特表2022-541399植物材料から高純度タンパク質標品を単離するプロセス及びその産物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-26
(54)【発明の名称】植物材料から高純度タンパク質標品を単離するプロセス及びその産物
(51)【国際特許分類】
C07K 1/14 20060101AFI20220915BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20220915BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20220915BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20220915BHJP
A23L 33/185 20160101ALI20220915BHJP
【ＦＩ】
C07K1/14
C12N9/88
C12P21/00 A
C12P21/00 Z
C07K14/415
A23L33/185
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022500839
(86)(22)【出願日】2020-07-10
(85)【翻訳文提出日】2022-03-04
(86)【国際出願番号】 US2020041525
(87)【国際公開番号】W WO2021007484
(87)【国際公開日】2021-01-14
(31)【優先権主張番号】62/872,917
(32)【優先日】2019-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＢＲＩＪ
３．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522008573
【氏名又は名称】プランティブル フーズ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100203828
【弁理士】
【氏名又は名称】喜多村 久美
(72)【発明者】
【氏名】トニー マーテンズ
(72)【発明者】
【氏名】セザー フローレス
(72)【発明者】
【氏名】エデュアルド レイノソ モレノ
(72)【発明者】
【氏名】ローランド バン デル モレン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B050
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018MD48
4B018MF01
4B050DD13
4B050FF01C
4B050FF03C
4B050FF08C
4B050LL02
4B064AG01
4B064CE02
4B064CE03
4B064CE08
4B064CE09
4B064DA10
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA30
4H045DA89
4H045EA01
4H045FA71
4H045GA01
4H045GA15
(57)【要約】
植物材料からタンパク質を調製する及び精製するプロセス、及びそれを含む組成物及びそれを含む使用が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって前記液相にて前記クロロフィルを凝固させ、その際、前記冷却は前記液相が前記第１の設定温度に達したときに開始することと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相にてクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着させるのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【請求項2】
植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって前記液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着させるのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【請求項3】
植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）ポリマー由来の凝固剤を使用して前記液相にて前記クロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相にてクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着させるのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【請求項4】
植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）電気凝固によって前記液相における前記クロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着させるのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【請求項5】
前記植物材料がａ）の前に洗浄される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項6】
前記還元剤が、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣＬ、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、第一鉄イオン、発生期水素、ナトリウムアマルガム、シュウ酸、ギ酸、マグネシウム、マンガン、リン酸、カリウムまたはナトリウムである、請求項１～４いずれか１項に記載のプロセス。
【請求項7】
前記還元剤が亜硫酸塩である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項8】
前記亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウム、亜硫酸マグネシウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項７に記載のプロセス。
【請求項9】
前記亜硫酸塩が重亜硫酸ナトリウムである、請求項７に記載のプロセス。
【請求項10】
ａ）の前記溶液が１以上の緩衝剤を含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項11】
ａ）の前記溶液が１以上のキレート剤を含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項12】
ａ）の前記溶液が１以上のプロテアーゼ阻害剤を含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項13】
ａ）の前記溶液が１以上の緩衝剤、１以上のキレート剤、及び／または１以上のプロテアーゼ阻害剤を含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項14】
ａ）の前記溶液のｐＨが約ｐＨ５．０～約ｐＨ９．０である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項15】
前記溶液の前記ｐＨが約ｐＨ６．０～約ｐＨ７．６である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項16】
前記溶液の前記ｐＨが約ｐＨ６．８である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項17】
前記植物材料とａ）の前記溶液が約６：１の比である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項18】
前記植物材料とａ）の前記溶液が約３：１の比である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項19】
前記植物材料とａ）の前記溶液が約２：１の比である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項20】
前記植物材料とａ）の前記溶液が約１：１の比である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項21】
前記植物材料の前記溶解が前記溶解物及び／または濾液に１以上の二価のイオン（複数可）を加えること及び／または前記溶解物及び／または濾液にキトサンを加えることを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項22】
前記植物材料の前記溶解が前記溶解物にカルシウムイオンを加えることを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項23】
前記植物材料の前記溶解が前記溶解物に塩化カルシウムを加えることを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項24】
前記植物材料が化学的に、機械的に、及び／または酵素によって溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項25】
前記植物材料が化学的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項26】
前記植物材料が１以上の界面活性剤を使用して化学的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項27】
前記植物材料がＣＨＡＰＳを使用して化学的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項28】
前記植物材料が１以上の酵素を使用して酵素によって溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項29】
前記植物材料がセルラーゼまたはペクチナーゼを使用して溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項30】
前記植物材料が機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項31】
前記植物材料がブレンダーを使用して機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項32】
前記植物材料がミル、ホモゲナイザー、微細フリューダイザー、機械的圧力またはＳｔｅｐｈａｎカッターを使用して機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項33】
前記植物材料がプレス機、超音波破砕機、粉砕機を使用して、パルス電場を使用して、窒素噴出を使用して、超音波エネルギーを使用して、または凍結によって機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項34】
前記植物材料が少なくとも１つのミルを使用して機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項35】
前記植物材料が少なくとも２つの異なる型のミルを使用して機械的に溶解される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項36】
ｃ）の前記分離することがネジプレス、デカンター、または遠心分離機によって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項37】
ｃ）の前記分離することがディスクスタック遠心分離機、連続遠心分離機、またはバスケット遠心分離機を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項38】
ｃ）の前記分離することが濾過を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項39】
ｃ）の前記分離することがプレス機を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項40】
ｃ）の前記分離することが濾過を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項41】
ｃ）の前記分離することが重力沈降を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項42】
ｃ）の前記分離することがふるい分けを使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項43】
ｄ）の前記第１の設定温度が約８０℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項44】
ｄ）の前記第１の設定温度が約６５℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項45】
ｄ）の前記第１の設定温度が約５５℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項46】
ｄ）の前記第１の設定温度が約５０℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項47】
ｄ）の前記第２の設定温度が約２５℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項48】
ｄ）の前記第２の設定温度が約１５℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項49】
ｄ）の前記第２の設定温度が約１０℃以下である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項50】
ｄ）の第１の設定温度に加熱することが約１５分以上かからない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項51】
ｄ）の第１の設定温度に加熱することが約５分以上かからない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項52】
ｄ）の第２の設定温度に冷却することが約１５分以上かからない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項53】
ｄ）の第２の設定温度に冷却することが約５分以上かからない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項54】
ｄ）の前記１以上の塩が、１以上のカルシウム塩、１以上のマグネシウム塩、１以上のベリリウム塩、１以上の亜鉛塩、１以上のカドミウム塩、１以上の銅塩、１以上の鉄塩、１以上のコバルト塩、１以上のスズ塩、１以上のストロンチウム塩、１以上のバリウム塩、及び／または１以上のラジウム塩を含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項55】
ｄ）の前記１以上の塩が、リン酸カリウム及び／または塩酸カルシウムを含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項56】
ｄ）の前記１以上の塩が５ｍＭ～２Ｍの濃度で加えられる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項57】
前記凝集剤が、アルキルアミンエピクロロヒドリン、ポリ塩化ジメチルジアリルアンモニウム、多糖、ポリアミン、デンプン、硫酸アルミニウム、ミョウバン、ポリアクリルアミド、ポリアクロミドまたはポリエチレンイミンである、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項58】
前記凝集剤がキトサンである、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項59】
前記凝集剤が活性化キトサンである、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項60】
前記凝集剤が溶液における１～２０％ｗ／ｗの活性化キトサンである、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項61】
ｅ）の前記吸着剤が樹脂である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項62】
ｅ）の前記吸着剤が活性炭、活性化木炭または活性化石炭である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項63】
ｅ）の前記吸着剤が２５０ｍ／ｇを超える表面積、１～１０００μｍの重量平均直径、４００～１，４００ｍｇ／ｇのヨウ素価、１００～５５０の範囲でのモラセスナンバー、及び／または少なくとも１０ｇ／１００ｇのメチレンブルー吸着を有する活性炭である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項64】
ｆ）の前記分離が２５℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項65】
ｆ）の前記分離が１５℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項66】
ｆ）の前記分離が１０℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項67】
ｆ）の前記分離が濾過を使用して実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項68】
ｆ）の前記分離がプレス機を使用して、重力沈降を使用して、またはふるい分けによって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項69】
ｆ）の前記分離が遠心分離機またはデカンターを使用して、または精密濾過によって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項70】
ｅ）を除くプロセスの全工程が２５℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項71】
ｅ）を除くプロセスの全工程が１５℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項72】
ｅ）を除くプロセスの全工程が１０℃以下で実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項73】
ｇ）の前記濾過することが膜フィルターによって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項74】
ｇ）の前記濾過することが０．７μｍの膜フィルターによって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項75】
ｇ）の前記濾過することが０．２μｍの膜フィルターによって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項76】
ｇ）の前記濾過することが珪藻土及び／または活性炭によって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項77】
ｇ）の前記濾過することが最大約１０％までの活性炭によって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項78】
ｇ）の前記濾過することが最大約２％までの活性炭によって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項79】
ｇ）の前記濾過することが０．２μｍの膜フィルターと約２％の活性炭とによって実行される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項80】
さらに、ｇ）の後に、０．２μｍの膜フィルターを介してｇ）の前記濾液を濾過することを含む、請求項７３～７９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項81】
１以上の液相及び／または１以上の濾液が１以上の消泡剤及び／または１以上の泡止め剤を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項82】
小型固形物及び／または微生物を取り除くために１以上の液相及び／または１以上の濾液が濾過される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項83】
１以上の液相及び／または１以上の濾液が滅菌される、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項84】
さらに、前記濾液を濃縮することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項85】
前記濾液を濃縮することが限外濾過によって実行される、請求項８４に記載のプロセス。
【請求項86】
前記限外濾過がポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテートまたはポリスルホンを介する、請求項８５に記載のプロセス。
【請求項87】
前記限外濾過が１００ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、請求項８５に記載のプロセス。
【請求項88】
前記限外濾過が５０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、請求項８５に記載のプロセス。
【請求項89】
前記限外濾過が１０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、請求項８５に記載のプロセス。
【請求項90】
前記精製タンパク質の収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約１０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項91】
前記精製タンパク質の前記収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約２０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項92】
前記精製タンパク質の前記収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約２５％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項93】
前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約４０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項94】
前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約６０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項95】
前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約８０％である、請求項１～４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項96】
前記精製タンパク質標品におけるクロロフィルのタンパク質に対する重量比が約１:１０００、約１:１５００、約１:２０００または約１:２５００未満である、請求項１～９５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項97】
１以上の官能特性を付与するまたはそれに関係する前記精製タンパク質標品における１以上の作用物質（複数可）が前記元となった植物材料と比べて減らされるまたは取り除かれる、請求項１～９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項98】
１以上の官能特性を付与するまたはそれに関係する前記精製タンパク質標品における１以上の作用物質（複数可）が前記元となった植物材料と比べて５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％減らされる、請求項１～９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項99】
前記精製タンパク質標品が本質的に無臭である、請求項１～９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項100】
前記精製タンパク質標品が無臭である、請求項１～９６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項101】
前記精製タンパク質標品が本質的に偏りのない食味である、請求項１～１００のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項102】
前記精製タンパク質標品が偏りのない食味である、請求項１～１００のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項103】
前記タンパク質がＲｕＢｉｓＣｏである、請求項１～１０２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項104】
前記植物材料がＬｅｍｎａに由来する、請求項１～１０３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項105】
前記植物材料がＬｅｍｎｏｉｄｅａｅに由来する、請求項１～１０３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項106】
請求項１～１０５のいずれか１項に記載のプロセスによって作製される製品。
【請求項107】
植物材料由来の精製タンパク質標品を含む食物であって、前記タンパク質標品が８０％以下の不純物を含有する、前記食物。
【請求項108】
前記タンパク質標品がＲｕＢｉｓＣｏを含む、請求項１０７に記載の食物。
【請求項109】
前記植物材料がＬｅｍｎａに由来する、請求項１０７または１０８に記載の食物。
【請求項110】
前記植物材料がＬｅｍｎｏｉｄｅａｅに由来する、請求項１０７または１０８に記載の食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願はその内容が全体として参照によって組み込まれる、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願番号６２／８７２，９１７の利益を主張する。
本出願はその内容が全体として参照によって組み込まれる、２０１９年７月１１日に出願された米国仮特許出願番号６２／８７２，９１７の利益を主張する。
【0002】
技術分野
開示されているのは、植物材料からタンパク質標品を作製する、抽出する及び精製するプロセスならびにそのようなプロセスから作製される産物である。
開示されているのは、植物材料からタンパク質標品を作製する、抽出する及び精製するプロセスならびにそのようなプロセスから作製される産物である。
【背景技術】
【0003】
ヒトが消費するための食肉の生産は環境に対する大きな負の影響を有する。製造業は温室効果ガスの最大の放出要因の１つであり、水質汚染及び生物多様性の喪失の主要な原因であることが知られている。Ｓｔｅｉｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ， Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ’ｓ Ｌｏｎｇ Ｓｈａｄｏｗ：Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｏｎｓ，（２００６），Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ；Ｍａｃｈｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｏｔａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，（２０１６），５３６：４１９－４３１；Ｇｏｄｆｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１８），３６１（６３９９）：ｅａａｍ５３２４。人口、富及びライフスタイルの変化のせいで食肉の世界消費が増加するにつれて、環境に優しい食肉に代わるものに対するニーズが増えている。Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，（２０１６），７：１１３８２．
【0004】
食事における食肉の置き換えは大規模で持続して生産することができる植物由来の高タンパク質代用品を必要とする。タンパク質リブロース－１,５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（「ＲｕＢｉｓＣｏ」）は植物における総タンパク質の最大５０％までを構成する。それは、大気中の二酸化炭素が植物及び他の光合成生物によってグルコースのような高エネルギー分子に変換されるプロセスである炭素固定の最初の主要な工程に関与する酵素である。植物におけるその豊富さのせいで、それは食糧生産のためのタンパク質の代替源として役立つ。精製したＲｕＢｉｓＣｏは通常、無味、無臭の白色粉末である。
【0005】
ウキクサ（亜科Ｌｅｍｎｏｉｄｅａｅ、属Ｌｅｍｎａ）は世界で最も小さい顕花植物である。その小柄なサイズにもかかわらず、それは急速に成長する能力を有し、条件に応じて約１６～４８時間でそのバイオマスを倍増する。Ｍｅｓｔａｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ ｐｕｎｃｔａｔａ Ａｑｕａｔｉｃ Ｂｏｔａｎｙ，（１９８４），１９：１５７－７０。Ｌｅｍｎａは高いタンパク質含量（その乾燥質量の約３０～３５％はタンパク質である）を有するので動物の備蓄食糧として使用されている。これらの特性のすべてによってＬｅｍｎａは食糧のための植物由来タンパク質の大規模生産について魅力的な候補になっている。
【0006】
タンパク質のエマルション、ゲル及び安定な泡状物質を形成する能力も種々の食糧の生産において重要であり、食品における食感の基礎を形成する。例えば、小さな気泡の均一な分布を持つ泡状物質は食物に密度、口当たりの良さ及び軽さを付与する。タンパク質標品の泡状物質を形成する能力はその純度に関係し、安定な泡状物質を形成するには少なくとも８０％の純度が必要であってもよい。同様に、タンパク質から作られるゲルはさまざまなレオロジー特性及び外観の食物を生じる。タンパク質のゲル化能はゲルを形成するのに必要とされるタンパク質の量によって測定されてもよい。したがって、高純度、起泡能力、泡安定性及びゲル化能を持つタンパク質標品は食品での使用に切望される。
【0007】
現在、植物から、例えば、ＬｅｍｎｏｉｄｅａｅまたはＬｅｍｎａからタンパク質を精製する及び抽出する経済的なプロセスに対するニーズがある。本明細書で開示されているのは、ほとんどの食品に加工される適応性を有する精製されたタンパク質標品を製造することができるプロセスである。
【発明の概要】
【0008】
本開示は
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって液相にてクロロフィルを凝固させ、その際、冷却は液相が第１の設定温度に達したときに開始することと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスを提供する。
本開示は、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって液相にてクロロフィルを凝固させ、その際、冷却は液相が第１の設定温度に達したときに開始することと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスを提供する。
本開示は、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
【0009】
本開示は、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
【0010】
本開示は、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）ポリマー由来の凝固剤を使用して液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）ポリマー由来の凝固剤を使用して液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
【0011】
本開示は、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）電気凝固によって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて植物材料を提供することと；
ｂ）植物材料を溶解することと；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）電気凝固によって液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスも提供する。
【0012】
いくつかの態様では、本開示は以下の実施形態に関する。
１．植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって前記液相にて前記クロロフィルを凝固させ、その際、冷却は前記液相が前記第１の設定温度に達したときに開始することと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
１．植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって前記液相にて前記クロロフィルを凝固させ、その際、冷却は前記液相が前記第１の設定温度に達したときに開始することと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【0013】
２．植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって前記液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）１以上の塩を加えることによって前記液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【0014】
３．植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）ポリマー由来の凝固剤を使用して前記液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）ポリマー由来の凝固剤を使用して前記液相におけるクロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【0015】
４．植物材料から精製したタンパク質標品を作製するプロセスであって、
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）電気凝固によって前記液相における前記クロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
ａ）還元剤を含む緩衝溶液にて前記植物材料を提供することと；
ｂ）前記植物材料を溶解することと；
ｃ）前記溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、前記液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有することと；
ｄ）電気凝固によって前記液相における前記クロロフィルを凝固させることと；
ｅ）ｄ）の前記液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、前記液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または前記吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成することと；
ｆ）ｅ）の前記凝集した混合物を固相と液相に分離することと；
ｇ）ｆ）の前記液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得ることとを含む、前記プロセス。
【0016】
５．前記植物材料がａ）の前に洗浄される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0017】
６．前記還元剤が、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣＬ、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、第一鉄イオン、発生期水素、ナトリウムアマルガム、シュウ酸、ギ酸、マグネシウム、マンガン、リン酸、カリウムまたはナトリウムである、実施形態１～４いずれか１つのプロセス。
【0018】
７．前記還元剤が亜硫酸塩である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0019】
８．前記亜硫酸塩が亜硫酸ナトリウム、亜硫酸マグネシウムまたはメタ重亜硫酸ナトリウムである、実施形態７のいずれか１つのプロセス。
【0020】
９．前記亜硫酸塩が重亜硫酸ナトリウムである、実施形態７のいずれか１つのプロセス。
【0021】
１０．ａ）の前記溶液が１以上の緩衝剤を含有する、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0022】
１１．ａ）の前記溶液が１以上のキレート剤を含有する、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0023】
１２．ａ）の前記溶液が１以上のプロテアーゼ阻害剤を含有する、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0024】
１３．ａ）の前記溶液が１以上の緩衝剤、１以上のキレート剤、及び／または１以上のプロテアーゼ阻害剤を含有する、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0025】
１４．ａ）の前記溶液のｐＨが約ｐＨ５．０～約ｐＨ９．０である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0026】
１５．前記溶液の前記ｐＨが約ｐＨ６．０～約ｐＨ７．６である、実施形態１４プロセス。
【0027】
１６．前記溶液の前記ｐＨが約ｐＨ６．８である、実施形態１５のプロセス。
【0028】
１７．前記植物材料とａ）の前記溶液が約６：１の比である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0029】
１８．前記植物材料とａ）の前記溶液が約３：１の比である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0030】
１９．前記植物材料とａ）の前記溶液が約２：１の比である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0031】
２０．前記植物材料とａ）の前記溶液が約１：１の比である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0032】
２１．前記植物材料の前記溶解が、前記溶解物及び／または濾液に１以上の二価のイオン（複数可）を加えること及び／または前記溶解物及び／または濾液にキトサンを加えることを含む、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0033】
２２．前記植物材料の前記溶解が前記溶解物にカルシウムイオンを加えることを含む、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0034】
２３．前記植物材料の前記溶解が前記溶解物に塩化カルシウムを加えることを含む、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0035】
２４．前記植物材料が化学的に、機械的に、及び／または酵素によって溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0036】
２５．前記植物材料が化学的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0037】
２６．前記植物材料が１以上の界面活性剤を使用して化学的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0038】
２７．前記植物材料がＣＨＡＰＳを使用して化学的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0039】
２８．前記植物材料が１以上の酵素を使用して酵素によって溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0040】
２９．前記植物材料がセルラーゼまたはペクチナーゼを使用して溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0041】
３０．前記植物材料が機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0042】
３１．前記植物材料がブレンダーを使用して機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0043】
３２．前記植物材料がミル、ホモゲナイザー、微細フリューダイザー、機械的圧力またはＳｔｅｐｈａｎカッターを使用して機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0044】
３３．前記植物材料がプレス機、超音波破砕機、粉砕機を使用して、パルス電場を使用して、窒素噴出を使用して、超音波エネルギーを使用して、または凍結によって機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0045】
３４．前記植物材料が少なくとも１つのミルを使用して機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0046】
３５．前記植物材料が少なくとも２つの異なる型のミルを使用して機械的に溶解される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0047】
３６．ｃ）の前記分離することがネジプレス、デカンター、または遠心分離機によって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0048】
３７．ｃ）の前記分離することがディスクスタック遠心分離機、連続遠心分離機、またはバスケット遠心分離機を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0049】
３８．ｃ）の前記分離することが濾過を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0050】
３９．ｃ）の前記分離することがプレス機を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0051】
４０．ｃ）の前記分離することが濾過を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0052】
４１．ｃ）の前記分離することが重力沈降を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0053】
４２．ｃ）の前記分離することがふるい分けを使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0054】
４３．ｄ）の前記第１の設定温度が約８０℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0055】
４４．ｄ）の前記第１の設定温度が約６５℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0056】
４５．ｄ）の前記第１の設定温度が約５５℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0057】
４６．ｄ）の前記第１の設定温度が約５０℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0058】
４７．ｄ）の前記第２の設定温度が約２５℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0059】
４８．ｄ）の前記第２の設定温度が約１５℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0060】
４９．ｄ）の前記第２の設定温度が約１０℃以下である、実施形態１のプロセス。
【0061】
５０．ｄ）の第１の設定温度に加熱することが約１５分以上かからない、実施形態１のプロセス。
【0062】
５１．ｄ）の第１の設定温度に加熱することが約５分以上かからない、実施形態１のプロセス。
【0063】
５２．ｄ）の第２の設定温度に冷却することが約１５分以上かからない、実施形態１のプロセス。
【0064】
５３．ｄ）の第２の設定温度に冷却することが約５分以上かからない、実施形態１のプロセス。
【0065】
５４．ｄ）の前記１以上の塩が１以上のカルシウム塩、１以上のマグネシウム塩、１以上のベリリウム塩、１以上の亜鉛塩、１以上のカドミウム塩、１以上の銅塩、１以上の鉄塩、１以上のコバルト塩、１以上のスズ塩、１以上のストロンチウム塩、１以上のバリウム塩、及び／または１以上のラジウム塩を含む、実施形態２のプロセス。
【0066】
５５．ｄ）の前記１以上の塩がリン酸カリウム及び／または塩酸カルシウムを含む、実施形態２のプロセス。
【0067】
５６．ｄ）の前記１以上の塩が５ｍＭ～２Ｍの濃度で加えられる、実施形態２のプロセス。
【0068】
５７．前記凝集剤がアルキルアミンエピクロロヒドリン、ポリ塩化ジメチルジアリルアンモニウム、多糖、ポリアミン、デンプン、硫酸アルミニウム、ミョウバン、ポリアクリルアミド、ポリアクロミドまたはポリエチレンイミンである、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0069】
５８．前記凝集剤がキトサンである、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0070】
５９．前記凝集剤が活性化キトサンである、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0071】
６０．前記凝集剤が溶液における１～２０％ｗ／ｗの活性化キトサンである、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0072】
６１．ｅ）の前記吸着剤が樹脂である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0073】
６２．ｅ）の前記吸着剤が活性炭、活性化木炭または活性化石炭である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0074】
６３．ｅ）の前記吸着剤が２５０ｍ／ｇを超える表面積、１～１０００μｍの重量平均直径、４００～１，４００ｍｇ／ｇのヨウ素価、１００～５５０の範囲でのモラセスナンバー、及び／または少なくとも１０ｇ／１００ｇのメチレンブルー吸着を有する活性炭である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0075】
６４．ｆ）の前記分離が２５℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0076】
６５．ｆ）の前記分離が１５℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0077】
６６．ｆ）の前記分離が１０℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0078】
６７．ｆ）の前記分離が濾過を使用して実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0079】
６８．ｆ）の前記分離がプレス機を使用して、重力沈降を使用して、またはふるい分けによって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0080】
６９．ｆ）の前記分離が遠心分離機またはデカンターを使用して、または精密濾過によって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0081】
７０．ｅ）を除くプロセスの全工程が２５℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0082】
７１．ｅ）を除くプロセスの全工程が１５℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0083】
７２．ｅ）を除くプロセスの全工程が１０℃以下で実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0084】
７３．ｇ）の前記濾過することが膜フィルターによって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0085】
７４．ｇ）の前記濾過することが０．７μｍの膜フィルターによって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0086】
７５．ｇ）の前記濾過することが０．２μｍの膜フィルターによって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0087】
７６．ｇ）の前記濾過することが珪藻土及び／または活性炭によって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0088】
７７．ｇ）の前記濾過することが最大約１０％までの活性炭によって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0089】
７８．ｇ）の前記濾過することが最大約２％までの活性炭によって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0090】
７９．ｇ）の前記濾過することが０．２μｍの膜フィルターと約２％の活性炭とによって実行される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0091】
８０．さらに、ｇ）の後、０．２μｍの膜フィルターを介してｇ）の前記濾液を濾過することを含む、実施形態７３～７９のいずれか１つのプロセス。
【0092】
８１．１以上の液相及び／または１以上の濾液が１以上の消泡剤及び／または１以上の泡止め剤を含む、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0093】
８２．小型固形物及び／または微生物を取り除くために１以上の液相及び／または１以上の濾液が濾過される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0094】
８３．１以上の液相及び／または１以上の濾液が滅菌される、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0095】
８４．さらに、前記濾液を濃縮することを含む、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0096】
８５．前記濾液を濃縮することが限外濾過によって実行される、実施形態８４のプロセス。
【0097】
８６．前記限外濾過がポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテートまたはポリスルホンを介する、実施形態８５のプロセス。
【0098】
８７．前記限外濾過が１００ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、実施形態８５のプロセス。
【0099】
８８．前記限外濾過が５０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、実施形態８５のプロセス。
【0100】
８９．前記限外濾過が１０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される、実施形態８５のプロセス。
【0101】
９０．前記精製タンパク質の収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約１０％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0102】
９１．前記精製タンパク質の前記収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約２０％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0103】
９２．前記精製タンパク質の前記収率が工程ｃ）の前記液相における前記可溶性タンパク質の少なくとも約２５％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0104】
９３．前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約４０％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0105】
９４．前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約６０％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0106】
９５．前記精製タンパク質の前記収率が少なくとも約８０％である、実施形態１～４のいずれか１つのプロセス。
【0107】
９６．前記精製タンパク質標品におけるクロロフィルのタンパク質に対する重量比が約１:１０００、約１:１５００、約１:２０００または約１:２５００未満である、実施形態１～９５のいずれか１つのプロセス。
【0108】
９７．１以上の官能特性を付与するまたはそれに関係する前記精製タンパク質標品における１以上の作用物質（複数可）が前記元となった植物材料と比べて減らされるまたは取り除かれる、実施形態１～９６のいずれか１つのプロセス。
【0109】
９８．１以上の官能特性を付与するまたはそれに関係する前記精製タンパク質標品における１以上の作用物質（複数可）が前記元となった植物材料と比べて５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％減らされる、実施形態１～９６のいずれか１つのプロセス。
【0110】
９９．前記精製タンパク質標品が本質的に無臭である、実施形態１～９６のいずれか１つのプロセス。
【0111】
１００．前記精製タンパク質標品が無臭である、実施形態１～９６のいずれか１つのプロセス。
【0112】
１０１．前記精製タンパク質標品が本質的に偏りのない食味である、実施形態１～１００のいずれか１つのプロセス。
【0113】
１０２．前記精製タンパク質標品が偏りのない食味である、実施形態１～１００のいずれか１つのプロセス。
【0114】
１０３．前記タンパク質がＲｕＢｉｓＣｏである、実施形態１～１０２のいずれか１つのプロセス。
【0115】
１０４．前記植物材料がＬｅｍｎａに由来する、実施形態１～１０３のいずれか１つのプロセス。
【0116】
１０５．前記植物材料がＬｅｍｎｏｉｄｅａｅに由来する、実施形態１～１０３のいずれか１つのプロセス。
【0117】
１０６．実施形態１～１０５のいずれか１つのプロセスによって作製される産物。
【0118】
１０７．植物材料由来の精製タンパク質標品を含む食物であって、前記タンパク質標品が８０％以下の不純物を含有する、前記食物。
【0119】
１０８．前記タンパク質標品がＲｕＢｉｓＣｏを含む、実施形態１０７の食物。
【0120】
１０９．前記植物材料がＬｅｍｎａに由来する、実施形態１０７または１０８の食物。
【0121】
１１０．前記植物材料がＬｅｍｎｏｉｄｅａｅに由来する、実施形態１０７または１０８の食物。
【0122】
本開示のいくつかの態様では、プロセスが開始される前に植物材料が洗浄される。いくつかの実施形態では、ａ）における還元剤は、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣＬ、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、第１鉄イオン、発生期水素、ナトリウムアマルガム、シュウ酸、ギ酸、マグネシウム、マンガン、リン酸、カリウム及びナトリウムである。いくつかの実施形態では、還元剤は亜硫酸塩である。いくつかの実施形態では、亜硫酸塩は亜硫酸ナトリウム、亜硫酸マグネシウム、またはメタ重亜硫酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、亜硫酸塩は重亜硫酸ナトリウムである。
【0123】
いくつかの実施形態では、ａ）における溶液のｐＨは約ｐＨ５．０～約ｐＨ９．０である。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約ｐＨ６．０～約ｐＨ７．６である。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約ｐＨ６．８である。
【0124】
いくつかの実施形態では、植物材料とａ）の溶液は約６：１の比である。いくつかの実施形態では、植物材料とａ）の溶液は約３：１の比である。いくつかの実施形態では、植物材料とａ）の溶液は約２：１の比である。いくつかの実施形態では、植物材料とａ）の溶液は約１：１の比である。
【0125】
本開示のいくつかの態様では、植物材料は機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はブレンダーを使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はミル、ホモゲナイザー、微細フリューダイザー、機械的圧力またはＳｔｅｐｈａｎカッターを使用して機械的に溶解される。
【0126】
本開示のいくつかの態様では、ｃ）の分離することはネジプレス、デカンターまたは遠心分離機を使用して実行される。
【0127】
本開示のいくつかの態様では、ｄ）の第１の設定温度は約８０℃以下である。本開示のいくつかの態様では、ｄ）の第１の設定温度は約６５℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第１の設定温度は約５５℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第１の設定温度は約５０℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第２の設定温度は約２５℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第２の設定温度は約１５℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第２の設定温度は約１０℃以下である。いくつかの実施形態では、ｄ）の第１の設定温度に加熱することは約１５分以上かからない。いくつかの実施形態では、ｄ）の第１の設定温度に加熱することは約５分以上かからない。いくつかの実施形態では、ｄ）の第２の設定温度に冷却することは約１５分以上かからない。いくつかの実施形態では、ｄ）の第１の設定温度に冷却することは約５分以上かからない。
【0128】
本開示のいくつかの態様では、ｄ）の１以上の塩はリン酸カリウム及び／または塩化カルシウムを含む。本開示のいくつかの態様では、ｄ）の１以上の塩は５ｍＭ～２Ｍの濃度で加えられる。
【0129】
本開示のいくつかの態様では、凝集剤はキトサンである。本開示のいくつかの態様では、凝集剤は活性化キトサンである。いくつかの実施形態では、凝集剤は溶液における１～２０％ｗ／ｗの活性化キトサンである。いくつかの実施形態では、ｅ）の吸着剤は活性炭、活性化木炭または活性化石炭である。いくつかの実施形態では、吸着剤は疎水性吸着剤である。
【0130】
本開示のいくつかの態様では、ｆ）の分離は２５℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、ｆ）の分離は１５℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、ｆ）の分離は１０℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、ｆ）の分離は遠心分離機またはデカンターを使用して、または精密濾過によって実行される。
【0131】
本開示のいくつかの態様では、ｅ）を除くプロセスの全工程が２５℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、ｅ）を除くプロセスの全工程が１５℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、ｅ）を除くプロセスの全工程が１０℃以下で実行される。
【0132】
本開示のいくつかの態様では、ｇ）の濾過することが膜フィルターによって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することが０．７μｍの膜フィルターによって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することは０．２μｍの膜フィルターによって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することは珪藻土及び／または活性炭によって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することは最大約１０％までの活性炭によって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することは最大約２％までの活性炭によって実行される。いくつかの実施形態では、ｇ）の濾過することは０．２μｍの膜フィルターと２％の活性炭によって実行される。いくつかの実施形態では、プロセスはさらに、ｇ）の後、０．２μｍの膜フィルターを介してｇ）の濾液を濾過することを含む。いくつかの実施形態では、プロセスはさらに、濾液を濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、濾液を濃縮することは透析濾過によって実行される。いくつかの実施形態では、濾液を濃縮することは限外濾過によって実行される。いくつかの実施形態では、限外濾過は１００ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される。いくつかの実施形態では、限外濾過は５０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される。いくつかの実施形態では、限外濾過は１０ｋＤａ以下のカットオフでの限外濾過フィルターを使用して実行される。
【0133】
本開示のいくつかの態様では、精製タンパク質の収率は工程ｃ）の液相における可溶性タンパク質の少なくとも約１０％である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質の収率は工程ｃ）の液相における可溶性タンパク質の少なくとも約２０％である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質の収率は工程ｃ）の液相における可溶性タンパク質の少なくとも約２５％である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質の収率は少なくとも約４０％である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質の収率は少なくとも約６０％である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質の収率は少なくとも約８０％である。
【0134】
本開示のいくつかの態様では、タンパク質はＲｕＢｉｓＣｏである。いくつかの実施形態では、植物材料はＬｅｍｎａに由来する。いくつかの実施形態では、植物材料はＬｅｍｏｎｏｉｄｅａｅに由来する。
【0135】
本明細書で開示されているのはまた、開示されているプロセスによって作られる産物である。
【0136】
本明細書で開示されているのはまた、植物材料由来の精製タンパク質標品を含む食物であり、その際、タンパク質標品は８０％以下の不純物を含有する。
【図面の簡単な説明】
【0137】
【図1】プロセスの一実施形態のフローチャートを示す図である。
【図2】プロセスの第２の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図3】プロセスの第３の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図4】プロセスの第４の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図5】精密濾過後の実施例５の画分１、２、３、及び４の描写である。
【図6】精密濾過後の実施例５の画分４、３、２、及び１の描写である。
【図7A】実施例５の画分の描写である。
【図7B】実施例５の画分の描写である。
【図8】塩化カルシウムとリン酸塩の添加及び卓上遠心分離の後の実施例６の画分の試料の描写である。
【図9】活性炭及びキトサンの除去の後の実施例６の画分１～６の試料の描写である。
【図10】実施例６の画分の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色分析の結果の描写である。
【図11】実施例７の種々の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの描写である。
【図12】活性炭及びキトサンの除去後の実施例７の画分の描写である。
【図13】実施例８の種々の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの描写である。
【図14】実施例９の種々の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの描写である。
【図15】精密濾過後の実施例１０の画分１～５の描写である。
【図16】最終タンパク質産物及びタンパク質標準のクロマト図の描写である。
【図17】最終植物タンパク質産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの描写である。
【図18】実施例１６の材料の吸光度スペクトルの描写である。
【発明を実施するための形態】
【0138】
開示されているプロセス及び組成物は、本開示の一部を形成する添付の図と併せて以下の詳細な説明を参照してさらに容易に理解されてもよい。
【0139】
この本文全体を通して、説明はプロセス及びプロセスによって作られる組成物に言及する。本開示が組成物に関連する特徴または実施形態を開示するまたは請求する場合、そのような特徴または実施形態は組成物を作るプロセスに同等に適用可能である。同様に、本開示が組成物を作るプロセスに関連する特徴または実施形態を開示するまたは請求する場合、そのような特徴または実施形態は組成物に同等に適用可能である。値の範囲が表現される場合、それはその範囲内の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲で記述される値に対する言及はその範囲内の各値及びあらゆる値を含む。値が先行する「約」の使用によって近似値として表現される場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されるであろう。「または」の使用はその使用の特定の文脈が指示しない限り、「及び／または」を意味するであろう。本明細書に引用されている参考文献はすべて任意の目的でその全体が参照によって組み込まれる。参考文献及び本明細書が矛盾する場合、本明細書が支配するであろう。明瞭性のために別の実施形態の文脈にて本明細書で開示されている、開示されたプロセス及び組成物の特定の特徴は単一の実施形態にて合わせて提供されてもよいことが理解されるべきである。逆に、簡潔性にために単一の実施形態の文脈で開示されている、開示されたプロセス及び組成物の種々の特徴は別々にまたは任意の部分組み合わせにて提供されてもよいことが理解されるべきである。
【0140】
本明細書で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数形態を含む。「約」または「およそ」という用語は数値及び範囲の文脈で使用されるとき、本明細書に含有される教示から当業者に明らかなように実施形態が最大プラスまたはマイナス約１０％まで目的どおりに実行してもよいように引用された値または範囲に近似するまたはそれに近い値または範囲を指す。いくつかの実施形態では、約は数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
【0141】
本明細書で開示されているのは、植物材料からタンパク質標品を作るプロセスである。本明細書で使用されるとき、「植物」という用語は植物界に属する生物を指す。開示されているプロセスでの使用に好適な植物の例には、木、草本、低木、草、つる植物、シダ、コケ及び緑藻が挙げられる。「植物材料」という用語は植物由来の任意のバイオマスを指す。植物材料は、植物の任意の部分、例えば、茎、根、果実、葉または種子に由来してもよい。いくつかの実施形態では、植物材料は葉に由来する。いくつかの実施形態では、植物材料は茎に由来する。植物材料は植物の１以上の種から得られてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、植物材料はウキクサ、藻類、テンサイの葉、ホウレンソウ、ケール、ビート、フダンソウ、テンサイ、シービート、飼料用ビート、ダイズまたはタバコに由来してもよい。いくつかの実施形態では、植物材料はウキクサに由来する。いくつかの実施形態では、植物材料はＬｅｍｎａに由来する。いくつかの実施形態では、植物材料はＬｅｍｎｏｉｄｅａｅに由来する。
【0142】
本明細書で使用されるとき、「タンパク質」という用語はペプチド結合によって共有結合されるアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質は通常、少なくとも２つのアミノ酸またはアミノ酸変異体を含有し、タンパク質配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限はない。「タンパク質標品」という用語はタンパク質の単離体を指し、その際、タンパク質は混合物の非タンパク質成分から実質的に分離されている。タンパク質標品の「純度」は標品の総量に対するタンパク質の量を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質標品の純度は乾燥総質量の割合として表現される。いくつかの実施形態では、タンパク質標品は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質標品の純度は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％のタンパク質である。タンパク質標品は１以上の種類のタンパク質を含んでもよく、異なるサイズの同じタンパク質を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質標品はエデスチン、グルテン、レグミンまたはビシリンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質標品はＲｕＢｉｓＣｏを含む。
本明細書で開示されているプロセスは植物材料で見いだされる他の化合物からタンパク質を分離する。例えば、プロセスはクロロフィル、揮発性化合物、酸、塩基、糖、塩及び／または脂質を取り除いてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは植物材料からクロロフィルを取り除き、脱クロロフィル化されているタンパク質標品を作り出す。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質標品におけるクロロフィルのタンパク質に対する重量比は約１:１０００、１:１５００、１:２０００または１:２５００未満である。
本明細書で開示されているプロセスは植物材料で見いだされる他の化合物からタンパク質を分離する。例えば、プロセスはクロロフィル、揮発性化合物、酸、塩基、糖、塩及び／または脂質を取り除いてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは植物材料からクロロフィルを取り除き、脱クロロフィル化されているタンパク質標品を作り出す。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質標品におけるクロロフィルのタンパク質に対する重量比は約１:１０００、１:１５００、１:２０００または１:２５００未満である。
【0143】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは精製タンパク質標品における１以上の官能特性を付与する、またはそれに関連する１以上の作用物質（複数可）を減らすまたは取り除く。そのような官能特性の非限定的な例には、匂い（例えば、異臭または望ましくない匂い）及び味感（例えば、異味または望ましくない味感）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは元となった植物材料と比べて１以上の作用物質（複数可）を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％減らす。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは１以上の作用物質（複数可）を完全に減らす。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは匂いを付与するまたは匂いに関連する１以上の作用物質（複数可）を減らして、または取り除いて無臭または本質的に無臭であるタンパク質標品を作り出す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは味感を付与するまたは味感に関連する１以上の作用物質（複数可）を減らして、または取り除いて偏りのない食味のタンパク質標品または本質的に偏りのない食味のタンパク質標品を作り出す。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているプロセスは、匂い及び／または味感を付与するまたはそれに関連する１以上の作用物質（複数可）を減らして、または取り除いて、無臭で且つ偏りのない食味である、本質的に無臭で且つ偏りのない食味である、無臭で且つ本質的に偏りのない食味である、または本質的に無臭で且つ本質的に偏りのない食味であるタンパク質標品を作り出す。いくつかの実施形態では、作用物質は揮発性化合物である。いくつかの実施形態では、作用物質は非揮発性化合物である。いくつかの実施形態では、作用物質はポリフェノール、ポリフェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、フェノール、脂質、アルコール、アルデヒド、硫化物、過酸化物、テルペン、アルブミン（例えば、レクチンまたはプロテアーゼ阻害剤）、酸化酵素活性のための基質（例えば、脂肪酸、例えば、Ｃ１４:０（ミリスチン酸メチル）、Ｃ１５:０（ペンタデカン酸メチル）、Ｃ１６：０パルミチン酸メチル、Ｃ１６：１パルミトレイン酸メチル、Ｃ１７：０ヘプタデカン酸メチル、Ｃ１８：０ステアリン酸メチル、Ｃ１８：１オレイン酸メチル、Ｃ１８：２リノール酸メチル、Ｃ１８：３αリノール酸メチル、Ｃ２０：０エイコセン酸メチル、及びＣ２２：０ベヘン酸メチル）、及び／または脂質基質と反応する酵素である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質標品はタンパク質の供給源と比べて低下した酸化酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、精製タンパク質標品はタンパク質の供給源と比べて酸化酵素活性で５％、１０％、１５％、２０％または２５％の低下を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質の供給源はＲｕＢｉｓＣｏであり、精製タンパク質標品はＲｕＢｉｓＣｏと比べて酸化酵素活性で５％、１０％、１５％、２０％または２５％の低下を有する。いくつかの実施形態では、酸化酵素活性はリポキシゲナーゼ活性である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質標品は低下したリポキシゲナーゼ活性のせいでタンパク質の供給源と比べて脂質または残留脂質の低い酸化を有する。
【0144】
本開示の一態様では、植物材料から精製タンパク質標品を作るプロセス（図１）は、
ａ）還元剤を含む溶液にて植物材料を提供する；
ｂ）植物材料を溶解する；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有する；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって液相にてクロロフィルを凝固させ、その際、冷却は液相が前記第１の設定温度に達したときに開始する；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成する；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離する；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得る工程を含む。
ａ）還元剤を含む溶液にて植物材料を提供する；
ｂ）植物材料を溶解する；
ｃ）溶解した植物材料を固相と液相に分け、その際、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含有する；
ｄ）約３０分以内で第１の設定温度に加熱し、次いで約３０分以内で第２の設定温度に冷却することによって液相にてクロロフィルを凝固させ、その際、冷却は液相が前記第１の設定温度に達したときに開始する；
ｅ）ｄ）の液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集させる及び／または吸着剤に吸着するのに十分な時間、混合し、それによって凝集した混合物を形成する；
ｆ）ｅ）の凝集した混合物を固相と液相に分離する；
ｇ）ｆ）の液相を濾過し、精製タンパク質を含有する濾液を得る工程を含む。
【0145】
いくつかの実施形態では、植物材料を収穫し、プロセスが開始される前にきれいにする。例えば、いくつかの実施形態では、プロセスが開始される前に植物材料を化学的に洗浄する。いくつかの実施形態では、プロセスが開始される前に植物材料を水で洗浄する。プロセスが開始される前に植物材料は複数回の洗浄を受けてもよい。
【0146】
いくつかの実施形態では、植物材料は還元剤を含む溶液にて混合される。開示されているプロセスにて使用するのに好適な還元剤の例には、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエチルアミン－ＨＣＬ、メタ重亜硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン、システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、第一鉄イオン、発生期水素、ナトリウムアマルガム、シュウ酸、ギ酸、マグネシウム、マンガン、リン酸、カリウムまたはナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、植物材料は１を超える還元剤を含む溶液にて混合される。いくつかの実施形態では、還元剤は亜硫酸塩である。いくつかの実施形態では、還元剤は亜硫酸ナトリウム、亜硫酸マグネシウム、またはメタ重亜硫酸ナトリウムのうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、還元剤は重亜硫酸ナトリウムである。理論によって束縛されることを望まないで、還元剤はポリフェノールオキシダーゼの活性を調節する及び／または阻害するように作用すると考えられている。
【0147】
還元剤を含む溶液が処方されてその成分の安定性を改善してもよい。例えば、溶液のｐＨ、イオン強度または温度が調整されてもよい。いくつかの実施形態では、溶液は緩衝剤を含んでもよい。開示されているプロセスにて使用するための緩衝剤の例には、アルカリ金属（例えば、Ｎａ+またはＫ+）、ＮａＣｌ、アンモニウムイオン（ＮＨ4）、硝酸塩、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、塩素酸塩、過塩素酸塩（ＮＯ3-、Ｃ2Ｈ3Ｏ2-、ＣＩＯ3-、ＣＩＯ4-）、金属を伴うハロゲンの二元化合物（例えば、Ｃｌ-、Ｂｒ-、またはＩ-）、硫酸塩（ＳＯ４2-）、硫酸アンモニウム、アルカリ土類金属の水酸化物（例えば、ＯＨ-、Ｃａ2+、またはＳｒ2+）、硫化物（Ｓ2-）、水酸化物（ＯＨ-）、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム）、シュウ酸塩、クロム酸塩（ＣＯ3
2-、Ｃ2Ｏ4
2-、ＣｒＯ4
2-）、リン酸塩（ＰＯ4
3-）（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸一カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、リン酸二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸アンモニウム（ＮＨ4）3ＰＯ4、リン酸カルシウム（Ｃａ3（ＰＯ4）2）、リン酸マグネシウム、リン酸一マグネシウム、リン酸二マグネシウム、及びリン酸三マグネシウム）、トリス－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、ＢＥＳ、イミダゾール－ＨＣｌ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、Ｂｉｓ－トリス、トリシン、ビシン、３－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸、４－２－ヒドロキシエチル－１－ピペラジンエタンスルホン酸、２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）、ジメチルアルシン酸、クエン酸ナトリウム、生理食塩水クエン酸ナトリウム、２－（Ｎ－モルフォリノ）エタンスルホン酸、塩化クロラミン、アセトアミノグリシン、トリシン、グリシンアミド及び炭酸アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【0148】
いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための溶液はキレート剤を含む。開示されているプロセスにて使用するためのキレート剤の例には、塩化物、シアン化物、有機酸（クエン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、及びコハク酸を含むが、これらに限定されない）、デフェロキサミン、デフェリプロン、デフェラシロックス、ペニシラミン、ハチミツ、ピロリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、スポリックス、ＢＡＬ、ＥＤＴＡ、デクスラゾキサン、プルシアンブルー、ＡＬＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＴＰ Ａ、ＤＭＰＳ、ＤＭＳＡ、ＥＧＴＡ、リボース、デオキシリボース、グルコース、フルクトース、グルコサミン、スクロース、ラクトース、マルトース、セルロース、デンプン、ペクチン、ガム、アルギン酸、キチン、キトサン、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、酢酸、脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、キサントフィル、ビタミンＡ、コルチゾン、コルチゾール、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒスチジン、アドレナリン、インスリン、ＡＴＰ、ＮＡＤ、ＦＭＮ、ＦＡＤ、補酵素Ａ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭酸塩、重炭酸塩、シアン化物、グリコール酸、シュウ酸、乳酸、クエン酸、オルソリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、ポリリン酸塩、フィチン酸、ＭＤＰ、ＨＭＤＰ、ＨＥＤＰ、ヘモグロビン、クロロフィル、植物アルカロイド、アントシアニン、タンニン、硫酸塩、硫酸、コンドロイチン硫酸、ビタミンＢ１２、アスコルビン酸、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。
【0149】
いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための溶液はプロテアーゼ阻害剤を含む。開示されているプロセスにて使用するためのプロテアーゼ阻害剤の例には、ＰＭＳＦ、フッ化ナトリウム、β－グリセロホスフェート、ピロリン酸ナトリウム、リューペプチン及びＥ－６４が挙げられるが、これらに限定されない。
【0150】
いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約５．０～９．０である。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約６．５～約７．５である。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約７．５である。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは約６．５～７．０である。
【0151】
植物材料と還元剤を含む溶液とは植物材料の還元剤への近接可能性を高める比率で混合されてもよい。例えば、植物材料と還元剤を含む溶液とは約６：１、３：１、２：１または１：１の比で準備されてもよい。
【0152】
本明細書で使用されるとき、「溶解すること」という用語は植物材料から細胞をバラバラにすること、及び細胞の内容物を露出することを指す。例えば、溶解することは細胞壁を壊すこと、細胞膜を破壊すること、及び／または細胞質を露出することを含んでもよい。植物材料を溶解する方法は当該技術分野で知られており、機械的溶解、化学的溶解及び／または酵素的溶解を含んでもよい。いくつかの実施形態では、植物材料は機械的に溶解される。開示されているプロセスにて使用するのに好適な機械的溶解の例には、機械的撹拌、圧力、粉砕、圧搾及び剪断が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、植物材料はブレンダーを使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はミルを使用して、例えば、ナイフミル、高剪断ミル、コロイドミル、ボールミル、Ｂｏｓｔｏｎ剪断ミル、ハンマーミル、粉砕機、Ｒｉｅｔｚミル、湿式ミルまたは高剪断ミルによって機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は少なくとも２つの異なる型のミル（例えば、直列磨砕を介して）を使用して機械的に溶解される。理論によって束縛されることを望まないで、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる型のミルを使用して植物材料を機械的に溶解することは、植物材料のさらに効果的な溶解をもたらすと考えられている。いくつかの実施形態では、植物材料は超音波破砕機を使用して、窒素噴出を使用して、超音波エネルギーを使用して、または凍結によって機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はプレス機（例えば、ネジプレスまたはフレンチプレス）を使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はホモゲナイザー（例えば、高圧ホモゲナイザーまたは微細フリューダイザー）を使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は粉砕機を使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料はパルス電場（ＰＥＦ）を使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は機械的圧力を使用して機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は本明細書で開示されている機械的溶解のための技法の１以上を使用して機械的に溶解される。
【0153】
いくつかの実施形態では、植物材料は化学的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は１以上の界面活性剤を使用して化学的に溶解される。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤はイオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤はカチオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤はアニオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤は、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＮＰ－４０、ジギトニン、及び／またはサポニンのような非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤は、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ、Ｂｒｉｊ、Ｔｗｅｅｎ、オクチル－β－グルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、及び／またはＣＨＡＰＳＯのような双性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤は低張性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤は高張性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、１以上の界面活性剤は等張性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、植物材料は本明細書で開示されている化学的溶解のための技法の１以上を使用して化学的に溶解される。
【0154】
いくつかの実施形態では、植物材料は１以上の酵素を使用して酵素によって溶解される。いくつかの実施形態では、１以上の酵素にはセルラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、１以上の酵素にはペクチナーゼが挙げられる。
【0155】
いくつかの実施形態では、植物材料は化学的に且つ機械的に溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は化学的に且つ酵素によって溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は機械的に且つ酵素によって溶解される。いくつかの実施形態では、植物材料は化学的に、機械的に且つ酵素によって溶解される。
【0156】
いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物に１以上の二価にイオン（複数可）を添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物にキトサンを添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物に１以上の二価にイオン（複数可）を添加すること及び溶解物にキトサンを添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物にカルシウムイオンを添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物にカルシウムイオンを添加すること及び溶解物にキトサンを添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物に塩化カルシウムを添加することを含む。いくつかの実施形態では、植物材料の溶解は溶解物に塩化カルシウムを添加すること及び溶解物にキトサンを添加することを含む。
【0157】
溶解した植物材料の固相と液相への分離は当該技術分野で知られる任意の固液分離技法によって実行されてもよい。開示されているプロセスにて使用するのに好適なそのような分離技法の例には、ふるい分け、濾過、遠心分離、及び傾瀉が挙げられる。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することはネジプレス、デカンターまたは遠心分離機によって実行される。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することはディスクスタック遠心分離機、デカンター遠心分離機、連続遠心分離機、またはバスケット遠心分離機を使用して実行される。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することはデッドエンド濾過システムを使用すること、限外濾過を使用すること、接線流濾過システムをすること、または平面濾過器を使用することを含むが、これらに限定されない濾過を含む。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することは、ネジプレス機、フレンチプレス機、ベルトプレス機、フィルタープレス機、ファンプレス機、仕上げプレス機、または回転プレス機を含むが、これらに限定されないプレス機の使用を含む。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することは重力沈降を使用することを含む。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料を固相と液相に分離することは円振動分離機または線形／傾斜運動振盪器を含むが、これらに限定されないふるい分けを含む。いくつかの実施形態では、液相は可溶性タンパク質とクロロフィルとを含む。いくつかの実施形態では、固相は不溶性タンパク質、リグニン、繊維等を含む。
【0158】
溶解した植物材料の固相と液相への分離は農業応用を含むが、これらに限定されない種々の応用に有用である物質を生じてもよい。例えば、溶解した植物材料の分離から得られる液相は、可溶性タンパク質、クロロフィル、フェノール化合物、細胞膜（例えば、脂質）、炭水化物（ペクチンを含むが、これに限定されない）、核酸、及び／または集光性の複合体／光化学系を含んでもよい。例えば、溶解した植物材料の分離から得られる固相は植物繊維（複数可）、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、インタクトの植物細胞、細胞器官、不溶性タンパク質、クロロフィル及び／または脂肪を含んでもよい。いくつかの実施形態では、固相は、例えば、動物飼料またはバイオ燃料として使用されてもよい。いくつかの実施形態では、固相は、バイオ燃料の製造における前駆物質であるレブリン酸を含有してもよい。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料の分離から得られる固相から得られるクロロフィルは、例えば、化粧品応用にて、色素として及び／またはヒト及び／または動物の栄養で使用されてもよい。
【0159】
精製タンパク質標品を作るプロセスは、熱処理を使用して所望ではない成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏではない成分）を凝固させて、液相に所望のタンパク質成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏ）を残す工程も含んでもよい。理論によって束縛されないで、加熱することはアミノ酸鎖の高次構造でアンフォールディングを引き起こし、いくつかのタンパク質の凝集をもたらす。そのアミノ酸の配列及び高次構造状態に応じて、タンパク質はさまざまなアンフォールディング温度を有し、それを超えるとアンフォールディングし始め、凝集し始める。慎重に制御された加熱と冷却の条件によって、所望のタンパク質産物のアンフォールディング温度よりも低いアンフォールディング温度を持つタンパク質は凝固してもよい。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質も凝集することを阻止するために加熱は穏やかな条件下で実施される。いくつかの実施形態では、液相は第１の設定温度に加熱される。いくつかの実施形態では、第１の設定温度は約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃または８０℃以下である。いくつかの実施形態では、加熱は迅速に行われる。いくつかの実施形態では、第１の設定温度までの加熱は約３０分以上かからない。いくつかの実施形態では、第１の設定温度までの加熱は約１５分以上かからない。いくつかの実施形態では、第１の設定温度までの加熱は約５分以上かからない。いくつかの実施形態では、液相は第１の設定温度に加熱した後、第２の設定温度に冷却される。いくつかの実施形態では、約３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃または５℃以上である。いくつかの実施形態では、冷却は第１の設定温度に到達し次第開始される。いくつかの実施形態では、冷却は迅速に行われる。いくつかの実施形態では、第２の設定温度に冷却するのに約３０分以上かからない。いくつかの実施形態では、第２の設定温度に冷却するのに約１５分以上かからない。いくつかの実施形態では、第２の設定温度に冷却するのに約５分以上かからない。
【0160】
精製タンパク質標品を作るプロセスは、１以上の塩の添加によって所望ではない成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏではない成分）を凝固させて、液相に所望のタンパク質成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏ）を残す工程も含んでもよい。いくつかの実施形態では、塩はカルシウム塩、マグネシウム塩、ベリリウム塩、亜鉛塩、カドミウム塩、銅塩、鉄塩、コバルト塩、スズ塩、ストロンチウム塩、バリウム塩、ラジウム塩、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、塩は塩化カルシウム、硝酸カルシウム、または炭酸鉄である。いくつかの実施形態では、添加される塩はリン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、添加される塩は塩化カルシウムである。いくつかの実施形態では、添加される塩はリン酸カリウム及び塩化カルシウムである。いくつかの実施形態では、１以上の塩は５ｍＭ～２Ｍの濃度で添加される。
【0161】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質標品を作るプロセスは、１以上の凝固剤の添加によって所望ではない成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏではない成分）を凝固させて、液相に所望のタンパク質成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏ）を残す工程も含んでもよく、その際、凝固剤はプロトン化した３級、２級または１級のアンモニウム種を含むが、これらに限定されない四級アンモニア種である。いくつかの実施形態では、凝固剤はエピアミン、ポリタンニン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、及びカチオン性ポリアクリルアミドから選択される。いくつかの実施形態では、凝固剤はポリマー由来の凝固剤である。いくつかの実施形態では、ポリマーは双性イオン性である。いくつかの実施形態では、ポリマーは溶液またはエマルションの形態である。いくつかの実施形態では、ポリマーは粒状である。いくつかの実施形態では、ポリマーはビーズである。いくつかの実施形態では、ポリマーは荷電されない。いくつかの実施形態では、ポリマーは１％未満から最大で１００％までの理論モルの荷電密度を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは５００ダルトン～２０，０００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは２０，０００，０００ダルトンを超える分子量を有する。
【0162】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質標品を作るプロセスは、電気凝固法によって所望ではない成分（例えば、ＲｕＢｉｓＣｏではない成分）を凝固させる工程も含んでもよい。電気凝固法のいくつかの実施形態では、水は電気凝固セルを通過し、その際、金属イオン（複数可）は水の中に入り、陰極の表面では水は水素ガスとヒドロキシル基に加水分解され、電子は自由に流れて浮遊固形物及び乳化油における表面電荷を不安定化し、浮遊固形物、重金属、乳化油、及び他の不純物を取り込む大きな綿状の塊が生じ、綿状の塊は下流の固形物分離及び／または濾過の操作（複数可）にて水から取り除かれる。
【0163】
精製タンパク質標品を作るプロセスはまた、液相を凝集剤及び／または吸着剤と接触させ、液相におけるクロロフィルを凝集するまたは吸着剤にそれを吸着させるのに十分な時間混合し、それによって凝集した混合物を形成する工程も含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「凝集剤」という用語はコロイドを不安定化し、懸濁液から出て来させるために添加される物質を指す。「吸着」という用語は固体表面または「吸着剤」への分子の接着を指す。凝集のプロセスは当該技術分野で周知であり、例示的な凝集剤にはアルキルアミンエピクロロヒドリン、ポリ塩化ジメチルジアリルアンモニウム、多糖（例えば、キトサン）、ポリアミン、デンプン、硫酸アルミニウム、ミョウバン、ポリアクリルアミド、ポリアクロミドまたはポリエチレンイミンが挙げられてもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、凝集剤は活性化キトサンである。いくつかの実施形態では、凝集剤は溶液における１～２０％ｗ／ｖの活性化キトサンである。キトサンを活性化し、溶液にキトサンを溶解する方法は当該技術分野で周知であり、溶液にて活性化キトサンを調製する任意の方法が使用されてもよい。例示的な方法は２０％酢酸及び７９％水に１％キトサンを溶解することを含んでもよい。吸着剤は当該技術分野で既知であり、例示的な吸着剤には活性炭、グラファイト、シリカゲル、ゼオライト、粘土、ポリエチレン等が挙げられてもよい。例示的な吸着剤には樹脂も挙げられてもよい。いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための樹脂は、強カチオン交換体、弱カチオン交換体、強アニオン交換体、弱アニオン交換体を含むが、これらに限定されないイオン交換樹脂、混合床樹脂、キレート樹脂、及びポリマー触媒である。いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための樹脂は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含むが、これらに限定されないサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）樹脂である。いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための樹脂は、基質類似体、抗体・抗原、多糖（例えば、レクチン）、相補性塩基配列（例えば、核酸）、受容体（例えば、ホルモン）、アビジン・ビオチン、カルモジュリン、ポリ－Ａ、グルタチオン、プロテインＡ及びプロテインＧ、及び／または金属イオンに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための樹脂は、例えば、フェニル、ブチル、オクチル、ヘキシル、エーテル及び／またはＰＰＧを含む樹脂のように疎水性の相互作用を有する。
【0164】
いくつかの実施形態では、吸着剤は活性炭、活性化木炭または活性化石炭である。いくつかの実施形態では、活性炭は２５０ｍ／ｇを超える表面積、１～１０００μｍの重量平均直径、４００～１，４００ｍｇ／ｇのヨウ素価、１００～５５０の範囲でのモラセスナンバー、及び／または少なくとも１０ｇ／１００ｇのメチレンブルー吸着を有する。いくつかの実施形態では、液相をポリマーと接触させる。いくつかの実施形態では、ポリマーは非イオン性である。いくつかの実施形態では、ポリマーはアニオン性である。いくつかの実施形態では、ポリマーはカチオン性である。いくつかの実施形態では、ポリマーは双性イオン性である。いくつかの実施形態では、ポリマーは溶液またはエマルションの形態である。いくつかの実施形態では、ポリマーは粒状である。いくつかの実施形態では、ポリマーはビーズである。いくつかの実施形態では、ポリマーは荷電されていない。いくつかの実施形態では、ポリマーは１未満から最大１００％までの荷電密度を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは５００ダルトン～２０，０００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは２０，０００，０００ダルトンを超える分子量を有する。理論によって束縛されないで、液相におけるクロロフィルは凝集してさらに大きなサイズの粒子を形成し、次いで活性炭、活性化木炭または活性化石炭の表面に吸着してもよい。凝集した混合物は、凝集剤と吸着剤と不溶性タンパク質とクロロフィルとを含む固相、及び溶液にて可溶性タンパク質を含む液相を含む。
【0165】
次いで、凝集した混合物を固相と液相に分離してもよい。凝集した混合物の分離は当該技術分野で既知の固液分離法によって実行されてもよい。開示されているプロセスにて使用するのに好適なそのような分離法の例には、ふるい分け、濾過、遠心分離、及び傾瀉が挙げられる。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は、ネジプレス、デカンター、または精密濾過によって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は、例えば、デカンター遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、または連続遠心分離機の使用のように遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は、例えば、デッドエンド濾過システム、限外濾過の使用、接線流濾過システム、または平面濾過器の使用のように濾過を含む。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は、例えば、ネジプレス機、フレンチプレス機、ベルトプレス機、フィルタープレス機、ファンプレス機、仕上げプレス機または回転プレス機のようなプレス機の使用を含む。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は重力沈降を含む。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離はふるい分けを含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、凝集した混合物の固相と液相への分離は疎水性吸着剤を取り除くことを含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことは、例えば、ディスクスタック遠心分離機、連続遠心分離機、またはバスケット遠心分離機の使用のように遠心分離を含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことは、デッドエンド濾過システムを使用すること、限外濾過を使用すること、接線流濾過システムをすること、または平面濾過器を使用することを含むが、これらに限定されない濾過を含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことは、ネジプレス機、フレンチプレス機、ベルトプレス機、フィルタープレス機、ファンプレス機、仕上げプレス機または回転プレス機を含むが、これらに限定されないプレス機の使用を含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことは重力沈降を使用することを含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことはふるい分けを含む。いくつかの実施形態では、疎水性吸着剤を取り除くことはカラム濾過を含む。凝集した混合物の固相と液相への分離は農業応用を含むが、これらに限定されない種々の応用で有用である物質を生じてもよい。例えば、吸着剤が活性炭、活性化木炭または活性化石炭である場合、液相は可溶性タンパク質を含んでもよく、固相は活性炭、活性化木炭または活性化石炭及びフェノール類、顔料、及び／または細胞膜を含んでもよい。固相由来のフェノール類はヒト及び／または動物の栄養で使用されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、フェノール類には、例えば、栄養補助食品で使用されてもよいカロテノイドが含まれる。いくつかの実施形態では、フェノール類は日焼け止めで使用されてもよい。いくつかの実施形態では、固相由来の活性炭、活性化木炭または活性化石炭は再利用することができる。いくつかの実施形態では、固相由来の活性炭、活性化木炭または活性化石炭が植物に適用されて、例えば、水分保持を改善することができる。いくつかの実施形態では、固相由来の活性炭、活性化木炭または活性化石炭はバイオ燃料技術にて応用性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、バイオ炭の製造に活性炭、活性化木炭または活性化石炭を使用することができる。
【0167】
いくつかの実施形態では、開示されているプロセスにて使用するための液相及び／または濾液は消泡剤及び／または泡止め剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤は油性消泡剤である。油性消泡剤のいくつかの実施形態では、油は鉱物油、植物油、ホワイトオイル、またはシリコーン油を除いて起泡性媒体に不溶性である任意の油である。いくつかの実施形態では、油系消泡剤はワックス及び／または疎水性シリカを含有する。いくつかの実施形態では、ワックスはエチレンビス－ステアルアミド（ＥＢＳ）、パラフィンワックス、エーテルワックス、及び脂肪アルコールワックスから選択される。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤は粉末消泡剤である。いくつかの実施形態では、粉末消泡剤はシリカのような特定の担体での油系消泡剤である。いくつかの実施形態では、粉末消泡剤は、例えば、セメント、しっくい、及び界面活性剤のような粉末製品に添加される。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤は水系消泡剤である。いくつかの実施形態では、水系消泡剤は水性基剤にて１以上の油及び／またはワックス、例えば、鉱物油、植物油、長鎖脂肪アルコール、及び脂肪酸セッケンまたは脂肪酸エステルを含む。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤はケイ素系消泡剤である。いくつかの実施形態では、ケイ素系消泡剤はケイ素主鎖のポリマーである。いくつかの実施形態では、ケイ素系消泡剤は油系エマルションまたは水系エマルションとして送達される。いくつかの実施形態では、ケイ素化合物はシリコーン油に分散された疎水性シリカを含む、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤は乳化剤を含むケイ素系消泡剤である。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤はシリコーングリコール及び／または改変されたシリコーン流体を含むケイ素系消泡剤である。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤はＥＯ／ＰＯ系消泡剤である。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤はポリエチレングリコール及び／またはポリプロピレングリコールのコポリマーを含むＥＯ／ＰＯ系消泡剤である。いくつかの実施形態では、消泡剤及び／または泡止め剤は油、水溶液または水系エマルションとして送達されるＥＯ／ＰＯ系消泡剤である。
【0168】
凝集した混合物の固相と液相への分離は農業応用を含むが、これらに限定されない種々の応用に有用である物質を生じてもよい。例えば、液相は可溶性タンパク質、過剰な凝集剤（例えば、キトサン）、他の連結した、分岐状の、または線形の多糖（イオン性、非イオン性及び／または中性の多糖を含むが、これらに限定されない）、ビタミンＢ－１２、塩化カルシウムまたは他の二価のイオン（例えば、塩化マグネシウム）、ＲｕＢｉｓＣｏ、集光性複合体／光化学系、可溶性タンパク質、細胞膜、フェノール化合物、カロテノイド、ルテイン、及び／またはキサントフィルを含んでもよい。例えば、固相はクロロフィル、リン酸カルシウム、細胞膜、集光性複合体／光化学系、及び／またはキトサンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、固相は、例えば、動物飼料として、またはバイオ燃料として使用されてもよい。いくつかの実施形態では、この固相は潜在的なバイオ燃料前駆物質であるレブリン酸を含有してもよい。いくつかの実施形態では、溶解した植物材料の分離から得られる固相から得られるクロロフィルは、例えば、化粧品応用にて、色素として、及び／またはヒト及び／または動物の栄養で使用されてもよい。
【0169】
液相における可溶性タンパク質を安定化するために、低温でプロセスの工程を実行することが有利であってもよい。低温は可溶性タンパク質の変性を阻止してもよい。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の分離は約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃または５℃以下で実行される。いくつかの実施形態では、加熱する工程を除くタンパク質標品を作るプロセスの工程はすべて約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃または５℃以下で実行される。
【0170】
凝集した混合物の固相と液相への分離の後、液相を濾過して精製タンパク質を含有する濾液を得てもよい。濾過の方法は当該技術分野で周知であり、表層フィルターまたは深層フィルターの使用によって、例えば、膜濾過、カラム濾過、透析濾過、限外濾過、接線流濾過、等によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は薄膜フィルターによって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は５．０μｍ、４．０μｍ、３．０μｍ、２．０μｍ、１．０μｍ、０．７μｍ、０．５μｍ、０．２２μｍの薄膜フィルターによって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は珪藻土による表層濾過または深層濾過による。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は沈泥による表層濾過または深層濾過によって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は活性炭による表層濾過または深層濾過によって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は最大約１０％、８％、６％、４％、２％、または１％までの活性炭によって実行される。いくつかの実施形態では、凝集した混合物の液相の濾過は濾過の複数の工程または様式を含む。例えば、濾過は薄膜フィルター及び活性炭床によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、濾過することは０．２μｍの薄膜フィルターによって行われ、タンパク質様の液体が約２％の活性炭に曝露される。いくつかの実施形態では、濾液はさらに、薄膜フィルターを介して、例えば、５．０μｍ、４．０μｍ、３．０μｍ、２．０μｍ、１．０μｍ、０．７μｍ、０．５μｍ、または０．２μｍの薄膜フィルターを介して濾過される。
【0171】
いくつかの実施形態では、小さな固形物及び／または微生物は液相及び／または濾液から取り除かれてもよい。いくつかの実施形態では、小さな固形物及び／または微生物は、精密濾過によって、例えば、ワンパスデッドエンド精密濾過システムまたは接線流濾過システムを使用することによって液相及び／または濾液から取り除かれてもよい。
【0172】
いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液は滅菌されてもよい。いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液は精密濾過によって、例えば、ワンパスデッドエンド精密濾過システムまたは接線流濾過システムを使用することによって滅菌される。いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液は紫外線（ＵＶ）照射によって滅菌される。いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液はガンマ線照射によって滅菌される。いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液は殺菌によって、例えば、高圧殺菌または高温短時間殺菌によって滅菌される。
【0173】
タンパク質標品を含む濾液はさらに濃縮されてもよい。溶質を濃縮する当該技術分野で既知の方法が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、濾液を濃縮することは好適なカットオフフィルターとしてのフィルターを介した限外濾過によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、濾液を濃縮することはポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテート、またはポリスルホンを介した限外濾過によって実行されてもよい。いくつかの実施形態では、濾液を濃縮することは蒸発によって実行されてもよく、濾液を濃縮することは逆浸透によって実行されてもよい。カットオフフィルターのサイズは目的のタンパク質に応じて最適化されてもよい。いくつかの実施形態では、限外濾過は、約２００ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、２５ｋＤａ、１０ｋＤａ、または５ｋＤａ以下のカットオフのフィルターを使用して実行される。
【0174】
いくつかの実施形態では、液相及び／または濾液は透析されてもよい。いくつかの実施形態では、透析は限外濾過を使用して実行されてもよい。いくつかの実施形態では、透析はポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、セルロースアセテートまたはポリスルホンを介した限外濾過を使用して実行されてもよい。いくつかの実施形態では、透析は逆浸透を使用して実行されてもよい。
【0175】
液相及び／または濾液は乾燥させてもよい。いくつかの実施形態では、乾燥は噴霧乾燥器、凍結乾燥器、ドラム乾燥、フィルム乾燥、ベッド乾燥、フラッシュ乾燥器または回転乾燥器を使用して達成されてもよい。
【0176】
本明細書で開示されているプロセスは高収率の精製タンパク質の調製を可能にする。本明細書で開示されているプロセスは精製タンパク質の高収率標品を調製するのに使用されてもよい。有利なことに、本明細書で開示されている工程は植物材料の溶解後の液相における可溶性タンパク質の量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％の収率を生じてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質標品の収率は少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。
【0177】
本明細書で開示されているプロセスはかなりのレベルのタンパク質を植物材料から抽出するのに使用されてもよい。ＲｕＢｉｓＣｏは光合成生物の葉緑体で見いだされた酵素であり、炭素固定の最初に主要な工程を触媒するのに使用される。緑葉植物材料で見いだされる総タンパク質の最大５０％まではＲｕＢｉｓＣｏから成ってもよく、それは葉における最も豊富なタンパク質となっている。いくつかの実施形態では、タンパク質標品はＲｕＢｉｓＣｏである。いくつかの実施形態では、植物材料はウキクサ、藻類、ビートの根、ホウレンソウビート、フダンソウ、テンサイ、シービート、Ｍａｎｇｅｌビート、ダイズまたはタバコに由来する。
【0178】
本開示の別の態様は本明細書で開示されているプロセスによって作られる産物に関する。
【0179】
本開示のさらに別の態様は植物材料由来の精製タンパク質標品を含む食物に関する。有利なことに、タンパク質標品を含む食物は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以下の不純物を含有してもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質標品を含む食物はＲｕＢｉｓＣｏを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質はＬｅｍｎａに由来する植物材料から調製される。いくつかの実施形態では、タンパク質はＬｅｍｏｎｏｉｄｅａｅに由来する植物材料から調製される。
【0180】
ゲル及び安定な泡状物質を形成するタンパク質の能力は種々の食物の製造で重要である。本明細書で使用されるとき、泡状物質は液体または固体にて気体のポケットを捕捉することによって形成される構造体を指す。泡状物質におけるタンパク質は小さな気泡を形成する泡状物質の能力及び構造を保持する安定性に寄与する。小さな気泡が均一に分布する泡状物質は食物に素地、滑らかさ及び軽さを付与する。タンパク質標品の泡状物質を形成する能力はその純度に関係し、安定な泡状物質を形成するには少なくとも約８０％の純度が必要であってもよい。本明細書で使用されるとき、ゲルは大量の水性相を含む軟らかい固形物である。タンパク質ゲルはマトリクス全体を通して連続した液相を伴うタンパク質繊維の三次元ネットワークを含んでもよい。高いゲル化能を持つタンパク質はゲルを形成するのに少ないタンパク質で済む。本明細書で開示されているプロセスは、食品で使用するのに好適である有利に高い純度、起泡能、泡状物質の安定性及びゲル化能を持つタンパク質標品を調製するのに使用されてもよい。
【0181】
本開示は以下の限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【0182】
実施例１～４及び比較例１にて詳述されている以下のプロセスによって作られる可溶性タンパク質標品及び凍結乾燥したタンパク質標品を性状分析した。凍結乾燥する前に溶液における可溶性タンパク質の濃度をＰｉｅｒｃｅ６６０ｎｍタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって測定した。Ｄｕｍａｓ法によってタンパク質の純度を測定した。可溶性標品のそれぞれから泡状物質を作り出し、起泡性の特徴を測定した。起泡能（ＦＣ）は
ＦＣ＝（起泡後の体積－起泡前の体積）／起泡前の体積×１００％
として算出した。起泡後の時間間隔ｔでの起泡安定性は
起泡安定性＝時間ｔでの残留泡状物質の体積／最初の泡状物質の体積×１００％
として算出した。
ＦＣ＝（起泡後の体積－起泡前の体積）／起泡前の体積×１００％
として算出した。起泡後の時間間隔ｔでの起泡安定性は
起泡安定性＝時間ｔでの残留泡状物質の体積／最初の泡状物質の体積×１００％
として算出した。
【0183】
実施例１
０．３％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムを含有する炭酸ナトリウム緩衝液と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇをＶｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）にて浸軟した。３０℃未満で温度を維持して中速の設定で抽出を３分間行った。続いて、網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、浸軟したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。５５℃の温度に設定した水浴にて溶液を５０℃の温度に加熱し、目標温度に到達した後、１５℃未満の温度に迅速に冷却した。タンパク質溶液の迅速な冷却に続いて、２％ｖ／ｖの活性化キトサンと４％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）とを液体ジュースに加えた。続いて溶液を５分間撹拌し、その後、溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。遠心ボトルの緑色のペレットを捨て、０．７μｍのガラス製超極細繊維膜（Ｗｈａｔｍａｎ １８２５－０４７ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ Ｂｉｎｄｅｒ Ｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ，０．７Ｍｉｃｒｏｎ；Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して透明な黄色の上清を精密濾過した。続いて濾液を０．２μｍのポリエーテルスルホンの膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に曝露し、細菌を含む望ましくない粒子の残りを取り除いた。次いで７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭の可溶性タンパク質粉末だった。
０．３％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムを含有する炭酸ナトリウム緩衝液と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇをＶｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）にて浸軟した。３０℃未満で温度を維持して中速の設定で抽出を３分間行った。続いて、網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、浸軟したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。５５℃の温度に設定した水浴にて溶液を５０℃の温度に加熱し、目標温度に到達した後、１５℃未満の温度に迅速に冷却した。タンパク質溶液の迅速な冷却に続いて、２％ｖ／ｖの活性化キトサンと４％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）とを液体ジュースに加えた。続いて溶液を５分間撹拌し、その後、溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。遠心ボトルの緑色のペレットを捨て、０．７μｍのガラス製超極細繊維膜（Ｗｈａｔｍａｎ １８２５－０４７ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ Ｂｉｎｄｅｒ Ｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ，０．７Ｍｉｃｒｏｎ；Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して透明な黄色の上清を精密濾過した。続いて濾液を０．２μｍのポリエーテルスルホンの膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に曝露し、細菌を含む望ましくない粒子の残りを取り除いた。次いで７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭の可溶性タンパク質粉末だった。
【0184】
実施例２
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．３％ｗ／ｖのアスコルビン酸を含有するリン酸カリウム緩衝液と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで上清を５％ｖ／ｖの活性化キトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び１０％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）と５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨て、０．２μｍのポリエーテルスルホン膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、脱臭され、脱色された上清を精密濾過した。次いで７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．３％ｗ／ｖのアスコルビン酸を含有するリン酸カリウム緩衝液と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで上清を５％ｖ／ｖの活性化キトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び１０％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）と５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨て、０．２μｍのポリエーテルスルホン膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、脱臭され、脱色された上清を精密濾過した。次いで７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
【0185】
実施例３
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．３％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムとアスコルビン酸とを含有する蒸留水と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。次いで、濾過したホモジネートを４０００ｇの速度／出力で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで、３０ｍＭのリン酸カリウムと２０ｍＭの塩化カルシウムを含有する溶液と上清を５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で遠心分離した。得られたペレットを捨て、５％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を上清に加え、溶液を５分間撹拌した。続いて、残りのクロロフィル、ポリフェノール、及び他の望ましくない味感／色彩／臭気に影響を及ぼす粒子を吸着している活性炭を取り除くために、０．２μｍのポリエーテルスルホンの薄膜フィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、活性炭を含有する混合溶液を精密濾過した。次いで、１００ｋＤａの膜（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，１００，０００ ＮＭＷＣ，８５０ｃｍ２；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭したタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．３％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムとアスコルビン酸とを含有する蒸留水と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。次いで、濾過したホモジネートを４０００ｇの速度／出力で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで、３０ｍＭのリン酸カリウムと２０ｍＭの塩化カルシウムを含有する溶液と上清を５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で遠心分離した。得られたペレットを捨て、５％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を上清に加え、溶液を５分間撹拌した。続いて、残りのクロロフィル、ポリフェノール、及び他の望ましくない味感／色彩／臭気に影響を及ぼす粒子を吸着している活性炭を取り除くために、０．２μｍのポリエーテルスルホンの薄膜フィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、活性炭を含有する混合溶液を精密濾過した。次いで、１００ｋＤａの膜（Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，１００，０００ ＮＭＷＣ，８５０ｃｍ２；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭したタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
【0186】
実施例４
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．５％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムを含有する蒸留水と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスをを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで、３０ｍＭのリン酸カリウムと２０ｍＭの塩化カルシウムを含有する溶液と上清を５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨てた。２％ｗ／ｖの活性化キトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び４％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を上清に加え、溶液を５分間撹拌した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨て、０．７μｍのポリエーテルスルホン膜（Ｗｈａｔｍａｎ １８２５－０４７ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ Ｂｉｎｄｅｒ Ｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ，０．７ミクロン；Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、脱臭し、脱色した上清を精密濾過した。次いで０．２μｍのポリエーテルスルホン膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、濾液をさらに精密濾過した。次いで、７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
Ｖｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を使用して、０．５％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムを含有する蒸留水と１：１の比で新鮮なコウキクサ１ｋｇを浸軟した。浸軟は３０℃未満の温度を維持するために中速で３分間行った。網目の細かいナイロン製の濾し袋（Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｏｍｅ Ｂｒａｎｄｓ，Ｓｕｎ Ｖａｌｌｅｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによって、溶解したバイオマスをを濾過し、可溶性タンパク質を含有する液体ジュースから繊維性が高い固形濾塊を分離した。濾過したホモジネートを次いで４０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。ペレットを捨て、上清を別々に回収した。次いで、３０ｍＭのリン酸カリウムと２０ｍＭの塩化カルシウムを含有する溶液と上清を５分間混合した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨てた。２％ｗ／ｖの活性化キトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）及び４％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を上清に加え、溶液を５分間撹拌した。続いて、混合した溶液を５０００ｇの速度／出力（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ローター；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で１０分間遠心分離した。得られたペレットを捨て、０．７μｍのポリエーテルスルホン膜（Ｗｈａｔｍａｎ １８２５－０４７ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ Ｂｉｎｄｅｒ Ｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ，０．７ミクロン；Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、脱臭し、脱色した上清を精密濾過した。次いで０．２μｍのポリエーテルスルホン膜（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を使用して、濾液をさらに精密濾過した。次いで、７０ｋＤａの膜（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０７０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、得られた淡黄色の脱臭されたタンパク質様溶液を濃縮した。続いて、得られた濃縮溶液を凍結乾燥し（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｒｉｇｈｔ ＬＬＣ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ）、成果は白色無臭で可溶性のタンパク質粉末だった。
【0187】
実施例１～４の結果
実施例１～４の方法によって調製されたタンパク質標品の平均純度は約８４．３％であり、限外濾過後の可溶性タンパク質の濃度は１．３１６μｇ／ｍＬだった。達成された起泡能は１９５％であり、１時間後９２％の安定性を維持した。凍結乾燥した物質のゲル化特性を検証し、ゲルを形成するために２％ｗ／ｖの凍結乾燥した物質を加えれば十分だった。
実施例１～４の方法によって調製されたタンパク質標品の平均純度は約８４．３％であり、限外濾過後の可溶性タンパク質の濃度は１．３１６μｇ／ｍＬだった。達成された起泡能は１９５％であり、１時間後９２％の安定性を維持した。凍結乾燥した物質のゲル化特性を検証し、ゲルを形成するために２％ｗ／ｖの凍結乾燥した物質を加えれば十分だった。
【0188】
比較例１
一部修正してＷＯ２０１１／０７７８６７１ Ａ１（ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．）に記載されたとおりにウキクサ葉のタンパク質を抽出した。
一部修正してＷＯ２０１１／０７７８６７１ Ａ１（ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅ ｅｔ ａｌ．）に記載されたとおりにウキクサ葉のタンパク質を抽出した。
【0189】
新鮮なウキクサ１ｋｇを洗浄し、０．３％ｗ／ｖの重亜硫酸ナトリウムに対して２：１の比でＶｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒを使用して浸軟した。６０℃まで加熱する前にチーズクロスを介してホモジネートをふるい分けた。濾液を６０℃で５分間保持し、次いで１０℃に冷却した。加熱処理に続いて、懸濁液を５２００ｇで５分間遠心分離した。次に５％ｗ／ｗの量で活性炭を上清に加えた。活性炭の添加に続いて、懸濁液を５分間撹拌し、その後、傾瀉によって上清を取り出した。
【0190】
得られた上清を２つの精密濾過工程に供した。先ず、０．７μｍの細孔径を有する精密フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ １８２５－０４７ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒ Ｂｉｎｄｅｒ Ｆｒｅｅ Ｆｉｌｔｅｒ，０．７ミクロン；Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に上清を通した。続いて、０．２μｍの細孔径を有する精密フィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）に濾液を通した。次いで濾液を凍結乾燥し、成果は白っぽい無臭の粉末だった。
【0191】
比較例１の結果
タンパク質の純度は乾燥物の単位あたり約３４．１％であり、凍結乾燥前の可溶性タンパク質の濃度は５２０μｇ／ｍＬだった。凍結乾燥物質の起泡特性は９２％の総起泡強度を示し、１時間後６２％の安定性だった。凍結乾燥物質のゲル化特性を検証し、ゲルを形成するために、少なくとも７％ｗ／ｖの凍結乾燥物質を加えることが必要だった。
タンパク質の純度は乾燥物の単位あたり約３４．１％であり、凍結乾燥前の可溶性タンパク質の濃度は５２０μｇ／ｍＬだった。凍結乾燥物質の起泡特性は９２％の総起泡強度を示し、１時間後６２％の安定性だった。凍結乾燥物質のゲル化特性を検証し、ゲルを形成するために、少なくとも７％ｗ／ｖの凍結乾燥物質を加えることが必要だった。
【表1】
【0192】
実施例５
この実施例はクロロフィル・タンパク質複合体を凝集させるための塩化カルシウムを使用したクロロフィルの除去を検討した。
この実施例はクロロフィル・タンパク質複合体を凝集させるための塩化カルシウムを使用したクロロフィルの除去を検討した。
【0193】
２％のメタ重亜硫酸塩と０．１ＭのＮａＣｌを含む抽出緩衝液で２ｋｇのバイオマスを溶解した（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）。次いで濾液からすべて３７５ｍＬの体積を有する４つの画分を作った。画分すべてを速度４で混合し、遠心分離をすべての画分で行い、工程を５２００ｇ及び５分に設定した。濾過については、ＤＥ（Ｄｉｃａｌｉｔｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ，Ｂａｌａ Ｃｙｎｗｙｄ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）でコーティングした０．４５μｍのカットオフフィルターのシート（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）付きのブフナー漏斗を使用した。
【0194】
画分１：画分にて１０ｍＭの濃度を得るために３．７５ｇのリン酸緩衝液を加えた。次いで、６８℃に設定した熱浴工程に画分を通し、その後、１５ｇの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を加え、２５分間混合した。それに続いて３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0195】
画分２：画分にて１０ｍＭの濃度を得るために３．７５ｇのリン酸緩衝液を加えた。次いで１５ｇの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を画分に加え、１５分間混合した。これに続いて、３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0196】
画分３：画分にてそれぞれ１０ｍＭ及び７．５ｍＭの濃度を得るために３．７５ｇのリン酸緩衝液及び２．８１ｇの塩化カルシウム溶液を加えた。次いで１５ｇの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を画分に加え、１５分間混合した。これに続いて、３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0197】
画分４：画分にてそれぞれ２０ｍＭ及び１５ｍＭの濃度を得るために７．５ｇのリン酸緩衝液及び５．６３ｇの塩化カルシウム溶液を加えた。次いで１５ｇの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を画分に加え、１５分間混合した。これに続いて、３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0198】
【表2】
【0199】
図５は精密濾過後の画分１、２、３及び４を示す。図６は精密濾過後の画分４、３、２及び１を示す。図５及び図６に示すように、塩化カルシウムによる凝固は対照画分（画分２）と比べてクロロフィルの除去で有意差を示さない。図５及び図６にまた示すように、画分３及び画分４における２つの異なる濃度の塩化カルシウムの使用はクロロフィルの除去で有意差を生じなかった。
【0200】
さらなる実験はＥＤＴＡを加えるポイントを調べた。画分の第１の設定については、バスケット遠心分離機を使用した固体／液体分離ののち得られた濾液はリン酸塩（二塩基性リン酸カリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含む）によって処理されたが、ＥＤＴＡによって処理されなかった。図７Ａはこれらの画分を示す。画分の第２の設定については、固体／液体分離ののち得られた溶解物はリン酸塩（二塩基性リン酸カリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含む）によって処理され、且つＥＤＴＡによって処理された。図７Ｂはこれらの画分を示す。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、画分の第２の設定に由来する画分２は画分の第１の設定由来の画分２と比べて劇的に異なる色彩を有する。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は濾液にＥＤＴＡを添加することが溶解物にＥＤＴＡを添加することに比べて色彩の大きな除去をもたらすことを示唆していると考えられる。
【0201】
実施例６
この実施例は熱浴を使用することの代替としてクロロフィル及び葉緑体膜を凝固させるための塩化カルシウムの使用を検討した。
この実施例は熱浴を使用することの代替としてクロロフィル及び葉緑体膜を凝固させるための塩化カルシウムの使用を検討した。
【0202】
０．１ＭのＮａＣｌ及び２％のメタ重亜硫酸塩（ＥＤＴＡなし）を含有する抽出緩衝液にてバイオマスを溶解した。バスケット遠心分離（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ－Ｒｏｂａｔｅｌ Ｍｏｄｅｌ ＲＡ２０ＶｘＲ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｂａｓｋｅｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｒｏｂａｔｅｌ Ｉｎｃ， Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）後の濾液３７５ｍＬに以下の表４にて詳述された量で塩化カルシウム及びリン酸塩（二塩基性リン酸カリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含む）を加えた。
【0203】
【表3】
【0204】
濾液を室温で１５分間撹拌した。塩化カルシウム処理の後、１３ｍＬの画分を取り、卓上遠心分離機（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｍｏｄｅｌ ６１４Ｂ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｄｒｕｃｋｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ，Ｐｏｒｔ Ｍａｔｉｌｄａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で遠沈した。上清の色彩及びペレット画分の重量を測定した。図８は塩化カルシウムとリン酸塩の添加及びおよそ５分間の卓上遠心分離の後の画分の試料を示す。図８に示すように、画分４は優れたクロロフィル除去を示した。図８に示すように、画分５は白色ペレット（内容は不明）を含有した一方で、上清は相対的にクロロフィルで満たされたままだった。理論によって束縛されることを望まないで、結果は塩化カルシウムが７５ｍＭの濃度でクロロフィルを効果的に除去するのにリン酸塩が必要であることを示唆してもよい。また図８に示すように、ｐＨ７．５で溶解された画分６は画分４と比べて相対的に少ないクロロフィル除去を示した。理論によって束縛されることを望まないで、結果は塩化カルシウムがさらに高いｐＨではあまり効果的ではないことを示唆してもよい。
【0205】
次いで標準的な手順によって、溶解物の残部を活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）及びキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で処理した。活性炭・キトサンを遠沈し、２枚のコーヒーフィルターを介して上清をさらに濾過した。上清の色彩に留意した。図９は活性炭とキトサンを除去した後の画分１～６の試料を示す。図９に示すように、キトサン及び活性炭は塩化カルシウム及びリン酸塩による前処理の後、適正に機能する。また図９に示すように、活性炭とキトサンによる色彩除去は画分６で最も効果的であったが、それは７５ｍＭの塩化カルシウムと１００ｍＭのリン酸塩を含有した。
【0206】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色分析を行って画分１、５、６及び７におけるＲｕＢｉｓＣｏを視覚化し、そのレベルを決定した。図１０はＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色分析の結果を示す。図１０は画分５～７についての卓上遠心分離後のペレット及び上清（「Ｓｕｐ」）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）の結果を示す。図１０に示すように、レーン９はクロロフィルが２５ｋＤａ前後のタンパク質に依然として結合していることを示す一方で、レーン６はクロロフィルが切り離されていることを示す。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果はクロロフィルに結合しているタンパク質がおよそ２５ｋＤａの（サブユニット）サイズを有することを示唆してもよい。また図１０に示すように、ＲｕＢｉｓＣｏは画分５、６及び７の上清における大部分である一方で、２５ｋＤａのクロロフィル結合タンパク質はペレットにおける大部分である。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果はリン酸塩を伴った塩化カルシウムはクロロフィル結合タンパク質を選択的に沈殿させ、ＲｕＢｉｓＣｏを溶液に残すことを示唆してもよい。
【0207】
理論によって束縛されることを望まないで、結果は、塩化カルシウムがバスケット遠心分離後の緑色濾液からクロロフィル及び細胞膜を効率的に取り除き、ＲｕＢｉｓＣｏの大部分は上清に残り、塩化カルシウムが誘導する沈殿は直ちに発生すると思われ、ならびに塩化カルシウムが２５ｋＤａのクロロフィル結合タンパク質を取り除くことを示すと考えられる。
【0208】
実施例７
この実施例は溶解物を濾過することからのタンパク質の回収に対する０．５％界面活性剤の効果及び下流のプロセス工程に対する界面活性剤の効果を検討した。
この実施例は溶解物を濾過することからのタンパク質の回収に対する０．５％界面活性剤の効果及び下流のプロセス工程に対する界面活性剤の効果を検討した。
【0209】
０．１ＭのＮａＣｌと０．１Ｍのリン酸塩（二塩基性リン酸カリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含む）と２％のメタ重亜硫酸塩とを含有する緩衝液で４ｋｇのバイオマスを溶解した（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）。２Ｌの溶解物を１０％のＣｈａｐｓ溶液（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）２００ｍＬと混合した後、溶解物にて０．５％の濃度を得た。次いでこれを約１０分間混合し、バスケット遠心分離機（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ－Ｒｏｂａｔｅｌ Ｍｏｄｅｌ ＲＡ２０ＶｘＲ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｂａｓｋｅｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｒｏｂａｔｅｌ Ｉｎｃ，Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で遠沈した。残りの溶解物に２００ｍＬの水を加え、希釈倍率を補正した。
【0210】
双方の画分について３７５ｍＬ溶解物の画分を取り、１Ｍの塩化カルシウム緩衝液２８．１ｍＬを加え、７５ｍＭの濃度を得た。混合物を遠沈し、上清を比較した。対照上清を取り、５％の分岐のないキトサン（キトサン（１０～１２０ ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）量を加えた（０．７５ｇ～３７５ｍＬ）。溶液を５分間混合し、その後、１３ｍＬの小試料を取り、卓上遠心分離機（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｍｏｄｅｌ ６１４Ｂ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｄｒｕｃｋｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬＬＣ，Ｐｏｒｔ Ｍａｔｉｌｄａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）で遠沈した。上清のｐＨを７．２に上げ、残りのキトサン及び十分な色彩除去をチェックした。別の０．７５ｇを元々の溶液に加え、合計１０％の分岐のないキトサン（３７５ｍＬにて１．５ｇ）を得た。色彩除去が十分であり、過剰なキトサンが観察されるまでこれを繰り返した。これが観察されるキトサンの％は１０％だった。２５％のＡＣ及び１０％のキトサンを双方の画分に加え、遠心分離機で遠沈した。
【0211】
図１１は種々の試料でのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を示す。図１１に示すように、界面活性剤は濾液でのＲｕＢｉｓＣｏを有意に増やすことはなく、どちらの画分でも活性炭・キトサンのペレットにＲｕＢｉｓＣｏがあるようには見えない。
【0212】
【0213】
理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は、Ｃｈａｐｓによる処理が溶解の間にさらに多くのＲｕＢｉｓＣｏを有意に放出することはないが、Ｃｈａｐｓによる処理は溶解の間にさらに多くの量のポリフェノール及び／またはポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）を放出することを示唆してもよい。また、理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は、２５％活性炭及び５％キトサンはいずれの画分でも色彩を有意に取り除かなかったことを示唆してもよい。
【0214】
実施例８
この実施例は塩化カルシウムのベースライン実行、０．１％ＣＨＡＰＳによる濾塊の再懸濁、及び０．１％ＣＨＡＰＳによる第２の濾塊の洗浄に関する。
この実施例は塩化カルシウムのベースライン実行、０．１％ＣＨＡＰＳによる濾塊の再懸濁、及び０．１％ＣＨＡＰＳによる第２の濾塊の洗浄に関する。
【0215】
０．２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＰＯ4 ｐＨ７．7、２％メタ重亜硫酸塩、（ｋｇあたりのレシピ：５ＭのＮａＣｌを２０ｍＬ、１ＭのＮａＯＨを１１５ｍＬ、Ｈ2Ｏを１１５ｍＬ、１ＭのＰＯ４緩衝液ｐＨ７．６を５０ｍＬ、２００ｇの氷）を含む抽出緩衝液で２ｋｇのバイオマスを溶解した（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）。２ｋｇを最終的に３つの画分に分けた。画分１については、Ｖｉｔａｍｉｘによる溶解の後、７５ｍＭの塩化カルシウムを加え、１０分間手動で混合した一方で、ｐＨを厳重に監視した。次いでそれをバスケット遠心分離機（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ－Ｒｏｂａｔｅｌ Ｍｏｄｅｌ ＲＡ２０ＶｘＲ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｂａｓｋｅｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｒｏｂａｔｅｌ Ｉｎｃ，Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって遠沈し、画分を濾液として回収した。画分２の調製は２Ｌの再懸濁緩衝液（７０ｍＭのＰＯ4 ｐＨ７．２，０．１ＭのＮａＣｌ，０．１％のＣＨＡＰＳ）にバスケット遠心分離濾塊を再懸濁することを含んだ。次いでスラリーをＶｉｔａｍｉｘで混合し、濾液（画分２）及び濾塊をバスケット遠心分離によって分離した。画分２に酷似して、画分３はバスケット遠心分離濾塊を１Ｌの再懸濁緩衝液に再懸濁することによって調製した。スラリーを手動で混合し、バスケット遠心分離の前に１０分間静置した。５０ｇの活性炭を加え、１５分間混合し、それに続いて３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）２０ｇを加え、画分ごとにさらに５分間混合した。次いで溶液を遠沈し、０．２ｕｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を介して精密濾過した。最後に、５０ｋＤａの限外濾過（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０５０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で溶液を濃縮し、塩分濃度が０．１ｐｐｔを下回るまで（約１０ＬのｄＨ2Ｏ）透析濾過した。最後の工程は１０ｋＤａの限外濾過（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０１０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）であり、その後凍結乾燥した。対照／濾塊の再懸濁／第２の洗浄のプロセスの間に使用したパラメーターを表５に提供する。
【0216】
【表4】
【0217】
バスケット遠心分離の後、画分２及び画分３は画分１と比べてさらに深い緑色を有した。しかしながら、精密濾過の後、画分３はほぼ無色であり、画分２は画分１よりも明るい色彩だった。図１３は種々の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示し、その際、「Ｆ１」は「画分１」を指し、「Ｆ２」は「画分２」を指し、「Ｆ３」は「画分３」を指す。「ＡＣ－Ｃ」は「活性炭・キトサン」を指し、「ｓｕｐ」は「上清」を指し、「Ｒｕｂｉ」は「ＲｕＢｉｓＣｏ」を指す。可溶性粗タンパク質のバイオマスにおける可溶性総タンパク質含量に基づいて９４．２５％の収率が観察された。
【0218】
実施例９
この実施例は塩化カルシウム、増加したリン酸塩、及び０．２５％のＣＨＡＰＳ界面活性剤による処理を検討した。
この実施例は塩化カルシウム、増加したリン酸塩、及び０．２５％のＣＨＡＰＳ界面活性剤による処理を検討した。
【0219】
合計６ｋｇのバイオマスを処理した（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）。６ｋｇを２ｋｇのバッチ３つに分け、３つの実験分画を実行した。画分１は０．２ＭのＮａＣｌと０．１Ｍのリン酸塩（二塩基性リン酸カリウム及び一塩基性リン酸カリウムを含む）、ｐＨ７．７と２％のメタ重亜硫酸塩（ｋｇあたりのレシピ：５ＭのＮａＣｌを２０ｍＬ、１ＭのＮａＯＨを１２０ｍＬ、Ｈ2Ｏを１１０ｍＬ、１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．６を５０ｍＬ、２００ｇの氷）とを含む抽出緩衝液にて溶解した。
【0220】
溶解は出力５でのＶｉｔａｍｉｘｉｎｇで３分間実行した。画分２は画分１と同じ方法で溶解したが、抽出緩衝液はさらに多くのリン酸塩（ｋｇあたりのレシピ：５ＭのＮａＣｌを２０ｍＬ、１ＭのＮａＯＨを１２０ｍＬ、Ｈ2Ｏを７７ｍＬ、１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．６を８３ｍＬ、２００ｇの氷）を含有した。画分３は最終濃度０．２５％のＣＨＡＰＳ界面活性剤（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を加えたことを除いて画分２と同じリン酸緩衝液で溶解した。溶解は画分１及び２と同じプロトコールを使用してＶｉｔａｍｉｘ Ｂｌｅｎｄｅｒにて発生した（若干の起泡を観察した）。
【0221】
濾液のｐＨを１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．３に合わせ、決してｐＨ６．８を下回らないようにした。溶解した後、７５ｍＭの塩化カルシウムを加え、手動で１０分間混合した一方で、ｐＨを厳重に監視した。次いでそれをバスケット遠心分離機（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ－Ｒｏｂａｔｅｌ Ｍｏｄｅｌ ＲＡ２０ＶｘＲ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｂａｓｋｅｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｒｏｂａｔｅｌ Ｉｎｃ，Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって遠沈し、濾液を回収した。画分２の調製は２Ｌの再懸濁緩衝液（７０ｍＭのＰ０４ ｐＨ７．２，０．１ＭのＮａＣｌ，０．１％のＣＨＡＰＳ）にバスケット遠心分離濾塊を再懸濁することから成った。次いでスラリーをＶｉｔａｍｉｘで１分間混合し、濾液（画分２）と濾塊をバスケット遠心分離によって分離した。画分２に酷似して、１Ｌの再懸濁緩衝液にバスケット遠心分離濾塊を再懸濁することによって画分３を調製した。スラリーを手動で混合し、バスケット遠心分離の前に１０分間静置した。５０ｇの活性炭を加え、１５分間混合し、それに続いて３％のキトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）２０ｇを加え、画分ごとにさらに５分間混合した。次いで溶液を遠沈し、０．２μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を介して精密濾過した。最後に、５０ｋＤａの限外濾過（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０５０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で溶液を濃縮し、塩分濃度が０．１ｐｐｔを下回るまで（約１０ＬのｄＨ2Ｏ）透析濾過した。最後の工程は１０ｋＤａの限外濾過（ＭＩＮＩＫＲＯＳ（登録商標）Ｓ０２－Ｅ０１０－０５－Ｎ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）であり、その後凍結乾燥した。対照／画分２／画分３のプロセスの間に使用したパラメーターを表６に提供する。
【0222】
【表5】
【0223】
画分２はバスケット遠心分離の後、画分１よりもやや黒っぽく、画分３はバスケット遠心分離の後、有意に深緑色だった。画分２及び３の双方はバスケット遠心分離の後、画分１と比べてさらに濁っていた。画分３の体積は４．８Ｌであったが、体積を増やす空気の明らかな増量のせいでそれを３．４Ｌとして扱った。濾液の体積は処理する前にすべて２．５Ｌに減らした。したがって、画分１の８９％、画分２の１００％及び画分３の９６％を実際に使用した。
【0224】
図１４は種々の試料についてのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示し、その際、「Ｆ１」は「画分１」を指し、「Ｆ２」は「画分２」を指し、「Ｆ３」は「画分３」を指し、「ＡＣ－Ｃ」は「活性炭・キトサン」を指し、「ｓｕｐ」は「上清」を指す。バイオマスにおける可溶性総タンパク質含量に基づく収率は以下のとおりだった：対照、８０．６９％；画分２：８９．４３％；画分３：９５．２０％
【0225】
実施例１０
この実施例は熱浴を使用しないクロロフィル除去に対するキトサン濃度の効果を検討した。
この実施例は熱浴を使用しないクロロフィル除去に対するキトサン濃度の効果を検討した。
【0226】
２％メタ重亜硫酸塩と１０ｍＭのＥＤＴＡと０．１ＭのＮａＣｌとを含む抽出緩衝液で２ｋｇのバイオマスを溶解した（Ｖｉｔａｍｉｘ Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）。濾液から５つの画分を作り、すべて３７５ｍＬの体積を有した。画分をすべて速度４で混合し、遠心分離（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ ｒｏｔｏｒ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）はすべての画分で行い、工程を５２００ｇ及び５分間に設定した。濾過については、コーヒーフィルターを使用し、それに続いてＤＥ（Ｄｉｃａｌｉｔｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ，Ｂａｌａ Ｃｙｎｗｙｄ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）でコーティングした０．４５μｍカットオフのフィルターシート（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）付きのブフナー漏斗を使用した。
【0227】
画分１：次いで１５ｇの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を画分に加え、１５分間混合した。それに続いて１％キトサン（キトサン（１０～１２０ｃｐｓ），真菌起源（９０１２－７６－４）；Ｇｌｅｎｔｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．，Ｃｏｒｓｈａｍ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）１５ｇを加え、さらに５分間混合した。溶液を遠心分離し（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ１５Ｒ，ＳＸ４７５０ ｒｏｔｏｒ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、次いで濾過した（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）。
【0228】
画分２：次いで１５ｇの活性炭を画分に加え、１５分間混合した。それに続いて２％のキトサン１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0229】
画分３：次いで１５ｇの活性炭を画分に加え、１５分間混合した。それに続いて３％のキトサン１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0230】
画分４：次いで１５ｇの活性炭を画分に加え、１５分間混合した。それに続いて４％のキトサン１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。
【0231】
画分５：次いで１５ｇの活性炭を画分に加え、１５分間混合した。それに続いて５％のキトサン１５ｇを加え、さらに５分間混合した。次いで溶液を遠心分離し、次いで濾過した。しかしながら、誤りがあり、キトサンの添加後タイマーを開始させなかった。したがって、画分５についての結果は他の画分と比較しなかった。
【0232】
模式的変数の概要
・キトサンの範囲：１％～５％
・リン酸緩衝液なし
・１００％活性炭混合の１５分とそれに続くキトサン混合の５分
・キトサンの範囲：１％～５％
・リン酸緩衝液なし
・１００％活性炭混合の１５分とそれに続くキトサン混合の５分
【0233】
図１５はブフナー漏斗による精密濾過後の画分１～５を示す。図１５に示すように、画分２、３及び４では色彩は見たところ等しく除かれた。理論によって束縛されることを望まないで、画分１と画分２の間での比較は１％キトサンが２％キトサンほど効果的にクロロフィルを取り除かなかったことを示唆している。図１５に示すように、画分１～４と比べて活性炭及びキトサンにおよそ２～４分間さらに曝露された画分５は画分１～４よりも透明だった。
【0234】
理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果はキトサンの２％溶液による処理がキトサンの３％溶液またはキトサンの４％溶液による処理と同様に近似して機能することを示唆してもよい。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は、例えば、キトサンの５％溶液による処理及び活性炭とキトサンへのさらに長い曝露時間による処理もクロロフィル除去を改善してもよいことを示唆してもよい。
【0235】
実施例１１
この実施例は、活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）の代わりに、またはそれと併せた、キトサン後の溶解物から着色化合物を取り除くための活性化ベントナイト粘土（ＥＰ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｌａｙｓ由来のＣＣ１６０）の使用を検討した。
新鮮な上清（抽出プロセスにおけるキトサン後の遠沈）を得て、そのｐＨをＮａＯＨで７．０に合わせた。Ｐｉｅｒｃｅアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定し、［タンパク質］とオレンジ脱色の量についての出発点を決定した。当業者が理解するように、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬は総タンパク質濃度を測定するのに使用することができる。理論によって束縛されることを望まないで、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイは６６０ｎｍで測定される色素の吸収極大で変化を引き起こすタンパク質への色素・金属錯体の結合に基づくと考えられる。色素・金属錯体は赤茶色であり、タンパク質結合の際、緑色に変化し、アッセイで生じた色彩はタンパク質濃度の増大に比例して増える。１００ｍＬの試料に０．３％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を加えた。混合物を１分間撹拌し、その後、０．４５μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、それに続いて０．２μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を備えたブフナー漏斗に直接注ぎ、真空を使用してフラスコに濾液を回収した。Ｐｉｅｒｃｅアッセイによって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した。別個の１００ｍＬ試料に０．３％ｗ／ｖのＣＣ１６０粘土を加えた。混合物を１分間撹拌し、その後、０．４５μｍフィルターとそれに続く０．２μｍフィルターを備えたブフナー漏斗に直接注ぎ、真空を使用してフラスコに濾液を回収した。Ｐｉｅｒｃｅアッセイによって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した。
この実施例は、活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）の代わりに、またはそれと併せた、キトサン後の溶解物から着色化合物を取り除くための活性化ベントナイト粘土（ＥＰ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｌａｙｓ由来のＣＣ１６０）の使用を検討した。
新鮮な上清（抽出プロセスにおけるキトサン後の遠沈）を得て、そのｐＨをＮａＯＨで７．０に合わせた。Ｐｉｅｒｃｅアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定し、［タンパク質］とオレンジ脱色の量についての出発点を決定した。当業者が理解するように、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬は総タンパク質濃度を測定するのに使用することができる。理論によって束縛されることを望まないで、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイは６６０ｎｍで測定される色素の吸収極大で変化を引き起こすタンパク質への色素・金属錯体の結合に基づくと考えられる。色素・金属錯体は赤茶色であり、タンパク質結合の際、緑色に変化し、アッセイで生じた色彩はタンパク質濃度の増大に比例して増える。１００ｍＬの試料に０．３％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を加えた。混合物を１分間撹拌し、その後、０．４５μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、それに続いて０．２μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を備えたブフナー漏斗に直接注ぎ、真空を使用してフラスコに濾液を回収した。Ｐｉｅｒｃｅアッセイによって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した。別個の１００ｍＬ試料に０．３％ｗ／ｖのＣＣ１６０粘土を加えた。混合物を１分間撹拌し、その後、０．４５μｍフィルターとそれに続く０．２μｍフィルターを備えたブフナー漏斗に直接注ぎ、真空を使用してフラスコに濾液を回収した。Ｐｉｅｒｃｅアッセイによって光学密度を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した。
【0236】
表７で引用したようにさまざまな濃度のＣＣ１６０粘土を使用して試料にて前述の手順を繰り返した。表７は処理及び濾過の前後での活性炭または粘土の濃度及び４７４ｎｍでの吸光度を列挙する。
【表6】
【0237】
理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は活性炭の方がベントナイト粘土よりもポリフェノールを除去するのに優れていることを示唆してもよい。
【0238】
実施例１２
この実施例は活性炭の代わりに樹脂を使用することができるかどうかを検討した。
この実施例は活性炭の代わりに樹脂を使用することができるかどうかを検討した。
【0239】
新鮮な上清（抽出プロセスにおけるキトサン後の遠沈）を得て、ＮａＯＨを使用してそのｐＨを７．０に高めた。Ｐｉｅｒｃｅアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって出発光学密度（「ＯＤ」）を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ ＵＶ－１７００；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。１００ｍＬの試料に０．３％ｗ／ｖの活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を加えた。混合物を１分間撹拌し、ブフナー漏斗にて０．４５μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）とそれに続く０．２μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を通して流し、フラスコに濾液を回収した。光学密度測定のために試料を回収した。さらなる１００ｍＬの試料に、表８で示した量（％ｗ／ｖ）の樹脂を加え、各試料について混合物を表８で示した時間撹拌し、その後、混合物をブフナー設定に注いだ。各試料について光学密度を測定した。
【0240】
【表7】
【0241】
実施例の態様は、考えられる最高のＰｉｅｒｃｅアッセイ読み取りを維持し、タンパク質濃度に相関しながらオレンジＯＤが最低である結合の時間と濃度を決定することだった。これは、Ｐｉｅｒｃｅ比線と４７４比線との間の最大分離によってグラフで見ることができる。最大分離がある実験群は１０分間で２０％であり、タンパク質の８３％はＰｉｅｒｃｅアッセイによって保持され、オレンジ色は３３％に減った。
【0242】
実施例１３
この実施例は活性炭と比べた、着色化合物を除去することでの樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＭＮ２００；Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｉｎｇｓ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の有効性を検討した。
この実施例は活性炭と比べた、着色化合物を除去することでの樹脂（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＭＮ２００；Ｐｕｒｏｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｉｎｇｓ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の有効性を検討した。
【0243】
新鮮な上清（抽出プロセスにおけるキトサン後の遠沈）を得て、そのｐＨをＮａＯＨで７．０に高めた。Ｐｉｅｒｃｅアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって出発光学密度（「ＯＤ」）を測定し、４７４ｎｍでの吸光度を測定した（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ ＵＶ－１７００；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）。１００ｍＬの試料に０．３％の活性炭（Ｃａｂｏｔ Ｎｏｒｉｔ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｔｅｘａｓ）を加えた。混合物を１分間撹拌し、ブフナー漏斗にて０．４５μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．４５ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）とそれに続く０．２μｍのフィルター（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜フィルター，０．２ミクロン；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ，Ｋｅｎｔ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を通して流し、フラスコに濾液を回収した。光学密度測定のために試料を回収した。さらなる１００ｍＬの試料に、表９で示した量の樹脂を加え、各試料について混合物を表８で示した時間撹拌し、その後、混合物をブフナー設定に注いだ。各試料について光学密度を測定した（７１０ｎｍでのＰｉｅｒｃｅ；４７４ｎｍでのＡｂｓ）。
【0244】
【表8】
【0245】
理論によって束縛されることを望まないで、１％活性炭、１分の群に見られるＰｉｅｒｃｅＯＤ比とオレンジＯＤ比の間の大きなギャップは、これが以前の試験では観察されなかったので誤りであってもよいと考えられる。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は活性炭の方が色彩を除去することにおいて調べた樹脂よりも効率的であるが、活性炭はＰｉｅｒｃｅアッセイに基づいてさらに多くの窒素化合物を取り除くことを示唆してもよい。
【0246】
実施例１４
最終的な植物タンパク質粉末を脱イオン水で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈した。ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して試料を分析した。その後、分子量標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を流して目的の試料における個々のタンパク質及びタンパク質複合体の分子サイズを概算した。図１６は最終タンパク質産物及びタンパク質標準のクロマト図を示す。クロマト図のタンパク質ピークの分析は、分子量タンパク質標準で測定したとき６７０ｋＤａに近いが、それを下回る分子量で目的のタンパク質（ＲｕＢｉｓＣｏ）がカラムから溶出されることを示した。
最終的な植物タンパク質粉末を脱イオン水で１０ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈した。ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を使用して試料を分析した。その後、分子量標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を流して目的の試料における個々のタンパク質及びタンパク質複合体の分子サイズを概算した。図１６は最終タンパク質産物及びタンパク質標準のクロマト図を示す。クロマト図のタンパク質ピークの分析は、分子量タンパク質標準で測定したとき６７０ｋＤａに近いが、それを下回る分子量で目的のタンパク質（ＲｕＢｉｓＣｏ）がカラムから溶出されることを示した。
【0247】
実施例１５
この実施例はＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を使用し、クマシー染色を介してＬｅｍｎａ植物タンパク質の純度及び複雑性を視覚化した。最終精製タンパク質産物の植物タンパク質抽出物の小試料を４～１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。タンパク質の視覚化はクマシー色素を利用してゲルにてタンパク質を青色に染色することによって行った。図１７はＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は最終タンパク質産物が主としてＲｕｂｉｓｃｏ酵素から成り、Ｒｕｂｉｓｃｏの個々の大小のサブユニットは変性条件下及び還元条件下にてＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色によって容易に検出できることを示唆していると考えられる。
この実施例はＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を使用し、クマシー染色を介してＬｅｍｎａ植物タンパク質の純度及び複雑性を視覚化した。最終精製タンパク質産物の植物タンパク質抽出物の小試料を４～１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で分析した。タンパク質の視覚化はクマシー色素を利用してゲルにてタンパク質を青色に染色することによって行った。図１７はＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。理論によって束縛されることを望まないで、これらの結果は最終タンパク質産物が主としてＲｕｂｉｓｃｏ酵素から成り、Ｒｕｂｉｓｃｏの個々の大小のサブユニットは変性条件下及び還元条件下にてＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色によって容易に検出できることを示唆していると考えられる。
【0248】
実施例１６
この実施例はクロロフィル、ポリフェノール及び分光分析によって特徴づけられ、定量されるような他の光吸収分子の除去を検討した。精製プロセスの各工程の試料を、精製プロセスを介して分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ ＵＶ－１７００；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって特徴づけた。試料を１１００ｎｍから２４５ｎｍに下って走査した。図１８は吸光度スペクトルを示す。画分１のピーク（「Ｆ１」）は最初の液体／固体分離工程後の濾液から検出されたシグナルに相当する。画分４のピーク（「Ｆ４」）は０．２μｍの精密濾過後に採取された試料に相当する。理論によって束縛されることを望まないで、走査分光光度計から検出された吸光度ピークはプロセス全体を通しての光吸収分子の効率的な除去を示したと考えられる。
この実施例はクロロフィル、ポリフェノール及び分光分析によって特徴づけられ、定量されるような他の光吸収分子の除去を検討した。精製プロセスの各工程の試料を、精製プロセスを介して分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ ＵＶ－１７００；Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって特徴づけた。試料を１１００ｎｍから２４５ｎｍに下って走査した。図１８は吸光度スペクトルを示す。画分１のピーク（「Ｆ１」）は最初の液体／固体分離工程後の濾液から検出されたシグナルに相当する。画分４のピーク（「Ｆ４」）は０．２μｍの精密濾過後に採取された試料に相当する。理論によって束縛されることを望まないで、走査分光光度計から検出された吸光度ピークはプロセス全体を通しての光吸収分子の効率的な除去を示したと考えられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】