特表 2022-542051 養子免疫療法のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-09-29

(54)【発明の名称】養子免疫療法のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220921BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220921BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220921BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220921BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20220921BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20220921BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220921BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220921BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220921BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220921BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220921BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220921BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220921BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C07K19/00

C07K14/705

C12N15/86 Z

A61K31/7088

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

A61K35/17 Z

A61P35/00

A61P31/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022504065

(86)(22)【出願日】2020-07-22

(85)【翻訳文提出日】2022-03-17

(86)【国際出願番号】 US2020043072

(87)【国際公開番号】W WO2021016353

(87)【国際公開日】2021-01-28

(31)【優先権主張番号】62/877,331

(32)【優先日】2019-07-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/044,059

(32)【優先日】2020-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522026913

【氏名又は名称】ヤン， ウェン

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， ウェン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087BC83

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA50

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与および／または増加させるための薬剤、組成物、および方法に関する。
【選択図】図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータ鎖またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む第１のポリペプチド鎖、ならびに（ＩＩ）ＴＣＲアルファ鎖またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む第２のポリペプチド鎖を含む抗原受容体であって、
前記ＴＣＲベータ鎖および前記ＴＣＲアルファ鎖が抗原結合部位を形成し、
前記第１のポリペプチド鎖または前記第２のポリペプチド鎖の前記細胞質ドメインが、
０、１、もしくは２コピーのヒト４－１ＢＢまたはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは
０、１、もしくは２コピーのヒトＣＤ３ゼータまたはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは
０、１、もしくは２コピーのヒトＣＤ３イプシロンまたはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは
０、１、もしくは２コピーのヒトＣＤ２８またはそのフラグメントの細胞質ドメインを含む、抗原受容体。

【請求項2】

前記第１のポリペプチド鎖が、前記膜貫通ドメイン、および前記細胞質ドメインのうちの１つ以上において、前記第２のポリペプチド鎖とは実質的に異なる、請求項１に記載の抗原受容体。

【請求項3】

１または２コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメインを含む、請求項１に記載の抗原受容体。

【請求項4】

１または２コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、請求項３に記載の抗原受容体。

【請求項5】

１または２コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメインを含む、請求項３または４に記載の抗原受容体。

【請求項6】

１コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、１コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインのみを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項7】

１コピーのＣＤ２８の膜貫通ドメイン、１コピーのＣＤ８の膜貫通ドメイン、１コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、１コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインのみを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項8】

２コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、２コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および２コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項9】

前記第１のポリペプチド鎖の前記細胞質ドメインは、１コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、１コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖の前記細胞質ドメインは、１コピーの前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、１コピーの前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、請求項８に記載の抗原受容体。

【請求項10】

前記第１のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、１コピーの前記細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、および１コピーの前記細胞質ドメインヒト４－１ＢＢを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項11】

前記第１のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、１コピーの前記細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、１コピーの前記細胞質ドメインヒト４－１ＢＢ、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項12】

前記第１のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、２コピーの前記細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み、
前記第２のポリペプチド鎖は、１コピーの前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、２コピーの前記細胞質ドメインヒト４－１ＢＢ、および１コピーの前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載の抗原受容体。

【請求項13】

前記第１のポリペプチド鎖または前記第２のポリペプチド鎖の前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよびＣＤ２８の膜貫通ドメインからなる群から選択される１つを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原受容体。

【請求項14】

前記抗原結合部位が、ＭＨＣ（ＨＬＡ）制限様式の状況で、腫瘍抗原、もしくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、もしくはウイルス抗原に結合するか、または前記細胞外ドメインが、細胞上で発現されると、ＭＨＣ（ＨＬＡ）制限様式の状況で、腫瘍抗原、もしくはＴＡＡ、もしくはウイルス抗原に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原受容体。

【請求項15】

前記腫瘍抗原がＮＹ－ＥＳＯ－１である、請求項１４に記載の抗原受容体。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質であって、前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖がタンパク質リンカー配列または自己切断ペプチド配列によって連結されている、融合タンパク質。

【請求項17】

前記自己切断ペプチド配列が、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＴ２Ａ配列を含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原受容体または請求項１６もしくは１７に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸または核酸のセット。

【請求項19】

（Ｉ）少なくとも１０アミノ酸の長さの第１のポリペプチドセグメントを含む前記第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸配列と、
（ＩＩ）少なくとも１０アミノ酸の長さの第２のポリペプチドセグメントを含む前記第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸配列と、を含み、
前記第１のポリペプチドセグメントが、前記第２のポリペプチドセグメントに対して少なくとも９０％同一であり、
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、前記第１のポリペプチドセグメントおよび前記第２のポリペプチドセグメントにおいて同一のアミノ酸残基をコードするコドン内に少なくとも１つの同一ではないコドンを含む、請求項１８に記載の単離された核酸または核酸のセット。

【請求項20】

（ａ）前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖が、１０アミノ酸を超える長さの同一のポリペプチド配列を含み、（ｂ）前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の同一のポリペプチド配列をコードするコドン内に少なくとも１つの同一ではないコドンを含む、請求項１９に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項21】

前記コドンの少なくとも２％が同一ではない、請求項１９または２０に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項22】

前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が前記コドン内で９８％未満同一である、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項23】

前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、（ａ）ＴＣＲベータ鎖またはその抗原結合フラグメント、
（ｂ）前記ＴＣＲアルファ鎖またはその抗原結合フラグメント、
（ｃ）前記ヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、
（ｄ）前記ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、
（ｅ）前記ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインまたはそのフラグメント、
（ｆ）前記ヒトＣＤ３イプシロンの細胞質ドメインまたはそのフラグメント、
（ｇ）前記ヒトＣＤ２８の細胞質ドメインまたはそのフラグメント、および
（ｈ）前記ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメインまたはそのフラグメントからなる群から選択される１つ以上をコードするコドン内に、少なくとも１つの同一ではないコドンを含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項24】

前記単離された核酸が、配列番号９、６４、１０、１１、および３２～４１からなる群から選択される１つをコードする、請求項２３に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項25】

前記単離された核酸が、配列番号１２、６５、１３、１４、および５４～６３からなる群から選択される配列を含む、請求項２４に記載の単離された核酸または核酸。

【請求項26】

前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＩＲＥＳ ＤＮＡフラグメントを含む核酸配列を介して連結されている、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の単離された核酸。

【請求項27】

請求項１８～２６のいずれか一項に記載の単離された核酸または核酸を含むベクター。

【請求項28】

前記ベクターが発現ベクターである、請求項２７に記載のベクター。

【請求項29】

前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２８に記載のベクター。

【請求項30】

請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原受容体、または請求項１６もしくは１７に記載の融合タンパク質、または請求項１８～２６のいずれか一項に記載の単離された核酸もしくは核酸、または請求項２７～２９のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項31】

前記細胞がＴ細胞である、請求項３０に記載の細胞。

【請求項32】

（ｉ）請求項１８～２６のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項２７～２９のいずれか一項に記載のベクター、または請求項３０もしくは３１に記載の細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項33】

腫瘍またはウイルス感染症疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項３２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月２３日に提出された米国仮出願第６２／８７７，３３１号および２０２０年６月２５日に提出された米国仮出願第６３／０４４，０５９号の優先権を主張する。それらの出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、組換え抗原受容体およびその使用に関する。そのような抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞は、抗原受容体によって結合される１つ以上の抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。

【背景技術】

【0003】

養子免疫療法は、治療効果を生み出すために患者に免疫エフェクター細胞を投与することを含む。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の出現は、養子免疫療法を改善するための有用なツールを提供してきた。その目的に向けて、特異性が規定された抗原標的受容体をＴ細胞に挿入するための遺伝子工学の使用は、養子免疫療法の能力を大幅に拡張した。ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインに融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインで構成される抗原標的受容体の一種である。抗体ベースのＣＡＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介した提示とは無関係に、細胞表面抗原を直接認識し、すべての患者で任意の所定の抗原に特異的な単一の受容体構築物の使用を可能にする。最初のＣＡＲは、抗原認識ドメインを、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ（ＣＤ３ゼータ）活性化鎖に融合させた。それに続くＣＡＲの反復には、ＣＤ２８、または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む、ＣＤ３ζと直列した二次共刺激シグナルが含まれてきた。第３世代の受容体には、ＣＤ３ζに加えて、最も一般的にはＣＤ２８および４－１ＢＢからの２つの異なる共刺激シグナルが含まれている。第２世代および第３世代の抗体ベースのＣＡＲは、インビトロおよびインビボで抗腫瘍効力を改善した。

【0004】

トランスジェニックＴ細胞受容体（ｔＴＣＲ）およびＴＣＲベースのＣＡＲ（ＴＣＲ－ＣＡＲ）は、抗体ベースのＣＡＲとは異なり、主にｔＴＣＲおよびＴＣＲベースのＣＡＲがＭＨＣ（ＨＬＡ）制限様式で抗原に結合する。したがって、ｔＴＣＲおよびＴＣＲベースのＣＡＲは、標的の可能性があるリストを大幅に拡張する。２つの別個のウイルスベクターフォーマットで、ヒトＣＤ２８およびＣＤ３ゼータ（ＣＤ３Ｚ）の細胞質ドメイン、またはヒトＣＤ２８およびＣＤ３イプシロン（ＣＤ３Ｅ）の細胞質ドメインを含む、第２世代のＴＣＲ－ＣＡＲの作製は、以前に記載されており（Ｇｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１９３：５３１５－５３２６）、単一のウイルスベクター型でヒトＣＤ２８およびＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含むものの作製は、米国特許第９，２０６，４４０号およびＩｍ ＥＪ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｉｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｖｉａ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１４）Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４０２２）に以前に記載されていた。加えて、単一のウイルスベクターフォーマットで単鎖ＴＣＲならびに、ヒトＣＤ２８およびＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む、第２世代のＴＣＲ－ＣＡＲの作製もまた、以前に記載されていた（Ｗａｌｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ＴＣＲ－ｂａｓｅｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ｓｅｐ ６；７（１）：１０７１３）。第３世代の受容体には、ＣＤ３ζに加えて、最も一般的にはＣＤ２８および４－１ＢＢからの２つの異なる共刺激シグナルが含まれている。第２世代および第３世代の抗体ベースのＣＡＲは、インビトロおよびインビボで抗腫瘍効果を改善した。

【0005】

抗体ベースのＣＡＲの第２世代または第３世代とは異なり、ｔＴＣＲおよびＴＣＲベースのＣＡＲは、効率的なｔＴＣＲまたはＴＣＲベースＣＡＲの発現および活性のための安定性の損失などの様々な障害に直面する。ｔＴＣＲ自体はそれ自体の分子に共刺激シグナル伝達を欠いているが、現在報告されているＴＣＲベースのＣＡＲは、４－１ＢＢなどの十分な共刺激シグナル伝達要素を欠いているか、または最適な細胞表面発現およびＣＡＲを介したＴ細胞活性のための最適な設計を欠いているかのいずれかである。細胞に強化された機能を提供する、新規なＴＣＲベースのＣＡＲ設計および養子縁組療法が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、いくつかの態様において上記の必要性に取り組む。一態様において、本開示は、（Ｉ）ＴＣＲベータ鎖またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン、膜貫通（ＴＭまたはＴｍ）ドメイン（ＴＭＤ）、および細胞質ドメイン（Ｃｙｔまたはｃｙｔ）を含む第１のポリペプチド鎖、ならびに（ＩＩ）ＴＣＲアルファ鎖またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン（Ｅｃ）、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む第２のポリペプチド鎖を含む抗原受容体を提供する。ＴＣＲベータ鎖およびＴＣＲアルファ鎖は抗原結合部位を形成する。実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインのうちの１つ以上において、第２のポリペプチド鎖とは実質的に異なる。

【0007】

第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖の細胞質ドメインは、（ａ）０、１、または２コピーのヒト４－１ＢＢまたはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは（ｂ）０、１、または２コピーのヒトＣＤ３ゼータ（ＣＤ３Ｚ）またはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは（ｃ）０、１、または２コピーのヒトＣＤ３イプシロン（ＣＤ３Ｅ）またはそのフラグメントの細胞質ドメイン、あるいは（ｄ）０、１、または２コピーのヒトＣＤ２８またはそのフラグメントの細胞質ドメインを含む。

【0008】

抗原受容体において、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖の膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインおよびＣＤ２８の膜貫通ドメインからなる群から選択される１つを含み得る。

【0009】

いくつかの実施形態において、抗原受容体は、１または２コピーのヒト４－１ＢＢの細胞質ドメインを含む。そのような抗原受容体の例には、本明細書に記載のベクターＮＴ４、５、６、２１、２２、２３、２４、２５、および２７によってコードされるものが含まれる。いくつかの例では、抗原受容体は、１または２コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含むことができる。他の例では、抗原受容体は、１または２コピーのヒトＣＤ２８の細胞質ドメインを含み得る。例には、ベクターＮＴ６、２１、２２、２３、２４、２５、および２７によってコードされたものが含まれる。

【0010】

一実施形態において、抗原受容体は、１コピーのヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、１コピーのヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインのみを含む。抗原受容体は、１コピーのＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび１コピーのＣＤ８の膜貫通ドメインのみをさらに含むことができる。一例（ＮＴ２２によってコードされるものなど）では、第１のポリペプチド鎖は、ＴＣＲベータ鎖の細胞外ドメイン、１コピーのＣＤ２８膜貫通ドメイン、１コピーのヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み得、一方、第２のポリペプチド鎖は、ＴＣＲアルファ鎖の細胞外ドメイン、１コピーのＣＤ８膜貫通ドメイン、および１コピーのヒト４－１ＢＢの細胞質ドメインを含み得る。

【0011】

一実施形態において、抗原受容体は、２コピーのヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、２コピーのヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、および２コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む。例えば、２つの鎖のそれぞれは、ヒト４－１ＢＢの細胞質ドメイン、ヒトＣＤ２８の細胞質ドメイン、およびヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメイン（例えば、ＮＴ６によってコードされるもの）のそれぞれについて１コピーを含むことができる。あるいは、一方のポリペプチド鎖（例えば、第１のポリペプチド鎖）は、２コピーのヒトＣＤ２８の細胞質ドメインを含み得、他方（例えば、第２のポリペプチド鎖）は、２コピーのヒト４－１ＢＢの細胞質ドメインを含み得る。例には、ベクターＮＴ２５によってコードされるものが含まれる。

【0012】

抗原受容体の一実施形態において、２つの鎖のうちの１つは、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを有する。例えば、第１のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン、１コピーの細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み得る。第２のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ８の膜貫通ドメインおよび１コピーの細胞質ドメインヒト４－１ＢＢを含み得るが、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含まない。例には、ＮＴ２２によってコードされるものが含まれる。

【0013】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、異なる共刺激ドメインを有する。例えば、第１のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、１コピーの細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み得る。第２のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、１コピーの細胞質ドメインヒト４－１ＢＢ、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含み得る。例には、ＮＴ２４によってコードされるものが含まれる。

【0014】

一実施形態において、第１のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、２コピーの細胞質ドメインヒトＣＤ２８、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む。第２のポリペプチド鎖は、１コピーのヒトＣＤ８の膜貫通ドメイン、２コピーの細胞質ドメインヒト４－１ＢＢ、および１コピーのヒトＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含む。例には、ＮＴ２５によってコードされるものが含まれる。

【0015】

（１）第２世代（例えば、ＮＴ２、ＮＴ３、ＮＴ４およびＮＴ５）および第３世代（例えば、ＮＴ２４）の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲベースのＣＡＲは、ネイティブ型のＴＣＲ（例えば、ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）と比較して、フローサイトメトリー測定によって決定されたように、ウイルス形質導入されたヒトＴ細胞上でより高い表面発現を示し、（２）第２世代（例えばＮｔ２、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５）および第３世代（例えば、ＮＴ２４）の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲベースのＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、ネイティブ型のＴＣＲ（例えば、ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）を発現するものと比較して、ＴＣＲ－ＣＡＲを媒介したサイトカイン分泌（例えば、ＩＬ－２）および腫瘍標的細胞とのエンゲージメント後の細胞拡大がより強力であり、かつ（３）異種移植のＳａｏｓ－２腫瘍マウスモデルを含むインビボ治療アッセイにおいて、データは、第２世代抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ（例えば、ＮＴ２、ＮＴ４）は、ネイティブ型ＮＴ１（ＮＴ１ａ）よりも優れた抗腫瘍活性を示し、一方、第３世代抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ－ＣＡＲ（例えば、ＮＴ２４）は、ヒトＣＤ２８（例えば、ＮＴ２）のみまたは４－１ＢＢ（例えば、ＮＴ４）のみからのＴＣＲシグナル２のみを有するその第２世代のそのカウンターパート（例えば、ＮＴ２、ＮＴ４）よりも有意により強力であり、ネイティブ型のＮＴ１（例えば、ＮＴ１ａ）よりもさらに強力であることを示唆していることは驚くべきかつ予期しないことであった。

【0016】

上記の抗原受容体において、抗原結合部位は、ＭＨＣ（ＨＬＡ）制限様式の状況で、腫瘍抗原、または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、またはウイルス抗原に結合し得る。つまり、細胞外ドメインは、細胞上で発現すると、ＭＨＣ（ＨＬＡ）制限様式の状況で、腫瘍抗原、ＴＡＡ、またはウイルス抗原に結合する。様々なそのような抗原が当技術分野で知られており、腫瘍抗原がＮＹ－ＥＳＯ－１であるものなどの、いくつかの例が本明細書に記載されている。

【0017】

抗原受容体およびそれを発現する細胞を作製する方法は、本明細書に開示されている。第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の助けを借りて、１つの共通の発現カセット／ベクターからの２つの別個の発現カセットまたはベクターから発現させることができる。

【0018】

２本の鎖は１つの融合タンパク質として発現することができる。したがって、本開示はまた、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含む融合タンパク質を提供する。その場合、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、タンパク質リンカー配列または自己切断ペプチド配列によって連結され得る。自己切断ペプチド配列の例には、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＴ２Ａ配列が含まれる。

【0019】

本開示はまた、上記の抗原受容体または融合タンパク質をコードする単離された核酸または核酸のセットを提供する。一実施形態において、本開示はさらに、単離された核酸または核酸のセットを提供し、これは、（Ｉ）少なくとも１０（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０および３００）アミノ酸（ａａ．）の長さの第１のポリペプチドセグメントを含む第１のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸配列、および（ＩＩ）少なくとも１０（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、および３００）アミノ酸の長さの第２のポリペプチドセグメントを含む第２のポリペプチド鎖をコードする第２の核酸配列を含み得る。第１のポリペプチドセグメントは、第２のポリペプチドセグメントに対して少なくとも９０％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であり、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、第１のポリペプチドセグメントおよび第２のポリペプチドセグメントにおける同一のアミノ酸残基をコードするコドン内に少なくとも１つの同一でないコドンを含む。第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖は、１０アミノ酸を超える長さの同一のポリペプチド配列を含み、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、第１の核酸配列および第２の核酸配列の同一のポリペプチド配列をコードするコドン内に少なくとも１つの同一でないコドンを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２％（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％）のコドンが同一ではない。第１の核酸配列および第２の核酸配列は、コドン内で、９８％（例えば、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または０％）未満、同一である。

【0020】

いくつかの実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、以下からなる群から選択される１つ以上をコードするコドン内に少なくとも１つの同一ではないコドンを含む：（ａ）ＴＣＲベータ鎖またはその抗原結合フラグメント、（ｂ）ＴＣＲアルファ鎖またはその抗原結合フラグメント、（ｃ）ＣＤ８の膜貫通ドメイン、（ｄ）ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、（ｅ）ＣＤ３Ｚの細胞質ドメインまたはそのフラグメント、（ｆ）ＣＤ３Ｅの細胞質ドメインまたはそのフラグメント、（ｇ）ＣＤ２８の細胞質ドメインまたはそのフラグメント、および（ｈ）４－１ＢＢの細胞質ドメインまたはそのフラグメント。単離された核酸は、配列番号９、６４、１０、１１、および３２～４１からなる群から選択される１つをコードし得る。単離された核酸は、配列番号１２、６５、１３、１４、および５４～６３からなる群から選択される配列を含み得る。

【0021】

上記の１つまたは複数の核酸を使用して、本明細書に記載の抗原受容体を発現させることができる。したがって、本開示はさらに、上記の単離された１つまたは複数の核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載されるようなウイルスベクターを含む発現ベクターである。細胞内で第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を発現させる場合、バイシストロン性またはマルチシストロン性の発現ベクターを使用することができる。バイシストロン性またはマルチシストロン性ベクターを構築するために採用される様々な戦略の中で、ＩＲＥＳが広く使用されている。自己切断２Ａペプチドは、単独で、またはＩＲＥＳと一緒に使用するのに適した候補でもあり得る。したがって、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、ＩＲＥＳを含む核酸配列を介して連結することができる。本開示はさらに、上記の抗原受容体、融合タンパク質、単離された１つまたは複数の核酸、またはベクターを含む細胞を提供する。Ｔ細胞などのリンパ球を含む細胞の例は以下に説明する。

【0022】

（ｉ）上記の１つまたは複数の核酸、ベクター、または細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた提供される。そのような医薬組成物は、腫瘍またはウイルス感染症疾患を治療する方法において使用することができる。この方法は、有効量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。

【0023】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の明細書中に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A-1B】例示的な抗原受容体を示す一連の図である。（Ａ）４つの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたはＴＣＲベースのＣＡＲ構築物の概略図：１（ＮＴ１）、２（ＮＴ１ｂ）、３（ＮＴ２）、および４（ＮＴ３）。（Ｂ）追加の１１個の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲベースのＣＡＲ構築物の概略図：５（ＮＴ４）、６（ＮＴ５）、７（ＮＴ６）、８（ＮＴ２１）、９（ＮＴ２２）、１０（ＮＴ２３）、１１（ＮＴ２４）、１２（ＮＴ２５）、１３（ＮＴ２６）、１４（ＮＴ２７）、および１５（ＮＴ２８）。

【図2A-2D】抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたはＴＣＲベースのＣＡＲ構築物をコードする４つのヌクレオチド配列の概略図である。Ａ：ＮＴ１（配列番号１２）、Ｂ：ＮＴ１ｂ（配列番号６５）、Ｃ：ＮＴ２（配列番号１３）、Ｄ：ＮＴ３（配列番号１４）。

【図3A】抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲアルファ鎖－２Ａ－ＴＣＲベータ鎖（ＮＴ１、ａＮＹ－ＴＣＲａ／ｂ）（配列番号９）のアミノ酸配列を表示する。

【図3B】抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲベータ鎖－２Ａ－ＴＣＲアルファ鎖（ＮＴ１ｂ、ａＮＹ－ＴＣＲｂ／ａ）（配列番号６４）のアミノ酸配列を表示する。

【図4】ＮＴ２＿抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ベータＣＤ２８ＴｍＣｙｔＺＣｙｔ－２Ａ－アルファｍｕＣＤ２８ＴｍＣｙｔｍｕＺＣｙｔ（ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｚ）（配列番号１０）のアミノ酸配列を表示する。

【図5】抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ベータＣＤ２８ＴｍＣｙｔＥＣｙｔ－２Ａ－アルファｍｕＣＤ２８ＴｍＣｙｔｍｕＥＣｙｔ（ＮＴ３、ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｅ）（配列番号１１）のアミノ酸配列を表示する。

【図6】ヌクレオチド配列ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔ（配列番号１７）およびＭｕｈＣＤ２８ＴｍＣｙ（配列番号１８）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ２８（ＣＤ２８ＴｍＣｙｔ）（配列番号６）のＴｍおよびＣｙｔドメインを含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は５６％である。同一のヌクレオチドはアスタリスク（＊）で示される。

【図7】ヌクレオチド配列ｈＣＤ３ＺＣｙｔ（ＺＣｙｔ）（配列番号１９）およびｍｕｈＣＤ３ＺＣｙｔ（ｍｕＺＣｙｔ）（配列番号２０）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ３ゼータ（配列番号７）のＣｙｔドメインを含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は５７％である。同一のヌクレオチドはアスタリスク（＊）で示される。

【図8】ヌクレオチド配列ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔ（２８ＴｍＣｙｔＺＣｙｔ）（配列番号１６）およびｍｕｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔ（ｍｕ２８ＴｍＣｙｔＺＣｙｔ）（配列番号２１）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ２８のＴｍおよびＣｙｔドメインならびにネイティブヒトＣＤ３ゼータのＣｙｔ（配列番号１５）を含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は５９％である。同一のヌクレオチドはアスタリスク（＊）で示される。

【図9】ヒトＣＤ３Ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３３．１）（配列番号２３）の１１９位に、ＢｓｐＥ１部位を破壊するために単一のサイレントヌクレオチド変異（ＧからＣ）を含むヌクレオチド配列ｈＣＤ３ＥＣｙｔ（ＥＣｙｔ）（配列番号２３）およびｍｕｈＣＤ３ＥＣｙｔ（ｍｕＥＣｙｔ）（配列番号２４）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）（ＥＣｙｔ）（配列番号８）のＣｙｔドメインを含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は５７％である。同一のヌクレオチドはアスタリスク（＊）で示される。

【図10】ＣＤ３ＺのＣｙｔのヌクレオチド配列とＣＤ３Ｚの変異したＣｙｔのヌクレオチド配列とのアラインメントを示す。ＣＤ３ＺＣｙｔ配列（配列番号１９）はヒトＣＤ３ゼータ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｊ０４１３２．１）に由来する。ｈＣＤ３ＺＣｙｔｅの配列およびｍｕ２ｈＣＤ３ＺＣｙｔの配列（配列番号２０）は、同一のアミノ酸配列（配列番号７）をコードする。縦棒「｜」は２つの配列間での同一のヌクレオチドを示す。これら２つの配列間の全体的な相同性は６０．４２％である。

【図11】ＣＤ２８のＴｍのヌクレオチド配列とＣＤ２８の変異したＴｍのヌクレオチド配列とのアラインメントを示す。ＣＤ２８Ｔｍの配列（配列番号４４）はヒトＣＤ２８（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＣ０９３６９８．１）に由来する。ＣＤ２８Ｔｍの配列およびｍｕ２ＣＤ２８Ｔｍの配列（配列番号４５）は、同一のアミノ酸配列（配列番号２７）をコードする。縦棒「｜」は２つの配列間での同一のヌクレオチドを示す。これらの２つの配列間の全体的な相同性は６２．９６％である。

【図12】ＣＤ２８のＣｙｔのヌクレオチド配列とＣＤ２８の変異したＣｙｔのヌクレオチド配列とのアラインメントを示す。ＣＤ２８Ｃｙｔ配列（配列番号４６）はヒトＣＤ２８（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＣ０９３６９８．１）に由来する。ｈＣＤ２８Ｃｙｔｅの配列およびｍｕ２ｈＣＤ２８Ｃｙｔの配列（配列番号４７）は、同一のアミノ酸配列（配列番号２８）をコードする。縦棒「｜」は２つの配列間での同一のヌクレオチドを示す。これら２つの配列間の全体的な相同性は５３．６５％である。

【図13】４－１ＢＢのＣｙｔヌクレオチド配列と４－１ＢＢの変異Ｃｙｔのヌクレオチド配列とのアラインメントを示す。ＢＢＣｙｔ配列（配列番号４８）は、ヒト４－１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：Ｕ０３３９７．１）に由来する。ｈＢＢＣｙｔおよびｍｕｈＢＢＣｙｔの配列（配列番号４９）は、同一のアミノ酸配列（配列番号２９）をコードする。縦棒「｜」は２つの配列間での同一のヌクレオチドを示す。これら２つの配列間の全体的な相同性は６３．４９％である。

【図14】ヌクレオチド配列ｈＣＤ８ヒンジ（配列番号５０）およびＭｕｈＣＤ８ヒンジ（配列番号５１）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ８（ＣＤ８ヒンジ）のヒンジドメイン（配列番号３０）（ヒトＣＤ８Ａの１３５～１８０のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００１７６８．４））を含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は５８．７０％である。同一のヌクレオチドは、縦棒「｜」で示される。

【図15】ヌクレオチド配列ｈＣＤ８Ｔｍ（配列番号５２）およびＭｕｈＣＤ８Ｔｍ（配列番号５３）のアラインメントを表示する。両方のＤＮＡ配列は、ネイティブヒトＣＤ８（ＣＤ８Ｔｍ）のＴｍドメイン（配列番号３１）（ヒトＣＤ８Ａの１８１～２０６のアミノ酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＮＭ＿００１７６８．４）を含む同一のポリペプチド配列をコードする。これら２つの配列間の全体的な相同性は６２．８２％である。同一のヌクレオチドは、縦棒「｜」で示される。

【図16】ＮＴ４＿抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ベータＣＤ８ｔｍＢＢＣｙｔＺＣｙｔ－２Ａ－アルファｍｕＣＤ８ＴｍＢＢＣｙｔｍｕＺＣｙｔ（ａＮＹ－ＴＣＲＢＢＺ）の配列（配列番号３２）を表示する。

【図17】ＮＴ５＿抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ベータＣＤ２８ｔｍＢＢＣｙｔＺＣｙｔ－２Ａ－アルファｍｕＣＤ２８ＴｍＢＢＣｙｔｍｕＺＣｙｔ（ａＮＹ－ＴＣＲＢＢＺ）の配列（配列番号３３）を表示する。

【図18】ＮＴ６＿抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ベータＣＤ２８ＴｍＣｙｔＺＣｙｔ－２Ａ－アルファｍｕＣＤ２８ＴｍＣｙｔｍｕＺＣｙｔ（ａＮＹ－ＴＣＲ２８ＢＢＺ）の配列（配列番号３４）を表示する。

【図19】ＮＴ２１のアミノ酸配列（配列番号３５）を表示する。

【図20】ＮＴ２２のアミノ酸配列（配列番号３６）を表示する。

【図21】ＮＴ２３のアミノ酸配列（配列番号３７）を表示する。

【図22】ＮＴ２４のアミノ酸配列（配列番号３８）を表示する。

【図23】ＮＴ２５のアミノ酸配列（配列番号３９）を表示する。

【図24】ＮＴ２６のアミノ酸配列（配列番号４０）を表示する。

【図25】ＮＴ２７のアミノ酸配列（配列番号４１）を表示する。

【図26A-26B】感染したＰＧ１３ＶＰＣでの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲの表面発現を示す図である。ＰＧ１３は、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２２（ベクター９、第３世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代）、ＮＴ２５（ベクター１２、第２世代））に感染させた。（Ａ）ＦＩＴＣ－抗ヒトＴＣＲＶｂ１３．１およびＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対する単一または二重陽性細胞の陽性染色を個別に示す強度プロット。陽性細胞の％が個々の象限に示された。（Ｂ）ヒストグラムは、ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対して陽性に染色された細胞の割合を示す。Ｕｎｔｄ：感染していない。

【図27A-27B】ネイティブ型または形質導入された活性化ヒトＴ細胞上の第２世代のＴＣＲ－ＣＡＲの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの表面発現を示す図である。評価されたＡＴＣは、２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）のうちの１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）のうちの１つを用いて形質導入した。（Ａ）ＦＩＴＣ－抗ヒトＴＣＲＶｂ１３．１およびＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対する単一または二重陽性細胞の陽性染色を個別に示す強度プロット。陽性細胞のパーセンテージは、個々の象限で示された。（Ｂ）ヒストグラムは、ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対して陽性に染色された細胞のパーセンテージを示す。

【図28】２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）のうちの１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）のうちの１つによって形質導入したＡＴＣによる、腫瘍細胞（Ｓａｏｓ－２）の特定の殺傷を示す写真のセットである。

【図29A-29B】２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）のうちの１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）のうちの１つで形質導入したＡＴＣによる、サイトカイン分泌を示す図である。（Ａ）ＩＬ－２分泌および（Ｂ）ＩＮＦ－γ分泌、ここで、データは、各グループの３つのサンプルからの平均数±Ｓ．Ｄ．として表示される。

【図30】腫瘍標的細胞（Ｓａｏｓ－２）との共培養後に、２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）のうちの１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）のうちの１つで形質導入されたＡＴＣのＮＹｐｅｐ／Ａ２＋細胞のパーセンテージ＋の変化を示す図である。

【図31A-31B】形質導入された活性化ヒトＴ細胞上での、ネイティブ型の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１のＴＣＲまたは第２もしくは第３世代のＴＣＲ－ＣＡＲの表面発現を示す図である。評価されたＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代）で形質導入したか、あるいは形質導入しないまま（Ｕｎｔｄ）であった）。（Ａ）ＦＩＴＣ－抗ヒトＴＣＲＶｂ１３．１およびＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対する単一または二重陽性細胞の陽性染色を個別に示す強度プロットである。陽性細胞の％を個々の象限に示した。（Ｂ）ヒストグラムは、ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対して陽性に染色された細胞の％を示す（括弧内の数字は地理的平均を示す）。

【図32】抗ＮＹ ＥＳＯ－１ＴＣＲまたは標的細胞（Ｓａｏｓ－２）とのエンゲージメント後、４つのＴＣＲベースのＣＡＲのうちの１つで形質導入されたヒトＡＴＣによる標的細胞の殺傷を示す図である。評価されたＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代）で形質導入したか、あるいは形質導入しないまま（Ｕｎｔｄ）であった）。

【図33A-33B】標的細胞（Ｓａｏｓ－２）とのエンゲージメント後、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ＴＣＲまたは４つのＴＣＲベースのＣＡＲのうちの１つで形質導入されたヒトＡＴＣの（Ａ）ＩＬ－２分泌および（Ｂ）ＩＦＮ－γを示す図である。評価されたＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代））で形質導入した。ＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代））で形質導入したか、あるいは形質導入しないまま（Ｕｎｔｄ）であった）。

【図34A-34B】標的細胞（Ｓａｏｓ－２）とのエンゲージメント後、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ＴＣＲまたは４つのＴＣＲベースのＣＡＲののうちの１つで形質導入されたＮＹｐｅｐ／Ａ２＋ＡＴＣの（Ａ）パーセンテージおよび（Ｂ）拡大の変化を示す図である。評価されたＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代））で形質導入したか、あるいは形質導入しないまま（Ｕｎｔｄ）であった）。

【図35A-35B】異種移植のＳａｏｓ－２腫瘍マウスモデルにおいて、ヒトＴ細胞における抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ ＣＡＲ媒介抗腫瘍活性を強化可能である第２世代または第３世代ＴＣＲ－ＣＡＲの発現のインビボ治療効果を示す図である。インビボでの抗腫瘍治療実験において評価されたＡＴＣは、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも名付けられた）、ベクター１）、または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２（ベクター３、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、ＮＴ２４（ベクター１１、第３世代））で形質導入したか、あるいは形質導入しないまま（Ｕｎｔｄ）であった）。（Ａ）各グループの６匹のマウスからの腫瘍サイズの平均数＋Ｓ．Ｄ．。（Ｂ）マウス／グループの生存率を計算して提示した。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本開示は、リンパ球の抗原特異的遺伝子改変サブセットを養子移入することによってなどの、細胞免疫療法によって媒介される免疫応答を付与および／または増加させるための薬剤、方法および組成物に関する。

【0026】

このような養子細胞移植または養子細胞療法（ＡＣＴ）は、がん患者の治療のための有望な治療アプローチを表している。しかしながら、それは効率的なＣＡＲの発現および活性のための安定性の喪失などの様々な障害に直面している。本開示は、（１）例えば、４－１ＢＢの共刺激分子シグナル伝達を組み込んだ第３世代ＴＣＲ－ＣＡＲの新規な設計、（２）膜貫通ドメインが異なり、同じＴＣＲシグナル伝達要素（ＣＤ３ゼータおよびＣＤ２８または４－１ＢＢの共刺激分子など）のコピー数が異なるバリエーションを含む新規な設計を含むがこれらに限定されない、多数の態様においてこのような障害に取り組む。本明細書に記載されるアプローチは、Ｔ細胞における新規な第３世代ＴＣＲ－ＣＡＲの遺伝子発現を介して、Ｔ細胞の抗腫瘍能を発現するＴＣＲ－ＣＡＲを改善するために、ＴＣＲ－ＣＡＲ媒介Ｔ細胞シグナル伝達を増強する。

【0027】

本開示は、免疫系ならびに先天性免疫応答および適応免疫応答を調節する能力を有するキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球を含む組成物を提供する。開示される薬剤、方法、および組成物は、遺伝子操作されたリンパ球に、そのようなリンパ球を発達させる方法と同様に、増強された抗腫瘍機能を提供する。

【0028】

抗原受容体
外来性抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞およびＮＫ細胞などの遺伝子改変免疫機能細胞は、がんおよび感染性疾患の免疫療法のために有効である。治療適用のためのＴ細胞などの自己抗原特異的免疫細胞の単離は、骨の折れる作業であり、そのような細胞が存在しないか、またはまれである場合には不可能である。したがって、腫瘍またはウイルスに特異的な免疫受容体を患者のＴ細胞に遺伝子移入するための戦略が開発された。この目的のために、抗原（Ａｇ）認識ドメインをＴＣＲまたはＦｃ受容体のシグナル伝達ドメインに結合する抗原受容体が構築されている。このような抗原受容体を発現するＴ細胞は、導入された受容体によって媒介される免疫特異的応答を再現する。

【0029】

キメラ抗原受容体（キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体としても知られている）は、Ｔ細胞に特定のタンパク質を標的とする新しい能力を与えるように操作された受容体タンパク質である。受容体は、抗原結合とＴ細胞活性化機能とを組み合わせて単一の受容体にするために、キメラである。抗原結合部位に加えて、ＣＡＲは１つ以上の機能ドメインを有することができる。

【0030】

ドメイン
本明細書に記載されるように、抗原受容体は、３つのドメインである、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメイン（これは細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる）を含む。いくつかの実施形態において、それは、第４のドメイン、すなわち、細胞外ドメインと細胞質ドメインとの間の細胞外ヒンジ領域を含む。このように、キメラ抗原受容体は、通常のＴ細胞活性化の多くの側面を単一のタンパク質に合わせる。それらは、細胞外抗原認識ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結し、抗原が結合するとＴ細胞を活性化する。

【0031】

細胞外ドメインは、抗原結合ドメインまたは標的結合ドメインを含む。細胞の外側に露出すると、このドメインは潜在的な標的分子と相互作用し、一致する分子を発現する任意の細胞に対して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的とする役割を果たす。抗原認識ドメインは、通常、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として一緒に連結されたモノクローナル抗体の可変領域またはＴＣＲに由来し得る。抗体およびＴＣＲに加えて、他のアプローチを使用してＣＡＲの特異性を誘導することもでき、通常は互いに結合するリガンド／受容体のペアを利用する。例えば、サイトカイン、先天性免疫受容体、ＴＮＦ受容体、成長因子、および構造タンパク質は、抗原認識ドメインとして使用することができる。好ましい実施形態において、細胞外ドメインは、抗体の可変領域またはその機能的フラグメント、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｂ、ＶａＣａまたはＶｂＣｂ）またはその機能的フラグメントを含む。

【0032】

スペーサーとも呼ばれるヒンジ領域は、抗原認識領域と細胞の外膜との間に位置する小さな構造ドメインである。理想的なヒンジは、受容体の標的結合ドメインの柔軟性を増強し、ＣＡＲとその標的抗原との間の空間的制約を軽減する。これにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞との間の抗原結合およびシナプス形成が促進される。ヒンジ配列は、ＩｇＧ、ＣＤ８、またはＣＤ２８などの免疫分子からの膜近位領域を含むことができる。

【0033】

膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがる疎水性のアルファヘリックスからなる構造成分である。抗原受容体を原形質膜に固定し、細胞外ヒンジおよび抗原認識ドメインを細胞質／細胞内シグナル伝達領域と橋渡しする。このドメインは、全体としての受容体の安定性にとって重要である。本開示では、細胞質の最も膜近位の成分からの膜貫通ドメインを使用することができるが、異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体の安定性をもたらす可能性がある。本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、当技術分野で認識されている機能的膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＣＤ４、またはＦｃεＲｉγ、あるいはその変異体ポリペプチドまたは機能的フラグメントのドメイン）を含み得る。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、高度に発現された安定した受容体をもたらすことが知られている。

【0034】

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、細胞内の受容体の細胞質ドメインにある。抗原が外部の抗原認識ドメインに結合した後、受容体は一緒にクラスター化し、活性化シグナルを伝達する。次に、受容体の内部細胞質末端は、Ｔ細胞内のシグナル伝達を永続させる。通常のＴ細胞の活性化は、ＣＤ３－ゼータの細胞質ドメインに存在する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化に依存している。したがって、ＣＤ３－ゼータの細胞質ドメインを使用することができる。他のＩＴＡＭを含むドメインも使用することができる。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ζの細胞質部分もしくはその機能的フラグメント、ＦＣεＲＩγもしくはその機能的フラグメント、および／またはＣＤ２８もしくはその機能的フラグメントを含み得る。

【0035】

Ｔ細胞は、活性化後も持続するために、ＣＤ３シグナル伝達に加えて共刺激分子も使用する。したがって、ＣＡＲ受容体の細胞質ドメインは、共刺激タンパク質からの１つ以上のキメラドメイン（すなわち、共刺激ドメイン）も含むことができる。多種多様な共刺激分子からのシグナル伝達ドメインを使用することができる。共刺激ポリペプチドであって、それらの結合を介して免疫応答を刺激または増加させることが知られている共刺激ポリペプチドの例には、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、およびＮＫＧ２Ｄ、ならびに、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ７０、およびＮＫＧ２Ｄリガンドを含む、それらの対応するリガンドが含まれる。このようなポリペプチドは腫瘍微小環境に存在し、腫瘍性細胞に対する免疫応答を活性化する。様々な実施形態において、治療的導入遺伝子を介して炎症誘発性ポリペプチドおよび／またはそれらのリガンドを促進し、刺激し、または作動させることは、免疫応答性細胞の免疫応答を増強する。例えば、ＴＣＲ（シグナル１）を介したＴ細胞活性化中のＣＤ２８共刺激（シグナル２）は、持続的な増殖、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の減少、およびリンパ球の長期生存の改善をもたらす。以下の表にリストされているのは、ＣＡＲに含めることができるドメイン配列の例である。

【表1】

【0036】

Ｔ細胞を再標的化するために使用される２つの主要な抗原受容体は、トランスジェニックＴ細胞受容体（ｔＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、抗体ベースのＣＡＲおよびＴＣＲベースのＣＡＲの２つの型に分類することができる。抗体ベースのＣＡＲ療法は、Ｂ細胞白血病を標的とすることに顕著な成功を実証しており、固形腫瘍を標的とする試験が進行中である。抗体ベースのＣＡＲは、がん免疫療法の治療薬として大きな可能性を秘めているが、細胞表面分子のみを認識する能力には限界がある。対照的に、ｔＴＣＲおよびＴＣＲベースのＣＡＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される処理済み抗原を識別する能力を有しているため、可能な標的のリストが大幅に拡大する。例えば、インビトロの研究では、内因的に発生するＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲで操作された細胞は、ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現する悪性黒色腫および非悪性黒色腫細胞株に対して活性を有することが示されている。ＮＹ－ＥＳＯ－１に向けられたＴ細胞を使用する最近の臨床試験では、高親和性ｔＴＣＲを有する操作された細胞が悪性黒色腫および滑膜細胞がんの患者に送達された。この研究における患者のほぼ半数が客観的な臨床反応を示し、確立された固形腫瘍の治療におけるｔＴＣＲ Ｔ細胞の可能性を強調している。

【0037】

Ｔ細胞に遺伝的にＴＣＲ関連の抗原特異性を導入する２つの方法が存在し、それらは、外因性のネイティブＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖など）を発現するようにＴ細胞を遺伝子操作する方法、および外因性のＴＣＲベースのＣＡＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子操作する方法である。ＴＣＲベースのＣＡＲは、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の細胞質ドメインなどの共刺激シグナル伝達要素の統合を伴って、または伴わずに、細胞外ドメイン（例えば、ＴＣＲアルファ鎖またはＴＣＲベータ鎖の細胞外ドメイン）、膜貫通ドメイン、およびＴＣＲシグナル伝達要素（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ）またはＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３Ｅ）の細胞質ドメイン）を含むように作製することができる。ネイティブＴＣＲに対するＴＣＲベースのＣＡＲの１つの利点は、ＣＤ３ＺおよびＣＤＥなどのＴＣＲシグナル伝達要素を含み、ＣＤ２８およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）などの共刺激シグナル伝達要素と統合することができることである。

【0038】

ＴＣＲ（シグナル１、例えば、ＣＤ３ＺまたはＣＤ３Ｅを介したシグナル伝達）を通したＴ細胞活性化中のＣＤ２８共刺激（シグナル２）は、持続的なＴ細胞増殖を促進することが示されている。単一の受容体内で活性化機能と共刺激機能とを組み合わせるために、同じ分子内のＣＤ３ゼータおよびＣＤ２８の両方の配列で構成されるＣＡＲを構築することができる。このようなＩｇＣＤ２８Ｚ分子は、細胞毒性、増殖、ならびにＩＬ２およびＩＦＮγ産生について、Ｔ細胞において優れた機能を保有していることが実証されている。

【0039】

抗体ベースのＣＡＲ（抗体ベースのＣＡＲ、ｓＦｖ－ＣＡＲ）の細胞外部分は、単鎖Ｆｖまたはそのフラグメントで構成されている。ｓＦｖ－ＣＡＲと同様に、ＴＣＲ－ＣＡＲは、ＴＣＲまたはＦｃ受容体のシグナル伝達ドメインに連結された特定のＭＨＣ（ＨＬＡ）分子の状況で、ＴＣＲ可変抗原結合フラグメント（ＶαおよびＶβ、またはそれらの抗原結合フラグメント）を含むことができる。ＴＣＲ－ＣＡＲは、単鎖ＴＣＲ－ＣＡＲ（ｓｃＴＣＲ－ＣＡＲ）または２つの鎖のＴＣＲ－ＣＡＲ（ｔｃＴＣＲ－ＣＡＲ）として、２つの基本的な型で構築することができる。ｓｃＴＣＲ－ＣＡＲについては、ＴＣＲＶαおよびＶβの両方が同じ単鎖ＴＣＲタンパク質内に存在するが、一方、ｔｃＴＣＲ－ＣＡＲでは、ＶαおよびＶβはヘテロダイマーを形成する別々の鎖にある。

【0040】

ＴＣＲは、同種抗原（ペプチド／ＭＨＣ複合体）に対して、同じ同種抗原に向けられた抗体と比較して、約１００～１，０００倍低い結合親和性を有することが知られている。さらに、Ｔ細胞受容体の単鎖フォーマットは、そのような抗原に対する対応する親の２鎖型の親和性と比較して、一般に同種抗原に対する親和性を大幅に低下させ、一部の単鎖Ｔ細胞受容体は抗原結合親和性を完全に失っていることが報告されている。キメラＴＣＲを含むＴＣＲのより高い結合親和性は、増殖の誘導、標的細胞の殺傷、およびサイトカイン分泌の誘導を含むＴ細胞活性化におけるそのような細胞の機能に関して、そのような受容体を発現する修飾Ｔ細胞のより高い効力と関連することが示されている。いくつかの報告は、ＴＣＲ－ＣＡＲの単鎖フォーマットは、治療的または診断的価値が低すぎる結合親和性を有していることを示す。したがって、合理的に高い抗原結合親和性を有する機能的なＴＣＲ－ＣＡＲを作製するために、天然ＴＣＲの２鎖フォーマットは、単鎖フォーマットに比べて大きな利点を有する。

【0041】

核酸間の組換えは、分子生物学において十分に確立された現象である。関与する核酸配列間で強い配列相同性が生じることを必要とする遺伝子組換えは、一般に相同組換えと呼ばれる。ほとんどの遺伝子ノックアウト戦略は、標的ノックアウトを達成するために相同組換えを利用しているが、特定のシステムでは、遺伝子組換えの発生が遺伝子操作に悪影響を与える可能性がある。特に、相同組換え事象は、ベクター、特にウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなど）の構築および産生に悪影響を与える可能性があり、例えば、１つ以上の宿主細胞および／または生物を介したウイルスベクターの継代および／または増殖中の相同組換えのない単一の安定なウイルスベクター内で、高度に相同な配列（例えば、同一のポリペプチド配列）を維持することがしばしば望ましい。

【0042】

同様に相同性の高い核酸配列によってコードされる相同性の高いポリペプチド配列を含む２つのタンパク質分子は、起こり得るウイルス組換え事象を低減する手段として２ベクターアプローチを使用して単一の細胞に形質導入することができる。例えば、それぞれ様々なＶａＣａおよびＶｂＣｂからなるが、同一のシグナル伝達要素ポリペプチド配列（例えば、ＣＤ２８および／またはＣＤ３Ｚの細胞質ドメイン）を共有する２鎖フォーマットのＴＣＲ－ＣＡＲである。それぞれが目的の２つの相同タンパク質のうちの１つをコードする２つの異なるベクターは、別々のＶＰＣから生成される可能性がある。しかしながら、レトロウイルスに曝露された活性化Ｔ細胞などの哺乳動物細胞への単一ベクターの成功した形質導入率は、しばしば制限される。

【0043】

低い宿主細胞形質導入効率に関連するそのような問題を克服するための新規のアプローチは、単一のウイルスベクター上で高度に相同な（例えば、同一の）ポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列の送達を可能にすることである。そのようなアプローチは、２つ以上の高度に相同な（例えば、同一の）ポリペプチドまたはそのポリペプチドドメインをコードする核酸配列を含むウイルスベクター配列を生成することを可能にする。ウイルスベクター配列は、例えば、宿主細胞における延長された継代および／もしくは複数の感染、染色体統合、ならびに／または切除事象の間でさえ、そのような核酸配列間の相同組換えのリスクを低減する。相同組換えのそのような低下した速度は、少なくとも部分的に、本明細書に記載されるようなウイルスベクターの合成中の遺伝コードの縮重の利用に起因する。

【0044】

さらに、ヒンジ／スペーサー領域は、ＣＡＲの非抗原結合細胞外領域からなる。ヒンジ／スペーサー領域は、柔軟性を提供し、長さを延長し、ダイマー化を可能にし、または安定性を改善することにより、ＣＡＲ機能を調節する。これらの特性は、エフェクター細胞と標的細胞との相互作用に影響を及ぼし、それによって活性化シグナル強度に影響を与えることが示唆されている。一般的なヒンジ／スペーサー領域は、免疫グロブリンＦｃ、ＣＤ８αおよびＣＤ２８スペーサー領域を利用している。

【0045】

以下に記載されているのは、本明細書に開示されるＣＡＲおよび関連する核酸配列に含めることができるドメイン配列の例である。
配列番号１．１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲのアルファ鎖（２７５ ａａ）

配列番号２．１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲのベータ鎖（３１１ ａａ）

配列番号３．Ｐ２Ａ （１９ ａａ）

配列番号４．１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲのアルファ鎖のＥｃドメイン（２２７ ａａ）：

配列番号５．１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲのベータ鎖のＥｃドメイン（２６２ ａａ）

配列番号６．ヒトＣＤ２８ＴｍＣｙｔ（６８ ａａ）

配列番号７．ヒトＣＤ３ＺＣｙｔ（１１２ ａａ）

配列番号８．ヒトＣＤ３ＥＣｙｔ（５５ ａａ）

配列番号９．ＮＴ１＿ａＮＹ－ＴＣＲ（６１２ ａａ）

配列番号６４．ＮＴ１ｂ＿Ｘｈｏ＿ＮＹ－ＥＳＯ．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（６１２ ａａ）

配列番号１０．ＮＴ２＿ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｚ（ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａ２８Ｚ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ）、８８３ ａａ

配列番号１１．ＮＴ３＿ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｅ（ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａ２８Ｅ＿ＮＹ－ＥＳＯ１ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｅｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｅｃｙｔ）（７６９ ａａ）

配列番号１２．ＮＴ１＿ａＮＹ－ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列（ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲａｂ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹ－Ｐ２Ａ－ｂ－Ｎｏｔ）

配列番号６５．ＮＴ１ｂ＿Ｘｈｏ＿ＮＹ－ＥＳＯ１－ＴＣＲｂ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹ－ｎｏｔ．ｔｘｔ．ｘｄｎａ

配列番号１３．ＮＴ２＿ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｚをコードするヌクレオチド配列
ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａ２８Ｚ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｎｏｔ

配列番号１４．ＮＴ３＿ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｅをコードするヌクレオチド配列
ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａ２８Ｅ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｅｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｅｃｙｔ－Ｎｏｔ

配列番号１５．ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔ（１４１ ａａ）

配列番号１６．ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔをコードするヌクレオチド配列（５４０ ｂｐ）

配列番号１７．ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔをコードするヌクレオチド配列（２０４ ｂｐ）

配列番号１８．ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔ（ｍｕ２８ＴｍＣｙｔ）をコードするヌクレオチド配列（２０４ ｂｐ）

配列番号１９．ヒトＣＤ３ＺＣｙｔ（ＺＣｙｔ）をコードするヌクレオチド配列、３３６ ｂｐ

配列番号２０．ヒトＣＤ３ＺＣｙｔ（ｍｕＺＣｙｔ）、ｍｕｈＣＤ３ＺＣｙｔをコードする変異ヌクレオチド配列、３３６ｂｐ

配列番号２１．ｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔＣＤ３ＺＣｙｔ（ｍｕ２８ＴｍＣｙｔｍｕＣｙｔ）ｍｕｈＣＤ２８ＴｍＣｙｔｍｕＣＤ３ＺＣｙｔをコードする変異ヌクレオチド配列、５４０ｂｐ

配列番号２２．ヒトＣＤ３ＥＣｙｔ＿ＮＭ＿０００７３３．１のヌクレオチド配列、（１６５ ｂｐ）

配列番号２３．ＢｓｐＥ １部位を破壊するために１１９位に単一のサイレントヌクレオチド変異（ＧからＣ）を有するヒトＣＤ３ＥＣｙｔ＿ＮＭ＿０００７３３．１のヌクレオチド配列、（１６５ ｂｐ）

配列番号２４．サイレント変異ヒトＣＤ３ＥＣｙｔ＿ＮＭ＿０００７３３．１のヌクレオチド配列、編集、１６５ ｂｐ

配列番号２５．ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１の残基１５７～１６５に対応するヒトＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ－１：１５７－１６５）（９ ａａ）

配列番号２６．ＣＤ２８ｐｅｃ（４０ ａａ）

配列番号２７．ヒトＣＤ２８Ｔｍ

配列番号２８．ヒトＣＤ２８Ｃｙｔ

配列番号２９．ヒト４－１ＢＢＣｙｔ

配列番号３０．ＣＤ８ヒンジ．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（４６ ａａ）

配列番号３１．ＣＤ８Ｔｍ＿ａａ １８１－２０．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（２６ ａａ）

配列番号３２．ＮＴ４＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａＢＢＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔ ＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔＺｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ、（８８３ ａａ）

配列番号３３．ＮＴ５＿設計＿ ＮＹＥ．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（８８５ ａａ）

配列番号３４．ＮＴ６＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂ．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（９６７ ａａ）

配列番号３５．ＮＴ２１＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（８８３ ａａ）

配列番号３６．ＮＴ２２＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（７７１ ａａ）

配列番号３７．ＮＴ２３＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（８８４ ａａ）

配列番号３８．ＮＴ２４＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（８８２ ａａ）

配列番号３９．ＮＴ２５＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（９６５ ａａ）

配列番号４０．ＮＴ２６＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（１０５９ ａａ）

配列番号４１．ＮＴ２７＿．ｔｘｔ．ｘｐｒｔ（８５９ ａａ）

配列番号４２．ｈＣＤ２８＿ヒト ＣＤ２８＿完全ｃｄｓ＿ｍＲＮＡ＿ＢＣ０９３６９８．１．ｔｘｔ．ｘｄｎａのｐＥｃのヌクレオチド配列（１２０ ｂｐ）

配列番号４３．ｍｕ２ｈＣＤ２８ｐＥｃ＿ヒトＣＤ２８＿完全ｃｄｓ＿ｍＲＮＡ＿ＢＣ０９３６９８．１．ｔｘｔ．ｘｄｎａのｎｔ（１２０ ｂｐ）

配列番号４４．ＣＤ２８Ｔｍ＿ヒトＣＤ２８＿ＢＣ０９３６９８．１．ｔｘｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（８１ ｂｐ）

配列番号４５．ｍｕ２ＣＤ２８Ｔｍ＿ヒト ＣＤ２８＿ＢＣ０９３６９８．１．ｔｘｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（８１ ｂｐ）

配列番号４６．ｈＣＤ２８Ｃｙｔ．ｔｘｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（１２３ ｂｐ）

配列番号４７．ｍｕ２ｈＣＤ２８Ｃｙｔ．ｔｘｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（１２３ ｂｐ）

配列番号４８．設計＿ｈ４－１ＢＢＣｙｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（１２６ ｂｐ）

配列番号４９．設計＿ｍｕｈ４１ＢＢＣｙｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列（１２６ ｂｐ）

配列番号５０．ＣＤ８ヒンジのヌクレオチド配列（１３８ ｂｐ）

配列番号５１．ｍｕＣＤ８ヒンジのヌクレオチド配列（１３８ ｂｐ）

配列番号５２．Ｈ＿ＣＤ８Ａ＿ＮＭ＿００１７６８．４．ｘｄｎａのＣＤ８Ｔｍ＿ａａ １８１－２０６のヌクレオチド配列（７８ ｂｐ）

配列番号５３．ＭｕＣＤ８Ｔｍのヌクレオチド配列、７８ ｂｐ
Ｈ＿ＣＤ８Ａ＿ＮＭ＿００１７６８．４のＭｕＣＤ８Ｔｍ＿ａａ １８１－２０６

配列番号５４．ＮＴ４＿設計＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａＢＢＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔＺｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号５５．ＮＴ５＿設計＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａＣＤ２８ｔｍＢＢＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号５６．ＮＴ６＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂａ２８ＢＢＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍｃｙｔＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号５７．ＮＴ２１＿ＮＴ２－４ｈ１＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂ２８ｔｍｃｙｔＺａ８ｔｍＢＺｈ１＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号５８．ＮＴ２２＿ＮＴ２－４ｈ２＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂ２８ｔｍｃｙｔＺａ８ｔｍＢｈ２＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号５９．ＮＴ２３＿ＮＴ２－５ｈ１＿ＮＹＥＳＯ１－ＴＣＲｂ２８ｔｍｃｙｔＺａ２８ｔｍＢＺｈ１＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ２８ｔｍｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ２８ｔｍＢＢｃｙｔＣＤ３Ｚｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号６０．ＮＴ２４＿ＮＴ２－４ｈ３＿ａＮＹ－ＴＣＲ－ＣＡＲ ｂ８ｔｍ２８ｃｙｔＺａ８ｔｍＢＢｃｙｔＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕＣＤ８ｔｍｍｕ２ＣＤ２８ｃｙｔｍｕＣＤ３Ｚｃｙｔ－リンカーＰ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔＺｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号６１．ＮＴ２５＿ａＮＹ－ＴＣＲ－ＣＡＲ ｂ８ｔｍ２８ｃｙｔｃｙｔ－ａ８ｔｍＢＢｃｙｔｃｙｔＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ８ｔｍＣＤ２８ｃｙｔｍｕ２ＣＤ２８ｃｙｔｍｕ２ＣＤ３Ｚｃｙｔ－リンカーＰ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｔｍｍｕＢＢｃｙｔＢＢｃｙｔＺｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号６２．ＮＴ２６＿ａＮＹ－ＴＣＲ－ＣＡＲｂ８ｈ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔＺａ８ｈ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔＺ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ８ｈｍｕ２ＣＤ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔｍｕ２Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｈＣＤ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔＺｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

配列番号６３．ＮＴ２７＿ＮＴ２ｂ－４ｈ１＿ａＮＹ－ＴＣＲ－ＣＡＲ ｂＣＤ８ｈ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔＺａ８ｔｍＢＢｃｙｔ＿Ｘｈｏ－ＮＹ－ＥＳＯ１ ｂｍｕ２ＣＤ８ｈｍｕ２ＣＤ２８ｐｅｃｔｍｃｙｔｍｕ２Ｚｃｙｔ－Ｐ２Ａ－１ｇ４ＴＣＲａ９５ＬＹＣＤ８ｔｍＢＢｃｙｔ－Ｎｏｔ．ｘｄｎａのヌクレオチド配列

【0046】

組成物およびキット
一態様において、本開示は、対象の免疫系を調節するために、上記のようにキメラ抗原受容体またはその鎖を発現する複数の遺伝子改変リンパ球を含む組成物を提供する。

【0047】

本発明では、様々なリンパ球を使用することができる。リンパ球の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および好塩基球が含まれ得る。いくつかの実施形態において、リンパ球は、ＣＤ３４造血幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞に由来する。リンパ球は、自家、同種、同系、または異種である可能性がある。いくつかの実施形態において、リンパ球は自己由来である。いくつかの実施形態において、リンパ球はヒトリンパ球である。

【0048】

いくつかの実施形態において、リンパ球は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。いくつかの実施形態において、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であり得る。いくつかの実施形態において、リンパ球は、キメラ抗原受容体を発現し得る。いくつかの実施形態において、リンパ球は、組換えＴ細胞受容体を発現し得る。ＣＡＲまたはＴＣＲは、目的のがん抗原に結合し得る。

【0049】

そのようながんおよび／または腫瘍抗原の例には、例えば、サイクリン依存性キナーゼ－４、β－カテニン、カスパーゼ－８、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、チロシナーゼ、表面Ｉｇイディオタイプ、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＭＵＣ－１、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＣＤ５、イディオタイプ、ＣＡＭＰＡＴＨ－１、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ムチン－１、ルイス^ｘ、ＣＡ－１２５、ＥＧＦＲ、ｐ１８５^ＨＥＲ２、ＩＬ－２Ｒ、ＦＡＰ、テネイシン、メタロプロテイナーゼ、ｐｈＣＧ、ｇｐ１００またはＰｍｅｌｌ７、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＴＲＰ－２、メラン－Ａ（ｍｅｌａｎ－Ａ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＮ（ｇｐ２５０）、イディオタイプ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、チロシナーゼ、テロメラーゼ、ＭＵＣ－１抗原、および生殖細胞由来腫瘍抗原、血液群抗原、例えば、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、ＬｅＸ、ＬｅＹ、Ｈ－２、Ｂ－１、Ｂ－２抗原が含まれるが、これらに限定されない。

【0050】

特定の実施形態において、１つより多くのがんおよび／または腫瘍抗原が、同じＣＡＲ発現Ｔ細胞によって結合され得、例えば、Ｔ細胞の１つのＣＡＲのＭＡＧＥ抗原への結合は、メラニンＡ、チロシナーゼ、またはｇｐ１００などの別の抗原へのＴ細胞の別のＣＡＲの結合と組み合わせることができる。例えば、ＣＤ２０は、悪性および非悪性Ｂ細胞の両方の表面に見られる汎Ｂ抗原であり、これは、非ホジキンリンパ腫の治療のための免疫療法抗体のための非常に効果的な標的であることが証明されている。この点で、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６およびＣＤ７などの汎Ｔ細胞抗原もまた、本発明の意味の範囲内の腫瘍関連抗原を含む。さらに他の例示的な腫瘍関連抗原は、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＵＣ－１、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７、ＴＡＧ－７２、ＣＥＡ、Ｌ６－抗原、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＨＬＡ－ＤＲ、ＥＧＦ受容体およびＨＥＲ２受容体を含むが、これらに限定されない。多くの場合、これらの抗原のそれぞれに対する免疫反応性抗体（および／または免疫反応性抗原結合フラグメント）が文献において報告されている。

【0051】

実施形態において、キメラ抗原受容体の２つの鎖は、１つの核酸導入遺伝子によってコードされる。２つの鎖は自己切断ペプチド配列によって連結することができる。あるいは、２つの鎖をコードする２つの配列は、ＩＲＥＳを含む核酸配列を介して連結され、その結果、２つの鎖は別々に翻訳され得る。導入遺伝子の発現は、構成的に活性化されたプロモーターまたは誘導性プロモーターによって調節することができる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子の発現は、リンパ球の活性化状態によって誘導され得る。他の場合、導入遺伝子は、統合能力のあるガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス、ＤＮＡ転位などを介してリンパ球に導入することができる。

【0052】

上記の遺伝子改変リンパ球は、投与のために適した医薬組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、一般に、実質的に単離／精製されたリンパ球および対象への投与のために適した型の薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定することができる。医薬組成物は、一般に、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤されている。

【0053】

組成物、担体、希釈剤、および試薬に言及される「薬学的に許容される」という用語は、交換可能に使用され、組成物の投与を妨げる程度まで望ましくない生理学的効果を生じることなく、対象にまたは対象への投与が可能である材料を含む。例えば、「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に安全で、毒性がなく、望ましい医薬組成物を調製する際に有用である賦形剤を含み、獣医学的な使用ならびにヒトの医薬の使用に許容される賦形剤を含む。

【0054】

そのような担体または希釈剤の例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および化合物の使用は、当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または化合物が開示された組成物と適合しない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が企図される。いくつかの実施形態において、抗がんまたは抗腫瘍などの第２の治療薬もまた、医薬組成物に組み込まれ得る。

【0055】

注射用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、かつ界面活性剤の使用によって維持することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、上記のように遺伝子改変されたリンパ球、および任意選択で凍結防止剤（例えば、グリセロール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ）を含む。

【0056】

本明細書に記載の組成物または医薬組成物は、キットで提供することができる。一実施形態において、キットは、（ａ）組成物を含む容器、および任意選択で（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載の方法および／または治療的利益のための薬剤の使用に関連する説明的、教育的、マーケティングまたは他の資料であり得る。例えば、キットは、製造、使用される治療レジメン、および投与期間についての指示を含み得る。一実施形態において、キットはまた、追加の治療薬（例えば、チェックポイントモジュレーター）を含む。キットは、それぞれが異なる試薬を伴う１つ以上の容器を含むことができる。例えば、キットは、組成物を含む第１の容器と、追加の治療薬のための第２の容器とを含む。

【0057】

容器は、単位用量の医薬組成物を含むことができる。組成物に加えて、キットは、溶媒または緩衝液、アジュバント、安定剤、または防腐剤などの他の成分を含むことができる。キットは、任意選択で、組成物の投与に適したデバイス、例えば、注射器または他の適切な送達デバイスを含む。デバイスは、薬剤の一方または両方を事前にロードして提供することも、空にすることもできるが、ロードに適している。

【0058】

組成物を調製するための方法
一般に、本発明の実施は、他に示されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ技術、免疫学（例えば、抗体技術）、発現系（例えば、無細胞発現、ファージディスプレイ）、リボソームディスプレイ、およびＰＲＯＦＵＳＩＯＮ）、および当技術分野の技術の範囲内であり、文献で説明されている任意の必要な細胞培養の従来の技術を使用する。本発明の特定の態様は、組換えＲＮＡレトロウイルス（例えば、レンチウイルスＨＩＶ－２、ＳＩＶなど）の組成物および使用に関するが、分子クローニングは、プロウイルスＤＮＡクローンを使用して行うことができ、したがって、標準的なクローニング技術の使用を可能にする。合成オリゴデオキシヌクレオチドによるインビトロでの部位特異的変異誘発は、当技術分野で知られている方法に従って実施することができる。特に本発明の融合タンパク質、例えば、ＣＡＲの合成に使用される遺伝子融合は、一般にＰＣＲ増幅中での融合プライマー（これは、任意選択で変異原性である）の使用に依存する遺伝子ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）法などの当技術分野で認められた方法によって行うことができる。（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．１９８９ Ｇｅｎｅ ７７：６１－６８、米国特許第５，０２３，１７１号）。ＰＣＲ技術によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、製造業者の説明書に従ってＤＮＡサーマルサイクラーを使用して実行することができる。

【0059】

ヌクレオチド配列の検証は、配列決定によって実施することができる。本発明の単一のベクター内に含まれていた、かつおそらくまだ含まれている２つの相同ポリペプチド間で相同組換え事象が起こったかどうかの検証は、ノーザンブロットおよび／またはＲＴ－ＰＣＲ法（例えば、単離されたレトロウイルスゲノム内で直接評価される場合）、サザンブロットおよび／またはＰＣＲ法（例えば、統合されたレトロウイルスベクターを含む宿主細胞ゲノムＤＮＡで評価される場合）、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥとそれに続くウエスタンブロットおよび／または免疫沈降とそれに続くＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび標識されたポリペプチドの検出（例えば、相同ポリペプチドが識別可能なサイズであり、かつ／または識別可能なドメイン、特徴および／もしくはエピトープを含む場合）を含むがこれらに限定されない任意の当技術分野で認められた方法によって実施することができる。

【0060】

いくつかの実施形態は、縮重したコドンを有する２つ以上の同一または高度に相同な分子をコードするレトロウイルスベクターを作製することを含む。ＤＮＡ組換え事象の可能性を低減するためにサイレント突然変異アプローチを利用する縮重コドンを有する２つ以上の同一または高度に相同な分子をコードするレトロウイルスベクターを作製するための方法は、以前に、例えば、米国特許第９，２０６，４４０号およびＩｍ ＥＪ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｉｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｖｉａ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｃｏｄｏｎ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１４）Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４０２２）に記載されている。これらの引用文献は参照により組み込まれる。

【0061】

別の態様において、本開示は、上記の組成物を調製する方法を提供する。この方法は、（ａ）複数のリンパ球を提供すること、（ｂ）複数のリンパ球に第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を導入して、複数の遺伝子操作されたリンパ球を得ること、ならびに（ｃ）細胞培養培地中で複数の遺伝子操作されたものを拡大することを含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、この方法は、（ａ）複数のリンパ球を提供すること、（ｂ）複数のリンパ球に、それぞれ第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子および第２の核酸分子を導入し、それによって複数の遺伝子操作されたリンパ球を得ること、ならびに（ｃ）細胞培養培地中で複数の遺伝子操作されたものを拡大することを含み得る。いくつかの実施形態において、この方法は、第１の核酸を導入する工程に続く細胞培養培地における第１の複数のリンパ球の拡大、または第２の核酸を導入する工程に続く細胞培養培地における第２の複数のリンパ球の拡大をさらに含み得る。

【0063】

上記のリンパ球の腫瘍特異的遺伝子改変サブセットの組成物を得るための方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。より具体的な型の方法は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８０３４３に開示されているものであり得、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0064】

「培養」または「拡大」という用語は、細胞が増殖し、老化を回避することができる条件下で細胞を維持することを指す。例えば、細胞は、任意選択で、１つ以上の成長因子、すなわち成長因子カクテルを含む培地で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、規定された細胞培養培地である。細胞培養培地は、新抗原ペプチドを含み得る。細胞の継続的な増殖を可能にするために、安定した細胞株を確立することができる。

【0065】

リンパ球
リンパ球の拡大および遺伝子改変の前に、対象からのリンパ球の供給源が得られる。リンパ球は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得ることができる。本明細書に記載されるように、当技術分野で利用可能な任意の数のリンパ球系統を使用することができる。リンパ球は、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（商標）分離などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。個人の循環血球は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス生成物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂリンパ球、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスによって収集された細胞は、血漿画分を除去するために洗浄され、その後の処理工程のために適切な緩衝液または培地に細胞を配置することができる。細胞はＰＢＳで洗浄することができる。あるいは、洗浄溶液はカルシウムを欠いていてもよく、マグネシウムを欠いていてもよく、またはすべてではないにしても、多くの二価陽イオンを欠いていてもよい。当業者であれば容易に理解されるように、洗浄工程は、半自動連続フロー遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはｅ１Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を使用して、製造元の指示に従って行った。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ２＋非含有、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または緩衝液を含むかもしくは含まない他の生理食塩水などに再懸濁することができる。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培地に直接再懸濁することができる。

【0066】

本明細書に記載されるように、リンパ球は、赤血球の溶解および単球の枯渇によって、例えば、パーコール勾配による遠心分離または向流遠心水簸によって、末梢血から単離され得る。必要に応じて、Ｔリンパ球（すなわち、Ｃｄ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、またはＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔリンパ球）などの特定の亜集団リンパ球を、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。例えば、Ｔリンパ球は、所望のＴリンパ球のポジティブ選択のために、十分な時間（すなわち、３０分から２４時間）、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどのコンジュゲート抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ（すなわち、３ｘ２８）とインキュベートすることによって単離することができる。白血病患者からのＴリンパ球の単離の場合、２４時間など、より長いインキュベーション時間の使用は、細胞のパフォーマンスを増加させることができる。腫瘍組織または免疫無防備状態の個体からＴＩＬを単離するなど、他の細胞タイプと比較してＴリンパ球が少ない状況では、より長いインキュベーション時間を使用してＴリンパ球を分離することができる。当業者は、複数ラウンドの選択もまた使用することができることを認識する。選択手順を実行し、活性化および拡大プロセスにおいて「選択されていない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞は、新しい選択のラウンドを受けることもできる。

【0067】

ネガティブ選択によるリンパ球（例えば、Ｔリンパ球）の集団の富化は、ネガティブ選択された細胞の独特な表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせで実行することができる。１つの方法は、ネガティブ選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞の選別および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によるＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。あるいは、制御性Ｔリンパ球は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法によって枯渇する。

【0068】

刺激のためのリンパ球はまた、洗浄工程後に凍結され得る。理論に拘束されないことを望むが、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団の顆粒球およびある程度は単球を除去することにより、より均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させることができる。多くの溶液および凍結パラメータが当該分野で公知であり、この状況において有用であるが、一方の方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース ヒトアルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含む細胞培地、または他の適切な細胞凍結培地、例えばＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａの使用を含む。次いで、細胞を１℃／分の速度で－８０℃まで凍結させ、液体窒素保管タンクの気相中に保存する。他の凍結を制御する方法を使用してもよく、かつ－２０℃または液体窒素中で制御されずに直ちに凍結される方法を使用してもよい。

【0069】

特定の態様において、凍結保存された細胞を解凍し、本明細書に記載のように洗浄し、室温で１時間静置してから本発明の方法を使用して活性化させてもよい。本明細書に記載されるように、リンパ球は、拡大され、凍結され、後で使用され得る。本明細書に記載されるように、サンプルは、本明細書に記載されるような特定の疾患の診断の直後であるが、任意の治療の前に患者から収集され得る。細胞は、任意の数の関連する治療様式の前に対象の血液サンプルまたはアフェレーシスから単離され、治療様式には、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射などの他の免疫除去剤による治療を含むがこれらに限定されない。これらの薬剤は、カルシウム依存性カルシニューリンホスファターゼを阻害する（例えば、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または成長因子によって誘導されるシグナル伝達のために重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１，１９９１、Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．，５：７６３－７７３，１９９３）。細胞は患者から単離され、骨髄または幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、放射線療法外部ビーム（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用したＴリンパ球アブレーションによる療法と一緒に、後で使用するために（例えば、その前に、同時に、またはその後に）、凍結され得る。本明細書に記載されるように、細胞は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢリンパ球のアブレーションによる療法後の治療において、後で使用するために、前に単離することができ、かつ凍結することができる。

【0070】

望ましい導入遺伝子を発現するためのリンパ球の遺伝子改変の前または後のいずれかで、リンパ球は、一般的には、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願第２００６／０１２１００５号に記載されているものなどの方法を使用して、活性化および拡大することができる。

【0071】

ベクター
導入遺伝子は、様々な方法を使用してリンパ系細胞に導入することができる。これらの方法には、統合に適合性であるガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス、およびＤＮＡ転位を使用した細胞の形質導入が含まれるが、これらに限定されない。

【0072】

導入遺伝子の発現には多種多様なベクターを使用することができる。特定のウイルスが受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞に感染もしくは侵入する能力、および宿主細胞ゲノムに統合されてウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力のために、それらは外来核酸を細胞に移入する魅力的な候補となっている。したがって、特定の実施形態において、ウイルスベクターを使用して、１つ以上の導入遺伝子またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞に導入する。ウイルスベクターは、１つ以上の制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の導入遺伝子またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、ウイルスベクターは制御配列を含まない場合があり、代わりに、宿主細胞内の制御配列に依存して、導入遺伝子またはそのフラグメントの発現を駆動する。核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例は、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびレトロウイルスベクターを含む。

【0073】

例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、１つ以上の導入遺伝子またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞に導入することができる。ＡＡＶ系は以前に記載されており、当該技術分野で一般的に周知である（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－７，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４－６０９８，１９９２、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４，１９９４、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９，１９９２）。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号に記載されており、それぞれ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0074】

いくつかの実施形態において、レトロウイルス発現ベクターを使用して、１つ以上の導入遺伝子またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を、発現のために宿主細胞に導入することができる。これらの系は以前に記載されており、当該技術分野で一般的に周知である（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４－５１３，１９８８、Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８，１９８６）。哺乳動物細胞における真核生物発現のためのベクターの例は、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、β－アクチンなどのプロモーターを使用する、ＡＤ５、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、Ｐｂｐｖなど、およびワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルス系に由来するベクターを含む。

【0075】

レトロウイルスと適切なパッケージング株との組み合わせも有用であり得、キャプシドタンパク質が標的細胞を感染させるために機能する。通常、細胞およびウイルスは培養培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされる。細胞は、次いで、いくつかの用途において短期間、例えば２４～７３時間、または少なくとも２週間、培養培地中で増殖させられ、分析前に５週間以上増殖させられ得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターには「欠陥がある」、すなわち、増殖感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖が必要である。レトロウイルスの宿主細胞特異性は、エンベロープタンパク質ｅｎｖ（ｐｌ２０）によって決定される。エンベロープタンパク質は、パッケージング細胞株によって提供される。エンベロープタンパク質には、同種指向性、両種指向性、異種指向性の少なくとも３つの種類がある。同種指向性エンベロープタンパク質をパッケージングされたレトロウイルス、例えばＭＭＬＶは、ほとんどのマウスおよびラットの細胞型に感染することができる。同種指向性パッケージング細胞株はＢＯＳＣ２３を含む。両種指向性エンベロープタンパク質を有するレトロウイルス、例えば４０７０Ａは、ヒト、イヌ、およびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型に感染することができる。両種指向性パッケージング細胞株は、ＰＡ１２およびＰＡ３１７を含む。異種指向性エンベロープタンパク質をパッケージングされたレトロウイルス、例えばＡＫＲ ｅｎｖは、マウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型に感染することができる。ベクターは、例えば、Ｃｒｅ／Ｌｏｘなどのリコンビナーゼ系を使用して後に除去されなければならない遺伝子を含み得るか、または、それらを発現する細胞は、例えばヘルペスウイルスＴＫ、ＢＣＬ－ｘｓなどの選択的毒性を可能にする遺伝子を含むことによって破壊される。適切な誘導性プロモーターは、トランスフェクトされた細胞またはその子孫のいずれかである、所望の標的細胞型において活性化される。

【0076】

有用なベクターの非限定的な例には、レトロウイルスベクターＳＦＧ．ＭＣＳ、およびヘルパープラスミドＲＤ１１４、Ｐｅｇ－Ｐａｍ３（Ａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１５ Ｊａｎ ２；１２５（１）：１５７－１６８）、レンチウイルスベクターｐＲＲＬ、およびヘルパープラスミドＲ８．７４およびｐＭＤ２Ｇ（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１２２５９）。いくつかの実施形態において、眠れる森の美女（ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾンシステムを使用することができる（Ｄｅｎｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．Ｊｕｎ；２４（６）：１０７８－１０８９）。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、細胞が小さな開口部を通過するときに細胞を変形させ、細胞膜を破壊し、材料を細胞に挿入することを可能にすること、例えば、エレクトロポレーション（Ｘｉａｏｊｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，８（７）：５１４－５２６）、またはＣｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）法を介して細胞に導入することができる。導入遺伝子をコードするＲＮＡのそのようなエレクトロポレーション法は、細胞内でのそのような導入遺伝子の一過性発現を可能にし、これは、操作された細胞の毒性および他の望ましくない影響を制限することができる（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｄｅｃ；２２（１２）：１５７５－１５８６）。

【0077】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。外因性ベクターおよび／または核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0078】

宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質系システムなどのコロイド分散系が含まれる。インビトロおよびインビボでの放出ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0079】

非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（インビトロ、エキソビボまたはインビボ）のために、脂質製剤の使用が企図されている。別の態様において、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合する核酸は、リポソームの脂質二重層内に点在するリポソームの水性内部にカプセル化され、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散され、脂質と混合され、脂質と合わされ、脂質中の懸濁液として含有され、ミセルに含有もしくはミセルと複合体化されるか、または他のやり方で脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造、ミセル、または「崩壊」構造で存在し得る。それらは単に溶液中に散在し得、おそらく、サイズまたは形状が一様でない凝集物を形成する。脂質は、天然または合成脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。

【0080】

使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができる。ジセチルリン酸（「ＤＣＰ」）はＫ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質ストック溶液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも蒸発しやすいため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、二重層または密閉された脂質凝集体の生成によって形成される多様な独特かつ多重層の脂質媒体を包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質の二重層膜および内部水性媒体を備えた小胞構造を有するものとして特徴付けることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された脂質の複数の層を有する。リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁させると、それらは自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を受け、脂質二重層の間に溶存水および溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質はミセル構造をとるか、または脂質分子の不均一な凝集体として単に存在する可能性がある。リポフェクタミン－核酸複合体もまた企図される。

【0081】

外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換えＤＮＡ配列の存在は、一連の試験によって確認することができる。このようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロット、ＲＴ－ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出するなどの「生化学」アッセイが含まれる。

【0082】

治療の方法
上記の薬剤（例えば、ベクターおよび細胞）は、様々な疾患の治療における免疫療法剤として使用することができる。したがって、本開示はさらに、感染症、がんまたは腫瘍などの障害の方法を提供する。この方法は、治療有効量の組成物または医薬組成物を、それを必要とする対象に上記のように投与することを含む。

【0083】

本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、対象が何らかの形態の治療を受けてきているかまたは現在受けているかに関係なく、交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、「対象（複数可）」という用語は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、チンパンジーなどのサル）およびヒト）を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物を指し得る。対象はヒトまたは非ヒトであり得る。より例示的な態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象はがんを有する。いくつかの実施形態において、対象は免疫が枯渇している。

【0084】

がん
いくつかの実施形態において、上記の薬剤（例えば、ベクターおよび細胞）は、がんまたは腫瘍を治療する際の免疫療法剤として使用することができる。本明細書で使用される場合、「がん」、「腫瘍」、および「悪性腫瘍」はすべて、組織または器官の過形成に同等に関連している。組織がリンパ系または免疫系の一部である場合、悪性細胞には循環細胞の非固形腫瘍が含まれ得る。他の組織または器官の悪性腫瘍は固形腫瘍を産生し得る。本発明の方法は、リンパ系細胞、循環免疫細胞、および固形腫瘍の治療において使用することができる。

【0085】

治療することができるがんには、血管新生されていない、または実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生された腫瘍が含まれる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病およびリンパ腫などの血液腫瘍）を含む場合もあれば、固形腫瘍を含む場合もある。本発明の組成物で治療されるがんのタイプには、がん腫、芽細胞腫および肉腫、ならびに特定の白血病または悪性リンパ性腫瘍、良性および悪性の腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）および悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、例えば、肉腫、がん腫、および悪性黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がんおよび小児の腫瘍／がんもまた含まれる。

【0086】

血液がんは、血液または骨髄のがんである。血液（または血行性）がんの例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、および慢性リンパ性白血病など）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、および骨髄異形成が含まれる。

【0087】

固形腫瘍は、通常は嚢胞または液体領域を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。様々なタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、がん腫、リンパ腫など）にちなんで名付けられている。肉腫およびがん腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫および他の肉腫、滑膜、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、リンパ系悪性腫瘍、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、甲状腺髄様がん、甲状腺乳頭がん、褐色細胞腫の皮脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、髄質がん、気管支原性がん腫、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛腫、ウィルムス腫瘍、頸部がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱がん、悪性黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫など）（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、膠芽細胞腫（また、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫 頭蓋咽頭腫（Ｓｃｈｗａｎｎｏｍａ ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、および脳転移）が含まれる。

【0088】

上記の薬剤は、例えば、感染性疾患の抗原を認識するＣＡＲを利用する手順において、感染性疾患の治療における免疫療法薬としても使用することができる。したがって、本明細書に記載のポリペプチドは、感染性疾患抗原の多数の形態のいずれかに結合し、それにより、結合時に感染性疾患抗原に対する免疫応答を誘導するように作製することができる。本明細書に記載のＣＡＲが結合するように設計することができる感染性疾患抗原には、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、および微生物毒素が含まれるが、これらに限定されない。抗原の各クラスの例示的な形態は、以下でより詳細に検討される。

【0089】

細菌
本発明のポリペプチドまたはＣＡＲが結合し得る細菌（具体的には、そのエピトープ）の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｅｎｔｅｒｉｄｔｉｄｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ３４５２Ａ相同性グループ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ。特定の実施形態において、本発明の構築物は、ブドウ球菌プロテインＡに結合する結合分子を含む。

【0090】

ウイルス
本発明のポリペプチドまたはＣＡＲによって結合され得るウイルス（またはそのエピトープ）の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ポリオーマウイルスＪＣ（ＪＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ Ｉ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス血球凝集素（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０２１３２；Ａｉｒ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：７６３９－７６４３；Ｎｅｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２８：４９５－５０１）、ヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ３３４２９；Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７６８３）、麻疹ウイルス血球凝集素（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８１８９９；Ｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：１３５－１４２）、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１４９２３；Ｂｚｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５：３２２－３３３）、ポリオウイルスＩ ＶＰ１（Ｅｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：６９９）、ＨＩＶ Ｉのエンベロープ糖タンパク質（Ｐｕｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３９２－１３９５）、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１９、Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｖａｃｃｉｎｅ ４：３４）、ジフテリア毒素（Ａｕｄｉｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２８９：５４３）、連鎖球菌２４Ｍエピトープ（Ｂｅａｃｈｅｙ，１９８５，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１８５：１９３）、淋菌性ピリン（ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ ｐｉｌｉｎ）（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ａｎｄ Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ，１９８５，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１８５：２４７）、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎マトリックスタンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ保護抗原、ウシウイルス性下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素ニューラミニダーゼ、ブタインフルエンザ血球凝集素、ブタインフルエンザニューラミニダーゼ、口蹄疫ウイルス、豚コレラウイルス、豚インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス（例えば、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅまたは糖タンパク質Ｇ）、または感染性喉頭気管炎ウイルス（例えば、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ）、Ｌａ Ｃｒｏｓｓｅウイルスの糖タンパク質（Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｓｃａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２０：４２）、新生子牛下痢ウイルス（Ｍａｔｓｕｎｏ ａｎｄ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８３，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３９：１５５）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Ｍａｔｈｅｗｓ ａｎｄ Ｒｏｅｈｒｉｇ，１９８２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２７６３）、プンタトロウイルス（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｉｓｈｏｐ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｓ（ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ｐ．１６７）、マウス白血病ウイルス（Ｓｔｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１４：１８７）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（Ｍａｓｓｅｙ ａｎｄ Ｓｃｈｏｃｈｅｔｍａｎ，１９８１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１５：２０）、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質および／またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはそのフラグメントまたは誘導体（例えば、１９８０年６月４日に公開された英国特許公開第ＧＢ２０３４３２３Ａ号を参照、Ｇａｎｅｍ ａｎｄ Ｖａｒｍｕｓ，１９８７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６５１ ６９３、Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４８９ ４９５）、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルス（例えば、ウマインフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ニューラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ニューラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ニューラミニダーゼウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルスＩ型糖タンパク質Ｄ、ウシ呼吸器合胞体ウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスの抗原（例えば、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク質（ＢＲＳＶ Ｇ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ Ｆ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、ウシパラインフルエンザウイルス３型血球凝集素ニューラミニダーゼ）、ウシウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質４８または糖タンパク質５３、Ａ型肝炎、インフルエンザ、バリセラ、アデノウイルス、単純ヘルペスＩ型（ＨＳＶ Ｉ）、単純ヘルペスＩＩ型（ＨＳＶ ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ ＩＩ）、任意のピコルナウイルス科、エンテロウイルス、カリシウイルス科、ノーウォークグループのいずれかのウイルス、トガウイルス、例えばアルファウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アリーナウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞白血病ウイルス型ＩＩ、サル免疫不全ウイルス、レンチウイルス、ポリオーマウイルス、パルボウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、セルコピテシンヘルペスウイルスＩ（Ｂウイルス）、およびポックスウイルス。

【0091】

特定の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはＣＡＲは、ＨＩＶに結合し、ウイルスベクターが投与される対象においてウイルスに対する免疫応答を誘導する。ＨＩＶの様々な抗原ドメイン（例えば、エピトープ）は当技術分野で知られており、そのようなドメインには、Ｇａｇ、Ｇａｇ－ポリメラーゼ、Ｇａｇ－プロテアーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、インテグラーゼ（ＩＮ）およびＥｎｖなどの構造ドメインが含まれる。ＨＩＶの構造ドメインは、多くの場合、ポリペプチド、例えばｐ５５、ｐ２４、ｐ６（Ｇａｇ）、ｐ１６０、ｐ１０、ｐ１５、ｐ３１、ｐ６５（ｐｏｌ、ｐｒｏｔ、ＲＴおよびＩＮ）、ならびにｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１（Ｅｍｓ）、またはＣｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって構築されたＯｇｐ１４０にさらに細分化される。そのようなポリペプチドの分子変異体はまた、本発明のポリペプチドまたはＣＡＲ、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７３およびＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７２に記載されるものなどの変異体による結合も標的とすることができる。

【0092】

真菌
本発明のポリペプチドまたはＣＡＲによって結合され得る真菌（またはそのエピトープ）の例には、Ｍｕｃｏｒ、Ｃａｎｄｉｄａ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来の真菌、例えば、Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｍｅｏｓｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒが含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

寄生虫
本発明のポリペプチドまたはＣＡＲによって結合され得る寄生虫（またはそのエピトープ）の例には、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｎ、Ｍａｌａｒｉａ、およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍが含まれるが、これらに限定されない。

【0094】

微生物毒素
本発明のポリペプチドまたはＣＡＲによって結合され得る微生物毒素（またはそのエピトープ）の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｒｏｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ ｓｐ．、およびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅによって産生される毒素が含まれるが、これらに限定されない。タチナタマメ由来のリシンなどの毒素、ならびに他の天然に存在する（例えば、生物によって産生される）毒素および人工毒素またはその一部もまた、本発明のポリペプチドまたはＣＡＲによって結合され得る。

【0095】

記載されているように、医薬組成物は、治療される（または予防される）疾患に適切な方法で投与することができる。投与の量および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定することができる。

【0096】

「免疫学的有効量」、「有効抗腫瘍量」、「有効腫瘍阻害量」または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個人差を考慮に入れて、医師によって決定され得る。一般的に、本明細書に記載されるリンパ球を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、例えば、１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重であり、これらの間隔の中の内のすべての値の整数を含む用量で投与することができることを言及することができる。リンパ球組成物はまた、これらの投与量で数回投与することができる。細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照）。特定の患者にとっての最適な用量および治療レジメンは、疾患の兆候について患者を監視し、それに応じて治療を調整することにより、医薬分野の当業者によって容易に決定することができる。

【0097】

本組成物の投与は、注入または注射（すなわち、静脈内、髄腔内、筋肉内、管腔内、気管内、腹腔内、または皮下）、経皮投与、または当技術分野で知られている他の方法を含む任意の便利な方法で実施することができる。投与は２週間に１回、１週間に１回、またはそれ以上の頻度で行うことができるが、疾患または障害の維持フェーズの間に頻度を減らすことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内注入によって投与される。

【0098】

特定の場合において、本明細書に記載の方法、またはリンパ球が治療レベルまで拡大される当技術分野で知られている他の方法を使用して活性化および増殖された細胞は、任意の数の関連する治療様式とともに患者に投与される。また、本明細書に記載されるように、リンパ球は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗がん抗体などの他の免疫除去剤と組み合わせて使用することができる。ＣＤ３または他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射。

【0099】

本発明の組成物はまた、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するＴリンパ球除去による療法、放射線療法外部ビーム（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体と一緒に（例えば、その前、同時に、またはその後に）、患者に投与することができる。また、本明細書に記載されるように、組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのＢリンパ球の除去療法の後に投与することができる。例えば、対象は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞の移植による標準的な治療を受けることができる。特定の場合においては、移植後、対象は、拡大リンパ球の注入を受けるか、または拡大リンパ球が手術の前または後に投与される。

【0100】

いくつかの実施形態において、この方法は、対象に第２の治療薬を投与することをさらに含んでもよい。第２の治療薬は抗がん剤または抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態において、組成物は、化学療法剤および免疫療法剤を含む第２の治療薬の前に、その後に、または同時に対象に投与される。

【0101】

いくつかの実施形態において、この方法は、治療有効量の免疫チェックポイントモジュレーターを投与することをさらに含む。免疫チェックポイントモジュレーターの例には、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＴＲＡＩＬが含まれる場合がある。チェックポイントモジュレーターは、同時に、別々に、または本発明の組成物と同時に投与することができる。

【0102】

「化学療法剤」は、がんの治療において有用な化合物である。化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムヌスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５－ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）））、クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。この定義には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）などの抗エストロゲン剤、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、ゼローダ、ゲムシタビン、ＫＲＡＳ変異共有阻害剤、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。追加の例には、イリノテカン、オキサリプラチナム、およびその他の標準的な結腸がんレジメンが含まれる。

【0103】

「免疫療法剤」は、がんの治療において有用な生物学的薬剤である。免疫療法剤の例には、アテゾリズマブ、アベルマブ、ブリナツモマブ、ダラツムマブ、セミプリマブ、デュルバルマブ、エロツズマブ、ラヘルパレプベック、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ、セツキシマブ、およびタリモジーンが含まれる。

【0104】

以下の実施例では、上記の１つのアプローチを使用して、ＨＬＡ－Ａ０２０１の状況においてＮＹ－ＥＳＯ－１に対して高い親和性および特異性を保持するＴＣＲベースのキメラ抗原受容体を用いてＴ細胞を操作することを通して、ＨＬＡ－Ａ０２０１の状況において、腫瘍関連抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１を発現するがんについての養子免疫療法の有効性を高めている。

【0105】

ＮＹ－ＥＳＯ－１は、通常、胎児および精巣組織でのみ発現するタンパク質であるが、一部の固形悪性腫瘍によって異常に発現される。これにより、ＮＹ－ＥＳＯ－１が、生殖細胞系列で適切に発現し、一部のがんによって異常に発現する分子のリストに追加された。これらの分子は「がん／精巣」抗原と呼ばれ、抗原指向免疫療法の標的として機能することができる。がん精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１は多くの固形腫瘍によって発現され、成熟した体細胞組織では発現が制限されているため、腫瘍免疫療法の非常に魅力的な標的となっている。操作したＴ細胞を使用してＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とすることは、一部の成人腫瘍の治療において臨床的有効性を実証してきた。

【0106】

このアプローチには、（１）ＴＣＲ共刺激シグナル伝達要素をＣＡＲ設計において統合すること、（２）コードされたポリペプチド配列を維持しながら、２つの核酸配列間の相同性を低減させる目的で縮重コドンを使用して外因性核酸配列のうちの１つをサイレント変異させることによって、同一のポリペプチド配列をコードする２つ以上の核酸配列を含むベクター核酸配列を作製すること、（３）ヒトＣＤ２８、またはヒト４－１ＢＢ、またはその２つの組み合わせのＴＣＲ共刺激シグナル伝達要素の繰り返し単位を統合すること、および（４）同じＴＣＲ－ＣＡＲ構築物に同じかまたは異なる膜貫通ドメインを含めること、が含まれる。そのようなＣＡＲ遺伝子の特定の核酸配列もまた開示されている。このアプローチは、ＴＣＲ－ＣＡＲを介した刺激を介してＴＣＲ－ＣＡＲを発現するＴ細胞の活性化を増強するために、１Ｇ４ １９５ＬＹ ＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖のＥＣドメインを利用すること、ならびにＴＣＲシグナル伝達要素ＣＤ３ＺまたはＣＤ３Ｅを共刺激要素ＣＤ２８または４－１ＢＢと、あるいはＣＤ２８および４－１ＢＢの組み合わせと一緒に組み込むことにより、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１特異性を有するＴＣＲベースのＣＡＲを作製した。これは、患者の抗腫瘍活性の増加につながる。

【0107】

定義
Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、Ｔ細胞またはＴリンパ球の表面に見出されるタンパク質複合体であり、ＭＨＣ分子に結合したペプチドとして抗原のフラグメントを認識する役割を果たす。ＴＣＲと抗原ペプチドとの間の結合は比較的親和性が低く、縮退している。つまり、多くのＴＣＲが同じ抗原ペプチドを認識し、多くの抗原ペプチドが同じＴＣＲによって認識される。Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴＣＲを有している。ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖で構成されている。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％でＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされている）からなるのに対して、Ｔ細胞の５％ではＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる（それぞれＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）。この比率は、個体発生中および病的状態（白血病など）で変化する。これはまた、種によっても異なる。ＴＣＲの各鎖は、可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域の２つの細胞外ドメインで構成されている。定常領域は細胞膜の近位にあり、膜貫通領域および短い細胞質尾部が続くのに対して、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。本発明の目的のために、「Ｔ細胞受容体鎖の定常領域またはその一部」という用語はまた、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域が（Ｎ末端からＣ末端まで）存在し、続いて、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域に天然に連結されている膜貫通領域および細胞質尾部などの、膜貫通領域および細胞質尾部が存在する実施形態も含む。

【0108】

本明細書で使用される「抗原受容体」または「抗原認識受容体」という用語は、抗原結合に応答して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化することができる受容体を指す。特に、「抗原受容体」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞に任意の特異性を付与する、操作された受容体を含む。本発明による抗原受容体は、例えば、Ｔ細胞自身のＴ細胞受容体の代わりに、またはそれに加えて、Ｔ細胞上に存在し得る。そのようなＴ細胞は、標的細胞の認識のために必ずしも抗原の処理および提示を必要としないが、むしろ、好ましくは、標的細胞上に存在する任意の抗原を特異的に認識し得る。好ましくは、上記抗原受容体は、細胞の表面に発現される。具体的には、この用語は、（例えば、標的細胞の表面上に発現された抗原への、抗原結合部位または抗原結合ドメインの結合によって）標的細胞上の標的構造（例えば、抗原結抗原）を認識し、すなわち、それに結合し、細胞表面に上記抗原受容体を発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に特異性を付与し得る、単一の分子または複合体の人工または組換え受容体を含む。好ましくは、抗原受容体による標的構造の認識は、上記抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。抗原受容体は、１つ以上のタンパク質単位を含み得、上記タンパク質単位は、本明細書に記載されるような１つ以上のドメインを含む。「抗原受容体」という用語は、好ましくは、天然に存在するＴ細胞受容体を含まない。本発明によれば、「抗原受容体」という用語は、好ましくは、「キメラ抗原受容体」、「キメラＴ細胞受容体」および「人工Ｔ細胞受容体」という用語と同義である。

【0109】

例示的な抗原認識受容体は、ネイティブのもしくは遺伝子操作されたＴＣＲ、または遺伝子操作されたＴＣＲ様ｍＡｂ（Ｈｏｙｄａｈｌ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９ ８：３２）、または腫瘍抗原結合ドメインが免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化可能な細胞内シグナル伝達ドメインに融合されているＣＡＲであり得る。特定のがん抗原に対するネイティブＴＣＲを発現するＴ細胞クローンは以前に開示されている（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９９２ １７６：１４５３－７、Ｏｔｔａｖｉａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００５ ５４：１２１４－２０、Ｃｈａｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９ １６３：２９２８－３６、Ｌｕｉｔｅｎ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，２０００ ５５：１４９－５２、ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４ ２４：３０３８－４３、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９ １６２：６８４９－５４、Ｍａ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，２００４ １０９：６９８－７０２、Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００９ ６９：１０４６－５４、Ａｙｙｏｕｂ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２ １６８：１７１７－２２、Ｃｈａｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００１ ３１：１９１０－１６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００７ ５６：８０７－１８、Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００ ６０：６２７２－７５、Ｃｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０ ６０：２３－２５、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００３ １７１：２１９－２５、Ｇｎｊａｔｉｃ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００３ １００：８８６２－６７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００４。

【0110】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、ポリペプチドのセットを指し、典型的には、最も単純な実施形態では２つであり、これは、免疫エフェクター細胞において、細胞に標的細胞に対する特異性および細胞内シグナル生成を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに、以下に定義する刺激分子および／または共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのセットは、互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのセットは、ダイマー化分子の存在時に、ポリペプチドを互いに結合することができ、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに結合することができるダイマー化スイッチを含む。一態様において、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体（例えば、ＣＤ３ゼータ）に関連するゼータ鎖である。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一態様において、細胞質シグナル伝達ドメインは、以下に定義されるように、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様において、共刺激分子は、本明細書に記載の共刺激分子、例えば、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／またはＣＤ２８から選択される。

【0111】

「ＴＣＲベースのＣＡＲ」または「ＴＣＲ－ＣＡＲ」という用語は、ＴＣＲα、β、γ、またはδ鎖あるいはそれらの抗原結合部分によって形成される抗原結合ドメインを含むＣＡＲを指す。

【0112】

「刺激分子」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＢ細胞）によって発現される分子を指し、これは、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともいくつかの側面について、刺激的な方法で免疫細胞の活性化を調節する細胞質シグナル伝達配列を提供する。一態様において、シグナルは、例えば、ペプチドがロードされたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって開始される一次シグナルであり、これは、増殖、活性化、分化などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞応答の媒介をもたらす。刺激的な様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列（「一次シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明で特に有用な細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例には、ＣＤ３ゼータ、一般的なＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃＲβ（ＦｃεＲ１ｂ）、ＣＤ３γ、ＣＤ３Δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明の任意の１つ以上のＣＡＲＳにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列は、本明細書で提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などからの同等の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３－ゼータの一次シグナル伝達配列は、本明細書で提供される配列、または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯動物、サル、類人猿などからの同等の残基である。

【0113】

「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、増殖などであるがこれに限定されない、Ｔ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、トールリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが含まれるがこれらに限定されない。

【0114】

共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、またはネイティブ細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはその機能的フラグメントもしくは誘導体を含むことができる。

【0115】

本明細書で使用される場合、２つのポリペプチド（または核酸）配列が「実質的に異なる」とは、２つの配列が９５％未満（例えば、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、または５０％）互いに同一であることを意味する。

【0116】

本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、野生型と実質的または有意な配列同一性または類似性を有する修飾ポリペプチドまたはタンパク質または導入遺伝子を指し、そのような機能的変異体は、変異体であるタンパク質または導入遺伝子で、野生型ポリペプチドの生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドまたはタンパク質または導入遺伝子の機能的変異体が使用される。

【0117】

本発明に開示されるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の保存的修飾または機能的同等物は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のポリペプチド誘導体、例えば、１つ以上の点突然変異、挿入、欠失、短縮、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を指す。それは、親ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（本発明に開示されるものなど）の活性を実質的に保持している。一般に、保守的修飾または機能的均等物は、少なくとも６０％（例えば、両端を含む、６０％～１００％までの任意の数、例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％を含む）親（例えば、本明細書に記載のもののうちの１つ）と同一である。したがって、本発明の範囲内にあるのは、１つ以上の点突然変異、挿入、欠失、短縮、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせを有するヒンジ領域である。

【0118】

アミノ酸置換は、場合によっては、（ａ）置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対する効果が大幅には異ならない置換を選択することによって行うことができる。例えば、天然に存在する残基は、側鎖の特性に基づいて群に分割することができる：（１）疎水性アミノ酸（ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）、（２）中性親水性アミノ酸（システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、およびグルタミン）、（３）酸性アミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、（４）塩基性アミノ酸（ヒスチジン、リジン、およびアルギニン）、（５）鎖の配向に影響を与えるアミノ酸（グリシンおよびプロリン）、および（６）芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）。これらの群の中で行われる置換は、保存的置換とみなすことができる。置換の例として、限定されないが、アラニンに対するバリン、アルギニンに対するリジン、アスパラギンに対するグルタミン、アスパラギン酸に対するグルタミン酸、システインに対するセリン、グルタミンに対するアスパラギン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシンに対するプロリン、ヒスチジンに対するアルギニン、イソロイシンに対するロイシン、ロイシンに対するイソロイシン、リジンに対するアルギニン、メチオニンに対するロイシン、フェニルアラニンに対するロイシン、プロリンに対するグリシン、セリンに対するスレオニン、スレオニンに対するセリン、トリプトファンに対するチロシン、チロシンに対するフェニルアラニン、および／またはバリンに対するロイシンの置換が挙げられる。例示的な置換を下の表に示す。アミノ酸置換を親のタンパク質に導入し、親のタンパク質の生物活性の保持について生成物をスクリーニングすることができる。

【表2】

【0119】

本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性と同等である。２つの配列間のパーセント相同性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、後述の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。

【0120】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７（１９８８））を使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ重みは、または１、２、３、４、５、もしくは６の長さ重みを用いて決定することができる。

【0121】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子のフラグメントも意味する。そのようなフラグメントはまた、当技術分野でよく知られており、インビトロおよびインビボの両方で定期的に利用されている。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、よく知られている活性フラグメントｆ（ａｂ’）２、およびｆａｂも意味する。Ｆ（ａｂ’）２、およびインタクトな抗体のＦｅフラグメントを欠くｆａｂフラグメントは、より迅速に循環から除去され、インタクトな抗体の非特異的組織結合が少ない可能性がある（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６－３２５（１９８３）。本発明の抗体は、全ネイティブ抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；ｆａｂ、ｆａｂ’、単鎖ｖ領域フラグメント、融合ポリペプチド、および従来型ではない抗体を含む。

【0122】

本明細書で使用される場合、「単鎖可変フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という用語は、共有結合してＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーを形成する免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）は、直接結合されるか、ＶＨのｎ末端をＶＬのＣ末端に連結するか、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に連結する、ペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）によって結合される。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、ならびに溶解性のためにセリンまたはスレオニンが豊富である。定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持している。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：５８７９－５８８３，１９８８）によって記載されているように、ＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現させることができる。また、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号、ならびに米国特許公開第２００５／０１９６７５４号および同第２００５／０１９６７５４号を参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｏｎｔ）２００８ ２７（６）：４５５－５１、Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｃａｃｈｅｘｉａ ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ ｍｕｓｃｌｅ ２０１２ Ａｕｇ．１２、Ｓｈｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９ １８３（４）：２２７７－８５、Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００７ ９７（６）：９５５－６３、Ｆｉｆｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｓｔ ２００６ １１６（８）：２２５２－６１、Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７ ３（３）：１７３－８４、Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５ ２（１０：３１－４０）。刺激活性を有するアゴニストｓｃＦｖが記載されている（例えば、Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｉ Ｃｈｅｒｎ ２００３ ２５２７８（３８）：３６７４０－７、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９７ １５（８）：７６８－７１、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ １７（５－６）：４２７－５５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００３ １６３８（３）：２５７－６６）。

【0123】

本明細書で使用される場合、「治療すること」または「治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する病態、または障害に対する素因を、治癒する、軽減する、緩和する、治療する、その発症を遅延させる、予防する、または改善する目的での、障害を有する、または障害を発症するリスクがある対象への化合物または薬剤の投与を指す。

【0124】

「有効量」または「治療有効量」は、治療対象において医学的に望ましい結果を生み出すことができる化合物または薬剤の量を指す。治療法は、単独で、または他の薬物または治療法と組み合わせて、インビボまたはエクスビボで実施することができる。治療有効量は、１つ以上の投与、適用、または投薬量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。

【0125】

「有効量」、「有効用量」、または「有効投与量」という用語は、所望の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。薬物または治療薬の「治療有効量」または「治療有効投与量」は、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて使用された場合に、疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および持続期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは能力障害の予防によって証明される疾患の退行を促進する薬物の任意の量である。薬物の「予防有効量」または「予防有効投与量」は、疾患を発症するリスクまたは疾患を再発するリスクのある対象に単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与された場合に、疾患の発症または再発を抑制する薬物の量である。疾患の退行を促進する、または疾患の発症もしくは再発を抑制する治療薬または予防薬の能力は、熟練した開業医に既知の様々な方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイで薬剤の活性をアッセイすることによって、評価することができる。

【0126】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、組成物の生物学的活性または特性を無効にせず、比較的非毒性である担体または希釈剤などの材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与され得る。

【0127】

「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明の化合物（複数可）を、その意図される機能を果たし得るように対象内でまたは対象に運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される材料、組成物、または担体、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料を含む。典型的には、そのような化合物は、ある器官または体の一部から別の器官または体の一部に運搬または輸送される。各塩または担体は、製剤の他の成分と適合性があり、かつ対象に有害ではないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例として以下が挙げられる：ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；潤滑剤；結合剤；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；着香剤；芳香剤；防腐剤；抗酸化剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤（ｈａｒｄｅｎｅｒ）；硬化剤（ｓｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）；懸濁剤；界面活性剤；保湿剤；担体；安定剤；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質、またはそれらの任意の組み合わせ。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」はまた、化合物の活性と適合性があり、かつ対象に生理学的に許容される、ありとあらゆるコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤なども含む。補足的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。

【0128】

本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、１つ以上の値に適用される場合、記載された参照値と同様の値を指す。いくつかの実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から明らかでない限り、記載される参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれより低い範囲内にある値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。本明細書において別段の指示がない限り、「約」という用語は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能に関して同等である、記載された範囲に近い値、例えば、重量パーセントを含むことを意図する。値および範囲が本明細書で提供される場合は常に、これらの値および範囲に包含されるすべての値および範囲が、本発明の範囲内に包含されることを意味することを理解されたい。さらに、これらの範囲内にあるすべての値、および値の範囲の上限または下限もまた、本出願によって企図される。

【実施例】

【0129】

実施例１．抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲ－、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ－、抗メソテリンＣＡＲ－、およびＧＦＰベースのＭＦＧ－レトロウイルスベクターの構築
レトロウイルス構築物の構築
Ｔ細胞における目的の遺伝子の構成的発現のために、Ｍｕｌｌｉｇａｎ博士によって最初に開発されたＭＦＧレトロウイルスバックボーン（図１Ｃ）およびＳＦＧレトロウイルスバックボーン（米国特許第６，１４０，１１１号）の両方を使用して、目的の遺伝子、ヒトＮＹ－ＥＳＯ－１由来のペプチド／Ａ２複合体に特異的なネイティブ型のＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）またはＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２、ＮＴ３、ＮＴ４、ＮＴ５、ＮＴ６、ＮＴ２１、ＮＴ２２、ＮＴ２３、ＮＴ２４、ＮＴ２５、ＮＴ２６、ＮＴ２７、およびＴ２８）をコードする組換えレトロウイルスベクターを構築した。（図１Ａおよび１Ｂおよび表１）。

【表3】

【0130】

ＧＦＰは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）および／または蛍光顕微鏡によってＧＦＰベースのベクター形質導入Ｔ細胞を追跡するためのマーカーとして使用した。抗メソテリンベースのＣＡＲの構築のために、ヒトメソセリン（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＰＳ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９８；９５：６６９－７４）との親和性が高い抗ヒトメソセリンｓＦｖ（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＦ０３５６１７．１）を選択した。抗メソテリンのｓＦｖのそのような使用は、第２および第３世代の機能的な抗メソテリンＣＡＲを首尾よく作製する際に以前に記載された（Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９；１０６：３３６０－５）。

【0131】

核酸間の組換えは、分子生物学において十分に確立された現象である。関与する核酸配列間で強い配列相同性があることを必要とする遺伝子組換えは、一般に相同組換えと呼ばれる。ほとんどの遺伝子ノックアウト戦略は、標的ノックアウトを達成するために相同組換えを利用しているが、特定の系においては、遺伝子組換えの発生が遺伝子操作に悪影響を与える可能性がある。特に、相同組換え事象は、ベクター、特にウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなど）の構築および産生に悪影響を与える可能性があり、ここでは、高度に相同な配列（例えば、同一のポリペプチド配列）を、例えば、１つ以上の宿主細胞および／または生物を介したウイルスベクターの継代および／または増殖の間に、相同組換えのない単一の安定なウイルスベクター内に維持することがしばしば望ましい。

【0132】

核酸間の潜在的な相同組換えに関連するそのような問題を克服するためのベクター設計のために、以前に記載されたアプローチ（米国特許第９，２０６，４４０号）を採用したが、これは、単一のウイルスベクター上の単一のタンパク質分子の高度に相同な（例えば、同一の）ポリペプチドフラグメントをコードする２つ以上の核酸配列の送達を可能にすることである。そのようなアプローチでは、ヌクレオチド配列レベルでのサイレント突然変異法を利用して、２つ以上の高度に相同な（例えば、同一の）ポリペプチドまたはそのポリペプチドドメインをコードする核酸配列で構成されるが、例えば、宿主細胞における延長された継代および／または複数の感染、染色体統合、および／または切除事象の間でさえも、このような核酸配列間で相同組換えのリスクが低減されたウイルスベクター配列を生成する。

【0133】

ＨＬＡ－Ａ＊０２０１クラスＩ制限要素の状況で、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＮＹ－ＥＳＯ－１：１５７－１６５）の残基１５７から１６５に高い親和性で対応するペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）を認識する変異ＴＣＲは、以前に記載されている（Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１１；２９：９１７－２４、およびＲｏｂｂｉｎｓ ＰＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：６１１６－６１３１）。１Ｇ４－α９５ＬＹと呼ばれるこのＴＣＲは、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞に付与されたネイティブ１Ｇ４ ＴＣＲα鎖の第３の相補性決定領域に２つのアミノ酸置換を含み、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２０１陽性標的細胞を認識する能力が向上している。アルファ鎖全体およびベータ鎖（配列番号１および配列番号２）、またはＴＣＲ ＩＧ４－ａ９５ＬＹのそれらの細胞外ドメイン（配列番号４および配列番号５）は、最初に、ネイティブ型ＩＧ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）（配列番号９、６４）の２つの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたは２つのＴＣＲ－ＣＡＲ（ＩＧ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ）－ＣＡＲ）（ＮＴ２；ＩＧ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲベースのＣＡＲ－ＣＤ２８Ｚ（ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｚ）（配列番号１０）、およびＮＴ３、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２５）を認識するＩＧ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲベースのＣＡＲ－ＣＤ２８Ｅ（ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｅ）（配列番号１１）（図１および２）の世代を利用し、これらは、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１クラスＩ制限要素の状況で高い親和性でＮＹ－ＥＳＯ－１の残基１５７から１６５に対応する（ＮＹ－ＥＳＯ－１：１５７－１６５）。

【0134】

上記のＭＦＧレトロウイルスバックボーンを利用して、ネイティブ型の２つの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ベクター１および２；図１Ａ、１Ｂ）の１つ、１２の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲベースのＣＡＲ（ベクター３－１５、図１Ａ、１Ｂ）の１つ、または抗ヒトメソセリン－ＣＡＲ、またはＧＦＰをコードする組換えウイルスベクターを構築した。

【0135】

（１）ネイティブ型の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２の１Ｇ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－ベクターの（図１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ）：
ベクター１（ＮＴ１、ＮＴ１ａ、ａＮＹ－ＴＣＲａ／ｂ）（配列番号９および１２）
ＨＬＡ－Ａ＊０２０１クラスＩ制限要素の状況で、ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣを認識するＴＣＲ（配列番号２５）をコードするＭＦＧベースのレトロウイルスベクターを、前述のように、ただしＭＦＧベースのベクター中で、レトロウイルスベクターバックボーンで生成した（Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１１；２９：９１７－２４、およびＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：６１１６－６１３１）。１Ｇ４－α９５：ＬＹと呼ばれるこのＴＣＲは、ＣＤ８^＋およびＣＤ４^＋Ｔ細胞に付与されたネイティブ１Ｇ４ ＴＣＲα鎖の第３の相補性決定領域に２つのアミノ酸置換を含み、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原を発現するＨＬＡ－Ａ＊０２０１－陽性標的細胞を認識する能力が向上した。（Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ ｅｔ ａｌ，，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：６１１６－６１３１）。

【0136】

１Ｇ４α鎖およびβ鎖は、２つの遺伝子産物の間に「自己切断」Ｐ２Ａ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２：５８９－５９４）を含むレトロウイルス構築物で発現した。ＮＴ１のペプチド配列（ａＮＹ－ＴＣＲａ／ｂ）（配列番号９）（図３）は、ヌクレオチド配列（配列番号１２）によってコードされるように設計した。ＭＦＧベースのベクターのクローニング部位における目的の遺伝子の分子サブクローニングを容易にするために、ＸｈｏＩ部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号７１）、およびＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号７３）を含む短い配列（ＣＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣ、配列番号７２）を、コード領域（配列番号１２）の「ＡＴＧ」開始コドンのすぐ上流および停止コドン「ＴＡＡ」の下流にそれぞれ挿入した。

【0137】

ベクター２（ＮＴ１ｂ、ａＮＹ－ＴＣＲｂ／ａ）
ベクター２（ＮＴ２、ａＮＹ－ＴＣＲｂ／ａ）（配列番号６４および６５）は、ＴＣＲのアルファ鎖のネイティブ型をコードするＤＮＡフラグメントがＰ２Ａコード配列の３’末端のすぐ下流にあり、ベータ鎖はＰ２Ａコード配列の上流にあることを除いて、ベクター１（ＮＴ１、ａＮＹ－ＴＣＲａ／ｂ）とまったく同じように設計した（図１、２、および３）。

【0138】

（２）ＣＤ２８およびＣＤ３Ｚシグナル伝達ベクター（ＮＴ２、ＮＴ３）と統合された１Ｇ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－ＣＡＲ（図１Ｃおよび図１Ｄ）
ベクター３（ＮＴ２、ａＮＹ－Ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｚ）（第２世代）
核酸配列が同一または高度に相同である２つ以上の分子をコードする組換えレトロウイルスは、相同組換えを引き起こす可能性があり、結果として、相同遺伝子の欠失および重複などのゲノム再配列が起こり得る。例えば、ＣＤ２８ＴｍＣｙｔ、ＣＤ３ＺＣｙｔ、ＣＤ３ＥＣｙｔセグメントなどのＴＣＲベースのＣＡＲのＴｍおよびＣｙｔドメインをコードする核酸配列は、プラスミドＤＮＡおよびレトロウイルスベクターの調製プロセス中に、ＴＣＲ－ＣＡＲをコードする遺伝子の望ましくない変異および／または欠失を引き起こす可能性がある。この問題に対処するために、突然変異手順を適用して、同じベクター内の繰り返されるセグメント間の相同性駆動型組換えを抑制することができる。

【0139】

以前に記載されたように（Ｇｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，１９３：５３１５－５３２６）、２８Ｚまたは２８Ｅペプチド配列の前には、リンカーとしてアミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９）があり（図４および５）、ＴＣＲａ（ＳＰＥＳＳで終わるＴＣＲ－Ｃａアミノ酸）およびＴＣＲｂ（ＷＧＲＡＤで終わるＴＣＲ－Ｃｂアミノ酸）に連結されている。

【0140】

ＮＴ２（ベクター３、ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｚ（１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲベースのＣＡＲ）は２８Ｚシグナル伝達を含むように設計した（図１Ｃおよび図２Ｃ）（配列番号１０）。

【0141】

ＮＴ２（図２Ｃ、配列番号：１０、１３）を構築するために、ベータ鎖の余分な細胞ドメイン（配列番号５）およびアルファ鎖の余分な細胞ドメイン（配列番号４）は、、リンカー（アミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９）を介してヒトＣＤ２８（２８ＴｍＣｙｔ）（配列番号６）のＴｍおよびＣｙｔ、ならびにヒトＣＤ３ＺのＣｙｔ（ＺＣｙｔ）（配列番号７）に、分子的に連結されており、ここで、１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲアルファ鎖の細胞外ドメインに直接連結しているＣＤ２８Ｚ（配列番号１５）は、ベータ鎖およびアルファ鎖のＥｃのＣ末端に直接連結しているものの間の２８Ｚをコードするヌクレオチド配列のレベルでの相同性を低減するために、元のアミノ酸配列（ｍｕ２８ｍｕＺ）を変更することなくサイレント変異していた（図６－８）（配列番号２１）。ネイティブ型（ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）の１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲと同様に、「自己切断」Ｐ２Ａ配列（配列番号３）は、ベータＣＤ２８ＺとアルファＣＤ２８ｍｕＺとの間にも挿入した（図４）。

【0142】

ベクター１３（ＮＴ２６；ａＮＹ－Ｂ／ａ８ｈ２８ｐｅｃｔｍ２８Ｚ）（第２世代）
ベクター１３（ＮＴ２６、配列番号４０および６２）は、ヒトＣＤ８ａヒンジ（ＣＤ８ｈ）（配列番号：３０）の同じアミノ酸配列をコードする２つのＤＮＡ配列、および部分的ヒトＣＤ２８細胞外ドメイン（ＣＤ２８ｐｅｃ）（配列番号２６）を、ＣｂのＣ末端に連結したアミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９）とＣＤ２８ＴｍのＮ末端（配列番号ＮＯ：４２、５０）の間に、およびＣａのＣ末端に連結したアミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９）とＣＤ２８ＴｍのＮ末端（配列番号４３、５１）の間に粗挿入したことを除いて、ベクター３（ＮＴ２）と同じ方法で設計および作製した。

【0143】

（３）ＣＤ２８およびＣＤ３Ｅシグナル伝達ベクター（ＮＴ３；ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｅ）と統合された１Ｇ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－ＣＡＲ（図１および２）
ベクター４（ＮＴ３、ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｅ）（第２世代）
アミノ酸配列レベルでの２８Ｅカセットの設計は、前述の設計と同じであり、ヒトＣＤ２８のＴｍおよびＣｙｔ（Ｉｃ）ドメイン（ＧＩ：３３８４４４、ａａ １５３－２２０、最初のメチオニンから始まる番号付け）をカバーし、その後にヒトＣＤ３εのＩＣドメイン（ＧＩ：４５０２６７０、ａａ １５３－２０７）（Ｔａｎ Ｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１４；１９３：５３１５－５３２６）をカバーした。２８εカセットの前にアミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９）があり、これは、Ｃアルファ領域（ＳＰＥＳＳで終わるＴＣＲ－Ｃａアミノ酸）およびＴＣＲｂ（ＷＧＲＡＤで終わるＴＣＲ－Ｃｂアミノ酸）のＥｃの下流に連結されていた。ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｅ部位のコード領域のすぐ上流にあるＸｈｏ Ｉのヌクレオチド配列と３つのプライムエンドフランキングおよびＮｏｔ Ｉ部位の短いフラグメントから構成されるＮＴ３をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を設計し（図２Ｄ、図５、および図１１）（配列番号１４）（配列番号１１）、および商業的に合成された（ＢＩＯ ＢＡＳＩＣ ＣＡＮＡＤＡ ＩＮＣ，Ｃａｎａｄａ）。２８Ｅシグナル伝達を含むＧ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲベースのＣＡＲ（（ＮＴ３；１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－２８Ｅ）（ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍ２８Ｅ）（図１Ｄおよび図２Ｄ）

【0144】

ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｚ（ＮＴ２；ベクター３）と同様に、２８Ｅシグナル伝達（１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－２８Ｅ、ａＮＹ－ＴＣＲ２８Ｅ、ベクター３）を含むＩＧ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲベースのＣＡＲを構築するために、ベータ鎖とアルファ鎖のＥｃドメインは、リンカー（アミノ酸ＧＳＰＫ（配列番号６９））を介して、ヒトＣＤ２８のＴｍドメインおよびＣｙｔドメイン、ならびにヒトＣＤ３ＥのＣｙｔに分子的に連結され、ここで、１Ｇ４ａ９５ＬＹ ＴＣＲアルファ鎖の細胞外ドメインに直接連結されたＣＤ２８Ｅは、ベータ鎖とアルファ鎖のＥｃドメインのＣ末端に直接連結されているものの間の２８Ｅをコードするヌクレオチド配列のレベルでの相同性を低下させるために、ベータ元のアミノ酸配列（ｍｕ２８ｍｕＥ）を変更することなくサイレント変異させた（図６）。１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲと同様に、「自己切断」Ｐ２Ａ配列（配列番号３）も、ベータＣＤ２８ＥとアルファｍｕＣＤ２８ｍｕＥとの間に挿入した（図５）。

【0145】

（４）４－１ＢＢおよびＣＤ３Ｚシグナリングベクターと統合された１Ｇ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－ＣＡＲ（ベクター５（ＮＴ４、ａＮＹ－ｂ／ａ８ｔｍＢＢＺ）および６（ＮＴ５、ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍＢＢＺ）
ベクター５（ＮＴ４、ＡＮＹ－Ｂ／ａ８ｔｍＢＢＺ）（第２世代）
ベクター５（配列番号３２および５４）は、ＣＤ２８のＴｍおよびＣｙｔドメインをコードするＤＮＡ配列が、ヒトＣＤ８のＴｍドメイン（配列番号３１）（配列番号５２および５３）およびヒト４－１ＢＢのＣｙｔドメイン（配列番号２９）をコードするＤＮＡ配列によって置き換えられたことを除いて、ベクター３（ＮＴ２）と同じ様式で設計および作製した（配列番号４８，４９）。

【0146】

ベクター６（ＮＴ５、ａＮＹ－Ｂ／ａ２８ｔｍＢＢＺ）（第２世代）
ベクター６（ＮＴ５、ａＮＹ－ｂ／ａ２８ｔｍＢＢＺ）（配列番号３３、５５）は、ＣＤ８のＴｍドメインをコードするＤＮＡ配列が、ヒトＣＤ２８（配列番号２９）（配列番号４８および４９）のＴｍドメインをコードするＤＮＡ配列に置き換えられたことを除いて、ベクター５（ＮＴ４）とまったく同じように設計および作製した。

【0147】

（５）１Ｇ４－ａ９５ＬＹ ＴＣＲ－ＣＡＲは、ＣＤ２８および４－１ＢＢの組み合わせ、ならびにＣＤ３Ｚシグナル伝達ベクター（ベクター７（ＮＴ６）、８（ＮＴ２１）、９（ＮＴ２２）、１０（ＮＴ２３）、１１（ＮＴ２４）、１２（ＮＴ２５）、１４（ＮＴ２７）で統合した。
ベクター７（ＮＴ６、ＡＮＹ－Ｂ／ａ２８ｔｍ２８ＢＢＺ）（第３世代）
ベクター７（配列番号３４、５６）は、ヒト４－１ＢＢのＣｙｔドメイン（配列番号２９）（配列番号４８および４９）をコードするＤＮＡ配列が、ＣＤ２８のＣ末端およびＣＤ３ＺのＮ末端のＣｙｔドメインの間にそれぞれ挿入されたことを除いて、ベクター３（ＮＴ２）と同じ様式で設計および作製した。

【0148】

ベクター１１（ＮＴ２４、ａＮＹ－ｂ８ｔｍ２８Ｚ／ａ８ｔｍＢＢＺ）（第３世代）
ベクター１１（配列番号３８、６０）は、ＴＣＲベータ鎖のＥｃドメイン（すなわち、Ｐ２Ａペプチドの上流）を含む第１のポリペプチドにおけるＣＤ８ＴｍのＣ末端とＣＤ３ＺＣｙｔのＮ末端との間に位置する、４－１ＢＢのＣｙｔドメインをコードするＤＮＡ配列が、ヒトＣＤ２８のＣｙｔドメインをコードするＤＮＡ配列で置き換えられたことを除いて、ベクター５（ＮＴ４、ａＮＹ－ｂ／ａ８ｔｍＢＢＺ）と同じ様式で設計および作製した。

【0149】

ベクター１２（ＮＴ２５、ａＮＹ－ｂ８ｔｍ２８２８Ｚ／ａ８ｔｍＢＢＢＢＺ）（第３世代）
ベクター１２（配列番号３９および６１）は、ＣＤ２８のＣｙｔドメイン（ＣＤ２８Ｃｙｔの第２の単位）をコードする追加のＤＮＡ配列が、Ｅｃの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲベータ鎖を含む第１のポリペプチドにおけるＣＤ８ＴｍのＣ末端と、ＣＤ２８ＣｙｔのＮ末端との間に挿入されたこと、および４－１ＢＢのｃｙｔドメインをコードする追加のＤＮＡ配列（４－１ＢＢｃｙｔの第２の単位）が、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲアルファ鎖のＥｃを含む第２のポリペプチド中のＣＤ８ＴｍのＣ末端と４１Ｂ－ＢのＮ末端に挿入されたことを除いて、ベクター１１（ＮＴ２４）と同じ様式で設計および作製した。

【0150】

上記と同様の分子設計およびアプローチを使用して、ベクター８（配列番号３５、５７；ＮＴ２１、ａＮＹ－ｂ２８ｔｍ２８Ｚ／ａ８ｔｍＢＢＺ）、ベクター９（配列番号３６、５８；ＮＴ２２、ａＮＹ－ｂ２８ｔｍ２８Ｚ／ａ８ｔｍＢＢ）、ベクター１０（配列番号３７、５９；ＮＴ２３、ａＮＹ－ｂ２８ｔｍ２８Ｚ／ａ２８ｔｍＢＢＺ）、ベクター１４（配列番号４１、６３；ＮＴ２４、ａＮＹ－ｂ８ｈ２８ｐｅｃｔｍ２８Ｚ／ａ８ｔｍＢＢ）（表１）を含む他のベクターを適切に設計および作製した。

【0151】

１４個の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲまたはＴＣＲ－ＣＡＲ（ベクター１－１４、表１）をコードするＤＮＡフラグメントは、商業的に合成され（ＢＩＯ ＢＡＳＩＣ ＣＡＮＡＤＡ ＩＮＣ，Ｃａｎａｄａ）、続いて、以前に記載された様式で（Ｙａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１９：１０８３－９３）で、ＭＦＧベースのレトロウイルスベクターのＭＣＳ領域のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にサブクローン化した（図１Ｃ）。ＴＣＲまたはＴＣＲ－ＣＡＲをコードするすべてのベクターインサートは、ＤＮＡ配列決定によって検証した。

【0152】

実施例２．目的の関連遺伝子産物をコードするレトロウイルスの生成
Ｐｈｏｅｎｉｘ ａｍｐｈｏ細胞（リン酸カルシウムトランスフェクション効率の高い２９３細胞派生株）に、１４個のベクターを個別にトランスフェクトした（表１；図１、２）。トランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ細胞のウイルス上清（ビリオンを含む）を収集し、すぐにＰＧ１３細胞または他のマウス細胞に感染させるために使用するか、将来の使用のために－８０℃で保存し、その後、Ｙａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１９：１０８３－９３およびＢｅａｕｄｏｉｎ ＥＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８；１４８：２５３－９に記載されているものなどの、当技術分野において公知である標準的なプロトコルに従った。

【0153】

ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）系統であるＰＧ１３細胞を、目的のベクターで別々にトランスフェクトしたＰｈｏｅｎｉｘ細胞から得られたレトロウイルス上清に感染させた。対応するベクターに感染したＰＧ１３細胞を富化するために、ＦＡＣＳベースのセルソーティングを実施した。感染したＰＧ１３細胞は、以前に記載されたように、ＦＩＴＣ抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ、およびＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、またはＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー（テトラマー／ＡＰＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号２５）（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ ９８１０９，ＵＳＡ）陽性細胞での染色後に、ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１鎖陽性細胞についてのセルソーティングによって富化した。富化したＶＰＣを用いた高力価レトロウイルス上清の産生は、当技術分野で知られている標準的なプロトコルに従った。

【0154】

一例では、ウイルス感染後のＴＣＲ＋またはＴＣＲ－ＣＡＲ＋ＰＧ１３細胞の濃縮のＦＡＣＳベースのセルソーティングの前に、感染したＰＧ１３細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＰＧ１３細胞は、３つの抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２２、ＮＴ２４、およびＮＴ２５）をコードするベクターで別々にトランスフェクトされたＰｈｏｅｎｉｘ細胞から得られたレトロウイルス上清に感染させた。感染したＰＧ１３細胞株（ＦＡＣＳベースのセルソーティングによるＣＡＲ＋細胞の事前富化なし）を、ＦＡＣＳによるＴＣＲＶｂ１３．１の表面発現およびＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーの結合について分析した。生細胞は分析のためにゲートされた。図２６に示されているのは、ＦＩＴＣ－抗ヒトＴＣＲＶｂ１３．１およびＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーに対する単一または二重陽性細胞の陽性染色をそれぞれ示す強度プロットである。

【0155】

実施例３．レトロウイルスで個別に形質導入された活性化ヒトＴ細胞の生成
抗ＣＤ３抗体活性化ヒトＴ細胞（ＡＴＣ）由来のＰＢＭＣを、Ｙａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１９：１０８３－９に記載されている様式で、７つのベクター：ａＮＹ－ＴＣＲ（ＮＴ１、ＮＴ１ｂ）およびａＮＹ－ＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２、ＮＴ３、ＮＴ４、およびＮＴ５、ＮＴ６）の各々で個別に形質導入した（表１）。形質導入の７～１０日後、ＦＩＴＣ－抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１と、テトラマー／ＡＰＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号５）（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）との組み合わせで染色することによりフローサイトメトリー分析を実施した。それらの結果を図２７に示す。

【0156】

この図に示すように、２つの第２世代抗ＮＹＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）は、ネイティブ型（ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）と比較して、ヒトＴＣＲＶｂ１３．１およびＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー結合ＴＣＲについて、形質導入したＡＴＣ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を含む）細胞両方で、有意に高いレベルで発現した。形質導入されていない細胞（Ｕｎｔｄ）の約３．９％もＴＣＲＶｂ１３．１染色で陽性であったが、これらの細胞はＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーで有意に染色されていない。

【0157】

活性化Ｔ細胞の１９．４～５１．２％がテトラマー／ＡＰＣ－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＮＹ－ＥＳＯ－１に結合したことがわかった。それらの細胞表面でのＴＣＲ Ｖβ１３．１の発現は、ＦＩＴＣ抗ヒトＴＣＲ Ｖβ１３．１抗体（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ／ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ，ＣＡ）染色に基づいて測定され、テトラマー／ＰＥ－ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ＮＹ－ＥＳＯ－１による陽性テトラマー染色とそれに続くＦＡＣＳ分析に基づくと、細胞表面上で同様の割合の活性化Ｔ細胞が機能的な１Ｇ４ ａ９５ＬＹ ＴＣＲ Ｅｃドメインの正しいペアを発現した。さらなる分析は、感染した活性化ヒトＴ細胞のＣＡＲ＋ ＣＤ３＋細胞の約半分がＣＤ４＋（５２％）およびＣＤ８＋（４８％）であることを示した。

【0158】

実施例４．抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲまたは２つのＴＣＲベースのＣＡＲの１つで形質導入されたヒトＡＴＣのサイトカインＩＬ－２の抗原特異的媒介性分泌
この実施例では、活性化されたヒトＴ細胞によるサイトカイン分泌を誘導する活性を、様々な量の特定の抗原ペプチドの非存在下および存在下でＴ細胞をＨＬＡ－Ａ０２０１＋標的細胞と共培養した培地中でＩＬ－２分泌を検出することによって調べた。

【0159】

簡単に説明すると、０．５×１０^５のＨＬＡ－Ａ０２０１＋標的細胞（Ｔ２細胞、１７４×ＣＥＭ．Ｔ２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２（商標））を、培養培地中、３７℃にて３時間、種々の濃度のペプチドＮＹ－ＥＳＯ－１（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号２５）の非存在下、または、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および２ｕＭ存在下でインキュベートした。細胞は未結合のペプチドを除去するために二回洗浄し、その後、Ｕ底９６ウェルプレートのウェルあたり２００ｕｌの培地（完全ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（Ｒ－１０）中で２４時間、ベクターＮＴ１（ＮＴ１ａ）、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２およびＮＴ３（図２）で個々に形質導入した１．５×１０^５個の活性化Ｔ細胞と共培養した。

【0160】

培養された上清を収集し、ＥＬＩＳＡ検出キット（ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）によってＩＬ－２濃度を測定した。得られたＩＬ－２分泌データは、３つすべての抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ベクターＮＴ１（ＮＴ１ａ）、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２およびＮＴ３で個別に形質導入された（図２）活性化Ｔ細胞が、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドでパルスされたＴ２細胞とのエンゲージメントの際にＩＬ－２を特異的に分泌したが、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチドでパルスされていないか、またはネガティブ対照ペプチドでパルスされたＴ２細胞では分泌しなかったことを示す。

【0161】

ＮＴ２で形質導入されたＴ細胞は３つの中で最高量のＩＬ－２を分泌したが、ＮＴ１で形質導入されたＴ細胞はＴ２細胞がパルスされたのと同じ濃度のペプチドで最低量を産生することが見出された。これらの結果は、２つのＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）の両方が、形質導入されたＴＣＲまたはＴＣＲ－ＣＡＲを介したＴ細胞活性化においてＮＴ１（図２Ａ）よりも優れていたことを示す。

【0162】

実施例５．抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたは２つのＴＣＲベースのＣＡＲの１つで形質導入されたＡＴＣによる腫瘍細胞の特異的殺傷
この実施例では、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたはＴＣＲベースのベクターＮＴ１、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２およびＮＴ３で形質導入された活性化ヒトＴ細胞（ＡＴＣ）によって腫瘍細胞を殺傷する活性を調べるために、Ｓａｏｓ－２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－８５（商標））を使用してアッセイを実施した（図２）。ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２細胞株は、ＮＹ－ＥＳＯ－１＋およびＨＬＡ－Ａ０２０１＋である。

【0163】

簡単に述べると、１×１０^３ Ｓａｏｓ－２細胞を、９６フラットウェル組織培養プレートのウェルに１２時間プレプレートした。次に、１×０^４非形質導入または形質導入ヒトＴ細胞を、各ウェルに添加した。これらのＴ細胞は、９０ＩＵのｒｅｃ ｈｕ ＩＬ－２／ｍｌで補充された完全ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ培地（Ｒ１０）中で、３つのベクター、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ３で個別に形質導入されていないか、形質導入されていた。細胞を最大５日間（１２０時間）培養した（図２８）。Ｔ細胞よりもはるかに大きく、Ｔ細胞とは異なる生存腫瘍標的細胞は、ウェルの底に付着しており、毎日観察され、等級分けされた。

【0164】

Ｔ細胞を含むウェルからの生存腫瘍細胞数を、Ｔ細胞を含まないウェルからの生存腫瘍細胞数と比較することにより、Ｔ細胞の殺傷活性は次のように評価した：「＋＋＋＋」、７５－１００％の殺傷、「＋＋＋＋」、７５－１００％の殺傷。「＋＋＋」、５０－７５％の殺傷、「＋＋」、２５－５０％の殺傷。「＋」、０～２５％の殺傷。顕微鏡下でのウェルの代表的なビューの写真は、Ｔ細胞の添加後５日目（１２０時間）に撮影した。図２８を参照のこと。

【0165】

図に示すように、ａＮＹ－ＴＣＲａ／ｂを発現するＡＴＣ（ＮＴ１（ＮＴ１ａ）およびＮＴ１ｂ）は、同様の最高の腫瘍殺傷活性を示した。ＡＴＣを発現するＮＴ２はわずかに低い殺傷活性を示し、ＮＴ３を発現するＮＴ２は比較的低い殺傷能力を示した。形質導入されていないＡＴＣは、顕著な殺傷を示さなかった。これらの結果は、４つのベクターで個別に形質導入されたヒトＴ細胞がＳａｏｓ－２腫瘍細胞を特異的に殺傷することができることを示唆する。

【0166】

実施例６．サイトカインＩＬ－２およびＩＮＦ－γの抗原特異的分泌
この実施例では、２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１（ＮＴ１ａ）およびＮＴ１ｂ）のうちの１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）のうちの１つで形質導入されたＡＴＣによるサイトカイン分泌を調べるために、アッセイを実行した。

【0167】

ＮＴ１ａ、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２、またはＮＴ３で形質導入されたＡＴＣは、上記の方法で調製した。ＦＡＣＳによるＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー染色に基づいてＮＹｐｅｐ／Ａ２陽性であったＴ細胞のパーセンテージ（ＮＴ１ａ、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２、およびＮＴ３の場合）は、上記のように、非形質導入Ｔ細胞（「ｕｎｔｄ」）で２０％に調整した。次いで、任意のＩＬ－２を添加していない、０．５×１０^６の標的細胞（Ｓａｏｓ－２または対照ＡｓｐＣ１）または媒体のみ（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＦＣＳ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）（Ｒ１０））は、２４フラットウェル組織培養プレート中、ＮＴ１ａ、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２、またはＮＴ３で、総量１．５ｍｌのＲ１０（ＩＬ－２を添加しない）で２４時間形質導入した、２×１０^６のＡＴＣと共培養した。細胞上清中のＩＬ－２またはＩＮＦ－γの濃度は、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤＳのキット（カタログ番号４３１８０４および４３０１０１）を使用したＥＬＩＳＡによって測定された。結果を図２９に示す。図２９Ａに示されるように、ＮＴ２で形質導入されたＴ細胞は、最高量のＩＬ－２（約２３０ｐｇ／ｍｌ）を分泌したが、ＮＴ３を用いたものは中程度の量のＩＬ－２を分泌し、抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ（ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）の２つのネイティブ型のいずれかを有するものは分泌量が最も少なかった。

【0168】

実施例７．ＮＴ１、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２およびＮＴ３で形質導入されたＡＴＣのＮＹｐｅｐ／Ａ２＋細胞のパーセンテージの変化
２つの抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲ（ＮＴ１およびＮＴ１ｂ）の１つ、または２つの第２世代ＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ２およびＮＴ３）の１つで形質導入したＡＴＣは、上記の様式で調製した。ＦＡＣＳによるＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー染色（ＮＴ１ａ、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２、およびＮＴ３について）に基づいてＮＹｐｅｐ／Ａ２陽性であったＴ細胞のパーセンテージは、上記のようにｕｎｔｄ Ｔ細胞で２０％に調整した。

【0169】

１日目に、１×１０^６個の標的細胞（Ｓａｏｓ－２）を、ＮＴ１ａ、ＮＴ１ｂ、ＮＴ２、またはＮＴ３で形質導入した４×１０^６のＡＴＣと、１２フラットウェル組織培養プレート中、９０ＩＵ ＩＬ－２／ｍｌを含むＲ１０の総量４ｍｌ中で４８時間共培養した。３日目に、細胞を新しい２４ウェルプレートに移した。６日目に、総量４ｍｌ／ウェル中１８０ＩＵのＩＬ－２／ｍｌを含むＲ１０を用いて、各ウェルからの細胞を２つのウェルに分割した。１０日目に、細胞を収集し、ＦＡＣＳによってＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーの結合について分析した。結果を図３０に示す。図に示すように、生細胞は分析のためにゲートされ、陽性細胞のパーセンテージが示された。ＮＹｐｅｐ／Ａ２陽性のパーセンテージはＮＴ２で最も有意に増加し（約３２％）、ＮＴ３では中程度の増加（約２５％）が観察され、ＮＴ１ａおよびＮＴ１ｂグループでは減少が観察された（約１７～１９％）。

【0170】

実施例８．第２世代ＴＣＲ－ＣＡＲおよび第３世代ＴＣＲ－ＣＡＲの分析
この実施例では、形質導入された活性化ヒトＴ細胞に対する、ネイティブ型の抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲのおよび第２世代または第３世代のＴＣＲ－ＣＡＲを調べ、比較するためにアッセイを実行した。

【0171】

最初に、形質導入された活性化ヒトＴ細胞上のＴＣＲまたはＴＣＲ－ＣＡＲの表面発現を調べた。簡単に説明すると、抗ＣＤ３抗体で活性化されたヒトＴ細胞は、形質導入されていない（Ｕｎｔｄ）か、または、上記のように、以前に選別された抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ＋（ＮＴ１（ＮＴ１ａとも呼ばれる）または抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ＋（ＮＴ２、第２世代）、ＮＴ４（ベクター５、第２世代）、ＮＴ５（ベクター６、第２世代）、およびＮＴ２４（ベクター１１、第３世代）細胞株に由来する上清を含むウイルスで形質導入されていた。形質導入の７～１０日後、形質導入されたＴ細胞を、ＴＣＲＶｂ１３．１の表面発現およびＦＡＣＳによるＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーの結合について分析した。生細胞は分析のためにゲートされた。結果を図３１ＡおよびＢに示す。図に示すように、３つの第２世代抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２、ＮＴ４、およびＮＴ５）のそれぞれで形質導入されたＴ細胞は、ＦＡＣＳによるＴＣＲＶｂ１３．１、ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー染色によって決定されるような、最も類似した最高レベルのＴＣＲＶｂ１３．１、ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー結合ＴＣＲまたはＴＣＲ－ＣＡＲを発現した。第３世代ＴＣＲ－ＣＡＲ ＮＴ２４を有するものは、比較的低い二重ＴＣＲＶｂ１３．１およびＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー結合＋細胞を示したが、一方、ネイティブ型ＴＣＲ（ＮＴ１）を有するものは、二重ＴＣＲＶｂ１３．１およびＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマー結合＋細胞の最も低いパーセンテージを示した。

【0172】

第二に、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ ＴＣＲまたは標的細胞とのエンゲージメント後の４つのＴＣＲ－ＣＡＲの１つで形質導入されたヒトＡＴＣによる標的細胞の殺傷の能力を調べるために、アッセイを実行した。簡単に説明すると、ＮＴ１（ＮＴ１ａとも呼ばれる）、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、またはＮＴ２４で形質導入されたＡＴＣは、上記のように調製された。これらの活性化ヒトＴ細胞についての抗原特異的標的細胞の殺傷は、サイトカインＩＬ－２の存在下で、形質導入されたヒトＴ細胞（エフェクター）をＳａｏｓ－２腫瘍細胞（標的）と共培養するインビトロ殺傷アッセイにおいて実行した。実験においては、ＮＴ１ａ、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、またはＮＴ２４で個別に形質導入されたヒトＴ細胞を、ｕｎｔｄ Ｔ細胞で１５％ＮＹｐｅｐ／Ａ＋に調整し、それぞれ１：２および１：２０のＥ／Ｔ比でのサイトカインＩＬ－２の存在下で、Ｓａｏｓ－２腫瘍細胞（標的）と１２時間共培養した。インキュベーションの最後に、Ｃａｙｍａｎの７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞媒介性細胞傷害アッセイキットを使用してＴ細胞媒介性細胞傷害を測定した。結果を図３２に示し、データは各グループの３つのサンプルからの平均数±Ｓ．Ｄ．として表す。図３２に示すように、ＮＴ１ａの１つまたは３つのＴＣＲベースのＣＡＲ（ＮＴ４、ＮＴ５、およびＮＴ２４）の１つで形質導入されたＴ細胞は、４－１ＢＢに由来するＴＣＲシグナル２を含み、両方のＥ／Ｔ比（１：２および１：２０）において、最高かつ類似の標的細胞殺傷活性を示す。ＮＴ２（ＣＤ２８に由来するＴＣＲシグナル２のみを含む第２世代のＴＣＲ－ＣＡＲ）を有するものは、わずかに低い殺傷能力を示した。形質導入されていない細胞（Ｕｎｔｄ）では、標的細胞の有意な殺傷は見られなかった。

【0173】

第三に、標的細胞とのエンゲージメント後にＴＣＲまたはＴＣＲベースのＣＡＲで形質導入されたヒトＡＴＣのサイトカイン分泌を調べた。ＮＴ１ａ、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、またはＮＴ２４で形質導入されたＡＴＣは、上記のように調製された。形質導入されたＴ細胞は、ｕｎｔｄ Ｔ細胞で再度１５％ＮＹｐｅｐ／Ａ＋に調整した。次に、０．５×１０^６の標的Ｓａｏｓ－２細胞または培地のみ（Ｒ１０）を、２４フラットウェル組織培養プレートで２×１０^６の形質導入ＡＴＣまたは非形質導入ヒトＴ細胞（Ｕｎｔｄ）と１．５ｍｌのＲ１０（ＩＬ－２を添加しない）の総量で、２４時間共培養した。細胞上清中のサイトカイン濃度は、上記のようにＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図３３ＡおよびＢに示し、ここで、データは各グループの３つのサンプルからの平均数±Ｓ．Ｄ．として示されている。図３３Ａに示されるように、ＮＴ２またはＮＴ２４（両方ともヒトＣＤ２８に由来する１つ（ＮＴ２４）または２つ（ＮＴ２）のＴＣＲシグナル伝達２を含む）を有するものは、最高量のＩＬ－２（それぞれ、約２００ｐｇ／ｍｌ、および２１５ｐｇ／ｍｌ）を分泌した。ＮＴ４またはＮＴ５（４－１ＢＢからのＴＣＲシグナル２）を有するものは、中程度の量（それぞれ、約１７０ｐｇ／ｍｌおよび１６５ｐｇ／ｍｌ）を生成した。抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ（ＮＴ１）のネイティブ型を有するものは、最低量を分泌した。図３３Ｂに示すＩＦＮ－γの場合、ＮＴ１（ＮＴ１ａとも呼ばれる）、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、およびＮＴ２４で形質導入されたＡＴＣは、標的Ｓａｏｓ－２細胞とのエンゲージメント時に同様のレベルのＩＦＮ－γを分泌したが、標的細胞の非存在下（Ｒ１０対照）では分泌しなかった。ネガティブ対照細胞Ｕｎｔｄは、標的細胞の存在下または非存在下で有意な量のＩＬ－２またはＩＦＮ－ｒを産生しなかった。

【0174】

最後に、アッセイを実施して、抗ＮＹ ＥＳＯ－１ＴＣＲまたは標的細胞とのエンゲージメント後の４つのＴＣＲベースのＣＡＲの１つで形質導入されたＮＹｐｅｐ／Ａ２＋ＡＴＣのパーセンテージの変化および拡大を調べた。簡単に説明すると、１日目に、ＮＴ１ａ、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、またはＮＴ２４で形質導入されたＡＴＣを、ｕｎｔｄ Ｔ細胞で１５％ＮＹｐｅｐ／Ａ＋に調整した。次いで、１×１０^６標的のＳａｏｓ－２細胞は、以前に１５％ＮＹｐｅｐ／Ａ＋細胞に調整し、１２フラットウェル組織培養プレート中０．９×１０^６ ＮＹｐｅｐ／Ａ＋細胞からなった、６×１０^６のＡＴＣと、９０ＩＵ ＩＬ－２／ｍｌを含む総量５ｍｌのＲ１０中、４８時間共培養した。３日目に、すべての細胞を新しい１２ウェルプレートに移した。６日目（共培養の開始から６日後）に、１８０ＩＵ ＩＬ－２／ｍｌを含む、総量５ｍｌ／ウェルのＲ１０で、各ウェルの細胞を２つの新しいウェルに分割した。１０日目に、浮遊細胞を回収し、トリパンブルー染色による顕微鏡検査で計数し、ＦＡＣＳによってＦＩＴＣ－抗ヒトＣＤ３抗体とＡＰＣ－ＮＹｐｅｐ／Ａ２テトラマーの結合について分析した。生細胞の９５～９８％以上がＣＤ３＋であることが見出された（データ示さず）。生細胞とＣＤ３＋細胞を分析のためにゲートした。結果を図３４ＡおよびＢに示す。ＮＹｐｅｐ／Ａ２＋ＡＴＣの総数は、次の式に基づいて計算した。
生細胞の総数（トリパンブルー染色による）×図３４Ａに示すＮＹｐｅｐ／Ａ２＋細胞の％／ＮＹｐｅｐ／Ａ２＋ＡＴＣの総数。

【0175】

図３４Ａに示すように、ＮＹｐｅｐ／Ａ２陽性細胞のパーセンテージは、１５％から、４つすべてのＴＣＲ－ＣＡＲ（ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、およびＮＴ２４）の同様のレベル、２５．３％から、それぞれ２９．２％、２８．４％、２７．１％、２５．３％および２９．２％の範囲に大幅に増加した。ＮＴ１ａのそれはわずかに増加して１９．１％になった。図３４Ｂに示すように、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、ＮＴ２４の増加倍率はそれぞれ３．２、３．１、２．９、３．５であったが、ＮＴ１ａの増加倍率は１．２であった。

【0176】

実施例９．インビボ抗腫瘍活性
この実施例では、異種移植腫瘍マウスモデルを使用して、本明細書に記載のベクターで形質導入されたＴ細胞のインビボ抗腫瘍活性を調べた。

【0177】

簡単に説明すると、エフェクターＴ細胞の養子細胞移入の５日前（－５日目）に、Ｓａｏｓ－２細胞を、例えば、１００ｕｌのＰＢＳ中３×１０^６細胞／マウスでＳＣＩＤ雌性マウスの後側腹部に皮下注射した。ＮＴ１ａ、ＮＴ２、ＮＴ４、およびＮＴ２４をコードするレトロウイルスで個別に形質導入された活性化ヒトＴ細胞または非形質導入ヒトＴ細胞（Ｕｎｔｄ）を、図３１について上記のように調製した。

【0178】

０日目に、マウスを５つのグループに分け、それぞれに６匹のマウスを入れた。ＮＴ１ａ、ＮＴ２、ＮＴ４、ＮＴ５、またはＮＴ２４で形質導入されたＡＴＣは、形質導入されていないＴ細胞で１５％ＮＹｐｅｐ／Ａ＋に調整した。次いで、細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含む）を、１×１０^７ Ｔ細胞／１００ｕｌのＰＢＳ／マウスの用量で尾静脈に静脈内投与した。

【0179】

マウスの腫瘍増殖を監視した。腫瘍の大きさはノギスで測定し、腫瘍の体積は式（腫瘍の測定値（ｍｍ^３）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６）を使用して計算した。腫瘍のサイズが大きすぎるために屠殺されたマウス、または死んでいることがわかったマウスは、腫瘍サイズに関するデータの収集および分析から除外した。結果を図３５に示す。図に示されているように、ＡＣＴ投与後５４日目に６匹すべてのマウス（１００％）がまだ生存していたのはＮＴ２４グループのみであった。対照的に、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ４、およびＵｎｔｄグループのマウスの０、４、４、および０がそれぞれ生存していた。さらに、ＡＴＣ後６２日目の実験の終わりに、ＮＴ１、ＮＴ２、ＮＴ４、およびＵｎｔｄグループではそれぞれ６匹のマウスのいずれも生存していなかったが、ＮＴ２４グループの６匹中３匹（５０％）のマウスが生存していた。

【0180】

これらのインビボデータは、第３世代抗ＮＹ－ＥＳＯ－１／Ａ２ ＴＣＲ－ＣＡＲ ＮＴ２４が、ヒトＣＤ２８（ＮＴ２）からのみ、または４－１ＢＢ（ＮＴ４）からのみのＴＣＲシグナル２を有する第２世代のそのカウンターパートよりも著しくより強力であり、ネイティブ型ＮＴ１（ＮＴ１ａ）よりもさらに強力であることを示す。データは、２つの第２世代抗ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＣＡＲの両方が、ＮＴ１（ＮＴ１ａ）からのネイティブ型よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを示唆する。

【0181】

前述の実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではなく、例示するものとして解釈されるべきである。容易に理解されるように、上記の特徴の多数の変形例および組み合わせは、特許請求の範囲に記載される本発明から逸脱することなく用いられ得る。そのような変形例は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、そのようなすべての変形例は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書において言及されるすべての参考文献は、その全体が参考により組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A-26B】

【図27A-27B】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図30】

【図31A-31B】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35A-35B】

【配列表】

2022542051000001.app

【国際調査報告】