特表 2022-541608 ヌクレアーゼ標的ＩＤＬＶを用いる正確な組み込み

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-26

(54)【発明の名称】ヌクレアーゼ標的ＩＤＬＶを用いる正確な組み込み

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20220915BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220915BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20220915BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/21 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/20 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/22 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/50 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/47 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/36 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/28 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/49 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/46 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/48 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20220915BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20220915BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/13

C12N5/10

C12N5/0783

A61P37/02

A61P31/12

A61P35/00

A61P7/00

A61K35/76

A61K35/28

A61K35/17 Z

A61K35/545

A61K35/30

A61K35/36

A61K48/00

C12N5/074

C12N5/0735

C12N5/0775

C12N5/0797

C12N5/0789

C12N5/0781

C12N15/62 Z

A61K38/19

A61K38/21

A61K38/20

A61K38/22

A61K38/50

A61K38/47

A61K38/36

A61K38/28

A61K38/49

A61K38/46

A61K38/48

A61K38/17

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022504173

(86)(22)【出願日】2020-07-22

(85)【翻訳文提出日】2022-03-22

(86)【国際出願番号】 EP2020070622

(87)【国際公開番号】W WO2021013867

(87)【国際公開日】2021-01-28

(31)【優先権主張番号】19305967.2

(32)【優先日】2019-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503197304

【氏名又は名称】ジェネトン

(71)【出願人】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(71)【出願人】

【識別番号】503119487

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】アメンドーラ，マリオ

(72)【発明者】

【氏名】パヴァーニ，ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】サッカル，アブード

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084CA56

4C084DA01

4C084DA12

4C084DA19

4C084DA21

4C084DA22

4C084DA23

4C084DA46

4C084DA48

4C084DB01

4C084DB34

4C084DC02

4C084DC10

4C084DC14

4C084DC15

4C084DC16

4C084DC17

4C084DC18

4C084DC19

4C084DC20

4C084DC21

4C084DC22

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB45

4C087BB48

4C087BB56

4C087BB64

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA09

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB33

(57)【要約】

本発明は、核酸を含む統合不全レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）に関し、前記核酸は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に、少なくとも１つの核外搬出シグナル配列；少なくとも１つの目的の核酸配列；及び少なくとも１つのヌクレアーゼ部位を含むことを特徴としている。本発明はさらに、前記ＩＤＬＶを含む単離細胞、前記ＩＤＬＶまたは前記単離細胞を含む医薬組成物、および免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／またはそれを必要としている個体のタンパク質の欠如または異常非機能の存在によって生じる疾患の治療におけるそれらの医薬使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を含む統合欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）であって、前記核酸が、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、以下：
ａ．少なくとも１つの核外搬出シグナル配列、特に少なくとも１つのＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、特に１つのＲＲＥ；
ｂ．ポリＡシグナル；スプライシングシグナル配列；ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位；プロモーター；および治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはその断片からなる群から選択される少なくとも１つの目的の核酸配列。
ｃ．少なくとも１つのヌクレアーゼ部位、特に少なくとも１つのガイド核酸標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）；
ｄ． 場合により、細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位の一部と相同な配列からなる少なくとも１つの相同性アーム配列；および
ｅ． 場合により、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定した発現を高めることを可能にする少なくとも１つの配列、特に少なくとも１つのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列
を含む統合不全型レンチウイルスベクター。

【請求項2】

請求項１に記載のＩＤＬＶであって、前記ＩＤＬＶは、以下：
ｄ． 細胞のゲノム中の目的の内在性ゲノム部位の一部と相同な配列からなる、少なくとも１つの相同性アーム配列；
を含む、前記ＩＤＬＶ。

【請求項3】

前記ＩＤＬＶは、環状または線状であり、特に環状であることを特徴とする請求項１または２に記載のＩＤＬＶ。

【請求項4】

少なくとも２つの同一または異なるヌクレアーゼ部位、特に少なくとも２つの同一または異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列、および特に２つの同一または異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項5】

請求項４に記載のＩＤＬＶであって、目的の少なくとも１つの核酸配列が、前記ＩＤＬＶの少なくとも２つ、特に２つのヌクレアーゼサイトの間に含む、ＩＤＬＶ。

【請求項6】

前記少なくとも１つのヌクレアーゼ部位が、点ｄの細胞のゲノム中の目的の内在性ゲノム部位に含まれる内在性ヌクレアーゼ部位と同一であるか、または異なる、請求項１～５のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項7】

ＩＤＬＶが、少なくとも２つの相同性アーム配列、特に２つの相同性アーム配列を含み、それぞれが他と異なり、細胞のゲノム中の関心のある内因性ゲノム部位の少なくとも２つ、特に２つの異なる部分に相同な配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項8】

前記ＩＤＬＶは、プロモーターを含まない、請求項１～７のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項9】

前記細胞のゲノムにおける目的の内在性ゲノム部位が、グロビン遺伝子、特にイプシロングロビン遺伝子、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、ゼータグロビン遺伝子、シュードゼータグロビン遺伝子、ミューグロビン遺伝子、シュードアルファ－１グロビン遺伝子、アルファ１グロビン遺伝子およびアルファ２グロビン遺伝子からなる群より選択され、特に、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、アルファ１グロビン遺伝子及びアルファ２グロビン遺伝子からなる群から選択され、より詳細には、アルファ１グロビン遺伝子及びアルファ２グロビン遺伝子からなる群から選択されるグロビン遺伝子内に含まれる、請求項１～８のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項10】

目的の少なくとも１つの核酸配列が、治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはそのフラグメントである、請求項１～９のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項11】

治療用タンパク質が、サイトカイン、特にインターフェロン、より詳細にはインターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ又はインターフェロン－パイ；ホルモン；ケモカイン；抗体（ナノボディを含む）；抗血管新生因子；たとえばアデノシンデアミナーゼ、アルファグルコシダーゼ、アルファガラクトシダーゼ、アルファ－Ｌ－イドロニーゼ及びベータグルコシダーゼのような置換療法用の酵素；インターロイキン；インスリン；Ｇ－ＣＳＦ；ＧＭ－ＣＳＦ；ｈＰＧ－ＣＳＦ；Ｍ－ＣＳＦ；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ｔＰＡ、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｘ、第ＸＩ、第ＸＩＩ、第ＸＩＩＩ因子のような血液凝固因子；神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）のような膜貫通タンパク質；α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｌ－イドロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）およびガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のようなリソソーム系酵素；β様グロビン；ＩＬ－２レセプター、ＩＬ－３レセプター、ＩＬ－４レセプター、ＩＬ－５レセプター、ＩＬ－６レセプター、ＩＬ－７レセプター、ＩＬ－９レセプター、ＩＬ－１１レセプター、ＩＬ－１２レセプター、ＩＬ－１３レセプター、ＩＬ－１５レセプター、ＩＬ－２１レセプター、ＩＬ－２３レセプターおよびＩＬ－２７レセプターのようなインターロイキンレセプター；ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）；アデノシンデアミナーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１、アルファ－Ｌイデュロニダーゼ、イデュロン酸２－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンサルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、チトクロムｂ－２４５α鎖、チトクロムｂ－２４５β鎖、好中球細胞質因子１、好中球細胞質因子２、好中球細胞質因子４；分泌され、最終的に非修飾細胞に取り込まれるように設計されたタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０記載のＩＤＬＶ。

【請求項12】

配列ａからｃ、および存在する場合はｄとｅが、ＩＤＬＶにおいて、５’から３’まで、以下の順序：
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；
－ ａ、ｄ、ｃ、ｄ、ｂ；
－ ａ、ｄ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ;
－ ａ、ｃ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；または
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｃ、ｅ
の１つで存在する、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＩＤＬＶ。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載のＩＤＬＶを少なくとも１つ含む、単離細胞。

【請求項14】

細胞が、造血幹細胞；免疫系の細胞、特にリンパ球；多能性幹細胞；胚性幹細胞；衛星細胞；神経幹細胞；間葉系幹細胞；網膜幹細胞；及び上皮幹細胞からなる群から選択され、特に造血幹細胞である、請求項１３に記載の単離細胞。

【請求項15】

請求項１～１２のいずれか一項に定義される少なくとも１つのＩＤＬＶおよび／または請求項１３または１４に定義される少なくとも１つの単離細胞、および薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。

【請求項16】

－免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患、および／または
－それを必要とする個体における、タンパク質の欠如または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患
の治療に使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＩＤＬＶ、請求項１３および１４に記載の単離細胞、または請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩＤＬＶを、リンパ球Ｔ細胞または造血幹細胞に組み込むことを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成方法。

【請求項18】

リンパ球Ｂ細胞または造血幹細胞に、請求項１～１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むことを含み、前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、抗体をコードする導入遺伝子を含む、抗体発現Ｂ細胞を生成するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の技術分野
本発明は、ゲノム工学およびＤＮＡ修復の分野に関するものである。
特に、細胞のゲノムに正確かつ無毒な配列の組み込みを行うことができ、効率的なノックイン（ＫＩ）を実現するＩＤＬＶに関連するものである。

【0002】

背景技術
機能喪失変異による有害な細胞表現型に対抗する主要な治療法の一つは、野生型遺伝子コピーの細胞内導入に依存している。この点、ウイルスを用いた遺伝子置換療法は急速に発展している分野であるが、導入遺伝子のコピー数や発現レベルの制御が不完全であることに加え、レンチウイルスやレトロウイルスベクターのセミランダムな組み込みは、挿入変異誘発やがん原遺伝子の活性化をもたらすことがあり、またアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）やアデノウイルスベクターはエピソームとしてＤＮＡを導入するので循環細胞で希薄になってしまうという制限がある。

【0003】

近年、部位特異的ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断を利用して、選択した遺伝子座への導入遺伝子の組み込みを偏らせるという新しい戦略が開発されている。例えば、変異遺伝子を修正するために野生型の導入遺伝子を内在性遺伝子座に挿入するような、導入遺伝子をその同属遺伝子座に組み込むというアプローチがある。あるいは、トランスジーンは、永久的で安全な、非常に高いレベルのトランスジーン発現のような、有益な特性のために特別に選ばれた非同一遺伝子座に挿入されることもある。

【0004】

興味深いことではあるが、効率的かつ無毒な送達と、導入遺伝子の効率的な部位特異的組み込みを達成することは、依然として解決すべき複雑な課題である。

【0005】

人工核酸酵素を用いた標的ゲノム編集は、基礎生物医学研究に革命をもたらし、遺伝子治療に多大な可能性を秘めている。しかし、その急速な進歩にもかかわらず、効率的なツールの欠如により、臨床目的での標的遺伝子組み込み（ノックイン、ＫＩ）の目標はまだ定まっていない。分裂中および非分裂細胞におけるＫＩはすでに報告されているが、導入遺伝子の主要な送達手段はプラスミドＤＮＡであり、これは初代細胞（特に造血幹細胞、ＨＳＣ）において毒性があり、特定の細胞を標的とすることができず、ｉｎ ｖｉｖｏ送達には実行不可能であった。

【0006】

ウイルスベクターによるＤＮＡ導入は、プラスミドＤＮＡに代わる興味深い方法であり、特にＡＡＶやインテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）がその代表的なものである。レンチウイルスは一本鎖ＲＮＡ（約９．７Ｋｂ）であり、細胞核に入ると逆転写されて二本鎖ＤＮＡを生成し、宿主細胞ゲノムにセミランダムで組み込まれる。ＩＤＬＶは、インテグラーゼタンパク質を不活性化することによりレンチウイルスから派生したものであり、したがって、ゲノムに組み込む能力をブロックしている。ＩＤＬＶのゲノムは、消失する前に異なる分子形態で核内に持続する。しかし、ＩＤＬＶは、相同（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両者のための非効率的なＤＮＡ基質を表す。

【0007】

ＡＡＶは一本鎖ＤＮＡウイルス（～４．７ｋｂ）で、標的細胞の細胞核に入ると二本鎖になり、円形化してエピソームとして存続する。ＡＡＶはＨＤＲを介したＫＩに適した基質であるが、ＨＤＲはほとんどの初代細胞では効率が低く、細胞周期のＳ／Ｇ２期でほとんど起こるため、非分裂細胞では効率が悪いという制約がある。さらに、ＨＤＲのためには、ゲノムＤＮＡ切断部位と相同なゲノム断片（それぞれ～８００ｂｐ）で導入遺伝子を挟む必要があり、ＡＡＶによって送達できる導入遺伝子のサイズ（パッケージング能力は～４．７ｋｂ）に制限があり、ＡＡＶ生産と導入に影響を与える可能性がある（たとえば、二次構造の場合）。このため、４ｋｂを超えるコーディング配列を持つ全ヒトタンパク質の約６％がＡＡＶに収まらず、プロモーターやポリアデニル化シグナル（ポリＡシグナル）などの発現エレメントのサイズを小さくする必要があり、転写力や組織特異性が制限されることが多い（Chamberlain、Riyad、Weber, Hum. Gene Ther. Methods. 2016 Feb;27(1):1-12）。最近、脳と筋肉においてｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶのＮＨＥＪベースのＫＩを行う相同非依存性ＫＩ戦略が報告されたが、報告された効率は非常に低く、ほとんどのケースで５％未満であり、統合されたＤＮＡ断片のサイズは７００ｂｐ未満と非常に小さい（Suzuki et al. 2016 Dec 1;540(7631):144-149）。

【0008】

造血幹細胞におけるＫＩについては、ＩＤＬＶとＨＤＲを介したＫＩ用のホモロジーアームを含むＡＡＶの両方が使用されている。ＩＤＬＶでは、非常に低い効率しかｅｘ ｖｉｖｏで報告されておらず、マウスの移植時に最小である（<1% Kuo et al. Cell Rep. 2018 May 29;23(9):2606-2616; ~5% Genovese et al. Nature. 2014 Jun 12;510(7504):235-240; ほとんど検出されず、Schiroli et al., Sci Transl Med. 2017 Oct 11;9(411); <1% Hoban, Blood, 2015, Apr 23;125(17):2597-604)。ＡＡＶ６はより有望であり、最新の報告ではｅｘ ｖｉｖｏでのＫＩは３０－４０％である；しかし、ＡＡＶはｐ５３活性化や細胞のアポトーシスを誘導するため、幹細胞にとっても毒性がある(Hirsch, PlosOne, 2011; 6(11):e27520)。ＡＡＶ６導入は、いくつかの細胞毒性を示し(Kuoら、Cell Rep. 2018 May 29;23(9):2606-2616）、修飾された造血幹細胞の生着が減少する（Schiroliら、Cell Stem Cell, 2019 Apr 4;24(4):551-565）。さらに、ＨＤＲを介したＫＩは、実際の長期造血幹細胞を犠牲にして前駆細胞でほとんど発生し、その標的は～５倍少ない（Gomez-Ospina et al., Human genome-edited hematopoietic stem cells phenotypically correct Mucopolysaccharidosis type I; Bioarchive; doi: https://doi.org/10.1101/408757)。最後に、ＡＡＶの送達は、上述のように、そのパッケージングの限界に影響される。

【0009】

したがって、上述したように、細胞内への導入遺伝子の効率的、部位特異的かつ無毒な送達方法が必要とされている。また、細胞内に目的の配列を正確に、効率よく、かつ無毒性で導入することができる新規なツールも必要とされている。前記方法およびツールは、特に、有意なサイズ変動を有する目的の配列の送達を可能にすべきであり、特に、少なくとも１ｋｂ（キロベース）、特に数ｋｂのサイズを有する配列の送達を可能にする必要がある。

【0010】

本明細書に記載された発明は、前述のニーズを満たすことを目的とするものである。

【0011】

発明の要約
まず、本発明は、核酸を含む統合欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）に関し、前記核酸は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、以下を含む：
ａ． 少なくとも１つの核外搬出シグナル配列、特に少なくとも１つのＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答配列（Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＲＲＥ）、特に１つのＲＲＥ、
ｂ． ポリＡシグナル；スプライシングシグナル配列；ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位；プロモーター；および治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはその断片からなる群より選ばれる少なくとも一つの目的の核酸配列、
ｃ． 少なくとも１つのヌクレアーゼ部位、特に少なくとも１つのガイド核酸標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）、
ｄ． 任意に、細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位の一部と相同な配列からなる少なくとも１つの相同性アーム配列、および
ｅ． 場合により、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定した発現を高めることを可能にする少なくとも１つの配列、特に少なくとも１つのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列。

【0012】

本発明者らは、長さ９ｋｂ程度の配列であっても、効率的なＫＩにより、細胞のゲノムに正確かつ無毒な配列の組み込みを行うことができる新規ＩＤＬＶを開発することに成功した。

【0013】

本発明は、特に、核酸を含む統合欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）に関し、前記核酸は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、以下を含む：
ａ． 少なくとも１つの核輸出シグナル配列、特に少なくとも１つのＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、特に１つのＲＲＥ、
ｂ． ポリＡシグナル；スプライシングシグナル配列；ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位；プロモーター；および治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはその断片からなる群より選択される少なくとも１つの目的の核酸配列、
ｃ． 少なくとも１つのヌクレアーゼ部位、特に少なくとも１つのガイド核酸標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）、
ｄ． 細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位の一部と相同な配列からなる少なくとも１つのホモロジーアーム配列；および
ｅ． 場合により、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定した発現を高めることを可能にする少なくとも１つの配列、特に少なくとも１つのウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列。

【0014】

実際、特定の実施形態において、本発明によるＩＤＬＶは、以下を含む：
ｄ． 細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位の一部と相同である配列で構成される少なくとも１つの相同性アーム配列。

【0015】

特定の実施形態によれば、前記ＩＤＬＶは、環状又は線状であり、特に環状である。

【0016】

本発明の実施形態によれば、前記ＩＤＬＶは、少なくとも２つの同一又は異なるヌクレアーゼ部位、特に少なくとも２つの同一又は異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列、特に２つの同一又は異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列を含む。特に、目的の少なくとも１つの核酸配列は、前記ＩＤＬＶの少なくとも２つの、特に２つのヌクレアーゼサイトの間に含むことができる。

【0017】

本発明の実施形態によれば、本発明のＩＤＬＶの少なくとも１つのヌクレアーゼ部位は、点ｄの細胞のゲノム中の関心のある内在性ゲノム部位に含まれる内在性ヌクレアーゼ部位と同一であるか、又は異なるものである。

【0018】

特定の実施形態では、本発明のＩＤＬＶの関心のある少なくとも１つの核酸配列は、治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはそのフラグメントである。

【0019】

特に、治療用タンパク質は、サイトカイン、特にインターフェロン、より具体的にはインターフェロンアルファ、インターフェロンベータまたはインターフェロンパイ；ホルモン；ケモカイン；抗体（ナノボディを含む）；抗血管新生因子；たとえば、アデノシンデアミナーゼ、アルファグルコシダーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼおよびベータ－グルコシダーゼなどの補充療法のための酵素；インターロイキン；インスリン；Ｇ－ＣＳＦ；ＧＭ－ＣＳＦ；ｈＰＧ－ＣＳＦ；Ｍ－ＣＳＦ；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ｔＰＡ、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、または第ＸＩＩＩ因子などの血液凝固因子。神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）などの膜貫通型タンパク質；α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）などのリソソーム酵素；ベータ様グロビン；ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－５受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－９受容体、ＩＬ－１１受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬなどのインターロイキン受容体－１３受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、ＩＬ－２３受容体およびＩＬ－２７受容体；Ｗｉｓｋｏｔｔ-Ａｌｄｒｉｃｈ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）；アデノシンデアミナーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１、α－Ｌイズロニダーゼ、イズロン酸２－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サイト、チトクロムｂ－２４５ベータ鎖、好中球サイトゾル因子１、好中球サイトゾル因子２、好中球サイトゾル因子４；分泌され、最終的には非修飾細胞に取り込まれるように操作できるタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。

【0020】

本発明の一実施形態では、ＩＤＬＶは、少なくとも２つの相同性アーム配列、特に２つを含み、それぞれが互いに異なり、細胞のゲノムにおける関心のある内因性ゲノム部位の、少なくとも２つ、特に２つの異なる部分に相同である配列からなる。

【0021】

特定の実施形態では、本発明のＩＤＬＶは、プロモーターを含まない。

【0022】

本発明の一実施形態では、細胞のゲノムにおける目的の内因性ゲノム部位は、グロビン遺伝子内に含まれ、特に、イプシロングロビン遺伝子、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、ゼータグロビン遺伝子、シュードゼタグロビン遺伝子、ミューグロビン遺伝子、シュードアルファ－１グロビン遺伝子、アルファ１グロビン遺伝子およびアルファ２グロビン遺伝子からなる群から選択され、特に、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、アルファ１グロビン遺伝子およびアルファ２グロビン遺伝子からなる群から選択され、より具体的にはアルファ１グロビン遺伝子およびアルファ２グロビン遺伝子からなる群から選択される。

【0023】

別の実施形態において、本発明のＩＤＬＶの配列ａからｃ、および存在する場合、ｄおよびｅは、以下の順序のうちの１つで、５’から３’まで、ＩＤＬＶ中に存在する：
－ａ、ｃ、ｄ、ｂ；
－ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ；
－ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ；
－ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；
－ａ、ｄ、ｃ、ｄ、ｂ；
－ａ、ｄ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ；
－ａ、ｃ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；または
－ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｃ、ｅ。

【0024】

本発明の別の目的は、本発明の少なくとも１つのＩＤＬＶを含む単離された細胞に関する。

【0025】

特に、細胞は造血幹細胞；免疫系の細胞、特にリンパ球；多能性幹細胞；胚性幹細胞；衛星細胞；神経幹細胞；間葉系幹細胞；網膜幹細胞；および上皮幹細胞からなる群から選択することができ、特に造血幹細胞である。

【0026】

本発明のさらなる目的は、本発明の少なくとも１つのＩＤＬＶ及び／又は本発明の少なくとも１つの単離細胞、並びに薬学的に許容される媒体を含む薬学的組成物に関するものである。

【0027】

本発明の別の目的は、以下の治療において使用するための、本発明のＩＤＬＶ、本発明の単離細胞、または本発明の医薬組成物に関する：
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／または
－ それを必要とする個体における、タンパク質の欠如または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患。

【0028】

本発明のさらなる目的は、リンパ球Ｔ細胞または造血幹細胞に、本発明の少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むことを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する方法に関するものであり、本発明のＩＤＬＶは、リンパ球Ｔ細胞または造血幹細胞に組み込まれ、前記ＩＤＬＶは、少なくとも１つの目的の核酸配列として、癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを含む。

【0029】

本発明の他の目的は、抗体発現Ｂ細胞を生成する方法であって、リンパ球Ｂ細胞または造血幹細胞に、本発明の少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むことを含む、方法に関し、前記ＩＤＬＶは、少なくとも１つの目的の核酸配列として、抗体をコードするトランスジーンを含む。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1A】図１Ａ：長い末端反復（ＬＴＲ）配列の間に、左から右に、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、ｇＲＮＡ切断部位（ｇＲＮＡ－Ｔ）（ｇＲＮＡ）を含む本発明によるＩＤＬＶの概略図（ヌクレアーゼ部位）、ＩＤＬＶが組み込まれる細胞のゲノム内の目的の内因性ゲノム部位の一部と同一の３５ｂｐのマイクロホモロジー（ＭＨ５’）（ホモロジーアーム）、プロモーターレス（Δ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をコードする配列。このカセットは、ＬＴＲおよびＲＲＥウイルス配列に関してセンス方向にある。

【図1B】図１Ｂ：Ｃａｓ９切断時の細胞ゲノムへのＩＤＬＶ統合の１つの可能な結果の概略図。内因性α－グロビンプロモーター（ＨＳ１－４）は、α－グロビンプロモーターとα遺伝子（ＨＢＡ）の間に挿入されるＧＦＰの発現を促進する。

【図1C】図１Ｃ：表は、ポイント（Ａ）で説明したＩＤＬＶと異なるｇＲＮＡ（ＨＢＡ１５．１またはＨＢＡ１６．１）を使用してＨＢＡ遺伝子におけるＧＦＰ組み込み後のＫ５６２－Ｃａｓ９細胞（Ｃａｓ９を安定して発現するヒト白血病細胞株Ｋ５６２）でのＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって測定されたゲート細胞のＧＦＰ＋細胞の割合とＧＦＰＭＦＩ（蛍光強度の中央値）値を示している。ＩｎＤｅｌの効率は、ｇＲＮＡを実装する２つの方法でも測定される。「ｎｏ－ｇＲＮＡ」コントロールで得られた結果も示されている。

【図2A】図２Ａ：Ｋ５６２－Ｃａｓ９細胞クローンにおけるＩＤＬＶゲノム統合を分析するために実行されたＰＣＲの概略図。二重矢印は、増幅に使用されるプライマーを表す。

【図2B】図２Ｂ：分析された１６３クローンのＤＮＡおよびＦＡＣＳ分析の要約表。組み込みがシームレスであるかどうかを確認するために、本発明者らは、ＰＣＲ２に由来する各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングを実施した。

【図3】図３：Ｋ５６２細胞に図１Ａに示す本発明のＩＤＬＶを形質導入し、表に示す時間（４時間、８時間、２４時間、３２時間、または４８時間）後、異なるｇＲＮＡ（ＨＢＡ１５．１またはＨＢＡ１６．１）を使用したＲＮＰ（組み立て済のＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体）を用いて細胞にトランスフェクトする。ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析は、ＩＤＬＶ形質導入から２週間後、ＩＤＬＶとＲＮＰの送達の間に４時間、８時間、２４時間、３２時間、および４８時間の遅延後に実行される。ＲＮＰが導入されていない場合に制御が実行される。この表は、ゲートされた細胞のＧＦＰ＋細胞の割合とＧＦＰＭＦＩ（蛍光強度の中央値）値を示している。ＩｎＤｅｌの効率は、ＨＢＡ１５．１ｇＲＮＡまたはＨＢＡ１６．１ｇＲＮＡを実装する２つの方法でも測定される。コントロールで得られた結果も示されている。

【図4A】図４Ａ：長い末端反復（ＬＴＲ）配列の間に、左から右に、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ｇＲＮＡ切断部位（ｇＲＮＡ－Ｔ）（ｇＲＮＡ）（ヌクレアーゼ部位）、ＩＤＬＶが組み込まれる細胞のゲノム内の目的の内因性ゲノム部位の一部と同一の３５ｂｐのマイクロホモロジー（ＭＨ５’）（ホモロジーアーム）、プロモーターレス（Δ）コドン最適化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）（ｃｏＦ８）およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む本発明によるＩＤＬＶの概略図。このカセットは、ＬＴＲおよびＲＲＥウイルス配列に関してセンス方向にある。

【図4B】図４Ｂ：Ｋ５６２－Ｃａｓ９細胞クローンにおけるＩＤＬＶゲノム統合を分析するために実行されたＰＣＲの概略図。二重矢印は、増幅に使用されるプライマーを表す。この図には、Ｃａｓ９切断時のＫ５６２－Ｃａｓ９細胞のゲノムにおけるＩＤＬＶ統合の１つの可能な結果の概略図も示されている。内因性α－グロビンプロモーター（ＨＳ１－４）は、α－グロビンプロモーターとα遺伝子（ＨＢＡ）の間に挿入されるＧＦＰの発現を促進する。

【図4C】図４Ｃ：分析された２７クローンのＤＮＡおよびＥＬＩＳＡ分析の要約表。組み込みがシームレスであるかどうかを確認するために、本発明者らは、ＰＣＲ２に由来する各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングを実施した。

【図4D】図４Ｄ：デュプリケートで行った、ＦＶＩＩＩカセットの標的化された組み込みを伴うバルクおよび単一のＫ５６２－Ｃａｓ９クローンの上清に存在するＦＶＩＩＩのＥｌｉｓａに続いて得られた結果（テスト１および２）。上から順に：クローン１２、クローン２４、クローン２６、クローン２７、ｕｔ（未処理の細胞）、細胞バルク（ＧＰ３４バルク）、ＮＮＦ（非ヌクレオフェクト細胞- ＧＰ３４ ＮＮＦ）。

【図5A】図５Ａ：長い末端反復（ＬＴＲ）配列の間に、左から右に、ｇＲＮＡ切断部位（ｇＲＮＡ－Ｔ）（ｇＲＮＡ）（ヌクレアーゼ部位）、３５ｂｐのマイクロホモロジー（ＭＨ ５’）（ホモロジーアーム）ＩＤＬＶが組み込まれる細胞のゲノム内の目的の内因性ゲノム部位の一部と同一、プロモーターのない（Δ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列、ポリアデニル化シグナルＡ（ｐｏｌｙＡシグナルまたはｐＡ）、プロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）およびＲｅｖ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＲＥ）の構成的発現を駆動するヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター。このカセットは、ＬＴＲおよびＲＲＥウイルス配列に関してアンチセンス方向にある。この概略図のすぐ下には、コントロールカセットに対応する別の概略図がある。このカセットは、切断部位（ｇＲＮＡ－Ｔ）（ｇＲＮＡ）（ヌクレアーゼ部位）および３５ｂｐのＭＨ５’相同性アーム配列を含まないという点で、上記で定義された発明によるものとは異なる。

【図5B】図５Ｂ：ポイント（Ａ）に記載されているＩＤＬＶとＨＢＡ１５．１ｇＲＮＡを用いてＫ５６２－Ｃａｓ９細胞のＨＢＡ遺伝子にＧＦＰを組み込んだ後、Ｋ５６２－Ｃａｓ９細胞のＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって測定されたゲート細胞のＧＦＰ＋細胞の割合とＧＦＰＭＦＩ（蛍光強度の中央値）値を示す表。ＩｎＤｅｌの効率も測定される。「ｎｏ－ｇＲＮＡ－Ｔ配列」コントロールで得られた結果も示されている。

【図6A】図６Ａ：図１Ａに記載されたＩＤＬＶおよび異なるｇＲＮＡ（ＨＢＡ１５．１またはＨＢＡ１６．１）を使用した細胞のＨＢＡ遺伝子へのＧＦＰ組み込み後の赤芽球分化一次ＨＳＰＣにおけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって測定されたゲート細胞のＧＦＰ＋細胞の％およびＧＦＰ ＭＦＩ（中央蛍光強度）値を示す表。ＩｎＤｅｌの効率も測定される。

【図6B】図６Ｂ：編集された細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ。バーは、標準偏差のある２枚のプレートの平均カウントを表す。座標：カウント 横軸：左から右へ：ＨＢＡ１５．１（ＧＰ３３ ＨＢＡ１５）を備えた図６Ａのセル。ｇＲＮＡを含まない図６Ａの細胞（ＧＰ３３）；図６ＡのセルとＨＢＡ１６．１（ＧＰ３３ ＨＢＡ１６）、未処理のセル（ＵＴ）。各列の基部から上へ：ＣＦＵ－ＧＥＭＭ（顆粒球／マクロファージ形成ユニット；ＢＦＵ－Ｅ（赤血球バースト形成ユニット）およびＣＦＵ－ＧＭ（顆粒球／赤血球／単球／巨核球形成単位）。

【図6C】図６Ｃ：１３ＣＦＵのＤＮＡ分析の要約表。統合がシームレスであるかどうかを確認するために、発明者らは、ＰＣＲ２に由来する各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングを実行した（図２Ｂに示すように）。

【図7A】図７Ａ：最初の行：長い末端反復（ＬＴＲ）配列の間に、左から右に、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、ｇＲＮＡ切断部位（ｇＲＮＡ－Ｔ）を含む本発明（ＧＰ５７）によるＩＤＬＶの概略図（ ）（ヌクレアーゼ部位＝配列番号６７＝ＧＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧ）、ＩＤＬＶが組み込まれる細胞のゲノム内の目的の内因性ゲノム部位の一部と同一の３５ｂｐのマイクロホモロジー（ＭＨ５’）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）。このカセットは、ＬＴＲおよびＲＲＥウイルス配列に関してセンス方向にある。２行目：本発明（ＧＰ５８）によるＩＤＬＶの概略図。これは、ＭＨ５’相同性アーム配列の３５ｂｐを含まないという事実のみが１行目に示されているＩＤＬＶとは異なる。３行目：コントロールＩＤＬＶ（ＭＡ２７７）の概略図。これは、ＭＨ５’相同性アーム配列の３５ｂｐまたはｇＲＮＡ切断部位を含まないという点で１行目に示されているＩＤＬＶとは異なる。

【図7B】図７Ｂ：ポイント（Ａ）に記載したＩＤＬＶ構造を使用してＡＡＶＳ１遺伝子座にＧＦＰを組み込んだ後、Ｋ５６２細胞のＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析によって測定されたゲート細胞のＧＦＰ＋細胞の割合とＧＦＰＭＦＩ（蛍光強度の中央値）値を示す表およびＡＡＶＳ１ｇＲＮＡを使用したＲＮＰ。ＩｎＤｅｌの効率とベクターコピー数（ＶＣＮ）も測定される。「ｎｏ－ｇＲＮＡ－Ｔ配列」コントロールで得られた結果も示されている。

【図8A】図８Ａ：実施例７の実験後に得られたＫ５６２細胞クローンにおけるオンターゲットＩＤＬＶゲノム統合を分析するために実行されたＰＣＲの概略図。二重矢印は、増幅に使用されるプライマーを表す。

【図8B】図８Ｂ：３６５クローンのオンターゲットＤＮＡ分析の要約表。組み込みがシームレスであるかどうかを確認するために、発明者らは、図８Ａに記載されている最初のＰＣＲから得られた各ＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングを実行した。

【図8C】図８Ｃ：実施例７の実験後に得られたＫ５６２細胞クローンにおけるオフターゲットＩＤＬＶゲノム統合を分析するために実行されたＰＣＲの概略図。二重矢印は、増幅に使用されるプライマーを表す。

【図8D】図８Ｄ：３６５クローンの１つの主要なオフターゲットＤＮＡ分析の要約表。

【0031】

発明の詳細な説明
上記のように、本発明者らは、効率的なＫＩによって実現される高効率で、細胞のゲノムにおいて正確で非毒性の配列統合を実行することができるＩＤＬＶを生成することに成功した。さらに、本発明者らは、このＩＤＬＶがかなりの長さを有する配列の組み込みさえも可能にすることを実証した。

【0032】

本発明のＩＤＬＶで標的化された細胞の核において、レンチウイルスＲＮＡゲノムは、ｄｓＤＮＡを生成するために逆転写される。このｄｓＤＮＡをヌクレアーゼでターゲットにすると、他のＤＮＡ末端と相互作用しやすい遊離ＤＮＡ末端が生成される。したがって、同じ細胞内でゲノムＤＮＡカットを生成することにより、発明者らは、目的の配列のＫＩの増加を可能にすることに成功した。

【0033】

統合欠損レンチウイルスベクター
本発明は、核酸を含む組み込み欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）に関する。前記核酸は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に以下を含む：
ａ．少なくとも１つの核輸出シグナル伝達配列、特に少なくとも１つのＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、特に１つのＲＲＥ、
ｂ．ポリＡシグナルからなる群から選択される目的の少なくとも１つの核酸配列。スプライシングシグナル配列；ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位；プロモーター；治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはその断片、
ｃ．少なくとも１つのヌクレアーゼ部位、特に少なくとも１つのガイド核酸標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）、および
ｄ．細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位の一部に相同である配列からなる少なくとも１つの相同性アーム配列。
本テキストでは、ＬＴＲは、当業者によく知られている「ロングターミナルリピート」を示す。

【0034】

現在のテキストでは、別のシーケンス位置と比較したシーケンス位置に関連する「アップスチーム」および「ダウンスチーム」という用語は、５’から３’の方向であると見なされる。アップストリームシーケンスは、５’から３’まで読み取る場合の他のシーケンスの「前」に配置される（したがって、ダウンストリームシーケンスである）。

【0035】

前に配置することにより、反対の表示がない場合、それは直前または直前ではないことを意味する。

【0036】

レンチウイルスは、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列に隣接する他のアクセサリー遺伝子に加えて、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を持っている。

【0037】

他のレンチウイルスと同様に、ＩＤＬＶは、ＬＴＲ５’および３’レンチウイルス配列の間に、レンチウイルスカプシデーションサイ配列、ＲＮＡ核輸出要素、目的の核配列（たとえば導入遺伝子）、スプライシングドナー／アクセプターサイト、およびｃＰＰＴ配列からなる組み換えゲノムを含んでなる（Dullら(1998)J. Vir. 72:8463; Sirvenら(2000) Blood, (96)203)）。ＩＤＬＶ構築物の設計は、たとえば、Shawら、Biomedecines, 2014, 2, 14-35に記載されている。

【0038】

ＩＤＶＬの製造は、当技術分野で周知のレンチウイルスベクターの製造と同様である。当業者は、特にMertenら（2016）Molecular therapy（3）16017, Sharon and Kamen（2017）Biotechnology and Bioengineering（115）25, Mertenら（2011）Hum.Gene Ther 22（3）343, Schweizer and Merten（2010）Cur.Gene Ther. 10(6) 474、Ansorgeetら(2010)。Biochem. Eng. J. 48(3): 362.に表されたこの分野の一般知識を参照し得る。ＩＤＬＶは、例えば、Yanez-Munozら（2006）Nat Med 12（3）：348-353；Nightingaleら（2006）Mol Ther 13（6）：1121-1 132、W0206／010834およびWO2009／019612に開示されるように、ネイティブのレンチウイルスインテグラーゼ遺伝子自体またはウイルスＬＴＲ中のインテグラーゼ認識配列に１または複数の変異を含むレンチウイルスベクターを使用して製造することができる。好ましくは、ＩＤＬＶは、宿主細胞のゲノムへの前記ゲノムの統合を防止する変異したインテグラーゼを含んでいる。特定の実施形態では、ＩＤＬＶは、酵素の触媒ドメインに変異Ｄ６４Ｖを有する欠陥インテグラーゼを有する。

【0039】

本発明によるＩＤＬＶは、シュードタイプ化することができる、すなわち、それは、ＩＤＬＶに由来するウイルスとは異なるウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質、改変されたエンベロープ糖タンパク質、またはキメラ外被糖タンパク質を含む。特定の実施形態では、ＩＤＬＶは、ＶＳＶ－Ｇ、ＧＡＬＶ－ＴＲ、ＲＤ１１４またはシンシチン糖タンパク質でシュードタイプ化される。

【0040】

シーケンスａ：ニュークリアスエクスポートシグナリングシーケンス
上記のように、本発明のＩＤＬＶは、それが５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、少なくとも１つの核外搬出シグナル配列を含む少なくとも１つの核酸を含むことを特に特徴とする。

【0041】

この少なくとも１つの核外搬出シグナル配列は、本発明のＩＤＬＶに一度だけ存在することができる。

【0042】

より具体的には、この核外搬出シグナル配列は、上記の配列ｂからｅの上流にあり得る。

【0043】

したがって、特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、それが、上記の配列ｂからｅの上流に１つの核外搬出シグナル配列を含む核酸を含むことを特に特徴とする。

【0044】

本発明による核外搬出シグナル配列は、有利には、ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）であり得る。

【0045】

ＲＲＥ配列（Ｒｅｖ応答配列：ＲＥＶ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ）は約３５０塩基のＲＮＡ配列で、特にＲｅｖタンパク質と結合した後、ウイルスのメッセンジャーＲＮＡを核から細胞質へ輸送することができるため、ウイルスの複製に不可欠なものとして知られている。しかし、レンチウイルスベクターにおけるこのエレメントの存在は、効率的なベクター機能にとって必須であることも証明されている（たとえば、Anson and Fuller; J. Gene Med. 2003; 5: 829-838を参照）。

【0046】

本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、それが、上記および以下に記載される配列ｂからｅの上流に１つのＲＲＥ配列を含む核酸を含むことを特徴とする。

【0047】

配列ｂ：目的の核酸配列
上記のように、本発明のＩＤＬＶは、それが５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、少なくとも１つの目的の核酸配列を含む少なくとも１つの核酸を含むことを特に特徴とする。

【0048】

この目的の核酸は、ｐｏｌｙＡシグナル；スプライシングシグナル配列；ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位；プロモーター；治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする導入遺伝子またはその断片からなるグループから選択される。

【0049】

ポリＡシグナルは、一般に、ＡＡＵＡＡＡ配列であり、これは、前記シグナルの約１０～３０ヌクレオチド下流でＲＮＡの切断を誘導する。その後、複数のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の配列、つまりアデニン塩基のみを持つ配列。それは、たとえば、５０から３００のアデノシン一リン酸、特に７０から２５０のアデノシン一リン酸から構成することができる。

【0050】

スプライシングシグナル配列は、スプライス部位自体の配列と、エキソニックスプライシングエンハンサー、イントロンスプライシングエンハンサー、エキソニックスプライシングサイレンサーなどの補助シグナルに分けることができる。すべてのスプライス部位は、イントロンの両端にほぼ不変のジヌクレオチドを含むコンセンサス配列に適合し、一般に、５’スプライスサイトではＭＡＧ｜ＧＴＲＡＧＴ、３’スプライスサイトではＣＡＧ｜Ｇの配列を有している。

【0051】

ＤＮＡまたはＲＮＡ結合部位とは、例えば、内因性遺伝子転写を調節するための転写活性化因子、転写抑制因子またはエピジェネティック修飾因子の結合部位に関するものである。ＲＮＡ結合部位は、例えば、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ局在化、ＲＮＡ核輸出／輸入に影響を与えるためのタンパク質結合用ＲＮＡ配列、マイクロＲＮＡ媒介の導入遺伝子抑制またはノックダウン用のマイクロＲＮＡ結合部位であることができる。

【0052】

本発明によるトランスジーンは、治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする。

【0053】

本発明の一実施形態において、前記治療用タンパク質または治療用リボ核酸は、ＩＤＬＶが存在する細胞、特に治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする配列が細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位に組み込まれる細胞に対して治療効果を提供する任意のタンパク質またはリボ核酸であり得る。

【0054】

本発明の別の実施形態では、前記治療用タンパク質は、ＩＤＬＶが存在する細胞の外、特に治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードする配列が細胞のゲノム中の目的の内因性ゲノム部位に組み込まれる細胞の外で治療効果を提供する任意のタンパク質であり得る。前記治療用タンパク質は、実際に前記細胞によって分泌され得るか、または前記細胞の表面上に部分的に（たとえば膜貫通タンパク質）または完全に存在し得る。

【0055】

治療用タンパク質は特に、サイトカイン、特にインターフェロン、より詳細にはインターフェロン－α、インターフェロン－β又はインターフェロン－ｐｉ；ホルモン；ケモカイン；抗体（ナノボディを含む）；抗血管新生因子；置換療法用の酵素、例えばアデノシンデアミナーゼ、αグルコシダーゼ、αガラクトシダーゼ、α－Ｌ－イドロニーゼ及びβグルコシダーゼインターロイキン；インシュリン；Ｇ－ＣＳＦ；ＧＭ－ＣＳＦ；ｈＰＧ－ＣＳＦ；Ｍ－ＣＳＦ；第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ｔＰＡ、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｘ、第ＸＩ、第ＸＩＩ、第ＸＩＩＩ因子のような血液凝固因子；神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）などの膜貫通タンパク質；α－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、α－Ｌ－イドロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）およびガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）などのリソソーム酵素；β様グロビン；ＩＬ－２受容体、ＩＬ－３受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－５受容体、ＩＬ－６受容体、ＩＬ－７受容体、ＩＬ－９受容体、ＩＬ－１１受容体、ＩＬ－１２受容体、ＩＬ－１３受容体、ＩＬ－１５受容体、ＩＬ－２１受容体、ＩＬ－２３受容体およびＩＬ－２７受容体のようなインターロイキン受容体；ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳＰ）；アデノシンデアミナーゼ、トリペプチジルペプチダーゼ１、α－Ｌイデュロニダーゼ、イデュロン酸２－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンサルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、チトクロムｂ－２４５α鎖、チトクロムｂ－２４５β鎖、好中球細胞質因子１、好中球細胞質因子２、好中球細胞質因子４、分泌され、最終的に非修飾細胞に取り込まれるように設計されたタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択可能である。

【0056】

本明細書に記載の導入遺伝子は、たとえば、少なくとも１つのβ様グロビンタンパク質及び／又は少なくとも１つのβ様グロビンリボ核酸をコードすることができ、特に、少なくとも１つの機能的β様グロビンタンパク質をコードしている。本発明によるβ様グロビン遺伝子は、イプシロン－グロビン（ε）、γ－Ｇ－グロビン（Ｇγ）、γ－Ａ－グロビン（Ａγ）、デルタ－グロビン（δ）及びβ－グロビン（β）遺伝子からなる群より選択される遺伝子を指す。特に、本発明によるβ様グロビン遺伝子は、β-グロビン遺伝子である。

【0057】

本発明によるトランスジーンは、２つ以上の治療用タンパク質および／または治療用リボ核酸をコードすることができる。例えば、本発明によるトランスジーンは、２つの治療用タンパク質、特に２つの異なる治療用タンパク質をコードすることができる。前記治療用タンパク質は、上記で定義したとおりであることができる。別の実施形態では、本発明によるトランスジーンは、２つの治療用リボ核酸、特に２つの異なる治療用リボ核酸をコードすることができる。前記治療用リボ核酸は、上記で定義した通りであることができる。別の実施形態では、本発明によるトランスジーンは、１つの治療用タンパク質および１つの治療用リボ核酸をコードすることができ、前記治療用タンパク質および治療用リボ核酸は、特に、上記で定義されたとおりである。

【0058】

また、本発明は、上記で定義した本発明の導入遺伝子の断片に関するものである。前記フラグメントは、前記治療用タンパク質と同じ特性を有する、優れた、類似した、または劣った強度／レベルの、目的の治療用タンパク質の画分とすることができる。

【0059】

特定の実施形態において、目的の少なくとも１つの核酸配列は、治療用タンパク質または治療用リボ核酸をコードするトランスジーンまたはそのフラグメントである。

【0060】

特定の実施形態では、本発明によるＩＤＬＶは、関心のある１つの核酸配列のみを含む。

【0061】

別の実施形態では、本発明によるＩＤＬＶは、その関心のある核酸配列（複数可）の直前および／または直後に、本明細書で定義される少なくとも１つの相同性アーム配列（配列ｄ）を含む。

【0062】

本発明の特定の実施形態では、本発明によるＩＤＬＶは、１つの関心対象の核酸配列のみと、当該関心対象の核酸配列の直前及び／又は直後に存在する少なくとも１つのホモロジーアーム配列とからなる。

【0063】

特定の実施形態において、本発明によるＩＤＬＶは、２つの相同性アーム配列からなり、一方の相同性アーム配列は、少なくとも１つの、特に１つの、関心のある核酸配列の上流にあり、他方の相同性アーム配列は、少なくとも１つの、特に１つの、関心のある核酸配列の下流にある。

【0064】

別の実施形態では、本発明によるＩＤＬＶは、２つのホモロジーアーム配列を含み、２つのホモロジーアーム配列は、少なくとも１つの、特に１つの、関心のある核酸配列の上流に存在する。

【0065】

配列番号ｃ：ヌクレアーゼ部位
上述したように、本発明のＩＤＬＶは、特に、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、少なくとも１つのヌクレアーゼ部位を含んでなることを特徴とするものである。

【0066】

本発明によるヌクレアーゼ部位とは、一旦二本鎖ＤＮＡに逆行転写されると、ヌクレアーゼによって認識されるＲＮＡ配列のことである。したがって、ヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することになる。ヌクレアーゼによって、この作用は一本鎖または両鎖で行われ、認識されたＤＮＡ配列の一本鎖または二本鎖の切断につながる。

【0067】

前記ヌクレアーゼ部位は、たとえば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼから選択された標的部位に結合するガイドペプチド含有エンドヌクレアーゼによって認識される部位であり得る。

【0068】

ＴＡＬＥＮｓ技術は、非特異的なＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼ）と特異的なＤＮＡ結合ドメインが融合したものである。特異的ＤＮＡ結合ドメインは、キサントモナス属細菌が分泌し、宿主植物細胞の遺伝子の転写を変化させるタンパク質である転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥｓ）由来の高度な保存反復配列で構成されている。ＤＮＡ切断ドメイン又は切断ハーフドメインは、例えば、Ｆｏｋ Ｉの様々な制限エンドヌクレアーゼ及び／又はホーミングエンドヌクレアーゼ（たとえば、Fok I Type IIS restriction endonuclease）から得ることができる（Wrightら(Biochem. J. 2014 Aug. 15;462(1):15-24)を参照）。

【0069】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメイン（ヌクレアーゼ）の融合によって生成された人工制限酵素の使用からなる。ジンクフィンガードメインは目的のＤＮＡ配列を特異的に捉えるため、関連するヌクレアーゼは複雑なゲノムの中でユニークな配列をターゲットにすることができる。

【0070】

亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２本のフィンガーモジュールの鎖で構成され、それぞれがＤＮＡのユニークな６量体（６ｂｐ）配列を認識する。２本のフィンガーモジュールが縫い合わされ、ジンクフィンガータンパク質が形成される。ＴＡＬＥＮｓ技術と同様に、ＤＮＡ切断ドメインはＦｏｋ Ｉのヌクレアーゼドメインからなる（Carroll D, Genetics, 2011 Aug; 188(4): 773-782; Urnov F.D. Nat Rev Genet. (9):636-46, (2010)）。

【0071】

別の実施形態では、ヌクレアーゼ部位は、標的部位特異性を欠くエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼによって標的化される部位であり得る。そのようなＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、特に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）関連タンパク質（Ｃａｓ）、特にＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）であることが可能である。

【0072】

本実施形態では、ヌクレアーゼ部位は、１つ以上のガイド核酸、特にガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）により認識される。ガイド核酸、特にガイドＲＮＡによって認識される本発明のヌクレアーゼ部位は、ガイド核酸標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）であるとも指定される。このガイド核酸は、本発明のヌクレアーゼ部位を特異的に標的として認識する。また、このガイド核酸には、上記のようにＩＤＬＶのヌクレアーゼ部位を切断する標的部位特異性を欠くエンドヌクレアーゼが連結されている。

【0073】

本発明によるヌクレアーゼ部位を標的とするｇＲＮＡは、それを特異的に標的とするものであれば、どのようなものでも使用することができる。たとえば、本発明にしたがって使用できるｇＲＮＡは、特にグロビン遺伝子内のヌクレアーゼ部位を標的とするものであり得、より詳細には、イプシロングロビン遺伝子、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、ゼータグロビン遺伝子、偽ゼータグロビン遺伝子からなる群より選ばれるいずれか１つに存在するヌクレアーゼ部位を標的としているものである。μグロビン遺伝子、擬α－１グロビン遺伝子、α１グロビン遺伝子及びα２グロビン遺伝子、特にγＧグロビン遺伝子、γＡグロビン遺伝子、δグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、α１グロビン遺伝子及びα２グロビン遺伝子、より特にα１グロビン遺伝子とα２グロビン遺伝子からなる群から選択される。

【0074】

上記のようなｇＲＮＡは、たとえば、下記の表１に示す配列をターゲットとするＨＢＡ－４、ＨＢＡ－１０、ＨＢＡ－１２、ＨＢＡ－１４、ＨＢＡ１９．１、ＨＢＡ１５．１、ＨＢＡ１６．１、ＨＢＡ１７－Ｇ、ＨＢＡ２０．１、ＨＢＡ５．１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、ｇＲＮＡ１１、ＨＢＡ ＩＮＴ１ ７２．１、ＨＢＡ ＩＮＴ１ ７３．２ 、ＨＢＡ ＩＮＴ１ ７３ｂ．１、ＨＢＡ ＩＮＴ２ １３．２、ＨＢＡ ＩＮＴ２ ６３．２、ＨＢＡ ＩＮＴ２ ７４．１、Ｈｂｂ ３７．１、Ｈｂｂ ４９．２、Ｈｂｂ ５３．１、Ｈｂｂ ５４．１、Ｈｂｂ ７７．１、Ｈｂｂ ＩＮＴ１ ３６．２、Ｈｂｂ ＩＮＴ１ ３６．２ ｒｅｖ、Ｈｂｂ ＩＮＴ１ ４７．１、Ｈｂｂ ＩＮＴ１ ４８．１、ＨＢＡ ＩＮＴ２ １３．３、ＨＢＡ ＩＮＴ１ １３．３ ｒｅｖ、ＨＢＡ ＩＮＴ２ １３．３ ｒｅｖ． １、ＨＢＢ ＩＮＴ２ ３４０．１、ＨＢＢ ＩＮＴ２ ７９７．１、ＨＢＢ ＩＮＴ２ ２０．１、ＨＢＢ ＩＮＴ２ ３９．２、ＨＢＢ ＫＯ ｅｔ ＨＢＢ ＡＡＶＳ１からなる群より選択することができる。

【0075】

【表1】

【0076】

本発明によるＩＤＬＶは、特に、その５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、１つまたは２つのヌクレアーゼ部位（複数可）を含む。
２つのヌクレアーゼ部位が本発明のＩＤＬＶの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に存在するとき、それらは異なっていても同一であってもよい。特にそれらは異なっている。
特定の実施形態では、本発明のＩＤＬＶは、少なくとも２つの同一または異なるヌクレアーゼ部位、特に少なくとも２つの同一または異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列、特に２つの同一または異なるｇＲＮＡ－Ｔ配列を含む。
この実施形態によれば、本発明のＩＤＬＶは、少なくとも１つの目的の核酸配列を含んでいることを特徴とすることができ、この核酸配列は、前記ＩＤＬＶの少なくとも２つ、特に２つのヌクレアーゼ部位の間に含むことができる。
本発明の実施形態において、少なくとも１つのヌクレアーゼ部位は、点ｄの細胞のゲノム中の目的の内在性ゲノム部位に構成される内在性ヌクレアーゼ部位と同一であるか、又は異なっている。
特定の実施形態では、本発明のＩＤＬＶに含まれる核酸の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に：
－ ヌクレアーゼ部位が１つだけ存在する場合、それは、関心のある少なくとも１つの核酸配列の上流にある；
－１つ以上のヌクレアーゼ部位、特に２つのヌクレアーゼ部位が存在する場合、少なくとも１つ、特に１つのヌクレアーゼ部位が、目的の少なくとも１つの核酸配列の上流にあり、少なくとも１つ、特に１つのヌクレアーゼ部位が、目的の少なくとも１つの核酸配列の下流にある。

【0077】

特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶに含まれる核酸の５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間で、複数のヌクレアーゼ部位、特に２つのヌクレアーゼ部位が存在する場合、少なくとも１つの、特に１つのヌクレアーゼ部位が少なくとも一つの相同性アーム配列の上流にあり、少なくとも一つの、特に１つのヌクレアーゼ部位が、少なくとも一つの相同性アーム配列の下流にある。

【0078】

特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間で、少なくとも１つのヌクレアーゼ部位が少なくとも１つの相同性アーム配列に直接隣接していることを特徴とする。

【0079】

「直接隣接する」とは、本発明による核酸において、ヌクレアーゼ部位がホモロジーアーム配列の直接上流または直接下流にあることを意味する。

【0080】

配列番号ｄ：ホモロジーアーム
前述のように、本発明のＩＤＬＶは、場合により、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に、少なくとも１つの相同性アーム配列を含む核酸を含む。特定の実施形態では、本発明のＩＤＬＶは、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列の間に、少なくとも１つの相同性アーム配列を含む核酸を含む。

【0081】

この少なくとも１つの相同性アーム配列は、細胞のゲノム、特にＩＤＬＶが組み込まれることが意図される細胞のゲノムにおける目的の内因性ゲノム部位の一部と相同である配列で構成されている。本発明のＩＤＬＶにおける相同性アームは、特に、目的の少なくとも１つの核酸配列の目的の内在性ゲノム部位への方向性ノックインに有利である。

【0082】

ＩＤＬＶが組み込まれることが意図され、したがってそのゲノムが関心のある内因性ゲノム部位を含んでいるそのような細胞は、本文中でさらに説明され、単離細胞とも呼ばれる。

【0083】

実施形態によれば、前記細胞は、特に、造血幹細胞；免疫系の細胞、特にリンパ球；多能性幹細胞；胚性幹細胞；衛星細胞；神経幹細胞；間葉系幹細胞；網膜幹細胞；及び上皮幹細胞からなる群から選択され得、特に、造血幹細胞である。

【0084】

本発明のＩＤＬＶは、特に、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、１つ又は２つの相同性アーム配列を含む。

【0085】

例示的な相同性アームの長さは、少なくとも２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、または５０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ホモロジーアーム長は、５０～１００、１００～２５０、２５０～５００、５００～７５０、７５０～１０００、１０００～２０００、２０００～３０００、３０００～４０００、または４０００～５０００ヌクレオチドである。

【0086】

一実施形態によれば、相同性アーム配列は、４０ヌクレオチドのものである。
特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶにおける相同性アーム配列の位置は、関心のある少なくとも１つの核酸配列のすぐ上流（すなわち、５’中）および／またはすぐ下流（すなわち、３’中）である。

【0087】

したがって、本発明の一実施形態において、本発明のＩＤＬＶが、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、１つの相同性アーム配列を含む場合、当該相同性アーム配列は、少なくとも１つの目的の核酸配列の、特に目的の核酸配列の、すぐ上流（すなわち５’に）および／またはすぐ下流（すなわち３’に）である。

【0088】

特定の実施形態によれば、ＩＤＬＶは、少なくとも２つの相同性アーム配列、特に２つからなり、各々が他とは異なり、細胞のゲノムにおける内因性ゲノム部位の少なくとも２つ、特に２つの異なる部分に相同な配列を含む。

【0089】

本発明のＩＤＬＶが、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、２つの相同性アーム配列を含んでなる場合、当該相同性アーム配列の少なくとも１つは、少なくとも１つの目的の核酸配列、特に目的の１つの核酸配列のすぐ上流（すなわち、５’に）および／またはすぐ下流（すなわち、３’に）存在する。

【0090】

本発明による興味のある内因性ゲノム部位は、遺伝子のエクソン、遺伝子のイントロン、プロモーター、遺伝子の５’ＵＴＲ領域、遺伝子の３’ＵＴＲ領域、または遺伝子間配列であり得る。

【0091】

特に、セーフハーバー（safe harbour）であることができる。
セーフハーバーは、本発明の少なくとも１つの目的の核酸配列が、内因性遺伝子活性を乱すことなく、または癌を促進することなく、予測可能な方法で統合し機能することができる宿主ゲノム内の染色体位置（Sadelain et al, Nat Rev Cancer. 2011 Dec 1;12(1):51-8）。セーフハーバーは、ゲノムセーフハーバー（ＧＳＨ）とも呼ばれ、宿主細胞や生物に悪影響を及ぼすことなく、新たに組み込まれたＤＮＡの予測可能な発現を受け入れることができる、細胞のゲノム内またはゲノム外の領域である。有用なセーフハーバーは、本発明の目的の少なくとも１つの核酸配列の所望のレベルをもたらすのに十分なトランスジーン発現を可能にしなければならない。

【0092】

ヒト細胞においてセーフハーバーとして使用され得るヒトゲノムの特定の遺伝子内遺伝子座としては、例えば、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）（染色体１９位置１９ｑ１３．４２）、ケモカイン（ＣＣモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子座（染色体３位置３ｑ２１．３１）およびマウスＲＯＳＡ２６座のヒト正ローグ（染色体３位置３ｑ２５．３）などを挙げることができる。

【0093】

特定の実施形態において、細胞のゲノムにおける目的の内因性ゲノム部位は、グロビン遺伝子に含まれ、特にイプシロングロビン遺伝子、ガンマＧグロビン遺伝子、ガンマＡグロビン遺伝子、デルタグロビン遺伝子、ベータグロビン遺伝子、ゼータグロビン遺伝子、シュードゼータグロビン遺伝子、ミューグロビン遺伝子、シュードα１グロビン遺伝子、α１グロビン遺伝子及びα２グロビン遺伝子からなる群から選ばれ、特に、γＧグロビン遺伝子、γＡグロビン遺伝子、δグロビン遺伝子、βグロビン遺伝子、α１グロビン遺伝子及びα２グロビン遺伝子からなる群から選ばれ、より特にα１グロビン遺伝子及びα２グロビン遺伝子からなる群から選ばれる。

【0094】

特定の実施形態において、本発明による関心のある内因性ゲノム部位は、本発明の少なくとも１つの関心のある核酸配列によって完全にまたは部分的に置換されることを意図した遺伝子にある。実際、本発明による導入遺伝子は、変異遺伝子を修正するために、例えば内因性遺伝子座への野生型導入遺伝子の挿入など、その同族遺伝子座に組み込むことができる。

【0095】

別の実施形態では、本発明による関心のある内因性ゲノム部位は、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体コード化遺伝子である。この実施形態によれば、本発明による関心のある前記内因性ゲノム部位は、特に、前記標的（抗原）に結合するとＴ細胞の免疫機能を活性化できる一方で、関心のある標的を標的とすることができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、人工Ｔ細胞受容体又はキメラＴ細胞受容体としても知られる）をコードし得る。それに応じて得られるＣＡＲ Ｔ細胞（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）は、多くの疾患の治療、特に癌の治療において、当該技術分野でよく知られている（たとえば、Rajeら、N. Engl. J. Med. 380;18;1726-1737を参照されたい）。

【0096】

別の実施形態では、本発明による関心のある内因性ゲノム部位は、Ｂ細胞における免疫グロブリン符号化遺伝子である。この実施形態によれば、本発明による関心のある前記内因性ゲノム部位は、特に、治療用タンパク質、より詳細には、関心のある免疫グロブリン、またはその断片をコードし得る（Vossら、eLife 2019;8:e42995およびT-C Cheong;Nat Commun. 2016 Mar 9;7:10934を参照）。

【0097】

さらなる実施形態において、本発明による関心のある内因性ゲノム部位は、造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるＴ細胞受容体コード化遺伝子又は免疫グロブリンコード化遺伝子である。

【0098】

配列ｅ：目的の核酸配列（配列ｂ）の安定発現を増強する配列
前述したように、本発明のＩＤＬＶは、以下含むことができる。
５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に、少なくとも１つの目的の核酸配列の安定的な発現を増強することができる少なくとも１つの配列が存在すること。
特に、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定発現を増強することを可能にする少なくとも１つの配列は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）配列である。

【0099】

ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後制御要素（ＷＰＲＥ）は、５９７塩基以下の配列（Schambachら、Gene Ther. 2006 Apr;13(7):641-5）で、転写されると発現を促進する３次構造を形成する。この配列は、分子生物学において、ウイルスベクターによって導入された遺伝子の発現を高めるために一般的に使用される。ＷＰＲＥは、γ、α、βの３つの構成要素からなる三重の制御エレメントである。α成分は８０ｂｐの長さで、単独でも使用できるが、γ成分およびβ成分と組み合わせて使用することが好ましい。

【0100】

特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定した発現を増強することを可能にする１つの配列のみからなる。

【0101】

特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）配列を１つだけ含む。

【0102】

本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間において、目的の少なくとも１つの核酸配列の安定発現を高めることができる少なくとも１つの配列が、上記の配列ａ～ｄの下流にあることを特に特徴としている。

【0103】

本発明の特定の実施形態において、本発明のＩＤＬＶは、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間において、少なくとも１つ、特に１つのＷＰＲＥ配列が、上記の配列ａ～ｄの下流にあることを特に特徴とする。

【0104】

特定の実施形態では、上記で定義された配列ａからｃ、および存在する場合はｄとｅは、ＩＤＬＶにおいて、５’から３’まで、以下の順序のうちの１つで存在する。
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ；
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；
－ ａ， ｄ， ｃ， ｄ， ｂ；
－ ａ、ｄ、ｃ、ｄ、ｂ、ｅ；
－ ａ、ｃ、ｂ、ｄ、ｃ、ｅ；または
－ ａ、ｃ、ｄ、ｂ、ｃ、ｅ。

【0105】

特定の実施形態によれば、本発明によるＩＤＬＶは、環状または直線状であり、特に環状である。より詳細には、特定の実施形態によれば、本発明によるＩＤＬＶの細胞内形態は、環状または直線状であり、特に環状である。

【0106】

別の実施形態によれば、本発明に係るＩＤＬＶは線状である。特に、別の実施形態によれば、本発明に係るＩＤＬＶの細胞内形態は、線状である。
特定の実施形態によれば、ＩＤＬＶは、プロモーターを含んでいない。

【0107】

単離した細胞
上記に示したように、本発明は、さらに、本発明に従って定義される少なくとも１つのＩＤＬＶを含む単離細胞に関するものである。

【0108】

特定の実施形態によれば、単離された細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）；免疫系の細胞、特にリンパ球；人工多能性幹細胞；胚性幹細胞；衛星細胞；神経幹細胞；間葉系幹細胞；網膜幹細胞；及び上皮幹細胞からなる群から選ばれ、特に造血系幹細胞である。
本発明の特定の実施形態では、単離された細胞は、胚性幹細胞とは異なる。
造血幹細胞は、自己複製が可能な多能性幹細胞であり、寛容な条件下で造血系の全ての細胞型を生じさせる能力を有することが特徴である。造血幹細胞は全能性細胞ではなく、完全な生物に成長する能力はない。

【0109】

特定の実施形態において、本発明による造血幹細胞は、胚性幹細胞、特にヒト胚性幹細胞に由来し、したがって、胚性造血幹細胞である。

【0110】

胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の未分化な内塊細胞から誘導され、自己複製が可能な幹細胞である。この多能性幹細胞は、許容された条件下で、成体における２２０以上の細胞型のいずれかに分化することが可能である。ＥＳＣは全能性細胞ではなく、完全な生物に成長する能力はない。ＥＳＣは、例えば、Young Chungら(Cell Stem Cell 2, 2008 February 7;2(2):113-7）に示される方法に従って取得することができる。

【0111】

別の特定の実施形態では、本発明によるＨＳＣは、人工多能性幹細胞、より詳細には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。したがって、特定の実施形態によれば、本明細書に記載のＨＳＣは、造血誘発性多能性幹細胞である。

【0112】

ｈｉＰＳＣは、ＥＳＣに類似した多能性幹細胞様の状態を示す、遺伝子的に再プログラムされた成体細胞である。ヒトの体内には存在しないが、ＥＳＣと同様の性質を持つ幹細胞を人工的に作り出したものである。このような細胞の生成は、Ｙｉｎｇ ＷＡＮＧら（https://doi.org/10.1101/050021）、ならびにＬａｐｉｌｌｏｎｎｅ Ｈ． ら（Haematologica. 2010; 95(10））、およびＪ． ＤＩＡＳら（Stem Cells Dev. 2011; 20(9): 1639-1647）において議論されている。

【0113】

「自己複製」とは、細胞が分裂して、親細胞と同一の（例えば、自己複製する）特性を持つ少なくとも１つの娘細胞を生成する能力のことである。第２の娘細胞は、特定の分化経路にコミットすることができる。例えば、自己複製する造血幹細胞は、分裂して１つの娘幹細胞と、骨髄系またはリンパ系への分化を約束するもう１つの娘細胞とを形成することができる。自己複製は、造血系を補充するための未分化幹細胞の継続的な供給源となる。

【0114】

造血幹細胞を同定するのに有用なマーカー表現型は、当技術分野で一般的に知られているものになる。ヒトＨＳＣｓについては、細胞マーカー表現型は、好ましくは、ＣＤ３４＋ ＣＤ３８ｌｏｗ／－ Ｃｄ４９ｆ＋ ＣＤ５９＋ ＣＤ９０＋ ＣＤ４５ＲＡ－ Ｔｈｙ１＋ Ｃ－ｋｉｔ＋ ｌｉｎ－（Notta F、Science.333(6039):218-21 (2011)）。マウス造血幹細胞の場合、細胞マーカー表現型は、例示的に、ＣＤ３４ｌｏｗ／－ Ｓｃａ－１＋ Ｃ－ｋｉｔ＋及びｌｉｎ－ ＣＤ１５０＋ ＣＤ４８－ ＣＤ９０．１．Ｔｈｙ１＋／ｌｏｗ Ｆｌｋ２／ｆｌｔ３－及びＣＤ１１７＋、（例えば、Ｆｒａｓｃｏｌｉら、（J. Vis. Exp. 2012 Jul 8; (65）. Pii:3736.を参照）。

【0115】

免疫系の細胞は、疾患から保護する生物体内の多くの生物学的構造及びプロセスからなる宿主防御系の一部である。本発明によれば、免疫系の細胞は、自然免疫系の細胞及び適応免疫系の細胞を含む。

【0116】

自然免疫系の細胞の例としては、食細胞（マクロファージ、好中球、樹状細胞）、自然リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞などの白血球が挙げられる。

【0117】

適応免疫系の細胞の例としては、リンパ球、特にＢ細胞、Ｔ細胞（キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞など）が挙げられる。
特定の実施形態によれば、本発明による単離された細胞は、リンパ球である。

【0118】

ミオサテライト細胞又は筋肉幹細胞としても知られるサテライト細胞は、成熟した筋肉に見られる非常に小さな細胞質を有する小さな多能性細胞である。サテライト細胞は、骨格筋細胞の前駆体であり、サテライト細胞又は分化した骨格筋細胞を生じさせることができる。サテライト細胞は、親筋線維に追加の筋核を供給したり、静止状態に戻ったりする可能性を持っている。より具体的には、衛星細胞は活性化されると、細胞周期に再び入り、筋芽細胞へと増殖・分化することができる。

【0119】

神経幹細胞（ＮＳＣ）は、胚発生の過程で、すべての動物の神経系の神経細胞とグリアを生み出す放射状グリア前駆細胞を最初に生み出す自己再生可能な多能性細胞である。一部の神経前駆幹細胞は、成体脊椎動物の脳の非常に限定された領域にとどまり、生涯を通じてニューロンを生成し続ける。

【0120】

間葉系幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞など様々な種類の細胞に分化できる多能性間質細胞である。骨髄に存在する成体幹細胞であるため、骨髄間質細胞とも呼ばれる。しかし、臍帯血、末梢血、卵管、胎児の肝臓や肺など、他の組織からも単離されることがある。

【0121】

網膜幹細胞は網膜前駆細胞としても知られ、網膜に存在する様々な種類の細胞に分化することができる多能性細胞である。

【0122】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、上記のように成体細胞から直接作製できる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは無限に増殖し、体内のあらゆる種類の細胞（神経細胞、心臓、膵臓、肝臓など）を生み出すことができるため、損傷や病気によって失われた細胞の代替となる単一の細胞源として使用することができる。人工多能性幹細胞を得ることは、当業者の一般的な知識である。

【0123】

上皮幹細胞は、組織の恒常性維持、創傷修復、発がんに中心的な役割を担っている。角膜上皮幹細胞は、辺縁上皮に存在することが証明されており、一方、結膜上皮幹細胞は、結膜の前庭部に多く存在するようである。角膜上皮、結膜上皮、毛包、毛包間表皮の幹細胞は、自己複製が可能であること、比較的静止していること（スローサイクル）、増殖を誘導できること、そして多能性であることが重要な特徴である。角膜と毛包のケラチノサイトの間には、ある程度の柔軟性が存在することが明らかになりつつある。
本明細書に記載されるような単離細胞は、好ましくは精製されたものである。

【0124】

本明細書で使用する場合、「精製された細胞」は、言及された細胞が精製された試料中の細胞の少なくとも５０％を構成することを意味する。より好ましくは、少なくとも５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の精製サンプル中の細胞である。

【0125】

細胞の選択および／または精製は、実質的に純粋な細胞集団を得るために、ポジティブおよびネガティブな選択方法の両方を含むことができる。

【0126】

一態様では、フローサイトメトリー技術の一つである蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、異なる細胞集団を選別し、分析することができる。特定の細胞マーカーを有する細胞は、細胞マーカーに結合する抗体、または典型的には抗体の混合物でタグ付けされる。異なるマーカーに向けられた各抗体は、検出可能な分子、特に他の抗体に結合した他の蛍光色素と区別できる蛍光色素と結合している。染色された細胞の流れは、蛍光色素を励起する光源を通過し、細胞からの発光スペクトルは、特定の標識された抗体の存在を検出することができます。異なる蛍光色素を同時に検出することで、異なる細胞マーカーを示す細胞を同定し、集団内の他の細胞から分離することができる。他のＦＡＣＳパラメータ（例として、限定はしないが、側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）、バイタル色素染色（例えば、ヨウ化プロピジウムによる）により、サイズおよび生存率に基づく細胞の選択が可能である。

【0127】

別の態様では、異なる細胞集団を選別するために、免疫磁気標識法を用いることができる。この方法は、抗体またはレクチンを介して、磁化可能な小粒子を細胞に付着させることに基づくものである。細胞の混合集団を磁場中に置くと、ビーズが付着した細胞は磁石に引き寄せられ、その結果、標識されていない細胞から分離することができる。

【0128】

特定の実施形態によれば、本発明に従って遺伝的に改変され得る造血幹細胞は、βヘモグロビン症表現型、すなわち、健康な対応する細胞と比較して、β様グロビンの発現の減少を呈する。特に、本発明に従って遺伝子改変される造血幹細胞は、β－サラセミアまたは鎌状赤血球症の表現型を提示する。

【0129】

特定の実施形態において、本明細書に記載の単離細胞、特にＨＳＣは、哺乳類細胞、特にヒト細胞である。
特定の実施形態では、単離された細胞の初期集団は、自己由来であってもよい。

【0130】

“自家”とは、同じ患者又は個体に由来すること、又は同じ個体に由来することを指す。自家移植」とは、被験者自身の細胞または臓器を採取して再注入または移植することを指す。自己細胞を独占的または補助的に使用することで、宿主への細胞投与による多くの副作用、特に移植片対宿主反応を排除または軽減することができる。

【0131】

この場合、単離細胞は、当該個体から採取され、本明細書に記載の方法に従ってｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子改変され、同じ個体に投与されたものである。

【0132】

別の実施形態では、単離された細胞の初期集団は、同種ドナーから、または複数の同種ドナーから得てもよい。ドナーは、互いに関連してもしなくてもよく、移植の環境では、レシピエント（または個体）と関連してもしなくてもよい。

【0133】

本明細書に記載されるように改変される単離された細胞は、それに応じて、治療を必要とする個体に対して外来性であってもよい。

【0134】

本明細書に記載の単離細胞は、薬学的に許容される担体に再懸濁し、直接使用してもよいし、ＦＡＣＳソーティング、磁気アフィニティー分離、及びイムノアフィニティーカラムなどの当業者が利用できる種々の細胞精製技術による処理に付されてもよい。

【0135】

医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載の少なくとも１つのＩＤＬＶ及び／又は本明細書に記載の少なくとも１つの単離細胞、並びに薬学的に許容される培地を含む、薬学的組成物に関するものである。

【0136】

本明細書に記載の薬学的に許容される培地は、特に、哺乳動物個体への投与に適している。

【0137】

薬学的に許容される培地」は、医薬組成物を製剤化する当業者に知られている標準的な薬学的に許容される培地のいずれかを含み、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、水性エタノール、またはグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば。植物油、動物油、合成油など）、微結晶セルロース、カルボキシムエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチンまたはポリソルベート８０などの溶液を挙げることができる。

【0138】

本明細書に記載の医薬組成物は、しばしば、１つ以上の緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）；炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど）；静菌；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；レシピエントの血液と等張、低張または弱高張にする溶質；懸濁剤；増粘剤および／または防腐剤などである。
もちろん、担体の種類は、典型的には、投与様式に応じて変化する。

【0139】

実施形態において、本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞は、以下の治療に有効な治療用化合物と組み合わせて組成物中で使用することができる。
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群より選択される疾患；および／または
－ それを必要とする個体におけるタンパク質の欠乏または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患。

【0140】

実施形態において、本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞は、本発明のものとは異なるＩＤＬＶと組み合わせて、及び／又は本発明によるＩＤＬＶを含まない単離細胞と組み合わせて、本明細書に記載の組成物に使用することが可能である。

【0141】

実施形態において、本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞は、投与されたＩＤＬＶ及び／又は細胞の治療効果を高める他の薬剤及び化合物と組み合わせて、本発明の組成物中で使用することができる。

【0142】

医薬品として使用するためのＩＤＬＶおよび単離細胞
本発明の別の目的は、ＩＤＬＶまたは単離細胞または医薬組成物を医薬として使用するための、上記で定義されたＩＤＬＶまたは単離細胞である。

【0143】

本明細書に記載のＩＤＬＶ、単離細胞及び医薬組成物は、静脈内、心臓内、髄腔内、筋肉内、関節内又は骨髄内注射等の任意の適切な経路で、治療効果をもたらすのに十分な量で対象に投与される。

【0144】

治療効果を得るために必要なＩＤＬＶまたは単離細胞の量は、特定の目的のために従来の手順に従い経験的に決定される。

【0145】

一般に、治療目的でＩＤＬＶ及び／又は単離細胞を投与するためには、それらは薬理学的に有効な量で投与される。

【0146】

「医薬的に有効な量」又は「医薬的に有効な用量」とは、所望の生理学的効果をもたらすのに十分な量又は所望の結果を得ることができる量を意味し、特に、障害又は疾患の１又は複数の症状又は症状の軽減又は除去を含む障害又は疾患の状態を治療するために必要な量を意味する。

【0147】

例示的に、βサラセミアに罹患している患者にＩＤＬＶ及び／又は単離細胞を投与すると、投与前の患者におけるβ様グロビンの量、ひいてはヘモグロビンの量と比較して、患者におけるβ様グロビンの量、ひいてはヘモグロビンの量が増加した場合に治療効果を得ることができる。

【0148】

ＩＤＬＶおよび／または単離細胞は、当技術分野でよく知られた方法によって投与される。一実施形態では、投与は静脈内注入によるものである。別の方法では、投与は、骨髄内注射によるものである。さらなる実施形態では、投与は、眼内注射によるものである。別の実施形態では、投与は、脳内注射によるものである。さらなる実施形態では、投与は、筋肉内注射によるものである。

【0149】

輸血されるＩＤＬＶ及び／又は分離細胞の数は、性別、年齢、体重、疾患又は障害の種類、障害の段階、細胞集団における所望の細胞の割合（例えば、細胞集団の純度）、及び治療効果をもたらすために必要な細胞数などの要因を考慮したものとなる。
例えば、一般に、注入される細胞数は、体重の１．１０^４から５．１０^６細胞／ｋｇ、特に１．１０^５～１０．１０^６細胞／ｋｇ、好ましくは５．１０^５細胞～約５．１０^６細胞／ｋｇある。

【0150】

本明細書に記載の医薬組成物は、前述したように、本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞を、それを必要とする個体に投与するために使用することができる。

【0151】

ＩＤＬＶ及び／又は単離細胞の投与は、単回投与又は連続投与によることができる。連続的な投与が含まれる場合、各投与に異なる細胞数及び／又は異なる細胞集団を使用することができる。

【0152】

例示的に、第１の投与は、即時の治療効果だけでなく、より長期の効果を提供する本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞であり得、第２の投与は、第１の投与の治療効果を延長するために長期の効果を提供する本明細書に記載のＩＤＬＶ及び／又は単離細胞を含む。

【0153】

本明細書に記載のＩＤＬＶ、単離細胞又は医薬組成物は、以下の治療において使用することができる。
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍及び血液疾患からなる群から選択される疾患；及び／又は
－ それを必要とする個体におけるタンパク質の欠乏または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患。

【0154】

特定の実施形態では、本明細書に記載のＩＤＬＶ、単離細胞、または医薬組成物は、それを必要とする個体における分泌タンパク質の欠如によって、または異常な非機能性分泌タンパク質の存在によって引き起こされる疾患の治療に使用することができる。

【0155】

そのような疾患は、例えば、凝固障害、リソソーム貯蔵障害、ホルモン欠陥及びα－１アンチトリプシン欠損症からなる群から選択され得る。

【0156】

上記の免疫疾患は、例えば、２２ｑ１１．２欠失症候群；アデノシンデアミナーゼ２欠損症；アデノシンデアミナーゼ欠損症；抗インターフェロンガンマ自己抗体による成人発症免疫不全；無ガンマグロブリン血症、非ブルトン型；エカルディ・グティエール症候群；エカルディ・グティエール症候群５型；アレルギー性気管支肺アスペルギルス症；円形脱毛症-希少疾患ではない；全頭脱毛症；全身性脱毛症；アミロイドーシスＡＡ；アミロイドーシス家族性内臓；毛細血管拡張性運動失調症；自己免疫性リンパ増殖症候群；ＣＴＬＡ４ハプロ不全による自己免疫性リンパ増殖症候群；自己免疫性多腺性自己免疫症候群１型；常染色体優性高ＩｇＥ症候群；常染色体劣性の早期発症炎症性腸疾患；常染色体劣性高ＩｇＥ症候群；裸リンパ球症候群２；バース症候群；ブラウ症候群；ブルーム症候群；閉塞性細気管支炎；Ｃ１ｑ欠損症；カンジダ症家族性慢性粘膜皮膚、常染色体劣性；軟骨毛低形成；ＣＨＡＲＧＥ症候群；チェディアック・東症候群；ケルビム症；リポジストロフィーと高温を伴う慢性非定型好中球性皮膚症；慢性移植片対宿主病；慢性肉芽腫症；コーエン症候群；皮膚肉芽腫との複合免疫不全症；一般的な可変免疫不全症；コンポーネント２欠損補完；コンポーネント８欠損補完タイプ１；コンポーネント８欠損補完；先天性肺胞タンパク症；クリオグロブリン血症；皮膚肥満細胞腫；周期性好中球減少症；インターロイキン－１受容体拮抗薬の欠乏；樹状細胞、単球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラーリンパ球の欠損；先天性角化異常症；先天性角化異常症常染色体優性；先天性角化異常症常染色体劣性；先天性角化異常症Ｘ連鎖；疣冗長表皮異形成症；家族性アミロイドーシス、フィンランド型；家族性冷自己炎症症候群；家族性地中海熱；家族性混合クリオグロブリン血症；家族性慢性粘膜皮膚カンジダ症；フェルティ症候群；糖原病１Ｂ型；グリセリ症候群２型；橋本脳症；橋本症候群；血球貪食性リンパ組織球症；ヘネカム症候群；免疫不全を伴う肝静脈閉塞性疾患；遺伝性葉酸吸収不良；ヘルマンスキープドラク症候群２；単純ヘルペス脳炎；ＨｏｙｅｒａａｌＨｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ症候群；高ＩｇＥ症候群；Ｈｙｐｅｒ－ＩｇＤ症候群；ＩＣＦ症候群；特発性急性好酸球性肺炎；特発性ＣＤ４陽性Ｔリンパ球減少症；ＩＬ１２ＲＢ１欠損症；胸腺の欠如による免疫障害；カルシウム流入障害によるＴ細胞の不活性化を伴う免疫機能障害１；カルシウム流入障害によるＴ細胞の不活性化を伴う免疫機能障害２；高ＩｇＭタイプ１による免疫不全；ハイパーＩｇＭタイプ２による免疫不全；ハイパーＩｇＭタイプ３による免疫不全；ハイパーＩｇＭタイプ４による免疫不全；高ＩｇＭ５型による免疫不全；胸腺腫を伴う免疫不全；無汗性外胚葉異形成を伴わない免疫不全；免疫調節不全、多発性内分泌障害および腸障害Ｘ連鎖；免疫グロブリンＡ欠損症２；複数の腸閉鎖；ＩＲＡＫ－４欠損症；孤立した成長ホルモン欠乏症タイプ３；川崎病；大顆粒リンパ球性白血病；白血球接着不全１型；ＬＲＢＡ欠損症；ループス；リンパ球性下垂体炎；マジード症候群；メルカーソン・ローゼンタール症候群；ＭＨＣクラス１欠損症；マックルウェルズ症候群；多発性線維硬化症；多発性硬化症；ＭＹＤ８８欠損症；新生児期発症多臓器炎症性疾患；新生児全身性エリテマトーデス；ネザートン症候群；好中球特異顆粒欠損症；ナイメーヘン破損症候群；オーメン症候群；大理石骨病常染色体劣性７；回文リウマチ；パピヨン・ルフェーブル症候群；部分的アンドロゲン非感受性症候群；ＰＡＳＬＩ病；ピアソン症候群；小児多発性硬化症；定期的な発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎および腺炎；ＰＧＭ３－ＣＤＧ；好中球減少症を伴う多形皮膚萎縮症；妊娠性痒疹性蕁麻疹丘疹プラーク；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；化膿性関節炎、神経節膿皮症およびにきび；再発性多発性軟骨炎；細網異形成症；サルコイドーシス；バーバーミラー症候群；シンケ免疫骨異形成症；シュニッツラー症候群；選択性ＩｇＡ欠損症；選択的ＩｇＭ欠損症；重症複合免疫不全症；完全なＲＡＧ１／２欠損症による重症複合免疫不全症；重症複合免疫不全症と電離放射線に対する感受性；重症複合免疫不全症、非定型；重症先天性好中球減少症常染色体劣性３；重症先天性好中球減少症Ｘ連鎖；重症複合免疫不全症を伴う短肢骨格異形成；シュバッハマンダイアモンド症候群；シングルトン－メルテン症候群；ＳＬＣ３５Ｃ１－ＣＤＧ（ＣＤＧ－Ｉｉｃ）；特定の抗体欠損症；脊椎骨異形成症；スティーブンス・ジョンソン症候群／中毒性表皮壊死症；Ｔ細胞免疫不全、先天性脱毛症および爪ジストロフィー；ＴＡＲＰ症候群；毛細血管腸症候群；腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群；双胎間輸血症候群；ビチ症候群；ＷＨＩＭ症候群；ウィスコットアルドリッチ症候群；ウッズブラックノーベリー症候群；Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症；マグネシウム欠損、エプスタインバーウイルス感染および新生物を伴うＸ連鎖免疫不全；Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群；Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群１；Ｘ連鎖リンパ増殖性症候群２；Ｘ連鎖重症複合免疫不全症とＺＡＰ－７０欠損症からなる群から選択することができる。

【0157】

上記のような血液疾患は、例えば、５ｑ－症候群；Ａａｇｅｎａｅｓ症候群；腹部大動脈瘤；無ベータリポタンパク血症；無カタラーゼ症；アセルロプラスミン血症；後天性無顆粒球症；後天性血友病；後天性血友病Ａ；後天性赤芽球癆；後天性フォンウィルブランド症候群；急性赤芽球性白血病；急性移植片対宿主病；急性単芽球性白血病；成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病；成熟のない急性骨髄芽球性白血病；異常な骨髄好酸球ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）；を伴う急性骨髄性白血病。ｉｎｖ３（ｐ２１；ｑ２６．２）またはｔ（３；３）（ｐ２１；ｑ２６．２）；を伴う急性骨髄性白血病。急性骨髄単球性白血病；骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症；急性前骨髄球性白血病；アデノシンデアミナーゼ２欠損症；副腎皮質がん；成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；無フィブリノゲン血症；ＡＬＫ＋組織球増殖症；アルファサラセミアｘ連鎖知的障害症候群；骨髄異形成関連の機能を備えたＡＭＬ。アデノシントリホスファターゼ欠損症による貧血；貧血鉄芽球性および脊髄小脳性運動失調；バルサルバ洞の動脈瘤；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管腫遺伝性神経皮膚；Ａｎｇｉｏｍａ ｓｅｒｐｉｇｉｎｏｓｕｍ；抗リン脂質抗体症候群；先天性皮膚欠損症腸リンパ管拡張症；再生不良性貧血；乳児期の動脈石灰化；動脈捻転症候群；無トランスフェリン血症；非定型溶血性尿毒症症候群；自己免疫性リンパ増殖症候群；常染色体劣性プロテインＣ欠乏症；バナヤン・ライリー・ルバルカバ症候群；ベーチェット病；ベータサラセミア；芽球性形質細胞様樹状細胞；Ｐ２ＲＹ１２欠損による出血障害；ブルーム症候群；ブルーラバーブレブネバス症候群；バージャー病；バーキットリンパ腫；カンポメリアカミングタイプ；キャッスルマン病；大脳海綿状奇形；チェディアック・東症候群；染色体１７ｑ１１．２欠失症候群；慢性骨髄性白血病；乳び腹水；ＣＬＯＶＥＳ症候群；コブ症候群；寒冷凝集素症；先天性無巨核球性血小板減少症；先天性無アルブミン血症；先天性異形成性貧血１型；先天性赤血球形成不全性貧血２型；先天性異形成性貧血３型；先天性赤血球生成性ポルフィリン症；一時的な無呼吸を伴う先天性筋無呼吸症候群；先天性肺リンパ管拡張症；先天性血栓性血小板減少性紫斑病；皮膚肥満細胞腫；皮膚弛緩症、常染色体劣性１型；Ｃｕｔｉｓ ｍａｒｍｏｒａｔａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃａ ｃｏｎｇｅｎｉｔａ；周期性好中球減少症；周期性血小板減少症；大動脈の嚢胞性内側壊死；ＤａｈｌｂｅｒｇＢｏｒｅｒＮｅｗｃｏｍｅｒ症候群；難聴－リンパ浮腫－白血病症候群；脱水性遺伝性口内炎；脱水性遺伝性口内炎偽性高カリウム血症および周産期浮腫；ダイヤモンド－ブラックファン貧血；ダイヤモンド－ブラックファン貧血２；ダイヤモンド－ブラックファン貧血３；異常フィブリノゲン血症；先天性角化異常症；先天性角化異常症常染色体優性；先天性角化異常症常染色体劣性；先天性角化異常症Ｘ連鎖；エーラス・ダンロス症候群、ジスフィブロネクチン血症型；多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症；持久性隆起；本態性血小板血症；エヴァンス症候群；節外性鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫；ファブリー病；ファクターＶ欠乏症；第Ｖ因子ライデン血栓症；第ＶＩＩ因子欠乏症；ファクターＸ欠乏症；第ＸＩ因子欠乏症；第ＸＩＩ因子欠乏症；第ＸＩＩＩ因子欠乏症；ＴＳＨ受容体の突然変異による家族性甲状腺機能亢進症；家族性ＬＣＡＴ欠損症；関連する骨髄性悪性腫瘍を伴う家族性血小板障害；家族性胸部大動脈瘤および解離；ファンコニ貧血；胎児および新生児同種免疫性血小板減少症；線維筋性異形成；濾胞性リンパ腫；本物のびまん性静脈拡張症；巨細胞性動脈炎；巨大血小板症候群；グランツマン血小板無力症；グルココルチコイド－治療可能なアルドステロン症；グルタミン酸フォルミミノトランスフェラーゼ欠損症；糖原病１２型；グリコーゲン貯蔵病タイプ７；糖タンパク質ＶＩ欠乏症；グッドパスチャー症候群；ゴーハム病；多発血管性肉芽腫症；肉芽腫性たるみ皮膚疾患；灰色血小板症候群；有毛細胞白血病；橋本－プリツカー症候群；ハインツ小体貧血；血管腫血小板減少症症候群；ヘモクロマトーシス－希少疾患ではない；ヘモクロマトーシス２型；ヘモクロマトーシス３型；ヘモクロマトーシス４型；ヘモグロビンＣ病；ヘモグロビンＥ病；ヘモグロビンＳＣ病；ヘモグロビンＳＥ病；溶血性貧血致死性先天性非球状細胞性器およびその他の異常；溶血性尿毒症症候群；血友病Ａ；血友病Ｂ；出血性ショックおよび脳症症候群；ヘネカム症候群；ヘノッホシェーンライン紫斑病；ヘパリン起因性血小板減少症；遺伝性アンチトロンビン欠乏症；遺伝性楕円赤血球症；遺伝性葉酸吸収不良；遺伝性出血性毛細血管拡張症；遺伝性出血性毛細血管拡張症２型；遺伝性出血性毛細血管拡張症３型；遺伝性出血性毛細血管拡張症４型；遺伝性リンパ浮腫ＩＩ型；ヘレディからなるグループから選択することができる。

【0158】

ライソゾーム病は、例えば、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ欠損症－遺伝子名：ＧＢＡ）、ファブリー病（αガラクトシダーゼ欠損症－ＧＬＡ）、ハンター病（イデュロン酸－２－スルファターゼ欠損症－ＩＤＳ）、ハーラー病（アルファ－Ｌ）、イズロニダーゼ欠損症－ＩＤＵＡ）、およびニーマン－ピック病（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１欠損症－ＳＭＰＤ１）から選択することができる。

【0159】

特定の実施形態において、タンパク質の欠如または個体における異常な非機能的タンパク質の存在によって引き起こされる疾患は、血友病Ｂ、血友病Ａ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ベータサラセミア、シックル細胞貧血、ウィスコットアルドリッチ症候群、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、一般的な可変免疫不全症、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、ＡＤＡ欠損ＳＣＩＤ、毛細血管拡張性運動失調症、オーメン症候群、ファンコニ貧血、ＷＨＩＭ症候群、ファブリー病、ウォルマン病、第Ｖ因子欠乏症、第Ｖ因子ライデン血栓症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症からなる群から選択することができる。

【0160】

別の実施形態では、本明細書に記載のＩＤＬＶ、単離細胞または医薬組成物は、免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群より選択される疾患の治療に使用することができる。

【0161】

実際、本発明の実施形態によれば、本発明の治療用タンパク質は、バクテリオトキシンのような標的タンパク質、または疾患を直接引き起こすタンパク質（例えば、黄斑変性症のＶＥＧＦ）の中和、ならびにその持続および複製が宿主を危険にさらす細胞（例えば、癌細胞、ならびに自己免疫疾患の特定の免疫細胞）の高選択的殺傷に使用できる治療抗体となり得る。

【0162】

また、本発明は、以下：
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／または
－ タンパク質の欠乏または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療方法に関し、
少なくとも本発明によるＩＤＬＶを、それを必要とする個体に投与することを含む。

【0163】

本発明はまた、以下：
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／または
－ タンパク質の欠如または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患のものを予防および／または治療するための方法に関し、
少なくとも本発明による単離細胞を、それを必要とする個体に投与することを含む。

【0164】

また、本発明は、以下：
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／または
－ タンパク質の欠乏または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患の予防及び／又は治療方法に関し、
少なくとも本発明による医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。

【0165】

本発明はさらに、下記：
－ 免疫疾患、ウイルス感染症、腫瘍および血液疾患からなる群から選択される疾患；および／または
－ タンパク質の欠如または異常な非機能的なものの存在によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための医薬の製造のための、本発明のＩＤＬＶ、本発明の単離細胞、または本発明の医薬組成物の使用に関するものである。

【0166】

本発明によるＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法
また、本発明によれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法が提供される。

【0167】

本発明は、実際、さらに、リンパ球Ｔ細胞に、上記に定義される少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むことを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成方法に関するものであって、
前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを含む。

【0168】

本発明はまた、造血幹細胞に、上記に定義される少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むこと、および前記造血幹細胞をリンパ球Ｔ細胞に形質転換することを含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成方法に関し、
前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体をコードするトランスジーンを含む。

【0169】

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞とも呼ばれる）は、遺伝子操作によって人工的なＴ細胞受容体を産生するようになったＴ細胞である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ、キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体とも呼ばれる）は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする新しい能力を持たせるために遺伝子操作された受容体タンパク質である。この受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を１つの受容体に結合しているため、キメラ型受容体と呼ばれている。

【0170】

特定の実施形態によれば、本発明による癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１．ＦＡＰ、ＣＤＣＰ１．ＦＡＰ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＩＧＦＲ、ＦＡＰ、ＦＡＰ、ＣＤＣＰ１．ＦＡＰ Ｄｅｒｌｉｎｌ、Ｔｅｎａｓｃｉｎ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ １ －１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２ （ＫＤＲ／ＦＬＫ１），ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４， ＣＤ３０９），ＰＤＧＦＲ－ａ （ＣＤ１４０ａ），ＰＤＧＦＲ－β（ＣＤ１４０ｂ）Ｅｎｄｏｇｌｉｎ，ＣＬＥＣ１４，Ｔｅｍ１－８およびＴｉｅ２などの腫瘍関連表面抗原を標的とするものから選択され得る。
さらなる例としては、Ａ３３、ＣＡＭ ＰＡＴＨ －１（ＣＤｗ５２）、Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ （ＣＥＡ）、Ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ （ＭＮ／ＣＡ ＩＸ） 、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２－７ ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＥＰＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ （ＦＬＴ－３， ＣＤ１３５）、ｃ－Ｋｉｔ （ＣＤ１ １７）， ＣＳＦ１ Ｒ （ＣＤ１ １５）， ＨＬＡ－ＤＲ， ＩＧＦＲ， ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＩＬ３Ｒ， ＭＣＳＰ （Ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｅ）， Ｍｕｃ－１， 前立腺特異膜抗原 （ＰＳＭＡ）， 前立腺幹細胞抗原 （ＰＳＣＡ）， 前立腺特異抗原 （ＰＳＡ） および ＴＡＧ－７２を挙げることもできる。腫瘍の細胞外マトリックスに発現する抗原の例としては、テナシン、線維芽細胞活性化蛋白（ＦＡＰ）などがある。

【0171】

本発明はまた、治療用タンパク質、特に免疫グロブリンを発現するＢ細胞を生成する方法であって、リンパ球Ｂ細胞に、上記に定義される少なくとも１つのＩＤＬＶを統合することを含み、
前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、目的の治療用タンパク質、特に免疫グロブリンまたはその断片をコードするトランスジーンを含む方法に関する。

【0172】

本発明はまた、治療用タンパク質、特に免疫グロブリンを発現するＢ細胞を生成する方法であって、造血幹細胞に、上記に定義される少なくとも１つのＩＤＬＶを組み込むこと、および前記造血幹細胞をリンパ球Ｂ細胞へ形質転換することを含み、前記ＩＤＬＶが、少なくとも１つの目的の核酸配列として、治療用タンパク質、特に目的の免疫グロブリンまたはその断片をコードするトランスジーンを含む方法に関する。

【0173】

本発明は、本明細書の実施例によってさらに例示されるが、これに何ら限定されるものではない。

【0174】

実施例
実施例１：ＩＤＬＶ導入によるＧＦＰノックイン（ＩＤＬＶ ＧＰ３３）
本発明者らは、プロモーターレスＧＦＰをコードするＩＤＬＶ（ＧＰ３３と呼ぶ）を作製し、ＧＦＰの５’にＩＤＶＬを切断するためのｇＲＮＡ標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）と、目的のゲノム部位と相同性のある約４０ｂｐの短い相同性配列（Ｍｉｃｒｏ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ＭＨ）を挿入した（図１Ａ）。

【0175】

上述のように、これらの挿入は、ＩＤＬＶ ＤＮＡの「反応性」（ヌクレアーゼ切断ゲノムＤＮＡによって生じる他のＤＮＡ末端との相互作用能力）を高め、相同性配列によってその指向性ＫＩを有利にすることを目的としている（Nakade et al.Nat Commun. 2014 Nov 20;5:5560; Hisano et al. Sci Rep. 2015 Mar 5;5:8841; Sugawara and Nikaido Antimicrob Agents Chemother. 2014 Dec;58(12):7250-7）に記載されている。ゲノムターゲットとして、本発明者らは、ＧＦＰをα－グロビンプロモーターの転写制御下に組み込むために、α－グロビン遺伝子座の５’ＵＴＲを選択した。ＩＤＬＶ－ＧＦＰはプロモーターレスであるため、ＩＤＬＶが意図した遺伝子座に正しい向きで組み込まれた場合にのみ発現した（図１Ｂ）。

【0176】

Ｋ５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ￢２４３）細胞は、ｋ５６２培地で維持した。ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｇｉｂｃｏ；２ｍＭグルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ）；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
ｓｐＣａｓ９とブラストサイジン耐性カセットを発現するレンチウイルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５２９６２）で形質転換したＫ５６２細胞をサブクローン化して、Ｋ５６２－Ｃａｓ９の安定クローンを作製した。

【0177】

６ｘ１０^５個のＫ５６２－Ｃａｓ９細胞にＩＤＬＶ ＧＰ３３を８μＭポリブレン存在下、５０の感染倍率（ＭＯＩ）で形質導入した。このトラップは、α－グロビン遺伝子の１つに組み込むと発現するように設計されていた。
本発明者らは、ＳｐＣａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－Ｃａｓ９細胞）に、記載のＩＤＬＶをトランスフェクトし、次にＩＤＬＶとゲノムＤＮＡの両方を標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミド（ＨＢＡ １５．）対照として、本発明者らは、ＩＤＬＶではなく、α－グロビン遺伝子座の５’ＵＴＲのみを切断するｇＲＮＡ（ＨＢＡ １５．１と同様の効率で、同じ部位で）を導入した細胞をトランスフェクトした（ＨＢＡ １６．１）。

【0178】

導入後２４時間、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＡｍａｘａ ４Ｄ ｗｉｔｈ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いて２００ ｎｇのＨＢＡ １５．１ またはＨＢＡ １６．１ ｇＲＮＡ含有ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５３１８８）で２ｘ１０^５細胞をトランスフェクションさせた。

【0179】

ヌクレオフェクションから５日後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ^TM ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを使用してＤＮＡを抽出した。５ μｌ のゲノム ＤＮＡ を用いて、ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ （Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ） を用いて各 ｇＲＮＡ の切断部位にまたがる領域の増幅を行った。サンガーシークエンス後、ＴＩＤＥ ｗｅｂｔｏｏｌ（ｔｉｄｅ．ｄｅｓｋｇｅｎ．ｃｏｍ）により、挿入と欠失の割合（ＩｎＤｅｌ）を算出した。

【0180】

２週間後、本発明者らはＦＡＣＳによりＧＦＰ発現を評価したところ、ＩＤＬＶ ＤＮＡの切断により陽性細胞の割合が約５倍に増加し、ゲノムＤＮＡのＧＦＰ ＫＩがより効率的に行われたことを確認した（図１Ｃ）。
ＩｎＤｅｌの％は、Ｃａｓ９によって切断されたゲノムアレルの割合と相関がある。

【0181】

実施例２：ＩＤＬＶ ＫＩの効率と精度
ＩＤＬＶ ＫＩの効率と精度を確認するために、本発明者らは、Ｋ５６２－Ｃａｓ９単細胞クローンから抽出したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ分析を行った（図２Ａ）。
図１に記載したように処理したＨＢＡ １５．１ ＩＤＬＶ細胞の連続希釈により、１６３個の単一細胞クローンを得た。

【0182】

ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ＤＮＡ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ” Ｋｉｔを用いて２週間後にゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｓ社製ＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて定量した。
ＰＣＲ １については、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを用いてクローン内の統合ＧＦＰカセットの有無のスクリーニングを行った。ヒトアルブミン遺伝子のｑＰＣＲは、ＤＮＡ＋コントロール（Ｐｒｏｂｅ ＧＦＰ， ＦＡＭ： ５’ＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣ３’（配列番号６９）， Ｆｏｒｗａｒｄ ＧＦＰ： ５’ＡＧＴＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡ３’（（配列番号７０），Ｒｅｖｅｒｓｅ ＧＦＰ：５’ＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣ３’（配列番号７１）として使用された。；プローブＡＬＢ（ＶＩＣ）：５’ＣＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣ３’（配列番号７２）、フォワードＡＬＢ：５’ＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴＧＧＣＴＧＴ３’（配列番号７３）、リバースＡＬＢ：５’ＡＣＴＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣ３’（配列番号７４））であった。

【0183】

適切な５’ゲノムＤＮＡ－ＩＤＬＶ接合を確認するために、本発明者らは、ゲノム特異的プライマー（ＴＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号７５））とトラップ特異的プライマー（ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣ（配列番号７６））を用いて定性的ＰＣＲ（ＰＣＲ ２）（ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ；Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を行って８２３ｂｐのアンプリコンを生成させた。
ＰＣＲ ２産物をサンガーシークエンスし、ゲノム配列と比較して、いかなるミスマッチの存在も評価した。

【0184】

組み込まれたたドナーＤＮＡの８４％がＧＦＰを発現し（６２クローン中５２クローン）、そのうちの８５％がカットＩＤＬＶとして挿入されていた（５２クローン中４４クローン）。ＭＨ配列の存在により、カットＩＤＬＶの１００％は野生型ゲノム配列と比較してヌクレオチドの変化がなく、シームレスに統合された。図２Ｂは、クローンの分子解析結果をまとめた表である。

【0185】

実施例３：ＩＤＬＶ導入とヌクレアーゼ切断の最適なタイミング
次に、本発明者らは、最も効率的にＩＤＬＶ ＫＩを行うことができるＩＤＬＶ導入とヌクレアーゼ切断の最適なタイミングを見出すために、追加の実験を行った。

【0186】

このために、本発明者らは、野生型Ｋ５６２をＧＰ３３ ＩＤＬＶで形質導入し（実施例１と同様）、異なる時点で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで予め組み立てたＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）で細胞をトランスフェクションした。示された時点のそれぞれで、トランスフェクトされた細胞の２×１０^５を洗浄し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＡｍａｘａ ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔの１８μｌおよび記載のＨＢＡ １５．１ またはＨＢＡ １６．１ ＲＮＰの２，７５μｌでヌクレオフェクションを行った。ｇＲＮＡ（ＨＢＡ１５．１またはＨＢＡ１６．１）を有するＣａｓ９の組み立ては、以下を混合することによって行われた。

【0187】

３０μＭの細菌精製Ｃａｓ９タンパク質と４５μＭのＳｙｎｔｈｅｇｏの合成ｇＲＮＡガイドから（それぞれ比率１：１，５）適切な量のＢｕｆｆｅｒ １０Ｘを用いて、室温で１０分間行った。

【0188】

２週間後、本発明者らはＦＡＣＳによりＧＦＰ発現を評価し、ＩＤＬＶとＲＮＰの送達の間に２４－３２時間の遅延が最良のＧＦＰ発現を保証し、切断されたＩＤＬＶは切断されていないＩＤＬＶよりも約１０倍優れた性能を示すことを観察した（図３）。ＫＩの効率が高いことは、ＲＮＰ技術の切断性能の高さによって説明できる。実際、ＲＮＰのインデルの頻度は、ｇＲＮＡプラスミドを用いて得られた効率よりはるかに高い（図１）。

【0189】

実施例４：ＩＤＬＶ導入によるＢＤＤ ＦＶＩＩＩノックイン
現在の造血幹細胞のゲノム編集技術の問題の一つは、組み込むことのできるＤＮＡの大きさである。そこで、本発明者らは、治療上重要な大きな導入遺伝子をＩＤＬＶに挿入することで、そのアプローチに挑戦することにした。そこで、彼らはＧＦＰ（～７００ ｎｔｄ）をＢＤＤ ＦＶＩＩＩコード配列：ｃｏＦ８（～４４００ｎｔｄ；参考文献）と交換した（図４Ａ）。

【0190】

実施例１と同様に、本発明者らは、Ｋ５６２－Ｃａｓ９にＩＤＬＶ ＦＶＩＩＩを形質導入し、その後、ＩＤＬＶとゲノムＤＮＡの両方を標的とするｇＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした（ＨＢＡ １５．１） 。から抽出したゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ解析を行い、ＩＤＬＶ ＫＩの効率と精度を測定した。
Ｋ５６２－Ｃａｓ９単細胞クローン（図４Ｂ）。

【0191】

ＰＣＲ１について、統合型ｃｏＦＶＩＩＩカセットの存在に関するＰＣＲスクリーニングは、ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）（Ｆｏｒｗａｒｄ．を使用した。ＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＴ（配列番号７７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ．ＧＴＧＡＴＣＡＣＣＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＡ（配列番号７８），ａｍｐｌｉｃｏｎ ２３０ｂｐ）を用いて行った。

【0192】

適切な５’ゲノムＤＮＡ－ＩＤＬＶ接合を確認するために、本発明者らは、ゲノム特異的（ＴＡＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡ（配列番号７９））とｃｏＦＶＩＩＩ７Ｒ（ＧＧＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＣＡＣＧＣ（配列番号８０））プライマー、８４５ｂｐのアンプリコン、を使用して定性的ＰＣＲ（ＰＣＲ ２）（ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ； Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）実施した。

【0193】

統合されたドナーＤＮＡの８２％はカットＩＤＬＶとして挿入された（１１クローン中９クローン）。ＭＨ配列の存在により、カットＩＤＬＶの１００％が、野生型ゲノム配列と比較してヌクレオチドが変化することなく、シームレスに統合された。図４Ｃは、クローンの分子解析結果をまとめた表である。

【0194】

２週間後、本発明者らは、バルク集団および細胞上清中の５つのクローンについて、ＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩ発現を分析した（Ａｓｅｒａｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：ＡＧ（Ｓｔａｇｏ）ＥＬＩＳＡキット）。ＩＤＬＶ ＦＶＩＩＩはプロモーターレスであるため、発現は以下の場合にのみ得られた：ｉ）ＩＤＬＶが意図した遺伝子座に、正しい方向で、機能的に組み込まれた；ｉｉ）Ｋ５６２細胞が、それが完全に機能するＦＶＩＩＩを生産し分泌することが可能であった。ＦＶＩＩＩ産生は、２×１０^６個の細胞によって２４ｈで産生されたＦＶＩＩＩの量として表された（図４Ｄ）。

【0195】

全体として、このデータは、本発明によるＩＤＬＶが効率的にＦＶＩＩＩを送達し、内因性プロモーターの制御下でそれを統合できることを示す。産生されたＦＶＩＩＩは、細胞によって効率的に分泌され、それはその酵素活性を維持する。

【0196】

実施例５：ＩＤＬＶ導入によるＧＦＰノックイン（ＩＤＬＶ ＧＰ３５）
本発明者らは、さらに、ｇＲＮＡ－Ｔを別の位置に配置したＩＤＬＶ（ＧＰ３５）を設計し、より柔軟な設計を可能にした。そのために、５’から３’の順に、ｉ） ｇＲＮＡ－Ｔ； ｉｉ） プロモーターレスＧＦＰ； ｉｉｉ） ＰＧＫ駆動のピュロマイシン導入遺伝子を含む発現カセットを挿入した。このカセットはベクターＬＴＲに対してアンチセンス方向に挿入された。コントロールとして、本発明者らはｇＲＮＡ－Ｔ配列とＧＦＰの上流のＭＨ５’配列を欠いた同様のＩＤＬＶを設計した（図５Ａ）。
Ｋ５６２－Ｃａｓ９細胞にこれらのＩＤＬＶを形質導入し、２４時間後にＨＢＡ １５．１ｇＲＮＡコードプラスミドを形質導入した。

【0197】

ＧＦＰ発現解析の結果、もう一度ｇＲＮＡ－Ｔの存在により、ＩＤＬＶのＫＩがコントロールのＩＤＬＶと比較してほぼ８倍に増加した（図５Ｂ）。
ＩｎＤｅｌの％は、Ｃａｓ９によって切断されたゲノムアレルの割合と相関している

【0198】

実施例 ６．
最後に、本発明者らは、本発明によるアプローチが、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣのような臨床的に関連する細胞の改変にも使用できることを確認した。

【0199】

本発明者らは、ＨＳＣを４８時間培養し、ＧＦＰ ＩＤＬＶ（ＧＰ３３）でトランスフェクトし、２４時間後に、ＲＮＰ（ＨＢＡ １５．１）でトランスフェクションした。
コントロールとして、本発明者らは、ゲノムＤＮＡのみを切断し、ＩＤＬＶを切断しないＨＢＡ１６．１を用いた。次に、α－グロビンの発現を誘導するために、細胞を赤血球系譜に向かって分化させた。

【0200】

そのために、動員した末梢血ＨＳＰＣ（AllCells）を解凍し、前刺激培地で４８時間培養した（StemSpan、Stem Cell technologies;rhSCF 300 ng/ml,Flt3-L 300 ng/ml,rhTPO 100 ng/ml,IL-3 20 ng/mL, CellGenix）。ＨＳＰＣは、レトロネクチンコーティングプレート（５μｇ／ｗｅｌｌ）上で、硫酸プロタミン（４μｇ／ｍｌ）の存在下、プレ刺激培地でＩＤＬＶ ＧＰ３３を形質導入された。

【0201】

導入から２４時間後、細胞を洗浄し、ＲＮＰでエレクトロポレーションした（Cas9:gRNA HBA15.1；実施例３のように）。Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）を用いて、１条件あたり２×１０５個の細胞をＲＮＰ複合体でヌクレオフェクションした。

【0202】

ＨＳＰＣを赤血球分化培地（StemSpan, Stem Cell Technologies; rhSCF 20 ng/ml, Epo 1 u/mL, IL3 5 ng/ml, Dexamethasone 2 μM and Betaestradiol 1 μM）中で１４日間培養した。ＧＦＰの発現は、フローサイトメトリーにより分化に伴ってモニターされた。

【0203】

両ｇＲＮＡの切断効率（ＩｎＤｅｌ効率）はほぼ同じであったが、ＦＡＣＳ解析の結果、ヌクレアーゼ標的ＩＤＬＶは標準ＩＤＬＶに比べて約１０倍のＧＦＰ陽性細胞を与えることがわかった（図６Ａ）。

【0204】

本発明者らは、ＨＳＰＣをメチルセルロース中にプレーティングして単細胞コロニーを得、ＨＳＰＣの多能性をｉｎ ｖｉｔｒｏでモニターした。ヌクレオフェクション後、条件ごとに１０^３個の細胞を３ｍｌのメチルセルロース培地（Ｈ３４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、コロニー形成単位（ＣＦＣ）アッセイを行った。

【0205】

１４日後、コロニーを数え、その外観に従ってスコア化した。コロニーは、顆粒球／赤血球／単球／巨核球形成単位（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）、顆粒球／マクロファージ形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）または赤血球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）としてスコア化された。

【0206】

重要なことは、未処理のコントロールと比較して、ＫＩの手順では、前駆細胞に毒性も系統の偏りも与えなかったことである（図６Ｂ）。

【0207】

倒立蛍光顕微鏡下で、単一のＧＦＰ陽性コロニーを摘出した。ＤＮＡは、プロテイナーゼＫ（Thermo Fisher Scientific）で溶解後、標準的な条件で抽出した。ゲノムＤＮＡの分子解析は、実施例２と同様に行った。

【0208】

このことから、ＧＦＰの発現は、赤血球特異的なα－グロビンプロモーターによって駆動されていることが明らかとなった。ＩＤＬＶ ＫＩの精度をさらに確認するため、彼らはＧＦＰ＋単一コロニーから抽出したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ分析を行い、オンターゲットのドナーＤＮＡの組み込みを確認した。

【0209】

挿入されたＩＤＬＶは１００％切断され、ＭＨ配列の存在により、切断されたＩＤＬＶの９０％は野生型ゲノム配列と比較してヌクレオチドの変化がなく、シームレスに統合された（図６Ｃ）。

【0210】

実施例７：
本発明者らは、ｈＰＧＫ、ＧＦＰをコードする本発明によるＩＤＬＶ（ＧＰ５７と呼ぶ）を作製し、ＩＤＶＬを切断するためにｈＰＧＫの５’にｇＲＮＡ標的配列（ｇＲＮＡ－Ｔ）、および目的のゲノム部位と相同な約４０ｂｐの短い塩基配列（マイクロ相同、ｍｉｃｒｏ ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ＭＨ）を挿入した。同様に、ＭＨまたはＭＨとｇＲＮＡ－Ｔをそれぞれ欠いた２つの他のＩＤＬＶ（本発明によるＧＰ５８および対照のＭＡ２７７）を作製した（図７Ａ）。

【0211】

このために、本発明者らは、野生型Ｋ５６２細胞を（実施例１と同様に）示されたＩＤＬＶのそれぞれで形質転換し、２４時間後に、形質転換された細胞の２×１０^５を、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＡｍａｘａ ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ）を用いたＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット１８μｌおよび記載のＨＢＡ １５．１ ＲＮＰ ２，７５μｌを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ組み立て済Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）でトランスフェクションすることができた。ｇＲＮＡ（ＨＢＡ１５．１）とＣａｓ９の組み立ては、３０μＭの細菌精製２－ＮＬＳ Ｃａｓ９タンパク質と４５μＭのＳｙｎｔｈｅｇｏの合成ｇＲＮＡガイドから（それぞれ比率１：１，５）、適切量のＢｕｆｆｅｒ １０Ｘを用いて室温で１０分間混合することによって行った。

【0212】

２週間後、本発明者らは、ＦＡＣＳによりＧＦＰ発現を評価し、ＩＤＬＶ ＤＮＡの切断により陽性細胞の割合が約４倍に増加したことを観察し、本発明によるＩＤＬＶ構築物の両方（相同性アーム配列ありおよびなし）について、対照ＩＤＬＶと比較してゲノムＤＮＡ中のＧＦＰ ＫＩが効率的であることを示していることを確認した。ＶＣＮ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒｓ）は、ＧＦＰ＋細胞の割合と相関している。ＩｎＤｅｌの％は、Ｃａｓ９によって切断されたゲノムアレルの割合と相関する。（図７Ｂ）。

【0213】

これらの結果は、ＩＤＬＶの切断がゲノムの標的統合を増加させることを明確に示している。

【0214】

実施例８．
ＩＤＬＶ ＫＩの効率と精度を確認するために、本発明者らは、実施例７の最後に得られたＫ５６２単細胞クローンから抽出したゲノムＤＮＡについてＰＣＲ分析を行った（図８Ａ）。

【0215】

ＧＦＰ＋細胞（ＦＡＣＳソート済み）ＡＡＶＳ１ ＩＤＬＶ細胞を図７に記載のように処理したものを連続希釈して３６５個の単一細胞クローンを得た。

【0216】

ＰＣＲ１産物は、任意のミスマッチの存在を決定するためにサンガー配列決定した。

【0217】

ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ＤＮＡ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ ＮＡ Ｓｍａｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ” Ｋｉｔ（Product No. 06543588001- by Roche）－を用いて２週間後にゲノムＤＮＡを抽出し、Thermo Fisher Scientificas社のＮａｎｏＤｒｏｐ ８０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて定量を行った。

【0218】

オンターゲット統合のスクリーニングは、ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ；Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍを用いた図８Ａに示すＰＣＲ ｉｎ－ｓｅｎｓｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎおよびＰＣＲ ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎで行った（ＳＥＮＳＥプライマー。Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＣＡＧＣＴＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ３’（配列番号８１）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＧＣＧＡＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧ３’（配列番号８２）；ＡＮＴＩＳＥＮＳＥプライマー。フォワード：５’ＧＣＧＡＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧ３’（配列番号８２），リバース：５’ＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＴＣＡ３’（配列番号８３）。

【0219】

オンターゲットインテグレーション用クローンの分子解析をまとめた結果を図８Ｂに示す。

【0220】

これらの結果は、ＩＤＬＶ中のｇＲＮＡ切断部位の隣にゲノム標的部位と相同な短い配列が存在することで、相同配列のないＩＤＬＶと比較して、ＩＤＬＶのゲノムへの統合を意図した向きで、かつシームレスに行えることを明確に示している。

【0221】

次に、本発明者らは、実施例７の最後に得られたＫ５６２単細胞クローンから抽出した前記ＤＮＡにおけるオフターゲットインテグレーションをＰＣＲ解析により検討した（図８Ｃ）。

【0222】

１つの主要なオフターゲットインテグレーションをスクリーニングするために、Ｋ５６２単一細胞クローンから抽出したゲノムＤＮＡに対して行ったＰＣＲ分析は、ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ； Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍを用いたＰＣＲ ｓｅｎｓｅとＰＣＲ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（ＳＥＮＳＥ ｐｒｉｍｅｒｓ：Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧ３’（配列番号８４）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＧＣＧＡＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧ３’（配列番号８２）およびＡＮＴＩＳＥＮＳＥプライマー。Ｆｏｒｗａｒｄ：５’ＧＣＧＡＡＣＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＧ３’（配列番号８２）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’ＧＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＧＧ３’（配列番号８５））。

【0223】

オフターゲット統合のためのクローンの分子解析をまとめた結果を図８Ｄに示す。

【0224】

これらの結果は、図８Ｂの結果と合わせて、ＩＤＬＶのｇＲＮＡ切断部位の隣にゲノム標的部位と相同な短い配列が存在することで、相同配列のないＩＤＬＶと比較して、１．５倍高いオンターゲット対オフターゲットの優先度でＩＤＬＶのゲノムへの統合を媒介できることが明確に示された。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【配列表】

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【国際調査報告】