特表 2022-541238 組換えアデノ随伴ウイルスのパッケージング効率を増加させるためのイオン濃度の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-22

(54)【発明の名称】組換えアデノ随伴ウイルスのパッケージング効率を増加させるためのイオン濃度の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20220914BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220914BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220914BHJP

【ＦＩ】

C12N7/01 ZNA

A61K48/00

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022502843

(86)(22)【出願日】2020-08-12

(85)【翻訳文提出日】2022-03-10

(86)【国際出願番号】 US2020045906

(87)【国際公開番号】W WO2021011941

(87)【国際公開日】2021-01-21

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】502097366

【氏名又は名称】チャールズ・リバー・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100096943

【氏名又は名称】臼井 伸一

(72)【発明者】

【氏名】ワング，チィツァオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB02

4B065BC11

4C084AA13

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA05

4C087BB64

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

(57)【要約】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させるために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする効率を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、さらなるイオンの投与を介して細胞培養培地のイオン強度を増加させることによって、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生力価を増加させる方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、前記方法が以下の工程を含む方法：
（Ａ）初期の培養培地において、初期の期間、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、前記ｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養することであって、前記細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有する、培養すること；
（Ｂ）前記初期の期間の後、前記培養培地にＮａ^＋以外の１以上のイオンを加えることにより、前記培養培地のイオン強度を変更すること；および
（Ｃ）（Ｂ）の非存在下で得られる力価よりも大きい前記ｒＡＡＶの産生力価を産生するように、前記細胞の前記培養を継続すること。

【請求項2】

前記加えられるイオンの各々が、前記初期の培養培地中の前記イオンの濃度を約１０ｍＭから約８０ｍＭ増加させるのに十分な量で提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記産生力価が、前記工程（Ｂ）の非存在下で同様に実施される細胞培養から得られる力価より少なくとも５０％高い、請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

前記ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを含み、または、転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、またはｒＡＡＶ９の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記加えられるイオンが、Ｋ^＋、Ｃａ^＋＋またはＭｇ^＋＋の１つ以上を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記加えられるイオンが、ＣＯ_３ ^－－、ＨＣＯ_３ ^－、ＨＰＯ_４ ^－、ＰＯ_４ ^－－、ＳＣＮ^－、ＳＯ_４ ^－－、ＨＳＯ_４ ^－、およびＣｌ^－の１つ以上を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記加えられるイオンが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、フタル酸水素塩、酒石酸水素塩、ブトキシエトキシ酢酸塩、カプリル酸塩、クエン酸塩、デヒドロ酢酸塩、二酢酸塩、ジヒドロキシグリシナート、ｄ－サッカレート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリシナート、グリコ硫酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、乳酸塩、メチオニン酸塩、シュウ酸塩、フェネート、フェノスルホン酸塩、プロピオン酸塩、プロピオン酸塩、サッカリン、サリチル酸塩、サルコシン酸塩、ソルビン酸塩、チオグリコール酸塩、およびトルエンスルホン酸塩の１つ以上を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記加えられるイオンがＫ^＋およびＣＯ_３ ^－－を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞がヒト胚性腎細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記細胞がＨＥＫ２９３細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞が、ベビーハムスター腎細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞がＢＨＫ２１細胞である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞がｓｆ９昆虫細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記初期の培養培地がダルベッコの改変イーグル培地である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記初期の培養培地に血清が補足される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

以下を含む薬学的組成物：
（Ａ）請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法によって製造された、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物であって、前記ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または、転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的であり、前記薬学的組成物は、有効量の前記ｒＡＡＶ調製物を含有する、調製物；および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。

【請求項19】

遺伝子または遺伝性の疾患または状態の治療において使用するための、
タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または転写された核酸、を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法によって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物、または
請求項１８に記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１５日に出願された米国特許出願番号第１６／５１１，６１２号（係属中）の継続であり、米国特許出願に対する優先権を主張する。２０１９年７月１５日に出願された米国特許出願番号第１６／５１１，６１２号（係属中）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0002】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させるために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする効率を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、追加的なイオンの投与を介し細胞培養培地のイオン強度を増加させることにより、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生力価を増加させる方法に関する。

【0003】

配列表の参照
本出願は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１以下に従った一以上の配列一覧を含み、この配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：２６５０－０００２ＵＳ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ（２０１９年７月１５日作成、サイズ３８，３３４バイト））に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【背景技術】

【0004】

Ｉ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅのＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する小型の自然発生非病原性ウイルスである（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｚｉｎｎ，Ｅ．他（２０１４）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｆｉｔ Ｔｏ Ｓｅｒｖｅ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．０：９０－９７）。疾患を引き起こさないにもかかわらず、ＡＡＶはヒトおよび他の霊長類に感染し、ヒト集団で流行することが知られる（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｂ．他（１９７２）“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ Ｐｒｅｐａｒｅｄ Ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９（６）：１０１７－１０２６）。ＡＡＶは広範囲の異なる細胞型（例えば、中枢神経系、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、網膜色素上皮の細胞、または光受容細胞、または骨格筋細胞）に感染する。異なる組織感染能（「トロピズム」）を示すウイルスの１２の血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６など）が同定されている（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＮＳ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”２４：５９－６７）。

【0005】

ＡＡＶは約４，７００ヌクレオチドからなる一本鎖ＤＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、ウイルスのタンパク質をコードする遺伝子を一緒に含む５’ハーフおよび３’ハーフを有するものとして記載することができる。（図１）。ＡＡＶゲノムの５’ハーフはＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含み、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、複数のリーディングフレーム、スタガード開始プロモーター（ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０）、および選択的スプライシングを用いて、ウイルスの転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要な４つの非構造Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８、およびＲｅｐ７８）をコードする（Ｌａｃｋｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．他（２００２）“Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ｐ１９ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｙ Ｒｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１６）：８２２５－８２３５）。ＡＡＶゲノムの３’ハーフはＡＡＶキャプシド遺伝子（ｃａｐ）を含み、ＶＰ１，ＶＰ２，ＶＰ３の３つのキャプシドタンパク質（ＶＰ）をコードする。３つのキャプシドタンパク質は、単一のプロモーター（ＡＡＶ２の場合はｐ４０）によって制御される単一のｍＲＮＡ転写産物から翻訳される。ＡＡＶゲノムの３’ハーフはまた、ＡＡＰ遺伝子を含み、ＡＡＶアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。６０個のＶＰモノマー（約５コピーのＶＰ１、５コピーのＶＰ２、および５０コピーのＶＰ３を含む）がＡＡＶゲノムの周囲で自己集合し、成熟ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｋ．Ｍ．他（２００８）Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ：ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｊａｉｎ，Ｋ．Ｋ．（編集），Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４３７：５１－９１）。ＡＡＶ ＡＡＰタンパク質は、新たに産生されたＶＰタンパク質を安定化し、細胞質から細胞核へ輸送するために必要であると考えられている。ＡＡＶゲノムの３’ハーフはまた、ＡＡＶ Ｘ遺伝子を含み、ゲノム複製をサポートするタンパク質をコードすると考えられている（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃａｏ，Ｍ．他（２０１４）“Ｔｈｅ Ｘ Ｇｅｎｅ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ２（ＡＡＶ２） Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ Ｉｎ Ｖｉｒａｌ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９，ｅ１０４５９６：１－１０）。

【0006】

上述のＡＡＶ遺伝子コード配列は、１４５ヌクレオチドの二つのＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．他（２０１４）“Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（２）：８６－１００；Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４）。

【0007】

ＡＡＶは本質的に欠陥のあるウイルスであり、少なくとも２つの重要な機能を果たす能力を欠いている：すなわち、ウイルス特異的産物の合成を開始する能力と、そのような産物を集めて成熟した感染性ウイルス粒子の正二十面体のタンパク質の殻（キャプシド）を形成する能力である。したがって、ＡＡＶゲノムの遺伝子によってコードされていないウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡを提供するために、アデノウイルス（Ａｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ワクシニアウイルスまたはヒトパピローマウイルスのような、同時感染する「ヘルパー」ウイルスを必要とする。このようなＶＡ ＲＮＡは翻訳されないが、他のウイルス遺伝子の翻訳を調節する役割を果たす。同様に、ＡＡＶゲノムはＡｄのウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、およびＥ４をコードする遺伝子を含まない；したがって、これらのタンパク質は、また、同時に感染する「ヘルパー」ウイルスによって供給されなければならない。Ｅ１ａタンパク質は増殖性感染中のウイルス遺伝子転写を大きく刺激する。Ｅ１ｂタンパク質はアデノウイルス感染細胞のアポトーシスを阻止し、増殖性感染を進行させる。Ｅ２ａタンパク質は、鋳型をほどいて転写開始を促進することにより、ウイルス鎖置換複製の伸長の段階において役割を果たす。Ｅ４タンパク質は、導入遺伝子の持続性、ベクター毒性、および免疫原性に影響を及ぼすことが示されている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．他（１９９２）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ１Ａ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｋｅｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ Ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”Ｃａｎｃ．Ｓｕｒｖ．１２：１６１－１９５；Ｊｏｎｅｓ Ｎ．Ｃ．（１９９０）“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１（６）：４２５－４３５；Ｂｅｎ－Ｉｓｒａｅｌ，Ｈ．他（２００２）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１３６９－ｄ１３９５；Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．他（２０１３）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：ａ０１３００３（１－１１ページ）；Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．（２０１３）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．他編集．），Ｖｏｌ．２．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１７０４－１７３１ページ；Ｗｅｉｔｚｍａｎ，Ｍ．Ｄ．（２００５）“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｅ４ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｍｐａｃｔ Ｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：１１０６－１１１７参照のこと）。

【0008】

ＡＡＶウイルスは分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、環状エピソーム分子として存続するか、または特定の染色体座（アデノ随伴ウイルス組込み部位またはＡＡＶＳ）において宿主細胞のＤＮＡに組み込まれる。（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４）。ＡＡＶの複製と成熟に必要な機能を果たすヘルパーウイルスが存在しない限り、ＡＡＶは感染細胞内に潜伏したままである。

【0009】

ＩＩ．遺伝子治療におけるｒＡＡＶとその利用
ＡＡＶの特性に照らして、組換え改変されたバージョンのＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療用ベクターとして実質的な有用性を見出している（Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ３１：３１７－３３４；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｕｎａｎｓｗｅｒｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３；Ｂｅｒｒｙ，Ｇ．Ｅ．他（２０１６）“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：５４－６０；Ｂｌｅｓｓｉｎｇ，Ｄ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｒｅｆｉｎｅｄ Ｔｏｏｌｋｉｔ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”２１：６１－６６；Ｓａｎｔｉａｇｏ－Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ２４０：２８７－３０１；Ｓａｌｇａｎｉｋ，Ｍ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｓ Ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．３（４）：１－３２；Ｈｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．他（２０１６）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ＣＮＳ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７（７）：４７８－４９６；Ｌｙｋｋｅｎ，Ｅ．Ａ．他（２０１８）“Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ａｎｄ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ ＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐ．Ｄｉｓ．１０：１６：１－１０；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．他（１９９８）“Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃａｕｄａｔｅｓ Ｏｆ ＭＰＴＰ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｏｎｋｅｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：８２０－８２７；Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９参照のこと）。

【0010】

ｒＡＡＶは、典型的には環状プラスミド（「ｒＡＡＶプラスミドベクター」）を用いて産生される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、典型的には、そのような構築物から欠失され、プロモーター、βグロビンイントロン、選択された治療用遺伝子（導入遺伝子）が挿入されたクローニング部位、およびポリアデニル化（「ｐｏｌｙＡ」）部位で置換される。しかし、ｒＡＡＶの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は保持されるので、ｒＡＡＶプラスミドベクターの導入遺伝子発現カセットはＡＡＶ ＩＴＲ配列によって挟まれる（Ｃｏｌｅｌｌａ，Ｐ．他（２０１８）“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ＡＡＶ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：８７－１０４；Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５）。したがって、５’から３’方向に、ｒＡＡＶは、５’ＩＴＲ、ｒＡＡＶの導入遺伝子発現カセット、および３’ＩＴＲを含む。

【0011】

ｒＡＡＶは、多数の遺伝子に関する疾患（例えば、遺伝性リポ蛋白リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素欠損症（ＡＡＤＣ）、脈絡膜血症、血友病）のいずれかに罹患している患者に導入遺伝子を送達するために使用されており、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）療法およびＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９などの遺伝子改変戦略などの新しい臨床的方法において有用である（米国特許第８，６９７，３５９号，米国特許第１０，０００，７７２号，米国特許第１０，１１３，１６７号，米国特許第１０，２２７，６１１号；Ｌｉｎｏ，Ｃ．Ａ．他（２０１８）“Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ Ａｎｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，”Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２５（１）：１２３４－１２３７；Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｖ．他（２０１４）“Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｔｏ ＡＡＶ－Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｔｈｅ Ｇｌｙｂｅｒａ Ｅｘａｍｐｌｅ Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ Ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ”Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（８２）：１－１５），Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｒａｓｔａｌｌ，Ｄ．Ｐ．Ｗ．（２０１７）“Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｔｒｅａｔ Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｎｅｕｒｏｌ．１９（１２）：４５；Ｋａｙ，Ｍ．他（２０１７）“Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｆ ｒＡＡＶ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｆｏｒ ＲＮＡｉ，Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｂｅｙｏｎｄ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８：３６１－３７２）；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．他（２０１７）“ＡＡＶ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｕｎａｎｓｗｅｒｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２８（４）：３０８－３１３）。ｒＡＡＶに関与する１５０以上の臨床試験が開始されている（Ｂｕｎｉｎｇ，Ｈ．他（２０１９）“Ｃａｐｓｉｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌ．１２：Ｐ２４８－Ｐ２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｎ．他（２０１６）“Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１６００２：１－７）。このような組換え改変ＡＡＶに最も一般的に使用されるＡＡＶ血清型はＡＡＶ２であり、中枢神経系、腎臓、網膜色素上皮および光受容体細胞の細胞に感染することができる。もう１つのＡＡＶ血清型はＡＡＶ９であり、筋細胞に感染し、また広く使用される（Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１６）“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：１６－２５）。ＡＡＶ血清型は以下に記載される：米国特許第１０，３０１，６５０号；米国特許第１０，２６６，８４６号；米国特許第１０，２６５，４１７号；米国特許第１０，２１４，７８５号；米国特許第１０，２１４，５６６号；米国特許第１０，２０２，６５７号；米国特許第１０，０４６，０１６号；米国特許第９，８８４，０７１号；米国特許第９，８５６，５３９号；米国特許第９，７３７，６１８号；米国特許第９，６７７，０８９号；米国特許第９，４５８，５１７号；米国特許第９，４５７，１０３号；米国特許第９，４４１，２４４号；米国特許第９，１９３，９５６号；米国特許第８，８４６，３８９号；米国特許第８，５０７，２６７号；米国特許第７，９０６，１１１号；米国特許第７，４７９，５５４号；米国特許第７，１８６，５５２号；米国特許第７，１０５，３４５号；米国特許第６，９８４，５１７号；米国特許第６，９６２，８１５号；および，米国特許７３３，７５７号。

【0012】

ＩＩＩ．ｒＡＡＶ製造の方法
所望の導入遺伝子発現カセットを含むｒＡＡＶは、典型的には、接着または懸濁のいずれかで増殖させたヒト細胞（ＨＥＫ２９３など）によって産生される。上述したように、ｒＡＡＶは欠陥ウイルスであるため、ｒＡＡＶを複製してパッケージングするためには、さらなる機能が提供されなければならない。

【0013】

典型的には、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶプラスミドベクターおよび第２のプラスミドベクターで細胞を一過性にトランスフェクトすることによって産生され得る。第２のプラスミドベクターはＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含む。ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは、ベクター転写制御および複製に、そしてウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要なＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８遺伝子（Ｒｅｐ４０およびＲｅｐ６８やｒＡＡＶの産生には必要とされない）、ならびにｒＡＡＶを産生するためにＡＡＶから削除されたｃａｐ遺伝子を提供する。第２のプラスミドベクターは、さらに、ＡＡＶ増殖に必要なウイルス転写因子および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）をコードする非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含むことができ、それにより、ｒＡＡＶと協調して、ダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含み得る（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７４５－２７６０；Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０）。

【0014】

しかし、（必要とされるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供する）ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを「ＡＡＶヘルパープラスミド」にクローニングし、（ウイルスの転写因子と翻訳因子をコードする遺伝子を提供する）非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを異なるプラスミド（すなわち、「Ａｄヘルパープラスミド」）上にクローニングすることは、ますます一般的になってきており、そのようなプラスミドは、ｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む（図２）。トリプルプラスミドトランスフェクションシステムの使用は、１つのｃａｐ遺伝子を別のｃａｐ遺伝子に容易に切り替えることができ、それによってｒＡＡＶの血清型の変化を容易にするという利点を有する。ヘルパーウイルスではなくヘルパープラスミドを用いることにより、ヘルパーウイルスの粒子をさらに産生することなく、ｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９３８－９４５）。

【0015】

ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＡＡＶヘルパー機能ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を提供するプラスミドベクター、ならびに非ＡＡＶヘルパー機能を提供するプラスミドベクターを含むプラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム共沈によるＨＥＫ２９３細胞への一過性トランスフェクションは、研究室でｒＡＡＶを産生するための標準的な方法となっている（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．他（１９９８）“Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７４５－２７６０）。しかし、このようなリン酸カルシウムを介したトランスフェクション過程を懸濁培養されたトランスフェクトされた哺乳動物細胞で使用するには、培地交換が必要であり、したがって、治療用量のｒＡＡＶを産生するために必要とされる大規模なｒＡＡＶ産生には理想的ではないと考えられる（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。この理由ため、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が使用され、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを用いて得られたものと類似のウイルスの収率を提供することが見出されている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．他（２００７）“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２ Ｂｙ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ ２９３ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４４：３２－４０）。

【0016】

あるいは、バキュロウイルスベクター（例えば、米国特許第９，８７９，２８２号；米国特許第９，８７９，２７９号；米国特許第８，９４５，９１８号；米国特許第８，１６３，５４３号；米国特許第７，２７１，００２号；米国特許第６，７２３，５５１号を参照のこと）を用いて昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）、または、ＨＳＶ感染ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えばＢＨＫ２１）でｒＡＡＶを産生することができる（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶの産生の方法はＧｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４，ａｎｄ ｉｎ Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．他（２０１８）“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：１６６－１８０でレビューされる。

【0017】

ＩＶ．ｒＡＡＶの精製および回収方法
産生後、ｒＡＡＶは、典型的には、１回以上、オーバーナイトのＣｓＣｌ勾配遠心分離によって収集および精製され（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．他（１９９９）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｎｄ Ｙｉｅｌｄ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３－９８５）、次いで脱塩によって精製されたｒＡＡＶ産生ストックを形成する。１０^１２～１０^１３の感染性ｒＡＡＶキャプシド／ｍＬの力価が得られる。

【0018】

ｒＡＡＶ感染は細胞変性効果を引き起こさないためｒＡＡＶ製剤の感染力価を測定するために、プラークアッセイは使用できない。したがって、感染力価は典型的には組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）として測定される。この方法では、ＨｅＬａ由来ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびｃａｐ発現細胞株を９６ウェルプレート中で増殖させ、血清型５のアデノウイルスの存在下で、ｒＡＡＶ調製物の複製１０倍連続希釈液で感染させる。感染後、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によりベクターゲノム複製を決定する（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。あるいは、調製ｒＡＡＶの感染力価は、感染中枢アッセイ（ＩＣＡ）を用いて測定することができる。このアッセイは、ＨｅＬａ ｒｅｐ－ｃａｐ細胞およびＡｄを使用するが、インキュベーション後、細胞を膜に移すことを含む。使用される導入遺伝子の一部に相補的な標識プローブを用いて、ハイブリダイゼーションを介して（個々の感染細胞を表す）感染中心を検出する。より広く使用されるが、ＴＣＩＤ５０アッセイは、ＩＣＡよりも高いバックグラウンドを導き、ＩＣＡと比較してベクター感染性を過大評価することが報告されている（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）。ｒＡＡＶを産生および精製する方法は、特に米国特許第１０，２９４，４５２号；米国特許第１０，１６１，０１１号；米国特許第１０，０１７，７４６号；米国特許第９，５９８，７０３号；米国特許第７，６２５，５７０号；米国特許第７，４３９，０６５号；米国特許第７，４１９，８１７号；米国特許第７，２０８，３１５号；米国特許第６，９９５，００６号；米国特許第６，９８９，２６４号；米国特許第６，８４６，６６５号；および米国特許第６，８４１，３５７に記載される。

【0019】

上述のように、研究室でｒＡＡＶを産生するために、典型的には、複数回のオーバーナイトの塩化セシウム勾配遠心分離が用いられる。しかし、ＣｓＣｌへの長期曝露は、ｒＡＡＶプラスミドベクターの効力を損なうことが報告されている（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．他（１９９９）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｎｄ Ｙｉｅｌｄ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９７３－９８５）。さらに、このような勾配は細胞溶解物に対し制限された負荷能力を有し、したがって、精製され得るｒＡＡＶの量を制限する。等張代替勾配培地、イオジキサノールはｒＡＡＶプラスミドベクターの精製に用いられているが、イオジキサノールはｒＡＡＶ産生のためのＣｓＣｌと同じ負荷能力の欠点を共有する。

【0020】

このような勾配特異的な制約を克服するために、研究者らはイオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティー精製法、および抗体アフィニティーに基づくｒＡＡＶ精製法を開発した（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ，Ａ．他（２００１）“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｈｉｇｈｌｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎｄ Ｐｕｒｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｗｉｔｈ Ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｅｐ Ｇｒａｖｉｔｙ－Ｆｌｏｗ Ｃｏｌｕｍｎ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：７１－７６；Ｂｒｕｍｅｎｔ，Ｎ．他（２００２）“Ａ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ａｎｄ Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｗｏ－Ｓｔｅｐ Ｉｏｎ－Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ－２ Ａｎｄ －５，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：６７８－６８６；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．他（２００２）“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ １，２，Ａｎｄ ５ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７；Ｄａｖｉｄｏｆｆ，Ａ．Ｍ．他（２００４）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂｙ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｇｅｎｅｒａｔｅｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔｏｃｋ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１：２０９－２１５；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｈ．他（２００９）“Ａ Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ－ＡＡＶ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｙｉｅｌｄｓ Ｈｉｇｈ－Ｔｉｔｅｒ ｒＡＡＶ Ｓｔｏｃｋｓ Ｆｒｏｍ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：１８８８－１８９６；Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。しかし、残念ながら、そのようなクロマトグラフィーに基づく精製方法は、一般的に、十分な機能的なベクター粒子から空のキャプシドのようなベクター関連不純物を分離することはできない。このように、ＣｓＣｌ勾配遠心分離が、その欠点にもかかわらず、依然としてｒＡＡＶベクター調製物から空の粒子を除去するための最もよく特徴付けられた方法である。

【0021】

リン酸カルシウムおよびＰＥＩでトランスフェクトした培養物の両方において、様々な血清型のｒＡＡＶが、上清に放出されることが観察された（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１；米国特許第６，５６６，１１８号；米国特許第６，９８９，２６４号；米国特許出願公開第２００５／０２６６５６７号）。米国特許第６，５６６，１１８号、米国特許第６，９８９，２６４号、および米国特許出願公開第２００５／０２６６５６７号はＮａＣｌ（すなわち、５０～３２５ｍＭ ＮａＣｌ）およびその他の不特定の塩、マンニトールまたはグルコースを用いて、またはＮａ^＋またはＫ^＋などのイオン性溶質を用いて培地の導電率を少なくとも約５ｍＳに操作することによって、培地が最初に約１００ｍＯｓＭから約６５０ｍＯｓＭの浸透圧を含むように処方されていた場合、高力価の組換えＡＡＶベクターが細胞懸濁液の上清中に放出されることを開示する。初期の浸透圧は３００ｍＯｓＭ（１５０ｍＭ）ＮａＣｌが最適であることが見いだされた。Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ，Ｌ．他（２０１７）は、同様に、形質導入後増加された塩化ナトリウムが４～６時間存在する感染条件下で、産生培地中の６０～９０ｍＭ塩化ナトリウムが、ｒＡＡＶ９形質導入単位およびキャプシドタンパク質の有意な増加をもたらすことを示した。（国際公開第２０１７／１１２９４８号；Ａｄａｍｓｏｎ－Ｓｍａｌｌ，Ｌ．他（２０１７）“Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．２８（１）：１－１４）。

【0022】

Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）は、ｒＡＡＶ粒子の回収を促進するためのＰＥＩトランスフェクションに基づくおよび上清ハーベストに基づく技術を開示する（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。この方法は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型に属するｒＡＡＶが、リン酸カルシウムトランスフェクト細胞の培地に主に放出され、細胞溶解物に保持されないという観察に基づいている。このように、Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）は、このようなｒＡＡＶ血清型にとって、産生培地がより低いレベルの細胞汚染物質を有するｒＡＡＶプラスミドベクターの比較的純粋な源であり、これらの因子が、負荷能力および精製勾配の分解能を改善することを開示する。開示された方法では、ＡＡＶ２血清型に属するｒＡＡＶを含むｒＡＡＶを、リン酸カルシウムを用いてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後（または１２０時間後）、無血清培地を加え、さらに２８時間インキュベーションを続けた。次に、すべての形態のＤＮＡおよびＲＮＡを分解する遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）エンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼ（商標）（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を培養上清に加えた。２時間後、ＮａＣｌを５００ｍＭとなるよう加え、培養を再開しさらに２時間後、培地を回収した。その後、清澄化した培地をタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）により１２５倍濃縮し、ｒＡＡＶをイオジキサノール段階勾配を用いて精製した。この方法は血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９のＡＡＶに用いることができた。Ｌｏｃｋ他（２０１０）の高塩培養の使用は、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ９プラスミドベクターの、さらなる２０％の放出を培地へもたらすことを開示する（米国特許第６，５６６，１１８号および米国特許第６，９８９，２６４号、ならびに米国特許公開第２００５／０２６６５６７号の方法と比較して）、しかし、他の血清型に関してはほとんど違いを導かなかった。ｒＡＡＶ８とｒＡＡＶ９の平均総収量は高かったが（２．２×１０^１４ゲノムコピー）、他のｒＡＡＶ血清型の収量は有意に低かった（例えば、ｒＡＡＶ６については６．７×１０^１３ゲノムコピー）。産生されたｒＡＡＶの推定純度は９０％を超えたが、産生されたｒＡＡＶ８とｒＡＡＶ９の３５％と５０％は処理段階で失われ、産生されたｒＡＡＶ６の８０～８５％は処理で失われ、ｒＡＡＶ２はほとんど細胞内に保持され、培地に放出されなかった。

【0023】

塩の供給は、トランスジーン関連遺伝子発現をより容易に測定するために細胞を透過化するためにも用いられている。したがって、例えば、Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．他（１９９８）は、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍｍグルコース、２００ｍＭアスコルビン酸および２ｍＭモノ－および二塩基リン酸ナトリウムを含むｐＨ７．４に緩衝化された「放出緩衝液」を用いて、ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および芳香族アミノデカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を発現するｒＡＡＶでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からのドーパミンの放出を促進した（Ｄｕｒｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．他（１９９８）“Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｃａｕｄａｔｅｓ Ｏｆ ＭＰＴＰ－Ｔｒｅａｔｅｄ Ｍｏｎｋｅｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ａｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：８２０－８２７）。

【0024】

しかし、このような以前のすべての成功にもかかわらず、遺伝子治療へのｒＡＡＶの適用性を現在制限している問題に取り組むことができる方法を開発する必要が残っている（Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．他（２０１２）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２２９－２５４；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．他（２０１４）“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５（７）：４４５－４５１；Ｋｗｏｎ，Ｉ．他（２００７）“Ｄｅｓｉｇｎｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２５（３）：４８９－４９９；Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．他（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，”ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１：３１７－３３４）。そのような問題とは以下を含む：
（１）ｒＡＡＶの限定された組織特異的向性：このような問題の１つは、ＡＡＶおよびｒＡＡＶの限られた組織特異的向性を反映する。異なる血清型のキャプシドタンパク質（すなわち、「モザイク」キャプシド）をコードする複数のヘルパープラスミドの使用は、ｒＡＡＶによって感染され得る組織型の範囲を増加させる方法として利用されてきた（Ｈａｕｃｋ，Ｂ．他（２００３）“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：４１９－４２５；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．他（２００４）“Ｃｒｏｓｓｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｖｉｒｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｓ Ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ，”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：４４２１－４４３２；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．他（２０１５）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”２４：５９－６７）。
（２）抗ｒＡＡＶ免疫応答の普及：第２の問題は、ヒトの３０～８０％が自然にＡＡＶ感染（主にＡＡＶ２）に曝露されており、ヒトの２０～６７％が血液および他の体液中に中和抗ＡＡＶキャプシド抗体の力価を有するという事実を反映している（Ｌｉｕ，Ｑ．他（２０１４）“Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ ＡＡＶ２，ＡＡＶ５ Ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｙ Ａｎｄ ＨＩＶ－１－Ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｉｎ Ｃｈｉｎａ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：７３２－７３８；Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ｃ．他（２０１７）“Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｔｒｉａｌ Ａｆｔｅｒ Ｔｒｉａｌ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２８（１１）：１０６１－１０７４）。これらの抗体の存在は導入遺伝子発現を阻害することによりｒＡＡＶ療法の有効性を減弱させる。合成ポリマー結合体（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））は、中和抗体からｒＡＡＶを遮蔽するための手段として使用されてきた（Ｌｅ，Ｈ．Ｔ．他（２００５）“Ｕｔｉｌｉｔｙ Ｏｆ Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ １０８：１６１－１７７；Ｌｅｅ，Ｇ．Ｋ．他（２００５）“ＰＥＧ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｒａｔｅｌｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｓ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２４－３４）。代替血清型または変異非免疫原性キャプシドを有するｒＡＡＶの使用も追求されている（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｋ．他（２０１８）“Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ａｎ Ａｒｓｅｎａｌ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｅａｌｔｈ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ，”ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１４（５）：１－６）。
（３）ｒＡＡＶのパッケージング能力の限界：ｒＡＡＶのパッケージング効率は、５ｋｂを超えると有意に減少することが見出されており、より大きなゲノムは５’切断でキャプシド化される（Ｗｕ，Ｚ．他（２０１０）“Ｅｆｆｅｃｔ Ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｉｚｅ Ｏｎ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．１８：８０－８６；Ｇｈｏｓｈ，Ａ．他（２００７）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃａｐａｃｉｔｙ：Ａ Ｔａｌｅ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．２４：１６５－１７７；ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａ．（２０１７）“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｄｕａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｌａｒｇｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ，”Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９０：６１１－６２３）。
（４）大規模製造技術の限界：大規模治療に使用するのに十分な量のｒＡＡＶを製造する能力は、プロセス収率が５％未満から３０％未満の範囲であるため、この技術の成功的な適用に対する障壁となっている。（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。
これらの問題は、場合によっては相互に関連している。例えば、最終生成物中に空の粒子が存在すると、ベクターの受容者は、望ましくない免疫応答および毒性につながる可能性のあるＡＡＶ抗原の大きな供給源にさらされる。このように、パッケージング効率を高め、高い産生力価を得るための改善された方法は非常に重要である。

【0025】

本発明は、ｒＡＡＶの製造中に培地中のイオン濃度を変化させることによる、ｒＡＡＶパッケージングの効率を増加させるための改善された方法に関する。

【発明の概要】

【0026】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させるために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする効率を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、追加的なイオンの投与を介して細胞培養培地のイオン強度を増加させることによって、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生力価を増加させる方法に関する。

【0027】

より詳細には、本発明は組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法が以下の工程を含む方法を提供する。
（Ａ）初期の培養培地において、初期の期間、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、前記ｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養することであって、前記細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有する、培養すること；
（Ｂ）前記初期の期間の後、前記培養培地にＮａ^＋以外の１以上のイオンを加えることにより、前記培養培地のイオン強度を変更すること；および
（Ｃ）（Ｂ）の非存在下で得られる力価よりも大きい前記ｒＡＡＶの産生力価を産生するように、前記細胞の前記培養を継続すること、

【0028】

本発明は、さらに、加えられるイオンの各々が、初期の培養培地中のイオンの濃度を約１０ｍＭから約８０ｍＭ増加させるのに十分な量で提供される上記の方法の実施形態を提供する。

【0029】

本発明は、さらに、産生力価が、工程（Ｂ）の非存在下で同様に実施される細胞培養から得られる力価より少なくとも５０％高い、上記の方法の実施形態を提供する。

【0030】

本発明は、さらに、ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする遺伝子導入カセットを含むか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、上記の方法の実施形態を提供する。

【0031】

本発明は、さらに、ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、またはこれらの血清型のハイブリッドに属する上記の方法の実施形態を提供する。

【0032】

本発明は、さらに、ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、またはｒＡＡＶ９の血清型、またはこれらの血清型のハイブリッドに属する上記の方法の実施形態を提供する。

【0033】

本発明は、さらに、加えられるイオンが、Ｋ^＋、Ｃａ^＋＋またはＭｇ^＋＋の１つ以上を含む上記の方法の実施形態を提供する。

【0034】

本発明は、さらに、加えられるイオンが、ＣＯ_３ ^－－、ＨＣＯ_３ ^－、ＨＰＯ_４ ^－、ＰＯ_４ ^－－、ＳＣＮ^－、ＳＯ_４ ^－－、ＨＳＯ_４ ^－、およびＣｌ^－の１つ以上を含む上記の方法の実施形態を提供する。

【0035】

本発明は、さらに、加えられるイオンが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、フタル酸水素塩、酒石酸水素塩、ブトキシエトキシ酢酸塩、カプリル酸塩、クエン酸塩、デヒドロ酢酸塩、二酢酸塩、ジヒドロキシグリシナート、ｄ－サッカレート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリシナート、グリコ硫酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、乳酸塩、メチオニン酸塩、シュウ酸塩、フェネート、フェノスルホン酸塩、プロピオン酸塩、プロピオン酸塩、サッカリン、サリチル酸塩、サルコシン酸塩、ソルビン酸塩、チオグリコール酸塩、およびトルエンスルホン酸塩の１つ以上を含む上記の方法の実施形態を提供する。

【0036】

本発明は、さらに、加えられるイオンがＫ^＋およびＣＯ_３ ^－－を含む上記の方法の実施形態を提供する。

【0037】

本発明は、さらに、細胞がヒト胚性腎細胞、ベビーハムスター腎細胞、またはｓｆ９昆虫細胞である上記の方法の実施形態を提供する。

【0038】

本発明は、さらに、細胞がＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞である上記の方法の実施形態を提供する。

【0039】

本発明は、さらに、細胞がＢＨＫ２１ベビーハムスター腎細胞である上記の方法の実施形態を提供する。

【0040】

本発明は、さらに、初期の培養培地がダルベッコの改変イーグル培地または血清が補足されたダルベッコの改変イーグル培地である、上記の方法の実施形態を提供する。

【0041】

本発明は、さらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：
（Ａ）上述された、いずれかの方法によって製造された、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物であって、前記ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または、転写された核酸を含み、それは遺伝子のまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的であり、前記薬学的組成物は、有効量の前記ｒＡＡＶ調製物を含有する、調製物；および

【0042】

（Ｂ）薬学的に許容される担体。
本発明は、さらに、遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態の治療において使用するための、タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または転写された核酸を含む、上述のいずれかの方法によって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製、または上述の薬学的組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】図１は野生型（Ｗｔ）ＡＡＶゲノムの概略的な遺伝子の地図を提供する。

【図2】図２は、野生型ＡＡＶ２ゲノム（１）、組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（２）、補足する「ＡＡＶヘルパープラスミド」（３）、およびアデノウイルスヘルパープラスミド（「Ａｄヘルパープラスミド」）（４）の構造ドメインの概略図を提供する。野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）は、ＡＡＶ特異的回文逆末端反復配列（ＩＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を含む５’ハーフ、およびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含む３’ハーフからなる。ｒＡＡＶ（２）は、野生型（Ｗｔ）ＡＡＶ２（１）のＲｅｐおよびＣａｐをコードする遺伝子を、プロモーター（Ｐｒｏ）、目的の外来性導入遺伝子、およびポリアデニル化部位（ｐＡ）を含む導入遺伝子カセットで置換することによって形成される。ｒＡＡＶ（２）を産生するために、補足する「ＡＡＶヘルパー」プラスミドベクター（３）およびアデノウイルスヘルパープラスミドベクター（Ａｄヘルパープラスミド）（４）が提供される。補足するＡＡＶヘルパープラスミド（３）は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供する。Ａｄヘルパープラスミド（４）は、アデノウイルスタンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４を提供する。

【図3】図３は、ＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２の地図を示す。

【図4】図４は、非ＡＡＶヘルパープラスミドベクターｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎの地図を示す。

【図5】図５はｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの地図を示す。

【図6】図６はｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの地図を示す。

【図7A】図７Ａは、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生に対するカチオンおよびカチオン濃度の効果を示す。図７Ａは、トランスフェクトされた細胞における増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の程度、および感染中心アッセイを用いたｒＡＡＶストックの力価を示す。ストックは追加的に加えられるＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２の存在下、ダルベッコの改変イーグル培地で、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を増殖させることによって作製された。このように提供された塩の追加的な濃度は、０、２０、４０、６０、８０または１００ｍＭである。図７Ａは感染中心アッセイを示す。

【図7B】図７Ｂは、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生に対するカチオンおよびカチオン濃度の効果を示す。図７ＢはＡＡＶベクターの力価の倍率変化と塩濃度のグラフである。

【図7C】図７Ｃは、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生に対するカチオンおよびカチオン濃度の効果を示す。図７Ｃは、カチオンおよびカチオン濃度の関数としてのＡＡＶの総ゲノム（ＴＧ）における倍率変化のグラフである。図に示される濃度は、上記のような塩を加えることによって得られる培地中の濃度増加である。

【図8A】図８Ａは、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶストックの産生に対するカチオンおよびカチオン濃度の効果を示す。図８Ａは、トランスフェクトされた細胞における増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の程度、および感染中心アッセイを用いたｒＡＡＶストックの力価を示す。ストックは１２の塩を追加的に加えたダルベッコの改変イーグル培地で、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を増殖させることによって作製された。このように提供された塩の追加的な濃度は、４０、５０、６０または７０ｍＭである。図８Ａは感染中心アッセイを示す。

【図8B】図８Ｂは、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶストックの産生に対するカチオンおよびカチオン濃度の効果を示す。図８ＢはＡＡＶベクターの力価の倍率変化と塩濃度のグラフである。図は、異なる陰イオンの存在下で、追加的にそのような供給される陰イオンの濃度を変化して産生されたｒＡＡＶに対するｒＡＡＶ力価の倍率変化を示す。図に示した濃度は、このような陰イオンの添加による培地中の濃度増加である。

【図9A】図９Ａは、ＫＨＣＯ_３の供給が、他のイオンと比較して、予想外に高いｒＡＡＶの力価を引き起こしたことを示す（図９Ａ：培地中のＡＡＶ力価の倍率変化；図９Ｂ：総ゲノムの倍率変化）。図に示される濃度（４０、５０、６０または７０ｍＭ）は、上述のＫＨＣＯ_３の添加によってもたらされる培地中の濃度増加である。

【図9B】図９Ｂは、ＫＨＣＯ_３の供給が、他のイオンと比較して、予想外に高いｒＡＡＶの力価を引き起こしたことを示す（図９Ａ：培地中のＡＡＶ力価の倍率変化；図９Ｂ：総ゲノムの倍率変化）。図に示される濃度（４０、５０、６０または７０ｍＭ）は、上述のＫＨＣＯ_３の添加によってもたらされる培地中の濃度増加である。

【図10】図１０は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を提供するために、Ａｄヘルパープラスミドと、ＡＡＶ ＩＴＲを提供するプラスミドと、増強された緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子カセットと、およびＡＡＶ２ヘルパープラスミドまたはＡＡＶ８ヘルパープラスミドのいずれかを共トランスフェクトした細胞によって培地中に放出されたｒＡＡＶの総産生量およびｒＡＡＶの放出量の倍率変化を示す。トランスフェクション後２、４、６、８、および１０時間で、ＫＨＣＯ_３を加えて培地中に３０ｍＭの追加的な濃度を生じさせ、培地中に放出されたｒＡＡＶ（ＡＡＶ２－培地およびＡＡＶ８－培地）の倍率変化および細胞溶解物における総ゲノム（ＡＡＶ２－総およびＡＡＶ８－総）をトランスフェクション後７２時間に評価した。

【図11A】図１１Ａは、異なる血清型のｒＡＡＶの産生の増強に対するＫＨＣＯ_３の提供の効果を示す。図１１Ａは２４時間後に培地中に放出されたｒＡＡＶの倍率変化を示す；ＫＨＣＯ３－３０は、ＫＨＣＯ_３が培地中に３０ｍＭの追加的濃度を生じさせるために加えられたことを示す。ＫＨＣＯ３－５５は、ＫＨＣＯ_３が培地中に５５ｍＭの追加的濃度を生じさせるために加えられたことを示す。

【図11B】図１１Ｂは、異なる血清型のｒＡＡＶの産生の増強に対するＫＨＣＯ_３の提供の効果を示す。図１１ＢはｒＡＡＶの総ゲノムの倍率変化を示す；ＫＨＣＯ３－３０は、ＫＨＣＯ_３が培地中に３０ｍＭの追加的濃度を生じさせるために加えられたことを示す。ＫＨＣＯ３－５５は、ＫＨＣＯ_３が培地中に５５ｍＭの追加的濃度を生じさせるために加えられたことを示す。

【図12】図１２は、ＫＨＣＯ_３の供給に応答してｒＡＡＶのレベルを増加させる、懸濁液中で培養された細胞の能力を示す。培養液中のＫＨＣＯ_３濃度を約２０ｍＭ以上増加させるのに十分なＫＨＣＯ_３を供給すると、２０時間後のｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ６の産生が増加した。

【発明を実施するための形態】

【0044】

Ｉ．本発明の方法
本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させるために、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をパッケージングする効率を増加させる方法に関する。より具体的には、本発明は、追加的なイオンの投与を介して細胞培養培地のイオン強度を増加させることによって、トランスフェクトされた細胞によるｒＡＡＶの産生力価を増加させる方法に関する。

【0045】

本明細書での使用において、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスを示すことを意図し、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。この用語は、全ての亜型および自然発生型と組換え型の両方を含む。本明細書での使用において、用語「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶ起源でないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種性のポリヌクレオチド）を含む、ＡＡＶの組換え改変型を示すことを意図する。ｒＡＡＶは一本鎖または二本鎖であり得、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成され得る。

【0046】

本明細書での使用において、「ＡＡＶヘルパー機能」は、ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要なＡＡＶタンパク質（例えば、ＲｅｐとＣａｐ）および／またはＡＡＶのポリヌクレオチドを示す。このようなＡＡＶヘルパー機能は、「ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶヘルパープラスミド、例えばｐＡＡＶ－ＲＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ；Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＡＡＶ－ＲＣ２（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）などは商業的に入手可能である。プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２（配列番号１；図３）は、ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得るＡＡＶヘルパープラスミドである。
プラスミドｐＡＡＶ－ＲＣ２のコード鎖（配列番号１）：
ccgggccccc cctcgaggtc gacggtatcg ggggagctcg cagggtctcc
attttgaagc gggaggtttg aacgcgcagc cgccatgccg gggttttacg agattgtgat taaggtcccc agcgaccttg acgagcatct gcccggcatt tctgacagct ttgtgaactg ggtggccgag aaggaatggg agttgccgcc agattctgac atggatctga atctgattga gcaggcaccc ctgaccgtgg ccgagaagct gcagcgcgac tttctgacgg aatggcgccg tgtgagtaag gccccggagg ctcttttctt tgtgcaattt gagaagggag agagctactt ccacatgcac gtgctcgtgg aaaccaccgg ggtgaaatcc atggttttgg gacgtttcct gagtcagatt cgcgaaaaac tgattcagag aatttaccgc gggatcgagc cgactttgcc aaactggttc gcggtcacaa agaccagaaa tggcgccgga ggcgggaaca aggtggtgga tgagtgctac atccccaatt acttgctccc caaaacccag cctgagctcc agtgggcgtg gactaatatg gaacagtatt taagcgcctg tttgaatctc acggagcgta aacggttggt ggcgcagcat ctgacgcacg tgtcgcagac gcaggagcag aacaaagaga atcagaatcc caattctgat gcgccggtga tcagatcaaa aacttcagcc aggtacatgg agctggtcgg gtggctcgtg gacaagggga ttacctcgga gaagcagtgg atccaggagg accaggcctc atacatctcc ttcaatgcgg cctccaactc gcggtcccaa atcaaggctg ccttggacaa tgcgggaaag attatgagcc tgactaaaac cgcccccgac tacctggtgg gccagcagcc cgtggaggac atttccagca atcggattta taaaattttg gaactaaacg ggtacgatcc ccaatatgcg gcttccgtct ttctgggatg ggccacgaaa aagttcggca agaggaacac catctggctg tttgggcctg caactaccgg gaagaccaac atcgcggagg ccatagccca cactgtgccc ttctacgggt gcgtaaactg gaccaatgag aactttccct tcaacgactg tgtcgacaag atggtgatct ggtgggagga ggggaagatg accgccaagg tcgtggagtc ggccaaagcc attctcggag gaagcaaggt gcgcgtggac cagaaatgca agtcctcggc ccagatagac ccgactcccg tgatcgtcac ctccaacacc aacatgtgcg ccgtgattga cgggaactca acgaccttcg aacaccagca gccgttgcaa gaccggatgt tcaaatttga actcacccgc cgtctggatc atgactttgg gaaggtcacc aagcaggaag tcaaagactt tttccggtgg gcaaaggatc acgtggttga ggtggagcat gaattctacg tcaaaaaggg tggagccaag aaaagacccg cccccagtga cgcagatata agtgagccca aacgggtgcg cgagtcagtt gcgcagccat cgacgtcaga cgcggaagct tcgatcaact acgcagacag gtaccaaaac aaatgttctc gtcacgtggg catgaatctg atgctgtttc cctgcagaca atgcgagaga atgaatcaga attcaaatat ctgcttcact cacggacaga aagactgttt agagtgcttt cccgtgtcag aatctcaacc cgtttctgtc gtcaaaaagg cgtatcagaa actgtgctac attcatcata 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actttggcta cagcacccct tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccactttt caccacgtga ctggcaaaga ctcatcaaca acaactgggg attccgaccc aagagactca acttcaagct ctttaacatt caagtcaaag aggtcacgca gaatgacggt acgacgacga ttgccaataa ccttaccagc acggttcagg tgtttactga ctcggagtac cagctcccgt acgtcctcgg ctcggcgcat caaggatgcc tcccgccgtt cccagcagac gtcttcatgg tgccacagta tggatacctc accctgaaca acgggagtca ggcagtagga cgctcttcat tttactgcct ggagtacttt ccttctcaga tgctgcgtac cggaaacaac tttaccttca gctacacttt tgaggacgtt cctttccaca gcagctacgc tcacagccag agtctggacc gtctcatgaa tcctctcatc gaccagtacc tgtattactt gagcagaaca aacactccaa gtggaaccac cacgcagtca aggcttcagt tttctcaggc cggagcgagt gacattcggg accagtctag gaactggctt cctggaccct gttaccgcca gcagcgagta tcaaagacat ctgcggataa caacaacagt gaatactcgt ggactggagc taccaagtac cacctcaatg gcagagactc tctggtgaat ccgggcccgg ccatggcaag ccacaaggac gatgaagaaa agttttttcc tcagagcggg gttctcatct ttgggaagca aggctcagag aaaacaaatg tggacattga aaaggtcatg attacagacg aagaggaaat caggacaacc aatcccgtgg ctacggagca gtatggttct gtatctacca acctccagag aggcaacaga caagcagcta ccgcagatgt caacacacaa ggcgttcttc caggcatggt ctggcaggac agagatgtgt accttcaggg gcccatctgg gcaaagattc cacacacgga cggacatttt cacccctctc ccctcatggg tggattcgga cttaaacacc ctcctccaca gattctcatc aagaacaccc cggtacctgc gaatccttcg accaccttca gtgcggcaaa gtttgcttcc ttcatcacac agtactccac gggacaggtc agcgtggaga tcgagtggga gctgcagaag gaaaacagca aacgctggaa tcccgaaatt cagtacactt ccaactacaa caagtctgtt aatgtggact ttactgtgga cactaatggc gtgtattcag agcctcgccc cattggcacc agatacctga ctcgtaatct gtaattgctt gttaatcaat aaaccgttta attcgtttca gttgaacttt ggtctctgcg tatttctttc ttatctagtt tccatgctct aggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattcgg ctttgtagtt aatgattaac ccgccatgct acttatctac gtagccatgc tctagaggtc ctgtattaga ggtcacgtga gtgttttgcg acattttgcg acaccatgtg gtcacgctgg gtatttaagc ccgagtgagc acgcagggtc tccattttga agcgggaggt ttgaacgcgc agccgccaag ccgaattctg cagatatcca aacactggcg gccgctcgac tagagcggcc gccaccgcgg tggagctcca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 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acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggta

【0047】

配列番号１において、ｐＡＡＶ－ＲＣ２の８５－１９５０残基はＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８をコードし（４８４－６６３残基はＰ１９プロモーターに相当、１４６４－１６４３残基はＰ４０プロモーターに相当、１６６８－１６７６残基はドナー部位）；１９６７－４１７４残基はキャプシドタンパク質ＶＰ１をコードし；１９９２－２０１６残基はＲｅｐ６８の部分をコードし；４１７５－４２５６残基はポリＡ配列をコードし；４６１０－４６２６残基はＭ１３Ｒｅｖ配列であり；４６３４－４６５０残基はＬａｃオペレーター配列であり、；４６５８－４６８８はＬａｃプロモーター配列であり；４９５１－５６７５残基はｐＭＢ ｏｒｉ配列に相当し、５７７１－６６３１残基はアンピシリン耐性決定因子をコードし；そして、６６３２－６７３０残基はｂｌａプロモーター配列である（図３）。

【0048】

本明細書での使用において、「非ＡＡＶヘルパー機能」との用語は、ｒＡＶＶの複製およびパッケージングに必要なＡｄ、ＣＭＶ、ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルス（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡ ａｎｄ Ｅ４）のタンパク質、および／またはＡｄ、ＣＭＶ、ＨＳＶまたは他の非ＡＡＤウイルスのポリヌクレオチドを意味する。これらの非ＡＡＶヘルパー機能は「非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチド」によって提供され、この用語は、本明細書での使用において、非ＡＡＶヘルパー機能を提供する、ウイルス、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、または細胞染色体に組み込まれたポリヌクレオチドである。ベクター、ｐＨｅｌｐｅｒおよびそれらの誘導体（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に利用可能である）は、適切な非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである（例えばＭａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｔ．他（１９９８）“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｃａｎ Ｂｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：９３８－９４５；Ｓｈａｒｍａ，Ａ．他（２０１０）“Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｏｆ ＡＡＶ２／６，２／８ Ａｎｄ ２／９ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｎｅａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．８１（２－３）：２７３－２７８を参照のこと）。ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎプラスミド（配列番号２；図４）は非ＡＡＶヘルパー機能を提供するために本発明に従って使用され得る非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドである。
プラスミドｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎのコード鎖（配列番号２）：
ggtacccaac tccatgctta acagtcccca ggtacagccc accctgcgtc gcaaccagga acagctctac agcttcctgg agcgccactc gccctacttc cgcagccaca gtgcgcagat taggagcgcc acttcttttt gtcacttgaa aaacatgtaa aaataatgta ctaggagaca ctttcaataa aggcaaatgt ttttatttgt acactctcgg gtgattattt accccccacc cttgccgtct gcgccgttta aaaatcaaag gggttctgcc gcgcatcgct atgcgccact ggcagggaca cgttgcgata ctggtgttta gtgctccact taaactcagg cacaaccatc cgcggcagct cggtgaagtt ttcactccac aggctgcgca ccatcaccaa cgcgtttagc aggtcgggcg ccgatatctt gaagtcgcag ttggggcctc cgccctgcgc gcgcgagttg cgatacacag ggttgcagca ctggaacact atcagcgccg ggtggtgcac gctggccagc acgctcttgt cggagatcag atccgcgtcc aggtcctccg cgttgctcag ggcgaacgga gtcaactttg gtagctgcct tcccaaaaag ggtgcatgcc caggctttga gttgcactcg caccgtagtg gcatcagaag gtgaccgtgc ccggtctggg cgttaggata cagcgcctgc atgaaagcct tgatctgctt aaaagccacc tgagcctttg cgccttcaga gaagaacatg ccgcaagact tgccggaaaa ctgattggcc ggacaggccg cgtcatgcac gcagcacctt gcgtcggtgt tggagatctg caccacattt cggccccacc ggttcttcac gatcttggcc ttgctagact gctccttcag cgcgcgctgc ccgttttcgc tcgtcacatc catttcaatc acgtgctcct tatttatcat aatgctcccg tgtagacact taagctcgcc ttcgatctca gcgcagcggt gcagccacaa cgcgcagccc gtgggctcgt ggtgcttgta ggttacctct gcaaacgact gcaggtacgc ctgcaggaat cgccccatca tcgtcacaaa ggtcttgttg ctggtgaagg tcagctgcaa cccgcggtgc tcctcgttta gccaggtctt gcatacggcc gccagagctt ccacttggtc aggcagtagc ttgaagtttg cctttagatc gttatccacg tggtacttgt ccatcaacgc gcgcgcagcc tccatgccct tctcccacgc agacacgatc ggcaggctca gcgggtttat caccgtgctt tcactttccg cttcactgga ctcttccttt tcctcttgcg tccgcatacc ccgcgccact gggtcgtctt cattcagccg ccgcaccgtg cgcttacctc ccttgccgtg cttgattagc accggtgggt tgctgaaacc caccatttgt agcgccacat cttctctttc ttcctcgctg tccacgatca cctctgggga tggcgggcgc tcgggcttgg gagaggggcg cttctttttc tttttggacg caatggccaa atccgccgtc gaggtcgatg gccgcgggct gggtgtgcgc ggcaccagcg catcttgtga cgagtcttct tcgtcctcgg actcgagacg ccgcctcagc cgcttttttg ggggcgcgcg gggaggcggc ggcgacggcg acggggacga cacgtcctcc atggttggtg gacgtcgcgc cgcaccgcgt ccgcgctcgg gggtggtttc 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gcagcaacag cagcggtcac acagaagcaa aggcgaccgg atagcaagac tctgacaaag cccaagaaat ccacagcggc ggcagcagca ggaggaggag cgctgcgtct ggcgcccaac gaacccgtat cgacccgcga gcttagaaat aggatttttc ccactctgta tgctatattt caacaaagca ggggccaaga acaagagctg aaaataaaaa acaggtctct gcgctccctc acccgcagct gcctgtatca caaaagcgaa gatcagcttc ggcgcacgct ggaagacgcg gaggctctct tcagcaaata ctgcgcgctg actcttaagg actagtttcg cgccctttct caaatttaag cgcgaaaact acgtcatctc cagcggccac acccggcgcc agcacctgtc gtcagcgcca ttatgagcaa ggaaattccc acgccctaca tgtggagtta ccagccacaa atgggacttg cggctggagc tgcccaagac tactcaaccc gaataaacta catgagcgcg ggaccccaca tgatatcccg ggtcaacgga atccgcgccc accgaaaccg aattctcctc gaacaggcgg ctattaccac cacacctcgt aataacctta atccccgtag ttggcccgct gccctggtgt accaggaaag tcccgctccc accactgtgg tacttcccag agacgcccag gccgaagttc agatgactaa ctcaggggcg cagcttgcgg gcggctttcg tcacagggtg cggtcgcccg ggcgttttag ggcggagtaa cttgcatgta ttgggaattg tagttttttt aaaatgggaa gtgacgtatc gtgggaaaac ggaagtgaag atttgaggaa gttgtgggtt ttttggcttt cgtttctggg cgtaggttcg cgtgcggttt tctgggtgtt ttttgtggac tttaaccgtt acgtcatttt ttagtcctat atatactcgc tctgtacttg gcccttttta cactgtgact gattgagctg gtgccgtgtc gagtggtgtt ttttaatagg tttttttact ggtaaggctg actgttatgg ctgccgctgt ggaagcgctg tatgttgttc tggagcggga gggtgctatt ttgcctaggc aggagggttt ttcaggtgtt tatgtgtttt tctctcctat taattttgtt atacctccta tgggggctgt aatgttgtct ctacgcctgc gggtatgtat tcccccgggc tatttcggtc gctttttagc actgaccgat gttaaccaac ctgatgtgtt taccgagtct tacattatga ctccggacat gaccgaggaa ctgtcggtgg tgctttttaa tcacggtgac cagttttttt acggtcacgc cggcatggcc gtagtccgtc ttatgcttat aagggttgtt tttcctgttg taagacaggc ttctaatgtt taaatgtttt tttttttgtt attttatttt gtgtttaatg caggaacccg cagacatgtt tgagagaaaa atggtgtctt tttctgtggt ggttccggaa cttacctgcc tttatctgca tgagcatgac tacgatgtgc ttgctttttt gcgcgaggct ttgcctgatt ttttgagcag caccttgcat tttatatcgc cgcccatgca acaagcttac ataggggcta cgctggttag catagctccg agtatgcgtg tcataatcag tgtgggttct tttgtcatgg ttcctggcgg ggaagtggcc gcgctggtcc gtgcagacct gcacgattat gttcagctgg ccctgcgaag ggacctacgg gatcgcggta tttttgttaa tgttccgctt ttgaatctta tacaggtctg tgaggaacct gaatttttgc aatcatgatt cgctgcttga ggctgaaggt ggagggcgct ctggagcaga tttttacaat ggccggactt aatattcggg atttgcttag agacatattg ataaggtggc gagatgaaaa ttatttgggc atggttgaag gtgctggaat gtttatagag gagattcacc ctgaagggtt tagcctttac gtccacttgg acgtgagggc agtttgcctt ttggaagcca ttgtgcaaca tcttacaaat gccattatct gttctttggc tgtagagttt gaccacgcca ccggagggga gcgcgttcac ttaatagatc ttcattttga ggttttggat aatcttttgg aataaaaaaa aaaaaacatg gttcttccag ctcttcccgc tcctcccgtg tgtgactcgc agaacgaatg tgtaggttgg ctgggtgtgg cttattctgc ggtggtggat gttatcaggg cagcggcgca tgaaggagtt tacatagaac ccgaagccag ggggcgcctg gatgctttga gagagtggat atactacaac tactacacag agcgagctaa gcgacgagac cggagacgca gatctgtttg tcacgcccgc acctggtttt gcttcaggaa atatgactac gtccggcgtt ccatttggca tgacactacg accaacacga tctcggttgt ctcggcgcac tccgtacagt agggatcgcc tacctccttt tgagacagag acccgcgcta ccatactgga ggatcatccg ctgctgcccg aatgtaacac tttgacaatg cacaacgtga 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ggccagccgg ggagaaagga ctgtgtactc tgtgtgttgg gagggaggtg gcaggttgaa tactagggtt ctgtgagttt gattaaggta cggtgatcaa tataagctat gtggtggtgg ggctatacta ctgaatgaaa aatgacttga aattttctgc aattgaaaaa taaacacgtt gaaacataac atgcaacagg ttcacgattc tttattcctg ggcaatgtag gagaaggtgt aagagttggt agcaaaagtt tcagtggtgt attttccact ttcccaggac catgtaaaag acatagagta agtgcttacc tcgctagttt ctgtggattc actagaatcg atgtaggatg ttgcccctcc tgacgcggta ggagaagggg agggtgccct gcatgtctgc cgctgctctt gctcttgccg ctgctgagga ggggggcgca tctgccgcag caccggatgc atctgggaaa agcaaaaaag gggctcgtcc ctgtttccgg aggaatttgc aagcggggtc ttgcatgacg gggaggcaaa cccccgttcg ccgcagtccg gccggcccga gactcgaacc gggggtcctg cgactcaacc cttggaaaat aaccctccgg ctacagggag cgagccactt aatgctttcg ctttccagcc taaccgctta cgccgcgcgc ggccagtggc caaaaaagct agcgcagcag ccgccgcgcc tggaaggaag ccaaaaggag cgctcccccg ttgtctgacg tcgcacacct gggttcgaca cgcgggcggt aaccgcatgg atcacggcgg acggccggat ccggggttcg aaccccggtc gtccgccatg atacccttgc gaatttatcc accagaccac ggaagagtgc ccgcttacag gctctccttt tgcacggtct agagcgtcaa cgactgcgca cgcctcaccg gccagagcgt cccgaccatg gagcactttt tgccgctgcg caacatctgg aaccgcgtcc gcgactttcc gcgcgcctcc accaccgccg ccggcatcac ctggatgtcc aggtacatct acggattacg tcgacgttta aaccatatga tcagctcact
caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gtcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagtaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gatggatcc

【0049】

配列番号２において、ｐＨｅｌｐｅｒ－Ｋａｎの１－５３４３残基はアデノウイルスに由来しＥ２Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド（２５８－１８４７残基）を含み；５３４４－８５３５残基はアデノウイルスに由来し、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み；９４２３－１００１１残基はｏｒｉ配列に相当し；１０１８２－１０９７６残基はｂｌａプロモーター配列によって発現されるカナマイシン耐性決定因子（１０９７７－１１０８１残基）をコードし；１１１０７－１１５６１残基はｆ１ ｏｒｉ配列に相当する（図４）。

【0050】

上記で議論されたように、ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドと非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドは典型的にはｒＡＡＶプラスミドベクターと協働して使用され、トリプルトランスフェクションシステムを含む。複数の商業的に利用可能なｒＡＡＶプラスミドベクター（例えばｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ、ｐＧＯＩなど（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））は、本発明に従って使用され得る。本発明に従って使用され得る例示的なｒＡＡＶプラスミドベクターは、５’ＩＴＲ、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーター配列、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド（Ｇａｍｂｏｔｔｏ，Ａ．他（２０００）“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｏｆ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）Ｉｎ ＢＡＬＢ／Ｃ Ｍｉｃｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｎ Ｈ２－Ｋｄ－Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ Ｅｐｉｔｏｐｅ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（２３）：２０３６－２０４０；Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）“Ｔｈｅ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：５０９－５４４；Ｃｉｎｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．他（２０００）“Ｔｈｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓ Ａ Ｔｏｏｌ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ａｎｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ：Ｌｏｃａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｔｕｄｙ Ａｔ Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｌｅｖｅｌ，”Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．７１（６）：７７１－７７６；Ｃｈｏｐｒａ Ａ．（２００８）“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｉｎ：ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＡＮＤ ＣＯＮＴＲＡＳＴ ＡＧＥＮＴ ＤＡＴＡＢＡＳＥ（ＭＩＣＡＤ），Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）、発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲ．を含むｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（配列番号３；図５）である。
プラスミドｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのコード鎖（配列番号３）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg ccctccagtg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggttcctgc ggccgcacgc gtctagttat taatagtaat cgaattcgtg ttactcataa ctagtaaggt cgggcaggaa gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttgggtt tatatatctt gtggaaagga cgcgggatcc actggaccag gcagcagcgt cagaagactt ttttggaaaa gcttgactag taatactgta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttgcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagagatc cggtaccgag gagatctgcc gccgcgatcg ccggcgcgcc agatctcacg cttaactagc tagcggaccg acgcgtacgc ggccgctcga gatggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta agtcgaggat tataaggatg acgacgataa attcgtcgag caccaccacc accaccacta ataaggttta tccgatccac cggatctaga taagatatcc gatccaccgg atctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcggtaac cacgtgcgga ccgagcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc aggggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatac gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacctgccag cgccttagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt

【0051】

配列番号３において、ｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの１－１２８残基は５’ＩＴＲに相当し；２０１－４４１残基はＵ６プロモーター配列であり、５６２－８６５残基はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー配列、８６６－１０６８残基はＣＭＶ前初期プロモーター配列を含み；１１９２－１９１１残基はＥＧＦＰをコードする哺乳動物コドン最適化ポリヌクレオチドを含み；１９１８－１９４１残基はＦＬＡＧタグをコードし；１９５１－１９６８残基は６×Ｈｉｓタグをコードし、２１３９－２２６０残基はＳＶ４０ポリ（Ａ）配列をコードし、２２９３－２４３３残基は３’ＩＴＲに相当し；２５０８－２２９６３残基はＦ１ ｏｒｉ配列に相当し；３３５０－４２１０残基はｂｌａプロモーター配列（３２４５－３３４９残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３３５０－３４１８残基）をコードし；４３８１－４９６９残基はｏｒｉ配列に相当する（図５）。

【0052】

本発明に従って使用され得る第二の例示的なプラスミドベクターは５’ＩＴＲ、甲状腺ホルモン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチド、発現タンパク質の回収および局在を容易化するＦＬＡＧタグおよび６×Ｈｉｓタグ部位、ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位および３’ＩＴＲを含むｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰ（配列番号４；図６）である。
ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰプラスミドのコード鎖（配列番号４）：
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct gcggccggtc gcgtctagta ctagtaggtt aatttttaaa aagcagtcaa aagtccaagt ggcccttggc agcatttact ctctctgttt gctctggtta ataatctcag gagcacaaac attccagatc caggttaatt tttaaaaagc agtcaaaagt ccaagtggcc cttggcagca tttactctct ctgtttgctc tggttaataa tctcaggagc acaaacattc cagatccggc gcgccagggc tggaagctac ctttgacatc atttcctctg cgaatgcatg tataatttct acagaaccta ttagaaagga tcacccagcc tctgcttttg tacaactttc ccttaaaaaa ctgccaattc cactgctgtt tggcccaata gtgagaactt tttcctgctg cctcttggtg cttttgccta tggcccctat tctgcctgct gaagacactc ttgccagcat ggacttaaac ccctccagct ctgacaatcc tctttctctt ttgttttaca tgaagggtct ggcagccaaa gcaatcactc aaagttcaaa ccttatcatt ttttgctttg ttcctcttgg ccttggtttt gtacatcagc tttgaaaata ccatcccagg gttaatgctg gggttaattt ataactaaga gtgctctagt tttgcaatac aggacatgct ataaaaatgg aaagatgttg ctttctgaga gacaggtacc gaggagatct gccgccgcga tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacttacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtagac gcgtacgcgg ccgctcgagg attataagga tgacgacgat aaattcgtcg agcaccacca ccaccaccac taataaggtt tatccgatcc accggatcta gataagatat ccgatccacc ggatctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct taacgcggta accacgtgcg gacccaacgg ccgcaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcacat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacctgcc agcgccttag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ctctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg tctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt

【0053】

配列番号４において、ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰの１－１３０残基は５’ＩＴＲに相当し；１５０－８５４残基は、ＴＢＧを含む４１５－８２４残基と共にＴＢＧプロモーター配列であり；８８６－１６０８残基はＥＧＦＰをコードし；１６３０－１６５３残基はＦＬＡＧタグをコードし；１６６３－１６８０残基は６×Ｈｉｓタグをコードし；１８５１－１９７２残基はポリ（Ａ）配列をコードし；２００５－２１４５残基は３’ＩＴＲに相当し；２２２０－２６７５残基はＦ１ ｏｒｉ配列に相当し；３０６２－３９２２残基はｂｌａプロモーター配列（２９５７－３０６１残基）によって発現されるアンピシリン耐性決定因子とそのシグナル配列（３０６２－３１３０残基）をコードし；４０９３－４６８１残基はｏｒｉ配列に相当する（図６）。

【0054】

本明細書での使用において、用語「産生力価」は調製物中の感染性ｒＡＡＶの濃度の量を示すことを意図する。このような量または濃度は、好ましくは、このような調製物中のＡＡＶまたはｒＡＡＶを力価化（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）することによって決定される。本発明のｒＡＡＶ調製物の産生力価は、好ましくは、産生細胞（例えば、ｒＡＡＶプラスミドベクター、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するＡＡＶヘルパーベクター、および必要なアデノウイルス転写および翻訳因子を提供するＡｄヘルパーベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３）を３回凍結／解凍した後、超音波処理してｒＡＡＶ粒子の放出に供した後、力価化される。次いで、調製物は遠心分離される。使用されるＡＡＶベクターは上清に局在する。調製物のアリコートはプロテイナーゼＫで処理され、ＡＡＶゲノムの数が決定される。調製物のアリコートを（ＡＡＶ２ ＲｅｐおよびＣａｐを発現する）ＨｅＬａ－３２Ｃ２細胞に感染させ、感染力価は感染中心アッセイ（ＩＣＡ）（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ａ．他（２０１８）“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ＡＡＶ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ Ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ，”Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：２２３－２３６）を用いて、またはより好ましくは、組織培養感染用量の中央値（ＴＣＩＤ５０）として測定される（Ｚｅｎ，Ｚ．他（２００４）“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｗｉｔｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｅｖｅｎｔｓ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７０９－７１５）。

【0055】

本明細書中において、本発明の方法の使用から得られた産生力価が、追加的に提供されたイオンが提供されずに同様に実施された産生から得られた力価より、少なくとも１０％大きい、より好ましくは少なくとも２０％大きい、さらに好ましくは少なくとも３０％大きい、より好ましくは少なくとも４０％大きい、より好ましくは少なくとも５０％大きい、より好ましくは少なくとも６０％大きい、より好ましくは少なくとも７０％大きい、より好ましくは少なくとも８０％大きい、より好ましくは少なくとも９０％大きい、より好ましくは少なくとも２倍大きい、より好ましくは少なくとも１１０％大きい、より好ましくは少なくとも１２０％大きい、より好ましくは少なくとも１３０％大きい、より好ましくは少なくとも１４０％大きい、より好ましくは少なくとも２．５倍大きい、より好ましくは少なくとも１６０％大きい、より好ましくは少なくとも１７０％大きい、より好ましくは少なくとも１８０％大きい、より好ましくは少なくとも１９０％大きい、より好ましくは少なくとも３倍大きければ、ｒＡＡＶ産生力価が、本発明の方法によって「増加した（された）」と言われる。

【0056】

本発明の方法を用いて産生力価を増加させることができるｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド粒子内にカプセル化され得るｒＡＡＶプラスミドベクターにｒＡＡＶがパッケージングされることを可能にする任意の導入遺伝子カセットを含むことができる。限定されるものではないが、このような導入遺伝子カセットは、ヒト、霊長類（チンパンジー、テナガザル、ゴリラ、オランウータンなどを含む）、セルコピテクシン（ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ）（ヒヒ、カニクイザル、ビロードサルなどを含む）、イヌ、グリリン（ｇｌｉｒｉｎｅ）（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなどを含む）、ネコ、ヒツジ、ヤギ、またはウマ起源であってもよい。

【0057】

好ましい実施形態において、そのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターは、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードするか、または遺伝的もしくは遺伝的疾患もしくは状態に関連する転写された核酸を含み、その結果、そのような疾患もしくは状態を治療するための遺伝子治療において使用され得る。

【0058】

本発明の方法は、所望のｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクター、ならびにそのようなｒＡＡＶまたはｒＡＡＶプラスミドベクターによって提供されないタンパク質またはＲＮＡ分子を提供することができる、１以上のウイルスおよび／またはヘルパープラスミドでトランスフェクトされた細胞において、ｒＡＡＶおよびｒＡＡＶプラスミドベクターの産生力価を増加させるために使用することができる。上述のように、このようなタンパク質またはＲＮＡ分子には、ベクターの転写制御および複製、ならびにウイルスゲノムのウイルスカプセルへのパッケージングに必要なＲｅｐ５２およびＲｅｐ７８タンパク質をコードする遺伝子、およびｒＡＡＶの場合には、感染性粒子の形成に必要なＶＰキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子が含まれる。このようなタンパク質またはＲＮＡ分子には、ＡＡＶの増殖に必要なウイルス転写因子および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）も含まれる。本発明のｒＡＡＶを産生するための、本発明の一実施形態において、これらの遺伝子およびＲＮＡ分子の全ては、ｒＡＡＶと協働してダブルプラスミドトランスフェクションシステムを含むように、同一のヘルパーウイルス（より好ましくは、ヘルパーベクター）上に提供される。しかし、より好ましくは、本発明のｒＡＡＶを産生するために、必要なｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドによって提供され、ウイルス転写および翻訳因子をコードする遺伝子は、第２のプラスミド上に提供され、そのようなプラスミドは、ｒＡＡＶと協働して、トリプルプラスミドトランスフェクションシステムを含む。

【0059】

本発明の方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０血清型ならびにｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９およびｒＡＡＶ１０血清型を含み、ハイブリッド血清型（例えば、ＡＡＶ２／５およびｒＡＡＶ２／５は、血清型２および５のハイブリッドであり、したがって、このような血清型の両方のトロフィズム（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）を有する）を含む、いずれかの血清型に属するｒＡＡＶの産生力価を増加させるために使用することができる。

【0060】

本発明の方法は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルスまたはパピローマウイルスによって提供される「ヘルパー」ＲＮＡまたはタンパク質を用いて産生されるｒＡＡＶの産生力価を増強するために使用することができる。

【0061】

本発明の方法は、接着単層培養または懸濁培養において細胞によって産生されるｒＡＡＶの産生力価を増強するために使用することができ、ｒＡＡＶを産生することができる任意の方法とともに使用することができる。しかし、ｒＡＡＶは、好ましくは、組織培養で成長させたベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、またはより好ましくは、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を上述されたプラスミドベクターでトランスフェクトすることによって産生される。内因性レトロウイルスを欠くＢＨＫ細胞株ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）は、好ましいＢＨＫ細胞株である。ＨＥＫ細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６：ＳＶ４０Ｔ抗原に対する温度感受性遺伝子が挿入されたＨＥＫ２９３細胞株の高度にトランスフェクト可能な誘導体）またはＨＥＫ２９３Ｔ／１７（トランスフェクションの容易さのために選択されたＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１１２６８）のような、その誘導体が特に好ましい。ＨＥＫ２９３Ｔ／１７ＳＦ細胞株（ＡＴＣＣ ＡＣＳ－４５００）は、無血清培地および懸濁液に適合した２９３Ｔ／１７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）の誘導体であり、希望によって用いることができる。

【0062】

このような細胞を培養するための本発明の好ましい基本培地は、イーグル最小必須培地（ＡＴＣＣカタログＮｏ．３０－２００３）またはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。ウシ胎児血清（例えばＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を１０％の最終濃度まで加えて完全増殖培地が作製される。イーグル最小必須培地およびダルベッコの改変イーグル培地は、様々な無機塩に加えて、アミノ酸、ビタミン、および必要に応じてグルコースを含有する複合培地である。このような塩の濃度は起源によって若干異なるが、ダルベッコの改変イーグル培地（例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的入手可能）はさらにおよそ表１に示されている無機塩を含む。ダルベッコの改変イーグル培地は、オリジナルのイーグル最小必須培地の約４倍のビタミンとアミノ酸を含み、２～４倍のグルコースを含むという点で培地は異なる。追加的に、それはｐＨ表示用に硫酸第二鉄の形態の鉄とフェノールレッドを含有する（Ｙａｏ，Ｔ他（２０１７）“Ａｎｉｍａｌ－Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ：Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ａｎｄ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｓｓｕｅｓ，”Ｒｅｐｒｏｄｕｃ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１６（２）：９９－１１７）。

【表1】

【0063】

このようなトランスフェクションに使用される細胞は、好ましくは、指数増殖期に維持するために週２回継代される。小規模トランスフェクションについては、例えば、マルチウェルプレート上のウェル当たり１×１０^６ ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞、または１５ｃｍディッシュ当たり１．５×１０^７ ＨＥＫ２９３細胞のアリコートを使用することができる。大規模産生のために、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞は、複数のコンフルエントな１５ｃｍプレートから収集され、１リットルの完全な培養培地を含有する２つの１０層細胞スタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に分割され得る。一実施形態において、そのような細胞は、トランスフェクション前にそのような培地中で４日間増殖される。トランスフェクションの前日に、２つの細胞スタックをトリプシン処理し、細胞（例えば、約６×１０^８細胞）を２００ｍｌの培地中に再懸濁させてもよい。好ましくは、細胞をトランスフェクション前に２４時間付着させる。細胞スタックの集密性は、顕微鏡ステージ上に細胞スタックを収容するために、位相コントラストハードウェアが除去された、ダイアポット（Ｄｉａｐｈｏｔ）倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてモニターすることができる。

【0064】

本明細書で使用される用語「イオン強度」は、溶液中のイオンの濃度を示すことを意図される。本発明は、ｒＡＡＶトランスフェクト細胞を培養するために使用される培地に追加的なイオンを提供することによって、培地のイオン強度を増加させることによって、ｒＡＡＶ産生力価を増強する。
一実施形態においては、提供されるイオンはカチオンである。適当なカチオンには、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^＋＋、およびＭｇ^＋＋を含む。このようなカチオンは、無機塩または有機分子の塩として提供することができる。別の実施形態では、提供されるイオンはアニオンである。適当なアニオンは、以下のような無機アニオンを含む：ＣＯ_３ ^－－、ＨＣＯ_３ ^－、ＨＰＯ_４ ^－、ＰＯ_４ ^－－、ＳＣＮ^－（チオシアナート）、ＳＯ４^－－、ＨＳＯ４^－、およびＣ^－、および有機イオン、例えば：酢酸塩（ＣＨ_３ＣＯＯ^－）、アスパラギン酸塩、フタル酸水素塩、酒石酸水素塩、ブトキシエトキシ酢酸塩、カプリル酸塩、クエン酸塩（Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７ ^－－－）、デヒドロ酢酸塩、二酢酸塩、ジヒドロキシグリシナート、ｄ－サッカレート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリシナート、グリコ硫酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、乳酸塩、メチオニン酸塩、シュウ酸塩、フェネート、フェノスルホン酸塩、プロピオン酸塩、プロピオン酸塩、サッカリン、サリチル酸塩、サルコシン酸塩、ソルビン酸塩、チオグリコール酸塩、およびトルエンスルホン酸塩。

【0065】

そのような陽イオンまたは陰イオンは、そのような追加的に提供された陽イオンなしで同じ培地中で産生される力価を超えてｒＡＡＶ産生力価を増加するのに十分な任意の濃度で提供され得る。そのような陽イオンまたは陰イオンの適切な濃度は、そのような添加の前に、そのような培地中に存在する、そのようなイオンの任意の濃度に加えて、培養培地中のそのようなイオンの初期濃度を約３０ｍＭから約８０ｍＭ、約４０ｍＭから約８０ｍＭ、約５０ｍＭから約８０ｍＭ、約６０ｍＭから約８０ｍＭ、約７０ｍＭから約８０ｍＭ、または約８０ｍＭ増加させるのに十分な濃度を含む。もし、そのような培地が最初に投与されるべきイオンを含まなかった場合、そのような加えられるイオンは、好ましくは、そのような培地中に約３０ｍＭから約８０ｍＭ、約４０ｍＭから約８０ｍＭ、約５０ｍＭから約８０ｍＭ、約６０ｍＭから約８０ｍＭ、約７０ｍＭから約８０ｍＭ、または約８０ｍＭの、イオンの濃度を提供するのに十分な量で提供される。

【0066】

最初の培地に加えられるイオンまたは塩は、産生されるｒＡＡＶの回収前にいつでも加えることができる。好ましくは、そのようなイオンまたは塩は、培養開始後、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２２時間、または少なくとも約２４時間で加えられる。

【0067】

本明細書中での使用において、用語「約」は、濃度、量、または時間に関して使用される場合、そのような濃度、およびそのような濃度の±４０％以内、より好ましくはそのような濃度の±３０％以内、さらにより好ましくはそのような濃度の±２０％以内、さらにより好ましくはそのような濃度の±１０％以内、さらにより好ましくはそのような濃度の±５％以内である濃度の範囲を示すことが意図される。つまり、例えば、記載された１０．０ｍＭの濃度は、１０．０ｍＭの濃度、ならびに６～１４ｍＭの濃度、より好ましくは７～１３ｍＭの濃度、さらにより好ましくは８～１２ｍＭの濃度、さらにより好ましくは９～１１ｍＭの濃度、さらにより好ましくは９．５～１０．５ｍＭの濃度を示す。

【0068】

つまり、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地は約５．３７ｍＭの初期Ｋ^＋濃度を有するので、そのようなカチオンの濃度を約３０ｍＭ増加させるのに十分な追加的なＫ^＋を供給すると、培地は約３５．４ｍＭのＮａ^＋濃度を有することになる。同様に、ダルベッコの改変イーグル培地は、約４４．０４ｍＭの初期ＨＣＯ_３ ^-濃度を有するので、そのようなカチオンの濃度を約３０ｍＭ増加させるのに十分な追加的なＨＣＯ_３ ^-の供給は、培養培地に約７４．０４ｍＭのＨＣＯ_３ ^-濃度を生じさせる。

【0069】

すなわち、特に本発明は、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法が以下の工程を含む方法を提供する。
（Ａ）培養培地において、初期の期間、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、そのようなｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞を培養すること；
（Ｂ）前記初期の期間の後、培地に１以上のイオン、好ましくはＮａ^＋以外の１以上のイオンを、培養培地中のそのようなイオンの濃度を約３０ｍＭから約８０ｍＭ増加させるのに十分な量、加えることにより、培地のイオン強度を変更すること；
（Ｃ）（Ｂ）の非存在下で得られる力価よりも大きい前記ｒＡＡＶの産生力価を産生するように、前記細胞の前記培養を継続すること。

【0070】

本発明は、特に、ｒＡＡＶ産生力価を高めるためのＫＨＣＯ_３の使用を意図している。このようなＫＨＣＯ_３は、好ましくは、培地中のＫ^＋およびＨＣＯ_３ ^-の濃度を約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭ増加させるのに十分な量で提供される。このような添加は、ダルベッコ改変イーグル培地中のＫ^＋濃度を約２５ｍＭ、約３５ｍＭ、約４５ｍＭ、または約５５ｍＭとし、このような培地中のＨＣＯ_３ ^-濃度を約６４ｍＭ、約７４ｍＭ、約８４ｍＭ、または約９４ｍＭとする。もし、そのような培地がＫ^＋およびＨＣＯ_３ ^-イオンを含まない場合、そのようなＫＨＣＯ_３は、好ましくは、そのような培地中のＫ^＋およびＨＣＯ_３ ^-の濃度を約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約４０ｍＭとするのに十分な量で提供される。

【0071】

ＩＩ．本発明の薬学的組成物
本発明は、さらに、本発明の方法に従って製造されたｒＡＡＶの薬学的に許容される調製物、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的組成物を含む。そのような薬学的組成物のｒＡＡＶは、タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを含むか、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態を治療する、そのような薬学的組成物中に有効な量（「有効量」）で存在する。

【0072】

用語「薬学的に許容される」は、連邦政府または州政府の規制機関あるいは米国薬局方（ＵＳ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）または他の一般に認められた薬局方にリストされた規制機関によって、動物、特にヒトにおける使用が承認されたことを意味する。用語「担体」は、それと共に治療薬が投与される、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント）、賦形剤、または賦形剤を指す。そのような医薬担体は、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物または合成起源のものを含む、水および油のような滅菌液体であり得る。薬学的組成物を静脈内投与する場合、水は好ましい担体である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。適切な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、所望すれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態をとることができる。適切な薬学的形剤は、米国特許第８，８５２，６０７号；米国特許第８，１９２，９７５号；米国特許第６，７６４，８４５；米国特許第６，７５９，０５０号および米国特許第７，５９８，０７０号に記載される。

【0073】

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば、乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、または活性剤の量を示すバイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器中の水溶液として、単位投与形態で別々に、または一緒に混合されて供給される。この組成物を注入によって投与する場合には、無菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて投与することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射または生理食塩水のための滅菌水のアンプル、または他の希釈剤を提供して、成分を投与前に混合することができる。

【0074】

本発明はまた、このような薬学的組成物の１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器には、適宜、薬品または生物由来製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定める様式による通知を関連付けることができる。その通知とは、人の投与のための、製造、使用または販売の機関による承認を反映するものである。

【0075】

このような薬学的組成物のｒＡＡＶは、好ましくは、バイアル、アンプルまたはサシェットのような密封容器内に包装され、分子の量を示し、任意に使用指示書を含む。一実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として密閉容器内に供給され、対象への投与のための適切な濃度まで、例えば、水、生理食塩水または他の希釈剤で再構成することができる。凍結乾燥物は、元の容器で２～８°Ｃで保存され、再構成された後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または溶解後１時間以内に投与される。別の実施形態では、このようなキットのｒＡＡＶは、密閉容器内の水溶液として供給され、例えば、水、生理食塩水、または他の希釈剤で、被験体への投与のための適切な濃度に希釈され得る。キットは、１つ以上の容器中に、疾患または状態の治療に有用な１つ以上の他の予防および／または治療剤をさらに含むことができる；および／またはキットは、癌に関連する１以上の癌抗原に結合する１以上の細胞傷害性抗体をさらに含むことができる。ある態様において、他の予防または治療剤は化学療法剤である。他の態様において、予防剤または治療剤は、生物学的またはホルモン治療剤である。

【0076】

ＩＩＩ．本発明の使用
本発明の方法は、ｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、特に、タンパク質（例えば、酵素、ホルモン、抗体、受容体、リガンドなど）をコードする導入遺伝子カセットを含むｒＡＡＶの産生を容易にするために使用することができ、または転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態を治療し、そのような疾患または状態を治療するための遺伝子治療において使用することができる。そのような疾患および状態の例には、色盲（ＡＣＨＭ）、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症；アルツハイマー病；芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）欠損症；脈絡膜血症（ＣＨＭ）；癌；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ジスフェルリン欠損症；ホリスタチン遺伝子欠損症（ＢＭＤＳＩＢＭ）；血友病Ａ；血友病Ｂ；Ａ型肝炎；Ｂ型肝炎；Ｃ型肝炎；ハンチントン病；特発性パーキンソン病；乳児後期神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ、バッテン病の乳児型）；レーベル先天性黒内障（ＬＣＡ）；レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｂ（ＬＧＭＤ１Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー１Ｃ（ＬＧＭＤ１Ｃ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ａ（ＬＧＭＤ２Ａ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（ＬＧＭＤ２Ｂ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｉ（ＬＧＭＤ２Ｉ）；肢帯型筋ジストロフィー２Ｌ（ＬＧＭＤ２Ｌ）；リポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）欠損症；異染性白質ジストロフィー；神経学的障害；神経運動障害；神経骨格障害；パーキンソン病；関節リウマチ；サンフィリッポＡ症候群；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）；Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）；αサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｄ）；βサルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｅ）；γ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｃ）およびδ－サルコグリカン欠損症（ＬＧＭＤ２Ｆ）。

【0077】

ＩＶ．本発明の実施形態
本発明は組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法、そのような方法から産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ヘルパーベクター、その使用および組成物に関する。特に以下の実施形態Ｅ１～Ｅ１９に向けられる。
Ｅ１．組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生力価を増加させる方法であって、該方法が以下の工程を含む方法：
（Ａ）初期の培養培地において、初期の期間、ｒＡＡＶの産生を可能にするのに十分な条件下で、前記ｒＡＡＶでトランスフェクトされた細胞の培養することであって、前記細胞はさらにＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドおよび非ＡＡＶヘルパー機能提供ポリヌクレオチドを含有する、培養すること；
（Ｂ）前記初期の期間の後、前記培養培地にＮａ^＋以外の１以上のイオンを加えることにより、前記培養培地のイオン強度を変更すること；および
（Ｃ）（Ｂ）の非存在下で得られる力価よりも大きい前記ｒＡＡＶの産生力価を産生するように、前記細胞の前記培養を継続すること。
Ｅ２．前記加えられるイオンの各々が、前記初期の培養培地中の前記イオンの濃度を約１０ｍＭから約８０ｍＭ増加させるのに十分な量で提供される、Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．産生力価が、工程（Ｂ）の非存在下で同様に実施される細胞培養から得られる力価より少なくとも５０％高い、Ｅ１またはＥ２のいずれかの方法。
Ｅ４．ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを含み、または、転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的である、Ｅ１からＥ３のいずれかの方法。
Ｅ５．ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９またはｒＡＡＶ１０の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、Ｅ１からＥ４のいずれかの方法。
Ｅ６．ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、またはｒＡＡＶ９の血清型、または前記血清型のハイブリッドに属する、Ｅ５に記載の方法。
Ｅ７．加えられるイオンが、Ｋ^＋、Ｃａ^＋＋またはＭｇ^＋＋の１つ以上を含む、Ｅ１からＥ６のいずれかの方法。
Ｅ８．加えられるイオンが、ＣＯ_３ ^－－、ＨＣＯ_３ ^－、ＨＰＯ_４ ^－、ＰＯ_４ ^－－、ＳＣＮ^－、ＳＯ_４ ^－－、ＨＳＯ_４ ^－、およびＣｌ^－の１つ以上を含む、Ｅ１からＥ７のいずれか１項に記載の方法。
Ｅ９．加えられるイオンが、酢酸塩、アスパラギン酸塩、フタル酸水素塩、酒石酸水素塩、ブトキシエトキシ酢酸塩、カプリル酸塩、クエン酸塩、デヒドロ酢酸塩、二酢酸塩、ジヒドロキシグリシナート、ｄ－サッカレート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリシナート、グリコ硫酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、乳酸塩、メチオニン酸塩、シュウ酸塩、フェネート、フェノスルホン酸塩、プロピオン酸塩、プロピオン酸塩、サッカリン、サリチル酸塩、サルコシン酸塩、ソルビン酸塩、チオグリコール酸塩、およびトルエンスルホン酸塩の１つ以上を含む、Ｅ１からＥ７のいずれかの方法。
Ｅ１０．加えられるイオンがＫ^＋およびＣＯ_３ ^－－を含む、Ｅ１からＥ８のいずれかの方法。
Ｅ１１．細胞がヒト胚性腎細胞である、Ｅ１からＥ１０のいずれかの方法。
Ｅ１２．細胞がＨＥＫ２９３細胞である、Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１３．細胞が、ベビーハムスター腎細胞である、Ｅ１からＥ１０のいずれかの方法。
Ｅ１４．細胞がＢＨＫ２１細胞である、Ｅ１３の方法。
Ｅ１５．細胞がｓｆ９昆虫細胞である、Ｅ１からＥ１０のいずれかの方法。
Ｅ１６．初期の培養培地がダルベッコの改変イーグル培地である、Ｅ１からＥ１５のいずれかの方法。
Ｅ１７．初期の培養培地に血清が補足される、Ｅ１６の方法。
Ｅ１８．以下を含む薬学的組成物：
（Ａ）Ｅ１からＥ１７のいずれか１項に記載の方法によって製造された、組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物、ただし、前記ｒＡＡＶが、タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または、転写された核酸を含み、それは遺伝子に関するまたは遺伝性の疾患または状態に対して治療的であり、また、前記薬学的組成物は、有効量の前記ｒＡＡＶ調製物を含有する；および
（Ｂ）薬学的に許容される担体。
Ｅ１９．遺伝子または遺伝性の疾患または状態の治療において使用するための、タンパク質をコードする導入遺伝子カセット、または転写された核酸、を含む、Ｅ１からＥ１７のいずれかの方法によって産生される組換え改変アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の調製物、またはＥ１８の薬学的組成物。

【実施例】

【0078】

本発明を一般的に説明した後、以下の実施例を参照することにより、同じことがより容易に理解されるであろう。これらの実施例は、例示として提供され、特定されない限り、本発明を限定することを意図しない。

【0079】

実施例１
ｒＡＡＶ産生に及ぼすカチオンおよびカチオン濃度の効果
ＡＡＶ産生に対する陽イオンおよび陽イオン濃度の効果は培養ＨＥＫ２９３細胞を用いて示された。培地を変え、１時間後、細胞を以下でトランスフェクトした：
（１）ｒＡＡＶの複製およびパッケージングに必要なＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を発現することができるプラスミドベクターｐＡＡＶ－ＲＣ２；
（２）ＡＡＶ増殖に必要なウイルス転写および翻訳因子（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４）を提供することができるプラスミドベクターｐＨｅｌｐｅｒ；
（３）増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする導入遺伝子カセットおよびＡＡＶ ＩＴＲを含むｒＡＡＶプラスミドベクターｐＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ。

【0080】

このようなトランスフェクションの５時間後、塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２またはＭｇＣｌ_２のいずれか）を最終濃度０、２０、４０、６０、８０または１００ｍＭに提供した。図７Ａは、トランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰの発現の程度および感染中心アッセイを用いたｒＡＡＶ株の力価を示す。図７Ｂは、このような陽イオンおよび陽イオン濃度の関数としての感染中心における倍率変化のグラフである。図７Ｃは、このようなカチオンおよびカチオン濃度の関数としてのＡＡＶの総ゲノム（ＴＧ）における倍率変化のグラフである。結果は、カチオンの供給は産生された総ゲノム（ＴＧ）に影響し、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２の供給はＡＡＶゲノム複製およびＡＡＶ産生を増加させたことを示す。ＮａＣｌおよびＫＣｌの供給は、総ゲノムの最高力価およびＡＡＶ産生の最大増加を引き起こすことが見出され、培地中のそのようなイオンの濃度を約４０ｍＭから約８０ｍＭの範囲だけ増加させるのに十分であるＮａＣｌおよびＫＣｌ濃度で、見られる最大増加を伴った。より高濃度のカチオンの供給はＥＧＦＰ発現を阻害することが分かった（ＮａＣｌ≧１８０ｍＭ；ＫＣｌ≧１００ｍＭ；ＭｇＣｌ_２≧６０ｍＭ）。

【0081】

実施例２
ｒＡＡＶ産生に及ぼすアニオンおよびアニオン濃度の効果
ＡＡＶ産生に対するアニオンおよびアニオン濃度の効果は、また培養ＨＥＫ２９３細胞を用いて示された。実施例１と同様に、培地を変え、１時間後に、細胞はＡｄヘルパープラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミド、およびＡＡＶ ＩＴＲおよび増強された緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを提供するｐＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドベクターでトランスフェクトされた。このようなトランスフェクションの５時間後、塩（Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＣＨ_３ＣＯＯ（酢酸カリウム）、ＫＣＮＳ、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＮＯ_３、Ｋ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７（クエン酸カリウム）またはＫＣＬのいずれか）は、培地中のこのようなイオンの濃度を４０、５０、６０または７０ｍＭ増加させるのに十分な量提供された。ｒＡＡＶ感染中心の倍率変化を７２時間後に測定した。ＫＨＣＯ_３の供給は、総ゲノムの最高力価およびＡＡＶ産生の最大増加を引き起こすことが見出され、培地中のそのようなイオンの濃度を約４０ｍＭから約５０ｍＭの範囲だけ増加させるのに十分である濃度で最大増加を伴った（図８Ａ）。図８Ｂは、このようなアニオンおよびアニオン濃度の関数としてのｒＡＡＶベクターの力価の倍率変化のグラフである。結果は、陰イオンの供給が産生された全ゲノム（ＴＧ）に影響することを示す。高濃度イオン（＞６０ｍＭ）の供給はｒＡＡＶ産生を減弱することが分かった。結果は、培地中のそのようなイオンの濃度を約３０ｍＭから約５０ｍＭの範囲だけ増加させるのに十分な量のＫＨＣＯ_３の供給が、他の塩で得られたものよりも予想外に良好な結果を提供することを示す（図９Ａから図９Ｂ）。約３０ｍＭの濃度増加が最適と考えられた。

【0082】

実施例３
ｒＡＡＶ産生に及ぼすＫＨＣＯ_３の供給の時間の効果
トランスフェクション後の異なる時間にＫＨＣＯ_３を供給することによって引き起こされる効果もまた調査された。ＨＥＫ２９３細胞を培養し、以下で共トランスフェクトされた：（１）上記Ａｄヘルパープラスミド、（２）ＡＡＶ ＩＴＲおよび増強された緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを提供するｐＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドベクター、および（３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を提供するためのＡＡＶ２ヘルパープラスミドまたはＡＡＶ８ヘルパープラスミド。共トランスフェクションの１時間前に培地は交換された。トランスフェクション後２、４、６、８、および１０時間に、ＫＨＣＯ_３を、培地中のそのようなイオンの濃度を３０ｍＭ濃度増加させるのに十分な量加え、培地中に放出されたｒＡＡＶの倍率変化を７２時間で評価した。ｒＡＡＶの総産生量の変化もまた評価された（図１０）。結果は、塩がトランスフェクションの４～８時間後に加えられたときに最大の増強が見られたことを示す。

【0083】

実施例４
ｒＡＡＶ産生に対する血清型の影響
上述のように、ｒＡＡＶの産生を増強する以前の方法は、ＡＡＶ２血清型を有するｒＡＡＶについては成功しなかった（Ｌｏｃｋ，Ｍ．他（２０１０）“Ｒａｐｉｄ，Ｓｉｍｐｌｅ，ａｎｄ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｔ Ｓｃａｌｅ，”Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１：１２５９－１２７１）。異なる血清型のｒＡＡＶの産生を増強するＫＨＣＯ_３添加の能力を評価するために、血清型１、２、５、６、７、８、９または１０のＣａｐタンパク質をコードするＡＡＶ２ヘルパープラスミドを、上述のＡｄヘルパープラスミドおよびＡＡＶ ＩＴＲおよび増強された緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを提供するｐＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドベクター（ｐＡＶ－ＴＢＧ－ＥＧＦＰ）と共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、ＫＨＣＯ_３を最終濃度３０ｍＭとなるよう加え、培地に放出されたｒＡＡＶの倍率変化が７２時間に評価された。この研究の結果は、図１１Ａから１１Ｂに示され、イオンの添加、特にＫＨＣＯ_３の添加は、ｒＡＡＶ２血清型を含む、試験した全ての血清型のｒＡＡＶの産生力価を有意に増加させたことを示す。

【0084】

実施例５
大規模ｒＡＡＶ産生へのイオン供給の効果
イオンの供給が大規模調製物におけるｒＡＡＶの産生を増強することを実証するために、緑色蛍光蛋白質または他の外因性分子をコードする導入遺伝子カセットを有する血清型１、５、６および９のｒＡＡＶを、５つの１５ｃｍディッシュ中の総濃度３０ｍＭ ＫＨＣＯ_３の存在下または非存在下で大規模に産生した。ＡＡＶ力価は精製後に得られた。結果は表２に示される（ｐＤＮＡ＿００１ドナー構築物、ＰｉＢＦＸＮｃｏ３およびＰｉＢＦＸＮｃｏ１１は対照ベクターである）。

【表2】

【0085】

表２に示すように、イオンの供給、特にＫＨＣＯ_３の供給は、ｒＡＡＶ産生を１．２倍から４．６倍の増加であり、平均で約３倍の増加の結果であった。

【0086】

実施例６
懸濁液中で増殖させた細胞によるｒＡＡＶの産生に対するイオン供給の影響
イオンの供給が懸濁液中で増殖させた細胞によるｒＡＡＶの産生を増強することを実証するために、ＨＥＫ２９３細胞を以下で共トランスフェクトした：（１）上記Ａｄヘルパープラスミド、（２）ＡＡＶ ＩＴＲおよび増強された緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子カセットを提供するｐＡＡＶ－ＩＴＲプラスミドベクター、および（３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子機能を提供するためのＡＡＶ５ヘルパープラスミドまたはＡＡＶ６ヘルパープラスミド。ＫＨＣＯ_３を、トランスフェクション後５時間または２０時間で培養培地中のそのようなイオンの濃度を１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＭ増加させるのに十分な量加えた。作製したｒＡＡＶの全ゲノムをトランスフェクション後７２時間で測定した。産生されたｒＡＡＶの総ゲノムはトランスフェクション後７２時間に決定された。懸濁細胞を１２０ｒｐｍの撹拌速度で３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で培養した。懸濁液中で培養された細胞の、イオンの供給に応答して増強されたレベルのｒＡＡＶを産生する能力を図８に示す。図１２に示すように、最終濃度が約２０ｍＭを超えるイオンを供給は、ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ６の産生を増強した。

【0087】

本明細書に記載されているすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許出願がその全体が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、それは更なる修正が可能であることが理解されるであろうし、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った、本開示からの逸脱を含む、本発明が関係する技術分野における公知のまたは慣習的な実施の範囲内で、かつ、先に述べた本質的特徴に適用され得る、本開示からの任意の変形、用途または適合をカバーすることを意図している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【国際調査報告】