特表 2022-541169 結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための非侵襲的方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-22

(54)【発明の名称】結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための非侵襲的方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6886 20180101AFI20220914BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220914BHJP

   G01N 33/72 20060101ALI20220914BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220914BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220914BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220914BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALN20220914BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6886 Z

G01N33/53 M

G01N33/53 D

G01N33/72 A

C12Q1/6869 Z

C12M1/00 A

C12N15/11 Z

C12Q1/686 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502110

(86)(22)【出願日】2020-07-14

(85)【翻訳文提出日】2022-02-21

(86)【国際出願番号】 EP2020069918

(87)【国際公開番号】W WO2021009184

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】19382597.3

(32)【優先日】2019-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521559603

【氏名又は名称】インスティテュ ディンベスティガシオンス ビオメディクス アウグスト ピ イ スニェール（イデイベーアーペーエセ）

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ Ｄ‘ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＳ ＢＩＯＭＥＤＩＱＵＥＳ ＡＵＧＵＳＴ ＰＩ Ｉ ＳＵＮＹＥＲ（ＩＤＩＢＡＰＳ）

【住所又は居所原語表記】Ｃ．Ｒｏｓｓｅｌｌｏ，１４９－１５３，０８０３６ ＢＡＲＣＥＬＯＮＡ（ＥＳ）

(71)【出願人】

【識別番号】513295630

【氏名又は名称】ホスピタル クリニック デ バルセロナ

(71)【出願人】

【識別番号】522007451

【氏名又は名称】コンソルシオ セントロ デ インベスティガシオン バイオメディカ エン レッド

【住所又は居所原語表記】Ｃ．Ｍｏｎｆｏｒｔｅ ｄｅ Ｌｅｍｏｓ ３－５．Ｐａｂｅｌｌｏｎ １１，ＭＡＤＲＩＤ（ＥＳ）

(71)【出願人】

【識別番号】514267962

【氏名又は名称】ウニベルシタ デ バルセローナ

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】カステル ガランゴウ，アントニ

(72)【発明者】

【氏名】ヒロネーリャ コス，メリチェル

(72)【発明者】

【氏名】デュラン，サンチョン サライ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045CB04

2G045FB02

2G045FB03

4B029AA07

4B029BB20

4B029CC01

4B029DG10

4B029FA02

4B029FA10

4B029FA12

4B029GA08

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための非侵襲的方法。本発明は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断のためのインビトロ方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするためのインビトロ方法であって、
ａ）対象から得られた生体サンプル中の少なくともｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定することを含み、前記生体サンプルが便サンプルであり、
ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲ－４２１の過剰発現が、前記対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示す、
インビトロ方法。

【請求項2】

ａ）前記対象から得られた生体サンプルにおける少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの発現レベルを測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合の、前記少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの過剰発現が、前記対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示す、
請求項１に記載のインビトロ方法。

【請求項3】

５０歳～７５歳の対象において実施される、請求項１～２のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項4】

好ましくは前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する前に、ヘモグロビンの存在または濃度を測定することをさらに含み、健常な対照対象と比較した場合のヘモグロビンの存在またはより高い濃度が、前記対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示す、請求項１～３のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項5】

前記生体サンプルが、５ｍｇ未満、好ましくは２．５ｍｇの便サンプルである、請求項１～４のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項6】

前記ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定が、前記ヘモグロビンの存在または濃度の測定のために先に使用された残りの便サンプルにおいて行われる、請求項１～５のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項7】

前記結腸直腸癌の前癌段階が、進行性結腸直腸腺腫である、請求項１～６のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項8】

前記結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断が、画像技術、好ましくは結腸内視鏡検査によって確認される、先行請求項のいずれかに記載のインビトロ方法。

【請求項9】

対象の便サンプルにおける、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための、少なくともｍｉＲ－４２１のインビトロ使用。

【請求項10】

少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための、請求項９に記載のインビトロ使用。

【請求項11】

ａ．ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬と、
ｂ．ｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定するための手段または試薬と、
を含むキット・オブ・パーツ。

【請求項12】

ａ．ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬と、
ｂ．［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の発現レベルを測定するための手段または試薬と、
を含む、請求項１１に記載のキット・オブ・パーツ。

【請求項13】

ヘモグロビンの存在または濃度の測定が、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を使用することによって行われ、ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定が、ｑＲＴ－ＰＣＲによって行われる、請求項１１または１２のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ。

【請求項14】

結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするための、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のキットの使用。

【請求項15】

進行性結腸直腸腺腫を診断またはスクリーニングするための、請求項１４に記載のキットの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１５日に出願された欧州特許出願第１９３８２５９７．３号の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、医療分野に含まれ得る。具体的には、本発明は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのためのインビトロ方法に関する。

【背景技術】

【0003】

結腸直腸癌（ＣＲＣ）（結腸癌、直腸癌、または大腸癌としても知られている）は、結腸または直腸（大腸の一部）における癌の発症である。結腸直腸癌の大部分は腺癌である。これは、結腸が組織内に多数の腺を有するためである。これらの腺は、遺伝的レベルでいくつかの変化を受けると、良性から浸潤性の悪性結腸癌に移行するように、予測可能な様式で進行する。結腸の腺腫、特に進行性結腸直腸腺腫（ＡＡ）は、悪性腺癌の良性のバージョンであるが、除去されない場合には依然として悪性となる可能性を有する（それらは、悪性となり、結腸癌をもたらす傾向があるため、通常除去される）。

【0004】

スクリーニングは、結腸直腸癌による死亡を予防および減少させるための有効な方法であり、５０～７５歳から開始することが推奨される。結腸直腸癌において最もよく知られて、最も頻繁に使用されるスクリーニング検査は、糞便免疫化学検査（ＦＩＴ）と呼ばれる。ＦＩＴは、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を使用して便サンプル中の少量の血液を検出することによってＣＲＣをスクリーニングするために使用される。ＦＩＴは、前癌または癌の徴候であり得る便サンプル中の血液を検出する。異常な結果が得られた場合、通常、医師が結腸および直腸を内視して診断することを可能にする結腸内視鏡検査が推奨される。結腸内視鏡検査中に小さなポリープが見つかった場合は、それを除去することができる。大きなポリープまたは腫瘍が見つかった場合、それが癌性であるか否かを確認するために、生検を行い得る。胃腸科医は、結腸内視鏡検査を使用してこれらの腺腫およびポリープを発見して除去し、侵襲性腺癌につながる遺伝子変化をし続けることを防ぐ。

【0005】

上記で説明したように、ＦＩＴは現在結腸直腸癌のスクリーニングに使用されているが、ＦＩＴはＡＡに対する感度が低い（文献によると約２０～３０％）ことに留意する必要があり、これは、上記の種類の患者のほとんどが疾患を有さないと誤って分類され得ることを意味する。それゆえ、ＦＩＴは、その感度が低いために腺腫を同定することができない。一方、結腸内視鏡検査は侵襲的技術であり、最も重篤な合併症は一般に消化管の穿孔である。さらに、結腸内視鏡検査は、今日では麻酔を伴う処置であり、結腸内視鏡検査のために腸を準備する際に通常投与される下剤は、いくつかの消化に関する問題を伴う。

【0006】

ＣＲＣまたはＡＡに罹患するリスクを有する一般集団をスクリーニングするために今日使用されている方法は、高い偽陽性率に関連することに留意する必要がある。その結果、今日では大量の不必要なフォローアップ結腸内視鏡検査が行われる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ｍｉＲＮＡの発現レベルから出発して、結腸直腸癌または結腸直腸腺腫（特に進行性結腸直腸腺腫）に罹患するリスクを有するヒト対象を同定またはスクリーニングするためのインビトロ方法に焦点を当てているため、上記で引用した問題に対する明確な解決策を提供する。さらに、本発明の方法は、高い感度および特異性を提供し、これは、結腸直腸癌および結腸直腸腺腫の両方を検出するための強力かつ費用効果の高い方法であることを意味する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、便サンプルなどの非侵襲性サンプルから単離されるｍｉＲＮＡの発現レベルから出発して、結腸直腸癌および／または進行性結腸直腸腺腫に罹患するリスクがあるヒト対象を診断、同定またはスクリーニングするためのインビトロ方法に関する。本発明の方法は、高い感度および特異性を提供し、これは、結腸直腸癌および結腸直腸腺腫の両方を検出するための強力かつ費用効果の高い方法であることを意味する。

【0009】

本発明の方法は、ＣＲＣまたはＡＡに罹患するリスクがある一般集団をスクリーニングするために今日使用されている方法（ＦＩＴ）と比較し、より高い感度および特異度を有するため、偽陽性の割合の低さにつながる。その結果、本発明に記載される方法は、フォローアップの結腸内視鏡検査数を減らすのに明らかに役立ち、したがって、患者に対する今日のスクリーニングまたは診断方法が改善される。本発明の方法の実施において、患者が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患している可能性があると判定された場合、その結果は結腸内視鏡検査によって確認される。しかしながら、患者が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患している可能性があると判定されない場合、結腸内視鏡検査を行う必要はなく、以下に定義される本発明の方法を用いた日常的な検査が推奨される。

【発明を実施するための形態】

【0010】

具体的には、その試験は、以下の４つの段階を含むものであった：
１２４対の正常腫瘍組織におけるゲノムワイドｍｉＲＮＡ発現プロファイリングによる発見段階（３０ＣＲＣ；３２ＡＡ）；
発見段階に含まれる患者のサブセット（ｎ＝３９）、ならびに対照個人（ｎ＝３９）からの糞便サンプルにおける、ｑＲＴ－ＰＣＲによるｍｉＲＮＡ候補の技術的検証；
ＣＲＣスクリーニングプログラムにおける、ＦＩＴ陽性参加者から得られた糞便サンプルの独立したセット（ｎ＝７６７）における、ｑＲＴ－ＰＣＲによる最も顕著に上方制御されたｍｉＲＮＡの臨床的検証；および
進行性新生物（すなわちＣＲＣまたはＡＡ）を有する患者を同定するためのｍｉＲＮＡベースの予測モデルの開発。

【0011】

ＣＲＣおよびＡＡ組織サンプルにおいてそれぞれ有意に脱制御された２００個および３２４個のｍｉＲＮＡのうち、７個および５個を、便サンプルにおいて技術的に検証した。そのうち、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－２７ａ－３ｐは、進行性新生物を有する患者において上方制御されることが確認された。したがって、ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ－３ｐを含む便中ｍｉＲＮＡシグネチャーは、便中ヘモグロビン濃度よりも正確であり（ＡＵＣ＝それぞれ０．６３対０．５９）、これらの患者を正常な結腸内視鏡検査結果を有する個人と区別したが、両方のアプローチの組み合わせは、かかる目的のためには最も高い精度を提供するものであった（ＡＵＣ＝０．６７）。

【0012】

したがって、本発明の第１の実施形態は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするためのインビトロ方法（以下、「本発明の方法」）であって、
ａ）対象から得られた生体サンプルにおいて、少なくともｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａの発現レベルを測定すること、を含み、
ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較して、ｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａの過剰発現が、該対象が、結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものである、方法に関する。

【0013】

好ましい実施形態では、本方法は、
ａ）対象から得られた生体サンプル中の少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの発現レベルを測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象で測定された参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲＮＡの組み合わせの少なくとも１つの過剰発現が、該対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0014】

ｍｉＲ－４２１、または組み合わせ［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］もしくは［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］を用いて得られたロジスティック回帰の統計的結果を表１にまとめる。

【0015】

好ましい実施形態では、本方法は、
ａ）対象から得られた生体サンプルにおいて、少なくとも組み合わせ［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］または［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］の発現レベルを測定することを含み、ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲＮＡの組み合わせの少なくとも１つの過剰発現は、該対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0016】

ｍｉＲ－１３０ｂ、または組み合わせ［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］もしくは［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］を用いて得られたロジスティック回帰の統計的結果を表２にまとめる。

【0017】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、
ｍｉＲ－２７ａがｍｉＲ－２７ａ－３ｐである、および／または
ｍｉＲ－２５がｍｉＲ－２５－３ｐである、および／または
ｍｉＲ－２２１がｍｉＲ－２２１－３ｐである、および／または
ｍｉＲ－３４ａがｍｉＲ－３４ａ－５ｐである、および／または
ｍｉＲ－２９ａがｍｉＲ－２９ａ－３ｐである、および／または
ｍｉＲ－１３０ｂがｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、またはそれらのいずれかの組み合わせである。

【0018】

例えば、表１および表２に示されるように、好ましい実施形態では、本方法は、好ましくはｍｉＲＮＡの発現レベルの測定の前に、対象の年齢および性別の判定をさらに含む。そのため、好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＣＲＣまたはＡＡに罹患するリスクがある対象、好ましくは５０歳～７５歳の集団で実施される。

【0019】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本方法は、任意の年齢、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳の、男性または女性で実施される。

【0020】

好ましい実施形態では、本方法は、好ましくはｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する前にヘモグロビンの存在または濃度を測定することをさらに含み、健常な対照対象と比較して、ヘモグロビンの存在またはより高い濃度が、該対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0021】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、生体サンプルは、便、血液、血清または血漿サンプルである。

【0022】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、生体サンプルは便サンプルである。

【0023】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、便サンプル、好ましくは１０ｍｇ未満、好ましくは５ｍｇ未満、より好ましくは２．５ｍｇの便サンプルで実施される。実際、本発明の方法の明らかな利点は、少量の便サンプルを使用することによって実施できることである。なお、Ｃｏｌｏｇｕａｒｄ（登録商標）のような市販の試験は、典型的には約５０ｇｒの大量の便サンプルの使用を必要とする。本発明の方法は、少量の便サンプルを使用して行うことができるので、ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定は、ヘモグロビンの存在または濃度の測定のために先に使用された残りの便サンプルにおいて行うことができる。

【0024】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本方法は、
ａ）対象から得られた便サンプル中の、少なくともｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定し、ヘモグロビンの存在または濃度を測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合の、ｍｉＲ－４２１の過剰発現、および健常な対照対象と比較した場合のヘモグロビンの存在または高い濃度が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0025】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本方法は、
ａ）対象から得られた便サンプル中の、少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの発現レベルを測定し、ヘモグロビンの存在または濃度を測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲＮＡの組み合わせの少なくとも１つの過剰発現、および健常な対照対象と比較した場合のヘモグロビンの存在または高い濃度が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0026】

好ましい実施形態では、結腸直腸癌の前癌段階は、進行性結腸直腸腺腫である。

【0027】

好ましい実施形態では、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断は、画像技術、好ましくは結腸内視鏡検査によって確認される。

【0028】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の方法は、当業者に公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＪＨ，“Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｂｏｏｓｔｉｎｇ”Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔａｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌ ２００２ ３８：３６７－３７８で説明されているアルゴリズムを使用することにより、例えば、勾配ブースティングマシンアルゴリズム、Ｃツリー（Ｃ－ｔｒｅｅ）、ランダムフォレスト、線形識別分析、サポートベクターマシン、ｋ近傍アルゴリズムまたはロジスティック回帰により実施される。

【0029】

本発明の第１の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、診断またはスクリーニングのための方法は、勾配ブースティングマシンアルゴリズムによって実施される。

【0030】

本発明の第１の態様の１つの実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするためのインビトロ方法は、
ａ）対象から得られる生体サンプル（一例では、生体サンプルが便サンプルである）における少なくともｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａの発現レベルを測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象において測定される参照発現レベルと比較して、ｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａの過剰発現が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものであり、
任意に、加えて、本方法は、該対象の年齢および性別を判定することを含み、
本方法は、勾配ブースティングマシンアルゴリズム、Ｃツリー、ランダムフォレスト、線形識別分析、サポートベクターマシン、ｋ近傍法およびロジスティック回帰の群から選択されるアルゴリズムによって実施される。

【0031】

本発明の第１の態様の１つの実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするためのインビトロ方法は、
ａ）対象から得られる生体サンプル（一例では生体サンプルが便サンプルである）における少なくともｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定することを含み、
ｂ）健常な対照対象において測定される参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲ－４２１の過剰発現が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものであり、
加えて、本方法は、該対象の年齢および性別の判定を含み、
本方法は、勾配ブースティングマシンアルゴリズムによって実施される。この実施形態は、任意に、ステップａ）において、対象から得られた便サンプル中のヘモグロビンの存在または濃度をさらに測定することを含むことができ、ステップｂ）において、加えて、健常な対照対象と比較してヘモグロビンの存在またはより高い濃度が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0032】

本発明の第１の態様の１つの実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本方法は、
ａ）少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの発現レベルを測定することを含み、
ｂ）ｍｉＲＮＡの組み合わせの少なくとも１つの過剰発現が、健常な対照対象において測定される参照発現レベルと比較して、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものであり、
加えて、本方法は、該対象の年齢および性別を判定することを含み、
本方法は、勾配ブースティングマシンアルゴリズムによって実施される。この実施形態は、任意に、ステップａ）において、対象から得られた便サンプル中のヘモグロビンの存在または濃度をさらに測定することを含むことができ、ステップｂ）において、加えて、健常な対照対象と比較してヘモグロビンの存在またはより高い濃度が、該対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0033】

本発明の第２の実施形態は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階をスクリーニングまたは診断するための、少なくともｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａのインビトロでの使用に関する。

【0034】

好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階をスクリーニングまたは診断するための、少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］または［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］のインビトロでの使用に関する。

【0035】

好ましい実施形態では、本発明は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階をスクリーニングまたは診断するための、少なくとも［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］または［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］のインビトロでの使用に関する。

【0036】

本発明の第２の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本インビトロ使用は、便、血液、血清または血漿サンプル中で実施される。

【0037】

本発明の第２の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本インビトロ使用は、便サンプル中で実施される。

【0038】

好ましい実施形態では、本発明は、対象の年齢および性別の決定および／またはヘモグロビンの存在もしくは濃度の測定と組み合わせた、少なくとも上記で引用したｍｉＲＮＡのインビトロでの使用に関する。

【0039】

本発明の第３の実施形態は、以下を含むキットに関する：
・ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬、ならびに
・ｍｉＲ－４２１および／またはｍｉＲ－１３０ｂおよび／またはｍｉＲ－２７ａの発現レベルを決定するための手段または試薬。

【0040】

好ましい実施形態では、上記キットは、以下を含む：
・ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬、ならびに
・［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］または［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］の発現レベルを測定するための手段または試薬。

【0041】

好ましい実施形態では、上記キットは、以下を含む：
・ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬、ならびに
・［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－３４ａ］または［ｍｉＲ－１３０ｂおよびｍｉＲ－２９ａ］の発現レベルを測定するための手段または試薬。

【0042】

好ましい実施形態では、ヘモグロビンの存在または濃度の測定は、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を使用することによって行われ、ｍｉＲＮＡの発現レベルの決定は、ＰＣＲによって行われる。

【0043】

本発明の第３の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、いずれかのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するための手段または試薬は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）のためのものである。

【0044】

本発明の第４の実施形態は、結腸直腸癌および／またはその前癌段階をスクリーニングまたは診断するための、上記で引用されたキットの使用に関する。

【0045】

本発明の第４の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本使用は、対象の便サンプル中におけるものである。

【0046】

本発明の方法によれば、上記のいずれかのバイオマーカーの組み合わせの発現レベルを測定した後、シグネチャーについてのスコア値が得られ、このスコア値が診断ルールを定義する閾値と比較される。このスコア値が閾値より高い場合、対応するサンプルは陽性試料として分類され、これは患者が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患している可能性があることの指標である。閾値は、感度および特異性の値を最適化するために定義される。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、
ａ）対象から得られた生体サンプル中の、上記で引用したいずれかのバイオマーカーの組み合わせの濃度レベルを測定することと、
ｂ）発現値を処理してリスクスコアを得ることと、を含み、
ｃ）上記で引用したいずれかのバイオマーカーの組み合わせついて得られたリスクスコアの値の偏差または変動が、参照値と比較して、同定された場合、これは、対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示すものである。

【0047】

本発明の第１の態様のすべての実施形態は、本発明の第２、第３および第４の態様の実施形態でもある。

【0048】

本発明の第１の態様、第２の態様、第３の態様または第４の態様の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ｍｉＲＮＡ発現レベルがｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。

【0049】

本発明の最後の実施形態は、結腸直腸癌またはその前癌段階を治療する方法であって、
ａ）上記の実施形態のいずれかに従って結腸直腸癌またはその前癌段階を有する患者を診断することと、
ｂ）結腸直腸癌の病変またはポリープを除去することを含み得る結腸内視鏡検査を実施することによって患者を治療することと、
を含む方法に関する。以下、この結腸直腸癌またはその前癌段階の治療方法を、「本発明の治療方法」と称する。

【0050】

本発明の第１、第２、第３および第４の態様の全ての実施形態もまた、本発明の治療方法の実施形態である。

【0051】

本発明の治療方法の一実施形態では、任意に、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップｂ）において、結腸直腸癌が診断された患者は、例えば、腫瘍ステージに応じて、内視鏡的ポリープ切除術、外科的切除術、化学療法（例えば、フルオロピリミジン、オキシプラチンおよび／またはイリノテカン）および／または放射線療法によって治療され、一方、進行性腺腫が診断された患者は、例えば、ポリープの大きさに応じて、内視鏡的ポリープ切除術または外科的切除術によって治療される。

【0052】

本発明の目的のための、以下の用語について定義する：

【0053】

・「結腸直腸癌」という用語は、小腸より下の腸管（すなわち、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸および直腸を含む大腸（結腸））の細胞の癌を特徴とする医学的症状である。

【0054】

・「結腸直腸腺腫」という表現は、腺腫性ポリープとも呼ばれる結腸の腺腫を指し、これは結腸直腸癌の良性および前癌段階であるが、依然として結腸直腸癌への進行のリスクが高い。

【0055】

・「進行性結腸直腸腺腫」という表現は、少なくとも１０ｍｍのサイズを有するか、または組織学的に高い悪性度の異形成もしくは２０％を超える絨毛成分を有する腺腫を指す。

【0056】

・「非侵襲的生体サンプル」という表現は、患者から血液を採取するために使用される微細針以外の有害な器具を使用する必要なく、したがって患者に害を及ぼすことなく、患者の身体から採取された任意のサンプルを指す。具体的には、非侵襲的生体サンプルは、本発明においては、便、血液、血清または血漿サンプルを指す。

【0057】

・「健常な対照対象で測定された参照発現レベル」という表現は、バイオマーカーの発現レベルの「参照値」を指す。バイオマーカーの発現レベルの偏差が、上記「健常な対照対象で測定された参照発現レベル」に関して測定される場合、これは結腸直腸癌またはその前癌段階の指標である。特に、本発明のバイオマーカーまたはシグネチャーの発現レベルが上記「参照値」に対して有意に高いまたは低い場合、これは結腸直腸癌またはその前癌段階の指標である。

【0058】

・「リスクスコア」という表現は、１つ以上の濃度値を単一の値（またはリスク値）に処理した後に得られるリスク値を指し、個人についての疾患の可能性を表す。このリスク値を参照値と比較して、患者が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患している可能性があるか否かを評価する。

【0059】

・「参照値」は、閾値またはカットオフ値とすることができる。典型的には、「閾値」または「カットオフ値」は、実験的に、経験的に、または理論的に決定することができる。閾値はまた、当業者によって認識されるように、既存の実験条件および／または臨床条件に基づいて任意に選択することができる。閾値は、検査の機能および利益／リスクのバランス（偽陽性および偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度および特異度を得るために決定されなければならない。好ましくは、当業者は、本発明の方法に従って得られたバイオマーカーレベル（またはスコア）を、定義された閾値と比較し得る。典型的には、最適な感度および特異度（閾値も同様）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定することができる。例えば、参照群におけるバイオマーカーのレベルを決定した後、試験される生体サンプル中のバイオマーカーの測定濃度の統計処理のためのアルゴリズム分析を使用することができ、それにより、サンプルの分類にとって重要な分類基準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は、受信者動作特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）としても知られる受信者動作者特性曲線（ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）である。それは主に臨床生化学的診断試験に使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）および偽の陽性率（１特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。それは、画像合成法により、感度と特異度の関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値または臨界値、診断試験の正常な結果と異常な結果の境界値）を連続変数として設定し、一連の感度および特異度値を計算する。次に、感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の精度が高い。ＲＯＣ曲線において、座標線図上の最も左上に近い点は、感度と特異度の両方が高い臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０～０．５の間である。ＡＵＣ＞０．５の場合、診断結果はＡＵＣが１に近づくにつれてより良好になる。例えば以下のような当技術分野における既存のソフトウェアまたはシステムを、ＲＯＣ曲線の描画に使用することができる：ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医療統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ ９．０またはｐＲＯＣ Ｒパッケージ。

【0060】

・「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「を含む」という単語に続くものを含むことを意味するが、これに限定されない。したがって、「を含む」という用語の使用は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。

【0061】

・「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、語句「からなる」に続く何らかのもの「を含み、以下に限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。

【0062】

明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の場合を包含する。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、発明の詳細な説明を検討することにより当業者に明らかになるか、または本発明の実施によって習得され得る。以下の実施例および図面は例示として提供され、それらは本発明を限定することを意図するものではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態のすべての可能な組み合わせを網羅する。

【図面の簡単な説明】

【0063】

【図1】試験の概要。ＣＲＣ：結腸直腸癌、ＡＡ：進行性腺腫、ＮＡＡ：非進行性腺腫、ＦＤＲ：誤発見率、ＦＣ：倍率変化。

【図2】パネルＡ：ｍｉＲＮＡ発現プロファイルに基づくサンプルのクラスタリングを示す群間分析プロット。ＣＲＣ：結腸直腸癌、ＡＡ：進行性腺腫、Ｃ：対になった正常組織。パネルＢ：１２４個の組織サンプルのＮＧＳ結果から作成されたベン図。内側の円は、偽発見率＜０．０５および倍率変化≧１．５または≦－１．５を有するｍｉＲＮＡを示す。円と円との間の収束は、両方の新生物病変における共通の有意な脱調節ｍｉＲＮＡである。赤色：上方制御されたｍｉＲＮＡの数、緑色：下方制御されたｍｉＲＮＡの数。

【図3】ＧＢＭアルゴリズムによって計算された最良のｍｉＲＮＡ－糞便予測モデル（ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－２７ａ、年齢、性別）の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、以下を区別する高い能力を示す： １）進行性結腸直腸新生物（ＣＲＣ＋ＡＡ）対 非進行性結腸直腸新生物（ＮＡＡ＋健常対照） ２）進行性結腸直腸新生物（ＣＲＣ＋ＡＡ）対 健常対照 ３）ＣＲＣ 対 健常対照、および ４）ＡＡ 対 健常対照。曲線下面積（ＡＵＣ）。Ｘ軸は、特異度を表す。Ｙ軸は、感度を表す。

【実施例】

【0064】

発明の詳細な説明
実施例１ 材料および方法。
実施例１．１ 患者および方法。

【0065】

この試験では、以下の４つの主要な段階を含めた：
１）ＣＲＣおよびＡＡサンプルの組織セット、ならびにそれらの対になった正常粘膜における、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によるｍｉＲＮＡ発見段階、
２）該発見段階に含まれる患者のサブセットならびに対照個人からの糞便サンプルにおける、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるｍｉＲＮＡ候補の技術的検証、
３）ＢａｒｃｅｌｏｎａのＣＲＣスクリーニングプログラムの参加者から得られた糞便サンプルの独立したセットにおける、ｑＲＴ－ＰＣＲによる最も有意に上方制御されたｍｉＲＮＡの臨床的検証、
４）結腸内視鏡検査で関連性のない所見を有する患者のうち、進行性新生物（すなわちＣＲＣまたはＡＡ）を有する患者を識別するための、ｍｉＲＮＡベースの予測モデルの開発。試験の概要を図１に示す。

【0066】

ｍｉＲＮＡ発見段階のために、１２４個の新鮮な結腸直腸組織サンプルを、ＢａｒｃｅｌｏｎａのＨｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃにおいて予め採集した。新生物および正常な粘膜サンプルのペアを、手術に供されたＣＲＣを有する３０人の患者から得たが、これらの患者のいずれも、ネオアジュバント化学療法または放射線療法のいずれも受けていなかった。さらに、新生物および正常な粘膜サンプルのペアを、内視鏡切除後のＡＡを有する３２人の患者から得た。すべての組織サンプルを、ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に保存し、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で凍結した。

【0067】

糞便サンプル中のｍｉＲＮＡ候補の技術的検証のために、前の段階に含まれる３９名の患者のサブセット（ＣＲＣを有する１１名およびＡＡを有する２８名）、ならびに正常な結腸内視鏡検査を有する３９名の対照個人について解析した。

【0068】

最後に、選択されたｍｉＲＮＡの臨床的検証を、２０１１年３月から２０１７年５月までの間に、ＢａｒｃｅｌｏｎａのＣＲＣスクリーニングプログラムにおけるＦＩＴ陽性参加者の間で集められた７６７の糞便サンプルにおいて実施した。各参加者は、キャップに取り付けられた鋸歯状プローブで１０ｍｇの糞便を２ｍＬの緩衝液に収集する検体収集デバイス（ＯＣ－センサー、栄研化学株式会社、日本）を使用して、１つの糞便サンプルを提供した。すべてのサンプルを、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。集団ベースの組織化されたスクリーニングプログラムの特徴は、他の箇所にも記載されている。

【0069】

本試験に含まれる全ての個人の臨床病理学的特徴を表３に示す。この試験は、バルセロナ・ホスピタル・クリニックの倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言に従ってすべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得て行った。

【0070】

実施例１．２ マイクロＲＮＡ抽出。

【0071】

ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を、製造者のプロトコルに従って使用して、組織または糞便（５００μＬ緩衝液）から、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを単離した。組織サンプルについては、ＲＮＡ抽出後、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して混入物質の除去を確保し、１２μＬの最終溶出体積となるようサンプルを濃縮した。ＲＮＡ組織サンプルの純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて分析し、濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）１０００分光光度計（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）によって測定した。糞便サンプル中に存在する総ｍｉＲＮＡの濃度を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって測定した。

【0072】

実施例１．３ ＮＧＳによるゲノムワイドｍｉＲＮＡプロファイリング。

【0073】

製造業者のプロトコルに従って、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）スモールＲＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、組織由来の１μｇの全ＲＮＡからスモールＲＮＡライブラリーの作製を行った。最初に、３’および５’ＲＮＡアダプターを、スモールＲＮＡ末端にライゲーションした。その後、３’ＲＮＡアダプターに相補的な特異的プライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いた逆転写によって、ｃＤＮＡ構築物を合成した。ｃＤＮＡを、キットに同封のインデックス付きアダプターを使用してＰＣＲによってさらに増幅した。このステップは、両端にアダプター分子を有するＲＮＡ断片を選択的に濃縮する。最後に、ライブラリーからの増幅されたｃＤＮＡ構築物を、６％Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＴＢＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で単離した。ゲルから１８塩基対～３６塩基対（ｂｐ）のバンドサイズを示す領域を切り出し、ＤＮＡを沈殿させ、１０μＬの溶出緩衝液に溶出させた。生成したｃＤＮＡライブラリーを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ（登録商標）キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して分析して、許容可能な量を確保し、サイズ分布を確認した。ｃＤＮＡライブラリーのハイスループットシーケンシングを、１ｘ５０ｂｐのシングルエンドリードを用いてＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）で行い、サンプルあたり＞１５ Ｍのリードを得た。リアルタイム分析ソフトウェアによる画像解析および塩基の割り当てによって品質管理を行った。最初の２５塩基において低い信頼値を有するリードを破棄した。品質管理リードを、ＧＥＭプログラムを用いて参照ゲノムとアラインメントした。配列決定前にサンプルに添加したＰｈｉＸのゲノムから計算した誤差パーセンテージは２．５％未満であった。

【0074】

実施例１．４ ｑＲＴ－ＰＣＲによる糞便中ｍｉＲＮＡ発現の分析。

【0075】

ｑＲＴ－ＰＣＲを、ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。簡潔には、５ ｎｇの総ｍｉＲＮＡを使用して逆転写を行った。その後、いくつかのｍｉＲＮＡにおいては、糞便中のｍｉＲＮＡレベルが低いために、定量的ｑＰＣＲの前に前増幅ステップを行った。最後に、最終体積１０μＬ中２μＬのｃＤＮＡを使用して、Ｖｉｉａ７（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でｑＰＣＲを行った。各点を３連で評価した。

【0076】

糞便ｍｉＲＮＡを正規常化するための信頼できる内因性対照が存在しなかったため、絶対定量化を行った。したがって、既知量の各特異的合成ｍｉＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＡ）の段階希釈によって作製した標準曲線を使用して、各サンプルについての平均Ｃｔを、ｎｇ特異的ｍｉＲＮＡ／ｇ総ｍｉＲＮＡに変換した。

【0077】

実施例１．５ バイオインフォマティクスおよび統計分析。

【0078】

配列決定解析は、ｓＲＮＡｂｅｎｃｈパッケージを使用して行った。簡潔には、アダプタートリミングおよびユニークリードのグループ化の後、Ｂｏｗｔｉｅ１．１．２を使用して、１つのミスマッチを許容し、リードをヒトゲノム（ＵＣＳＣ ｈｇ１９）にアラインメントした。ヒトゲノムにマッピングされるＲＮＡエレメントについてのアノテーションを提供するために、成熟型およびプレｍｉＲＮＡ配列についてのｍｉＲＢａｓｅ（バージョン２１）を使用した。カウントデータを百万あたりのｌｏｇ２－カウント（ｌｏｇＣＰＭ）にｖｏｏｍ変換し、循環レス（ｃｙｃｌｉｃ－ｌｏｅｓｓ）法によって正規化した。示差的に発現されるｍｉＲＮＡを特定するために、緩和されたｔ検定を適用した。差次的発現、倍率変化および差のｌｏｇ ２としての発現の平均を、結腸直腸新生物組織と、対をなす正常粘膜との間で解析した。ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの方法による多重試験のためにｐ値を調整した。偽発見率＜０．０５のｍｉＲＮＡを有意と見なした。主成分分析プロットを作成して、楕円で区切られた領域が第１および第２の軸上のサンプルスコアの二項分布の９５％を表す２Ｄグラフに高次元データを視覚化した。有意なｍｉＲＮＡを考慮したベン図も作成した。ＮＧＳの結果から得たｍｉＲＮＡ候補の選択を、以下の基準に基づいて行った：

【0079】

偽発見率＜０．０５、倍率変化≧１．５、平均発現＞３．５、ならびにＣＲＣおよびＡＡの両方における上方制御。

【0080】

定量的変数については、スチューデントのｔ検定を使用した。個々のｍｉＲＮＡの識別能を、年齢および性別によって調整された多変量ロジスティック回帰によって評価した。Ｐ値≦０．０５を有意とみなした。ｐＲＯＣ Ｒパッケージを使用して、各ｍｉＲＮＡを連続変数として考慮し、受信者動作特性の曲線下面積（ＡＵＣ）およびそれに由来するカットポイントを計算した。最小誤差率に関連する最適カットポイントから、感度および特異度を計算した。

【0081】

実施例１．６ 糞便ｍｉＲＮＡに基づく予測モデリング。

【0082】

異なる個人群を識別するための予測モデルを、年齢および性別とともに、臨床検証段階において得られたｍｉＲＮＡ結果を考慮して行った。この分析の主要な評価項目は、結腸内視鏡検査（すなわち、ＮＡＡまたは正常検査）で関連性のない所見を有する患者のうち進行性新生物（すなわちＣＲＣまたはＡＡ）を有する患者を識別することとした。副次的な評価項目は、それぞれ、進行性新生物、ＣＲＣおよびＡＡを有する患者を、正常な結腸内視鏡検査を有する個人から区別することとした。

【0083】

予測モデル生成のために、サンプルを訓練セットと試験セットに、７５％および２５％の割合でランダムに分割した。次に、数値データをセンタリングおよびスケーリングによって前処理した。サンプル群の不均衡に対処するため、合成少数オーバーサンプリング（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｉｎｏｒｉｔｙ ｏｖｅｒ－ｓａｍｐｌｉｎｇ）技術を使用した。訓練セットでは、１０倍交差検証を行った。モデルの生成のために試験したアルゴリズムは以下の通りとした：Ｃツリー法、ランダムフォレスト法、線形判別分析法、勾配ブースティングマシン法、サポートベクターマシン法、およびＫ最近傍法。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。判別手段は、ＡＵＣ、感度、特異度、ならびに正および負の予測値とした。１５の予測確率ビン 対 観測確率ビンを用いて後処理較正を行い、予測モデルの誤差分布を分析した。全ての分析は、ＣＡＲＥＴパッケージでＲを用いて行った。

【0084】

糞便ｍｉＲＮＡベースの予測モデルで得られた結果を、ほとんどのＣＲＣスクリーニングプログラムにおける標準的なケアを表す、年齢および性別によって調整された糞便ヘモグロビン濃度を使用することによって得られると考えられる結果と比較した。

【0085】

最後に、ｍｉＲＮＡシグネチャーおよび糞便ヘモグロビン濃度の両方を組み合わせた予測モデルの性能も評価した。

【0086】

実施例２ 結果。
実施例２．１ ＮＧＳによるｍｉＲＮＡ発見段階。

【0087】

結腸直腸サンプルの組織のセットにおいて、１６４０個のｍｉＲＮＡの発現が検出され、６３７個のｍｉＲＮＡが１００個を超えるカウントを有していた。それらのうち、２００個および３２４個のｍｉＲＮＡは、それらと対をなす正常な粘膜と比較し、それぞれＣＲＣおよびＡＡにおいて有意に調節解除され、倍率変化≧１．５であった。群間分析は、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングがＣＲＣまたはＡＡ組織サンプルを、それらと対をなす正常粘膜から区別でき（図２Ａ）、同様に、ＣＲＣをＡＡから区別できることを示した。さらに、本発明者らは、７２個および５６個のｍｉＲＮＡが、両方の新生物病変部において、それぞれ共通に上方制御または下方制御されることを見出した（図２Ｂ）。

【0088】

選抜基準（すなわち、偽発見率＜０．０５、倍率変化≧１．５、平均発現＞３．５およびＣＲＣとＡＡの両方における上方制御）に従い、２１個のｍｉＲＮＡ候補（表４）を糞便サンプルにおける技術的検証のために選抜した。

【0089】

実施例２．２ ｑＲＴ－ＰＣＲによる、糞便サンプルのｍｉＲＮＡ分析。

【0090】

結腸直腸組織におけるｍｉＲＮＡパターンが糞便サンプルにおいて再現され得るか否かを明らかにするため、本発明者らは、最初に、発見段階に含まれる３９名の患者のサブセット（１１名のＣＲＣ患者および２８名のＡＡ患者）ならびに３９名の正常な結腸内視鏡検査を有する対照個人における上記の２１個のｍｉＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲによって解析した。

【0091】

この技術的検証段階の結果は、７つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐおよびｍｉＲ－４２１）が、ＣＲＣを有する患者の糞便サンプルにおいて有意に上方制御されたことを示した。さらに、それらのうちの４つ（ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐおよびｍｉＲ－４２１）、ならびにｍｉＲ－３３５－３ｐは、ＡＡ患者由来の糞便サンプルにおいて有意に上方制御された。これらの８つのｍｉＲＮＡを、同じくＣＲＣおよびＡＡを有する患者の糞便サンプルにおいて上方制御されたｍｉＲ－２９ａ－３ｐ（それぞれ０．８４および０．７１のＡＵＣ、ｐ値＜０．１）と共に、ＣＲＣスクリーニングプログラムにおける参加者の独立コホートにおいて臨床的に検証するため選抜した。

【0092】

実施例２．３ ｍｉＲＮＡ候補の臨床的検証。

【0093】

上記の９つの上方制御されたｍｉＲＮＡを、ＣＲＣを有する６７名の患者、ＡＡを有する３４７名の患者、ＮＡＡを有する１３６名の患者、および正常な結腸内視鏡検査を有する２１７名の個人を含む、７６７名のＦＩＴ陽性個人から念のために集められたコホートからの糞便サンプルを検証した（表３）。

【0094】

このサンプルのセットでは、対照群と比較して、ＣＲＣ患者ではｍｉＲ－２５－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐおよびｍｉＲ－４２１の上方制御が確認された（ＡＵＣは０．６９～０．７７の範囲）、一方、ＡＡ患者ではｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐおよびｍｉＲ－４２１の上方制御が確認された（ＡＵＣはそれぞれ０．６９および０．７１であった）。これらの７つの糞便ｍｉＲＮＡのいずれも、ＮＡＡを有する患者および正常な結腸内視鏡検査を有する個人との間で有意差を示さなかったことに留意することが重要である（表５）。

【0095】

最後に、試験の主要な評価項目に関して、進行性新生物を有する患者を、結腸内視鏡検査で関連性のない所見を有する患者から区別するための、最も識別力のある糞便ｍｉＲＮＡとして、特にｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐおよびｍｉＲ－１３０ｂ－３ｐを選抜した（表６）。

【0096】

結腸直腸癌スクリーニングのための、糞便中ｍｉＲＮＡに基づく予測モデルの開発および検証

【0097】

進行性新生物を有する患者において有意に上方制御される糞便ｍｉＲＮＡを、年齢および性別と共に考慮した、異なる患者群を識別するための予測的モデリングを行った。主なコンポーネント分析により、ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａがこの目的のために最終的に選抜されたが、これは、それらが３つの最も識別力のある糞便ｍｉＲＮＡの中で冗長でないことが示されたからである。モデル生成のために、個人を訓練セット（ｎ＝５７８）および試験セット（ｎ＝１８９）にランダムに分割し、開発段階で１０倍の交差検証を行い、バイアスおよびばらつきを低減させた。前述のように、試験の主要評価項目に関してより良く適合したものを選抜するために、異なるアルゴリズムを試験し、その最高の精度に基づいて最終的に選抜されたのが、勾配ブースティングマシン（ＧＢＭ）アルゴリズムであった。

【0098】

表７に示されるように、ｍｉＲ－４２１、ｍｉＲ－２７ａ、年齢および性別を組み合わせて得られた予測モデルは、ＣＲＣスクリーニングプログラムにおけるＦＩＴ陽性参加者の中で、進行性新生物を有する患者を同定するために非常に正確性が高かった（ＡＵＣ＝０．６３）。興味深いことに、この結果は、ＣＲＣを有する患者を認識するための高い精度（ＡＵＣ＝０．７４、感度、９６％）のみならず、ＡＡを有する患者を対照個人から識別すること（ＡＵＣ＝０．６４、感度、５９％）によるものでもあった。

【0099】

糞便ｍｉＲＮＡベースの予測モデル［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］において得られた結果は、進行性新生物（結腸内視鏡検査で関連性のない所見を有する対象と比較した場合はＡＵＣ＝０．６２、結腸内視鏡検査を受けた正常な個人と比較した場合はＡＵＣ＝０．５９）、ＣＲＣ（ＡＵＣ＝０．６７）およびＡＡ（ＡＵＣ＝０．５９）の検出に関して、分類因子として糞便ヘモグロビン濃度を使用して得られた結果よりも優れていた（表７）。

【0100】

最後に、例えば図３において認められ得るように、ｍｉＲＮＡシグネチャー［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］および糞便ヘモグロビン濃度の両方の組み合わせにより、進行性新生物（結腸内視鏡検査で関連性のない所見を有する対象と比較した場合はＡＵＣ＝０．７０、結腸内視鏡検査を受けた正常な個人と比較した場合はＡＵＣ＝０．６７）、ＣＲＣ（ＡＵＣ＝０．９３）およびＡＡ（ＡＵＣ＝０．６４）を有する患者を特定するための最も高い精度が可能になった（表７）。実際、組み合わせモデルの検量線は、糞便ヘモグロビン濃度のみを使用して得られた結果と比較しても、予測によるものが観察された結果によるものに近く、誤差分布がより低いことを示した。

【0101】

【表1】

【0102】

【表2】

【0103】

【表3】

【0104】

【表4】

【0105】

【表5】

【0106】

【表6】

【0107】

【表7】

【0108】

完全を期すために、本発明の様々な態様を、以下の付番された項に記載する。
第１項．結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするためのインビトロ方法であって、ａ）対象から得られた生体サンプル中の少なくともｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定することを含み、前記生体サンプルが便サンプルであり、ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合のｍｉＲ－４２１の過剰発現が、前記対象が結腸直腸癌および／またはその前癌段階に罹患していることを示す、インビトロ方法。
第２項．ａ）前記対象から得られた生体サンプルにおける少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの発現レベルを測定することを含み、ｂ）健常な対照対象において測定された参照発現レベルと比較した場合の、前記少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の組み合わせの過剰発現が、前記対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示す、第１項に記載のインビトロ方法。
第３項．５０歳～７５歳の対象において実施される、第１～２項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第４項．好ましくは前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する前に、ヘモグロビンの存在または濃度を測定することをさらに含み、健常な対照対象と比較した場合のヘモグロビンの存在またはより高い濃度が、前記対象が結腸直腸癌および／または前癌段階に罹患していることを示す、第１～３項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第５項．前記生体サンプルが、５ｍｇ未満、好ましくは２．５ｍｇの便サンプルである、第１～４項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第６項．前記ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定が、前記ヘモグロビンの存在または濃度の測定のために先に使用された残りの便サンプルにおいて行われる、第１～５項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第７項．前記結腸直腸癌の前癌段階が、進行性結腸直腸腺腫である、第１～６項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第８項．前記結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断が、画像技術、好ましくは結腸内視鏡検査によって確認される、先行する項のいずれかに記載のインビトロ方法。
第９項．対象の便サンプルにおける、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための、少なくともｍｉＲ－４２１のインビトロ使用。
第１０項．少なくとも［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の、結腸直腸癌および／またはその前癌段階の診断またはスクリーニングのための、第９項に記載のインビトロ使用。
第１１項．
ａ．ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬と、
ｂ．ｍｉＲ－４２１の発現レベルを測定するための手段または試薬と、
を含むキット・オブ・パーツ。
第１２項．
ａ．ヘモグロビンの存在または濃度を測定するための手段または試薬と、
ｂ．［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２７ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２５］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２２１］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－３４ａ］、［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－２９ａ］または［ｍｉＲ－４２１およびｍｉＲ－１３０ｂ］の発現レベルを測定するための手段または試薬と、
を含む、第１１項に記載のキット・オブ・パーツ。
第１３項．ヘモグロビンの存在または濃度の測定が、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を使用することによって行われ、ｍｉＲＮＡの発現レベルの測定が、ｑＲＴ－ＰＣＲによって行われる、第１１または１２項のいずれかに記載のキット・オブ・パーツ。
第１４項．結腸直腸癌および／またはその前癌段階を診断またはスクリーニングするための、第１１から１３項のいずれか一項に記載のキットの使用。
第１５項．進行性結腸直腸腺腫を診断またはスクリーニングするための、第１４項に記載のキットの使用。

【図1】

【図2A)】

【図2B)】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【国際調査報告】