(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-09-27
(54)【発明の名称】ＨＩＶ感染症を治療するための長寿命Ｔ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220916BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220916BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20220916BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220916BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220916BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220916BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220916BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20220916BHJP
C07K 14/545 20060101ALN20220916BHJP
C07K 14/495 20060101ALN20220916BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783
A61P37/04
A61P31/18
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K35/17 Z
C12N5/10
C12N15/09 Z
C07K14/545
C07K14/495
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022503015
(86)(22)【出願日】2020-07-17
(85)【翻訳文提出日】2022-03-03
(86)【国際出願番号】 US2020042567
(87)【国際公開番号】W WO2021011882
(87)【国際公開日】2021-01-21
(31)【優先権主張番号】62/875,217
(32)【優先日】2019-07-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】597138069
【氏名又は名称】ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】セカリー，ラフィック－ピエール
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ，アシッシュ
(72)【発明者】
【氏名】ゼイダン，ジョマーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065BA03
4B065CA44
4C084AA19
4C084NA05
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4C084ZB092
4C084ZB331
4C084ZB332
4C084ZC751
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB64
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4C087CA12
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA20
4C087ZB09
4C087ZB33
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA03
4H045EA20
(57)【要約】
ＨＩＶ感染した対象を治療する方法は、ＣＤ４５ＡおよびＣＤ４５Ｏ（ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ）の中間細胞表面共発現を特徴とする濃縮ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を対象に投与することを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を生成する方法であって、前記方法が、対象の生体試料からＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を単離することと、
ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞からＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を分離することと、
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の前記集団を分離する前に、前記ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が機能的ＣＣＲ５および／もしくはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように前記ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を修飾すること、ならびに／または前記ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が機能的ＣＣＲ５および／もしくはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように、前記ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を修飾することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記生体試料が、前記対象から単離された末梢血単核細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記単離されたＴ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記単離されたＴ細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、またはＣＤ２７のうちの少なくとも１つを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、４－１ＢＢを中間的に発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＤ５、ＩＬ２ＲＧ、ＩＧＦ２Ｒ、ＳＬＣ３８Ａ１、ＩＬ７Ｒ、ＳＬＣ４４Ａ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＣＤ９６、ＣＤ４４、ＣＤ６、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、またはＳＬＣ１２Ａ７のうちの少なくとも１つを発現する、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋ＩＬ７Ｒ＋ＣＤ４４＋ＳＣＬ３８Ａ１＋ＩＬ２ＲＧ＋ＣＤ６＋ＣＤ５＋表現型を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体で活性化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団の拡大および／または形成を促進するのに有効な量のＩＬ７およびＩＬ１５で培養することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項12】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を維持するために、ＴＧＦβ／ＩＬ－１βを含む培養培地中の前記ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する前記分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を培養することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項13】
前記機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠く前記ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４をコードする遺伝子を不活性化することによって修飾される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記単離されたＴ細胞が、形質導入、トランスフェクション、および／またはエレクトロポレーションのうちの少なくとも１つによって遺伝子修飾される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
単離された濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団であって、前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ４５ＡおよびＣＤ４５Ｏ（ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ）の中間細胞表面共発現ならびにＣＤ９５＋、ＣＤ１２７＋、およびＣＤ２７＋の発現を特徴とし、前記細胞が、機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように修飾される、単離された濃縮ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団。
【請求項16】
ＨＩＶに感染した対象に投与すると、前記対象における絶対ＣＤ４細胞数の持続的な増加、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫の回復、およびＨＩＶリザーバーにおける実質的な減衰のうちの少なくとも１つを促進することができる、請求項１５に記載の集団。
【請求項17】
ＣＤ４５ＡおよびＣＤ４５Ｏの中間細胞表面共発現（ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ）ならびにＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ５８＋およびＣＤ９５＋の発現を特徴とする濃縮メモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団であって、前記遺伝子編集細胞が、機能的ＣＣＲ５ ＨＩＶ補助受容体を欠く、濃縮メモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団。
【請求項18】
ＨＩＶ感染した対象を治療する方法であって、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の濃縮Ｔ細胞集団を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記対象が、抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記濃縮Ｔ細胞集団が、前記対象における絶対ＣＤ４細胞数の持続的増加、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫の回復、およびＨＩＶリザーバーの実質的な減衰のうちの少なくとも１つを促進するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項21】
ＨＩＶ感染した対象を治療する方法であって、ＣＤ４５ＡおよびＣＤ４５Ｏ（ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ）の中間細胞表面共発現を特徴とする濃縮ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項22】
前記対象が、抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記濃縮Ｔ細胞集団が、前記対象における絶対ＣＤ４細胞数の持続的増加、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫の回復、およびＨＩＶリザーバーの実質的な減衰のうちの少なくとも１つを促進するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項２２に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国仮出願第６２／８７５，２１７号の優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国仮出願第６２／８７５，２１７号の優先権を主張し、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
潜伏感染した細胞の小さなプールの存在は、抗レトロウイルス治療（ＡＲＴ）の停止およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の根絶に対する主要な障害となっている。ＡＲＴはウイルス複製を永続的に抑制することができるが、ＨＩＶは無期限に持続し、感染した個人は一生複雑な抗レトロウイルス薬レジメンを継続する必要がある。免疫機能を再構成するＡＲＴの能力は、非常に変動する。個人のサブセット（最大４５％）は、何年にもわたる効果的なＡＲＴの後でも、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の完全な回復を示すことができない。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の回復障害は、胸腺形成（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ）障害および恒常性障害など、多くの宿主関連およびＨＩＶ関連の要因と関連付けられている。ＡＲＴ中の個人におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞数が少ないことは、がんおよび他の疾患の高いリスクと関連しているため、そのような個人の免疫機能を増強するための新規の治療アプローチが必要である。
【0003】
潜伏性ＨＩＶリザーバーをモデル化した研究では、特に感染の慢性期にＡＲＴが開始された個人では、ＡＲＴ開始から４年後に総ＨＩＶ ＤＮＡおよび統合ＨＩＶ ＤＮＡの減衰が最小限であったことが示されている。恒常性増殖、機能不全の宿主クリアランス機序、およびおそらく残留ウイルス複製によって維持される長寿命メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の「潜伏」感染を含む、いくつかの機序がＨＩＶの持続に寄与する。興味深いことに、これらの機序はすべて、免疫学的な非応答者で悪化し、より大きなＨＩＶリザーバーのサイズと関連付けられている。したがって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞の回復を増強することは、ＡＲＴ中のＨＩＶリザーバーの低減に寄与する可能性がある。
【0004】
ＣＣＲ５は、ＨＩＶ侵入の主要な補助受容体のうちの１つである。ＨＩＶ感染した対象にＣＣＲ５欠損免疫コンパートメントを提供するという治療概念は、ホモ接合型ＣＣＲ５Δ３２適合ドナーからＣＤ３４＋幹細胞の同種異系骨髄移植を受けて以来ＨＩＶに感染していない「ベルリンの患者」で実証された。これらの結果は有望であるが、より侵襲性が低く、より広く適用可能な治療戦略が望ましいであろう。１つのアプローチは、自家Ｔ細胞の養子移入を通じて免疫機能を再構成することであり、これはサイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルスを含む他のウイルス感染ではうまく展開されたが、ＣＤ４＋ Ｔ細胞がＨＩＶ感染に感受性を維持していることもあり、ＨＩＶ感染ではほとんど失敗した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）媒介性ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４ Ｔ細胞（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）の養子移入がＨＩＶ感染した成人の群で行われた最近の試験では、この注入が安全で忍容性が高く、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の増加およびＨＩＶリザーバーの減少につながったことを示している。
【発明の概要】
【0005】
本明細書に記載される実施形態は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞）、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する遺伝子修飾および／または改変されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の長寿命濃縮集団、ならびにＨＩＶ感染した対象、特に抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている対象の潜伏性ＨＩＶ感染の治療におけるそれらの使用に関する。サブセットＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、長寿命多能性幹細胞の表現型および分子属性を有することがわかった。他の既知の幹細胞集団と同様に、このサブセット集団は、代謝プロファイルが低く（脂肪酸代謝および酸化的リン酸化の上方調節、ならびに細胞循環経路の下方調節）、自己再生能力を保持し、エフェクター細胞に分化することができる。このサブセットは、主にＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの中間的な共発現（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ）を特徴とする。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ９５（Ｆａｓ）ＣＤ１２７（ＩＬ７Ｒ）およびＣＤ２７を発現することもできる。低用量のサイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５の添加は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８細胞の濃縮集団の形成につながる可能性があるが、高用量のサイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５は、細胞のエフェクター分化につながる可能性がある。
【0006】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、それらが機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾することができる。ＨＩＶ感染した対象へのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集された自家ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の投与は、対象におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞数の持続的な増加、Ｔ細胞の恒常性の回復、およびＨＩＶリザーバーのサイズのかなりの低下をもたらし得る。
【0007】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾され得る、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を生成する方法は、対象の生体試料からＴ細胞を単離することを含む。生体試料は、治療されるＨＩＶを有する対象の末梢血単核細胞などの試料を含むＴ細胞、すなわち、治療される対象からの自家Ｔ細胞を含むことができる。単離されたＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含み得る。
【0008】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団は、単離されたＴ細胞から分離することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を単離されたＴ細胞から分離する前に、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾され得る。他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団は、単離されたＴ細胞から分離した後に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団が機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾され得る。
【0009】
いくつかの実施形態において、単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、細胞内のＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４をコードする遺伝子を不活性化するために、形質導入、トランスフェクション、および／またはエレクトロポレーションのうちの少なくとも１つによって遺伝子修飾される。
【0010】
いくつかの実施形態において、分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、またはＣＤ２７のうちの少なくとも１つを発現することができる。他の実施形態において、分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、４－１ＢＢを中間的に発現することができ、場合によりＯＸ４０を発現することができる。
【0011】
他の実施形態において、分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＤ５、ＩＬ２ＲＧ、ＩＧＦ２Ｒ、ＳＬＣ３８Ａ１、ＩＬ７Ｒ、ＳＬＣ４４Ａ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＣＤ９６、ＣＤ４４、ＣＤ６、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、またはＳＬＣ１２Ａ７のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ以上を発現することができる。
【0012】
いくつかの実施形態において、分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋表現型を有することができる。他の実施形態において、分離されたＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋ＩＬ７Ｒ＋ＣＤ４４＋ＳＣＬ３８Ａ１＋ＩＬ２ＲＧ＋ＣＤ６＋ＣＤ５＋表現型を有することができる。
【0013】
他の実施形態において、この方法は、遺伝子修飾および／または分離の前に、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体で単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を活性化することを含み得る。活性化したＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団の拡大および／または形成を促進するのに有効なＩＬ７およびＩＬ１５の量で培養することができる。一旦分離されると、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を維持するために、ＴＧＦβ／ＩＬ－１βを含む培養培地中で培養することができる。
【0014】
本明細書に記載される他の実施形態は、本明細書に記載される方法によって産生されるＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を含む組成物に関する。ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団の少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有し得る。組成物または濃縮Ｔ細胞集団は、ＨＩＶ感染症を治療するために、ＨＩＶ感染症を有する対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、ＨＩＶを有する対象への組成物または濃縮Ｔ細胞集団の投与は、対象における絶対ＣＤ４細胞数の持続的増加、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫の回復、およびＨＩＶリザーバーの実質的な減衰のうちの少なくとも１つを促進することができる。いくつかの実施形態において、対象は、抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を生成する方法を示すフロー図である。
【図2A-F】ＳＢ－７２８－Ｔ注入後のＨＩＶリザーバーの減衰を示すプロットは、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の持続性と相関していることを示す。Ａ、ベースライン（ＢＬ）、注入後１年、および２年における１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡを保有する細胞の頻度を示すジッターを重ねた箱ひげ図。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは最大値および最小値まで伸びている。個々のデータポイントは、９人の参加者全員について、異なるコホートに対応する色で示される（コホート１、２、および３は、それぞれ青色、緑色および赤色で示される）。対象１－０１および１－０２のＢＬ値は、材料および方法に記載されているように入力した。＊Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン順位和検定。Ｂ、１０６個の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞当たりの統合ＨＩＶ ＤＮＡコピーの頻度は、ＢＬおよび２～３年目（長期フォローアップ）において示される。コホート１、２および３の参加者は、それぞれ青色、緑色および赤色の記号で示される。＊Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン順位和検定。Ｃ～Ｄ、長期時点での総ＨＩＶ ＤＮＡを保有するＰＢＭＣの頻度の変化（０日目に対する７２０日目でのｌｏｇ１０値の比率）と注入後２１日目（Ｃ）および３～４年目（Ｄ）での五量体複製とマークされた細胞の倍率拡大との間の関連。ロバスト回帰モデルからの散布図および予測は、９５％信頼区間（影付きの領域）とともに示される。Ｅ、非線形混合効果モデルのパラメーター推定用ソフトウェアであるＭｏｎｏｌｉｘを使用したＨＩＶ ＤＮＡ（参加者３－０１）の二相減衰分析の代表的な例。青色の線は、１０６個のＰＢＭＣ（赤色の星で表される）当たりのＨＩＶ ＤＮＡコピーに対する二相の指数的適合線を表す。これらの線は、それぞれ、高速および低速の減衰、ならびに低速の減衰相の終了後に到達したプラトーを表す。挿入図は、低速の相減衰の開始および終了を表す２つの交点を強調している。Ｆ、注入後の希釈（参加者３－０１）の結果として予想される１０６個のＰＢＭＣ当たりの推定総ＨＩＶ ＤＮＡの代表的な例（赤色の線）。１０６個のＰＢＭＣ（青色の線）当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡの測定された頻度、および１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の推定された頻度（紫色の線、五量体複製とマークされた細胞の頻度に４を掛けることによって計算される）も示される。
【図3A-D】ＣＣＲ５遺伝子編集Ｔ細胞および総ＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続に寄与するが、ＣＤ４＋ Ｔ細胞リザーバーには最小限に寄与する新規メモリー幹細胞ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット（ＣＤ９５を発現するＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞）の同定を示すグラフおよびプロットを示す。Ａ、ＢＬ（注入前７日～３ヶ月、ｎ＝９）、注入後初期（１４～２８日目、ｎ＝６）、中期（４～７ヶ月目、ｎ＝７）、および長期時点（３～４年目、ｎ＝９）でのＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるナイーブ、ＴＣＭ、ＴＴＭ、ＴＥＭ、およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ頻度の平均分布を示す棒グラフ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン順位和検定。Ｂ、１４日目～４ヶ月目（３つのサブセットすべてについて、ｎ＝７）、６～８ヶ月目（それぞれｎ＝７、７、および６）、１１～１２ヶ月目（それぞれｎ＝７、７、および６）、および３～４年目（それぞれｎ＝７、７、および５）での選別されたＴＣＭ、ＴＴＭ、およびＴＥＭメモリーサブセット、ならびに注入後９～１０ヶ月目（それぞれｎ＝６および５）、１１～１２ヶ月目（それぞれｎ＝３および５）、および３～４年目（それぞれｎ＝７および８）でのＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭおよびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて測定された１０６個の細胞当たりの五量体複製マーカーの頻度中央値。Ｎ／Ａ＝未実施；凍結保存されたＰＢＭＣの制限により、初期時点でＴＳＣＭサブセットの定量化が妨げられた。Ｃ、３～４年目の試料におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞ＨＩＶリザーバーに対するそれぞれのサブセットの寄与率を示すジッターを重ねた箱ひげ図（細胞の利用可能性の制限によりｎ＝８）。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは最大値および最小値まで伸びている。ウィルコクソン順位和検定のＰ値が示される。Ｄ、３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数の関数としての注入後の総ＨＩＶ ＤＮＡを保有するＰＢＭＣの頻度の変化（０日目に対する７２０日目でのｌｏｇ１０値の比率）、３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおける五量体複製の頻度、および３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおける五量体複製の頻度とＴＥＭにおける五量体複製の頻度との比を示す三次元散布図。疎線形多変量モデルを構築して、リザーバー減衰を予測した。最高のリザーバー減衰を予測する多変量回帰モデルは、３つの特徴を含んでいた：３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数（ｚ軸）、３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおけるｌｏｇ１０五量体複製レベル（ｘ軸）、および３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ／ＴＥＭにおける五量体複製比（ｙ軸）。散布図のそれぞれのドットは、ＨＩＶ ＤＮＡの７２０日目／ＢＬ比に比例するドットサイズの参加者に対応し、より大きい減衰はより小さいドットサイズによって象徴される。
【図4A-G】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭを示す表、グラフ、およびプロットは、以前に同定されたＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ細胞とは異なることを示す。Ａ、３～４年目の試料中のＴＥＭおよびＴＣＭと比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて誘導または抑制された遺伝子中で著しく濃縮された選択された経路のヒートマップ（ｎ＝７）。色のグラデーションは、ＴＥＭおよびＴＣＭ（Ｐ＜０．０５）と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて誘導または抑制された遺伝子中で濃縮された経路のＧＳＥＡ正規化された濃縮スコア（－４～＋５の範囲のＮＥＳ）を示す。選択された経路は、いくつかの生物学的機能；細胞周期、細胞代謝、サイトカインシグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達およびアポトーシスにグループ化した。Ｂ、３～４年目のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＳＢ－７２８－Ｔ製品中のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋に固有に存在する、ＤＮＡシーケンシングによって決定されたＺＦＮ媒介性ＣＣＲ５変異の分布（ｎ＝５）。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは１．５＊ＩＱＲの距離まで伸びている。外れ値は、ドットで示される。Ｃ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激に応答して注入後３～４年目にＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットで産生されるＩＦＮ－ｇ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－ａサイトカインの頻度を示す円グラフおよび棒グラフ。応答は、それぞれの細胞サブセットについて平均化した（ｎ＝６）。円グラフは、１、２、または３つの関数をもたらす細胞の割合を示す。円弧は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αに陽性である細胞集団を同定する。棒グラフは、サイトカイン産生の異なる組み合わせの相対頻度を示す。Ｄ、注入後３～４年目のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおける転写因子Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、ＲＯＲｇｔ、およびＧＡＴＡ－３の発現を示すヒストグラム（ｎ＝７）。＊Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン順位和検定。Ｅ、ユークリッド距離を使用し、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭとＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭサブセットとの間のトランスクリプトーム分散を強調する多次元尺度構成法（ＭＤＳ）プロット。一次元は、２つのＴＳＣＭサブセット間のトランスクリプトーム分散の２７％を説明する。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭは赤色で示され、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭは、緑色で示される（ｎ＝７）。Ｆ、ＷＮＴシグナル伝達（Ｒｅａｃｔｏｍｅ）に焦点を当て、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて著しく濃縮される遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって同定された経路のヒートマップ。事前定義された経路の先端を使用する凝集遺伝子セットは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットにおけるこれらの遺伝子の著しい濃縮を明らかにした。スケールはＮＥＳスコアを表し、赤色および青色の四角は、それぞれ正および負の濃縮を示す。列は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭサブセットを表す。Ｇ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセット内で著しく濃縮された最先端の遺伝子を強調する共発現ネットワーク。ＧｅｎｅＭａｎｉａアルゴリズムを使用して、ネットワーク接続および共発現を推測した。
【図5A-H】ウイルス量の制御とのＡＴＩ相関前のＣＣＲ５遺伝子編集ＴＳＣＭを示すプロットを示す。Ａ、２２週目（ＡＴＩの１６週に相当）のウイルス量（ＶＬ）値、および参加者のチャートから得られた過去のＡＲＴ前ウイルス設定点値（研究１１０１コホート１～５からの１５人の参加者のうち１４人について利用可能なデータ）を示すプロット。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。ウィルコクソン順位和検定のＰ値が示される。Ｂ～Ｃ、２２週目～過去のＡＲＴ前ウイルス設定点のＶＬの変化と、ピーク拡大中（注入後１～３週目）のＣＤ４＋ Ｔ細胞数の変化（Ｂ）およびＡＴＩ前（６週目）の１０６個のＰＢＭＣ当たりの「五量体複製」マーカーの頻度（Ｃ）との間のスピアマン順位相関。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。破線は、９５％信頼区間を表す。パネルｄ～ｈに示されている免疫学的およびウイルス学的アッセイは、凍結保存された細胞が分析に利用できるコホート３～５の参加者に対して実施された。ｄ～ｅ、注入後６週間（ＡＴＩ前）（Ｄ）および注入後２２週間（ＡＴＩの終了）（Ｅ）でのＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット（ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＴＭ、およびＴＥＭ）について、ＤＮＡシーケンシングによって決定されたＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度を示すジッターを重ねた箱ひげ図。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは最大値および最小値まで伸びている。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。ｎ＝７；＋Ｐ＜０．０５；ウィルコクソン順位和検定。Ｆ～Ｇ、２２週目～過去のＡＲＴ前ウイルス設定点のＶＬの変化と、ＡＴＩ前（６週目）の（ｆ）ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭおよび（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭとの間のスピアマン順位相関。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。破線は、９５％信頼区間を表す。（ｎ＝８；ＡＴＩを延長したためＶＬ関連分析に含まれなかった参加者０１～０６０について、過去のＡＲＴ前ＶＬ設定点のデータが欠落していた）。Ｈ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数の関数としてのＶＬの変化（ｗ２２～過去の設定点）およびｇａｇペプチドプール刺激後にＩＬ－２を産生するＣＤ８＋ ＴＴＭ細胞の頻度を示す三次元散布図（それぞれの参加者について、最大応答を伴う時点を使用する、Ｔｍａｘ）（ｎ＝８）。多変量線形回帰モデルは、６週目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ数、ならびに注入後のｇａｇペプチドプール刺激後にＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２サイトカインを産生するＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットの頻度を使用して構築した。ＶＬの最良の変化を予測する多変量モデルは、６週目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ数（Ｐ＝０．０５）およびＴｍａｘでＩＬ－２を産生するＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ ＴＴＭ細胞（Ｐ＝０．０２）を含んでいた。
【図6A-I】ＡＴＩ中のＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭのレベルが、ウイルス量の制御と相関し、ＴＥＭＨＩＶリザーバーの再播種を低下させることを示すプロットを示す。Ａ、注入後６週目および２２週目にＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいて検出される、ＳＢ－７２８－Ｔ製品中のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋（ＴＳＣＭ表現型）に固有に存在するＺＦＮ誘導性ＣＣＲ５変異のパーセントを示す箱ひげ図（ｎ＝７）。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは１．５＊ＩＱＲの距離まで伸びている。外れ値は、ドットで示される。Ｂ、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞ダイナミクスのダイナミクスを示す概略図（完全なモデルの詳細および仮定については、材料および方法を参照）。モデルパラメーターは、ＡＴＩ期間が延長された５人の参加者の５つの個々の適合結果の幾何平均をとることによって得られる。箱に列挙されているパラメーターは、１００，０００個のビンを使用してＭＡＴＬＡＢで実施された感度分析テストから得られた細胞集団の大きさと有意な相関（≧±０．５）を表したパラメーターを示す。Ｃ～Ｅ、ＡＴＩ終了時（２２週目）のＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭ細胞数と、ＡＴＩ前（６週目）のＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ（Ｃ）、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ（Ｄ）、ＴＣＭ（Ｅ）細胞数との間のスピアマン順位相関。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。ｎ＝７。Ｆ、ＢＬ、注入後６週目および２２週目でのＴＥＭ細胞内の統合ＨＩＶ ＤＮＡの頻度を表すジッターを重ねた箱ひげ図（ｎ＝７）。箱には、中央値、第１および第３四分位数が示され、ひげは最大値および最小値まで伸びている。すべての参加者について、ドットおよび線が示される。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。ウィルコクソン順位和検定のＰ値が示される。Ｇ～Ｈ、ウイルス血症中（２２週目）のＴＥＭ内のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度と、２２週目（ＡＴＩ後１６週間）～過去のＡＲＴ前ウイルス設定点のウイルス量の変化（Ｇ）および６週目～２２週目の中間ＨＩＶ ＤＮＡを担持するＴＥＭ細胞の頻度の変化（Ｈ）との間のスピアマン順位相関。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。破線は、９５％信頼区間を表す。ｎ＝６；ＡＴＩを延長したためＶＬ関連分析に含まれなかった参加者０１～０６０について、過去のＡＲＴ前ＶＬ設定点のデータが欠落していた。Ｉ、６週目～２２週目の中間ＨＩＶ ＤＮＡを担持するＴＥＭ細胞の頻度の変化と、２２週目（ＡＴＩ後１６週間）でのウイルス量レベルとの間のスピアマンの順位相関。ＡＴＩを延長した参加者は、赤色で示される。破線は、９５％信頼区間を表す。ｎ＝８。
【図7】ベースライン時のＳＢ－７２８－０９０２研究参加者のＨＩＶリザーバーのサイズを示すプロットを示す。ベースライン（ＢＬ）でのＣＤ４＋ Ｔ細胞数と、精製ＣＤ４＋ Ｔ細胞において測定されたＢＬでの統合ＨＩＶ ＤＮＡのレベルとの相関。スピアマンのｒｈｏ（ρ）検定を使用した。破線は、９５％信頼区間を表す。
【図8A-E】ＳＢ－７２８－Ｔの単回注入が、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の持続的増加、ＣＤ４：ＣＤ８比の改善、およびＣＣＲ５遺伝子編集細胞の長期持続につながったことを示す。Ａ、ベースライン（ＢＬ、注入の７日前）、１４日目、３、６、および１２ヶ月目、ならびに２年目および３～４年目の最後のフォローアップを含む長期フォローアップ時点のＣＤ４＋ Ｔ細胞数が示される。平均は、黒色の線で示される。ウィルコクソン符号付き順位検定＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。パネルＡ～Ｃの場合、コホート１（約１Ｅ１０注入細胞）の参加者は、青色の記号で示され、コホート２（約２Ｅ１０注入細胞）は、緑色の記号で示され、コホート３（約３Ｅ１０注入細胞）は、赤色の記号で示される。Ｂ、ＢＬ、１４日目、３、６、１２ヶ月目、２および３～４年目のＣＤ４：ＣＤ８比が示される。平均は、黒色の線で示される。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン符号付き順位検定。Ｃ、材料および方法に記載されているように、フォローアップ中の９人の研究参加者全員について、注入後の五量体複製とマークされたＣＤ４＋ Ｔ細胞の拡大倍率を推定した。灰色の領域は、倍率変化が１未満であるデータ点を表す。Ｄ、注入後の直腸生検からの１０６個の単核細胞当たりの五量体複製（遺伝子編集細胞のマーカー）のジッターを重ねた箱ひげ図。箱ひげ図は、７５パーセンタイル（上端）、中央値（箱内の実線）、および２５パーセンタイル（下端）を示す。ひげは、最小値から最大値まで描画される。Ｅ、五量体複製マーカーがＬＮＭＣで定量化された３人の個人についての注入後の１０６個のＰＢＭＣ（黒丸）およびリンパ節生検からの単核細胞（ＬＮＭＣ、四角）当たりの五量体複製マーカーのプロット。
【図9A-C】ＳＢ－７２８－Ｔ製品の特性を示すプロットを示す。Ａ、製造前の白血球アフェレーシス試料（ＢＬ）および製造後（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）からの精製ＣＤ４＋ Ｔ細胞中の統合ＨＩＶ ＤＮＡのレベル。ウィルコクソン符号付き順位検定のＰ値が示される。生きたＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞をＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ、続いてＣＣＲ７およびＣＤ２７上でゲートして、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋）、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＴＳＣＭ様細胞、ＴＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋）、ＴＴＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ２７＋）、ＴＥＭ（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－ＣＤ２７－）、およびＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７－サブセットを同定した。Ｂ、ＳＢ－７２８－Ｔ製品で観察されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの頻度。線は、平均および標準偏差を表す。Ｃ、多様なＣＣＲ５ ＺＦＮ誘導性変異のＤＮＡシーケンシングによって測定されたＳＢ－７２８－Ｔ製品のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット内のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度。線は、平均および標準偏差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン符号付き順位検定。
【図10A-F】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－サブセット中のＣＤ５８＋ＣＤ９５＋細胞の頻度が、注入後に増加し、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の持続性に寄与することを示すプロットを示す。Ａ～Ｂ、ＢＬ（ｎ＝６）、注入後中期（６～８ヶ月目、ｎ＝５）、後期（９～１１ヶ月目、ｎ＝５）、および長期時点（３～４年目、ｎ＝６）でのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、Ａ）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋（ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ、Ｂ）サブセットにおいてＣＤ５８およびＣＤ９５を発現する細胞の平均頻度を示すヒストグラム。エラーバーは、標準偏差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；マン・ホイットニー検定。Ｃ～Ｄ、３～４年目のＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔサブセット内のＣＤ５８＋ＣＤ９５＋細胞の頻度は、長期時点でのＰＢＭＣにおけるＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞の推定倍率拡大と相関していた（注入されたＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の数（用量）に対する３～４年目のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の数）。Ｅ、ＢＬ分析を実施した６人の対象についての、ＢＬ（注入前３ヶ月まで）、ならびに注入後中期（６ヶ月目）、後期（８～１１ヶ月目）、および長期時点（３～４年目）でのＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋ＣＤ５８＋ＣＤ９５＋（ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＴＳＣＭと呼ばれる）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋ＣＤ５８－ＣＤ９５－（ナイーブと呼ばれる）細胞数の縦断分析。Ｆ、ＢＬ分析を実施した６人の対象についての、ＢＬ（注入前３ヶ月まで）、ならびに注入後中期（６ヶ月目）、後期（８～１１ヶ月目）、および長期時点（４４ヶ月目まで）でのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋ＣＤ５８＋ＣＤ９５＋（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭと呼ばれる）およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２８＋ＣＤ５８－ＣＤ９５－（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５－と呼ばれる）細胞数の縦断分析。
【図11】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、他のメモリーサブセットと比較して、より高いレベルのＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子を有することを示すプロットを示す。多様なＣＣＲ５ ＺＦＮ誘導性変異のＤＮＡシーケンシングによって測定された、注入後２～４年目の選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット内のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度のジッターを重ねた箱ひげ図。線は、平均および標準偏差を表す。箱ひげ図は、７５パーセンタイル（上端）、中央値（箱内の実線）、および２５パーセンタイル（下端）を示す。ひげは、最小値から最大値まで描画される。ウィルコクソン符号付き順位検定のＰ値が示される。
【図12A-B】ＣＣＲ５遺伝子編集Ｔ細胞が、Ｔ細胞のポリクローナルで偏りのない再構成に寄与することを示すプロットを示す。Ａ、注入後７日（ＣＣＲ５遺伝子編集細胞増殖のピーク）（ｎ＝３）および７～９ヶ月（ｎ＝４）での、製造前試料（ＢＬ白血球アフェレーシス試料から精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、ｎ＝４）、ＳＢ－７２８－Ｔ製品（ｎ＝４）、精製ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＴＣＲ多様性を示す棒グラフ。シャノンエントロピー指数を使用して、ＴＣＲクローンの多様性を測定した。ＮＡ＝試料は、この時点で利用可能でなかった。Ｂ、シャノンエントロピー指数を使用した注入後の長期時点（３～４年目）からのサブセットと比較した、ＳＢ－７２８－Ｔ製品からのＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の多様性（ｎ＝８）。線は、平均および標準偏差を表す。ウィルコクソン符号付き順位検定のＰ値が示される。
【図13A-B】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、総ＨＩＶリザーバーのわずかな寄与因子であることを示すグラフを示す。ＳＢ－７２８－Ｔ製品中の選別されたＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋サブセット（ＴＣＭ、ｎ＝９；ＴＴＭ、ｎ＝８；ＴＥＭ、ｎ＝９；およびＣＣＲ７＋ＣＤ２７、ｎ＝９）、ならびにＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔサブセット（総ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ、ｎ＝９；およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋、ｎ＝９）（Ａ）、ならびに注入後３～４年での選別されたＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ４５ＲＯ＋サブセット（（ＴＣＭ、ｎ＝８；ＴＴＭ、ｎ＝７；およびＴＥＭ、ｎ＝８）、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔサブセット（ＣＤ９５＋；ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ｎ＝８；およびＣＤ９５－、ｎ＝８）、ならびにＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－サブセット（ＣＤ９５＋；ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ）、ｎ＝６；およびＣＤ９５－；ナイーブ、ｎ＝７）（Ｂ）における統合ＨＩＶ ＤＮＡ（ｌｏｇ１０コピー／１０６個の細胞）の平均レベルを示すヒストグラム。エラーバーは、標準偏差を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１；ウィルコクソン符号付き順位検定。
【図14A-B】ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、前述のＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭサブセットとは異なる集団を構成していることを示すプロットを示す。Ａ、多次元尺度構成法（ＭＤＳプロット）を使用して、注入後３～４年目のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットのトランスクリプトーム分散を強調した。ユークリッド距離が使用され、ＡＮＯＶＡ（分散分析、Ｆ検定、ｎ＝３３５８転写物、Ｐ≦０．０５）に基づく上位変異型遺伝子の次元低減が表される。一次元は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット間の分散の５０％を説明する。異なるサブセットは異なる記号によって表される。細胞サブセット当たりｎ＝７試料。Ｂ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭとＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ、ＴＣＭ、またはＴＥＭとの間で差次的に発現される遺伝子の数（ＤＥＧ、Ｐ＜０．０５）を表す棒グラフ。
【図15A-B】１１０１研究においてＳＢ－７２８－Ｔ注入後に分析的治療中断（ＡＴＩ）を受けた対象のウイルス量を示すプロットを示す。Ａ、１１０１臨床試験の要約。対象は、注入の２日前に漸増用量のシトキサン（ＣＴＸ）前調整を受けた。対象は、注入後６週間で１６週間の間隔でＡＴＩを受けた。Ｂ、ウイルス量（ＶＬ）は、２２週目までにＡＲＴを再開した９人の対象、およびＡＴＩが延長された６人の対象（ＶＬが１０，０００コピー／ｍＬ未満のままであり、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数が５００細胞／μｌを超える）について示される。赤色の線は、ＡＲＴの再開を表す。
【図16A-B】１１０１研究における注入後（６週目）および治療中断後（２２週目）のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの分布および細胞数を示すプロットを示す。注入後６週間（ＡＴＩ前）および注入後２２週間（ＡＴＩの終了）でのＣＤ４ Ｔ細胞サブセット（ナイーブ、ＣＤ４５ＲＡ＋ ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ＴＣＭ、ＴＴＭおよびＴＥＭ）の頻度（Ａ）および細胞数（Ｂ）が示される（ｎ＝９）。ウィルコクソン符号付き順位検定のＰ値が示される。
【図17】１１０１研究におけるＡＴＩ後のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５遺伝子編集細胞の頻度を示す。ＤＮＡシーケンシングによって決定されたＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度は、少なくとも１２ヶ月目までＡＴＩが延長された参加者について、注入後６週目（ＡＴＩ前）、２２週目、７／８ヶ月目および１２ヶ月目（ＡＴＩ中）のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＡ＋ ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ＴＣＭ、およびＴＥＭ）について示されている。
【発明を実施するための形態】
【0016】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0017】
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションでそれと関連付けられる意味を有する。
【0018】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【0019】
量、時間的持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書で使用される「約」は、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１の変動を包含することを意味し、そのような変動は開示された方法を実施するために適切である。
【0020】
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導性サイトカイン産生、および検出可能なエフェクター機能と関連付けられ得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を起こしているＴ細胞を指す。
【0021】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源または組換え源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに単鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
【0022】
本明細書で使用される「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方を伴う場合がある。熟練者であれば、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として役立つことができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。熟練者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがって、その用語が本明細書で使用される「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が複数の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されないこと、およびこれらのヌクレオチド配列が様々な組み合わせで配置されて所望の免疫応答を誘発することは、容易に明らかである。さらに、熟練者であれば、抗原が「遺伝子」によって全くコード化される必要がないことを理解するであろう。抗原を生成合成することができるか、または生体試料から誘導することができることは、容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または生体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0023】
本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、後でその個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指すことを意味する。
【0024】
「同種異系」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【0025】
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【0026】
本明細書で使用される「有効量」は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。
【0027】
本明細書で使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
【0028】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、別の分子または特徴を認識して結合するが、試料中の他の分子または特徴を実質的に認識または結合しない抗体などの分子を意味する。
【0029】
本明細書で使用される「阻害する」という用語は、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡ、および／またはタンパク質の発現、安定性、機能もしくは活性を測定可能な量だけ低減すること、または完全に防止することを意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子、およびｍＲＮＡの安定性、発現、機能および活性に結合する、部分的もしくは完全に刺激を遮断する、減少させる、防止する、活性化を遅延させる、不活性化する、脱感作する、または下方調節する化合物、例えば、アンタゴニストである。
【0030】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、線状または円状立体配座で、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）で修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合するであろう。
【0031】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【0032】
「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間、または２つの核酸間）の配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基と接触する）必要はない。そのような相互作用は、一般に、１０－６Ｍ－１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強さを指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄと相関している。
【0033】
「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」という用語は交換可能に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約１０～３０（１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）塩基対配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と交換可能に使用することができる。「ｔｒａｃｒメイト配列」という用語はまた、「直接反復」という用語と交換可能に使用することができる。
【0034】
「相補性」とは、従来のワトソン・クリックまたは他の非従来型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての隣接する残基が、第２の核酸配列における同じ数の隣接する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【0035】
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または１つもしくは複数の異なるタンパク質の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、複数のタイプの結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合の活性を有する。
【0036】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、タンパク質、または１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するより大きなタンパク質内のドメインであり、これらは亜鉛イオンの配位により構造が安定化した結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【0037】
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの同族の標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、通常、長さが３３～３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。
【0038】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つ以上のアミノ酸を改変する）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、自然界には存在しないタンパク質であり、その設計／組成は、主に合理的な基準に基づいている。設計の合理的な基準には、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計の情報ならびに結合データを格納するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。
【0039】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、自然界には見られないタンパク質であり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの経験的プロセスから生じる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、同第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、同様にＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【0040】
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向修復機序を介した細胞における二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「ドナー」分子を使用して「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復をテンプレート化し、ドナーから標的への遺伝子情報の転送につながるため、「非交差（ｎｏｎ－ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に知られている。特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような移入は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、ならびに／またはドナーが標的の一部となるであろう遺伝情報および／もしくは関連プロセスを再合成するために使用される「合成依存鎖アニーリング」を伴い得る。そのような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の改変をもたらすことが多い。
【0041】
本開示の方法において、本明細書に記載される１つ以上の標的ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）は、所定の部位で標的配列（例えば、細胞クロマチン）に二本鎖切断を作成し、切断領域のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。二本鎖切断の存在は、ドナー配列の統合を促進することが示されている。ドナー配列は物理的に組み込まれ得るか、あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介して切断を修復するためのテンプレートとして使用され、ドナーにおけるヌクレオチド配列の全部または一部が細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチンの第１の配列を改変することができ、ある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別のヌクレオチド配列による置換（すなわち、情報の意味での配列の置換）を表すと理解することができ、必ずしもあるポリヌクレオチドから別のポリヌクレオチドへの物理的または化学的置換を必要としない。
【0042】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはジンクフィンガーもしくはＴＡＬＥＮタンパク質の追加の対を、細胞内の追加の標的部位の追加の二本鎖切断に使用することができる。
【0043】
細胞クロマチンの関心領域における配列の標的組換えおよび／または置換および／または改変のための方法に関するある特定の実施形態において、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組換えによって改変される。そのような相同組換えは、切断の領域に相同な配列が存在する場合、細胞クロマチンにおける二本鎖切断の存在によって刺激される。
【0044】
本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心領域内のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含み得、それにより、相同組換えを刺激して、関心領域内の同一でない配列を挿入する。したがって、ある特定の実施形態において、関心領域内の配列に相同であるドナー配列の部分は、置換されるゲノム配列に対して約８０～９９％（またはそれらの間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば、１００を超える連続する塩基対のドナー配列とゲノム配列との間で１ヌクレオチドのみが異なる場合、ドナーとゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある特定の場合において、ドナー配列の非相同部分は、関心領域に存在しない配列を含み得、それにより新しい配列が関心領域に導入される。これらの例において、非相同配列は、一般に、関心領域内の配列と相同または同一である、５０～１，０００塩基対（もしくはそれらの間の任意の整数値）または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列に隣接している。他の実施形態において、ドナー配列は、第１の配列に対して非相同であり、非相同組換え機序によってゲノムに挿入される。
【0045】
本明細書に記載される方法のうちのいずれも、関心の遺伝子の発現を中断させるドナー配列の標的化統合による、細胞内の１つ以上の標的配列の部分的または完全な不活性化に使用することができる。部分的または完全に不活化された遺伝子を有する細胞株も提供される。
【0046】
さらに、本明細書に記載される標的化統合の方法を使用して、１つ以上の外因性配列を統合することもできる。外因性核酸配列は、例えば、１つ以上の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコードもしくは非コード配列、同様に１つ以上の制御要素（例えば、プロモーター）を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ分子（例えば、小さなヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生することができる。
【0047】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として発生する可能性がある。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【0048】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なる）と合わせて、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および－切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」という用語は、二量体化する切断ハーフドメインの対を指すために交換可能に使用される。
【0049】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）との義務的なヘテロ二量体を形成するように修飾された切断ハーフドメインである。また、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００８／０１３１９６２号および同第２０１１／０２０１０５５号（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0050】
「配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、線状、円状、または分岐状であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。「ドナー配列」という用語は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２～１０，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間もしくはそれら以上の任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００ヌクレオチド長（またはそれらの間の任意の整数）、より好ましくは約２００～５００ヌクレオチド長であり得る。
【0051】
「相同な非同一配列」は、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、その配列が第２の配列の配列同一性と同一ではない第１の配列を指す。例えば、変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異体遺伝子の配列と相同であり、非同一である。ある特定の実施形態において、２つの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機序を利用して、それらの間の相同組換えを可能にするのに十分である。２つの相同な非同一配列は、任意の長さであり得、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドほど小さいか（例えば、標的相同組換えによるゲノム点変異の修正のため）、または１０キロベース以上の大きさであり得る（例えば、染色体の所定の異所性部位に遺伝子を挿入するため）。相同な非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０～１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を使用することができる。
【0052】
核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技法は、当技術分野で知られている。典型的には、そのような技法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。この方法でゲノム配列を決定し、比較することもできる。一般に、同一性とは、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、２つの配列の同一性パーセントは、２つの整列した配列間の完全一致の数を短い配列の長さで割って１００を掛けたものである。核酸配列のおよそのアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発されたスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって正規化され得る。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいてＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって提供される。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための好適なプログラムは、当技術分野で一般に知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメーターを使用して使用することができる：遺伝子コード＝標準、フィルター＝なし、ストランド＝両方、カットオフ＝６０、期待＝１０、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、説明＝５０配列、並べ替え＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ、データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、インターネットで見つけることができる。本明細書に記載される配列に関して、所望の配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％～１００％およびそれらの間の任意の整数値である。典型的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０～７５％、好ましくは８０～８２％、より好ましくは８５～９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【0053】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定した二本鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定され得る。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定されるように、配列が分子の定義された長さにわたって少なくとも約７０％～７５％、好ましくは８０％～８２％、より好ましくは８５％～９０％、さらにより好ましくは９２％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合、互いに実質的に相同である。本明細書で使用される場合、実質的に相同であるとは、特定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について定義されているように、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業者に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。
【0054】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配列は、標的分子への完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当技術分野で周知であるハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）を使用して評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで変動する条件を使用して、様々な程度の選択性を使用して行うことができる。低ストリンジェンシーの条件が用いられる場合、非特異的結合の欠如は、部分的な程度の配列同一性さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができ、それにより、非特異的結合事象がない場合、二次プローブは、標的にハイブリダイズしないであろう。
【0055】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを構成する核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質で構成されている。真核生物の細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のうちのそれぞれ２つを含む八量体と関連付けられたＤＮＡのおよそ１５０塩基対を含み、（生物によって可変長の）リンカーＤＮＡは、ヌクレオソームコアの間に伸びている。ヒストンＨ１の分子は、一般にリンカーＤＮＡと関連付けられている。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は、原核生物および真核生物の両方のすべてのタイプの細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【0056】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、多くの場合、細胞のゲノムを構成するすべての染色体の集合である核型を特徴とする。細胞のゲノムは、１つ以上の染色体を含み得る。
【0057】
「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。
【0058】
「アクセス可能な領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る細胞クロマチン内の部位である。特定の理論に拘束されることを望まないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされていない領域であると考えられている。アクセス可能な領域の明確な構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する感度によって検出され得る。
【0059】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。
【0060】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝的、生化学的、または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞内の正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体の筋細胞に関して外因性の分子である。同様に、熱ショックによって誘導された分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性の分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能しているバージョン、または正常に機能している内因性分子の機能不全のバージョンを含み得る。
【0061】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアル化学プロセスによって生成されるような小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類などの巨大分子、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体であり得る。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得、線状、分岐状、または円状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二本鎖を形成することができるもの、同様に三本鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼが含まれるが、これらに限定されない。したがって、この用語は、細胞に導入された外因性配列である「導入遺伝子」または「関心の遺伝子」を含む。
【0062】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞に通常は存在しない染色体を含み得る。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、パーティクルボンバードメント、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入を含むが、これらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じタイプの分子であり得るが、細胞が由来するものとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、もともとマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入され得る。外因性分子を植物細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介性形質転換、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、パーティクルボンバードメント（例えば、「遺伝子銃」を使用）、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入を含むが、これらに限定されない。
【0063】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階で特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、葉緑体もしくは他の細胞小器官、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加の内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
【0064】
本明細書で使用される場合、「外因性核酸の産生物」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物、例えば、転写産物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）の両方を含む。
【0065】
「融合」分子は、２つ以上のサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であり得るか、または異なる化学タイプの分子であり得る。第１のタイプの融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインとの間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれるが、これらに限定されない。第２のタイプの融合分子の例には、三重らせん形成核酸とポリペプチドとの間の融合、および副溝結合剤と核酸との間の融合が含まれるが、これらに限定されない。「融合ポリペプチド」は、異種ポリペプチドに融合または結合したポリペプチドまたはその一部（例えば、１つ以上のドメイン）を含むポリペプチドである。融合ポリペプチドの例には、Ｃａｓタンパク質の一部を免疫グロブリン配列と組み合わせる免疫アドヘシン、およびＣａｓタンパク質を含み得るエピトープタグ付きポリペプチド、例えば、または「タグポリペプチド」に融合されたその一部が含まれる。タグポリペプチドは、抗体を作製することができるエピトープを提供するのに十分な残基を有しているが、Ｃａｓのヌクレアーゼ活性を干渉しないように十分に短い。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基、および通常は約６～６０個のアミノ酸残基を有する。
【0066】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達から生じ得、ここでポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞内のタンパク質の発現に関与している可能性がある。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の場所に提示されている。
【0067】
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記参照）、ならびにそのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。「操作された遺伝子」とは、野生型遺伝子と非同一であるように何らかの方法で改変された遺伝子を指す。改変は、標的欠失、挿入およびトランケーションの形態であり得る。操作された遺伝子は、２つの異種遺伝子からのコード配列を含み得るか、または合成遺伝子配列を含むことができる。操作された遺伝子はまた、タンパク質配列においてサイレントであるコード配列の変化を含み得る（例えば、コドン最適化）。操作された遺伝子はまた、調節配列が改変された遺伝子を含み得る。
【0068】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡもしくは任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【0069】
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、改変、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含まない細胞と比較した場合の遺伝子発現の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。
【0070】
「関心領域」は、例えば、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子または遺伝子内もしくは遺伝子に隣接する非コード配列などの細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的のためであり得る。関心領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノムに存在し得る。関心領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。関心領域は、単一のヌクレオチド対もしくは最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、またはヌクレオチド対の任意の整数値まで小さくなり得る。
【0071】
「真核生物」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【0072】
「機能的連結」および「機能的に連結された」（または「動作可能に連結された」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して交換可能に使用され、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが、他の構成要素のうちの少なくとも１つに発揮される機能を媒介する可能性を考慮に入れるように配置される。例示として、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーターなどの転写調節配列は、コード配列に機能的に連結される。転写調節配列は、一般に、シスにおいてコード配列と機能的に連結されているが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していなくても、コード配列に機能的に連結されている転写調節配列である。
【0073】
融合ポリペプチドに関して、「機能的に連結された」という用語は、それぞれの構成要素が、他の構成要素と連結して、そのように連結されていない場合と同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えば、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、機能的連結状態にある。Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができる場合、Ｃａｓ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、機能的連結状態にある。
【0074】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持しているタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、より少ない、もしくは同じ数の残基を有することができ、かつ／または１つ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を決定するための方法は周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって分析することができる。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的および生化学的の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５－２４６、米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【0075】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、関心の遺伝子の発現を指示することができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに統合ベクターが含まれる。
【0076】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、好ましくはルーチンアッセイでは必ずしもそうではないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強された緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに増強された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が含まれるが、これらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つ以上のコピーが含まれる。「発現タグ」には、関心の遺伝子の発現をモニターするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結され得るレポーターをコードする配列が含まれる。
【0077】
「対象」および「患者」という用語は交換可能に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物を指す。したがって、本明細書で使用される「対象」または「患者」という用語は、本発明のまたは幹細胞を投与することができる任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象には、例えば、神経毒素を含む、１つ以上の化学的毒素に曝露された対象が含まれる。
【0078】
本明細書で使用される「治療的」という用語は、治療および／または予防を意味する。治療効果は、病状の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【0079】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められている組織、システム、または対象の生物学的または医学的応答を誘発するであろう対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されたときに、治療されている障害もしくは疾患の徴候もしくは症状のうちの１つ以上の発症を予防するか、またはある程度緩和するのに十分な量の化合物を含む。治療有効量は、治療される対象の化合物、疾患およびその重症度、ならびに年齢、体重などによって異なるであろう。本明細書で使用される用語としての疾患を「治療する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。
【0080】
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。細胞は、主要な対象細胞およびその子孫を含む。
【0081】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関連付けられるポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0082】
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の番号、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0083】
本明細書に記載される実施形態は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞）、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する遺伝子修飾および／または改変されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の長寿命濃縮集団、ならびにＨＩＶ感染した対象、特に抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている対象の潜伏性ＨＩＶ感染の治療におけるそれらの使用に関する。サブセットＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、長寿命多能性幹細胞の表現型および分子属性を有することがわかった。他の既知の幹細胞集団と同様に、このサブセット集団は、代謝プロファイルが低く（脂肪酸代謝および酸化的リン酸化の上方調節、ならびに細胞循環経路の下方調節）、自己複製能力を保持し、エフェクター細胞に分化することができる。このサブセットは、主にＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの中間共発現（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ）を特徴とする。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞はまた、ＣＤ９５（Ｆａｓ）ＣＤ１２７（ＩＬ７Ｒ）およびＣＤ２７を発現することができる。低用量のサイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５の添加は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８細胞の濃縮集団の形成につながる可能性があるが、高用量のサイトカインＩＬ－７およびＩＬ－１５は、細胞のエフェクター分化につながる可能性がある。
【0084】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、それらが機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾することができる。ＨＩＶ感染した対象へのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集された自家ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の投与は、対象におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞数の持続的な増加、Ｔ細胞の恒常性の回復、およびＨＩＶリザーバーのサイズのかなりの低下をもたらし得る。
【0085】
対象への移入または投与時に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する濃縮集団ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、対象において長期持続または生存する能力を有する。持続性は、ＨＩＶ感染症などの疾患の治療における治療的Ｔ細胞移植の有効性と相関し得る。治療Ｔ細胞の持続性が高いほど、治療レジメンが効果的である可能性が高くなる。したがって、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する長寿命の自己再生および多能性ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、産生コストを低減し、エフェクター分化を促進し、対象における潜伏ＨＩＶ感染症の治療効率を増加させることができる。さらに、現在利用可能なＨＩＶ治療製品におけるこれらの細胞の頻度は、バイオマーカーとして使用することができ、介入の成功を予測することができる。
【0086】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する濃縮集団ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、対象への投与後、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有しないＴ細胞よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８または７２ヶ月間長くインビボで持続することができる。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する濃縮集団ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞はまた、投与後の対象において生着する能力が増加し得る。具体的には、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する濃縮集団ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、馴化されていないレシピエントにおいて生着する能力が増加し得る。
【0087】
「生着」という用語は、移植された細胞がレシピエントに定植し、移植の直後に生き残る能力を指す。したがって、生着は、移植後の短期間に評価される。例えば、生着は、実験、臨床試験、または治療プロトコルの最初のインビボ評価で、例えば、移植された細胞またはそれらの子孫がレシピエントにおいて検出され得る最も早い時点で検出される移植された細胞から派生した細胞の数を指し得る。一実施形態において、移植は、移植後０～１２、０～２４、０～４８または０～７２時間で評価される。別の実施形態において、生着は、移植後約１、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８、６０または７２時間で評価される。好ましい実施形態において、生着は、移植後約１２時間で評価される。
【0088】
図１は、それらが機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾することができる、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を生成する方法を示すフロー図を示す。この方法では、ステップ１０で、対象の生体試料からＴ細胞のナイーブ集団が単離される。生体試料は、対象からの試料を含む任意のＴ細胞を含むことができる。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。好ましくは、対象は、ヒトである。
【0089】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、および腫瘍を含む、様々な供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、治療されるＨＩＶを有する対象から、すなわち、治療される対象からの自家Ｔ細胞から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、フィコール分離などの熟練者に知られている任意の数の技法を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス製品には通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球が含まれている。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、その後のプロセシングステップのために適切な緩衝液または培地に細胞を置くことができる。一実施形態において、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することができる。代替実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠くか、または多くもしくはすべての二価カチオンを欠く可能性がある。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａを含まない、Ｍｇを含まないＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁することができる。
【0090】
別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ勾配を介した遠心分離によって末梢血から単離することができる。あるいは、Ｔ細胞は、臍帯から単離することができる。いずれにせよ、Ｔ細胞の特定の亜集団は、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。
【0091】
いくつかの実施形態において、単離されたＴ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を含むことができる。ＣＤ４ Ｔ細胞および／またはＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞）は、正または負の選択によって生体試料から単離することができる。負の選択は、負に選択された細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを使用して達成することができる。１つの方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルには通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体が含まれている。
【0092】
正または負の選択による所望の細胞集団の単離の場合、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は変動し得る。ある特定の実施形態において、細胞およびビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態において、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態において、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億細胞／ｍｌ超が使用される。さらなる実施形態において、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、または５０００万細胞／ｍｌの細胞の濃度が使用される。さらに別の実施形態において、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００万、または１億細胞／ｍｌからの細胞の濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用することは、細胞収量の増加、細胞活性化、および細胞増殖をもたらし得る。
【0093】
生体試料からのＴ細胞の単離に続いて、ステップ２０で、単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、当技術分野で知られている任意の好適な方法によって活性化および／または増殖され得る。本発明の実施形態において、Ｔ細胞は活性化され、Ｔ細胞の数は、１つ以上の非特異的Ｔ細胞刺激（例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８）ならびに／または１つ以上のサイトカイン、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）組換えタンパク質、共刺激分子、レクチン、イオノフォア、合成分子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工ＡＰＣまたはフィーダーの存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は活性化され得、Ｔ細胞の数は、Ｔ細胞を１つ以上の非特異的Ｔ細胞刺激および／または１つ以上のサイトカインと物理的に接触させることによって拡大される。任意の１つ以上の非特異的Ｔ細胞刺激を、本発明の方法で使用することができる。非特異的Ｔ細胞刺激の例には、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が含まれる。いくつかの実施形態において、非特異的Ｔ細胞刺激は、ビーズに結合された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体であり得る。本発明の方法では、任意の１つ以上のサイトカインを使用することができる。例示的なサイトカインには、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１５が含まれる。
【0094】
単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化および／または増殖に続いて、ステップ３０で、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、例えばフローサイトメトリーを使用して、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの中間共発現（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ）を特徴とするＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団に分離または選別され得る。この方法は、任意の好適な方法で細胞を選別することを含み得る。いくつかの実施形態において、選別は、フローサイトメトリーを使用して実行される。フローサイトメトリーは、当技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して実行することができる。フローサイトメトリーは、任意の好適な抗体および染色を用いることができる。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーは、多色フローサイトメトリーである。
【0095】
本明細書に記載されるプロセスによって産生されたＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞の濃縮集団は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔを有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞を大部分の細胞型として含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプロセスは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔを有する少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％または少なくとも約５０％のＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞を含む細胞培養物および／または細胞集団を産生する。好ましい実施形態において、細胞培養物または細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。
【0096】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する長寿命ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞はまた、他の細胞表面マーカーの発現を特徴とし得る。例えば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、またはＣＤ２７のうちの少なくとも１つを発現することができる。他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、さらに４－１ＢＢを中間的に発現し、場合によりＯＸ４０を発現することができる。
【0097】
他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＩＬ１７ＲＡ、ＣＤ５、ＩＬ２ＲＧ、ＩＧＦ２Ｒ、ＳＬＣ３８Ａ１、ＩＬ７Ｒ、ＳＬＣ４４Ａ２、ＳＬＣ２Ａ３、ＣＤ９６、ＣＤ４４、ＣＤ６、ＣＣＲ４、ＩＬ４Ｒ、またはＳＬＣ１２Ａ７のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ以上をさらに発現することができる。
【0098】
いくつかの実施形態において、分離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋表現型を有することができる。他の実施形態において、分離されたＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔＣＤ９５＋ＣＤ１２７＋ＣＤ２７＋ＩＬ７Ｒ＋ＣＤ４４＋ＳＣＬ３８Ａ１＋ＩＬ２ＲＧ＋ＣＤ６＋ＣＤ５＋表現型を有することができる。
【0099】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞を分離または選別する前および／または後に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する単離されたＣＤ４－ＣＤ８ Ｔ細胞は、単離されたＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を少量のＩＬ－７および／またはＩＬ－１５を含む細胞培地中で培養することによって濃縮され得る。低ＩＬ－７／ＩＬ－１５条件（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ未満のＩＬ７／ＩＬ１５の濃度）で培養された活性化ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、高ＩＬ－７／ＩＬ－１５条件（例えば、１０ｎｇ／ｍｌを超えるＩＬ－７／ＩＬ－１５の濃度）中で培養された活性化ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞の濃縮集団を促進または形成できることが見出された。
【0100】
いくつかの実施形態において、培養培地は、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌ未満、約９５ｎｇ／ｍｌ未満、約９０ｎｇ／ｍｌ未満、約８５ｎｇ／ｍｌ未満、約８０ｎｇ／ｍｌ未満、約７５ｎｇ／ｍｌ未満、約７０ｎｇ／ｍｌ未満、約６５ｎｇ／ｍｌ未満、約６０ｎｇ／ｍｌ未満、約５５ｎｇ／ｍｌ未満、約５０ｎｇ／ｍｌ未満、約４５ｎｇ／ｍｌ未満、約４０ｎｇ／ｍｌ未満、約３５ｎｇ／ｍｌ未満、約３０ｎｇ／ｍｌ未満、約２５ｎｇ／ｍｌ未満、約２０ｎｇ／ｍｌ未満、約１５ｎｇ／ｍｌ未満、約１０ｎｇ／ｍｌ未満、約５ｎｇ／ｍｌ未満、約４ｎｇ／ｍｌ未満、約３ｎｇ／ｍｌ未満、約２ｎｇ／ｍｌ未満、または約１ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５を含むことができる。
【0101】
本明細書に記載される低ＩＬ－７／ＩＬ－１５濃度培養培地を使用して、細胞集団または細胞培養物を、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型含有量を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞において、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約２倍～約１０００倍濃縮することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約５～約５００倍濃縮され得る。他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約１０～約２００倍濃縮され得る。さらに他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約２０～約１００倍濃縮され得る。さらに他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約４０～約８０倍濃縮され得る。ある特定の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／Ｃ８ Ｔ細胞は、未処理の細胞集団または細胞培養物と比較して少なくとも約２～約２０倍濃縮され得る。
【0102】
いくつかの実施形態において、一旦分離または選別されると、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を維持するために、ＴＧＦβ／ＩＬ－１βを含む培養培地中で培養することができる。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８細胞のＴＧＦβおよび／またはＩＬ－１βの添加は、対象への投与前のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型の維持につながり得る。
【0103】
いくつかの実施形態において、方法は、それらが機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように、活性化および／または分離の前または後にＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を遺伝子修飾することをさらに含み得る。ＨＩＶがヒトＴ細胞に感染すると、Ｔ細胞受容体ＣＤ４と２つの補助受容体であるケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４のうちの１つとの会合に依存して、細胞に侵入する。特にホモ接合状態で、ＨＩＶ感染に耐性があると思われるヒト集団の天然ＣＣＲ５変異型（「ＣＣＲ５－Δ３２」）が同定された。したがって、ＨＩＶがＴ細胞に感染し、最終的にＨＩＶ感染患者におけるＴ細胞死および免疫機能の低下につながるのを防ぐために、補助受容体の一方または両方を破壊して、細胞をウイルス耐性にすることができる（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）。現在、ＨＩＶ患者のＴ細胞がエクスビボでＣＣＲ５遺伝子座で編集されてＣＣＲ５遺伝子をノックアウトする臨床試験が進行中である。次いで、これらの細胞は、ＨＩＶを治療するために患者に再導入される。
【0104】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団を単離されたＴ細胞から分離する前に、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞が機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾され得る。他の実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団は、単離されたＴ細胞から分離した後に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の集団が機能的ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ ＨＩＶ補助受容体を欠くように遺伝子修飾され得る。
【0105】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の遺伝子修飾またはゲノム編集は、形質導入、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって実施され得る。形質導入は、レンチウイルス、γ－、α－レトロウイルスもしくはアデノウイルス、または核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴミル、ＯＤＮ）、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰ／Ｒ）、自己複製ＲＮＡウイルス（例えば、ウマ脳症ウイルス）または統合欠損レンチウイルスベクターによるエレクトロポレーションまたはトランスフェクションで実施することができる。
【0106】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、操作されたヌクレアーゼを用いたゲノム編集によって遺伝子修飾され得る。ゲノム編集は、配列特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム配列を挿入、欠失、または修飾するプロセスである。現在、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、ゲノム編集のいくつかの方法が存在する。これらのヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、その後、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）または相同性依存修復（ＨＤＲ）のいずれかによって修復することができ、これにより、二本鎖切断を取り囲むＤＮＡと相同性のあるテンプレートを使用した遺伝子の挿入または修飾が可能になる。従来、ゲノム編集は、細胞をＲＮＡまたはＤＮＡでトランスフェクトまたは形質導入することによって実施され、次いでタンパク質を産生し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの場合はゲノム編集に必要なガイドＲＮＡを産生する。
【0107】
例えば、の二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの部位特異的ヌクレアーゼによって作成することができる。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６－５１、米国特許第８，５８６，５２６号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号（それらの開示は、すべての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【0108】
別のヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとして知られている細菌および古細菌に見られるいわゆる獲得免疫システムの使用を伴う。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細菌の４０％および古細菌の９０％に見られ、それらのシステムの複雑さが異なる。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復）は、外来ＤＮＡの短いセグメントが短い反復パリンドローム配列の間に統合されている生物のゲノム内の領域である。これらの遺伝子座は転写され、ＲＮＡ転写物（「ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ」）は短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには３つのタイプがあり、これらはすべて「Ｃａｓ」タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連）として知られるこれらのＲＮＡおよびタンパク質を組み込んでいる。タイプＩおよびＩＩＩはどちらも、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡをプロセシングするＣａｓエンドヌクレアーゼを有し、ｃｒＲＮＡに完全にプロセシングされると、ｃｒＲＮＡに相補的な核酸を切断することができるマルチＣａｓタンパク質複合体を組み立てる。
【0109】
タイプＩＩシステムでは、ｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの反復配列に相補的なトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるプロセシングをトリガーするという異なる機序を使用して産生される。次いで、Ｃａｓ９は成熟したｃｒＲＮＡに相補的な標的ＤＮＡを切断することができるが、Ｃａｓ９による切断は、ｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合、およびＰＡＭ配列（プロトスペーサー隣接モチーフ）と称されるｃｒＲＮＡ内の短いモチーフの存在の両方に依存する。さらに、ｔｒａｃｒＲＮＡは、３’末端でｃｒＲＮＡと塩基対合するため、存在する必要があり、この会合がＣａｓ９活性をトリガーする。
【0110】
Ｃａｓ９タンパク質には少なくとも２つのヌクレアーゼドメインがあり、１つのヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似しており、もう１つはＲｕｖエンドヌクレアーゼドメインに類似している。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する役割を果たしていると思われるが、Ｒｕｖドメインは、非相補的な鎖を切断する。
【0111】
ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の要件は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「シングルガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）の使用によって回避することができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６およびＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３を参照）。Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅでは、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体がＣａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に形成されると、操作されたｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合またはｓｇＲＮＡがＣａｓ９をガイドして、標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質、およびＰＡＭ配列を含む操作されたｓｇＲＮＡを含むこのシステムは、ＲＮＡガイドゲノム編集に使用されており（Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ ｉｂｉｄを参照）、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様の編集効率でインビボでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用である（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１（３）：２２７を参照）。
【0112】
特定のヌクレアーゼを操作して、ペプチド融合阻害剤をＨＩＶ受容体に挿入し、Ｔ細胞のＨＩＶ感染を防ぐこともでき（共同所有の米国特許公開第２０１２／００９３７８７号を参照）、そのようなペプチド融合阻害剤の例は、Ｃ３４またはフゼオンである。同様に、ＨＩＶは、操作されたヌクレアーゼを使用して、ウイルスと戦うために細胞内のセーフハーバー遺伝子座に抗ＨＩＶ導入遺伝子を挿入することによって治療することができる。そのようなＨＩＶ遺伝子の例は、ＨＩＶポリタンパク質を抑制するジンクフィンガー転写因子をコードする配列、ＨＩＶ受容体の発現を抑制するジンクフィンガー転写因子をコードする配列、ＣＣＲ５リボザイム、ＨＩＶポリタンパク質に標的されたｓｉＲＮＡ配列、Ｔｒｉｍ５α制限因子をコードする配列、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ制限因子コードする配列、ＲｅｖＭ１０タンパク質をコードする配列、Ｃ４６をコードする配列、他の抗ＨＩＶ遺伝子、自殺カセットおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。したがって、本発明の方法および組成物を使用して、単一のガイドＲＮＡが好適な抗ＨＩＶ導入遺伝子の組み込みのためにＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムでＨＩＶを治療または予防することができる。
【0113】
いくつかの実施形態において、ゲノム編集は、選択されたゲノム遺伝子座への標的挿入のための部位特異的ヌクレアーゼによる切断を含み得る（例えば、共同所有の米国特許第７，８８８，１２１号を参照）。標的遺伝子に特異的なヌクレアーゼは、導入遺伝子構築物が相同性指向修復（ＨＤＲ）または非相同末端接合（ＮＨＥＪ）駆動プロセス中の末端捕捉のいずれかによって挿入されるように利用することができる。標的遺伝子座には、ヒト細胞のＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴおよびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞のＲｏｓａ２６などの「セーフハーバー」遺伝子座が含まれる（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号、同第７，９７２，８５４号、同第７，９１４，７９６号、同第７，９５１，９２５号、同第８，１１０，３７９号、同第８，４０９，８６１号、同第８，５８６，５２６号、米国特許公開第２００３／０２３２４１０号、同第２００５／０２０８４８９号、同第２００５／００２６１５７号、同第２００６／００６３２３１号、同第２００８／０１５９９９６号、同第２０１０／００２１８２６４号、同第２０１２／００１７２９０号、同第２０１１／０２６５１９８号、同第２０１３／０１３７１０４号、同第２０１３／０１２２５９１号、同第２０１３／０１７７９８３号、および同第２０１３／０１７７９６０号を参照）。ヌクレアーゼ媒介性統合は、遺伝子サイレンシングまたは近くのがん遺伝子の活性化のリスクを最小限に抑えて正確な導入遺伝子のポジショニングを可能にするため、導入遺伝子のランダムな統合に依存する従来の統合アプローチと比較して、導入遺伝子の発現の改善、安全性および発現の耐久性の向上の見通しを提供する。
【0114】
ゲノム編集には、上記の挿入方法に加えて、遺伝子のノックアウトを含めることもできる。ドナー核酸がない場合、切断されたゲノムを持つ細胞は、エラーが発生しやすいＮＨＥＪ経路を利用して、切断を修復する。このプロセスは、多くの場合、修復プロセス中にヌクレオチドを付加または欠失し（「インデル」）、これは、標的部位にミスセンス変異またはナンセンス変異の導入につながり得る。
【0115】
例えば、ＣＣＲ５特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼは、Ｔ細胞に非機能的ＣＣＲ５受容体を作成し、したがってＨＩＶ感染を防ぐために第Ｉ／ＩＩ相試験で使用されている（米国特許第７，９５１，９２５号を参照）。次いで、これらの細胞は、ＨＩＶを治療するために患者に再導入される。したがって、本発明の方法および組成物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムでＣＣＲ５対立遺伝子を破壊することができ、単一ガイドＲＮＡは、特にエクソン領域（ｃｈｒ３：４６４１４３９４－４６４１５４５２）またはその近くで、ヒトＣＣＲ５遺伝子（ｃｈｒ３：４６４１１６３３－４６４１７６９７）を標的とする配列を含む。
【0116】
ノックアウトのためにＣＣＲ５遺伝子を標的とするための１つの特に好ましい領域は、δ－３２変異領域の近くの領域（ｃｈｒ３：４６４１４９２３－４６４１５０２０またはその近く）である。別の特に好ましい領域は、ＣＣＲ５タンパク質の第２の細胞外ループの一部をコードするｃｈｒ３：４６４１４５２２－４６４１４６４３の周りである。ＡＴＧタンパク質翻訳開始部位またはその近くの領域（ｃｈｒ３：４６４１４３４７－４６４１４４６６またはその近く）もまた、抗ＨＩＶ療法の標的化された統合によるＣＣＲ５のＮ末端へのＣ３４ペプチドの融合などのゲノム修飾に特に好ましい。
【0117】
同様の研究がＣＸＣＲ４依存性ＨＩＶの動物モデルで進行中であり、ＣＸＣＲ４が選択的に破壊されるか、またはＣＣＲ５と並行して破壊されてＴ細胞のＨＩＶ感染を防ぐ（米国特許公開第２０１０／０２９１０４８号を参照）。したがって、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムでＣＸＣＲ４対立遺伝子を破壊することができ、単一ガイドＲＮＡは、特にエクソン２領域（ｃｈｒ２：１３６８７２４３９－１３６８７３４８２）および小さいエクソン１（ｃｈｒ２：１３６８７５６１６－１３６８７５６３０）を取り囲む領域またはその近くで、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子（ｃｈｒ２：１３６８７１９１９－１３６８７５７２５）を標的とする配列を含む。ノックアウトのためにＣＸＣＲ４遺伝子を標的とするための１つの好ましい領域は、ＣＣＲ５遺伝子のδ－３２変異領域に対する類似体であるｃｈｒ２：１３６８７２８６３－１３６８７２９８２またはその近くの領域である。エクソン１のＡＴＧタンパク質翻訳開始部位の近くのｃｈｒ２：１３６８７５５４０－１３６８７５６８７またはその近くの領域が特に好ましく、エクソン２のスプライシング部位の近くのｃｈｒ２：１３６８７３３８９－１３６８７３５５８またはその近くの領域は、抗ＨＩＶ療法のための標的化された統合によるＣＸＣＲ４のＮ末端へのＣ３４ペプチドの融合などの遺伝子修飾に特に好ましい。したがって、ｓｇＲＮＡは、これらの好ましい標的領域のうちの１つ以上の配列を含むがこれらに限定されない、ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４遺伝子座の任意の場所の配列に結合するように設計することができる。
【0118】
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、エクスビボで、任意の好適な手段によってＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞に送達され得る。
【0119】
本明細書に記載されるヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，６０７，８８２号、同第６，６８９，５５８号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号に記載されており、これらすべての開示は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【0120】
本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのうちの１つ以上をコードする配列を含むベクターを使用して送達され得る。プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなど、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない任意のベクターシステムを使用することができる。米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，８２４，９７８号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、および同第７，１６３，８２４号、ならびに米国特許公開第２０１４／０３３５０６３号（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。さらに、これらのベクターのうちのいずれかが、治療に必要な配列のうちの１つ以上を含み得ることは明らかであろう。したがって、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクターまたは異なるベクター上に運ばれ得る。複数のベクターが使用される場合、それぞれのベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列を含み得る。
【0121】
従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入法を使用して、ヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー構築物を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子療法手順のレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８－８１３（１９９２）、Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７（１９９３）、Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６（１９９５）、Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ（ｅｄｓ．）（１９９５）、およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６（１９９４）を参照されたい。
【0122】
核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用したソノポレーションを核酸の送達に使用することもできる。
【0123】
追加の例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが含まれる（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質には、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。
【0124】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照）。
【0125】
追加の送達方法には、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸をパッケージングする使用が含まれる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対して特異性を有し、もう一方のアームがＥＤＶに対して特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでエンドサイトーシスによってＥＤＶを細胞に運ぶ。一旦細胞に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（７）：６４３を参照）。
【0126】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、対象に（インビボで）直接投与することができるか、またはそれらを使用してインビトロで細胞を処理することができ、修飾された細胞を対象に（エクスビボで）投与する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達のための従来のウイルスベースのシステムには、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入法で可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
【0127】
レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込んで、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって改変することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、通常は高いウイルス力価を生み出すレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を持つシス作用性の長い末端反復配列で構成されている。最小のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、その後、治療用遺伝子を標的細胞に統合して、恒久的な導入遺伝子の発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。
【0128】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含む多くの刊行物に記載されている。
【0129】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが現在、臨床試験での遺伝子移入に利用可能であり、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。
【0130】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８－３０５（１９９５）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７－１０２（１９９５）、Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３－１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５－４８０（１９９５））。ＭＦＧ－Ｓパッケージベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察されている。（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０－２０（１９９７）、Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：１１１－２（１９９７）。
【0131】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥のある非病原性のパルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達システムである。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５塩基対（ｂｐ）の逆位末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの統合に起因する効率的な遺伝子移入および安定した導入遺伝子送達は、このベクターシステムの重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにそれらのすべての変異型を含む他のＡＡＶ血清型もまた、本発明に従って使用することができる。
【0132】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は高力価で産生され、多くの異なる細胞型に容易に感染する。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠陥ベクターは、トランスで削除された遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中で増殖する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見られるものなどの非分裂の分化細胞を含む、複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな環境収容力を有している。臨床試験でのＡｄベクターの使用例には、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法が含まれていた（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５－１０（１９９６）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３－１０８９（１９９８）、Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５－１８（１９９５）、Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７－６１３（１９９７）、Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５０７－５１３（１９９８）、Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－１０８９（１９９８）が含まれる。
【0133】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするｐｓｉ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子療法で使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは通常、パッケージングおよびその後の宿主への組み込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠落しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法で使用されるＡＡＶベクターは、通常、ＡＡＶゲノムからの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有し、これはパッケージングおよび宿主ゲノムへの統合に必要である。ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされており、これは他のＡＡＶ遺伝子、つまりｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドが含まれているが、ＩＴＲ配列を欠いている。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染している。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列がないため、ヘルパープラスミドは大量にパッケージングされていない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感度が高い熱処理によって低減することができる。
【0134】
遺伝子編集ベクターは、ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞および／またはＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞にエクスビボで送達することができ、続いて通常はベクターを取り込んだ細胞の選択後に、患者に細胞を再移植する。エクスビボ投与用の遺伝子編集ベクターを含む製剤は、液体または乳化液体中の懸濁液を含むことができる。有効成分は、多くの場合、薬学的に許容され、有効成分と適合性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが含まれる。さらに、製剤は、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤または薬学的組成物の有効性を増強する他の試薬を含み得る。
【0135】
本明細書に記載される方法によって産生されたＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する選択された、濃縮集団ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を、対象におけるＨＩＶ感染を治療するための、薬学的組成物などの組成物中に含めることができる。組成物には、薬学的に許容される担体を含めることもできる。薬学的組成物に関して、担体は、細胞の投与に従来から使用されているもののうちのいずれかであり得る。そのような薬学的に許容される担体は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性を有しないものであることが好ましい。
【0136】
組成物は、対象に投与するための単位剤形で調製することができる。投与の量およびタイミングは、所望の結果を達成するために治療を行う臨床医の裁量に委ねられる。組成物は、全身投与（静脈内投与など）または局所投与（腫瘍内投与など）用に製剤化することができる。一実施例では、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を含む組成物は、例えば、対象におけるＨＩＶの治療に使用することができる。
【0137】
投与のための組成物は、水性担体などの薬学的に許容される担体で提供されるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団の溶液を含むことができる。様々な水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくない物質が含まれていない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、補助剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含み得る。細胞の数またはこれらの製剤中のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃度は、広く異なり得、選択された特定の投与形態および対象のニーズに従って主に流体体積、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。遺伝子療法、免疫療法および／または細胞療法で使用するためのそのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかになるであろう。
【0138】
一実施例では、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する輸液バッグに添加し、場合によっては体重の０．５～１５ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与することができる。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を、静脈内プッシュまたはボーラスではなく、遅い注入によって投与することができる。一実施例において、より高い負荷用量が投与され、その後、維持用量がより低いレベルで投与される。
【0139】
投与される用量、例えば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、例えば、妥当な時間枠にわたって対象または動物において治療的または予防的応答をもたらすのに十分であるべきである。例えば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、投与時から約６ヶ月、１年、２年、３年、４年以上の期間にわたってＨＩＶを治療するのに十分であるべきである。ある特定の実施形態において、期間はさらに長くなる可能性がある。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、例えば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の効力および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
【0140】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数はまた、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定されるであろう。典型的には、主治医は、年齢、体重、一般的な健康状態、食事、性別、投与経路、および治療されている状態の重症度などの様々な要因を考慮して、それぞれ個々の患者を治療するために用いるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する本発明のＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数を決定するであろう。例として、本発明を制限することを意図せず、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の数は、注入当たり約１０×１０４～約１０×１０１１細胞、注入当たり約１０×１０５細胞～約１０×１０９細胞、または注入当たり１０×１０７～約１０×１０９細胞であり得る。
【0141】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、それを必要とする対象におけるＨＩＶ感染を治療または予防する方法で使用できることが企図される。この点において、対象におけるＨＩＶ感染を治療または予防する方法は、本明細書に記載されるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有し得るＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の濃縮集団を、対象におけるＨＩＶを治療または予防するのに有効な量で対象に投与することを含み得る。
【0142】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶを有する対象への組成物または濃縮Ｔ細胞集団の投与は、対象における絶対ＣＤ４細胞数の持続的増加、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫の回復、およびＨＩＶリザーバーの実質的な減衰のうちの少なくとも１つを促進することができる。いくつかの実施形態において、対象は、抗レトロウイルス療法を受けており、かつ／または受け続けている。
【0143】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有する、投与されるＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、宿主または対象に対して同種異系または自家である細胞であり得る。好ましくは、細胞は、対象に対して自家である。
【0144】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子と組み合わせて投与することができる。潜伏性ＨＩＶ発現のいくつかの活性化因子を、本明細書に記載される組成物および方法で使用することができる。例えば、潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびタンパク質キナーゼＣアゴニストが含まれ得るが、これらに限定されない。
【0145】
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＩＶ－１プロモーターの転写活性化を誘導することが実証されている。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼの活性を低減する任意の分子であり得る。これには、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ分子（アンチセンスを含む）、ＲＮＡ分子（ｉＲＮＡ剤およびアンチセンスを含む）、ならびに小分子が含まれる。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、例えば、ＨＤＡＣ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１に対して向けられたｓｉ／ｓｈＲＮＡである。そのようなＨＤＡＣ阻害剤の非限定的な例を以下に示す。ＨＤＡＣ阻害剤には、本明細書に記載されるＨＤＡＣ阻害剤の任意の塩、結晶構造、非晶質構造、水和物、誘導体、代謝物、立体異性体、構造異性体、およびプロドラッグが含まれることが理解される。
【0146】
いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸（例えば、酪酸ナトリウム、イソ吉草酸、吉草酸、４－フェニル酪酸（４－ＰＢＡ）、フェニル酪酸（ＰＢ）、プロピオン酸、ブチルアミド、イソブチルアミド、フェニル酢酸、３－ブロモプロピオネート、トリブチリン、バルプロ酸（Ｖｐａ）、バルプロ酸塩、バルプロ酸半ナトリウムおよび酪酸ピバロイルオキシメチル（ＰＩＶＡＮＥＸ））を含み得る。
【0147】
他の実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒドロキサム酸誘導体（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、ボリノスタット）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびトリコスタチンＣなどのトリコスタチン類似体、ｍ－カルボキシシンナミン酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）、ピロキサミド、サリチルビスヒドロキサム酸、スベロイルビスヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）、アゼラ酸ビスヒドロキサム酸（ＡＢＨＡ）アゼラ酸－１－ヒドロキサム酸－９－アニリド（ＡＡＨＡ）、６－（３－クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸（３Ｃｌ－ＵＣＨＡ）、オキサムフラチン［（２Ｅ）－５－［３－［（フェニルスルホニル）アミノ］フェニル］－ペント－２－エン－４－イノヒドロキサム酸］、Ａ－１６１９０６ Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ、ＰＸＤ－１０１（Ｐｒｏｌｉｆｉｘ）、ＬＡＱ－８２４、ＣＨＡＰ、ＭＷ２７９６、ＭＷ２９９６；または米国特許第５，３６９，１０８号、同第５，９３２，６１６号、同第５，７００，８１１号、同第６，０８７，３６７号、および同第６，５１１，９９０号に開示されているヒドロキサム酸のうちのいずれかを含み得る。ある特定の実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＳＡＨＡである。
【0148】
さらに他の実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、ベンズアミド誘導体（例えば、ＣＩ－９９４；ＭＳ－２７５［Ｎ－（２－アミノフェニル）－４－［Ｎ－（ピリジン－３－イルメトキシカルボニル）アミノメチル］ベンズアミド］およびＭＳ－２７５の３’－アミノ誘導体を含み得る。
【0149】
さらに他の実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、環状ペプチド（例えば、トラポキシンＡ（ＴＰＸ）－環状テトラペプチド（シクロ－（Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－フェニルアラニル－Ｄ－ピペコリニル－Ｌ－２－アミノ－８－オキソ－９，１０－エポキシデカノイル））、ＦＲ９０１２２８（ＦＫ２２８、デプシペプチド）、ＦＲ２２５４９７環状テトラペプチド、アピシジン環状テトラペプチド［シクロ（Ｎ－Ｏ－メチル－Ｌ－トリプトファニル－Ｌ－イソロイシニル－Ｄ－ピペコリニル－Ｌ－２－アミノ－８－オキソデカノイル）］、アピシジンＩａ、アピシジンＩｂ、アピシジンＩｃ、アピシジンＩＩａ、およびアピシジンＩＩｂ、ＣＨＡＰ、ＨＣ毒素環状テトラペプチド、ＷＦ２７０８２環状テトラペプチド、およびクラミドシンを含み得る。
【0150】
追加のＨＤＡＣ阻害剤は、サマプリンおよびデプデシンなどの天然産物、トリフルオロメチルケトンなどの求電子性ケトン誘導体、Ｎ－メチル－α－ケトアミドなどのα－ケトアミド、ＬＳＤ１ポリペプチド、ＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）、誘導性転写因子ＮＦ－ＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）、および抗ＩκＢαまたはＩκＢε剤を含み得る。
【0151】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、単独でまたは本明細書に記載される潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子と組み合わせて、ＨＩＶに潜伏感染している対象、例えば、ＨＩＶに潜伏感染しているヒトに投与することができる。対象は、抗レトロウイルス療法（例えば、ＨＡＡＲＴ）による治療にもかかわらず、持続性ＨＩＶリザーバーを有する対象を含むことができる。したがって、いくつかの実施形態において、治療有効量は、潜伏性ＨＩＶ感染した対象における潜伏性ＨＩＶリザーバーを著しく減少させるためのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の量である。
【0152】
他の実施形態において、治療有効量のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞、ならびに任意選択で潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子を、別の治療薬と組み合わせて対象に投与することができ、これはＨＡＡＲＴまたは免疫毒素に使用される成分など、ＨＩＶ感染症の治療に有用である。
【0153】
上述のように、本明細書に記載されるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔを、ＨＩＶ感染の治療に有用な１つ以上の追加の治療剤と組み合わせてもよい。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ抗ウイルス薬、免疫調節剤、抗感染薬またはワクチンとの組み合わせの範囲は、以下のリストに限定されず、原則として、ＡＩＤＳの治療に有用な任意の薬学的組成物との任意の組み合わせを含むことが理解されるであろう。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ抗ウイルス薬および他の薬剤は、通常、これらの組み合わせで、当技術分野で報告されているようなそれらの従来の投薬量範囲およびレジメンで用いられるであろう。
【0154】
抗ウイルス薬の例は（限定されないが）、抗ウイルス剤製造業者（商品名および／または薬物名 場所）適応症（活性）を含む：アバカビルＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、ＧＷ １５９２（ＺＩＡＧＥＮ）（ｎＲＴＩ）；１５９２Ｕ８９アバカビル＋ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；ラミブジン＋（ＴＲＩＺＩＶＩＲ）ジドブジンアセマンナンＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｌａｂｓ ＡＲＣ（Ｉｒｖｉｎｇ，Ｔｅｘ．）ＡＣＨ １２６４４３ Ａｃｈｉｌｌｉｏｎ Ｐｈａｒｍ．ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）；アシクロビル Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、ＡＺＴ（ＡＺＴと組み合わせて）ＡＤ－４３９ Ｔａｎｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ ＡＤ－５１９ Ｔａｎｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣアデフォビルジピボキシルＧｉｌｅａｄ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ ＧＳ８４０（ＲＴＩ）；ＡＬ－７２１ Ｅｔｈｉｇｅｎ ＡＲＣ、ＰＧＬ、ＨＩＶ陽性（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＡＩＤＳαインターフェロンＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ カポジ肉腫、ＨＩＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒと組み合わせて）ＡＭＤ３１００ ＡｎｏｒＭｅｄ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＣＸＣＲ４アンタゴニスト）；アンプレナビル ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、１４１ Ｗ９４（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ）ＡＲＣ（ＰＩ）；ＧＷ １４１ ＶＸ４７８（Ｖｅｒｔｅｘ）アンサマイシン Ａｄｒｉａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＲＣ ＬＭ４２７（Ｄｕｂｌｉｎ，Ｏｈｉｏ）Ｅｒｂａｍｏｎｔ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．）抗体（中和する）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＡＩＤＳ、ＡＲＣ ｐＨ 不安定なα異常 Ｃｏｎｃｅｐｔｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｍｄ．）ＡＲ１７７ Ａｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ アタザナビル（ＢＭＳ ２３２６３２）Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＺＲＩＶＡＤＡ）（ＰＩ）；β－フルオロ－ｄｄＡ Ｎａｔ‘ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＡＩＤＳ関連疾患 ＢＭＳ－２３２６２３ Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＣＧＰ－７３５４７）Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＲＣ（ＰＩ）；ＢＭＳ－２３４４７５ Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ／ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＣＧＰ－６１７５５）Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＲＣ（ＰＩ）；カプラビリン Ｐｆｉｚｅｒ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＡＧ－１５４９、Ｓ－１１５３）ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；ＣＩ－１０１２ Ｗａｒｎｅｒ－Ｌａｍｂｅｒｔ ＨＩＶ－１感染症 ジドフォビル Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＣＭＶ網膜炎、ヘルペス、パピローマウイルス硫酸カードラン ＡＪＩ Ｐｈａｒｍａ ＵＳＡ ＨＩＶ感染症 サイトメガロウイルス免疫 ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ ＣＭＶ 網膜炎グロビンｃｙｔｏｖｅｎｅ Ｓｙｎｔｅｘ 視力を脅かすＣＭＶガンシクロビル末梢ＣＭＶ網膜炎デラビルジンＰｈａｒｍａｃｉａ－Ｕｐｊｏｈｎ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ）ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；硫酸デキストラン Ｕｅｎｏ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．ＡＩＤＳ、ＡＲＣ，ＨＩＶ Ｌｔｄ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）陽性無症候性ｄｄＣ Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ザルシタビン、（ＨＩＶＩＤ）（ｎＲＴＩ）；ジデオキシシチジンｄｄｌ Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ；ジデオキシイノシン（ＶＩＤＥＸ）（ＡＺＴ／ｄ４Ｔとの組み合わせ）（ｎＲＴＩ）ＤＰＣ ６８１＆ＤＰＣ ６８４ ＤｕＰｏｎｔ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）ＤＰＣ ９６１＆ＤＰＣ ０８３ ＤｕＰｏｎｔ ＨＩＶ感染症 ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎｎＲＴＲＩ）；エムビリンＴｒｉａｎｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＣＯＡＣＴＩＮＯＮ）（非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）；ＥＬ１０ Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐ，ＰＬＣ ＨＩＶ感染症（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，Ｇａ．）エファビレンツ ＤｕＰｏｎｔ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＤＭＰ ２６６）（ＳＵＳＴＩＶＡ）ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；Ｍｅｒｃｋ（ＳＴＯＣＲＩＮ）ファムシクロビル Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ 帯状疱疹、単純ヘルペスエムトリシタビン Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ ＦＴＣ（ＣＯＶＩＲＡＣＩＬ）（ｎＲＴＩ）；Ｅｍｏｒｙ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙエムビリンＴｒｉａｎｇｌｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＣＯＡＣＴＩＮＯＮ）（非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）；ＨＢＹ０９７ Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；ヒペリシンＶＩＭＲｘ Ｐｈａｒｍ．ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ組換えヒト；Ｔｒｉｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＩＤＳ、カポジ肉腫、インターフェロンβ（Ａｌｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆ．）；ＡＲＣインターフェロンα－ｎ３ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＲＣ、ＡＩＤＳインジナビル；Ｍｅｒｃｋ（ＣＲＩＸＩＶＡＮ）ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、無症候性ＨＩＶ陽性（またはＡＺＴ／ｄｄＩ／ｄｄＣと組み合わせて）（ＰＩ）；ＩＳＩＳ ２９２２ ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＣＭＶ網膜炎 ＪＥ２１４７／ＡＧ１７７６；Ａｇｏｕｒｏｎ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）；ＫＮＩ－２７２ Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＨＩＶ関連疾患ラミブジン；３ＴＣ Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＥＰＩＶＩＲ）ＡＲＣ；またはＡＺＴとともに（ｎＲＴＩ）；ロブカビル Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ＣＭＶ感染症；ロピナビル（ＡＢＴ－３７８）Ａｂｂｏｔｔ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）；ロピナビル＋リトナビル Ａｂｂｏｔｔ（ＫＡＬＥＴＲＡ）ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＡＢＴ－３７８／ｒ）（ＰＩ）；モゼナビル ＡＶＩＤ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎ．Ｊ．）ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＤＭＰ－４５０）（ＰＩ）；ネルフィナビル Ａｇｏｕｒｏｎ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＶＩＲＡＣＥＰＴ）ＡＲＣ（ＰＩ）；ネビラピン Ｂｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、Ｉｎｇｌｅｈｅｉｍ ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；（ＶＩＲＡＭＵＮＥ）ノバプレン Ｎｏｖａｆｅｒｏｎ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．ＨＩＶ阻害剤（Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏ）；ペンタフサイド Ｔｒｉｍｅｒｉｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ Ｔ－２０（融合阻害剤）；ペプチドＴ Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ ＡＩＤＳオクタペプチド（Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）配列ＰＲＯ ５４２ Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（付着阻害剤）；ＰＲＯ １４０ Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＣＣＲ５補助受容体阻害剤）；三ナトリウム Ａｓｔｒａ Ｐｈａｒｍ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ感染症、ホスホノホルメートＩｎｃ 他のＣＭＶ感染症；ＰＮＵ－１４０６９０ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）；プロブコール Ｖｙｒｅｘ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ；ＲＢＣ－ＣＤ４ Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｔｅｘ．）ＡＲＣ；リトナビル Ａｂｂｏｔｔ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＡＢＴ－５３８）（ＲＩＴＯＮＡＶＩＲ）ＡＲＣ（ＰＩ）；サキナビル Ｈｏｆｆｍａｎｎ－ＬａＲｏｃｈｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、（ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ）ＡＲＣ（ＰＩ）；スタブジンｄ４Ｔ Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣジデヒドロデオキシ－（ＺＥＲＩＴ．）（ｎＲＴＩ）；チミジンＴ－１２４９ Ｔｒｉｍｅｒｉｓ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（融合阻害剤）；ＴＡＫ－７７９ Ｔａｋｅｄａ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（注射可能なＣＣＲ５受容体アンタゴニスト）；テノホビル Ｇｉｌｅａｄ（ＶＩＲＥＡＤ）ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎＲＴＩ）；チプラナビル（ＰＮＵ－１４０６９０）Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）；ＴＭＣ－１２０＆ＴＭＣ－１２５ Ｔｉｂｏｔｅｃ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎｎＲＴＩ）；ＴＭＣ－１２６ Ｔｉｂｏｔｅｃ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ＰＩ）；バラシクロビル ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ 性器ＨＳＶ＆ＣＭＶ感染症ビラゾール Ｖｉｒａｔｅｋ／ＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ無症候性ＨＩＶ陽性、リバビリン Ｍｅｓａ，Ｃａｌｉｆ．）ＬＡＳ、ＡＲＣ；ジドブジン；ＡＺＴ ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、（ＲＥＴＲＯＶＩＲ）カポジ肉腫、他の療法と組み合わせて（ｎＲＴＩ）；［ＰＩ＝プロテアーゼ阻害剤 ｎｎＲＴＩ＝非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤 ＮＲＴＩ＝ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤］。
【0155】
追加の治療薬は、個々に、順次に、またはＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／もしくはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞と組み合わせて使用することができる。対象への投与は、同じもしくは異なる投与経路によって、または同じ薬学的製剤で一緒に行うことができる。
【0156】
この実施形態によれば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型および潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞は、任意のＨＡＡＲＴレジメンまたはその構成要素と同時投与することができる。ＨＡＡＲＴを使用した現在の標準治療は、通常、少なくとも３つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤の組み合わせであり、プロテアーゼ阻害剤、あるいは非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤が含まれることがよくある。ＣＤ４＋細胞数が少ない、または血漿ＲＮＡレベルが高い対象は、より積極的なＨＡＡＲＴを必要とする場合がある。ＣＤ４＋細胞数が比較的正常で、長期間にわたって血漿ＨＩＶ ＲＮＡのレベルが低いか測定できない（すなわち、遅いまたは進行していない）対象の場合、あまり積極的でないＨＡＡＲＴを必要とする場合がある。最初の抗レトロウイルスレジメンで治療される抗レトロウイルスナイーブな対象には、抗レトロウイルス薬の異なる組み合わせ（またはカクテル）を使用することができる。
【0157】
したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞、および任意選択で、潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシドＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤の「カクテル」とともに対象に同時投与することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞ならびにＨＤＡＣ阻害剤は、２つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ジドブジン（ＡＺＴ）およびラミブジン（３ＴＣ））、ならびに１つのプロテアーゼ阻害剤（例えば、インジナビル（ＭＫ－６３９））のカクテルと同時投与することができる。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞、ならびに任意選択でＨＤＡＣ阻害剤などの潜伏性ＨＩＶ発現の活性化因子を、１つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、スタブジン（ｄ４Ｔ））、１つの非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ネビラピン（ＢＩ－ＲＧ－５８７））、および１つのプロテアーゼ阻害剤（例えば、ネルフィナビル（ＡＧ－１３４３）のカクテルを対象に同時投与することもできる。あるいは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞、ならびに任意選択でＨＤＡＣ阻害剤を、１つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ジドブジン（ＡＺＴ））、および２つのプロテアーゼ阻害剤（例えば、ネルフィナビル（ＡＧ－１３４３）およびサキナビル（Ｒｏ－３１－８９５９））のカクテルを対象に同時投与することができる。
【0158】
本発明の文脈における同時投与は、改善された臨床転帰を達成するための協調的治療の過程での複数の治療薬の投与を意味すると定義される。そのような同時投与はまた、同一の広がりを有する可能性があり、すなわち、重複する期間中に発生し得る。
【0159】
追加の実施形態において、免疫毒素は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＣＤ４５ＲＯｉｎｔ表現型を有するＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４遺伝子編集ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞を対象に同時投与することができる。免疫毒素の例は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質またはその一部などの細胞の外部に発現されるＨＩＶタンパク質を標的とする免疫毒素である。「免疫毒素」という用語は、抗ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質抗体などの抗体への毒素の共有結合または非共有結合を指す。毒素は、抗体に直接連結され得るか、例えばリンカー分子を介して間接的に連結され得る。毒素は、リシン－Ａおよびアブリン－Ａからなる群から選択することができる。
【0160】
潜伏性ＨＩＶ発現の活性化（潜伏性ＨＩＶ発現の再活性化とも称される）は、潜伏感染した細胞の、産生的に感染した細胞への変換をもたらす。この移行は、活性ウイルス感染の任意の特徴、例えば、感染性粒子の産生、逆転写酵素活性、分泌抗原、細胞表面抗原、可溶性抗原、ＨＩＶ ＲＮＡおよびＨＩＶ ＤＮＡなどによって測定することができる。本明細書に記載される方法は、任意選択で、潜伏性ＨＩＶ発現の活性化を決定または検出するステップを含み得る。一実施形態において、そのような方法は、ｍＲＮＡ、例えば、ＨＩＶ ｍＲＮＡを決定または検出することを含む。Ｔａｔ ｍＲＮＡ、ＮＦ－κＢ ｍＲＮＡ、ＮＦ－ＡＴ ｍＲＮＡ、およびポリペプチドをコードする他のｍＲＮＡなどの他のｍＲＮＡもまた、ハイブリダイゼーションおよび増幅ベースのアッセイを含むがこれらに限定されない、周知の方法を使用して決定することができる。
【0161】
別の実施形態において、増幅ベースのアッセイを使用して、ＨＩＶ遺伝子の発現レベルを測定する。一実施形態において、潜伏性ＨＩＶ発現の活性化は、ＨＩＶポリペプチドの発現レベルを決定することによって検出することができる。ＨＩＶポリペプチドの発現レベルは、本明細書でさらに説明されるか、または当業者によって知られているように、アフィニティーキャプチャー、質量分析、ＨＩＶタンパク質（ｇｐ１２０および逆転写酵素など）を対象とした従来のイムノアッセイ、ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティング、またはＨＰＬＣを含むがこれらに限定されないいくつかの方法によって決定することができる。
【0162】
この目的のために用いることができる検出パラダイムには、光学的方法、電気化学的方法（電圧測定およびアンペロメトリー技法）、原子間力顕微鏡法、ならびに高周波法、例えば、多極共鳴分光法が含まれる。顕微鏡法に加えて、共焦点および非共焦点の両方の光学的方法の実例は、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出である（例えば、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、共鳴鏡法）、グレーティングカプラー導波路法または干渉法）。
【0163】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶベースのベクター構築物および本明細書に記載されるＰＣＲ産物のグローバルシーケンシングおよび４５４パイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ）を実施して、自家ウイルス集団の産生および純度を確認することができる。４５４は、試料中のおよその遺伝的多様性を得るための、シンプルで効率的かつ費用効果の高い手段である。例示的な実施形態において、ＤＮＡベクターおよび血漿ＲＮＡは、バーコード化されたプライマーで増幅され、次いで、４５４ ＪＲを使用してシーケンシングされ、アンプリコン／試料当たり平均約２０００リードを得る。
【0164】
本発明は、以下の実験例を参照することによりさらに詳細に説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、特に明記されない限り、限定することを意図しない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
【実施例】
【0165】
この実施例では、ＨＩＶ感染した成人がＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋Ｔ細胞の単回注入を受けた２つの独立した臨床試験からの免疫再構築およびウイルス学的転帰を示している。最初の研究（ＳＢ－７２８－０９０２臨床試験）において、この介入により、長期の効果的なＡＲＴにもかかわらず、以前にＣＤ４＋ Ｔ細胞数を正規化できなかった個人の群においてＣＤ４＋Ｔ細胞数が増加し、グローバルＴ細胞ホメオスタシスが回復することがわかった。重要なことに、参加者の大半で総ＨＩＶリザーバーのサイズの著しい長期減衰を観察し、９人のうち４人において、１００万個の細胞当たり１ｌｏｇ１０コピー超のＨＩＶ ＤＮＡが減少した。これらの結果は、ＨＩＶ複製適格リザーバーを含まないＨＩＶ ＤＮＡの測定値を使用して生成されたが、ＨＩＶリザーバーの非常に著しい観察された減少は、長期ＡＲＴ中および潜伏感染再活性化剤を使用した最近の臨床試験で報告された非常に安定したレベルとは明確に対照的である。これらの転帰は、非感染ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ由来細胞による短命ＨＩＶ感染細胞の連続置換によるものであると思われた。第２の研究（ＳＢ－７２８－１１０１臨床試験）では、これらのＣＣＲ５遺伝子編集細胞の単回注入により、この新規ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットが生成され、そのような細胞の頻度が高くなることが、ＡＲＴ中断後のＨＩＶ複製の制御が改善されたことと関連付けられることを確認した。これらの観察は、メモリーＣＤ４＋幹細胞のＣＣＲ５遺伝子編集により、これらの細胞がウイルスの存在下で他のメモリーサブセットに増殖および分化し、それらの子孫への感染から保護することを可能にするモデルを支持する。
【0166】
材料および方法
ＳＢ－７２８－０９０２臨床試験は、ＡＲＴ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ＃ＮＣＴ０１０４４６５４）で治療された慢性ＨＩＶ感染者を対象とした、第１相の非対照、非盲検、非ランダム化研究である。この研究は、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって後援され、２００９年１２月～２０１４年４月の間に米国の２つのセンターで行われた。この研究の主な目的は、漸増用量の、ＺＦＮによってＣＣＲ５遺伝子において編集された自家ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞（ＳＢ－７２８－Ｔ細胞）の安全性および忍容性を評価することであった。二次的な目的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の長期持続性、腸粘膜へのホーミング、およびＨＩＶウイルス持続性（ＨＩＶ ＲＮＡおよびプロウイルスＤＮＡ）への影響の評価が含まれていた。合計９人の参加者を３つの漸増用量コホートに登録した（それぞれのコホートに３人の参加者）。すべての参加者を、最初の４週間は毎週、その後は１年間毎月追跡し、その後３年間の安全性試験に登録した。参加者１－０１は、１２ヶ月目～３１ヶ月目に治療の中断を受けた。
ＳＢ－７２８－０９０２臨床試験は、ＡＲＴ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ＃ＮＣＴ０１０４４６５４）で治療された慢性ＨＩＶ感染者を対象とした、第１相の非対照、非盲検、非ランダム化研究である。この研究は、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって後援され、２００９年１２月～２０１４年４月の間に米国の２つのセンターで行われた。この研究の主な目的は、漸増用量の、ＺＦＮによってＣＣＲ５遺伝子において編集された自家ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞（ＳＢ－７２８－Ｔ細胞）の安全性および忍容性を評価することであった。二次的な目的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の長期持続性、腸粘膜へのホーミング、およびＨＩＶウイルス持続性（ＨＩＶ ＲＮＡおよびプロウイルスＤＮＡ）への影響の評価が含まれていた。合計９人の参加者を３つの漸増用量コホートに登録した（それぞれのコホートに３人の参加者）。すべての参加者を、最初の４週間は毎週、その後は１年間毎月追跡し、その後３年間の安全性試験に登録した。参加者１－０１は、１２ヶ月目～３１ヶ月目に治療の中断を受けた。
【0167】
ＳＢ－７２８－１１０１臨床試験は、ＡＲＴ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ＃ＮＣＴ０１５４３１５２）で治療された慢性ＨＩＶ感染者を対象とした、第１相の非対照、非盲検、非ランダム化研究である。この研究は、Ｓａｎｇａｍｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって後援され、２０１２年３月～２０１７年１月の間に米国の１２のセンターで行われた。この研究の主な目的は、ＳＢ－７２８－Ｔ細胞の単回用量の投与後の、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を促進するための漸増用量のシクロホスファミド（ＣＴＸ）前処理の安全性および忍容性を評価することであった。参加者は、ＳＢ－７２８－Ｔ細胞の注入の前日に、０．１（コホート１、ｎ＝３）、０．５（コホート２、ｎ＝６）、１．０（コホート３、ｎ＝３）、１．５（コホート５、ｎ＝３）および２．０ｇ／ｍ２（コホート４、ｎ＝３）の用量でＣＴＸを受けた。その後、参加者は、約１００億～４００億個のＳＢ－７２８－Ｔ細胞を受けた。すべての参加者は、最初の４週間は毎週、１４週目までは隔月、２２週目までは毎月、その後１２ヶ月目までは２ヶ月ごとに追跡した。ＡＲＴは、ＳＢ－７２８－Ｔ注入の６週間後に１６週間中止された（図１７Ａ）。二次的な目的には、ＡＲＴ中断後の血漿ＨＩＶ－１ ＲＮＡレベルに対するＳＢ－７２８－Ｔ細胞の影響の評価が含まれていた。治療の中断中に、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００細胞／μＬ未満に低下した参加者、および／または３回の連続した毎週の測定でＨＩＶ－ＲＮＡが１００，０００コピー／ｍＬ超に増加した参加者でＡＲＴが再開された。研究から離脱した１人の参加者を除いて、すべての参加者が１年間の研究を完了し、３年間の長期安全性研究に登録された。１人の参加者（０３－００３）は、ＡＲＴを中断しなかった。
【0168】
最終的な臨床プロトコル、修正、および同意文書は、ＮＩＨ組換えＤＮＡ諮問委員会、ならびにそれぞれの研究センターの施設内審査委員会および施設内バイオセーフティ委員会（必要に応じて）によって審査および承認された。すべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。
【0169】
登録基準
ＳＢ－７２８－０９０２試験
適格な参加者は１８歳以上であり、ＥＬＩＳＡによって文書化されているようにＨＩＶに感染していた。参加者は、無ウイルス血症（検出不可能なＨＩＶ ＲＮＡ）であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が２００～５００細胞／μＬである安定したＡＲＴを受け、十分な静脈アクセスがあり、白血球アフェレーシスに対する禁忌はなかった。重要な除外基準には、ＣＣＲ５ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的領域でのＳＮＰ、現在または以前のＡＩＤＳ診断、マラビロクまたは免疫抑制剤による治療の実施、およびＢ型肝炎またはＣ型肝炎の同時感染が含まれていた。
ＳＢ－７２８－０９０２試験
適格な参加者は１８歳以上であり、ＥＬＩＳＡによって文書化されているようにＨＩＶに感染していた。参加者は、無ウイルス血症（検出不可能なＨＩＶ ＲＮＡ）であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が２００～５００細胞／μＬである安定したＡＲＴを受け、十分な静脈アクセスがあり、白血球アフェレーシスに対する禁忌はなかった。重要な除外基準には、ＣＣＲ５ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的領域でのＳＮＰ、現在または以前のＡＩＤＳ診断、マラビロクまたは免疫抑制剤による治療の実施、およびＢ型肝炎またはＣ型肝炎の同時感染が含まれていた。
【0170】
ＳＢ－７２８－１１０１試験
適格な参加者は１８歳以上であり、ＥＬＩＳＡによって文書化されているようにＨＩＶに感染していた。参加者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００／μＬ超の安定したＡＲＴに対して無ウイルス血症であり、Ｒ５向性ＨＩＶに感染しており、治療の中断中に現在のＡＲＴを進んで中止した。重要な除外基準には、４０を超えるアデノウイルス中和抗体、ＣＣＲ５ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的領域でのＳＮＰ、現在または以前のＡＩＤＳ診断、マラビロクまたは免疫抑制剤による治療の実施、およびＢ型肝炎またはＣ型肝炎の同時感染が含まれていた。
適格な参加者は１８歳以上であり、ＥＬＩＳＡによって文書化されているようにＨＩＶに感染していた。参加者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が５００／μＬ超の安定したＡＲＴに対して無ウイルス血症であり、Ｒ５向性ＨＩＶに感染しており、治療の中断中に現在のＡＲＴを進んで中止した。重要な除外基準には、４０を超えるアデノウイルス中和抗体、ＣＣＲ５ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的領域でのＳＮＰ、現在または以前のＡＩＤＳ診断、マラビロクまたは免疫抑制剤による治療の実施、およびＢ型肝炎またはＣ型肝炎の同時感染が含まれていた。
【0171】
細胞の製造
簡潔に説明すると、参加者は１０Ｌの白血球アフェレーシスを受けて、自家ＣＤ４＋Ｔ細胞を収集、濃縮、修飾および増殖した。ＳＢ－７２８－Ｔは、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（ＳＢＳ８１９６ｚおよびＳＢＳ８２６７）をコードする複製欠損組換えＡｄ５／３５ウイルスベクターであるＳＢ－７２８でエクスビボで形質導入された自家ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞を指し、遺伝子編集細胞および未編集細胞の混合物を含む。ＣＣＲ５特異的ＺＦＮの発現は、細胞のＤＮＡに二本鎖切断を誘導し、細胞機構によって修復され、形質導入された細胞の約２５％でランダムな配列の挿入または欠失（インデル）につながる。これらのインデルは、ＣＣＲ５コード配列を破壊し、フレームシフト変異およびタンパク質発現の終了につがる。
簡潔に説明すると、参加者は１０Ｌの白血球アフェレーシスを受けて、自家ＣＤ４＋Ｔ細胞を収集、濃縮、修飾および増殖した。ＳＢ－７２８－Ｔは、ＣＣＲ５特異的ＺＦＮ（ＳＢＳ８１９６ｚおよびＳＢＳ８２６７）をコードする複製欠損組換えＡｄ５／３５ウイルスベクターであるＳＢ－７２８でエクスビボで形質導入された自家ＣＤ４＋濃縮Ｔ細胞を指し、遺伝子編集細胞および未編集細胞の混合物を含む。ＣＣＲ５特異的ＺＦＮの発現は、細胞のＤＮＡに二本鎖切断を誘導し、細胞機構によって修復され、形質導入された細胞の約２５％でランダムな配列の挿入または欠失（インデル）につながる。これらのインデルは、ＣＣＲ５コード配列を破壊し、フレームシフト変異およびタンパク質発現の終了につがる。
【0172】
凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料
ＳＢ－７２８－０９０２
異なる時点での凍結保存された試料の利用可能性は、参加者間で異なり、その結果、時点を、注入後初期（１４～２８日）、中期（４～７ヶ月または９～１０ヶ月）、後期（１１～１２ヶ月）、および長期（２～３または３～４年）の時点にグループ化した。ベースライン試料には、最初の白血球アフェレーシス（注入の２～３ヶ月前）および注入の１～２週間前の少量の採血からの凍結保存されたＰＢＭＣが含まれていた。参加者１－０１、１－０２、および１－０３からのＰＢＭＣは、注入後６ヶ月または８ヶ月まで凍結保存されなかった。ほとんどの参加者は、選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５シーケンシングおよび統合ＨＩＶ ＤＮＡ定量化などの大量の細胞を必要とするアッセイを可能にするために、大量の採血（ｎ＝９、２～３年目）および／または白血球アフェレーシス（ｎ＝７、３～４年目）を長期フォローアップ期間中に行うことに同意した。ＩＣＳアッセイおよびＣＤ９５フローサイトメトリー染色を含む、ある特定のアッセイでは、６人の参加者のみのベースライン試料が依然として利用可能であった。製造試料（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）もすべての参加者に利用可能であった。
ＳＢ－７２８－０９０２
異なる時点での凍結保存された試料の利用可能性は、参加者間で異なり、その結果、時点を、注入後初期（１４～２８日）、中期（４～７ヶ月または９～１０ヶ月）、後期（１１～１２ヶ月）、および長期（２～３または３～４年）の時点にグループ化した。ベースライン試料には、最初の白血球アフェレーシス（注入の２～３ヶ月前）および注入の１～２週間前の少量の採血からの凍結保存されたＰＢＭＣが含まれていた。参加者１－０１、１－０２、および１－０３からのＰＢＭＣは、注入後６ヶ月または８ヶ月まで凍結保存されなかった。ほとんどの参加者は、選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５シーケンシングおよび統合ＨＩＶ ＤＮＡ定量化などの大量の細胞を必要とするアッセイを可能にするために、大量の採血（ｎ＝９、２～３年目）および／または白血球アフェレーシス（ｎ＝７、３～４年目）を長期フォローアップ期間中に行うことに同意した。ＩＣＳアッセイおよびＣＤ９５フローサイトメトリー染色を含む、ある特定のアッセイでは、６人の参加者のみのベースライン試料が依然として利用可能であった。製造試料（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）もすべての参加者に利用可能であった。
【0173】
ＳＢ－７２８－１１０１
臨床測定（ＣＤ４、ＣＤ８数、ウイルス量（ＶＬ）、および五量体複製マーカー）は、すべての時点で実施した。ベースラインおよびＡＴＩ前での凍結保存されたＰＢＭＣの利用可能性は、コホート１および２の参加者には利用できず、その結果、免疫学的（Ｔ細胞表現型決定、選別されたＣＤ４＋サブセットにおけるＺＦＮ媒介性変異のＣＣＲ５ ＤＮＡシーケンシング）およびウイルス学的（統合ＨＩＶ ＤＮＡ）測定は、コホート３～５の参加者でのみ実施された。ベースライン試料には、最初の白血球アフェレーシス（注入の２～３ヶ月前）および注入の１～２週間前の少量の採血からの凍結保存されたＰＢＭＣが含まれていた。製造試料（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）もコホート３～５の参加者に利用可能であった。
臨床測定（ＣＤ４、ＣＤ８数、ウイルス量（ＶＬ）、および五量体複製マーカー）は、すべての時点で実施した。ベースラインおよびＡＴＩ前での凍結保存されたＰＢＭＣの利用可能性は、コホート１および２の参加者には利用できず、その結果、免疫学的（Ｔ細胞表現型決定、選別されたＣＤ４＋サブセットにおけるＺＦＮ媒介性変異のＣＣＲ５ ＤＮＡシーケンシング）およびウイルス学的（統合ＨＩＶ ＤＮＡ）測定は、コホート３～５の参加者でのみ実施された。ベースライン試料には、最初の白血球アフェレーシス（注入の２～３ヶ月前）および注入の１～２週間前の少量の採血からの凍結保存されたＰＢＭＣが含まれていた。製造試料（ＳＢ－７２８－Ｔ製品）もコホート３～５の参加者に利用可能であった。
【0174】
直腸およびリンパ節生検
直腸生検は、ベースライン、１４日目、３、６、および１２ヶ月目にＳＢ－９２８－０９０２試験の参加者に対して実施した（ｎは、時点当たり３～９人の参加者間で変動した）。粘膜単核細胞は、コラゲナーゼ消化および１８Ｇ針によるティージングの組み合わせを介した内視鏡検査によって得られたＳ状結腸生検から単離された。鼠径部リンパ節は、ある時点（ＳＢ－７２８－Ｔ注入後９～１８ヶ月）で３人のボランティアから生検した。Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ４７に記載されているように、組織を単一細胞にプロセシングし、ＣＣＲ５遺伝子修飾の評価のためにゲノムＤＮＡを単離した。
直腸生検は、ベースライン、１４日目、３、６、および１２ヶ月目にＳＢ－９２８－０９０２試験の参加者に対して実施した（ｎは、時点当たり３～９人の参加者間で変動した）。粘膜単核細胞は、コラゲナーゼ消化および１８Ｇ針によるティージングの組み合わせを介した内視鏡検査によって得られたＳ状結腸生検から単離された。鼠径部リンパ節は、ある時点（ＳＢ－７２８－Ｔ注入後９～１８ヶ月）で３人のボランティアから生検した。Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ４７に記載されているように、組織を単一細胞にプロセシングし、ＣＣＲ５遺伝子修飾の評価のためにゲノムＤＮＡを単離した。
【0175】
ポリメラーゼ連鎖反応によるＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４±Ｔ細胞の定量化
ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾は、ＣＣＲ５遺伝子座を破壊するために、広範囲のフレームシフト変異を生成することができる。ＰＣＲベースのアッセイは、遺伝子編集対立遺伝子のおよそ２５％のＺＦＮ切断部位における５ヌクレオチド（五量体）ＤＮＡ配列、ＣＴＧＡＴの固有の複製の獲得を測定するために開発された。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、市販のキット（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ ＤＮＡ精製キット、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＰＢＭＣから抽出した。５μｇのｇＤＮＡを用いて標準的なＰＣＲを実施し、ＣＣＲ５遺伝子修飾を含む１．１ｋｂの領域を増幅した。この１．１ｋｂアンプリコンは、その後、２つの独立したｑＰＣＲで評価され、１つは（五量体複製を含むプライマーを使用することにより）五量体複製－ＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子に特異的であり、２つ目はすべてのＣＣＲ５対立遺伝子を増幅する。五量体複製に特異的なテンプレートの比率およびＣＣＲ５対立遺伝子の総数により、１００万個のＰＢＭＣ当たりの五量体複製が得られる。アッセイは、１０５個の総ＣＣＲ５対立遺伝子当たり１つのＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の感度を有する。ＰＢＭＣ中のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の頻度は、五量体複製遺伝子編集細胞の頻度に４を掛けることによって推定された。
ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾は、ＣＣＲ５遺伝子座を破壊するために、広範囲のフレームシフト変異を生成することができる。ＰＣＲベースのアッセイは、遺伝子編集対立遺伝子のおよそ２５％のＺＦＮ切断部位における５ヌクレオチド（五量体）ＤＮＡ配列、ＣＴＧＡＴの固有の複製の獲得を測定するために開発された。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、市販のキット（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ ＤＮＡ精製キット、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＰＢＭＣから抽出した。５μｇのｇＤＮＡを用いて標準的なＰＣＲを実施し、ＣＣＲ５遺伝子修飾を含む１．１ｋｂの領域を増幅した。この１．１ｋｂアンプリコンは、その後、２つの独立したｑＰＣＲで評価され、１つは（五量体複製を含むプライマーを使用することにより）五量体複製－ＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子に特異的であり、２つ目はすべてのＣＣＲ５対立遺伝子を増幅する。五量体複製に特異的なテンプレートの比率およびＣＣＲ５対立遺伝子の総数により、１００万個のＰＢＭＣ当たりの五量体複製が得られる。アッセイは、１０５個の総ＣＣＲ５対立遺伝子当たり１つのＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の感度を有する。ＰＢＭＣ中のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の頻度は、五量体複製遺伝子編集細胞の頻度に４を掛けることによって推定された。
【0176】
Ｃｅｌ－Ｉを使用したＳＢ－７２８－Ｔ製品におけるＣＣＲ５遺伝子修飾の定量化
Ｃｅｌ－Ｉヌクレアーゼは、二重らせんＤＮＡ構造のバルジまたはミスマッチのいずれかによって作成された歪みの部位でＤＮＡ二本鎖を特異的に切断する。ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾によって通常誘導されるマイナーインデルの定量化のために、この酵素を使用するプロトコルを採用した。簡潔に説明すると、関心のゲノム領域（ＣＣＲ５）をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を変性させた後、再アニーリングして、野生型および非相同末端接合編集対立遺伝子を一緒に再アニーリングしてヘテロ二本鎖を作成できるようにする。次いで、再アニーリングされたＰＣＲ産物をＣｅｌ－Ｉヌクレアーゼで消化し、ミスマッチの部位でＰＣＲ増幅されたＤＮＡを切断する。その後、ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾のレベルは、２つのより低い移動性の切断産物に対する未切断の親フラグメントの比率を決定することによって定量化することができる。
Ｃｅｌ－Ｉヌクレアーゼは、二重らせんＤＮＡ構造のバルジまたはミスマッチのいずれかによって作成された歪みの部位でＤＮＡ二本鎖を特異的に切断する。ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾によって通常誘導されるマイナーインデルの定量化のために、この酵素を使用するプロトコルを採用した。簡潔に説明すると、関心のゲノム領域（ＣＣＲ５）をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を変性させた後、再アニーリングして、野生型および非相同末端接合編集対立遺伝子を一緒に再アニーリングしてヘテロ二本鎖を作成できるようにする。次いで、再アニーリングされたＰＣＲ産物をＣｅｌ－Ｉヌクレアーゼで消化し、ミスマッチの部位でＰＣＲ増幅されたＤＮＡを切断する。その後、ＺＦＮ媒介性遺伝子修飾のレベルは、２つのより低い移動性の切断産物に対する未切断の親フラグメントの比率を決定することによって定量化することができる。
【0177】
次世代シーケンシング／ＭｉＳｅｑによるＣＣＲ５遺伝子修飾の定量化
関心の遺伝子座（ＣＣＲ５のＺＦＮ結合部位）をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、それぞれの遺伝子座での修飾レベルをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーでのペアエンドディープシーケンシングによって決定した。ペア配列は、ＳｅｑＰｒｅｐ（Ｊｏｈｎ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｔｊｏｈｎ／ＳｅｑＰｒｅｐ、未公開）を介してマージした。標的アンプリコンゲノム領域と得られたＩｌｌｕｍｉｎａ配列との間でニードルマン・ブンシュアラインメントを実施して、インデルをマップした。ＣＣＲ５シーケンシングを、ＳＢ－７２８－Ｔ製品（ｎ＝９）および３～４年目の試料（ｎ＝８）のＳＢ－７２８－０９０２参加者、ならびにＳＢ－７２８－Ｔ製品（ｎ＝７）および６週目と２２週目の試料（ｎ＝７）のＳＢ－７２８－１１０１コホート３～５参加者からの選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいて実施した。ＣＣＲ５遺伝子編集メモリーサブセット細胞数は、それぞれのメモリーサブセット細胞数に、ＣＣＲ５シーケンシングによって決定される、それぞれのメモリーサブセット内のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度を掛けることによって推定された。
関心の遺伝子座（ＣＣＲ５のＺＦＮ結合部位）をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、それぞれの遺伝子座での修飾レベルをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーでのペアエンドディープシーケンシングによって決定した。ペア配列は、ＳｅｑＰｒｅｐ（Ｊｏｈｎ Ｓｔ．Ｊｏｈｎ、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｓｔｊｏｈｎ／ＳｅｑＰｒｅｐ、未公開）を介してマージした。標的アンプリコンゲノム領域と得られたＩｌｌｕｍｉｎａ配列との間でニードルマン・ブンシュアラインメントを実施して、インデルをマップした。ＣＣＲ５シーケンシングを、ＳＢ－７２８－Ｔ製品（ｎ＝９）および３～４年目の試料（ｎ＝８）のＳＢ－７２８－０９０２参加者、ならびにＳＢ－７２８－Ｔ製品（ｎ＝７）および６週目と２２週目の試料（ｎ＝７）のＳＢ－７２８－１１０１コホート３～５参加者からの選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいて実施した。ＣＣＲ５遺伝子編集メモリーサブセット細胞数は、それぞれのメモリーサブセット細胞数に、ＣＣＲ５シーケンシングによって決定される、それぞれのメモリーサブセット内のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度を掛けることによって推定された。
【0178】
ＳＢ－７２８－Ｔ注入後のＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの細胞トラッキング
選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５ ＺＦＮ媒介性変異のシーケンシングを使用して、注入後のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の分化をトラッキングした。最初に、野生型ＣＣＲ５（アンプリコン）およびシーケンシングされた試料のうちの１つのみで検出された配列は、さらなる分析から除外した（固有のＣＣＲ５配列の約８０％）。次いで、それぞれのドナーについて、ＳＢ－７２８－Ｔ製品のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞においてのみ発現される配列を同定し、次いで３～４年目の試料（ＳＢ－７２８－０９０２）または６週目および２２週目の試料（ＳＢ－７２８－１１０１）でのＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットにおけるそれらの分布を分析した。
選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５ ＺＦＮ媒介性変異のシーケンシングを使用して、注入後のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の分化をトラッキングした。最初に、野生型ＣＣＲ５（アンプリコン）およびシーケンシングされた試料のうちの１つのみで検出された配列は、さらなる分析から除外した（固有のＣＣＲ５配列の約８０％）。次いで、それぞれのドナーについて、ＳＢ－７２８－Ｔ製品のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞においてのみ発現される配列を同定し、次いで３～４年目の試料（ＳＢ－７２８－０９０２）または６週目および２２週目の試料（ＳＢ－７２８－１１０１）でのＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットにおけるそれらの分布を分析した。
【0179】
注入後のＳＢ－７２８－Ｔの拡大の推定
注入されたＣＣＲ５遺伝子編集細胞の量に対する参加者において存続するＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルは、五量体複製マーカーによるＣＣＲ５修飾の測定値および仮定によるＣＤ４＋細胞数を使用して推定することができる。１）血液量は４．７リットルである、２）すべてのＣＤ４＋ Ｔ細胞のおよそ２．５％が末梢４９において見られる、ならびに３）ＳＢ－７２８－Ｔ製品の分布は、内因性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と同様である（Ｓ状結節および鼠径部結節からのＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＣＣＲ５修飾のレベルは、末梢におけるレベルと同様である、図８Ｅ）。
注入されたＣＣＲ５遺伝子編集細胞の量に対する参加者において存続するＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルは、五量体複製マーカーによるＣＣＲ５修飾の測定値および仮定によるＣＤ４＋細胞数を使用して推定することができる。１）血液量は４．７リットルである、２）すべてのＣＤ４＋ Ｔ細胞のおよそ２．５％が末梢４９において見られる、ならびに３）ＳＢ－７２８－Ｔ製品の分布は、内因性ＣＤ４＋ Ｔ細胞と同様である（Ｓ状結節および鼠径部結節からのＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＣＣＲ５修飾のレベルは、末梢におけるレベルと同様である、図８Ｅ）。
【数1】
【0180】
ベースライン時およびＳＢ－７２８－Ｔ注入後の試料でのＳＢ－７２８－Ｔ製品の細胞表現型決定
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセット上の共抑制受容体の分析および評価は、２％ ＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による２２℃で１５分間の固定前に、ＴＳＣＭパネルまたは負調節因子パネルのいずれかを用いて４℃で３０分間染色した１００万個の解凍したＰＢＭＣ表面を使用して実施した。両方のパネルには、ＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローンＯ３２３）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ ＰｅｒＣＰｅ７１０（クローンＵＣＨＬ１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および水性蛍光反応性色素（死細胞マーカー）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。ＴＳＣＭパネルには、ＣＤ９５ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＤＸ２）、ＣＤ５８ ＰＥ（クローン１Ｃ３）、ＣＤ１２７ ＢＶ４２１（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＤ２８ ＡＰＣ（クローンＣＤ２８．２）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９ ＢＶ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＣＣＲ７ ＦＩＴＣ（クローン１５０５０３）（Ｒ＆Ｄ）が含まれる。負の調節因子パネルには、ＣＣＲ７ ＰＥ－ＣＦ５９４（クローン１５０５０３）、ＣＴＬＡ－４ ＡＰＣ（クローンＢＮＩ３）、ＣＤ３１ ＰＥ（クローンＷＭ５９）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｉｍ－３ ＢＶ４２１（クローンＦ３８－２Ｅ２）、ＰＤ－１ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＬＡＧ－３ ＦＩＴＣ（クローン１７Ｂ４）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）が含まれる。ＢＤ ＬＳＲ－ＩＩを使用して２４時間以内に最低１００，０００個の生細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏバージョン９を使用して分析した。
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセット上の共抑制受容体の分析および評価は、２％ ＦＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）による２２℃で１５分間の固定前に、ＴＳＣＭパネルまたは負調節因子パネルのいずれかを用いて４℃で３０分間染色した１００万個の解凍したＰＢＭＣ表面を使用して実施した。両方のパネルには、ＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローンＯ３２３）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ ＰｅｒＣＰｅ７１０（クローンＵＣＨＬ１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および水性蛍光反応性色素（死細胞マーカー）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。ＴＳＣＭパネルには、ＣＤ９５ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＤＸ２）、ＣＤ５８ ＰＥ（クローン１Ｃ３）、ＣＤ１２７ ＢＶ４２１（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＤ２８ ＡＰＣ（クローンＣＤ２８．２）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９ ＢＶ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＣＣＲ７ ＦＩＴＣ（クローン１５０５０３）（Ｒ＆Ｄ）が含まれる。負の調節因子パネルには、ＣＣＲ７ ＰＥ－ＣＦ５９４（クローン１５０５０３）、ＣＴＬＡ－４ ＡＰＣ（クローンＢＮＩ３）、ＣＤ３１ ＰＥ（クローンＷＭ５９）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｉｍ－３ ＢＶ４２１（クローンＦ３８－２Ｅ２）、ＰＤ－１ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＬＡＧ－３ ＦＩＴＣ（クローン１７Ｂ４）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）が含まれる。ＢＤ ＬＳＲ－ＩＩを使用して２４時間以内に最低１００，０００個の生細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏバージョン９を使用して分析した。
【0181】
細胞選別
ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット内の五量体複製メーカーおよび統合ＤＮＡレベルの定量化の場合、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を最初に負の磁気選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）によってＰＢＭＣから単離し、次いでＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ９５ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＤＸ２）、ＣＤ５８ ＰＥ（クローン１Ｃ３）、ＣＤ１２７ ＢＶ４２１（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＤ２８ ＡＰＣ（クローンＣＤ２８．２）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローンＯ３２３）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ ＰｅｒＣＰｅ７１０（クローンＵＣＨＬ１）、ＣＤ１９ ＢＶ ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ７ ＦＩＴＣ（クローン１５０５０３）（Ｒ＆Ｄ）、および水性蛍光反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面染色した。次いで、最大２００，０００個の総ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で選別し、分析まで－８０℃で乾燥ペレットとして保管した。免疫サブセットの遺伝子アレイ分析のために、１０，０００個の選別された細胞を１％のβ－メルカプトエタノールとともに５００μＬのＲＬＴ緩衝液を含む、ＲＮＡｓｅを含まない１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに直接収集し、分析まで－８０℃で保管した。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット内の五量体複製メーカーおよび統合ＤＮＡレベルの定量化の場合、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を最初に負の磁気選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）によってＰＢＭＣから単離し、次いでＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ９５ ＰＥ－Ｃｙ７（クローンＤＸ２）、ＣＤ５８ ＰＥ（クローン１Ｃ３）、ＣＤ１２７ ＢＶ４２１（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＤ２８ ＡＰＣ（クローンＣＤ２８．２）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローンＯ３２３）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８ ＰｅｒＣＰ（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ ＰｅｒＣＰｅ７１０（クローンＵＣＨＬ１）、ＣＤ１９ ＢＶ ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＣＲ７ ＦＩＴＣ（クローン１５０５０３）（Ｒ＆Ｄ）、および水性蛍光反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面染色した。次いで、最大２００，０００個の総ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットを、ＦＡＣＳＡｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で選別し、分析まで－８０℃で乾燥ペレットとして保管した。免疫サブセットの遺伝子アレイ分析のために、１０，０００個の選別された細胞を１％のβ－メルカプトエタノールとともに５００μＬのＲＬＴ緩衝液を含む、ＲＮＡｓｅを含まない１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに直接収集し、分析まで－８０℃で保管した。
【0182】
ＰＢＭＣ中のＨＩＶ ＤＮＡ、合計および選別されたＣＤ４± Ｔ細胞サブセット
ＰＢＭＣ中の総ＨＩＶ ＤＮＡは、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。要するに、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、市販のキット（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ ＤＮＡ精製キット、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＰＢＭＣから抽出した。２μｇのｇＤＮＡを、制限酵素ＤｄｅＩにより３７℃で１時間消化した。ＰＣＲ液滴は、製造業者の推奨に従って調製した。簡潔に説明すると、２５０ｎｇまたは５００ｎｇの消化されたｇＤＮＡをｄｄＰＣＲ（商標）２×マスターミックスおよび２つのＴａｑｍａｎプライマー／プローブセットと混合することによって、２０μＬのマルチプレックスＰＣＲ混合物を調製する。ＰＣＲ液滴は、ＱＸ－１００液滴発生器を使用してＤＧ８（商標）カートリッジで生成し、それぞれ２０μＬのＰＣＲ混合物を、およそ１５，０００ナノリットルサイズの液滴に分割した。ＰＣＲ液滴を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、ホイルで密封した。標準的なＰＣＲは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００サーマルサイクラー（９５℃（６０秒）、９４℃（３０秒）／６０℃（６０秒）、９８℃（６００秒）の４０サイクル）を用いて実施した。ＨＩＶ ＤＮＡコピー数は、ＱＸ－１００液滴デジタルＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して評価した。ＨＩＶ ｇａｇおよびＲＰＰ３０のＰＣＲ陽性およびＰＣＲ陰性の液滴を測定し、テンプレート濃度をポアソン分析によって計算した。ＨＩＶコピー数は、ＨＩＶ ｇａｇ濃度をＲＰＰ３０濃度に正規化することによって決定した。統合ＤＮＡは、ベースライン時のＳＢ－７２８－０９０２参加者からの精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＳＢ－７２８－Ｔ製品、２～３年目の試料（ｎ＝９）およびＳＢ－７２８－Ｔ製品および３～４年目の試料（ｎ＝８）中の選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいて、前述のように測定した。統合ＤＮＡは、精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、ならびにベースライン、２～６週目および１４～２２週目の試料（ｎ＝８）中のＳＢ－７２８－１１０１コホート３～５参加者からの選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいても測定した。
ＰＢＭＣ中の総ＨＩＶ ＤＮＡは、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。要するに、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、市販のキット（Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ ＤＮＡ精製キット、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＰＢＭＣから抽出した。２μｇのｇＤＮＡを、制限酵素ＤｄｅＩにより３７℃で１時間消化した。ＰＣＲ液滴は、製造業者の推奨に従って調製した。簡潔に説明すると、２５０ｎｇまたは５００ｎｇの消化されたｇＤＮＡをｄｄＰＣＲ（商標）２×マスターミックスおよび２つのＴａｑｍａｎプライマー／プローブセットと混合することによって、２０μＬのマルチプレックスＰＣＲ混合物を調製する。ＰＣＲ液滴は、ＱＸ－１００液滴発生器を使用してＤＧ８（商標）カートリッジで生成し、それぞれ２０μＬのＰＣＲ混合物を、およそ１５，０００ナノリットルサイズの液滴に分割した。ＰＣＲ液滴を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、ホイルで密封した。標準的なＰＣＲは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃ１０００サーマルサイクラー（９５℃（６０秒）、９４℃（３０秒）／６０℃（６０秒）、９８℃（６００秒）の４０サイクル）を用いて実施した。ＨＩＶ ＤＮＡコピー数は、ＱＸ－１００液滴デジタルＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して評価した。ＨＩＶ ｇａｇおよびＲＰＰ３０のＰＣＲ陽性およびＰＣＲ陰性の液滴を測定し、テンプレート濃度をポアソン分析によって計算した。ＨＩＶコピー数は、ＨＩＶ ｇａｇ濃度をＲＰＰ３０濃度に正規化することによって決定した。統合ＤＮＡは、ベースライン時のＳＢ－７２８－０９０２参加者からの精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＳＢ－７２８－Ｔ製品、２～３年目の試料（ｎ＝９）およびＳＢ－７２８－Ｔ製品および３～４年目の試料（ｎ＝８）中の選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいて、前述のように測定した。統合ＤＮＡは、精製されたＣＤ４＋ Ｔ細胞、ならびにベースライン、２～６週目および１４～２２週目の試料（ｎ＝８）中のＳＢ－７２８－１１０１コホート３～５参加者からの選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおいても測定した。
【0183】
ＨＩＶ向性アッセイ
ＨＩＶ向性は、市販のＴｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＤＮＡアッセイ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＬａｂＣｏｒｐ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して評価した。ウイルスエンベロープＤＮＡ配列を、ＰＢＭＣから抽出した。ＨＩＶ向性は、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質配列がＰＢＭＣ試料から増幅され、ライブラリーとしてサブクローン化され、レンチウイルスベクターにパッケージングされ、補助受容体制限細胞株を使用して評価される細胞ベースの形質導入アッセイを使用して決定される。
ＨＩＶ向性は、市販のＴｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＤＮＡアッセイ（Ｍｏｎｏｇｒａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ／ＬａｂＣｏｒｐ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して評価した。ウイルスエンベロープＤＮＡ配列を、ＰＢＭＣから抽出した。ＨＩＶ向性は、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質配列がＰＢＭＣ試料から増幅され、ライブラリーとしてサブクローン化され、レンチウイルスベクターにパッケージングされ、補助受容体制限細胞株を使用して評価される細胞ベースの形質導入アッセイを使用して決定される。
【0184】
細胞内サイトカイン染色
解凍したＰＢＭＣを１２時間静置した後、それぞれ２００万個の細胞をブレフェルジンＡ（５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｇａｇペプチド（１μｇ／ペプチド／ｍＬ、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、１μｇ／ｍＬ）または完全培地（ｍｏｃｋ）のいずれかで６時間刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＣＲ７ ＰＥ－ＣＦ５９４（クローン１５０５０３）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローン０３２３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ１９ ＢＶ ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および水性蛍光反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面染色し、０．０５％のサポニンで透過処理し、ＩＬ－２ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＢ２７）およびＴＮＦα Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（クローンＭＡＢ１１）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞内に染色した後、２％ホルムアルデヒドで固定した。ＢＤ ＬＳＲ－ＩＩを使用して、２４時間以内に細胞を取得した。少なくとも５００，０００の生事象を取得した。ＦｌｏｗＪｏバージョン９を使用して細胞を分析し、ブールゲーティング関数を使用して多機能ＣＤ８＋ Ｔサブセットの分布を決定した。
解凍したＰＢＭＣを１２時間静置した後、それぞれ２００万個の細胞をブレフェルジンＡ（５μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｇａｇペプチド（１μｇ／ペプチド／ｍＬ、ＮＩＨ ＡＩＤＳ試薬プログラム）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、１μｇ／ｍＬ）または完全培地（ｍｏｃｋ）のいずれかで６時間刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ３ Ａｌｅｘａ ７００（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（クローンＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＣＲ７ ＰＥ－ＣＦ５９４（クローン１５０５０３）、ＣＤ１４ Ｖ５００（クローンＭ５Ｅ２）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｑｄｏｔ ６０５（クローンＳ３．５）、ＣＤ２７ ＡＰＣｅ７８０（クローン０３２３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ４５ＲＡ ＢＶ ６５０（クローンＨＩ１００）、ＣＤ１９ ＢＶ ５１０（クローンＨ１Ｂ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および水性蛍光反応性色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で表面染色し、０．０５％のサポニンで透過処理し、ＩＬ－２ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（クローンＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＩＦＮγ ＡＰＣ（クローンＢ２７）およびＴＮＦα Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（クローンＭＡＢ１１）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞内に染色した後、２％ホルムアルデヒドで固定した。ＢＤ ＬＳＲ－ＩＩを使用して、２４時間以内に細胞を取得した。少なくとも５００，０００の生事象を取得した。ＦｌｏｗＪｏバージョン９を使用して細胞を分析し、ブールゲーティング関数を使用して多機能ＣＤ８＋ Ｔサブセットの分布を決定した。
【0185】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリー
ＴＣＲレパートリー分析は、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて実施した。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ法は、マルチプレックスＰＣＲによって再配列されたＴＣＲ ＣＤＲ３配列を増幅して、単離されたゲノムＤＮＡからすべてのＶβおよびＪβの組み合わせを探索し、ハイスループットシーケンシング技術を使用してＴＣＲ ＣＤＲ３鎖をシーケンシングし、それぞれの試料内の様々なＴ細胞クローンの組成を決定する。ＴＣＲの多様性は、それぞれの試料に存在するＴＣＲ Ｖβ ＣＤＲ３配列の固有のクローンの数（豊富さ）およびクローンの分布（均一性）の両方を説明するシャノンエントロピー指数を使用して評価される。より大きなシャノンエントロピー指数は、ＴＣＲ Ｖβ ＣＤＲ３配列のより多様な分布を反映する。
ＴＣＲレパートリー分析は、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱアッセイ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて実施した。ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ法は、マルチプレックスＰＣＲによって再配列されたＴＣＲ ＣＤＲ３配列を増幅して、単離されたゲノムＤＮＡからすべてのＶβおよびＪβの組み合わせを探索し、ハイスループットシーケンシング技術を使用してＴＣＲ ＣＤＲ３鎖をシーケンシングし、それぞれの試料内の様々なＴ細胞クローンの組成を決定する。ＴＣＲの多様性は、それぞれの試料に存在するＴＣＲ Ｖβ ＣＤＲ３配列の固有のクローンの数（豊富さ）およびクローンの分布（均一性）の両方を説明するシャノンエントロピー指数を使用して評価される。より大きなシャノンエントロピー指数は、ＴＣＲ Ｖβ ＣＤＲ３配列のより多様な分布を反映する。
【0186】
遺伝子マイクロアレイおよび分析
選択されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋サブセットを、上記のようにＲＬＴ緩衝液に選別した。具体的には、ＣＤ４＋ ＴＣＭ、ＣＤ４＋ ＴＴＭ、ＣＤ４＋ ＴＥＭおよびＣＤ８＋総メモリー細胞を、ベースラインおよび１２ヶ月目に選別した。さらに、ＣＤ４＋メモリーサブセットもまた、３～４年目に選別され、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ＴＣＭ、およびＴＥＭ細胞を含んでいた。選別された細胞を、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、ＲＮＡ抽出のために溶解した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライム逆転写反応に続いて、インビトロ転写を実施した。これらの製品は、２回目の増幅（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ増幅キット）を受け、ビオチン標識ａＲＮＡを生成し、これを製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ－１２バージョン４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎシステムを使用して定量化した。
選択されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋サブセットを、上記のようにＲＬＴ緩衝液に選別した。具体的には、ＣＤ４＋ ＴＣＭ、ＣＤ４＋ ＴＴＭ、ＣＤ４＋ ＴＥＭおよびＣＤ８＋総メモリー細胞を、ベースラインおよび１２ヶ月目に選別した。さらに、ＣＤ４＋メモリーサブセットもまた、３～４年目に選別され、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、ＴＣＭ、およびＴＥＭ細胞を含んでいた。選別された細胞を、製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、ＲＮＡ抽出のために溶解した。Ｔ７オリゴ（ｄＴ）プライム逆転写反応に続いて、インビトロ転写を実施した。これらの製品は、２回目の増幅（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＩＩ ａＲＮＡ増幅キット）を受け、ビオチン標識ａＲＮＡを生成し、これを製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ－１２バージョン４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎシステムを使用して定量化した。
【0187】
遺伝子アレイ出力データの分析は、Ｒ統計言語およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒからのマイクロアレイデータの線形モデル（ＬＩＭＭＡ）統計パッケージを使用して行った。簡潔に説明すると、走査されたアレイ画像にアーチファクトおよびチップ内の異常な信号分布がないかを検査し、全体的な強度または変動性が低いアレイを分析から除外した。密度プロット、箱ひげ図、およびアレイ間距離のヒートマップなどの診断プロットを使用して、チップ間のハイブリダイゼーション品質を評価した。クオンタイル正規化法を使用して正規化する前に、強度をｌｏｇ２変換した。注釈付きのＲｅｆＳｅｑ遺伝子にマッピングされなかったプローブおよび制御プローブを除外した。差次的に発現した遺伝子分析を、ベースラインと比較して１２ヶ月目にＣＤ４＋ ＴＣＭ（ｎ＝６）、ＣＤ４＋ ＴＴＭ（ｎ＝９）、ＣＤ４＋ ＴＥＭ（ｎ＝７）およびＣＤ８＋総メモリー細胞（ｎ＝９）上で実施し、３～４年目にＣＤ４＋ ＴＣＭおよびＴＥＭサブセットと比較して、ＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ上で実施した（ｎ＝７）。異なる時点またはサブセット間の遺伝子発現レベルの差異は、縦断ドナーペア分析を実施することによって決定した。ＬＩＭＭＡパッケージにおいて実装された調整されたｔ検定を使用して、ベースラインと月との間の遺伝子の差次的発現の統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を評価した。すべてのマイクロアレイデータは、受託番号ＧＳＥ６６２１４でＧＥＯに寄託されている。
【0188】
遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を使用して、注入後にＴメモリー細胞で調節される濃縮された生物学的経路を同定した（図４）。ＧＳＥＡは、特定の遺伝子セットのメンバーが、関心の転帰との関連の強さによって遺伝子がランク付けされている、ランク付けされた遺伝子リストの上位または下位に優先的に発生するかどうかを判断する統計的方法である。より具体的には、ＧＳＥＡは、発現の異なる遺伝子間で遺伝子のセットが大きな比率を占めている程度を反映する濃縮スコア（ＮＥＳ）を計算する。観察されたＮＥＳの重要性は、並べ替え検定によって得られ、遺伝子リストを再選別して、観察されたＮＥＳが偶然に発生する頻度を決定する。最先端の分析を実施して、濃縮に最も寄与している遺伝子セットの特定の遺伝子を調べる。ＧＳＥＡの事前ランク付けされた遺伝子リストオプションを使用し、ＭＳｉｇＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／）でキュレートされた遺伝子セットおよびカスタム遺伝子セットの濃縮について試験して、我々のデータ内のＴｒｅｇおよびＳＴＡＴ３経路の濃縮を試験した。偽発見率（ＦＤＲ）が２５％を超え、名目上のＰ値が０．０５を超える遺伝子セットを破棄した。
【0189】
フィッシャー複合試験アプローチとともに上記のＧＳＥＡを使用して、ＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ対ＣＤ４＋ ＴＣＭの比較、ならびにＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ対ＣＤ４＋ ＴＥＭの比較において濃縮される経路を同定した。ＴＥＭおよびＴＣＭの両方と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ中で誘導または抑制された遺伝子において著しく濃縮された選択された経路を、いくつかの生物学的機能；細胞周期、細胞代謝、サイトカインシグナル伝達、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達およびアポトーシスにグループ化した（図４Ａ）。
【0190】
円グラフを使用して、ＣＤ４＋ ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴＴＭならびにＣＤ８＋総メモリーサブセットにおいて、ベースラインと比較して、１２ヶ月目に増加または減少した上位濃縮経路を表した（図４Ｂ、Ｃ）。注入後１２ヶ月でのＣＤ４＋メモリーＴ細胞サブセットの遺伝子発現プロファイルが、免疫応答者（ＩＲ）のプロファイルを模倣したかどうかを評価するために、独立したコホート（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ免疫障害－ＣＬＩＦ－コホート）のＨＩＶ感染したＩＲ（ｎ＝２０、ＣＤ４＋数＞５００細胞／μＬ）および免疫学的非応答者（ＩＮＲ、ｎ＝２１、ＣＤ４＋数＜３５０細胞／μＬ）参加者のコホートでＧＳＥＡ分析を実施した。ＳＢ－７２８－Ｔ製品注入後１２ヶ月目にＣＤ４＋メモリーＴ細胞で上方調節されたすべての経路（５／５）は、ＩＮＲと比較してＩＲにおいて豊富であり（図４Ｅ、Ｆ）、これらの経路は、活性代謝（ＭＹＣ、ＯＸ／ＰＨＯＳ）および増殖（ＤＮＡ修復）と関連付けられた。
【0191】
ベースラインと比較して、１２ヶ月目でのＣＤ４＋ ＴＣＭおよびＣＤ８＋総メモリー細胞における炎症および免疫活性化に対するＳＢ－７２８－Ｔ製品の影響を調べるために、我々は最初に、上記のようにＬＩＭＭＡアプローチを使用して、縦断ドナーペア分析を実施した。確率Ｐが０．０５を下回る場合、遺伝子は、ベースラインと１２ヶ月目との間で差次的に発現しているとみなされた。インターフェロンＩ型（ＩＦＮ Ｉ）によって誘導される差次的に発現した遺伝子は、インターフェロンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅ．ｉｔｓ．ｍｏｎａｓｈ．ｅｄｕ．ａｕ／ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐｘ）を使用して同定した。選択した遺伝子（ベースラインと比較して１２ヶ月目に上方調節または下方調節された）を、それぞれの比較から選択し、ＧｅｎｅＭａｎｉａウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｍａｎｉａ．ｏｒｇ／）に送信して、共発現相互作用カテゴリーを使用して遺伝子相互作用ネットワークを生成した。
【0192】
線形回帰分析を使用して、２～４年目の１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡコピーの頻度および３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ数と相関した３～４年目の試料中のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭによって発現された遺伝子を同定した。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ中の遺伝子発現と連続的変数としてのこれらの転帰のレベルとの間に（Ｒ言語を使用して）線形モデルを適合させ、ＧＳＥＡを使用して経路を両方の読み出しと正または負で関連付けた。同様の方法で調節された経路、および異なる方向に調節された経路を図４ｇに表した。２～４年目の総ＨＩＶ ＤＮＡによって測定して、ＨＩＶリザーバーのサイズと正の相関があり、３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭカウントと負の相関がある上位経路を、正規化された濃縮スコアをプロットすることによって強調した（図４Ｈ、Ｉ）。この分析は、７人の参加者のうち６人で実施した。注入後のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の生着が低かった参加者１－０２は、探査分析において外れ値として同定されたため、分析から除外した。
【0193】
統計分析
ＨＩＶリザーバー分析
経時的な（日数）注入後のＨＩＶリザーバーの全体的な減衰を（１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡとして測定される）、Ｒパッケージｌｍｅ４からの関数ｌｍｅｒにおいて実装されるように、ランダムな切片を有する混合効果線形回帰モデルを使用してモデル化した。モデルに関連付けられたＰ値は、Ｒのｍｕｌｔｉｃｏｍｐパッケージにおいて実装されるように、ｃｆｔｅｓｔ関数を使用して推定した。
ＨＩＶリザーバー分析
経時的な（日数）注入後のＨＩＶリザーバーの全体的な減衰を（１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡとして測定される）、Ｒパッケージｌｍｅ４からの関数ｌｍｅｒにおいて実装されるように、ランダムな切片を有する混合効果線形回帰モデルを使用してモデル化した。モデルに関連付けられたＰ値は、Ｒのｍｕｌｔｉｃｏｍｐパッケージにおいて実装されるように、ｃｆｔｅｓｔ関数を使用して推定した。
【0194】
それぞれの個体のＨＩＶリザーバーの減衰を分析するために、経時的な１０６個のＰＢＭＣ当たりの総ＨＩＶ ＤＮＡの頻度を、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムｖ７．０ソフトウェアを使用して線形回帰モデルを用いて、それぞれの個体に適合させた。Ｐ値および回帰係数を計算した（図２Ａ）。参加者１－０１および１－０２の欠落しているベースライン値は、モデル適合切片によって計算した。
【0195】
臨床データ、ＣＣＲ５修飾、およびフローサイトメトリー
対応のあるウィルコクソン順位和両側検定を使用して、ベースラインと比較したＣＤ４＋総Ｔ細胞およびサブセット数、ＣＤ４：ＣＤ８比、Ｔ細胞機能、免疫チェックポイント阻害剤、および統合ＨＩＶ ＤＮＡの注入後の変化のノンパラメトリックドナーペア両側分析を実施した。ウィルコクソン順位和両側検定を使用して、サブセット間のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルを比較し、ＳＢ－７３８－Ｔ製品と長期時点との間のＴＣＲレパートリーおよびＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の多様性を比較した。ＳＢ－７２８－０９０２研究（五量体複製およびＣＣＲ５ ＤＮＡシーケンシング）において、マン・ホイットニー両側検定を使用して、一致した参加者の数が時点によって異なり、所与の時点で６つ未満の一致した対が含まれていた場合に、例えば、ベースラインと比較した注入後のＣＤ９５＋細胞の頻度、および異なるＣＤ４＋メモリーサブセット間のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルについて、対応のないノンパラメトリック両側比較を実施した。スピアマンのｒｈｏ（ρ）検定を使用して、デルタＣＤ４＋Ｔ細胞数（ＳＢ－７２８－０９０２）、ベースラインに対する最後に測定した値（２～４年目の時点）の比を使用して計算されたリザーバーのサイズの変化（ＳＢ－７２８－０９０２）、およびウイルス複製の制御（ＳＢ－７２８－１１０１）を含む、様々な測定値と臨床転帰との間のノンパラメトリック相関分析を実施した。ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの元のＦＤＲ法を使用してＦＤＲ値を計算することによって、多重比較検定を制御した。Ｐ値＜０．０５およびＱ値＜０．２５を有意とみなした。これらの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７．０を使用して実施した。
対応のあるウィルコクソン順位和両側検定を使用して、ベースラインと比較したＣＤ４＋総Ｔ細胞およびサブセット数、ＣＤ４：ＣＤ８比、Ｔ細胞機能、免疫チェックポイント阻害剤、および統合ＨＩＶ ＤＮＡの注入後の変化のノンパラメトリックドナーペア両側分析を実施した。ウィルコクソン順位和両側検定を使用して、サブセット間のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルを比較し、ＳＢ－７３８－Ｔ製品と長期時点との間のＴＣＲレパートリーおよびＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の多様性を比較した。ＳＢ－７２８－０９０２研究（五量体複製およびＣＣＲ５ ＤＮＡシーケンシング）において、マン・ホイットニー両側検定を使用して、一致した参加者の数が時点によって異なり、所与の時点で６つ未満の一致した対が含まれていた場合に、例えば、ベースラインと比較した注入後のＣＤ９５＋細胞の頻度、および異なるＣＤ４＋メモリーサブセット間のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のレベルについて、対応のないノンパラメトリック両側比較を実施した。スピアマンのｒｈｏ（ρ）検定を使用して、デルタＣＤ４＋Ｔ細胞数（ＳＢ－７２８－０９０２）、ベースラインに対する最後に測定した値（２～４年目の時点）の比を使用して計算されたリザーバーのサイズの変化（ＳＢ－７２８－０９０２）、およびウイルス複製の制御（ＳＢ－７２８－１１０１）を含む、様々な測定値と臨床転帰との間のノンパラメトリック相関分析を実施した。ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの元のＦＤＲ法を使用してＦＤＲ値を計算することによって、多重比較検定を制御した。Ｐ値＜０．０５およびＱ値＜０．２５を有意とみなした。これらの統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７．０を使用して実施した。
【0196】
ＳＢ－７２８－０９０２におけるＳＢ－７２８－Ｔ製品注入後の総ＨＩＶ ＤＮＡ減衰の統計分析
６人の参加者で観察された注入後のＨＩＶ ＤＮＡの減衰を説明するために、非線形混合効果モデルアプローチを使用してパラメーターを推定する、Ｍａｒｃ Ｌａｖｉｅｌｌｅによって開発され、Ｍａｔｌａｂにおいて実装された統計ソフトウェアパッケージであるＭｏｎｏｌｉｘバージョン２０１６Ｒ１（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｘｏｆｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｎｏｌｉｘ／）を使用して統計分析を実施した。個々のアプローチおよび集団アプローチ（６人の患者すべてをまとめたもの）を使用して、方程式Ｙ＝ａ＋ｂ１＊ｅｘｐ（－ｒ１＊時間）＋ｂ２＊ｅｘｐ（－ｒ２＊時間）（方程式１）を使用して二相性指数関数的減衰を推定した。Ｍｏｎｏｌｉｘは、マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）反復アルゴリズムを使用して、期待値最大化アルゴリズムの確率的近似を実装する。ＭＣＭＣ反復法は、メトロポリス・ヘイスティングスアプローチを使用する。適合を実施するために、二相減衰モデル方程式のそれぞれに異なる分布を考慮した。２つの減衰率ｒ１およびｒ２は、（０，１）の間の値を取り、ロジット正規分布に従って推定した。低速および高速の切片パラメーターｂ１およびｂ２は、プラトーパラメーターａとともに、正の値のみを取り、対数正規分布を使用して推定した。モデル収束を確実にするために、シミュレーションステップで２０００回のモンテカルロ反復を使用した。Ｍｏｎｏｌｉｘの個々の適合の形状もまた、同じ二相減衰関数に対して、非線形最小二乗推定法であるＲのｎｌｓＬＭパッケージを使用して確認した。
６人の参加者で観察された注入後のＨＩＶ ＤＮＡの減衰を説明するために、非線形混合効果モデルアプローチを使用してパラメーターを推定する、Ｍａｒｃ Ｌａｖｉｅｌｌｅによって開発され、Ｍａｔｌａｂにおいて実装された統計ソフトウェアパッケージであるＭｏｎｏｌｉｘバージョン２０１６Ｒ１（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｘｏｆｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｏｎｏｌｉｘ／）を使用して統計分析を実施した。個々のアプローチおよび集団アプローチ（６人の患者すべてをまとめたもの）を使用して、方程式Ｙ＝ａ＋ｂ１＊ｅｘｐ（－ｒ１＊時間）＋ｂ２＊ｅｘｐ（－ｒ２＊時間）（方程式１）を使用して二相性指数関数的減衰を推定した。Ｍｏｎｏｌｉｘは、マルコフ連鎖モンテカルロ（ＭＣＭＣ）反復アルゴリズムを使用して、期待値最大化アルゴリズムの確率的近似を実装する。ＭＣＭＣ反復法は、メトロポリス・ヘイスティングスアプローチを使用する。適合を実施するために、二相減衰モデル方程式のそれぞれに異なる分布を考慮した。２つの減衰率ｒ１およびｒ２は、（０，１）の間の値を取り、ロジット正規分布に従って推定した。低速および高速の切片パラメーターｂ１およびｂ２は、プラトーパラメーターａとともに、正の値のみを取り、対数正規分布を使用して推定した。モデル収束を確実にするために、シミュレーションステップで２０００回のモンテカルロ反復を使用した。Ｍｏｎｏｌｉｘの個々の適合の形状もまた、同じ二相減衰関数に対して、非線形最小二乗推定法であるＲのｎｌｓＬＭパッケージを使用して確認した。
【0197】
ＨＩＶ ＤＮＡの高速相および低速相のそれぞれが優勢になり始めた時間を推定するために、次の方程式を使用して、高速相および低速相のそれぞれと関連付けられた勾配をプロットした。
勾配＿高速＝（ａ＋ｂ１＋ｂ２）＊ｅｘｐ（－ｒ１＊時間）（方程式２）
勾配＿低速＝（ａ＋ｂ２）＊ｅｘｐ（－ｒ２＊時間）（方程式３）
勾配＿高速＝（ａ＋ｂ１＋ｂ２）＊ｅｘｐ（－ｒ１＊時間）（方程式２）
勾配＿低速＝（ａ＋ｂ２）＊ｅｘｐ（－ｒ２＊時間）（方程式３）
【0198】
２つの勾配（方程式２および３）の交点は、低速相が高速減衰相よりも優勢になり始める時間である。同様に、低速相（方程式３）とプラトーラインとの交点は、低速減衰相が終了し、ＨＩＶ ＤＮＡがプラトーによって推定された新しい頻度レベルに達した時間を示す。６人の患者のそれぞれの計算は、ＭＡＴＬＡＢ．２０１６を使用して実施した。
【0199】
同様に、総ＨＩＶ ＤＮＡ減衰に対する高速相および低速相の両方の寄与率を推定するために、以下の方程式を使用した。
パーセント＿高速：Φ＝ｂ１／（Ｙ０－プラトー）＊０．０１、Ｙ０＝ａ＋ｂ１＋ｂ２（ｔ＝０日でのＨＩＶ ＤＮＡコピー）
パーセント＿低速：Ｙ＝１００－Φ
パーセント＿高速：Φ＝ｂ１／（Ｙ０－プラトー）＊０．０１、Ｙ０＝ａ＋ｂ１＋ｂ２（ｔ＝０日でのＨＩＶ ＤＮＡコピー）
パーセント＿低速：Ｙ＝１００－Φ
【0200】
モデルの選択および診断
集団アプローチの結果と比較して、個々のアプローチはより良い適合をもたらした。Ｒ適合とＭｏｎｏｌｉｘ適合のそれぞれの差異、および個体対集団の適合結果を評価するために、赤池情報量基準（ＡＩＣ）およびベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を使用した。ＡＩＣおよびＢＩＣが小さいということは、最も節約的なモデルを示し、これは、Ｍｏｎｏｌｉｘの個々のアプローチを使用してより適切に達成された。
集団アプローチの結果と比較して、個々のアプローチはより良い適合をもたらした。Ｒ適合とＭｏｎｏｌｉｘ適合のそれぞれの差異、および個体対集団の適合結果を評価するために、赤池情報量基準（ＡＩＣ）およびベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を使用した。ＡＩＣおよびＢＩＣが小さいということは、最も節約的なモデルを示し、これは、Ｍｏｎｏｌｉｘの個々のアプローチを使用してより適切に達成された。
【0201】
ＣＤ４± Ｔ細胞のダイナミクスの数学的モデル
ＣＣＲ５遺伝子編集メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続性を調査するために、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞集団のダイナミクスを説明する数学モデルを開発した。メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＣＲ５遺伝子編集および非編集メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の２つの集団に分けた。モデルは、ナイーブ（Ｎ）、幹メモリーＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ（ＴＳＣＭ２、ＴＳＣＭ２ＧＥ）、幹メモリーＣＤ４５ＲＡ＋（ＴＳＣＭ１、ＴＳＣＭ１ＧＥ）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＭＧＥ）、トランジショナルメモリー（ＴＭ、ＴＭＧＥ）およびエフェクターメモリー（ＥＭ、ＥＭＧＥ）を考慮し、下付き文字ＧＥは、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４ Ｔ細胞を指す。このシステムを説明する微分方程式は、以下のとおりである。
ＣＣＲ５遺伝子編集メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続性を調査するために、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞集団のダイナミクスを説明する数学モデルを開発した。メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞を、ＣＣＲ５遺伝子編集および非編集メモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の２つの集団に分けた。モデルは、ナイーブ（Ｎ）、幹メモリーＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ（ＴＳＣＭ２、ＴＳＣＭ２ＧＥ）、幹メモリーＣＤ４５ＲＡ＋（ＴＳＣＭ１、ＴＳＣＭ１ＧＥ）、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＭＧＥ）、トランジショナルメモリー（ＴＭ、ＴＭＧＥ）およびエフェクターメモリー（ＥＭ、ＥＭＧＥ）を考慮し、下付き文字ＧＥは、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４ Ｔ細胞を指す。このシステムを説明する微分方程式は、以下のとおりである。
【数2】
【0202】
Ｍｏｎｏｌｉｘ Ｒ２０１８の個々の適合アプローチを使用して、ＡＴＩ中断期間（６週目～１２ヶ月目）が延長された５人の患者のＣＣＲ５遺伝子編集および非遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットデータ数の両方をＯＤＥモデルに適合させた。試料サイズが小さいため、前のセクションで説明したように、モデルパラメーターをパラメーター化するために個々の適合ルーチンを採用した（ＳＢ－７２８－０９０２でのＳＢ－７２８－Ｔ製品注入後の総ＨＩＶ ＤＮＡ減衰の統計分析）。すべてのモデルパラメーターについて、正の値のみを取る対数正規分布を仮定した。
【0203】
グローバル感度分析
どのパラメーターが細胞集団の大きさに最も影響を与えるかを判断するために、ラテン超方格サンプリング（ＬＨＳ）および部分順位相関係数（ＰＲＣＣ）を使用して感度分析試験を実施し、モデルパラメーターとモデル出力の間の線形関係を測定した。この試験により、複数のパラメーターとモデル出力との間の感度を同時に調べることができる。パラメーター分布の不確実性を考慮して、均一分布を使用してモデルパラメーターを変化させ、ここで最大値および最小値は、それぞれの対象に対して得られた５つの個々の適合からとる。モデルパラメーターと出力との間の単調性関係が確認された。精度を保証するために、ＭＡＴＬＡＢで１００，０００個のビンを使用してＰＲＣＣ値を得た。
どのパラメーターが細胞集団の大きさに最も影響を与えるかを判断するために、ラテン超方格サンプリング（ＬＨＳ）および部分順位相関係数（ＰＲＣＣ）を使用して感度分析試験を実施し、モデルパラメーターとモデル出力の間の線形関係を測定した。この試験により、複数のパラメーターとモデル出力との間の感度を同時に調べることができる。パラメーター分布の不確実性を考慮して、均一分布を使用してモデルパラメーターを変化させ、ここで最大値および最小値は、それぞれの対象に対して得られた５つの個々の適合からとる。モデルパラメーターと出力との間の単調性関係が確認された。精度を保証するために、ＭＡＴＬＡＢで１００，０００個のビンを使用してＰＲＣＣ値を得た。
【0204】
ＳＢ－７２８－０９０２における注入細胞の希釈に起因するＨＩＶ ＤＮＡ減衰の推定
注入された細胞の量による希釈に起因するＳＢ－７２８－０９０２研究の参加者の注入後のＨＩＶ ＤＮＡ減衰は、五量体複製マーカーによるＣＣＲ５遺伝子編集およびＣｅｌ－Ｉヌクレアーゼを使用したＳＢ－７２８－Ｔ製品におけるＣＣＲ５遺伝子編集の測定値を使用して推定することができ、１）１つの遺伝子編集対立遺伝子は１つの遺伝子編集細胞を表し、２）ＳＢ－７２８－Ｔ製品からのＣＤ４＋ Ｔ細胞はＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞を含まず、３）未編集の細胞は注入後のＣＣＲ５遺伝子編集細胞と同様に存続する（参加者はＡＲＴを続けた）と仮定する。
注入された細胞の量による希釈に起因するＳＢ－７２８－０９０２研究の参加者の注入後のＨＩＶ ＤＮＡ減衰は、五量体複製マーカーによるＣＣＲ５遺伝子編集およびＣｅｌ－Ｉヌクレアーゼを使用したＳＢ－７２８－Ｔ製品におけるＣＣＲ５遺伝子編集の測定値を使用して推定することができ、１）１つの遺伝子編集対立遺伝子は１つの遺伝子編集細胞を表し、２）ＳＢ－７２８－Ｔ製品からのＣＤ４＋ Ｔ細胞はＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞を含まず、３）未編集の細胞は注入後のＣＣＲ５遺伝子編集細胞と同様に存続する（参加者はＡＲＴを続けた）と仮定する。
【0205】
ＰＢＭＣ中のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の推定頻度＝それぞれの時点での１０６個のＰＢＭＣ当たりの五量体複製の頻度＊４／１０００
【0206】
ＰＢＭＣ中の注入された細胞の推定頻度＝それぞれの時点でのＰＢＭＣ中のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の頻度＊（１００／ＳＢ－７２８－Ｔ製品中のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の頻度、Ｃｅｌ－Ｉヌクレアーゼによって決定される）
【0207】
注入された細胞に起因するＨＩＶ ＤＮＡの推定減衰＝ＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞のベースライン頻度＊それぞれの時点でのＰＢＭＣ中の注入された細胞の頻度／１００
【0208】
注入された細胞に起因するＨＩＶ ＤＮＡの推定頻度＝ＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞のベースライン頻度－それぞれの時点での注入された細胞によるＨＩＶ ＤＮＡの推定減衰
【0209】
外れ値
参加者１－０２は上昇した抗アデノウイルス力価を有し、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の生着レベルおよび遺伝子編集細胞中で高度に濃縮された集団であるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の持続を妨げる場合があり（ＳＢ－７２８－Ｔ製品は、ＣＣＲ５標的ＺＦＮをコードする組換えＡｄ５／Ｆ３５アデノウイルスベクターでの形質導入に由来する）、したがって、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットの増殖をＨＩＶリザーバーの減衰と相関させることに焦点を当てた選択的分析から除外した（例えば、図１ｃ～ｄ、図２ｄ～ｅ、および図３ｇ～ｉ）。
参加者１－０２は上昇した抗アデノウイルス力価を有し、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の生着レベルおよび遺伝子編集細胞中で高度に濃縮された集団であるＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の持続を妨げる場合があり（ＳＢ－７２８－Ｔ製品は、ＣＣＲ５標的ＺＦＮをコードする組換えＡｄ５／Ｆ３５アデノウイルスベクターでの形質導入に由来する）、したがって、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットの増殖をＨＩＶリザーバーの減衰と相関させることに焦点を当てた選択的分析から除外した（例えば、図１ｃ～ｄ、図２ｄ～ｅ、および図３ｇ～ｉ）。
【0210】
結果
単回のＳＢ－７２８－Ｔ注入により、ＨＩＶリザーバーのサイズが継続的に減少し、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖および持続性と相関する。
臨床試験ＳＢ－７２８－０９０２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を５００細胞／μＬを超えるレベルまで増加させることができなかった長期ＡＲＴ中の９人のＨＩＶ感染した成人を評価した。ベースラインでは、参加者は７～２２年間有効なＡＲＴを受けており、平均ＣＤ４＋ Ｔ細胞数は３６３細胞／μＬであった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞数は、ベースライン訪問時の統合ＨＩＶ ＤＮＡ（ここではＨＩＶリザーバーと称される）のレベルと逆相関していた（Ｐ＝０．０１７）。すべての参加者は、ＺＦＮ媒介性ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞の単回注入を受けた。
単回のＳＢ－７２８－Ｔ注入により、ＨＩＶリザーバーのサイズが継続的に減少し、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖および持続性と相関する。
臨床試験ＳＢ－７２８－０９０２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞数を５００細胞／μＬを超えるレベルまで増加させることができなかった長期ＡＲＴ中の９人のＨＩＶ感染した成人を評価した。ベースラインでは、参加者は７～２２年間有効なＡＲＴを受けており、平均ＣＤ４＋ Ｔ細胞数は３６３細胞／μＬであった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞数は、ベースライン訪問時の統合ＨＩＶ ＤＮＡ（ここではＨＩＶリザーバーと称される）のレベルと逆相関していた（Ｐ＝０．０１７）。すべての参加者は、ＺＦＮ媒介性ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞の単回注入を受けた。
【0211】
末梢ＣＤ４＋ Ｔ細胞数（およびＣＤ４：ＣＤ８比）は、予想どおり、注入後７日以内に増加した（オンラインディスカッションを参照、図１０Ａ、１０Ｂ）。注目すべきことに、この増加は持続し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数は、縦断的観察中に３～４年間ベースラインを大幅に上回ったままであった（Ｐ＝０．０２４）（図１０Ａ）。ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖は、注入後７～２１日でピークに達し（２１日で中央値２．４倍の増殖、図１０ｃ）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の増加と関連付けられた。ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ中で最大４年間（平均０．８％のマークされたＰＢＭＣおよび平均２．７％のマークされたＣＤ４＋ Ｔ細胞）、直腸生検およびリンパ節で最大１２ヶ月間（最後に測定した時点）検出された（図１０ｄ、１０ｅ）。
【0212】
次に、ＳＢ－７２８－Ｔ注入後のＣＤ４＋ Ｔ細胞数の回復が、ＨＩＶ ＤＮＡを含む循環細胞の頻度の低減につながるかどうかを判断した。ベースラインと比較した場合、注入後２年で総ＨＩＶ ＤＮＡレベルの有意な低下が観察された（Ｐ＝０．０１９５、平均減衰－０．９１ ｌｏｇ１０、９５％信頼区間（ＣＩ）－１．７１～－０．１１）（図２Ａ）。さらに、統合ＤＮＡを有するＣＤ４＋ Ｔ細胞の頻度の著しい減衰（図２Ｂ）も注入後に観察された。初期（２１日）および長期時点（約３～４年）でのより高いレベルのＣＣＲ５遺伝子編集細胞増殖は、ＨＩＶ ＤＮＡレベルのより大きな持続的低減と相関していた（ｒ２＝０．６２、Ｐ＝０．００１４およびｒ２＝０．９１、それぞれ０．０００３）（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの結果は、注入されたＣＤ４＋ Ｔ細胞の持続性がＨＩＶリザーバーサイズの減衰に影響を与えることを強く示唆している。
【0213】
興味深いことに、ＳＢ－７２８－Ｔ製品からのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ベースラインからのＣＤ４＋ Ｔ細胞よりも潜伏感染細胞の頻度が有意に低かった（Ｐ＝０．００４、図１６Ａ）。二相減衰モデルを使用して、低レベルの統合ＨＩＶ ＤＮＡを含む注入細胞の持続性が、注入細胞のピーク増殖中の希釈を通じたＨＩＶリザーバーの減衰にのみ寄与するかどうかを判断した。ＨＩＶ ＤＮＡ減衰の勾配は、注入の最初の１～１５日間で最大であり、その間に平均３０．４７％（９５％ ＣＩ、９．６６４～５１．２８）の衰退が観察された。その後、ＨＩＶ ＤＮＡのレベルは、２１１日の半減期で、より低速で減少し続けた（９５％ ＣＩ、５６－３６５）。このより低速の減衰相は、ＨＩＶ ＤＮＡの減少の大部分を占めた（減少の平均６９．５％）（図２Ｅ）。続いて、希釈の結果としてＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞の推定頻度を、それぞれの時点で計算した（図２Ｆ）。観察されたＨＩＶ ＤＮＡを含む細胞の頻度は、およそ１００日後に希釈のみで推定された頻度よりも低くなることがわかり、これは、希釈だけではＨＩＶ感染細胞の頻度の長期的な減少を説明できないことを証明する。我々の分析は、注入された細胞の持続性が、Ｔ細胞の恒常性の回復および／または非感染細胞によるＣＤ４＋ Ｔ細胞プールの補充を含み得る機序を通じてＨＩＶの減衰につながることを示唆している。
【0214】
新規のメモリー幹細胞様ＣＤ４± Ｔ細胞サブセットは、Ｔ細胞の恒常性の回復に寄与し、リザーバーの減衰と相関する
ＣＤ４＋ Ｔ細胞の再構成につながる機序を調査するために、注入後のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの分布の縦断的分析を実施した。我々の研究は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの中間レベル（「ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ」と称される）を発現するＴ細胞の特異的増加を示した（図３Ａ）。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞は、ＳＢ－７２８－Ｔ製品に存在し、ＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子中で高度に濃縮されており、注入後に分析されたすべての時点で絶対数が大幅に増加した。重要なことに、注入後のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞数の変化は、他のメモリーサブセットの変化ではなく、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の長期的な増加と有意に相関していた（表１）。ＣＤ９５＋ＣＤ５８＋細胞（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－サブセット内のＴＳＣＭ中で発現されるマーカー）の頻度は、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖と正に相関していた。五量体複製マーカー（ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の配列タグ）のレベルは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５＋細胞（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭと称される）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＣＤ９５＋細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと称される）内で特異的に濃縮され、それぞれ３～４年目のセントラルメモリー（ＴＣＭ）またはトランジショナルメモリー（ＴＴＭ）細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ中のレベルよりもおよそ１４倍および２１倍高かった（図３Ｂ）。遺伝子編集により駆動されるＣＣＲ５ ＤＮＡ変異のシーケンシングは、ＴＣＭにおける２．５％～１６．７％、ＴＴＭにおける１％～１６．７％、およびＴＥＭにおける０．７％～２．５９％の範囲と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ（１４．４％～３７．７％の範囲）におけるＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の長期濃縮を確認した。注目すべきことに、これらの変異の多様性は、ＳＢ－７２８－Ｔ製品と３～４年目の時点の試料との間でＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて変動せず、これらの細胞が、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の長期ポリクローナル持続性に寄与する長寿命メモリーサブセットを表す可能性が最も高いことを示す。さらに、３～４年目の時点でのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５－またはＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ細胞の持続性ではなく、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの持続性が、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の増加と有意に相関していた（表１）。まとめると、これらの結果は、ＳＢ－７２８－Ｔの注入が、ＣＣＲ５遺伝子変異の長期持続およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の再構成と関連付けられた新規のＴＳＣＭ様サブセットにつながることを示す。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞の再構成につながる機序を調査するために、注入後のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの分布の縦断的分析を実施した。我々の研究は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの中間レベル（「ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ」と称される）を発現するＴ細胞の特異的増加を示した（図３Ａ）。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞は、ＳＢ－７２８－Ｔ製品に存在し、ＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子中で高度に濃縮されており、注入後に分析されたすべての時点で絶対数が大幅に増加した。重要なことに、注入後のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞数の変化は、他のメモリーサブセットの変化ではなく、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の長期的な増加と有意に相関していた（表１）。ＣＤ９５＋ＣＤ５８＋細胞（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－サブセット内のＴＳＣＭ中で発現されるマーカー）の頻度は、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖と正に相関していた。五量体複製マーカー（ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の配列タグ）のレベルは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５＋細胞（ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭと称される）およびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＣＤ９５＋細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと称される）内で特異的に濃縮され、それぞれ３～４年目のセントラルメモリー（ＴＣＭ）またはトランジショナルメモリー（ＴＴＭ）細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ中のレベルよりもおよそ１４倍および２１倍高かった（図３Ｂ）。遺伝子編集により駆動されるＣＣＲ５ ＤＮＡ変異のシーケンシングは、ＴＣＭにおける２．５％～１６．７％、ＴＴＭにおける１％～１６．７％、およびＴＥＭにおける０．７％～２．５９％の範囲と比較して、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ（１４．４％～３７．７％の範囲）におけるＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の長期濃縮を確認した。注目すべきことに、これらの変異の多様性は、ＳＢ－７２８－Ｔ製品と３～４年目の時点の試料との間でＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおいて変動せず、これらの細胞が、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の長期ポリクローナル持続性に寄与する長寿命メモリーサブセットを表す可能性が最も高いことを示す。さらに、３～４年目の時点でのＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５－またはＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ細胞の持続性ではなく、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの持続性が、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の増加と有意に相関していた（表１）。まとめると、これらの結果は、ＳＢ－７２８－Ｔの注入が、ＣＣＲ５遺伝子変異の長期持続およびＣＤ４＋ Ｔ細胞の再構成と関連付けられた新規のＴＳＣＭ様サブセットにつながることを示す。
【表1】
【0215】
注入後３～４年目のＴＥＭなどの短寿命のメモリー細胞におけるＣＣＲ５遺伝子変異の存在（図３Ｂ）は、ＴＳＣＭおよびＴＣＭなどの長寿命のメモリー細胞内のＣＣＲ５遺伝子編集細胞が、ＴＥＭに分化し、注入後３～４年目までＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭ細胞の小さなサブセットの維持をもたらすことを示唆する。ＨＩＶリザーバーの減衰に対するＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの役割を調べるために、ＳＢ－７２８－Ｔ製品およびＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット中の３～４年目の試料における統合ＨＩＶ ＤＮＡのレベルを最初に定量化し、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、他のメモリーサブセットと比較して、統合ＨＩＶ ＤＮＡのレベルが有意に低かったことがわかった（１．９９ ｌｏｇ１０、９５％ ＣＩ：３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ中１．６４～２．３４対２．８ ｌｏｇ１０、９５％ ＣＩ；ＴＣＭ中２．４８～３．１３、Ｐ＝０．０１６、２．７９ ｌｏｇ１０ ９５％ ＣＩ：ＴＴＭ中２．３１～３．２８、Ｐ＝０．０１６、２．８７ ｌｏｇ１０ ９５％ ＣＩ：ＴＥＭ中２．２８～３．４５、Ｐ＝０．０２３）。さらに、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の５．３％のみが、３～４年目の試料中のＣＤ４＋ Ｔ細胞に寄与したが（図３ｃ）、他のメモリーサブセットは、ＨＩＶ ｔｏｔ ＤＮＡを有する細胞のプールに対して有意に高い細胞の頻度に寄与した［ＴＣＭの場合４５．５％（Ｐ＝０．００７８）、ＴＴＭの場合１６．５％（Ｐ＝０．０１５６）、およびＴＥＭの場合２９．６％（Ｐ＝０．０１５６）］。
【0216】
低レベルの統合ＨＩＶ ＤＮＡを保有するＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の、他のメモリーサブセットへの分化は、総ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＨＩＶリザーバーの減衰の根底にある機序を提供することができる。これを調べるために、スパース線形多変量モデルを構築して、注入後に総ＨＩＶ ＤＮＡを保有するＰＢＭＣの頻度の変化を予測し、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞中の五量体複製の頻度、ならびにＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭとＴＥＭとの間で共有される変異の数を可能な独立変数として含んでいた。我々の分析は、注入後のＨＩＶリザーバーにおけるより大きな減衰が、３～４年目のより高いＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数（Ｐ＝０．００１８）、３～４年目のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおけるより高い頻度の五量体複製（Ｐ＝０．００５）、およびＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭにおける五量体複製の頻度と、３～４年目のＴＥＭにおける五量体複製の頻度とのより低い比によって最も良く予測されたことを示した（（Ｐ＝０．００１４）（調整済みのＲ２＝０．９９、Ｆ検定：Ｐ＝０．０００８、図３Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数の長期持続およびＴＥＭ集団内でのＣＣＲ５遺伝子編集細胞のサブセットの維持が、ＨＩＶリザーバーの低減に重要であることを実証し、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、より分化したメモリー細胞のプールに分化し、そのプールを感染に耐えるＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子を保有する検出可能な比率の細胞で補充できることを示唆する。
【0217】
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭは、静止および自己再生と関連付けられた遺伝子を発現し、他のメモリーサブセットに分化することができる。
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの持続および長期ＣＤ４＋ Ｔ細胞再構成に対するそれらの影響を実証する我々の結果は、これらの細胞が、長期持続を付与する遺伝子および経路を発現することを示唆した。選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの転写分析は、注入後３～４年の試料で実施した。遺伝子発現変動の多次元尺度構成法は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭと、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭとよりも、ＴＣＭおよびＴＥＭとの間でより大きな相違を示した。加えて、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭをＴＥＭと比較した場合、ＴＣＭおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと比較した場合よりも多数の差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）が見出された（５０２２対２９４３、対２１３６）。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、幹細胞性（Ｗｎｔを介した未分化ＨＳＣの維持に必要なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路など）、ならびに脂肪酸酸化、酸化的リン酸化、およびピルビン酸代謝などの細胞の持続性に寄与する代謝経路に関与する遺伝子において濃縮されたことを示した。ＴＣＭおよびＴＥＭ（図４Ａ）の両方と比較した場合、アポトーシス、エフェクター機能、細胞周期、およびＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達と関連付けられた遺伝子は下方調節され、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が他のメモリーサブセットよりも静止状態であることを示唆している。
ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの持続および長期ＣＤ４＋ Ｔ細胞再構成に対するそれらの影響を実証する我々の結果は、これらの細胞が、長期持続を付与する遺伝子および経路を発現することを示唆した。選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの転写分析は、注入後３～４年の試料で実施した。遺伝子発現変動の多次元尺度構成法は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭと、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭとよりも、ＴＣＭおよびＴＥＭとの間でより大きな相違を示した。加えて、ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭをＴＥＭと比較した場合、ＴＣＭおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと比較した場合よりも多数の差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）が見出された（５０２２対２９４３、対２１３６）。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、幹細胞性（Ｗｎｔを介した未分化ＨＳＣの維持に必要なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路など）、ならびに脂肪酸酸化、酸化的リン酸化、およびピルビン酸代謝などの細胞の持続性に寄与する代謝経路に関与する遺伝子において濃縮されたことを示した。ＴＣＭおよびＴＥＭ（図４Ａ）の両方と比較した場合、アポトーシス、エフェクター機能、細胞周期、およびＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達と関連付けられた遺伝子は下方調節され、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が他のメモリーサブセットよりも静止状態であることを示唆している。
【0218】
他のメモリーサブセットに分化するＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの能力を評価するために、選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＣＣＲ５ ＺＦＮ媒介性変異をシーケンシングし、ＳＢ－７２８－Ｔ製品中のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞に固有の配列を同定した（ｎ＝３，８８１）。様々なＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットにおける注入後３～４年のこれらの配列の分布分析（図４Ｂ）は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ固有の変異が、短寿命のＴＥＭを含むすべてのメモリーＴ細胞サブセットで検出されたことを示した（０．４９％（９５％ ＣＩ：０％～１．３６％）。これらの結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、より分化したメモリー細胞のプールに分化し、そのプールを補充できることを実証する。他のメモリーサブセットと比較してＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの分化状態をさらに特徴付けるために、フローサイトメトリーによって、抗ＣＤ３／２８被覆ビーズ（図４ｃ）、ＳＥＢまたはＰＭＡ／イオノマイシンによる刺激後のそれらの多官能性応答を調べた。我々の分析は、ＣＤ４＋ ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞を、ＴＣＭＴＴＭ、およびＴＥＭよりも分化していないとみなした。ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞の未分化状態は、Ｔｈ１（Ｔ－ｂｅｔおよびＥｏｍｅｓ）、Ｔｈ２（ＧＡＴＡ－３）およびＴｈ１７（ＲＯＲｇｔ）系統の関与と関連付けられた転写因子の発現レベルを分析することによって確認した。ナイーブ細胞およびＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭと同様に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞は、Ｔｈ特異的転写因子を発現しなかった（図３ｄ）。免疫チェックポイントマーカーのさらなる分析は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５＋細胞が、ＴＴＭおよびＴＥＭよりも著しく低いＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、およびＳＬＡＭのレベルを有することを示し、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＣＤ９５＋細胞が、他のメモリーサブセットよりも排出されないことを示唆している（図２８Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭが、寿命および多能性を含む幹細胞特性を示し、ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴＥＭメモリー細胞よりも分化した前駆細胞であることを示している。
【0219】
次に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ細胞のトランスクリプトームを比較して、Ｔ細胞の「幹のような」表現型を維持する際に実装される経路であるＷｎｔシグナル伝達カスケードを含む自己再生に関与する遺伝子発現および具体的には経路の差を調査した（図４Ｆ）。遺伝子発現分散の多次元尺度構成法は、以前に特徴付けられたＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ９５＋Ｔメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）が、この研究で説明されたＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ集団とは転写的に異なることを示した（図４Ｅ）。これらの遺伝子セットの組み合わせた最先端の遺伝子を詳しく見ると、幹細胞性を維持するために重要ないくつかの遺伝子の発現の上方調節が明らかになった。これらには、Ｗｎｔ因子およびそれらの受容体（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－ＦＺＤ）が含まれ、上記のように、幹細胞性維持カスケードを開始することが知られている（図４Ｇ）。これは、エフェクターＴ細胞の分化を防ぐことが知られているＤＶＬ、βカテニンおよびＴＣＦ７遺伝子を含む下流のシグナル伝達カスケードと組み合わされた。ＳＯＸ遺伝子の上方調節によって定義される幹細胞性のさらなる下流機序も観察された（図４ｇ）。興味深いことに、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭは、それらのＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ対応物と比較した場合、炎症誘発性（ＭＡＰＫ、Ｊｕｎ、ＮＦＡＴ）およびアポトーシス（ＰＳＭ）遺伝子セットにおいて濃縮された（図４Ｇ）。このサブセットにおける炎症誘発性シグネチャーの増強は、より「エフェクター」のような細胞に分化する能力の増加を示している可能性があった。興味深いことに、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードと関連付けられた最先端の遺伝子の組み合わせは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数の長期的な増加と正の相関があり、注入後のＨＩＶリザーバーの低減と負の相関があった。
【0220】
まとめると、これらの結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ表現型の細胞が、長寿命で未分化のメモリー細胞の特徴を有する、新規で別個のＴＳＣＭサブセットを構成することを確認する。
【0221】
ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの頻度は、ＳＢ－７２８－Ｔ注入後６週間の治療中断を受けた参加者におけるウイルス量の制御と相関する。
次に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭを含むＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞の注入が、ＡＲＴ治療中止時のウイルス血症の制御に及ぼす影響を評価した。参加者がＳＢ－７２８－Ｔ製品の注入後６週間で分析的治療中断（ＡＴＩ）を受けた、独立した臨床試験（ＳＢ－７２８－１１０１研究、ｎ＝１５、５コホート、材料および方法を参照）からの試料を分析した。ウイルス量レベルの分析は、ＡＴＩ中（２２週目）のウイルス量が過去のＡＲＴ前ウイルス量設定点（Ｐ＝０．００６７）よりも有意に低いことを示し（図５Ａ）、ＳＢ－７２８－Ｔ製品の注入が、参加者の大多数において、一過性ではあるが不完全なウイルス血症の制御につながった場合があることを示す。６人の個人においてＡＴＩを延長したことは、２２週目に１０，０００コピー／ｍＬ未満のウイルス量測定値および５００細胞／μｌを超えるＣＤ４＋ Ｔ細胞数を示し、その後ＡＴＩに０．５～２年を費やした。その時点でＡＴＩ中であった５人の参加者の１２か月目のウイルス量は、１３０～１６，０００コピー／ｍＬの範囲であった。これらの個人（０１～０６０）のうちの１人は、防御的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ５７を有していた。
次に、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭを含むＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞の注入が、ＡＲＴ治療中止時のウイルス血症の制御に及ぼす影響を評価した。参加者がＳＢ－７２８－Ｔ製品の注入後６週間で分析的治療中断（ＡＴＩ）を受けた、独立した臨床試験（ＳＢ－７２８－１１０１研究、ｎ＝１５、５コホート、材料および方法を参照）からの試料を分析した。ウイルス量レベルの分析は、ＡＴＩ中（２２週目）のウイルス量が過去のＡＲＴ前ウイルス量設定点（Ｐ＝０．００６７）よりも有意に低いことを示し（図５Ａ）、ＳＢ－７２８－Ｔ製品の注入が、参加者の大多数において、一過性ではあるが不完全なウイルス血症の制御につながった場合があることを示す。６人の個人においてＡＴＩを延長したことは、２２週目に１０，０００コピー／ｍＬ未満のウイルス量測定値および５００細胞／μｌを超えるＣＤ４＋ Ｔ細胞数を示し、その後ＡＴＩに０．５～２年を費やした。その時点でＡＴＩ中であった５人の参加者の１２か月目のウイルス量は、１３０～１６，０００コピー／ｍＬの範囲であった。これらの個人（０１～０６０）のうちの１人は、防御的なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ５７を有していた。
【0222】
偶然にも、過去のＡＲＴ前ウイルス量設定点と比較した２２週目のウイルス量の大幅な低減は、ピーク細胞増殖時のＣＤ４＋ Ｔ細胞数の大きな変化（図５Ｂ）およびＡＴＩ前（６週目）のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子のより高い頻度と有意に相関した（図５Ｃ）。これらの結果はＳＢ－７２８－Ｔ注入時のＣＣＲ５遺伝子編集細胞の増殖とウイルス量の制御との間の関連を強調しており、１１０１試験においてＣＣＲ５遺伝子変異で濃縮されることも示された（図５ｄ、ｅ）、ＡＴＩ後のウイルス量の低減におけるＴＳＣＭサブセットの役割を示唆する。ウイルス量とＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセット数との間の相関分析では、ＡＴＩ前（６週目）のより高いＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭおよびＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＴＳＣＭ細胞数（特にＣＣＲ５遺伝子編集ＴＳＣＭ細胞数）のみが、過去のウイルス量設定点と比較して、２２週目のウイルス量の大幅な低減と相関した（図５Ｆ、Ｇ）。
【0223】
次に、ＡＴＩ後のウイルス複製（ＲＥＦＳ）の制御に重要な役割を果たすことが以前に示された、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の機能的応答を調査し、ＡＴＩ後のＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットによるサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２）産生のピーク頻度、およびＡＴＩ前（６週目）のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ数を使用した、過去のＡＲＴ前ウイルス量設定点と比較して、２２週目のウイルス量の変化を予測するために多変量回帰モデルを構築した。我々の分析は、過去のＡＲＴ前設定点に対する２２週目のウイルス量の低減が、ＩＬ－２を産生するＣＤ８＋ ＴＴＭ細胞のピーク頻度と一緒に、ＡＴＩ前のより高いＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞数によって最も良く予測され、ウイルス量の変化の９５％を説明する（図５Ｈ）。これらの結果は、ＨＩＶリザーバーの減衰が、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞（ｐ＝０．０５）およびＩＬ－２を産生するＣＤ８＋ ＴＴＭ細胞（Ｐ＝０．０２）の増殖に有意かつ負に関連することを実証する。
【0224】
ＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭの頻度は、ＳＢ－７２８－Ｔ注入の６週間に治療中断を受けた参加者におけるウイルス量の制御と相関している。
ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、ＡＴＩ中の他のメモリーサブセットへの分化を通じたウイルス量の制御に寄与するという仮説を試験するために、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ製品に固有のＣＣＲ５変異を最初に同定し、注入後およびＡＴＩ後の他のメモリー細胞におけるそれらの持続を追跡した。我々の結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ製品に固有のＣＣＲ５変異が、６週目および２２週目ですべてのメモリーサブセットＣＤ４＋において検出されたことを示し（頻度数を付加する、図６Ａ）、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が分化する能力を強調する。
ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が、ＡＴＩ中の他のメモリーサブセットへの分化を通じたウイルス量の制御に寄与するという仮説を試験するために、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ製品に固有のＣＣＲ５変異を最初に同定し、注入後およびＡＴＩ後の他のメモリー細胞におけるそれらの持続を追跡した。我々の結果は、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ製品に固有のＣＣＲ５変異が、６週目および２２週目ですべてのメモリーサブセットＣＤ４＋において検出されたことを示し（頻度数を付加する、図６Ａ）、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞が分化する能力を強調する。
【0225】
ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットの持続性および分化能力に対する長期ウイルス複製の影響を調査するために、次に、通常の微分方程式モデルを使用して、ＡＴＩが１２ヶ月目以降まで延長された５人の個人におけるウイルス血症中（６週目～１２ヶ月目）のＣＣＲ５遺伝子編集および未編集のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットの恒常性をモデル化した。Ｍｏｎｏｌｉｘで個々の適合ルーチンを使用して、それぞれのＣＣＲ５遺伝子編集および未編集のＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットについて、死亡（γ）、増殖（ρ）、および遷移（φ）率（細胞／日）を得た。我々は、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、およびＴＣＭメモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の死亡率が、未編集の対応物の死亡率と比較して、平均３倍低いことを観察した（図６Ｂ）。加えて、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、およびＴＣＭメモリーＣＤ４＋ Ｔ細胞の死亡率は、それらの遷移率よりも低かった（図６Ｂ）。さらに、パラメーターと細胞数との間の関係を識別するためにＭａｔｌａｂにおける感度分析試験を使用して、遷移のモデルパラメーターが、ＡＴＩ後のＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ、およびＴＣＭ細胞数と有意な負の相関を有していたことを観察した（図６Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＣＣＲ５変異の存在が、ＣＤ４＋初期メモリーサブセットに保護効果をもたらし、これらの細胞の経時的な喪失が、細胞死よりもこれらの細胞の分化に起因する可能性がはるかに高いことを示唆している。加えて、感度分析はまた、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの増殖率が、ＴＥＭを含むすべてのＣＣＲ５遺伝子編集細胞の細胞数と有意な正の相関を有していたことも示し、これは他のサブセットの増殖率については観察されなかった（図６Ｂ）。これは、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの自己再生が、他のメモリーサブセットのＣＣＲ５変異の補充および維持に重要であることを示唆している。
【0226】
これらの所見を支持して、ＡＲＴ中断前（６週目）のより高いＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ－ＴＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭおよびＴＣＭ細胞数は、ＡＴＩ後（２２週目）のより多くのＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭ細胞数と相関し、ウイルス血症がＴＳＣＭのＴＥＭ細胞への漸進的な分化を引き起こし得ることを確認する（図６Ｃ～Ｅ）。
【0227】
ＴＥＭ細胞は、他のメモリー細胞と比較して最高レベルのＣＣＲ５を発現することが示されているため、ウイルス複製中にＴＥＭサブセット内のＣＣＲ５遺伝子編集細胞のサブセットを維持すると、デノボ感染からの保護につながり得る。これを調査するために、ベースライン時、ならびに注入後６週目および２２週目に、選別されたＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットにおけるＨＩＶリザーバーのサイズ（統合ＨＩＶ ＤＮＡレベルによって推定）を測定した。我々の結果は、統合ＨＩＶ ＤＮＡを担持するＴＥＭの頻度は、ＡＴＩ中に著しく変化しなかった（図６Ｆ）。綿密な調査により、分析された参加者の５０％が、６週目～２２週目にＴＥＭ細胞中のリザーバーのサイズを増加させ、残りの半分は、統合ＨＩＶ ＤＮＡの頻度の変化または減少を示さなかったことが明らかになった。重要なことに、ＡＴＩ中のＴＥＭ内の統合ＨＩＶ ＤＮＡを保有する細胞の頻度の変化は、ＴＥＭ集団におけるＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度と逆相関していた（図６Ｇ）。ＴＥＭサブセット（他のサブセットではない）における２２週目のＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子の頻度が高いほど、過去のＡＲＴ前のウイルス量設定点と比較して、２２週目のウイルス量の大幅な減少と特異的に相関することがさらにわかった（図６Ｈ～Ｉ）。まとめると、これらの結果は、ＣＣＲ５遺伝子編集ＴＥＭ細胞の継続的な補充が、それらの前駆細胞からの分化の結果として、ウイルス血症中にＴＥＭ中のリザーバーのサイズを制限すること、およびＴＥＭサブセットのデノボ感染からの優れた保護が、ＡＴＩ中の活発なウイルス複製の制御に対して影響を及ぼすことを示す。
【0228】
この研究からの観察は、新規のＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットが、最高レベルのＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子を有し、他のメモリーサブセットに分化できることを実証する、ＳＢ－７２８－０９０２コホートから生成された我々の所見をさらに裏付ける。ＣＣＲ５変異を発現する短寿命のＴＥＭを含む、分化したメモリーＴ細胞は、ウイルス感染から保護され、これは、両方の研究で観察されたように、ウイルス血症の制御およびＨＩＶリザーバーの進行性の減衰につながる。
【0229】
ＣＤ４５ＲＡ＋ ＴＳＣＭサブセットは、従来のメモリーＴ細胞の特徴、増強された自己再生および他のメモリーサブセットに分化する能力とともに以前に説明された。ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２７＋ＣＤ９５＋ＴＳＣＭのような表現型は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはＩＬ－２１などのサイトカインの存在下で共刺激された精製ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ナイーブＴ細胞のインビトロ増殖後に以前に報告されたが、これらの細胞がインビボで存続する能力、およびこれらの細胞の一部がＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ－表現型に戻ることができるかどうかは調査されていなかった。加えて、低レベルのＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを発現するＣＤ４＋サブセットは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増加と相関するＩＬ－２療法と組み合わされたＡＲＴ開始時にインビボで出現すると思われ、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔ細胞がまた、恒常的増殖に応答してインビボで生成され得ることを実証する。我々が本研究で同定したＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットはまた、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの遺伝子セット濃縮によって観察されるような自己再生の能力も実証した。幹細胞性（ＳＯＸ遺伝子）の追加機序の上方調節、およびＣＤ４５ＲＡ＋ ＴＳＣＭサブセットとは異なり、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭサブセットに固有の炎症誘発性およびアポトーシスシグネチャーの増強をさらに観察し、これらのＴＳＣＭ集団間の区別をさらに強調した。
【0230】
ＴＳＣＭは、ＨＩＶ感染を許容することが以前に示されている。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の恒常性を維持するために初期メモリー細胞でＨＩＶ感染を制限することの重要性は、非ヒト霊長類だけでなく、ウイルス性の非進行性ＨＩＶ感染者でも示されている。二次リンパ組織内の（ＣＣＲ５遺伝子編集対立遺伝子において濃縮された（３～４年目に末梢で最大４０％））ＴＳＣＭ細胞の存在は（ＨＩＶ複製が完全に阻害されない場合でも部分的に阻害される）、それらの長期生存につながる可能性がある。これにより順に、適応免疫機能が全体的に改善され、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数が増加し、ＨＩＶやその他の病原体が制御され、その結果、現在の研究で示したように、リザーバーのサイズが低減される。実際に、我々は、３～４年目にＴＴＭおよびＴＥＭなどの短寿命細胞におけるＳＢ－７２８－Ｔ製品中のＴＳＣＭサブセットに固有のＣＣＲ５遺伝子編集細胞を検出し、ＴＳＣＭのＴＥＭへの分化能を確認した。さらに、これらの観察は、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４＋ Ｔ細胞メモリーサブセットの恒常性のモデリングを支持しており、死亡率の低減が観察された。加えて、ＨＩＶ ＤＮＡの二相性減衰分析は、希釈がＨＩＶ減衰の原因である可能性を排除した。しかしながら、我々の多変量モデルは、ＣＣＲ５遺伝子編集ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの長期持続が、注入後のＨＩＶリザーバーの減衰に寄与することを実証した。
【0231】
中心的な仮説は、ＨＩＶ感染症からの保護をＴ細胞の小さなサブセットに提供することが、包括的利益を提供し、ウイルス複製の制御を可能にするというものであった。これを支持して、ＳＢ－７２８－０９０２およびＳＢ－７２８－１１０１の両方の研究結果は、Ｔ細胞の恒常性の回復およびＨＩＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞への同族の助けにおけるＳＢ－７２８－Ｔ注入の役割を確認し、ＴＳＣＭの、ＨＩＶ感染から保護されるＴＥＭへの分化につながり得る。提供される同族の助けは、ＨＩＶリザーバーにおける観察された減衰によってさらに強調され、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭ細胞およびＧＡＧ特異的ＣＤ８＋ ＴＴＭＩＬ－２産生細胞の両方の増殖と負に相関していた。ウイルス複製におけるＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＬ－２産生の役割は、以前に示されている。
【0232】
我々の結果は、注入された製品内のＣＣＲ５遺伝子編集および遺伝子未修飾のＴＳＣＭ細胞の両方のエクスビボ増殖に起因する可能性があり、そのような細胞が、ＡＲＴによってインビボで保護されることを認識した。この仮説を支持して、注入後のＣＣＲ５修飾細胞および非修飾細胞の両方の明らかな増殖を観察した。興味深いことに、我々のモデルは、ＣＤ４５ＲＡｉｎｔＲＯｉｎｔＴＳＣＭの増殖率が、すべてのＣＣＲ５遺伝子編集細胞の細胞数と正に相関していたことを示す。しかしながら、養子移入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激ＣＣＲ５未修飾細胞を用いた以前の研究では、ＨＩＶ＋参加者におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞数を持続的に増加させることができなかったことに留意すべきである。現在、ランダム化臨床試験を実施しており、ＣＣＲ５修飾細胞と未修飾細胞を注入して、この問題にさらに明確に対処することができる。
【0233】
ここで説明される結果は、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の単回注入が安全で、忍容性が高く、ＨＩＶ ＤＮＡレベル（およびおそらく複製能力のあるＨＩＶリザーバー）の大幅な低下につながる可能性があることを実証する。加えて、遺伝子編集されたメモリー幹細胞の長期持続により、機能不全／感染した古いメモリー細胞が、感染から保護された新しい細胞に置き換わり、それによって免疫系が再増殖する。この療法の非侵襲的かつ自家的な側面は、造血幹細胞移植よりもアクセスしやすく、煩わしさを軽減する。エレクトロポレーションによるジンクフィンガーヌクレアーゼｍＲＮＡ送達の進歩により、複数用量レジメンが可能になり、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数を大幅に改善すると予想される。これに沿って、未修飾の抗ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激未修飾ＣＤ４＋ Ｔ細胞を８週間ごとに複数回注入することにより、以前に注入後１年で細胞数が大幅に増加した。加えて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数がそれぞれの注入後に増加するにつれて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数が多いＨＩＶ＋対象からの製品は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞数が少ない対象と比較して、インビトロでより良好に増殖することが示されたため、その後に生成される製品はまた、より優れた生着および持続性をもたらすと予想される。さらに、ＨＩＶ ＤＮＡの統計分析の結果は、６週間の注入によってリザーバーが部分的に低減することを示しており、減衰の第２相に沿って延長期間後に治療が中断された場合、ウイルス量制御の最適な達成が可能であることを示唆している。
【0234】
要約すると、我々の結果は、ＣＣＲ５遺伝子編集細胞の注入が、Ｔ細胞の恒常性を改善し、総ＨＩＶリザーバーを低減する固有の治療的介入を提供することを示している。理論的には、このアプローチを他の介入と組み合わせると、転帰がさらに改善される可能性がある。
【0235】
本発明は、特にその好ましい実施形態を参照して示され、説明されてきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。前述の明細書で引用されているすべての特許、刊行物および参考文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図6G】
【図6H】
【図6I】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【国際調査報告】