉ３３２Ｅ）は、Ｆｃ受容体に対する親和性を改善するためになされる；２つの他の突然変異（Ｓ２６７Ｅ及びＨ２６８Ｆ）は、補体結合を増加させるためになされる。41,43
【0050】
別の修飾において（図８Ｂ）、ＦｃのＣH２ドメイン中に導入された突然変異の例（Ｅ３４５Ｋ、Ｅ４３０Ｇ、及びＳ４４０Ｙ）は、六量体形成を促進するためになされる。ＩＦＬ六量体は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを増加させることができるであろう。44,48
【0051】
別の修飾において（図８Ｃ）、ＩＬ－１５が、ＩＦＬ構築物に追加される；このサイトカインは、免疫細胞の活性化及び増加を促進する。45,46ＩＦＬ及びＩＬ－１５は、リンカーによってつながれる。ＩＦＬ構築物とサイトカインとの間の種々のリンカードメインが、適している。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、その対応するヌクレオチド配列（配列番号５１）によって産生される配列番号５２のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、リンカードメインは、Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａとすることができる。他の実施形態において、リンカードメインは、（ＥＡＡＡＫ）z及びＡ（ＥＡＡＡＫ）zＡとすることができ、ｚは、１～１００の整数である；好ましくは、ｚは、２～５の整数である。他の実施形態において、リンカードメインは、（ＸＰ）wとすることができ、Ｘは、任意のアミノ酸を指定する；好ましくは、Ｘは、アラニン、リシン、又はグルタミン酸であり、ｗは、１～１００の整数である。
【0052】
別の修飾において（図８Ｅ）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、又はＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの免疫細胞の共刺激分子に結合するリガンドが、ＩＦＬ構築物に追加される。ＩＦＬ及び共刺激リガンドは、リンカーによってつながれる。ＩＦＬ構築物と共刺激リガンドとの間の種々のリンカードメインが、適しており、一般に、図８ＣのＩＦＬ構築物とサイトカインとの間の適しているリンカードメインと同じである。
【0053】
図８Ｄは、ＩＦＬの結合ドメインが、エプスタイン－バーウイルスに対して誘導されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞外ドメインである構築物を示す。47そのようなＩＦＬは、ウイルス感染した又は癌化した（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）細胞によって産生されるペプチドを認識することができ、ＭＨＣ／ＨＬＡ分子と関連して細胞膜上に発現させることができる。そのため、そのようなＩＦＬは、抗体又は抗体に由来するｓｃＦｖによって認識することができないウイルスペプチド又は癌細胞によって産生されるペプチドを標的とするために使用することができるであろう。
【0054】
トランスジェニック宿主細胞を作製するための方法
トランスジェニックナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はトランスジェニックＴ細胞などのようなトランスジェニック宿主細胞を作製するための方法が、本明細書において記載される。トランスジェニック宿主細胞は、たとえば、宿主細胞の中に、本明細書において記載される１つ又はそれ以上のベクターの実施形態を導入することによって作製することができる。
トランスジェニックナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はトランスジェニックＴ細胞などのようなトランスジェニック宿主細胞を作製するための方法が、本明細書において記載される。トランスジェニック宿主細胞は、たとえば、宿主細胞の中に、本明細書において記載される１つ又はそれ以上のベクターの実施形態を導入することによって作製することができる。
【0055】
一実施形態では、方法は、ＩＦＬをコードする核酸を含むベクターを宿主細胞の中に導入することを含む。いくつかの実施形態では、バイシストロニックベクターなどのような核酸は、キメラ受容体と共にＩＦＬを発現する。いくつかの実施形態では、２つの別々のベクターは、ＩＦＬ及びキメラ受容体を発現する、トランスジェニックＴ細胞などのようなトランスジェニック細胞を作り出すために使用することができる。
【0056】
いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の核酸は、宿主細胞のゲノムの中に統合される。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムの中に統合される核酸は、たとえば相同組換え、ＣＲＩＳＰＲベースのシステム（たとえばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）、及びＴＡＬＥＮシステムを含む、当技術分野において知られている様々な適した手法のいずれかを使用して、宿主細胞の中に導入することができる。
【0057】
宿主細胞
種々の宿主細胞が、トランスジェニック宿主細胞を作製するのに適している。最も一般的には、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＴリンパ球細胞などの免疫細胞である。
種々の宿主細胞が、トランスジェニック宿主細胞を作製するのに適している。最も一般的には、宿主細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又はＴリンパ球細胞などの免疫細胞である。
【0058】
本明細書において使用されるように、「ナチュラルキラー細胞」（「ＮＫ細胞」）は、免疫系の一種の細胞傷害性リンパ球を指す。ＮＫ細胞は、速やかな反応をウイルス感染した細胞にもたらし、がん化した細胞に応答する。典型的に、免疫細胞は、感染した細胞の表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される病原体由来のペプチドを検出し、サイトカイン放出を引き起こし、溶解又はアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、病原体由来のペプチドがＭＨＣ分子上に存在するかどうかにかかわらず、ストレスがかかっている細胞を認識する能力を有するので、他に類を見ない細胞である。ＮＫ細胞は、標的を死滅させるために事前の活性化を必要としないと当初考えられたため、「ナチュラルキラー」と命名された。ＮＫ細胞は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、骨髄において分化し、成熟することが知られており、ＮＫ細胞は、次いで、骨髄から血液循環中に入る。腫瘍細胞の表面の抗原に抗体が結合している場合、ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞を死滅させることもできる；抗体のＦｃ部分は、ＮＫ細胞の表面のＦｃ受容体（ＣＤ１６）に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）として知られているプロセスである細胞傷害作用を引き起こす。
【0059】
本明細書において使用されるように、「Ｔリンパ球」又は「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟するリンパ球を指す。Ｔ細胞は、さらに特徴づけられ、Ｔヘルパー（ＴH）細胞、Ｔ細胞傷害性（ＴC）細胞、及びＴ調節性（Ｔreg）細胞を含む亜集団に分けることができる。ＴH及びＴC細胞は、膜糖タンパク質ＣＤ４及びＣＤ８の存在又は非存在に従って特徴づけることができる。一般に、ＴH細胞は、それらの表面にＣＤ４を発現するが、ＴC細胞は、それらの表面にＣＤ８を発現する。Ｔヘルパー細胞は、ＴH１細胞及びＴH２細胞としてさらに特徴づけることができる。Ｔ細胞はまた、ＣＤ１６及びシグナル伝達分子をコードする受容体を形質導入した場合、ＡＤＣＣを発揮することもできる。32
【0060】
いくつかの態様において、ＮＫ細胞又はＴ細胞は、哺乳動物細胞である。「哺乳動物」又は「哺乳類」の例は、霊長類（例えばヒト）、イヌ科の動物、ネコ科の動物、げっ歯類、ブタ、反芻動物、及びその他同種のものを含む。特定の例は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット、及びマウスを含む。特定の態様において、哺乳動物Ｔ又はＮＫ細胞は、ヒトＴ又はＮＫ細胞である。
【0061】
ＩＦＬをコードする核酸を含むベクターを宿主細胞の中に導入すると同時に、宿主細胞は、ＩＦＬを発現するトランスジェニック宿主細胞になる。典型的に、ＩＦＬは、トランスジェニック宿主細胞によって分泌される。
【0062】
値及び範囲
特に明記しない限り又は特に文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、特に文脈が明確に指示しない限り、様々な実施形態において指定される範囲内の任意の特定の値又は部分範囲と考えることができる。数値に関する「約」は、特に指定のない限り又は特に文脈から明白でない限り、その値の±８％、いくつかの実施形態では±６％、いくつかの実施形態では±４％、いくつかの実施形態では±２％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％以内にある値の範囲を一般に指す。
特に明記しない限り又は特に文脈及び当業者の理解から明白でない限り、範囲として表される値は、特に文脈が明確に指示しない限り、様々な実施形態において指定される範囲内の任意の特定の値又は部分範囲と考えることができる。数値に関する「約」は、特に指定のない限り又は特に文脈から明白でない限り、その値の±８％、いくつかの実施形態では±６％、いくつかの実施形態では±４％、いくつかの実施形態では±２％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％以内にある値の範囲を一般に指す。
【実施例】
【0063】
材料及び方法
細胞
ヒト細胞株ＲＳ４；１１及びＮａｌｍ－６（Ｂ細胞白血病）、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、及びＤａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、並びにＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。Ｂ細胞白血病細胞株ＯＰ－１は、発明者らの研究所で確立した。33発明者らは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）－配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスベクター（Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮからの）によりＮａｌｍ－６及びＤａｕｄｉを形質導入した。発明者らはまた、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するＭＳＣＶレトロウイルスベクターによりＲａｍｏｓ及びＲａｊｉを形質導入した。形質導入した細胞は、ＭｏＦｌｏセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して、それぞれ、それらのＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ発現について選択した。Ｎａｌｍ－６が表面にＣＤ２０を発現するように、発明者らは、サイトメガロウイルスプラスミド（ｐＣＭＶ６）ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中のヒトＣＤ２０遺伝子をＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターの中にサブクローニングし、ＣＤ２０遺伝子によりＮａｌｍ－６を形質導入した。ＣＤ２０を発現しているＮａｌｍ－６細胞は、抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）による染色後に、ＭｏＦｌｏソーターを使用して選択した。細胞株は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で培養した。
細胞
ヒト細胞株ＲＳ４；１１及びＮａｌｍ－６（Ｂ細胞白血病）、Ｒａｍｏｓ、Ｒａｊｉ、及びＤａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、並びにＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞白血病）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得た。Ｂ細胞白血病細胞株ＯＰ－１は、発明者らの研究所で確立した。33発明者らは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）－配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスベクター（Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮからの）によりＮａｌｍ－６及びＤａｕｄｉを形質導入した。発明者らはまた、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を含有するＭＳＣＶレトロウイルスベクターによりＲａｍｏｓ及びＲａｊｉを形質導入した。形質導入した細胞は、ＭｏＦｌｏセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を使用して、それぞれ、それらのＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ発現について選択した。Ｎａｌｍ－６が表面にＣＤ２０を発現するように、発明者らは、サイトメガロウイルスプラスミド（ｐＣＭＶ６）ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）中のヒトＣＤ２０遺伝子をＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰベクターの中にサブクローニングし、ＣＤ２０遺伝子によりＮａｌｍ－６を形質導入した。ＣＤ２０を発現しているＮａｌｍ－６細胞は、抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）による染色後に、ＭｏＦｌｏソーターを使用して選択した。細胞株は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ－１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）中で培養した。
【0064】
末梢血は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅで健康なドナーから寄付された血小板の廃棄物から得た。単核細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）による密度勾配遠心分離によって単離し、ＲＰＭＩ－１６４０中で２回洗浄した。ウイルス形質導入のために、ＮＫ細胞を、発明者らの研究所において以前に確立した遺伝子修飾Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬにより、単離した単核細胞から増加させた。34,35Ｔ細胞は、Ｔ ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって活性化し、インターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、１００ＩＵ／ｍＬ）を有するＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で培養した。
【0065】
プラスミド及びウイルス形質導入
発明者らは、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾された結晶性断片ドメイン（Ｆｃ）と連結している単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から構成されるＩＦＬを設計した。シグナルペプチド、ＣＤ２０に対するｓｃＦｖ、及びＩｇＧ１の修飾されたＦｃのアミノ酸の配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ；受入番号ＤＢ０００７３）において記載されるリツキシマブの配列から得た。ＣＤ１９に対するｓｃＦｖ配列は、発明者らの研究所において以前に開発された抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＣＤ３ζＣＡＲ由来のものとした。31重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3をコードする可動性リンカー配列によって結んだ。連結されたｓｃＦｖを、シグナルペプチド及びヒンジにつなぎ、続いて、ＩｇＧ１の定常重ドメイン２及び３（ＣH２、ＣH３）につないだ。抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζと融合させ、これは、Ｔ細胞に、自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）を通して、発明者らの研究所によって以前に記載された通り、ＡＤＣＣを発揮させることができた。36遺伝子を、ＧＦＰあり又はなしで、ＭＳＣＶベクターの中にサブクローニングした。
発明者らは、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾された結晶性断片ドメイン（Ｆｃ）と連結している単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から構成されるＩＦＬを設計した。シグナルペプチド、ＣＤ２０に対するｓｃＦｖ、及びＩｇＧ１の修飾されたＦｃのアミノ酸の配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ；受入番号ＤＢ０００７３）において記載されるリツキシマブの配列から得た。ＣＤ１９に対するｓｃＦｖ配列は、発明者らの研究所において以前に開発された抗ＣＤ１９－４１ＢＢ－ＣＤ３ζＣＡＲ由来のものとした。31重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3をコードする可動性リンカー配列によって結んだ。連結されたｓｃＦｖを、シグナルペプチド及びヒンジにつなぎ、続いて、ＩｇＧ１の定常重ドメイン２及び３（ＣH２、ＣH３）につないだ。抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζと融合させ、これは、Ｔ細胞に、自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）を通して、発明者らの研究所によって以前に記載された通り、ＡＤＣＣを発揮させることができた。36遺伝子を、ＧＦＰあり又はなしで、ＭＳＣＶベクターの中にサブクローニングした。
【0066】
レトロウイルスベクターによる遺伝子形質導入は、以前に記載される通り、実行した。37簡単に述べると、ＭＳＣＶレトロウイルスベクターを、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング（Ｔａｋａｒａ、大津、日本）チューブに追加し、１６時間４℃でインキュベートした。次いで、活性化されたＮＫ細胞又はＴリンパ球を、上清の除去の後にチューブに追加し、２４時間５％ＣＯ2中３７℃でインキュベートした。形質導入手順を、次の日、もう一回繰り返した。形質導入した細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０、ＩＬ－２を有する１０％ＦＢ中で維持した。
【0067】
ＩＦＬ発現及び特異性の決定
ＩＦＬ発現を検出するために、形質導入した細胞を、８Ｅ試薬（発明者らの研究所において開発された透過処理試薬）によって透過処理した後に、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）により染色した。細胞表面のＣＤ１６及びＣＤ３発現は、それぞれ抗ＣＤ１６－ＰＥ（ｃｌｏｎｅ Ｂ７３．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＣＤ３－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ ＳＫ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、決定した。
ＩＦＬ発現を検出するために、形質導入した細胞を、８Ｅ試薬（発明者らの研究所において開発された透過処理試薬）によって透過処理した後に、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）により染色した。細胞表面のＣＤ１６及びＣＤ３発現は、それぞれ抗ＣＤ１６－ＰＥ（ｃｌｏｎｅ Ｂ７３．１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＣＤ３－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ ＳＫ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、決定した。
【0068】
ＩＦＬの特異性については、形質導入した細胞由来の培養上清を、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ２０ネガティブ、ＣＤ１９ネガティブ）、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ２０ポジティブ、ＣＤ１９ポジティブ）、又はＲＳ４；１１（ＣＤ２０ネガティブ、ＣＤ１９ポジティブ）に１μｇ／ｍＬで追加し、１０分間インキュベートした。細胞表面に結合したＩＦＬを、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体により検出した。細胞染色は、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。
【0069】
ＩＦＬ濃度の測定及びグリコシル化解析
形質導入した細胞由来の培養上清中のＩＦＬ濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。簡単に述べると、ＩＦＬ又はリツキシマブを含有する培養上清を、１時間、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体によりコーティングされたプレート上でインキュベートし、洗浄した。その後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗リツキシマブ抗体（ＭＢ２Ａ４、Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をプレートに追加し、１時間インキュベートした。蛍光を、ＱｕａｎｔａＢｌｕ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を追加した後に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定した。ＩＦＬ濃度を、リツキシマブにより調製した検量線によって決定した。
形質導入した細胞由来の培養上清中のＩＦＬ濃度を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。簡単に述べると、ＩＦＬ又はリツキシマブを含有する培養上清を、１時間、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体によりコーティングされたプレート上でインキュベートし、洗浄した。その後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗リツキシマブ抗体（ＭＢ２Ａ４、Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）をプレートに追加し、１時間インキュベートした。蛍光を、ＱｕａｎｔａＢｌｕ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を追加した後に、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定した。ＩＦＬ濃度を、リツキシマブにより調製した検量線によって決定した。
【0070】
グリコシル化解析は、Ｐｒｏｔｅｏｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｒｉｏｍ、Ｆｒａｎｃｅ）によって実行した。簡単に述べると、形質導入した細胞の培養上清中のＩＦＬを、透析膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔｓ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）によって濃縮し、ＮＡＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｐｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して精製した。精製したＩＦＬを、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１％β－メルカプトエタノール中で変性させ、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ）によって脱グリコシルした。ＰＮＧａｓｅによって放出されたＮ－グリカンを、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ Ｈｙｐｅｒｓｅｐ ２００ｍｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で精製し、Ａｕｔｏｆｌｅｘ ｓｐｅｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析の前に、水酸化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びヨウ化メチル（ＩＣＨ３）によって多メチル化した（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）。
【0071】
インビトロにおける細胞傷害作用アッセイ
ＣＤＣアッセイのために、５％補体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）あり又はなしのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地中のＲａｍｏｓ又はＳＵＤＨＬ－４を平板培養し、リツキシマブ又は抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、０．０５μｇ／ｍｌで追加した。生細胞を、２時間、５％ＣＯ2中３７℃でのインキュベーションの後に、Ａｃｃｕｒｉ ＣＤ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってカウントした。
ＣＤＣアッセイのために、５％補体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）あり又はなしのＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地中のＲａｍｏｓ又はＳＵＤＨＬ－４を平板培養し、リツキシマブ又は抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、０．０５μｇ／ｍｌで追加した。生細胞を、２時間、５％ＣＯ2中３７℃でのインキュベーションの後に、Ａｃｃｕｒｉ ＣＤ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってカウントした。
【0072】
ＡＤＣＰを試験するために、ｍＣｈｅｒｒｙにより標識したＲａｍｏｓ細胞を、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２０ ＩＦＬ又はリツキシマブの存在下において、４８時間、１：１の比で、ＴＨＰ－１あり又はなしで培養した。Ｒａｍｏｓ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）によってカウントした。
【0073】
ＡＤＣＣアッセイのために、カルセインＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により染色した標的細胞を、４時間、２：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、形質導入したＮＫ細胞又はＴリンパ球と共培養した。標的生細胞を、フローサイトメトリーによってカウントした。他の試験において、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する標的細胞を、５％ＣＯ2中３７℃で、ＩＬ－２（ＮＫ細胞については２００ＩＵ／ｍＬ、Ｔ細胞については１００ＩＵ／ｍＬ）と共にＮＫ細胞又はＴリンパ球とインキュベートした。コントロールとして、リツキシマブを、１．０μｇ／ｍｌで、ＧＦＰのみを有するＮＫ細胞に追加した。標的細胞を、３日間、８時間毎に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍを使用してカウントした。
【0074】
マウスモデルにおけるＩＦＬ動態及び力学
Ｔ細胞から分泌されたＩＦＬの血漿濃度を測定するために、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを形質導入した２×１０7Ｔ細胞を、続いて、２日後に、ＣＤ２０を発現している２×１０5Ｎａｌｍ－６を静脈内注射した（ｉ．ｖ．）。マウスはまた、３週間、２日毎に、２０，０００ＩＵのＩＬ－２を腹腔内に受けた。血漿中のＩＦＬを、ＥＬＩＳＡによって測定した。
Ｔ細胞から分泌されたＩＦＬの血漿濃度を測定するために、ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを形質導入した２×１０7Ｔ細胞を、続いて、２日後に、ＣＤ２０を発現している２×１０5Ｎａｌｍ－６を静脈内注射した（ｉ．ｖ．）。マウスはまた、３週間、２日毎に、２０，０００ＩＵのＩＬ－２を腹腔内に受けた。血漿中のＩＦＬを、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【0075】
インビボにおける抗腫瘍活性について検査するために、ルシフェラーゼ標識Ｄａｕｄｉを、腹腔内に（ｉ．ｐ．）、マウス当たり２×１０5細胞で、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに注射した。３及び６日後、マウスは、ｉ．ｐ．で、マウス当たり２×１０7細胞で、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζを形質導入したＴ細胞を受けた。他のマウスは、Ｔ細胞ではなく、ＧＦＰ又は０．２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０のみを形質導入した２×１０7Ｔ細胞を受けた。すべてのマウスは、１又は３週間、２日毎に、２０，０００ＩＵのＩＬ－２を受けた。Ｄａｕｄｉ細胞の成長は、Ｄ－ルシフェリンカリウム塩（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の注射後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定した。発光は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ３．０ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により解析した。マウスは、発光が１秒当たり１×１０11光子に達した場合又は安楽死を正当化する身体的徴候が現れた場合、安楽死させた。
【0076】
結果
ＩＦＬの設計及び発現
発明者らは、最初に、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブについて公開されている配列からｓｃＦｖ断片を産出した。このｓｃＦｖ及び発明者らの研究所において以前に開発された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ31を、ヒトＩｇＧ１のヒンジ並びに重鎖定常ドメイン２（ＣH２）及び３に（ＣH３）に連結した（図１Ａ）。発明者らは、ＧＦＰ遺伝子もまた含有するＭＳＣＶレトロウイルスベクターの中にＩＦＬ遺伝子を挿入し、それらを、増加させたＮＫ細胞中に形質導入した。形質導入された細胞によってＩＦＬが合成されたかどうかを決定するために、発明者らは、Ｆｃ構成要素を標的にする細胞内染色を実行した。図１Ｂにおいて示されるように、ほとんどのＮＫ ＧＦＰ＋細胞はまた、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ又は抗ＣＤ１９ ＩＦＬも発現した。末梢血Ｔリンパ球に同じ構築物を形質導入した場合に、同様の結果が見られた（図１Ｃ）。
ＩＦＬの設計及び発現
発明者らは、最初に、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブについて公開されている配列からｓｃＦｖ断片を産出した。このｓｃＦｖ及び発明者らの研究所において以前に開発された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ31を、ヒトＩｇＧ１のヒンジ並びに重鎖定常ドメイン２（ＣH２）及び３に（ＣH３）に連結した（図１Ａ）。発明者らは、ＧＦＰ遺伝子もまた含有するＭＳＣＶレトロウイルスベクターの中にＩＦＬ遺伝子を挿入し、それらを、増加させたＮＫ細胞中に形質導入した。形質導入された細胞によってＩＦＬが合成されたかどうかを決定するために、発明者らは、Ｆｃ構成要素を標的にする細胞内染色を実行した。図１Ｂにおいて示されるように、ほとんどのＮＫ ＧＦＰ＋細胞はまた、抗ＣＤ２０ ＩＦＬ又は抗ＣＤ１９ ＩＦＬも発現した。末梢血Ｔリンパ球に同じ構築物を形質導入した場合に、同様の結果が見られた（図１Ｃ）。
【0077】
発明者らは、ＩＦＬがそれらの同系の標的に結合することができるかどうかを決定した。図２に示されるように、分泌された抗ＣＤ１９ ＩＦＬは、ＣＤ１９＋細胞Ｒａｍｏｓ及びＲＳ４；１１を標識したが、抗ＣＤ２０ ＩＦＬは、ＣＤ２０＋Ｒａｍｏｓ細胞株のみを標識し、ＣＤ２０－ＲＳ４；１１細胞株は標識しなかった。どちらもＣＤ１９－ＣＤ２０－Ｔ細胞株Ｊｕｒｋａｔを標識しなかった（図２）。
【0078】
ＩＦＬの特徴づけ
免疫細胞がＩＦＬを産生する能力を測定するために、発明者らは、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを形質導入した細胞から培養培地を収集し、抗イディオタイプリツキシマブ抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって抗体の濃度を測定した。図３Ａに示されるように、ＮＫ細胞もＴ細胞も、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを分泌した。特に、Ｔ細胞の上清において測定されたＩＦＬの量は、ＮＫ細胞の上清において測定された量よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。形質導入した１×１０6ＮＫ細胞から２４時間で分泌されたＩＦＬの量は、２３．５ｎｇのリツキシマブと等価であった（範囲、１５．１～３６．８ｎｇ、ｎ＝３）。Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＬの量は、７４．３ｎｇと等価であった（範囲、６２．８～９３．２ｎｇ、ｎ＝３）。
免疫細胞がＩＦＬを産生する能力を測定するために、発明者らは、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを形質導入した細胞から培養培地を収集し、抗イディオタイプリツキシマブ抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって抗体の濃度を測定した。図３Ａに示されるように、ＮＫ細胞もＴ細胞も、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを分泌した。特に、Ｔ細胞の上清において測定されたＩＦＬの量は、ＮＫ細胞の上清において測定された量よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。形質導入した１×１０6ＮＫ細胞から２４時間で分泌されたＩＦＬの量は、２３．５ｎｇのリツキシマブと等価であった（範囲、１５．１～３６．８ｎｇ、ｎ＝３）。Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＬの量は、７４．３ｎｇと等価であった（範囲、６２．８～９３．２ｎｇ、ｎ＝３）。
【0079】
免疫細胞によって産生された構築物の翻訳後修飾プロファイルのタイプを明らかにするために、発明者らは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、修飾されたＦｃドメインに結合したＮ結合型グリカンの解析を実行した。１２のＮ－グリカン構造が、ＮＫ細胞ＩＦＬについて検出され、８つがＴ細胞ＩＦＬについて検出された。両方とも、主要な構造は、Ｇ２Ｓ２と命名される、コアフコースを有さず、２つのガラクトース及び２つの端末シアル酸を含有するジシアリル化２分岐Ｎ－グリカン（［Ｍ＋Ｎａ］+２７９２）であった。興味深いことに、ＩＦＬが、それぞれ、ＮＫ及びＴ細胞によって産生された場合、Ｆｃグリカンの７９％及び５９％は、非フコシル化であった。（図３Ｂ、Ｃ）。コントロールとして、発明者らはまた、リツキシマブのＮ結合型グリカンパターンを試験した；検出されたＮ－グリカンは、２つのフコシル化２分岐Ｎ－グリカン（［Ｍ＋Ｎａ］＋１８３６＝Ｇ０Ｆ、２０４０＝Ｇ１Ｆ）であった。
【0080】
ＩＦＬは、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、及びＡＤＣＣを媒介する
ＩＦＬがＣＤＣを媒介することができるかどうかを試験するために、発明者らは、ＣＤ２０＋Ｂ－リンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ、ＳＵＤＨＬ－４、及びＲａｊｉを、様々な濃度の抗ＣＤ２０ ＩＦＬ（ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞又はＴ細胞の上清から収集した）及び５％補体と、２時間インキュベートした。並行試験において、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、リツキシマブと交換した。図４Ａに示されるように、ＩＦＬは、Ｒａｍｏｓ及びＳＵＤＨＬ－４細胞株の両方（補体溶解に対して感受性であることが知られている）の大量の溶解を引き起こしたが、補体抵抗性のＲａｊｉ細胞は、ほとんど影響を受けないままであった。38,39
ＩＦＬがＣＤＣを媒介することができるかどうかを試験するために、発明者らは、ＣＤ２０＋Ｂ－リンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ、ＳＵＤＨＬ－４、及びＲａｊｉを、様々な濃度の抗ＣＤ２０ ＩＦＬ（ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞又はＴ細胞の上清から収集した）及び５％補体と、２時間インキュベートした。並行試験において、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを、リツキシマブと交換した。図４Ａに示されるように、ＩＦＬは、Ｒａｍｏｓ及びＳＵＤＨＬ－４細胞株の両方（補体溶解に対して感受性であることが知られている）の大量の溶解を引き起こしたが、補体抵抗性のＲａｊｉ細胞は、ほとんど影響を受けないままであった。38,39
【0081】
ＡＤＣＰを、タグ付き標的細胞の食作用を発揮することができる単球性細胞株、ＴＨＰ－１とＲａｍｏｓを共培養することによって試験した。40図４Ｂに示されるように、ＮＫ又はＴ細胞に由来するＩＦＬは、ＴＨＰ－１細胞の存在下において、Ｒａｍｏｓ細胞の消失を促進することができた。
【0082】
ＮＫ細胞及びＴ細胞によって産生されたＩＦＬがＡＤＣＣを媒介することができるかどうかを決定するために、発明者らは、Ｅ：Ｔ １：１の比で、ＧＦＰのみ又は抗ＣＤ２０ ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞と、ＣＤ２０＋リンパ腫細胞株Ｒａｊｉを共培養し、コントロールとしてＮＫ－ＧＦＰ細胞と１μｇ／ｍＬのリツキシマブを使用した。図５Ａに示されるように、ＩＦＬ ＮＫ細胞は、強力な細胞傷害作用を発揮した。他の試験において、発明者らは、３つのＣＤ１９＋白血病細胞株（ＲＳ４；１１、ＯＰ－１、及びＮａｌｍ－６）に対する、抗ＣＤ１９ ＩＦＬを形質導入したＮＫ細胞の細胞傷害能力を決定した。図５Ｂに示されるように、ＮＫ－ＩＦＬ細胞は、ＧＦＰのみを形質導入したＮＫ細胞よりも、有意に強力であり、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－細胞株ＲＳ４；１１に対する細胞死滅は、抗ＣＤ１９ ＩＦＬによってのみ媒介された（図５Ｃ）。
【0083】
ＣＤ１６受容体を発現するＴ細胞は、自己産生ＩＦＬを通してＡＤＣＣを発揮する
発明者らは、Ｐ２Ａによって分離される抗ＣＤ２０ ＩＦＬ及びＣＤ１６（Ｖ１５８）－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ受容体を含有するバイシストロニック構築物を調製した（図６Ａ）。ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζは、発明者らの研究所において以前に産出されたものであり、Ｔリンパ球にＡＤＣＣの能力を与えることが示された。32発明者らは、両方の構成要素の発現を達成する構築物をＴリンパ球に形質導入した（図６Ｂ、Ｃ）。長期培養においてＲａｍｏｓ細胞に曝露した場合、ＩＦＬ及びＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの両方を発現するＴリンパ球は、リンパ腫細胞を根絶したが、一方の遺伝子のみ又はＧＦＰを発現するＴ細胞は、根絶しなかった（図６Ｄ）。ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζに関する付加的な情報は、米国特許第１０，１４４，７７０ Ｂ２号明細書及び米国特許出願公開第２０１５／０１３９９４３号明細書で見つけることができ、両方とも、それらの全体が参照によって本明細書において援用される。
発明者らは、Ｐ２Ａによって分離される抗ＣＤ２０ ＩＦＬ及びＣＤ１６（Ｖ１５８）－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ受容体を含有するバイシストロニック構築物を調製した（図６Ａ）。ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζは、発明者らの研究所において以前に産出されたものであり、Ｔリンパ球にＡＤＣＣの能力を与えることが示された。32発明者らは、両方の構成要素の発現を達成する構築物をＴリンパ球に形質導入した（図６Ｂ、Ｃ）。長期培養においてＲａｍｏｓ細胞に曝露した場合、ＩＦＬ及びＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの両方を発現するＴリンパ球は、リンパ腫細胞を根絶したが、一方の遺伝子のみ又はＧＦＰを発現するＴ細胞は、根絶しなかった（図６Ｄ）。ＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζに関する付加的な情報は、米国特許第１０，１４４，７７０ Ｂ２号明細書及び米国特許出願公開第２０１５／０１３９９４３号明細書で見つけることができ、両方とも、それらの全体が参照によって本明細書において援用される。
【0084】
発明者らは、次に、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ免疫不全マウスにおける、抗ＣＤ２０ ＩＦＬを形質導入した２×１０7Ｔリンパ球の静脈内注射の後にマウス血漿において測定することができる血漿ＩＦＬのレベルを決定した。図７Ａに示されるように、ＩＦＬは、細胞注射の５０日後に血漿において検出することができ、ＩＦＬ分泌が持続的であることを示す。発明者らは、ＩＦＬ及びＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの両方を発現するＴリンパ球が抗腫瘍活性を発揮することができるかどうかを、ＣＤ２０＋Ｂ細胞リンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉを腹腔内に移植したＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ免疫不全マウスにおいて評価した。Ｔ細胞の腹腔内注射の後に、ＩＦＬ及びＣＤ１６－４１ＢＢ－ＣＤ３ζを有するＴ細胞を受けたマウスにおいて強力な抗腫瘍活性があったが、腫瘍は、ＧＦＰのみを形質導入したＴ細胞を受けた又はＴ細胞を受けなかったマウスにおいて急速に成長した（図７Ｂ）。
【0085】
修飾ＩＦＬ
ＩＦＬ構築物を、いくつかのその機能を増強させる及び／又はその特異性の範囲を広げるために修飾した。例えば、修飾されたＦｃは、ＮＫ細胞及びマクロファージにおけるＦｃ受容体に対するその親和性を増加させ、したがってＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを増強するために並びに／又は補体を結合させるその能力を増加させるために、さらに改変することができる。特に、図８Ａ～Ｄの修飾ＩＦＬを構築した。
ＩＦＬ構築物を、いくつかのその機能を増強させる及び／又はその特異性の範囲を広げるために修飾した。例えば、修飾されたＦｃは、ＮＫ細胞及びマクロファージにおけるＦｃ受容体に対するその親和性を増加させ、したがってＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを増強するために並びに／又は補体を結合させるその能力を増加させるために、さらに改変することができる。特に、図８Ａ～Ｄの修飾ＩＦＬを構築した。
【0086】
図９Ａ～Ｂにおいて示される実験の結果は、ＮＫ細胞によって分泌された抗ＣＤ２０ ＩＦＬにＩＬ－１５をコードする配列を追加することにより、３日間の共培養においてＣＤ２０＋リンパ腫細胞に対する死滅活性が著しく増加することを実証する。これらの実験において、ＮＫ細胞にＩＦＬ－ＩＬ１５を形質導入した場合に、Ｒａｍｏｓ細胞数は、最も効果的に低下した；これらの細胞は、ＩＬ－１５を欠くＩＬＦを形質導入した細胞よりも強力であり、これらは、さらには、ＧＦＰのみを形質導入したＮＫ細胞よりも強力であった。ＩＦＬ－ＩＬ１５が優位であることは、ＩＬ－２が培養物中に存在するかどうかにかかわらず、観察された。これらの結果は、ＩＦＬを他の機能的分子に連結することによって、ＩＦＬの機能を強化することができることを実証する。
【0087】
追加の実施形態
１．以下を含むペプチド：
ａ）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン；
ｂ）結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；並びに
ｃ）ｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインをつなぐヒンジドメイン。
１．以下を含むペプチド：
ａ）単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ドメイン；
ｂ）結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；並びに
ｃ）ｓｃＦｖドメイン及びＦｃドメインをつなぐヒンジドメイン。
【0088】
２．ｓｃＦｖドメインは、免疫グロブリン可変軽（ＶL）ドメイン、免疫グロブリン可変重（ＶH）ドメイン、並びにＶL及びＶHドメインをつなぐリンカードメインを含む、実施形態１のペプチド。
【0089】
３．リンカードメインは、（Ｇ4）xであり、ｘは、１～１００の整数である、実施形態２のペプチド。
【0090】
４．リンカードメインは、（Ｇ4）3である、実施形態３のペプチド。
【0091】
５．ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９に結合する、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0092】
６．ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ２０に結合する、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0093】
７．ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ２２、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、メソテリン、ヒト上皮増殖因子受容体２（Ｈｅｒ２）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＤ８０、又はＣＤ８６に結合する、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0094】
８．Ｆｃドメインは、免疫グロブリン定常重２（ＣH２）ドメイン及び免疫グロブリン定常重３（ＣH３）ドメインを含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0095】
９．Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0096】
１０．ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるシグナルペプチドをさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0097】
１１．キメラ受容体にＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチドをさらに含み、キメラ受容体は、受容体ドメイン、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、並びに細胞質シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0098】
１２．自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである、実施形態１１のペプチド。
【0099】
１３．受容体ドメインは、ＣＤ１６である、実施形態１１のペプチド。
【0100】
１４．ヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通ドメインである、実施形態１１のペプチド。
【0101】
１５．共刺激ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインである、実施形態１１のペプチド。
【0102】
１６．細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達である、実施形態１１のペプチド。
【0103】
１７．キメラ受容体は、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζである、実施形態１１のペプチド。
【0104】
１８．ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ１９又はＣＤ２０に結合する、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、及びヒンジドメインは、ＩｇＧ１ヒンジドメインである；ペプチドは、ｓｃＦｖドメインに対してＮ末端にあるＣＤ８αシグナルペプチドをさらに含む；ペプチドは、ＣＤ１６Ｖ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζであるキメラ受容体をさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド
【0105】
１９．次の突然変異の１つ以上をさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド：Ｓ２３９Ｄ；Ｓ２６７Ｅ；Ｈ２６８Ｆ；又はＩ３３２Ｅ。
【0106】
２０．次の突然変異の１つ以上をさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド：Ｅ３４５Ｋ；Ｅ４３０Ｇ；又はＳ４４０Ｙ。
【0107】
２１．ペプチドは、リンカーによってＦｃドメインにつながれたＩＬ－１５をさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0108】
２２．ＦｃドメインにＩＬ－１５をつなぐリンカーは、配列番号５１；Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａ；（ＥＡＡＡＫ）z；Ａ（ＥＡＡＡＫ）zＡ；及び（ＸＰ）wからなる群から選択される、ｚは、１～１００の整数である；Ｘは、任意のアミノ酸である、及びｗは、１～１００の整数である、実施形態２１のペプチド。
【0109】
２３．ペプチドは、リンカーによってＦｃドメインにつながれた、４－１ＢＢ（ＣＤ３７）、ＣＤ２８、又はＯＸ４０（ＣＤ１３４）に結合するリガンドをさらに含む、実施形態１～４のいずれか１つのペプチド。
【0110】
２４．ＦｃドメインにＩＬ－１５をつなぐリンカーは、配列番号５１；Ａ（ＥＡＡＫ）4ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）4Ａ；（ＥＡＡＡＫ）z；Ａ（ＥＡＡＡＫ）zＡ；及び（ＸＰ）wからなる群から選択される、ｚは、１～１００の整数である；Ｘは、任意のアミノ酸である、及びｗは、１～１００の整数である、実施形態２３のペプチド。
【0111】
２５．実施形態１～２４のいずれかのペプチドをコードする核酸。
【0112】
２６．実施形態１～２４のいずれかのペプチドをコードする核酸を含むベクター。
【0113】
２７．ベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である、実施形態２６のベクター。
【0114】
２８．ペプチドを発現する免疫細胞であって、ペプチドは、
ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメイン；
ｂ）ＴＣＲβドメインにつながれた第１の結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；
ｃ）ＴＣＲαドメイン；
ｄ）ＴＣＲαドメインにＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチド；
ｅ）ＴＣＲαドメインにつながれた第２のＦｃドメイン
を含む、免疫細胞。
ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメイン；
ｂ）ＴＣＲβドメインにつながれた第１の結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；
ｃ）ＴＣＲαドメイン；
ｄ）ＴＣＲαドメインにＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチド；
ｅ）ＴＣＲαドメインにつながれた第２のＦｃドメイン
を含む、免疫細胞。
【0115】
２９．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメインにつながれたシグナルペプチドをさらに含む、実施形態２８の免疫細胞。
【0116】
３０．第１のＦｃドメインは、第２のＦｃドメインと同じである、実施形態２８の免疫細胞。
【0117】
３１．以下を含むペプチド：
ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメイン；
ｂ）ＴＣＲβドメインにつながれた第１の結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；
ｃ）ＴＣＲαドメイン；
ｄ）ＴＣＲαドメインにＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチド；
ｅ）ＴＣＲαドメインにつながれた第２のＦｃドメイン。
ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメイン；
ｂ）ＴＣＲβドメインにつながれた第１の結晶性断片（Ｆｃ）ドメイン；
ｃ）ＴＣＲαドメイン；
ｄ）ＴＣＲαドメインにＦｃドメインをつなぐ自己切断ペプチド；
ｅ）ＴＣＲαドメインにつながれた第２のＦｃドメイン。
【0118】
３２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）βドメインにつながれたシグナルペプチドをさらに含む、実施形態３１のペプチド。
【0119】
３３．第１のＦｃドメインは、第２のＦｃドメインと同じである、実施形態３１のペプチド。
【0120】
３４．実施形態３１～３３のいずれか１つのペプチドをコードする核酸。
【0121】
３５．実施形態３１～３３のいずれか１つのペプチドをコードする核酸を含むベクター。
【0122】
３６．トランスジェニック宿主細胞を作製するための方法であって、ベクターを宿主細胞の中に導入することを含み、ベクターは、実施形態１～２４又は実施形態３１～３３のいずれかのペプチドをコードする核酸を含む、方法。
【0123】
３７．対象において抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、又は補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強するための方法であって、本明細書において記載される免疫細胞のいずれかの治療有効量を対象に投与することを含む、方法。
【0124】
配列
配列番号１：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブシグナルペプチド；ｃＤＮＡ：ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴ
配列番号１：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブシグナルペプチド；ｃＤＮＡ：ＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴ
【0125】
配列番号２：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブシグナルペプチド；アミノ酸：ＭＤＦＱＶＱＩＩＳＦＬＬＩＳＡＳ
【0126】
配列番号３：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブ軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化1】
【0127】
配列番号４：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブ軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
ＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0128】
配列番号５：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リンカー；ｃＤＮＡ：ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣ
【0129】
配列番号６：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リンカー；アミノ酸：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【0130】
配列番号７：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブ重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化2】
【0131】
配列番号８：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、リツキシマブ重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
【化3】
【0132】
配列番号９：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；ｃＤＮＡ：
【化4】
【0133】
配列番号１０：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；アミノ酸：
【化5】
【0134】
配列番号１１：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、ＣＤ８αシグナルペプチド；ｃＤＮＡ：
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ
ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ
【0135】
配列番号１２：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、ＣＤ８αシグナルペプチド；アミノ酸：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【0136】
配列番号１３：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化6】
【0137】
配列番号１４：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ
ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴ
【0138】
配列番号１５：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、リンカー；ｃＤＮＡ：ＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴ
【0139】
配列番号１６：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、リンカー；アミノ酸：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【0140】
配列番号１７：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化7】
【0141】
配列番号１８：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
【化8】
【0142】
配列番号１９：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；ｃＤＮＡ：
【化9】
【0143】
配列番号２０：抗ＣＤ１９ ＩＦＬ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；アミノ酸：
【化10】
【0144】
配列番号２１：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブシグナルペプチド；ｃＤＮＡ：ＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＧＴＧＣＣＡＧＴ
【0145】
配列番号２２：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブシグナルペプチド；アミノ酸：ＭＤＦＱＶＱＩＩＳＦＬＬＩＳＡＳ
【0146】
配列番号２３：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブ軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化11】
【0147】
配列番号２４：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブ軽鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
ＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＶＩＭＳＲＧＱＩＶＬＳＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＩＨＷＦＱＱＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＴＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
【0148】
配列番号２５：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リンカー；ｃＤＮＡ：ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣ
【0149】
配列番号２６：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リンカー；アミノ酸：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【0150】
配列番号２７：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブ重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化12】
【0151】
配列番号２８：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、リツキシマブ重鎖の免疫グロブリン可変ドメイン；アミノ酸：
【化13】
【0152】
配列番号２９：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；ｃＤＮＡ：
【化14】
【0153】
配列番号３０：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、免疫グロブリンＧ１のヒンジ並びに定常重ドメイン２及び３；アミノ酸：
【化15】
【0154】
配列番号３１：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、Ｐ２Ａ；ｃＤＮＡ：ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡ
【0155】
配列番号３２：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、Ｐ２Ａ；アミノ酸：ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ
【0156】
配列番号３３：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ８αシグナルペプチド；ｃＤＮＡ：
ＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡ
ＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＣＡ
【0157】
配列番号３４：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ８αシグナルペプチド；アミノ酸：ＰＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
【0158】
配列番号３５：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＦＣＧＲ３Ａ細胞外ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化16】
【0159】
配列番号３６：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＦＣＧＲ３Ａ細胞外ドメイン；アミノ酸：
【化17】
【0160】
配列番号３７：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通；ｃＤＮＡ：
【化18】
【0161】
配列番号３８：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通；アミノ酸：
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
【0162】
配列番号３９：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ１３７細胞質ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化19】
【0163】
配列番号４０：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ１３７細胞質ドメイン；アミノ酸：ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
【0164】
配列番号４１：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ３ζ細胞質内ドメイン；ｃＤＮＡ：
【化20】
【0165】
配列番号４２：抗ＣＤ２０ ＩＦＬ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１６Ｖ－ＢＢ－ζ、ＣＤ３ζ細胞質内ドメイン；アミノ酸：
【化21】
【0166】
配列番号４３：Ｐ２Ａ ｃＤＮＡ：ＧＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡ
【0167】
配列番号４４：Ｐ２Ａアミノ酸：ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧ
【0168】
配列番号４５：Ｔ２Ａ ｃＤＮＡ：
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
【0169】
配列番号：４６：Ｔ２Ａアミノ酸：ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
【0170】
配列番号４７：Ｅ２Ａ ｃＤＮＡ：
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
【0171】
配列番号４８：Ｅ２Ａアミノ酸：ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
【0172】
配列番号４９：Ｆ２Ａ ｃＤＮＡ：
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
【0173】
配列番号：５０：Ｆ２Ａアミノ酸：ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ
【0174】
配列番号５１：図８Ｃのリンカー ヌクレオチド：
ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＣＡ
ＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＣＡ
【0175】
配列番号５２：図８Ｃのリンカー アミノ酸：ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＬＥＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ
【0176】
【0177】
配列番号５４：図８ＣのＩＬ－１５ アミノ酸：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
【0178】
参照による援用；等価物
本明細書において引用されるすべての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、それらの全体が参照によって援用される。
本明細書において引用されるすべての特許、公開出願、及び参考文献の教示は、それらの全体が参照によって援用される。
【0179】
例示の実施形態について詳細に示し、記載したが、添付の特許請求の範囲によって包含される実施形態の範囲から逸脱することなく、形態及び細部において様々な変更を実施形態において行うことができることが、当業者らによって理解されるであろう。
【0180】
参考文献
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８． Ｋｏｅｎｅ ＨＲ，Ｋｌｅｉｊｅｒ Ｍ，Ａｌｇｒａ Ｊ，Ｒｏｏｓ Ｄ，ｖｏｎ ｄｅｍ Ｂｏｒｎｅ ＡＥ，ｄｅ Ｈａａｓ Ｍ．Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ，ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０（３）：１１０９－１１１４．
９． Ｃａｒｔｒｏｎ Ｇ，Ｄａｃｈｅｕｘ Ｌ，Ｓａｌｌｅｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９（３）：７５４－７５８．
１０． Ｗｅｎｇ ＷＫ，Ｌｅｖｙ Ｒ．Ｔｗｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２１（２１）：３９４０－３９４７．
１１． Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ Ｓ，Ｔａｒｔａｓ Ｓ，Ｐａｉｎｔａｕｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＦＣＧＲ３Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；６４（１３）：４６６４－４６６９．
１２． Ｈａｔｊｉｈａｒｉｓｓｉ Ｅ，Ｘｕ Ｌ，Ｓａｎｔｏｓ ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１６，ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＤＣＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ａｍｏｎｇ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩＩａ－１５８ Ｖ／Ｖ ａｎｄ Ｖ／Ｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０（７）：２５６１－２５６４．
１３． Ｍｕｓｏｌｉｎｏ Ａ，Ｎａｌｄｉ Ｎ，Ｂｏｒｔｅｓｉ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ－２／ｎｅｕ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８；２６（１１）：１７８９－１７９６．
１４． Ｂｉｂｅａｕ Ｆ，Ｌｏｐｅｚ－Ｃｒａｐｅｚ Ｅ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩａ－Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩＩａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｐｌｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００９；２７（７）：１１２２－１１２９．
１５． Ａｈｌｇｒｉｍｍ Ｍ，Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ Ｍ，Ｋｒｅｕｚ Ｍ，Ｒｅｇｉｔｚ Ｅ，Ｐｒｅｕｓｓ ＫＤ，Ｂｉｔｔｅｎｂｒｉｎｇ Ｊ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｃ－ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＨＯＰ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１７）：４６５７－４６６２．
１６． Ｖｅｅｒａｍａｎｉ Ｓ，Ｗａｎｇ ＳＹ，Ｄａｈｌｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＮＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ１６ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１２）：３３４７－３３４９．
１７． Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．ＭＡｂｓ．２０１５；７（２）：３０３－３１０．
１８． Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ，Ｗｉｌｓｏｎ ＷＨ，Ｊａｎｉｋ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＣＤ１９．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（２０）：４０９９－４１０２．
１９． Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｂａｇｇ Ａ，Ｊｕｎｅ ＣＨ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６５（８）：７２５－７３３．
２０． Ｍａｕｄｅ ＳＬ，Ｆｒｅｙ Ｎ，Ｓｈａｗ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７－１５１７．
２１． Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉ，Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ １９－２８ｚ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４；６（２２４）：２２４ｒａ２２５．
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４８． ｄｅ Ｊｏｎｇ ＲＮ，Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ ＦＪ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｈｅｘａｍｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１６；１４（１）：ｅ１００２３４４．
１． Ｙｕ ＡＬ，Ｇｉｌｍａｎ ＡＬ，Ｏｚｋａｙｎａｋ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ＧＤ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ＧＭ－ＣＳＦ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２，ａｎｄ ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０；３６３（１４）：１３２４－１３３４．
２． Ｆｅｒｒｉｓ ＲＬ，Ｊａｆｆｅｅ ＥＭ，Ｆｅｒｒｏｎｅ Ｓ．Ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｅｓｃａｐｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１０；２８（２８）：４３９０－４３９９．
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５． Ｗｅｉｎｅｒ ＬＭ，Ｍｕｒｒａｙ ＪＣ，Ｓｈｕｐｔｒｉｎｅ ＣＷ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ．２０１２；１４８（６）：１０８１－１０８４．
６． Ｇａｌｌｕｚｚｉ Ｌ，Ｖａｃｃｈｅｌｌｉ Ｅ，Ｆｒｉｄｍａｎ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｉａｌ Ｗａｔｃｈ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１（１）：２８－３７．
７． Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ Ｆ，Ｒａｖｅｔｃｈ ＪＶ．Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；８（１）：３４－４７．
８． Ｋｏｅｎｅ ＨＲ，Ｋｌｅｉｊｅｒ Ｍ，Ａｌｇｒａ Ｊ，Ｒｏｏｓ Ｄ，ｖｏｎ ｄｅｍ Ｂｏｒｎｅ ＡＥ，ｄｅ Ｈａａｓ Ｍ．Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ－１５８Ｖ／Ｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ，ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ－４８Ｌ／Ｒ／Ｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０（３）：１１０９－１１１４．
９． Ｃａｒｔｒｏｎ Ｇ，Ｄａｃｈｅｕｘ Ｌ，Ｓａｌｌｅｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２０ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ ｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００２；９９（３）：７５４－７５８．
１０． Ｗｅｎｇ ＷＫ，Ｌｅｖｙ Ｒ．Ｔｗｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３；２１（２１）：３９４０－３９４７．
１１． Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ Ｓ，Ｔａｒｔａｓ Ｓ，Ｐａｉｎｔａｕｄ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ＦＣＧＲ３Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；６４（１３）：４６６４－４６６９．
１２． Ｈａｔｊｉｈａｒｉｓｓｉ Ｅ，Ｘｕ Ｌ，Ｓａｎｔｏｓ ＤＤ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１６，ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＤＣＣ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ａｍｏｎｇ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩＩａ－１５８ Ｖ／Ｖ ａｎｄ Ｖ／Ｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０（７）：２５６１－２５６４．
１３． Ｍｕｓｏｌｉｎｏ Ａ，Ｎａｌｄｉ Ｎ，Ｂｏｒｔｅｓｉ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ－２／ｎｅｕ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８；２６（１１）：１７８９－１７９６．
１４． Ｂｉｂｅａｕ Ｆ，Ｌｏｐｅｚ－Ｃｒａｐｅｚ Ｅ，Ｄｉ Ｆｉｏｒｅ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩａ－Ｆｃ｛ｇａｍｍａ｝ＲＩＩＩａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｐｌｕｓ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００９；２７（７）：１１２２－１１２９．
１５． Ａｈｌｇｒｉｍｍ Ｍ，Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈ Ｍ，Ｋｒｅｕｚ Ｍ，Ｒｅｇｉｔｚ Ｅ，Ｐｒｅｕｓｓ ＫＤ，Ｂｉｔｔｅｎｂｒｉｎｇ Ｊ．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｃ－ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＨＯＰ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１７）：４６５７－４６６２．
１６． Ｖｅｅｒａｍａｎｉ Ｓ，Ｗａｎｇ ＳＹ，Ｄａｈｌｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ＮＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ＣＤ１６ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（１２）：３３４７－３３４９．
１７． Ｗｅｉｓｋｏｐｆ Ｋ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｒｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．ＭＡｂｓ．２０１５；７（２）：３０３－３１０．
１８． Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ，Ｗｉｌｓｏｎ ＷＨ，Ｊａｎｉｋ ＪＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ－ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＣＤ１９．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（２０）：４０９９－４１０２．
１９． Ｐｏｒｔｅｒ ＤＬ，Ｌｅｖｉｎｅ ＢＬ，Ｋａｌｏｓ Ｍ，Ｂａｇｇ Ａ，Ｊｕｎｅ ＣＨ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６５（８）：７２５－７３３．
２０． Ｍａｕｄｅ ＳＬ，Ｆｒｅｙ Ｎ，Ｓｈａｗ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１４；３７１（１６）：１５０７－１５１７．
２１． Ｄａｖｉｌａ ＭＬ，Ｒｉｖｉｅｒｅ Ｉ，Ｗａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ １９－２８ｚ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｕｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１４；６（２２４）：２２４ｒａ２２５．
２２． Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ＪＮ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ，Ｋａｓｓｉｍ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ－Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌａｒｇｅ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ａｎｄ Ｉｎｄｏｌｅｎｔ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｔｒｅａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ１９ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１４．
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４１． Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６；１０３（１１）：４００５－４０１０．
４２． Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＪＲ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８；７（８）：２５１７－２５２７．
４３． Ｍｏｏｒｅ ＧＬ，Ｃｈｅｎ Ｈ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，Ｌａｚａｒ ＧＡ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＭＡｂｓ．２０１０；２（２）：１８１－１８９．
４４． Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒ ＣＡ，Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ ＦＪ，ｄｅ Ｊｏｎｇ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ＩｇＧ ｈｅｘａｍｅｒｓ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４；３４３（６１７６）：１２６０－１２６３．
４５． Ｓｎｅｌｌｅｒ ＭＣ，Ｋｏｐｐ ＷＣ，Ｅｎｇｅｌｋｅ ＫＪ，ｅｔ ａｌ．ＩＬ－１５ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍａｓｓｉｖｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１８（２６）：６８４５－６８４８．
４６． Ｉｍａｍｕｒａ Ｍ，Ｓｈｏｏｋ Ｄ，Ｋａｍｉｙａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５．Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（７）：１０８１－１０８８．
４７． Ｋｏｈ Ｓ，Ｓｈｉｍａｓａｋｉ Ｎ，Ｂｅｒｔｏｌｅｔｔｉ Ａ．Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１４２８：２８５－２９６．
４８． ｄｅ Ｊｏｎｇ ＲＮ，Ｂｅｕｒｓｋｅｎｓ ＦＪ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ Ｈｅｘａｍｅｒｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１６；１４（１）：ｅ１００２３４４．
【図1A-C】
【図2】
【図3A-B】
【図3C】
【図4A-B】
【図5A-B】
【図5C】
【図6A-C】
【図6D】
【図7A-B】
【図8A-B】
【図8C-D】
【図8E】
【図9A-B】
【配列表】
【国際調査報告】