特表 2022-541697 高解像度で広範なエピトープを網羅するために、ラクダ科動物抗体を生成する配列ベースのハイスループット法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-27

(54)【発明の名称】高解像度で広範なエピトープを網羅するために、ラクダ科動物抗体を生成する配列ベースのハイスループット法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220916BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220916BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALN20220916BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20220916BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220916BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

G01N33/53 D

C12Q1/68

C12P21/08

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021549905

(86)(22)【出願日】2020-02-28

(85)【翻訳文提出日】2021-10-12

(86)【国際出願番号】 US2020020248

(87)【国際公開番号】W WO2020176815

(87)【国際公開日】2020-09-03

(31)【優先権主張番号】62/811,302

(32)【優先日】2019-02-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521375405

【氏名又は名称】ジャージャン ナノマブ テクノロジー センター カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ズー，ウェイミン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS33

4B063QS36

4B063QX01

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA50

4H045FA71

4H045FA74

(57)【要約】

標的の機能的エピトープを高解像度で網羅するための複数の多様なラクダ科動物抗体を生成するための方法。ラクダ科動物抗体を生成するための方法も提供される。
【選択図】図なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗原に特異的なラクダ科動物抗体を生成する方法であって、
ａ）前記抗原に特異的な、免疫させたラクダ科動物由来のＢ細胞を濃縮し、増殖させることと、
ｂ）前記抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと、
ｃ）前記ＮＧＳライブラリー内のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１鎖の抗体配列を系統別にグループ化することと、
ｄ）ステップｃ）の前記系統を１つ以上の系統優先因子によってランク付けすることと、
ｅ）前記ＮＧＳライブラリー内のステップｄ）の上位ランクのＶＨＨ^２またはＶＨＨ^３を含む系統から代表的な配列を選択することと、
ｆ）ステップｅ）から前記選択された配列を含む抗体の試験を行って、前記抗体が前記抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、
を含む、方法。

【請求項2】

特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離が、系統からのＣＤＲ３の前記グループの中で１以下であり、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、同じ長さの他のすべてのＣＤＲ３と比較して、そのようなＣＤＲ３の最も短いハミング距離である、請求項１に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法であって、
ｉ）ＦＲ２親水性領域、
ｉｉ）拡大ＣＤＲ１、
ｉｉｉ）ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３間の追加のジスルフィド結合、
ｉｖ）ＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合、
ｖ）長いＣＤＲ３（≧１５ａａ）、
ｖｉ）ＣＤＲ１内の追加のジスルフィド結合、
ｖｉｉ）従来のＩｇＧ１と同じＶおよびＪ生殖細胞系列を有する非古典的ＶＨＨ、
ｖｉｉｉ）所定の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ、
ｉｘ）新規カノニカル結合ループ構造、および
ｘ）収束モチーフまたは配列シグネチャ
からなる群から選択されるＶＨＨ固有の特徴を有する系統のサブグループ化をさらに含む、方法。

【請求項4】

前記系統優先因子が、高配列存在量から低配列存在量までの系統、高い増幅因子から低い増幅因子までの系統、免疫過程中の系統配列存在量の変化、特定の不要なＢ細胞の枯渇の前後の系統配列存在量の変化、ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項5】

ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３の最初の上位１００系統がｅ）で選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項6】

ｆ）の前記抗体が、原核細胞または真核細胞によって発現する、請求項１～５のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項7】

ラクダ科動物抗体ＩｇＧ２（ＨｃＡｂ）、ＩｇＧ３（ＨｃＡｂ）およびＩｇＧ１（従来のＩｇＧ）の免疫応答を監視することをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項8】

ｅ）～ｆ）を繰り返して、前記選択されたＶＨＨ^２またはＶＨＨ^３重鎖のみの抗体の前記同じ系統グループ内の配列を最適化することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項9】

抗原に特異的なラクダ科動物抗体を生成する方法であって、
ａ）前記抗原に特異的な、免疫させたラクダ科動物由来のＢ細胞を濃縮し、増殖させることと、
ｂ）前記抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１およびＶＬ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと、
ｃ）前記ＮＧＳライブラリー内のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、およびＶＬ^１の配列を系統別にグループ化することと、
ｄ）単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマアプローチによって生成されたアンカーバインダーに従ってＶＨ^１／ＶＬ^１系統を対形成することと、
ｅ）ステップｃ）およびステップｄ）の系統および系統対を１つ以上の系統優先因子によってランク付けすることと、
ｆ）前記ＮＧＳライブラリー内で、ステップｅ）において上位ランクのＶＨＨ^２またはＶＨＨ^３の系統およびＶＨ^１／ＶＬ^１の系統対からそれぞれ代表的な配列または配列対を選択することと、
ｇ）ステップｆ）から前記選択された配列対または配列を含む抗体の試験を行って、前記抗体が前記抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、
を含む、方法。

【請求項10】

ＩｇＧ１レパートリーのアンカーが、単一のＢ細胞選別およびヘテロハイブリドーマアプローチにより生成される、請求項９に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項11】

ステップｅ）における系統対の前記ランク付けが、前記系統対のＶＨ^１系統の系統優先因子に基づく、請求項９または請求項１０に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項12】

前記上位１００の系統または系統対グループからのＶＨＨの１つの代表的な配列または１つの代表的な対ＶＨ^１／ＶＬ^１がアンカーとして選択される、請求項１０に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項13】

前記上位１００の系統または系統対グループが、７０のＶＨＨ系統グループおよび３０のＶＨ^１／ＶκまたはＶＨ^１／Ｖλ系統グループ対を含む、請求項１２に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項14】

前記系統優先因子が、高配列存在量から低配列存在量までの系統、高い増幅因子から低い増幅因子までの系統、免疫過程中の系統配列存在量の変化、特定の不要なＢ細胞の枯渇の前後の系統配列存在量の変化、ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項15】

請求項９～１４のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法であって、ｆ）～ｇ）を繰り返すことをさらに含み、ＶＨＨクローンが、
ｉ）ＦＲ２親水性領域、
ｉｉ）拡大ＣＤＲ１、
ｉｉｉ）ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３間の追加のジスルフィド結合、
ｉｖ）ＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合、
ｖ）長いＣＤＲ３（≧１５ａａ）、
ｖｉ）ＣＤＲ１内の追加のジスルフィド結合、
ｖｉｉ）従来のＩｇＧと同じＶおよびＪ生殖細胞系列を有する非古典的ＶＨＨ、
ｖｉｉｉ）所定の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ、
ｉｘ）新規カノニカル結合ループ構造、および
ｘ）収束モチーフまたは配列シグネチャ
からなる群から選択される特徴を有する、方法。

【請求項16】

抗原に特異的なヒト化ＶＨＨ^２またはＶＨＨ^３抗体を生成するための方法であって、
ａ）前記抗原に特異的な、免疫させたラクダ科動物由来のＢ細胞を濃縮し、増殖させることと、
ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと、
ｃ）前記ＮＧＳライブラリー内のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１の配列を系統別にグループ化することと、
ｄ）そのアミノ酸配列を、同じ系統内でそれぞれが親抗体と同じエピトープに結合する複数の関連抗体のアミノ酸配列と比較することにより、同じナイーブＢ細胞起源を共有する親ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３抗体またはＶＨ^１内の置換可能な位置を同定することと、
ｅ）前記親ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３抗体の１つ以上の前記置換可能な位置のアミノ酸を、ヒト抗体内の対応する位置にあるアミノ酸で置換することと、
ｆ）前記選択された配列内の前記置換された残基を含む抗体の試験を行って、前記抗体が前記抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、
を含む、方法。

【請求項17】

前記置換可能な位置がＣＤＲ領域内にある、請求項１６に記載のヒト化ＶＨＨ抗体を生成するための方法。

【請求項18】

前記置換可能な位置がＦＲ領域内にある、請求項１６に記載のヒト化ＶＨＨ抗体を生成するための方法。

【請求項19】

前記抗原が複合免疫原であり、
ステップｆ）で前記複合免疫原と結合すると判断された抗体を使用して、タンパク質アレイ、細胞／組織抗原ｃＤＮＡライブラリー、または質量分析ベースの免疫沈降によって前記複合免疫原に含まれる個々の抗原を同定することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項20】

前記選択されたＶＨＨ配列を適用して、前記同じナイーブＢ細胞起源を共有するこれらのクローンのＶＨ^１－ＶＬ^１対の選択を導くことをさらに含み、選択基準が、１）ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じＣＤＲ３配列、２）ＣＤＲ１とＣＤＲ２との差、ならびに３）ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の差のうちの１つ以上を含む、請求項９～１９のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項21】

ｅ）～ｆ）を繰り返して抗体を生成することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項22】

ｆ）～ｇ）を繰り返してラクダ科動物抗体を生成することをさらに含む、請求項９～１５のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項23】

前記試験された抗体の前記発現細胞が真核細胞を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のラクダ科動物抗体を生成するための方法。

【請求項24】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法により生成された、単離されたラクダ科動物抗体または抗原結合部分。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

各標的は数百または数千のエピトープを有し、その中で生物学的機能に関与するエピトープの数は非常に限られているため、現在の抗体技術では、疾患標的の機能的エピトープを標的にすることは大きい課題であるが、現在の技術はバインダーをランダムかつ散発的に生成するため、エピトープの不十分なカバレッジ、冗長な選択、および低い奏効率がボトルネックとなっている。

【0002】

ヒトコブラクダ、フタコブラクダは旧世界ラクダ科およびラマに属する。アルパカは、新世界ラクダ科に属する。ラクダ科（一般名ラクダ科動物）のみが、従来の抗体およびホモ二量体抗体（ＨｃＡｂ）の両方を含む二分性適応性体液性免疫系を有する。さらに、ＨｃＡｂは、抗原の非常に広範囲のエピトープを認識するための駆動因子のうちの１つとして包括的なパラトープアーキテクチャを進化させ、ＩｇＧ１抗体は、より多様な認識のためにＨｃＡｂ結合アーキテクチャを補完する。

【0003】

ラクダ科は、２種類のＨｃＡｂであるＩｇＧ２およびＩｇＧ３からなる独特の体液性免疫系を有し、短い長さのヒンジ領域および長い長さのヒンジ領域を有する。系統発生分析により、最近の適応変化の結果として、ＨｃＡｂが従来の抗体であるＩｇＧ１から分岐していることが確認された。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ウエストナイルウイルスを中和するが、ＩｇＧ２は感染した動物またはワクチン接種した動物では効果が低いと考えられることが報告されている（Ｄａｌｅｙ ＬＰ，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２３９－４６，２０１０年）。さらに、ＨｃＡｂおよびＩｇＧ１によってサンプリングされたエピトープの範囲は、重複し得るが、ＨｃＡｂは、ＩｇＧ１にアクセスできない部位にも到達することもできる。様々なラクダ科動物ＩｇＧアイソタイプの正確な役割および機能の理解はまだ初期段階である。しかし、ＨｃＡｂ（ＩｇＧ２およびＩｇＧ３）の扁長、凸面、凹面、突出、および平坦な表面などの多様なパラトープアーキテクチャにより、特に診断用途および治療用途のために、問題の標的に対する抗体を開発する最大の機会がもたらされる。軽鎖対形成のないＨｃＡｂが単純であることにより、遺伝子クローニングおよび抗体操作もはるかに容易になる。さらに、ラクダ科動物の総ＩｇＧの２５～５０％に寄与する従来のＩｇＧ１は、免疫させたヒトコブラクダまたはラマのＨｃＡｂレパートリーが従来のＩｇＧ１とは異なる認識パターンを示し（ＭｃＣｏｙ ＬＥ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１２年）、特定の固有のエピトープまたは創薬可能な標的ホットスポットは、高い親和性および所望の機能性によりＩｇＧ１にアクセス可能である（Ｃｒｉｓｔｉｎａ Ｂａｓｉｌｉｃｏ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １２４ Ｎｕｍｂｅｒ ７ Ｊｕｌｙ，２０１４年；Ｂａｓｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｎｉｎｇａ，ＭＡＢＳ，ＶＯＬ．８，ＮＯ．６，１１２６－１１３５，２０１６年）ため、抗原結合レパートリーを拡大するために重要な役割を果たす。ラクダ科動物は２種類の軽鎖を有する（ＶκまたはＶλが、ＶＨ１と対形成して従来のＩｇＧ１を形成し、その生殖細胞系組織が最近明らかになった（Ｌａｕｒａ Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌｕｍｅ ４０５，Ｐａｇｅｓ ３５－４６，Ｍａｒｃｈ ２０１４年３月；Ａｌｅｘ Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋ，ｍＡｂｓ ７：４，６９３－７０６；２０１５年）。

【0004】

広範な体細胞超変異および遺伝子変換は、初代ＶＨＨ Ｂ細胞レパートリー内のＶＨよりもＶＨＨ間で有意に高く（３０％対１．５％）、これにより軽鎖の欠如を補完するためにＨｃＡｂレパートリーのさらなる多様化をさらにサポートする。同様に重要なことに、ＨｃＡｂのＶＨＨドメインは、例えば、凸状のパラトープ表面を有する扁長（ラグビーボール型）構造を作成することにより、全体的な抗原結合レパートリーを拡大し、これにより、抗原の表面上の空洞または溝（活性部位およびアロステリック部位など）に挿入するのに非常に好適となる。対照的に、従来のＩｇＧのＶＨ－ＶＬドメインには、より平坦であるかまたは凹状のパラトープ表面が含まれている。Ｂ細胞レパートリー多様化の以下のメカニズムは、ＶＨＨの固有の結合特性に大きく貢献する：（ｉ）ほとんどのＶＨＨには、従来のＦＲ２（Ｖａｌ３７→Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｇｌｙ４４→Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５→Ａｒｇ、およびＴｒｐ４７→Ｇｌｙ）と比較して、親水性アミノ酸置換を伴うフレームワーク領域２（ＦＲ２）が含まれており、これらは軽鎖結合に関与する、（ｉｉ）拡大ＣＤＲ１領域は、Ｋａｂａｔの番号付けによると、残基２７～３０内の免疫Ｂ細胞における広範な体細胞超変異を伴う、（ｉｉｉ）ＶＨＨの大部分におけるＣＤＲ１－ＣＤＲ３（ラクダ）またはＦＲ２－ＣＤＲ３（ラマおよびアルパカ）間の追加のジスルフィド結合、（ｉｖ）ＶＨＨの特定の部分におけるＣＤＲ１およびＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合、（ｖ）より長いＣＤＲ３ループも、おそらく一部のＶＨＨでの追加の非鋳型ヌクレオチド挿入により同定される（Ａｄｈｄｉ Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ８，２０１７年；Ｖｉｅｔ Ｋｈｏｎｇ Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１９ Ｎｏ．５ ２０００年；Ｍｅｈｄｉ Ａｒｂａｂｉ－Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１７年１１月２０日；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５４：３９－４７，２００２年；Ｃｏｎｒａｔｈ ＫＥ，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：８７－１０３，２００３年）。従来のＩｇＧ１と同じ遺伝子座ＩＧＨＶ３またはＩＧＨＶ４、ＤおよびＪに由来する非古典的ＶＨＨ（ＦＲ２親水性アミノ酸を含まない）のセットがあり、これらの重鎖抗体は、両方のカテゴリーの抗体が、エピトープ認識に関与する同じまたは類似のＣＤＲ３を共有するため、ＩｇＧ１と同じものまたは同様のエピトープを認識し得ることも見出された（Ｃｏｎｒａｔｈ ＫＥ Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：８７－１０３，２００３；Ｎｉｃｋ Ｄｅｓｃｈａｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１８４（１０）５６９６－５７０４，２０１０年）。ＨｃＡｂ生殖細胞系列の構成およびＶＨＨ構造を図１ＡおよびＢに示す。

【0005】

高親和性、特異性、単純な遺伝子クローニング、高発現収率、精製の容易さ、溶解性が高く安定した単一ドメインフォールドなどの機能的利点および物理化学的利点は、ＨｃＡｂ技術の基盤となる。さらに、従来のＩｇＧ１によって拡大された抗原結合レパートリーでは、さらに広いエピトープカバレッジが可能になる。さらに、ＶＨＨ、ＶＨ、Ｖκ、およびＶλのヒト対応物との密接な相同性により、ヒト化および治療法の開発に大きな利点がもたらされる。ラクダ科動物固有の抗体組織およびＮＧＳ技術を利用して、Ｂ細胞抗体レパートリー全体を捕捉することにより、標的の幅広いエピトープを高解像度で網羅する数百または数千の多様な抗体を生成する新規方法がここで開発され、これにより、体系的かつ合理的な方法でこれらの重要かつ機能的なエピトープの標的化が可能になる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明では、抗原に対するラクダ科動物抗体を生成するハイスループット法を開示し、本方法は、ａ）抗原に特異的な、免疫させたラクダ科動物由来のＢ細胞を濃縮し、増殖させることと、ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ１鎖配列を含む抗体次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリーを生成することと、ｃ）ＮＧＳライブラリー内のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１の配列を系統別にグループ化することと、ｄ）ＶＨＨ重鎖（ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３）を含む系統を１つ以上の系統優先因子によってランク付けすることと、ｅ）ＮＧＳデータベースライブラリー内で上位ランクのＶＨＨ重鎖（ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３）の系統から代表的な配列を選択することと、ｆ）選択されたＶＨＨ重鎖配列を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。一実施形態では、抗原は複数のエピトープを含む。

【0007】

一実施形態では、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、系統からのＣＤＲ３のグループ間で１以下であり、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、同じ長さのすべての他のＣＤＲ３と比較して、このＣＤＲ３の最も短いハミング距離である。

【0008】

いくつかの実施形態では、系統優先因子は、高い配列存在量から低い配列存在量までの系統、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞の濃縮および増殖後の高増幅因子から低増幅因子への系統、免疫過程での系統配列の存在量の変化、特定の不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列の存在量の変化、ＶＨＨとＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0009】

いくつかの実施形態では、ＶＨＨ^２および／またはＶＨＨ^３系統は、ｅ）での上位１００系統から選択される。

【0010】

いくつかの実施形態では、この方法は、ｅ）～ｆ）を繰り返してラクダ科動物抗体を生成することをさらに含み、代表的配列は、上位１０１～２００、２０１～３００、３０１～４００、４０１～５００、５０１～６００、６０１～７００、７０１～８００、８０１～９００、９０１～１０００、１００１～１１００、１１０１～１２００、１２０１～１３００、１３０１～１４００、１４０１～１５００、１５０１～１６００、１６０１～１７００、１７０１～１８００、１８０１～１９００、または１９０１～２０００ランク付け系統から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、ｅ）～ｆ）を繰り返してラクダ科動物抗体を生成することをさらに含み、代表的な配列は、上位２０００～１０，０００のランク付け系統から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、試験抗体は、原核生物または真核生物の細胞によって発現される。

【0012】

好ましい実施形態では、この方法は、ＩｇＧ２、３（ＨｃＡｂ）およびＩｇＧ１（従来のＩｇＧ）の免疫応答を監視することをさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、選択されたＩｇＧ２またはＩｇＧ３重鎖のみの抗体の同じ系統グループ内の配列は、方法のｅ）～ｆ）を繰り返すことによって抗体の最適化のために選択され得る。

【0014】

いくつかの実施形態では、抗原または免疫原は、細胞、組織、または生体液であり得る。

【0015】

いくつかの実施形態では、抗原は複合免疫原であり得、方法は、ステップ（ｆ）で複合免疫原と結合すると判断された抗体を使用して、タンパク質アレイ、細胞／組織抗原ｃＤＮＡライブラリー、または質量分析ベースの免疫沈降によって複合免疫原に含まれる個々の抗原を同定することをさらに含む。

【0016】

本発明の一態様では、本方法は、ｉ）ＦＲ２親水性領域；ｉｉ）拡大ＣＤＲ１；ｉｉｉ）ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３間の追加のジスルフィド結合；ｉｖ）ＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合；ｖ）長いＣＤＲ３（≧１５ａａ）；ｖｉ）ＣＤＲ１内の追加のジスルフィド結合；ｖｉｉ）従来のＩｇＧ１と同じＶおよびＪ生殖細胞系列を有する非古典的ＶＨＨ；ｖｉｉｉ）特定の所定の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ；ｉｘ）特定の所定のカノニカル結合ループ構造；ｘ）同じ免疫グループからの個々の動物間の収束モチーフまたは配列シグネチャ；ｘｉ）ＣＤＲ２の長さ；ｘｉｉ）ＣＤＲ３の長さ；ｘｉｉｉ）ＣＤＲ３の長さおよび同一性；ｘｉｖ）ＣＤＲ３領域内に３つ以上の正電荷が存在する；ｘｖ）アミノ酸配列中のシステインの数；およびｘｖｉ）ＣＤＲ領域に見られる２～４のアミノ酸モチーフからなる群から選択される特定のＶＨＨ特徴を有する系統サブグループ化をさらに含む。モチーフは、リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定される。

【0017】

本発明の別の態様では、抗原に対するラクダ科動物抗体をハイスループットで生成するための方法が提供され、本方法は、ａ）免疫させたラクダ科動物からの抗原特異的Ｂ細胞を濃縮し、増殖させることと；ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１およびＶＬ１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと；ｃ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、およびＶＬ^１ＮＧＳ配列を系統別にグループ化することと；ｄ）単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマアプローチによって生成されたアンカーバインダーに従ってＶＨ^１／ＶＬ^１系統の対形成を行うことと；ｅ）ステップｃ）およびステップｄ）の系統および系統対を系統優先因子によってランク付けすることと；ｆ）ＮＧＳライブラリー内で上位ランクのＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３の系統およびＶＨ^１／ＶＬ^１の系統対から代表的な配列または配列対を選択することと；ｇ）選択された重鎖／軽鎖配列対または重鎖ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３配列を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。一実施形態では、抗原は複数のエピトープを含む。

【0018】

一実施形態では、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、系統からのＣＤＲ３のグループ間で１以下であり、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、同じ長さの他のすべてのＣＤＲ３と比較して、このＣＤＲ３の最も短いハミング距離である。

【0019】

一実施形態では、ステップｅ）における系統対のランク付けは、系統対のＶＨ１系統の系統優先因子に基づく。

【0020】

いくつかの実施形態では、系統優先因子は、高い配列存在量から低い配列存在量までの系統、ｌｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞の濃縮および増殖、後の高増幅因子から低増幅因子への系統、免疫過程での系統配列の存在量の変化、特定の不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列の存在量の変化、ＶＨＨとＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１レパートリーのアンカーは、単一のＢ細胞選別およびヘテロハイブリドーマアプローチで生成される。

【0022】

いくつかの実施形態では、試験抗体は、原核生物または真核生物の細胞によって発現される。

【0023】

いくつかの実施形態では、各上位１００系統または系統対からのＶＨＨの１つの代表的な配列または１つの代表的な対ＶＨ^１／ＶＬ^１が選択される。いくつかの実施形態では、１００の系統／系統対は、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０のＶＨＨ系統および５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５のＶＨ^１／ＶＬ^１系統対をそれぞれ含み、ＶＬ^１はＶκおよびＶλを含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、この方法は、ｆ）～ｇ）を繰り返してラクダ科動物抗体を生成することをさらに含み、代表的配列は、上位１０１～２００、２０１～３００、３０１～４００、４０１～５００、５０１～６００、６０１～７００、７０１～８００、８０１～９００、９０１～１０００、１００１～１１００、１１０１～１２００、１２０１～１３００、１３０１～１４００、１４０１～１５００、１５０１～１６００、１６０１～１７００、１７０１～１８００、１８０１～１９００、または１９０１～２０００ランク付け系統から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、ｆ）～ｇ）を繰り返してラクダ科動物抗体を生成することをさらに含み、代表的な配列は、上位２０００～１０，０００のランク付け系統から選択される。

【0025】

いくつかの実施形態では、系統のランク付け／選択の基準は、高配列存在量から低配列存在量までの系統、高い増幅因子から低い増幅因子までの系統、免疫過程中の系統配列存在量の変化、特定の不要なＢ細胞の枯渇の前後の系統配列存在量の変化、ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗原または免疫原は細胞または組織であり得、生成されたＶＨＨは、タンパク質アレイまたは細胞／組織抗原ｃＤＮＡライブラリーまたは免疫沈降に基づく質量分析法によって個々の対応する抗原を同定するために使用される。

【0027】

本発明の別の態様では、特定の抗原の複数のエピトープに対するラクダ科動物抗体をハイスループットで生成するための方法は、ｉ）ＦＲ２親水性領域；ｉｉ）拡大ＣＤＲ１；ｉｉｉ）ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合；ｉｖ）長いＣＤＲ３（≧１５ａａ）；ｖ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列；ｖｉ）抗原結合ループ構造の配列ベースの予測；ｘ）同じ免疫グループからの個々の動物間の収束モチーフまたは配列シグネチャ；ｘｉ）ＣＤＲ２の長さ；ｘｉｉ）ＣＤＲ３の長さ；ｘｉｉｉ）ＣＤＲ３の長さおよび同一性；ｘｉｖ）ＣＤＲ３領域内に３つ以上の正電荷が存在する；ｘｖ）アミノ酸配列中のシステインの数；およびｘｖｉ）ＣＤＲ領域に見られる２～４のアミノ酸モチーフからなる群から選択される特徴を有するＶＨＨ系統をサブグループ化することをさらに含む。モチーフは、リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定される。

【0028】

いくつかの実施形態では、第１のラウンドで試験された抗体の同じ系統グループ内の配列は、第２のラウンドでｆ）～ｇ）を繰り返すことによって抗体の最適化のために選択され得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、抗原に対するラクダ科動物抗体をハイスループットで生成するための方法は、選択されたＶＨＨ配列を適用して、同じナイーブＢ細胞起源を共有するこれらのクローンのＶＨ１－ＶＬ１対の選択を導くことをさらに含み、ここで、選択基準は、１）ＣＤＲ１とＣＤＲ２との差；２）ＦＲ１、２、３、４の差である。

【0030】

本発明の別の態様では、ヒト化ＶＨＨ抗体を生成するための方法は、ａ）免疫させたラクダ科動物からの抗原特異的Ｂ細胞を濃縮し、増殖させることと；ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１およびＶＬ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと；ｃ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１ ＮＧＳ配列を系統別にグループ化することと；ｄ）親ＶＨＨ^２抗体、ＶＨＨ^３抗体または同じナイーブＢ細胞起源を共有するＶＨ^１内の置換可能な位置を、それぞれが同じ系統内の親抗体と同じエピトープに結合する複数の関連する抗体のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列を比較することによって同定することと、ｅ）親ＶＨＨ^２抗体またはＶＨＨ^３抗体の１つ以上の置換可能な位置のアミノ酸を、ヒト抗体内の対応する位置にあるアミノ酸で置換することと；ｆ）選択された配列内の置換された残基を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。

【0031】

一実施形態では、ヒト化ＶＨＨ抗体の置換位置は、ＦＲ領域内にある。一実施形態では、ヒト化ＶＨＨ抗体の置換位置は、ＣＤＲ領域内にある。

【0032】

一実施形態では、親抗体はラクダ科動物抗体である。一実施形態では、親抗体は、ヒト化ラクダ科動物抗体である。

【0033】

本発明の別の態様では、本発明によって生成された抗体配列を含む単離されたラクダ科動物抗体または抗原結合部分。

【0034】

本発明の別の態様では、本発明のラクダ科動物抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【図面の簡単な説明】

【0035】

例示的な実施形態は、参照された図に示す。本明細書に開示の実施形態および図は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図されている。

【図1A】ＶＨＨ、ＶＨ、およびＣＨ免疫グロブリンをコードするラクダ科動物の遺伝子座の構成を示す図である。

【図1B】ラクダ科動物のＶＨＨ構造を示す図である。

【図2】ラクダ科動物の免疫および抗原特異的Ｂ細胞の濃縮／増殖を示す図である。

【図3】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλを増幅するためのＩｇＧアイソタイプ特異的プライマーセットを示す図である。

【図4】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλＮＧＳライブラリーの生成および系統のグループ化を示す図である。

【図5】ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３系統を配列シグネチャでさらにグループ化したものを示す図である。

【図6】ＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ系統と、単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマにより開発されたアンカーとの対形成を示す図である。

【図7】バインダーおよび生物活性スクリーニングのための各系統からの配列選択を示す図である。

【図8】同じ系統内で選択されたリードの最適化を示す図である。第１の選択ラウンドからのリードは、＠と＋でマークする。

【図9】系統分析によるＶＨＨおよびＶＨ－ＶＬのヒト化のワークフローを示す図である。

【図10】ＥＧＦＲに結合する選択された抗体からの蛍光シグナルを示す図である。

【図11】抗ＫＬＨ抗体分泌Ｂ細胞およびアルパカフィーダー細胞の選択された共培養から分泌された抗体のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。フィーダー細胞のないＢ細胞のみは成長も増幅もしない。これは、陰性対照として使用した。免疫させた動物血清は、ＥＬＩＳＡの陽性対照として対照培地で１：１０００に希釈した。

【図12】フィーダー細胞および抗体分泌Ｂ細胞の共培養から得られたＢ細胞と、フィーダー細胞を含まないＢ細胞のみの増幅を示す図である。

【図13】ＫＬＨ ＮＧＳデータから、選択したクローンの上清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。

【図14】リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定されたＣＤＲ領域２～４アミノ酸モチーフに基づいてブロッキング抗体を同定するためのワークフローを示す図である。

【図15】ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間に形成された複合体の２つのビューを示す図であり、複合体の界面にあるＰＤ－１の２つのペプチドを強調表示している。

【図16】ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体における界面ペプチドの相互作用の分析結果を示す図である。

【図17】選択した抗ＰＤ－１ＶＨＨ抗体の系統グループを示す系統発生樹を示す図である。系統発生樹のルートは、サブグループ１、２、および３を含む系統グループを定義するアンカーとして機能する。

【図18】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２のクローンライブラリにおけるＣＤＲ３ドメインアミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図19A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図19B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図20A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図20B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図21A】共通のＣＤＲ３ドメイン配列を有する単一のアルパカのライブラリー内のＶＨ、ＶＨＨ^２、およびＶＨＨ^３抗体の重複クローンを示すベン図である。

【図21B】一般的なＣＤＲ３配列を示す図である。

【図22】アルパカＡ１およびＡ２、ＶＨ、ＶＨＨ２、およびＶＨＨ３抗体に共通するＣＤＲ３ドメイン配列の数を示すベン図である。

【図23】古典的なＶＨＨ型および非古典的なＶＨＨ型の選択された抗体クローンのＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６細胞を使用したＦＡＣＳによる抗原結合親和性を示す図である。

【図24】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における固有のＦＲ２ドメイン配列の割合を示す図である。

【図25】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における抗体のＦＲ２ドメインにおける特定のアミノ酸置換の頻度を示す図である。

【図26】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、１１～１５アミノ酸のＣＤＲ１ドメイン長を有するクローンの割合を示す図である。

【図27】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体における「長いＣＤＲ２」ドメインを有する抗体のＥＬＩＳＡによる結合親和性の分布を示す図である。

【図28】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体において、ＣＤＲ３ドメイン内に余分なジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図29-30】３つの異なる抗原を標的とする３つからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を持つクローンの割合を示す図である。

【図31】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体内でのＶ領域のアミノ酸配列内のシステイン残基の数の分析結果を示す図である。

【図32】３つの異なる抗原を標的とする３つライブラリーからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図33】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーの抗体において、ＦＲ２ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間、またはＦＲ２ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図34】ＶＨＨ抗体配列内のシステインアミノ酸数と上清のＯＤ値との相関関係を示す図である。

【図35】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々内に「長いＣＤＲ３」ドメインを有するクローンの割合を示す図である。

【図36-38】ＣＤＲ３ドメイン長と、ＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との相関関係を示す図である。

【図39】特定の抗原のほぼ同一のエピトープまたは同じエピトープに結合するＶＨＨ抗体の集団のＣＤＲ３の長さの範囲を示す図である。

【図40】ＰＤ１への結合について、選択した抗ＰＤ１クローンとＫＥＹＴＲＵＤＡおよびＯＰＤＩＶＯとの競合を評価する実験結果を示す図である。

【図41】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、ＶＨＨ抗体内でＴｒｐ１１８アミノ酸がＡｒｇで置換されているクローンの割合を示す図である。

【図42】ＣＤＲ３の長さと抗ＫＬＨＶＨＨ抗体のＥＬＩＳＡ結合活性との正の相関関係を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下の実施形態およびそれらの態様は、範囲を限定するものではなく、例示的かつ図示的であることを意図するシステム、組成物、および方法と併せて説明され、図示される。
定義

【0037】

本明細書で使用される場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、一実施形態に有用であるが、有用であるか否かにかかわらず、不特定エレメントを含むことができる組成物、方法、およびそれらのそれぞれの成分に関して使用される。一般に、本明細書で使用される用語は、一般に「オープン」用語として意図されていることが当業者によって理解されている（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきである。「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、「含むがこれに限定されない」と解釈されるべきである）。

【0038】

特に明記しない限り、本出願の特定の実施形態を説明する文脈で（特に特許請求の範囲で）使用される用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の言及は、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈することができる。本明細書での値の範囲の列挙は、範囲内にある個々の値を個別に参照する簡単な方法として機能することを目的としている。本明細書に別段の記載がない限り、個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意のすべての例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単にその用途をよりよく明らかにすることを意図するものであり、他の方法で主張される用途の範囲に制限を課すものではない。略語、「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語の「例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ）」から派生し、本明細書では、非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「例えば」の同義語である。本出願内のいかなる文言も、本出願の実施に必須であるクレームされていない要素を示すものと解釈されるべきではない。

【0039】

「複数」という用語は、１つ以上、例えば、２つ以上、約５以上、約１０以上、約２０以上、約５０以上、約１００以上、約２００以上、約５００以上、約１０００以上、約２０００以上、約５０００以上、約１万以上、約２万以上、約５万以上、約１０万以上、通常、約２０万以下を指す。「集団」は、複数の項目を含む。

【0040】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、持続時間などの測定可能な値を指し、指定値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％の変動を包含する。

【0041】

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含むことができる。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面グループで構成され、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。平衡解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭの場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われている。

【0042】

「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すことができる。

【0043】

本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、および補体など）の作用を指すことができ、その結果、侵入する病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合は正常な生物細胞または組織の生物への選択的損傷、破壊、またはこれらの生物からの排除がもたらされる。

【0044】

本明細書で使用される「抗原特異的Ｔ細胞応答」は、Ｔ細胞が特異的である抗原によるＴ細胞の刺激から生じるＴ細胞による応答を指すことができる。抗原特異的刺激時のＴ細胞による応答の非限定的な例としては、増殖およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ－２産生）が挙げられる。

【0045】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶化可能断片）領域を有するモノクローナルもしくはポリクローナル抗原結合断片、または本明細書で「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」と呼ばれるＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を指す。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷な抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって生成され得る。抗原結合断片としては、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単領域抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、およびポリペプチドへの特異的抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。Ｆｃ領域には、２つまたは３つのクラスの抗体に寄与する２つの重鎖の一部分を含む。Ｆｃ領域は、組換えＤＮＡ技術によって、または酵素的（例えば、パパイン切断）によって、または無傷の抗体の化学的切断を介して生成され得る。

【0046】

本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、無傷な抗体の一部のみを含み、一般に無傷な抗体の抗原結合部位を含み、したがって抗原に結合する能力を保持するタンパク質断片を指す。本定義に含まれる抗体断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨおよびＣＨ１領域を有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１領域のＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域を有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１領域とＣＨＩ領域のＣ末端に１つ以上のシステイン残基を有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨ領域を有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨ領域からなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９年））；（ｖｉｉ）単離したＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む二価断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば、単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８年）；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９－５８８３（１９８８年））；（ｘ）同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変領域（ＶＬ）に接続された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３年）を参照のこと）；（ｘｉ）相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「直鎖抗体」（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５年）；および米国特許第５，６４１，８７０号）が挙げられる。

【0047】

本明細書で使用される「単鎖可変断片」、「単鎖抗体可変断片」または「ｓｃＦｖ」抗体は、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）のみの可変領域を含み、リンカーペプチドによって接続されている抗体の形態を指す。ｓｃＦｖは、単鎖ポリペプチドとして発現させることができる。ｓｃＦｖは、それが由来する無傷の抗体の特異性を保持している。軽鎖および重鎖は、標的抗原に対するｓｃＦｖの特異性が保持されている限り、任意の順序、例えば、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨであってもよい。

【0048】

本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことができる（例えば、ＴＲＡＩＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、ＴＲＡＩＬタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まないことが可能である）。しかし、ヒトＴＲＡＩＬタンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのＴＲＡＩＬタンパク質などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0049】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指すことができる。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。

【0050】

本明細書で使用されるとき、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマ（以下に記載）についてトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（例えば、マウス）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から（例えば、トランスフェクトーマから）単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離された抗体を指すことができる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合には、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受けることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト生殖細胞系列レパートリー内に自然に存在しない可能性がある配列である。

【0051】

「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指すことができる。抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＤ分子であり得るか、またはそれらに由来する。

【0052】

「ＶＨＨ^２」、「ＶＨＨ^３」および「ＶＨ^１」という用語は、それぞれ、３つのラクダ科動物のＩｇＧアイソタイプ１ｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ１の重鎖を表す。ＶＬ^１は、ラクダ科動物ＩｇＧ１の軽鎖を表している。ラクダ科動物ＶＬ^１としては、これらに限定されないが、ＶκおよびＶλが挙げられる。

【0053】

本明細書で同義的に使用される「対応して配置されたアミノ酸」および「対応するアミノ酸」という用語は、２つ以上のアミノ酸配列が整列している場合に同一の位置にある（すなわち、互いに向かい合っている）アミノ酸残基である。抗体配列を整列させ、番号付けするための方法は、上記のＣｈｏｔｈｉａ、上記のＫａｂａｔ、および他のものに非常に詳細に記載されている。当技術分野で公知であるとおり（例えば、Ｋａｂａｔ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＤＨＨＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣを参照のこと）、アラインメントを達成するために、時には１、２、または３つのギャップおよび／または最大１、２、３または４残基、または最大約１５残基（特に軽鎖および重鎖ＣＤＲ３）の挿入を抗体のアミノ酸の一方または両方に作製することができる。

【0054】

「天然」抗体という用語は、抗体の重鎖および軽鎖が、多細胞生物の免疫系によって作られ、対形成している抗体を指す。脾臓、リンパ節、骨髄、血液、および他のリンパ組織は、天然抗体を産生する細胞を含む組織の例である。例えば、抗原によって免疫させた第１の動物から単離されたＢ細胞によって産生される抗体は、天然抗体である。天然抗体には、自然に対形成している重鎖および軽鎖が含まれている。

【0055】

「自然に対形成されている」という用語は、多細胞生物の免疫系によって対形成されている重鎖および軽鎖配列を指す。

【0056】

本明細書で使用される「混合物」という用語は、エレメント、例えば、散在していて特定の順序ではない細胞の組み合わせを指す。混合物は均質であり、異なる成分に空間的に分離されていない。エレメントの混合物の例としては、空間的にむきだし（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｕｎｄｒｅｓｓｅｄ）で同じ水溶液中に存在する、複数の異なる細胞が挙げられる。

【0057】

「評価」という用語には、あらゆる形式の測定が含まれ、エレメントが存在するか否かを判断することも含む。「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「分析すること（ａｓｓａｙｉｎｇ）」という用語は同義的に使用され、定量的および／または定性的決定を含み得る。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「存在を評価すること」としては、存在するものの量を決定すること、および／またはそれが存在するか不在であるかを決定することを含む。

【0058】

「濃縮な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」という用語は、濃縮する前よりもサンプル中の他の成分（例えば、他の細胞）と比較して、より高濃度の（ｍｏｒｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）（例えば、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５０倍、少なくとも１，０００倍））組成物の成分（例えば、特定のタイプの細胞）を指すことを意図している。場合によっては、濃縮されたものが、それが存在するサンプルのかなりの割合（例えば、２％を超える、５％を超える、１０％を超える、２０％を超える、５０％を超える、またはそれ以上、通常は、約９０％～１００％以下）を表し得る。

【0059】

「濃縮する（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）」という用語は、抗原特異的細胞をより多くのＢ細胞集団から得ることができるあらゆる方法を意図している。以下でより詳細に記載するとおり、濃縮することは、例えば、ビーズまたは細胞選別を使用して、パニングすることによって実施できる。

【0060】

エレメント（例えば、細胞または配列）を得るという文脈での「得る」という用語は、エレメントを受け取ること、ならびにエレメントを物理的に産生することを含むことを意図している。

【0061】

「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」という用語は、（葉状核とは対照的に）単一のほぼ円形の核を有し、かつリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）、単球およびマクロファージを含む血液細胞を指す。ＰＢＭＣは、フィコールグラジエントを使用して全血から濃縮することができる。

【0062】

「抗原特異的Ｂ細胞」という用語は、それらの表面上の抗原に特異的に結合する抗体を有するメモリーＢ細胞、およびその前駆細胞を指す。

【0063】

細胞またはその子孫が宿主から得られた場合、細胞は宿主に「由来する」。前駆細胞の子孫は、前駆細胞に由来する。

【0064】

「抗原を含む支持体」という用語は、その上に固定化された抗原またはその一部を含む任意のタイプの支持体（例えば、プレートおよびビーズなどの固体または半固体支持体）を含む。抗原は、直接的または間接的に、例えば、リンカーを介して、ビオチン－ストレプトアビジン相互作用を介して、または例えば細胞を介して、支持体上に固定化され得る。パニングまたはビーズの使用によって抗原特異的Ｂ細胞を濃縮する方法では、そのような支持体を利用する。

【0065】

「パニング」という用語は、抗原またはその一部でコーティングされた１つ以上の表面を有する容器（例えば、プレート）にＢ細胞が適用される方法を指すために使用される。非結合細胞は、細胞を適用後、表面を洗浄することで取り除くことができる。

【0066】

「ビーズベースの濃縮」という用語は、Ｂ細胞が、抗原またはその一部に連結させたビーズ、例えば、磁気ビーズと混合する方法を指すために使用される。

【0067】

「細胞選別」という用語は、Ｂ細胞が溶液中で検出可能な抗原（例えば、蛍光的に検出可能な抗原）と混合される方法を指すために使用される。細胞選別法では、抗原に結合した細胞を非結合細胞から選別する。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、細胞選別法の一例である。

【0068】

「複合免疫原」という用語は、複数の抗原を含む免疫原を指すことを意図している。複合免疫原は、別々に作られ、次に一緒に混合された複数の異なる抗原から構成され得るか、またはそれらは、免疫中（例えば、細胞および組織全体またはその一分画を使用する場合のように）自然に複合体であり得る。

【0069】

「活性化する」という用語は、ａ）増殖し、ｂ）形質芽球および／または形質細胞に分化し、ｃ）抗体を分泌するためのＢ細胞の刺激を指す。Ｂ細胞の活性化は、Ｂ細胞を抗原、ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞、およびサイトカインと接触させることによって行うことができるが、他の方法も公知である（例えば、Ｗｙｋｅｓ，Ｉｍｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００３ ８１：３２８－３３１を参照されたい）。

【0070】

「活性化されたＢ細胞」という用語は、活性化されたＢ細胞の子孫を含む細胞集団を指す。上記のとおり、活性化によりＢ細胞が増殖し、そのような細胞の子孫は、本明細書では活性化Ｂ細胞と称する。

【0071】

「収集する」という用語は、培養培地中の細胞を基質から分離する行為を指す。収集することは、例えば、ピペッティングまたはデカンテーションによって行うことができる。

【0072】

「抗原によって免疫させた」という用語およびその文法的同等物（例えば、「免疫させた動物」）は、抗原の免疫応答を開始している任意の動物（ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、ラクダ）を指すことを意図している。動物は、例えば、感染性因子への曝露、ワクチン接種を介して、または抗原およびアジュバントを投与することによって（例えば、注射によって）、外来抗原に曝露され得る。「抗原によって免疫させた」という用語はまた、「自己」抗原に対して免疫応答を開始している、すなわち自己免疫疾患を有する動物を含むことを意図している。

【0073】

「ランク付け」および「ランク付けされた存在量の順序」という用語は、それらが存在量によって列挙されている場合の配列順序を指す。すなわち、最初に最も豊富な配列、次に２番目に豊富な配列、次に３番目に豊富な配列などである。場合によっては、度数分布を作成し、次いでそれらの頻度で配列を並べ替えることによって、配列をランク付けできる。

【0074】

「対応するランク」または「対応してランク付けされた」という用語は、２つのランクで同じ位置を有する２つの配列を指す。例えば、第１位の第１、第２、第３の位置は、それぞれ第２位の第１、第２、第３の位置に対応する。

【0075】

「系統ランク」という用語は、優先因子によって列挙されている系統の順序を指す。優先因子としては、これらに限定されないが、系統配列の存在量、増幅因子、特定の不要なＢ細胞を枯渇させる前後の系統配列の動的変化、免疫過程中の系統配列存在量の動的変化、ＶＨＨとＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統、開発可能性責任配列の回避およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0076】

「ハミング距離」という用語は、同じ長さの２つの配列間で対応する記号が異なる位置の数を指す。

【0077】

本明細書で使用される場合、用語「系統別にグループ化された抗体」、「系統関連抗体」および「系統によって関連する抗体」、ならびにそれらの文法的同等のバリアントは、共通のＢ細胞祖先を共有する細胞によって産生される抗体である。系統によって関連する抗体は、抗原の同じエピトープに結合し、典型的には、特に軽鎖および重鎖のＣＤＲ３において配列が非常に類似している。系統関連抗体の重鎖および軽鎖のＣＤＲ３は両方とも、同一の長さおよびほぼ同一の配列を有することができる（すなわち、最大５、すなわち、０、１、２、３、４または５残基が異なる）。系統からのＣＤＲ３のグループの中で、特定のＣＤＲ３の最小ＣＤＲ３距離は、同じ長さの他のすべてのＣＤＲ３と比較して、このＣＤＲ３の最も短いハミング距離である。いくつかの実施形態では、最小ＣＤＲ３距離は１以下である。場合によっては、Ｂ細胞の祖先は、再配列された軽鎖ＶＩＣ領域および再配列された重鎖ＶＤＪ領域を有するゲノムを含み、親和性成熟を受けていない抗体を産生する。脾臓組織内に存在する「ナイーブ」または「バージン」Ｂ細胞は、例示的なＢ細胞共通の祖先である。

【0078】

関連抗体は、共通の抗体の祖先、例えば、ナイーブＢ細胞の祖先内で産生される抗体を介して関連している。「系統関連抗体」という用語は、同じ祖先Ｂ細胞から生じる細胞によって産生される抗体のグループについて説明することを意図している。「系統グループ」は、系統によって互いに関連している抗体のグループを含む。

【0079】

本明細書で使用される場合、「少なくともＣＤＲ３」または「少なくともＣＤＲ３配列」という用語は、ＣＤＲ３配列のみ、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２配列と組み合わせたＣＤＲ３配列、または可変ドメインの少なくとも５０の連続するアミノ酸（最大で可変ドメインの全長）の配列を指す。ここで、配列にはＣＤＲ３配列を含む。

【0080】

本明細書で使用される場合、「系統ツリー」という用語は、目的の個々の種につながる系統の仮想的な分岐配列を描写する、分岐解析から得られた図を指す。系統ツリー内の分岐点はノードと呼ばれる。

【0081】

本明細書で使用される場合、「系統発生樹を構築すること」という用語は、配列から系統発生樹を作成する計算行為を指す。

【0082】

本明細書で使用される場合、「系統」という用語は、理論上の降下線を指す。「系統」は「グループ」と同義的に使用され、系統によって関連する抗体のグループは、「系統グループ」と呼ばれることがある。「グループ」または「系統」という用語は、配列が１つのグループまたは系統にのみ属し得るという点で排他的である。

【0083】

本明細書で使用される「サブグループ化」という用語は、固有の特徴またはシグネチャに基づく系統内の配列のさらなるグループ化を指す。「サブグループ」は排他的ではなく、１つの配列を異なるサブグループに含めることができる。例えば、１つの配列は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの固有の特徴を同時に有することができる。「サブグループ化」はＶＨＨについてのみである。ＶＨＨ配列シグネチャを適用することにより、より良好な方法で試験を行う系統（代表的な配列）を選択する／絞り込む補助となり得る。これにより、より良い生物学的機能／生物活性の結果がもたらされ得る。

【0084】

本明細書で使用されるとき、「系統分析」という用語は、抗体の理論的降下系統を分析することを指し、これは通常、系統ツリーを分析することによって行われる。

【0085】

本明細書で使用される場合、「配列リード」という用語は、シーケンサーによって決定されるヌクレオチドの配列を指し、その決定は、例えば、技術に関連する塩基呼び出しソフトウェアによって行われる。

【0086】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸配列を得る」という用語は、アミノ酸配列を含むファイルを得ることを指す。周知のとおり、核酸配列はｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアミノ酸配列に翻訳することができる。

【0087】

本明細書で使用される場合、「最も豊富に発現する」という用語は、タンパク質配列に関して、サンプル中に最も豊富であることである。タンパク質の存在量は、例えば、そのタンパク質をコードする配列リードを数えることによって決定できる。最も多くの配列リードによってコードされているタンパク質は、最も豊富なタンパク質である。

【0088】

本明細書で同義的に使用される「アンカー」および「アンカーバインダー」という用語は、単一のＢ細胞選別または天然のＨおよびＬ対形成を有するヘテロハイブリドーマによって生成される従来の抗体を指し、これにより、抗原のエピトープに遭遇した後、ナイーブＢ細胞ＨおよびＬ配列のクローン拡大に由来する配列のグループからなる重鎖系統および軽鎖系統を位置決め／対形成することができる。系統は、互いに対形成することが知られている重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を考慮して「アンカー」することができる。これらの実施形態では、アンカーされた配列間に最小数のクロスオーバー（例えば、クロスオーバーがない）が存在するまで、分岐はそれらのノードの周りを回転する。タングルグラム分析によってツリーを「整列」させた後、対形成することがわかっているリーフをエッジによって接続できる。対形成することがわかっているリーフがエッジによって接続されている場合、理論上、介在するリーフは、エッジまたは相互にクロスオーバーイベントを作り出さない限り、相互に対形成できる。

【0089】

「抗原上のエピトープを認識するモノクローナル抗体」、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。

【0090】

「特異的結合」という用語は、異なる分子の均一混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体の能力を指す。特定の実施形態では、特異的結合相互作用は、サンプル中の望ましい分子と望ましくない分子とを区別し、いくつかの実施形態では、約１０～１００倍を超えるか、例えば、約１０００倍または１０，０００倍を超える。

【0091】

本明細書で使用される場合、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、高い親和性でタンパク質または細胞に結合できないまたは結合しないことを意味する。すなわち、ＫＤが２ｘ１０^－６Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０^－５Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０^－４Ｍ以上、より好ましくは１ｘ１０^－３Ｍ以上、さらにより好ましくは１ｘ１０^－２Ｍ以上を有するタンパク質または細胞に結合する。

【0092】

ＩｇＧ抗体の「高親和性」という用語は、標的抗原について、ＫＤが１ｘ１０^－６Ｍ以下、好ましくは１ｘ１０^－７Ｍ以下、より好ましくは１ｘ１０^－８Ｍ以下、さらにより好ましくは１ｘ１０^－９Ｍ以下、またはさらにより好ましくは１ｘ１０^－１０Ｍ以下の抗体を指すことができる。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプでは変動し得る。

【0093】

「医薬製剤」という用語は、内部に含まれる有効成分の生物学的活性が有効であるような形態であり、本製剤が投与される対象に対して許容できない毒性の追加の成分をいずれも含まない調製物を指す。

【0094】

剤、例えば、医薬製剤または細胞の「治療有効量」は、疾患、状態または障害の治療などのための所望の治療結果、および／または治療の薬物動態学的または薬物力学的効果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、および体重、および投与される細胞の集団などの因子によって異なり得る。いくつかの実施形態では、提供される方法は、有効量、例えば、治療有効量で細胞および／または組成物を投与することを含む。

【0095】

「ＣＤＲグラフト化抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体に由来する１つ以上のＣＤＲと、同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークとを含む抗体である。

【0096】

「ヒト化抗体」は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有し、これにより、ヒト対象に投与された場合、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫応答を誘導する可能性が低く、かつ／または重症度の低い免疫応答を誘発するようになる。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常領域内の特定のアミノ酸が変異して、ヒト化抗体を産生する。別の実施形態では、ヒト抗体からの定常領域（複数可）は、非ヒト種の可変領域（複数可）に融合される。別の実施形態では、ヒト化抗体は、特定の種またはアイソタイプの抗体およびヒト抗体のフレームワークに由来する１つ以上のＣＤＲを含むＣＤＲグラフト化抗体である。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列中の１つ以上のアミノ酸残基を変更して、ヒト対象に投与されたときに非ヒト抗体の可能性のある免疫原性を低下させるようにする。ここで、変更されたアミノ酸残基は、抗体のその抗原への免疫特異的結合にとって重要でないか、または行われるアミノ酸配列への変更が保存的変更であり、これにより、抗原への非ヒト抗体の結合よりも、ヒト化抗体の抗原への結合は有意に悪化しないようになる。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。

【0097】

「キメラ抗体」という用語は、１つの抗体からの１つ以上の領域と、１つ以上の他の抗体からの１つ以上の領域とを含む抗体を指す。一実施形態では、ＣＤＲのうちの１つ以上は、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、ＣＤＲはすべて、ヒト抗体に由来する。別の実施形態では、２つ以上のヒト抗体からのＣＤＲが混合され、キメラ抗体中で一致する。例えば、キメラ抗体は、第１のヒト抗体の軽鎖からのＣＤＲ１、第２のヒト抗体の軽鎖からのＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第３の抗体からの重鎖からのＣＤＲを含み得る。他の組み合わせも可能である。

【0098】

「バイパラトピック抗体」という用語は、抗体が抗原の２つの重複しないエピトープに結合することを指す。いくつかの実施形態では、バイパラトピック抗体は、軽鎖を含まない重鎖のみのＶＨＨを含む。いくつかの実施形態では、バイパラトピック抗体は、重鎖のみのＶＨＨおよび従来のＶＨ^１／ＶＬ^１対の両方を含む。いくつかの実施形態では、バイパラトピック抗体は、２つの従来のＶＨ^１／ＶＬ^１対を含む。いくつかの実施形態では、バイパラトピック抗体は、１つのエピトープを標的とするモノクローナル抗体からの第１の重鎖および第１の軽鎖、ならびに別のエピトープを標的とする追加の抗体重鎖および軽鎖を有する。いくつかの実施形態では、追加の軽鎖または重鎖は、第１の軽鎖または重鎖とは異なり得る。

【0099】

開示されている発明の抗体の抗原への結合は、当技術分野で十分に確立された１つ以上の技術を使用して評価することができる。例えば、好ましい実施形態では、抗体は、例えば組換え抗原タンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡアッセイによって試験することができる。さらに他の好適な結合アッセイとしては、これらに限定されないが、抗体が、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト抗原を発現する細胞株と反応するフローサイトメトリーアッセイが挙げられる。追加的または代替的に、抗体の結合、例えば結合速度論（例えば、ＫＤ値）は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６（Ｐａｌｌ）などで試験することができる。

【0100】

「単一Ｂ細胞選別」という用語は、抗原特異性に基づいて、単離および分離された単一Ｂ細胞を選別することを指す。単一細胞の分離、単離、および選別の技術としては、これらに限定されないが、ＦＡＣＳ（例えば、蛍光タグ付き抗原を使用して、抗原に結合する細胞を単離する蛍光活性化セルソーティング）、ＩＳＡＡＣ（チップ上のイムノスポットアレイアッセイ）、ＬＣＭ（レーザーキャプチャーマイクロダイセクション）、マイクロエングレービング、および液滴マイクロフルイディクスが挙げられる。

【0101】

特に治療用途のために、抗原を認識するためのラクダ科動物重鎖のみの抗体またはその結合部分を生成するための方法であって、本方法は、
ａ）免疫させたラクダ科からの抗原特異的Ｂ細胞を濃縮し、増幅させることと；ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１およびＶＬ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと；ｃ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１配列データをＣＤＲ３に基づく系統発生系統クロノタイプとしてグループ化する－例えば、０または１のアミノ酸が異なり、同じ長さを有するＣＤＲ３アミノ酸配列をグループ化することと；ｄ）ＶＨＨ重鎖（ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３）を含む系統を系統優先因子によってランク付けすることと；ｅ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３の系統から代表的な配列を選択し、系統優先因子に従って抗体配列ライブラリーで上位にランク付けすることと；ｆ）選択された代表的配列を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。一実施形態では、抗原は複数のエピトープを含む。

【0102】

一実施形態では、複数の系統からの配列を選択し、ステップｆ）およびｇ）を繰り返すことによって試験することができる。一実施形態では、ｆ）は、１）選択された代表的な配列のＤＮＡを合成すること、２）ＤＮＡ配列を含むベクターを構築すること、３）細胞内でベクターを発現させること、４）特定の抗原に対する親和性および生物活性試験を実施することを含み得る。一実施形態では、ｂ）は、１）抗原特異的Ｂ細胞の濃縮集団からｃＤＮＡを作製すること、２）ｃＤＮＡを配列決定して、複数のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１重鎖配列、および複数のＶＬ^１（ＶκおよびＶλ）軽鎖配列を取得して、ラクダ科動物ＩｇＧ２（ＨｃＡｂ）、ＩｇＧ３（ＨｃＡｂ）、およびＩｇＧ１（従来のＡｂ）ライブラリーを生成することを含み得る。一実施形態では、生成されたラクダ科動物抗体は、ＩｇＧ２を含む。一実施形態では、生成されたラクダ科動物抗体は、ＩｇＧ３を含む。

【0103】

本発明の別の態様は、特に治療用途のために、抗原を認識するためのラクダ科動物抗体またはその結合部分を生成するための方法にあり、本方法は、ａ）免疫させたラクダ科動物の抗原特異的Ｂ細胞を濃縮し、増幅することと、ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１およびＶＬ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと、ｃ）ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、およびＶＬ^１配列データをＣＤＲ３をベースとした系統発生系統クロノタイプとしてグループ化することと、ｄ）単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマアプローチによって生成されたアンカーバインダーに従ったＩｇＧ１ＶＨ^１／ＶＬ^１系統の対形成を行うことと、ｅ）ステップｃ）およびステップｄ）の系統および系統対を系統優先因子によってランク付けすることと、ｆ）ＮＧＳライブラリー内で上位ランクのＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３の系統およびＶＨ^１／ＶＬ^１の系統対から代表的な配列を選択することと、ｇ）選択されたＶＨ^１／ＶＬ^１対配列またはＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３の配列を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。一実施形態では、ＶＬ１鎖は、ＶκおよびＶλを含む。一実施形態では、抗原は複数のエピトープを含む。

【0104】

一実施形態では、複数の系統からの配列を選択し、ステップｆ）およびｇ）を繰り返すことによって試験することができる。一実施形態では、ｆ）は、１）選択された代表的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成すること、２）ＤＮＡ配列を含むベクターを構築すること、３）細胞内でベクターを発現させること、４）特定の抗原に対する親和性および生物活性試験の実施することを含み得る。一実施形態では、ｂ）は、１）抗原特異的Ｂ細胞の濃縮集団からｃＤＮＡを作製すること、２）ｃＤＮＡを配列決定して、複数のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１重鎖配列、および複数のＶＬ^１（ＶκおよびＶλ）軽鎖配列を取得して、ラクダ科動物ＩｇＧ２（ＨｃＡｂ）、ＩｇＧ３（ＨｃＡｂ）、およびＩｇＧ１（従来のＡｂ）ライブラリーを生成することを含み得る。一実施形態では、生成されたラクダ科動物抗体は、ＩｇＧ２を含む。一実施形態では、生成されたラクダ科動物抗体は、ＩｇＧ３を含む。一実施形態では、生成されたラクダ科動物抗体は、従来のＩｇＧ１を含む。一実施形態では、ステップｅ）における系統対のランク付けは、系統対のＶＨ^１系統の系統優先因子に基づく。一実施形態では、ステップｅ）における系統対のランク付けは、系統対のＶＬ^１系統の系統優先因子に基づく。この方法は、抗原に結合する抗体が別のタンパク質への抗原の結合を阻害するか、例えば、抗体結合がリガンドの同族受容体への特異的結合を阻害するかを判断するための試験をさらに含むことができる。

【0105】

抗原を標的とするヒト化ラクダ科動物抗体を生成するための方法は、ａ）免疫させたラクダ科動物からの抗原特異的Ｂ細胞を濃縮し、増殖させることと、ｂ）抗原特異的Ｂ細胞からＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１鎖配列を含む抗体ＮＧＳライブラリーを生成することと、ｃ）ＮＧＳライブラリー内のＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、およびＶＨ^１の配列を系統別にグループ化することと、ｄ）親ＶＨＨ抗体または同じナイーブＢ細胞起源を共有するＶＨ^１内の置換可能な位置を、それぞれが同じ系統内の親抗体と同じエピトープに結合する複数の関連する抗体のアミノ酸配列とそのアミノ酸配列を比較することによって同定することと、ｅ）親ＶＨＨ抗体またはＶＨ１抗体の１つ以上の置換可能な位置のアミノ酸を、ヒト抗体内の対応する位置にあるアミノ酸で置換することと、ｆ）選択された配列内の置換された残基を含む抗体の試験を行って、抗体が抗原またはその一部に結合するか否かを判断することと、を含む。一実施形態では、抗原は複数のエピトープを含む。一実施形態では、置換可能な位置は、ＣＤＲ領域内にある。一実施形態では、置換可能な位置は、ＦＲ領域内にある。

【0106】

本発明で生成されたラクダ科動物の従来のＩｇＧ１抗体は、親ＩｇＧ１抗体の１つ以上の置換可能な位置のアミノ酸を、ヒト抗体内の対応する位置にあるアミノ酸で置換することによってヒト化することができる。

【0107】

ラクダ科動物の免疫および抗原特異的Ｂ細胞の単離／増殖のための方法の実施形態を図２に概略的に示す。そのような実施形態は、１）ラクダ科をＤＮＡで免疫するか、または小分子を担体タンパク質で免疫するか、ペプチドを担体タンパク質またはタンパク質または細胞もしくは組織などの抗原複合体で免疫することと、２）ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ１の免疫応答を別々に監視することと、３）ＰＢＭＣ、脾臓、リンパ節、リンパ組織からＢ細胞を含む細胞のサンプルを取得することであって、Ｂ細胞は、メモリー細胞、原形質芽細胞、および細胞膜１ｇＧ２（ＨｃＡｂ）、ＩＧ３（ＨｃＡｂ）およびＩｇＧ１（従来のＩｇＧ）を有する異なる段階のＢ細胞を指す、取得すること、４）物理的表面抗原パニング、または磁気ビーズ単離またはフローソーティングのいずれかを介して、細胞表面抗体で抗原特異的Ｂ細胞を濃縮することと、５）抗原、ラクダ科動物ＣＤ４０－Ｌ発現細胞および成長因子の存在下で細胞増殖のために濃縮されたＢ細胞を活性化することと、を含む。活性化ステップにより、メモリーＢ細胞を選択的に刺激して分化し、形質細胞となる。これらの形質細胞は急速に分裂し、大量の抗体を発現する。いくつかの実施形態では、抗血清中のＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ１の免疫応答は、ａ）異なるｐＨ溶出条件でプロテインＡおよびプロテインＧカラムを用いてＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ１を精製することによって、ｂ）ＩｇＧ２、３およびＩｇＧ１の免疫応答力価を分析することによって、またはｃ）ＩｇＧ２、３およびＩｇＧ１の生物活性を所望のイムノアッセイで試験することによって、監視される。

【0108】

実際に抗原に結合している表面結合抗体を有するＢ細胞のみを増殖させるこの方法の活性化ステップは、３つの効果を有する：（１）活性化ステップにより、抗原に特異的に結合しているＢ細胞のみを増殖させ、それにより、支持体に非特異的に結合している細胞と比較して、これらの細胞の相対濃度を増加させる。（２）この方法の活性化ステップにより、ＨｃＡｂまたは従来のＩｇＧ重鎖および軽鎖ｍＲＮＡの発現が、抗原に特異的に結合しているＢ細胞内でのみ誘導される。（３）これらの「まれな」抗原特異的Ｂ細胞であるが、高い親和性または特異性を有する抗体を発現するか、「まれな」エピトープが増幅され、シグナル対ノイズ比が大幅に改善されていることが認識される。

【0109】

いくつかの実施形態では、濃縮に使用される抗原としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
ａ）免疫原；
ｂ）免疫原の所望のドメイン／エピトープ；
ｃ）複合免疫原：動物は、複数の抗原または細胞または組織、あるいは生体液で免疫させ得、複数の抗原のそれぞれに対する抗原特異的Ｂ細胞は、互いに別々にまたは全体として濃縮され得る。次に、抗原特異的Ｂ細胞を活性化させて、互いに別々に、または全体として収集することができる。ＶＨＨの単純さは、ハイスループットＶＨＨのクローニングおよび発現について利点をもたらし、複合免疫原をデコンボリューションすることにより、ＶＨＨの対応する各抗原を同定することが比較的容易である。複合免疫原は、これらに限定されないが、タンパク質アレイまたは免疫沈降をベースにした質量分析法または細胞、組織抗原－ｃＤＮＡライブラリースクリーニング法などの方法によってデコンボリューションすることができる。

【0110】

時にはＢ細胞の純度を向上させるために、抗原特異的パニングの前にパニングによって不要なＢ細胞を枯渇させることが望ましい場合もある。

【0111】

ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、ＶκおよびＶλ ＮＧＳライブラリーは、それぞれＩｇＧ２（ＨｃＡｂ）、ＩｇＧ３（ＨｃＡｂ）、およびＩｇＧ１（従来のＡｂ）を発現するＢ細胞から調製できる。

【0112】

ラクダ科動物のＩｇＧ１（従来のＡｂ）、ＩｇＧ２（ＨｃＡｂ）、およびＩＧ３（ＨｃＡｂ）はそれぞれ固有の遺伝子構成を有し、これにより、特定のプライマーセットを設計してｃＤＮＡを個別に増幅することができる（例えば、図３）。ｃＤＮＡ増幅は、次のステップで実施できる：
ａ）トータルＲＮＡ抽出（ＴＲＩＯＬ）および精製（ＲＮｅａｓｙキット）；
ｂ）ＲＮＡの定量化および－２０℃での任意の保存。
ｃ）アイソタイプ特異的プライマーセットを用いたｍＲＮＡキャプチャー／ＲＴ－ＰＣＲ（ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、ＶκおよびＶλ）。

【0113】

ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、ＶκおよびＶλのＮＧＳライブラリーは、例えば、ＮＧＳアダプターおよびライブラリー索引付けを追加したＰＣＲを介したＮｅｘｔｅｒａ Ｌｉｂｒａｒｙによって調製できる。

【0114】

ＮＧＳライブラリーのｃＤＮＡは、例えばｌｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ３００ｘ２機器を使用して、ライブラリーのハイスループットシーケンスによって配列決定され得る。

【0115】

配列は、バイオインフォマティクスプロセス：－ＮＧＳＱＣＴｏｏｋｉｔを使用した品質評価、アセンブリＲ１／Ｒ２の読み取り、翻訳、およびＣＤＲ１、２、３の同定によって構造化できる。

【0116】

ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、ＶκおよびＶλ抗体は、例えばＣＤＲ３アミノ酸配列のＮＧＳデータを使用してグループ化し、系統発生系統のクロノタイプを構築することができる。

【0117】

系統は、同じナイーブＢ細胞に由来する配列のグループによって定義され（同じＶおよびＪの配置）、系統は、ＣＤＲ３領域内に１アミノ酸以下のアミノ酸配列の差を有するグループとして定義され得る（ハミング距離が１以下、またはアミノ酸の合計が５ａａ以内である場合同じＣＤＲ３配列）。系統の量は、ライブラリー内のナイーブＢ細胞の量、およびこれらの抗体が認識するエピトープの数を反映していると推定される（図４）。

【0118】

一般に、系統サイズは、抗体の成熟およびクローン拡大と相関する。バイオインフォマティクス技術では、候補抗体選択への合理的なアプローチのためのデータの構造および可視化が可能になる。各ＮＧＳライブラリーについて、ＮＧＳＱＣＴｏｏｋｉｔを使用したＱＣ、アセンブリＲ１／Ｒ２読み取り、翻訳、ＣＤＲ１、２、３の同定、およびＣＤＲ３の類似性に基づく系統グループ化を含むバイオインフォマティックプロセスを介して構造化された配列によって、最大１０，０００の系統を同定することができる。

【0119】

ＶＨＨ（ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３）配列は、固有の配列シグネチャによってさらにグループ化（サブグループ化）され得る。

【0120】

ラクダ科動物は、ＶＨＨ Ｂ細胞レパートリーをさらに多様化し、抗原結合能力を拡大するために、複数のメカニズムを進化させてきた。これらのメカニズムから生じる配列「シグネチャ」により、系統をさらにグループ化できる。系統をさらにグループ化するためのこのような追加の基準は、抗体の微妙に異なる認識を反映し、固有のＶＨＨ認識パターンを有するエピトープを同定する補助となる（図５）。ＶＨＨのシグネチャとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：
ｉ）ＦＲ２親水性領域：ほとんどのＶＨＨ抗体では、ＦＲ２は従来のＩｇＧに固有のアミノ酸置換を有する：３７Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ。
ｉｉ）拡大ＣＤＲ１：多くのＶＨＨは、ＣＤＲ１の隣に追加の超可変領域（Ｋａｂａｔの番号付けによれば残基２７～３０）を有する。ＶＨＨは、この領域を長いＣＤＲ３と一緒に使用して、抗原と相互作用する表面積を増加させる；
ｉｉｉ）ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３間の追加のジスルフィド結合：ラクダおよびヒトコブラクダでは、８２％のＶＨＨがＣＤＲ１－ＣＤＲ３間にジスルフィド結合を有し、ラマおよびアルパカでは、７４％のＶＨＨがＦＲ２－ＣＤＲ３間にジスルフィド結合を有する。
ｉｖ）長いＣＤＲ３：長いＣＤＲ３（≧１５ａａ）を有するこれらのＶＨＨの場合、多くの場合、追加のジスルフィド結合が見られる。
ｖ）ＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合：約５～１０％のＶＨＨは、ＣＤＲ３内に追加のジスルフィド結合を有する。これは、より多くのコンフォメーション認識パターンを示し得る。
ｖｉ）ＣＤＲ１内の追加のジスルフィド結合。
ｖｉｉ）従来のＩｇＧと同じＶおよびＪ生殖細胞系列を有する非古典的ＶＨＨ：従来のＩｇＧ１と同じナイーブＢ細胞起源（同じＶおよびＪの配置）を共有するＶＨＨ系統グループ。これは、ＶＨＨおよびＩｇＧ１の両方による同じまたは類似のエピトープ認識を示す。
ｖｉｉｉ）固有の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ：例えば、Ａｒｇ１１８で置換された保存されたＴｒｐ１１８および／またはＦＲ３内のより低い疎水性プロファイル。
ｉｘ）新規カノニカル結合ループ構造：カノニカルループ構造を決定するための重要部位に存在する超変異ホットスポットは、ＶＨＨ構造レパートリーを多様化する興味深い可能性を生み出す。結晶学的研究は、多くの場合、ラクダＶＨＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループが、従来のＶＨ１の既知のカノニカル構造から逸脱していることを強調している。配列ベースの新規Ａｇ結合ループコンフォメーション予測により、系統のさらなるグループ化も裏付けられる。
ｘ）ＣＤＲ２の長さ
ｘｉ）ＣＤＲ３の長さ
ｘｉｉ）ＣＤＲ３領域に３つ以上の正電荷が存在する
ｘｉｉｉ）アミノ酸配列中のシステインの数。
ｘｉｖ）ＣＤＲ領域に見られる２～４個のアミノ酸モチーフ。モチーフは、リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定される。
ｘｖ）ＣＤＲ３の長さおよび同一性、
ならびに
ｘｖｉ）同じ免疫グループのラクダ科動物間の収束モチーフまたは配列シグネチャ。

【0121】

ＶＨＨ（ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３）、ＶＨ^１－Ｖκ、およびＶＨ^１－Ｖλのヒト化は、系統分析によって導くことができる。

【0122】

本発明は、抗体の結合活性を有意に低下させることなく改変することができる抗体の位置を同定するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、そのアミノ酸配列を、同じ系統内の親抗体と同じ抗原およびエピトープにそれぞれ結合する複数の関連抗体のアミノ酸配列と比較することによって、親抗体内の置換可能な位置を同定することを含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、置換可能な位置のアミノ酸は、抗体の活性に有意な影響を与えることなく、異なるアミノ酸と置換され得る。主題の方法を使用して、抗体の親和性を有意に低下させることなく、ＣＤＲのアミノ酸配列を変更することができる。

【0124】

ヒト化法、または他の抗体工学法において、本発明は、様々な治療用途および診断用途での使用を見出す。

【0125】

二重特異性／バイパラトピック抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結など様々な方法によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｒｍ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１（１９９０年）、Ｋｏｓ－ｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３（１９９２年）を参照のこと。さらに、二重特異性抗体は「ダイアボディ」または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」として形成することができる。複数のＶＨＨ可変ドメインをリンカーによって接続して、二価および多価の抗体を形成することもできる。

【0126】

ＶＨ^１およびＶＬ^１（ＶκまたはＶλ）の対形成系統は、ヘテロハイブリドーマおよび／またはフローソートされた単一のＢ細胞によって分泌される抗体内で互いに対形成することが発見されたＶＨ^１－ＶＬ^１「アンカー」アミノ酸配列を考慮することによって、同定できる（図６に示す）。

【0127】

ＮＧＳ技術を使用したラクダ科動物の従来のＩｇＧ１開発の課題は、元の天然のＨとＬとの対を同定する方法である。典型的には、アンカーＨおよびＬ（κおよびλ）系統を確立するための２つのアプローチ（１）ヘテロハイブリドーマおよび（２）単一Ｂ細胞選別が使用される。系統対がこれらのアンカーでさらにグループ化された後、各系統対からの代表的な配列Ｈ／Ｌ対が、ＶＨＨ抗体として、ＤＮＡ合成、結合スクリーニング、および生物活性試験のために選択される。

【0128】

Ｉ．ヘテロハイブリドーマ法
リンパ球をＰＢＭＣから単離するか、免疫させたラクダ科動物から脾臓またはリンパ球を単離する；リンパ球をＳＰ／２０などのマウス骨髄腫融合パートナー細胞株と融合させ、ヘテロハイブリドーマを生成する；ＥＬＩＳＡおよび生物活性アッセイを用いてヘテロハイブリドーマの上清をスクリーニングする；選択されたヘテロハイブリドーマ由来のＶＨ^１およびＶＬ^１の配列決定を行う；これらのＶＨおよびＶＬの対は、ＩｇＧ１ ＮＧＳライブラリーからのＶＨ^１系統およびＶＬ^１系統を対形成するためのアンカーとして使用する。

【0129】

ＩＩ．単一Ｂ細胞ＮＧＳ法
ａ）パニングおよび増殖後に抗原特異的Ｂ細胞を回収する；ｂ）単一Ｂ細胞選別を行う；ｃ）ＶＨ^１－ＶＬ^１リンケージＰＣＲによりアンプリコンを増幅する；ｄ）ＮＧＳを使用して、バイオインフォマティクスを介してＶＨ^１－ＶＬ^１対配列（ＶＨ^１－ＶκまたはＶＨ^１－Ｖλ）をアンカーとして同定する。

【0130】

この方法では、ＨｃＡｂおよびＮＧＳを用いた従来のＩｇＧ１など、免疫からの抗原特異的Ｂ細胞レパートリー全体を捕捉することができ、ＨｃＡｂの単純さを利用する：
ａ）ＩｇＧ２／ＨｃＡｂ、ＩｇＧ３／ＨｃＡｂ、ＩｇＧ１／κおよびＩｇＧ１／λ
ｂ）異なるＣＤＲ３＿異なるエピトープを有する系統
ｃ）配列シグネチャ＿異なるエピトープを有するＶＨＨ系統
ｄ）ヘテロハイブリドーマから生成されたＶＨ－ＶＬアンカーとのＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ系統の対形成

【0131】

抗原の広域スペクトルのエピトープを認識する抗体の系統を選択できる（図７に示す）。

【0132】

各系統または系統対は、１つの固有のエピトープ、すなわち上位１００の系統／系統対からの１つの代表的な配列（ＶＨＨ）または１つの代表的な対（ＶＨ^１－ＶＬ^１）を認識すると推定され（例えば、ＶＨＨの場合は７０配列、ＶＨ^１－ＶκまたはＶＨ^１－Ｖλの場合は３０配列）、遺伝子合成、バインダースクリーニング、および生物活性試験用に選択される。系統選択基準（優先因子）としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
１）高存在量の配列から低存在量の配列までの系統：各系統からの固有のｃＤＮＡ数（配列存在量）の総数は２～５０，０００の範囲であり、最も豊富な配列を有する系統は、抗原刺激後の最も広範なクローン拡大を示し得る。
２）高増幅因子から低増幅因子への系統、Ｂ細胞の濃縮／増殖前後の配列存在量の動的変化（増幅倍率は５～１，０００の範囲であり得る）。
３）免疫過程中の系統配列の存在量の変化。これは、抗原特異的配列の濃縮および抗体親和性成熟を示す（配列存在量／固有のｃＤＮＡ数の変化は、２～１，０００の範囲であり得る）。
４）該当する場合、特定の不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列存在量の変化（配列存在量／固有のｃＤＮＡ数の変化は、２～１，０００の範囲であり得る）。
５）ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じナイーブＢ細胞起源（同じＶおよびＪの配置）を共有する系統。
６）開発可能性責任配列の回避：熱安定性（疎水性コア、電荷クラスター残基など）、化学的安定性（脱アミド化および異性化）、溶解性（表面疎水性など）ならびに不均一性（グリコシル化）など、開発可能性の問題を引き起こし得るいくつかのアミノ酸からなる配列が存在する（Ｔｏｍｏｙｕｋｉ Ｉｇａｗａら、ｍＡｂｓ，２０１１年）。これらの系統または系統対を選択することは避ける必要がある。

【0133】

選択基準は、上記の優先因子の組み合わせであってもよい。

【0134】

選択された系統配列または配列対は、ＤＮＡ合成のために使用され、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＨｃＡｂ、ラクダ科ＩｇＧ１、およびヒトＦｃキメラなどの発現ベクターに構築される。

【0135】

場合によっては、選択されたＶＨＨ系統および選択されたＶＨ^１／ＶＬ^１系統の対が両方とも同じナイーブＢ細胞起源を共有することもある。

【0136】

別の態様では、最初の選択ラウンドで同じ上位ランクの系統対内でより多くの対（例えば、ＶＨＨの場合は７０配列、ＶＨ^１－ＶκまたはＶＨ^１－Ｖλの場合は３０配列対）が遺伝子合成、バインダースクリーニングおよび生物活性試験のために選択される。これは、ＶＨ^１－ＶκまたはＶＨ^１－Ｖλの代表的な配列対が、最適な対を同定する前に、より多くの組み合わせ試験を必要とするためである。

【0137】

最初の１００抗体により所望の結果が得られない場合、次の上位ランク１００系統のより多くの配列および配列対（例えば、ＶＨＨの場合は７０配列、ＶＨ^１－ＶκまたはＶＨ^１－Ｖλの場合は３０配列対）が、遺伝子合成、バインダースクリーニング、および生物活性試験のために選択される。

【0138】

この方法の有意性により、広範なエピトープを高解像度で網羅するための試験のために、各系統から代表的な配列を体系的かつ関係的に選択することができる。これにより、次の状況での抗体の発見が改善される。
ａ）最良の親和性、特異性、および開発可能性のための候補の大規模なプールを用いた治療用抗体の発見；
ｂ）並行用途および他の用途でのコンパニオン診断抗体の発見；
ｃ）二価および多価抗体の構築および開発；
ｄ）抗体の重鎖と軽鎖との対の発見。

【0139】

同じエピトープに結合する抗体は、系統関連配列によって同定できる（図８に示す）。

【0140】

ＣＤＲ１およびＣＤＲ２が他の結合特性の決定に多少関与している一方で、ＣＤＲ３配列がエピトープへの結合の主な決定因子であることはよく認識されている。各系統からリード（例えば、図８で＠および＋でマークされている）をスクリーニングした後、親和性、特異性、機能性、生産性、および開発可能性などの異なる特性を備えたより多くの候補を同定して、最も望ましい抗体の試験を行い、選択することができる。これは、同じ系統からの抗体は、同じまたは類似のエピトープを認識するとされているためである。このステップは、さらなる抗体薬物開発のための大きい候補プールを構築する補助にもなる。

【0141】

同じナイーブＢ細胞の起源を共有する約１０～２０％のＶＨＨおよびＶＨ^１が存在し得る。最初の選択ラウンドから選択されたＶＨＨの配列は、ＶＨＨと同じＶ（Ｄ）Ｊ配置を有するＶＨ^１を同定し、さらに選択するためにＶＨ－ＶＬ対をさらに試験する補助となり得る。選択基準としては、
１）ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２の差＞２ａａ（アミノ酸）；
２）ＦＲ１および／または２および／または３および／または４の差＞２ａａ；
３）ＶＨＨと従来のＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列；
４）ＶλおよびＶκの両方と対形成できるＶＨ配列、が挙げられる。

【0142】

選択された配列または配列対は、ＤＮＡ合成のために使用され、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＨｃＡｂ、ラクダ科ＩｇＧ１、およびヒトＦｃキメラなどの発現ベクターに構築される。

【0143】

最良の抗体が同定されるまで、より多くの配列および配列対を選択でき、残りのクローンはさらなる候補のプールとして保持される。

【0144】

系統分析によるＶＨＨ（ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３）、ＶＨ^１－ＶκおよびＶＨ^１－Ｖλのヒト化。

【0145】

従来のＶＨと同じナイーブ細胞を共有する非古典的ＶＨＨ遺伝子であり、これは、（１）ＶＨＨ系統をサブグループ化すること、（２）同じまたは類似のエピトープを認識するＨｃＡｂおよび従来のＩｇＧを選択すること、（３）ＨｃＡｂおよび従来のＩｇＧの両方のヒト化を促進することにとって有用である。

【0146】

ＶＨＨドメインは典型的には、ヒトタイプ３ＶＨドメイン（ＶＨ３）と高い配列同一性を示し、これにより、それらの低い免疫原性が説明される（Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ Ｖ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．９８（３）：４５６－６２，２００２年）。さらに、従来の抗体のラクダ科動物ＶＨ^１、Ｖλ、およびＶκドメインも、配列および構造の両方で、それらのヒト対応物と有意な相同性を示す（Ａｌｅｘ Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋら、ｍＡｂｓ ７：４，６９３－－７０６；２０１５年）。図９。公知のとおり、同じ系統グループ内の配列は、同じまたは類似のＣＤＲ３配列を共有し、同じエピトープを認識する。機能スクリーニングにより、ＣＤＲおよびＦＲなどの可変領域内のこれらのアミノ酸を同定することができ、これらのアミノ酸は系統内で異なっていても同じ生物学的機能を構成するため、置換可能である。したがって、これらの耐性位置をヒト生殖細胞系抗体アミノ酸で置換することができ、置換可能なアミノ酸は、より良好なヒト化のためにＣＤＲ領域内にさえあり得る。

【0147】

さらに、前述のとおり、これらの非古典的ＶＨＨ（ＦＲ２親水性アミノ酸を除く）は、従来のＶＨ^１と同じＩＧＨＶ３またはＩＧＨＶ４、ＤおよびＪ遺伝子の遺伝子座に由来し、これらのグループ内のＶＨＨとＶＨ^１配列と間の系統構造は類似しており、系統分析を介して互いのヒト化設計をさらにサポートすることができる。
医薬製剤

【0148】

別の態様では、本発明は、医薬的に許容される担体と一緒に配合された、本発明のモノクローナル抗体の１つもしくは組み合わせ、またはその抗原結合部分（複数可）を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、（例えば、２つ以上の異なる）抗体の１つもしくは組み合わせ、または本発明の免疫コンジュゲート体または二重特異性分子を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する抗体（または免疫コンジュゲート体または二重特異性抗体）の組み合わせを含むことができる。
実施例

【0149】

実施例１：Ｂ細胞単離および増幅（ＢＩＡ）／ＮＧＳ配列分析および単一Ｂ細胞法を使用した、抗原に特異的に結合するＶＨＨ抗体のグループの同定。

【0150】

１Ａ．ＢＩＡ／ＮＧＳ
材料および方法
ＢＩＡ

【0151】

Ａ１．ＣＤ４０Ｌ発現ＥＬ４．ＩＬ－２－Ｃの構築
細胞株ＴＩＢ－１８１（ＥＬ４．ＩＬ－２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ヒトＣＤ４０ＬをコードするｃＤＮＡを含み、ヒトＣＤ４０Ｌの発現をもたらすｐＣＭＶ－６ベースのベクターで安定的にトランスフェクトした。安定した細胞株を選択し、フィーダー細胞としてマイトマイシンで処理した。

【0152】

Ａ２．アルパカ馴化培地
非免疫アルパカを屠殺し、アルパカ馴化培地の調製のために脾細胞を単離する。１０％ＦＢＳ、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、およびホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）を含む活性化培地を調製する。４ｘ１０^８脾細胞を活性化培地中のＴ１７５フラスコに懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートする。インキュベーション後、上清を収集し、アルパカ馴化培地としてろ過する。

【0153】

Ａ３．動物の免疫
０．５ｍＬ ＰＢＳ中の抗原（例えば、４００μｇキーホールリンペットシアニン（「ＫＬＨ」）は、０．５ｍＬの完全フロイントアジュバントで乳化する。乳化抗原は、アルパカの首および背中に沿って皮下注射する。約２００μＬ（またはそれ以下）の５回の注入が実施される。免疫は１４日間隔で３回行う。

【0154】

Ａ４．異なる臓器からのリンパ球の単離
血液からＰＢＭＣを単離するために、免疫させたアルパカからのＥＤＴＡ含有血液サンプルを、２％ＦＢＳを含む１ｘＤＰＢＳで２倍に希釈する。次に、密度遠心分離のために、希釈した血液をゆっくりとＦｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＰＬＵＳ密度勾配培地に入れる。上層を除き、リンパ球層を清潔な遠心管に移す。次に、ＰＢＭＣを１ｘＤＰＢＳで２回洗浄する。

【0155】

脾臓からリンパ球を単離するために、免疫させたアルパカからの脾臓を１ｘＤＰＢＳで洗浄し、清潔なディッシュに入れる。ほとんどのリンパ球が放出されるまで培地を注入することによって脾臓をバルーンにより膨張させる。次に、２０ｃｃの注射器の底を使用して、脾臓を細かく破砕させる。破砕時に多くの力を使用することは、リンパ球の可能な限り最高の収量を得る助けとなる。放出された細胞はすべて、穏やかな遠心分離（例えば、１４００ｒｐｍ）によって収集される。上清を吸引した後、赤血球溶解緩衝液のペレットの５倍量を添加して、サンプルを少なくとも４分間静置する。次に、ＲＰＭＩ１６４０培地を添加して溶解を終了させる。次にリンパ球を１ｘＤＰＢＳで２回洗浄する。

【0156】

リンパ節からリンパ球を単離するために、腸間膜リンパ節および鼠径部リンパ節を免疫させたアルパカから収集する。リンパ球は、ＲＰＭＩ１６４０培地でリンパ節を粉砕することによって放出される。細胞は細胞メッシュを通過させて、遠心分離によって収集する。ペレットの５倍量の赤血球溶解緩衝液をサンプルに添加し、サンプルを少なくとも４分間静置して、ＲＢＣを除去する。次に、ＲＰＭＩ１６４０を添加して、赤血球の溶解を停止させる。次にリンパ球を１ｘＤＰＢＳで２回洗浄する。

【0157】

骨髄からリンパ球を単離するために、免疫させたアルパカの脛骨および橈骨を骨の両端で開き、骨髄を採取する。ＲＰＭＩ１６４０培地で骨髄を粉砕することにより細胞が放出される。細胞は、細胞メッシュを通過させ、遠心分離によって収集する。ペレットの５倍量の赤血球溶解緩衝液を添加し、サンプルを少なくとも４分間静置して、ＲＢＣを除去する。次に、ＲＰＭＩ１６４０培地を添加して溶解を停止させ、リンパ球を１ｘＤＰＢＳで２回洗浄する。

【0158】

Ａ５．非特異的細胞の枯渇
収集した細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、０．０５ｍＭ ２－メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、１Ｍ／ｍＬの細胞懸濁液を得る。マクロファージおよび単球をプレート表面に非特異的に接着させるために、細胞を６ウェル培養プレートで３７℃で１時間プレインキュベートする。プレインキュベーション後、非結合細胞を収集してカウントする。

【0159】

Ａ６．Ｂ細胞パニング
収集した細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシンで再懸濁し、１００万／ｍＬの細胞懸濁液を得る。細胞は、特定のＢ細胞パニング用の抗原でプレコートした１０ｃｍディッシュあたり５００万で、３７℃で１．５時間インキュベートさせる。インキュベーション後、浮遊細胞が数個しか見つからなくなるるまで、播種した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で２～１０回洗浄する。非結合細胞をすべて収集してカウントし、カウントをＡｌと指定する。

【0160】

Ａ７．Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞培養
パニングによって保持されたＢ細胞を含むディッシュに２０ｍＬのＢ細胞培地を添加する。Ｂ細胞培地には、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、１０％アルパカ馴化培地、様々な成長因子（例えば１つ以上のインターロイキン）（１～５０ｎｇ／ｍｌの濃度）、２．５Ｍ ＭＭＣ前処理済みフィーダー細胞（ＥＬ４．ＩＬ－２－Ｃ３、アルパカＣＤ４０Ｌを発現）を含む必要がある。品質管理試験における対照として、Ｂ細胞のみおよびフィーダー細胞のみのディッシュも培養する。細胞は、５％ＣＯ_２で８～１０日間培養する。

【0161】

Ａ８．細胞収集およびＱＣ
１０日目に、Ｂ細胞培養物の５０μＬ上清をＥＬＩＳＡに使用して抗体分泌の試験を行う。共培養ディッシュ内のすべての細胞を収集し、カウントする。この数はＡ２と見なす。フィーダー細胞のみのディッシュ内の細胞を収集し、カウントする。この数はＡ３と見なす。Ｂ細胞増幅倍率（ＢＣＡＦ）は、次式により算出する：
ＢＣＡＦ＝（Ａ２－Ａ３）／（５Ｍ－Ａ１）

【0162】

Ａ９．ＮＧＳライブラリーの構築
各パニングからのＢ細胞を使用して、ＮＧＳｃＤＮＡライブラリー構築用の鋳型ＲＮＡを調製した。配列濃縮を算出するために、パニング前にＢ細胞を使用するライブラリーも構築した。
ｉ．ＲＮＡ単離

【0163】

ＴＲＩｚｏｌ法を使用して共培養Ｂ細胞からＲＮＡを抽出する。

【0164】

培養Ｂ細胞は、繰り返しピペッティングするか、シリンジおよび針を通過させることにより、ＴＲＩＺＯＬ試薬によって溶解させる。０．５－１ｘ１０^６セルあたり１ｍｌの試薬を使用する。２０％クロロホルムを添加し、管を約１５秒間撹拌させる。水相はピペットを使用して注意深く除去する。等量のイソプロパノールを水相に加え、穏やかに混合する。サンプルを最大速度（１２，０００ｒｐｍ）で１０分間遠心分離させる。イソプロパノールを除去し、ペレットを１ｍｌ ７５％エタノール／ＤＥＰＣ処理水で洗浄し、穏やかに混合する。ペレットを７，０００ｒｐｍで１分間再度遠心分離させ、ＲＮＡを、約７０μｌのＲＮａｓｅフリー水中で回収する。

【0165】

ｉｉ．逆転写
０．２ｍＬＰＣＲミックスでは、異なるプライマー（ランダム６ｍｅｒ、オリゴｄＴおよびＡＩ．ＣＨ２＋ＡＩ．ＣＨ２．２）をそれぞれ使用して、８つの反応を増幅させる。ＲＮＡ－プライマーミックスを６５℃で５分間加熱し、次いで氷上で少なくとも１分間インキュベートする。ＲＴ反応ミックスを調製し、逆転写を３０℃で１０分間、４２℃で５０分間、７５℃で１５分間行う。

【0166】

ｉｉｉ．ｃＤＮＡ増幅ＰＣＲ
逆転写からの約２μｌのｃＤＮＡは、２５μｌの２ｘＰｒｉｍｅｒ ｓｔａｒミックス、１８μｌのＲＮａｓｅフリーｄＨ２０、１μｌの各プライマーＮＧＳ－リーダー１＿Ｌ（ＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧ－配列番号６３）、ＮＧＳ－リーダー２＿Ｌ（ＧＣＡＧＧＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣ－配列番号６４）、ＮＧＳ－リーダー３＿Ｌ（ＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴ－配列番号６５）、ＮＧＳ－ヒンジｌ＿Ｌ（ＴＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＴＧＧＧ－配列番号６６）およびＮＧＳ－ヒンジ２＿Ｌ（ＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＧＣ－配列番号６７）を含む５０μｌのＰＣＲ反応の鋳型として使用し、次のサイクルを行った：９８℃で３分間、２０サイクル（９８℃で１５秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、７２℃で３分間。得られたアンプリコンは、ＴＩＡＮＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、３００ｂｐ以上のサイズのカットオフで製造業者の指示に従って精製する。

【0167】

ｉｖ．インデックスＰＣＲ
各アンプリコンサンプルは、２５μｌの２ｘＰｒｉｍｅｒ ｓｔａｒミックス、１８μｌのＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ２０、１μｌの各プライマー対（Ｐ５－ｓｅｑＦおよびＰ７－ｉｎｄｅｘｌ－ｓｅｑＲなど）、および１００ｎｇの鋳型としての第１ラウンドＰＣＲを含む、第２の「タグ付け」５０μｌ ＰＣＲ反応で個別にバーコードが付けられ、次に、以下のサイクルを行った：９８℃で３０秒間、１２サイクル（９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）；７２℃で５分間。最後の３つのアンプリコン（３つの異なるリバースプライマーに由来）をプールして、ＴＩＡＮＧＥＮ（登録商標）ＰＣＲ精製キットを使用して、１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルから精製する。

【0168】

Ａ１０．ＮＧＳデータ分析
増幅させたｃＤＮＡは、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ｌｌｌｕｍｉｎａ，Ｍｉｓｅｑ，３００ｘ２）を使用して配列決定する。各サンプルから、１～３００万回のリードが生成される。データは、ＮＧＳＱＣツールキットを使用して品質確認し、ＦＬＡＳＨを使用してアセンブルする。アセンブルされた配列はタンパク質配列に変換し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域（ＩＭＧＴの番号付けに基づく）を計算によって同定する。配列は、図４に示すとおり、同じＣＤＲ３の長さ、１以下のＣＤＲ３ハミング距離、および同じマッピングされたＶ／Ｊ生殖細胞系列に基づいて、系統／グループにクラスター化させる。配列は、同じＣＤＲ３の長さと８０％以上のＣＤＲ３の同一性に基づいて、さらにサブグループ化して、クラスター化させる。例えば、系統は、少なくとも１２アミノ酸のＣＤＲ３の長さ、０または１のＣＤＲ３ハミング距離（参照配列と比較して）を有し、また同一のＶ／Ｊ領域アミノ酸配列を有するクローンによって定義され得る。配列または配列グループの濃縮スコアは、パニングの前後にＢ細胞から構築されたライブラリー間の頻度の比率を使用して算出する。

【0169】

代表的なクローン（２０以上）は、図７に示すとおり、系統優先因子に基づいて異なる系統から選択され、それらが産生する抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳなどの様々な結合アッセイで試験が行われる。異なる系統から選択されたクローンは、典型的には、標的タンパク質の異なるエピトープに結合することがわかっている。既存のクローンを最適化するために、図８に示すとおり、同じ系統からさらなるクローンを選択できる。系統内から選択されたクローンは、典型的には、同じエピトープの異なる部分に結合することが示されている。

【0170】

選択Ａ：クラスター内で最も数の多いクローンを選択する。
以下のスクリーンショットに示すとおり、クラスターＣ３２８は、濃縮後に３５７倍の頻度の増加を有する。クラスター内の上位のクローンであるＮＢＬ５０５－Ａ１Ｌ１－Ｐ３Ｒ３＿３５５は、さらなる試験のために選択するのに良い選択肢である。

【表1】

【0171】

選択Ｂ：濃縮スコアが最高であるクローンを選択する。
濃縮前後のライブラリー内の配列を比較することにより（例えば、パニングまたはフローソートによって）、濃縮前後の配列頻度に基づいて濃縮スコアを計算することができる。機能的なＶＨＨを分泌するクローンを選択する機会を増加させるために、濃縮スコアを使用してクローンの選択に優先順位を付けることができる。以下のスクリーンショットでは、濃縮率に基づいてクローンＮＢＬ５０５－Ａ１Ｌ２－Ｐ３Ｒ２＿５５５９が選択されている。

【表2】

【0172】

１Ｂ．単一Ｂ細胞
Ｂ１．免疫させたアルパカＰＢＭＣからのＡｇ特異的単一Ｂ細胞の選別

【0173】

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、免疫されたアルパカからフィコール密度勾配遠心分離（ＧＥ）によって得られ、免疫染色のために２００ｘ１０^６の細胞を含む管に分割する。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で５μｇ／ｍＬに希釈した２００μＬＫＬＨ－ビオチンと共に４℃で３０分間インキュベートした後、５ｍｌの氷冷ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。次に、細胞をウサギ抗ラマＩｇＧ（ＦＩ＆Ｌ）、ＡＰＣ－ストレプトアビジンおよび生／死色素で染色する。次に、染色したサンプルをＭｏｆｌｏ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）で収集し、単一のｌｇＧ＋、ＫＬＦＩ＋、生＋の細胞を８μＬ溶解緩衝液（Ｔｉａｎｄｚ）、１ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ）、３．７５μＭランダム６ｍｅｒ（Ｔａｋａｒａ）を含む１０μＬ緩衝液およびウェルあたり１．２５μＭオリゴｄＴプライマー（Ｔａｋａｒａ）の入った個々のＰＣＲ管に収集した。

【0174】

Ｂ２．単一細胞ＲＴ－ＰＣＲおよびＢ細胞クローニング
収集した抗原特異的アルパカＢ細胞を回収管内で溶解させ、６５℃で５分間加熱させる。４℃まで冷却後、溶解した単一細胞からのトータルＲＮＡは、最終容量２０μＬの４μＬ ５ｘＰｒｉｍｅＳｃｉｐｔ ＩＩ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）、２０Ｕ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ）、２００Ｕ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）、４．５μＬＲＮａｓｅフリー水（Ｔａｋａｒａ）中で３０℃、１０分の初期ステップの後、４２℃で５０分間逆転写させて、ランダムヘキサマーハイブリダイゼーションを可能にする。７２℃で１５分間インキュベートすることにより反応を停止させる。

【0175】

次に、再配列された重鎖（ＨＣ）遺伝子座、ラムダ（ＬＣλ）またはカッパ（ＬＣκ）軽鎖遺伝子座の可変領域は、２ラウンドのネステッドＰＣＲによって各単一細胞ｃＤＮＡから個別に増幅される。可変セグメントについて、３μＬのｃＤＮＡに対して、ＨＣについては９８℃で５分間、９８℃で１５秒間、５５℃で１分間（ＬＣκでは６２℃、ＬＣλでは５８℃で）、７２℃で１分間のＰＣＲの第１ラウンドを４０サイクル実施し、次いで、最終伸長ステップを２Ｘ ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＭＡＸ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）および１００ｎＭのプライマー／４０μＬの反応容量中、７２℃で７分間実施する。４μＬの第１の増幅産物は、第２のＰＣＲラウンドによってさらに増幅させた。ＰＣＲプロトコルの第２のラウンドは、９８℃で５分間の変性ステップ、４０回の増幅サイクル（９８℃で３０秒、ＨＣでは５８℃で３０秒、ＬＣκでは６２℃、ＬＣλでは５８℃、および７２℃で１分）、および最終ステップ、７２℃で７分間から構成され、２Ｘ ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＭＡＸ緩衝液（Ｔａｋａｒａ）および１００ｎＭのプライマー／５０μＬの反応容量を用いて行う。各単一細胞からのＰＣＲ産物は、１．５％アガロースＧｅｌＲｅｄゲルで検出される。各ウェルからのＰＣＲ産物は、市販の精製キット（Ｔｉａｎｇｅｎ）によりろ過して精製した。

【0176】

ライゲーションは、１０μＬのＧｅｎｂｕｉｌｄｅｒおよびクローニング－リガーゼ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、１００ｎｇの消化され精製されたＰＣＲ産物、および１００ｎｇの線形化ベクターを含む総量２０μＬ中で実施する。エレクトロコンピテント大腸菌上位１０の細菌（ＴＯＰ１０ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、２０μｌのライゲーション産物で形質転換させる。コロニーは、フォワードプライマーとしてＰＥＴ－ＳＥＱ－Ｆ（ＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣ－配列番号６８）およびリバースプライマーとしてＰＥＴ－ＳＥＱ－Ｒ（ＡＣＣＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡＴＧＧ－配列番号６９）をそれぞれ使用するＰＣＲによってスクリーニングする。予想されるインサートバンドは、長さ約７００ｂｐである。コンセンサス可変遺伝子配列が確実に同定されるように、各プレートについて、１０のコロニーからのプラスミドＤＮＡが単離され、配列決定される。

【0177】

上記の単一Ｂ細胞選別法および精製された上皮成長因子受容体を抗原として使用して、それぞれが高親和性でＥＧＦＲに特異的に結合するＶＨＨ抗体を発現する１１のクローンのグループを同定した。図１０を参照のこと。

【0178】

上記のパニングＢ細胞濃縮法および抗原としてメソセリン（ＭＳＬＮ）を使用して、系統およびＣＤＲ３の長さを含むＮＧＳデータから、同一性グループ化方法を使用して、クローンのセットを選択した。ライブラリー内で最も豊富な１２配列のクローンのうち、７クローンが強力なＭＳＬＮバインダーであることが示された（以下の表１を参照のこと）。重要なことに、ＭＳＬＮは３つのドメインから構成されており、また５つのＭＳＬＮ結合クローンの抗体は、ＭＳＬＮのドメイン１のエピトープに特異的に結合する。さらに、選択されたクローンのうちの１つの抗体は、ドメイン２に特異的に結合し、クローンの１つの抗体はドメイン３にのみ特異的に結合する。したがって、系統のグループ化および選択を行う１回の作業で、完全長抗原の広域スペクトルのエピトープを認識するクローンを同定できる。これにより、抗原結合の異なる条件の治療においてクローンを選択するより多くの機会がもたらされるか、または二重特異性の組み合わせについて、より多くの選択肢がもたらされるであろう。さらに、この方法では、抗原－リガンド複合体のブロッカーまたは非ブロッカーとして挙動することが示されているクローンを同定することもできる。例えば、７つのＭＳＬＮ結合クローンの中で、ＭＳＬＮのドメイン２または３のいずれかに結合するが、ＭＳＬＮへのＣＡ１２５の結合を阻害しない２つのクローンからの抗体が同定される。対照的に、５ドメイン１エピトープバインダーは、ＣＡ１２５がＭＳＬＮに結合するのを防ぐことが示されている。本開示の方法は、広範囲のエピトープを高解像度でカバーするために、試験のために体系的かつ関係的に抗体を効率よく選択することができる。

【表3】

【0179】

抗原特異的抗体を産生するクローンの同定のさらなる例において、抗ＫＬＨ抗体を産生するクローンは、以下の手順によって発見した。

【0180】

抗原特異的Ｂ細胞の単離およびこのさらなる実験では、１つのアルパカ（名前＃００９）を、市販のＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）を用いて、２００μｇ ＫＬＨ／完全フロイントアジュバントで１回免疫させ、次に２週間ごとに１００μｇ ＫＬＨ（ｓｉｇｍａ）／不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）で免疫させる、標準的免疫レジメで、免疫させる。連続希釈サンプルのＥＬＩＳＡによる抗血清の評価後、製造業者の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ密度勾配法（ＧＥ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、１００～２００ｍＬの血液を採取する。単離されたＰＢＭＣ（生存率＞９５％）は、完全なＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁され、１０^６／ｍＬの細胞懸濁液を得る。４ｍＬのＰＢＭＣ懸濁液を６ウェルプレートの各ウェルに加え、１時間インキュベートして、非特異的結合細胞を捕獲する。次に、非結合細胞を収集し、完全なＲＰＭＩ１６４０培地で１０^６／ｍＬに再懸濁させる。細胞懸濁液５ｍＬを、抗原でプレコートした１０ｃｍの高結合ペトリディッシュ（タンパク質結合容量＞５００ｎｇ／ｃｍ^２）に、５０ｒｐｍ、３７℃で穏やかに振とうしながら１．５時間添加する。インキュベーション後、非結合細胞を１ｘＤＰＢＳで２～１０回洗い流して、非特異的結合細胞を除去する。Ｂ細胞培地に再懸濁したマイトマイシン処理ＥＬ４．ＩＬ－２－Ｃ３フィーダー細胞（安定してアルパカＣＤ４０Ｌを発現）を、Ｂ細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養用に０．５ｘ１０^６細胞／ｍＬでディッシュに添加する。最終容量は、各１０ｃｍディッシュに２０ｍＬである。Ｂ細胞共培養培地には、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン、アルパカブランクＰＢＭＣの培養物からの１０％アルパカ馴化培地、および様々な成長因子、例えば１つ以上のインターロイキンが１～５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含まれている。

【0181】

１０日間の共培養後、５０μＬの上清をＥＬＩＳＡに使用して、抗体分泌およびＫＬＨ免疫原への結合の特異性について試験を行う。その間、共培養された細胞を収集し、総細胞数をカウントする。Ｂ細胞の単離および増幅後のＢ細胞の増幅は、総細胞数からフィーダー細胞対照の細胞数を引いて算出する。この濃縮された細胞数を最初に添加された細胞量と比較するために、抗原特異的Ｂ細胞の増幅を算出することができる。図１１に示すとおり、５つの異なる共培養ディッシュのＢ細胞は、一貫した抗原特異的ＶＨＨ抗体分泌を示した。ＰＢＭＣ中の抗原特異的Ｂ細胞は、Ｂ細胞の単離および増幅（ＢＩＡ）後に４～６倍に増幅された。

【0182】

ＢＩＡ後、共培養細胞のｍＲＮＡを使用して３つのＮＧＳライブラリーが構築される。逆転写には、オリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、ＣＨ２特異的プライマーがそれぞれ使用される。（Ｍａａｓｓ ＤＲ，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ Ｊ，Ｐｅｒｎｔｈａｎｅｒ Ａ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＣＢ．Ａｌｐａｃａ（Ｌａｍａ ｐａｃｏｓ）ａｓ ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｍｅｌｉｄ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＶＨＨｓ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７年；３２４（ｌ－２）：１３－２５．）。次に、これらのｃＤＮＡを２ラウンドのＰＣＲ反応にかける。これら３つのライブラリーはすべて、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）に送信され、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｍｉｓｅｑ、３００ｘ２）で、サンプルごとに４００～５００万回の読み取りで３０％ＰｈｉＸゲノムＤＮＡスパイクを使用して配列決定した。データはＮＧＳＱＣ Ｔｏｏｌｋｉｔを使用して品質確認し、ＦＬＡＳＨをアセンブルする。配列は、図４に示すとおり、同じＣＤＲ３の長さ、１以下のＣＤＲ３ハミング距離、および同じマッピングされたＶ／Ｊ生殖細胞系列に基づいて、系統／グループにクラスター化させる、配列は、同じＣＤＲ３の長さと８０％以上のＣＤＲ３の同一性に基づいて、さらにサブグループ化して、クラスター化させる。各ライブラリーに対して、８００を超えるグループが生成された。ここでは、いくつかの系統優先因子：配列存在量、古典的ＶＨＨ対非古典的ＶＨＨ、およびＣＤＲ３の長さを適用して、これらのグループからクローンを選択する。２０の異なるグループから２０のクローンが選択され、それらの合成、発現、および精製が行われる。選択したクローンに関連するバイオインフォマティクスデータを以下の表２から４に示す。選択されたクローンのそれぞれによって発現する抗体の完全なアミノ酸配列は、各ドメイン（ＦＲ１、ＣＤＲ１など）の連続配列として得られる。

【表4】

【表5】

【表6】

【0183】

抗体の抗原特異的結合の検証は、ＥＬＩＳＡによって行う。ライブラリーは、サブグループ化シグネチャ（配列存在量、古典的ＶＨＨ対非古典的ＶＨＨおよびＣＤＲ３の長さ）に基づいて調査される。この実施例では、各クラスターから１つのクローンのみが選択される。この例では、選択されたクローンのほとんどが、非古典的ＶＨＨではなく古典的ＶＨＨを生成する。この例では、通常のＶＨＨ配列よりもＣＤＲ３内にジスルフィド結合のさらなる対を有する１つのクローンと同様に、長いヒンジ配列および短いヒンジ配列の両方を有するアミノ酸配列が選択されたクローンに含まれている。このようなクローン選択戦略により、結合活性を有するクローンの選択において１００％の成功率を達成した。ＥＬＩＳＡアッセイに示すとおり、選択された２０のクローンすべてがＫＬＨ抗原ＫＬＨに対して特異的な結合活性を示した（図１３に示す）。それらの１８は、０．４６５ｎｍの平均結合ＥＣを有していた（外れ値としての番号６および番号９を除く）。３つのクローン（番号１、３、および１３）は、それぞれ６７、７７、および７２ｐｍｏｌ／ＬのＥＣ５０を有する強力なＫＬＨバインダーであることが示されている。リードのほとんどは、ナノモル以下の効力を有することが示されている。したがって、強力なＫＬＨ結合抗体を分泌するクローン化されたＢ細胞は、ＢＩＡおよびＮＧＳにより同定できる。ＣＤＲ３の長さと結合活性との相関結果を確認するために、異なるＣＤＲ３の長さを有するクローンをリストに含めている。見られる最短のＣＤＲ３の長さは９アミノ酸であるが、最長のＣＤＲ３の長さは２１である。２０のＶＨＨ抗体の平均ＣＤＲ３長は、１６アミノ酸である。図４２に示すとおり、ＣＤＲ３の長さとクローンＥＬＩＳＡ活性との間に正の相関が見られる。

【表7】

【0184】

実施例２：エピトープ予測によるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体形成をブロックする抗体の発見
実験的アプローチの概要
リガンド：受容体結合相互作用（複合体形成）をブロックする抗体を発見するためのワークフローを図１４に示す。このワークフローは、計算または結晶学的方法による、リガンドおよび受容体の三次元構造、ならびに／またはそれらの複合体の構造の同定から開始する。結合界面を形成する受容体およびリガンドの両方の部分は、「ドッキングされた」タンパク質の界面を調べることによって決定できる。結合した複合体を確立するかまたは安定化させるために相互作用するアミノ酸は、構造を調べることによって決定することができる。界面でアミノ酸を変化させ、そのような変化が複合体の結合強度に及ぼす影響を調べる実験からのデータは、相互作用して複合体を形成し、安定化させるアミノ酸の決定に寄与し得る。

【0185】

複合体の界面にあるリガンドまたは受容体の２～４アミノ酸の短い直鎖アミノ酸配列部分が選択され、次にＮＧＳアミノ酸配列ライブラリーを検索して、配列のＣＤＲ部分、好ましくは抗体配列のＣＤＲ３部分内で選択された短いアミノ酸をコードする抗体ｃＤＮＡクローンを同定する。ＮＧＳデータベースからＣＤＲ３配列を検索するためのキーワードとして、２～４アミノ酸長のスクリーニングペプチド配列を設定し、満足のいくＶＨＨ配列およびその存在量を得る。

【0186】

選択された存在量のしきい値を超えてＮＧＳライブラリーに存在すると同定された配列は、遺伝子合成のために選択され、ヒトＩｇＧ４－ＦＣタグと融合したＨＥＫ２９３細胞内で発現される。発現されたタンパク質は精製され、機能テスト、例えば抗原結合およびＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体形成の阻害についての機能テストを行う。

【0187】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１構造解析
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の構造は、ＰＤＢデータベース（ＰＤＢ ＩＤ：４ＺＱＫ）からダウンロードした。ＰＹＭＯＬソフトウェアは、構造解析に使用する。構造は、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１の２つのペプチドをカバーしていることを示した（図１５）。黄色のペプチドは、ＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡ（配列番号１４１）であり、黄色のペプチドは、ＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲ（配列番号１４２）である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結晶構造で観察される極性接触残基領域が選択される。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の極性接触は、「作用－検索－極性接触－溶媒を除くその他（ａｃｔｉｏｎｓ－ｆｉｎｄ－ｐｏｌａｒ ｃｏｎｔａｃｔｓ－ｔｏ ｏｔｈｅｒｓ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ）」を用いてＰＹＭＯＬに表示される。

【0188】

図１５は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体（複合体のデータは公開されている－タンパク質データベースＩＤ番号：４ＺＱＫ）および複合体形成を阻害する可能性のある「ブロッキング」ペプチドであるＰＤ－１の２つの隣接ペプチドの界面を示している。図１６は、ＰＤ－１タンパク質と２つの隣接するペプチドと間の相互作用分析の結果を示している。それらの複合体の界面でＰＤ－１のＳＦＶ．．．．ＳＬＲペプチドとＰＤ－Ｌ１のＡＦＴ．．．ＲＩＴペプチドとの間で相互作用するアミノ酸は、接続線によって同定される。

【0189】

上記の分析により、ＰＤ－Ｌ１の極性接触残基が決定され、それらはＦ－Ｄ－Ｑ－ＡＤＹＫＲである。Ｆ－Ｄ－Ｑ－Ａには非常に長いアミノ酸間隔（＞２アミノ酸）があるため、ペプチドＡＤＹＫＲのみが選択戦略に適合する。ＶＨＨの選択には、２～４のアミノ酸ペプチドが選択される。次に、ペプチドＡＤＹＫ（配列番号１４５）、ＤＹＫＲ（配列番号１４６）、ＡＤＹ、ＤＹＫ、ＹＫＲ、ＡＤ、ＤＹ、ＹＫおよびＫＲをＮＧＳデータベースからのスクリーニング基準に設定する（表２）。

【0190】

様々な抗体によって複合体形成したＰＤ－１の追加の構造が利用可能であり、ＰＤＢデータベースからダウンロードして、上記と同じ方法で分析する。ＰＤ－１と様々な抗ＰＤ－１抗体との複合体、および上記の複合体の相互作用分析によって潜在的なブロッキングペプチドとして同定された短いペプチドを表６に示す。

【表8】

【0191】

ＶＨＨ内のＣＤＲ３は抗原への主な結合領域であり、ＶＨＨ抗体内ではＣＤＲ３部分が従来の（ＶＨＶＬ）抗体内でのＣＤＲ３部分よりも長く、ＣＤＲ３が長いほどＶＨＨ抗体に大きな結合領域が提供されるため、ＣＤＲ３配列に注目が集まっている。スクリーニングペプチドを含むＣＤＲ３配列は、ＮＧＳデータベースから抽出され、それらの存在量をカウントして、反復配列を排除した。ＮＧＳデータベースの検索には２～４のアミノ酸が適切であることがわかっている。２つのアミノ酸では短すぎる可能性があり（その結果、ヒット数が管理不能になる）、４つのアミノ酸では、選択肢の数を過度に制限し得る。したがって、ＮＧＳデータベースを検索するために３つのアミノ酸ストリングを選択した。

【0192】

以前の刊行物には、ファージ表面ＶＨＨディスプレイライブラリーのパニングによる抗体発見のためのプロトコルが記載されている。しかし、この方法では、ライブラリー内で存在量の多いＶＨＨクローンのみが取得される傾向があり、結果として、存在量の少ないＶＨＨが失われる。様々なスクリーニングペプチドストリングを使用したキーワード検索に基づいて、様々な存在量（選択されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持しているすべてのクローンの割合）の一連のＶＨＨ配列がＮＧＳデータベースから選択される。異なる存在量を有する選択されたクローン内にコードされているアミノ酸配列のＣＤＲ３部分を表７に示す。

【表9】

【0193】

ＮＧＳデータベースからのＣＤＲ３配列の選択
アミノ酸長が２～４の一連のスクリーニングペプチドを決定した。ＣＤＲ３にはスクリーニングペプチドが含まれ、ＰＤ－１と結合してＰＤ－Ｌ１をブロックし得ると考えた。ＶＨＨ内のＣＤＲ３は、抗原との主要な結合領域であるため、従来の抗体よりも長く、ＣＤＲ３が長いほどＶＨＨに大きな結合領域がもたらされる。スクリーニングペプチドを含むＣＤＲ３配列は、ＮＧＳデータベースから抽出され、反復配列を一掃するためにそれらの存在量をカウントした。スクリーニングペプチドが異なるため、２～４アミノ酸が適切であることがわかったが、説明が必要なのは、２ＡＡは短すぎる可能性があり、４ＡＡでは選択数が制限され得るため、３アミノ酸長のスクリーニングペプチドが最良の選択肢であった。

【0194】

抗体の発現および精製
選択されたＶＨＨ抗体配列をコードする核酸が合成され、（Ｇ４Ｓ）_３リンカーを含むＩｇＧ４－ＦＣタグと融合させたｐＣＤＮＡ３．４ベクターに挿入させる。組換えプラスミドは、配列決定によって確認される。次に、ＶＨＨ－ＦＣコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞内で形質転換させる。形質転換された細胞を５～７日間培養して、組換えタンパク質を得る。次に、組換えＶＨＨ抗体をろ過した培養上清から精製する。得られた抗体のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって測定する。精製された組換え抗体の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって評価する。

【0195】

ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
ＥＬＩＳＡ結合アッセイのために、２μｇ／ｍｌのＰＤ－１タンパク質を９６ウェルプレートに一晩コーティングさせる。組換えＶＨＨ－ＦＣタンパク質をウェルに加え、一定時間放置した後、検出抗体として１μｇ／ｍｌのＨＲＰコンジュゲート抗ＦＣ抗体を加え、アッセイ試薬を加える。吸光度は４５０ｎｍで読み取る。ニボルマブの結合は陽性対照として機能し、ＢＳＡでコーティングされたプレートは陰性対照群として使用する。

【0196】

ＥＬＩＳＡブロッキングアッセイ
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルは、２μｇ／ｍｌのＰＤ－１タンパク質／ＰＢＳでコーティングされ、１％ＢＳＡでブロックする。５μｇ／ｍｌの濃度の精製ＶＨＨ－ＦＣタンパク質を各ウェルに添加する。

【0197】

次に、２μｇ／ｍｌのビオチン標識ＰＤ－Ｌ１タンパク質を各ウェルに添加する。ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧおよびＴＭＢを基質として検出される。発色した色の強度は、４５０ｎｍで測定する。ＰＤ－１未添加ウェルおよびＶＨＨ－ＦＣ未添加ウェルは、それぞれ陰性対照および陽性対照である。

【0198】

３０のクローンを選択し、選択したクローンからＶＨＨ抗体を精製する。上記のとおり、発現および精製のために３０のクローンを選択する。１９のクローンが組換えＶＨＨ抗体の良好な発現を示した。

【0199】

１９のクローンから精製されたＶＨＨ抗体は、上記のとおりＥＬＩＳＡによって、ＰＤ－Ｌ１への結合について、およびＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体の形成の阻害について評価する。結果をそれぞれ表８および表９に示す。

【表10】

【表11】

【0200】

１１９４－ｚ0－ＩｇＧ４は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体形成をブロックする活性を有することが知られている陽性対照抗体である。ＮＢＬ５０７－ＢＭＫ２－Ｈ４－ＩｇＧ４は、陰性対照として使用される無関係な抗体である。

【0201】

選択したクローンのうち７つは、ＰＤ－１に結合する実質的な活性を有するＶＨＨ抗体を産生し、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体形成をブロックする活性の試験を行うために、最も強い結合を有する５つを選択した。クローンＳＳ５は、陽性対照１１９４－ｚ0－ＩｇＧ４よりも強い複合体形成阻害を呈することが見出されている。

【0202】

得られた結果から、少なくとも１０コピー内で選択されたすべてのクローンの中で表されるＣＤＲ３配列を有する抗体を発現するクローンのコレクションは、抗原に特異的に結合し、特定のタンパク質結合パートナーとの抗原の複合体形成をブロックするであろうＶＨＨ抗体を発現する少なくとも１つのクローンを含む高い可能性を有すると考えられる。例えば、本明細書に開示の実験では、選択されたクローンの中で１０コピーを超えるＣＤＲ３配列を有するクローンの１００％が、ＰＤ－１に結合するＶＨＨ抗体を発現し、それらのうちの３３％がＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするであろうＶＨＨ抗体を発現する。対照的に、選択されたクローンの中で１０コピー未満で存在するＣＤＲ３配列を有するクローンのうちの２５％のみが、ＰＤ－１に結合するＶＨＨ抗体を発現し、選択されたクローンはいずれも、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックするであろうＶＨＨ抗体を発現しない。

【0203】

上記のように実施された追加の実験では、発現および精製のために３０のクローンが上記のとおりに選択される。１９のクローンが、良好に発現している組換えＶＨＨ抗体を有することが示されている。これらのうちの７つはヒトＰＤ－１への強い結合を示した。抗原結合ＶＨＨ抗体を分泌するクローンを同定するための全体的な成功率ＮＧＳガイド付きクローン選択は３７％である。

【0204】

実施例３：配列シグネチャおよびクローン選択規則の開発
ＢＣＭＡ免疫下の動物間の収束（重複）配列。この実験では、５０７－Ａ１（Ａｌ）および５０７－Ａ２（Ａ２）という名前の２つのアルパカを、ヒト組換えＢＣＭＡタンパク質で免疫させる。動物Ａ１およびＡ２は、同じ免疫レジメを使用して、同量の組換えヒトＢＣＭＡを受ける。固有のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する９３および４０のＶＨＨ配列は、それぞれ動物Ａ１およびＡ２の有望なリードとして発見される。動物間で、免疫およびクローン同定に関して二重盲検化されたクローンを選択すると、両方の動物が共有するＣＤＲ３配列を有する２０の配列がある。表１１は、両方の動物が共有する２０の固有のＣＤＲ３配列を示す。

【表12】

【0205】

動物Ａ１とＡ２のＣＤＲ３配列間の関係は、図１８にベン図として示す。

【0206】

ＶＨＨ２（長いヒンジ）配列とＶＨＨ３（短いヒンジ）配列との間で共有される抗体配列。Ａ１アルパカでは、長い領域または短いヒンジ領域のいずれかを有する６つのＶＨＨ配列を見出すことができる。図１９Ａに示すとおり、２４９の配列の元のプールが見られ、そのうち１３５がヒンジ配列を有することが見られる。これら中に、長いヒンジ配列および８９の短いヒンジ配列を有する２６の非冗長配列が見られる。これらのうち、１９の固有のＣＤＲ３配列は長いヒンジ配列を有し、５３の固有のＣＤＲ３配列は短いヒンジ配列を有する。これらの２つのグループの中で、６つのＣＤＲ３配列が共有されていることがわかる。

【0207】

動物Ａ２由来のクローンのアミノ酸配列の同様の考察では、図２０Ａおよび２０Ｂに示すとおり、長いヒンジのプールまたは短いヒンジのプールの両方でＡ２動物によって共有される２つの配列を同定する。

【0208】

全体として、Ａ１およびＡ２動物の８つの配列は、長いヒンジ配列プールおよび短いヒンジ配列プールの両方内にあることがわかる。

【0209】

アルパカ（ＶＨ）とＶＨＨ２／ＶＨＨ３との従来の抗体間の収束配列。ヒトＢＣＭＡへの良好な結合を示す２匹の動物から１９の単鎖抗体が同定されている。驚くべきことに、１Ａ１および１Ｄ２と名付けられた長いヒンジプールおよび短いヒンジプールによって共有される２つのＶＨＨ配列は、伝統的なＶＨレパートリーからのリードによっても共有される。異なるクラスの抗体によって共有される配列の数を図２１Ａに示す。長いヒンジまたは短いヒンジのいずれかによって共有される８のＶＨＨＣＤＲ３配列が図２１Ｂに示され、強調表示された配列はすべてのＶＨ／ＶＨＨ２およびＶＨＨ３によって共有される。

【0210】

共有されている配列は、強力なＢＣＭＡバインダーであることが示されている。重複する配列が好ましいシグネチャであるかを試験するために、ＶＨＨ２およびＶＨＨ３によって共有される８つの収束ＶＨＨクローンによって発現される抗体を精製する。ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーのいずれかにより、すべてが強力なＢＣＭＡバインダーであることがわかった。１Ａ１および１Ｄ２と名付けられた図２１Ｂで強調表示された配列（配列番号１１７および１１８）は、ＶＨ抗体およびＶＨＨ抗体の両方によって共有されている。８つの収束ＶＨＨ抗体は、ＢＣＭＡを過剰発現する腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６の細胞に結合するが、ＢＣＭＡ発現が陰性である２９３Ｔ細胞には結合しない。ＥＬＩＳＡでは、コーティング抗原としてＨｉｓまたはＦｃコンジュゲート結合ヒトＢＣＭＡのいずれかを使用して、同様の結果を示した（表１２）。

【表13】

【0211】

重複配列シグネチャ。最後に、ＶＨ／ＶＨＨ２／ＶＨＨ３によって共有される２つの配列は、Ａ１およびＡ２の両方の動物にも見られる（図２２を参照のこと）。したがって、複数の動物／ＶＨ／ＶＨＨ生殖細胞系列に見られるこれらの配列を選択することは、それらの抗原への強力で特異的な結合を呈する抗体の有用なシグネチャであると考えられる。

【0212】

追加のシグネチャを裏付けるデータ。ヒトＢＣＭＡへの結合に対する古典的ＶＨＨおよび非古典的ＶＨＨの親和性を調べる。古典的ＶＨＨは、非古典的ＶＨＨよりも高い親和性を有する。結果を図２３に示す；Ｐ＜０．０５。

【0213】

追加のシグネチャ統計
ＦＲ２親水性領域：ＶＨＨ抗体のほとんどでは、ＦＲ２は従来のＩｇＧと比較して固有のアミノ酸置換を有する：３７Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ。図２４は、３つのライブラリー（それぞれ異なる抗原（ＮＢＬ５０１（抗ＭＳＬＮ）、ＮＢＬ５０４（抗ＰＤ１）、およびＮＢＬ６０２（抗ＫＬＨ））に対する）ＶＨＨ抗体のこれらのＦＲ２固有のアミノ酸を有するクローンの割合を示している。驚くべきことに、これら３つのライブラリーのクローンのＶＨＨレパートリー全体の最大８％に、この特定のＦＲ２置換パターンが含まれていることがわかった。ＦＲ２固有の配列の３７、４４、４５、および４７位（Ｋａｂａｔの番号付け）での個々の置換の頻度も調査し、これらのデータを図２５に示す。

【0214】

興味深いことに、固有の配列置換は非常に多様化している。４４位と４５位では、ＧｌｕおよびＡｒｇが優勢なアミノ酸であるが、３７位および４７位では可変である。ＮＢＬ５０１抗ＭＳＬＮプロジェクトでは、Ｔｙｒ７０％およびＰｈｅ１０％が３７位を占有していた。対照的に、抗ＰＤ１（ＮＢＬ５０４）および抗ＫＬＨプロジェクト（ＮＢＬ６０２）では、３７Ｐｈｅは７０％に達し、３７Ｔｙｒは約２５％であることがわかった。４７位にグリシンの代わりに一貫して高い割合のＬｅｕが観察され、この位置にＰｈｅおよびＴｒｐを有するクローンが有意な割合で存在する。シグネチャアミノ酸Ｇｌｙは、この位置において頻度の１０％未満のみを占有する。したがって、アルパカＶＨＨＦＲ２のシグネチャは、３７Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅとして提唱される。拡大ＣＤＲ１およびＣＤＲ２：ＶＨＨは、ＣＤＲ１の隣に追加の超可変領域（Ｋａｂａｔの番号付けによると残基２７～３０）を有する。この領域および長いＣＤＲ３領域を有するＶＨＨ抗体では、抗原と相互作用する表面積が増加する。しかし、このシグネチャを有する抗体は、多くの場合、確認されない。

【0215】

ＣＤＲ２ドメインは、通常、５～９アミノ酸の長さを有する。しかし、多くのクローンには、１４～１７アミノ酸の長さを有する「長いＣＤＲ２」が含まれている。重要なことに、長いＣＤＲ２を含むＶＨＨは、短いＣＤＲ２を含むＶＨＨよりもそれらの抗原に対して、より高い結合親和性を有することがわかっている。３つの異なるライブラリーからの抗体からのＥＬＩＳＡデータを図２７に示す。

【0216】

ＣＤＲ３内の追加のジスルフィド結合：ＶＨＨ抗体の約５～１０％がＣＤＲ３ドメイン内に追加のジスルフィド結合を有する。これは、抗体が結合するエピトープが、短い長さの直鎖アミノ酸配列ではなく、抗原の三次元構造から形成されるより「コンフォメーション」の認識部位であることを示し得る。ＣＤＲ３の約２～１９％にジスルフィド内結合が含まれている。図２８は、ＣＤＲ３ドメイン内に追加のジスルフィド結合を有する抗体の３つのライブラリーの比率を示す（追加のＣｙｓ残基、すなわちＣＤＲ３内の２つのシステインアミノ酸として同定される）。ＮＢＬ５０４抗ＰＤ１ライブラリーには、長いＣＤＲ３ドメインを有する抗体が高い割合で含まれており、約２％のこのようなクローンを有する他の２つのライブラリーよりも、ＣＤＲ３ジスルフィド内結合が有意に多く含まれている。

【0217】

ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間の追加のジスルフィド結合：低頻度ではあるが、ＣＤＲ１とＣＤＲ２との間に追加のジスルフィド結合を有する抗体は、追加のＣｙｓアミノ酸ＣＤＲ１またはＣＤＲ２として見つけることができる。図２９および図３０を参照のこと。

【0218】

ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３間の追加のジスルフィド結合：ラクダおよびヒトコブラクダでは、ＶＨＨ抗体の８２％がＣＤＲ１とＣＤＲ３との間にジスルフィド結合を有し、ラマおよびアルパカでは、ＶＨＨ抗体の７４％がＦＲ２－ＣＤＲ３間にジスルフィド結合を有する。ＶＨＨ抗体配列の７０～８０％は、追加のジスルフィド結合を含まない。ＶＨＨ配列の１０～２５％には、追加のジスルフィド結合が含まれ得る（配列内の４つのシステイン）。興味深いことに、ＶＨＨ抗体配列の５～１０％には対形成されていないシステインが含まれる。これらのＶＨＨ抗体が、対形成されていないシステイン間にジスルフィド結合を形成することにより、別のＶＨＨ抗体とどのように対形成できるか、または対形成するか否かは不明である。単一のＶＨＨ配列内では、合計７つ以下のシステインが観察されている。これらのデータは、最大３つのドメイン内ジスルフィド結合が残りの対形成されていないシステインで形成され得ることを示唆している。図３１は、３つの異なるライブラリー内で選択されたＶＨＨ抗体のアミノ酸配列内のシステイン残基数の分析を示す。

【0219】

ＣＤＲ１とＣＤＲ３との間に追加のジスルフィド結合を見ることができるが、これはまれである。図３２を参照のこと。

【0220】

ＶＨＨ抗体内の追加のジスルフィド結合のほとんどは、ＦＲ２／ＣＤＲ２－ＣＤＲ３間にある。総システイン数の計算と一致して、追加のジスルフィド結合のほとんどは、ＦＲ２／ＣＤＲ２（ＩＭＧＴまたはＫＡＢＡＴのいずれかの命名法による）とＣＤＲ３との間にある。追加の対形成システインは、ＮＧＳデータベース内のすべてのＶＨＨ配列の２～９％である。図３３を参照のこと。

【0221】

クローンによる上清のＯＤ値とそのアミノ酸配列内のシステインの数との有意な負の相関が観察される（図３４を参照のこと）。したがって、クローンを選択する際には、通常、ＶＨＨアミノ酸配列内では、奇数のシステインを回避することが推奨される。さらに、１対を超えるシステイン配列を含むＶＨＨ配列を選択することは避けることが好ましい。追加のジスルフィド結合は、ＶＨＨの発現収量に影響を与え得るか、または結合の親和性に悪影響を有し得る。したがって、追加のジスルフィド結合は、ナノボディの下流製造の開発可能性に悪影響を与え得る。

【0222】

長いＣＤＲ３：ＰＤ１ ＮＧＳライブラリ－（ＮＢＬ５０４）内では、ＶＨＨクローンの最大８６％が１５を超えるアミノ酸を有する「長いＣＤＲ３」ドメインを有する。図３５を参照のこと。

【0223】

図３６，図３７および図３８は、ＣＤＲ３ドメインの長さと、ＢＣＭＡを発現する２つの異なる細胞株からの細胞の表面に結合するＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳによって、および上清を使用したＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との間に正の相関があることを示す。すべての相関のｐ値は、０．００１以下である。ＣＤＲ３の長さは、抗体のその抗原への結合親和性と有意な相関関係を有することが一貫して示されている。したがって、選択される可能性のあるクローンが多数存在する場合は、１４アミノ酸より長いＣＤＲ３ドメイン長を有する抗体を選択することが好ましい。

【0224】

同様の長さを有するＣＤＲ３バリアントは、単一抗原の同様のエピトープに結合する可能性が高いことが観察されている。特定の抗原のほぼ同一のエピトープまたは同じエピトープに結合するＶＨＨ抗体の集団について、ＣＤＲ３の長さの範囲が狭いことが観察された。図３９を参照のこと。

【0225】

さらに、同じエピトープに結合する抗体は、系統関連配列によって同定され得る。例えば、ＣＤＲ３の長さが０または１アミノ酸異なるクローン。クローン１１８２、１２０２、および１７３４は、同じ系統の抗ＰＤ１抗体から選択され、そのすべてがＰＤ１結合についてＫｅｙｔｒｕｄａと競合する（図４０を参照のこと）。同じ長さのＣＤＲ３を有する関連系統から選択されたクローンが同じビン内にあることが確認される。本明細書に開示される実験では、同じ長さのＣＤＲ３ドメインを有する系統関連クローンが、正確に同じエピトープに対して結合する機会を多く有することが示唆される。ＮＧＳデータに基づいてクローンを選択する場合は、選択したプール内のそのような冗長クローンの数を減少させることが好ましい。

【0226】

従来のＩｇＧと同じＶおよびＪ生殖細胞系列を有する非古典的ＶＨＨ：従来のＩｇＧ１と同じナイーブＢ細胞起源（同じＶおよびＪの配置）を共有するＶＨＨ系統グループは、ＶＨＨ抗体またはＩｇＧ１抗体のいずれかである同じまたは類似のエピトープを認識するものとして示される。５０７のライブラリーには、ＶＨＨ２／ＶＨＨ３／ＶＨによって共有される８１の配列のうち２つが存在し、これは、クローンの約２．５％である。

【0227】

固有の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ－保存されたＴｒｐ１１８がＡｒｇ１１８で置換されているか、またはＦＲ３内の疎水性プロファイルが低い：Ｔｒｐ１１８は、ＮＢＬ５０１、ＮＢＬ５０４、およびＮＢＬ６０２ライブラリーのそれぞれ内で最大３％の割合で見ることができる。図４１を参照のこと。

【0228】

全体として、上記のデータは、次のクローン選択規則を示唆する。
１．１匹の動物を免疫させる場合には、ＶＨＨ２およびＶＨＨ３が共有するＶＨＨ配列を選択する。ＶＨＶＬを調査する場合は、ＶＨとＶＨＨとの間で共有されているものを選択する。
２．収束モチーフまたは配列シグネチャ：同じ実験グループ内の異なる動物は、同じＶＤＪ配置を介して同じモチーフまたは配列シグネチャを収束的に生成できる。これらのモチーフまたは配列シグネチャによってコードされるパラトープは、機能的エピトープを標的とし得る。複数の動物が免疫されている場合には、動物間で共有される収束配列を選択する。
３．ＦＲ２親水性領域：ＶＨＨ抗体のほとんどでは、ＦＲ２は、従来のＩｇＧに固有のアミノ酸置換：３７Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ／Ｌｅｕ／Ｐｈｅを有する。
４．固有の配列シグネチャを有する非古典的ＶＨＨ：Ａｒｇ１１８で置換された保存されたＴｒｐ１１８および／またはＦＲ４のより低い疎水性プロファイル。
５．古典的ＶＨＨは、非古典的よりも高い親和性を有する。クローンを選択するときには、好ましくは、古典的ＶＨＨを選択するものとする。非古典的ＶＨＨは、ＦＲ２シグネチャを含まない。
６．配列内のシステインの数が奇数のクローンを選択するのを避ける：３つのシステインを使用して合成するために１つのクローンを選択した。それでは、発現しなかった。３つのシステインを有するいくつかのスクリーニングされたクローンは、平均以下の発現を有する。
７．従来の抗体では、ＣＤＲ３内に正または負の電荷が引き続き残存することにより、折り畳みの問題が生じることがわかっている。ＶＨＨでは、ＣＤＲ３に３つのＲを有する１つのクローンを選択したが、クローンは発現しなかった。３つの継続的な正電荷（ＫまたはＲまたはそれらの混合）を有するいくつかのスクリーニングされたクローンは、平均以下の発現を有する。ＣＤＲ３内で３つ以上の継続的な正電荷を有するクローンを選択することは避ける。
８．Ｎ末端に正電荷を有するクローンを避けるために、そのような２つのクローンを選択したが、いずれも発現しなかった。Ｎ末端に正電荷を有するスクリーニングされたクローンはほとんどない。
９．一部のアルパカは、長いＣＤＲ２（８／９ではなく１７ａａ）のＶＨＨを有し、そのような長いＣＤＲ２を有するクローンは、高い結合親和性を有すると考えられる。
１０．一部のプロジェクトでは、ＣＤＲ３の長さは結合親和性と正の相関関係を有し、優先的に長いＣＤＲ３クラスターを選択する。
１１．同様のＣＤＲ３の長さを有する関連クラスターの場合、同様の長さでの相同ＣＤＲ３が同様のエピトープへの結合をもたらすことがわかったため、冗長な候補を多く選択することは避ける。
１２．収束モチーフまたは配列シグネチャ：同じ実験グループ内の異なる動物は、同じＶＤＪ配置を介して同じモチーフまたは配列シグネチャを収束的に生成できる。これらのモチーフまたは配列シグネチャによってコードされるパラトープは、機能的エピトープを標的とし得る。
１３．新規カノニカル結合ループ構造：カノニカルループ構造を決定するための重要部位に存在する超変異ホットスポットは、ＶＨＨ構造レパートリーを多様化する興味深い可能性を生み出す。結晶学的研究は、多くの場合、ラクダＶＨＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２ループが、従来のＶＨの既知のカノニカル構造から逸脱していることを強調している。配列ベースの新規Ａｇ結合ループコンフォメーション予測は、系統のさらなるグループ化を裏付けるものとする（Ｌａｕｒａ Ｓ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｌｕｃｙ Ｊ．Ｃｏｌｗｅｌｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｎｏｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄａｔａ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．２０１８；８６：６９７－７０６）。

【0229】

参考文献
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【図1A-B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A-B】

【図20A-B】

【図21A-B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【手続補正書】

【提出日】2022-01-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2022541697000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-06-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0035】

例示的な実施形態は、参照された図に示す。本明細書に開示の実施形態および図は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図されている。

【図1A】ＶＨＨ、ＶＨ、およびＣＨ免疫グロブリンをコードするラクダ科動物の遺伝子座の構成を示す図である。

【図1B】ラクダ科動物のＶＨＨ構造を示す図である。

【図2】 （ｉ）では、ラクダ科動物（ラクダまたはラマ）が、ｃＤＮＡ、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質でありうる免疫源、または、複合免疫源－正常または疾患の細胞または組織で免疫される。生成されたＶＨＨは、タンパク質アレイまたは細胞／組織抗原ｃＤＮＡライブラリーまたは免疫沈降ベースの質量分析によって個々の対応する抗原を同定するために使用される。（ｉｉ）では、抗血清がＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／κ、ＩｇＧ１／λ）を単離し、それぞれ力価および生物活性の試験を行うことにより評価される。（ｉｉｉ）では、免疫Ｂ細胞が、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄、リンパ節および他のリンパ組織から単離される。（ｉｖ）では、パニング（不要なＢ細胞の濃縮および/または除去）；磁気ビーズ精製またはＦＡＣＳソーティングにより、抗原特異的Ｂ細胞、抗原特異的メモリーＢ細胞、および形質芽細胞が、免疫原、所望のドメインまたはエピトープまたは複合免疫原で濃縮される。（ｖ）では、抗原特異的Ｂ細胞が、ラクダ科動物のＣＤ４０－Ｌ細胞、サイトカインおよび／または免疫原によって活性化および増殖するかを試験される。

【図3】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλを増幅するためのＩｇＧアイソタイプ特異的プライマーセットを示す図である。Ｉａ／ｂでは、リード配列（ＶＨ／ＶＨＨ）ＣＨ２が同定される。ＩＩａ／ｂでは、ＶＨおよびＶＨＨ用のプライマーセットを用いてＰＣＲが行われる；ＩＩＩａでは、約６００ｂｐのＶＨＨ断片が精製される；ＩＩＩｂでは、約９００ｂｐのＶＨ断片が精製される；ＩＶａでは、ＰＣＲでＶＨＨ２（短いヒンジ）配列を増幅するために、ＶＨＨ２用のネステッドプライマーが使用され、ＩＶｂでは、ＰＣＲで増幅するために、ＶＨ１およびＶＨＨ３（長いヒンジ）配列用のネステッドプライマーが使用される。ＩＩｃでは、Ｖκ用ＰＣＲプライマーセットが、ＰＣＲでそれらの配列を増幅するために使用され、ＩＩｄでは、Ｖλ用ＰＣＲプライマーセットが、ＰＣＲでそれらの配列を増幅するために使用される。

【図4】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλＮＧＳライブラリーの生成および系統のグループ化を示す図である。Ｉでは、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３、ＶＨ１、Ｖκ、およびＶλの配列に関するデータが、ＮＧＳアダプターの追加および索引付けにより生成される；ＩＩでは、クローンのヌクレオチド配列が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ｘ２およびデータ構築により生成される；ＩＩＩでは、配列が、バイオインフォマティクスを用いた重鎖ＣＤＲ３または軽鎖ＣＤＲ３の配列に基づく系統でグループ化される。

【図5】ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３系統を配列シグネチャでさらにグループ化したものを示す図である。さらなるグループ化は、１つまたは複数の基準に基づいて行われる： １）ＦＲ２親水性領域（３７Ｐｈｅ／Ｔｈｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ）、 ２）拡大ＣＤＲ１、 ３）ジスルフィド結合：ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３、 ４）ジスルフィド結合：ＣＤＲ１内またはＣＤＲ３内、 ５）ＣＤＲ３≧１５ａａ、 ６）非古典的ＶＨＨ：従来のＶＨと同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列、 ７）非古典的ＶＨＨ：Ａｒｇ１１８で置換された保存されたＴｒｐ１１８、 ８）非古典的ＶＨＨ：ＦＲ３での低疎水性プロファイル、 ９）配列ベースの新規Ａｇ結合ループコンフォメーション予測、 １０）個々の動物間の収束モチーフまたは配列シグネチャ、 １１）ＣＤＲ２長、 １２）ＣＤＲ３長、 １３）ＣＤＲ３長および同一性、 １４）ＣＤＲ３領域内における３つ以上の正電荷の存在、 １５）アミノ酸配列中のシステインの数、 １６）ＣＤＲ領域に見られる２～４のアミノ酸モチーフ。モチーフは、リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定される。

【図6】ＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ系統と、単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマにより開発されたアンカーとの対形成を示す図である。（ｉａ）では、抗原特異的Ｂ細胞が選別され、（ｉｉａ）では、ＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ対が、単一細胞連結ＰＣＲにより同定される。（ｉｂ）では、ＳＰ／２０マウス細胞株の細胞と、免疫ラクダ科動物リンパ球が融合され、ヘテロハイブリドーマを作成する。（ｉｉｂ）では、ヘテロハイブリドーマがスクリーニングされ、ＶＨ－Ｖκおよび／またはＶＨ－Ｖλ対を同定する。（ｉｉｉ）では、ＨおよびＬ（κまたはλ）系統が、Ｂ細胞選別またはヘテロハイブリドーマからのアンカーにより対形成される。

【図7】 １) 高い系統配列存在量から低い系統配列存在量、 ２）高系統配列増幅因子から低系統配列増幅因子、 ３）不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列の動的変化、 ４）免疫過程中の系統配列存在量の動的変化、 ５）ＶＨＨと従来のＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統配列、 ６）開発可能性責任配列の回避、 の系統優先因子を用いた、バインダーおよび生物活性スクリーニングのための各系統からの配列選択を示す図である。その結果、選択された抗体は、標的抗原の異なるエピトープに結合することが予想され、標的抗原の広いエピトープカバレッジが得られる。

【図8】同じ系統内で選択されたリードの最適化を示す図である。第１の選択ラウンドからのリードは、＠と＋でマークする。最適化配列の選択の基準は： １）ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２の差≧２ａａ； ２）ＦＲ１および／または２および／または３および／または４の差≧２ａａ； ３）ＶＨＨと従来のＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列； ４）ＶκおよびＶλの両方と対形成できるＶＨ配列； ５）異なる特性を有する様々な抗体フォーマットによって認識される同じエピトープ を含む。

【図9】系統分析によるＶＨＨおよびＶＨ－ＶＬのヒト化のワークフローを示す図である。Ｉでは、ラクダ科動物が抗原で免疫される；その後、２つの代替スクリーニングに適用される。ＩＩａでは、ＮＧＳを介して抗原に結合するＶＨＨの配列が得られ；ＩＩＩａでは、系統発生的に関連する抗体のグループ（系統）が同定され；ＩＶａでは、ＶＨＨの同じ系統内の置換可能な位置が同定され；Ｖａでは、ＦＲおよびＣＤＲの両方の変異耐性位置でヒトアミノ酸が置換される。代替スクリーニング方法では、ＩＩｂで、ＮＧＳを介して抗原に結合するＶＨおよびＶκまたはＶλ(従来のＩｇＧ)の配列が同定され；ＩＩＩｂで、系統発生的に関連する抗体のグループ（系統）が同定され；ＩＶｂで、ＶＨおよびＶκまたはＶλの同じ系統内の置換可能な位置が同定され；Ｖｂで、ＦＲおよびＣＤＲの両方の変異耐性位置でヒトアミノ酸が置換される。

【図10】ＥＧＦＲに結合する選択された抗体からの蛍光シグナルを示す図である。

【図11】抗ＫＬＨ抗体分泌Ｂ細胞およびアルパカフィーダー細胞の選択された共培養から分泌された抗体のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。フィーダー細胞のないＢ細胞のみは成長も増幅もしない。これは、陰性対照として使用した。免疫させた動物血清は、ＥＬＩＳＡの陽性対照として対照培地で１：１０００に希釈した。

【図12】フィーダー細胞および抗体分泌Ｂ細胞の共培養から得られたＢ細胞と、フィーダー細胞を含まないＢ細胞のみの増幅を示す図である。

【図13】ＫＬＨ ＮＧＳデータから、選択したクローンの上清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。

【図14】リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定されたＣＤＲ領域２～４アミノ酸モチーフに基づいてブロッキング抗体を同定するためのワークフローを示す図である。

【図15】ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間に形成された複合体の２つのビューを示す図であり、複合体の界面にあるＰＤ－１の２つのペプチドを強調表示している。

【図16】ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体における界面ペプチドの相互作用の分析結果を示す図である。

【図17】選択した抗ＰＤ－１ＶＨＨ抗体の系統グループを示す系統発生樹を示す図である。系統発生樹のルートは、サブグループ１、２、および３を含む系統グループを定義するアンカーとして機能する。

【図18】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２のクローンライブラリにおけるＣＤＲ３ドメインアミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図19A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図19B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図20A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図20B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図21A】共通のＣＤＲ３ドメイン配列を有する単一のアルパカのライブラリー内のＶＨ、ＶＨＨ^２、およびＶＨＨ^３抗体の重複クローンを示すベン図である。

【図21B】一般的なＣＤＲ３配列を示す図である。

【図22】アルパカＡ１およびＡ２、ＶＨ、ＶＨＨ２、およびＶＨＨ３抗体に共通するＣＤＲ３ドメイン配列の数を示すベン図である。

【図23】古典的なＶＨＨ型および非古典的なＶＨＨ型の選択された抗体クローンのＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６細胞を使用したＦＡＣＳによる抗原結合親和性を示す図である。

【図24】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における固有のＦＲ２ドメイン配列の割合を示す図である。

【図25】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における抗体のＦＲ２ドメインにおける特定のアミノ酸置換の頻度を示す図である。

【図26】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、１１～１５アミノ酸のＣＤＲ１ドメイン長を有するクローンの割合を示す図である。

【図27】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体における「長いＣＤＲ２」ドメインを有する抗体のＥＬＩＳＡによる結合親和性の分布を示す図である。

【図28】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体において、ＣＤＲ３ドメイン内に余分なジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図29-30】３つの異なる抗原を標的とする３つからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を持つクローンの割合を示す図である。

【図31】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体内でのＶ領域のアミノ酸配列内のシステイン残基の数の分析結果を示す図である。

【図32】３つの異なる抗原を標的とする３つライブラリーからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図33】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーの抗体において、ＦＲ２ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間、またはＦＲ２ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図34】ＶＨＨ抗体配列内のシステインアミノ酸数と上清のＯＤ値との相関関係を示す図である。

【図35】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々内に「長いＣＤＲ３」ドメインを有するクローンの割合を示す図である。

【図36-38】ＣＤＲ３ドメイン長と、ＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との相関関係を示す図である。

【図39】特定の抗原のほぼ同一のエピトープまたは同じエピトープに結合するＶＨＨ抗体の集団のＣＤＲ３の長さの範囲を示す図である。

【図40】ＰＤ１への結合について、選択した抗ＰＤ１クローンとＫＥＹＴＲＵＤＡおよびＯＰＤＩＶＯとの競合を評価する実験結果を示す図である。

【図41】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、ＶＨＨ抗体内でＴｒｐ１１８アミノ酸がＡｒｇで置換されているクローンの割合を示す図である。

【図42】ＣＤＲ３の長さと抗ＫＬＨＶＨＨ抗体のＥＬＩＳＡ結合活性との正の相関関係を示す図である。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0132】

各系統または系統対は、１つの固有のエピトープ、すなわち上位１００の系統／系統対からの１つの代表的な配列（ＶＨＨ）または１つの代表的な対（ＶＨ^１－ＶＬ^１）を認識すると推定され（例えば、ＶＨＨの場合は７０配列、ＶＨ^１－ＶκおよびＶＨ^１－Ｖλの場合は３０配列）、遺伝子合成、バインダースクリーニング、および生物活性試験用に選択される。系統選択基準（優先因子）としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：
１）高存在量の配列から低存在量の配列までの系統：各系統からの固有のｃＤＮＡ数（配列存在量）の総数は２～５０，０００の範囲であり、最も豊富な配列を有する系統は、抗原刺激後の最も広範なクローン拡大を示し得る。
２）高増幅因子から低増幅因子への系統、Ｂ細胞の濃縮／増殖前後の配列存在量の動的変化（増幅倍率は５～１，０００の範囲であり得る）。
３）免疫過程中の系統配列の存在量の変化。これは、抗原特異的配列の濃縮および抗体親和性成熟を示す（配列存在量／固有のｃＤＮＡ数の変化は、２～１，０００の範囲であり得る）。
４）該当する場合、特定の不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列存在量の変化（配列存在量／固有のｃＤＮＡ数の変化は、２～１，０００の範囲であり得る）。
５）ＶＨＨとＶＨ^１との間で同じナイーブＢ細胞起源（同じＶおよびＪの配置）を共有する系統。
６）開発可能性責任配列の回避：熱安定性（疎水性コア、電荷クラスター残基など）、化学的安定性（脱アミド化および異性化）、溶解性（表面疎水性など）ならびに不均一性（グリコシル化）など、開発可能性の問題を引き起こし得るいくつかのアミノ酸からなる配列が存在する（Ｔｏｍｏｙｕｋｉ Ｉｇａｗａら、ｍＡｂｓ，２０１１年）。これらの系統または系統対を選択することは避ける必要がある。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0138】

この方法の有意性により、広範なエピトープを高解像度で網羅するための試験のために、各系統から代表的な配列を体系的かつ関係的に選択することができる。これにより、次の状況での抗体の発見が改善される。
ａ）最良の親和性、特異性、および開発可能性のための候補の大規模なプールを用いた治療用抗体の発見；
ｂ）並行用途および他の用途でのコンパニオン診断抗体の発見；
ｃ）二価および多価抗体の構築および開発；
ｄ）抗体の重鎖と軽鎖との対の発見；
ｅ）同じエピトープに結合する抗体は、系統関連配列によって同定できる（図８に示す）。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３９

【補正方法】削除

【補正の内容】

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0170】

選択Ａ：クラスター内で最も数の多いクローンを選択する。
以下の表１に示すとおり、クラスターＣ３２８は、濃縮後に３５７倍の頻度の増加を有する。クラスター内の上位のクローンであるＮＢＬ５０５－Ａ１Ｌ１－Ｐ３Ｒ３＿３５５は、さらなる試験のために選択するのに良い選択肢である。

【表1】

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0171】

選択Ｂ：濃縮スコアが最高であるクローンを選択する。
濃縮前後のライブラリー内の配列を比較することにより（例えば、パニングまたはフローソートによって）、濃縮前後の配列頻度に基づいて濃縮スコアを計算することができる。機能的なＶＨＨを分泌するクローンを選択する機会を増加させるために、濃縮スコアを使用してクローンの選択に優先順位を付けることができる。以下の表２では、濃縮率に基づいてクローンＮＢＬ５０５－Ａ１Ｌ２－Ｐ３Ｒ２＿５５５９が選択されている。

【表2】

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１７８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0178】

上記のパニングＢ細胞濃縮法および抗原としてメソセリン（ＭＳＬＮ）を使用して、系統およびＣＤＲ３の長さを含むＮＧＳデータから、同一性グループ化方法を使用して、クローンのセットを選択した。ライブラリー内で最も豊富な１２配列のクローンのうち、７クローンが強力なＭＳＬＮバインダーであることが示された（以下の表３を参照のこと）。重要なことに、ＭＳＬＮは３つのドメインから構成されており、また５つのＭＳＬＮ結合クローンの抗体は、ＭＳＬＮのドメイン１のエピトープに特異的に結合する。さらに、選択されたクローンのうちの１つの抗体は、ドメイン２に特異的に結合し、クローンの１つの抗体はドメイン３にのみ特異的に結合する。したがって、系統のグループ化および選択を行う１回の作業で、完全長抗原の広域スペクトルのエピトープを認識するクローンを同定できる。これにより、抗原結合の異なる条件の治療においてクローンを選択するより多くの機会がもたらされるか、または二重特異性の組み合わせについて、より多くの選択肢がもたらされるであろう。さらに、この方法では、抗原－リガンド複合体のブロッカーまたは非ブロッカーとして挙動することが示されているクローンを同定することもできる。例えば、７つのＭＳＬＮ結合クローンの中で、ＭＳＬＮのドメイン２または３のいずれかに結合するが、ＭＳＬＮへのＣＡ１２５の結合を阻害しない２つのクローンからの抗体が同定される。対照的に、５ドメイン１エピトープバインダーは、ＣＡ１２５がＭＳＬＮに結合するのを防ぐことが示されている。本開示の方法は、広範囲のエピトープを高解像度でカバーするために、試験のために体系的かつ関係的に抗体を効率よく選択することができる。

【表3】

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0182】

ＢＩＡ後、共培養細胞のｍＲＮＡを使用して３つのＮＧＳライブラリーが構築される。逆転写には、オリゴｄＴ、ランダムヘキサマー、ＣＨ２特異的プライマーがそれぞれ使用される。（Ｍａａｓｓ ＤＲ，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ Ｊ，Ｐｅｒｎｔｈａｎｅｒ Ａ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ＣＢ．Ａｌｐａｃａ（Ｌａｍａ ｐａｃｏｓ）ａｓ ａ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｍｅｌｉｄ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＶＨＨｓ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７年；３２４（ｌ－２）：１３－２５．）。次に、これらのｃＤＮＡを２ラウンドのＰＣＲ反応にかける。これら３つのライブラリーはすべて、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）に送信され、ＭｉＳｅｑ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｍｉｓｅｑ、３００ｘ２）で、サンプルごとに４００～５００万回の読み取りで３０％ＰｈｉＸゲノムＤＮＡスパイクを使用して配列決定した。データはＮＧＳＱＣ Ｔｏｏｌｋｉｔを使用して品質確認し、ＦＬＡＳＨをアセンブルする。配列は、図４に示すとおり、同じＣＤＲ３の長さ、１以下のＣＤＲ３ハミング距離、および同じマッピングされたＶ／Ｊ生殖細胞系列に基づいて、系統／グループにクラスター化させる、配列は、同じＣＤＲ３の長さと８０％以上のＣＤＲ３の同一性に基づいて、さらにサブグループ化して、クラスター化させる。各ライブラリーに対して、８００を超えるグループが生成された。ここでは、いくつかの系統優先因子：配列存在量、古典的ＶＨＨ対非古典的ＶＨＨ、およびＣＤＲ３の長さを適用して、これらのグループからクローンを選択する。２０の異なるグループから２０のクローンが選択され、それらの合成、発現、および精製が行われる。選択したクローンに関連するバイオインフォマティクスデータを以下の表４から６に示す。選択されたクローンのそれぞれによって発現する抗体の完全なアミノ酸配列は、各ドメイン（ＦＲ１、ＣＤＲ１など）の連続配列として得られる。

【表4】

【表5】

【表6】

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0183】

抗体の抗原特異的結合の検証は、ＥＬＩＳＡによって行う。ライブラリーは、サブグループ化シグネチャ（配列存在量、古典的ＶＨＨ対非古典的ＶＨＨおよびＣＤＲ３の長さ）に基づいて調査される。この実施例では、各クラスターから１つのクローンのみが選択される。この例では、選択されたクローンのほとんどが、非古典的ＶＨＨではなく古典的ＶＨＨを生成する。この例では、通常のＶＨＨ配列よりもＣＤＲ３内にジスルフィド結合のさらなる対を有する１つのクローンと同様に、長いヒンジ配列および短いヒンジ配列の両方を有するアミノ酸配列が選択されたクローンに含まれている。このようなクローン選択戦略により、結合活性を有するクローンの選択において１００％の成功率を達成した。ＥＬＩＳＡアッセイに示すとおり、選択された２０のクローンすべてがＫＬＨ抗原ＫＬＨに対して特異的な結合活性を示した（図１３に示す）。それらの１８は、０．４６５ｎｍの平均結合ＥＣを有していた（外れ値としての番号６および番号９を除く）。３つのクローン（番号１、３、および１３）は、それぞれ６７、７７、および７２ｐｍｏｌ／ＬのＥＣ５０を有する強力なＫＬＨバインダーであることが示されている。リードのほとんどは、ナノモル以下の効力を有することが示されている。したがって、強力なＫＬＨ結合抗体を分泌するクローン化されたＢ細胞は、ＢＩＡおよびＮＧＳにより同定できる。ＣＤＲ３の長さと結合活性との相関結果を確認するために、異なるＣＤＲ３の長さを有するクローンをリストに含めている。見られる最短のＣＤＲ３の長さは９アミノ酸であるが、最長のＣＤＲ３の長さは２１である。２０のＶＨＨ抗体の平均ＣＤＲ３長は、１６アミノ酸である。図４２に示すとおり、ＣＤＲ３の長さとクローンＥＬＩＳＡ活性との間に正の相関が見られる。

【表7】

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0187】

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１構造解析
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の構造は、ＰＤＢデータベース（ＰＤＢ ＩＤ：４ＺＱＫ）からダウンロードした。ＰＹＭＯＬソフトウェアは、構造解析に使用する。構造は、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１の２つのペプチドをカバーしていることを示した（図１５）。ＰＤ－Ｌ１に近いループ配列は、ＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡ（配列番号１３８）であり、ＰＤ－１に近いループ配列は、ＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲ（配列番号１３９）である。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結晶構造で観察される極性接触残基領域が選択される。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の極性接触は、「作用－検索－極性接触－溶媒を除くその他（ａｃｔｉｏｎｓ－ｆｉｎｄ－ｐｏｌａｒ ｃｏｎｔａｃｔｓ－ｔｏ ｏｔｈｅｒｓ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ）」を用いてＰＹＭＯＬに表示される。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0189】

上記の分析により、ＰＤ－Ｌ１の極性接触残基が決定され、それらはＦ－Ｄ－Ｑ－ＡＤＹＫＲ（配列番号１４４）である。Ｆ－Ｄ－Ｑ－Ａには非常に長いアミノ酸間隔（＞２アミノ酸）があるため、ペプチドＡＤＹＫＲ（配列番号１４３）のみが選択戦略に適合する。ＶＨＨの選択には、２～４のアミノ酸ペプチドが選択される。次に、ペプチドＡＤＹＫ（配列番号６８）、ＤＹＫＲ（配列番号１４２）、ＡＤＹ、ＤＹＫ、ＹＫＲ、ＡＤ、ＤＹ、ＹＫおよびＫＲをＮＧＳデータベースからのスクリーニング基準に設定する（表４）。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0190】

様々な抗体によって複合体形成したＰＤ－１の追加の構造が利用可能であり、ＰＤＢデータベースからダウンロードして、上記と同じ方法で分析する。ＰＤ－１と様々な抗ＰＤ－１抗体との複合体、および上記の複合体の相互作用分析によって潜在的なブロッキングペプチドとして同定された短いペプチドを表８に示す。

【表8】

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0192】

以前の刊行物には、ファージ表面ＶＨＨディスプレイライブラリーのパニングによる抗体発見のためのプロトコルが記載されている。しかし、この方法では、ライブラリー内で存在量の多いＶＨＨクローンのみが取得される傾向があり、結果として、存在量の少ないＶＨＨが失われる。様々なスクリーニングペプチドストリングを使用したキーワード検索に基づいて、様々な存在量（選択されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持しているすべてのクローンの割合）の一連のＶＨＨ配列がＮＧＳデータベースから選択される。異なる存在量を有する選択されたクローン内にコードされているアミノ酸配列のＣＤＲ３部分を表９に示す。

【表9】

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0199】

１９のクローンから精製されたＶＨＨ抗体は、上記のとおりＥＬＩＳＡによって、ＰＤ－Ｌ１への結合について、およびＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体の形成の阻害について評価する。結果をそれぞれ表１０および表１１に示す。

【表10】

【表11】

【手続補正15】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２０４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0204】

実施例３：配列シグネチャおよびクローン選択規則の開発
ＢＣＭＡ免疫下の動物間の収束（重複）配列。この実験では、５０７－Ａ１（Ａｌ）および５０７－Ａ２（Ａ２）という名前の２つのアルパカを、ヒト組換えＢＣＭＡタンパク質で免疫させる。動物Ａ１およびＡ２は、同じ免疫レジメを使用して、同量の組換えヒトＢＣＭＡを受ける。固有のＣＤＲ３アミノ酸配列を有する９３および４０のＶＨＨ配列は、それぞれ動物Ａ１およびＡ２の有望なリードとして発見される。動物間で、免疫およびクローン同定に関して二重盲検化されたクローンを選択すると、両方の動物が共有するＣＤＲ３配列を有する２０の配列がある。表１２は、両方の動物が共有する２０の固有のＣＤＲ３配列を示す。

【表12】

【手続補正16】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0210】

共有されている配列は、強力なＢＣＭＡバインダーであることが示されている。重複する配列が好ましいシグネチャであるかを試験するために、ＶＨＨ２およびＶＨＨ３によって共有される８つの収束ＶＨＨクローンによって発現される抗体を精製する。ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーのいずれかにより、すべてが強力なＢＣＭＡバインダーであることがわかった。１Ａ１および１Ｄ２と名付けられた図２１Ｂで強調表示された配列（配列番号１１７および１１８）は、ＶＨ抗体およびＶＨＨ抗体の両方によって共有されている。８つの収束ＶＨＨ抗体は、ＢＣＭＡを過剰発現する腫瘍細胞株ＲＰＭＩ８２２６の細胞に結合するが、ＢＣＭＡ発現が陰性である２９３Ｔ細胞には結合しない。ＥＬＩＳＡでは、コーティング抗原としてＨｉｓまたはＦｃコンジュゲート結合ヒトＢＣＭＡのいずれかを使用して、同様の結果を示した（表１３）。

【表13】

【手続補正17】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図2】

【手続補正18】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図3】

【手続補正19】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図4】

【手続補正20】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図5】

【手続補正21】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図6】

【手続補正22】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図7】

【手続補正23】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図8】

【手続補正24】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図9】

【手続補正25】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図10】

【手続補正26】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図11】

【手続補正27】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図13】

【手続補正28】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図14】

【手続補正29】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図15】

【手続補正30】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図16】

【手続補正31】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１９Ａ－Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図19A-B】

【手続補正32】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２０Ａ－Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図20A-B】

【手続補正33】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２１Ａ－Ｂ

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図21A-B】

【手続補正34】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図23】

【手続補正35】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図25】

【手続補正36】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図27】

【手続補正37】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図31】

【手続補正38】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図34】

【手続補正39】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図36】

【手続補正40】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図37】

【手続補正41】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図38】

【手続補正42】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図39】

【手続補正43】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図40】

【手続補正44】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図41】

【手続補正45】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図42】

【手続補正書】

【提出日】2022-09-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0035】

例示的な実施形態は、参照された図に示す。本明細書に開示の実施形態および図は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図されている。

【図1A】ＶＨＨ、ＶＨ、およびＣＨ免疫グロブリンをコードするラクダ科動物の遺伝子座の構成を示す図である。

【図1B】ラクダ科動物のＶＨＨ構造を示す図である。

【図2】（ｉ）では、ラクダ科動物（ラクダまたはラマ）が、ｃＤＮＡ、小分子、ペプチド、もしくはタンパク質でありうる免疫源、または、複合免疫源－正常または疾患の細胞または組織で免疫される。生成されたＶＨＨは、タンパク質アレイまたは細胞／組織抗原ｃＤＮＡライブラリーまたは免疫沈降ベースの質量分析によって個々の対応する抗原を同定するために使用される。（ｉｉ）では、抗血清がＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１／κ、ＩｇＧ１／λ）を単離し、それぞれ力価および生物活性の試験を行うことにより評価される。（ｉｉｉ）では、免疫Ｂ細胞が、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄、リンパ節および他のリンパ組織から単離される。（ｉｖ）では、パニング（不要なＢ細胞の濃縮および/または除去）；磁気ビーズ精製またはＦＡＣＳソーティングにより、抗原特異的Ｂ細胞、抗原特異的メモリーＢ細胞、および形質芽細胞が、免疫原、所望のドメインまたはエピトープまたは複合免疫原で濃縮される。（ｖ）では、抗原特異的Ｂ細胞が、ラクダ科動物のＣＤ４０－Ｌ細胞、サイトカインおよび／または免疫原によって活性化および増殖するかを試験される。

【図3】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλを増幅するためのＩｇＧアイソタイプ特異的プライマーセットを示す図である。Ｉａ／ｂでは、リード配列（ＶＨ／ＶＨＨ）ＣＨ２が同定される。ＩＩａ／ｂでは、ＶＨおよびＶＨＨ用のプライマーセットを用いてＰＣＲが行われる；ＩＩＩａでは、約６００ｂｐのＶＨＨ断片が精製される；ＩＩＩｂでは、約９００ｂｐのＶＨ断片が精製される；ＩＶａでは、ＰＣＲでＶＨＨ２（短いヒンジ）配列を増幅するために、ＶＨＨ２用のネステッドプライマーが使用され、ＩＶｂでは、ＰＣＲで増幅するために、ＶＨ１およびＶＨＨ３（長いヒンジ）配列用のネステッドプライマーが使用される。ＩＩｃでは、Ｖκ用ＰＣＲプライマーセットが、ＰＣＲでそれらの配列を増幅するために使用され、ＩＩｄでは、Ｖλ用ＰＣＲプライマーセットが、ＰＣＲでそれらの配列を増幅するために使用される。

【図4】ＶＨＨ^２、ＶＨＨ^３、ＶＨ^１、Ｖκ、およびＶλＮＧＳライブラリーの生成および系統のグループ化を示す図である。Ｉでは、ＶＨＨ２、ＶＨＨ３、ＶＨ１、Ｖκ、およびＶλの配列に関するデータが、ＮＧＳアダプターの追加および索引付けにより生成される；ＩＩでは、クローンのヌクレオチド配列が、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ３００ｘ２およびデータ構築により生成される；ＩＩＩでは、配列が、バイオインフォマティクスを用いた重鎖ＣＤＲ３または軽鎖ＣＤＲ３の配列に基づく系統でグループ化される。

【図5】ＶＨＨ^２およびＶＨＨ^３系統を配列シグネチャでさらにグループ化したものを示す図である。さらなるグループ化は、１つまたは複数の基準に基づいて行われる：１）ＦＲ２親水性領域（３７Ｐｈｅ／Ｔｈｒ、４４Ｇｌｕ、４５Ａｒｇ、および４７Ｇｌｙ）、２）拡大ＣＤＲ１、３）ジスルフィド結合：ＣＤＲ１－ＣＤＲ３またはＦＲ２－ＣＤＲ３、４）ジスルフィド結合：ＣＤＲ１内またはＣＤＲ３内、５）ＣＤＲ３≧１５ａａ、６）非古典的ＶＨＨ：従来のＶＨと同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列、７）非古典的ＶＨＨ：Ａｒｇ１１８で置換された保存されたＴｒｐ１１８、８）非古典的ＶＨＨ：ＦＲ３での低疎水性プロファイル、９）配列ベースの新規Ａｇ結合ループコンフォメーション予測、１０）個々の動物間の収束モチーフまたは配列シグネチャ、１１）ＣＤＲ２長、１２）ＣＤＲ３長、１３）ＣＤＲ３長および同一性、１４）ＣＤＲ３領域内における３つ以上の正電荷の存在、１５）アミノ酸配列中のシステインの数、１６）ＣＤＲ領域に見られる２～４のアミノ酸モチーフ。モチーフは、リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定される。

【図6】ＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ系統と、単一Ｂ細胞選別およびヘテロハイブリドーマにより開発されたアンカーとの対形成を示す図である。（ｉａ）では、抗原特異的Ｂ細胞が選別され、（ｉｉａ）では、ＶＨ－ＶκまたはＶＨ－Ｖλ対が、単一細胞連結ＰＣＲにより同定される。（ｉｂ）では、ＳＰ／２０マウス細胞株の細胞と、免疫ラクダ科動物リンパ球が融合され、ヘテロハイブリドーマを作成する。（ｉｉｂ）では、ヘテロハイブリドーマがスクリーニングされ、ＶＨ－Ｖκおよび／またはＶＨ－Ｖλ対を同定する。（ｉｉｉ）では、ＨおよびＬ（κまたはλ）系統が、Ｂ細胞選別またはヘテロハイブリドーマからのアンカーにより対形成される。

【図7】１) 高い系統配列存在量から低い系統配列存在量、２）高系統配列増幅因子から低系統配列増幅因子、３）不要なＢ細胞を枯渇させる前後での系統配列の動的変化、４）免疫過程中の系統配列存在量の動的変化、５）ＶＨＨと従来のＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する系統配列、６）開発可能性責任配列の回避、の系統優先因子を用いた、バインダーおよび生物活性スクリーニングのための各系統からの配列選択を示す図である。その結果、選択された抗体は、標的抗原の異なるエピトープに結合することが予想され、標的抗原の広いエピトープカバレッジが得られる。

【図8】同じ系統内で選択されたリードの最適化を示す図である。第１の選択ラウンドからのリードは、＠と＋でマークする。最適化配列の選択の基準は：１）ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２の差≧２ａａ；２）ＦＲ１および／または２および／または３および／または４の差≧２ａａ；３）ＶＨＨと従来のＶＨとの間で同じナイーブＢ細胞起源を共有する配列；４）ＶκおよびＶλの両方と対形成できるＶＨ配列；５）異なる特性を有する様々な抗体フォーマットによって認識される同じエピトープを含む。

【図9】系統分析によるＶＨＨおよびＶＨ－ＶＬのヒト化のワークフローを示す図である。Ｉでは、ラクダ科動物が抗原で免疫される；その後、２つの代替スクリーニングに適用される。ＩＩａでは、ＮＧＳを介して抗原に結合するＶＨＨの配列が得られ；ＩＩＩａでは、系統発生的に関連する抗体のグループ（系統）が同定され；ＩＶａでは、ＶＨＨの同じ系統内の置換可能な位置が同定され；Ｖａでは、ＦＲおよびＣＤＲの両方の変異耐性位置でヒトアミノ酸が置換される。代替スクリーニング方法では、ＩＩｂで、ＮＧＳを介して抗原に結合するＶＨおよびＶκまたはＶλ(従来のＩｇＧ)の配列が同定され；ＩＩＩｂで、系統発生的に関連する抗体のグループ（系統）が同定され；ＩＶｂで、ＶＨおよびＶκまたはＶλの同じ系統内の置換可能な位置が同定され；Ｖｂで、ＦＲおよびＣＤＲの両方の変異耐性位置でヒトアミノ酸が置換される。

【図10】ＥＧＦＲに結合する選択された抗体からの蛍光シグナルを示す図である。

【図11】抗ＫＬＨ抗体分泌Ｂ細胞およびアルパカフィーダー細胞の選択された共培養から分泌された抗体のＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。フィーダー細胞のないＢ細胞のみは成長も増幅もしない。これは、陰性対照として使用した。免疫させた動物血清は、ＥＬＩＳＡの陽性対照として対照培地で１：１０００に希釈した。

【図12】フィーダー細胞および抗体分泌Ｂ細胞の共培養から得られたＢ細胞と、フィーダー細胞を含まないＢ細胞のみの増幅を示す図である。

【図13】ＫＬＨ ＮＧＳデータから、選択したクローンの上清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。

【図14】リガンド／受容体複合体の三次元構造から同定されたＣＤＲ領域２～４アミノ酸モチーフに基づいてブロッキング抗体を同定するためのワークフローを示す図である。

【図15】ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間に形成された複合体の２つのビューを示す図であり、複合体の界面にあるＰＤ－１の２つのペプチドを強調表示している。

【図16】ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１複合体における界面ペプチドの相互作用の分析結果を示す図である。

【図17】選択した抗ＰＤ－１ＶＨＨ抗体の系統グループを示す系統発生樹を示す図である。系統発生樹のルートは、サブグループ１、２、および３を含む系統グループを定義するアンカーとして機能する。

【図18】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２のクローンライブラリにおけるＣＤＲ３ドメインアミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図19A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図19B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図20A】共通のヒンジ領域およびＣＤＲ３ドメイン配列を有するアルパカＡ１およびＡ２から重複するクローンを同定するための選択スキームを示す図である。

【図20B】免疫させたアルパカＡ１およびＡ２からのクローンライブラリー内のヒンジ領域アミノ酸配列の重複を示すベン図である。

【図21A】共通のＣＤＲ３ドメイン配列を有する単一のアルパカのライブラリー内のＶＨ、ＶＨＨ^２、およびＶＨＨ^３抗体の重複クローンを示すベン図である。

【図21B】一般的なＣＤＲ３配列を示す図である。

【図22】アルパカＡ１およびＡ２、ＶＨ、ＶＨＨ２、およびＶＨＨ３抗体に共通するＣＤＲ３ドメイン配列の数を示すベン図である。

【図23】古典的なＶＨＨ型および非古典的なＶＨＨ型の選択された抗体クローンのＢＣＭＡを発現するＲＰＭＩ８２２６細胞を使用したＦＡＣＳによる抗原結合親和性を示す図である。

【図24】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における固有のＦＲ２ドメイン配列の割合を示す図である。

【図25】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々における抗体のＦＲ２ドメインにおける特定のアミノ酸置換の頻度を示す図である。

【図26】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、１１～１５アミノ酸のＣＤＲ１ドメイン長を有するクローンの割合を示す図である。

【図27】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体における「長いＣＤＲ２」ドメインを有する抗体のＥＬＩＳＡによる結合親和性の分布を示す図である。

【図28】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体において、ＣＤＲ３ドメイン内に余分なジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図29】３つの異なる抗原を標的とする３つからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を持つクローンの割合を示す図である（その１）。

【図30】 ３つの異なる抗原を標的とする３つからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を持つクローンの割合を示す図である（その２）。

【図31】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーからの抗体内でのＶ領域のアミノ酸配列内のシステイン残基の数の分析結果を示す図である。

【図32】３つの異なる抗原を標的とする３つライブラリーからの抗体のＣＤＲ１ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図33】３つの異なる抗原を標的とする３つのライブラリーの抗体において、ＦＲ２ドメインとＣＤＲ２ドメインとの間、またはＦＲ２ドメインとＣＤＲ３ドメインとの間に追加のジスルフィド結合を有するクローンの割合を示す図である。

【図34】ＶＨＨ抗体配列内のシステインアミノ酸数と上清のＯＤ値との相関関係を示す図である。

【図35】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々内に「長いＣＤＲ３」ドメインを有するクローンの割合を示す図である。

【図36】ＣＤＲ３ドメイン長と、ＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との相関関係を示す図である（その１）。

【図37】 ＣＤＲ３ドメイン長と、ＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との相関関係を示す図である（その２）。

【図38】 ＣＤＲ３ドメイン長と、ＶＨＨ抗ＢＣＭＡ抗体についてＦＡＣＳまたはＥＬＩＳＡによってアッセイされた抗体親和性との相関関係を示す図である（その３）。

【図39】特定の抗原のほぼ同一のエピトープまたは同じエピトープに結合するＶＨＨ抗体の集団のＣＤＲ３の長さの範囲を示す図である。

【図40】ＰＤ１への結合について、選択した抗ＰＤ１クローンとＫＥＹＴＲＵＤＡおよびＯＰＤＩＶＯとの競合を評価する実験結果を示す図である。

【図41】３つの異なる抗原に結合する抗体の３つのライブラリーの各々において、ＶＨＨ抗体内でＴｒｐ１１８アミノ酸がＡｒｇで置換されているクローンの割合を示す図である。

【図42】ＣＤＲ３の長さと抗ＫＬＨＶＨＨ抗体のＥＬＩＳＡ結合活性との正の相関関係を示す図である。

【国際調査報告】