特表 2022-541227 成長板再生用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-22

(54)【発明の名称】成長板再生用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/32 20150101AFI20220914BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20220914BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20220914BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 31/726 20060101ALI20220914BHJP

【ＦＩ】

A61K35/32

A61L27/38 112

A61L27/36 130

A61P19/04

A61K38/39

A61L27/36 312

A61K31/711

A61K31/726

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502613

(86)(22)【出願日】2020-07-13

(85)【翻訳文提出日】2022-03-10

(86)【国際出願番号】 KR2020009179

(87)【国際公開番号】W WO2021010702

(87)【国際公開日】2021-01-21

(31)【優先権主張番号】10-2019-0086412

(32)【優先日】2019-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515131404

【氏名又は名称】アジュ ユニバーシティー インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＡＪＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＩＮＤＵＳＴＲＹ－ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＣＯＯＰＥＲＡＴＩＯＮ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100175477

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 林太郎

(72)【発明者】

【氏名】ミン ビョン－ヒュン

【テーマコード（参考）】

4C081

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C081AB02

4C081BA12

4C081CD34

4C081DA12

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084DA40

4C084MA28

4C084MA66

4C084MA67

4C084NA03

4C084NA14

4C084ZA961

4C084ZA962

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086EA26

4C086MA03

4C086MA06

4C086MA28

4C086MA66

4C086MA67

4C086NA03

4C086NA14

4C086ZA96

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB46

4C087BB63

4C087CA04

4C087MA28

4C087MA66

4C087MA67

4C087NA03

4C087NA14

4C087ZA96

(57)【要約】

本発明は、胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を有効成分として含む成長板再生用組成物を提供する。成長板再生用組成物は、支持体なしに成長板損傷部位の骨架橋を抑制し、成長板軟骨組織に分化して損傷部位を効果的に充填及び再生させ、再生された成長板組織は成長能を回復することができる。また、組成物は、生体組織に適し、安全であり、再現性及び均質性が高い特徴を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を有効成分として含む、成長板再生用組成物。

【請求項2】

前記組成物は、
水、コラーゲン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びＤＮＡからなり、ゲル状であることを特徴とする、請求項１に記載の成長板再生用組成物。

【請求項3】

前記組成物は、
前記組成物全体１００重量部について、
前記水６０～９８重量部、前記コラーゲン５～１５重量部、前記グリコサミノグリカン１～５重量部及び前記ＤＮＡ ０．５～３．５重量部であることを特徴とする、請求項２に記載の成長板再生用組成物。

【請求項4】

請求項１から請求項３のうち何れか一項に記載の組成物を含む、成長板損傷治療用薬学組成物。

【請求項5】

前記組成物は、
侵襲点の切開または外傷手術時に手術切開部を通じて挿入されて、成長板損傷または欠損部位を再生させることを特徴とする、請求項４に記載の成長板損傷治療用薬学組成物。

【請求項6】

前記組成物は、
成長板に移植された後、３～５週まで残存して骨架橋形成を抑制し、以後、前記成長板の組織に分化されることを特徴とする、請求項４に記載の成長板損傷治療用薬学組成物。

【請求項7】

前記組成物は、
注射剤の形態に製造され、３～５℃の冷蔵状態で２４時間保管可能であることを特徴とする、請求項４に記載の成長板損傷治療用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、成長板再生用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

成長板（Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｌａｔｅ）とは、肢骨の中央部と両端部との間に残っている軟骨組織であって、骨の長さの成長が起こる部分である。骨端軟骨とも称するが、肢骨がいずれも軟骨である胎児が成長しながら、軟骨の中央部が骨に変わりながら、両端に次第に広がり（一次骨化中心）、肢骨の両端にまだ骨に変わっていない軟骨部位に自体的に、また骨に変わる部分が表われる（二次骨化中心）。このように骨に変わり、その間に残りの軟骨部分が成長板になり、思春期になると、成長板もいずれも骨に変わりながら、長さの成長が終わる。

【0003】

成長板骨折形態を５種に分類したソルターハリス（Ｓａｌｔｅｒ－Ｈａｒｒｉｓ）分類法によれば、第１型は、骨折が最も軽い場合であって、Ｘ線によっても観察されない場合が多く、はやければ３週以内に回復され、他の問題を残さない方である。第２型は、骨折が成長板上にある形態であって、成長板損傷部分及び成長板損傷がない部分が形成され、必要に応じて手術的治療ができる。第３、４型及び第５型は、第１、２型に比べて重い場合であって、まず、第３型は、骨折が成長板下の関節面まで広がっている形態であって、部分的な成長障害を示すことができる。第４型は、骨折が成長板を通過して関節まで進行した場合であって、手術的治療が必要であり、処置なしにそのままにしておく場合、骨の変形などが生じてしまう。第５型は、垂直に力が加えられて生じる骨折であって、成長板骨折中で成長障害などの最も悪い予後をもたらす。第１型及び第２型は、２～４０％程度発生し、第３型及び第４型は、８～５０％程度発生する。

【0004】

一般的に、損傷した成長板の４０～７０％で骨架橋が形成され、これによる骨の成長に問題が生じて、長さの成長障害、角変形などの深刻な問題が発生する。現在、このような問題を解決するための治療方法として障害発生以後、成長板が閉じるまで待って施行される変形矯正術があるが、これは、複数回の手術が必要であり、変形残存、神経損傷、フィラーなど多くの後遺症を伴う問題点がある。変形初期に施行することができる手術としては、骨形成部位除去術があるが、成長板で骨化が起こった部位を除去した後、自家脂肪組織、シリコン、ボーンワックス（ｂｏｎｅ ｗａｘ）などの骨化遮蔽材を挿入するが、前記骨化遮蔽材は、成長板の機能までは行えない限界がある。したがって、成長板損傷の根本的な治療のための新たな治療剤が必要な実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

前記問題を解決するために、本発明は、胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を有効成分として含む成長板再生用組成物を提供する。

【0006】

また、本発明は、前記成長板再生用組成物を含む成長板損傷治療用薬学組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明による成長板再生用組成物は、胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を有効成分として含みうる。

【0008】

本発明による成長板損傷治療用薬学組成物は、前記成長板再生用組成物を含みうる。

【発明の効果】

【0009】

本発明による組成物は、生体組織に適し、再現性及び均質性が高く、人工支持体なしに組織工学的にゲル状の成長板類似組織に分化される。

【0010】

前記組成物は、成長板損傷部位の骨架橋を抑制し、成長板軟骨組織に分化して損傷部位を効果的に充填及び再生させ、それによって再生された成長板は、成長能などの機能が回復される。

【0011】

また、前記組成物は、安全であり、手術時に、特別な手術機器を要さず、損傷部位のサイズ及び形状に関係なく、容易に移植することにより、より簡便に損傷した成長板を治療することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の一実施例による成長板ゲルを利用した成長板治療方法を簡略に示した図面である。

【図2】本発明の一実験例によるウサギの損傷した成長板内に前記実施例２によって製造された成長板ゲルを移植する過程を示した図面である。

【図3】図２によるウサギ成長板損傷モデルのマイクロ－ＣＴ（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）イメージ及び組織分化を確認したイメージである。

【図4】図２によるウサギ成長板損傷モデル実験の免疫染色イメージである。

【図5】本発明の一実験例によるラットモデルである。

【図6】本発明の一実験例によるラットモデルの長さ及び角変形の測定結果グラフである。

【図7】本発明の一実験例によるラットモデルの組織分化を確認したイメージである。

【図8】本発明の一実験例によるラットモデルの組織分化を確認したイメージである。

【図9】本発明の一実験例によるラットモデルの４、１４、２１、２８週目のサフラニン－Ｏ（Ｓａｆｒａｎｉｎ－Ｏ）及びｕ－ＣＴイメージである。

【図10】培養方法による成長板ゲルの特徴を観察したものである。

【図11】遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）条件による成長板ゲルの特徴を示した図面である。

【図12】本発明の一実施例によって製造された成長板ゲルの形状である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

本発明は、胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を有効成分として含む成長板再生用組成物を提供する。

【0015】

本発明において、「胎児軟骨組織由来の細胞」は、胎児軟骨組織から分離された細胞を総称し、望ましくは、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）などを用いて軟骨組織を完全に消化させた後、分離された軟骨前駆細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ）である。

【0016】

本発明において、「胎児軟骨組織由来の細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）」は、胎児軟骨組織由来の細胞から細胞によって合成され、細胞外に分泌、蓄積された分子で構成されている生体高分子の集合体であって、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、エラスチン（ｅｌａｓｔｉｎ）などの繊維性タンパク質、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ、ＧＡＧ）などの複合タンパク質、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）などの細胞付着性タンパク質などを含みうる。前記細胞外基質は、前記のようなタンパク質で組織の形状を成しながら、組織の物理的性質を決定し、細胞の環境の保持に重要な役割を果たす。

【0017】

本発明において、「成長板」は、動物の長さの成長を担当する部位かつヒトの身長を伸ばす身体部位であって、長骨（ｌｏｎｇ ｂｏｎｅ）の端部に存在する一種の軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）である。組織学的には、ガラス軟骨（硝子軟骨、ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）に属し、骨端板とも称する。

【0018】

本発明において、「再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」は、さまざまな原因で組織または器官の欠損などが起こった場合、以前と同じ組織または器官にその欠損部を補充、修復、回復させようとする作用を言う。

【0019】

本発明による成長板再生用組成物は、水、コラーゲン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びＤＮＡからなり、ゲル（ｇｅｌ）状である。より詳細には、前記組成物全体１００重量部について、前記水６０～９８重量部、前記コラーゲン５～１５重量部、前記グリコサミノグリカン１～５重量部及び前記ＤＮＡ ０．５～３．５重量部である。

【0020】

本発明において、「ゲル」は、ゼリーと類似した物質であって、柔らかくて弱い範囲から強くて粗い範囲までの物性を有し、ゲルのほとんどの重量は、液体（ｌｉｑｕｉｄ）であるが、３次元ネットワーク構造によって全体としては固体のように行動し、「ゲル」と混用して使われる。

【0021】

本発明は、前記成長板再生用組成物を含む成長板損傷治療用薬学組成物を提供する。

【0022】

本発明において、前記「成長板損傷」は、成長板、成長板組織などが機械的刺激や炎症反応による損傷、欠陥、欠損が発生したものであって、これによる疾患も含まれる。

【0023】

本発明による薬学組成物は、侵襲点の切開または外傷手術時に手術切開部を通じて挿入されて、成長板損傷または欠損部位を再生させることができる。成長板が損傷した後、４週以内に骨架橋が形成されうるが、前記薬学組成物は、成長板に移植された後、３～５週、望ましくは、４週まで残存して骨架橋形成を抑制し、以後、成長板類似組織に分化される。また、前記成長板類似組織に再生された後、前記組織は、成長板としてのその機能が回復され、成長能などが継続的に行われる。

【0024】

本発明による薬学組成物は、成長板損傷または欠損部位に直接注入可能な形態で剤形化され、例えば、支持体なしに前記細胞及び細胞外基質を含むゲル状である。
図１は、本発明の一実施例による成長板ゲルを利用した成長板治療方法を簡略に示したものであって、前記組成物は、望ましくは、図１のように前記ゲルを含む注射剤の形態に製造されて移植される。

【0025】

また、前記注射剤は、生理食塩液、リンゲル液、Ｈａｎｋ溶液または滅菌された水溶液などの水性溶剤、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの高級脂肪酸エステル及びエタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはグリセリンなどの非水性溶剤などを用いて製造可能であり、粘膜透過のために、通過するバリアに適した当業者に公知の非浸透性剤が使われ、変質防止のための安定化剤として、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなどと、乳化剤、ｐＨ調節のための緩衝剤、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなどの微生物発育を阻止するための保存剤などの薬学的に許容可能な担体をさらに含みうる。前記注射剤は、３～５℃、望ましくは、４℃の冷蔵状態で２４時間保管される。

【0026】

本発明による薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与される。前記「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の比率で成長板損傷の治療に十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味する。

【0027】

前記薬学組成物の有効容量レベルは、使用目的、患者の年齢、性別、体重及び健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、配合または同時使用される薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって異なるように決定される。本発明による薬学組成物は、前記成長板損傷または欠損部位のサイズによって適切な容量で移植される。

【0028】

また、本発明は、成長板再生用組成物の製造方法を提供する。

【0029】

本発明による成長板再生用組成物の製造方法は、ヒト胎児軟骨組織から分離された軟骨前駆細胞を培養する第１段階；前記培養された軟骨前駆細胞から前記細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を収得する第２段階；前記収得された細胞膜を軟骨分化培地に入れ、遠心分離して細胞ペレットを得る第３段階；及び前記得た細胞ペレットを前記軟骨分化培地で培養して成長板ゲルを製造する第４段階；を含みうる。

【0030】

本発明による製造方法において、前記第１段階は、ヒト胎児軟骨組織から分離された軟骨前駆細胞を培養する段階であって、前記軟骨前駆細胞は、胎児の関節部位から分離された軟骨組織から得られる。本発明の一実施例によれば、１２～１５週齢の胎児のヒザ関節から軟骨組織を分離した。

【0031】

前記軟骨組織は、コラゲナーゼ、ペプシンのようなプロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）で処理され、それによって放出された細胞を集めて遠心分離した後、沈殿された軟骨前駆細胞を培養培地に接種することができる。前記軟骨前駆細胞は、抗生剤が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）で培養されるが、これに制限されず、以外の通常使われる培養培地で培養される。本発明の一実施例によれば、前記軟骨前駆細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）が添加されたＤＭＥＭで１５～１８日間単層培養された。

【0032】

本発明による製造方法において、前記第２段階は、前記第１段階で培養された軟骨前駆細胞から前記細胞及びその細胞外基質を含む細胞膜を収得する段階であって、一般的な細胞の取得方法とは異なって、本発明では、前記細胞及び細胞外基質をいずれも含む細胞膜を収得することができる。本発明の一実施例によれば、培養後、培地を除去し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡを添加して処理後、細胞をピペットで分離せず、細胞及び細胞外基質を含む細胞膜全体を一回に収得した。

【0033】

本発明による製造方法において、前記第３段階は、前記第２段階で収得された細胞膜を軟骨分化培地に入れ、遠心分離して細胞ペレットを得る段階であって、前記「軟骨分化培地」は、試験管内成長及び生存を支持し、成長板再生用組成物として製造可能に栄養分を供給することができる培地を意味し、培養期間の間に細胞から分泌された基質などと細胞培養に消耗し、残りの栄養成分などをいずれも含みうる。本発明の一実施例によれば、前記軟骨分化培地として１％抗生剤－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、１．０ｍｇ／ｍＬインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン（ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、１．２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、１００ｎＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、４０μｇ／ｍＬプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）及び１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－βを含むダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ－Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ；ＤＭＥＭ－ＨＧ）を使用した。

【0034】

前記第３段階の遠心分離は、２００～１５００×ｇの回転数で１０～３０分間行われる。望ましくは、１０００×ｇの回転数で２０分間行われる。前記遠心分離条件による組織の形状及び物性の変化はないが、前記回転数と遂行時間とで最も安定した再現性が表われる。

【0035】

本発明による製造方法において、前記第４段階は、前記第３段階で得た細胞ペレットを前記軟骨分化培地で培養して成長板ゲルを製造する段階であって、前記培養方法によって成長板ゲルの特性が変わりうる。本発明の一実験例によれば、ウェルプレートで高密度培養時に、培養期間が長くなるほどメンブレンが厚くなりながら、全体的な組織のサイズが大きくなり、物性が柔らかくなる傾向が表われた。また、ウェル数が多くなるほどメンブレンが薄くなり、サイズが小さくなる傾向が表われた。これにより、前記培養は、６～２４ウェル（ｗｅｌｌ）プレートで１～３日間行われ、望ましくは、６ウェルプレートで３日間高密度（Ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＨＤ）で培養され、この際、組織の製作再現性及び製作均質性がより高くなる。このように製造された成長板ゲルは、支持体なしに前記細胞及び細胞外基質のみからなり、より詳細には、水、コラーゲン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及びＤＮＡからなりうる。

【0036】

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。

【0037】

＜実施例１＞ヒト胎児軟骨組織由来の軟骨前駆細胞の分離及び培養

【0038】

胎児軟骨組織由来の細胞及び胎児軟骨組織由来の細胞外基質を含む成長板ゲルの製造のために、１２～１５週齢の胎児のヒザ関節から軟骨前駆細胞を分離した。前記ヒザ関節から分離された軟骨組織をリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄した後、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで０．２％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で４時間培養した。軟骨組織が完全に消化されて放出された軟骨細胞を１７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、沈殿された軟骨前駆細胞を組織培養皿（培養皿当たり１×１０^６ｃｅｌｌｓの密度に１５０ｍｍ（ｄｉａ．）×２０ｍｍ（ｈ））に接種した。

【0039】

＜実施例２＞成長板ゲルの製作

【0040】

前記実施例１から収得した軟骨前駆細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭに２×１０^５ｃｅｌｌｓで希釈した後、１５～１８日間単層培養した。培養後、培地を除去し、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を添加して細胞外基質と結合された細胞膜を収得した。細胞及び細胞外基質が結合された細胞膜の収得は、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）処理後、細胞をピペットで分離せず、細胞及び細胞外基質を含む細胞膜全体を一回に収得した。

【0041】

収得した細胞及び細胞外基質を含む細胞膜を軟骨分化培地（１％抗生剤－抗真菌剤）、１．０ｍｇ／ｍＬインスリン、０．５５ｍｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、０．５ｍｇ／ｍＬ亜セレン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１．２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１００ｎＭデキサメタゾン、４０μｇ／ｍＬプロリン及び１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ－βを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ－Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ；ＤＭＥＭ－ＨＧ）が含まれた５０ｍｌチューブに入れ、２５０×ｇで２０分間遠心分離してペレット状の構造体を製造した。

【0042】

製造された細胞ペレットを前記組成と同一の軟骨分化培地が入れられた培養皿に入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで１週、２週及び３週間培養して成長板ゲルを製造した。

【0043】

＜実験例１＞ウサギ成長板損傷モデルで成長板ゲル注入による組織特性の変化及び成長板組織への活性確認

【0044】

図２は、本発明の一実験例によるウサギの損傷した成長板内に前記実施例２によって製造された成長板ゲルを移植する過程を示したものである。ウサギは、成長板の直接的な役割である骨の長さと角変形とに対する結果を確認することができて、本発明の治療機転でターゲットする成長板ゲルの開発の役割を正確に確認可能なモデルである。

【0045】

図２を参照すれば、ウサギで成長板部分を２ｍｍのパンチで２回斜めに穿孔した後、本発明の実施例２によって製造された成長板ゲルを移植した後、移植部位を分離し、凍結切片機を使用して４μｍの厚さに切片してスライドを製作して、骨の成長形態及び移植した成長板ゲルの動態を確認した。グループ１（ｇｒｏｕｐ １）は、成長板を損傷させた陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）であり、グループ２は、現在臨床で最も多く使われているボーンワックスを移植した陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）である。

【0046】

図３は、図２によるウサギ成長板損傷モデルのマイクロ－ＣＴイメージ及び組織分化を確認したイメージである。

【0047】

図３を参照すれば、前記ウサギ成長板損傷モデルのマイクロ－ＣＴイメージを確認した結果、４週目では、各グループ（ｎｏｒｍａｌ（成長板正常モデル）、ｇｒｏｕｐ １（成長板損傷モデル／陰性対照群）、ｇｒｏｕｐ ２（ボーンワックス移植モデル／陽性対照群）、ｇｒｏｕｐ ３（成長板ゲル移植モデル））で確実な差はなかったが、８週後の場合、各グループごとに確実な差が表われた。陰性対照群（グループ１）と陽性対照群（グループ２）とで骨の角変形が起こっており、陽性対照群（グループ２）のボーンワックスは、移植空間を満たす効果はあるが、移植材が骨組織で保持される限界があった。一方、成長板ゲル移植モデル（グループ３）の場合、軟骨を形成させて肉眼で観察した時にも、移植した部位が見られないほど成長板正常モデル（ｎｏｒｍａｌ）の骨角度と同一の正常軟骨で再生されて成長板ゲルの有効性を確認することができた。

【0048】

また、サフラニン－Ｏ（ＳＯ）、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＆ Ｅｏｓｉｎ；Ｈ＆Ｅ、ＨＥ）染色を通じて、陰性対照群（グループ１）と陽性対照群（グループ２）との場合には、損傷部位に骨組織が形成される一方、成長板ゲル移植モデル（グループ３）の場合には、薄いが、軟骨組織が成長板位置に位置していることを確実に確認することができた。

【0049】

図４は、図２によるウサギ成長板損傷モデル実験の免疫染色イメージであって、Ａは、ウサギ成長板正常モデルの免疫染色イメージであり、Ｂは、成長板ゲル移植モデル（グループ３）の免疫染色イメージである。

【0050】

図４を参照すれば、成長板ゲル移植モデル（グループ３）で成長板正常モデル（ｎｏｒｍａｌ）の場合と類似にコラーゲンと糖タンパクとを形成していることが確認され、骨形成段階であるコラーゲンＸ（ｃｏｌ Ｘ）の場合、８週以後に形成されて骨化が遅く起こるか、防止されると予想された。

【0051】

＜実験例２＞ラット（ｒａｔ）成長板損傷モデルで成長板ゲル注入による変化確認

【0052】

図５は、本発明の一実験例によるラットモデルである。前記実験例１によるウサギモデルの場合、成長板の役割を臨床的効果として確認可能な一方、大量の動物試験及び作用機転を研究するには限界があるので、ラットモデルで成長板損傷及び治療効果について実験した。

【0053】

図６は、本発明の一実験例によるラットモデルの長さ及び角変形の測定結果グラフである。陰性対照群であるラット成長板損傷モデル（グループ１）、陽性対照群であるボーンワックス移植モデル（グループ２）及び成長板ゲル移植モデル（グループ３）の４週後の長さの成長及び角変形を測定した。

【0054】

図６を参照すれば、長さの成長の場合には、ラット成長板損傷モデル（グループ１）のみで長さの成長に対する差が観察され、角変形の場合には、ラット成長板損傷モデル（グループ１）で最も大きく観察され、ボーンワックス移植モデル（グループ２）でもグループ１ほどではないが、角変形が観察された。

【0055】

図７及び図８は、本発明の一実験例によるラットモデルの組織分化を確認したイメージである。

【0056】

図７及び図８を参照すれば、サフラニン－Ｏ及びヘマトキシリン＆エオシンの染色結果、４週後、ラット成長板損傷モデル（グループ１）及びボーンワックス移植モデル（グループ２）では、損傷部位に骨組織が形成されたが、成長板ゲル移植モデル（グループ３）の場合には、骨分化は起こらず、軟骨組織で保持されたことを確認することができた。また、成長する部位に肥大性マーカー（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒ）が発現されることにより、長さの成長の可能性を確認することができた。

【0057】

また、成長板ゲル移植モデル（グループ３）で成長板ゲルが移植されたと予想される部位をＨｕＮＡ（ｈｕｍｅｎ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）染色することにより、移植された組織を確認し、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）染色を通じて増殖細胞を確認した。

【0058】

図９は、本発明の一実験例によるラットモデルの４、１４、２１、２８週目のサフラニン－Ｏ及びｕ－ＣＴイメージである。

【0059】

図９を参照すれば、移植後、４、１４、２１、２８週にサフラニン－Ｏとｕ－ＣＴとを行った結果、同じ傾向性が表われることを確認した。ラット成長板損傷モデル（グループ１）及びボーンワックス移植モデル（グループ２）では、成長板損傷部位の軟骨組織が発見されず、ｕ－ＣＴ結果で骨が形成されたことを確認した。特に、ラット成長板損傷モデル（グループ１）は、あらゆる週齢で角変形が観察された。

【0060】

＜実験例３＞培養方法による成長板ゲルの特性確認

【0061】

図１０は、培養方法による成長板ゲルの特徴を観察したものであって、組織培養容器及び高密度（ＨＤ）培養期間による組織のサイズ、物性（Ｈａｎｄｌｉｎｇ ｔｅｓｔ）を確認した。

【0062】

図１０を参照すれば、既存に構築された６０ｍｍのディッシュ（ｄｉｓｈ）で高密度（ＨＤ）で５～６日間培養していた方法を、６ウェル、１２ウェル、２４ウェルにおいて高密度で１、２、３日間培養する方法を施行した。培養プレートで高密度で培養時に、１日目にもメンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）がよく形成され、高密度培養期間が長くなるほどメンブレンが厚くなりながら、全体的な組織のサイズが大きくなり、物性も柔らかくなる傾向が表われた。また、６ウェル、１２ウェル、２４ウェルに行くほどメンブレンは薄くなり、サイズも小さくなる傾向が表われた。このような結果に基づいて、成長板ゲルの製造時に、組織の製作再現性及び製作均質性が高い６ウェルプレートで３日の高密度培養期間を最適化された工程として確立した。

【0063】

図１１は、遠心分離条件による成長板ゲルの特徴を示したものであって、２次元培養後、３次元培養に移る前段階である遠心分離条件を調整した時、前記成長板ゲルの物性に如何なる影響を与えるかを確認した。

【0064】

図１１を参照すれば、以前に確立された遠心分離条件である１０００×ｇ、２０分で、５００×ｇ、２０分、２５０×ｇ、２０分に設定して施行した結果、遠心分離条件による組織の形状と物性の変化はないと表われ、組織のサイズは、１０００×ｇから２５０×ｇに行くほど小さくなる傾向を表わした。このような結果に基づいて、２５０×ｇ、２０分の条件で組織の体積が最も大きいが、高密度培養された膜が乾かす過程で１０００×ｇ、２０分条件の場合に最も安定した再現性が表われるので、１０００×ｇ、２０分を最適化された工程として確立した。

【0065】

＜製造例１＞成長板ゲル

【0066】

図１２は、本発明の一実施例によって製造された成長板ゲルの形状である。

【0067】

図１２を参照すれば、前記成長板ゲルは、無色の円（球）状の人工軟骨ゲルであって、２０±１５μｇ／ｍｇ（または、２±１．５％）のＤＮＡ、８００±１８０μｇ／ｍｇ（または、８０±１８％）の水分、３０±２０μｇ／ｍｇ（または、３±２％）のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及び１００±５０μｇ／ｍｇ（または、１０±５％）のコラーゲンからなることが確認された。

【0068】

また、４×１０^６ｃｅｌｌｓ以上の軟骨細胞で完成医薬品を作った時、重量は、５０±２０ｍｇと測定され、ゲルタイプの人工軟骨の完成医薬品の物性は、１０±８ｋＰａと測定された。

【0069】

＜比較例１＞ボーンワックス、シラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）との比較

【0070】

既存の製品であるボーンワックス及びシラスティック（シリコン）と本発明の一実施例による成長板ゲルとを比較した時、既存の製品は、骨遮蔽機能に優れた緻密ゲルであるが、単純遮蔽機能の材料であって、むしろ成長板欠損部位を発生させる問題点を有する。

【0071】

一方、前記成長板ゲルは、組織工学製剤であって、遮蔽機能に優れ、細胞分化及び細胞外基質の再生性で組織復元が可能であり、さらにリモデリング及び成長も可能な特徴を有する。

【0072】

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。すなわち、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【国際調査報告】