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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-26
(54)【発明の名称】造血の完全なアブレーションを誘導するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20220915BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20220915BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220915BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20220915BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220915BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220915BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220915BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220915BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20220915BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220915BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220915BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
C07K14/47 ZNA
C12N15/12
C12N5/0789
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
A61K47/68
A61K47/54
A61K31/7088
A61K31/7105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022502383
(86)(22)【出願日】2020-07-17
(85)【翻訳文提出日】2022-02-15
(86)【国際出願番号】 EP2020070244
(87)【国際公開番号】W WO2021009336
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】19305948.2
(32)【優先日】2019-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】515028470
【氏名又は名称】フォンダシオン・イマジネ
【氏名又は名称原語表記】ＦＯＮＤＡＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＥ
(71)【出願人】
【識別番号】591140123
【氏名又は名称】アシスタンス ピュブリク－オピトー ドゥ パリ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ － ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
(71)【出願人】
【識別番号】520053762
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ
(71)【出願人】
【識別番号】510139564
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ポール サバティエ トゥールーズ トロワ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ラグレル－ペイルー，シャンタル
(72)【発明者】
【氏名】オリション，オーレリアン
(72)【発明者】
【氏名】シャーデク－ロック，ハネム
(72)【発明者】
【氏名】アンドレ，イザベル
(72)【発明者】
【氏名】カヴァッツァーナ，マリナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA07
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086ZB26
4C086ZB27
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045EA24
(57)【要約】
本発明者らは、臨床症状がＲＤ ＳＣＩＤ形態と重複するが、しかし、ＡＫ２変異及び難聴を欠く３名の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者において、ＲＡＣ２遺伝子（Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２（ＲＡＣ２）をコードする）中で常染色体優性（ＡＤ）ミスセンス変異を同定した。生化学的アッセイ及びインビトロ分化アッセイを使用し、本発明者らは、ＲＡＣ２変異が細胞分化能における障害ならびに細胞及びミトコンドリアネットワークにおける欠損に密接に関連していることを実証した。全体として、このデータによって、ＲＡＣ２タンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ結合部位中の優性機能獲得（ＧＯＦ）変異がＨＳＰＣ分化を阻害し、ＲＤの臨床症状を伴うＳＣＩＤの重度ＡＤ形態に導くことが実証される。したがって、この結果によって、造血系列における同定されたＲＡＣ２ムテインの導入が、造血の完全なアブレーションを誘導するために適切でありうることを考慮するように促された。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とする患者において造血を完全にアブレーションする方法であって、患者に治療有効量のｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項2】
造血幹細胞の集団の増殖及び分化を阻害するための方法であって、前記集団に有効量のｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを接触させることを含む方法。
【請求項3】
造血細胞の集団の細胞死を誘導する方法であって、前記集団に有効量のｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを接触させることを含む方法。
【請求項4】
悪性造血細胞の集団の細胞死を誘導する方法であって、前記集団に有効量のｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを接触させることを含む方法。
【請求項5】
それを必要とする患者において造血細胞悪性病変を処置する方法であって、患者に治療有効量のｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを含む方法。
【請求項6】
骨髄移植に対して患者を準備（即ち、前処置）するための、請求項１、２、又は３に記載の方法。
【請求項7】
骨髄移植が造血幹細胞移植である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
造血細胞悪性病変が、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項9】
造血細胞悪性病変が、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；骨髄増殖性疾患、例えば真性赤血球増加症（即ち、ＰＶ、ＰＣＶ、又は真性一次性赤血球増加症（ＰＲＶ））、本態性血小板血症（ＥＴ）、骨髄線維症など；ならびに骨髄異形成症候群及び骨髄増殖性疾患の両方の特色を伴う疾患、例えば慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病（ａＣＭＬ）、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項10】
１２位のアミノ残基（Ｇ）が置換されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
１２位のアミノ残基（Ｇ）がアミノ酸残基（Ｒ）により置換されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
本発明のポリヌクレオチドがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ポリヌクレオチドがベクター中に挿入されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、レクチン、糖、ビタミン、補因子、及び薬物からなる群より選択される少なくとも１つの他の分子に結合している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、造血細胞について特異的な親和性を有する分子、例えば造血幹細胞の表面で発現されるタンパク質について結合親和性を有する抗体又はペプチドなどに結合されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドがリピドイドを用いて製剤化されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化されている、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
【0002】
本発明は、血液学の分野における。
【0003】
発明の背景
【0004】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、多様な悪性及び非悪性の造血器疾患のための潜在的に根治的な治療アプローチである。ＨＳＣＴが悪性障害を伴う患者において実施される場合、準備又は前処置(conditioning)レジメンが手順の一部として投与され、３つの目標を達成する：骨髄中にスペースを作る（骨髄破壊）、移植片の拒絶反応を防止するために十分な免疫破壊を提供する、及び腫瘍負荷を低下させる。前処置レジメンの強度は大幅に変動し、最適な前処置レジメンを任意の所与の患者について選択する場合、疾患関連因子、例えば診断及び寛解状態など、ならびに患者関連因子（年齢、ドナーの利用可能性、及び合併症の存在を含む）を考慮する必要がある。完全なコンセンサスにはＨＣＴ学会内では達していないが、前処置レジメンは高用量（骨髄破壊的）、低下した強度、及び非骨髄破壊的として分類されている。例えば、骨髄破壊的な、又は「高用量」のレジメンは、全身照射を伴う、又は伴わないアルキル化剤（単剤又は多剤）からなり、造血を破壊し、自己血液学的回復を可能にしないことが予想される。前処置レジメンの投与は、即時及び遅発性の毒性に関連付けられる。例えば、嘔気、嘔吐、一過性の急性耳下腺炎、口腔乾燥、粘膜炎、及び下痢は、一般に観察される急性合併症である。間質性肺炎、特発性肺線維症、及び低下した肺機能が観察されうる。洞不全症候群（また、肝臓の静脈閉塞性疾患として公知である）の発生は、化学療法に基づくレジメンにおいてより一般的である。長期的な副作用は、不妊症、白内障形成、甲状腺機能低下症及び甲状腺炎、ならびに二次悪性病変を含む。したがって、短期及び長期の重度副作用の最小限の発生を伴う、造血の完全なアブレーションを可能にする新たな方法についての必要性がある。
【0005】
ＲＡＣ２は、低分子量ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのＲａｃサブファミリーに属する。不活性なＧＤＰ結合状態では、ＲＡＣ２は細胞質内に局在する。グアニンヌクレオチド交換因子による刺激及び活性化時に、活性なＲＡＣ２－ＧＴＰ結合形態は細胞膜に移動する。そこで、ＲＡＣ２は、ＧＴＰが加水分解される、又はＧＴＰａｓｅが細胞により分解されるまで、種々のシグナル伝達経路の引き金となる７－９。Ｒａｃサブファミリーの他のメンバー（ＲＡＣ１及びＲＡＣ３）とは異なり、ＲＡＣ２の発現は造血系列に制限されている１０，１１。
【0006】
発明の要約
【0007】
特許請求の範囲により定義するように、本発明は、造血の完全なアブレーションを誘導するための方法ならびに骨髄移植のための前処置及び造血細胞悪性病変の処置におけるその使用に関する。
【0008】
発明の詳細な説明
【0009】
本発明者らは、臨床症状がＲＤ ＳＣＩＤ形態と重複するが、しかし、ＡＫ２変異及び難聴を欠く３名の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者において、ＲＡＣ２遺伝子（Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２（ＲＡＣ２）をコードする）中で常染色体優性（ＡＤ）ミスセンス変異を同定している。生化学的アッセイ及びインビトロ分化アッセイを使用し、本発明者らは、ＲＡＣ２変異が細胞分化能における障害ならびに細胞及びミトコンドリアネットワークにおける欠損に密接に関連していることを実証した。全体として、このデータによって、ＲＡＣ２タンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ結合部位中の優性機能獲得（ＧＯＦ）変異がＨＳＰＣ分化を阻害し、ＲＤの臨床症状を伴うＳＣＩＤの重度ＡＤ形態に導くことが実証される。したがって、この結果によって、造血系列における同定されたＲＡＣ２ムテインの導入が、造血の完全なアブレーションを誘導するために適切でありうることを考慮するように促された。
【0010】
本発明の第１の目的は、それを必要としている患者において造血を完全にアブレーションする方法であって、ｉ）１２位のアミノ酸残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ酸残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療的有効量を患者に投与することを含む方法に関する。
【0011】
本発明のさらなる目的は、造血幹細胞の集団の増殖及び分化を阻害する方法であって、前記集団を、ｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量と接触させることを含む方法に関する。
【0012】
本発明のさらなる目的は、造血細胞の集団の細胞死を誘導する方法であって、前記集団を、ｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量と接触させることを含む方法に関する。
【0013】
本発明のさらなる目的は、悪性造血細胞の集団の細胞死を誘導する方法であって、前記集団を、ｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量と接触させることを含む方法に関する。
【0014】
本発明のさらなる目的は、それを必要としている患者において造血細胞悪性病変を処置する方法であって、ｉ）１２位のアミノ酸残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はｉｉ）１２位のアミノ酸残基（Ｇ）が変異している、配列番号１において示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療的有効量を患者に投与することを含む方法に関する。
【0015】
本明細書中で使用するように、用語「造血細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、造血系の任意の型の細胞を指し、未分化細胞、例えば造血幹細胞及び前駆細胞など、ならびに分化細胞、例えば、白血球（例えば、顆粒球、単球、及びリンパ球）、血小板、及び赤血球を含むが、それらに限定されない。
【0016】
本明細書中で使用するように、用語「造血幹細胞」又は「ＨＳＣ」は、自己複製するための、及び循環成熟血液細胞の前駆体に分化するための能力を有する血液細胞を指す。これらの前駆細胞は、自己複製することができない、及び循環成熟血液細胞に分化する未熟な血液細胞である。骨髄微小環境内では、幹細胞は自己複製し、生涯を通じて全ての成熟血球を生じさせる造血細胞の継続的産生を維持する。一部の実施形態では、造血前駆細胞又は造血幹細胞は、末梢血細胞から単離される。
【0017】
本明細書中で使用するように、用語「造血」は、幹細胞からの増殖及び／又は分化を含む造血細胞の形成及び発生を指す。
【0018】
典型的には、患者は、小児、若年成人、中年成人、及び高齢成人からなる群より選択される。
【0019】
一部の実施形態では、本発明の方法は、骨髄移植に対して患者を準備（即ち、前処置）するために特に適切である。したがって、本発明の方法は、化学療法及び放射線療法の使用を回避するために特に適切である。本発明の方法は、新たな血液幹細胞が成長するために骨髄を助けうるが、患者の身体が移植細胞を拒絶するのを防止し、身体中に存在しうる任意の癌細胞を死滅させるのを助ける。典型的には、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの投与は、骨髄移植前に実施される。
【0020】
本明細書中で使用されるように、用語「骨髄移植」又は「造血幹細胞移植」は互換的として考えるべきであり、レシピエントへの、特定の形態における造血幹細胞の移植を指す。造血幹細胞は、必ずしも骨髄から由来しなくてもよく、しかし、また、他の供給源、例えば臍帯血又は動員ＰＢＭＣなどから由来することができうる。本明細書中で使用するように、用語「造血幹細胞移植」又は「ＨＳＣＴ」は、広範な血液障害の処置の構成要素を指す。一般的に、２つの型のＨＳＣＴがある：自家移植及び同種移植。本明細書中で使用するように、用語「同種」は、同じ種から由来すること、同じ種に起源をもつこと、又は同じ種のメンバーであることを指し、ここでメンバーは遺伝的に関連している、又は遺伝的に関連していないが、しかし、遺伝的に類似している。「同種移植」は、ドナーからレシピエントへの細胞又は器官の移行を指し、ここでレシピエントはドナーと同じ種である。同種移植は、典型的には、レシピエントのＭＨＣと一致するドナーを使用したドナー幹細胞の注入を含む。本明細書中で使用するように、用語「自家」は、同じ患者から由来すること、又は同じ患者に起源をもつことを指す。「自家移植」は、患者自身の細胞又は器官の収集及び再移植を指す。
【0021】
癌である造血細胞悪性病変の例は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含む。白血病の例は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む。リンパ腫の例は、ホジキン病及びその亜型；非ホジキンリンパ腫及びその亜型（慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、毛状細胞白血病（ＨＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病（Ｂ－ＰＬＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症／リンパ形質性細胞リンパ腫、及び他のナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）又はＴ細胞リンパ腫を含む）を含む。造血細胞悪性病変である他の悪性状態の例は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）；骨髄増殖性疾患、例えば真性赤血球増加症など（即ち、ＰＶ、ＰＣＶ、又は真性一次性赤血球増加症（ＰＲＶ））、本態性血小板血症（ＥＴ）、骨髄線維症；ならびに骨髄異形成症候群及び骨髄増殖疾患の両方の特色を伴う疾患（例えば慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、非定型慢性骨髄性白血病（ａＣＭＬ）、及び骨髄異形成／骨髄増殖疾患など）を含む。
【0022】
特に、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）造血細胞悪性病変は、本明細書中に記載される変異により影響される。
【0023】
本明細書中で使用するように、用語「処置」又は「処置する」は、予防的又は防止的処置ならびに治癒的又は疾患修飾的処置の両方を指し、疾患に罹るリスクのある又は疾患に罹った疑いのある患者ならびに病気である、あるいは疾患又は医学的状態に苦しんでいると診断された患者の処置を含み、臨床再発の抑制を含む。この処置は、医学的障害を有する又は最終的に障害を獲得しうる患者に、障害又は再発障害の１つ以上の症状を防止する、治癒させる、その発症を遅延させる、その重症度を低下させる、又は寛解させるために、あるいはそのような処置の非存在において予想されるものを超えて患者の生存を延長させるために投与されうる。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば、治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に患者に高レベルの薬物を供給することである。導入レジメンは、「負荷レジメン」を（一部で又は全体で）用いてもよく、それは、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも大きな用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間に患者の維持のため、例えば、患者を長期間（月又は年）にわたり寛解状態に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続治療（例、例えば、毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与すること）又は間欠治療（例、中断処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の発現など］の達成時の処置）を用いてもよい。
【0024】
本明細書中で使用するように、用語「Ｒａｃ２」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２を指す。ヒトＲａｃ２についての例示的なアミノ酸配列を、配列番号１により表す。
配列番号１ ＞ｓｐ｜Ｐ１５１５３｜Ｒａｃ２＿ヒトＲａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝Ｒａｃ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＭＱＡＩＫＣＶＶＶＧＤＧＡＶＧＫＴＣＬＬＩＳＹＴＴＮＡＦＰＧＥＹＩＰＴＶＦＤＮＹＳＡＮＶＭＶＤＳＫＰＶＮＬＧＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬＳＹＰＱＴＤＶＦＬＩＣＦＳＬＶＳＰＡＳＹＥＮＶＲＡＫＷＦＰＥＶＲＨＨＣＰＳＴＰＩＩＬＶＧＴＫＬＤＬＲＤＤＫＤＴＩＥＫＬＫＥＫＫＬＡＰＩＴＹＰＱＧＬＡＬＡＫＥＩＤＳＶＫＹＬＥＣＳＡＬＴＱＲＧＬＫＴＶＦＤＥＡＩＲＡＶＬＣＰＱＰＴＲＱＱＫＲＡＣＳＬＬ
配列番号１ ＞ｓｐ｜Ｐ１５１５３｜Ｒａｃ２＿ヒトＲａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２ ＯＳ＝ホモサピエンス ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝Ｒａｃ２ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＭＱＡＩＫＣＶＶＶＧＤＧＡＶＧＫＴＣＬＬＩＳＹＴＴＮＡＦＰＧＥＹＩＰＴＶＦＤＮＹＳＡＮＶＭＶＤＳＫＰＶＮＬＧＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬＳＹＰＱＴＤＶＦＬＩＣＦＳＬＶＳＰＡＳＹＥＮＶＲＡＫＷＦＰＥＶＲＨＨＣＰＳＴＰＩＩＬＶＧＴＫＬＤＬＲＤＤＫＤＴＩＥＫＬＫＥＫＫＬＡＰＩＴＹＰＱＧＬＡＬＡＫＥＩＤＳＶＫＹＬＥＣＳＡＬＴＱＲＧＬＫＴＶＦＤＥＡＩＲＡＶＬＣＰＱＰＴＲＱＱＫＲＡＣＳＬＬ
【0025】
本明細書中で使用するように、用語「変異」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、置換、欠失、又は挿入を指す。用語「置換」は、特定の位置の特定のアミノ酸残基が除去され、別のアミノ酸残基が同じ位置中に挿入されることを意味する。用語「欠失」は、特定のアミノ酸残基が除去されることを意味する。用語「挿入」は、１つ以上のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基の前又は後に挿入されること、より具体的には、１つ以上の、好ましくは１つ又はいくつかのアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基のａ－カルボキシル基又はａ－アミノ基に結合されることを意味する。
【0026】
一部の実施形態では、１２位のアミノ酸残基（Ｇ）は置換されている。一部の実施形態では、１２位のアミノ酸残基（Ｇ）は、アミノ酸残基（Ｒ）により置換されている。
【0027】
本明細書中で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは修飾アミノ酸を含むことができる。この用語はまた、天然に又は介入により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合など。また、定義内に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、例えばホモシステイン、オルニチン、ｐ－アセチルフェニルアラニン、Ｄアミノ酸、及びクレアチンなどを含む）、ならびに当技術分野において公知である他の修飾を含むポリペプチドである。
【0028】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、又はそれらの混合物を含む）を指す。この用語は、分子の一次構造を指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。それはまた、例えば、アルキル化により、及び／又はキャッピングにより修飾された、及び非修飾形態のポリヌクレオチドを含む。特に、用語「ポリヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む）（スプライスされている又はスプライスされていないかを問わず）、プリン塩基又はピリミジン塩基のＮ又はＣグリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルフォリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー（ポリマーが、ＤＮＡ及びＲＮＡ中で見出されるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含むという条件で）を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡを含む。他の態様では、ｍＲＮＡは合成ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、合成ｍＲＮＡは少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。一部の実施形態では、特定のクラスの全ての核酸塩基が、非天然核酸塩基を用いて置換されている（例、本明細書中に開示されているポリヌクレオチド中の全てのウリジンが、非天然核酸塩基、例、５－メトキシウリジンを用いて置換することができる）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（例、合成ＲＮＡ又は合成ＤＮＡ）は、天然核酸塩基、即ち、合成ＤＮＡの場合におけるＡ、Ｃ、Ｔ、及びＧ、又は合成ＲＮＡの場合におけるＡ、Ｃ、Ｔ、及びＵだけを含む。
【0029】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。
【0030】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなど）中に挿入される。典型的には、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、又は感染性ウイルスであるウイルスベクターである。典型的には、本発明のベクターは「制御配列」を含み、それは、まとめて、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指し、それらは、まとめて、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、及び翻訳を提供する。これらの制御配列の全てが、選択されたコード配列が、適した宿主細胞において複製、転写、及び翻訳されることが可能である限り、常に存在する必要はない。別の核酸配列は「プロモーター」配列であり、それは、その通常の意味において本明細書中で使用され、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、ここで調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能である遺伝子に由来する。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（ここで、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、「抑制性プロモーター」（ここで、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、及び「構成性プロモーター」を含むことができる。
【0031】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、少なくとも１つの他の分子に結合させることができる。典型的には、前記分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、レクチン、糖、ビタミン、補因子、及び薬物からなる群より選択される。一部の実施形態では、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、造血細胞について特定の親和性を有する分子、例えば造血幹細胞の表面で発現されるタンパク質について結合親和性を有する抗体又はペプチドなどに結合される。結合によって、増加した安定性及び／又は半減期がもたらされ、造血細胞へポリペプチド又はポリヌクレオチドを標的化する際に特に有用でありうる。
【0032】
「治療的有効量」により、任意の医学的処置に適用可能である合理的な利益／リスク比率で、症状を処置又は低下させるために十分な量の有効成分を意味する。本発明の化合物及び組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の対象についての特定の治療的に有効な用量レベルは、多様な要因（処置されている障害及び障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；用いられる特定の化合物の投与の時間、投与の経路、及び排泄の率；処置の期間；活性成分との組み合わせにおいて使用される薬物；及び医学技術において周知の同様の要因を含む）に依存するであろう。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために要求されるレベルより低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることは十分に当技術分野の技能内である。しかし、産物の１日の投与量は、成人１名当たり１日当たり０．０１～１，０００mgの広い範囲にわたり変動されうる。典型的には、組成物は、処置される対象への投与量の症候調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg～約５００mgの活性成分、典型的には１mg～約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、１日当たり０．０００２mg/kg～約２０mg/kg体重、特に１日当たり約０．００１mg/kg～７mg/kg体重の投与量レベルで供給される。
【0033】
典型的には、本発明の活性成分（即ち、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）は、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、徐放性マトリックス、例えば生分解性ポリマーなどと組み合わせて、医薬的組成物を形成する。用語「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合、有害な、アレルギー性の、又は他の不快な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、任意の型の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を指す。
【0034】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、リピドイドを用いて製剤化される。リピドイドの合成は、広範に記載されている（Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454；Schroeder et al., J Intern Med. 2010 267:9-21；Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869；Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci US A. 2011 108:12996-3001を参照のこと）。これらのリピドイドは、齧歯類及び非ヒト霊長類において二本鎖低分子干渉ＲＮＡ分子を有効に送達するために使用されてきたが（Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569；Frank-Kamenetsky et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2008 105:11915-11920；Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879；Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869；Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010を参照のこと）、本開示は、ポリヌクレオチドの送達におけるそれらの製剤化及び使用を記載する。
【0035】
一部の実施形態では、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、又は脂質ナノ粒子を使用して製剤化される。
【0036】
リポソームは、主に脂質二重層で構成されうる人工的に調製された小胞であり、医薬製剤の投与のための送達媒体として使用することができる。リポソームは異なるサイズでありえ、例えば直径が数百ナノメートルでありうる、狭い水性区画により分離された一連の同心二重層を含むことができる多重膜小胞（ＭＬＶ）、直径が５０nmより小さくなりうる小単細胞小胞（ＳＵＶ）、及び直径が５０～５００nmの間でありうる大型単層小胞（ＬＵＶ）などでありえるが、それらに限定されない。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの付着を改善するために、又は事象、例えば、限定されないが、エンドサイトーシスなどを活性化するために、オプソニン又はリガンドを含むことができる。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低又は高ｐＨを含むことができる。非限定的な例として、リポソーム、例えば合成膜小胞などは、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１７７６３８、ＵＳ２０１３０１７７６３７、ＵＳ２０１３０１７７６３６、ＵＳ２０１３０１７７６３５、ＵＳ２０１３０１７７６３４、ＵＳ２０１３０１７７６３３、ＵＳ２０１３０１８３３７５、ＵＳ２０１３０１８３３７３、及びＵＳ２０１３０１８３３７２において記載されている方法、装置、及びデバイスにより調製される。一部の実施形態では、リポソームは、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）リポソーム、Marina Biotech（ワシントン州ボセル）からのＤｉＬａ２リポソーム、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ならびにＭＣ３（ＵＳ２０１００３２４１２０において記載されている）及び小分子薬物を送達することができるリポソーム（例えば、限定されないが、Janssen Biotech, Inc.（ペンシルバニア州ホーシャム）からのDOXIL（登録商標）など）から形成される。本発明のポリヌクレオチドのポリペプチドは、リポソームによりカプセル化することができる、及び／又は、次にリポソームによりカプセル化することができる水性コア中に含むことができる（国際公開番号ＷＯ２０１２０３１０４６、ＷＯ２０１２０３１０４３、ＷＯ２０１２０３０９０１、及びＷＯ２０１２００６３７８ならびに米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８９３５１、ＵＳ２０１３０１９５９６９、及びＵＳ２０１３０２０２６８４を参照のこと）。
【0037】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、以前に記載され、インビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチド送達のために適切であることが示されている安定化プラスミド－脂質粒子（ＳＰＬＰ）又は安定化核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を用いて製剤化される（Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281；Zhang et al. Gene Therapy. 1999 6:1438-1447；Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372；Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-1007；Zimmermann et al., Nature. 2006 441:111-114；Heyes et al. J Contr Rel. 2005 107:276-287；Semple et al. Nature Biotech. 2010 28:172-176；Judge et al. J Clin Invest. 2009 119:661-673；deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132；米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１２２１０４）。Wheelerらによる当初の製造方法は、洗剤透析方法であったが、それは後に、Jeffsらにより改善され、自発的小胞形成方法として言及される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチドの他に３～４の脂質成分で構成されている。一例として、リポソームは、限定されないが、５５%コレステロール、２０%ジステロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１０%ＰＥＧ－Ｓ－ＤＳＧ、及び１５%１，２－ジオレオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）を含むことができ、Jeffsらにより記載された通りである。別の例として、特定のリポソーム製剤は、限定されないが、４８%コレステロール、２０%ＤＳＰＣ、２%ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ、及び３０%カチオン性脂質を含み、カチオン性脂質は、１，２－ジステアロキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、ＤＯＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、又は１，２－ジリノレノキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）であることができ、Heyesらにより記載される通りである。
【0038】
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子、例えば国際公開番号ＷＯ２０１２１７０９３０において記載されているようなものの中に製剤化される。脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、脂質、特にイオン化可能なカチオン性脂質を含み、中性脂質、ステロール、及び粒子凝集を低下させることが可能な分子、例えば、ＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。脂質は、限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質及びアミノアルコール脂質より選択することができる。一部の実施形態では、脂質は、カチオン性脂質、例えば、限定されないが、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｄ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、及びアミノアルコール脂質などである。アミノアルコールカチオン性脂質は、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１５０６２５において記載される脂質でありうる、及び／又はそれにおいて記載される方法により作製されうる。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物１）；２－アミノ－３－［（９Ｚ）－オクタデク－９－エン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳＣ２０１３０１５０６２５における化合物２）；２－アミノ－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－［（オクチルオキシ）メチル］プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物３）；及び２－（ジメチルアミノ）－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１－オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５における化合物４）；又はそれらの任意の医薬的に許容可能な塩もしくは立体異性体でありうる。本開示のナノ粒子製剤は、粒子の送達を改善するために、界面活性剤又はポリマーを用いてコーティングすることができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、親水性コーティング、例えば、限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／又は中性表面電荷を有するコーティングなどを用いてコーティングされる。親水性コーティングは、より大きなペイロード、例えば、限定されないが、ポリヌクレオチドなどを伴うナノ粒子を中枢神経系内に送達するのを助けうる。非限定的な例として、親水性コーティングを含むナノ粒子及びそのようなナノ粒子を作製する方法が、米国特許公開番号ＵＳ２０１３０１８３２４４において記載されている。
【0039】
本発明は、以下の図及び実施例によりさらに例証される。しかし、これらの実施例及び図は、本発明の範囲を限定するものとして、任意の方法において解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1A】ｐ．Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異の同定及びＲＡＣ２のＧＴＰａｓｅ活性に対するその効果。Ａ．２つの無関係の家系からの３名の患者の系図。黒四角及び黒丸は、それぞれ罹患した男性（Ｐ１）及び女性（Ｐ２、Ｐ３）を表す。白四角及び丸は非罹患者を表す。矢印は発端者を表し、２つの横棒は血縁を表す。Ｂ．コントロール細胞及び患者細胞についてのＲＡＣ２ ＤＮＡシークエンシングの代表的なエレクトロフェログラムであって、ｃ．３４Ｇ＞Ａ変異を示す。Ｃ．コントロール線維芽細胞（Ｃ１、Ｃ２）及び罹患者から由来する線維芽細胞（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）の溶解液中でのＲＡＣ２タンパク質発現の代表的なイムノブロット。ローディングコントロールはＧＡＤＰＨ発現に対応する。Ｄ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、形質導入されていない（ＮＴ、コントロール）、あるいはＲＡＣ２ ｃＤＮＡの野生型（ＷＴ）形態、本明細書中に記載する変異形態（Ｇ１２Ｒ）、又は（陽性コントロールとして）構成的に活性化されたＲＡＣ２ ＧＴＰ形態（Ｇ１２Ｖ）を含むレンチウイルス空ベクター（ＷＰＩ）を用いて形質導入されている。形質導入後２日に、細胞を、Ｇ－ＬＩＳＡアッセイを使用した解析のために回収した（１ウェル当たり１５μgの総タンパク質）。結果を、３つの独立した実験の平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図1B】ｐ．Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異の同定及びＲＡＣ２のＧＴＰａｓｅ活性に対するその効果。Ａ．２つの無関係の家系からの３名の患者の系図。黒四角及び黒丸は、それぞれ罹患した男性（Ｐ１）及び女性（Ｐ２、Ｐ３）を表す。白四角及び丸は非罹患者を表す。矢印は発端者を表し、２つの横棒は血縁を表す。Ｂ．コントロール細胞及び患者細胞についてのＲＡＣ２ ＤＮＡシークエンシングの代表的なエレクトロフェログラムであって、ｃ．３４Ｇ＞Ａ変異を示す。Ｃ．コントロール線維芽細胞（Ｃ１、Ｃ２）及び罹患者から由来する線維芽細胞（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）の溶解液中でのＲＡＣ２タンパク質発現の代表的なイムノブロット。ローディングコントロールはＧＡＤＰＨ発現に対応する。Ｄ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、形質導入されていない（ＮＴ、コントロール）、あるいはＲＡＣ２ ｃＤＮＡの野生型（ＷＴ）形態、本明細書中に記載する変異形態（Ｇ１２Ｒ）、又は（陽性コントロールとして）構成的に活性化されたＲＡＣ２ ＧＴＰ形態（Ｇ１２Ｖ）を含むレンチウイルス空ベクター（ＷＰＩ）を用いて形質導入されている。形質導入後２日に、細胞を、Ｇ－ＬＩＳＡアッセイを使用した解析のために回収した（１ウェル当たり１５μgの総タンパク質）。結果を、３つの独立した実験の平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図1C】ｐ．Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異の同定及びＲＡＣ２のＧＴＰａｓｅ活性に対するその効果。Ａ．２つの無関係の家系からの３名の患者の系図。黒四角及び黒丸は、それぞれ罹患した男性（Ｐ１）及び女性（Ｐ２、Ｐ３）を表す。白四角及び丸は非罹患者を表す。矢印は発端者を表し、２つの横棒は血縁を表す。Ｂ．コントロール細胞及び患者細胞についてのＲＡＣ２ ＤＮＡシークエンシングの代表的なエレクトロフェログラムであって、ｃ．３４Ｇ＞Ａ変異を示す。Ｃ．コントロール線維芽細胞（Ｃ１、Ｃ２）及び罹患者から由来する線維芽細胞（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）の溶解液中でのＲＡＣ２タンパク質発現の代表的なイムノブロット。ローディングコントロールはＧＡＤＰＨ発現に対応する。Ｄ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、形質導入されていない（ＮＴ、コントロール）、あるいはＲＡＣ２ ｃＤＮＡの野生型（ＷＴ）形態、本明細書中に記載する変異形態（Ｇ１２Ｒ）、又は（陽性コントロールとして）構成的に活性化されたＲＡＣ２ ＧＴＰ形態（Ｇ１２Ｖ）を含むレンチウイルス空ベクター（ＷＰＩ）を用いて形質導入されている。形質導入後２日に、細胞を、Ｇ－ＬＩＳＡアッセイを使用した解析のために回収した（１ウェル当たり１５μgの総タンパク質）。結果を、３つの独立した実験の平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図1D】ｐ．Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異の同定及びＲＡＣ２のＧＴＰａｓｅ活性に対するその効果。Ａ．２つの無関係の家系からの３名の患者の系図。黒四角及び黒丸は、それぞれ罹患した男性（Ｐ１）及び女性（Ｐ２、Ｐ３）を表す。白四角及び丸は非罹患者を表す。矢印は発端者を表し、２つの横棒は血縁を表す。Ｂ．コントロール細胞及び患者細胞についてのＲＡＣ２ ＤＮＡシークエンシングの代表的なエレクトロフェログラムであって、ｃ．３４Ｇ＞Ａ変異を示す。Ｃ．コントロール線維芽細胞（Ｃ１、Ｃ２）及び罹患者から由来する線維芽細胞（Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３）の溶解液中でのＲＡＣ２タンパク質発現の代表的なイムノブロット。ローディングコントロールはＧＡＤＰＨ発現に対応する。Ｄ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、形質導入されていない（ＮＴ、コントロール）、あるいはＲＡＣ２ ｃＤＮＡの野生型（ＷＴ）形態、本明細書中に記載する変異形態（Ｇ１２Ｒ）、又は（陽性コントロールとして）構成的に活性化されたＲＡＣ２ ＧＴＰ形態（Ｇ１２Ｖ）を含むレンチウイルス空ベクター（ＷＰＩ）を用いて形質導入されている。形質導入後２日に、細胞を、Ｇ－ＬＩＳＡアッセイを使用した解析のために回収した（１ウェル当たり１５μgの総タンパク質）。結果を、３つの独立した実験の平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す（＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図2A】Ｇ１２Ｒ変異は、ＨＳＰＣの増殖及び分化を阻害する。Ａ．７日間培養におけるＣＤ３４陽性細胞の増殖。フローサイトメトリーを使用して、生細胞（７－ＡＡＤ陰性）ゲートにおけるＧＦＰ＋発現細胞の割合（%）を解析した。ＲＯＳ－ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５）－ｌｏｗ、及びアネキシンＶ陽性ＧＦＰ＋生細胞の割合を、４日目に決定した。結果を、４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｂ．７日間培養における好中球分化。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の間の顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を解析した。ＧＦＰ＋生細胞の間のＲＯＳ ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５） ｌｏｗ、アネキシンＶ＋細胞の割合を４日目に解析した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｃ．７日間培養におけるＴ細胞分化（ｎ＝３）。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の割合を解析した。Ｔ細胞前駆細胞（ＣＤ７＋）の数を、７日目にＧＦＰ＋生細胞において評価した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。全ての実験について：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図2B】Ｇ１２Ｒ変異は、ＨＳＰＣの増殖及び分化を阻害する。Ａ．７日間培養におけるＣＤ３４陽性細胞の増殖。フローサイトメトリーを使用して、生細胞（７－ＡＡＤ陰性）ゲートにおけるＧＦＰ＋発現細胞の割合（%）を解析した。ＲＯＳ－ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５）－ｌｏｗ、及びアネキシンＶ陽性ＧＦＰ＋生細胞の割合を、４日目に決定した。結果を、４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｂ．７日間培養における好中球分化。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の間の顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を解析した。ＧＦＰ＋生細胞の間のＲＯＳ ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５） ｌｏｗ、アネキシンＶ＋細胞の割合を４日目に解析した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｃ．７日間培養におけるＴ細胞分化（ｎ＝３）。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の割合を解析した。Ｔ細胞前駆細胞（ＣＤ７＋）の数を、７日目にＧＦＰ＋生細胞において評価した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。全ての実験について：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図2C】Ｇ１２Ｒ変異は、ＨＳＰＣの増殖及び分化を阻害する。Ａ．７日間培養におけるＣＤ３４陽性細胞の増殖。フローサイトメトリーを使用して、生細胞（７－ＡＡＤ陰性）ゲートにおけるＧＦＰ＋発現細胞の割合（%）を解析した。ＲＯＳ－ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５）－ｌｏｗ、及びアネキシンＶ陽性ＧＦＰ＋生細胞の割合を、４日目に決定した。結果を、４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｂ．７日間培養における好中球分化。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の間の顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を解析した。ＧＦＰ＋生細胞の間のＲＯＳ ｌｏｗ、ＤｉｌＣ１（５） ｌｏｗ、アネキシンＶ＋細胞の割合を４日目に解析した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。Ｃ．７日間培養におけるＴ細胞分化（ｎ＝３）。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ＋生細胞の割合を解析した。Ｔ細胞前駆細胞（ＣＤ７＋）の数を、７日目にＧＦＰ＋生細胞において評価した。結果を、３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして示す。全ての実験について：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図3A】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、転座ＭＬＬ－ＡＦ９）からのＭｏｌｍ－１３細胞のテスト。Ａ．Ｍｏｌｍ－１３細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を伴うベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入された細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、７日間の培養の間にＧＦＰ＋細胞の%及びＧＦＰ＋形質導入細胞の数を検出することを可能にする。Ｂ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、アポトーシスに入るＧＦＰ＋形質導入細胞の割合（% アネキシンＶ＋）、ミトコンドリア膜分極化（% Δμｍ）、及びＲＯＳ産生を評価した。結果は、４つの独立した実験を代表している（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図3B】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、転座ＭＬＬ－ＡＦ９）からのＭｏｌｍ－１３細胞のテスト。Ａ．Ｍｏｌｍ－１３細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を伴うベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入された細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、７日間の培養の間にＧＦＰ＋細胞の%及びＧＦＰ＋形質導入細胞の数を検出することを可能にする。Ｂ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、アポトーシスに入るＧＦＰ＋形質導入細胞の割合（% アネキシンＶ＋）、ミトコンドリア膜分極化（% Δμｍ）、及びＲＯＳ産生を評価した。結果は、４つの独立した実験を代表している（＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図4】ＡＭＬ（転座ＭＬＬ－ＡＦ４）からのＭＶ４－１１細胞のテスト。ＭＶ４－１１細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を伴うベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入された細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、７日間の培養の間にＧＦＰ＋細胞の%及びＧＦＰ＋形質導入細胞の数を検出することを可能にする。結果は、２つの独立した実験を代表している。
【図5A】ＡＭＬからのＨＬ６０細胞のテスト。ＨＬ－６０細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を含むベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入工程に続き、細胞を、顆粒球系列に向けたそれらの分化を誘導するために、レチノイン酸の存在において培養した。Ａ－Ｂ．形質導入細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、培養の開始後２日（Ｊ２）及び４日（Ｊ４）のＧＦＰ＋形質導入細胞の数ならびに顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を検出することを可能にする。結果は、３つの独立した実験を代表している（＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｃ－Ｄ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、低いミトコンドリア膜分極化レベル及び低いＲＯＳ産生レベルを伴う細胞の割合を評価した。アポトーシスに入る細胞のパーセンテージは、ＷＴ及びＧ１２Ｒの条件についてそれぞれ２%及び１０%であった。ヒストグラムは、３つの独立した実験を代表している。
【図5B】ＡＭＬからのＨＬ６０細胞のテスト。ＨＬ－６０細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を含むベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入工程に続き、細胞を、顆粒球系列に向けたそれらの分化を誘導するために、レチノイン酸の存在において培養した。Ａ－Ｂ．形質導入細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、培養の開始後２日（Ｊ２）及び４日（Ｊ４）のＧＦＰ＋形質導入細胞の数ならびに顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を検出することを可能にする。結果は、３つの独立した実験を代表している（＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｃ－Ｄ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、低いミトコンドリア膜分極化レベル及び低いＲＯＳ産生レベルを伴う細胞の割合を評価した。アポトーシスに入る細胞のパーセンテージは、ＷＴ及びＧ１２Ｒの条件についてそれぞれ２%及び１０%であった。ヒストグラムは、３つの独立した実験を代表している。
【図5C】ＡＭＬからのＨＬ６０細胞のテスト。ＨＬ－６０細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を含むベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入工程に続き、細胞を、顆粒球系列に向けたそれらの分化を誘導するために、レチノイン酸の存在において培養した。Ａ－Ｂ．形質導入細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、培養の開始後２日（Ｊ２）及び４日（Ｊ４）のＧＦＰ＋形質導入細胞の数ならびに顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を検出することを可能にする。結果は、３つの独立した実験を代表している（＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｃ－Ｄ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、低いミトコンドリア膜分極化レベル及び低いＲＯＳ産生レベルを伴う細胞の割合を評価した。アポトーシスに入る細胞のパーセンテージは、ＷＴ及びＧ１２Ｒの条件についてそれぞれ２%及び１０%であった。ヒストグラムは、３つの独立した実験を代表している。
【図5D】ＡＭＬからのＨＬ６０細胞のテスト。ＨＬ－６０細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）あるいはＲＡＣ２の野生型形態を含むベクター（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入工程に続き、細胞を、顆粒球系列に向けたそれらの分化を誘導するために、レチノイン酸の存在において培養した。Ａ－Ｂ．形質導入細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、培養の開始後２日（Ｊ２）及び４日（Ｊ４）のＧＦＰ＋形質導入細胞の数ならびに顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋）の数を検出することを可能にする。結果は、３つの独立した実験を代表している（＊ｐ＜０．０５ ＊＊＊ｐ＜０．００１）。Ｃ－Ｄ．４日目に、フローサイトメトリー解析を実施して、低いミトコンドリア膜分極化レベル及び低いＲＯＳ産生レベルを伴う細胞の割合を評価した。アポトーシスに入る細胞のパーセンテージは、ＷＴ及びＧ１２Ｒの条件についてそれぞれ２%及び１０%であった。ヒストグラムは、３つの独立した実験を代表している。
【図6A】Ａ．健常ドナーの末梢血からの単核細胞を、フィトヘマグルチニンＡの存在において培養し、空ベクター（ＷＰＩ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物を用いて形質導入した。形質導入された細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ＋細胞の%、ＧＦＰ＋形質導入細胞の数、及びアポトーシスに入るＧＦＰ＋細胞の割合（%アネキシンＶ＋）を追跡することを可能にする。結果は、２つの独立した実験を代表している。
【図6B】Ｂ．健常ドナーからのＢ－ＥＢＶ株を、空ベクター（ＷＰＩ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入された細胞は全て、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ＋細胞の%を追跡することを可能にする。結果は、３つの独立した実験を代表している（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0041】
実施例
【0042】
材料及び方法
【0043】
患者及びヒト臍帯血サンプル
【0044】
本試験は、フランスの法律及びヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。インフォームドコンセントを患者の両親又は法定後見人から得て、試験プロトコルは現地の独立倫理委員会及びフランス研究省により承認された（ＤＣ ２０１４－２２７２／２０１５／ ＤＣ－２００８－３２９．）初代線維芽細胞株を皮膚生検から得た。
【0045】
研究目的のために適格なヒト臍帯血（ＣＢ）サンプルを、セントルイス病院（フランス、パリ；公認２０１４年９月２３日）の臍帯血バンクから得た。単核細胞は、Lymphoprep（Abcys）上での密度分離により単離した。ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣは、autoMACSpro separator（Miltenyi Biotec）を使用して磁気的に選別し、細胞の純度を、MACSQuant analyzer（Miltenyi Biotec）を用いてチェックした。
【0046】
遺伝子、シークエンシング、及び遺伝子発現解析
【0047】
ゲノムＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出により線維芽細胞（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｐ３父親）から単離した。全エクソームシークエンシングを、Illumina TruSeqエクソーム濃縮キット（Illumina）を用いて、１００bpペアエンドリードを使用して実施した。標的領域の８５%を、カバー度＞２０×を伴って観察した。バリアントコールは特定の遺伝モデルに基づいていなかった。Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異体は、多数の社内及び公開の配列データベースにおいて見出されなかった。サンガーシークエンシングによって、Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３における変異が確認された（ABI Prism 3700シークエンサー、Life Technologies）。
【0048】
ウェスタンブロット解析のために、コントロール又は患者からの初代線維芽細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤が添加されたＴｒｉｓ緩衝液（２０mM Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．９；３００mM ＮａＣｌ；１% Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）中に溶解させた。細胞抽出物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ブロットし、抗ＲＡＣ２（ａｂ１５４７１１、Abcam）抗体又は抗ＧＡＰＤＨ（ＳＣ－３２２３３、Santa Cruz）抗体を用いて染色した。ＨＲＰ結合二次抗体を用いた染色後、イムノブロットを、ＥＣＬ＋キット（Amersham）を用いて現像した。タンパク質レベルを、Ｆｉｊｉソフトウェアを用いて定量化した。
【0049】
レンチウイルスベクターの構築及び産生。複製欠損の自己不活性化ｐＷＰＩレンチウイルスベクターの骨格がAddgene（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／）より提供された。全ての構築物（Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｖ、Ｄ５７Ｎ、及びＥ６２Ｋ）がGenScript（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ）により生成された。レンチウイルス上清は、SFR BioSciences Gerland-Lyon Sud（フランス、リヨン）のベクター施設により産生された。遺伝子改変細胞を用いた全ての手順が、フランス国立バイオテクノロジー評議会及びフランス研究省により承認された（参照：４９８３／３）。
【0050】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株でのＲＡＣ２活性化アッセイ及びイムノブロット
【0051】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２０の感染倍数での適したレンチウイルス上清を用いた形質導入の前に一晩培養した。２日間の培養後、細胞ペレットを液体窒素中で凍結した。活性化ＲＡＣ２のレベルを、G-LISA（登録商標）RAC Activation Assay Biochem Kit（商標） （＃ＢＫ１２５、Cytoskeleton Inc.）を使用して決定した。G-LISA（登録商標）キットは、１０μg/ml ＲＡＣ２特異的抗体（ＡＴ２Ｇ１１、ｓｃ－５１７４２４、Santa Cruz Biotechnology, Inc.）及び １／２０００ ＨＲＰ結合抗マウス抗体（＃１７２１０１１、Bio-Rad）を使用して、捕捉された活性ＲＡＣ２の量を検出したことを除き、製造元の説明書に従って実施した。この反応は、３分間にわたる１００μlの発色基質（1-step UltraTMB, 34028、Thermo Scientific）の添加により可視化し、５０μlのＨ２ＳＯ４ １Ｎを用いて停止させた。４５０nmでの吸光度を、FLUOstar OPTIMAマイクロプレートリーダーを使用して測定した。全細胞抽出物を、プロテアーゼ阻害剤カクテルが添加されたＧ－ＬＩＳＡ溶解緩衝液中で細胞を溶解することにより得た。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、抗ＲＡＣ２抗体（ＡＴ２Ｇ１１、ｓｃ－５１７４２４、Santa Cruz Biotechnology, Inc.）又は抗ＧＡＰＤＨ抗体（１４Ｃ１０、Cell Signaling Technology）を用いてイムノブロットした。イムノブロットは、ChemiDoc MP System（Bio-Rad）を使用した化学発光により明らかになった。タンパク質レベルを、Image Labソフトウェアを用いて定量化した。
【0052】
ホロトモグラフィー
【0053】
細胞内の屈折率を測定するため（即ち、細胞オルガネラの無標識での可視化）、細胞サンプルを３５mmガラスボトムディッシュ（Ibidi-Dishes（商標）＃８１１５６；Ibidi,GmbH）中に播き、3D Cell Explorer 顕微鏡（Nanolive SA）の観察領域中に設置した。細胞画像を、STEVEソフトウェア（Nanolive）を使用して処理した。
【0054】
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のインビトロ培養
【0055】
臍帯血ＣＤ３４＋ＨＳＰＣを一晩培養し（以前に記載されたとおり５）、次いで適したレンチウイルス上清を８０の感染倍率で用いて形質導入した。２日間の培養後、ＧＦＰ＋細胞を、フローサイトメトリーによりインビトロ培養の前に測定した。顆粒球系列又はＴ細胞系列に沿って分化するためのＣＤ３４＋細胞の能力を、他で記載されているように測定した６，２９。
【0056】
フローサイトメトリー、Mitotracker DIIC1(5)、CellRox染色
【0057】
ＣＤ７（ＭＴ－７０１）、ＣＤ１１ｂ（Ｄ１２）、ＣＤ３４（８Ｇ１２）、ならびにマウスＩｇＧ１ｋ、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロールに対するモノクローナル抗体、ならびに試薬アネキシンＶ及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）は、BD Biosciences（カリフォルニア州サンホゼ）から得た。ＣＤ１５（８０Ｈ５）及びマウスＩｇＭコントロール抗体は，Beckman Coulter（サンディエゴ）から購入した。ミトコンドリア膜電位を、MitoProbe（商標）DiIC1（５）アッセイキット（Ｍ３４１５１）を使用して測定し、ＲＯＳレベルを、CellRox（登録商標）アッセイキット（Ｃ１０４９２）を使用し、製造元の説明書（Life Technologies）に従って測定した。染色後，細胞を、Galliosフローサイトメーターで解析し、データを、Kaluzaソフトウェア（全てBeckman Coulterから）を使用して処理した。
【0058】
ホモロジーモデリング
【0059】
三次元ホモロジーモデルを、ヒトＲＡＣ２のＧ１２Ｒ変異体（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１５１５３）について、MODELLERソフトウェアv20（Webb and Sali, 2016, 2017）を使用して構築した。ＷＴヒトＲＡＣ２の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＤＳ６）をテンプレートとして使用した。
【0060】
統計解析
【0061】
全ての解析において、３つ又はそれ以上の独立した実験を実施した。データを平均値±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として報告する。対応のない両側ｔ検定を、Prism 4 ソフトウェア（GraphPad）を使用して実施した。統計的有意性についての閾値をｐ＜０．０５に設定した。
【0062】
結果
【0063】
ＲＡＣ２ ＧＴＰａｓｅタンパク質におけるミスセンス変異（Ｇ１２Ｒ）は、ＳＣＩＤ表現型に導く
【0064】
本発明者らのＳＣＩＤ表現型を伴う患者のコホート中で、数名の個人が分子診断をまだ有していない。２つの無関係の家系からの３名の患者（１つの家系からのＰ１、ならびに別の家系からのそれぞれ母親及び娘としてのＰ２及びＰ３）は、難聴以外のＲＤの全ての臨床的特徴を呈した（図１Ａ）。ＲＤを伴う患者において観察されるように、好中球の完全な非存在が、他の形態のＳＣＩＤにおいて通常観察されるよりも早期での重度感染の発生についての原因となった（表１）ｐｉｃａｒｄ２。他の血球系列の解析によって、Ｔ及びＢリンパ球ならびに循環単球の非存在が強調された。逆に、血小板数は正常であったが、ヘモグロビンレベルは１名だけの患者において正常よりわずかに低かった（表１）。全体的に、末梢細胞数のプロファイルは、患者の骨髄の重度低形成形態に対応した（表１、及びデータは示さず）。出生後すぐに実施された造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、Ｐ１（Ｐ４１２として以前に記載されている）及びＰ２において成功しており、遺伝的欠陥が内因性であり、外因性でないこと（即ち、微小環境でないこと）を実証している（表１）。
【0065】
患者の線維芽細胞の全ゲノムシークエンシング（ＷＥＳ）を実施することにより、本発明者らは、ＲＡＣ２遺伝子中のヘテロ接合型ミスセンス変異（ｃ．３４Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｇ１２Ｒ）を唯一の可能性のある遺伝的原因として同定した。この変異は、３名の患者においてサンガーシシークエンシングにより確認されたが、しかし、Ｐ３の父親（本発明者らがＤＮＡサンプルを得ることができた唯一の親族）においては存在しなかった（図１Ｂ）。Ｐ２及びその娘Ｐ３における同じ表現型及び同じＲＡＣ２ Ｇ１２Ｒミスセンス変異の存在によって、ＡＤの遺伝パターンが強調された。
【0066】
ｐ．Ｇ１２Ｒミスセンス変異はＧ１ボックス（高度に保存されたグアニンヌクレオチド結合領域１３）中に位置し、本発明者らの社内データベース（コホート中のｎ＝１４１５４）中に又はヒトGenome Aggregation Database（ｇｎｏｍＡＤ）中に注釈は付けられていなかった。この変異は、４つの異なるインシリコ予測ソフトウェア（Combined Annotation Depletionを含む）により有害であると予測された。この遺伝子変異が、軽度の好中球欠損及び／又はリンパ球減少症についての原因であると以前に報告された機能喪失（ＬＯＦ）又は機能獲得（ＧＯＦ）変異とは異なることは注目に値する１４－１８。Ｇ１２Ｒミスセンス変異が、患者の線維芽細胞における正常レベルのＲＡＣ２タンパク質発現と関連付けられたことは注目に値する（図１Ｃ）。
【0067】
ＧＤＰ／ＧＴＰ結合ドメイン中に位置するＧ１２Ｒ変異は、細胞のホメオスタシスを破壊する
【0068】
このＧ１２Ｒ変異の機能的影響を理解するために、本発明者らは、野生型（ＷＴ）ＲＡＣ２のＸ線構造１９をテンプレートとして使用し、３次元ホモロジーモデルを生成した（データは示さず）。かさ高く、柔軟なアルギニンは、Ｇ１ボックス中のＧＤＰ／ＧＴＰ結合ポケットへの入り口をブロックすると予測される（データは示さず）。したがって、アルギニンの荷電グアニジニウム基が正荷電ポケットを破壊し、したがって、ＧＴＰ加水分解速度に影響しうる（他の低分子ＧＴＰａｓｅについて以前に実証されているように２０）。
【0069】
このモデルを生化学的にテストするために、本発明者らは、天然でＲＡＣ２陰性のＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抽出液中で、活性なＲＡＣ２ ＧＴＰ結合形態を定量化した。この細胞を、トラッカーとしての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を伴う空レンチウイルス骨格（ＷＰＩ）、あるいはＷＴ形態のＲＡＣ２ ｃＤＮＡ、本明細書中に記載する変異形態（Ｇ１２Ｒ）又はポジティブコントロールとしての構成的に活性化したＲＡＣ２ ＧＴＰ形態（Ｇ１２Ｖ）２１を含むベクターを用いて形質導入した。高いレベルの活性化ＧＴＰ結合ＲＡＣ２形態が、Ｇ１２Ｖ及びＧ１２Ｒの両方を用いて観察され（図１Ｄ）、１２位でのアルギニンによる置換が、ＲＡＣ２シグナル伝達経路の持続的活性化に導くことを実証する。Ｇ１２Ｒ変異は、従って、ＧＯＦ変異である。
【0070】
ＲＡＣ２の構成的活性形態の発現が細胞分裂及び生存にどのような影響するのかを決定するために、本発明者らは、Ｐ３からの初代線維芽細胞のホロトモグラフィー解析を実施した。インビトロでの低い観察された細胞増殖率（データは示さず）と一致して、患者の線維芽細胞は、非常に遅い細胞動態及び細胞質分裂不全を示唆する断片化した核により特徴付けられた（データは示さず）。さらに、コントロール線維芽細胞とは対照的に、細胞の形状及びミトコンドリアネットワークがＰ３の線維芽細胞において破壊されていた（データは示さず）。これらの２つの観察によって、Ｇ１２Ｒ変異、欠損したミトコンドリア活性、及び細胞質分裂を駆動するＲＡＣシグナル経路における欠損を反映する細胞有糸分裂における劇的な変化の間の関連が強調された２２。
【0071】
Ｇ１２Ｒ変異はミトコンドリア活性を破壊し、ＨＳＰＣ分化をブロックする
【0072】
造血に対する構成的なＲＡＣ２活性化の影響を理解するために、ＣＤ３４陽性のヒト臍帯血ＨＳＰＣ（患者の骨髄サンプルの非存在を仮定）を、ＷＰＩ、ＷＴ、Ｇ１２Ｒ、又はＧ１２Ｖ ＲＡＣ２ ｃＤＮＡ（トラッカーとしてＧＦＰを用いる）を用いて形質導入し、次いでサイトカインを用いて７日間にわたり培養した（図２Ｂ）。構成的に活性化なＲＡＣ２形態（Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｖ）の発現によって、４日以内でのＧＦＰ＋形質導入細胞の消失に導かれ、この時間点で、活性酸素種（ＲＯＳ）産生（「ＲＯＳ ｌｏｗ」細胞の割合として定量化）が有意にブロックされ、ミトコンドリア膜脱分極（「ＤｉｌＣ１（５） ｌｏｗ」細胞の割合）及びアポトーシス（アネキシンＶ陽性細胞の割合）は有意に増加した（図２Ａ）。これらの変化は、ＧＦＰ陰性サブセットにおいて観察されなかったことは注目に値する。全体として、これらの知見によって、ＲＡＣ２タンパク質中の１２位での変異とミトコンドリア機能障害の間での特異的な相関が明示された。本発明者らの結果は、（ｉ）ミトコンドリア活性がＨＳＰＣ機能のために要求されること２３，２４、及び（ｉｉ）ＲＡＣ２シグナル経路の破壊がミトコンドリア動態２５及び活性酸素産生２６－２８に影響を及ぼすことを示す以前の報告と一致する（図２Ａ）。
【0073】
ＲＡＣ２はヒト造血器骨髄サブセットにおいて、及びヒト胸腺形成の間に高度に発現されるため、本発明者らは、ＨＳＰＣをＷＰＩ、ＷＴ、Ｇ１２Ｒ、又はＧ１２Ｖ ＲＡＣ２ ｃＤＮＡを用いて形質導入し、それらが、顆粒球、単球、及びＴリンパ系列に沿って分化するように刺激した（全てが３名の患者において存在しない）。顆粒球コロニー刺激因子を用いた７日間の培養後、ＧＦＰ＋ＣＤ１５＋ＣＤ１１ｂ＋好中球数は、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｖ条件において、ＷＰＩ又はＷＴ条件においてより、有意に低かった（図２Ｂ）。ミトコンドリア膜電位及びＲＯＳ産生がまた、破壊されていることが見出され、アポトーシスの上昇レベルと関連付けられた（図２Ｂ）。単球系列に向かう分化及びコロニー形成単位アッセイにおける分化は、同様の結果を与えた（データは示さず）。Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様４（ＤＬ４）培養系（７日間でのＣＤ７＋Ｔ細胞前駆細胞へのＨＳＰＣの分化を可能にする２９）への曝露時に、Ｇ１２Ｒ及びＧ１２Ｖ条件におけるＧＦＰ＋サブセット数は（ＷＴ及びＷＰＩ条件に比べて）非常に低く、ＧＦＰ＋ＣＤ７＋Ｔ細胞前駆細胞がほぼ完全に存在しなかった（図２Ｃ）。これらの結果は、ＲＡＣ２のＧ１２Ｖ構成的活性形態の発現によって、マウス胸腺細胞の分化が防止され、アポトーシスに導かれるという以前の報告３０と一致している。全体として、本発明者らの結果は、リンパ骨髄区画の生存及び分化におけるＧＤＰ／ＧＴＰ結合ＲＡＣ２バランスの重要な機能を示し、ＨＳＰＣ機能におけるＲＡＣ２シグナル伝達経路の関与を強調する。本発明者らは次に、ヒト臍帯血ＨＳＰＣの増殖に対するＧ１２Ｒの影響を、以前に記載されているＲＡＣ２におけるＬＯＦ及びＧＯＦミスセンス変異（それぞれｐ．Ｄ５７Ｎ及びｐ．Ｅ６２Ｋ）１４、１５、１８の影響と比較した。８日間の培養の間に、ＧＦＰ＋形質導入ＨＳＰＣの数はＥ６２Ｋ及びＧ１２Ｒ群において低かったが、しかし、Ｅ６２Ｋ条件ではＧ１２Ｒ条件より有意に高かった。Ｇ１２Ｒ変異とは異なり、Ｄ５７Ｎ及びＥ６２Ｋ変異はミトコンドリア活性に対する影響を有さなかった。
【0074】
全体として、本発明者らの観察は、ＲＡＣ２におけるＧ１２Ｒミスセンス変異が、ＲＡＣ２の活性なＧＴＰ結合形態のレベルと、及びＨＳＰＣの生存及び機能と相関していることを示唆する。これらの知見は、本発明者らの３名の患者において観察されたＳＣＩＤの臨床的及び免疫学的表現型と、ならびにＥ６２Ｋ又はＤ５７変異を持つ患者により呈されるあまり重度ではない表現型と適合する。
【0075】
テストされた３つの型のＬＡＭ（Ｍｏｌｍ１３、ＭＶ４－１１、及びＨＬ６０）
【0076】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、転座ＭＬＬ－ＡＦ９）からのＭｏｌｍ－１３細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）、ＲＡＣ２の野生形態を含むベクター（ＷＴ）、又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入された細胞は全て、レポーター遺伝子ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を発現し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ及び形質導入されたＧＦＰ＋細胞の数を追跡することを可能にする。構成的に活性化されたＲＡＣ２形態（Ｇ１２Ｒ）の発現によって、７日以内でのＧＦＰ＋形質導入細胞の消失に導かれた（図３Ａ）。この観察は、欠損したミトコンドリア膜分極及び欠損した活性酸素種（ＲＯＳ）産生を有するＧＦＰ＋アポトーシス細胞（%アネキシンＶ＋）の増加した割合と相関する（図３Ｂ）。
【0077】
ＡＭＬ（転座ＭＬＬ－ＡＦ４）からのＭＶ４－１１細胞をまた、空ベクター（ＷＰＩ）、ＲＡＣ２の野生形態を含むベクター（ＷＴ）、又はＲＡＣ２から変異した形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。ＧＦＰレポーター遺伝子を発現する形質導入細胞をフローサイトメトリーにより追跡し、本発明者らは、Ｇ１２Ｒ条件において減少したＧＦＰ＋細胞のパーセンテージ及び数を観察した（図４）。細胞をまた、Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、核の断片化（ｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、Ｇ１２Ｒ構築物を用いて形質導入された細胞だけにおいて観察された（データは示さず）。
【0078】
ＡＭＬからのＨＬ６０細胞を、ＲＡＣ２の野生形態（ＷＴ）又はＲＡＣ２の変異形態（Ｇ１２Ｒ）を含むベクターを含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入後、細胞をレチノイン酸の存在において４日間にわたり培養し、顆粒球（ＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ１５＋）へそれらの分化を誘導した。ＧＦＰ＋細胞の数を２日目（Ｊ２）及び４日目（Ｊ４）に、顆粒球の数を４日目に測定した。図５Ａ及び図５Ｂで観察されるように、ＧＦＰ＋及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５＋細胞の数が、ＷＴ条件と比較し、Ｇ１２Ｒ条件において劇的に低下した。この観察は、より高いミトコンドリア膜脱分極（ＤＩＬＣ ｌｏｗ細胞の割合として定量化；図５Ｃ）及びＲＯＳを産生できない細胞のより高い割合（ＲＯＳ ｌｏｗの%として定量化；図５Ｄ）と相関していた。注目すべきは、アポトーシスに入るＧＦＰ＋細胞の割合は、ＷＴ及びＧ１２Ｒ条件についてそれぞれ２%及び１０%であった。細胞をまた、Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａを用いて染色し、断片化した核が、Ｇ１２Ｒ構築物を用いて形質導入された細胞だけで観察された。
【0079】
本発明者らはまた、初代細胞に対するＲＡＣ２ Ｇ１２Ｒミスセンス変異の効果を試験した。簡単には、健常ドナーからの単核細胞を、空ベクター（ＷＰＩ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。形質導入されたＧＦＰ＋を、８日間の培養の間にフローサイトメトリーにより追跡した。図６Ａで観察されるように、ＧＦＰ＋細胞の%及び数が、コントロール条件と比較し、Ｇ１２Ｒ条件において劇的に低下した。この観察は、アポトーシス細胞のより高い%に関連付けられる（図６Ａ）。健常ドナーからのＢ－ＥＢＶ株を、空ベクター（ＷＰＩ）又はＲＡＣ２の変異形態を含むベクター（Ｇ１２Ｒ）を含むレンチウイルス構築物の存在において形質導入した。図６Ｂに表される時間経過動態において、ＧＦＰ＋細胞の%は、Ｇ１２Ｒ条件において有意に減少している。
【0080】
考察
【0081】
ＳＣＩＤを伴う３名の患者において、本発明者らは、ＲＡＣ２タンパク質の高度に保存されたＧ１ボックスドメイン中にヘテロ接合性の優性ミスセンス変異（ｐ．Ｇ１２Ｒ）を同定した。この変異は自然免疫系及び適応免疫系に影響を及ぼした。臨床症状の重症度を考慮すると、患者は生後数週間中に造血幹細胞移植を受けなければならなかった。ＡＤ遺伝の観察によってＲＤの臨床スペクトルが広がる。本発明者らは、本明細書で２つの形態のＲＤの間で区別している：難聴及びＡＫ２変異に関連付けられる劣性症候群形態（Ｉ型）ならびにＲＡＣ２におけるＡＤ Ｇ１２Ｒ変異に特に関連付けられる非症候群形態（難聴を伴わない）（ＩＩ型）。ＩＩ型ＡＤ－ＳＣＩＤ形態における感音性聴覚消失の非存在は、造血系列におけるＲＡＣ２の特異的発現ならびにＲＡＣ１及びＲＡＣ３（ＲＡＣ２ではない）がマウス内耳の発生に関与するＲＡＣ ＧＴＰａｓｅであるという事実に起因するかもしれない３１。
【0082】
本明細書において同定されているＧ１２Ｒ－ＲＡＣ２変異は、特にＨＳＰＣにおいて、細胞の増殖及び生存に対する劇的な効果を有した。さらに、この変異によって、ＨＳＰＣにおけるミトコンドリア活性が破壊され、リンパ系列及び骨髄系列に向かう細胞分化が損なわれた。これらの特色によって、本発明者らの３名の患者における循環するリンパ球及び好中球の非存在が説明され、異なる造血チェックポイントでのＲＡＣ２の非重複調節の役割が強調されうる。
【0083】
驚くべきことに、本発明者らの実験では、Ｄ５７Ｎ ＬＯＦ変異体はＨＳＰＣプールに対する影響を有さず、Ｅ６２Ｋ ＧＯＦ変異体が（Ｇ１２Ｒと比べて）中程度の効果だけを有する。全体として、本発明者らの知見は、種々のＲＡＣ２変異が、ＨＳＰＣに対するそれらの効果において異なることを強調し、恐らくは、ＲＡＣ２欠損を伴う患者において観察される広いスペクトルの臨床表現型（好中球欠損及び／又は白血球減少（任意の報告された造血の変化を伴わない）から、本発明者らが本明細書で記載する骨髄低形成を伴うＳＣＩＤ形態まで）を説明する。この型の不均一性は、ＲＡＧ１変異について既に報告されており、ここで、表現型は自己免疫疾患からＳＣＩＤまで及ぶ３２。
【0084】
アミノ酸置換の位置（ＧＤＰ／ＧＴＰ結合ポケット内（Ｇ１２Ｒ）又はスイッチＩＩドメイン中（Ｅ６２Ｋ））によって、これら２つのＧＯＦ変異の違いが説明されうる。この仮説は、（ｉ）Ｇ１２Ｒ条件において観察される高レベルの活性（ＧＴＰ結合）形態ＲＡＣ２（Ｅ６２Ｋ条件におけるその非存在と比べて）、及び（ｉｉ）Ｅ６２Ｋ条件において観察される低レベルのＲＡＣ２タンパク質発現量と一致しており、６２位でのグルタミン酸置換がタンパク質の安定性に影響しうることを示唆する。結果的に、本発明者らは、Ｇ１２Ｒ変異が、構成的で、持続的な様式において下流の標的を活性化することができる唯一の変異であることを示唆する。Ｅ６２Ｋ変異体についての本発明者らの結果は、Ｈｓｕら１８により記載された結果とは異なる。なぜなら、彼らは、精製されたＥ６２Ｋタンパク質のＧＴＰ結合能力を評価したが；本明細書では、本発明者らは、細胞溶解物中のＲＡＣ２ＧＴＰ活性を測定したからである。これらの結果に照らして、２つのＧＯＦ変異は、同じレベルのＲＡＣ２ ＧＴＰ活性を駆動せず、Ｇ－ＬＩＳＡアッセイが、生細胞においてＲＡＣ２活性化のレベルを測定するための適した方法であると思われる。
【0085】
まとめると、ｐ．Ｇ１２Ｒ ＲＡＣ２変異はＨＳＰＣ区画の維持及び分化に対して劇的な影響を有し、したがって、患者の臨床的及び免疫学的表現型の重症度を説明しうる。本発明者らの知る限り、本試験はＳＣＩＤのＡＤ形態を報告する最初のものであり、医師は、ＳＣＩＤ及びＲＤの臨床症状を伴う患者のためにＲＡＣ２遺伝子シークエンシングを考慮すべきである。本発明者らはまた、種々の細胞株（Ｂ－ＥＢＶ、ＡＭＬ）又は成熟した初代細胞においてＧ１２Ｒミスセンス変異の劇的な影響を観察したが、ＲＡＣ２タンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ結合ドメインを標的化することが、白血病細胞死を誘導するための新たな治療戦略を表しうることを示唆する。
【表1】
【0086】
参考文献
【0087】
本願を通し、種々の参考文献により、本発明が属する最先端技術が記載される。これらの参考文献の開示内容は、本開示中への参照により本明細書により組み入れられる。
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【配列表】
【国際調査報告】