特表 2022-541645 治療用タンパク質の多機能性および増強された分泌のための多量体タンパク質ドメイン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-26

(54)【発明の名称】治療用タンパク質の多機能性および増強された分泌のための多量体タンパク質ドメイン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220915BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220915BHJP

   C07K 14/525 20060101ALI20220915BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220915BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220915BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220915BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220915BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20220915BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 38/39 20060101ALI20220915BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220915BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K19/00 ZNA

C07K14/525

C07K14/78

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N7/01

A61P25/28

A61P35/00

A61P37/06

A61K35/76

A61K48/00

A61K9/14

A61K47/68

A61K47/65

A61K38/17

A61K38/39

A61K39/395 Y

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022504703

(86)(22)【出願日】2020-07-22

(85)【翻訳文提出日】2022-03-24

(86)【国際出願番号】 US2020043011

(87)【国際公開番号】W WO2021016316

(87)【国際公開日】2021-01-28

(31)【優先権主張番号】62/876,850

(32)【優先日】2019-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501453307

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ フロリダ リサーチ ファンデーション， インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】ゴルデ，トッド イー．

(72)【発明者】

【氏名】ラン，ヨン

(72)【発明者】

【氏名】グッドウィン，マーシャル

(72)【発明者】

【氏名】クルス，ペドロ

(72)【発明者】

【氏名】レビテス，ヨナ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA29

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC03

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076EE59M

4C076EE59Q

4C076FF31

4C076FF63

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA40

4C084DB63

4C084DC50

4C084MA43

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA12

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA151

4C084ZA161

4C084ZB081

4C084ZB261

4C085AA25

4C085BB11

4C085BB31

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA43

4C087NA03

4C087NA05

4C087NA12

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZB08

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA14

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書に提供されるのは、目的の生物活性小ペプチドの、標的細胞への送達を介した安定した産生のための組成物および方法であって、これは、目的の小ペプチドの、Ｃ１ｑＴＮＦタンパク質のコラーゲンドメインへの融合により、多量体化可能な新規の足場タンパク質を産生することに基づく。有利なことに、本開示の融合タンパク質、組成物および方法は、目的の細胞内分泌可能ペプチドのより高い安定発現およびより長い安定性を提供することにより、当技術分野における既存のニーズを満たす。さらに、本開示の融合タンパク質、組成物および方法は、発現された受容体ペプチドの、標的細胞におけるリガンド結合パートナーとの、改善された結合親和性を提供する。本明細書でさらに提供されるのは、記載された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物、およびこれらのポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス粒子である。記載された融合タンパク質を含む医薬組成物およびナノ粒子も、本明細書に提供される。本明細書にさらに提供されるのは、記載された融合タンパク質、ｒＡＡＶ粒子、組成物、および／またはナノ粒子を投与することにより、対象を処置する方法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合タンパク質であって、（ｉ）Ｃ１ｑＴＮＦタンパク質コラーゲンドメイン（ＣＣＤ）および（ｉｉ）第１の異種ペプチドを含み、ここでＣＣＤがヒト起源のＣ１ｑＴＮＦに由来する、前記融合タンパク質。

【請求項2】

（ｉｉｉ）第２の異種ペプチド、をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

ＣＣＤが、配列番号１または１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

ＣＣＤが、配列番号２または３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

ＣＣＤが、配列番号４～９いずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

融合タンパク質が、構造：ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＣＣＤ］－［第１の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＣＣＤ］－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、またはＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－ＣＯＯＨを含み、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列の存在を示す、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

任意のリンカー配列が、アミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号１０３）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０４）を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

第１および第２の異種ペプチドが、分泌可能ヒトペプチドである、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

１つ以上のＦＬＡＧまたはＨｉｓ_６タグをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

分泌シグナル配列をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

融合タンパク質が、２つ以上のリガンドに対して二重特異性を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項13】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、免疫チェックポイントモジュレーターである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項14】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、可溶性リンパ球活性化遺伝子（ｓＬａｇ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項15】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、成長因子受容体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、Ｌａｇ３、ＰＤ－１、ＷＩＦ１、Ｉｃｏｓ、ＮＯＴＣＨ１、ＶＥＧＦＲ１、ＧＢＡ、ＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ－ＳＲ３９、およびＦＧＦＲ１からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つが、ＮＯＴＣＨ４、ＣＴＬＡ４、ＤＬＬ３、ＪＡＧ１、Ｂ７Ｈ３、ＥＧＦＲ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＨＨＩＰ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、ＤＫＫ１、ＳＯＳＴＤＣ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＴＲＡＩＬ、ＴＩＭＰ３、ＨＡＶＣＲ２、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３、および可溶性トール様受容体（ｓＴＬＲ）の外部ドメイン、からなる群から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

第２の異種ペプチドが、アミロイドβペプチド（α－Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

第１の異種ペプチドが、タウタンパク質（α－タウ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

融合タンパク質が、構造：ＮＨ_２－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＦＬＡＧ－ＣＯＯＨ、またはＮＨ_２－ＦＬＡＧ－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨを含み、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列を示す、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

第１の異種ペプチドが、ＧＢＡを含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

第１の異種ペプチドがアミロイドβペプチド（Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含み、第２の異種ペプチドが異なるアミロイドβペプチドに対して親和性を有するｓｃＦｖを含む、請求項１２に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

融合タンパク質が、配列番号５６、５７、５９、７０、７２、７７、８０、８７、１０１、１０２、または１０５～１０８のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

融合タンパク質が、配列番号１３～４８、５０～９６、１０１、１０２、または１０５～１０８に記載のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

融合タンパク質が、配列番号５６、５７、５９、７０、７２、７７、８０、８７、１０１、１０２、または１０５～１０８に記載のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項26】

融合タンパク質が、配列番号５７、８７、１０２、または１０５～１０８に記載のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項27】

請求項１～２６に記載の融合タンパク質のいずれか１つを含む２つ以上の単量体を含む、多量体融合タンパク質。

【請求項28】

請求項１～２６に記載の融合タンパク質のいずれか１つを含む３または６個の単量体を含む、請求項２７に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項29】

単量体が同一である、請求項２７または２８に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項30】

単量体が同一ではない、請求項２７または２８に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項31】

２つ以上の単量体のＣＣＤが、１つ以上のグリシン－システイン－グリシンリンカードメインまたはグリシン－チロシン－システインリンカードメインによって互いに連結されている、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項32】

２つ以上の単量体が、１つ以上のジスルフィド架橋によって互いに連結されている、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項33】

多量体融合タンパク質が、２つ以上のリガンドに対して二重特異性を有する、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項34】

多量体融合タンパク質が、in vivoで２つ以上のリガンドに対して、in vivoでの同じリガンドに対する第１および第２の異種ペプチドの結合親和性の合計と実質的に等価である結合アビディティを有する、請求項２７～３３に記載の多量体融合タンパク質。

【請求項35】

（ｉ）メロゾイト表面タンパク質ドメイン（ＭＳＰ）および（ｉｉ）第１の異種ペプチドを含む、融合タンパク質。

【請求項36】

第２の異種ペプチドをさらに含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

ＭＳＰが、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３５または３６に記載の融合タンパク質。

【請求項38】

融合タンパク質が、構造：ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＭＳＰ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＭＳＰ］－［第１の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＭＳＰ］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＭＳＰ］－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、またはＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－［ＭＳＰ］－ＣＯＯＨを含み、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列の存在を示す、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項39】

融合タンパク質が、配列番号９７～１００に記載のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項40】

請求項１～２６または請求項３５～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項41】

請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項42】

ベクターが、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項４１に記載のベクター。

【請求項43】

異種プロモーターが、ヒト脳細胞において活性である、請求項４２に記載のベクター。

【請求項44】

プロモーターが、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）プロモーターまたはシナプシン１（ＳＹＮ）プロモーターから選択される、請求項４３に記載のベクター。

【請求項45】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項２７～３４のいずれか一項に記載の多量体融合タンパク質および、薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項46】

請求項４１～４３のいずれか一項に記載のベクターおよび、薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項47】

請求項４６に記載の組成物を含む、ナノ粒子。

【請求項48】

請求項３６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４１～４３のいずれか一項に記載のベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。

【請求項49】

ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／１粒子を含む、請求項４８に記載のｒＡＡＶ粒子。

【請求項50】

疾患、障害、もしくは状態を有するか、またはこれを発症するリスクのある対象を処置する方法であって、以下：
請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５もしくは４６に記載の医薬組成物、請求項４７に記載のナノ粒子、または請求項４８もしくは４９に記載のｒＡＡＶ粒子を、対象に投与すること、
を含む、前記方法。

【請求項51】

対象が、疾患、障害、または状態と診断されている、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

疾患、障害、または状態が、アルツハイマー病または別の神経変性疾患、がん、または自己免疫疾患である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

対象がヒトである、請求項５０～５２に記載の方法。

【請求項54】

細胞、組織または器官における分析物の濃度を決定する方法であって、以下：
対象の細胞、組織または器官に、請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５もしくは４６に記載の医薬組成物、請求項４７に記載のナノ粒子、または請求項４８もしくは４９に記載のｒＡＡＶ粒子を、投与すること；および
分析物の濃度を測定すること、ここで融合タンパク質は、分析物に対して結合親和性を有する、
を含む、前記方法。

【請求項55】

細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

細胞が、哺乳動物対象から単離された、請求項５４または５５に記載の方法。

【請求項57】

対象の処置を、分析物の濃度を考慮して調整することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

細胞、組織、または器官中の分析物の濃度を測定するためのキットであって、以下：
請求項１～３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４５もしくは４６に記載の医薬組成物、請求項４７に記載のナノ粒子、または請求項４８もしくは４９に記載のｒＡＡＶ粒子；および
融合タンパク質と分析物との間の結合親和性を測定するための手段であって、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、および分光法から選択される、前記手段、
を含む、前記キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、２０１９年７月２２日出願の米国仮出願第62/876,850号の出願日の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援研究
本発明は、国立衛生研究所により授与されたP01 CA166009のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
天然に存在するかまたは合成的に生成される生物活性小ペプチド（bioactive small peptide）は、近年、研究ツールおよび薬理学的薬物としてますます関心を集めている。特に、これらの生物活性小ペプチドは、様々な生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしており、したがって多くの病的状態に対する治療的介入の有望な標的である。さらに生物活性小ペプチドは、従来の薬剤に比べて増強された標的結合親和性および特異性を有する、様々な生物学的プロセスのアゴニストまたはアンタゴニストとしての使用を獲得している。これら進歩にもかかわらず、外来性の遺伝子送達候補としての小ペプチドの使用は、細胞における限られた発現効率、低い結合親和性、および短い半減期（主に、分解のための細胞プロテアーゼに対する小ペプチドの感受性のため）によって妨げられてきた。

【0004】

小ペプチドの外来性投与のこれらの問題を克服するために開発された１つの戦略は、目的の細胞または組織に投与される高発現ベクターを使用することによって、細胞内でペプチドを生成することである。研究者は、足場タンパク質または他のレポータータンパク質との融合ペプチドの一部として小ペプチドを発現させるために、異なる発現システムを採用したが、この戦略は、遊離ペプチド形態でのみ活性であるかまたはより高度に活性である小ペプチドでは、成功していない。

【0005】

これとは別に、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）および関連する神経変性疾患に対する効果的な治療法は、未だ満たされていない重要な医学的要求である。免疫療法アプローチは、ＡＤに対する効果的な疾患改変療法を開発するための努力の、主要な焦点であり続けている。脳内でのアミロイドβ（ＡβまたはＡベータ）斑産生を標的とする阻害剤とは対照的に、抗Ａβ免疫療法は、既存の沈着物を除去するか、有毒なＡβ凝集体を中和するか、またはその両方を行う可能性がある。したがって、既存の病状を有する患者において免疫療法を試験するための、より良い理論的根拠が存在する。

【発明の概要】

【0006】

発明の概要
本開示は、目的の生物活性小ペプチドを標的細胞への送達を介して安定して産生するための、新規な組成物および方法を提供する。本開示の側面は、Ｃ１ＱＴＮＦタンパク質のコラーゲンドメインを含むより大きな足場タンパク質の生成物としての、目的のペプチドの外来性発現を提供する。

【0007】

本開示の融合タンパク質、組成物および方法は、目的の細胞内かつ分泌可能なペプチドの、より高い安定発現およびより長い安定性を提供することにより、当技術分野における既存のニーズを満たす。さらに本開示の融合タンパク質、組成物および方法は、発現された受容体ペプチドの、標的細胞におけるリガンド結合パートナーとの改善された結合親和性を提供し、これには、免疫療法ペプチドのアミロイドβリガンドとの結合が含まれる。

【0008】

本開示は少なくとも部分的に、コラーゲンが、哺乳動物の様々な結合組織の主要な構造タンパク質である、細胞外マトリックスタンパク質であるとの理解に基づく。これは、反復三重らせん配列グリシン－Ｘ－Ｙを持つ１つ以上の三重らせん領域（コラーゲンドメイン）を含有し、ここでＸおよびＹは、多くの場合プロリン（アミノ酸コード、ＰまたはＰｒｏ）またはヒドロキシプロリン（アミノ酸コード、ＯまたはＨｙｐ）である。Lodish et al., MOLECULAR CELL BIOLOGY, 4^th edition, Section 22.3, New York: W. H. Freeman, ed.; 2000を参照。かかるトリプレットの存在により、３つのコラーゲンポリペプチド鎖（α鎖）が、細胞内で三重らせんの立体配座に折り畳まれることが可能となる。

【0009】

コラーゲンドメインを有する多くのコラーゲン様タンパク質がヒト血清中に存在し、感染性生物からの保護において自然免疫系として機能する。これらには、補体タンパク質Ｃ１ｑが含まれる。これらの「防御コラーゲン」分子に共通する構造的特徴は、Ｃ末端に標的結合ドメインを持つ複数三量体タンパク質ユニットへの、それらの会合である。結果として多量体化は、これらの防御コラーゲン分子の結合ドメインの機能的親和性を増加させ得る。コラーゲンドメインを含有する異種融合タンパク質の三量体化は、同種または異種の三量体化ドメインをコラーゲンドメインに融合させて、コラーゲン三重らせん形成を駆動することにより達成されてきた。米国公開第2008/0176247号を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0010】

その臨床的可能性について活発に調査されている高発現ベクター系は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。分泌可能小ペプチドの限られた発現レベルと貧弱な半減期は、多くのｒＡＡＶ用途の開発における障害として残っている。いくつかのグループは、目的の小ペプチドとの抱合、またはそれとの融合タンパク質に、分泌シグナルおよび細胞透過性ペプチド配列を導入した。例えば、米国特許公開第2012/0157513号を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0011】

本開示のペプチド送達戦略は、ｒＡＡＶ系を、ヒトＣ１ｑＴＮＦタンパク質の遺伝的に最適化されたコラーゲンドメイン（ＣＤ）を含む融合タンパク質と組み合わせる。このドメインは、本明細書では「Ｃ１ｑＴＮＦコラーゲンドメイン」または「ＣＣＤ」と呼ばれる。様々な側面において、本明細書で提供される融合タンパク質のコラーゲンドメインは、Ｃ１ｑＴＮＦタンパク質に由来する。特定の態様において、コラーゲンドメインは、Ｃ１ｑＴＮＦ３タンパク質に由来する。いくつかの態様において、コラーゲンドメインは、Ｃ１ｑＴＮＦ５タンパク質に由来する。様々な態様において、コラーゲンドメインは、哺乳動物Ｃ１ｑＴＮＦタンパク質、例えばヒトＣ１ｑＴＮＦタンパク質に由来する。

【0012】

本開示のＣＣＤ融合タンパク質を使用するペプチドの発現および送達は、驚くべきことに、以下の長年のニーズのそれぞれに対する解決策を提供する：１）in vitroおよびin vivoで目的の小ペプチドの１０倍を超える発現レベルの達成、２）目的のペプチドの多量体化を促進して、アビディティの利用によりリガンド結合親和性を高めること、および３）ペプチド生成物の半減期の安定化。

【0013】

したがって、いくつかの側面において、本開示は、（ｉ）Ｃ１ｑＴＮＦタンパク質コラーゲンドメイン（ＣＣＤ）および（ｉｉ）第１の異種ペプチドを含む、融合タンパク質を提供する。特定の態様において、ＣＣＤは、ヒト起源のＣ１ｑＴＮＦに由来する。いくつかの態様において、ＣＣＤはＣ１ｑＴＮＦ３ ＣＤであり、ヒトＣ１ｑＴＮＦ３ ＣＤに由来し得る。

【0014】

異種ペプチドは、ＣＣＤ融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置し得る。したがって、いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、構造：ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－［ＣＣＤ］－［第１の異種ペプチド］－ＣＯＯＨを含み、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列の存在を示す。

【0015】

いくつかの態様において、開示された融合タンパク質はさらに、第２の異種ペプチドを含む。したがって、かかる態様において、融合タンパク質は、構造：ＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＣＣＤ］－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－ＣＯＯＨ、またはＮＨ_２－［第１の異種ペプチド］－［第２の異種ペプチド］－［ＣＣＤ］－ＣＯＯＨを含み得、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列の存在を示す。かかる融合タンパク質は、２つ以上のリガンドに対して二重特異性を有し得る。

【0016】

ある側面において、融合タンパク質の１つ以上の異種ペプチドは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）または免疫チェックポイントモジュレーターを含み得る。

【0017】

ある側面において、本開示は、上記のような融合タンパク質を含む２つ以上の単量体を含む多量体融合タンパク質を提供する。単量体は、同一であっても異なっていてもよい。いくつかの態様において、多量体融合タンパク質は、三量体または六量体を含む。

【0018】

ある側面において、本開示は、１つ以上の融合タンパク質または多量体融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。さらに提供されるのは、かかるポリヌクレオチドを含む発現ベクター（または構築物）である。かかるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む組換えＡＡＶ粒子もまた、提供される。

【0019】

他の側面において、本開示は、上記の融合タンパク質または多量体タンパク質、または上記の発現ベクター、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。融合タンパク質を含むナノ粒子も提供される。

【0020】

他の側面において、本開示は、上記のような１つ以上のＣＣＤ融合タンパク質を対象に投与することを含む、疾患、障害、または状態を有する対象の処置方法を提供する。細胞、組織または器官における１つ以上の分析物の存在を検出するための、１つ以上のＣＣＤ融合タンパク質を投与することを含む方法およびキットも提供され、ここで該タンパク質は、１つ以上の分析物に対して結合親和性を有する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために含まれ、本開示は、これらの図面の１つ以上を本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、さらによく理解することができる。

【0022】

【図1】図１Ａは、２つの異種ペプチド（「融合タンパク質１」および「融合タンパク質２」）を含むＣＣＤ融合タンパク質の、推定の三量体構造を示す概略図である。参考のために、単量体融合タンパク質も示す。システイン残基間のジスルフィド架橋は「Cys」で示す。図１Ｂは、ＦＬＡＧタグおよびポリ（Ａ）テールに融合された、Ｃ１ｑＴＮＦ３からの最適化ＣＣＤ配列のアミノ酸（配列番号１１に対応）を示す。

【0023】

【図2】図２は、ＣＣＤドメインとの融合が、様々なＣＣＤ－異種ペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを含むｒＡＡＶ粒子の、ＰＥＩトランスフェクションによるＨＥＫ２９３細胞への投与後に、様々な異種ペプチドパートナーの発現および分泌レベルを実質的に増加させることを示す、ウエスタンブロット画像を示す。異種ペプチドパートナーは、可溶性Ｌａｇ３、可溶性ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＮＯＴＣＨ１、ＤＬＬ３、およびＡβ９単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）で構成されていた。上のパネルは、還元剤の不在下での細胞溶解物のウエスタンブロットを示す。下のパネルは、細胞採取後の馴化培地のウエスタンブロットを示す。

【0024】

【図3】図３は、ＣＣＤ融合タンパク質が多量体構造を形成することを示すウエスタンブロット画像を示す。左のパネルは、ｓＬａｇ３－ＣＣＤ＿ＦＬＡＧをコードするｒＡＡＶ核酸ベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の溶解後の培地の、いくつかの溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。一連のバンドはそれぞれ、異なる多量体（例えば六量体、三量体、二量体、単量体）を表す。右のパネルは、異なる温度および還元条件で処理した後のこれらの培地溶出画分のうちの５つの、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

【0025】

【図4】図４は、室温および４℃でそれぞれ１２日間および３０日間保管後の、ｓＢ７Ｈ３－ＣＣＤ融合タンパク質の安定性を示す。

【0026】

【図5】図５は、アミロイドβペプチド５（Ａβ５ｓｃＦｖ ＣＣＤ）に対する単鎖抗体フラグメントを含むＣＣＤ融合タンパク質の、この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ粒子をマウスモデルに投与した後の、増強された発現を示す。

【0027】

【図6-1】６Ａ～６Ｅは、機能的な多価タウおよびＡβ結合単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ、または「ナノボディ」）異種ペプチドを含む二重特異性ＣＣＤ融合タンパク質の例を示す。図６Ａは、タウを標的とする９４－３Ａ６ ｓｃＦｖおよびＡβ９を標的とするｓｃＦｖを含有する例示的な二重特異性ＣＣＤナノボディの概略図である（ＣＣＤは「Col D」として表される）。図６Ｂは、二重特異性ナノボディＣＣＤ融合タンパク質の、ＥＬＩＳＡによるタウおよびＡβの両方への結合を示す（ＣＣＤは「コラーゲン」として表されている）。図６Ｃは、細胞培地における融合タンパク質の発現レベルを示す。図６Ｄは、ＣＲＮＤ８マウスおよびヒトアルツハイマー病患者（「ヒトAD」）に由来する細胞における、ｓｃＦｖの標的化タウおよびＡβを含む二重特異性ＣＣＤ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶ２／８の投与後の、アミロイド斑病変の染色を示す。

【図6-2】図６Ｅは、生体層干渉測定の結果を示す表面プラズモン共鳴センサーグラムであり、融合タンパク質の、タウおよびＡβに連続的に結合する能力を示す。

【図6-3】図６Ｅは、生体層干渉測定の結果を示す表面プラズモン共鳴センサーグラムであり、融合タンパク質の、タウおよびＡβに連続的に結合する能力を示す。

【0028】

【図7】図７は、ＶＥＧＦＲ－２を標的とする抗Ａβ９ ｓｃＦｖおよびＢ１１ｓｃＦｖを含む二重特異性ＣＣＤ融合タンパク質のｒＡＡＶ投与が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現するＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおいて、in vivoのアミロイド斑沈着を低減することを示す。「コラーゲン」＝ＣＣＤドメイン。

【0029】

【図8-1】図８Ａ～８Ｃは、ＶＥＧＦＲ１デコイ受容体を含むＣＣＤ融合タンパク質が、ヒトＨＵＶＥＣ細胞株におけるin vitroおよびin vivoアッセイにおいて細胞の増殖を首尾よく阻害することを示す。図８Ａは、ＨＵＶＥＣ管形成アッセイを示す概略図である。ＭＴＴアッセイで実行される酵素的ＭＴＴ還元反応も示す。さらに、血管新生の様々な分子メディエーターのチャートが示され、そのうちのいくつかは、ＣＣＤ融合タンパク質の生成および評価、例えばＨＵＶＥＣチューブ形成およびＭＴＴアッセイのために選択されている。

【図8-2】図８Ｂの免疫染色画像は細胞管形成アッセイの結果を示し、これは、単離および精製されたヒトＶＥＧＦＲ１－ＣＣＤ融合タンパク質、ならびにヒトＶＥＧＦＲ１ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ２ドメイン３およびＣＣＤドメイン（「VLV2-CCD」」および馴化培地を含む融合タンパク質による、ＨＵＶＥＣ管形成の阻害を示す。図８Ｃは、ＭＴＴ活性を示す。「コラーゲン」および「コラーゲンタンパク質」は、ＣＣＤドメインのみの投与を示す。

【0030】

【図9】図９は、本開示のＣＣＤドメインへのクローニングおよび融合のために選択された抗原提示細胞およびＴ細胞上で発現される、様々な膜貫通および細胞外免疫シナプス異種ペプチドを示す概略図である。

【0031】

【図10】図１０は、クローニングおよび融合のために選択された様々な細胞シグナル伝達（抗増殖性）異種ペプチドの、伝達経路を示す概略図である。

【0032】

【図11-1】図１１は、細胞におけるｒＡＡＶ媒介発現、溶解、および細胞溶解物からの培地／上清の単離後の、ヒト由来（黒）またはマウス由来（赤）の免疫チェックポイントタンパク質を含む様々なＣＣＤ融合デコイタンパク質の過剰発現および分泌レベルを示す。マウス由来ペプチドとのＣＣＤ融合物をマウス組織に投与し、ヒト由来ペプチドとの融合物をヒト組織に投与した。示されている免疫シナプスタンパク質の多くについて、ＣＣＤドメインへの外部ドメイン融合は、マウスとヒトの両方の構築物で高レベルの発現と分泌を生成する。これらのウエスタンブロットは、５０を超えるＣＣＤ融合タンパク質の生成に成功したことを示す。上のパネルは、細胞溶解物のウエスタンブロットの減少を示す。下のパネルは、還元剤がない場合の培地のウエスタンブロットを示す。非抱合ＣＣＤドメイン（「コラーゲン」）およびｒＡＡＶベクターのみを、陰性対照として使用した。

【図11-2】図１１は、細胞におけるｒＡＡＶ媒介発現、溶解、および細胞溶解物からの培地／上清の単離後の、ヒト由来（黒）またはマウス由来（赤）の免疫チェックポイントタンパク質を含む様々なＣＣＤ融合デコイタンパク質の過剰発現および分泌レベルを示す。マウス由来ペプチドとのＣＣＤ融合物をマウス組織に投与し、ヒト由来ペプチドとの融合物をヒト組織に投与した。示されている免疫シナプスタンパク質の多くについて、ＣＣＤドメインへの外部ドメイン融合は、マウスとヒトの両方の構築物で高レベルの発現と分泌を生成する。これらのウエスタンブロットは、５０を超えるＣＣＤ融合タンパク質の生成に成功したことを示す。上のパネルは、細胞溶解物のウエスタンブロットの減少を示す。下のパネルは、還元剤がない場合の培地のウエスタンブロットを示す。非抱合ＣＣＤドメイン（「コラーゲン」）およびｒＡＡＶベクターのみを、陰性対照として使用した。

【0033】

【図12】図１２は、ヒトおよびマウスモデルの両方における、細胞シグナル伝達異種ペプチドを含む様々なＣＣＤ融合タンパク質の、過剰発現および分泌を示すウエスタンブロットを示す。シグナルペプチドのＣＣＤドメインへの融合は、マウスとヒトの両方で高レベルの発現と分泌を生成する。還元剤の存在下および不在下での馴化培地および溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。非抱合ＣＣＤドメイン（「コラーゲン」）を対照として使用した。

【0034】

【図13】図１３は、ヒトおよびマウス組織の両方における様々なＣＣＤ融合タンパク質の、過剰発現および分泌を示すウエスタンブロットを示す。右端のブロットは、ＣＣＤが可溶性Ｔｏｌｌ様受容体５（ｓＴＬＲ５）ペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置されている場合の、過剰発現と分泌の違いの評価を示す（「Col」および「CD」はＣＣＤを表す）、ここで細胞は、トランスフェクションの４８時間後に回収した。

【0035】

【図14】図１４は、Ｉｃｏｓリガンド（「IcosL」）を含有する培地の存在下または不在下での、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｒＡＡＶ媒介投与後のＩｃｏｓ－ＣＣＤ融合タンパク質の発現レベルを示す、ウエスタンブロットを示す。「コラーゲン」はＣＣＤを表す。

【0036】

【図15-1】図１５Ａ～１５Ｃは、ｓＬａｇ３、ＮＯＴＣＨ１、ＨＨＩＰ、ＶＥＧＦＲ１、Ｔｇｆｂｒ２、ＰＤ－１、ＨＡＶＣＲ２、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＳＦＲＰ１およびＥＧＦＲ ＣＣＤ融合タンパク質のいくつかが、精製された融合タンパク質をヒトおよびマウス細胞とインキュベートし、続いて溶解および分離した後に、細胞表面に結合することを示す、ウエスタンブロットを示す。図１５Ａおよび１５ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して実施したが、図１５Ｃでは、マウス神経膠腫２６１（ＧＬ２６１）細胞を使用して実施した。「ms」はマウス配列を示し、「h」または「hs」はヒト配列を示す。図１５Ｄは、任意のデコイ受容体活性について６つのＣＣＤ融合タンパク質を評価するための、ＧＬ２６１細胞におけるＭＴＴアッセイを示す。培地および非抱合ＣＣＤのみを対照として使用した。

【図15-2】図１５Ａ～１５Ｃは、ｓＬａｇ３、ＮＯＴＣＨ１、ＨＨＩＰ、ＶＥＧＦＲ１、Ｔｇｆｂｒ２、ＰＤ－１、ＨＡＶＣＲ２、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＳＦＲＰ１およびＥＧＦＲ ＣＣＤ融合タンパク質のいくつかが、精製された融合タンパク質をヒトおよびマウス細胞とインキュベートし、続いて溶解および分離した後に、細胞表面に結合することを示す、ウエスタンブロットを示す。図１５Ａおよび１５ＢのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して実施したが、図１５Ｃでは、マウス神経膠腫２６１（ＧＬ２６１）細胞を使用して実施した。「ms」はマウス配列を示し、「h」または「hs」はヒト配列を示す。図１５Ｄは、任意のデコイ受容体活性について６つのＣＣＤ融合タンパク質を評価するための、ＧＬ２６１細胞におけるＭＴＴアッセイを示す。培地および非抱合ＣＣＤのみを対照として使用した。

【0037】

【図16】図１６は、ヒト異種ペプチドとの様々なＣＣＤ融合タンパク質の、ＭＢ－ＭＤＡ－２３１上皮ヒト乳癌細胞へのｒＡＡＶ６媒介送達の、発現および分泌レベルを示すウエスタンブロットを示す。細胞は、以前の実験よりも遅い、トランスフェクションの７２時間後に回収した。

【0038】

【図17】図１７は、様々なＣＣＤ融合タンパク質デコイ受容体の、ＨＥＫ２９３細胞での発現および分泌レベルを示す、ウエスタンブロットを示す。右端のブロットは、複数の培地変更の、ＥＧＦＲ－ＣＤＤ発現レベルに対する影響を示す。

【0039】

【図18】図１８は、単一ステップのＨｉｓ_６タグ精製を実施後の様々なＣＣＤ融合タンパク質デコイ受容体の、ＨＥＫ２９３細胞での発現および分泌レベルを示す、ＳＤＳ－ＰＡＧＥクーマシー染色を示す。

【0040】

【図19】図１９Ａは、本開示による３つの例示的な融合タンパク質の概略図である。異種ペプチドはＣＣＤのＮ末端に配置されている。図１９Ｂは、公開された明細書に従って実施したＭＴＴアッセイの、期待される結果を示す参考図である。

【0041】

【図20】図２０は、完全培地で９０％コンフルエンスまで培養されたＨＵＶＥＣ細胞の、３６時間のインキュベーション期間後に実施したＭＴＴアッセイ（上のパネル）および管形成アッセイ（下のパネル）の結果を示す。

【0042】

【図21】図２１Ａは、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤの溶液を、固定化された酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦリガンド上に注入した結合分析からの、ＳＰＲセンサーグラムを示す。このセンサーグラムは２つの相から構成される：（左）会合相では、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤとＦＧＦリガンド間の相互作用が増加すると、ＳＰＲシグナルが増加する［応答単位（ＲＵ）で表示］。最大結合は「Align X」時に示される。（右）６００秒後、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤのバイオセンサーへの注入を停止し、系を解離相で緩衝液に戻した。ヌルリガンドであるＶＥＧＦＡを陰性対照として使用した。図２１Ｂは、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤをコードするｒＡＡＶが投与されたＨＵＶＥＣ細胞の、ＭＴＴアッセイの結果を示す。ＧＦＰおよび非抱合ＣＣＤを対照として使用した。

【0043】

【図22】図２２は、多量体融合タンパク質で使用するための最適なＣ１ＱＴＮＦタイプの評価における、２つのＣ１ＱＴＮＦタンパク質（Ｃ１ＱＴＮＦ３（col3）およびＣ１ＱＴＮＦ５（col5））に由来するＣＣＤドメインの、発現および分泌レベルを示すウエスタンブロットを示す。

【0044】

【図23】図２３は、ＣＣＤとグルコセレブロシダーゼおよびＣＣＤとＡβ９ ｓｃＦｖを含有する多量体融合物の、活性アッセイの結果を示す。

【0045】

【図24】図２４は、ＨＳＶ－ＴＫ－ＳＲ３９でトランスフェクトされたＭＣ３８細胞に対する、ガンシクロビル（ＧＣＶ）のＭＴＴアッセイの結果を示す。

【0046】

【図25】図２５は、α－Ａβ５ ｓｃＦｖＣＣＤ多量体融合タンパク質構築物をマウスに投与した後の、環状単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）の血清レベルのプロットを示す。このアッセイは、これらの融合タンパク質の半減期を評価するために設計した。

【0047】

定義
明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形の用語「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかに別を示さない限り、複数形の参照を含む。例えば、「細胞（a cell）」という用語は複数の細胞（それらの混合物を含む）を含む。

【0048】

「改善する」および「処置する」という用語は交換可能に使用され、治療的および予防的処置の両方を含む。両方の用語は、疾患（例えば、本明細書で説明される疾患または障害）の発症または進行を低減、抑制、減弱、減少、阻止、または安定化することを意味する。

【0049】

「投与」または「投与すること」という用語は、本発明の化合物を対象に導入して、それらの意図された機能を実行する経路を含む。使用できる投与経路の例には、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内）、経口、吸入、直腸および経皮が含まれる。医薬製剤は、各投与経路に適した形態で与えることができる。例えば、これらの製剤は、錠剤またはカプセルの形態で、注射、吸入、アイローション、軟膏、坐剤などの注射、注入または吸入により；ローションまたは軟膏により局所的に；および坐剤により直腸に、投与される。経口投与が好ましい。注射は、ボーラスまたは持続注入で行うことができる。投与経路に応じて、本発明の化合物は選択された材料でコーティングまたは処理して、その意図された機能を実行する能力に悪影響を及ぼし得る自然条件から保護することができる。本発明の化合物は、単独で、または上記のような別の剤のいずれか、もしくは薬学的に許容し得る担体、あるいはその両方と組み合わせて、投与することができる。本発明の化合物は、他の剤の投与前に、剤と同時に、または剤の投与後に、投与することができる。さらに、本発明の化合物はまた、in vivoでその活性代謝物またはより活性な代謝物に変換されるプロドラッグ形態でも、投与することができる。

【0050】

「剤」という用語は、小分子化合物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは類似体、または他の生物学的に活性な分子を指す。

【0051】

本明細書で使用する場合、「アミロイド関連疾患または障害」には、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）が含まれる。本開示の例示的な疾患、障害または状態には、限定はされないが、ＡＤ、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）、多発性硬化症（「ＭＳ」）、脳卒中および前頭側頭型認知症が含まれる。

【0052】

本明細書で使用する場合、「異種ペプチド」は、生物学的に活性なペプチドを指す。ある態様において、異種ペプチドは小さな生物活性ペプチドであり、例えば、ＣＣＤドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む単一のｒＡＡＶ核酸セグメントにパッケージ化され得るｃＤＮＡ配列、例えば約４キロベース（ｋＢ）未満の長さのｃＤＮＡ配列によって、コードされるものである。様々な態様において、本開示の異種ペプチドは、３ｋＢ未満、２ｋＢ未満、および／または１ｋＢ未満のｃＤＮＡ配列によってコードされる。異種ペプチドは、細胞内または細胞外（分泌可能）であり得る。例示的な異種ペプチドには、限定はされないが、一本鎖抗体フラグメント、膜貫通受容体の外部ドメイン、デコイ受容体、Notch受容体およびリガンド、ならびに免疫チェックポイントモジュレーターが含まれる。異種ペプチドは、抗体結合ドメインまたはそのフラグメント（例えば、一本鎖抗原結合フラグメント）を含むがこれらに限定されない「結合ドメイン」を含有し得る。

【0053】

「外部ドメイン」は、細胞外空間に延びる膜貫通タンパク質のドメインを指す。

【0054】

「抗体」は、免疫グロブリンの可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、無傷の（例えば、完全長の）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された構成、例えば抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有修飾抗体を含む。抗体には、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は特定のクラスである必要はない。その重鎖定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分類し得る（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成はよく知られている。

【0055】

本明細書で使用する、抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行できることが示されている。かかる抗体の態様はまた、二重特異性（bispecific）、二重特異性（dual specific）、または多重特異性フォーマットであり得、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合する。多重特異性および二重特異性抗体構築物は当技術分野で周知であり、Kontermann (ed.), Bispecific Antibodies, Springer, NY (2011)およびSpiess et al., Mol. Immunol. 67(2):96-106 (2015)に記載および特徴付けされており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

【0056】

抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al.、ＰＣＴ公開WO 90/05144 A1、参照により本明細書に組み込まれる）、これは単一の可変ドメインを含む；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコード化されているが、組換え法を使用し、合成リンカーによって結合することができ、これにより、ＶＬとＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作成することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426：およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。かかる一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図している。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖で発現される二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用しているため、ドメインは別の鎖の相補的なドメインとペアリングされ、２つの抗原結合部位が生成される（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照）。かかる抗体結合部分は当技術分野で知られている（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)）。

【0057】

可変領域は、単鎖Ｆｖ領域をコードするために連結することができる。複数のＦｖ領域を連結して、２つ以上の標的に結合能力を付与するか、キメラの重鎖と軽鎖の組み合わせを使用することができる。抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の生成には、任意の適切な方法を使用することができる。

【0058】

本明細書で使用する「二重特異性」という用語は、２つの異なる抗原結合ドメインを有することを意味し、各ドメインは、異なるリガンドまたはエピトープに対して向けられている。

【0059】

本明細書で使用する場合、「コラーゲン足場ドメイン」という用語は、それ自体で三重構造の形成を可能にするコラーゲン性またはコラーゲン様ドメインであり、ここで「三重構造」は、３つのサブユニットの共有結合または非共有結合複合体である。本明細書で使用する場合、「コラーゲン足場ドメイン」という用語は、足場ドメインの自己三量体化を指示するコラーゲン性またはコラーゲン様ドメインを指す。

【0060】

本明細書で使用する場合、リガンドまたはエピトープに対して「向けられる」または「特異的に結合する」という用語は、当技術分野で十分に理解されている。分子が「特異的結合」を示すとされるのは、代替の標的よりも頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／または特定の標的リガンドもしくはエピトープとのより大きな親和性で反応する場合である。抗体フラグメントまたは異種ペプチドは、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間結合する場合に、標的リガンドまたはエピトープに「特異的に結合する」。例えば、その中のリガンドまたはエピトープに特異的に（または優先的に）結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、他のリガンドまたは他のエピトープよりもこの標的抗原に、より高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間結合するフラグメントである。この定義により、例えば、第１の標的リガンドまたは抗原に特異的に結合する異種ペプチドまたはｓｃＦｖは、第２の標的リガンドまたは抗原に特異的または優先的に結合する場合もあれば、そうでない場合もあることも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（ただし、それを含むことができる）。

【0061】

いくつかの態様において、本明細書に記載の異種ペプチドは、標的リガンドまたはそのエピトープに対して適切な結合親和性を有する。本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、見かけの結合定数またはＫ_Ａを指す。Ｋ_Ａは、解離定数（Ｋ_Ｄ）の逆数である。本明細書に記載の異種ペプチドは、標的抗原、リガンド、または抗原性エピトープに対して、少なくとも１０^－５、１０^－６、１０^－７、１０^－８、１０^－９、１０^－１０Ｍまたはそれより低い結合親和性（Ｋ_Ｄ）を有し得る。特定の例において、本開示の異種ペプチドは、標的リガンドまたはエピトープに対して、少なくとも１０^－６Ｍの結合親和性を有し得る。結合親和性の増加は、Ｋ_Ｄの減少に対応する。異種ペプチドの、第１の抗原に対する第２の抗原より高い親和性結合は、第２の抗原を結合するためのＫ_Ａ（または数値Ｋ_Ｄ）よりも、第１のリガンドまたは抗原を結合するためのより高いＫ_Ａ（またはより小さい数値Ｋ_Ｄ）によって示され得る。かかる場合、異種ペプチドは、第１のリガンドまたは抗原（例えば、第１のタンパク質の第１の立体配座またはその模倣物）に対し、第２のリガンドまたは抗原（例えば、同じ第１のタンパク質の第２の立体配座またはその模倣物；または第２のタンパク質）と比較して、特異性を有する。

【0062】

結合親和性（または結合特異性）は、様々な方法、例えば平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使用）により決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）である。これらの技術は、結合した結合タンパク質の濃度を、標的タンパク質濃度の関数として測定するために使用することができる。結合した結合タンパク質の濃度（［結合］）は、一般に次の式によって、遊離の標的タンパク質（［遊離］）の濃度に関連している。
［結合］＝［遊離］／（Ｋ_Ｄ＋［遊離］）

【0063】

しかしながら、Ｋ_ＡまたはＫ_Ｄを正確に決定することは必ずしも必要ではなく、なぜならば、親和性の定量的測定値を、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を用いて決定して取得すれば十分な場合もあるからであって、該測定値はＫ_ＡまたはＫ_Ｄに比例し、したがって比較に使用することができ、例えば、より高い親和性、例えば２倍高いものが、親和性の定性的測定値を取得するためであるのかどうか、または例えば、機能アッセイにおける、例えばin vitroまたはin vivoアッセイにおける活性により、親和性の推論を取得するためであるのかどうかが決定される。

【0064】

「疾患」とは、細胞、組織、器官または生物の正常な機能を損傷または妨害する、任意の状態または障害を意味する。

【0065】

本明細書で使用する場合、「デコイ受容体」という用語は、細胞内または細胞表面上のリガンドまたは抗原の結合において、ネイティブなシグナル伝達受容体と競合する非シグナル伝達受容体を指す。デコイ受容体は、下流の免疫シグナル伝達を開始することができない。本発明のデコイ受容体には、膜貫通受容体の可溶性外部ドメインが含まれるが、これに限定されない。

【0066】

「エピトープ」という用語は、抗体またはそのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）に特異的に結合することができる、任意のポリペプチドを含む。ある態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面グループ（chemically active surface groupings）を含み、ある態様において、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体またはそのフラグメント（またはｓｃＦｖ）によって結合される抗原の領域である。ある態様において、抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言う。

【0067】

「リガンド」という用語は、受容体またはそのフラグメント（例えば、膜貫通受容体）に特異的に結合することができる、任意のポリペプチドを含む。ある態様において、リガンドは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性なグループを含み、ある態様において、特定の三次元構造特性および／または特定の電荷特性を有し得る。

【0068】

「有効量」という用語は、所望の結果を達成するため、例えば本明細書に記載の疾患または障害を処置するために十分な投薬量および必要な期間における、有効な量を含む。本発明の化合物の有効量は、対象の病状、年齢、および体重、ならびに本発明の化合物の細胞または対象において所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて、変化し得る。投薬量レジメンは、最適な治療反応を提供するように調整することができる。有効量はまた、本発明の化合物の任意の毒性効果または有害な効果（例えば、副作用）よりも、治療的に有益な効果が上回る量である。

【0069】

「と組み合わせて」という用語は、本発明の化合物を、追加の医薬品、例えば破骨細胞関連疾患または障害を処置または予防するために診療所で使用される第２の化合物などと一緒に提供する、すべての形態の投与を指すことを意図し、ここで２つは、同時にまたは任意の順序で連続して投与される。

【0070】

用語「単離された」、「精製された」、「純粋な」または「生物学的に純粋な」とは、そのネイティブなまたは自然の状態、例えば、化合物または材料が天然に存在しているところの生物での状態に見出されるような、通常付随する成分（タンパク質、核酸、炭水化物、および他の細胞物質など）を、実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの、分析化学技術を使用して決定する。ある態様において、本発明の化合物は、少なくとも５０％純粋、６０％純粋、７５％純粋、８０％純粋、８５％純粋、少なくとも９０％純粋、または少なくとも９５％純粋（例えば、重量で）である。ある例において、化合物は、少なくとも９８％純粋、９９％純粋、９９．５％純粋、９９．８％純粋、または９９．９％純粋である。

【0071】

「対象」という用語は、本明細書に記載のような障害に罹患し得るか、さもなければ本発明の化合物の投与から利益を得ることができる、例えばヒトおよび非ヒト動物などの生物を含む。好ましいヒトには、本明細書に記載のように、上記の疾患または障害に罹患している、または罹患しやすいヒト患者が含まれる。開示された処置方法から利益を得る可能性のある哺乳動物種には、限定はされないが以下が含まれる：類人猿；チンパンジー；オランウータン；ヒト；サル；イヌおよびネコなどの飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜；マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの他の動物。「処置が必要であると特定された対象」には、例えば、医学または獣医学の専門家によって、本明細書に記載の疾患、障害または状態に罹患しているか、または罹患しやすいと診断された対象が含まれる。

【0072】

本明細書で使用する「薬学的に許容し得る」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび他の哺乳動物の組織と接触して使用するのに適した成分であって、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等がなく、合理的な利益／リスク比に見合うものを指す。「薬学的に許容し得る塩」とは、レシピエントへの投与時に、本発明の化合物を直接的または間接的に提供することができる、任意の非毒性の塩を意味する。

【0073】

本明細書で使用する「実質的により高い親和性」という用語は、既知の分泌タンパク質に対する親和性と比較して、開示されたポリペプチドに対する親和性の測定可能な増加を意味する。このより高い親和性は、既知の分泌タンパク質、例えばタンパク質のＴＮＦ様ファミリーのメンバーに比べて、本発明のポリペプチドに対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍またはそれ以上である。

【0074】

本明細書で使用する場合、「トール様受容体（ＴＬＲ）」は、外来性病原体および内在性危険関連分子パターン（ＰＡＭＰおよびＤＡＭＰ）を認識する、内在性パターン認識受容体を包含する。ＴＬＲは、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）などの神経変性プロテオパチーで上方制御され、過剰な炎症性シグナル伝達を引き起こし得る。例示的なＴＬＲには、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、およびＴＬＲ５が含まれる。

【0075】

本明細書で使用する「有効量」という用語は、疾患または状態を処置または改善することができるか、さもなければ意図された治療効果を生み出すことができる量を指す。

【0076】

本明細書で使用する場合、「改変された」および「組換え」細胞という用語は、外来性のポリヌクレオチドセグメント（生物学的に活性な分子の転写をもたらすＤＮＡセグメントなど）が導入された細胞を指すことを意図している。したがって、改変された細胞は、組換えによって導入された外来性ＤＮＡセグメントを含有しない、天然に存在する細胞と区別できる。したがって、改変された細胞は、人間の手によって導入された少なくとも１つ以上の異種核酸セグメントを含む細胞である。

【0077】

本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、転写を調節する核酸配列の１つ以上の領域を指す。

【0078】

本明細書で使用する「調節要素」という用語は、転写を調節する核酸配列の１つ以上の領域を指す。例示的な調節要素には、エンハンサー、転写後要素、転写制御配列などが含まれるが、これらに限定されない。

【0079】

本明細書で使用する「作動可能に連結された」という用語は、連結されている核酸配列が通常は隣接しているか、または実質的に隣接しており、必要に応じて、２つのタンパク質コード領域を隣接してリーディングフレーム内に結合することを指す。しかしながら、エンハンサーは一般にプロモーターから数キロベース離れた場合に機能し、イントロン配列は可変長であり得るため、いくつかのポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されているが、隣接はしていない可能性がある。

【0080】

本明細書で使用する場合、「バリアント」という用語は、自然界で生じるものから逸脱する特性を有する分子（例えば、ＣＣＤタンパク質配列）を指し、例えば「バリアント」は、野生型タンパク質と少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。タンパク質分子のバリアント、例えばＣＣＤは、タンパク質をコードする核酸配列に組み込まれた点変異から生じる野生型タンパク質配列と比較して、アミノ酸配列への改変を含有し得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、または１５～２０のアミノ酸置換を有する）。これらの改変には、化学的修飾および切断、例えばタンパク質配列のＮ末端またはＣ末端での切断などが含まれまる。

【0081】

「パーセント（％）同一性」は、２つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアラインメントの同じ位置に同じ残基を有する程度を指す。例えば、「アミノ酸配列は、配列番号ＹとＸ％同一である」とは、配列番号Ｙに対するアミノ酸配列の％同一性を指し、アミノ酸配列中の残基のＸ％が、配列番号Ｙに開示された配列の残基と同一であるとされる。一般に、かかる計算にはコンピュータプログラムが使用される。配列のペアを比較および整列させる例示的なプログラムには、ALIGN（Myers and Miller, 1988）、FASTA（Pearson and Lipman, 1988；Pearson, 1990）およびギャップ付きBLAST（Altschul et al., 1997）、BLASTP、BLASTN、またはGCG（Devereux et al., 1984）が含まれる。

【0082】

典型的には、選択された配列および参照配列は、少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、さらには８５パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５パーセントの配列同一性を有する。さらにより好ましくは、相同性の高い配列は、選択された配列とそれが比較される参照配列との間で、少なくとも約９６、９７、９８、または９９パーセントを超える配列同一性を共有することが多い。配列同一性のパーセンテージは、比較される配列の全長にわたって算出してもよく、または選択された参照配列の合計約２５パーセント程度に満たない小さな欠失または付加を除外することにより算出してもよい。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。

【0083】

高度に相同なフラグメントが望まれる場合、２つの配列間のパーセント同一性の程度は、当業者に周知の１つ以上の配列比較アルゴリズムにより容易に決定されるように、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは約９０％または９５％以上であり、該比較アルゴリズムとしては例えば、Pearson and Lipman（1988）によって記述されたFASTAプログラム分析およびBrutlag et al.（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）のアルゴリズムに基づくblastnコンピュータプログラムなどである。クエリ配列（例えば、本開示の配列）と、グローバル配列アラインメントとも呼ばれる主題配列との間の最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、FASTAまたはblastnを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列と主題配列は両方ともヌクレオチド配列、または両方ともアミノ酸配列である。上記のグローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性として表される。FASTAアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは、次のとおりである：マトリックス＝PAM 0、k-tuple＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象のアミノ酸配列の長さのいずれか短い方。ヌクレオチドが一致する／整列されているかどうかは、FASTA配列アラインメントの結果によって決まる。このパーセンテージを次に、特定されたパラメータを用いて上記のFASTAプログラムで算出したパーセント同一性から差し引き、最終的なパーセント同一性スコアを得る。この最終的なパーセント同一性スコアは、本開示の目的のために使用されるものである。

【0084】

発明の詳細な説明
本開示の側面は、目的のペプチドの、細胞への改善された送達のため、特に、目的のペプチドをコードする導入遺伝子の、組換えＡＡＶ技術を使用した送達のための新規な足場に関する。本明細書に記載の新規なＣ１ｑＴＮＦコラーゲンドメイン（ＣＣＤ）足場は、目的のペプチドの増強された発現、分泌、および安定性の向上を提供する。

【0085】

いくつかの態様において、ＣＣＤおよび１つ以上の目的の異種ペプチドを含む融合タンパク質が提供される。例示的な態様において、これらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。さらなる態様において、開示されたポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクター（または核酸セグメント）に挿入され、これはその後、ｒＡＡＶ粒子にパッケージ化され得る。例示的な態様において、かかるｒＡＡＶ粒子は、細胞、組織もしくは器官への、または疾患、障害もしくは状態に罹患している、診断されている、もしくはそのリスクのある対象への投与に適している。

【0086】

本開示は、単量体融合タンパク質で使用される改変されたＣＣＤ足場が、in vitroおよびin vivoで互いに共局在および会合して多量体融合タンパク質を形成する、との観察に部分的に基づいている。これらの多量体融合タンパク質は、二量体、三量体、四量体、六量体または八量体であり得る。例示的な態様において、開示された多量体融合タンパク質は六量体である。融合タンパク質単量体をコードするポリヌクレオチドのｒＡＡＶ媒介送達後の細胞における、コラーゲンドメインの自然な会合により、in vivoで多量体の十分な形成を達成するためには、単一の融合タンパク質単量体のみをｒＡＡＶ核酸ベクターにコードする必要があることが発見された。したがって、本開示は、本明細書に記載の単量体融合タンパク質をコードする、ｒＡＡＶ核酸ベクターを提供する。

【0087】

ある態様において、開示された方法および組成物による処置の対象となる疾患、障害または状態は、細胞内ペプチドの活性、局在化または結合挙動に関係する。本開示は、かかる疾患を処置するように設計された融合タンパク質、および融合タンパク質を送達するためのｒＡＡＶ粒子を提供する。したがってこれらの融合タンパク質は、細胞内異種ペプチドを含み得る。例示的な細胞内異種ペプチドには、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ１）、可溶性トール様受容体（ｓＴＬＲ）、様々なｓｃＦｖおよび誘導性Ｔ細胞共刺激分子（Ｉｃｏｓ）受容体が含まれる。

【0088】

ある態様において、開示された方法および組成物による処置の対象となる疾患、障害または状態は、細胞外、細胞表面または間質ペプチドの活性または結合挙動に関係する。本開示は、かかる疾患を処置するように設計された融合タンパク質、および融合タンパク質を送達するためのｒＡＡＶ粒子を提供する。生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たす分泌ペプチドの例には、サイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質（接着分子）、プロテアーゼ、ならびに成長および分化因子が含まれる。したがってこれらの融合タンパク質は、分泌可能な異種ペプチドを含み得る。本開示のｒＡＡＶ粒子および組成物は、これらのペプチドの増強された分泌を提供し得る。例示的な分泌可能異種ペプチドには、様々なＴＬＲの可溶性外部ドメイン、リンパ球活性化遺伝子３（Ｌａｇ３）および成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ）が含まれる。

【0089】

いくつかの態様において、ヒトＣ１ｑＴＮＦ３からのＣＣＤが、開示された融合タンパク質のＣＣＤ足場として使用される。Ｃ１ｑＴＮＦファミリーメンバーの中で、Ｃ１ｑＴＮＦ３タンパク質は、ヒトの脳における内在性発現レベルが低いために、例示的な前駆体として選択された。さらに、Ｃ１ｑＴＮＦ３からの遺伝子改変コラーゲンドメインは、可溶性リンパ球活性化遺伝子３（ｓＬａｇ３）異種ペプチドに抱合されている間に多量体化を媒介する該ドメインの能力を評価するアッセイにおいて、Ｃ１ｑＴＮＦ５からの対応するドメインよりも優れていた（図２２を参照）。

【0090】

特定の態様において、ヒトＣ１ｑＴＮＦ３からのネイティブＣＣＤのバリアントが足場として使用される。Ｃ１ｑＴＮＦ３のネイティブＣＣＤの長さは、６５アミノ酸である。いくつかの態様において、ＣＣＤバリアントは、切断型バリアントである。例示的な切断型ＣＣＤの長さは、約６５アミノ酸、８０アミノ酸、１００アミノ酸、１１５アミノ酸、１２０アミノ酸、１２５アミノ酸、１３０アミノ酸、１５０アミノ酸、１７５アミノ酸、２００アミノ酸、または２００より多くのアミノ酸長であり得る。

【0091】

ＣＣＤバリアントはさらに、改変されたアミノ酸配列を含み得る。開示されたＣＣＤドメインは、野生型ＣＣＤドメインと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、または１５～２０のアミノ酸が異なり得る。野生型配列と比較したこれらの違いは、ドメインのＮ末端および／またはＣ末端での切断を包含し得る。例示的なＣＣＤは最適化された配列であり得、すなわちそれらは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ反復配列を破壊することなくin vitroまたはin vivoで最適な発現または活性を提供するアミノ酸置換を含む。例示的なＣＣＤは、配列番号１（下記）の１２５アミノ酸最適化ＣＣＤ配列である：GYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIP。

【0092】

いくつかの態様において、ＣＣＤドメインは、アミノ酸配列の配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。配列番号１のＣＣＤは、Ｃ１ｑＴＮＦ３タンパク質の６０アミノ酸改変Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ反復配列の二量体を含む。この６０アミノ酸は、コンセンサス配列：
GYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIP（配列番号１０）を含む。いくつかの態様において、ＣＣＤは、アミノ酸配列の配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質は、配列番号１０の単量体または二量体内以外のアミノ酸配列の領域における変異に対して、より耐性であり得る。

【0093】

いくつかの態様において、ＣＣＤは、ヒトＣ１ｑＴＮＦファミリーメンバーのいずれかに由来する。いくつかの態様において、ＣＣＤは、ヒトＣ１ｑＴＮＦ５、ヒトＣ１ｑＴＮＦ１またはヒトＣ１ｑＴＮＦ２、またはそれらのバリアントに由来する。特定の態様において、ＣＣＤは、配列番号２～４のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0094】

Ｃ１ｑＴＮＦ１
GEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGERGEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGERGEKGDRGDRGLQGKYGKTGSAGARGHTGPKGQKGSMGAPGER（配列番号２）

【0095】

Ｃ１ｑＴＮＦ２
GPQGPPGPPGAPGPSGMMGRMGFPGKDGQDGHDGDRGDSGEEGPPGRTGNRGKPGPKGKAGAIGRAGPRGPKGVNGTPGKHGTPGKKGPKGKKGEPGLPGPC（配列番号３）。

【0096】

約１１０～１７５アミノ酸の長さが単一のＣＣＤ単量体に最適であることが、親和性タグを含む開示された融合タンパク質により、決定された。したがって、６５アミノ酸以下の長さを有するＣ１ｑＴＮＦファミリーコラーゲンドメイン（例えば、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ反復ドメイン）に由来するＣＣＤを、長さが１２０～１２５アミノ酸の配列を生成するための関連するコラーゲンドメインの２つまたは３つのコピーのオリゴマー化により、構築した。これは、Ｃ１ｑＴＮＦ１、Ｃ１ｑＴＮＦ３、Ｃ１ｑＴＮＦ５、Ｃ１ｑＴＮＦ６、およびＣ１ｑＴＮＦ８に由来するＣＣＤの場合であった。

【0097】

他の態様において、ＣＣＤは、ヒトＣ１ｑＴＮＦ５、ヒトＣ１ｑＴＮＦ６、ヒトＣ１ｑＴＮＦ７、ヒトＣ１ｑＴＮＦ８、ヒトＣ１ｑＴＮＦ９、ヒトＣ１ｑＴＮＦ９Ｂ、またはそれらのバリアントに由来する。特定の態様において、ＣＣＤは、配列番号４～９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0098】

Ｃ１ｑＴＮＦ５
GHPGLPGTPGHHGSQGLPGRDGRDGRDGAPGAPGEKGEGGRPGLPGPRGDPGPRGEAGPAGPTGPAGECGHPGLPGTPGHHGSQGLPGRDGRDGRDGAPGAPGEKGEGGRPGLPGPRGDPGPRGEAGPAGPTGPAGEC（配列番号４）

【0099】

Ｃ１ｑＴＮＦ６
GDKGDPGPMGLPGYMGREGPQGEPGPQGSKGDKGEMGSPGAPGDKGDPGPMGLPGYMGREGPQGEPGPQGSKGDKGEMGSPGAPGDKGDPGPMGLPGYMGREGPQGEPGPQGSKGDKGEMGSPGAP（配列番号５）

【0100】

Ｃ１ｑＴＮＦ７
GLPGPPGPPGANGSPGPHGRIGLPGRDGRDGRKGEKGEKGTAGLRGKTGPLGLAGEKGDQGETGKKGPIGPEGEKGEVGPIGPPGPKGDRGEQGDPGLPGVCRCGSI（配列番号６）

【0101】

Ｃ１ｑＴＮＦ８
GEKGEAGVRGRAGRSGKEGPPGARGLQGRRGQKGQVGPPGAAGEKGEAGVRGRAGRSGKEGPPGARGLQGRRGQKGQVGPPGAAGEKGEAGVRGRAGRSGKEGPPGARGLQGRRGQKGQVGPPGAA（配列番号７）

【0102】

Ｃ１ｑＴＮＦ９
GHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGRPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGDQGSRGSPGKHGPKGLAGPMGEKGLRGETGPQGQKGNKGDVGPTGPEGPRGNIGPLGPTGLPGPMGPIGKPGPKGEAGPTGPQGEPGVRGIRGWKGDRGEKGKIGET（配列番号８）

【0103】

Ｃ１ｑＴＮＦ９Ｂ
GHPGIPGNPGHNGLPGRDGRDGAKGDKGDAGEPGCPGSPGKDGTSGEKGERGADGKVEAKGIKGDQGSRGSPGKHGPKGLAGPMGEKGLRGETGPQGQKGNKGDVGPTGPEGPRGNIGPLGPTGLPGPMGPIGKPGPKGEAGPTGPQGEPGVRGIRGWKGDRGEKGKIGET（配列番号９）

【0104】

本明細書に記載の融合タンパク質の第１および／または第２の異種ペプチドは、任意の小ペプチドであってよい。第１および／または第２の異種ペプチドは、マウス（Mus musculus）またはヒトのペプチドを含み得る。第１および／または第２の異種ペプチドは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、免疫チェックポイントモジュレーター、可溶性リンパ球活性化遺伝子（ｓＬａｇ）、成長因子受容体、またはその外部ドメインもしくはバリアントを含み得る。

【0105】

融合タンパク質の異種ペプチドは、免疫チェックポイント活性化ペプチド、免疫チェックポイント不活性化ペプチド、ＩＩ型膜貫通タンパク質、受容体阻害タンパク質（ＲＩＰ）キナーゼ阻害剤、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、または可溶性ペプチド、例えば膜貫通ドメインなしの可溶性ペプチドを含み得る。

【0106】

いくつかの態様において、第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つは、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（Ｉｃｏｓ）、Notchホモログ１（ＮＯＴＣＨ１）、血管内皮細胞増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）、または線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）、またはその外部ドメインもしくはバリアントからなる群から選択される。いくつかの態様において、第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫ、ＨＳＶ－ＴＫ ＳＲ３９変異体、またはそのバリアントからなる群から選択される。

【0107】

他の態様において、第１または第２の異種ペプチドの少なくとも１つは、以下からなる群から選択される：Notchホモログ４（ＮＯＴＣＨ４）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）、デルタ様３（ＤＬＬ３）、Jagged1（ＪＡＧ１）、分化抗原群２７６（Ｂ７Ｈ３）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、形質転換成長因子ベータ受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）、形質転換成長因子、ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦＢＲ２）、ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ＨＨＩＰ）、分泌型frizzled関連タンパク質１（ＳＦＲＰ１）、分泌型frizzled関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）、Dickkopf関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、スクレロスチンドメイン含有タンパク質１（ＳＯＳＴＤＣ１）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、メタロプロテイナーゼ阻害剤３（ＴＩＭＰ３）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）、ＶＥＧＦＲ１ドメイン２、ＶＥＧＦＲ２ドメイン３、および可溶性トール様受容体（ｓＴＬＲ、例えばｓＴＬＲ５）、またはその外部ドメインもしくはバリアント。本明細書に開示の目的の異種ペプチドを含有する例示的な融合タンパク質を示す概略図を、図９、１０および１９Ａに示す。

【0108】

ある態様において、融合タンパク質は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を介して細胞表面に固定されたタンパク質であるメロゾイト表面タンパク質（「ＭＳＰ」）に対応するドメインを含む。ＭＳＰは、マラリア原虫Plasmodium falciparumに由来する。いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＭＳＰおよびＣＣＤの両方を含む。他の態様において、融合タンパク質はＭＳＰを含有し、ＣＣＤを含有しない。

【0109】

特定の態様において、開示された融合タンパク質は、次のアミノ酸配列を含むＭＳＰ配列を含む：ＤＧＩＦＣＳＳＳＮＦＬＧＩＳＦＬＬＩＬＭＬＩＬＹＳＦＩ（配列番号４９）。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号４９の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある態様において、融合タンパク質は、ＭＳＰ配列をＣ末端に含む。他の態様において、ＭＳＰ配列は、Ｎ末端に配置され得る。

【0110】

様々な態様において、異種ペプチドは、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）であり、これは、１つの可変領域（例えば、ＶＨ）のみを含み得るか、またはＶＨおよびＶＬの両方を含み得る。特定の態様において、第１の異種ペプチドは、タウタンパク質（α－タウ）に対して親和性を有するｓｃＦｖ、またはアミロイドβペプチド（α－Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む。他の態様において、異種ペプチドは、ＶＥＧＦＲ－２に親和性を有するＢ１１ ｓｃＦｖを含む。Boldicke et al., Stem Cells. 2001, 19(1):24-36を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0111】

いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、ｉ）ＣＣＤ、ｉｉ）異種ペプチド、およびｉｉｉ）１つ以上の親和性タグ、例えばＦＬＡＧタグまたはポリヒスチジン（Ｈｉｓ_６）タグなどを含む。特定の態様において、融合タンパク質は、１つまたは２つのＨｉｓ_６タグを含む。特定の態様において、融合タンパク質は、Ｈｉｓ_６タグをタンパク質のＣ末端に含む。特定の態様において、融合タンパク質は、異種タンパク質のＣ末端に配置されたＨｉｓ_６タグを含む。

【0112】

他の態様において、融合タンパク質は、１つまたは２つのＦＬＡＧタグを含む。特定の態様において、融合タンパク質は、異種タンパク質のＣ末端に配置されたＦＬＡＧタグを含む。特定の態様において、融合タンパク質は、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１２）を含むＦＬＡＧタグ配列を有する。

【0113】

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、ＣＣＤのＣ末端にＦＬＡＧ親和性タグを有するＣＣＤを含む。したがって特定の態様において、融合タンパク質は、次の配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有するＣＣＤを含む（ＦＬＡＧタグは下線付きイタリック体で示す）：

【表1】

【0114】

いくつかの態様において、本開示の融合タンパク質は、ＣＣＤのＣ末端にＦＬＡＧ親和性タグを有するＣＣＤを含む。ある態様において、これらの融合タンパク質はさらに、ポリ（Ａ）テール配列を含む。したがって特定の態様において、融合タンパク質は、以下の配列番号１０９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有するＣＣＤを含む（ＦＬＡＧタグは下線付きイタリック体で示し、ポリ（Ａ）テールおよびＨｉｓ_６タグは太字の下線で示す）：

【表2】

【0115】

ある態様において、融合タンパク質はさらに、分泌シグナル配列を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質（例えば、融合タンパク質の異種ペプチド）は、２つ以上のリガンドに対して二重特異性を有する。

【0116】

免疫チェックポイントモジュレーターを含む異種タンパク質を含む例示的な融合タンパク質が、本明細書に記載されている。融合タンパク質名に別段の記載がない限り、ＣＣＤはタンパク質のＣ末端に配置されている。融合タンパク質名に「-MSP」が含まれている場合、融合タンパク質はＣＣＤを含有しないが、タンパク質のＣ末端に位置するＭＳＰ配列を含有する。

【0117】

様々な態様において、開示された融合タンパク質は、次のアミノ酸配列（配列番号１３～１０２および１０５～１０８）のいずれかと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。開示された融合タンパク質のいずれかは、以下のアミノ酸配列のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、１５～２０、２０～３０、３０～５０、または５０より多くのアミノ酸が異なり得る。これらの違いは、配列番号１３～６４または１０５～１０８のいずれかの配列に対して挿入、欠失、または置換されたアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号１３～６４または１０５～１０８のいずれかの配列と共通する、約１０、約２０、約２５、約４０、５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約１８０のアミノ酸のストレッチを含有する。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号１３～６４または１０５～１０８のいずれかに対して５’または３’末端に切断を含む。

【0118】

様々な態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号１０のコンセンサスアミノ酸配列または配列番号１として示されるこのコンセンサス配列の二量体以外の領域の次のアミノ酸配列（配列番号１３～１０２および１０５～１０８）のいずれかと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号１３～１０２および１０５～１０８のいずれかの配列と共通する約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、または約３７５のアミノ酸のストレッチを含む。いくつかの態様において、これらのストレッチは共通して、配列番号１０のコンセンサスアミノ酸配列または配列番号１として示されるこのコンセンサス配列の二量体を含む。

【0119】

多くの次の配列（配列番号１３～１０２および１０５～１０８）は、Ｃ末端におけるポリ（Ａ）テールおよびポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、または他のタグと共に示されている。しかしながら、当業者によって容易に視覚化され得るように、いくつかの態様において、開示された例示的な融合タンパク質は、これらのタグのいずれも含有しない。いくつかの態様において、配列番号１３～１０２および１０５～１０８に示されるタンパク質のいずれかは、ポリヒスチジンタグまたはＦＬＡＧタグ以外のタグを含む。いくつかの態様において、配列番号１３～１０２および１０５～１０８のタンパク質のいずれかのポリヒスチジンタグまたはＦＬＡＧタグは、代替のタグ、例えばｍｙｃタグ、Strepタグ、Ｅタグ、血球凝集素タグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、ＨＳＶ、ＶＳＶ－Ｇ、抗Xpress、およびＶＳタグなどで置換されている。
（「ｍｓ」はマウス配列を示し、「ｈｓ」はヒト配列を示す）：

【0120】

ＣＣＤ－分化抗原群４０リガンド（ｍｓＣｄ４０Ｌ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISVNLHEDFVFIKKLKRCNKGEGSLSLLNCEEMRRQFEDLVKDITLNKEEKKENSFEMQRGDEDPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLAAAHHHHHHV（配列番号１３）

【0121】

ＣＣＤ－分化抗原群７０（ｍｓＣＤ７０）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISHPEPHTAELQLNLTVPRKDPTLRWGAGPALGRSFTHGPELEEGHLRIHQDGLYRLHIQVTLANCSSPGSTLQHRATLAVGICSPAAHGISLLRGRFGQDCTVALQRLTYLVHGDVLCTNLTLPLLPSRNADETFFGVQWICPAAAHHHHHHV（配列番号１４）

【0122】

ＣＣＤ－ｍｓＣＤ７０
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISHPEPHTAELQLNLTVPRKDPTLRWGAGPALGRSFTHGPELEEGHLRIHQDGLYRLHIQVTLANCSSPGSTLQHRATLAVGICSPAAHGISLLRGRFGQDCTVALQRLTYLVHGDVLCTNLTLPLLPSRNADETFFGVQWICPAAAHHHHHHV（配列番号１５）

【0123】

ＣＣＤ－ＣＤ１３７リガンド（ｍｓＣＤ１３７Ｌ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGCPNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLCNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVQGWVSLVLQAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEAAAHHHHHHV（配列番号１６）

【0124】

ＣＣＤ－ヘルペスウイルスエントリーメディエーターリガンド（ｍｓＨｖｅｍｌ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISHLPDGGKGSWEKLIQDQRSHQANPAAHLTGANASLIGIGGPLLWETRLGLAFLRGLTYHDGALVTMEPGYYYVYSKVQLSGVGCPQGLANGLPITHGLYKRTSRYPKELELLVSRRSPCGRANSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVPGNRLVRPRDGTRSYFGAFMVAAAHHHHHHV（配列番号１７）

【0125】

ＣＣＤ－ｍｓＯｘ４０Ｌ、またはｍｓＣＤ２５２
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISIQRLRGAVTRCEDGQLFISSYKNEYQTMEVQNNSVVIKCDGLYIIYLKGSFFQEVKIDLHFREDHNPISIPMLNDGRRIVFTVVASLAFKDKVYLTVNAPDTLCEHLQINDGELIVVQLTPGYCAPEGSYHSTVNQVPLAAAHHHHHHV（配列番号１８）

【0126】

分化抗原群２７６（ｍｓＢ７Ｈ３、またはＣＤ２７６）
MLRGWGGPSVGVCVRTALGVLCLCLTGAVEVQVSEDPVVALVDTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYSNRTALFPDLLVQGNASLRLQRVRVTDEGSYTCFVSIQDFDSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGNMVTITCSSYQGYPEAEVFWKDGQGVPLTGNVTTSQMANERGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号１９）

【0127】

Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１（ｍｓＢ７ｈ４、またはＶＴＣＮ１）
MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２０）

【0128】

ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ｍｓＢＴＬＡ）
MKTVPAMLGTPRLFREFFILHLGLWSILCEKATKRNDEECPVQLTITRNSKQSARTGELFKIQCPVKYCVHRPNVTWCKHNGTICVPLEVSPQLYTSWEENQSVPVFVLHFKPIHLSDNGSYSCSTNFNSQVINSHSVTIHVTERTQNSSEHPLITVSDIPDATNASGPSTMEELKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２１）

【0129】

ｍｓＣＤ２７
MAWPPPYWLCMLGTLVGLSATLAPNSCPDKHYWTGGGLCCRMCEPGTFFVKDCEQDRTAAQCDPCIPGTSFSPDYHTRPHCESCRHCNSGFLIRNCTVTANAECSCSKNWQCRDQECTECDPPLNPALTRQPSETPSPQPPPTHLPHGTEKPSWPLHRQLPNSTVYSQRSSHRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２２）

【0130】

ｍｓＣＤ２８
MTLRLLFLALNFFSVQVTENKILVKQSPLLVVDSNEVSLSCRYSYNLLAKEFRASLYKGVNSDVEVCVGNGNFTYQPQFRSNAEFNCDGDFDNETVTFRLWNLHVNHTDIYFCKIEFMYPPPYLDNERSNGTIIHIKEKHLLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２３）

【0131】

ｍｓＣＤ４０
MVSLPRLCALWGCLLTAVHLGQCVTCSDKQYLHDGQCCDLCQPGSRLTSHCTALEKTQCHPCDSGEFSAQWNREIRCHQHRHCEPNQGLRVKKEGTAESDTVCTCKEGQHCTSKDCEACAQHTPCIPGFGVMEMATETTDTVCHPCPVGFFSNQSSLFEKCYPWTSCEDKNLEVLQKGTSQTNVLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２４）

【0132】

ｍｓＣＤ８０
MACNCQLMQDTPLLKFPCPRLILLFVLLIRLSQVSSDVDEQLSKSVKDKVLLPCRYNSPHEDESEDRIYWQKHDKVVLSVIAGKLKVWPEYKNRTLYDNTTYSLIILGLVLSDRGTYSCVVQKKERGTYEVKHLALVKLSIKADFSTPNITESGNPSADTKRITCFASGGFPKPRFSWLENGRELPGINTTISQDPESELYTISSQLDFNTTRNHTIKCLIKYGDAHVSEDFTWEKPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２５）

【0133】

ｍｓＣＤ８６
MDPRCTMGLAILIFVTVLLISDAVSVETQAYFNGTAYLPCPFTKAQNISLSELVVFWQDQQKLVLYEHYLGTEKLDSVNAKYLGRTSFDRNNWTLRLHNVQIKDMGSYDCFIQKKPPTGSIILQQTLTELSVIANFSEPEIKLDQNVTGNSGINLTCMSKQGHPKPKKMYFLITNSTNEYGDNMQISQDNVTELFSISNSLSLSFPDGVWHMTVVCVLETESMKISSKPLNFTQELKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２６）

【0134】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ｍｓＣｄ１３７またはＴＮＦＲＳＦ９）
MGNNCYNVVVIVLLLVGCEKVGAVQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２７）

【0135】

細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ｍｓＣｔｌａ４）
MACLGLRRYKAQLQLPSRTWPFVALLTLLFIPVFSEAIQVTQPSVVLASSHGVASFPCEYSPSHNTDEVRVTVLRQTNDQMTEVCATTFTEKNTVGFLDYPFCSGTFNESRVNLTIQGLRAVDTGLYLCKVELMYPPPYFVGMGNGTQIYVILKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２８）

【0136】

Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ｍｓＨａｖｃｒ２）
MFSGLTLNCVLLLLQLLLARSLEDGYKVEVGKNAYLPCSYTLPTSGTLVPMCWGKGFCPWSQCTNELLRTDERNVTYQKSSRYQLKGDLNKGDVSLIIKNVTLDDHGTYCCRIQFPGLMNDKKLELKLDIKAAKVTPAQTAHGDSTTASPRTLTTERNGSETQTLVTLHNNNGTKISTWADEIKLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号２９）

【0137】

ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ｍｓＨｖｅｍ）
MEPLPGWGSAPWSQAPTDNTFRLVPCVFLLNLLQRISAQPSCRQEEFLVGDECCPMCNPGYHVKQVCSEHTGTVCAPCPPQTYTAHANGLSKCLPCGVCDPDMGLLTWQECSSWKDTVCRCIPGYFCENQDGSHCSTCLQHTTCPPGQRVEKRGTHDQDTVCADCLTGTFSLGGTQEECLPWTNCSAFQQEVRRGTNLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３０）

【0138】

誘導性Ｔセル共刺激物質（ｍｓＩｃｏｓ）
MKPYFCRVFVFCFLIRLLTGEINGSADHRMFSFHNGGVQISCKYPETVQQLKMRLFREREVLCELTKTKGSGNAVSIKNPMLCLYHLSNNSVSFFLNNPDSSQGSYYFCSLSIFDPPPFQERNLSGGYLHIYESQLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３１）

【0139】

誘導性Ｔ細胞共刺激物質リガンド（ｍｓＩｃｏｓＬ）
MQLKCPCFVSLGTRQPVWKKLHVSSGFFSGLGLFLLLLSSLCAASAETEVGAMVGSNVVLSCIDPHRRHFNLSGLYVYWQIENPEVSVTYYLPYKSPGINVDSSYKNRGHLSLDSMKQGNFSLYLKNVTPQDTQEFTCRVFMNTATELVKILEEVVRLRVAANFSTPVISTSDSSNPGQERTYTCMSKNGYPEPNLYWINTTDNSLIDTALQNNTVYLNKLGLYDVISTLRLPWTSRGDVLCCVENVALHQNITSISQAESFTGNNTKLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３２）

【0140】

リンパ球活性化遺伝子３（ｍｓＬａｇ３）
MREDLLLGFLLLGLLWEAPVVSDYKDDDDKSGPGKELPVVWAQEGAPVHLPCSLKSPNLDPNFLRRGGVIWQHQPDSGQPTPIPALDLHQGMPSPRQPAPGRYTVLSVAPGGLRSGRQPLHPHVQLEERGLQRGDFSLWLRPALRTDAGEYHATVRLPNRALSCSLRLRVGQASMIASPSGVLKLSDWVLLNCSFSRPDRPVSVHWFQGQNRVPVYNSPRHFLAETFLLLPQVSPLDSGTWGCVLTYRDGFNVSITYNLKVLGLEPVAPLTVYAAEGSRVELPCHLPPGVGTPSLLIAKWTPPGGGPELPVAGKSGNFTLHLEAVGLAQAGTYTCSIHLQGQQLNATVTLAVITVTPKSFGLPGSRGKLLCEVTPASGKERFVWRPLNNLSRSCPGPVLEIQEARLLAERWQCQLYEGQRLLGATVYAAESSSGAHSARRILKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３３）

【0141】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４（ｍｓＯｘ４０、またはＴＮＦＲＳＦ４）
MYVWVQQPTALLLLGLTLGVTARRLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCETGFYNEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVDCVPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRSLLATLLWETQRPTFRPTTVQSTTVWPRTSELPSPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３４）

【0142】

プログラム細胞死タンパク質１（ｍｓＰＤ１）
MWVRQVPWSFTWAVLQLSWQSGWLLEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３５）

【0143】

プログラム細胞死リガンド１（ｍｓＰＤ－Ｌ１）
MRIFAGIIFTACCHLLRAFTITAPKDLYVVEYGSNVTMECRFPVERELDLLALVVYWEKEDEQVIQFVAGEEDLKPQHSNFRGRASLPKDQLLKGNAALQITDVKLQDAGVYCCIISYGGADYKRITLKVNAPYRKINQRISVDPATSEHELICQAEGYPEAEVIWTNSDHQPVSGKRSVTTSRTEGMLLNVTSSLRVNATANDVFYCTFWRSQPGQNHTAELIIPELPALKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３６）

【0144】

プログラム細胞死リガンド２（ｍｓＰＤ－Ｌ２）
MLLLLPILNLSLQLHPVAALFTVTAPKEVYTVDVGSSVSLECDFDRRECTELEGIRASLQKVENDTSLQSERATLLEEQLPLGKALFHIPSVQVRDSGQYRCLVICGAAWDYKYLTVKVKASYMRIDTRILEVPGTGEVQLTCQARGYPLAEVSWQNVSVPANTSHIRTPEGLYQVTSVLRLKPQPSRNFSCMFWNAHMKELTSAIIDPLSRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３７）

【0145】

ガレクチン９（ｈＬＧＡＬＳ９）
MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERKTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTISVNGSVQLSYISFQPPGVWPANPAPITQTVIHTVQSAPGQMFSTPAIPPMMYPHPAYPMPFITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQTLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号３８）

【0146】

ＣＣＤ－分化抗原群４０リガンド（ｈｓＣＤ４０Ｌ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLAAAHHHHHHV（配列番号３９）

【0147】

ＣＣＤ－ｈｓＣＤ７０
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRPLAAAHHHHHHV（配列番号４０）

【0148】

ＣＣＤ－ｈｓＣＤ１３７Ｌ
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISRASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEAAAHHHHHHV（配列番号４１）

【0149】

ＣＣＤ－腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー４リガンド（ｈｓＯｘ４０Ｌ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLAAAHHHHHHV（配列番号４２）

【0150】

ＣＤ２７６（ｈｓＢ７Ｈ３、または分化抗原群２７６）
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４３）

【0151】

Ｖセットドメイン含有Ｔ細胞活性化阻害剤１（ｈｓＢ７Ｈ４、またはＶＴＣＮ１）
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４４）

【0152】

ｈｓＢＴＬＡ
MKTLPAMLGTGKLFWVFFLIPYLDIWNIHGKESCDVQLYIKRQSEHSILAGDPFELECPVKYCANRPHVTWCKLNGTTCVKLEDRQTSWKEEKNISFFILHFEPVLPNDNGSYRCSANFQSNLIESHSTTLYVTDVKSASERPSKDEMLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４５）

【0153】

ｈｓＣＤ２７
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４６）

【0154】

ｈｓＣＤ２８
MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４７）

【0155】

ｈｓＣＤ４０
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号４８）

【0156】

ｈｓＣＤ８０
MGHTRRQGTSPSKCPYLNFFQLLVLAGLSHFCSGVIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５０）

【0157】

ｈｓＣＤ８６
MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGIMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５１）

【0158】

ｈｓＣＤ１３７
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５２）

【0159】

ｈｓＣＴＬＡ４
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５３）

【0160】

ｈｓＨＡＶＣＲ２
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTLQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５４）

【0161】

ｈｓＨＶＥＭ
MEPPGDWGPPPWRSTPRTDVLRLVLYLTFLGAPCYAPALPSCKEDEYPVGSECCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPCPPGTYIAHLNGLSKCLQCQMCDPAMGLRASRNCSRTENAVCGCSPGHFCIVQDGDHCAACRAYATSSPGQRVQKGGTESQDTLCQNCPPGTFSPNGTLEECQHQTKCSWLVTKAGLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５５）

【0162】

ｈｓＩｃｏｓ
MRLGSPGLLFLLFSSLRADTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５６）

【0163】

ｈｓＬａｇ３
MWEAQFLGLLFLQPLWVAPVKPLQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRALKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５７）

【0164】

ｈｓＯｘ４０
MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５８）

【0165】

ｈｓＰＤ１
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号５９）

【0166】

ｈｓＰＤ－Ｌ１
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６０）

【0167】

ｈｓＰＤ－Ｌ２
MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６１）

【0168】

ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ｈｓＴＩＧＩＴ）
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASGMMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVALKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６２）

【0169】

抗ＣＤ３ｅ単鎖フラグメント、メロゾイト表面タンパク質（ｓｃＦｖ－ＭＳＰ）（マウス）
MNSGLQLVFFVLTLKGIQGEGSHHHHHHVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKRDIGGGGSGGGGSDYKDDDDKDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号６３）

【0170】

抗ＣＤ３ｅ ｓｃＦｖ－ＭＳＰ（ヒト）
MERHWIFLLLLSVTAGVHSQVGSHHHHHHSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRLKEFGGGGSGGGGSDYKDDDDKDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号６４）

【0171】

ＨＳＶ－ＴＫ－ＣＣＤ
WTMASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEANLKEFGGGGSGGGGSGGGGSMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKGGGGSGGGGSGGGGSLQISTRAAAHHHHHHV（配列番号１０５）

【0172】

ＨＳＶ－ＴＫ ＳＲ３９－ＣＣＤ
MASYPCHQHASAFDQAARSRGHSNRRTALRPRRQQEATEVRLEQKMPTLLRVYIDGPHGMGKTTTTQLLVALGSRDDIVYVPEPMTYWQVLGASETIANIYTTQHRLDQGEISAGDAAVVMTSAQITMGMPYAVTDAVLAPHIGGEAGSSHAPPPALTIFLDRHPIAFMLCYPAARYLMGSMTPQAVLAFVALIPPTLPGTNIVLGALPEDRHIDRLAKRQRPGERLDLAMLAAIRRVYGLLANTVRYLQGGGSWREDWGQLSGTAVPPQGAEPQSNAGPRPHIGDTLFTLFRAPELLAPNGDLYNVFAWALDVLAKRLRPMHVFILDYDQSPAGCRDALLQLTSGMVQTHVTTPGSIPTICDLARTFAREMGEANLKEFGGGGSGGGGSGGGGSMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKGGGGSGGGGSGGGGSLQISTRAAAHHHHHHV（配列番号１０６）

【0173】

ｈＧＢＡ－ＣＣＤ
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号１０７）

【0174】

ｈＧＢＡ－ＣＣＤ－Ａβ９ ｓｃＦｖ
MEFSSPSREECPKPLSRVSIMAGSLTGLLLLQAVSWASGARPCIPKSFGYSSVVCVCNATYCDSFDPPTFPALGTFSRYESTRSGRRMELSMGPIQANHTGTGLLLTLQPEQKFQKVKGFGGAMTDAAALNILALSPPAQNLLLKSYFSEEGIGYNIIRVPMASCDFSIRTYTYADTPDDFQLHNFSLPEEDTKLKIPLIHRALQLAQRPVSLLASPWTSPTWLKTNGAVNGKGSLKGQPGDIYHQTWARYFVKFLDAYAEHKLQFWAVTAENEPSAGLLSGYPFQCLGFTPEHQRDFIARDLGPTLANSTHHNVRLLMLDDQRLLLPHWAKVVLTDPEAAKYVHGIAVHWYLDFLAPAKATLGETHRLFPNTMLFASEACVGSKFWEQSVRLGSWDRGMQYSHSIITNLLYHVVGWTDWNLALNPEGGPNWVRNFVDSPIIVDITKDTFYKQPMFYHLGHFSKFIPEGSQRVGLVASQKNDLDAVALMHPDGSAVVVVLNRSSKDVPLTIKDPAVGFLETISPGYSIHTYLWRRQLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTFGMGVSWIRQPSGKGLEWLAHIFWDDDKHYNPSLKSRLTISKDTSNNQVFLKITTVDTADTATYYCVRYGFDGFPYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSNQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGFYFCSQSTRVPWTFGGGTKLELKRAAAHHHHHHV（配列番号１０８）

【0175】

細胞シグナル伝達モジュレーターを含む異種ペプチドを含む例示的な融合タンパク質が、本明細書に記載されている。融合タンパク質名に別段の記載がない限り、ＣＣＤはタンパク質のＣ末端に配置される。様々な態様において、開示された融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、１つ以上の異種ペプチドを含む。開示された融合タンパク質のいずれかは、以下のアミノ酸配列のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、１５～２０、２０～３０、３０～５０、または５０より多くのアミノ酸が異なり得る。これらの違いは、配列番号６５～９１のいずれかの配列に対して挿入、欠失、または置換されたアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号６５～９１のいずれかの配列と共通する約１０、約２０、約２５、約４０、５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約１８０のアミノ酸のストレッチを含有する。

【0176】

多くの次の配列（配列番号６５～９１）は、Ｃ末端におけるポリ（Ａ）テールおよびポリヒスチジンタグ、または他のタグと共に示されている。しかしながら、いくつかの態様において、および当業者によって容易に視覚化され得るように、開示された例示的な融合タンパク質は、これらのタグを含有しない。
（「ｓ」は可溶性タンパク質を示し、「ｈｓ」はヒト配列を示す）：

【0177】

インターロイキン１０受容体（ｓＩＬ１０Ｒ）
MLPCLVVLLAALLSLRLGSDAHGTELPSPPSVWFEAEFFHHILHWTPIPNQSESTCYEVALLRYGIESWNSISNCSQTLSYDLTAVTLDLYHSNGYRARVRAVDGSRHSNWTVTNTRFSVDEVTLTVGSVNLEIHNGFILGKIQLPRPKMAPANDTYESIFSHFREYEIAIRKVPGNFTFTHKKVKHENFSLLTSGEVGEFCVQVKPSVASRSNKGMWSKEECISLLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６５）

【0178】

骨髄細胞で発現するトリガー受容体１（ｈｓＴＲＥＭ１）
MRKTRLWGLLWMLFVSELRAATKLTEEKYELKEGQTLDVKCDYTLEKFASSQKAWQIIRDGEMPKTLACTERPSKNSHPVQVGRIILEDYHDHGLLRVRMVNLQVEDSGLYQCVIYQPPKEPHMLFDRIRLVVTKGFSGTPGSNENSTQNVYKIPPTTTKALCPLYTSPRKDPGHLVEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAARGRRKR（配列番号６６）

【0179】

ＴＲＥＭ様転写物１（ｈｓＴＲＥＭＬ１）
MGLTLLLLLLLGLEGQGIVGSLPEVLQAPVGSSILVQCHYRLQDVKAQKVWCRFLPEGCQPLVSSAVDRRAPAGRRTFLTDLGGGLLQVEMVTLQEEDAGEYGCMVDGARGPQILHRVSLNILPPEEEEETHKIGSLAENLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６７）

【0180】

Ｔｏｌｌ様受容体５（ｓＴＬＲ５）
MGDHLDLLLGVVLMAGPVFGIPSCSFDGRIAFYRFCNLTQVPQVLNTTERLLLSFNYIRTVTASSFPFLEQLQLLELGSQYTPLTIDKEAFRNLPNLRILDLGSSKIYFLHPDAFQGLFHLFELRLYFCGLSDAVLKDGYFRNLKALTRLDLSKNQIRSLYLHPSFGKLNSLKSIDFSSNQIFLVCEHELEPLQGKTLSFFSLAANSLYSRVSVDWGKCMNPFRNMVLEILDVSGNGWTVDITGNFSNAISKSQAFSLILAHHIMGAGFGFHNIKDPDQNTFAGLARSSVRHLDLSHGFVFSLNSRVFETLKDLKVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQVLNLSYNLLGELYSSNFYGLPKVAYIDLQKNHIAIIQDQTFKFLEKLRTLDLRDNALTTIHFIPSIPDIFLSGNKLVTLPKINLTANLIHLSENRLENLDILYFLLRVPHLQILILNQNRFSSCSGDQTPSENPSLEQLFLGENMLQLAWETELCWDVFEGLSHLQVLYLNHNYLNSLPPGVFSHLTALRGLSLNSNRLTVLSHNDLPANLEILDISRNQLLAPNPDVFVSLSVLDITHNKFICECELSTFINWLNHTNVTIAGPPADIYCVYPDSFSGVSLFSLSTEGCDEEEVLKGSMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAARV（配列番号６８）

【0181】

ヘッジホッグ相互作用タンパク質（ｈＨＨＩＰ）
MLKMLSFKLLLLAVALGFFEGDAKFGERNEGSGARRRRCLNGNPPKRLKRRDRRMMSQLELLSGGEMLCGGFYPRLSCCLRSDSPGLGRLENKIFSVTNNTECGKLLEEIKCALCSPHSQSLFHSPEREVLERDLVLPLLCKDYCKEFFYTCRGHIPGFLQTTADEFCFYYARKDGGLCFPDFPRKQVRGPASNYLDQMEEYDKVEEISRKHKHNCFCIQEVVSGLRQPVGALHSGDGSQRLFILEKEGYVKILTPEGEIFKEPYLDIHKLVQSGIKGGDERGLLSLAFHPNYKKNGKLYVSYTTNQERWAIGPHDHILRVVEYTVSRKNPHQVDLRTARVFLEVAELHRKHLGGQLLFGPDGFLYIILGDGMITLDDMEEMDGLSDFTGSVLRLDVDTDMCNVPYSIPRSNPHFNSTNQPPEVFAHGLHDPGRCAVDRHPTDININLTILCSDSNGKNRSSARILQIIKGKDYESEPSLLEFKPFSNGPLVGGFVYRGCQSERLYGSYVFGDRNGNFLTLQQSPVTKQWQEKPLCLGTSGSCRGYFSGHILGFGEDELGEVYILSSSKSMTQTHNGKLYKIVDPKRPLMPEECRATVQPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号６９）

【0182】

血管内皮増殖因子受容体１（ｈｓＶＥＧＦＲ１）
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLHLQCRGEAAHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQPTIKWFWHPCNHNHSEARCDFCSNNEESFILDADSNMGNRIESITQRMAIIEGKNKMASTLVVADSRISGIYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLEKMPTEGEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYTGEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSSTTLDCHANGVPEPQITWFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIERVTEEDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７０）

【0183】

血管内皮増殖因子受容体２（ｈｓＶＥＧＦＲ２）
MQSKVLLAVALWLCVETRAASVGLPSVSLDLPRLSIQKDILTIKANTTLQITCRGQRDLDWLWPNNQSGSEQRVEVTECSDGLFCKTLTIPKVIGNDTGAYKCFYRETDLASVIYVYVQDYRSPFIASVSDQHGVVYITENKNKTVVIPCLGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISWDSKKGFTIPSYMISYAGMVFCEAKINDESYQSIMYIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGITRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKPFVAFGSGMESLVEATVGERVRIPAKYLGYPPPEIKWYKNGIPLESNHTIKAGHVLTIMEVSERDTGNYTVILTNPISKEKQSHVVSLVVYVPPQIGEKSLISPVDSYQYGTTQTLTCTVYAIPPPHHIHWYWQLEEECANEPSQAVSVTNPYPCEEWRSVEDFQGGNKIEVNKNQFALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYKCEAVNKVGRGERVISFHVTRGPEITLQPDMQPTEQESVSLWCTADRSTFENLTWYKLGPQPLPIHVGELPTPVCKNLDTLWKLNATMFSNSTNDILIMELKNASLQDQGDYVCLAQDRKTKKRHCVVRQLTVLERVAPTITGNLENQTTSIGESIEVSCTASGNPPPQIMWFKDNETLVEDSGIVLKDGNRNLTIRRVRKEDEGLYTCQACSVLGCAKVEAFFIIELKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７１）

【0184】

線維芽細胞成長因子受容体１（ｈｓＦＧＦＲ１）
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATGSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７２）

【0185】

分泌型frizzled関連タンパク質１（ｈＳＦＲＰ１）
MGIGRSEGGRRGAALGVLLALGAALLAVGSASEYDYVSFQSDIGPYQSGRFYTKPPQCVDIPADLRLCHNVGYKKMVLPNLLEHETMAEVKQQASSWVPLLNKNCHAGTQVFLCSLFAPVCLDRPIYPCRWLCEAVRDSCEPVMQFFGFYWPEMLKCDKFPEGDVCIAMTPPNATEASKPQGTTVCPPCDNELKSEAIIEHLCASEFALRMKIKEVKKENGDKKIVPKKKKPLKLGPIKKKDLKKLVLYLKNGADCPCHQLDNLSHHFLIMGRKVKSQYLLTAIHKWDKKNKEFKNFMKKMKNHECPTFQSVFKLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７３）

【0186】

上皮成長因子受容体（ｈｓＥＧＦＲ）
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７４）

【0187】

骨髄細胞で発現するトリガー受容体２（ｈｓＴＲＥＭ２）
MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAIKDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLELKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７５）

【0188】

ＴＲＥＭ様転写物２タンパク質（ｈｓＴＲＥＭＬ２）
MAPAFLLLLLLWPQGCVSGPSADSVYTKVRLLEGETLSVQCSYKGYKNRVEGKVWCKIRKKKCEPGFARVWVKGPRYLLQDDAQAKVVNITMVALKLQDSGRYWCMRNTSGILYPLMGFQLDVSPAPQSERNIPFTHLDNILKSGTVTTGQAPTSGPDAPFTTGVMVFTPGLITLPRLLASTRPASKTGYSFTATSTTSQGPRRTMGSQTVTASPSNARDSSAGPESISTKSGDLSTRSPTTGLCLTSRSLLNRLPSMPLKEFIEGRMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７６）

【0189】

Notchホモログ１（ｈｓＮＯＴＣＨ１）
MPPLLAPLLCLALLPALAARGPRCSQPGETCLNGGKCEAANGTEACVCGGAFVGPRCQDPNPCLSTPCKNAGTCHVVDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLDNACLTNPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQADPCASNPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQDVNECGQKPRLCRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGPNCERPYVPCSPSPCQNGGTCRPTGDVTHECACLPGFTGQNCEENIDDCPGNNCKNGGACVDGVNTYNCPCPPEWTGQYCTEDVDECQLMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCASAACFHGATCHDRVASFYCECPHGRTGLLCHLNDACISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVDECSLGANPCEHAGKCINTLGSFECQCLQGYTGPRCEIDVNECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCMCMPGYEGVHCEVNTDECASSPCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７７）

【0190】

コロニー刺激因子１受容体（ｈｓＣＳＦ１Ｒ）
MGPGVLLLLLVATAWHGQGIPVIEPSVPELVVKPGATVTLRCVGNGSVEWDGPPSPHWTLYSDGSSSILSTNNATFQNTGTYRCTEPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPWNVLAQEVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMRHTNYSFSPWHGFTIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQKVIPGPPALTLVPAELVRIRGEAAQIVCSASSVDVNFDVFLQHNNTKLAIHQQSDFHNNRYQKVLTLNLDQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAYLNLSSEQNLIQEVTVGEGLNLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPKLANVTTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFLARNPGGWRALTFELTLRYPPEVSVIWTFINGSGTLLCAASGYPQPNVTWLQCSGHTDRCDEAQVLQVWDDPYPEVLSQEPFHKVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIPISAGAHTHLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号７８）

【0191】

ＣＣＤ－ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ｈｓＴＲＡＩＬ）
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGAAAHHHHHHV（配列番号７９）

【0192】

ｈｓＷＩＦ１
MARRSAFPAAALWLWSILLCLLALRAEAGPPQEESLYLWIDAHQARVLIGFEEDILIVSEGKMAPFTHDFRKAQQRMPAIPVNIHSMNFTWQAAGQAEYFYEFLSLRSLDKGIMADPTVNVPLLGTVPHKASVVQVGFPCLGKQDGVAAFEVDVIVMNSEGNTILKTPQNAIFFKTCQQAECPGGCRNGGFCNERRICECPDGFHGPHCEKALCTPRCMNGGLCVTPGFCICPPGFYGVNCDKANCSTTCFNGGTCFYPGKCICPPGLEGEQCEISKCPQPCRNGGKCIGKSKCKCSKGYQGDLCSKPVCEPGCGAHGTCHEPNKCQCQEGWHGRHCNKRYEASLIHALRPAGAQLRQHTPSLKKAEERRDPPESNYIWLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８０）

【0193】

ｈｓＤＫＫ１
MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGGAAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDAGVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDHSTLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEGQVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRHLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８１）

【0194】

ｈＳＦＲＰ２
MLQGPGSLLLLFLASHCCLGSARGLFLFGQPDFSYKRSNCKPIPVNLQLCHGIEYQNMRLPNLLGHETMKEVLEQAGAWIPLVMKQCHPDTKKFLCSLFAPVCLDDLDETIQPCHSLCVQVKDRCAPVMSAFGFPWPDMLECDRFPQDNDLCIPLASSDHLLPATEEAPKVCEACKNKNDDDNDIMETLCKNDFALKIKVKEITYINRDTKIILETKSKTIYKLNGVSERDLKKSVLWLKDSLQCTCEEMNDINAPYLVMGQKQGGELVITSVKRWQKGQREFKRISRSIRKLQCLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８２）

【0195】

ｈｓＤＬＬ３
MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPPVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８３）

【0196】

神経原性遺伝子座Notchホモログ４（ｈｓＮＯＴＣＨ４）
MQPPSLLLLLLLLLLLCVSVVRPRGLLCGSFPEPCANGGTCLSLSLGQGTCQCAPGFLGETCQFPDPCQNAQLCQNGGSCQALLPAPLGLPSSPSPLTPSFLCTCLPGFTGERCQAKLEDPCPPSFCSKRGRCHIQASGRPQCSCMPGWTGEQCQLRDFCSANPCVNGGVCLATYPQIQCHCPPGFEGHACERDVNECFQDPGPCPKGTSCHNTLGSFQCLCPVGQEGPRCELRAGPCPPRGCSNGGTCQLMPEKDSTFHLCLCPPGFIGPDCEVNPDNCVSHQCQNGGTCQDGLDTYTCLCPETWTGWDCSEDVDECETQGPPHCRNGGTCQNSAGSFHCVCVSGWGGTSCEENLDDCIAATCAPGSTCIDRVGSFSCLCPPGRTGLLCHLEDMCLSQPCHGDAQCSTNPLTGSTLCLCQPGYSGPTCHQDLDECLMAQQGPSPCEHGGSCLNTPGSFNCLCPPGYTGSRCEADHNECLSQPCHPGSTCLDLLATFHCLCPPGLEGQLCELKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８４）

【0197】

Jagged１（ｈｓＪＡＧ１）
MRSPRTRGRSGRPLSLLLALLCALRAKVCGASGQFELEILSMQNVNGELQNGNCCGGARNPGDRKCTRDECDTYFKVCLKEYQSRVTAGGPCSFGSGSTPVIGGNTFNLKASRGNDRNRIVLPFSFAWPRSYTLLVEAWDSSNDTVQPDSIIEKASHSGMINPSRQWQTLKQNTGVAHFEYQIRVTCDDYYYGFGCNKFCRPRDDFFGHYACDQNGNKTCMEGWMGPECNRAICRQGCSPKHGSCKLPGDCRCQYGWQGLYCDKCIPHPGCVHGICNEPWQCLCETNWGGQLCDKDLNYCGTHQPCLNGGTCSNTGPDKYQCSCPEGYSGPNCEIAEHACLSDPCHNRGSCKETSLGFECECSPGWTGPTCSTNIDDCSPNNCSHGGTCQDLVNGFKCVCPPQWTGKTCQLDANECEAKPCVNAKSCKNLIASYYCDCLPGWMGQNCDINLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８５）

【0198】

血小板由来成長因子受容体Ａ（ｈｓＰＤＧＦＲＡ）
MGTSHPAFLVLGCLLTGLSLILCQLSLPSILPNENEKVVQLNSSFSLRCFGESEVSWQYPMSEEESSDVEIRNEENNSGLFVTVLEVSSASAAHTGLYTCYYNHTQTEENELEGRHIYIYVPDPDVAFVPLGMTDYLVIVEDDDSAIIPCRTTDPETPVTLHNSEGVVPASYDSRQGFNGTFTVGPYICEATVKGKKFQTIPFNVYALKATSELDLEMEALKTVYKSGETIVVTCAVFNNEVVDLQWTYPGEVKGKGITMLEEIKVPSIKLVYTLTVPEATVKDSGDYECAARQATREVKEMKKVTISVHEKGFIEIKPTFSQLEAVNLHEVKHFVVEVRAYPPPRISWLKNNLTLIENLTEITTDVEKIQEIRYRSKLKLIRAKEEDSGHYTIVAQNEDAVKSYTFELLTQVPSSILDLVDDHHGSTGGQTVRCTAEGTPLPDIEWMICKDIKKCNNETSWTILANNVSNIITEIHSRDRSTVEGRVTFAKVEETIAVRCLAKNLLGAENRELKLVAPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８６）

【0199】

ｈｓＶＥＧＦＲ１ドメイン２－ｈｓＶＥＧＦＲ２ドメイン３（ｈｓＶ１Ｖ２）
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQGGGGSGGGGSLKIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHGGGGSGGGGSLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８７）

【0200】

ＴＧＦベータ受容体１（ｈｓＴＧＦＢＲ１）
MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATALQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８８）

【0201】

ＴＧＦベータ受容体２（ｈｓＴＧＦＢＲ２）
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号８９）

【0202】

ＴＧＦベータ受容体３（ｈｓＴＧＦＢＲ３）
MTSHYVIAIFALMSSCLATAGPEPGALCELSPVSASHPVQALMESFTVLSGCASRGTTGLPQEVHVLNLRTAGQGPGQLQREVTLHLNPISSVHIHHKSVVFLLNSPHPLVWHLKTERLATGVSRLFLVSEGSVVQFSSANFSLTAETEERNFPHGNEHLLNWARKEYGAVTSFTELKIARNIYIKVGEDQVFPPKCNIGKNFLSLNYLAEYLQPKAAEGCVMSSQPQNEEVHIIELITPNSNPYSAFQVDITIDIRPSQEDLEVVKNLILILKCKKSVNWVIKSFDVKGSLKIIAPNSIGFGKESERSMTMTKSIRDDIPSTQGNLVKWALDNGYSPITSYTMAPVANRFHLRLENNAEEMGDEEVHTIPPELRILLDPGALPALQNPPIRGGEGQNGGLPFPFPDISRRVWNEEGEDGLPRPKDPVIPSIQLFPGLREPEEVQGSVDIALSVKCDNEKMIVAVEKDSFQASGYSGMDVTLLDPTCKAKMNGTHFVLESPLNGCGTRPRWSALDGVVYYNSIVIQVPALGDSSGWPDGYEDLESGDNGFPGDMDEGDASLFTRPEIVVFNCSLQQVRNPSSFQEQPHGNITFNMELYNTDLFLVPSQGVFSVPENGHVYVEVSVTKAEQELGFAIQTCFISPYSNPDRMSHYTIIENICPKDESVKFYSPKRVHFPIPQADMDKKRFSFVFKPVFNTSLLFLQCELTLCTKMEKHPQKLPKCVPPDEACTSLDASIIWAMMQNKKTFTKPLAVIHHEAESKEKGPSMKEPNPISPPILKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９０）

【0203】

フィブリノーゲン様タンパク質１（ｈｓＦＧＬ１）
MAKVFSFILVTTALTMGREISALEDCAQEQMRLRAQVRLLETRVKQQQVKIKQLLQENEVQFLDKGDENTVIDLGSKRQYADCSEIFNDGYKLSGFYKIKPLQSPAEFSVYCDMSDGGGWTVIQRRSDGSENFNRGWKDYENGFGNFVQKHGEYWLGNKNLHFLTTQEDYTLKIDLADFEKNSRYAQYKNFKVGDEKNFYELNIGEYSGTAGDSLAGNFHPEVQWWASHQRMKFSTWDRDHDNYEGNCAEEDQSGWWFNRCHSANLNGVYYSGPYTAKTDNGIVWYTWHGWWYSLKSVVMKIRPNDFIPNVILKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９１）

【0204】

受容体阻害タンパク質（ＲＩＰ）キナーゼ阻害剤および細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（「Ｔｉｍｐ」）を含む異種ペプチドを含む例示的な融合タンパク質が、本明細書に記載されている。融合タンパク質名にそのように示されている場合、融合タンパク質はＣＣＤを含有せず、むしろタンパク質のＣ末端に位置するＭＳＰ配列を含有する。様々な態様において、開示された融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、１つ以上の異種ペプチドを含む。開示された融合タンパク質のいずれかは、以下のアミノ酸配列のいずれかと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０～１５、１５～２０、２０～３０、３０～５０、または５０より多くのアミノ酸が異なり得る。これらの違いは、配列番号９２～１０２のいずれかの配列に対して挿入、欠失、または置換されたアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号９２～１０２のいずれかの配列と共通する約１０、約２０、約２５、約４０、５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約１８０アミノ酸のストレッチを含有する。

【0205】

多くの次の配列（配列番号９２～１０２）は、Ｃ末端におけるポリ（Ａ）テールおよびポリヒスチジンタグ、または他のタグと共に示されている。しかしながら、いくつかの態様において、および当業者によって容易に視覚化され得るように、開示された例示的な融合タンパク質は、これらのタグを含有しない。
（「ｍｓ」はマウス配列を示す）：

【0206】

セクレターゼ不活性プレセニリン１ Ｄ３８５Ａ変異体（ＰＳ１Ｄ３８５Ａ）
MTELPAPLSYFQNAQMSEDNHLSNTNDNRERQEHNDRRSLGHPEPLSNGRPQGNSRQVVEQDEEEDEELTLKYGAKHVIMLFVPVTLCMVVVVATIKSVSFYTRKDGQLIYTPFTEDTETVGQRALHSILNAAIMISVIVVMTILLVVLYKYRCYKVIHAWLIISSLLLLFFFSFIYLGEVFKTYNVAVDYITVALLIWNFGVVGMISIHWKGPLRLQQAYLIMISALMALVFIKYLPEWTAWLILAVISVYDLVAVLCPKGPLRMLVETAQERNETLFPALIYSSTMVWLVNMAEGDPEAQRRVSKNSKYNAESTERESQDTVAENDDGGFSEEWEAQRDSHLGPHRSTPESRAAVQELSSSILAGEDPEERGVKLGLGAFIFYSVLVGKASATASGDWNTTIACFVAILIGLCLTLLLLAIFKKALPALPISITFGLVFYFATDYLVQPFMDQLAFHQFYI（配列番号９２）

【0207】

ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（ｍｓＴｉｍｐ１）
MMAPFASLASGILLLLSLIASSKACSCAPPHPQTAFCNSDLVIRAKFMGSPEINETTLYQRYKIKMTKMLKGFKAVGNAADIRYAYTPVMESLCGYAHKSQNRSEEFLITGRLRNGNLHISACSFLVPWRTLSPAQQRAFSKTYSAGCGVCTVFPCLSIPCKLESDTHCLWTDQVLVGSEDYQSRHFACLPRNPGLCTWRSLGARLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９３）

【0208】

ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤２（ｍｓＴｉｍｐ２）
MGAAARSLRLALGLLLLATLLRPADACSCSPVHPQQAFCNADVVIRAKAVSEKEVDSGNDIYGNPIKRIQYEIKQIKMFKGPDKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDGKMHITLCDFIVPWDTLSITQKKSLNHRYQMGCECKITRCPMIPCYISSPDECLWMDWVTEKSINGHQAKFFACIKRSDGSCAWYRGAAPPKQEFLDIEDPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９４）

【0209】

ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤３（ｍｓＴｉｍｐ３）
MTPWLGLVVLLSCWSLGHWGAEACTCSPSHSQDAFCNSDIVIRAKVVGKKLVTEGPFGTLVYTIKQMKMYRGFSKMPHVQYIHTEASESLCGLKLEVNKYQYLLTGRVYEGKMYTGLCNFVERWDHLTLSQRKGLNYRYHLGCNCKINSCYYLPCFVTSKNECLWTDMLSNFGYPGYQSKHYACIRQKGGYCSWYRGWAPPDKSISNATDPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９５）

【0210】

ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤４（ｍｓＴｉｍｐ４）
MPWSPLAALSWALVLRLLALLWPPGRGEACSCAPAHPQQHFCHSALVIRAKISSEKVVPASKDPADTQKLIRYEIKQIKMFKGFEKAKDIQYVYTPFDSSLCGVKLETNSHKQYLLTGQILSDGKVFIHLCNYIEPWEDLSLVQRESLNHHYHQNCGCQITTCYAVPCTISAPNECLWTDWLLERKLYGYQAQHYVCMKHVDGICSWYRGHLHLRKEYVDIIQPLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISSTVAAAHHHHHHV（配列番号９６）

【0211】

ｍｓＴｉｍｐ１－ＭＳＰ
MMAPFASLASGILLLLSLIASSKACSCAPPHPQTAFCNSDLVIRAKFMGSPEINETTLYQRYKIKMTKMLKGFKAVGNAADIRYAYTPVMESLCGYAHKSQNRSEEFLITGRLRNGNLHISACSFLVPWRTLSPAQQRAFSKTYSAGCGVCTVFPCLSIPCKLESDTHCLWTDQVLVGSEDYQSRHFACLPRNPGLCTWRSLGARTRTRPLEQKLISEEDLAANDDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号９７）

【0212】

ｍｓＴｉｍｐ２－ＭＳＰ
MGAAARSLRLALGLLLLATLLRPADACSCSPVHPQQAFCNADVVIRAKAVSEKEVDSGNDIYGNPIKRIQYEIKQIKMFKGPDKDIEFIYTAPSSAVCGVSLDVGGKKEYLIAGKAEGDGKMHITLCDFIVPWDTLSITQKKSLNHRYQMGCECKITRCPMIPCYISSPDECLWMDWVTEKSINGHQAKFFACIKRSDGSCAWYRGAAPPKQEFLDIEDPTRTRPLEQKLISEEDLAANDDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号９８）

【0213】

ｍｓＴｉｍｐ３－ＭＳＰ
MTPWLGLVVLLSCWSLGHWGAEACTCSPSHSQDAFCNSDIVIRAKVVGKKLVTEGPFGTLVYTIKQMKMYRGFSKMPHVQYIHTEASESLCGLKLEVNKYQYLLTGRVYEGKMYTGLCNFVERWDHLTLSQRKGLNYRYHLGCNCKINSCYYLPCFVTSKNECLWTDMLSNFGYPGYQSKHYACIRQKGGYCSWYRGWAPPDKSISNATDPTRTRPLEQKLISEEDLAANDDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号９９）

【0214】

ｍｓＴｉｍｐ４－ＭＳＰ
MPWSPLAALSWALVLRLLALLWPPGRGEACSCAPAHPQQHFCHSALVIRAKISSEKVVPASKDPADTQKLIRYEIKQIKMFKGFEKAKDIQYVYTPFDSSLCGVKLETNSHKQYLLTGQILSDGKVFIHLCNYIEPWEDLSLVQRESLNHHYHQNCGCQITTCYAVPCTISAPNECLWTDWLLERKLYGYQAQHYVCMKHVDGICSWYRGHLHLRKEYVDIIQPTRTRPLEQKLISEEDLAANDDGIFCSSSNFLGISFLLILMLILYSFI（配列番号１００）

【0215】

本開示の例示的なＣＣＤ融合タンパク質（単量体）が、本明細書に記載されている。様々な態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号５６、５７、５９、７０、７２、７７、８０、８７、１０１、１０２、または１０５～１０８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号５６、５７、５９、７０、７２、７７、８０、８７、１０１、１０２、または１０５～１０８のいずれか１つの配列を含む。ある態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号５７の配列を含む。ある態様において、開示された融合タンパク質は、配列番号１０５～１０８のいずれか１つの配列を含む。

【0216】

２つの異種ペプチドを含む例示的な融合タンパク質には、ＩｃｏｓＬ－ＣＣＤ－ＴＲＡＩＬおよびＦＧＦＲ１－ＣＣＤ－ＶＥＧＦＲ１－ＶＥＧＦＲ２（「ＦＧＦＲ１－ＣＣＤ－Ｖ１Ｖ２」）が含まれ、これらは以下の配列で例示される。

【0217】

ｈＩｃｏｓＬ－ＣＣＤ－ｈＴＲＡＩＬ
MRLGSPGLLFLLFSSLRADTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENPVLKEFGGGGSGGGGSGGGGSMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKGGGGSGGGGSGGGGSLQISTRISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENTKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVGTRAAAHHHHHHV（配列番号１０１）

【0218】

ｈｓＦＧＦＲ１－ＣＣＤ－ｈｓＶＥＧＦＲ１－ｈｓＶＥＧＦＲ２
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATGSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMLKEFMGYQGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPGYCGPPGPPGPPGIPGNHGNNGNNGATGHEGAKGEKGDKGDLGPRGERGQHGPKGEKGYPGIPDYKDDDDKLQISGGGGSGGGGSIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQGGGGSGGGGSLKIVVVVGYRIYDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHAAAHHHHHHV（配列番号１０２）

【0219】

開示された融合タンパク質およびその組成物のいずれも、長い貯蔵寿命を有し得、例えば、１週間から１０年間などの特定の時点までの－２０℃または室温などの特定の温度での保管後に、安定性を有し得る。開示された組成物は、保管前後のタンパク質試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析後に実施されたウエスタンブロット画像の外観に有意な変化がない場合、例えば分解物の存在を示し得る「新しい」タンパク質バンドがウエスタンブロットにない場合、特定の時点で安定していると見なされる。

【0220】

したがって、ある態様において、開示された融合タンパク質の個々のアリコート（例えば、単位用量）またはその組成物の少なくとも９５％、しばしば少なくとも９８％、およびしばしば１００％は、約－２０℃で８ヶ月から１０年の保管後に安定である。ある態様において、開示された組成物の個々のアリコートの少なくとも９５％、しばしば少なくとも９８％、および通常１００％は、約－２０℃で数週間または数ヶ月の保管後（例えば、３ヶ月後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２４か月後）に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出された場合に安定性を示す。

【0221】

具体的な態様において、開示された組成物の個々のアリコートの少なくとも９５％、しばしば少なくとも９８％、およびしばしば１００％は、約－２０℃で数週間から数ヶ月保管し、続いて約２℃～約８℃（例えば、約４または４．５℃）の温度に解凍し、続いて約２℃～約８℃（例えば、約４または４．５℃）で１から６週間保管した後に、安定である。ある態様において、開示された組成物の個々のアリコートの少なくとも９５％、しばしば少なくとも９８％、およびしばしば１００％は、約－２０℃で数週間から数ヶ月保管し、続いて約２℃～約８℃（例えば、４．０℃または４．５℃）で２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間、解凍して保管した後に、安定である。ある態様において、開示された組成物の個々のアリコートの少なくとも９５％、しばしば少なくとも９８％、およびしばしば１００％は、６ヶ月から１０年の間の期間凍結し、次いで約２℃～約８℃（例えば４．０℃または４．５℃）で少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、６か月、８か月、１０か月、１２か月、１５か月、１８か月、２０か月、２２か月、または２４か月、解凍して保管された後に、安定である。

【0222】

ある態様において、溶液は、－２０℃未満の温度で長期間保管される。例えば溶液は、－３０℃、－４０℃、－６０℃、または－８０℃の温度で保管され得る。

【0223】

多量体融合タンパク質
ＣＣＤおよび融合タンパク質の多量体の形成を増強するために、Ｃ１ｑＴＮＦ３からの２つのＣＣＤドメインを、グリシン－チロシン－システインリンカーによって接続した。単一の理論に制限されることなく、隣接するＣＣＤドメイン間のシステイン残基は、分子間ジスルフィド結合（またはジスルフィド架橋）を形成する。目的の異種ペプチドの性質に応じて、タンパク質は、当技術分野で知られている分子クローニング技術を介して、Ｎ末端またはＣ末端に組み込まれる。ある場合には、異種ペプチドがＣＣＤドメインの各末端に組み込まれて、「二重弾頭（double warhead）」として知られる場合もある二機能性分子を形成する（図１Ａを参照）。

【0224】

ＣＣＤ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子工学技術によってｒＡＡＶベクターに挿入され得る。目的のタンパク質ｃＤＮＡを有する完全なｒＡＡＶベクターを次に使用して、異種ペプチドの発現を増強することができる。

【0225】

したがって、いくつかの側面において、本明細書で提供されるのは、２、３、４、６、または８個のＣＣＤ融合タンパク質単量体を含む多量体融合タンパク質である。特定の態様において、多量体融合タンパク質は、三量体または六量体を含む。多量体融合タンパク質の単量体は、同じであっても、異なっていてもよい。単量体が異なり得る例示的な多量体タンパク質は、ネイティブな最適化Ｃ１ｑＴＮＦ３コラーゲンドメインを含む融合タンパク質の送達によって生じ得、ここでこれらのドメインは、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ反復の存在により、標的細胞内で（例えば三量体に）会合する。

【0226】

開示された多量体融合タンパク質の特定の態様において、２つ以上の単量体のＣＣＤは、１つ以上のグリシン－システイン－グリシンリンカードメインまたはグリシン－チロシン－システインリンカードメインによって互いに連結されている。特定の態様において、２つ以上の単量体は、１つ以上のジスルフィド架橋によって互いに連結されている。

【0227】

いくつかの側面において、開示された多量体融合タンパク質は、２つ以上のリガンドに対して二重特異性を有する。例示的な側面において、多量体融合タンパク質は、in vivoで２つ以上のリガンドに対して、in vivoでの同じリガンドに対する第１および第２の異種ペプチドの結合親和性の合計と実質的に等価である結合アビディティを有する。いくつかの側面において、多量体融合タンパク質は、in vivoで２つ以上のリガンドに対して、in vivoでの同じリガンドに対する第１および第２の異種ペプチドの結合親和性の合計よりも大きい、結合アビディティを有する。開示された多量体融合タンパク質のin vivoでのアビディティの維持または増強は、本発明の予想外かつ重要な結果を表す。

【0228】

免疫シナプスでの免疫チェックポイント分子またはそのモジュレーターの単一分子標的化が、免疫チェックポイントを標的とする所望の治療には不十分かも知れないという証拠が増えている。本明細書に記載の多量体融合タンパク質は、アルツハイマー病、がんまたは自己免疫障害および状態における免疫調節のための、二重および多重特異的治療法の開発に対する当技術分野における必要性に対処する。したがって、本明細書に記載されているのは、タウタンパク質およびアミロイドβペプチドを標的とする二重特異性機能性多量体融合タンパク質である。

【0229】

いくつかの態様において、開示された任意の融合タンパク質の第２の異種ペプチドは、アミロイドβペプチド（Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む。いくつかの態様において、第１の異種ペプチドは、タウタンパク質（α－タウ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含み得る。他の態様において、第１の異種ペプチドは、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）を含み得る。特定の態様において、第１の異種ペプチドはタウタンパク質（α－タウ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含み、第２の異種ペプチドはアミロイドβペプチド（Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む。例示的なアミロイドβｓｃＦｖペプチドには、βペプチド９およびβペプチド５に対するｓｃＦｖが含まれる。

【0230】

特定の態様において、タウを標的とするｓｃＦｖは、９４－３Ａ６抗タウ抗体からのフラグメントであり、Ａβを標的とするｓｃＦｖは、βペプチド９に対して特異性を有する（「Ａβ９ ｓｃＦｖ」）（図６Ａ～６Ｅを参照）。Croft CL et al. (2018), Novel monoclonal antibodies targeting the microtubule binding domain of human tau, PLoS ONE 13(4):e0195211を参照のこと、これは参照により本明細書に組み込まれる。これらの融合タンパク質は、本明細書では「タウおよびＡβを標的とするナノボディ」と呼ばれ得る。以下の実施例に示すように、これらのナノボディは、in vitroおよびin vivoでタウおよびＡβに対してアビディティを示す。これらのナノボディは、in vivoでこれらのリガンドに対して、in vivoでの同じリガンドに対するα－タウｓｃＦｖおよびα－Ａβ ｓｃＦｖの結合親和性の合計と実質的に同等の程度まで、アビディティを示す。いくつかの態様において、融合タンパク質の第１の異種ペプチドはＧＢＡタンパク質を含み、第２の異種ペプチドはアミロイドβペプチド９（Ａβ９）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含む。

【0231】

本開示の異種ペプチド（ｓｃＦｖなど）のin vitroでの結合親和性およびアビディティは、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光またはＦＡＣＳアッセイを使用）を含む様々な方法によって決定することができる。in vivoでの結合親和性およびアビディティは、例えば、細胞代謝活性アッセイなどの機能的in vivoアッセイまたはアミロイド斑検出アッセイなどの最終産物検出アッセイにおける活性によって推定することができ；または、対象のin vivoイメージングを含む方法によって直接推定することができ、該方法としては例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）、生物発光イメージング（ＢＬＩ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、電子顕微鏡、Ｘ線コンピュータ断層撮影、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、熱イメージング、蛍光反射イメージング、蛍光顕微鏡、蛍光分子断層撮影イメージング、核磁気共鳴イメージング、Ｘ線イメージング、超音波イメージング、光音響イメージング、ラボアッセイ、またはタグ付け／染色／イメージングが必要なあらゆる状況である。

【0232】

ｓｃＦｖを含む融合タンパク質は、構造：ＮＨ_２－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＦＬＡＧ－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＧＢＡ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－ＦＬＡＧ－［α－タウｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨ、ＮＨ_２－［ＧＢＡ］－［ＣＣＤ］－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－ＣＯＯＨ、またはＮＨ_２－［α－Ａβ ｓｃＦｖ］－［ＣＣＤ］－［ＧＢＡ］－ＣＯＯＨ、ここで「］－［」の各例は、任意のリンカー配列の存在を示す。いくつかの態様において、「α－Ａβ ｓｃＦｖ」はα－Ａβ９ ｓｃＦｖを表す。ある態様において、これらの多量体融合タンパク質は、三量体または六量体である（図６Ａを参照のこと）。

【0233】

他の例示的な態様において、第１の異種ペプチドは、アミロイドβペプチド（Ａβ）に対して親和性を有するｓｃＦｖを含み、第２の異種ペプチドは、異なるアミロイドβペプチドに対して親和性を有するｓｃＦｖを含む。驚くべきことに、以下の例４に示されるように、第１の異種ペプチドがＡβ９に対して親和性を有するｓｃＦｖを含み、第２の異種ペプチドが異なるアミロイド前駆体ペプチドに対して親和性を有するｓｃＦｖを含む単量体ナノボディをコードするｒＡＡＶベクターの投与は、溶液中の非抱合ｓｃＦｖの投与と比較して、ＣＲＤＮ８マウスの脳におけるアミロイド斑沈着を首尾よく低減した（図６Ｄを参照）。この機能的in vivoアッセイで観察されたアミロイド斑の減少に基づき、この単量体ナノボディは、非抱合状態の同じｓｃＦｖよりも、Ａβ９およびアミロイド前駆体ペプチドに対するin vivoでのアビディティを増強したと推測することができる。

【0234】

特定の態様において、多量体融合タンパク質は、そのリガンドに対して１０^７Ｍ^－１を超えるアビディティを有する。ある態様において、多量体タンパク質は、そのリガンドに対して１０^８Ｍ^－１を超えるアビディティを有する。ある態様において、多量体タンパク質は、そのリガンドに対して１０^９Ｍ^－１を超えるアビディティを有する。ある態様において、多量体タンパク質は、そのリガンドに対して、１０^７Ｍ^－１～１０^９Ｍ^－１の間、１０^７Ｍ^－１～１０^８Ｍ^－１の間、１０^８Ｍ^－１～１０^１０Ｍ^－１の間、１０^８Ｍ^－１～１０^９Ｍ^－１、および１０^９Ｍ^－１～１０^１０Ｍ^－１の間のアビディティを有する。

【0235】

特定の態様において、多量体融合タンパク質の各単量体は、以下を含むＣＣＤを含む：少なくとも１０個のＧ－Ｘ－Ｙ反復（ここで、Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸、およびＹは任意のアミノ酸であり、ここでＧ－Ｘ－Ｙ反復の少なくとも１０個はＧ－Ｐ－ＰまたはＧ－Ｐ－Ｏであり、ここでＧ－Ｘ－Ｙ反復の少なくとも６個はＧ－Ｐ－Ｏであり、およびここでＰはプロリンでありＯはヒドロキシプロリンである）；および抗体ドメイン（ここで、各１つの単量体のヒドロキシプロリン化コラーゲン様ドメインは互いに相互作用して、少なくとも１０^７Ｍ^－１のアビディティでリガンドに結合する多量体タンパク質を形成する）。

【0236】

融合タンパク質は、本開示の融合タンパク質の検出および精製を目的として、親和性タグの配列を含むか、または除外することができる。親和性タグの例には、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ_６タグ）、ｍｙｃタグ、Strepタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｅタグ、血球凝集素タグ、Ｔ７、Ｓタグ、ＨＳＶ、ＶＳＶ－Ｇ、抗Xpress、およびＶＳタグが含まれる。

【0237】

異種ペプチドの結合ドメインの特異性に基づいて、本明細書に記載の融合タンパク質は、がん、炎症性疾患、代謝性疾患、線維症疾患、および心血管疾患を含む様々な障害を処置するために使用され得る。したがって本発明は、例えば、それを必要とする対象に、障害を処置するための本発明のタンパク質複合体の有効量を投与することによって、かかる障害を処置する方法を特徴とする。処置される対象は、障害を特徴とする状態を有するか、またはこれを獲得するリスクがあると特定することができる。これらの方法は、単独で、または他の薬物もしくは療法と組み合わせて実施することができる。

【0238】

本明細書に記載の融合タンパク質の多重特異的な結合親和性のために、当業者は、これらの融合タンパク質を使用して、通常は互いに会合しない分子または細胞を架橋することができる。この特徴は、細胞ベースの治療に特に役立つ。一例において、タンパク質複合体の１つの異種ドメインは、細胞傷害性細胞上のエフェクター抗原に特異的に結合することによって、細胞傷害性細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）を活性化することができ、一方、別の異種ドメインは、破壊すべき病原体細胞または悪性細胞上の標的抗原に特異的に結合する。このようにして、タンパク質複合体は、病原体または悪性細胞によって引き起こされる障害を処置することができる。

【0239】

Ｃｌｑタンパク質
Ｃｌｑは、補体活性化の古典的経路の、Ｃ１酵素複合体のサブユニットである。これは、鎖Ａ、Ｂ、およびＣの９個のジスルフィド結合二量体で構成されており、Ｎ末端非らせん領域、三重らせん（コラーゲン）領域、およびＣｌｑドメインと呼ぶＣ末端球状頭部からなる共通の構造を共有する（Smith et al. 1994 Biochem. J. 301 :249-256）。ＣｌｑおよびＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、宿主の防御、炎症、アポトーシス、自己免疫、細胞分化、器官形成、冬眠、およびインスリン抵抗性肥満に関与する。厳密に保存された５つの残基がＣｃｌｑファミリーで同定されている（Kishore et al. Trends in Immunology 2004. 25(10):551-561）。各Ｃｌｑドメインは、２つの５本鎖βシート：（Ａ’、Ａ、Ｈ、Ｃ、Ｆ）および（Ｂ’、Ｂ、Ｇ、Ｄ、Ｅ）で構成される、ゼリーロールトポロジーを持つ１０本鎖βサンドイッチフォールドを示し、それぞれが逆平行鎖でできている。ｃｌｑファミリータンパク質内の５つの保存された残基のそれぞれは、Ｃｌｑドメインの疎水性コアに属する。β鎖は、（配向およびサイズに関して）異なるＣｌｑドメインにおいて強く保存されており、これは、顕著な変動性を示すβ鎖を接続するループとは対照的である。Ｃｌｑドメイン内には、２つの良好に保存された領域が存在する：芳香族モチーフはドメインの前半にあり、もう１つの保存された領域はＣ末端の近くにある。

【0240】

さらに、タンパク質Ｃｌｑ、コラーゲンａ１（Ｘ）、ａ２（ＶＩＩ）、越冬（overwintering）タンパク質ＡＣＲＰ３０、内耳構造タンパク質、セレベリンおよびマルチメリンは、それぞれの多量体化配列セグメントにおけるそれらの配列相同性のために、用語Ｃｌｑファミリーの下でタンパク質ファミリーとして分類され（Kischore and Reid, Immunopharmacol., 42: 15-21 (1999)）、およびそれらの構造のため、これらのタンパク質は、より高い凝集体、例えば三量体の形態である。このファミリーに見られる多量体化特性を有するタンパク質の中で、例えば、補体系から知られているタンパク質Ｃｌｑの構造は、それぞれが「ヘッド」として知られている球状ドメイン、および「コラーゲン状」ヘリカル配列セグメントを有する単量体によって特徴付けられる。コイルドコイル三重らせんを形成するのはこのらせん配列セグメントであり、それを介して単量体が三量体化する。次に、これらのＣｌｑ三量体のうち６つがオリゴマーを形成し、タンパク質三量体のオリゴマー化は、個々のコイルドコイル三重らせん間の相互作用に基づく。タンパク質またはマルチ（オリゴ）マー化タンパク質複合体Ｃｌｑのこの構造配置の結果は、「ブーケ」とも呼ばれる構成であり、球状のＣ末端に配置された「ヘッド」ドメインが接続されて三量体の六量体を与えることが保証される。

【0241】

ＣｌｑおよびＴＮＦファミリータンパク質は、類似の遺伝子構造を有する：それらのＣｌｑおよびＴＮＦ相同性ドメインは、それぞれが１つのエクソン内にコードされているが、両方のファミリーのイントロンは、それぞれのＮ末端コラーゲンまたは柄（stalk）領域に制限されている。ゼリーロール構造は、植物ウイルスおよび、口蹄疫ウイルスとポリオウイルスを含む哺乳類ピコランウイルスのカプシドタンパク質と非常によく似ている。

【0242】

ＣｌｑサブコンポーネントおよびＶＩＩＩ型およびＸ型コラーゲンのＣ末端球状ドメインは、三重らせんの正しい折り畳みおよびアラインメント、ならびにタンパク質－タンパク質認識事象の両方にとって重要である。Ｘ型コラーゲンの場合、ドメインはタンパク質の正しい集合の開始および維持に重要であることが示唆されている（Kwan et al. 1991 J. Cell Biol. 114:597-604）。アディポネクチンでは、Ｃｌｑドメインは、完全長のアディポネクチンよりもはるかに強力に高血糖および高インスリン血症を改善することができる。アディポネクチンは、それらの食作用活性およびそれらのＬＰＳ誘導性のＴＮＦ－α産生を顕著に阻害することによって、成熟マクロファージ機能を抑制することが示され、したがって炎症を解消する可能性がある。アディポネクチンはまた、肥満マウスの筋肉および肝臓のトリグリセリド含有量を減少させることにより、肥満に関連するインスリン抵抗性を逆転させることも示されている。アディポネクチンの減少は、肥満および２型糖尿病のマウスモデルにおけるインスリン抵抗性の発症に関係している。「シュミット型骨幹端軟骨異形成症」と呼ばれる成長板の異常に関連する軽度の常染色体障害は、疎水性コアを破壊し三量体の集合を混乱させるコラーゲンＸのＣｌｑドメインにおけるミスセンス変異に関連する。ＣＴＲＰ５のＣｌｑドメインにおける特定の変異は、遅発性網膜変性に関連する。

【0243】

コラーゲンドメインは、結合組織構造の形成に関与する一般に細胞外構造タンパク質であるコラーゲンに見出される。ドメインは、三重らせんを形成するＧ－Ｘ－Ｙ反復の２０のコピーを含有する。反復の最初の位置はグリシンであり、２番目と３番目の位置は任意の残基であり得るが、多くの場合プロリンおよびヒドロキシプロリンである。コラーゲンは、プロリンヒドロキシラーゼにより翻訳後修飾されて、ヒドロキシプロリン残基を形成する。不完全なヒドロキシル化は壊血病の原因である。コラーゲンスーパーファミリーの一部のメンバーは結合組織構造に関与しないが、同じ三重らせん構造を共有する。ヒト線維芽細胞に対するＣｌｑの抗増殖（Ｇ１有糸分裂停止）およびアポトーシス促進効果は、カルレティキュリン－ＣＣＤ９１複合体を介してコラーゲン領域によって媒介される。この相互作用は、マクロファージにおけるｐ３８ ＭＡＰＫ活性化、ＮＦ－κＢ活性、および炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの産生を増強する。

【0244】

したがって、タンパク質を含有するＣｌｑドメインの活性の変化は、疾患の表現型を変化させる手段を提供し、したがって、このタイプの新規なタンパク質の同定は、それらが、上記で特定された疾患および他の病状の処置の開発において役割を果たすか、または有用であり得るために、非常に関連性がある。

【0245】

多量体化戦略
一価抗体フラグメント、例えば単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）およびナノボディ（ＶＨＨ）は、一般に、速い腎クリアランスのため循環時間が短いという問題がある。これらの抗体フラグメントの改変は高親和性結合ドメインを生成することができるが、抗原の強い結合能力および高い局所密度は、「結合部位バリア」と呼ばれる状況になると組織浸透の低下につながる可能性もある。

【0246】

ヒト組織の非平衡環境において、一価抗体フラグメントは、結合ドメインの迅速な解離のために中程度の標的保持の問題がある。最適な治療用分子では、最適な腫瘍浸透（分子量を考慮）、機能的親和性、および妥当な血清半減期の間で適切な妥協点を確立する必要がある。抗原特異性を損なうことなく標的結合分子の結合強度を増強することは、困難な課題である。

【0247】

そのために、小さな一価の結合分子を、抗体の固有の多価フォーマットへと改変することができる。したがって、小さな抗体フラグメントの標的結合強度を、抗原結合部位の数を増やすことによって大幅に改善することができる。多量体化はさらに、結合部分の強制的な近接およびより遅いＫ_Ｄオフレートによって引き起こされる、標的組織でのより高い分子量およびより長い保持時間のために、延長された循環時間をもたらす。改善された半減期と増強された機能的親和性により、診療所での低用量の使用が可能になり、その結果コストおよび用量依存性の副作用が低減される。

【0248】

標的結合分子を多価足場分子に融合させて、多価性を達成することができる。多価足場への融合にはいくつかの利点があり、その中には、リガンドが強制的に近接しているため複数のリガンドがそれらの標的部位に結合するときに達成できる、標的滞留時間の延長がある。この場合、結合したリガンドは、残りの足場関連の対応物を標的細胞上の結合部位に近接させ、したがって、それらの結合および解離したリガンドの再結合の両方に有利に働く。これは当然、近接した標的分子の分布に強く依存する。

【0249】

本明細書で使用する場合、「足場」という用語は、機能単位の多価表示のための定義された構成（architecture）を有する合成または天然起源の分子を指す。多量体化に適用される足場分子は、一定の最適な属性を有し得る：小さいサイズ、定義された構成、高い安定性、低い凝集傾向、水溶液での十分な溶解性、および足場の完全性に影響を与えることなく対処できる修飾部位。オリゴマー化ドメインへの融合は、融合パートナーの半減期を延長し、したがってそれらの活性を長期間可能にすることが見出されている。多量体機能性生体分子の活性は、親和性ではなく、アビディティによるより強い標的結合によって増強される。

【0250】

足場の例として、平行なジスルフィド安定化五量体構造に自己組織化が可能な少なくとも４６個の残基から構成される、ヒト軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ４８、または「ＣＯＭＰ」）が、以前から様々な標的結合分子の五量体化に使用されている。ＣＯＭＰは、コラーゲンやフィブロネクチンなどの他の細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を介して、軟骨の構造的完全性に役割を果たす。メラノーマペプチドＨＬＡＡ２複合体を標的とするＶＨＨをＣＯＭＰ４８のＮ末端に融合させ、一価のＶＨＨと比較して増強された結合能力を示す、五量体抗体ＣＯＭＢＯＤＹがもたらされた。

【0251】

さらに、二重特異性ＣＯＭＢＯＤＹが、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖのＣ末端への追加の融合によって生成された。予想される二重特異性二価分子はより大きな凝集体に蓄積し、これは、ペプチドを負荷した標的細胞の特異的細胞溶解を媒介した。別のグループは、ＥＧＦＲ過剰発現がん細胞上のＥＧＦＲの細胞外ドメインに特異的に結合してアポトーシスを誘導する５つのＥＧＦリガンドを有する、五量体ＣＯＭＰ－ＥＧＦ融合タンパク質を生成した。この融合タンパク質は、大腸菌細胞で産生されたが、複雑な三次構造のために大規模な再折り畳みが必要であった。

【0252】

リンカーおよびシグナル配列
開示された融合タンパク質の様々な態様において、リンカーは、ペプチドドメインのいずれかを連結するために使用され得る。リンカーは、共有結合のように単純な場合もあれば、多数原子の長さの高分子リンカーの場合もある。ある態様において、リンカーは、ポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある態様において、リンカーは、共有結合（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）である。ある態様において、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。ある態様において、リンカーは、環状または非環状、置換または非置換、分岐または非分岐の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある態様において、リンカーはポリマーである（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。ある態様において、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータアラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。ある態様において、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、またはポリマーを含む。ある態様において、リンカーは、炭素環部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある態様において、リンカーはペプチドを含む。ある態様において、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドの求核試薬（例えば、チオール、アミノ）のリンカーへの付着を容易にする、官能化された部分を含み得る。任意の求電子試薬をリンカーの一部として使用することができる。例示的な求電子試薬には、限定はされないが、活性化エステル、活性化アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアナートが含まれる。

【0253】

いくつかの態様において、リンカーは、１つのアミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの態様において、リンカーは、結合（例えば、共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは、長さが５～１００アミノ酸であり、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、または１５０～２００アミノ酸の長さである。より長いかまたはより短いリンカーも企図される。

【0254】

いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＳ（配列番号１０３）またはＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１０４）を含む。

【0255】

様々な態様において、開示された融合タンパク質は、分泌シグナル配列を含む。細胞が細胞外タンパク質を作って分泌する能力は、多くの生物学的プロセスの中心である。酵素、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、およびシグナル伝達分子はすべて、細胞から分泌される。これは、分泌小胞と原形質膜との融合によるものである。すべてではないがほとんどの場合、タンパク質はシグナルペプチドによって小胞体および分泌小胞内に向けられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞等の膜結合コンパートメントへのポリペプチド鎖の輸送に影響を与える、シス作用性配列である。分泌小胞を標的とするポリペプチドは、細胞外マトリックスに分泌されるか、原形質膜に保持される。原形質膜に保持されているポリペプチドは、１つ以上の膜貫通ドメインを有する。

【0256】

医薬組成物および処置方法
本明細書でさらに提供されるのは、医薬組成物であって、本明細書に開示された改変ｒＡＡＶベクターを含み、さらに医薬賦形剤を含み、ex vivoまたはin situで動物、特にヒトにおける宿主細胞に投与するために製剤化され得る、前記医薬組成物である。かかる組成物はさらに、任意にリポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含み得るか、あるいは必要のある対象の細胞、組織、器官、または体への投与のために製剤化され得る。かかる組成物は、様々な治療で使用するために製剤化することができ、例えば本明細書に記載の状態、疾患または障害を含む、ペプチド欠乏症、ポリペプチド欠乏症、ペプチド過剰発現、ポリペプチド過剰発現などの状態の改善、予防、および／または処置である。

【0257】

「賦形剤」という用語は、ｒＡＡＶ粒子もしくは調製物または核酸セグメントと共に投与される、希釈剤、アジュバント、担体、またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水および油など滅菌の液体であることができ、例えば鉱油などの石油、ピーナッツ油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成由来の油を含む。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として使用することができる。

【0258】

ある態様において、本開示は、対象におけるＡＡＶ免疫を低下させる方法を提供し、ここで方法は、開示されたｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容し得る賦形剤を含む組成物を対象に投与することをさらに含み、任意にここで、対象は以前にｒＡＡＶ粒子を含む組成物を投与されている。特定の態様において、対象はヒトである。

【0259】

いくつかの態様において、宿主細胞に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、５００～５０００ベクターゲノム（ｖｇｓ）／細胞の範囲のオーダーであり得る。特定の態様において、開示された方法は、ｒＡＡＶ粒子の約５００ｖｇｓ／細胞、１０００ｖｇｓ／細胞、２０００ｖｇｓ／細胞、３０００ｖｇｓ／細胞、４０００ｖｇｓ／細胞、５０００ｖｇｓ／細胞、６０００ｖｇｓ／細胞、または７０００ｖｇｓ／細胞の用量での投与を含む。

【0260】

いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、１０^６～１０^１４粒子／ｍＬまたは１０^３～１０^１３粒子／ｍＬの範囲のオーダー、またはいずれかの範囲についてのそれらの間の任意の値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４粒子／ｍＬであり得る。一態様において、１０^１３粒子／ｍＬより高いｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの態様において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、１０^６～１０^１４ｖｇｓ／ｍＬまたは１０^３～１０^１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲のオーダー、またはいずれかの範囲についてのそれらの間の任意の値、例えば、ｒＡＡＶ粒子組成物の約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４ｖｇｓ／ｍＬであり得る。ある態様において、開示された方法は、３ｘ１０^３～１ｘ１０^４ｖｇｓ／ｍＬの用量での投与を含む。一態様において、１０^１３ｖｇｓ／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。

【0261】

ｒＡＡＶ粒子は単回投与として投与することができ、または、処置される特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得るように、２回以上の投与に分割することができる。いくつかの態様において、０．０００１ｍＬから１０ｍＬが対象に送達される。いくつかの態様において、インターフェロン－γが、ｒＡＡＶ粒子と同時投与される。いくつかの態様において、インターフェロン－γは、ｒＡＡＶ粒子の投与後に投与される。

【0262】

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示された組成物の、細胞または動物に投与するための薬学的に許容し得る溶液中の製剤であって、単独で、または１つ以上の他の治療法と組み合わせた、特にヒトの細胞、組織、および人間に影響を与える病気の治療のための、前記製剤を提供する。

【0263】

必要に応じて、ｒＡＡＶ粒子または調製物および核酸セグメントは、他の剤、例えば、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な剤と組み合わせて投与することができ、これには、治療用ポリペプチド、生物学的活性フラグメント、またはそれらのバリアントの１つ以上の全身投与または局所投与を含む。実際、追加の剤が標的細胞または宿主組織との接触時に重大な悪影響を引き起こさなければ、含まれ得る他の成分に事実上制限はない。したがって、ｒＡＡＶ粒子または調製物および核酸セグメントは、特定の場合に必要とされるように、様々な他の剤と共に送達され得る。かかる組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、または代替的に、本明細書に記載されるように化学的に合成され得る。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸セグメント（例えば、プラスミドまたは組換えウイルスゲノム）またはウイルスベクター（例えば、組換えゲノムを含むｒＡＡＶ粒子）を指すことができる。

【0264】

薬学的に許容し得る賦形剤の製剤は、本明細書に記載の特定の組成物を様々な処置計画（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内の投与および製剤を含む）で使用するための、適切な投薬および処置計画の開発と同様に、当業者によく知られている。

【0265】

典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／または核酸セグメント）またはそれ以上を含有し得るが、ただし、有効成分のパーセンテージは当然ながら様々であり、都合の良いことに、全製剤の重量または体積の約１または２％から約７０％または８０％以上の間であり得る。当然のことながら、各治療上有用な組成物中の治療剤の量は、適切な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量において得られるような方法で、調製することができる。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命、および他の薬理学的考察などの要因は、かかる製剤を調製する当業者によって企図され、したがって様々な投薬量および処置計画が望ましい場合がある。

【0266】

例示的な多量体融合タンパク質、すなわちアミロイドβタンパク質の単鎖可変領域フラグメントとのＣＣＤ融合、またはα－Ａβ５ ｓｃＦｖＣＣＤの半減期は、約２時間であると決定された。２５０μｇの精製ビオチン化抗パンＡβ５ ｓｃＦｖ５またはパンＡβ５ ｓｃＦｖＣＣＤを、成体の非トランスジェニックＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに腹腔内注射した。注射後の様々な時点で、血漿をマウスから収集し、環状ｓｃＦｖのレベルを、直接ＥＬＩＳＡ法により、単量体Ａβ（１０μｇ／ｍｌ）を捕捉としておよびニュートラアビジン－ＨＲＰ二次抗体を検出として用いて、検出した。結果を図２５に示す。

【0267】

ある状況において、本明細書に開示の適切に製剤化された医薬組成物中のｒＡＡＶ粒子または調製物および／または核酸セグメントを、皮下、眼内、硝子体内、非経口、皮下、静脈内、脳室内、筋肉内、髄腔内、経口、腹腔内に、経口または経鼻吸入により、または直接注射により、１つ以上の細胞、組織、または器官へ送達することが望ましい。

【0268】

注射可能な使用に適した組成物の剤形には、滅菌水溶液または分散液が含まれる。いくつかの態様において、形態は、容易な注射可能性が存在する程度まで滅菌および流動性である。いくつかの態様において、形態は、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。担体は、例えば水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。

【0269】

本開示の医薬組成物は、処置される対象に標準的な経路によって投与することができ、これには、限定はされないが以下が含まれる：肺、鼻腔内、経口、吸入、非経口例えば、静脈内、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋肉内、関節包内、眼窩内、硝子体内、心臓内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射。

【0270】

注射可能な水溶液の投与のために、例えば、溶液は必要に応じて適切に緩衝され得、および液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能な滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。例えば、１回の投薬量を１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの皮下注射液に加えるか、提案された注入部位に注射することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。投薬量のいくらかの変動は、処置される対象の状態に応じて必然的に発生する。いずれにせよ、投与の責任者は、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は、無菌性、発熱性、および例えばFDA Office of Biologicsの基準などで要求される一般的な安全性および純度の基準を満たす必要がある。

【0271】

滅菌の注射可能溶液は、ｒＡＡＶ粒子または調製物および／または核酸セグメントを、必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他のいくつかの成分と共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌の注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これにより、有効成分に加えて以前に滅菌濾過されたその溶液から任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

【0272】

ｒＡＡＶ粒子または調製物で形質導入された細胞のex vivo送達もまた、本明細書で企図される。ex vivo遺伝子送達を使用して、ｒＡＡＶで形質導入された宿主細胞を宿主に移植して戻すことができる。適切なex vivoプロトコルは、いくつかのステップを含み得る。例えば、標的組織のセグメントまたは標的流体のアリコートを宿主から採取することができ、ｒＡＡＶ粒子または調製物を使用して、核酸セグメントを、組織または流体中の宿主細胞に形質導入することができる。次に、これらの遺伝子改変細胞を、宿主に移植して戻すことができる。いくつかのアプローチを、細胞の宿主への再導入に使用することができ、これには静脈内注射、腹腔内注射、または標的組織へのin situ注射が含まれる。自家および同種異系細胞移植を、本発明に従って使用することができる。

【0273】

ｒＡＡＶ粒子もしくは調製物または核酸セグメントの組成物の量、およびかかる組成物の投与時間は、本教示の利益を有する当業者の範囲内である。しかしながら、開示された組成物の治療有効量の投与は、単回投与によって、例えば、かかる処置を受けている患者に治療上の利益を提供するのに十分な数の感染性粒子の単回注射などによって、達成され得る。代替的に、いくつかの状況では、かかる組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、ｒＡＡＶ粒子もしくは調製物または核酸セグメントの組成物の複数回または連続的な投与を、比較的短い期間または比較的長い期間のいずれかで提供することが望ましい場合があり得る。

【0274】

組成物は、ｒＡＡＶ粒子もしくは調製物または核酸セグメントを、単独で、または天然もしくは組換え源から得られるかまたは化学的に合成され得る１つ以上の追加の活性成分と組み合わせて、含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子または調製物は、同じ組成物で、または同じ処置計画の一部として、ボルテゾミブまたはヒドロキシ尿素などのプロテアソーム阻害剤と組み合わせて投与される。

【0275】

他の側面において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の融合タンパク質の、それを必要とする対象への投与を含む、処置方法である。ある態様において、処置方法は、本明細書に記載の医薬組成物、ｒＡＡＶ粒子、またはナノ粒子を投与することを含む。

【0276】

本明細書で使用される用語としての、疾患を「処置する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の、頻度または重症度を低減することを意味する。上記の組成物は、典型的には、有効量、すなわち、望ましい結果を生み出すことができる量で、対象に投与される。望ましい結果は、投与される活性剤に依存する。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、異種核酸を宿主器官、組織、または細胞に移すことができる粒子の量であり得る。

【0277】

ある態様において、本明細書に提供されるのは、疾患、障害、または状態を有するか、または発症するリスクのある対象を処置するための、本明細書に記載の融合タンパク質を対象に投与することを含む、方法である。特定の態様において、投与される融合タンパク質は、多量体融合タンパク質である。他の態様において、疾患、障害、または状態を有するか、または発症するリスクのある対象の処置方法は、本明細書に記載の１つ以上の医薬組成物、ナノ粒子、またはｒＡＡＶ粒子を投与することを含む。

【0278】

いくつかの態様において、対象は、疾患、障害、または状態があると診断されている。いくつかの態様において、対象は、アミロイド関連の疾患または障害と診断されている。特定の態様において、アミロイド関連疾患または障害は、アルツハイマー病または別の神経変性疾患である。他の態様において、疾患、障害または状態は、がんまたは自己免疫疾患である。

【0279】

本開示の方法で利用される組成物の毒性および有効性は、標準的な薬学的手順により決定することができ、培養中の細胞または実験動物のいずれかを使用してＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死量）を決定する。毒性と有効性の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。有毒な副作用を示すものを使用することもできるが、かかる副作用の潜在的な損傷を最小限に抑える送達システムを設計するように、注意する必要がある。本明細書に記載の組成物の投薬量は、一般に、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ_５０を含む範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。

【0280】

診断方法およびキット
いくつかの側面において、本開示は、分析物を検出するための診断方法およびキットを提供する。いくつかの態様において、細胞、組織または器官中の分析物の濃度を決定するための方法が提供され、これは以下を含む：対象の細胞、組織または器官に、本明細書に記載の多量体融合タンパク質の１つを投与すること、および分析物の濃度を測定すること；ここで多量体融合タンパク質は、分析物に対して結合親和性を有する。他の態様において、細胞、組織または器官における分析物またはリガンドの濃度を決定するための方法は、本明細書に記載の医薬組成物またはナノ粒子を投与することを含む。ある態様において、開示された診断方法の融合タンパク質は、２つ以上の分析物を結合することができる。これらの方法およびキットは、融合タンパク質と目的の分析物の間の結合親和性を測定するための任意の既知の方法またはこれを測定するための手段を利用することができ、これには例えば、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使用）が含まれる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ－Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤Ｐ２０）中であり得る。

【0281】

いくつかの態様において、開示された方法における細胞は、哺乳動物対象から誘導または単離された哺乳動物細胞である。哺乳動物の対象は、アルツハイマー病などの疾患または障害と診断されているか、またはそれらに罹患している可能性がある。いくつかの態様において、開示された方法は、哺乳動物対象の処置（例えば、処置計画）を、診断アッセイの結果（例えば、分析物の濃度）を考慮して調整することをさらに含み得る。

【0282】

他の側面において、本開示は、分析物を検出するための、精製された多量体融合タンパク質および１つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤を含み得る送達用のビヒクルを含む、キットを提供する。ある態様において、キットは、１つ以上の多量体融合タンパク質を含むナノ粒子を含む。ある態様において、開示されたキットの融合タンパク質は、２つ以上の分析物を結合することができる。キットは、哺乳動物細胞を哺乳動物対象から単離するための手段、および／または分析物を細胞から単離するための手段を含み得る。開示された任意のキットは、融合タンパク質と分析物（analyst）との間の結合親和性を測定するための、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、および分光法から選択される手段を含み得る。

【0283】

特定の態様において、本明細書に記載の融合タンパク質のリガンドに対する結合親和性を検出するための、方法およびキットが提供される。特定の態様において、これらの方法は、以下を含む：多量体融合タンパク質をリガンドとインキュベートすること；ここで、融合タンパク質の各単量体は、少なくとも１０個のＧ－Ｘ－Ｙ反復を含むＣＣＤを含み；ここで、Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸、およびＹは任意のアミノ酸であり、ここでＧ－Ｘ－Ｙ反復の少なくとも１０個はＧ－Ｐ－ＰまたはＧ－Ｐ－Ｏであり、ここでＧ－Ｘ－Ｙ反復の少なくとも６個はＧ－Ｐ－Ｏであり、およびここでＰはプロリンであり、Ｏはヒドロキシプロリンであり；および、抗体ドメインを含み；ここで、各１つの単量体のヒドロキシプロリン化コラーゲン様ドメインは互いに相互作用して、少なくとも１０^７Ｍ^－１のアビディティでリガンドに結合する多量体タンパク質を形成し；および、多量体タンパク質の、リガンドへの結合を検出すること。

【0284】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子およびゲノム
本開示の側面は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子またはかかる粒子の調製物であって、異種ペプチドをコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを様々な組織、器官、および／または細胞に送達するための、前記粒子または調製物に関する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のように宿主細胞に送達される。

【0285】

野生型ＡＡＶゲノムは、正または負いずれかのセンスの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）である。ゲノムは、以下を含む：２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）をＤＮＡ鎖の両端に１つずつ、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ＩＴＲ間のｒｅｐとｃａｐ、および、ＩＴＲ間に配置され、任意に導入遺伝子を含むインサート核酸。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶライフサイクルに必要なＲｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦは、カプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする重複遺伝子を含み、これは相互作用してウイルスカプシドを形成する。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３は１つのｍＲＮＡ転写物から翻訳され、２つの異なる方法でスプライシングされ得る：長いまたは短いイントロンを切除して、ｍＲＮＡの２つのアイソフォーム（～２．３ｋｂおよび～２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡアイソフォーム）を形成することができる。カプシドは、約６０個の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子集合体を、ＡＡＶゲノムを保護可能なエンベロープなしのＴ－１二十面体格子中に形成する。成熟したカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３（それぞれ分子量が約８７、７３、および６２ｋＤａ）が約１：１：１０の比率で構成される。

【0286】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子は、核酸セグメントを含み得、これは、少なくとも以下を含み得る：（ａ）異種ペプチドまたは目的のＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）をコードする配列を含む１つ以上の導入遺伝子、および（ｂ）１つ以上の異種核酸領域（例えば、トランスジーン）に隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、改変されたＩＴＲ配列）を含む１つ以上の領域。いくつかの態様において、核酸セグメントは、サイズが４ｋｂから５ｋｂの間である（例えば、４．２～４．７ｋｂのサイズ）。本明細書に記載の任意の核酸セグメントは、ＡＡＶ２カプシドまたは別の血清型（例えば、ＩＴＲ配列と同じ血清型である血清型）などのウイルスカプシドによってカプシド化され得、これは、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を含み得る。特定の態様において、カプシドは、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／１血清型である。

【0287】

いくつかの態様において、核酸セグメントは環状である。いくつかの態様において、核酸セグメントは一本鎖である。いくつかの態様において、核酸セグメントは二本鎖である。いくつかの態様において、二本鎖核酸セグメントは、例えば、核酸セグメントの別の領域に相補的である核酸セグメントの領域を含有して核酸セグメントの二本鎖の形成を開始する、自己相補的ベクターであり得る。

【0288】

したがって、いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子またはかかる粒子を含有するｒＡＡＶ調製物は、ウイルスカプシドおよび、ウイルスカプシドによってカプシド化される本明細書に記載の核酸セグメントを含む。いくつかの態様において、核酸セグメントの挿入核酸は、以下を含む：（１）異種ペプチドをコードする配列を含む１つ以上の導入遺伝子、（２）導入遺伝子の発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域（例えば、プロモーター）、および（３）導入遺伝子の、対象のゲノムへの組み込みを促進する配列を含む１つ以上の核酸領域（任意選択で、発現を促進する配列を含む１つ以上の核酸領域を伴う）。ある態様において、挿入核酸のプロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0289】

いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびベクターは、ＩＴＲ配列を含む。いくつかの態様において、コード配列および関連するプロモーターは、ｒＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。本明細書に記載のポリヌクレオチドのＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来するか、または２種以上の血清型に由来することができる。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来する。いくつかの態様において、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来する。他の態様において、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０に由来する。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、カプシドと同じ血清型である（例えば、ＡＡＶ３ ＩＴＲ配列およびＡＡＶ３カプシドなど）。

【0290】

ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは当技術分野で知られており、市販されている（例えば以下を参照：Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な製品およびサービス；ならびにGene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein. Kessler PD, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida, Methods in Molecular Medicine（商標）. Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols. 10.1385/1-59259-304-6:201 Humana Press Inc. 2003: Chapter 10, Targeted Integration by Adeno-Associated Virus. Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni Cathomen and Richard Jude Samulski；米国特許第5,139,941 号および5,962,313号。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。

【0291】

いくつかの態様において、核酸セグメントは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有するプラスミドである、ｐＴＲ－ＵＦ－１１プラスミド骨格を含む。このプラスミドは、American Type Culture Collection（ATCC MBA-331）から市販されている。

【0292】

核酸セグメント（本明細書で企図される任意の形態）を含むｒＡＡＶ粒子は、組成物の形態で、例えばｒＡＡＶ粒子などの活性成分、核酸セグメント（本明細書で企図される任意の形態）、および治療的または薬学的に許容し得る担体を含む組成物の形態で、送達することができる。ｒＡＡＶ粒子または核酸セグメントは、様々な組成物中に調製することができ、および、ヒトまたは動物の対象に投与するための適切な医薬ビヒクル中に製剤化することができる。

【0293】

本開示の他の側面は、細胞を、本明細書に記載の方法によって生成されたｒＡＡＶ調製物と接触させることを含む、方法に関する。接触することは、例えば、ex vivoまたはin vivoで、ｒＡＡＶ調製物を対象に投与することによってであり得る。ｒＡＡＶ粒子または調製物は、組成物の形態で、例えば本明細書に記載のｒＡＡＶ粒子または調製物などの有効成分、および治療的または薬学的に許容し得る賦形剤を含む組成物などで、送達することができる。ｒＡＡＶ粒子または調製物は、様々な組成物中に調製することができ、および、ヒトまたは動物の対象に投与するための適切な医薬ビヒクル中に製剤化することができる。

【0294】

異種ペプチドの適切なまたは増強された発現レベルを達成するために、選択された宿主細胞での使用に適したいくつかの異種プロモーターのいずれかを使用することができる。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターであり得る。

【0295】

誘導性プロモーターおよび／または調節要素もまた、異種ペプチドの適切な発現レベルを達成するために企図され得る。適切な誘導性プロモーターの非限定的な例には、ＣＢＡプロモーター、ならびに遺伝子からのプロモーター、例えばチトクロームＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびホルモン誘導性遺伝子からのプロモーター、例えばエストロゲン遺伝子プロモーターなどが含まれる。

【0296】

組織特異的プロモーターおよび／または調節要素もまた、本明細書で企図される。ある態様において、開示された融合タンパク質の異種プロモーターは、ヒト脳細胞（例えば、ヒトニューロンおよびグリア）などの脳細胞において活性である。ヒト脳細胞で活性な例示的なプロモーターには、限定はされないが、ヒトシナプシン１遺伝子プロモーター（ＳＹＮ）、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）プロモーター、および血小板由来成長因子β鎖プロモーター（１５００ｂｐ）が含まれる。これらのプロモーターは、例えば、Kugler et al. Virology, 311(1):89-95 (2003)およびMorelli et al. J Gen Virol., 80(Pt 3):571-83 (1999)に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。使用し得るかかるプロモーターの非限定的な例には、ヒト特異的プロモーターなどの種特異的プロモーターが含まれる。

【0297】

合成プロモーターもまた本明細書で企図される。合成プロモーターは、例えば、既知のプロモーター、調節要素、転写因子結合部位、エンハンサー要素、リプレッサー要素などの領域を含み得る。

【0298】

ｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ調製物内の粒子は任意のＡＡＶ血清型であり得て、これには、任意の誘導体またはシュードタイプ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／６、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８、または３／９）が含まれる。本明細書で使用する場合、ｒＡＡＶウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の血清型とは、組換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ２ではない。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ８ではない。誘導体およびシュードタイプの非限定的な例には、以下が含まれる：ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／６、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ→Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶｒ３．４５。これらのＡＡＶ血清型および誘導体／シュードタイプ、ならびにかかる誘導体／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708). The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子はシュードタイプｒＡＡＶ粒子であり、以下を含む：（ａ）１つの血清型（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３）からのＩＴＲを含む核酸セグメント、および（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０）に由来するカプシドタンパク質から構成されるカプシド。シュードタイプｒＡＡＶベクターを生成および使用するための方法は、当技術分野で知られている（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001；Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000；Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002；およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照のこと）。

【0299】

本明細書に開示されたｒＡＡＶカプシドの追加の血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６を含むカプシド、ならびにＡＡＶ２およびＡＡＶ６に由来するカプシドが含まれる。さらに、かかるカプシドには、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈ１０Ｙ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ７ＢＰ２、ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔおよびＡＡＶ２Ｇ９が含まれる。

【0300】

ＡＡＶ－ＤＪカプシドは、Grimm et al., J. Virol., 2008, 5887-5911およびKatada et al., (2019) Evaluation of AAV-DJ vector for retinal gene therapy, PeerJ 7:e6317に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ－ＤＪは、７個のアミノ酸の、ＡＡＶ２カプシドのＨＳＰＧ結合ドメインへの挿入を含み、ミュラー細胞において硝子体内注射後に高い発現効率を示す。ＡＡＶ－ＤＪと密接に関連するＡＡＶ７ｍ８カプシドは、Dalkara et al. Sci Transl Med. 2013; 5(189):189ra76に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0301】

ＡＡＶ２／２－ＭＡＸカプシドは、Reid, Ertel & Lipinski, Improvement of Photoreceptor Targeting via Intravitreal Delivery in Mouse and Human Retina Using Combinatory rAAV2 Capsid Mutant Vectors, Invest. Ophthalmol Vis Sci. 2017; 58:6429-6439に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ２／２－ＭＡＸカプシドは、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｔ４９１Ｖの５個の点変異を含む。ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）カプシドは、Boye et al., Impact of Heparan Sulfate Binding on Transduction of Retina by Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors, J. Virol. 90:4215-4231 (2016)に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0302】

両方ともＡＡＶ６の誘導体であるＡＡＶＳＨｈ１０およびＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）カプシドは、Klimczak et al. (2009) A Novel Adeno-Associated Viral Variant for Efficient and Selective Intravitreal Transduction of Rat Muller Cells. PLoS ONE 4(10): e746に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ（ＡＡＶ６（ＴＭ６）およびＡＡＶ６（Ｙ７０５＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）としても知られる）カプシドは、Rosario et al., Microglia-specific targeting by novel capsid-modified AAV6 vectors, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 13;3:16026および国際特許公開第2016/126857号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

【0303】

開示されたｒＡＡＶ粒子での使用に適した追加のカプシドには、以下が含まれる：野生型ＡＡＶ２カプシドのアミノ酸残基での非ネイティブアミノ酸置換を含むカプシドであって、ここで非ネイティブアミノ酸置換は、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４ＦおよびＹ７３０Ｆの１つ以上を含む；野生型ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸残基での非ネイティブアミノ酸置換を含むカプシドであって、ここで、非ネイティブアミノ酸置換は、Ｙ４４５Ｆ、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、Ｔ４９２ＶおよびＳ６６３Ｖの１つ以上を含む。

【0304】

生成方法
ｒＡＡＶ粒子および核酸セグメントを生成する方法が、本明細書に記載される。他の方法も当技術分野で知られており、市販されている（例えば、以下を参照：Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158－167；および米国特許番号US 2007/0015238およびUS 2012/0322861（これらは参照により本明細書に組み込まれる）、ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキット）。例えば、核酸セグメントを含有するプラスミドは、１つ以上のヘルパープラスミドと、例えばｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするもの）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、および本明細書に記載の改変されたＶＰ３領域を含むＶＰ３をコードするもの）を含有するものと組み合わせて、プロデューサー細胞株にトランスフェクトし、こうしてｒＡＡＶ粒子をパッケージ化し続いて精製することが可能である。

【0305】

いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミドと、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドとを含む。いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ６に由来し、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を生成するための遺伝子への改変を含み得る。いくつかの態様において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２に由来し、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を生成するための遺伝子への改変を含み得る。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作る方法は、当技術分野で知られており、市販されている（例えば、PlasmidFactory, Bielefeld, GermanyからのｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；他の製品およびサービスは以下から利用可能である：Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MA；pxx6；Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760；Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.；Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850；Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188)。

【0306】

次に、例示的非限定的なｒＡＡＶ粒子の生成方法について説明する。１つ以上のヘルパープラスミドが生成または取得され、これは、所望のＡＡＶ血清型のｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦおよびそのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルス性ＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、第１の血清型（例えば、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ６）のｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子（第１の血清型であってもなくてもよい）、および任意に、そのネイティブプロモーターの転写制御下にある１つ以上のアデノウイルス性ＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。いくつかの態様において、１つ以上のヘルパープラスミドは、所望のＡＡＶ血清型のｃａｐ ＯＲＦ（および任意にｒｅｐ ＯＲＦ）、およびそのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルス性ＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦはまた、本明細書に記載の改変カプシドタンパク質を生成するための、１つ以上の改変を含み得る。ＨＥＫ２９３細胞（ATCC（登録商標）から入手可能）は、ＣａＰＯ_４媒介性トランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの高分子を介して、ヘルパープラスミドおよび本明細書に記載の核酸セグメントを含有するプラスミドでトランスフェクトされる。ＨＥＫ２９３細胞を次に少なくとも６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする。代替的に、別の例では、Ｓｆ９ベースのプロデューサー安定細胞株を、核酸セグメントを含有する単一の組換えバキュロウイルスに感染させる。さらなる代替として、別の例では、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸セグメントを含有するＨＳＶ、および任意に、本明細書に記載のｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦ、ならびにそのネイティブプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルス性ＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含有する1つ以上のＨＳＶに感染させる。次に、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞を少なくとも６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする。次に、ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られているかまたは本明細書に記載の任意の方法を使用して精製することができ、方法は例えば、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿による。

【0307】

宿主細胞
本開示はまた、本明細書に記載の開示されたｒＡＡＶ粒子または核酸セグメントの少なくとも１つを含む、宿主細胞も企図する。かかる宿主細胞は哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好ましく、細胞または組織培養において単離され得る。遺伝子改変された動物モデル（例えば、マウス）の場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物自体の体内に含まれ得る。

【0308】

本開示はまた、開示されたｒＡＡＶ粒子または核酸セグメントの少なくとも１つを含む、宿主細胞も企図する。かかる宿主細胞は哺乳動物宿主細胞を含み、ヒト宿主細胞が好ましく、細胞または組織培養において単離され得る。遺伝子改変された動物モデル（例えば、マウス）の場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物自体の体内に含まれ得る。いくつかの態様において、宿主細胞はがん細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、肝臓がん細胞などの肝細胞である。ある態様において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞である。

【0309】

いくつかの態様において、本明細書に記載の宿主細胞は、本明細書に記載の対象に由来する。宿主細胞は、当技術分野で知られている任意の方法を使用して、例えば、細胞を対象の体液または組織から単離することによって、得ることができる。いくつかの態様において、宿主細胞は培養される。細胞を単離および培養するための方法は、当技術分野でよく知られている。

【0310】

ｒＡＡＶ以外の送達方法
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載のＣＣＤ融合タンパク質などの１つ以上の精製タンパク質、またはこれらの融合タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターを、対象または宿主細胞または組織に送達する方法を提供する。いくつかの態様において、提供される送達方法は、ナノ粒子送達、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリステック法、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたはカチオン性脂質抱合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および剤で増強されたＤＮＡ取り込みを含む。

【0311】

ポリヌクレオチドおよび発現ベクターの例示的な送達方法には、カチオン性ポリマー：ＤＮＡ複合体（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用）、リポフェクション、ヌクレオフェクション、エレクトポレーション、安定したゲノム統合（例えば、ピギーバック）、マイクロインジェクション、バイオリステック法、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸抱合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および剤で増強されたＤＮＡの取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、第4,946,787号；および第4,897,355号に記載され、およびリポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）、Lipofectin（商標）およびSF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit（商標）（Lonza））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質には、Feigner、WO1991/17424およびWO1991/16024のものが含まれる。送達は、細胞へ（例えば、in vitroまたはex vivo投与）または標的組織へ（例えば、in vivo投与）であり得る。

【0312】

精製された融合タンパク質の例示的な送達方法には、カチオン性脂質：ペプチド抱合体などのナノ粒子および脂質粒子が含まれる。例示的なナノ粒子は、タンパク質ベースまたはポリマーベースであり得、当技術分野で知られている。

【0313】

対象
本開示の側面は、対象に使用するための方法および調製物に関し、例えばヒトまたは非ヒト霊長類対象、対象におけるin situの宿主細胞、または対象に由来する宿主細胞などである。非ヒト霊長類対象の非限定的な例には、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、フクロウザル、ベルベットモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンが含まれる。いくつかの態様において、対象はヒト対象である。他の例示的な対象には、以下が含まれる：イヌおよびネコなどの飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ヒニワトリなどの家畜；マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物。

【0314】

いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療で処置され得る疾患を有するか、または有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、異常ヘモグロビン症を有するか、または有する疑いがある。異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビン分子の１つ以上のグロビン鎖の異常な構造をもたらす、ゲノムの１つ以上の変異を特徴とする疾患である。例示的な異常ヘモグロビン症には、溶血性貧血、鎌状赤血球症、およびサラセミアが含まれる。鎌状赤血球症は、異常な鎌状赤血球ヘモグロビンの存在を特徴とし、重度の感染症、重度の痛み、脳卒中、および死亡リスクの増加をもたらす可能性がある。鎌状赤血球症を有する対象は、例えば、全血球計算、血液塗抹標本、ヘモグロビン電気泳動、および遺伝子検査のうちの１つ以上を使用して特定することができる。サラセミアは、生成されるヘモグロビンの量の減少を特徴とする常染色体劣性疾患のグループである。症状には、鉄過剰症、感染症、骨変形、脾臓の肥大、および心臓病などがある。サラセミアのサブグループには、アルファサラセミア、ベータサラセミア、およびデルタサラセミアが含まれる。サラセミアを有する対象は、例えば、全血球計算、ヘモグロビン電気泳動、Ｆｅ結合能、尿ウロビリンおよびウロビリノーゲン、末梢血塗抹標本、ヘマトクリット、および遺伝子検査の１つ以上を使用して特定することができる。

【0315】

いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療で処置され得る疾患を有するか、または有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、がんなどの増殖性疾患を有するか、または有する疑いがある。本明細書で使用する「がん」という用語は、異常な細胞の急速で制御されていない増殖を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流やリンパ系を介して体の他の部分に広がることができる。様々ながんの例には、限定はされないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが含まれる。いくつかの態様において、がんは肝臓がんである。例示的な肝臓がんには、限定はされないが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、胆管癌、血管肉腫、および肝芽腫が含まれる。がんを有する対象は、熟練した医師により、当技術分野で知られている方法、例えば、生検、細胞診、組織学、内視鏡検査、Ｘ線、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波、ＣＡＴスキャン（コンピュータ断層撮影）、遺伝子検査、および血液または尿中の腫瘍抗原の検出のための検査を含む方法を使用して、識別され得る。

【0316】

さらなる詳細なしに、当業者は上記の説明に基づき、本開示を最大限に利用することができると考えられる。したがって以下の具体的な態様は単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために、参照により組み込まれる。

【0317】

例
例１：ＣＣＤドメインは融合タンパク質の分泌を劇的に増加させる
多量体融合実験に最適なＣ１ＱＴＮＦファミリーメンバーを同定するために、Ｃ１ＱＴＮＦタンパク質の２つのアイソタイプ、すなわちＣ１ＱＴＮＦ３およびＣ１ＱＴＮＦ５に由来するＣＣＤドメインを試験した。これら２つのタンパク質からのＣＣＤを、可溶性Ｌａｇ３に融合させた。結果は、両方のＣＣＤがｓＬａｇ３の分泌を増加させたが（中央のパネル）、Ｃ１ＱＴＮＦ３からのＣＣＤは、ｓＬａｇ３の多量体化（右のパネル）を増加させるはるかに高い効力を有することを示した。結果を図２２に示す。

【0318】

多くのデコイペプチドは切断型ポリペプチドを含み、in vivoでペプチダーゼによりしばしば攻撃される；したがって、哺乳類の過剰発現系における使用の間、それらはしばしば低収量にさらされる。細胞外（可溶性）および細胞内ペプチドを含むデコイ異種ペプチドとの様々なＣＣＤ融合をコードするプラスミドを、細胞内での過剰発現を改善してこの欠陥を克服するために設計した。これらのペプチドには、可溶性Ｌａｇ３、可溶性ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＮＯＴＣＨ１、ＤＬＬ３、およびＡβ９ｓｃＦｖが含まれる（図２を参照）。これらのプラスミドはさらに、その後のウエスタンブロッティング実験を容易にするためのＦＬＡＧタグを含んでいた。

【0319】

これらのペプチドの過剰発現および分泌レベルに対する、ＣＣＤドメインとの融合の効果を評価するために、ＣＣＤ融合タンパク質をコードするプラスミドおよび異種ペプチドのみをコードするプラスミドを、ｒＡＡＶ粒子にカプセル化し、次にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを使用して一過性にトランスフェクトした。ＰＥＩはよく知られているカチオン性ポリマーである。

【0320】

トランスフェクションの１６時間後、細胞培地を、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を供給した新鮮なダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）と交換した。細胞および培地を２４時間後に回収した。細胞を氷冷ＰＢＳ（１％のTriton-100）で溶解した。細胞破片は、１０分間の１８０００ｇの遠心分離により培地から分離した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、細胞溶解物および培地に対して還元剤の不在下で実施した。

【0321】

ウエスタンブロットを展開し、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で図２に示すように画像化した（ＣＣＤ融合物は「［ペプチド］＿コラーゲン」と示す）。過剰発現レベル（細胞溶解物ブロットに見られる）および分泌レベル（培地ブロット）の両方が、ペプチド単独と比較して、ＣＣＤ融合タンパク質で劇的に増加した。ある場合には、ペプチドの発現は、ＣＣＤなしで発現させた場合の検出不可能なレベル（細胞溶解物および／または培地ブロット）から、ＣＣＤを使用した場合（ｓＰＤ－１、ＤＬＬ３およびＮＯＴＣＨ１など）の非常に高いレベルに改善した。

【0322】

可能性のある２つの原因が、発現および分泌レベルの増加について仮定されている。何よりも、in vivoでのＣＣＤ融合タンパク質の多量体化は、細胞内異種ペプチドをエンドペプチダーゼによる攻撃から保護する可能性がある。また、ＣＣＤドメインは、細胞外異種ペプチドを、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダーゼによるタンパク質分解攻撃から保護する可能性があり、これらの作用機序は、ＣＣＤが配置された異種ペプチドの末端に依存する。例えば、ｓＤＬＬ３は細胞溶解物のブロットでは観察されなかったが、ｓＤＬＬ３－ＣＣＤは同じ条件で明確に検出された。このＣＣＤ融合タンパク質の分泌レベルは比較的低かったが、ｓＤＬＬ３－ＣＣＤが驚くべきことに細胞表面に局在していることが確認された。そのリガンドは主に膜タンパク質であるため、細胞表面の局在化がこのペプチドの機能に影響を与える可能性は低い。

【0323】

様々な追加のＣＣＤ融合タンパク質の発現および分泌レベルを、ａ）マウスおよびヒト細胞へのｒＡＡＶ投与、またはｂ）細胞の精製タンパク質とのインキュベーション、の後に分析した。細胞溶解物および培地におけるウエスタンブロットの結果を、図１１～１８に示す。

【0324】

例として、図１３のウエスタンブロットに示されるように、ＣＣＤの様々な融合タンパク質および可溶性Ｔｏｌｌ様受容体の過剰発現および分泌が、ヒトおよびマウス組織の両方において、ｓＴＬＲ－ＣＣＤ融合構築物を発現するｒＡＡＶベクターの投与後に達成された。ＣＣＤがｓＴＬＲ５のＮ末端またはＣ末端に配置されており、ここで細胞がトランスフェクションの４８時間後に回収された場合の、過剰発現および分泌を、ブロットで比較する。図１４のウエスタンブロットは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｒＡＡＶ媒介性投与が、Ｉｃｏｓリガンドを含む培地の存在下または不在下において、Ｉｃｏｓ－ＣＣＤ融合タンパク質の過剰発現を誘導したことを示す。図１１および１２は、それぞれ、ヒト由来とマウス由来の免疫チェックポイントタンパク質、および細胞シグナル伝達異種ペプチドの、ＣＣＤ抱合体をコードするｒＡＡＶベクターを用いた同様の実験後に生成された、ウエスタンブロットを示す。図１５Ａ～１５Ｃのウエスタンブロットが示すように、ｓＬａｇ３、ＮＯＴＣＨ１、ＨＨＩＰ、ＶＥＧＦＲ１、Ｔｇｆｂｒ２、ＰＤ－１、ＨＡＶＣＲ２、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ、ＳＦＲＰ１またはＥＧＦＲペプチドを含むＣＣＤ融合タンパク質構築物は、精製された融合タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔおよびマウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞とインキュベートし続いて溶解および分離した後に、細胞表面に結合する。

【0325】

例２：ＣＣＤ融合タンパク質は多量体である
デコイタンパク質を評価するための重要なパラメータは、そのリガンド結合親和性である。アビディティは、デコイタンパク質または抗体の総結合強度を測定する。デコイまたは抗体のアビディティを高めるための効果的な方法の１つは、多価性の工学（multivalence engineering）によるものである。上記のように、ネイティブなコラーゲンは通常、グリシン反復ドメインの会合を通して三量体を形成する。ＣＣＤ融合タンパク質の多量体化は、異種ペプチドのアビディティを増強し得る。

【0326】

ＣＣＤ融合タンパク質のin vivoでの（例えば三量体への）多量体化が、細胞内異種ペプチドをエンドペプチダーゼによる攻撃から保護し得るとの仮説を試験するために、ｓＬａｇ３－ＣＣＤ＿ＦＬＡＧをコードするｒＡＡＶ核酸ベクターを、上記のようにＰＥＩトランスフェクションによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞で過剰発現させた。馴化（または使用済み）細胞培地を収集した。（馴化培地は分泌されたＣＣＤ融合タンパク質を含有する。）適切な量に濃縮した後、培地を、AKTA（登録商標）Prime FPLC system（GE）に接続されたＰＢＳで事前に平衡化したサイズ排除カラム（Superose（登録商標）6 10/300 GL, GE, USA）に負荷した。０．３ｍｌの溶出液を各画分について収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、還元剤の不在下で実施した。

【0327】

ウエスタンブロットを展開し、図２に示すように抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体で画像化した。図３の左パネルに見られるように、単量体融合タンパク質よりも高濃度の多量体ＣＣＤ融合タンパク質が発現された。融合タンパク質の六量体（溶出画分２～７の上端のバンド）、四量体（画分６～１３の約２５０ｋＤａに対応するバンド）、三量体（画分９～１７の１５０～２５０ｋＤａの間のバンド）、二量体（画分１１～２０の１００～１５０ｋＤａの間のバンド）、および単量体（画分９～１７の５０～７５０ｋＤａの間のバンド）が、順次溶出された。ＣＣＤ融合三量体の推定構造を示す概略図を、図１に示す。

【0328】

この実験からのいくつかの０．３ｍｌの溶出画分（画分番号５、８、１１、１６および２０）を、次の様々な温度および還元条件に供した：室温（ＲＴ）または１００℃での保管；および還元剤β－メルカプトエタノール（β－ＭＥ）の存在下および不在下。β－メルカプトエタノールは、ジスルフィド結合を切断する。画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。より広い範囲の単量体から六量体のタンパク質を、図３の左パネルよりも図３の右パネルに見出すことができる。ｓＬａｇ３－ＣＣＤのオリゴマーは耐熱性であった。還元剤および熱での処理により、オリゴマーの解離がもたらされた。

【0329】

これらの結果は、ｓＬａｇ３－ＣＣＤが多量体を効率的に形成し、多量体がジスルフィド結合を介して安定化されることを示唆する。

【0330】

例３：ＣＣＤ融合タンパク質は長期の安定性を有し、マウスで効率的に発現させ得る
ｓＢ７Ｈ３－ＣＣＤ融合タンパク質単量体の安定性を、室温および４℃で最大１ヶ月間保管した後に試験した。ｓＢ７Ｈ３－ＣＣＤは、このタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターの送達によって細胞内で発現された。細胞を溶解し、タンパク質を単離してアリコートに分けた。馴化培地から精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色に使用して、タンパク質の安定性を視覚化した。

【0331】

タンパク質試料を、安定性分析の前に－８０℃でアリコートし、次いで１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢＳに懸濁した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を保管の前後で比較して、分解物の存在を示すタンパク質バンドが現れたかどうかを決定した。

【0332】

図４に示すように、室温で２週間保管した後、または４℃で３０日間保管した後に、ブロット画像に有意な変化は観察されず、これは、分解物がないことを示す。この結果は、ＣＣＤ融合タンパク質が長い貯蔵寿命を有し得ることを示唆する。

【0333】

例示的なＣＣＤ融合タンパク質がin vivoで効率的に送達および発現され得るかどうかを試験するために、抗アミロイドβ５抗体フラグメント（Ａβ５ ｓｃＦｖ）ＣＣＤ融合タンパク質をコードするベクターを含むｒＡＡＶ粒子を合成した。ｒＡＡＶ粒子をマウスに注射した。注射の２週間後、マウスを犠牲にし、ｓｃＦｖ－ＣＣＤタンパク質をマウス脳の免疫染色で検出した。

【0334】

図５に示すように、Ａβ５ ｓｃＦｖ－ＣＣＤ融合タンパク質は、非常に高いレベルで過剰発現された（より暗い領域）。結果は、ＣＣＤ融合タンパク質が動物モデルで効率的に過剰発現され得ることを示唆する。

【0335】

例４：ＣＣＤ融合タンパク質は生物学的に活性である
究極の目標は、遺伝子送達後に過剰発現することができる活性な異種ペプチドを、例えばｒＡＡＶ媒介の遺伝子送達を介して生成することである。ＣＣＤ融合戦略は標的タンパク質の発現および分泌レベルを増加させたが、ＣＣＤドメインが異種ペプチドの構造および活性を妨害し得るかどうかは、まだ理解されていなかった。したがって、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤ融合タンパク質を構築し、細胞で発現させ、次いで単離および精製した。このタンパク質の結合親和性を、in vitro結合で直接的に、および細胞代謝活性アッセイによって間接的に試験した。

【0336】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して、ＦＧＦＲ１の結合動態（kinetics）を、２つのリガンド、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦで測定した。ヌルＦＧＦＲ１リガンドである血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）を、対照として使用した。ＳＰＲ実験では、可溶性相の分子（融合タンパク質のペプチドなど）の、センサー表面に固定化されたリガンド分子への結合は、バイオセンサーデバイスで反射光信号（ＳＰＲ信号）として直接測定される。センサーデバイスは、ＬＥＤ発光近赤外光、センサーマイクロチップに固定されたガラスプリズム、および位置感知ダイオードアレイ検出器を含み得る。結合事象は表面層の屈折率の変化を引き起こし、これは、ＳＰＲ信号の変化として検出される。具体的には、入射ＬＥＤ光が、屈折率の異なる２つの媒体（ガラスプリズムと溶液）間の金属被覆界面から完全に内部反射されると、信号が発生する。入射光がウェッジの表面に集束すると、共鳴角での強度の低下が反射光ウェッジの「影」として現れ、検出器によって検出される。固定化されたリガンドと溶液中のペプチドの相互作用が起きると、「影」が検出器上でシフトし、すなわち共鳴角が変化する。

【0337】

ＦＧＦＲ１－ＣＣＤを用いたＳＰＲ実験からのセンサーグラムを、図２１Ａに示す。このセンサーグラムは２つの相で構成される：（左）会合相では、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤが表面に固定化されたリガンドに注入された。ＦＧＦＲ１－ＣＣＤとリガンドの相互作用が増加すると、ＳＰＲ応答の増加が検出される［応答単位（ＲＵ）で表示］。最大の結合は「AlignX」時に示される。（右）６００秒後、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤのバイオセンサーへの注入を停止し、系を解離相で緩衝液に戻した。解離定数であるＫ_Ｄの値を含む結合動態は、センサーグラムから計算できる。

【0338】

センサーグラムは、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤ融合タンパク質が、塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦの両方を効率的に捕捉したことを示す。ＦＧＦＲ１－ＣＣＤおよび酸性ＦＧＦのＫ_Ｄは１．０ｘ１０^－１２未満であると計算され、ネイティブのＦＧＦＲ１と同等であった。この結果は、ＣＣＤドメインへの融合がＦＧＦＲ１の結合能力に有意な影響を与えなかったことを示唆する。

【0339】

次に、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤが機能的なデコイ受容体として作用し、in vivoで細胞増殖を阻害することができるかどうかを試験した。ヒト臍帯静脈内皮細胞株（ＨＵＶＥＣ）をこの実験で選択した。ＭＴＴアッセイを実施して、ＨＵＶＥＣ細胞の代謝活性を評価した。ＭＴＴアッセイでは、３－［４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のＭＴＴ－ホルマザンへの酵素的還元は、ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによって触媒される（図８Ａを参照）。したがって、ＭＴＴアッセイはミトコンドリア呼吸に依存しており、細胞の細胞エネルギー容量を評価するのに間接的に役立つ。ＭＴＴアッセイは、３５ｍｍディッシュまたはマルチウェルプレートにプレーティングされた細胞単層から容易に測定可能な比色反応である。

【0340】

馴化培地または精製ＦＧＦＲ１－ＣＣＤをＨＵＶＥＣ細胞培養物に添加し、４８時間インキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞培養物を、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含有する培地またはKrebs－Hensleit－HEPES緩衝液（１１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４、２ｍＭのＣａＣｌ_２、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で２時間インキュベートした。２時間後、インキュベーション緩衝液を除去し、青色のＭＴＴ－ホルマザン生成物を酸性化イソプロピルアルコール（０．０４Ｎ ＨＣｌ）で抽出した。室温で３０分間抽出した後、ホルマザン溶液の吸光度を５７０ｎｍで分光光度的に読み取った。

【0341】

図２１Ｂおよび８Ｃに見られるように、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤは、細胞増殖を最大５０％まで実質的に阻害した。結果は、ＦＧＦＲ１－ＣＣＤがデコイ受容体として生物学的に活性であり、ＦＧＦリガンドを細胞内のネイティブなＦＧＦＲ受容体への結合からうまくそらしていることを示唆する。これらの結果はＨＵＶＥＣ細胞管形成アッセイにおいても実証され、ここでＦＧＦＲ１－ＣＣＤは、ＨＵＶＥＣ細胞管の成長をグロースファクターリデュースト（growth factor-reduced）マトリゲルにおいて同様に阻害した（図８Ｂを参照）。

【0342】

ＭＴＴアッセイを、図２０に示すように、様々な精製ＣＣＤ融合タンパク質と共にインキュベートしたＨＵＶＥＣ細胞においても実施した。細胞を、１００μｌの５０：５０基本培地、５０μｇ／ｍｌの精製ヒトＶＥＧＦＲ１－ＣＣＤを含む２００または１００％基本培地；ヒトＶＥＧＦＲ１ドメイン２およびヒトＶＥＧＦＲ２ドメイン３を含む融合タンパク質（「Ｖ１Ｖ２－ＣＣＤ」）；またはＶＥＧＦＲ１－ＦＧＦＲ１－ＣＣＤでインキュベートした。ＶＥＧＦＡ（左のグラフ）または低血清増殖サプリメント（右のグラフ）を、最終濃度２ｎｇ／ｍｌで細胞培地に添加した。ホルマザン吸光度で測定した細胞生存率および代謝活性の経時的な阻害のプロットを、下部に示す。緩衝液のみ、馴化培地のみ、および非抱合ＣＣＤドメイン（「コラーゲン」）を、対照として使用した。精製タンパク質とのインキュベーション後の細胞代謝活性および生存率の結果は、図８Ｃおよび２１Ｂに示されるように、ｒＡＡＶ投与の結果と一致している。デコイ受容体活性について６つのＣＣＤ融合タンパク質を評価するための、マウス神経膠腫ＧＬ２６１細胞における同様のＭＴＴアッセイを、図１５Ｄに示す。

【0343】

次に、タウタンパク質（α－タウ）に親和性を有する第１の異種ｓｃＦｖおよびアミロイドβペプチド９（α－Ａβ９）に親和性を有する第２の異種ｓｃＦｖを含有する、二重特異性ＣＣＤ融合タンパク質を構築し、このタンパク質の、そのリガンドに対する結合親和性／アビディティを、in vitroで結合アッセイを使用して、およびin vivoでＩＨＣイメージングおよびアミロイド斑検出を介して試験した。（二重特異性ＣＣＤ融合構築物は、本明細書では「二重弾頭」とも呼ぶ。）この融合タンパク質の、in vivoで六量体に多量体化した後の仮定の構造の概略図を、図６Ａに示す。

【0344】

最初に、細胞培地におけるこの融合タンパク質の発現レベルを、非抱合α－タウ３Ａ６ ｓｃＦｖおよびα－Ａβ９ ｓｃＦｖの発現レベルと比較して検出した（すなわち、ＣＣＤの不在下で）。結果を図６Ｃに示す。

【0345】

α－タウ／α－Ａβ９ ＣＣＤ融合タンパク質を発現させた後、単離および精製した。次に、融合タンパク質の結合親和性および動態を、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲによって評価した。図６Ｂに示すＥＬＩＳＡの結果は、融合タンパク質がそのリガンドとｓｃＦｖペプチドに等しく結合することを示す。ＳＰＲバイオレイヤー（biolyaer）干渉測定実験を、上記のように２つの別々の段階で実行した：最初に、溶液中の融合タンパク質を固定化されたビオチン化タウペプチドリガンド上に流した；続いて、同じ融合タンパク質溶液を固定化されたＡβ９リガンド上に流した。結果は、融合タンパク質がタウに（例えば、Ｎ末端で）結合し、次にＡβ９（Ｃ末端で）に連続的に結合することができたことを示す。結果を図６Ｅに示す。

【0346】

α－タウ／α－Ａβ９ ＣＣＤ融合タンパク質（またはナノボディ）をコードするｒＡＡＶ２／８粒子を、ＣＲＤＮ８マウスおよびヒトアルツハイマー病患者の脳に投与した。融合タンパク質は、溶液中の非抱合ｓｃＦｖの投与と比較して、脳内のアミロイド斑沈着を首尾よく減少させた（図６Ｄを参照）。この機能的in vivoアッセイで観察されたアミロイド斑の減少に基づき、この単量体ナノボディが、非抱合状態の同じｓｃＦｖよりも、Ａβ９およびタウに対するin vivoアビディティを増強したと推測することができる。

【0347】

確認アッセイにおいて、ＶＥＧＦＲ－２を標的とする抗Ａβ９ ｓｃＦｖおよびＢ１１ ｓｃＦｖを含む二重特異性ＣＣＤ融合タンパク質のｒＡＡＶ投与は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を過剰発現するＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおいてin vivoでアミロイド斑沈着を低減する。これらの結果を図７に示す。

【0348】

これらの結果が示すのは、α－タウ／α－Ａβ９ ＣＣＤ融合ナノボディが、リガンドに対するin vivoでのアビディティを、in vivoでの同じリガンドに対するα－タウｓｃＦｖおよびα－Ａβ ｓｃＦｖ（ＣＣＤは不在）の結合親和性の合計と実質的に同等程度示すことである。

【0349】

結論として、融合タンパク質を生成するためのプラットフォームの創生が本明細書に開示された。複数のタンパク質のＣＣＤドメインへの融合は、分泌される融合タンパク質パートナーのレベルを劇的に増加させる（ある場合には、タンパク質は、ドメインなしで発現させた場合の検出不能レベルから非常に高いレベルになる）。ＣＣＤへの融合はまた、デコイ受容体および組換え抗体フラグメントの機能的アビディティを増加させ得る。

【0350】

例５：グルコセレブロシダーゼおよびＨＳＶ－ＴＫ送達
変異型グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）遺伝子はゴーシェ病に関係し、またパーキンソン病の危険因子である。ＧＢＡ－ＣＣＤ融合タンパク質構築物を、ゴーシェ病およびパーキンソン病の治療に使用できるように設計および生成した。「二重弾頭」ＧＢＡ－ＣＣＤ－抗Ａβ９ ｓｃＦｖ融合タンパク質も生成した。構築物のα－Ａβ９ ｓｃＦｖドメインは、パーキンソン病に対するコード化されたＧＢＡ－ＣＣＤ融合タンパク質の治療効果を潜在的に高める可能性がある。ＧＢＡ活性アッセイおよびα－Ａβ９ ｓｃＦｖ活性ＥＬＩＳＡアッセイを評価して、ＧＢＡおよびｓｃＦｖドメインが、それぞれの活性をＣＣＤドメインに抱合している間に保持しているかどうかを示した。

【0351】

ＧＢＡ活性アッセイにおいて、ＧＢＡ－ＣＣＤおよびＧＢＡ－ＣＣＤ－Ａβ９ ｓｃＦｖ構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において過剰発現させた。細胞を回収し、馴化細胞培地を収集した。馴化培地、２９３Ｔ細胞溶解物、ならびに培地および溶解物から精製したタンパク質を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２５ｍＭのコリン酸ナトリウム、５ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．０）中に調製した。基質４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシドを添加して、最終濃度を６ｍＭにした。３７℃で２０分間インキュベートした後、反応を、停止溶液（０．５Ｍのグリシン、０．３ＭのＮａＯＨ、ｐＨ１０）を加えることにより停止させた。４４５ｎｍでの蛍光発光を、ＧＢＡ活性の測定に使用した。

【0352】

ＥＬＩＳＡベースのアッセイを実施して、Ａβ９v ｓｃＦｖ活性を評価した。９６ウェルプレートをＡβ４２ペプチドでコーティングし、２９３Ｔ馴化培地（ＧＢＡ－ＣＣＤおよびＧＢＡ－ＣＣＤ－Ａβ９ ｓｃＦｖタンパク質含有）および細胞溶解物を次に添加し、６時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡの展開を、抗ＦＬＡＧ Ｍ２ ＨＲＰを用いて行った。（図２３参照）。

【0353】

単純ヘルペスウイルス－１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）は、がん治療および他の疾患において使用される最もよく特徴付けられた自殺遺伝子の１つである。ＨＳＶ－ＴＫは、抗ウイルス薬ガンシクロビルを毒性剤に変えることができる。その結果、ガンシクロビル投与と組み合わせたＨＳＶ－ＴＫ発現は、ＨＳＶ－ＴＫで形質導入されこれを活発に発現している細胞においてのみ、死を引き起こす。このため、ＨＳＶ－ＴＫ遺伝子は「自殺遺伝子」と呼ばれる。

【0354】

ＨＳＶ－ＴＫ－ＣＣＤ野生型の融合タンパク質構築物を設計し、生成した。さらに、がん治療においてより高い有効性を有するＨＳＶ－ＴＫ－ＳＲ３９をコードする改変された融合構築物（他者からの公表されたデータ）を、比較試験のために生成した。ＣＣＤ融合がＨＳＶ－ＴＫの自殺活性を妨害しないことを確認するために、ＨＳＶ－ＴＫ（野生型）－およびＨＳＶ－ＴＫ－ＳＲ３９－ＣＣＤ融合タンパク質構築物を、結腸腺癌ＭＣ３８細胞にトランスフェクトし、続いてガンシクロビルを添加した。７２時間のインキュベーション後、細胞生存率をＭＴＴアッセイを用いて測定した（図２４参照）。結果は、ＨＳＶ－ＴＫ活性が、タンパク質がＣＣＤに抱合している間保持されたことを示す。

【0355】

他の態様
本明細書に開示されたすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同一、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴に置き換えることができる。したがって、特に明記されない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の一般的系列の例にすぎない。

【0356】

上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特性を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、開示の様々な変更および改変を行って、それを様々な使用および条件に適合させることができる。したがって、他の態様もまた特許請求の範囲内にある。

【0357】

均等物
いくつかの本発明の態様が本明細書で説明および図示されているが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行し、および／または結果および／または１つ以上の利点を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想定し、またかかるバリエーションおよび／または改変のそれぞれは、本明細書に記載の本発明の態様の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は本発明の教示が使用される特定の用途に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の本発明の態様の多くの均等物を認識するか、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の態様は単なる例として提示されており、添付の特許請求の範囲およびそれに相当する範囲内で、本発明の態様は、具体的に記載および特許請求される以外の方法で実施できることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の各個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象としている。さらに、かかる機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のかかる機能、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。

【0358】

本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。本明細書に開示されたすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれ、ある場合には文書全体が包含され得る。

【0359】

本明細書および特許請求の範囲で使用する不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0360】

本明細書および特許請求の範囲で使用する「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合は結合的に存在し、別の場合は分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」でリストされた複数の要素は、同じ様式で解釈する必要があり、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」である。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、具体的に識別される要素に関連するかどうかに関わらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用－－される場合、一態様において、Ａのみを指し（任意にＢ以外の要素を含み）；別の態様では、Ｂのみ指し（任意にＡ以外の要素を含み）；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）；などである。

【0361】

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、「または」は、上記定義の「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち多数の要素または要素のリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上もまた含むと解釈され、任意に、追加のリストされていない項目も含む。明確に逆が示される用語のみは、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合の「～からなる」などは、多数の要素または要素のリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用する「または」という用語は、「いずれか」、「一方」、「１つのみ」または「正確に１つ」などの排他性の用語が前に付いている場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方または他方だが両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。特許請求の範囲で使用される場合の「本質的に～からなる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

【0362】

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであり、ただし、要素のリスト内に具体的にリストされているすべての要素それぞれの少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外する必要もない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、具体的に特定された要素に関連するかどうかに関わらず、任意に存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様において、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、Ｂは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様において、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含み、Ａは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、少なくとも１つ、任意に２つ以上のＡを含み、および少なくとも１つ、任意に２つ以上のＢを含む（および任意に他の要素を含む）；などである。

【0363】

明確に逆が示されない限り、２つ以上のステップまたは行為を含む本明細書に請求されている方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。

【0364】

特許請求の範囲、ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む(including)」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成される」などのすべての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、含むがこれに限定されないことを意味すると理解されるべきである。「～からなる」および「本質的に～からなる」の移行句のみが、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures, Section 2111.03に記載されているように、それぞれクローズドまたはセミクローズドの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用して本文書に記載される態様もまた、代替の態様において、オープンエンドの移行句により記載される特徴「からなる」および「本質的にそれらからなる」として企図されることを、理解されたい。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替の態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「本質的にＡおよびＢからなる組成物」もまた企図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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【国際調査報告】