特表2022-541331エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-22
(54)【発明の名称】エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を検出するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20220914BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220914BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220914BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220914BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022504712
(86)(22)【出願日】2020-07-24
(85)【翻訳文提出日】2022-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2020070896
(87)【国際公開番号】W WO2021013972
(87)【国際公開日】2021-01-28
(31)【優先権主張番号】62/878,643
(32)【優先日】2019-07-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】アーロン ティー．ハミルトン
(72)【発明者】
【氏名】マリンサ ヘイル
(72)【発明者】
【氏名】デブラ リジェット
(72)【発明者】
【氏名】チンタオ スン
(72)【発明者】
【氏名】リン ワン
(72)【発明者】
【氏名】シアオニン ウー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR32
4B063QR39
4B063QR79
4B063QS25
(57)【要約】
生物学的もしくは非生物学的サンプル中のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の存在もしくは非存在を迅速に検出するための方法が開示される。該方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、および検出工程を実施することを含み得る。さらに、ＥＢＶを標的化するプライマーおよびプローブ、およびＥＢＶの標的領域を検出するために設計されたキットが提供される。ＥＢＶの増幅および検出のためのキット、反応混合物およびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーおよびプローブ）も開示される。ＥＢＶの異なる領域を検出するプライマーおよびプローブも開示されており、ＥＢＶの２つの異なる重複しない標的領域を同時に検出するための二重標的アッセイに使用し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１つ以上の標的核酸を検出するための方法であって、（ａ）サンプルを供給すること、
（ｂ）ＥＢＶの前記１つ以上の標的核酸がサンプル中に存在する場合、前記サンプルを１つ以上のプライマーのセットと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること、
（ｃ）ＥＢＶの前記１つ以上の標的核酸がサンプル中に存在する場合、前記増幅産物を１つ以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること、および
（ｄ）前記増幅産物の存在もしくは非存在を検出することを含む検出工程を実施することであって、前記増幅産物の存在が、サンプル中にＥＢＶの前記１つ以上の標的核酸が存在することを示唆し、前記増幅産物の非存在が、サンプル中にＥＢＶの前記１つ以上の標的核酸が存在しないことを示唆する、検出工程を実施すること、を含み、
前記１つ以上のプライマーのセット、および前記１つ以上のプローブが、
（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブ、および／または
（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号６の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブとを含む、
方法。
【請求項2】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記生物学的サンプルが、血漿もしくは血液である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出する方法であって、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するためのプライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含み、
ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するためのプライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない、請求項４もしくは５に記載の方法。
【請求項7】
サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するための方法であって、（ａ）サンプルを供給すること、
（ｂ）ＥＢＶの１以上の前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記サンプルをプライマーの少なくとも２つのセットと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること、
（ｃ）ＥＢＶの１以上の前記標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記増幅産物を少なくとも２つのプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること、および
（ｄ）前記増幅産物の存在または非存在を検出することを含む検出工程を実施することであって、前記増幅産物の存在が前記サンプル中にＥＢＶの１以上の前記標的核酸が存在することを示唆し、前記増幅産物の非存在が前記サンプル中にＥＢＶの１以上の前記標的核酸が存在しないことを示唆する、検出工程を実施することを含み、
プライマーの前記少なくとも２つのセットの一方および前記少なくとも２つのプローブの一方は、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するためのものであり、
（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含み、
プライマーの前記１以上のセットの一方および前記少なくとも２つのプローブの一方は、ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するためのものであり、
（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含む、
方法。
【請求項8】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない、請求項７もしくは８に記載の方法。
【請求項10】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記生物学的サンプルが、血漿もしくは血液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
サンプル中に存在する可能性のあるＥＢＶの１以上の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）ヌクレオチドモノマー、
（ｃ）プライマーの１以上のセット、および
（ｄ）１以上のプローブ
を含む増幅試薬を含み、
前記１つ以上のプライマーのセット、および前記１つ以上のプローブが、
（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブ、および／または
（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブとを含む、
キット。
【請求項13】
前記１つ以上のプローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されている、請求項１２に記載のキット。
【請求項14】
サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するための、請求項１２または１３に記載のキットであって、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するためのプライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、
（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含み、
ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するためのプライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、
（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含む、
キット。
【請求項15】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない、請求項１４もしくは１５に記載の方法。
【請求項17】
サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが、（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｂ）ヌクレオチドモノマー、
（ｃ）ＥＢＶの第１の標的核酸を検出するためのプライマーの第１のセットおよび１つのプローブ、ならびに
（ｄ）ＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのプライマーの第２のセットおよび１つのプローブ
を含む増幅試薬を含み、
前記プライマーの第１のセットおよび１つのプローブが、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するためのものであり、配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーと、配列番号２またはその相補体を含むプローブとを含み、
前記プライマーの第２のセットおよび１つのプローブが、ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するためのものであり、配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含む、
キット。
【請求項18】
前記プローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項19】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる、請求項１７もしくは１８に記載のキット。
【請求項20】
ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、体外診断の分野に関する。この分野では、本発明は、サンプル中に存在し得る標的核酸の増幅および検出、特に、プライマーおよびプローブを使用した、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の配列変異および／または個々の変異を含む標的核酸の増幅、検出および／または定量に関する。本発明はさらに、ＥＢＶの増幅および検出のためのプライマーおよびプローブを含有する反応混合物およびキットを提供する。
【背景技術】
【0002】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスウイルス群のメンバーであるＤＮＡウイルスである（ヒトヘルペスウイルス－４もしくはＨＨＶ－４との別名称を有する）。ＥＢＶ感染は一般的であり、成人における有病率は推定９０％であり、無症候性であることが多い。ＥＢＶ感染は、いくつかの潜伏期のうちの１つ以上に入る前に、初期の溶解段階で単核球症を引き起こす可能性がある。ＥＢＶは、免疫不全患者の生命を脅かす疾患およびいくつかの形態の癌（バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、鼻型ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫＴＬ）、リンパ上皮腫様癌（ＬＥＬＣ）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、および胃癌（ＧＣ）と非常に関連している。免疫反応が抑制された臓器移植患者では、潜在的にＥＢＶに感染したＢ細胞の増殖が制御されず、深刻な合併症が生じるので、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）を引き起こす可能性があるため、特に危険にさらされる。移植は、免疫抑制による拒絶リスクと疾患リスクのバランスを伴う。ＥＢＶは、いくつかの一般的な（９０％）、しばしば無症候性のウイルス感染症の１つであるが、ウイルスを排除し得ないため、免疫反応が抑制された患者に脅威をもたらす。ＰＴＬＤは、主にＥＢＶ陽性と関連するＢリンパ球の増殖である（特に早期発症の場合）。実際、ＥＢＶは第２の主要な移植後監視マーカー（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染後）であり、ＥＢＶ関連ＰＴＬＤは、固形臓器移植もしくは造血幹細胞移植後の最も一般的な悪性疾患の１つである。移植患者の最大５％がＰＴＬＤを発症し、最悪の場合、リンパ腫を引き起こし得る。最大リスク群としては、移植後１年目の患者、ＥＢＶ陽性ドナーからＥＢＶ陰性レシピエントへの臓器移植、幹細胞移植患者および小児患者が挙げられる。
【0003】
ＥＢＶは、血漿中のウイルス粒子および断片化ＤＮＡにより、また細胞内エピソームＤＮＡウイルスゲノムおよびｍＲＮＡにより、血流中に検出される可能性がある。ＥＢＶは、（内部反復数および欠失に応じて）約１７２ｋｂ以上のゲノムサイズを有し、線状もしくは環状（エピソーム）構造のいずれかで存在し得る。ＥＢＶの遺伝的多様性は、一般に、文献に列挙されている２つの型を含むと報告されているが、ウイルスの実際の多様性の特徴付けはより複雑であり、ゲノムのどの部分をサンプリングするかに依存し得る。ＥＢＮＡ２およびＥＢＮＡ３Ａ、ＢおよびＣ遺伝子配列により、ＥＢＶ株の従来の「１型」および「２型」カテゴリーへの分類が推進される。一般に、１型はほとんどの地域で多くみられるが、アフリカでは、１型と２型の両方が非常に流行している。これらの遺伝子以外では、１型／２型の相違はあまり関連性がなく、選択された遺伝子については異なる系統発生パターンがあり得る。地理的変異は、ＥＢＶの東アジア系統とヨーロッパおよびアフリカの系統との間の違いから記載されているが、ＥＢＶゲノム多様性の完全な特徴付けには、２つ以上の遺伝子領域のサンプリングが必要な場合がある。組換えは、ウイルスの履歴において頻繁に起こるようであり、単一細胞において再感染もしくは共感染が起こり得ることを示している。当技術分野では、ＥＢＶを検出するための信頼性が高く、高感度で、再現性のある手段が依然として必要とされている。
【0004】
ＥＢＶウイルス量の測定は、移植患者を管理し、ＥＢＶ関連疾患を診断および追跡するための日常的な検査になりつつある。ＥＢＶウイルスのモニタリングを受けている患者では、連続ＤＮＡ測定を使用して、潜在的な治療変更の必要性を示し、治療に対するウイルス反応を評価し得る。世界中におけるＥＢＶ感染症の広範な有病率およびＥＢＶで頻繁に起こる組換えを考えると、当技術分野では、サンプル中のＥＢＶの存在を検出および／または定量するための迅速で信頼性が高く、特異的で高感度の方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0005】
分子診断の分野では、核酸の増幅および検出はかなり重要である。そのような方法は、任意の数のウイルスおよび細菌のような微生物を検出するために使用し得る。最も顕著で広く使用されている増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅技術としては、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ－ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびＱβ増幅が挙げられる。ＰＣＲに基づく分析のための自動化されたシステムは、しばしば、同じ反応容器におけるＰＣＲプロセス中の産物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法の鍵は、レポーター基もしくは標識を有する修飾オリゴヌクレオチドの使用である。
【0006】
本発明は、信頼性が高く、高感度で再現性のある、ＥＢＶの増幅および検出に関する。ＥＢＶは、アッセイ設計のための複数のよく保存された標的領域を有するＤＮＡウイルスであるが、遭遇することのないような置換もしくは欠失の可能性は、二重標的アプローチが賢明であることを意味する。プライマーおよびプローブの設計は、最大限にＥＢＶを含み、他のヘルペスウイルスを排除するために利用可能な公開配列情報を使用した。
【0007】
本発明は、最大限にＥＢＶを含み、他の鋳型との交差反応性を防止するように設計された新規なオリゴヌクレオチド設計からなる。このＥＢＶアッセイは、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用し得る。本発明のプライマーおよびプローブは、ウイルス配列の不均一性に対する対抗手段として、両方の標的が同じ色素を使用する二重標的アッセイとして使用され得る。設計戦略は、ＥＢＶゲノムから保存された配列領域を選択し、各標的についていくつかのプライマーおよびプローブの組み合わせを評価することであった。アッセイ設計を選択した５つの領域は、ＩＲ－１リピート、ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＮＡ－１（ＢＫＲＦ－１）、ＢＭＲＦ－２およびレダクターゼ／ＢＯＲＦ－２であった。配列は、１型および２型の両方のＥＢＶ、およびアジア、アフリカ、北米、南米、欧州およびオーストラリアを含む世界中の地理的位置からの配列を含んでいた。スクリーニングおよび最適化プロセスの後、２つの候補がＥＢＮＡ－１の最終エクソンのすぐ上から、およびＢＭＲＦ－２のコード配列内から同定された。これらの候補は、二重標的アッセイで個別にもしくは一緒に二重に使用し得る。二重標的アッセイとして使用する場合、２セットのプライマーおよびプローブを使用する（各セットはＥＢＮＡ－１もしくはＢＭＲＦ－２のいずれかを検出する）。
【0008】
本開示の特定の実施形態は、生物学的サンプルもしくは非生物学的サンプル中のＥＢＶの存在もしくは非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管もしくは容器内でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＥＢＶの多重検出のための方法に関する。実施形態は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含むＥＢＶの検出方法を含む。更に、実施形態は、単一の試験管もしくは容器内でのＥＢＶの検出のために設計されたプライマー、プローブおよびキットを含む。
【0009】
本発明の一態様は、サンプル中のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１つ以上の標的核酸を検出するための方法であって：（ａ）サンプルを供給すること、（ｂ）ＥＢＶの前記１以上の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記サンプルをプライマーの１以上のセットと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること、（ｃ）ＥＢＶの前記１以上の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記増幅産物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）前記増幅産物の存在もしくは非存在を検出することを含む検出工程を実施することであって、前記増幅産物の存在が前記サンプル中にＥＢＶの前記１以上の標的核酸が存在することを示唆し、前記増幅産物の非存在が前記サンプル中にＥＢＶの前記１以上の標的核酸が存在しないことを示唆する、検出工程を実施すること、を含み、プライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブ、および／または（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号６の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブとを含む、方法に関する。
【0010】
関連する実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。関連する実施形態では、生物学的サンプルは血漿である。関連する実施形態では、生物学的サンプルは血液である。別の実施形態では、方法が、サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのものであり、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するための１以上のプライマーのセットおよび１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１および３の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含み、ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するための１以上のプライマーのセットおよび１以上のプローブが、（ｉｉ）配列番号４および６の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含む、方法である。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない。
【0011】
別の態様は、サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するための方法であって、（ａ）サンプルを供給すること、（ｂ）ＥＢＶの前記１以上の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記サンプルをプライマーの１以上のセットと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること、（ｃ）ＥＢＶの前記１以上の標的核酸が前記サンプル中に存在する場合、前記増幅産物を１以上のプローブと接触させることを含むハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）前記増幅産物の存在もしくは非存在を検出することを含む検出工程を実施することであって、前記増幅産物の存在が前記サンプル中にＥＢＶの前記１以上の標的核酸が存在することを示唆し、前記増幅産物の非存在が前記サンプル中にＥＢＶの前記１以上の標的核酸が存在しないことを示唆する、検出工程を実施すること、を含み、プライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１および３の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含み、ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するための１以上のプライマーのセットおよび１以上のプローブが、（ｉｉ）配列番号４および６の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含む、方法に関する。
【0012】
別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない。別の実施形態では、サンプルは、生物学的サンプルである。別の実施形態では、生物学的サンプルは血漿である。別の実施形態では、生物学的サンプルは血液である。
【0013】
本発明の別の態様は、サンプル中に存在する可能性のあるＥＢＶの１つ以上の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオチドモノマー、（ｃ）プライマーの１以上のセット、および（ｄ）１以上のプローブを含む増幅試薬を含み、プライマーの前記１以上のセットおよび前記１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む第１のプライマーと配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブ、および／または（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列もしくはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブとを含む、キットに関する。別の実施形態では、前記１つ以上のプローブは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施形態では、キットが、サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのものであり、ＥＢＶの前記第１の標的核酸を検出するためのプライマーの１以上のセットおよび１以上のプローブが、（ｉ）配列番号１および３の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含み、ＥＢＶの前記第２の標的核酸を検出するための１以上のプライマーのセットおよび１以上のプローブが、（ｉｉ）配列番号４の核酸配列を含む第１のプライマーと、配列番号６の核酸配列またはその相補体を含む第２のプライマーとを含むプライマーのセットと、配列番号３の核酸配列またはその相補体を含むプローブとを含む、キットである。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない。
【0014】
本発明の別の態様は、サンプル中のＥＢＶの第１の標的核酸およびＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのキットであって、前記キットが（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオチドモノマー、（ｃ）ＥＢＶの第１の標的核酸を検出するためのプライマーの第１のセットおよび１つのプローブ、ならびに（ｄ）ＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのプライマーの第２のセットおよび１つのプローブを含む増幅試薬を含み、ＥＢＶの第１の標的核酸を検出するための１つのプライマーの第１のセットおよび１つのプローブが、（ｉ）配列番号１および３の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号２の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含み、ＥＢＶの第２の標的核酸を検出するためのプライマーの第２のセットおよび１つのプローブが、（ｉｉ）配列番号４および６の核酸配列もしくはその相補体を含むプライマーのセット、および配列番号３の核酸配列もしくはその相補体を含むプローブを含む、キットに関する。別の実施形態では、プローブは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識されている。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が異なる。別の実施形態では、ＥＢＶの前記第１の標的核酸およびＥＢＶの前記第２の標的核酸が重複していない。
【0015】
他の態様は、１００以下のヌクレオチドを有する、配列番号１～６から選択されるヌクレオチドの配列もしくはその相補体を含むかもしくはそれらからなるオリゴヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号１～６もしくはその相補体の１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％など）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。これらの実施形態の一定のものでは、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチドなど）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、未修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。必要に応じて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識、および少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」もしくは単に「保存的変異」とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、もしくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸もしくは少量のアミノ酸（通常は５％未満、より通常には４％、２％もしくは１％未満）を変更、付加もしくは欠失させる個々の置換、欠失もしくは付加は、修飾がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、もしくは化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的修飾変異」であることを認識するであろう。
【0016】
一態様では、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用し得る。したがって、ドナー蛍光部分およびアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、７もしくは１０ヌクレオチド）以内であり得る。別の態様では、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。該方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
【0017】
本開示は、また個体由来の生物学的サンプル中のＥＢＶもしくはＥＢＶ核酸の存在もしくは非存在を検出する方法を提供する。これらの方法は、例えば、血液スクリーニングおよび診断試験に使用するために、血漿中のＥＢＶ核酸の存在もしくは非存在を検出するために使用し得る。さらに、同じ試験を当業者が使用して、尿および他の種類のサンプルを評価し、ＥＢＶ核酸を検出および／または定量し得る。そのような方法は、一般に、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、核酸分子がサンプル中に存在する場合に、サンプルを複数のオリゴヌクレオチドプライマー対と接触させて１つ以上の増幅産物を生成することを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在もしくは非存在を検出することを含み、結合の存在はサンプル中にＥＢＶ核酸が存在することを示し、結合の非存在はサンプル中にＥＢＶが存在しないことを示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、およびＹＯ－ＹＯ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどのシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含み得、融解温度により、ＥＢＶ核酸の存在もしくは非存在が確認される。
【0018】
さらなる実施形態では、ＥＢＶの１以上の核酸を検出および／または定量するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な１つ以上のプライマーのセット；および増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
【0019】
一態様では、キットは、ドナー部分および対応するアクセプター部分、例えば、別の蛍光部分もしくはダーククエンチャーで既に標識されているプローブを含み得、もしくはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼおよび核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液を更に含み得る。キットはまた、添付文書およびプライマー、プローブおよびフルオロフォア部分を使用してサンプル中のＥＢＶ核酸の存在もしくは非存在を検出するための説明書を含み得る。
【0020】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様もしくは同等の方法および材料が本主題の実施もしくは試験で使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義をも含む本明細書が優先する。
【0021】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】図１は、ＥＢＶのゲノム構造を示す。図１Ａは、線状ＥＢＶゲノム（溶菌型）の模式図を示す。図１Ｂは、環状ＥＢＶゲノム（潜伏型）の模式図を示す。ＥＢＶは、約１７２ｋｂ以上の二本鎖ＤＮＡウイルスである。以下が存在する。（ｉ）大部分が独特の領域、（ｉｉ）内部反復領域（ＩＲ１－ＩＲ４）、（ｉｉｉ）末端反復（ＴＲ）、（ｉｖ）プラスミド維持およびＤＮＡ複製活性を有する、潜伏感染ＥＢＶエピソーム複製の起点であるＯｒｉ Ｐ、（ｖ）潜伏ＥＢＶ誘導性膜タンパク質および核タンパク質のエクソン。図１は、二重標的アッセイとして使用し得るＥＢＶ標的ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１を強調している。
【図4A】図４Ａは、８，０００ＩＵ／ｍｌ（図４Ａ）での、ＥＢＶについてのＷＨＯの基準（ＮＩＢＳＣコード０９／２６０）に対するＱｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｐａｎｅｌ（Ｑｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号ＥＢＶＡＱＰ０３－Ｃ）のアッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。
【図4B】図４Ｂは、８０ＩＵ／ｍｌ（図４Ｂ）での、ＥＢＶについてのＷＨＯの基準（ＮＩＢＳＣコード０９／２６０）に対するＱｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｐａｎｅｌ（Ｑｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号ＥＢＶＡＱＰ０３－Ｃ）のアッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。
【図4C】図４Ｃは、８ＩＵ／ｍｌ（図４Ｃ）での、ＥＢＶについてのＷＨＯの基準（ＮＩＢＳＣコード０９／２６０）に対するＱｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｐａｎｅｌ（Ｑｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号ＥＢＶＡＱＰ０３－Ｃ）のアッセイの性能の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。 ＥＢＶ陰性血漿にスパイクした抽出ＥＢＶ ＤＮＡおよびＲａｊｉ細胞株ＤＮＡなどの他のＥＢＶサンプルタイプも試験した（データは示さず）。
【図5L】図５Ｌは、細胞培養由来材料（２０ＩＵ／ｍＬ）（図５Ｌ）に対する多重化アッセイの実行の希釈系列のＰＣＲ増殖曲線を示す。 チャネル２は二重標的ＥＢＶアッセイを示し、チャネル５は内部対照反応である。
【図6A】図６Ａは、個々の標的（Ｅ１ｃ、Ｂ２ｃ）もしくは両方の標的（ｄＣ）を含むプラスミド鋳型、およびＢ９５－８細胞株抽出物（ＥＢＶ ＤＮＡのコピーを含む）における、ＥＢＮＡ１（図６Ａ）についての別々の反応のＰＣＲ増殖曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
核酸増幅によるＥＢＶ感染症の診断は、ＥＢＶ感染症を迅速、正確、確実に、特異的に、また高感度に検出および／または定量化するための方法を提供する。非生物学的もしくは生物学的サンプル中のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むＥＢＶ核酸を検出および／または定量するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを本明細書に開示する。ＥＢＶを検出および／または定量するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含有する製造品もしくはキットも提供される。他の方法と比較してＥＢＶの検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性および感度が上昇し、サンプルの封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、臨床検査室におけるＥＢＶ感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、この技術は、血液スクリーニングおよび予後診断に使用し得る。このＥＢＶ検出アッセイはまた、他の核酸、例えば、他の細菌および／またはウイルスの検出のための他のアッセイと並行して多重化され得る。
【0024】
本開示は、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を用いてＥＢＶを特異的に同定するために、ＥＢＶゲノムにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光標識加水分解プローブを含む。
【0025】
開示される方法は、１種以上のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の１種以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「ＥＢＶプライマー（複数可）」とは、ＥＢＶ中に見出される核酸配列を特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。ＥＢＶゲノムに見出される核酸配列の例としては、ＥＢＶゲノムのウイルスキャプシドタンパク質領域、例えばＶＰ２領域内の核酸が挙げられる。検討されるＥＢＶプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、標的にアニーリングする。１つ以上の核酸がサンプル中に存在すれば、１つ以上の増幅産物が生成され、したがって、１つ以上の増幅産物の存在がサンプル中にＥＢＶが存在することを示す。増幅産物は、ＥＢＶについての１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。本明細書で使用される「ＥＢＶプローブ（複数可）」は、ＥＢＶゲノム中に見出される核酸と特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含み、サンプル中のＥＢＶの存在もしくは非存在を検出するために、サンプルを１つ以上の検出可能なＥＢＶプローブと接触させる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子（例えば、ＥＢＶゲノムからの核酸分子）の一方もしくは両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）およびポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液および／または補因子（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。
【0027】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、３’から５’へのホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得て、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
【0028】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ、サーマス・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティスク（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・ファービダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
【0029】
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
【0030】
核酸に関して使用される場合の「伸長」もしくは「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（もしくは他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼなどの生体触媒を組み込むヌクレオチドによって必要に応じて伸長される。
【0031】
２以上の核酸配列の文脈における「同一」もしくは「同一性」パーセントという用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用してもしくは目視検査によって測定して最大の一致に関して比較およびアラインメントした場合に、同一もしくは特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２以上の配列もしくは部分配列を指す。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，Ｇｉｓｈら（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２，Ｍａｄｄｅｎら（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，およびＺｈａｎｇら（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に開示され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0032】
オリゴヌクレオチドに関して「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ、５－プロピニルｄＵ、５－プロピニルｄＣ、７－デアザ－デオキシグアノシン（デアザＧ（ｕ－デアザ））などが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、もしくは当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。更に説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の修飾ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、もしくは他の望ましい特徴を提供し得る。
【0033】
ＥＢＶ標的核酸の検出／定量
本開示は、例えばＥＢＶ核酸配列の一部を増幅することによってＥＢＶを検出する方法を提供する。具体的には、ＥＢＶ核酸分子標的を増幅し、検出および／または定量するためのプライマーおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
本開示は、例えばＥＢＶ核酸配列の一部を増幅することによってＥＢＶを検出する方法を提供する。具体的には、ＥＢＶ核酸分子標的を増幅し、検出および／または定量するためのプライマーおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
【0034】
ＥＢＶの検出および／または定量のために、ＥＢＶを増幅および検出／定量するためのプライマーおよびプローブが提供される。本明細書に例示される核酸以外のＥＢＶ核酸も、サンプル中のＥＢＶを検出するために使用し得る。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示されるＥＢＶ核酸における１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。
【0035】
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～６から選択される配列を有する核酸、配列番号１～６の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、もしくは配列番号１～６の相補体およびバリアントを含む。
【表1】
【0036】
一実施形態では、ＥＢＶを含有すると思われる生物学的サンプル中のＥＢＶの検出を提供するために、前記のプライマーのセットおよびプローブが使用される（表１）。プライマーのセットおよびプローブは、配列番号１～６の核酸配列を含むか、もしくはそれからなるＥＢＶ核酸配列に特異的なプライマーおよびプローブを含むか、もしくはそれからなり得る。別の実施形態では、ＥＢＶ標的のためのプライマーおよびプローブは、配列番号１～６のプライマーおよびプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントを含むか、もしくはそれからなる。
【0037】
配列番号１～６のプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示される方法においてプライマーおよび／またはプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～６のいずれかのプライマーおよび／またはプローブの機能的に活性なバリアントは、配列番号１～６のそれぞれの配列と比較して、記載の方法もしくはキットにおいて、類似し、もしくはより高い特異性および感度を提供するプライマーおよび／またはプローブに関する。
【0038】
バリアントは、例えば、配列番号１～６のそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換などの１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換によって、配列番号１～６の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマーおよび／またはプローブは化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマーおよび／またはプローブは修飾ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（もしくはプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（もしくは「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、もしくはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置換されてもよく、そのようにしても「修飾ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」もしくは「ヌクレオチド類縁体」という用語は、本出願では互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（もしくは「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（もしくは「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
【0039】
ＥＢＶ標的をコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチド、ＥＢＶの別の部位をコードする核酸は、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）などのコンピュータプログラムを使用して設計し得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８もしくは５０ヌクレオチド長）である。
【0040】
プライマーのセットに加えて、本方法は、ＥＢＶの存在もしくは非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的もしくは生物学的に生成された核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を指し、これは、設計もしくは選択により、ＥＢＶ（標的）核酸が存在する場合に、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）、「標的核酸」にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
【0041】
いくつかの実施形態では、開示されるプローブは、少なくとも１種の蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、ＥＢＶプローブは、ドナー蛍光部分、例えば、蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えば、クエンチャーで標識し得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むか、もしくはそれからなり、核酸配列は配列番号２および／または５を含むか、もしくはそれからなる。
【0042】
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行い得。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブもしくは一対のプローブを使用し得る。実施形態に応じて、使用するプローブ（複数可）は、少なくとも１種の標識および／または少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常同様の融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５）ヌクレオチド長である。
【0043】
コンストラクトは、それぞれがＥＢＶプライマーおよびプローブ核酸分子（例えば、配列番号、１、２、３、４および５）のうちの１つを含有するベクターを含み得る。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用し得る。使用に適したベクターは、市販されている、および／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ＥＢＶ核酸分子は、例えば、化学合成、ＥＢＶからの直接クローニング、もしくは核酸増幅によって得ることができる。
【0044】
本方法での使用に適したコンストラクトは、典型的には、ＥＢＶ核酸分子（例えば、配列番号１～６の１つ以上の配列を含む核酸分子）に加えて、所望のコンストラクトおよび／または形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、および複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
【0045】
ＥＢＶ核酸分子を含有するコンストラクトを、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物細胞および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれ得る。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞もしくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、およびアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。更に、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達し得る（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照されたい）。
【0046】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載されるＥＢＶ核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、４および６）を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製し得るか、もしくは合成的に生成し得る。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載されるＥＢＶ核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１、３、４および６）を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製し得るか、もしくは合成的に生成し得る。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
【0047】
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、もしくは酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成し得る。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、および変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、もしくは１．５分）行われる。
【0048】
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進もしくは最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではなく（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
【0049】
レトロウイルス若しくはＲＮＡウイルスのゲノム、もしくはＥＢＶなどのＤＮＡウイルスによって産生されるｍＲＮＡは、リボ核酸、すなわち、ＲＮＡからなる。そのような場合、鋳型核酸であるＲＮＡは、酵素逆転写酵素の作用を介して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に最初に転写されなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型およびＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を指示し、次いでこれをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として直接使用し得る。
【0050】
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの核酸を使用し得る。鋳型核酸を精製する必要はなく、ヒト細胞に含まれるＥＢＶ核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。ＥＢＶ核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているものなどの日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、もしくは、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、もしくは植物若しくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
【0051】
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１、２、４、および５）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼおよび１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、もしくはそれらの１種以上の類縁体を含有する。
【0052】
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的ＥＢＶ核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシドトリホスフェートの量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質による。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。概して、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、もしくは１００回繰り返してもよい。
【0053】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、もしくは他の方法で検出および／または定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、もしくは他の方法で検出および／または定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
【0054】
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分もしくは色素（例えば、ＨＥＸもしくはＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ－２など））とを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（ＢＨＱ２など）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
【0055】
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
【0056】
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、もしくは蛍光光度計を使用して行い得る。エネルギー移動を開始するため、もしくは蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、もしくは所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
【0057】
ドナー部分および対応するアクセプター部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分もしくはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非放射エネルギー伝達を行い得る。
【0058】
蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍもしくはアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有する対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。
【0059】
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンイミジル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｄｙｌ）１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、もしくはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、もしくはテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）もしくはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
【0060】
ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Ａ～約２５Ａである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
【0061】
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）もしくはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈもしくはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、もしくはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
【0062】
本開示は、生体サンプルもしくは非生体サンプル中のＥＢＶの存在もしくは非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、サンプル汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。上記方法は、１つ以上のプライマー対を使用してサンプルからの標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、およびＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。方法を、ＥＢＶの存在を検出するためにプライマーおよびプローブを使用して行うことができ、標的ＥＢＶ遺伝子の検出は、サンプル中のＥＢＶの存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在もしくは非存在、したがってＥＢＶの存在もしくは非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば１種の蛍光部分もしくは色素（例えばＨＥＸもしくはＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよい１種のクエンチャー（例えば、ＢＨＱ－２）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブとを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分もしくはダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャーの不在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のＥＢＶの存在もしくは非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在もしくは非存在、したがってＥＢＶの存在もしくは非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば１種の蛍光部分もしくは色素（例えばＨＥＸもしくはＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよい１種のクエンチャー（例えば、ＢＨＱ－２）で標識された１つの一本鎖ハイブリダイゼーションプローブとを利用する。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分もしくはダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャーの不在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のＥＢＶの存在もしくは非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
【0063】
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部分が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
【0064】
ＦＲＥＴ技術の別の共通形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）ｏｒ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に移動する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＥＢＶゲノムの数）と相関させることができる。標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
【0065】
一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中のＥＢＶの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中のＥＢＶの非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、もしくは特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムもしくはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。
【0066】
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、全血、呼吸器検体、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚および軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集および保存方法は、当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法および／またはキットによって）処理してＥＢＶ核酸を放出させ得、もしくはいくつかの場合では、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。一部の例では、生物学的サンプルは全血である。全血を典型的に収集する場合、全血を適切な温度で保存することを可能にする、ヘパリン、クエン酸塩、もしくはＥＤＴＡなどの抗凝固剤を含む容器に収集することが多い。しかし、そのような条件下では、全血内の核酸はかなりの量の分解を受ける。したがって、核酸安定化溶液などの、核酸を含む全血成分を溶解、変性および安定化する試薬に血液を回収することが有利であり得る。そのような場合、核酸は、後続の単離およびＰＣＲなどの核酸試験などによる分析のために、より良好に保存および安定化され得る。そのような核酸安定化溶液は当技術分野で周知であり、これには、限定するものではないが、ｐＨ ７．５で４．２ Ｍグアニジニウム塩（ＧｕＨＣｌ）および５０ ｍＭ Ｔｒｉｓを含有するｃｏｂａｓ ＰＣＲ培地が含まれる。
【0067】
サンプルは、分析前にサンプルを適切に保持および保存するように設計された任意の方法もしくは装置によって回収することができる。そのような方法および装置は、当技術分野で周知である。サンプルが全血などの生物学的サンプルである場合、方法もしくは装置は、採血管を含むことができる。このような採血管は、当該技術において周知であり、例えば採血チューブを含むことができる。多くの場合、採血チューブを使用することが有利であり得、この場合、採血管は、サンプル取り込みのために意図された空間内で圧力下にあり、例えば、バキュテナー採血チューブのような、真空チャンバを有する血液管などである。真空チャンバを有するそのような採血チューブ、例えばバキュテナー採血チューブは、当技術分野で周知である。核酸を含む全血成分を溶解、変性、および安定化する溶液、例えば核酸安定化溶液を内部に含む採血管内に、吸引される全血が採血管内の核酸安定化溶液と直ちに接触するように、真空チャンバの有無にかかわらず、血液を回収することがさらに有利であり得る。
【0068】
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。増幅産物からのプローブの融解温度（複数可）により、サンプル中のＥＢＶの有無を確認し得る。
【0069】
各サーモサイクラーを運転している間に、対照サンプルも同様にサイクルすることができる。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照サンプルはまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル中で）もしくは患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプル中で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはＦＲＥＴ反応の成功もしくは失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、およびプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
【0070】
一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減もしくは排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号および国際公開第９７／４６７１２号は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを開示している。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号および国際公開第９７／４６７１２号は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを開示している。
【0071】
サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示し得る。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新し得る。生成されたデータは、さらなる分析のために保存し得る。
【0072】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＩＩ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍは、ＰＣワークステーションを使用しても操作し得る。装置はサーマルブロックサイクラーを有し、ペルチェ素子を使用して加熱および冷却が達成される。サンプルからの蛍光シグナルは、広域スペクトルにわたって光を発する高強度キセノンランプを使用して９６ウェルプレートから得られる。特定の励起および発光のための内蔵フィルタの柔軟な組み合わせにより、様々な蛍光色素および検出フォーマットの使用が可能になる。ソフトウェアは、蛍光シグナルを表示し、ＣＴ値を計算すし得、生成されたデータは、さらなる分析のために保存し得る。
【0073】
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎもしくはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出し得る。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、好適な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
【0074】
当業者は、他の核酸もしくはシグナル増幅方法も使用され得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、もしくはスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ ２）が挙げられる。
【0075】
本開示の実施形態は、１種以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
【0076】
製造品／キット
本開示の実施形態は、ＥＢＶを検出するための製造品、組成物もしくはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＥＢＶ遺伝子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ＥＢＶを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし得る。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施形態は、ＥＢＶを検出するための製造品、組成物もしくはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＥＢＶ遺伝子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含み得る。ＥＢＶを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズし得る。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
【0077】
製造品はまた、プローブを標識するための１種以上の蛍光部分を含み得、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識し得る。例えば、製造品は、プローブを標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
【0078】
製造品はまた、サンプル中のＥＢＶを検出するプライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書もしくは包装ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、もしくは汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１種に特異的であり得る。
【0079】
本開示の実施形態はまた、サンプル中のＥＢＶを優先的および／または選択的に検出および／または定量するための一組のプライマーおよび１つ以上の検出可能なプローブを提供する。
【0080】
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。
【実施例】
【0081】
以下の実施例および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。
【0082】
この試験では、完全に自動化されたサンプル調製（核酸の抽出および精製）に続いてＰＣＲ増幅および検出を実施した。使用したシステムは、サンプル供給モジュール、移動モジュール、処理モジュール、および分析モジュールからなる、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムであった。自動化したデータ管理は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００のシステムによって実行された。
【0083】
マスターミックスは、ＥＢＶおよび対照核酸に特異的な検出プローブを含んでいた。特異的なＥＢＶ検出プローブおよび対照検出プローブを、レポーターとして作用する２つのユニークな蛍光色素の１つでそれぞれ標識した。それぞれのプローブは、クエンチャーとして作用する第２の色素も有していた。レポーター色素を規定された波長で測定し、それによって増幅されたＥＢＶ標的および対照の検出および識別が可能になる。完全なプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制された。ＰＣＲ増幅工程の間、プローブの特異的な一本鎖ＤＮＡ鋳型へのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素およびクエンチャー色素が分離し、蛍光シグナルが産生された。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断プローブ量が増加し、レポーター色素の累積シグナルが同時に増加した。２つの特異的なレポーター色素は、一定の波長で測定されるので、増幅したＥＢＶ標的と対照の同時検出および識別が可能であった。
【0084】
ＥＢＶ試験用のプライマーおよびプローブは、アライメントに基づいて最も保存されている領域中のゲノムに従ってプライマーおよびプローブをシーディングすること（ｓｅｅｄｉｎｇ）によって設計した。ＥＢＶゲノムのＢＭＲＦ２領域を検出するために、オリゴヌクレオチドの１セット（配列番号１～３）を設計した。ＥＢＶゲノムのＥＢＮＡ１領域を検出するために、オリゴヌクレオチドの別のセット（配列番号４～６）を設計した。オリゴヌクレオチド（もしくはプライマー／プローブ）の各セットは、興味のある特定の標的領域（すなわち、ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１）を増幅および検出するために、独自の反応でシングルプレックスで使用し得る。しかしながら、オリゴヌクレオチドのセットは、二重標的化アッセイで併用することもでき、これにより、反応混合物に両方のオリゴヌクレオチドセット（配列番号１～３および配列番号４～６）が含まれているため、単一のリアルタイムＰＣＲ反応で、ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１の両方がサンプル内で増幅され、検出される。ＢＭＲＦ２領域の検出については、フォワードプライマーは配列番号１の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号３の核酸配列に対応し、プローブは配列番号２の核酸配列に対応する。ＥＢＮＡ１領域の検出については、フォワードプライマーは配列番号４の核酸配列に対応し、リバースプライマーは配列番号６の核酸配列に対応し、プローブは配列番号５の核酸配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、ＥＢＶのＢＭＲＦ２領域の検出（配列番号１～３を使用）およびＥＢＶのＥＢＮＡ１領域の検出（配列番号４～６を使用）のための個々のアッセイに使用し得る。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド（配列番号１～６）が、同じサンプル中のＥＢＶのＢＭＲＦ２領域およびＥＢＮＡ１領域を同時に検出する二重標的アッセイにおいて使用し得る。二重標的アッセイには、１つ以上の標的領域が何らかの種類のミスマッチもしくはエラーを含む場合、もしくは反応の１つがエラーを経験した場合、別の標的および起こり得る別の反応が存在するという点で、一定の利点がある。
【0085】
実施例１：リアルタイムＰＣＲによるＥＢＶ検出のためのプライマーおよびプローブの設計
ＥＢＶ核酸試験は、２つの標的を意識して設計した。選択された２つの標的は、ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１であり、図１に示されている。これらの候補は、二重標的アッセイで個別にもしくは一緒に二重に使用し得る。二重標的アッセイとして使用する場合、２セットのプライマーおよびプローブを使用する（各セットはＥＢＮＡ１もしくはＢＭＲＦ２のいずれかを検出する）。上記表１に示すように、ＢＭＲＦ２標的用プライマーは配列番号１および３の核酸配列を有し、ＢＭＲＦ２標的用プローブは配列番号２の核酸配列を有する。また、上記表１に示すように、ＥＢＮＡ１標的用プライマーは配列番号４および６の核酸配列を有し、ＥＢＮＡ１標的用プローブは配列番号５の核酸配列を有するＢＭＲＦ２を標的とするプライマーによって生成されたアンプリコンは、９６塩基対長のアンプリコンであり、（プライマーおよびプローブがアンプリコンと重複する位置と共に）図２に示されている。ＥＢＮＡ１を標的とするプライマーによって生成されたアンプリコンは、９８塩基対長のアンプリコンであり、（プライマーおよびプローブがアンプリコンと重複する位置と共に）図３に示されている。
ＥＢＶ核酸試験は、２つの標的を意識して設計した。選択された２つの標的は、ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１であり、図１に示されている。これらの候補は、二重標的アッセイで個別にもしくは一緒に二重に使用し得る。二重標的アッセイとして使用する場合、２セットのプライマーおよびプローブを使用する（各セットはＥＢＮＡ１もしくはＢＭＲＦ２のいずれかを検出する）。上記表１に示すように、ＢＭＲＦ２標的用プライマーは配列番号１および３の核酸配列を有し、ＢＭＲＦ２標的用プローブは配列番号２の核酸配列を有する。また、上記表１に示すように、ＥＢＮＡ１標的用プライマーは配列番号４および６の核酸配列を有し、ＥＢＮＡ１標的用プローブは配列番号５の核酸配列を有するＢＭＲＦ２を標的とするプライマーによって生成されたアンプリコンは、９６塩基対長のアンプリコンであり、（プライマーおよびプローブがアンプリコンと重複する位置と共に）図２に示されている。ＥＢＮＡ１を標的とするプライマーによって生成されたアンプリコンは、９８塩基対長のアンプリコンであり、（プライマーおよびプローブがアンプリコンと重複する位置と共に）図３に示されている。
【0086】
実施例２：ＥＢＶプライマーおよびプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてＥＢＶのＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ－１を検出する。
ＥＢＶ核酸試験は、ＢＭＲＦ２（配列番号１～３）およびＥＢＮＡ１（配列番号４～６）を検出するためのプライマー／プローブを用いて試験した。ＥＢＶアッセイの全過程を実行した。以下の４種類のＥＢＶ含有サンプルを使用した：（１）ＥＢＶ陰性血漿にスパイクした、ＥＢＶ感染Ｒａｊｉ細胞抽出物；（２）抽出したＥＢＶ ＤＮＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号１７－９２６－５００）由来のＢ９５－８細胞株から抽出）；（３）Ｑｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ分析パネル（ＥＢＶ１６０４００９Ｃ）；および（４）ＥＢＶに関する第1のＷＨＯ国際基準。使用される試薬としては、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックス、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルおよび条件、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用するものが挙げられる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、プライマーについては０．３μＭ、プローブについては０．１μＭであった。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルを以下の表２に示す：
ＥＢＶ核酸試験は、ＢＭＲＦ２（配列番号１～３）およびＥＢＮＡ１（配列番号４～６）を検出するためのプライマー／プローブを用いて試験した。ＥＢＶアッセイの全過程を実行した。以下の４種類のＥＢＶ含有サンプルを使用した：（１）ＥＢＶ陰性血漿にスパイクした、ＥＢＶ感染Ｒａｊｉ細胞抽出物；（２）抽出したＥＢＶ ＤＮＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号１７－９２６－５００）由来のＢ９５－８細胞株から抽出）；（３）Ｑｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ分析パネル（ＥＢＶ１６０４００９Ｃ）；および（４）ＥＢＶに関する第1のＷＨＯ国際基準。使用される試薬としては、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００汎用ＰＣＲマスターミックス、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００で使用するためのプロファイルおよび条件、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用するものが挙げられる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、プライマーについては０．３μＭ、プローブについては０．１μＭであった。使用したｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００ ＰＣＲプロファイルを以下の表２に示す：
【表2】
【0087】
結果を、以下の表３に示す。
【表3】
【0088】
ＥＢＶストックの第１のＷＨＯ国際標準は５×１０６ＩＵ／ｍｌの濃度であったが、Ｑｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｐａｎｅｌは様々な一連の濃度のサンプルを有する。ＷＨＯ材料の連続希釈およびＱｎｏｓｔｉｃｓパネルの一部のさらなる希釈を行った。Ｑｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ分析パネルを８，０００、８００、８０および８ＩＵ／ｍｌで分析したのに対して、ＥＢＶの第１のＷＨＯ国際標準は８００，０００、８０，０００、８，０００、８００、８０および８ＩＵ／ｍｌで分析した。Ｑｎｏｓｔｉｃｓ ＥＢＶ分析パネル、およびＥＢＶについての第１のＷＨＯ国際標準についての結果を図４Ａ～４Ｃに示す。二重標的アッセイの別の完全プロセス試験を、図５Ｈ～図５Ｌに示されるような細胞培養由来ウイルス材料（正確な診断上清）と、図５Ａ～図５Ｇに示されるような両方の標的領域を含有する対照プラスミド材料との両方で行った。これらの２つの材料をそれぞれ希釈し、推定力価は、両方の材料を試験することができた１Ｅ４ＩＵ／ｍＬおよび１Ｅ３ＩＵ／ｍＬで重複した。得られた成長曲線を図５Ａ～図５Ｌに示した。これらのデータおよび結果により、プライマーおよびプローブ（配列番号１～６）が、市販および国際標準を含む様々な種類のサンプルにおいてＥＢＶの存在を増幅および検出することが実証されている。
【0089】
ＥＢＶ二重標的プラスミドおよび単一標的プラスミドは、単一標的ＥＢＶプライマーおよびプローブを使用して試験した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。これにより、ＢＭＲＦ２およびＥＢＮＡ１の両方の陽性対照鋳型が、ＢＭＲＦ２（配列番号１～３）およびＥＢＮＡ１（配列番号４～６）のそれぞれのＥＢＶプライマー／プローブによって増幅および検出されるが、各単一標的対照プラスミドは他の標的と交差反応せず、一方、二重標的対照プラスミドおよびウイルスゲノムＤＮＡ抽出物は両方のオリゴセットによって増幅されることが実証される。
【0090】
ＥＢＶ遺伝子型１およびＥＢＶ遺伝子型２の材料に対して、二重標的アッセイの直線性試験を行った。遺伝子型１については、細胞培養由来ウイルス材料（正確な診断）および両方の標的領域を含有する対照プラスミド材料の両方を使用し、その推定力価は重複していた。遺伝子型２については、細胞培養由来ウイルス材料（ＡＴＣＣ株Ｐ３）を試験した。結果を図７および８に示す。これらのデータおよび結果は、アッセイがＥＢＶ遺伝子型１と遺伝子型２の両方を検出し、それらの定量に使用できることを示している。
【0091】
前述の発明を明確化および理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術および装置を、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献が全ての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図5J】
【図5K】
【図5L】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】