ホーム > 特許ランキング > Ｉｎｂｉｏｓｅ Ｎ．Ｖ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-22
(54)【発明の名称】宿主細胞におけるフコシルラクトースの産生
(51)【国際特許分類】
C12P 19/18 20060101AFI20220914BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220914BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220914BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220914BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220914BHJP
C12N 5/14 20060101ALI20220914BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220914BHJP
【ＦＩ】
C12P19/18 ZNA
C12P21/02 C
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/14
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503521
(86)(22)【出願日】2020-07-16
(85)【翻訳文提出日】2022-01-18
(86)【国際出願番号】 EP2020070209
(87)【国際公開番号】W WO2021013708
(87)【国際公開日】2021-01-28
(31)【優先権主張番号】19187404.9
(32)【優先日】2019-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519232574
【氏名又は名称】インバイオス エン．フェー．
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｂｉｏｓｅ Ｎ．Ｖ．
【住所又は居所原語表記】Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ８２，ｂｕｓ ４１，９０５２ Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ボープレ， ユーリ
(72)【発明者】
【氏名】ラノー， ナウシカー
(72)【発明者】
【氏名】ファンデワル， クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ベルコーテレン， アナリス
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AF04
4B064AG01
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA42
(57)【要約】
本発明は、合成生物学および代謝工学の技術分野に属する。より具体的には、本発明は、代謝が操作された宿主細胞の発酵の技術分野に属する。本発明は、遺伝子改変された細胞を用いる発酵によってフコシルラクトースを産生する方法、および該方法において使用される遺伝子改変された細胞について記載する。遺伝子改変された細胞は、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には細胞は、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列および膜タンパク質を発現する少なくとも１つの核酸、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にする膜タンパク質を発現する核酸配列を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、グアノシン－ジホスフェートフコース（ＧＤＰ－フコース）のドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが前記各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と前記各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していないか、またはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
前記膜タンパク質が、ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【請求項4】
前記ポーターが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgで定義される、ＴＣＤＢクラスの２．Ａ．１．１、２．Ａ．１．１２、２．Ａ．１．１５、２．Ａ．１．２、２．Ａ．１．３、２．Ａ．１．３６、２．Ａ．１．３８、２．Ａ．１．４６、２．Ａ．１．６８、２．Ａ．１．７、２．Ａ．１．８１、２．Ａ．１２３、２．Ａ．２、２．Ａ．２１、２．Ａ．５８、２．Ａ．６．３、２．Ａ．６６および２．Ａ．７．１の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの３．Ａ．１．１、３．Ａ．１．２、３．Ａ．１．１０、３．Ａ．１．１１および３．Ａ．１．５の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記βバレル型ポリンが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの１．Ｂ．３．１および１．Ｂ．１８から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記補助輸送タンパク質が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの８．Ａ．３から選択される、具体的な請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記推定輸送タンパク質が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの９．Ｂ．１４および９．Ｂ．１５８の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの４．Ａ．１．１および４．Ａ．４．１の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ポーターが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺＳ、０５Ｃ０Ｒ、０５Ｃ２Ｃ、０５ＣＴ４、０５ＣＸＰ、０５ＣＺＱ、０５Ｄ９４、０５ＤＸＩ、０５Ｅ５Ｍ、０５Ｅ５Ｗ、０５Ｅ８Ｇ、０５ＥＡＭ、０５ＥＤＲ、０５ＥＧＺ、０５Ｆ９Ｎ、０５ＪＨＥ、０５ＰＳＶ、０５Ｗ２Ｙ、０５Ｗ３Ｈ、０５ＸＪ５、０７０Ｑ９、０７ＣＷＣ、０７ＱＦ７、０７ＱＮＫ、０７ＲＢＪ、０７ＲＪ１、０７Ｔ５Ｅ、０７ＶＱ３、０８１４Ｃ、０８８ＱＴ、０８Ｈ１５、０８Ｎ８Ａ、０８ＳＣ４、０８Ｚ４Ｑの群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺ１、０５ＣＪ１、０５ＥＹ８、０５ＨＡＣ、０５ＤＭＫ、０５ＤＦＷ、０５ＭＦＶ、０７ＦＫＫ、０７Ｒ５Ｕ、０７Ｖ１Ｔ、０８ＩＪ９、０８ＪＱ７、１７２Ｔ７の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記βバレル型ポリンが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＤＡＹ、０８ＫＤＤの群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記補助輸送タンパク質が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０７ＳＹＲの群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記推定輸送タンパク質が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＲＥ、０５ＧＷＦ、０６Ｎ３Ａの群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＩ１および０５ＶＩ０の群から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ポーターが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０００８３、ＰＦ００４７４、ＰＦ００８７３、ＰＦ００８９３、ＰＦ０１８９５、ＰＦ０１９４３、ＰＦ０２６９０、ＰＦ０３０８３、ＰＦ０４１９３、ＰＦ０５９７７、ＰＦ０７６９０、ＰＦ０７６９０、ＰＦ１３３４７、ＰＦ１３４４０およびＰＦ１４６６７から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ００００５、ＰＦ００５３２、ＰＦ００６６４、ＰＦ０１０６１、ＰＦ０８３５２、ＰＦ１４５２４、ＰＦ１３４０７、ＰＦ１３４１６およびＰＦ１７９１２から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記βバレル型ポリンが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０２２６４、ＰＦ０２５６３、ＰＦ１０５３１およびＰＦ１８４１２から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記補助輸送タンパク質が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ１３８０７およびＰＦ０２７０６から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記推定輸送タンパク質が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０１５７８、ＰＦ０３９３２、ＰＦ０５１４０およびＰＦ１１０４５から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ００３６７、ＰＦ００３５８、ＰＦ０２３７８、ＰＦ０３８２９から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ポーターが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００３９０、ＩＰＲ００１０３６、ＩＰＲ００１４１１、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１９２７、ＩＰＲ００２７９７、ＩＰＲ００３６６３、ＩＰＲ００３８４１、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００４６３３、ＩＰＲ００４６３８、ＩＰＲ００４７３４、ＩＰＲ００４８１２、ＩＰＲ００５２７５、ＩＰＲ００５８２８、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ０１０２９０、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３００８、ＩＰＲ０２３７２１、ＩＰＲ０２３７２２、ＩＰＲ０２６０２２、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２７４６３、ＩＰＲ０２９３０３、ＩＰＲ０３２８９６、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３８０７８、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９６７２から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００４１２、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１７６１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００５９７８、ＩＰＲ００５９８１、ＩＰＲ００６０５９、ＩＰＲ００６０６０、ＩＰＲ００６０６１、ＩＰＲ００８９９５、ＩＰＲ０１１５２７、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０１３４５６、ＩＰＲ０１３５２５、ＩＰＲ０１３５６３、ＩＰＲ０１５８５１、ＩＰＲ０１５８５５、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２５９９７、ＩＰＲ０２６２６６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２８０８２、ＩＰＲ０２９４３９、ＩＰＲ０３３８９３、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３６６４０、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９４２１およびＩＰＲ０４０５８２から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記βバレル型ポリンが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３１９２、ＩＰＲ００３７１５、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２３７３８、ＩＰＲ０３６９９８およびＩＰＲ０４０７１６から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記補助輸送タンパク質が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３８５６、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３２８０７およびＩＰＲ０３６２５９から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記推定輸送タンパク質が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００２５４１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００５６２７、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ００７８１６、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０２０３６８、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３６４８、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３６２５９およびＩＰＲ０３６８２２から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００１１２７、ＩＰＲ００１９９６、ＩＰＲ００３３５２、ＩＰＲ００４７１６、ＩＰＲ０１０９７４、ＩＰＲ０１１０５５、ＩＰＲ０１３０１３、ＩＰＲ０１８１１３、ＩＰＲ０１８４５４、ＩＰＲ０３６６６５およびＩＰＲ０３６８７８から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号４０を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）、または配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＤＳＭ ２５３２９のｗｚｘ様タンパク質、または上記ポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号０２、０６、４０、４２、５８、６６、６４もしくは６２を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２３３２膜タンパク質もしくはｗｚｘ様膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質が、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のｌｍｒＡ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ膜タンパク質、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉまたは配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、または配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、あるいは上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログまたは機能性断片、あるいはそれぞれ、配列番号２８、７０、７４、６８、７２、７６、８２、８４、２０６、２０８、２１４、２１６、または２１８を含む前記ｌｍｒＡ、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦまたはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記βバレル型ポリンが、配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記補助輸送タンパク質が、配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記推定輸送タンパク質が、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１もしくは配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、または前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号９０、９２、９４もしくは９６を含む前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記推定輸送タンパク質が、配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、・ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
・ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ポーター膜タンパク質である配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターである配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、
配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびβバレル型ポリン膜タンパク質である配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、または前記ＷｚａもしくはｌａｍＢタンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および補助輸送タンパク質である配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；推定輸送タンパク質である配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびリン酸基転移駆動性基輸送体である配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる膜タンパク質の群から選択される、ステップを含む、方法。
【請求項38】
前記膜タンパク質が、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である、前記請求項のいずれか一項に記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
【請求項39】
ｉ）好ましくは連続的に、反応体積が２５０ｍＬ～１０．０００ｍ３の範囲である初期の反応器体積１リットル当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、前記培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の前記培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
前記培養培地の前記最終体積において、少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす、前記請求項のいずれか一項に記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
【請求項40】
前記ラクトースフィードが、培養の開始から、少なくとも５ｍＭの濃度、好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０ｍＭの濃度、より好ましくは３００ｍＭを超える濃度のラクトースを添加することによって達成される、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ラクトースフィードが、前記培養培地に、培養の生産段階を通して、少なくとも５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭまたは３０ｍＭのラクトース濃度が得られるような濃度で、ラクトースを添加することによって達成される、請求項３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
宿主細胞が、少なくとも約６０、８０、１００、もしくは約１２０時間または連続的に培養される、請求項３９、４０または４１のいずれかに記載の方法。
【請求項43】
炭素およびエネルギー供給源、好ましくはスクロース、グルコース、フルクトース、グリセロール、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、ポリオール、デンプン、スクシネート、マレエート、ピルベート、ラクテート、エタノール、シトレート、ラクトースも、好ましくは連続的に前記培養培地に、好ましくはラクトースと共に添加される、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
指数関数的細胞成長の第１段階が、第２段階に前記ラクトースが前記培養培地に添加される前に、炭素ベースの基質、好ましくはグルコースまたはスクロースを前記培養培地に添加することによって提供される、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
フコシルラクトースの混合物を生産する、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび／またはジフコシルラクトースである、請求項１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記遺伝子改変された細胞が、微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳類である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質はＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、宿主細胞。
【請求項50】
前記膜タンパク質が、ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、請求項４９に記載の宿主細胞。
【請求項51】
フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、宿主細胞。
【請求項52】
前記膜タンパク質が、請求項４から３８のいずれか一項において定義される膜タンパク質の群から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項53】
ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載のフコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞。
【請求項54】
前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項55】
前記推定輸送タンパク質が、配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項56】
前記βバレル型ポリンが、配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、または前記ＷｚａもしくはｌａｍＢタンパク質のいずれか１つに対する機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項57】
前記補助輸送タンパク質が、配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項58】
前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項59】
前記膜タンパク質が、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項60】
培地中で安定的に培養される、請求項４９から５９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項61】
微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳動物である、請求項４９から６０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項62】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、請求項６１に記載の宿主細胞。
【請求項63】
少なくとも部分的に不活性化され、単糖、二糖またはオリゴ糖が、フコシルラクトースの合成に関与するおよび／または必要とされる、選択された前記単糖、二糖またはオリゴ糖に関する異化経路を含む、請求項４９から６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項64】
前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたはジフコシルラクトースである、請求項４９から６３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項65】
フコシルラクトースの産生のための方法であって、ａ）請求項４９から６４のいずれか一項に記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）前記フコシルラクトースを前記培養から分離するステップと
を含む、方法。
【請求項66】
フコシルラクトースの発酵産生において、フコシルラクトース輸送のための、請求項１から３８のいずれか一項において定義される膜タンパク質の群から選択される膜タンパク質の使用。
【請求項67】
フコシルラクトースの産生のための、請求項４９から６４のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項68】
前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたはジフコシルラクトースである、請求項６７に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、合成生物学および代謝工学の技術分野に属する。より具体的には、本発明は、代謝が操作された宿主細胞の発酵の技術分野に属する。本発明は、遺伝子改変された細胞を用いる発酵によってフコシルラクトースを産生する方法、および該方法において使用される遺伝子改変された細胞について記載する。遺伝子改変された細胞は、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には細胞は、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列および膜タンパク質を発現する少なくとも１つの核酸、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にする膜タンパク質を発現する核酸配列を含む。
本発明は、合成生物学および代謝工学の技術分野に属する。より具体的には、本発明は、代謝が操作された宿主細胞の発酵の技術分野に属する。本発明は、遺伝子改変された細胞を用いる発酵によってフコシルラクトースを産生する方法、および該方法において使用される遺伝子改変された細胞について記載する。遺伝子改変された細胞は、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には細胞は、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列および膜タンパク質を発現する少なくとも１つの核酸、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にする膜タンパク質を発現する核酸配列を含む。
【背景技術】
【0002】
背景
今日、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ：Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のファミリーに属する８０個を超える化合物が、構造的に特徴付けられている。これらのＨＭＯは、プレバイオティクスとして機能する複雑なオリゴ糖のクラスである。加えて、ＨＭＯの上皮エピトープに対する構造相同性は、細菌性病原体に対する保護特性の原因となっている。乳児消化管内で、ＨＭＯは、選択された細菌株の増殖を選択的に育成し、したがって、母乳栄養乳児において独特な腸微生物叢の発達を刺激する。
今日、ヒト母乳オリゴ糖（ＨＭＯ：Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のファミリーに属する８０個を超える化合物が、構造的に特徴付けられている。これらのＨＭＯは、プレバイオティクスとして機能する複雑なオリゴ糖のクラスである。加えて、ＨＭＯの上皮エピトープに対する構造相同性は、細菌性病原体に対する保護特性の原因となっている。乳児消化管内で、ＨＭＯは、選択された細菌株の増殖を選択的に育成し、したがって、母乳栄養乳児において独特な腸微生物叢の発達を刺激する。
【0003】
これらのヒト母乳オリゴ糖の一部は、特定の生物活性を示す可能性が高い特定のフコシル化構造の存在を必要とする。これらのフコシル化オリゴ糖の産生は、フコシルトランスフェラーゼの作用を必要とする。そのようなフコシルトランスフェラーゼは、グリコシルトランスフェラーゼの酵素ファミリーに属し、脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌、酵母および細菌において広く発現される。それらは、フコース残基の、ドナー、一般的にグアノシン二リン酸フコース（ＧＤＰ－フコース）から、オリゴ糖、（糖）タンパク質および（糖）脂質を含むアクセプターへの移行を触媒する。このようにしてフコシル化されたアクセプター基質は、様々な生物プロセスおよび病理プロセスに関与する。
【0004】
フコシルラクトース（ＦＬ）の微生物発酵による産生では、ＦＬは、工業的産生宿主において細胞内で産生される場合が多い。細胞内でオリゴ糖を産生する際に真に困難であると当技術分野において特定される１つの問題は、産生されたオリゴ糖とそれらの抽出物の細胞内濃縮である。細胞内濃縮は、所望のオリゴ糖の産生に関する産生阻害作用の原因であると考えられている。合成が緩慢になる場合があるか、または所望のオリゴ糖が、代謝停止もしくは細胞溶解さえももたらす細胞毒性濃度に達する場合がある。
【0005】
フコシルラクトースを効率的な、時間およびコスト効果の高い方法で産生することができ、所望の生成物を多量にもたらすツールおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【0006】
本発明によれば、この目的および他の目的は、細胞が、フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変され、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には細胞が、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含む、フコシルラクトースの産生のための方法および細胞を提供することによって達成される。さらに、細胞は膜タンパク質も発現し、より具体的には、細胞は本発明に従ってフコシルラクトース輸送を可能にする以前に知られていない膜タンパク質も発現する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
説明
驚くべきことには、ここで、本発明において使用される膜タンパク質が、新たに同定された膜タンパク質を提供し、より具体的には本発明が、フコシルラクトース輸送を可能にすることを以前に知られておらず、フコシルラクトースの発酵産生に関する正の作用を有し、フコシルラクトースを産生する宿主細胞を遺伝子操作するために使用される場合により良好な収率、生産性、特定の産生速度および／または成長速度を与える、新たに同定された膜タンパク質を提供することが見出された。
驚くべきことには、ここで、本発明において使用される膜タンパク質が、新たに同定された膜タンパク質を提供し、より具体的には本発明が、フコシルラクトース輸送を可能にすることを以前に知られておらず、フコシルラクトースの発酵産生に関する正の作用を有し、フコシルラクトースを産生する宿主細胞を遺伝子操作するために使用される場合により良好な収率、生産性、特定の産生速度および／または成長速度を与える、新たに同定された膜タンパク質を提供することが見出された。
【0008】
本発明は、フコシルラクトースを産生するための方法も提供する。フコシルラクトースは、本発明の膜タンパク質を含む宿主細胞を用いて得られる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
定義
本発明およびその様々な実施形態を説明するために本明細書において使用される単語は、それらの一般に定義される意味の語義においてのみではなく、一般に定義される意味の範囲を超える本明細書の特別な定義による構造、材料または作用も含むと理解されるべきである。したがって、要素が本明細書の文脈において２つ以上の意味を含むと理解され得る場合、特許請求の範囲におけるその使用は、明細書によって、および単語それ自体によって支持される全ての可能な意味について包括的であると理解されなければならない。
本発明およびその様々な実施形態を説明するために本明細書において使用される単語は、それらの一般に定義される意味の語義においてのみではなく、一般に定義される意味の範囲を超える本明細書の特別な定義による構造、材料または作用も含むと理解されるべきである。したがって、要素が本明細書の文脈において２つ以上の意味を含むと理解され得る場合、特許請求の範囲におけるその使用は、明細書によって、および単語それ自体によって支持される全ての可能な意味について包括的であると理解されなければならない。
【0010】
本明細書で開示される本発明の様々な実施形態および実施形態の態様は、本明細書で具体的に説明される順序および文脈でのみではなく、その任意の順序および任意の組合せを含むと理解されるべきである。文脈が要求する場合は常に、単数形で使用される全ての単語は、複数を含むと考えられるべきであり、その逆も同じである。別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、一般的に、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用される命名法、ならびに本明細書で説明される細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける研究室手技は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されている手技である。核酸およびペプチド合成に、標準技法が使用される。一般的に、酵素反応および精製ステップは、製造業者の仕様書に従って行われる。
【0011】
図面および明細書において、本発明の実施形態が開示されており、特定の用語が使用されているが、用語は、単に説明の語義において使用され、限定の目的のためではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲で示される。説明される実施形態は例の目的のためにのみ示されており、それは本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことが理解されなければならない。変更、他の実施形態、改善、詳細および使用は、本明細書中の本開示の文言および趣旨と一致して、本開示の範囲内で行うことができ、それは特許請求の範囲によってのみ限定され、均等論を含む特許法に従って解釈されることが当業者に明らかである。以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲のステップを示すために使用される参照符号は、説明の利便性のためにのみ提供され、ステップを行うための任意の特定の順序を意味することを意図しない。
【0012】
本発明に従って、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般的に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ；一本鎖、またはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖領域、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。そのような領域内の鎖は、同じ分子からの鎖、または異なる分子からの鎖であり得る。領域は、分子のうちの１つまたは複数の全てを含み得るが、より典型的には、分子のうちの一部の領域のみを含む。三本鎖ヘリックス領域の分子のうちの１つは多くの場合、オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、また、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つまたは複数の改変された塩基を含有する上記に説明されるＤＮＡまたはＲＮＡを含む。したがって、安定性のためまたは他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明による「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの異常な塩基、またはトリチル化塩基などの改変された塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、「ポリヌクレオチド」という用語に包含されると理解されるべきである。当業者に公知の多くの有用な目的を満たす広範な改変がＤＮＡおよびＲＮＡになされていることが理解される。「ポリヌクレオチド」という用語は、それが本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドのそのような化学的、酵素的または代謝的に改変された型、ならびにウイルスおよび単純型および複雑型細胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型を包含する。また、「ポリヌクレオチド」という用語は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる短いポリヌクレオチドを包含する。
【0013】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合によって互いに接合された２つまたはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖、ならびに一般的にタンパク質と呼ばれるより長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子をコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、また化学修飾技法によって改変されたポリペプチドを含む。そのような改変は、基本的な教本およびより詳細な研究書、ならびに多数の研究文献で十分に説明されており、それらは当業者に周知である。所与のポリペプチドのいくつかの部位において、同じ型の改変は、同じ程度または様々な程度で存在し得る。さらに、所与のポリペプチドは、多くの型の改変を含有し得る。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこで起こってもよい。改変には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ－リボシル化、セレニル化（selenoylation）、アミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介添加、例えば、アルギニル化およびユビキチン化が含まれる。ポリペプチドは、分岐または環式であってもよく、分岐を伴っても、伴わなくてもよい。環式、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから生じてもよく、全て合成法によって作製されてもよい。
【0014】
「単離された」とは、その天然状態から「人為的に」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、それがその元の環境から変化もしくは除去されているか、またはその両方であることを意味する。例えば、この用語が本明細書で使用される場合、生存生物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。同様に、「合成」配列とは、この用語が本明細書で使用される場合、合成生成され、天然源から直接単離されていない任意の配列を意味する。「合成された」とは、この用語が本明細書で使用される場合、任意の合成生成された、天然源から直接単離されていない配列を意味する。
【0015】
「組換え体」とは、ある種からの遺伝子を様々な種の宿主生物の細胞に移植またはスプライシングすることによって調製した遺伝子操作されたＤＮＡを意味する。そのようなＤＮＡは、宿主の遺伝子構造の部分になり、複製される。
【0016】
本開示の文脈内の「内因性」という用語は、細胞の天然部分であり、細胞染色体のその天然の場所に存在している任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を指す。
【0017】
「異種の」という用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素について使用される場合、宿主生物種以外の源からの、または宿主生物種以外の源に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を指す。対照的に、「同種の」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素は、宿主生物種に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を示すために本明細書で使用される。遺伝子配列を維持または操作するために使用される遺伝子調節配列または補助的な核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、配列内リボソーム進入配列、ゲノムホモロジー領域、組換え部位など）について言及する場合、「異種の」は、調節配列または補助的配列が、構築物、ゲノム、染色体またはエピソームにおいて調節または補助的核酸配列が並置されている遺伝子と天然に関連付けられないことを意味する。したがって、プロモーターがその天然状態では（すなわち、非遺伝子操作生物のゲノムでは）作動可能に連結していない遺伝子に作動可能に連結したプロモーターは、プロモーターが、プロモーターが連結されている遺伝子と同じ種（または一部の場合、同じ生物）に由来し得る場合でさえも、「異種のプロモーター」と本明細書で呼ばれる。
【0018】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。また、この用語は、ポリペプチドをコードする単一の連続領域または非連続領域を含むポリヌクレオチド（例えば、組み込まれたファージもしくは挿入配列または編集によって中断された）ならびにこれもまたコード配列および／または非コード配列を含有し得る追加の領域を包含する。
【0019】
遺伝子の「改変された発現」という用語は、フコシルラクトースの産生プロセスのいずれかの段階における前記遺伝子の野生型の発現と比較した発現の変化に関する。前記改変された発現は、野生型と比較してより低いかまたはより高い発現であり、「より高い発現」という用語はまた、内因性遺伝子の場合には前記遺伝子の「過剰発現」、または野生型株に存在しない異種遺伝子の場合には「発現」として定義される。より低い発現は、機能的な最終生成物を産生する能力が劣る（すなわち、野生型の機能性遺伝子と比較して統計的に有意に「能力が劣る」）かまたは完全に不可能である（ノックアウト遺伝子など）ように遺伝子を変化させるために使用される、当業者にとって一般的な周知の技術（ｓｉＲＮＡ、ＣｒｉｓｐＲ、ＣｒｉｓｐＲｉ、組換え、相同組換え、ｓｓＤＮＡ突然変異誘発、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ａｓＲＮＡ、変異遺伝子、ノックアウト遺伝子、トランスポゾン突然変異誘発、・・・の利用など）により得られる。過剰発現または発現は、当業者にとって一般的に周知の技術によって得られ、前記遺伝子は、プロモーター配列、非翻訳領域配列（リボソーム結合配列またはＫｏｚａｋ配列のいずれかを含有する）、コード配列（例えば、膜タンパク質遺伝子配列）および必要に応じて転写ターミネーターが存在し、機能的に活性なタンパク質の発現をもたらすいずれかの配列に関する「発現カセット」の一部である。前記発現は、構成的であるか、または条件付きであるか、または調節されている。
【0020】
「構成的発現」という用語は、ある特定の成長条件下で、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット以外の転写因子（例えば、細菌のシグマ因子）によって調節されていない発現として定義される。そのような転写因子の非限定的な例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＲＰ、ＬａｃＩ、ＡｒｃＡ、Ｃｒａ、ＩｃｌＲ、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡｆｔ２ｐ、Ｃｒｚ１ｐ、Ｓｋｎ７、またはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＤｅｏＲ、ＧｎｔＲ、Ｆｕｒである。これらの転写因子は、特異的配列に結合し、ある特定の成長条件下で発現を遮断または増強し得る。ＲＮＡポリメラーゼは、特定の配列に結合し、例えば原核生物の宿主におけるシグマ因子によって転写を開始する。
【0021】
「調節された発現」という用語は、ある特定の成長条件下で、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット以外の転写因子（例えば、細菌のシグマ因子）によって調節される発現として定義される。そのような転写因子の例は上記されている。一般的に、発現の調節は、非限定的に、ＩＰＴＧ、アラビノース、ラムノース、フコース、アロラクトースなどの誘導剤、またはｐＨシフト、もしくは温度シフトまたは炭素欠乏もしくは基質もしくは産生産物によって得られる。
【0022】
「野生型」という用語は、自然に生じるような一般的に公知の遺伝子または表現型の状況を指す。
【0023】
「バリアント」とは、この用語が本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持する、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチドのバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する場合も、変更しない場合もある。ヌクレオチド変化は、以下に説明されるように、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断をもたらし得る。典型的なポリペプチドのバリアントは、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的に、相違は限定的であり、そのため、参照ポリペプチドの配列とバリアントの配列とは、全体的に密接に類似し、多くの領域で同一である。バリアントおよび参照ポリペプチドは、任意の組合せの１つまたは複数の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされる残基であっても、そうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものであってもよく、またはそれは天然に存在することが公知でないバリアントであってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然に存在しないバリアントは、変異誘発技法によって、直接合成によって、および当業者に公知の他の組換え法によって作製され得る。
【0024】
一部の実施形態では、本開示は、本発明において使用される膜タンパク質の構造を改変することによって機能的バリアントを作製することを企図する。バリアントは、アミノ酸置換、欠失、付加またはその組合せによって産生され得る。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、トレオニンのセリンでの単独の置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的突然変異）は、得られる分子の生物活性に対して大きな効果を有しないと予測することが妥当である。保存的置換は、側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的ホモログをもたらすかどうかは、バリアントポリペプチドの、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞において応答をもたらす能力、本発明の場合、バリアントを有しない細胞よりも優れた収率、生産性および／または増殖スピードを提供する能力を評定することによって容易に決定することができる。
【0025】
「機能的ホモログ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列類似性を有し、また生化学活性などの少なくとも１つの機能的特徴を共有する分子を説明する。より具体的には、「機能的ホモログ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列類似性（言い換えれば、相同性）と、同時に生化学活性などの少なくとも１つの機能的類似性とを有するこれらのタンパク質について記載する（Altenhoff et al., PLoS Comput. Biol. 8 (2012) e1002514）。
【0026】
機能的ホモログは、オルソログと呼ばれる場合もあり、「オルソログ」とは、別の種の参照される遺伝子またはタンパク質の機能的同等物である同種の遺伝子またはタンパク質を指す。機能的ホモログは、典型的に、同様であるが、必ずしも同じではない程度まで同じ特徴を生ずる。機能的に同種のタンパク質は、１つのホモログによって産生される定量的測定値が、他方の少なくとも１０パーセント；より典型的には少なくとも２０パーセント、元の分子によって産生される測定値の約３０パーセント～約４０パーセントの間；例えば、約５０パーセント～約６０パーセントの間；約７０パーセント～約８０パーセントの間；もしくは約９０パーセント～約９５パーセントの間；約９８パーセント～約１００パーセントの間、または１００パーセント超である同じ特徴を与える。したがって、分子が酵素活性を有する場合、機能的ホモログは、元の酵素と比較して上記に列挙されるパーセントの酵素活性を有する。分子がＤＮＡ結合分子（例えば、ポリペプチド）である場合、ホモログは、元の分子と比較して、結合した分子の重量によって測定される上記に列挙されるパーセンテージの結合親和性を有する。
【0027】
機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってもよく、配列類似性は、収束性または多様性の進化的事象のためであり得る。
【0028】
機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列整列の分析によって特定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースについて照会を行うことにより、バイオマス調節ポリペプチドのホモログを特定することができる。配列分析は、バイオマス調節ポリペプチドのアミノ酸配列を参照配列として使用する非重複データベースのＢＬＡＳＴ、Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ分析を含み得る。アミノ酸配列は、一部の場合、ヌクレオチド配列から推測される。典型的に、４０パーセント超の配列同一性を有するデータベース内のそれらのポリペプチドは、バイオマス調節ポリペプチドとしての適合性についてのさらなる評価の候補物である。アミノ酸配列類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換を可能にする。所望の場合、さらに評価するべき候補物の数を狭めるために、そのような候補物の手動の検査を行ってもよい。手動の検査は、生産性調節ポリペプチドに存在するドメイン、例えば、保存された機能的ドメインを有するように見えるそれらの候補物を選択することによって行うことができる。
【0029】
ポリヌクレオチドについての「断片」とは、ポリヌクレオチド分子のクローンまたは任意の部分、特に使用可能な機能的特徴を保持するポリヌクレオチドの部分を指す。有用な断片は、ハイブリダイゼーションもしくは増幅技術において、または複製、転写もしくは翻訳の調節において使用され得るオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド断片」とは、典型的に、本明細書で提供される配列のうちのいずれかの少なくとも約９個の連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも約３０個のヌクレオチドまたは少なくとも約５０個のヌクレオチドの、ポリヌクレオチドの任意のサブ配列を指す。例示的な断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドの保存されたファミリードメインをコードする領域を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる断片を含み得る。例示的な断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドの保存されたドメインを含む断片を含み得る。
【0030】
断片は、加えて、またはあるいは、ポリペプチドおよびタンパク質分子のサブ配列、またはポリペプチドのサブ配列を含み得る。一部の場合、断片またはドメインは、インタクトなポリペプチドが行うのと実質的に同じ様式で、または同様の程度まで、インタクトなポリペプチドの少なくとも１つの生物機能を行うポリペプチドのサブ配列である。例えば、ポリペプチド断片は、認識可能な構造モチーフまたは機能的ドメイン、例えば、ＤＮＡプロモーター領域に結合するＤＮＡ結合部位またはドメイン、活性化ドメイン、またはタンパク質－タンパク質相互作用のためのドメインを含んでもよく、転写を開始してもよい。断片は、わずか３個のアミノ酸残基からインタクトなポリペプチドの全長まで大きさが変動し、例えば、少なくとも約２０個のアミノ酸残基の長さ、例えば、少なくとも約３０個のアミノ酸残基の長さであり得る。優先的に、断片は、それが由来するポリペプチドの少なくとも１つの特性または活性を有する機能的断片であり、例えば、断片は、ポリペプチドの機能的ドメインまたは保存されたドメインを含み得る。ドメインは、例えば、Ｐｆａｍ（https://pfam.xfam.org/）（El-Gebali et al., Nucleic Acids Res. 47 (2019) D427-D432）またはＣｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）（Lu et al., Nucleic Acids Res. 48 (2020) D265-D268）命名法によって特徴付けることができる。Ｐｆａｍデータベースは、本明細書で使用される場合、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍデータベースＰｆａｍ３２．０を指し、ＣＤＤデータベースは、本明細書で使用される場合、２０１９年４月３日にリリースされたＣＤＤデータベースｖ３．１７を指す。
【0031】
「フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ）」、「フコシルラクトース（ｆｕｃｏｓｙｌ ｌａｃｔｏｓｅ）」および「ＦＬ」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、フコース残基およびラクトース残基を含むオリゴ糖を指す。そのようなフコシルラクトースは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、もしくはジフコシルラクトースまたはこれらの任意の組合せを指し、フコシルラクトースは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、またはジフコシルラクトースのうちの少なくともいずれか２つの組合せを指す。
【0032】
「アルファ－１，２’－フコシルトランスフェラーゼ」、「アルファ１，２’－フコシルトランスフェラーゼ」、「２’－フコシルトランスフェラーゼ」、「α－１，２’－フコシルトランスフェラーゼ」、「α１，２’フコシルトランスフェラーゼ」、「２’フコシルトランスフェラーゼ」、「２’－ＦＴ」または「２’ＦＴ」という用語は、本発明において使用される場合、互換的に使用され、ドナーの基質であるＧＤＰ－Ｌ－フコース由来のフコースの、アルファ－１，２－連結におけるアクセプター分子であるラクトースへの移行を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。「アルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼ」または上記用語のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、ドナーの基質であるＧＤＰ－Ｌ－フコース由来のフコースの、アルファ－１，２－連結におけるアクセプター分子であるラクトースへの移行を触媒するそのようなグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを指す。
【0033】
「２’－フコシルラクトース」、「アルファ－１，２’－フコシルラクトース」、「アルファ１，２’フコシルラクトース」、「α－１，２’－フコシルラクトース」、「α１，２’フコシルラクトース」、「Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ」、「２’ＦＬ」または「２’－ＦＬ」という用語は、本発明において使用される場合、互換的に使用される。好ましい実施形態では、これらの用語は、ＧＤＰ－Ｌ－フコース由来のフコース残基をアルファ－１，２’－連結におけるラクトースに移行するアルファ－１，２’－フコシルトランスフェラーゼの触媒によって得られる生成物を指す。
【0034】
「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」、「アルファ１，３フコシルトランスフェラーゼ」、「３－フコシルトランスフェラーゼ」、「α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」、「α１，３フコシルトランスフェラーゼ」、「３フコシルトランスフェラーゼ」、「３－ＦＴ」または「３ＦＴ」という用語は、本発明で使用される場合、互換的に使用され、フコースの、ドナー基質ＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でのアクセプター分子ラクトースへの移行を触媒するグリコシルトランスフェラーゼを指す。「アルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼ」または上記の用語のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、フコースの、ドナー基質ＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でのアクセプター分子ラクトースへの移行を触媒するそのようなグリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを指す。
【0035】
「３－フコシルラクトース」、「アルファ－１，３－フコシルラクトース」、「アルファ１，３フコシルラクトース」、「α－１，３－フコシルラクトース」、「α１，３フコシルラクトース」、「Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ」、「３ＦＬ」または「３－ＦＬ」という用語は、本発明で使用される場合、互換的に使用される。好ましい実施形態では、これらの用語は、フコース残基をＧＤＰ－Ｌ－フコースからアルファ－１，３－結合でラクトースへ移行するアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの触媒によって得られる生成物を指す。
【0036】
「ジフコシルラクトース」、「ジ－フコシルラクトース」、「ラクトジフコテトラオース」、「２’，３－ジフコシルラクトース」、「２’，３ジフコシルラクトース」、「α－２’，３－フコシルラクトース」、「α２’，３フコシルラクトース」、「Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ １－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ」、「ＤＦＬａｃ」、「２’，３ジＦＬ」、「ＤＦＬ」または「ジＦＬ」という用語は、本発明において使用される場合、互換的に使用される。好ましい実施形態では、これらの用語は、フコース残基を２’ＦＬに移行して、２’，３－ジフコシルラクトースをもたらすアルファ－１，３－フコシルトランスフェラーゼの触媒によって得られる生成物を指すか、またはフコース残基を３ＦＬに移行して、２’，３ジフコシルラクトースをもたらすアルファ－１，２－フコシルトランスフェラーゼの触媒によって得られる生成物を指す。
【0037】
「オリゴ糖」とは、この用語が本明細書で使用される場合、および一般的に最新の技術において理解されるように、少数の、典型的に、３～１０個の単純な糖、すなわち、単糖を含有する糖ポリマーを指す。
【0038】
「ＳＥＴ」または「Ｓｕｇａｒ Ｅｆｆｌｕｘ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ」は、本明細書で使用される場合、ＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０（リリース日が２０１９年７月４日）によって定義されるＩｎｔｅｒＰＲＯドメインＩＰＲ００１２１４を有するタンパク質および／またはＥｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２データベース（リリース日が２０１７年１１月３日）によって定義されるｅｇｇＮＯＧｖ４．５ファミリーのＥＮＯＧ４１０ＸＴＥ９に属するタンパク質であるＳＥＴファミリーの膜タンパク質を指す。ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインの同定は、デフォルト値を使用して、https://www.ebi.ac.uk/interpro/のオンラインツールまたはＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html）のスタンドアローンバージョンを使用することによってなされ得る。ｅｇｇＮＯＧｖ４．５のオルソログファミリーの同定は、ｅｇｇＮＯＧ－ｍａｐｐｅｒｖ１（http://eggnogdb.embl.de/#/app/home）のオンラインバージョンまたはスタンドアローンバージョンを使用してなされ得る。
【0039】
「膜タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞膜の一部であるかまたはそれと相互作用するタンパク質を指し、分子流および細胞にわたる情報を制御する。よって、膜タンパク質は、輸送に関与し、細胞に移入されるかまたは細胞から排出される。
【0040】
そのような膜タンパク質は、www.tcdb.orgにより利用可能なＳａｉｅｒ Ｌａｂ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐによって作動され、精選され、膜輸送タンパク質の機能的かつ系統発生的分類を与えるＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅによって定義されるポーター、Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、βバレル型ポリン（β－Ｂａｒｒｅｌ Ｐｏｒｉｎｓ）、補助輸送タンパク質（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、推定輸送タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはリン酸基転移駆動性基輸送体であり得る。このＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅは、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＣ）系として公知の膜輸送タンパク質に関する包括的ＩＵＢＭＢに認可された分類系について詳述する。ＴＣＤＢ分類は、本明細書に記載されるように、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgに基づいて定義される。
【0041】
ポーターは、キャリヤー媒介性プロセスを利用するユニポーター、シンポーター、およびアンチポーターの総称名である（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。これらは、電気化学電位駆動性トランスポーターに属し、二次キャリヤー型ファシリテーターとしても公知である。膜タンパク質は、キャリヤー媒介性プロセスを利用して、二次キャリヤーの、ユニポート（拡散の促進によって、または溶質が荷電される場合には膜電位依存性プロセスにおいて、単一種が輸送される場合）；アンチポート（２種またはそれより多い種が密接に関連するプロセスの反対方向に輸送され、化学浸透圧性エネルギー以外のエネルギーの直接形態に関連しない場合）；および／またはシンポート（２種またはそれより多い種が密接に関連するプロセスの同一方向に一緒に輸送され、化学浸透圧性エネルギー以外のエネルギーの直接形態に関連しない場合）を触媒する場合にこのクラスに含まれる（Forrest et al., Biochim. Biophys. Acta 1807 (2011) 167-188）。これらの系は、通常、立体特異的である。溶質：溶質対向輸送は、二次キャリヤーの特徴的な特性である。ポーターと酵素の動的会合によって、典型的には細胞外コンパートメントから得られる基質をそれらの細胞代謝へと直接的に運ぶ機能的膜輸送メタボロンが生じる（Moraes and Reithmeier, Biochim. Biophys. Acta 1818 (2012), 2687-2706）。このポーター系を介して輸送される溶質としては、非限定的に、カチオン、有機アニオン、無機アニオン、ヌクレオシド、アミノ酸、ポリオール、リン酸化解糖中間体、オスモライト（ｏｓｍｏｌｉｔｅ）、シデロホアが挙げられる。膜タンパク質は、溶質（１種または複数）の能動的取込みおよび／または押出しを駆動するために、無機ピロリン酸、ＡＴＰ、または別のヌクレオシド三リン酸の二リン酸結合を加水分解する場合には、Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターのクラスに含まれる（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。膜タンパク質は、一時的にリン酸化されてもされなくてもよいが、基質はリン酸化されない。Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターのクラスによって輸送される基質は、非限定的に、カチオン、重金属、ベータ－グルカン、ＵＤＰ－グルコース、リポ多糖、タイコ酸を含む。
【0042】
βバレル型ポリン膜タンパク質は、通常、溶質のエネルギーに依存しない膜通過を可能にする膜貫通ポアを形成する。これらのタンパク質の膜貫通部分は、βバレルを形成するβ鎖から排他的になる（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。これらのポリンタイプのタンパク質は、グラム陰性細菌、ミトコンドリア、色素体、およびおそらくは抗酸グラム陽性細菌の外膜に見られる。これらのβバレル型ポリン膜タンパク質を介して輸送される溶質としては、非限定的に、ヌクレオシド、ラフィノース、グルコース、ベータ－グルコシド、オリゴ糖が挙げられる。
【0043】
補助輸送タンパク質は、１つまたは複数の生体膜を通過する輸送を促進するが、それ自体は輸送に直接的に関与しないタンパク質であると定義される。これらの膜タンパク質は、常に、非限定的に、外膜因子（ＯＭＦ）、多糖（ＰＳＴ）ポーター、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）型トランスポーターなどの１種または複数の確立された輸送系と併せて機能する。これらは、輸送する、複合体形成において構造的役割を果たす、生体機能もしくは安定性機能を果たす、または調節機能を果たすためのエネルギーカップリングに関係する機能を与え得る（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。補助輸送タンパク質の例としては、非限定的に、多糖輸送に関与する多糖コポリメラーゼファミリー、バクテリオシンおよび化学的毒素の輸送に関与する膜融合タンパク質ファミリーが挙げられる。
【0044】
推定輸送タンパク質は、膜の輸送機能が確立される場合にその他に分類されることになるか、または提案された輸送機能が誤りである場合に、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ系から排除されることになるファミリーを含む。これらのファミリーは、輸送機能が示唆されるが、そのような機能に対するエビデンスが未だ説得力のないメンバー（１種または複数）を含む（Saier et al., Nucleic Acids Res. 44 (2016) D372-D379）。２０１９年６月１７日にリリースされたＴＣＤＢ系の下でこの群に分類された推定トランスポーターの例としては、非限定的に、銅トランスポーターが挙げられる。
【0045】
リン酸基転移駆動性基輸送体は、細菌のホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）のＰＥＰ依存性ホスホリル転移駆動性基輸送体としても公知である。細胞外の糖に由来する反応の生成物は、細胞質の糖リン酸である。糖リン酸化を触媒する酵素構成要素は、密接に関連するプロセスにおける輸送プロセスに重畳される。ＰＴＳ系は、調節および走化性、バイオフィルム形成、ならびに発病を含む多くの異なる態様に関与する（Lengeler, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 79-93；Saier, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 25 (2015) 73-78）。２０１９年６月１７日にリリースされたＴＣＤＢ系下でリン酸基転移駆動性基輸送体に分類された膜タンパク質ファミリーは、グルコース－グルコシド、フルクトース－マンニトール、ラクトース－Ｎ，Ｎ’－ジアセチルキトビオース－ベータ－グルコシド、グルシトール、ガラクチトール、マンノース－フルクトース－ソルボースおよびアスコルベートの輸送に関連するＰＴＳ系を含む。
【0046】
Ｐｆａｍ ３２．０（２０１８年９月にリリースされた）、ＣＤＤ ｖ３．１７（２０１９年４月３日にリリースされた）、ｅｇｇｎｏｄｄｂ １．０．２（２０１７年１１月３日にリリースされた）、ＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０（２０１９年７月４日にリリースされた）およびＴＣＤＢ（２０１９年６月１７日にリリースされた）を含む本明細書で使用されるデータベースについて、各データベースの内容が、各リリース時に固定され、変更されることはないことが、当業者に理解されるべきである。特定のデータベースの内容が変更される場合は、この特定のデータベースは、新たなリリース日を含む新たなリリース版を受理する。対応するリリース日とこれらの具体的なリリース日に注釈を付けられた特定の内容を含む各データベースに関するすべてのリリース版は、当業者にとって利用可能かつ公知である。
【0047】
「輸送を可能にする」という用語は、原形質膜および／または細胞壁を超えて溶質の輸送活性を導入することを意味する。前記輸送は、本発明において記載されるトランスポータータンパク質の発現を導入するおよび／または増加させることによって可能となり得る。「輸送を増強する」という用語は、原形質膜および／または細胞壁を超えて溶質の輸送活性を改善することを意味する。前記輸送は、本発明において記載されるトランスポータータンパク質の発現を導入するおよび／または増加させることによって増強され得る。トランスポータータンパク質の「発現」は、前記遺伝子が内因性遺伝子である場合には前記トランスポータータンパク質をコードする遺伝子の「過剰発現」、または前記トランスポータータンパク質をコードする遺伝子が野生型株には存在しない異種遺伝子である場合には「発現」として定義される。
【0048】
ハイブリダイゼーション
本明細書で定義される「ハイブリダイゼーション」という用語は、実質的に同種の相補性ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、全体的に、溶液中で起こり得る、すなわち、両相補性核酸は溶液中に存在する。ハイブリダイゼーションプロセスは、磁気ビーズ、セファロースビーズまたは任意の他の樹脂などのマトリックスに固定された相補性核酸のうちの１つと起こる場合もある。さらに、ハイブリダイゼーションプロセスは、ニトロセルロースもしくはナイロン膜などの固体支持体に固定されたか、または例えば、フォトリソグラフィーによって、例えば、ケイ酸ガラス支持体に固定された（後者は、核酸アレイもしくはマイクロアレイとして、または核酸チップとして公知）相補性核酸のうちの１つと起こる場合がある。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、一般的に、核酸分子は、熱的もしくは化学的に変性されて二本鎖を解かれて２本の一本鎖となるおよび／または一本鎖核酸からヘアピン構造もしくは他の二次構造を除去する。「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝組成物などの条件によって影響を受ける。一般的に、低ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に関する熱融点（Ｔｍ）よりも約３０℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより１０℃低い場合である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、標的核酸配列に対して高い配列類似性を有するハイブリダイズする配列を単離するために使用される。しかし、核酸は、配列を外れる場合があり、遺伝子コードの縮重により、実質的に同一なポリペプチドを依然としてコードし得る。したがって、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのような核酸分子を同定するために必要とされる場合がある。
本明細書で定義される「ハイブリダイゼーション」という用語は、実質的に同種の相補性ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、全体的に、溶液中で起こり得る、すなわち、両相補性核酸は溶液中に存在する。ハイブリダイゼーションプロセスは、磁気ビーズ、セファロースビーズまたは任意の他の樹脂などのマトリックスに固定された相補性核酸のうちの１つと起こる場合もある。さらに、ハイブリダイゼーションプロセスは、ニトロセルロースもしくはナイロン膜などの固体支持体に固定されたか、または例えば、フォトリソグラフィーによって、例えば、ケイ酸ガラス支持体に固定された（後者は、核酸アレイもしくはマイクロアレイとして、または核酸チップとして公知）相補性核酸のうちの１つと起こる場合がある。ハイブリダイゼーションを生じさせるために、一般的に、核酸分子は、熱的もしくは化学的に変性されて二本鎖を解かれて２本の一本鎖となるおよび／または一本鎖核酸からヘアピン構造もしくは他の二次構造を除去する。「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、イオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝組成物などの条件によって影響を受ける。一般的に、低ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列に関する熱融点（Ｔｍ）よりも約３０℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、高ストリンジェンシー条件は、温度がＴｍより１０℃低い場合である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、標的核酸配列に対して高い配列類似性を有するハイブリダイズする配列を単離するために使用される。しかし、核酸は、配列を外れる場合があり、遺伝子コードの縮重により、実質的に同一なポリペプチドを依然としてコードし得る。したがって、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、そのような核酸分子を同定するために必要とされる場合がある。
【0049】
Ｔｍは、規定のイオン強度およびｐＨ下で、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、溶液条件ならびにプローブの塩基組成および長さに応じて変わる。例えば、より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。最大ハイブリダイゼーション率は、Ｔｍより約１６℃から最大３２℃低い温度で得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、２本の核酸鎖の間の静電反発力を低減し、それによってハイブリッド形成を促進する；この効果は、最大０．４Ｍのナトリウム濃度について見られる（より高濃度では、この効果は無視され得る）。ホルムアミドは、ＤＮＡ－ＤＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖の融解温度をホルムアミド１％ごとに０．６～０．７℃低下させ、５０％のホルムアミドの添加によって、３０～４５℃でハイブリダイゼーションを行うことが可能となるが、ハイブリダイゼーション率は低下することになる。塩基対のミスマッチは、ハイブリダイゼーション率および二本鎖の熱安定性を低下させる。概して、大型のプローブでは、Ｔｍは、塩基ミスマッチ１％当たり約１℃低下する。Ｔｍは、ハイブリッドのタイプに応じて、以下の等式を使用して計算することができる：
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．４１×（％［Ｇ＋Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×（ホルムアミドの％）
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８×（％［Ｇ＋Ｃｂ］）＋１１．８×（％［Ｇ＋Ｃｂ］）２－８２０×［Ｌｃ］－１
３）オリゴ－ＤＮＡまたはオリゴ－ＲＮＡｄハイブリッド：
＜２０ヌクレオチドについて：Ｔｍ＝２／ｎ
２０～３５ヌクレオチドについて：Ｔｍ＝２２＋１．４６／ｎ
ここで、
ａ：または、他の一価カチオンに関するが、０．０１～０．４Ｍの範囲においてのみ正確である。
ｂ：ＧＣの％については、３０％～７５％の範囲においてのみ正確である。
ｃ：Ｌ＝塩基対での二本鎖の長さ、
ｄ：オリゴ、オリゴヌクレオチド、
ｎ：有効なプライマー長＝２×（Ｇ＋Ｃの数）＋（Ａ＋Ｔの数）。
１）ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．４１×（％［Ｇ＋Ｃｂ］－５００×［Ｌｃ］－１－０．６１×（ホルムアミドの％）
２）ＤＮＡ－ＲＮＡまたはＲＮＡ－ＲＮＡハイブリッド：
Ｔｍ＝７９．８℃＋１８．５×（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ａ）＋０．５８×（％［Ｇ＋Ｃｂ］）＋１１．８×（％［Ｇ＋Ｃｂ］）２－８２０×［Ｌｃ］－１
３）オリゴ－ＤＮＡまたはオリゴ－ＲＮＡｄハイブリッド：
＜２０ヌクレオチドについて：Ｔｍ＝２／ｎ
２０～３５ヌクレオチドについて：Ｔｍ＝２２＋１．４６／ｎ
ここで、
ａ：または、他の一価カチオンに関するが、０．０１～０．４Ｍの範囲においてのみ正確である。
ｂ：ＧＣの％については、３０％～７５％の範囲においてのみ正確である。
ｃ：Ｌ＝塩基対での二本鎖の長さ、
ｄ：オリゴ、オリゴヌクレオチド、
ｎ：有効なプライマー長＝２×（Ｇ＋Ｃの数）＋（Ａ＋Ｔの数）。
【0050】
非特異的結合は、例えば、タンパク質を含有する溶液を含む膜を遮断すること、異種ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＤＳのハイブリダイゼーション緩衝剤への添加、およびＲｎａｓｅによる処置などのいくつかの公知の技法のいずれか１つを使用して制御することができる。非相同性プローブに対して、（ｉ）アニーリング温度を進行的に低下させること（例えば、６８℃～４２℃）または（ｉｉ）ホルムアミド濃度を進行的に低下させること（例えば、５０％～０％）のうちの１つを変更することによって、一連のハイブリダイゼーションが実施され得る。当業者であれば、ハイブリダイゼーションの間に変更することができ、ストリンジェンシー条件を維持するかまたは変化させる様々なパラメーターを知っている。
【0051】
ハイブリダイゼーション条件の他に、ハイブリダイゼーションの特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、試料を希釈した塩溶液で洗浄する。そのような洗浄の重要な因子としては、最終的な洗浄溶液のイオン強度および温度が挙げられる：塩濃度が低く、洗浄温度が高くなるほど、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は、典型的には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーで、またはそれより下で実施される。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドのシグナルの少なくとも２倍のシグナルを与える。一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイまたは遺伝子増幅検出手順に好適なストリンジェント条件は、上記に示される。より高いか、またはより低いストリンジェント条件を選択することもできる。当業者であれば、洗浄の間に変化させることができ、ストリンジェンシー条件を維持するか、または変化させる様々なパラメーターを知っている。
【0052】
例えば、５０ヌクレオチドよりも長いＤＮＡハイブリッドのための典型的な高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣ中６５℃または１×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４２℃でのハイブリダイゼーション、次いで、０．３×ＳＳＣ中６５℃での洗浄を包含する。５０ヌクレオチドよりも長いＤＮＡハイブリッドのための中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、４×ＳＳＣ中５０℃または６×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中４０℃でのハイブリダイゼーション、次いで、２×ＳＳＣ中５０℃での洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズする核酸の予測される長さである。公知の配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッドの長さは、配列をアラインし、本明細書に記載の保存された領域を同定することによって決定することができる。１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである；ハイブリダイゼーション溶液および洗浄溶液は、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５～１．０％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．５％のピロリン酸ナトリウムをさらに含んでもよい。
【0053】
ストリンジェンシーのレベルを規定するために、Sambrook et al.(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New YorkまたはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y.（１９８９年および毎年のアップデート）を参照することができる。
【0054】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的サブ配列とハイブリダイズするが、他のいずれの配列ともハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なることになる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約１５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであり得る：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳを４２℃でインキュベートする、または５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳを６５℃でインキュベートし、６５℃の０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中で洗浄する。
【0055】
「精製された」という用語は、生体分子の活性に干渉する成分から実質的または本質的に遊離している材料を指す。細胞、糖、核酸およびポリペプチドについて、「精製された」という用語は、材料のそのネイティブの状態において見られる場合に普通、材料に付随する成分から実質的に遊離しているまたは本質的に遊離している材料を指す。典型的に、本発明の精製した糖、オリゴ糖、タンパク質または核酸は、銀染色ゲル上のバンド強度または純度を決定するための他の方法によって測定して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％純粋であり、通常少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純粋である。純度または均一性は、当該技術分野で周知のいくつかの手段、例えば、タンパク質または核酸試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、および続く染色に際しての可視化によって示すことができる。ある特定の目的のために、高分解能が必要とされ、ＨＰＬＣまたは精製のための同様の手段が利用される。オリゴ糖、例えば、３－フコシルラクトースについて、純度は、非限定的に、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動または質量分析などの方法を使用して決定することができる。
【0056】
２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列に関する「同一の」または「同一性」パーセントまたは「同一性」％という用語は、最大一致について比較および整列した場合、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定して、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つまたはそれよりも多い配列またはサブ配列を指す。配列比較のために、１つの配列が、参照配列として働き、試験配列をそれと比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、サブ配列協調を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して決定することができる（Altschul et al., 1990, J Mol Biol 215:3, 403- 410；Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res 25: 17, 3389-402）。本発明の目的のために、同一性パーセントは、ＭａｔＧＡＴ２．０１を使用して決定される（Campanella et al., 2003, BMC Bioinformatics 4:29）。タンパク質についての以下のデフォルトパラメーターが使用される：（１）Ｇａｐ ｃｏｓｔ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１２およびＥｘｔｅｎｓｉｏｎ：２；（２）使用されるマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ５０であった。
【0057】
「制御配列」という用語は、宿主細胞転写および翻訳系によって認識され、ポリヌクレオチド配列のポリペプチドへの転写および翻訳を可能にする配列を指す。したがって、そのようなＤＮＡ配列は、特定の宿主細胞または生物において作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要である。そのような制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合配列、シャイン・ダルガノ配列、コザック配列、転写ターミネーター配列であり得るが、これらに限定されない。例えば、原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。プレ配列もしくは分泌リーダーについてのＤＮＡは、それが、ポリペプチドの分泌に参加するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結され得るか；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。前記制御配列は、さらに、非限定的に、ＩＰＴＧ、アラビノース、ラクトース、アロラクトース、ラムノースまたはフコースなどの外部化学物質によって、誘導性プロモーターを介して、または前記ポリヌクレオチドのポリペプチドへの転写もしくは翻訳を誘導もしくは抑制する遺伝子制御機構を介して制御され得る。
【0058】
一般的に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合、連続し、読み出し相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。
【0059】
本明細書で使用される場合、「細胞産生性指数（ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）（ＣＰＩ）」という用語は、培養中に生じた組換え細胞の質量で除した組換え細胞によって産生された生成物の質量を指す。
【0060】
発明の詳細な説明
第１の実施形態では、本発明は、遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法を提供する。本方法は：
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には前記細胞が、グアノシン－ジホスフェートフコース（ＧＤＰ－フコース）のドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質、より具体的にはフコシルラクトース輸送に関与する内因性膜タンパク質、さらにより具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）異種膜タンパク質、より具体的にはフコシルラクトース輸送に関与する異種膜タンパク質、さらにより具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、ステップと、所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップとを含む。好ましくは、フコシルラクトースは、本明細書で説明される培養から分離される。
第１の実施形態では、本発明は、遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法を提供する。本方法は：
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、より具体的には前記細胞が、グアノシン－ジホスフェートフコース（ＧＤＰ－フコース）のドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質、より具体的にはフコシルラクトース輸送に関与する内因性膜タンパク質、さらにより具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）異種膜タンパク質、より具体的にはフコシルラクトース輸送に関与する異種膜タンパク質、さらにより具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、ステップと、所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップとを含む。好ましくは、フコシルラクトースは、本明細書で説明される培養から分離される。
【0061】
本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞は、
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される膜タンパク質を含む。
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される膜タンパク質を含む。
【0062】
別の実施形態は、遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素、より具体的にはＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ＳＥＴを除くポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと
を含む、方法を提供する。好ましくは、産生されたフコシルラクトースは、本明細書で説明される培養から分離される。
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素、より具体的にはＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ＳＥＴを除くポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと
を含む、方法を提供する。好ましくは、産生されたフコシルラクトースは、本明細書で説明される培養から分離される。
【0063】
本明細書に記載の本発明の方法では、膜タンパク質は、改変された発現を有する内因性タンパク質であり、好ましくは前記内因性タンパク質は過剰発現されているか；または膜タンパク質は、細胞によって異種性に発現され得る異種タンパク質である。異種性に発現された膜タンパク質は、次いで、導入および発現されることになり、好ましくは過剰発現されることになる。別の実施形態では、内因性タンパク質は、異種膜タンパク質も発現する細胞において改変された発現を有し得る。
【0064】
本明細書において使用される宿主細胞は、好ましくは、フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変されている。さらに好ましい実施形態では、本明細書において使用される細胞は、ラクトースまたは中間体をフコシルラクトースへと改変することが可能な組換えフコシルトランスフェラーゼを含む。
【0065】
本明細書において使用される宿主細胞は、フコシルラクトースの産生のために必要に応じて遺伝子改変されており、前記宿主細胞は、ＧＤＰ－フコースのｄｅ ｎｏｖｏ合成を発現するように改変されている。ＧＤＰ－フコースの前記ｄｅ ｎｏｖｏ合成は、酵素であるマンノース－６－リン酸イソメラーゼ、ホスホマンノムターゼをコードする遺伝子、マンノース－１－リン酸グアノシルトランスフェラーゼ、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼおよびＧＤＰ－Ｌ－フコース合成酵素によって触媒される。好ましくは、前記宿主細胞は、ＧＤＰ－フコースのｄｅ ｎｏｖｏ合成の酵素をコードする１つまたは複数の遺伝子を発現するようにさらに改変されている。
【0066】
本明細書において使用される宿主細胞は、ラクトースパーミアーゼの導入および／または過剰発現によって、細胞内にラクトースを移入するよう必要に応じて遺伝子改変されている。前記ラクトースパーミアーゼは、例えば、ｌａｃＹ遺伝子またはｌａｃ１２遺伝子によってコードされている。
【0067】
本発明のさらなる態様によれば、膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、各細胞または発現系のコドン利用に適応している。
【0068】
上記実施形態の好ましい態様では、ポーターは、ＴＣＤＢクラスの２．Ａ．１．１、２．Ａ．１．１２、２．Ａ．１．１５、２．Ａ．１．２、２．Ａ．１．３、２．Ａ．１．３６、２．Ａ．１．３８、２．Ａ．１．４６、２．Ａ．１．６８、２．Ａ．１．７、２．Ａ．１．８１、２．Ａ．１２３、２．Ａ．２、２．Ａ．２１、２．Ａ．５８、２．Ａ．６．３、２．Ａ．６６および２．Ａ．７．１の群から選択されるか、Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターは、ＴＣＤＢクラスの３．Ａ．１．１、３．Ａ．１．２、３．Ａ．１．１０、３．Ａ．１．１１および３．Ａ．１．５の群から選択されるか、βバレル型ポリンは、ＴＣＤＢクラスの１．Ｂ．１８および１．Ｂ．３．１から選択されるか、補助輸送タンパク質は、ＴＣＤＢクラスの８．Ａ．３から選択されるか、推定輸送タンパク質は、ＴＣＤＢクラスの９．Ｂ．１４および９．Ｂ．１５８の群から選択されるか、またはリン酸基転移駆動性基輸送体は、ＴＣＤＢクラスの４．Ａ．１．１および４．Ａ．４．１の群から選択される。前記ＴＣＤＢクラスは、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgで定義されるように分類される。
【0069】
上記実施形態の別の好ましい態様では、ポーターは、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺＳ、０５Ｃ０Ｒ、０５Ｃ２Ｃ、０５ＣＴ４、０５ＣＸＰ、０５ＣＺＱ、０５Ｄ９４、０５ＤＸＩ、０５Ｅ５Ｍ、０５Ｅ５Ｗ、０５Ｅ８Ｇ、０５ＥＡＭ、０５ＥＤＲ、０５ＥＧＺ、０５Ｆ９Ｎ、０５ＪＨＥ、０５ＰＳＶ、０５Ｗ２Ｙ、０５Ｗ３Ｈ、０５ＸＪ５、０７０Ｑ９、０７ＣＷＣ、０７ＱＦ７、０７ＱＮＫ、０７ＲＢＪ、０７ＲＪ１、０７Ｔ５Ｅ、０７ＶＱ３、０８１４Ｃ、０８８ＱＴ、０８Ｈ１５、０８Ｎ８Ａ、０８ＳＣ４、０８Ｚ４Ｑの群から選択されるか、Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターは、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺ１、０５ＣＪ１、０５ＤＭＫ、０５ＤＦＷ、０５ＥＹ８、０５ＨＡＣ、０５ＭＦＶ、０７ＦＫＫ、０７Ｒ５Ｕ、０７Ｖ１Ｔ、０８ＩＪ９、０８ＪＱ７、１７２Ｔ７の群から選択されるか、βバレル型ポリンは、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＤＡＹ、０８ＫＤＤの群から選択されるか、補助輸送タンパク質は、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０７ＳＹＲの群から選択されるか、推定輸送タンパク質は、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＲＥ、０５ＧＷＦ、０６Ｎ３Ａの群から選択されるか、またはリン酸基転移駆動性基輸送体タンパク質は、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＩ１、０５ＶＩ０の群から選択される。前記ｅｇｇｎｏｇファミリーは、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ１．０．２によって定義されるように分類される。
【0070】
上記実施形態の別の好ましい態様では、ポーターは、ＰＦ０００８３、ＰＦ００４７４、ＰＦ００８７３、ＰＦ００８９３、ＰＦ０１８９５、ＰＦ０１９４３、ＰＦ０２６９０、ＰＦ０３０８３、ＰＦ０４１９３、ＰＦ０５９７７、ＰＦ０７６９０、ＰＦ０７６９０、ＰＦ１３３４７、ＰＦ１３４４０、ＰＦ１４６６７のＰＦＡＭリストから選択される；Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターは、ＰＦＡＭリストのＰＦ００００５、ＰＦ００５３２、ＰＦ００６６４、ＰＦ０１０６１、ＰＦ０８３５２、ＰＦ１４５２４、ＰＦ１３４０７、ＰＦ１３４１６、ＰＦ１７９１２から選択される；βバレル型ポリンは、ＰＦＡＭリストのＰＦ０２２６４、ＰＦ０２５６３、ＰＦ１０５３１、ＰＦ１８４１２から選択される；補助輸送タンパク質は、ＰＦＡＭリストのＰＦ１３８０７、ＰＦ０２７０６から選択される；推定輸送タンパク質は、ＰＦＡＭリストのＰＦ０１５７８、ＰＦ０３９３２、ＰＦ０５１４０、ＰＦ１１０４５から選択される；および／またはリン酸基転移駆動性基輸送体タンパク質は、ＰＦＡＭリストのＰＦ００３６７、ＰＦ００３５８、ＰＦ０２３７８、ＰＦ０３８２９から選択される。前記ＰＦＡＭリストは、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ３２．０によって定義されるように分類される。
【0071】
上記実施形態の別の好ましい態様では、ポーターは、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００３９０、ＩＰＲ００１０３６、ＩＰＲ００１４１１、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１９２７、ＩＰＲ００２７９７、ＩＰＲ００３６６３、ＩＰＲ００３８４１、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００４６３３、ＩＰＲ００４６３８、ＩＰＲ００４７３４、ＩＰＲ００４８１２、ＩＰＲ００５２７５、ＩＰＲ００５８２８、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ０１０２９０、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３００８、ＩＰＲ０２３７２１、ＩＰＲ０２３７２２、ＩＰＲ０２６０２２、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２７４６３、ＩＰＲ０２９３０３、ＩＰＲ０３２８９６、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３８０７８、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９６７２から選択される；Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターは、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００４１２、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１７６１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００５９７８、ＩＰＲ００５９８１、ＩＰＲ００６０５９、ＩＰＲ００６０６０、ＩＰＲ００６０６１、ＩＰＲ００８９９５、ＩＰＲ０１１５２７、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０１３４５６、ＩＰＲ０１３５２５、ＩＰＲ０１３５６３、ＩＰＲ０１５８５１、ＩＰＲ０１５８５５、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２５９９７、ＩＰＲ０２６２６６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２８０８２、ＩＰＲ０２９４３９、ＩＰＲ０３３８９３、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３６６４０、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９４２１、ＩＰＲ０４０５８２から選択される；βバレル型ポリンは、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３１９２、ＩＰＲ００３７１５、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２３７３８、ＩＰＲ０３６９９８、ＩＰＲ０４０７１６から選択される；補助輸送タンパク質は、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３８５６、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３２８０７、ＩＰＲ０３６２５９から選択される；推定輸送タンパク質は、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００２５４１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００５６２７、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ００７８１６、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０２０３６８、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３６４８、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３６８２２から選択される；またはリン酸基転移駆動性基輸送体タンパク質は、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストＩＰＲ００１１２７、ＩＰＲ００１９９６、ＩＰＲ００３３５２、ＩＰＲ００４７１６、ＩＰＲ０１０９７４、ＩＰＲ０１１０５５、ＩＰＲ０１３０１３、ＩＰＲ０１８１１３、ＩＰＲ０１８４５４、ＩＰＲ０３６６６５、ＩＰＲ０３６８７８から選択される。前記ｉｎｔｅｒｐｒｏリストは、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ７５．０によって定義されるように分類される。
【0072】
本発明の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号４０を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）、または配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＤＳＭ ２５３２９のｗｚｘ様タンパク質、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号０２、０６、４０、４２、５８、６６、６４もしくは６２を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２３３２膜タンパク質もしくはｗｚｘ様膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるポーター膜タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。別の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＳＲＣＭ１０３４５７由来のｌｍｒＡ、配列番号７０および７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５または配列番号６８および７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ膜タンパク質、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、または配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、あるいは上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログまたは機能性断片、あるいはそれぞれ、配列番号２８、７０、７４、６８、７２、７６、８２、８４、２０６、２０８、２１４、２１６、または２１８を含む前記ｌｍｒＡ、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦまたはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
【0073】
なお別の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるβバレル型ポリンを発現する宿主細胞を使用する。
【0074】
代替の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される補助輸送タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
【0075】
別の代替の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１もしくは配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、または前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号９０、９２、９４もしくは９６を含む前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される推定輸送タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
【0076】
別の代替の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、または配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、またはそれらの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるリン酸基転移駆動性基輸送体を発現する宿主細胞を使用する。
【0077】
なおさらなる代替の好ましい態様では、本明細書に記載される方法は、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるポーター膜タンパク質；配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、
Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔもしくはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター；配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される推定輸送タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔもしくはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター；配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される推定輸送タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
【0078】
本明細書で使用される場合、列挙された膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、その配列が、各膜タンパク質のアミノ酸配列の全長に対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５，５％、９６％、９６，５％、９７％、９７，５％、９８％、９８，５％、９９％、９９，５％、９９，６％、９９，７％、９９，８％、９９，９％の配列同一性を有するものと理解されるべきである。
【0079】
そのような膜タンパク質のアミノ酸配列は、添付の配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６もしくは２１８から選択される配列、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６もしくは２１８のいずれか１つの全長アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性、すなわち８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５，５％、９６％、９６，５％、９７％、９７，５％、９８％、９８，５％、９９％、９９，５％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。
【0080】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載される方法は、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である膜タンパク質を発現する宿主細胞を使用する。
【0081】
さらに好ましい態様では、本明細書に記載されるフコシルラクトースの産生のための方法は、
ｉ）好ましくは連続的に、総反応体積が２５０ｍＬ（ミリリットル）～１０．０００ｍ３（立方メートル）の範囲である初期の反応器体積１リットル当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、前記培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の前記培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
前記培養培地の前記最終体積において、少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす。
ｉ）好ましくは連続的に、総反応体積が２５０ｍＬ（ミリリットル）～１０．０００ｍ３（立方メートル）の範囲である初期の反応器体積１リットル当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、前記培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の前記培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
前記培養培地の前記最終体積において、少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす。
【0082】
好ましくは、前記ラクトースフィードは、培養の開始から、少なくとも５ｍＭの濃度、好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０ｍＭの濃度、より好ましくは３００ｍＭを超える濃度のラクトースを添加することによって達成される。
【0083】
別の態様では、前記ラクトースフィードは、前記培養培地に、培養の生産段階を通して、少なくとも５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭまたは３０ｍＭのラクトース濃度が得られるような濃度で、ラクトースを添加することによって達成される。
【0084】
本明細書に記載される方法のさらなる実施形態では、宿主細胞は、少なくとも約６０、８０、１００、もしくは約１２０時間または連続的に培養される。
【0085】
本明細書に記載される方法の別の実施形態では、炭素およびエネルギー供給源、好ましくはスクロース、グルコース、フルクトース、グリセロール、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、ポリオール、デンプン、スクシネート、マレエート、ピルベート、ラクテート、エタノール、シトレート、および／またはラクトースも、好ましくは連続的に前記培養培地に、好ましくはラクトースと共に添加される。
【0086】
好ましい実施形態では、炭素ベースの基質、好ましくはスクロースは、３日もしくはそれより長い日数、好ましくは最大７日間培養培地中で提供され、および／または連続的に、初期培養体積１リットル当たり少なくとも１００グラム、有利には少なくとも１０５グラム、より有利には少なくとも１１０グラム、さらにより有利には少なくとも１２０グラムのスクロースの培養培地中で提供され、その結果、培養培地の最終体積は、培養前の培養培地の体積の３倍以下、有利には２倍以下、より有利には２倍未満である。
【0087】
好ましくは、本明細書に記載される方法を実施する場合、指数関数的細胞成長の第１段階が、第２段階に前記ラクトースが前記培養培地に添加される前に、炭素ベースの基質、好ましくはグルコースまたはスクロースを前記培養培地に添加することによって提供される。
【0088】
代替の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法において、ラクトースは、炭素ベースの基質と一緒に指数関数的成長の第１段階で既に添加されている。
【0089】
別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよびジフコシルラクトースからなる群の唯一のフコシルラクトースを産生する。
【0090】
代替の実施形態では、本明細書に記載される方法は、フコシルラクトースの混合物を産生する。
【0091】
そのような混合物は、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよびジフコシルラクトースからなる群のうちの少なくとも２種を含み得る。
【0092】
本明細書に記載される方法では、前記遺伝子改変された細胞は、すべて本明細書に記載されるとおりの、微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳類である。
【0093】
特定の例示的実施形態では、本発明の方法は、高収率でフコシルラクトースの産生を提供する。本方法は、ラクトース、遺伝子改変された細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ、より好ましくは遺伝子ｌａｃＺ、ｌａｃＹ ｌａｃＡ、ｇｌｇＣ、ａｇｐ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｐｇｉ、ａｒｃＡ、ｉｃｌＲ、ｗｃａＪ、ｌｏｎおよびｔｈｙＡをノックアウトすることによって改変されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を含有する水性培養培地または発酵培地中で、培養するまたは発酵させるステップを含む。さらにより好ましくは、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃＹ遺伝子、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓに由来するフルクトースキナーゼ遺伝子（ｆｒｋ）およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓに由来するスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）は、ゲノム内にノックインされ、構成的に発現され得る。構成的プロモーターは、De Mey et al.(BMC Biotechnology, 2007)によって記載されたプロモーターライブラリーに由来する。これらの遺伝子改変は、ＷＯ２０１６０７５２４３およびＷＯ２０１２００７４８１にも記載される。さらに、改変されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、例示的実施形態では、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）を産生するためにラクトースを改変することが可能である、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼであり得る単一のフコシルトランスフェラーゼをコードする組換え遺伝子を有する。さらに、細胞は、本明細書に記載される膜タンパク質のいずれか１つの発現をコードする組換え遺伝子を含む。
【0094】
本発明の別の態様は、フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、フコシルラクトース合成に関与する酵素、より具体的にはＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、ｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送に関与する、より具体的にはフコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含む、宿主細胞を提供する。膜タンパク質は、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質はＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される。
【0095】
あるいはまたは好ましくは、膜タンパク質は、
ａ）ＳＥＴを除くポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される。
ａ）ＳＥＴを除くポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される。
【0096】
あるいはまたは好ましくは、前記膜タンパク質は、ｉ）配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるポーター膜タンパク質；ｉｉ）配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８６もしくは１８８を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、
Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター；ｉｉｉ）配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される推定輸送タンパク質；ｉｖ）配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、またはそれらの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるβバレル型ポリン；ｖ）配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される補助輸送タンパク質；ｖｉ）配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、またはそれらの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるリン酸基転移駆動性基輸送体の群から選択される。
Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択されるＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター；ｉｉｉ）配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される推定輸送タンパク質；ｉｖ）配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、またはそれらの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるβバレル型ポリン；ｖ）配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される補助輸送タンパク質；ｖｉ）配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、またはそれらの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択されるリン酸基転移駆動性基輸送体の群から選択される。
【0097】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載される細胞は、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である膜タンパク質を発現する。
【0098】
別の態様は、培地中で安定的に培養される細胞であって、前記培地が、最少培地、複合培地または例えば、非限定的に、ビタミン、微量元素、アミノ酸のような特定の化合物を豊富に含む成長培地を含むいずれかのタイプの成長培地であり得る、細胞を提供する。
【0099】
好ましくは、細胞は、ラクトーストランスポーター、フコーストランスポーター、ヌクレオチド活性化糖のためのトランスポーターからなる群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むように形質転換される。
【0100】
本明細書に記載の方法において、細胞は、任意の生物の細胞であってもよい。「生物」または「細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌、酵母もしくは真菌からなるリストから選択される微生物を指すか、または植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞およびプロトゾア細胞を指す。後者の細菌は、好ましくは、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門またはＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門またはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ門に属する。Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門に属する後者の細菌は、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する。後者の細菌は、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種に属する任意の株、例えば、非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅに関する。より具体的には、後者の用語は、研究室環境に十分に適合され、野生型株とは異なり、腸内で繁栄する能力を失っている、培養されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株と命名される）に関する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の周知の例は、Ｋ１２野生型、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｍ１８２、ＭＣ１０００、ＭＣ１０６０、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＪＭ１０１、ＮＺＮ１１１およびＡＡ２００である。したがって、好ましくは本発明は、具体的には、上記で示した変異したおよび／または形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株であって、Ｋ１２株であるＥ．ｃｏｌｉ株に関する。より具体的には、本発明は、上記で示した変異したおよび／または形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株であって、前記Ｋ１２株がＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５である、Ｅ．ｃｏｌｉ株に関する。好ましくは、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門に属する後者の細菌は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ種由来の桿菌に属する。後者の酵母は、好ましくは、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ門またはＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門またはＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ門またはＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ門に属する。後者の酵母は、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｕｎｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、ＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＤｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する。後者の真菌は、好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ、ＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する。「植物細胞」は、顕花および非顕花植物の細胞、ならびに藻類細胞、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａなどを含む。好ましくは、前記植物細胞は、タバコ、アルファルファ、イネ、トマト、穀物、トウモロコシまたはダイズの細胞であり、前記哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞であり、前記昆虫細胞は、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞であり、前記プロトゾア細胞は、Ｌ．ｔａｒｅｎｔｏｌａｅの細胞である。
【0101】
好ましい実施形態では、細胞は微生物の細胞であり、より好ましくは、前記微生物は、細菌または酵母である。より好ましい実施形態では、微生物は細菌、最も好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。そのようなＥ．ｃｏｌｉを使用する例は、本明細書に記載される。
【0102】
別のより好ましい実施形態では、細菌は酵母である。フコシルラクトースの産生のために、および本発明において使用可能な酵母を使用する例は、例えば、Hollands et al.(Metabolic Engineering 52 (2019) 232-242)に記載される。
【0103】
選択された単糖、二糖またはオリゴ糖に関する細胞の異化経路は少なくとも部分的に不活性化され、単糖、二糖またはオリゴ糖は、フコシルラクトースの合成に関与するおよび／または必要とされることが一般的に好ましい。
【0104】
さらなる実施形態では、本発明は、フコシルラクトースの産生のための方法であって、本明細書に記載される細胞が、前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で培養するために使用される、方法を提供する。次いで、フコシルラクトースは培養から分離される。本明細書で使用される場合、産生を許容する条件は、非限定的に、温度、ｐＨ、圧力、浸透圧および生成物／抽出物の濃度を含む、細胞の成長および生存を可能にする物理的または化学的パラメーターに関する条件であると理解されるべきである。好ましくは、そのような許容される条件は、３０＋／－２０℃の温度範囲、７＋／－３のｐＨ範囲を含み得る。
【0105】
本発明による細胞はフコシルラクトースを産生する。フコシルラクトースは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよびジフコシルラクトースからなる群から選択される。
【0106】
本発明の別の態様は、フコシルラクトースの発酵産生において、本明細書で定義される膜タンパク質の群から選択される膜タンパク質の使用を提供する。フコシルラクトースは、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよびジフコシルラクトースからなる群から選択される。
【0107】
さらなる態様では、本発明は、フコシルラクトースの産生のための方法における、本明細書で定義される細胞の使用を提供する。
【0108】
また別の態様では、本発明は、本明細書で定義される細胞の使用であって、前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび／またはジフコシルラクトースである、使用を提供する。
【0109】
さらに、本発明は、本発明による方法によって得られるフコシルラクトース、およびフコシルラクトースを産生するための、上記のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、微生物またはポリペプチドの使用にも関する。フコシルラクトースは、ベビーフード、成人の食物もしくは飼料の栄養補助のための食品添加物、プレバイオティクス、シンバイオティクスとして、または治療的もしくは薬学的に活性な化合物として使用することができる。新規方法を用いて、複雑な、時間と費用を消費する合成プロセスを必要とせずに、フコシルラクトースを容易かつ効果的に提供することができる。
【0110】
本明細書で使用される場合、「分離する」という用語は、本明細書で説明されるように、フコシルラクトースを宿主細胞および／またはその成長培地から採取、収集または回収することを意味する。
【0111】
フコシルラクトースは、混合物が製造された培養物または水性培養培地から、従来型の様式で分離することができる。フコシルラクトースがフコシルラクトースを産生する細胞内にまだ存在している場合、細胞からフコシルラクトースを遊離または抽出するための従来型の様式、例えば、高ｐＨ、ヒートショック、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、酵素加水分解、化学加水分解、溶媒加水分解、洗剤、加水分解などを使用する細胞破壊を使用することができる。培養培地、反応混合物および／または細胞抽出物は、共に、および別々に、フコシルラクトース含有混合物または培養物と呼ばれ、その後、フコシルラクトースを分離するためにさらに使用され得る。
【0112】
典型的には、オリゴ糖、およびオリゴ糖であるフコシルラクトースは、最初に、マクロ構成成分、すなわち第１に、細胞および細胞デブリ、次いでより小さい構成成分、すなわちタンパク質、エンドドキシンおよび１０００Ｄａから１０００ｋＤａの間の他の構成成分を除去することによって精製され、次いで、第１のステップにおいてナノ濾過膜または電気透析を用いてオリゴ糖を保持し、第２のステップにおいてイオン交換クロマトグラフィー（カチオン交換樹脂とアニオン交換樹脂からなり、最も好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーの前に実施される）としても公知のイオン交換によって、オリゴ糖を脱塩する。これらのステップは、重合の程度にわずかな差しかない糖を互いに分離しない。前記分離は、例えば、クロマトグラフィーによる分離によってなされる。
【0113】
これは、好ましくは、フコシルラクトース含有混合物を浄化して、懸濁された微粒子および夾雑物、特に、遺伝子改変された細胞を培養することおよび／または酵素反応を行うことによって産生された細胞、細胞成分、不溶性代謝物および細片を除去することを含む。このステップでは、フコシルラクトース含有混合物は、従来型の様式で浄化され得る。好ましくは、フコシルラクトース含有混合物は、遠心分離、凝結、デカンテーションおよび／または濾過によって浄化される。フコシルラクトースをフコシルラクトース含有混合物から分離する第２のステップは、好ましくはフコシルラクトース含有混合物が浄化された後に、好ましくは、実質的に全てのタンパク質、ならびに次の分離ステップに干渉し得るペプチド、アミノ酸、ＲＮＡおよびＤＮＡおよび任意のエンドトキシンおよび糖脂質を、フコシルラクトース含有混合物から除去することを含む。このステップでは、タンパク質および関連する不純物は、従来型の様式でフコシルラクトース含有混合物から除去され得る。好ましくは、タンパク質、塩、副産物、色および他の関連する不純物は、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透法、精密濾過、活性炭もしくは炭素処理、接線流高性能濾過、接線流限外濾過、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、非限定的に、カチオン交換、アニオン交換、混床式イオン交換）、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはゲル濾過（すなわち、サイズ排除クロマトグラフィー）によって、特にクロマトグラフィーによって、より具体的にはイオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはリガンド交換クロマトグラフィーによってフコシルラクトース含有混合物から除去される。サイズ排除クロマトグラフィーを除いては、タンパク質および関連する不純物は、クロマトグラフィー媒体または選択される膜によって保持され、一方で、フコシルラクトースはフコシルラクトース含有混合物中に残る。
【0114】
分子量が１０００Ｄａ（ダルトン）を超える夾雑化合物は、１０００Ｄａを超え、およそ１０００ｋＤａまでのカットオフを有する限外濾過膜によって除去される。膜は、夾雑物を保持し、オリゴ糖を濾液へと通過させる。典型的な限外濾過の原理は当技術分野で周知であり、管型モジュール、ホローファイバー、渦巻型またはプレートに基づく；これらは、クロスフロー条件で、または全量濾過において使用される。膜の組成は周知であり、いくつかの供給メーカーから入手可能であり、ＰＥＳ（ポリエチレンスルホン）、ポリビニルピロリドン、ＰＡＮ（ポリアクリロニトリル）、ＰＡ（Ｐｏｌｙ－アミド）、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、ＮＣ（ニトロセルロース）、セラミック物質またはこれらの組合せから構成される。
【0115】
オリゴ糖より小さい構成成分、例えば、単糖、塩、二糖、酸、塩基、培地成分は、ナノ濾過または／および電気透析によって分離される。そのような膜は、１００Ｄａから１０００Ｄａの間の分子量カットオフを有する。２’－フコシルラクトースなどのオリゴ糖では、最適なカットオフは、３００Ｄａから５００Ｄａの間であり、濾液における損失が最小限になる。典型的な膜の組成は周知であり、例えば、ポリアミド（ＰＡ）、ＴＦＣ、ＰＡ－ＴＦＣ、ポリピペラジン－アミド、ＰＥＳ、酢酸セルロースまたはそれらの組合せである。
【0116】
フコシルラクトースは、エバポレーション、凍結乾燥、結晶化、沈殿、および／または乾燥、噴霧乾燥によるさらなる精製ステップを用いてまたは用いないで、培養培地および／または細胞からさらに単離される。前記さらなる精製ステップによって、フコシルラクトースを他のオリゴ糖および／または生成物と組み合わせた製剤化、例えば、非限定的に、噴霧乾燥、乾燥もしくは凍結乾燥による合剤化、または液体形態でのエバポレーションによる濃縮が可能になる。
【0117】
またさらなる態様では、また、本発明は、フコシルラクトースのさらなる精製を提供する。前記フコシルラクトースのさらなる精製は、例えば、（活性）炭もしくは炭素、ナノ濾過、限外濾過またはイオン交換の使用によって達成されて、任意の残留するＤＮＡ、タンパク質、ＬＰＳ、エンドトキシンまたは他の不純物を除去し得る。また、アルコール、例えば、エタノールおよび水性アルコール混合物を使用してもよい。別の精製ステップは、生成物の結晶化または沈殿によって達成される。別の精製ステップは、フコシルラクトースを噴霧乾燥または凍結乾燥することである。
【0118】
分離され、好ましくは、また、精製されたフコシルラクトースは、調整粉乳中の栄養補助剤として、および新生児における様々な疾患を処置するために使用することができる。
【0119】
本明細書の実施例において示されるように、同一の遺伝的バックグラウンドを有するが、異種膜タンパク質の発現または内因性膜タンパク質のモジュレートされた発現を欠くフコシルラクトース産生宿主と比較した場合、本発明の方法および細胞は、本明細書で定義される膜タンパク質を使用する場合、以下の驚くべき利点のうちの少なくとも１つを提供する：
－ より高いフコシルラクトース力価（増強された）（ｇ／Ｌ）、
－ より高い産生率ｒ（フコシルラクトースのｇ／Ｌ／時）、
－ より高い細胞性能指数ＣＰＩ（フコシルラクトースのｇ／Ｘのｇ）、
－ より高い特異的産生性Ｑｐ（フコシルラクトースのｇ／Ｘのｇ／時）、
－ スクロースに関するより高い収率Ｙｓ（フコシルラクトースのｇ／スクロースのｇ）、
－ より高いスクロースの取込み／変換率Ｑｓ（スクロースのｇ／Ｘのｇ／時）、
－ より高いラクトースの変換／消費率ｒｓ（ラクトースのｇ／時）、
－ 増強されたフコシルラクトースの分泌、および／または
－ 増強された産生宿主の成長速度。
－ より高いフコシルラクトース力価（増強された）（ｇ／Ｌ）、
－ より高い産生率ｒ（フコシルラクトースのｇ／Ｌ／時）、
－ より高い細胞性能指数ＣＰＩ（フコシルラクトースのｇ／Ｘのｇ）、
－ より高い特異的産生性Ｑｐ（フコシルラクトースのｇ／Ｘのｇ／時）、
－ スクロースに関するより高い収率Ｙｓ（フコシルラクトースのｇ／スクロースのｇ）、
－ より高いスクロースの取込み／変換率Ｑｓ（スクロースのｇ／Ｘのｇ／時）、
－ より高いラクトースの変換／消費率ｒｓ（ラクトースのｇ／時）、
－ 増強されたフコシルラクトースの分泌、および／または
－ 増強された産生宿主の成長速度。
【0120】
さらに、本発明は、以下の具体的実施形態に関する：
実施形態１．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、それぞれｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していない、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、培養からフコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
実施形態１．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、それぞれｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していない、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、培養からフコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【0121】
実施形態２．前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、実施形態１に記載の方法。
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【0122】
実施形態３．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、培養からフコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、培養からフコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【0123】
実施形態４．前記ポーターが、ＴＣＤＢクラスの２．Ａ．１．１、２．Ａ．１．１２、２．Ａ．１．１５、２．Ａ．１．２、２．Ａ．１．３、２．Ａ．１．３６、２．Ａ．１．３８、２．Ａ．１．４６、２．Ａ．１．６８、２．Ａ．１．７、２．Ａ．１．８１、２．Ａ．１２３、２．Ａ．２、２．Ａ．２１、２．Ａ．５８、２．Ａ．６．３、２．Ａ．６６および２．Ａ．７．１の群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0124】
実施形態５．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、ＴＣＤＢクラスの３．Ａ．１．１、３．Ａ．１．１０、３．Ａ．１．１１および３．Ａ．１．５の群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0125】
実施形態６．前記βバレル型ポリンが、ＴＣＤＢクラスの１．Ｂ．１８から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0126】
実施形態７．前記補助輸送タンパク質が、ＴＣＤＢクラスの８．Ａ．３から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0127】
実施形態８．前記推定輸送タンパク質が、ＴＣＤＢクラスの９．Ｂ．１４および９．Ｂ．１５８の群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0128】
実施形態９．前記ポーターが、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺＳ、０５Ｃ０Ｒ、０５Ｃ２Ｃ、０５ＣＴ４、０５ＣＸＰ、０５ＣＺＱ、０５Ｄ９４、０５ＤＸＩ、０５Ｅ５Ｍ、０５Ｅ５Ｗ、０５Ｅ８Ｇ、０５ＥＡＭ、０５ＥＤＲ、０５ＥＧＺ、０５Ｆ９Ｎ、０５ＪＨＥ、０５ＰＳＶ、０５Ｗ２Ｙ、０５Ｗ３Ｈ、０５ＸＪ５、０７０Ｑ９、０７ＣＷＣ、０７ＱＦ７、０７ＱＮＫ、０７ＲＢＪ、０７ＲＪ１、０７Ｔ５Ｅ、０７ＶＱ３、０８１４Ｃ、０８８ＱＴ、０８Ｈ１５、０８Ｎ８Ａ、０８ＳＣ４、０８Ｚ４Ｑの群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0129】
実施形態１０．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺ１、０５ＣＪ１、０５ＥＹ８、０５ＨＡＣ、０５ＭＦＶ、０７Ｖ１Ｔ、０８ＩＪ９、０８ＪＱ７の群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0130】
実施形態１１．前記βバレル型ポリンが、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＤＡＹの群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0131】
実施形態１２．前記補助輸送タンパク質が、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０７ＳＹＲの群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0132】
実施形態１３．前記推定輸送タンパク質が、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＲＥ、０５ＧＷＦ、０６Ｎ３Ａの群から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0133】
実施形態１４．前記ポーターが、ＰＦＡＭリストのＰＦ０００８３、ＰＦ００４７４、ＰＦ００８７３、ＰＦ００８９３、ＰＦ０１８９５、ＰＦ０１９４３、ＰＦ０２６９０、ＰＦ０３０８３、ＰＦ０４１９３、ＰＦ０５９７７、ＰＦ０７６９０、ＰＦ０７６９０、ＰＦ１３３４７、ＰＦ１３４４０およびＰＦ１４６６７から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0134】
実施形態１５．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、ＰＦＡＭリストのＰＦ００００５、ＰＦ００６６４、ＰＦ０１０６１、ＰＦ０８３５２、ＰＦ１４５２４およびＰＦ１７９１２から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0135】
実施形態１６．前記βバレル型ポリンが、ＰＦＡＭリストのＰＦ０２５６３、ＰＦ１０５３１およびＰＦ１８４１２から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0136】
実施形態１７．前記補助輸送タンパク質が、ＰＦＡＭリストのＰＦ１３８０７およびＰＦ０２７０６から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0137】
実施形態１８．前記推定輸送タンパク質が、ＰＦＡＭリストのＰＦ０１５７８、ＰＦ０３９３２、ＰＦ０５１４０およびＰＦ１１０４５から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0138】
実施形態１９．前記ポーターが、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００３９０、ＩＰＲ００１０３６、ＩＰＲ００１４１１、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１９２７、ＩＰＲ００２７９７、ＩＰＲ００３６６３、ＩＰＲ００３８４１、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００４６３３、ＩＰＲ００４６３８、ＩＰＲ００４７３４、ＩＰＲ００４８１２、ＩＰＲ００５２７５、ＩＰＲ００５８２８、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ０１０２９０、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３００８、ＩＰＲ０２３７２１、ＩＰＲ０２３７２２、ＩＰＲ０２６０２２、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２７４６３、ＩＰＲ０２９３０３、ＩＰＲ０３２８９６、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３８０７８、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９６７２から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0139】
実施形態２０．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００４１２、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００５９７８、ＩＰＲ００５９８１、ＩＰＲ００８９９５、ＩＰＲ０１１５２７、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０１３５２５、ＩＰＲ０１３５６３、ＩＰＲ０１５８５１、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２９４３９、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３６６４０、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９４２１およびＩＰＲ０４０５８２から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0140】
実施形態２１．前記βバレル型ポリンが、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３７１５、ＩＰＲ０１９５５４およびＩＰＲ０４０７１６から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0141】
実施形態２２．前記補助輸送タンパク質が、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３８５６、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３２８０７およびＩＰＲ０３６２５９から選択される、実施形態２に記載の方法。
【0142】
実施形態２３．前記推定輸送タンパク質が、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００２５４１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００５６２７、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ００７８１６、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０２０３６８、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３６４８、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３６２５９およびＩＰＲ０３６８２２から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0143】
実施形態２４．前記ポーター膜タンパク質が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）、またはＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＤＳＭ ２５３２９のｗｚｘ様タンパク質、または上記ポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２３３２膜タンパク質もしくはｗｚｘ様膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0144】
実施形態２５．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ｂｖ． Ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ由来のｌｍｒＡ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ膜タンパク質、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉまたはＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ｌｍｒＡ、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣもしくはＭｓｂＡ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0145】
実施形態２６．前記βバレル型ポリンが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚａ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0146】
実施形態２７．前記補助輸送タンパク質が、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0147】
実施形態２８．前記推定輸送タンパク質が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ： １０１３、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１もしくはＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、または前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0148】
実施形態２９．前記ポーター膜タンパク質が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＦ２＿４２＿９由来のＮＡｍ、Ｎｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、Ｓａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0149】
実施形態３０．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔまたはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0150】
３１．前記推定輸送タンパク質が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣまたはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0151】
実施形態３２．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ポーター膜タンパク質であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＦ２＿４２＿９由来のＮＡｍ、Ｎｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、Ｓａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターであるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔまたはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびβバレル型ポリン膜タンパク質であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚａ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および補助輸送タンパク質であるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および推定輸送タンパク質であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる膜タンパク質の群から選択される、ステップ
を含む、方法。
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ポーター膜タンパク質であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＦ２＿４２＿９由来のＮＡｍ、Ｎｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、Ｓａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターであるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔまたはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびβバレル型ポリン膜タンパク質であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚａ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および補助輸送タンパク質であるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および推定輸送タンパク質であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質
からなる膜タンパク質の群から選択される、ステップ
を含む、方法。
【0152】
実施形態３３．
ｉ）好ましくは連続的に、初期の反応器体積当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／ｌ、好ましくは７５ｇ／ｌ、より好ましくは１００ｇ／ｌ、より好ましくは１２５ｇ／ｌ、より好ましくは１５０ｇ／ｌ、より好ましくは１７５ｇ／ｌ、より好ましくは２００ｇ／ｌ、より好ましくは２２５ｇ／ｌ、より好ましくは２５０ｇ／ｌ、より好ましくは２７５ｇ／ｌ、より好ましくは３００ｇ／ｌ、より好ましくは３２５ｇ／ｌ、より好ましくは３５０ｇ／ｌ、より好ましくは３７５ｇ／ｌ、より好ましくは４００ｇ／ｌ、より好ましくは４５０ｇ／ｌ、より好ましくは５００ｇ／ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／ｌ、最も好ましくは６００ｇ／ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
ｉｖ）前記培養培地の最終体積において、少なくとも５０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす、前記実施形態のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
ｉ）好ましくは連続的に、初期の反応器体積当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／ｌ、好ましくは７５ｇ／ｌ、より好ましくは１００ｇ／ｌ、より好ましくは１２５ｇ／ｌ、より好ましくは１５０ｇ／ｌ、より好ましくは１７５ｇ／ｌ、より好ましくは２００ｇ／ｌ、より好ましくは２２５ｇ／ｌ、より好ましくは２５０ｇ／ｌ、より好ましくは２７５ｇ／ｌ、より好ましくは３００ｇ／ｌ、より好ましくは３２５ｇ／ｌ、より好ましくは３５０ｇ／ｌ、より好ましくは３７５ｇ／ｌ、より好ましくは４００ｇ／ｌ、より好ましくは４５０ｇ／ｌ、より好ましくは５００ｇ／ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／ｌ、最も好ましくは６００ｇ／ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
ｉｖ）前記培養培地の最終体積において、少なくとも５０ｇ／ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす、前記実施形態のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
【0153】
実施形態３４．前記ラクトースフィードが、培養の開始から、少なくとも５ｍＭの濃度、好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０ｍＭの濃度、より好ましくは３００ｍＭを超える濃度のラクトースを添加することによって達成される、実施形態３３に記載の方法。
【0154】
実施形態３５．前記ラクトースフィードが、前記培養培地に、培養の生産段階を通して、少なくとも５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭまたは３０ｍＭのラクトース濃度が得られるような濃度で、ラクトースを添加することによって達成される、実施形態３３または３４のいずれか一つに記載の方法。
【0155】
実施形態３６．宿主細胞が、少なくとも約６０、８０、１００、もしくは約１２０時間または連続的に培養される、実施形態３３、３４または３５のいずれかに記載の方法。
【0156】
実施形態３７．炭素およびエネルギー供給源、好ましくはスクロース、グルコース、フルクトース、グリセロール、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、ポリオール、デンプン、スクシネート、マレエート、ピルベート、ラクテート、エタノール、シトレート、ラクトースも、好ましくは連続的に前記培養培地に、好ましくはラクトースと共に添加される、実施形態３３から３６のいずれか１つに記載の方法。
【0157】
実施形態３８．指数関数的細胞成長の第１段階が、第２段階に前記ラクトースが前記培養培地に添加される前に、炭素ベースの基質、好ましくはグルコースまたはスクロースを前記培養培地に添加することによって提供される、実施形態３３から３７のいずれか１つに記載の方法。
【0158】
実施形態３９．フコシルラクトースの混合物を生産する、実施形態１から３８のいずれか１つに記載の方法。
【0159】
実施形態４０．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび／またはジフコシルラクトースである、実施形態１から３９のいずれか１つに記載の方法。
【0160】
実施形態４１．前記遺伝子改変された細胞が、微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳類である、実施形態１から４０のいずれか１つに記載の方法。
【0161】
実施形態４２．前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、実施形態４１に記載の方法。
【0162】
実施形態４３．フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、それぞれｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していない、宿主細胞。
－ ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、それぞれｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していない、宿主細胞。
【0163】
実施形態４４．前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、実施形態４３に記載の宿主細胞。
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、実施形態４３に記載の宿主細胞。
【0164】
実施形態４５．フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、宿主細胞。
－ 前記細胞が、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現、および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、および
ｅ）推定輸送タンパク質
の群から選択される、宿主細胞。
【0165】
実施形態４６．前記膜タンパク質が、実施形態４から３２のいずれか１つにおいて定義される膜タンパク質の群から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0166】
実施形態４７．ポーター膜タンパク質が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ． ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、Ｄｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＦ２＿４２＿９由来のＮＡｍ、Ｎｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、Ｓａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、Ｐｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、Ｙｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、Ｌｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ． ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞。
【0167】
実施形態４８．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ． Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、ＷｚｔまたはＮｏｄｊ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0168】
実施形態４９．前記推定輸送タンパク質が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ． ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣまたはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0169】
実施形態５０．前記βバレル型ポリンが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚａ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0170】
実施形態５１．前記補助輸送タンパク質が、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃまたはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、実施形態４４または４５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0171】
実施形態５２．培地中で安定的に培養される細胞であって、フコシルラクトースの産生のために調整され、フコシルラクトース合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むように形質転換され、さらに、ｉ）内因性膜タンパク質の改変された発現および／またはｉｉ）異種膜タンパク質の発現を含み、前記膜タンパク質が、実施形態１から３３のいずれか１つにおいて定義されている、細胞。
【0172】
実施形態５３．微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳動物である、実施形態４３から５２のいずれか１つに記載の細胞。
【0173】
実施形態５４．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、実施形態５３に記載の宿主細胞。
【0174】
実施形態５５．少なくとも部分的に不活性化され、単糖、二糖またはオリゴ糖が、フコシルラクトースの合成に関与するおよび／または必要とされる、選択された前記単糖、二糖またはオリゴ糖に関する異化経路を含む、実施形態４３から５４のいずれか１つに記載の細胞。
【0175】
実施形態５６．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたはジフコシルラクトースである、実施形態４３から５５のいずれか１つに記載の細胞。
【0176】
実施形態５７．フコシルラクトースの産生のための方法であって、
ａ）実施形態４３から５６のいずれか１つに記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）前記フコシルラクトースを前記培養から分離するステップと
を含む、方法。
ａ）実施形態４３から５６のいずれか１つに記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）前記フコシルラクトースを前記培養から分離するステップと
を含む、方法。
【0177】
実施形態５８．フコシルラクトースの発酵産生における、実施形態１から３１のいずれか１つにおいて定義される膜タンパク質群から選択される膜タンパク質の使用。
【0178】
実施形態５９．フコシルラクトースの産生のための方法における、実施形態４３から５６のいずれか１つに記載の細胞の使用。
【0179】
実施形態６０．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび／またはジフコシルラクトースである、実施形態５９に記載の細胞の使用。
【0180】
さらに、本発明は、以下の好ましい具体的実施形態に関する：
具体的実施形態１．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、グアノシン－ジホスフェートフコース（ＧＤＰ－フコース）のドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが前記各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と前記各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していないか、またはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
具体的実施形態１．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、グアノシン－ジホスフェートフコース（ＧＤＰ－フコース）のドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現、ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが前記各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と前記各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質がＳＥＴファミリーに属していないか、またはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【0181】
具体的実施形態２．前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、具体的実施形態１に記載の方法。
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、具体的実施形態１に記載の方法。
【0182】
具体的実施形態３．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、ステップと、
－ 所望のフコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
－ 好ましくは、前記培養から前記フコシルラクトースを分離するステップと
を含む、方法。
【0183】
具体的実施形態４．前記ポーターが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgで定義される、ＴＣＤＢクラスの２．Ａ．１．１、２．Ａ．１．１２、２．Ａ．１．１５、２．Ａ．１．２、２．Ａ．１．３、２．Ａ．１．３６、２．Ａ．１．３８、２．Ａ．１．４６、２．Ａ．１．６８、２．Ａ．１．７、２．Ａ．１．８１、２．Ａ．１２３、２．Ａ．２、２．Ａ．２１、２．Ａ．５８、２．Ａ．６．３、２．Ａ．６６および２．Ａ．７．１の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0184】
具体的実施形態５．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの３．Ａ．１．１、３．Ａ．１．２、３．Ａ．１．１０、３．Ａ．１．１１および３．Ａ．１．５の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0185】
具体的実施形態６．前記βバレル型ポリンが、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの１．Ｂ．３．１および１．Ｂ．１８から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0186】
具体的実施形態７．前記補助輸送タンパク質が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの８．Ａ．３から選択される、具体的な具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0187】
具体的実施形態８．前記推定輸送タンパク質が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの９．Ｂ．１４および９．Ｂ．１５８の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0188】
具体的実施形態９．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１９年６月１７日にリリースされたTCDB.orgによって定義される、ＴＣＤＢクラスの４．Ａ．１．１および４．Ａ．４．１の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0189】
具体的実施形態１０．前記ポーターが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺＳ、０５Ｃ０Ｒ、０５Ｃ２Ｃ、０５ＣＴ４、０５ＣＸＰ、０５ＣＺＱ、０５Ｄ９４、０５ＤＸＩ、０５Ｅ５Ｍ、０５Ｅ５Ｗ、０５Ｅ８Ｇ、０５ＥＡＭ、０５ＥＤＲ、０５ＥＧＺ、０５Ｆ９Ｎ、０５ＪＨＥ、０５ＰＳＶ、０５Ｗ２Ｙ、０５Ｗ３Ｈ、０５ＸＪ５、０７０Ｑ９、０７ＣＷＣ、０７ＱＦ７、０７ＱＮＫ、０７ＲＢＪ、０７ＲＪ１、０７Ｔ５Ｅ、０７ＶＱ３、０８１４Ｃ、０８８ＱＴ、０８Ｈ１５、０８Ｎ８Ａ、０８ＳＣ４、０８Ｚ４Ｑの群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0190】
具体的実施形態１１．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＢＺ１、０５ＣＪ１、０５ＥＹ８、０５ＨＡＣ、０５ＤＭＫ、０５ＤＦＷ、０５ＭＦＶ、０７ＦＫＫ、０７Ｒ５Ｕ、０７Ｖ１Ｔ、０８ＩＪ９、０８ＪＱ７、１７２Ｔ７の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0191】
具体的実施形態１２．前記βバレル型ポリンが、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＤＡＹ、０８ＫＤＤの群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0192】
具体的実施形態１３．前記補助輸送タンパク質が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０７ＳＹＲの群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0193】
具体的実施形態１４．前記推定輸送タンパク質が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＲＥ、０５ＧＷＦ、０６Ｎ３Ａの群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0194】
具体的実施形態１５．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２によって定義される、ｅｇｇｎｏｇファミリーの０５ＣＩ１および０５ＶＩ０の群から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0195】
具体的実施形態１６．前記ポーターが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０００８３、ＰＦ００４７４、ＰＦ００８７３、ＰＦ００８９３、ＰＦ０１８９５、ＰＦ０１９４３、ＰＦ０２６９０、ＰＦ０３０８３、ＰＦ０４１９３、ＰＦ０５９７７、ＰＦ０７６９０、ＰＦ０７６９０、ＰＦ１３３４７、ＰＦ１３４４０およびＰＦ１４６６７から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0196】
具体的実施形態１７．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ００００５、ＰＦ００５３２、ＰＦ００６６４、ＰＦ０１０６１、ＰＦ０８３５２、ＰＦ１４５２４、ＰＦ１３４０７、ＰＦ１３４１６およびＰＦ１７９１２から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0197】
具体的実施形態１８．前記βバレル型ポリンが、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０２２６４、ＰＦ０２５６３、ＰＦ１０５３１およびＰＦ１８４１２から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0198】
具体的実施形態１９．前記補助輸送タンパク質が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ１３８０７およびＰＦ０２７０６から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0199】
具体的実施形態２０．前記推定輸送タンパク質が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ０１５７８、ＰＦ０３９３２、ＰＦ０５１４０およびＰＦ１１０４５から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0200】
具体的実施形態２１．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０によって定義される、ＰＦＡＭリストのＰＦ００３６７、ＰＦ００３５８、ＰＦ０２３７８、ＰＦ０３８２９から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0201】
具体的実施形態２２．前記ポーターが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００３９０、ＩＰＲ００１０３６、ＩＰＲ００１４１１、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１９２７、ＩＰＲ００２７９７、ＩＰＲ００３６６３、ＩＰＲ００３８４１、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００４６３３、ＩＰＲ００４６３８、ＩＰＲ００４７３４、ＩＰＲ００４８１２、ＩＰＲ００５２７５、ＩＰＲ００５８２８、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ０１０２９０、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３００８、ＩＰＲ０２３７２１、ＩＰＲ０２３７２２、ＩＰＲ０２６０２２、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２７４６３、ＩＰＲ０２９３０３、ＩＰＲ０３２８９６、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３８０７８、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９６７２から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0202】
具体的実施形態２３．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ０００４１２、ＩＰＲ００１７３４、ＩＰＲ００１７６１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００５８２９、ＩＰＲ００５９７８、ＩＰＲ００５９８１、ＩＰＲ００６０５９、ＩＰＲ００６０６０、ＩＰＲ００６０６１、ＩＰＲ００８９９５、ＩＰＲ０１１５２７、ＩＰＲ０１１７０１、ＩＰＲ０１３４５６、ＩＰＲ０１３５２５、ＩＰＲ０１３５６３、ＩＰＲ０１５８５１、ＩＰＲ０１５８５５、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２５９９７、ＩＰＲ０２６２６６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０２８０８２、ＩＰＲ０２９４３９、ＩＰＲ０３３８９３、ＩＰＲ０３６２５９、ＩＰＲ０３６６４０、ＩＰＲ０３８３７７、ＩＰＲ０３９４２１およびＩＰＲ０４０５８２から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0203】
具体的実施形態２４．前記βバレル型ポリンが、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３１９２、ＩＰＲ００３７１５、ＩＰＲ０１９５５４、ＩＰＲ０２３７３８、ＩＰＲ０３６９９８およびＩＰＲ０４０７１６から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0204】
具体的実施形態２５．前記補助輸送タンパク質が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００３８５６、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３２８０７およびＩＰＲ０３６２５９から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0205】
具体的実施形態２６．前記推定輸送タンパク質が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００２５４１、ＩＰＲ００３４３９、ＩＰＲ００３５９３、ＩＰＲ００４３１６、ＩＰＲ００５６２７、ＩＰＲ００６６０３、ＩＰＲ００７８１６、ＩＰＲ０１７８７１、ＩＰＲ０２０３６８、ＩＰＲ０２０８４６、ＩＰＲ０２３６４８、ＩＰＲ０２７４１７、ＩＰＲ０３６２５９およびＩＰＲ０３６８２２から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0206】
具体的実施形態２７．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義される、ｉｎｔｅｒｐｒｏリストのＩＰＲ００１１２７、ＩＰＲ００１９９６、ＩＰＲ００３３５２、ＩＰＲ００４７１６、ＩＰＲ０１０９７４、ＩＰＲ０１１０５５、ＩＰＲ０１３０１３、ＩＰＲ０１８１１３、ＩＰＲ０１８４５４、ＩＰＲ０３６６６５およびＩＰＲ０３６８７８から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0207】
具体的実施形態２８．前記ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号４０を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢ．ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．ＣＦ１１８、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）、または配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＤＳＭ ２５３２９のｗｚｘ様タンパク質、または上記ポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号０２、０６、４０、４２、５８、６６、６４もしくは６２を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２３３２膜タンパク質もしくはｗｚｘ様膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0208】
具体的実施形態２９．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質が、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のｌｍｒＡ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ膜タンパク質、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉまたは配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、または配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、あるいは上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログまたは機能性断片、あるいはそれぞれ、配列番号２８、７０、７４、６８、７２、７６、８２、８４、２０６、２０８、２１４、２１６、または２１８を含む前記ｌｍｒＡ、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦまたはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
具体的実施形態３０．前記βバレル型ポリンが、配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
具体的実施形態３１．前記補助輸送タンパク質が、配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
具体的実施形態３２．前記推定輸送タンパク質が、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：１０１３、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ．ＰＤＣ５１もしくは配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、または前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号９０、９２、９４もしくは９６を含む前記ＣｕｔＣ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0212】
具体的実施形態３３．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0213】
具体的実施形態３４．前記ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ．ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0214】
具体的実施形態３５．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0215】
具体的実施形態３６．前記推定輸送タンパク質が、配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ．ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態２または３のいずれか１つに記載の方法。
【0216】
具体的実施形態３７．遺伝子改変された細胞によるフコシルラクトースの産生のための方法であって、
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ポーター膜タンパク質である配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ．ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターである配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、
７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびβバレル型ポリン膜タンパク質である配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、または前記ＷｚａもしくはｌａｍＢタンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および補助輸送タンパク質である配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；推定輸送タンパク質である配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ．ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびリン酸基転移駆動性基輸送体である配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる膜タンパク質の群から選択される、ステップを含む、方法。
－ フコシルラクトースを産生することが可能な細胞を提供するステップであって、前記細胞が、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ポーター膜タンパク質である配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ．ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびＰ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターである配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、
７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびβバレル型ポリン膜タンパク質である配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、または前記ＷｚａもしくはｌａｍＢタンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；および補助輸送タンパク質である配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；推定輸送タンパク質である配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ．ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質；およびリン酸基転移駆動性基輸送体である配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列からなる膜タンパク質の群から選択される、ステップを含む、方法。
【0217】
具体的実施形態３８．前記膜タンパク質が、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である、前記具体的実施形態のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
【0218】
具体的実施形態３９．ｉ）好ましくは連続的に、反応体積が２５０ｍＬ～１０．０００ｍ３の範囲である初期の反応器体積１リットル当たり少なくとも５０、より好ましくは少なくとも７５、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１２０、より好ましくは少なくとも１５０グラムのラクトースを含むラクトースフィードを、培養培地に添加し、好ましくはその結果、前記培養培地の最終体積が、前記ラクトースフィードの添加前の前記培養培地の体積の３倍を超えない、好ましくは２倍を超えない、より好ましくは２倍未満となる、ステップ、
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
前記培養培地の前記最終体積において、少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす、前記具体的実施形態のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
ｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップ、
ｉｉｉ）連続的に、ラクトースフィードを供給溶液によって１日、２日、３日、４日、５日の間に、前記培養培地に添加するステップであって、前記ラクトース供給溶液の濃度が、５０ｇ／Ｌ、好ましくは７５ｇ／Ｌ、より好ましくは１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは２００ｇ／Ｌ、より好ましくは２２５ｇ／Ｌ、より好ましくは２５０ｇ／Ｌ、より好ましくは２７５ｇ／Ｌ、より好ましくは３００ｇ／Ｌ、より好ましくは３２５ｇ／Ｌ、より好ましくは３５０ｇ／Ｌ、より好ましくは３７５ｇ／Ｌ、より好ましくは４００ｇ／Ｌ、より好ましくは４５０ｇ／Ｌ、より好ましくは５００ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは５５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは６００ｇ／Ｌであり、好ましくは前記溶液のｐＨが、３から７の間に設定され、好ましくは前記フィード溶液の温度が、２０℃から８０℃の間に保たれている、ステップ
のうちの少なくとも１つをさらに含み、
前記培養培地の前記最終体積において、少なくとも５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも９０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１２５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１７５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも２００ｇ／Ｌのフコシルラクトース濃度をもたらす、前記具体的実施形態のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のための方法。
【0219】
具体的実施形態４０．前記ラクトースフィードが、培養の開始から、少なくとも５ｍＭの濃度、好ましくは３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０ｍＭの濃度、より好ましくは３００ｍＭを超える濃度のラクトースを添加することによって達成される、具体的実施形態３９に記載の方法。
【0220】
具体的実施形態４１．前記ラクトースフィードが、前記培養培地に、培養の生産段階を通して、少なくとも５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭまたは３０ｍＭのラクトース濃度が得られるような濃度で、ラクトースを添加することによって達成される、具体的実施形態３９または４０のいずれか１つに記載の方法。
【0221】
具体的実施形態４２．宿主細胞が、少なくとも約６０、８０、１００、もしくは約１２０時間または連続的に培養される、具体的実施形態３９、４０または４１のいずれかに記載の方法。
【0222】
具体的実施形態４３．炭素およびエネルギー供給源、好ましくはスクロース、グルコース、フルクトース、グリセロール、マルトース、マルトデキストリン、トレハロース、ポリオール、デンプン、スクシネート、マレエート、ピルベート、ラクテート、エタノール、シトレート、ラクトースも、好ましくは連続的に前記培養培地に、好ましくはラクトースと共に添加される、具体的実施形態３９から４２のいずれか１つに記載の方法。
【0223】
具体的実施形態４４．指数関数的細胞成長の第１段階が、第２段階に前記ラクトースが前記培養培地に添加される前に、炭素ベースの基質、好ましくはグルコースまたはスクロースを前記培養培地に添加することによって提供される、具体的実施形態３９から４３のいずれか１つに記載の方法。
【0224】
具体的実施形態４５．フコシルラクトースの混合物を生産する、具体的実施形態１から４４のいずれか１つに記載の方法。
【0225】
具体的実施形態４６．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび／またはジフコシルラクトースである、具体的実施形態１から４５のいずれか１つに記載の方法。
【0226】
具体的実施形態４７．前記遺伝子改変された細胞が、微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳類である、具体的実施形態１から４６のいずれか１つに記載の方法。
【0227】
具体的実施形態４８．前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、具体的実施形態４７に記載の方法。
【0228】
具体的実施形態４９．フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質はＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、宿主細胞。
ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、ｉ）それぞれ２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるｉｎｔｅｒｐｒｏ番号ＩＰＲ００１５０３およびＩＰＲ００２５１６を有するＧＴ１０およびＧＴ１１フコシルトランスフェラーゼファミリーのゲノム近傍を探索することによって見出されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを含む膜タンパク質の群から選択され、前記ゲノム近傍の窓サイズが各フコシルトランスフェラーゼの前の１４遺伝子と各フコシルトランスフェラーゼの後の１４遺伝子であり、前記膜タンパク質はＳＥＴファミリーに属していないか、あるいはｉｉ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８を含む前記膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列の群から選択される、宿主細胞。
【0229】
具体的実施形態５０．前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、具体的実施形態４９に記載の宿主細胞。
ａ）ポーター、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、具体的実施形態４９に記載の宿主細胞。
【0230】
具体的実施形態５１．フコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞であって、ＧＤＰ－フコースのドナー由来のフコース残基をラクトースアクセプターに移行し、それによってフコシルラクトースを合成するフコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み、
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、宿主細胞。
－ 前記細胞が、ｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する内因性膜タンパク質の改変された発現ならびに／またはｉｉ）フコシルラクトース輸送を可能にするおよび／もしくは増強する異種膜タンパク質の発現をさらに含み、前記膜タンパク質が、
ａ）ポーター（前記膜タンパク質は、ＳＥＴファミリーに属していない）、
ｂ）Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター、
ｃ）βバレル型ポリン、
ｄ）補助輸送タンパク質、
ｅ）推定輸送タンパク質、および
ｆ）リン酸基転移駆動性基輸送体
の群から選択される、宿主細胞。
【0231】
具体的実施形態５２．前記膜タンパク質が、具体的実施形態４から３８のいずれか１つにおいて定義される膜タンパク質の群から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0232】
具体的実施形態５３．ポーター膜タンパク質が、配列番号０２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｄｆＡ、配列番号０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＩｃｅＴ、配列番号０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｎｆＭ、配列番号０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｈｈｓ、配列番号１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＤ、配列番号１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｈＣ、配列番号１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｂｄＡ、配列番号１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｄｅＥ、配列番号１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＭｈｐＴ、配列番号２０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｅｂＱ、配列番号２２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＹｊｈＢ、配列番号２４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＢｃｒ、配列番号２６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＦｕｃＰ、配列番号３２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚｘＥ、配列番号３８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＥｍｒＥ、配列番号４０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３１、配列番号４２を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２３３２、配列番号４６を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４７、配列番号４８を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０２４５、配列番号５０を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿０３４５、配列番号５２を含むＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ由来のＣＤＴ２、配列番号５４を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ４０由来のＣＤＴ２、配列番号５８を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．ＣＦ１１８由来のＷｚｘ、配列番号６０を含むＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：５８１由来のＷｚｘ、配列番号６２を含むＤｙａｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ（ＤＳＭ ２５３２９）由来のＷｚｘ、配列番号６４を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ（ＡＴＣＣ ４３９２０）由来のＷｚｘ、配列番号６６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ（ＡＲ３２）由来のＷｚｘ、配列番号８６を含むＢｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈａｍｐｓｏｎｉｉ Ｐ２８０／１由来のＮＡＰＯ、配列番号９８を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｕｉｓ（ＤＳＭ ２０６３９）由来のＮＡｍ、配列番号１００を含むＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｎａｖｕｓ由来のＮＡｍ、配列番号１０２を含むＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．３１４Ｃｈｉｒ４．１由来のＮＡｍ、配列番号１０４を含むＮｉａｂｅｌｌａ ｄｒｉｌａｃｉｓ（ＤＳＭ２５８１１）由来のＮａｐ、配列番号１０６を含むＳａｃｃｈａｒｉｃｒｉｎｉｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ（ＤＳＭ ９５５５）由来のＮａｐ、配列番号１０８を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ＭＧＨ１５２由来のｍｄｔＤ、配列番号１１０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｅｒｋｍａｎｉｉ ＮＢＲＣ １０５７２１由来のｍｄｔＤ、配列番号１１２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１４を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のｍｄｔＤ、配列番号１１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ Ｂ１５６由来のｍｄｔＤ、配列番号１１８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のｙｅｇＢ、配列番号１２０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ３０６８４／ＮＪＳＴ２５８＿２由来のｍｄｔＤ、配列番号１２２を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＴｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、配列番号１２４を含むＰｓｅｕｄｏｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｍｄｔＤ、配列番号１２６を含むＹｏｋｅｎｅｌｌａ ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇｅｉ（ＡＴＣＣ４３００３）由来のＣｍｒ、配列番号１２８を含むＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｙｔｊｅｎｓｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３０を含むＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ由来のＭＦＳ、配列番号１３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１３６を含むＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来のＣｍｒ、配列番号１３８を含むＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｓａｌａｍａｅ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４０を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ（ＡＴＣＣ ２９２２０）由来のＣｍｒ、配列番号１４２を含むＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４４を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｂｅｉ由来のＭｄｆＡ、配列番号１４６を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．由来のＭｄｆＡ、配列番号１４８を含むＬｅｌｌｉｏｔｔｉａ ｓｐ．ＷＢ１０１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５０を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥｃＷＳＵ１由来のＭｄｆＡ、配列番号１５２を含むＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｕｔａｈｅｎｓｉｓ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５４を含むＣｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＭＧ＿２４６由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５６を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＰＤＣ８２由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１５８を含むＫｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ（ＤＳＭ １９７１１）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６０を含むＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＩＳ１５由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６２を含むＧｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ（株ＡＴＣＣ ２５０７８）由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６４を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６６を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１６８を含むＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｓｔｒ．８５－１０由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７０を含むＨｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ａｑｕａｔｉｃｕｍ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＳ０２４－２Ａ由来のＳｗｅｅｔ様タンパク質、配列番号１８２を含むＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｄｉｃａｅ ＷＳＭ４１９由来のｒｎｄ様、配列番号１８４を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のアラビノース排出、または上記ポーター膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号０２、０６、０４、０８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３２、３８、４０、４２、４６、４８、５０、５２、５４、５８、６０、６２、６４、６６、８６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１８２もしくは１８４を含む前記ＭｄｆＡ、ＩｃｅＴ、ＹｎｆＭ、Ｙｈｈｓ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ、ＦｕｃＰ、ＷｚｘＥ、ＥｍｒＥ、Ｗｚｘ、Ｂｌｏｎ＿２３３１、Ｂｌｏｎ＿２２３２、Ｂｌｏｎ＿０２４７、Ｂｌｏｎ＿０２４５、Ｂｌｏｎ＿０３４５、ＮＡＰＯ、ＮＡｍ、Ｎａｐ、ｍｄｔＤ、ＹｅｇＢ、Ｔｃｒ＿１＿Ｄ３８２１５、ｃｍｒ、ＭＦＳ、ＣＤＴ２、ｒｎｄ、Ｓｗｅｅｔ様もしくはアラビノース排出膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載のフコシルラクトースの産生のために遺伝子改変された宿主細胞。
【0233】
具体的実施形態５４．前記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーターが、配列番号２８を含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ株ＳＲＣＭ１０３４５７由来のＬｍｒＡ、配列番号３０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＯｐｐＦ、配列番号３６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（株ＡＴＣＣ ７００３９２／２６６９５）由来のＷｚｋ、配列番号４４を含むＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ（株ＡＴＣＣ １５６９７）由来のＢｌｏｎ＿２４７５、配列番号６８もしくは７２を含むＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐａｒｔａｎｓｉｉ由来のＬｐｓＥ、配列番号７０もしくは７４を含むＳｐｏｒｏｍｕｓａ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ＤＳＭ ２８７５由来のＬｐｓＥ、配列番号７６を含むＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｌａｎｋｔｏｐｈｉｌａ ｓｕｌｆｏｎｉｃａ由来のＴｏｌＣ、配列番号７８を含むＢｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｈｕｎｇａｔｅｉ ＸＢＤ２００６由来のＴｏｌＣ、配列番号８０を含むＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ ＣＡＧ：１３由来のＭｓｂＡ、配列番号８２を含むＰｅｄｏｂａｃｔｅｒ ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｌｉ由来のＭｓｂＡ、配列番号８４を含むＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＣＧ１＿０２＿４３＿２６由来のＭｓｂＡ、配列番号１７４を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｍ、配列番号１７６を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｍ、配列番号１９６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｍ、配列番号１７８を含むＲｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．Ｒｏｏｔ１４９由来のＷｚｔ、配列番号１８０を含むＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ ＬＭＧ ０４３７５由来のＷｚｔ、配列番号１９４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １１３３０３由来のＷｚｔ、配列番号１８８もしくは１９０を含むＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０由来のＮｏｄｊ、配列番号２０６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＥ、配列番号２０８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｍａｌＫ、配列番号２１４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のａｒａＦ、配列番号２１６を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｘｙｌＦ、もしくは配列番号２１８を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来のｙｔｆＱ、または上記Ｐ－Ｐ結合加水分解駆動性トランスポーター膜タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号２８、３０、３６、４４、６８、７２、７０、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１７４、１７６、１９６、１７８、１８０、１９４、１８８、１９０、２０６、２０８、２１４、２１６もしくは２１８を含む前記ＬｍｒＡ、ＯｐｐＦ、Ｗｚｋ、Ｂｌｏｎ＿２４７５、ＬｐｓＥ、ＴｏｌＣ、ＭｓｂＡ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ、Ｎｏｄｊ、ｍａｌＥ、ｍａｌＫ、ａｒａＦ、ｘｙｌＦもしくはｙｔｆＱ膜タンパク質のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0234】
具体的実施形態５５．前記推定輸送タンパク質が、配列番号５６を含むＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のチトクロームＣバイオジェネシスタンパク質、配列番号９０を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＣＡＧ：１０１３由来のＣｕｔＣ、配列番号９２を含むＯｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ ＤＳＭ ２０７１２由来のＣｕｔＣ、配列番号９４を含むＭｉｔｓｕａｒｉａ ｓｐ．ＰＤＣ５１由来のＣｕｔＣ、配列番号９６を含むＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ ２５６１１（ＤＳＭ ２０７０６）由来のＣｕｔＣ、配列番号１９０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｙｂｊＭ、配列番号１９２を含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＥＮＮＩＨ１由来のｙｂｊＭ、または上記推定輸送タンパク質のいずれか１つの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ、配列番号５６、９０、９２、９４、９６、１９０もしくは１９２を含む前記ＣｙｔＣ、ＣｕｔＣもしくはｙｂｊＭ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0235】
具体的実施形態５６．前記βバレル型ポリンが、配列番号３４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のＷｚａまたは配列番号２０４を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｌａｍＢ、または前記ＷｚａもしくはｌａｍＢタンパク質のいずれか１つに対する機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号３４もしくは２０４を含む前記ＷｚａもしくはｌａｍＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0236】
具体的実施形態５７．前記補助輸送タンパク質が、配列番号８８を含むＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（株ＡＴＣＣ ４３５８９／ＭＳＢ８／ＤＳＭ ３１０９／ＪＣＭ １００９９）由来のＷｚｃ、またはその機能性ホモログもしくは機能性断片、または配列番号８８を含む前記Ｗｚｃ膜タンパク質と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0237】
具体的実施形態５８．前記リン酸基転移駆動性基輸送体が、配列番号２１０を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｎａｇＥ、配列番号２１２を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のｓｒｌＢ、または前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれかの機能性ホモログもしくは機能性断片、またはそれぞれ配列番号２１０もしくは２１２を含む前記ｎａｇＥもしくはｓｒｌＢ膜タンパク質のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される、具体的実施形態５０または５１のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0238】
具体的実施形態５９．前記膜タンパク質が、細胞壁の外膜を通過する化合物の輸送に関与するトランスポータータンパク質である、具体的実施形態４９から５８のいずれか１つに記載の細胞。
【0239】
具体的実施形態６０．培地中で安定的に培養される、具体的実施形態４９から５９のいずれか１つに記載の細胞。
【0240】
具体的実施形態６１．微生物、植物、または動物の細胞からなる群から選択され、好ましくは前記微生物が、細菌、真菌または酵母であり、好ましくは前記植物が、イネ、ワタ、ナタネ、ダイズ、トウモロコシまたは穀物植物であり、好ましくは前記動物が、昆虫、魚、鳥または非ヒト哺乳動物である、具体的実施形態４９から６０のいずれか１つに記載の細胞。
【0241】
具体的実施形態６２．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、具体的実施形態６１に記載の宿主細胞。
【0242】
具体的実施形態６３．少なくとも部分的に不活性化され、単糖、二糖またはオリゴ糖が、フコシルラクトースの合成に関与するおよび／または必要とされる、選択された前記単糖、二糖またはオリゴ糖に関する異化経路を含む、具体的実施形態４９から６２のいずれか１つに記載の細胞。
【0243】
具体的実施形態６４．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたはジフコシルラクトースである、具体的実施形態４９から６３のいずれか１つに記載の細胞。
【0244】
具体的実施形態６５．フコシルラクトースの産生のための方法であって、
ａ）具体的実施形態４９から６４のいずれか１つに記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）前記フコシルラクトースを前記培養から分離するステップと
を含む、方法。
ａ）具体的実施形態４９から６４のいずれか１つに記載の細胞を提供するステップと、
ｂ）前記フコシルラクトースの産生を許容する条件下で、培地中で前記細胞を培養するステップと、
ｃ）前記フコシルラクトースを前記培養から分離するステップと
を含む、方法。
【0245】
具体的実施形態６６．フコシルラクトースの発酵産生において、フコシルラクトース輸送のための、具体的実施形態１から３８のいずれか１つにおいて定義される膜タンパク質の群から選択される膜タンパク質の使用。
【0246】
具体的実施形態６７．フコシルラクトースの産生のための、具体的実施形態４９から６４のいずれか１つに記載の細胞の使用。
【0247】
具体的実施形態６８．前記フコシルラクトースが、２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたはジフコシルラクトースである、具体的実施形態６７に記載の細胞の使用。
【0248】
以下の図面および実施例は、本発明のさらなる例示および明確化としての役割を果たし、限定的であることを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【0249】
【図1】ＴＵ２における配列番号５８から配列番号９６まで（配列番号９０を除く）、ＴＵ３における配列番号９０またはＴＵ１０における配列番号０２から配列番号４４までを含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する株を用いる成長実験において得られる相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。配列番号０４から配列番号３４の膜タンパク質を有する株は、ＦＴ１から３－ＦＬを産生し、一方、配列番号０２および配列番号４０から配列番号９６までを含む膜タンパク質を有する株は、ＦＴ２から３－ＦＬを産生する。ＣＰＩデータは、全ブロス試料における３－ＦＬの測定値を指す。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0250】
【図2】ＴＵ２における配列番号５８から配列番号１０４まで（配列番号９０を除く）、ＴＵ３における配列番号９０またはＴＵ１０における配列番号０２から配列番号３４までを含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での３－ＦＬ排出比。配列番号０８から配列番号３０までを含む膜タンパク質を有する株は、ＦＴ１から３－ＦＬを産生し、一方、配列番号５８から配列番号１０４までを含む膜タンパク質を有する株は、ＦＴ２から３－ＦＬを産生する。配列番号０２を含む膜タンパク質を有する株を、ＦＴ１またはＦＴ２のいずれかと組み合わせて試験した。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0251】
【図3】ＴＵ１０における配列番号０８、１４、１８または２２を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での成長速度。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0252】
【図4】ＴＵ１０における配列番号２８を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での３－ＦＬ排出比。３－ＦＬに対する前駆体として４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0253】
【図5】ＴＵ１０における配列番号２８を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。ＣＰＩデータは、全ブロス試料における３－ＦＬの測定値を指す。３－ＦＬに対する前駆体として９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0254】
【図6】ＴＵ１０における配列番号１０または１６を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験において得られた相対パーセンテージ（％）での３ＦＬ排出比。３－ＦＬに対する前駆体として９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0255】
【図7】ＴＵ１０における配列番号１０、１６または２８を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。３－ＦＬに対する前駆体として１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0256】
【図8】ＴＵ１０における配列番号２８を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での成長速度。３－ＦＬに対する前駆体として１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0257】
【図9】ＴＵ１０における配列番号２２を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。３－ＦＬに対する前駆体として５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0258】
【図10】宿主のゲノム由来のＴＵ１０における配列番号０２または２８を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のＦＴ１またはＦＴ２のいずれかであるα１，３－フコシルトランスフェラーゼを発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。それによって、配列番号０１を有する遺伝子をＥｃＬｄｈＡ遺伝子座に組み込み、配列番号２７を有する遺伝子をＥｃＳｅｔＡ遺伝子座に組み込んだ。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0259】
【図11】宿主のゲノム由来のＴＵ１０における配列番号０２または２８を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での３－ＦＬの排出比。それによって、配列番号０１を有する遺伝子をＥｃＬｄｈＡ遺伝子座に組み込み、配列番号２７を有する遺伝子をＥｃＳｅｔＡ遺伝子座に組み込んだ。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0260】
【図12A】プラスミド由来の様々な転写単位（ＴＵ）における配列番号０２、０６、１０、１６、２２、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または５０を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【図12B】プラスミド由来の様々な転写単位（ＴＵ）における配列番号０２、０６、１０、１６、２２、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または５０を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0261】
【図13】プラスミド由来の様々な転写単位（ＴＵ）における配列番号０２、０６、１０、１６、２２、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４または５０を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での３－ＦＬの排出比。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0262】
【図14】ＴＵ１０において単一の遺伝子としてクローニングされたか、または２つの膜タンパク質遺伝子を含有し、プラスミドに提示されるそれらの天然の転写オペロン構造においてクローニングされた、配列番号４０、４２、４６または４８を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ（左のパネル）および３－ＦＬの排出比（右のパネル）。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0263】
【図15】ＴＵ１０において配列番号０２、０６または２８を含む膜タンパク質を発現し、ＥｃＳｅｔＡ遺伝子座（配列番号２８を含む膜タンパク質に関する）またはＥｃＬｄｈＡ遺伝子座（配列番号０２および０６を含む膜タンパク質に関する）における宿主のゲノムに組み込まれ、プラスミド由来のα１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ３を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での２’ＦＬ（パネルＡ）またはＤｉＦＬ（パネルＢ）を産生する宿主に関するＣＰＩおよびＤｉＦＬ排出比（パネルＣ）。２’－ＦＬおよびＤｉＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0264】
【図16】ゲノム由来の配列番号０２を含む膜タンパク質およびプラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を過剰発現する３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ産生宿主を用いて実施した８回の独立した発酵ランで測定したバッチ段階および流加段階（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｐｈａｓｅ）において増強された生産性パラメーター。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。膜タンパク質遺伝子の過剰発現カセットを欠如する同一の株を用いて参照発酵を実施した。発酵は実施例３に記載したように実施した。ＣＰＩ、細胞性能指数（３－ＦＬのｇ／バイオマスのｇ）；ｂｒ、全ブロス；ｓｎ、上清；Ｑｐ、比生産性（３－ＦＬのｇ／バイオマスのｇ／時）；Ｑｓ、比生産性（スクロースのｇ／バイオマスのｇ／時）；Ｙｓ、スクロースの収率（３－ＦＬのｇ／スクロースのｇ）；Ｙｘ、バイオマスの収率（バイオマスのｇ／スクロースのｇ）；ｒａｔｅ、産生率（３－ＦＬのｇ／Ｌ／時）；ｌａｃ＿ｒａｔｅ、ラクトース変換率（消費されたラクトースのｇ／時）。
【0265】
【図17】第１のプラスミド由来の配列番号０６を含む膜タンパク質および第２のプラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を過剰発現する３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ産生宿主を用いて実施した発酵ランで測定したバッチ段階および流加段階において増強された生産性パラメーター。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。膜タンパク質遺伝子を欠如する同一の株を用いて特定の参照発酵を実施した。発酵は実施例３に記載したように実施した。ＣＰＩ、細胞性能指数（３－ＦＬのｇ／バイオマスのｇ）；ｂｒ、全ブロス；ｓｎ、上清；Ｙｓ、スクロースの収率（３－ＦＬのｇ／スクロースのｇ）；Ｙｘ、バイオマスの収率（バイオマスのｇ／スクロースのｇ）。
【0266】
【図18】配列番号０２、０６、１２０、１２６、１２８、１４０、１４６または１５０を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１（配列番号０２および配列番号０６を含む膜タンパク質に関する）またはＦＴ２（他の膜タンパク質に関する）を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。配列番号０２および配列番号０６を含む膜タンパク質をＴＵ１０においてクローニングした。配列番号１２６を含む膜タンパク質をＴＵ２においてクローニングした。配列番号１２０、１４０および１５０を含む膜タンパク質をＴＵ３においてクローニングした。配列番号１２８および配列番号１４６を含む膜タンパク質をＴＵ２（バージョンｖ１）またはＴＵ３（バージョンｖ２）のいずれかにおいてクローニングした。ＣＰＩデータは、全ブロス試料における３－ＦＬの測定値を指す。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0267】
【図19】ＴＵ２においてクローニングした配列番号１２６および配列番号１２８（バージョンｖ１）、ＴＵ３においてクローニングした配列番号１２８（バージョン２）ならびにＴＵ１０における配列番号０２を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１（配列番号０２を含む膜タンパク質を有する株に関する）またはＦＴ２（配列番号１２６および１２８を含む膜タンパク質を有する株に関する）を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での３－ＦＬ排出比。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0268】
【図20】ＴＵ３において配列番号１２０および１４０を含む膜タンパク質を発現し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での成長速度。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0269】
【図21】ＥｃＭｄｆＡに関する実施例２０のＭＡＴＧＡＴ表。
【0270】
【図22】ＥｃＩｃｅＴに関する実施例２０のＭＡＴＧＡＴ表。
【0271】
【図23】ＴＵ１においてクローニングした配列番号５４、ＴＵ２においてクローニングした配列番号６２、６６、７０、７６、８４、９２、９６、１０４、ＴＵ３においてクローニングした配列番号５８、６４、７２、７４、９４、ＴＵ１１においてクローニングした配列番号１８４、２０４、２０８、ＴＵ１２においてクローニングした配列番号５２、５６、６０、８０、８２、８８、９０、９８を含む膜タンパク質を発現し、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。ＣＰＩデータは、全ブロス試料における３－ＦＬの測定値を指す。３－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0272】
【図24】ＴＵ１１においてクローニングした配列番号２０４または２１４を含む膜タンパク質を発現し、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）でのＣＰＩ。ＣＰＩデータは、全ブロス試料における２’－ＦＬ測定値を指す。２’－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【0273】
【図25】ＴＵ１１においてクローニングした配列番号２０６、２０８、２１４、２１６、２１８を含む膜タンパク質を発現し、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する株を用いる成長実験で得られた相対パーセンテージ（％）での２’－ＦＬ排出比。２’－ＦＬに対する前駆体として２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地中で、成長実験を実施した。破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。
【実施例】
【0274】
（実施例１）
膜タンパク質ファミリーの同定
ＨＭＭは、プロファイル隠れマルコフモデルと呼ばれる確率モデルである。これは、位置特異的スコアリングシステムにアラインされたタンパク質のセットを特徴付ける。アミノ酸は、それらが生じる頻度に従って、配列アライメントにおける各位置でのスコアを与えられる（Eddy, S.R.1998. Profile hidden Markov models. Bioinformatics. 14: 755-63）。ＨＭＭは、Ｐｆａｍ、ＩｎｔｅｒＰｒｏ、ＳＭＡＲＴ、ＴＩＧＲＦＡＭ、ＰＩＲＳＦ、ＰＡＮＴＨＥＲ、ＳＦＬＤ、ＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙおよびＧｅｎｅ３Ｄを含む、タンパク質分類のためにこの方法を使用する多数のデータベースから明らかであるように、広く利用されている。
膜タンパク質ファミリーの同定
ＨＭＭは、プロファイル隠れマルコフモデルと呼ばれる確率モデルである。これは、位置特異的スコアリングシステムにアラインされたタンパク質のセットを特徴付ける。アミノ酸は、それらが生じる頻度に従って、配列アライメントにおける各位置でのスコアを与えられる（Eddy, S.R.1998. Profile hidden Markov models. Bioinformatics. 14: 755-63）。ＨＭＭは、Ｐｆａｍ、ＩｎｔｅｒＰｒｏ、ＳＭＡＲＴ、ＴＩＧＲＦＡＭ、ＰＩＲＳＦ、ＰＡＮＴＨＥＲ、ＳＦＬＤ、ＳｕｐｅｒｆａｍｉｌｙおよびＧｅｎｅ３Ｄを含む、タンパク質分類のためにこの方法を使用する多数のデータベースから明らかであるように、広く利用されている。
【0275】
２０１９年６月１３日にリリースされたＨＭＭＥＲパッケージ３．２．１（http://hmmer.org/）に由来するＨＭＭｓｅａｒｃｈは、配列ホモログに関する配列データベースを検索するためにこのＨＭＭを使用することができる。使用することができる配列データベースは、例えば、非限定的に、ＮＣＢＩ ｎｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＮＲ；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、https://www.uniprot.org/help/uniprotkb）およびＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴデータベース（https://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html）である。
【0276】
２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇＮＯＧデータベース１．０．２（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6324079/；http://eggnog.embl.de/#/app/home）、２０１９年６月１７日にリリースされたＴＣＤＢデータベース（http://www.tcdb.org/public/tcdb）、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）、および２０１８年９月にリリースされたＰｆａｍ ３２．０（https://pfam.xfam.org/）を使用するＰＦＡＭドメインに基づいて、膜タンパク質ファミリーを分類した。ｅｇｇＮＯＧデータベースは、オルソロジー関係、遺伝子進化の歴史および機能予測についての公共のデータベースである。Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＤａｔａＢａｓｅ（ＴＣＤＢ）は、酵素を分類するためのＥｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ（ＥＣ）システムに類似し、機能情報と系統発生情報の両方を組み込んでいる。ＰｆａｍおよびＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースは、タンパク質ファミリーの大きな集合である。ＳＭＡＲＴ（http://smart.embl-heidelberg.de/）、ＴＩＧＲＦＡＭ（https://www.jcvi.org/tigrfams）、ＰＩＲＳＦ（https://proteininformationresource.org/pirwww/dbinfo/pirsf.shtml）、ＰＡＮＴＨＥＲ（http://pantherdb.org/）、ＳＦＬＤ（http://sfld.rbvi.ucsf.edu/archive/django/index.html）、Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（http://supfam.org/）およびＧｅｎｅ３Ｄ（http://gene3d.biochem.ucl.ac.uk/Gene3D/）、ＮＣＢＩ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）のような他のタンパク質ドメインも使用することができる。
【0277】
２０１７年１１月３日にリリースされたｅｇｇｎｏｇｄｂ １．０．２に基づいて、ｅｇｇＮＯＧ－ｍａｐｐｅｒ（https://github.com/eggnogdb/eggnog-mapper）のスタンドアローンバージョンを使用することによってｅｇｇＮＯＧファミリーの同定を行った。ｅｇｇＮＯＧファミリーのそれぞれについて、ＨＭＭを、ｅｇｇＮＯＧウェブサイトでダウンロードすることができ、タンパク質データベースに対するＨＭＭｓｅａｒｃｈのために使用することができる。
【0278】
２０１９年６月１７日にリリースされたＴＣＤＢデータベースに対してブラスティング（ｂｌａｓｔｐ）することによって、ＴＣＤＢファミリーの同定を行った。得られたファミリーの新たなメンバーをウェブサイト（http://www.tcdb.org/download.php）で検索することができる。タンパク質データベースに対するｂｌａｓｔｐにおいて、Ｆａｓｔａファイルを入力に使用することができる。
【0279】
２０１８年９月にリリースされたhttps://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1でのオンライン検索によって、ＰＦＡＭドメインの同定を行った。得られたファミリーに関するＨＭＭを「Ｃｕｒａｔｉｏｎ ＆ ｍｏｄｅｌ」にダウンロードした。タンパク質データベースに対してこのモデルを用いるＨＭＭｓｅａｒｃｈによって、新たなファミリーのメンバーを同定することになる。ＩｎｔｅｒＰｒｏのヒットを含む配列も、ＰＦＡＭウェブサイトからダウンロードすることができる。
【0280】
いずれも２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０に基づいて、https://www.ebi.ac.uk/interpro/のオンラインツールまたはＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（https://www.ebi.ac.uk/interpro/download.html）のスタンドアローンバージョンを使用することによって、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（スーパー）ファミリー、ドメインおよびサイトの同定を行った。ＩｎｔｅｒＰｒｏは、タンパク質のモチーフおよびドメインの多くのデータベースの情報を組み合わせた複合データベースである。ＩｎｔｅｒＰｒｏドメインおよび／または（スーパー）ファミリーのＨＭＭは、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎから得ることができ、これを使用して、タンパク質データベースにおいて新たなファミリーのメンバーを同定することができる。ＩｎｔｅｒＰｒｏのヒットを含む配列も、ＩｎｔｅｒＰｒｏのウェブサイト（「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｔｃｈｅｄ」）からダウンロードすることができるか、またはＵｎｉＰｒｏｔのウェブサイト（https://www.uniprot.org）に問い合わせることができる。
【0281】
（実施例２）
本発明の方法において有用な膜タンパク質またはタンパク質配列の同定
フコシルトランスフェラーゼの近傍に見られる膜タンパク質のＰＦＡＭドメインを同定し、実施例１において例示したように、同定されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを有する膜タンパク質を選択することによって、膜タンパク質またはタンパク質配列の第１のセットを見出した。フコシルトランスフェラーゼファミリーのＩＰＲ００１０５３（ＧＴ１０）およびＩＰＲ００２５１６（ＧＴ１１）に属するタンパク質識別子を、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ｔｒｅｍｂｌから抽出した。これらの識別子を、２０１９年６月１９日にリリースされたゲノム近傍に関するツールhttps://efi.igb.illinois.edu/efi-gnt/における入力に使用した。ＥＦＩ－ＧＮＴ（ＥＦＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ Ｔｏｏｌ）は、ゲノム近傍の探索を可能にし、タンパク質のファミリーおよびスーパーファミリーをゲノムコンテキストに配置することに焦点を当てている。配列類似性ネットワーク（ＳＳＮ）を入力に使用する。ＳＳＮ内の各配列を、そのゲノム近傍の照合のための問い合わせとして使用する。ＥＦＩ－ＧＮＴによって、機能の割当てを容易にするために、ＳＳＮクラスターの配列に対するゲノム近傍の探索が可能になる。
本発明の方法において有用な膜タンパク質またはタンパク質配列の同定
フコシルトランスフェラーゼの近傍に見られる膜タンパク質のＰＦＡＭドメインを同定し、実施例１において例示したように、同定されたＰＦＡＭドメインのいずれか１つを有する膜タンパク質を選択することによって、膜タンパク質またはタンパク質配列の第１のセットを見出した。フコシルトランスフェラーゼファミリーのＩＰＲ００１０５３（ＧＴ１０）およびＩＰＲ００２５１６（ＧＴ１１）に属するタンパク質識別子を、２０１９年７月４日にリリースされたＩｎｔｅｒＰｒｏ ７５．０によって定義されるＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ｔｒｅｍｂｌから抽出した。これらの識別子を、２０１９年６月１９日にリリースされたゲノム近傍に関するツールhttps://efi.igb.illinois.edu/efi-gnt/における入力に使用した。ＥＦＩ－ＧＮＴ（ＥＦＩ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ Ｔｏｏｌ）は、ゲノム近傍の探索を可能にし、タンパク質のファミリーおよびスーパーファミリーをゲノムコンテキストに配置することに焦点を当てている。配列類似性ネットワーク（ＳＳＮ）を入力に使用する。ＳＳＮ内の各配列を、そのゲノム近傍の照合のための問い合わせとして使用する。ＥＦＩ－ＧＮＴによって、機能の割当てを容易にするために、ＳＳＮクラスターの配列に対するゲノム近傍の探索が可能になる。
【0282】
近傍の窓サイズ１４を選択した。近接する遺伝子をそれらのＰＦＡＭドメインに基づいて分類した。以下のＰＦＡＭドメインを有する膜タンパク質は、ＧＴ１０（ＩＰＲ００１５０３）およびＧＴ１１（ＩＰＲ００２５１６）フコシルトランスフェラーゼの近くに存在する：ＰＦ００００５、ＰＦ００００６、ＰＦ０００２３、ＰＦ０００８３、ＰＦ０００９２、ＰＦ００１１５、ＰＦ００１１６、ＰＦ００１２２、ＰＦ００２０９、ＰＦ００２１３、ＰＦ００２３０、ＰＦ００２３１、ＰＦ００２５４、ＰＦ００３５９、ＰＦ００３７５、ＰＦ００３８１、ＰＦ００３９１、ＰＦ００４０１、ＰＦ００４０３、ＰＦ００４７４、ＰＦ００４８４、ＰＦ００５２０、ＰＦ００５２８、ＰＦ００５２９、ＰＦ００５４３、ＰＦ００５７１、ＰＦ００５９３、ＰＦ００６２５、ＰＦ００６５４、ＰＦ００６６４、ＰＦ００６８９、ＰＦ００６９０、ＰＦ００７０２、ＰＦ００８６０、ＰＦ００８７３、ＰＦ００８９２、ＰＦ００８９３、ＰＦ００９０２、ＰＦ００９０９、ＰＦ００９１６、ＰＦ００９３９、ＰＦ００９９９、ＰＦ０１０３２、ＰＦ０１０６１、ＰＦ０１１０３、ＰＦ０１２０３、ＰＦ０１２３５、ＰＦ０１３８４、ＰＦ０１４９６、ＰＦ０１５４４、ＰＦ０１５４７、ＰＦ０１５５４、ＰＦ０１５６６、ＰＦ０１５７８、ＰＦ０１６１４、ＰＦ０１６１８、ＰＦ０１６５６、ＰＦ０１６９９、ＰＦ０１７４０、ＰＦ０１７４１、ＰＦ０１７５８、ＰＦ０１８１０、ＰＦ０１８１３、ＰＦ０１８９１、ＰＦ０１８９５、ＰＦ０１８９９、ＰＦ０１９４３、ＰＦ０２０２６、ＰＦ０２０８０、ＰＦ０２１３３、ＰＦ０２１３６、ＰＦ０２２２５、ＰＦ０２２５４、ＰＦ０２２７７、ＰＦ０２３０２、ＰＦ０２３２１、ＰＦ０２３５５、ＰＦ０２３７８、ＰＦ０２３８６、ＰＦ０２４１７、ＰＦ０２４４７、ＰＦ０２５０１、ＰＦ０２５６３、ＰＦ０２６３２、ＰＦ０２６５２、ＰＦ０２６５３、ＰＦ０２６９０、ＰＦ０２７０６、ＰＦ０２８７４、ＰＦ０２８９６、ＰＦ０３０３０、ＰＦ０３０８３、ＰＦ０３１８６、ＰＦ０３２２２、ＰＦ０３４１２、ＰＦ０３４５９、ＰＦ０３４７１、ＰＦ０３５４４、ＰＦ０３５４７、ＰＦ０３５４８、ＰＦ０３５６７、ＰＦ０３６０５、ＰＦ０３６０６、ＰＦ０３６１０、ＰＦ０３６１６、ＰＦ０３８１４、ＰＦ０３８４０、ＰＦ０３８６５、ＰＦ０３９３２、ＰＦ０４１９３、ＰＦ０４２７７、ＰＦ０４３８９、ＰＦ０４９６６、ＰＦ０５１３４、ＰＦ０５１４０、ＰＦ０５５２４、ＰＦ０５５５２、ＰＦ０５９７７、ＰＦ０６２５１、ＰＦ０６８２６、ＰＦ０６８３５、ＰＦ０７２６４、ＰＦ０７５４９、ＰＦ０７６６０、ＰＦ０７６７０、ＰＦ０７６８５、ＰＦ０７６９０、ＰＦ０７７１５、ＰＦ０７８８５、ＰＦ０７９６９、ＰＦ０８２３９、ＰＦ０８２７９、ＰＦ０８３３４、ＰＦ０８３５２、ＰＦ０８４０２、ＰＦ０８４７９、ＰＦ１０５３１、ＰＦ１１３５６、ＰＦ１１６１２、ＰＦ１２１５６、ＰＦ１２３９９、ＰＦ１２７９６、ＰＦ１２８２２、ＰＦ１２８４８、ＰＦ１２９７４、ＰＦ１３３０６、ＰＦ１３３４７、ＰＦ１３４０９、ＰＦ１３４１０、ＰＦ１３４１６、ＰＦ１３４１７、ＰＦ１３４４０、ＰＦ１３４４２、ＰＦ１３４６２、ＰＦ１３４６６、ＰＦ１３４７３、ＰＦ１３４９９、ＰＦ１３５０５、ＰＦ１３５２０、ＰＦ１３５３１、ＰＦ１３５９９、ＰＦ１３６０９、ＰＦ１３６３７、ＰＦ１３８０７、ＰＦ１３８５５、ＰＦ１４５２４、ＰＦ１４６６７、ＰＦ１６３２７、ＰＦ１７９１２およびＰＦ１８４１２。
【0283】
（実施例３）
材料および方法 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
培地
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、１％のトリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％の塩化ナトリウム（ＶＷＲ．Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からなった。９６ウェルプレートまたは振盪フラスコ中の培養実験によって使用した最少培地は、２．００ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、５．００ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．９９３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７．３１５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、８．３７２ｇ／ＬのＭＯＰＳ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｇ／Ｌのスクロース、または実施例で特定される場合、別の炭素源、１ｍｌ／Ｌのビタミン溶液、１００μＬ／Ｌのモリブデート溶液、および１ｍＬ／Ｌのセレン溶液を含有した。各実施例において特定したように、２０または４５ｇ／Ｌのラクトースを前駆体として培地にさらに添加した。１ＭのＫＯＨを用いて、培地をｐＨ７に設定した。ビタミン溶液は、３．６ｇ／ＬのＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、５ｇ／ＬのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．９４ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、０．０３１１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、０．４ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏおよび１．０１ｇ／ＬのチアミンＨＣｌからなった。モリブデート溶液は、０．９６７ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏを含有した。セレン溶液は、４２ｇ／ＬのＳｅｏ２を含有した。
材料および方法 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
培地
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、１％のトリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、０．５％の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％の塩化ナトリウム（ＶＷＲ．Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からなった。９６ウェルプレートまたは振盪フラスコ中の培養実験によって使用した最少培地は、２．００ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、５．００ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．９９３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７．３１５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、８．３７２ｇ／ＬのＭＯＰＳ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｇ／Ｌのスクロース、または実施例で特定される場合、別の炭素源、１ｍｌ／Ｌのビタミン溶液、１００μＬ／Ｌのモリブデート溶液、および１ｍＬ／Ｌのセレン溶液を含有した。各実施例において特定したように、２０または４５ｇ／Ｌのラクトースを前駆体として培地にさらに添加した。１ＭのＫＯＨを用いて、培地をｐＨ７に設定した。ビタミン溶液は、３．６ｇ／ＬのＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、５ｇ／ＬのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．９４ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、０．０３１１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、０．４ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏおよび１．０１ｇ／ＬのチアミンＨＣｌからなった。モリブデート溶液は、０．９６７ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏを含有した。セレン溶液は、４２ｇ／ＬのＳｅｏ２を含有した。
【0284】
発酵のための最少培地は、６．７５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．９３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および７．３１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３０ｇ／Ｌのスクロース、上記に説明されるのと同じ組成の１ｍＬ／Ｌのビタミン溶液、１００μＬ／Ｌのモリブデート溶液、および１ｍＬ／Ｌのセレン溶液を含有した。各実施例で特定したように、２０ｇ／Ｌのラクトースを前駆体として培地にさらに添加した。
【0285】
複合培地はオートクレーブ（１２１℃、２１分）によって、最少培地は濾過（０．２２μｍ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）によって滅菌した。必要な場合、培地を、抗生物質（例えば、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、スペクチノマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）および／またはカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ））を添加することによって選択的にした。
【0286】
プラスミド
ｐＫＤ４６（Ｒｅｄヘルパープラスミド、アンピシリン耐性）、ｐＫＤ３（ＦＲＴ隣接クロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）遺伝子を含有する）、ｐＫＤ４（ＦＲＴ隣接カナマイシン耐性（ｋａｎ）遺伝子を含有する）およびｐＣＰ２０（ＦＬＰリコンビナーゼ活性を発現する）プラスミドは、Ｒ．Ｃｕｎｉｎ教授（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、２００７年）から譲渡された。
ｐＫＤ４６（Ｒｅｄヘルパープラスミド、アンピシリン耐性）、ｐＫＤ３（ＦＲＴ隣接クロラムフェニコール耐性（ｃａｔ）遺伝子を含有する）、ｐＫＤ４（ＦＲＴ隣接カナマイシン耐性（ｋａｎ）遺伝子を含有する）およびｐＣＰ２０（ＦＬＰリコンビナーゼ活性を発現する）プラスミドは、Ｒ．Ｃｕｎｉｎ教授（Ｖｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、２００７年）から譲渡された。
【0287】
膜タンパク質およびフコシルトランスフェラーゼ発現のためのプラスミドを、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリーを使用して、それぞれｐＳＣ１０１ ｏｒｉ（Ｒｅｐ１０－ｖ３）およびｐＭＢ１ ｏｒｉを含有するバックボーンベクターにおいて構築した。すべての膜タンパク質およびフコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）において合成的に合成した。膜タンパク質および対応する膜タンパク質ポリペプチドのポリヌクレオチド配列を、配列番号１～１９６および配列番号２０４～２１８に示し、表１に列挙する。同封した実施例で使用したフコシルトランスフェラーゼは、それぞれ配列番号１９７および１９８の核酸およびタンパク質の配列を含む３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１ならびに配列番号１９９および２００を含む３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２である。使用した２－フコシルトランスフェラーゼは、それぞれ、本明細書においてＦＴ３と称される配列番号２０１および２０２を含むＨｐＦｕｔＣ、ならびに核酸およびタンパク質の配列である配列番号２１９および２２０を含むＦＴ４である。膜タンパク質とフコシルトランスフェラーゼの遺伝子はいずれも、表２に列挙した特異的プロモーター、ＵＴＲおよびターミネーターの組合せを使用して、異なる転写単位（ＴＵ）で表した。遺伝子は、プロモーターＭｕｔａｌｉｋＰ５（「ＰＲＯＭ０００５＿ＭｕｔａｌｉｋＰ５」）、ＭｕｔａｌｉｋＰ１２（「ＰＲＯＭ００１２＿ＭｕｔａｌｉｋＰ１２」）、ａｐＦＡＢ１４６（「ＰＲＯＭ００３２」）およびＭｕｔａｌｉｋＰ１０（「ＰＲＯＭ００１０＿ＭｕｔａｌｉｋＰ１０」）（Mutalik et al.(Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)に記載される）ならびにプロモーターｐ２２（ＰＲＯＭ００１５＿ｐ２２）およびｐ１４（ＰＲＯＭ００１６＿ｐ１４）（いずれもDe Mey et al.(BMC Biotechnology 2007, 7:34)に記載される））を使用して表した。使用したＵＴＲは、Ｇｅｎｅ１０－ＬｅｕＡＢ－ＢＣＤ２（「ＵＴＲ０００２＿Ｇｅｎｅ１０－ＬｅｕＡＢ－ＢＣＤ２」）、ＢＣＤ１（「ＵＴＲ００３＿ＢＣＤ１」）、Ｇｅｎｅ１０＿ＬｅｕＬ（「ＵＴＲ００１１＿Ｇｅｎｅ１０＿ＬｅｕＬ」）、ＴｈｒＡ＿ＢＣＤ２（「ＵＴＲ００１３＿ＴｈｒＡ＿ＢＣＤ２」）、ＧａｌＥ＿ＬｅｕＡＢ（「ＵＴＲ００１４＿ＧａｌＥ＿ＬｅｕＡＢ」）、ＧａｌＥ＿ｌｐｔＦＧ（「ＵＴＲ００３８＿ＧａｌＥ＿ＩｐｔＦＧ」）およびｕｓｐＦ＿ｉｐｔＦＧ（「ＵＴＲ００５５＿ｕｓｐＦ＿ｉｐｔＦＧ」）（Mutalik et al.(Nat. Methods 2013, No. 10, 354-360)に記載される）を含む。実施例で使用したターミネーターは、Dunn et al.(Nucleic Acids Res. 1980, 8(10), 2119-32)に記載されたＴＥＲ００１０＿Ｔ７ Ｅａｒｌｙである。表３は、上記プロモーターＵＴＲとターミネーターの組合せによって、実施例で使用した転写単位の概要を示す。発現宿主のコドン使用頻度に対するコドン使用頻度を最適化することによって発現はさらに容易になるであろう。供給業者のツールを使用して遺伝子を最適化した。
【0288】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0289】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0290】
【表3】
【0291】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａ（Ｆ－、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、デルタ（ｌａｃＺＹＡａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ－、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ラムダ－、ｔｈｉ－１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）においてプラスミドを維持した。
【0292】
株および突然変異
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５［ｌａｍｂｄａ－、Ｆ－、ｒｐｈ－１］を、２００７年３月にＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳ）、ＣＧＳＣ株番号７７４０から取得した。Datsenko and Wanner (PNAS 97 (2000), 6640-6645)によって公開された技法を使用して、遺伝子破壊および遺伝子導入を行った。この技法は、ラムダＲｅｄリコンビナーゼによって行われる相同組換え後の抗生物質選択に基づく。次のフリッパーゼリコンビナーゼの触媒により、最終産生株における抗生物質選択カセットは確実に除去される。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５［ｌａｍｂｄａ－、Ｆ－、ｒｐｈ－１］を、２００７年３月にＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳ）、ＣＧＳＣ株番号７７４０から取得した。Datsenko and Wanner (PNAS 97 (2000), 6640-6645)によって公開された技法を使用して、遺伝子破壊および遺伝子導入を行った。この技法は、ラムダＲｅｄリコンビナーゼによって行われる相同組換え後の抗生物質選択に基づく。次のフリッパーゼリコンビナーゼの触媒により、最終産生株における抗生物質選択カセットは確実に除去される。
【0293】
ＲｅｄヘルパープラスミドｐＫＤ４６を有する形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびＬ－アラビノース（１０ｍＭ）を含む１０ｍｌのＬＢ培地中で３０℃にて０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。細胞を、それらを最初に５０ｍｌの氷冷水で、次に１ｍｌの氷冷水で洗浄することによってエレクトロコンピテントにした。その後、細胞を５０μｌの氷冷水に再懸濁した。５０μｌの細胞および１０～１００ｎｇの直鎖状二本鎖ＤＮＡ生成物で、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（商標）（ＢｉｏＲａｄ）（６００Ω、２５μＦＤおよび２５０ボルト）を使用することによって電気穿孔を行った。
【0294】
電気穿孔後、細胞を、１ｍｌのＬＢ培地に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、最終的に２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールまたは５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天上に拡げて、抗生物質耐性形質転換体を選択した。選択した突然変異体を、改変された領域の上流および下流のプライマーによるＰＣＲによって検証し、ＬＢ寒天中で４２℃にてヘルパープラスミドの喪失のために増殖させた。突然変異体を、アンピシリン感受性について試験した。
【0295】
直鎖状ｄｓ－ＤＮＡアンプリコンを、ｐＫＤ３、ｐＫＤ４およびそれらの誘導体を鋳型として使用するＰＣＲによって得た。使用したプライマーは、鋳型に相補的な配列の一部、および組換えが起こらなければならない染色体ＤＮＡ上の側に相補的な別の部分を有した。ゲノムノックアウトのために、目的の遺伝子の開始および停止コドンの５０ｎｔ上流および５０ｎｔ下流に、ホモロジー領域を設計した。ゲノムノックインのために、転写開始点（＋１）を、尊重しなければならなかった。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製し、ＤｐｎＩで消化し、アガロースゲルから再精製し、溶離緩衝剤（５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中に懸濁した。
【0296】
選択した突然変異体（クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性）は、熱感受性の複製およびＦＬＰ合成の熱による誘導を示すアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性であるｐＣＰ２０プラスミドを用いて形質転換させた。アンピシリン耐性の形質転換体を３０℃で選択し、その後、いくつかを４２℃のＬＢ中でコロニー精製し、次いで、すべての抗生物質耐性およびＦＬＰヘルパープラスミドの喪失について試験した。遺伝子のノックアウトおよびノックインを対照プライマー（Ｆｗ／Ｒｖ－ｇｅｎｅ－ｏｕｔ）を用いてチェックした。
【0297】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５に由来する突然変異株を、遺伝子ｌａｃＺ、ｌａｃＹ ｌａｃＡ、ｇｌｇＣ、ａｇｐ、ｐｆｋＡ、ｐｆｋＢ、ｐｇｉ、ａｒｃＡ、ｉｃｌＲ、ｗｃａＪ、ｌｏｎおよびｔｈｙＡをノックアウトすることによって作出した。加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＹ遺伝子、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓに由来するフコースキナーゼ遺伝子（ｆｒｋ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗスクローストランスポーター（ｃｓｃＢ）およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓに由来するスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）をゲノム内にノックインし、構成的に発現させた。構成的プロモーターは、De Mey et al. (BMC Biotechnology, 2007)によって説明されるプロモーターライブラリーに由来する。また、これらの遺伝子改変は、ＷＯ２０１６０７５２４３およびＷＯ２０１２００７４８１で説明されている。これらに記載されたように、α１，３－またはα１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、プラスミドから突然変異株に与えられた。すべての膜タンパク質遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＭＧ１６５５由来のこの突然変異株において評価した。プラスミドに存在するかまたは宿主のゲノム内（ｓｅｔＡまたはｌｄｈＡ遺伝子座内）に組み込まれた膜タンパク質遺伝子を評価した。すべての株をクライオバイアル中で－８０℃にて保存する（一晩、７０％グリセロールと１：１の比で混合したＬＢ培養）。
【0298】
代替の突然変異株は、遺伝子ｌａｃＺ、ｒｃｓＡおよびｗｃａＪがノックアウトされたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＪＭ１０９に由来してもよい。α１，３－またはα１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記のようにプラスミドから前記突然変異株に与えられ、２’フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたは２’，３－ジフコシルラクトースの産生をもたらす。上記と同じように、膜タンパク質遺伝子を評価する。ラクトースパーミアーゼ遺伝子ｌａｃＹを誘導するアロラクトースまたはＩＰＴＧによって、前記株はラクトースを内在化させることが可能となる。
【0299】
別の代替の突然変異株は、Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２１に由来してもよい。遺伝子ｌａｃＺ、ｆｕｃＩ、ｆｕｃＫおよびｗｚｘＣ－ｗｃａＪは、前記株においてノックアウトされている。前記突然変異株におけるＧＤＰ－フコースの合成を改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース－１－リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ｇｍｄ）、およびＧＤＰ－Ｌ－フコース合成酵素（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子を上記と同様に過剰発現させた。遺伝子ｌｇｔＢにコードされたベータ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の過剰発現によって、細胞内ラクトース合成が達成される。ＵＤＰ－ガラクトースの合成を増強するために、ｇａｌＥＴＫＭをコードするオペロンをノックアウトし、ＵＤＰ－グルコースエピメラーゼをコードする遺伝子を過剰発現させる。α１，３－またはα１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記のようにプラスミドから前記突然変異株に与えられ、２’フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたは２’，３－ジフコシルラクトースの産生をもたらす。上記と同じように、膜タンパク質遺伝子を評価する。
【0300】
別の代替の突然変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に由来してもよい。遺伝子ｌａｃＺ、ｆｕｃＩ、ｆｕｃＫおよびｗｚｘＣ－ｗｃａＪは、前記株においてノックアウトされている。前記突然変異株におけるＧＤＰ－フコースの合成を改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース－１－リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ｇｍｄ）、およびＧＤＰ－Ｌ－フコース合成酵素（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子を上記と同様に過剰発現させた。さらに、前記株を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のフコースパーミアーゼ（ｆｕｃＰ）遺伝子およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ由来の二官能性フコースキナーゼ／フコース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（ｆｋｐ）遺伝子のゲノムノックインにより改変する。α１，３－またはα１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記のようにプラスミドから前記突然変異株に与えられ、２’フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたは２’，３－ジフコシルラクトースの産生をもたらす。上記と同じように、膜タンパク質遺伝子を評価する。ラクトースパーミアーゼ遺伝子ｌａｃＹを誘導するアロラクトースまたはＩＰＴＧによって、前記株はラクトースを内在化させることが可能となる。
【0301】
別の代替の突然変異株は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２に由来してもよい。遺伝子ｌａｃＺ、およびｗｚｘＣ－ｗｃａＪは、前記株においてノックアウトされている。前記突然変異株におけるＧＤＰ－フコースの合成を改善するために、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のホスホマンノムターゼ（ｍａｎＢ）、マンノース－１－リン酸グアノシルトランスフェラーゼ（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ｇｍｄ）、およびＧＤＰ－Ｌ－フコース合成酵素（ｗｃａＧ）をコードする遺伝子を、上記と同様に過剰発現させた。グリセロール、アセテート、ラクテート、エタノール、スクシネート、ピルベートなどの糖新生基質からのフルクトース－６－ホスフェートの形成を改善するために、ホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡおよびｐｆｋＢ）をコードする遺伝子をノックアウトし、フルクトース－１，６－ビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａＢ）およびＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来の異種のフルクトース－１，６－ビスリン酸ホスファターゼ（ｆｂｐａｓｅ）を過剰発現させた。α１，３－またはα１，２－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、上記のようにプラスミドから前記突然変異株に与えられ、２’フコシルラクトース、３－フコシルラクトースまたは２’，３－ジフコシルラクトースの産生をもたらす。上記と同じように、膜タンパク質遺伝子を評価する。
【0302】
培養条件
９６ウェルマイクロタイタープレート実験の前培養を、クライオバイアルから１５０μＬのＬＢ中で開始し、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて一晩インキュベートした。この培養物を、４００倍希釈することによって、４００μＬの最少培地を有する９６ウェル正方形マイクロタイタープレートのための種菌として使用した。生物学的反復として、各株を９６ウェルプレートの複数のウェル中で成長させた。これらの最終的な９６ウェル培養プレートを、その後、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて７２時間またはそれより短い時間もしくはそれより長い時間インキュベートした。培養実験の終わりに、各ウェルから試料を取って、ブロス上清の糖濃度（細胞外糖濃度、細胞を５回スピンダウンした後）または細胞をスピンダウンする前に培養ブロスを９０℃で１５分間沸騰させることによる糖濃度（＝全ブロスの測定、細胞内および細胞外の糖濃度の平均）を測定した。
９６ウェルマイクロタイタープレート実験の前培養を、クライオバイアルから１５０μＬのＬＢ中で開始し、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて一晩インキュベートした。この培養物を、４００倍希釈することによって、４００μＬの最少培地を有する９６ウェル正方形マイクロタイタープレートのための種菌として使用した。生物学的反復として、各株を９６ウェルプレートの複数のウェル中で成長させた。これらの最終的な９６ウェル培養プレートを、その後、８００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて７２時間またはそれより短い時間もしくはそれより長い時間インキュベートした。培養実験の終わりに、各ウェルから試料を取って、ブロス上清の糖濃度（細胞外糖濃度、細胞を５回スピンダウンした後）または細胞をスピンダウンする前に培養ブロスを９０℃で１５分間沸騰させることによる糖濃度（＝全ブロスの測定、細胞内および細胞外の糖濃度の平均）を測定した。
【0303】
培養物の希釈も行い、６００ｎｍでの光学密度を測定した。全ブロス中で測定したフコシルラクトース濃度をバイオマスで除して、参照株と比較した相対的パーセンテージで、細胞性能指数またはＣＰＩを決定した。バイオマスは、６００ｎｍで測定した光学密度のおよそ３分の１であることが経験的に決定される。上清において測定したフコシルラクトース濃度を全ブロスにおいて測定したフコシルラクトース濃度で除して、参照株と比較した相対的パーセンテージでフコシルラクトース排出比を決定した。
【0304】
バイオリアクターのための前培養を、ある特定の株の１ｍＬのクライオバイアル全部から開始し、１Ｌまたは２．５Ｌの振盪フラスコ中の２５０ｍＬまたは５００ｍＬの最少培地に接種し、２００ｒｐｍの軌道シェーカー上で３７℃にて２４時間インキュベートした。その後、５Ｌのバイオリアクターに接種し（２Ｌの回分培地中に２５０ｍＬの種菌）；プロセスはＭＦＣＳ制御ソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御した。培養条件を３７℃および最大撹拌に設定し；圧力ガス流速は、株およびバイオリアクターに依存した。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４および２０％ＮＨ４ＯＨを使用して、ｐＨを６．８に制御した。排ガスを冷却した。発酵中に発泡する場合、シリコーン消泡剤の１０％溶液を添加した。
【0305】
光学密度
培養物の細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度を測定することによって頻繁にモニターした（Ｉｍｐｌｅｎ Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＰ８０、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＢｅｌｇｉｕｍまたはＳｐａｒｋ １０Ｍマイクロプレートリーダー、Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより）。
培養物の細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度を測定することによって頻繁にモニターした（Ｉｍｐｌｅｎ Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＮＰ８０、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、ＢｅｌｇｉｕｍまたはＳｐａｒｋ １０Ｍマイクロプレートリーダー、Ｔｅｃａｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより）。
【0306】
生産性
比生産性Ｑｐは、典型的には時間単位当たりのバイオマスの質量単位当たりの生成物の質量単位（＝フコシルラクトースのｇ／バイオマスのｇ／時）で表される、フコシルラクトース生成物の比産生率である。Ｑｐ値は、各段階の終了時および各段階が継続した時間枠に形成された生成物とバイオマスの量の両方を測定することによって、発酵ランの各段階、すなわちバッチ段階と流加段階で決定した。
比生産性Ｑｐは、典型的には時間単位当たりのバイオマスの質量単位当たりの生成物の質量単位（＝フコシルラクトースのｇ／バイオマスのｇ／時）で表される、フコシルラクトース生成物の比産生率である。Ｑｐ値は、各段階の終了時および各段階が継続した時間枠に形成された生成物とバイオマスの量の両方を測定することによって、発酵ランの各段階、すなわちバッチ段階と流加段階で決定した。
【0307】
比生産性Ｑｓは、典型的には時間単位当たりのバイオマスの質量単位当たりの基質の質量単位（＝スクロースのｇ／バイオマスのｇ／時）で表される、基質、例えばスクロースの比消費率である。Ｑｓ値は、各段階の終了時および各段階が継続した時間枠に消費されたスクロースと形成されたバイオマスの総量の両方を測定することによって、発酵ランの各段階、すなわちバッチ段階と流加段階で決定した。
【0308】
スクロースの収率Ｙｓは、基質から作製された生成物の分率であり、典型的には基質の質量単位当たりの生成物の質量単位（＝フコシルラクトースのｇ／スクロースのｇ）で表される。Ｙｓは、各段階の終わりに産生されたフコシルラクトースの総量と消費されたスクロースの総量の両方を測定することによって、発酵ランの各段階、すなわちバッチ段階と流加段階で決定した。
【0309】
バイオマスの収率Ｙｘは、基質から作製されるバイオマスの分率であり、典型的には基質の質量単位当たりのバイオマスの質量単位（＝バイオマスのｇ／スクロースのｇ）で表される。Ｙｐは、各段階の終わりに産生されたバイオマスの総量と消費されたスクロースの総量の両方を測定することによって、発酵ランの各段階、すなわちバッチ段階と流加段階で決定した。
【0310】
比率は、典型的には時間単位あたりに作製された生成物の濃度（＝フコシルラクトースのｇ／Ｌ／時）で表される、生成物が発酵ランで作製される速度である。比率は、流加段階の終わりに作製されたフコシルラクトースの濃度を測定し、この濃度を総発酵時間で除して決定する。
【0311】
ラクトース変換率は、ラクトースが、典型的には時間単位当たりのラクトースの質量単位（＝消費されたラクトースのｇ／時）で表される、ラクトースが発酵ランで消費される速度である。ラクトース変換率は、発酵ラン中に消費される総ラクトースの測定値を総発酵時間で除すことによって決定される。
【0312】
成長率／速度の測定
最大成長率（μＭａｘ）は、Ｒパッケージｇｒｏｆｉｔを使用して、６００ｎｍの光学密度の実測値に基づいて計算した。
最大成長率（μＭａｘ）は、Ｒパッケージｇｒｏｆｉｔを使用して、６００ｎｍの光学密度の実測値に基づいて計算した。
【0313】
液体クロマトグラフィー
２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび２’，３－ジフコシルラクトースの標準物質を社内で合成した。非限定的に、ラクトース、スクロース、グルコース、グリセロール、フルクトースなどの他の標準物質は、Ｓｉｇｍａから購入した。炭水化物をＨＰＬＣ－ＲＩ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）法により分析し、それによって、ＲＩ（屈折率：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ）は、試料を含有する場合の移動相の屈折率の変化を検出する。糖を、Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ＨＰＬＣカラム、ＵＳＡ）ならびに７５ｍｌアセトニトリルおよび２５ｍｌ超純水および０．１５ｍｌトリエチルアミンを含有する移動相を使用して無勾配流中で分離した。カラムサイズは４．６×１５０ｍｍであり、３．５μｍの粒径であった。カラムの温度を３５℃に設定し、ポンプ流速は１ｍＬ／分であった。
２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトースおよび２’，３－ジフコシルラクトースの標準物質を社内で合成した。非限定的に、ラクトース、スクロース、グルコース、グリセロール、フルクトースなどの他の標準物質は、Ｓｉｇｍａから購入した。炭水化物をＨＰＬＣ－ＲＩ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）法により分析し、それによって、ＲＩ（屈折率：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ）は、試料を含有する場合の移動相の屈折率の変化を検出する。糖を、Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ ＨＰＬＣカラム、ＵＳＡ）ならびに７５ｍｌアセトニトリルおよび２５ｍｌ超純水および０．１５ｍｌトリエチルアミンを含有する移動相を使用して無勾配流中で分離した。カラムサイズは４．６×１５０ｍｍであり、３．５μｍの粒径であった。カラムの温度を３５℃に設定し、ポンプ流速は１ｍＬ／分であった。
【0314】
データの正規化
すべてのタイプの培養条件について、突然変異株から得られたデータを、突然変異株と同一の遺伝子バックグラウンドを有するが膜タンパク質発現カセットを欠く参照株に関して同一の培養条件で得られたデータに対して正規化した。実施例において示される各プロットの破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。すべてのデータは、その設定値に対する相対的パーセンテージで与えられる。
すべてのタイプの培養条件について、突然変異株から得られたデータを、突然変異株と同一の遺伝子バックグラウンドを有するが膜タンパク質発現カセットを欠く参照株に関して同一の培養条件で得られたデータに対して正規化した。実施例において示される各プロットの破線の横線は、すべての適応を正規化した設定値を示す。すべてのデータは、その設定値に対する相対的パーセンテージで与えられる。
【0315】
（実施例４）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０２、０４、０６、１８、２０、２２、２６、２８、３０、３２、３４、４０、４２、４４、５８、６２、６４、６６、７０、７２、７４、８２、８４、９０、９２、９４および９６を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において産生される３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０２、０４、０６、１８、２０、２２、２６、２８、３０、３２、３４、４０、４２、４４、５８、６２、６４、６６、７０、７２、７４、８２、８４、９０、９２、９４および９６を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において産生される３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
【0316】
（実施例５）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース分泌を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０２、０８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、５８、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、８２、８４、９０、９２、９４、９６および１０４を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ細菌産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株の３－ＦＬの排出比を実証する。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース分泌を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０２、０８、１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３４、５８、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、８２、８４、９０、９２、９４、９６および１０４を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ細菌産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株の３－ＦＬの排出比を実証する。
【0317】
（実施例６）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において成長速度を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞の成長速度に影響を及ぼすそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０８、１４、１８および２２を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主の成長速度を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図３は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株の成長速度を実証する。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において成長速度を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞の成長速度に影響を及ぼすそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号０８、１４、１８および２２を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ１またはＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主の成長速度を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ２、ＴＵ３またはＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図３は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株の成長速度を実証する。
【0318】
（実施例７）
４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬの分泌を増強することが同定された膜タンパク質
４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース分泌を増強する、ある範囲の同定された膜タンパク質の有効性を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、この株のＣＰＩを示す。
４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬの分泌を増強することが同定された膜タンパク質
４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース分泌を増強する、ある範囲の同定された膜タンパク質の有効性を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。４５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、この株のＣＰＩを示す。
【0319】
（実施例８）
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ産生を増強することが同定された膜タンパク質
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地においてフコシルラクトース産生を増強する、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図５は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを示す。
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ産生を増強することが同定された膜タンパク質
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地においてフコシルラクトース産生を増強する、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図５は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを示す。
【0320】
（実施例９）
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ分泌を増加させることが同定された膜タンパク質
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース分泌を増加させる、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号１０および１６を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図６は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、３－ＦＬの排出比を実証する。
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ分泌を増加させることが同定された膜タンパク質
９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース分泌を増加させる、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号１０および１６を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図６は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、３－ＦＬの排出比を実証する。
【0321】
（実施例１０）
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ産生を増加させることが同定された膜タンパク質
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞におけるフコシルラクトース産生を増加させるそれらの能力について、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号１０、１６および２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。すべての候補遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図７は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを実証する。
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－ＦＬ産生を増加させることが同定された膜タンパク質
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞におけるフコシルラクトース産生を増加させるそれらの能力について、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号１０、１６および２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主における３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。すべての候補遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図７は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを実証する。
【0322】
（実施例１１）
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した場合のＥ．ｃｏｌｉ宿主の成長速度を増加させることが同定された膜タンパク質
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞の成長速度に影響を及ぼすそれらの能力について膜タンパク質を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主の成長速度を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図８は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの成長速度を実証する。
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した場合のＥ．ｃｏｌｉ宿主の成長速度を増加させることが同定された膜タンパク質
１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞の成長速度に影響を及ぼすそれらの能力について膜タンパク質を評価するために、実験を設定した。配列番号２８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主の成長速度を増強することができることを示した。配列番号２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。１００ｇ／Ｌのスクロースおよび９０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図８は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの成長速度を実証する。
【0323】
（実施例１２）
５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主の３－ＦＬ産生を増加させることが同定された膜タンパク質
５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース産生に影響を及ぼすそれらの能力について膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号２２を含む膜タンパク質は、それが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主の３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。配列番号２１を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図９は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを実証する。
５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主の３－ＦＬ産生を増加させることが同定された膜タンパク質
５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞によるフコシルラクトース産生に影響を及ぼすそれらの能力について膜タンパク質の能力を評価するために、実験を設定した。配列番号２２を含む膜タンパク質は、それが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１を発現する３－ＦＬ産生宿主の３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。配列番号２１を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。５ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地を使用して、実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図９は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでのＣＰＩを実証する。
【0324】
（実施例１３）
宿主のゲノムに組み込んだ場合に、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または分泌を増加させることが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞において／によるフコシルラクトース産生および／または分泌を増加させる、ゲノムに組み込まれた膜タンパク質の能力を評価するために、別のシリーズの実験を設定した。配列番号０２および２８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１またはＦＴ２のいずれかを発現する３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。配列番号０１および２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、それぞれＥｃＬｄｈＡまたはＥｃＳｅｔＡ遺伝子座におけるゲノムＫＩとして３－ＦＬ産生宿主のゲノムに与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。両方とも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、図１０はＣＰＩを実証し、図１１は３－ＦＬ排出を示す。
宿主のゲノムに組み込んだ場合に、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または分泌を増加させることが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞において／によるフコシルラクトース産生および／または分泌を増加させる、ゲノムに組み込まれた膜タンパク質の能力を評価するために、別のシリーズの実験を設定した。配列番号０２および２８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１またはＦＴ２のいずれかを発現する３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。配列番号０１および２７を含む遺伝子を転写単位ＴＵ１０において組み合わせ、それぞれＥｃＬｄｈＡまたはＥｃＳｅｔＡ遺伝子座におけるゲノムＫＩとして３－ＦＬ産生宿主のゲノムに与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。両方とも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、図１０はＣＰＩを実証し、図１１は３－ＦＬ排出を示す。
【0325】
（実施例１４）
それらがクローニングされる転写単位とは関係なく、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強する膜タンパク質
宿主細胞の、フコシルラクトース産生および／または分泌に影響を及ぼす膜タンパク質の能力を評価するために、別のシリーズの実験を設定した。この実施例でも、いくつかの転写単位をクローニングに使用した。配列番号０２、０６、１０、１６、２２、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および５０を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ２によって３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。排出遺伝子を異なる転写単位中にクローニングし、クローンベクター（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ）として３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。両方とも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、図１２はＣＰＩを実証し、図１３は３－ＦＬ排出を示す。
それらがクローニングされる転写単位とは関係なく、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強する膜タンパク質
宿主細胞の、フコシルラクトース産生および／または分泌に影響を及ぼす膜タンパク質の能力を評価するために、別のシリーズの実験を設定した。この実施例でも、いくつかの転写単位をクローニングに使用した。配列番号０２、０６、１０、１６、２２、２８、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および５０を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ２によって３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。排出遺伝子を異なる転写単位中にクローニングし、クローンベクター（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ）として３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。両方とも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、図１２はＣＰＩを実証し、図１３は３－ＦＬ排出を示す。
【0326】
（実施例１５）
それらの天然の転写オペロン構造にクローニングした場合に、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞のフコシルラクトース産生および／または分泌を増強する膜タンパク質の能力を評価するために実験を設定した。この時点で、膜タンパク質はそれらの天然の転写オペロン構造にクローニングされた。配列番号４０、４２、４６および４８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。すべての候補排出遺伝子を、単一遺伝子としてＴＵ１０に、または２つの膜タンパク質遺伝子を含有するそれらの天然の転写オペロン構造にクローニングし、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、ＣＰＩ（左のパネル）と３－ＦＬ排出比（右のパネル）を示す。
それらの天然の転写オペロン構造にクローニングした場合に、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞のフコシルラクトース産生および／または分泌を増強する膜タンパク質の能力を評価するために実験を設定した。この時点で、膜タンパク質はそれらの天然の転写オペロン構造にクローニングされた。配列番号４０、４２、４６および４８を含む膜タンパク質は、α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において３－ＦＬ産生および／または３－ＦＬ分泌を増強することができることを示した。すべての候補排出遺伝子を、単一遺伝子としてＴＵ１０に、または２つの膜タンパク質遺伝子を含有するそれらの天然の転写オペロン構造にクローニングし、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、ＣＰＩ（左のパネル）と３－ＦＬ排出比（右のパネル）を示す。
【0327】
（実施例１６）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した２’－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における２’－ＦＬおよび／またはＤｉＦＬ産生、および／またはＤｉＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞のフコシルラクトース産生および／または分泌を増強する、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために実験を設定した。この時点で、膜タンパク質を２’－ＦＬおよび／またはｄｉＦＬの産生について試験した。配列番号０２、０６および２８を含む膜タンパク質は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ３を発現する２’－ＦＬ産生宿主において２’ＦＬおよび／またはＤｉＦＬ産生および／またはＤｉＦＬ分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を、異なるＴＵにおいてクローニングし、ＳｅｔＡ遺伝子座（配列番号２７を含む遺伝子のために）またはｌｄｈＡ遺伝子座（配列番号０１および０５を含む遺伝子のために）のいずれかを使用して、２’－ＦＬ産生宿主のゲノムに与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１５は、いずれの時点でも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、２’ＦＬ（パネルＡ）またはＤｉＦＬ（パネルＢ）産生を含む宿主に関するＣＰＩとＤｉＦＬ排出比（パネルＣ）を示す。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した２’－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における２’－ＦＬおよび／またはＤｉＦＬ産生、および／またはＤｉＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において７２時間培養した宿主細胞のフコシルラクトース産生および／または分泌を増強する、ある範囲の膜タンパク質の能力を評価するために実験を設定した。この時点で、膜タンパク質を２’－ＦＬおよび／またはｄｉＦＬの産生について試験した。配列番号０２、０６および２８を含む膜タンパク質は、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ３を発現する２’－ＦＬ産生宿主において２’ＦＬおよび／またはＤｉＦＬ産生および／またはＤｉＦＬ分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を、異なるＴＵにおいてクローニングし、ＳｅｔＡ遺伝子座（配列番号２７を含む遺伝子のために）またはｌｄｈＡ遺伝子座（配列番号０１および０５を含む遺伝子のために）のいずれかを使用して、２’－ＦＬ産生宿主のゲノムに与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図１５は、いずれの時点でも各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、２’ＦＬ（パネルＡ）またはＤｉＦＬ（パネルＢ）産生を含む宿主に関するＣＰＩとＤｉＦＬ排出比（パネルＣ）を示す。
【0328】
（実施例１７）
膜タンパク質ＭｄｆＡは、（３０Ｌの）発酵ランにおいて３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の生産性を増強する。
ＴＵ１において発現し、ＥｃｌｄｈＡ遺伝子座において宿主のゲノムに与えられた配列番号０１を有する膜タンパク質遺伝子を有し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する、３－ＦＬを産生するＥ．ｃｏｌｉ宿主を、バイオリアクターの設定においてその生産性について評価した。実施例３で提供した条件に従って、８回の発酵ランを実施した。また、３－ＦＬ産生宿主と同一であるが、膜タンパク質遺伝子を欠く参照株を、同一の発酵設定において分析した。図１６は、この参照株と相対的に比較した、８回の異なる発酵ランにおいて配列番号０２を含む膜タンパク質ＥｃＭｄｆＡを過剰発現する株の増強された生産性を実証する。
膜タンパク質ＭｄｆＡは、（３０Ｌの）発酵ランにおいて３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の生産性を増強する。
ＴＵ１において発現し、ＥｃｌｄｈＡ遺伝子座において宿主のゲノムに与えられた配列番号０１を有する膜タンパク質遺伝子を有し、プラスミド由来のα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する、３－ＦＬを産生するＥ．ｃｏｌｉ宿主を、バイオリアクターの設定においてその生産性について評価した。実施例３で提供した条件に従って、８回の発酵ランを実施した。また、３－ＦＬ産生宿主と同一であるが、膜タンパク質遺伝子を欠く参照株を、同一の発酵設定において分析した。図１６は、この参照株と相対的に比較した、８回の異なる発酵ランにおいて配列番号０２を含む膜タンパク質ＥｃＭｄｆＡを過剰発現する株の増強された生産性を実証する。
【0329】
（実施例１８）
膜タンパク質ＩｃｅＴは（３０Ｌ）の発酵ランにおける３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の生産性を増強する。
膜タンパク質を発現する別の３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を、３０Ｌのバイオリアクターにおけるその生産性について評価した。３－ＦＬ株は、第１のプラスミド由来のＴＵ３において発現した配列番号０５および第２のプラスミドから発現したα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を含む膜タンパク質遺伝子ＥｃＩｃｅＴを有した。３－ＦＬ産生宿主と同一であるが、膜タンパク質遺伝子構築物を欠く具体的な参照株を使用して、同一の発酵設定における３－ＦＬ生産性を分析した。図１７は、具体的な参照株と相対的に比較した、膜タンパク質を過剰発現する株の増強された生産性を実証する。
膜タンパク質ＩｃｅＴは（３０Ｌ）の発酵ランにおける３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の生産性を増強する。
膜タンパク質を発現する別の３－ＦＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を、３０Ｌのバイオリアクターにおけるその生産性について評価した。３－ＦＬ株は、第１のプラスミド由来のＴＵ３において発現した配列番号０５および第２のプラスミドから発現したα１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を含む膜タンパク質遺伝子ＥｃＩｃｅＴを有した。３－ＦＬ産生宿主と同一であるが、膜タンパク質遺伝子構築物を欠く具体的な参照株を使用して、同一の発酵設定における３－ＦＬ生産性を分析した。図１７は、具体的な参照株と相対的に比較した、膜タンパク質を過剰発現する株の増強された生産性を実証する。
【0330】
（実施例１９）
ＥｃＭｄｆＡまたはＥｃＩｃｅＴに対して相同な膜タンパク質は、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生、および／または３－ＦＬ分泌、および／または成長速度を増強する
α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１またはＦＴ２によって３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される、３－ＦＬの産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができる、および／または３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の成長速度を改善する、配列番号１２０を含む膜タンパク質（配列番号０６を含むＥｃＩｃｅＴと相同）、ならびに配列番号１２６、１２８、１４０、１４６および１５０を含む膜タンパク質（配列番号０２を含む膜タンパク質ＥｃＭｄｆＡと相同）を評価するために、実験を設定した。排出遺伝子を異なる転写単位中にクローニングし、クローンベクター（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ）として３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。各時点で、各参照株と比較した相対パーセンテージで、図１８はＣＰＩを実証し、一方、図１９は３－ＦＬ排出を示し、図２０は成長速度が上昇した株を表す。
ＥｃＭｄｆＡまたはＥｃＩｃｅＴに対して相同な膜タンパク質は、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養した３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における３－ＦＬ産生、および／または３－ＦＬ分泌、および／または成長速度を増強する
α１，３－フコシルトランスフェラーゼ酵素ＦＴ１またはＦＴ２によって３－ＦＬ産生宿主において細胞内で産生される、３－ＦＬの産生および／または３－ＦＬの分泌を増強することができる、および／または３－ＦＬ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の成長速度を改善する、配列番号１２０を含む膜タンパク質（配列番号０６を含むＥｃＩｃｅＴと相同）、ならびに配列番号１２６、１２８、１４０、１４６および１５０を含む膜タンパク質（配列番号０２を含む膜タンパク質ＥｃＭｄｆＡと相同）を評価するために、実験を設定した。排出遺伝子を異なる転写単位中にクローニングし、クローンベクター（ｐＳＣ１０１ ｏｒｉ）として３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。各時点で、各参照株と比較した相対パーセンテージで、図１８はＣＰＩを実証し、一方、図１９は３－ＦＬ排出を示し、図２０は成長速度が上昇した株を表す。
【0331】
（実施例２０）
ポリペプチド配列間での包括的な同一性パーセンテージの計算
比較のための配列のアライメントに関する方法は当技術分野で周知であり、そのような方法としては、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰは、Needleman and Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453)のアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する２つの配列の包括的（すなわち、完全な配列に及ぶ）アライメントを見出す。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）によって、配列同一性のパーセンテージが計算され、２つの配列間の類似性の統計分析が実施される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって公共に利用可能である。ホモログは、例えば、デフォルトペアワイズアライメントのパラメーター、およびパーセンテージでのスコアリング方法を用いたＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントアルゴリズム（バージョン１．８３）を使用して容易に同定され得る。類似性および同一性の包括的パーセンテージはまた、ＭａｔＧＡＴソフトウェアパッケージ（Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.）において利用可能な方法の１つを使用して決定してもよい。わずかな手作業の編集は、保存モチーフ間のアライメントを最適化するために実施されてもよく、このことは当業者に明らかであろう。さらに、ホモログの同定のために全長配列を使用する代わりに、特定のドメインが使用されてもよい。配列同一性の値は、全核酸もしくはアミノ酸配列にわたって、または選択されたドメインもしくは保存モチーフ（複数可）にわたって、デフォルトパラメーターを使用する上述のプログラムを使用して決定されてもよい。局所的アライメントに関しては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが特に有用である（Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7）。
ポリペプチド配列間での包括的な同一性パーセンテージの計算
比較のための配列のアライメントに関する方法は当技術分野で周知であり、そのような方法としては、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰは、Needleman and Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453)のアルゴリズムを使用して、マッチ数を最大化し、ギャップ数を最小化する２つの配列の包括的（すなわち、完全な配列に及ぶ）アライメントを見出す。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）によって、配列同一性のパーセンテージが計算され、２つの配列間の類似性の統計分析が実施される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって公共に利用可能である。ホモログは、例えば、デフォルトペアワイズアライメントのパラメーター、およびパーセンテージでのスコアリング方法を用いたＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントアルゴリズム（バージョン１．８３）を使用して容易に同定され得る。類似性および同一性の包括的パーセンテージはまた、ＭａｔＧＡＴソフトウェアパッケージ（Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.）において利用可能な方法の１つを使用して決定してもよい。わずかな手作業の編集は、保存モチーフ間のアライメントを最適化するために実施されてもよく、このことは当業者に明らかであろう。さらに、ホモログの同定のために全長配列を使用する代わりに、特定のドメインが使用されてもよい。配列同一性の値は、全核酸もしくはアミノ酸配列にわたって、または選択されたドメインもしくは保存モチーフ（複数可）にわたって、デフォルトパラメーターを使用する上述のプログラムを使用して決定されてもよい。局所的アライメントに関しては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムが特に有用である（Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7）。
【0332】
本発明の方法を実施する際に有用な全長ポリペプチド配列間の類似性および同一性の包括的パーセンテージは、ＭａｔＧＡＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）ソフトウェア（BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT：タンパク質またはＤＮＡ配列を使用して類似性／同一性マトリックスを生成するアプリケーション。Campanella JJ, Bitincka L, S malley J：Ｌｅｄｉｏｎ Ｂｉｔｉｎｃｋａがホストするソフトウェア）を使用して決定した。ＭａｔＧＡＴは、データの事前アライメントを必要とすることなく、ＤＮＡまたはタンパク質の配列に関する類似性／同一性マトリックスを生じる。プログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒの包括的アライメントアルゴリズムを使用する一連のペアワイズアライメントを実施し、類似性および同一性を計算し、次いで結果を距離行列に配置する。１．ＣＹＰ７０４様ポリペプチド
【0333】
ＥｃＭｄｆＡ（配列番号２）およびＥｃＩｃｅＴ（配列番号６）に関するポリペプチド配列の全長にわたる包括的同一性について、例示的な分析の結果を図２１および２２に示す。配列同一性は、対角分割線の上半分に示される。この比較で使用したパラメーターは、スコアリング行列：Ｂｌｏｓｕｍ６２、Ｆｉｒｓｔ Ｇａｐ：１２、Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｇａｐ：２であった。本発明の方法を実施する際に有用なＥｃＭｄｆＡ膜タンパク質とそのホモログの間の配列同一性（パーセント）は、概して８０％より高い。本発明の方法を実施する際に有用なＥｃＩｃｅＴ膜タンパク質とそのホモログの間の、パーセントでの配列同一性は、概して８０％より高い。
【0334】
（実施例２１）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、８０、８２、８４、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１０４、１８４、２０４および２０８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において産生される３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１、ＴＵ２、ＴＵ３、ＴＵ１１またはＴＵ１２において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２３は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主において３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、７０、７２、７４、７６、８０、８２、８４、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１０４、１８４、２０４および２０８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，３－フコシルトランスフェラーゼＦＴ２を発現する３－ＦＬ産生宿主において産生される３－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１、ＴＵ２、ＴＵ３、ＴＵ１１またはＴＵ１２において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて３－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２３は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
【0335】
（実施例２２）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号２０４および２１４を含む膜タンパク質は、それらが、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する２’－ＦＬ産生宿主において産生される２’－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１１において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて２’－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）産生を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース産生を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号２０４および２１４を含む膜タンパク質は、それらが、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する２’－ＦＬ産生宿主において産生される２’－ＦＬ産生を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１１において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて２’－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２４は、各参照株と比較した相対的パーセンテージでの、これらの株のＣＰＩを表す。
【0336】
（実施例２３）
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における２’－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース分泌を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号２０６、２０８、２１４、２１６および２１８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する２’－ＦＬ細菌産生宿主において細胞内で産生される２’－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１１において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて２’－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２５は、各参照株と比較した相対パーセンテージで、これらの株における２’－ＦＬの排出比を実証する。
２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地における成長実験で７２時間培養したＥ．ｃｏｌｉ宿主における２’－ＦＬ分泌を増強することが同定された膜タンパク質
膜タンパク質を、２０ｇ／Ｌのラクトースを補充した最少培地において成長する宿主細胞のフコシルラクトース分泌を増強するそれらの能力について評価するために、実験を設定した。配列番号２０６、２０８、２１４、２１６および２１８を含む膜タンパク質は、それらが、α１，２－フコシルトランスフェラーゼＦＴ４を発現する２’－ＦＬ細菌産生宿主において細胞内で産生される２’－ＦＬの分泌を増強することができることを示した。候補遺伝子を転写単位ＴＵ１１において組み合わせ、ｐＳＣ１０１プラスミドにおいて２’－ＦＬ産生宿主に与えた。実施例３で提供した培養条件に従って、成長実験を実施した。図２５は、各参照株と比較した相対パーセンテージで、これらの株における２’－ＦＬの排出比を実証する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】