特表 2022-542389 拘束された脂質を含むナノ材料およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-03

(54)【発明の名称】拘束された脂質を含むナノ材料およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07C 219/16 20060101AFI20220926BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 295/088 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 513/04 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 231/56 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 239/42 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 241/24 20060101ALI20220926BHJP

   C07D 241/42 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220926BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220926BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220926BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220926BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20220926BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220926BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220926BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20220926BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20220926BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20220926BHJP

【ＦＩ】

C07C219/16

C12N15/09 110

C07D295/088 CSP

C07D513/04 331

C07D231/56 C

C07D239/42 Z

C07D241/24

C07D241/42

A61K9/51

A61K47/18

A61K47/22

A61K47/24

A61K47/10

A61K47/28

A61K31/7088

A61K48/00

A61P43/00 105

A61P37/02

C12N15/55 ZNA

C12N15/113 Z

C12N5/0783

C12N5/0784

C12N5/0786

C12N5/0781

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022506087

(86)(22)【出願日】2020-07-24

(85)【翻訳文提出日】2022-03-14

(86)【国際出願番号】 US2020043512

(87)【国際公開番号】W WO2021021634

(87)【国際公開日】2021-02-04

(31)【優先権主張番号】62/879,731

(32)【優先日】2019-07-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504466834

【氏名又は名称】ジョージア テック リサーチ コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100110663

【弁理士】

【氏名又は名称】杉山 共永

(72)【発明者】

【氏名】ダールマン，ジェームズ エバレット

(72)【発明者】

【氏名】サゴ，コリー デーン

(72)【発明者】

【氏名】ガン，ズバオ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C072

4C076

4C084

4C086

4H006

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065BA05

4B065CA31

4B065CA44

4C072AA01

4C072BB02

4C072CC02

4C072CC16

4C072EE13

4C072FF05

4C072GG09

4C072HH01

4C072UU01

4C076AA65

4C076AA67

4C076AA95

4C076CC50

4C076DD09F

4C076DD15F

4C076DD49F

4C076DD60F

4C076DD63F

4C076DD70F

4C076EE23F

4C076FF16

4C076FF32

4C076FF43

4C084AA13

4C084MA05

4C084MA24

4C084MA38

4C084NA12

4C084NA13

4C084ZB021

4C084ZB071

4C084ZB211

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA24

4C086MA38

4C086NA12

4C086NA13

4C086ZB02

4C086ZB07

4C086ZB21

4H006AA01

4H006AB20

4H006BJ20

4H006BT12

4H006BU32

(57)【要約】

細胞または組織の微小環境に核酸を送達するための組成物が提供される。一実施形態では、この組成物は、脾臓および肝臓でのクリアランスを減少させるように配合されている脂質ナノ粒子組成物である。脂質ナノ粒子の化学組成は脂質ナノ粒子の自然な輸送に有意に影響を及ぼすことが発見された。より具体的には、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、脂質ナノ粒子の指向性およびクリアランスプロファイルを修飾し得ることが発見された。本開示の脂質ナノ粒子の指向性がサイズ依存的であることも発見された。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）：

【化1】

の化合物であって、
式中、
Ｒ_１は、

【化2】

であり、
Ｒ_２は、

【化3】

であり、式中、Ｘは、

【化4】

であり、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、

【化5】

である、
化合物。

【請求項2】

式（ＩＩＩ）：

【化6】

の化合物であって、
式中、
Ｒ_８は、－Ｈまたは

【化7】

であり、
Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８は、それぞれ独立して、－Ｃ_８Ｈ_１７、－Ｃ_１０Ｈ_２１、－Ｃ_１２Ｈ_２５、－Ｃ_１３Ｈ_２７、－Ｃ_１４Ｈ_２９、Ｃ_１６Ｈ_３３、またはアダマンタニルであり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり、
Ａは、

【化8】

、－Ｏ－、

【化9】

、－Ｓ－、

【化10】

であり、
Ｒ_１０およびＲ_１１は、それぞれ独立して、－Ｈまたは

【化11】

であり、
Ｒ_１２は、－Ｃ_１０Ｈ_２１である、
化合物。

【請求項3】

Ｒ_２は、

【化12】

である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

立体構造的に拘束されているイオン性脂質、
リン脂質、
ポリエチレングリコール－脂質、
コレステロール、および任意選択で
核酸
を含む脂質ナノ粒子組成物。

【請求項5】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、請求項１または２に記載の構造を含む、請求項４に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項6】

存在する立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量は、総モル数を基準として約３５～約６５モルパーセントの範囲である、請求項４または５に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項7】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、

【化13】

に従う構造を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項8】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、

【化14】

に従う構造を有する、請求項４～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項9】

前記リン脂質は、１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項４～８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項10】

前記ポリエチレングリコール－脂質は、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００である、請求項４～９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項11】

前記組成物は、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％のコレステロール、および約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のポリエチレングリコール－脂質を含む、請求項４、５、または７～１０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項12】

前記核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはこれらの組合せを含む、請求項４～１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項13】

前記核酸はタンパク質をコードする、請求項４～１２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項14】

前記核酸は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、請求項４～１３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項15】

前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１である、請求項１４に記載の脂質ナノ粒子組成物。

【請求項16】

前記脂質ナノ粒子は、流体力学的直径が約３０ｎｍ～約１７０ｎｍの範囲である、請求項４～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子組成物。

【請求項17】

アダマンタンテイルを含む立体構造的に拘束されているイオン性脂質、
１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００、
コレステロール、
および
ｓｉＲＮＡ
を含む脂質ナノ粒子組成物。

【請求項18】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエートである、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項19】

Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００は、約２．０～約３．０モルパーセントで存在し、ＤＳＰＣは、約１５～約１７モルパーセントで存在し、コレステロールは、約４５～約４７モルパーセントで存在し、前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、約３３～約３６モルパーセントで存在し、前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対する５～２０質量比の総脂質で存在する、請求項１７または１８に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項20】

Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００は、約２．５モルパーセントで存在し、ＤＳＰＣは、約１６モルパーセントで存在し、コレステロールは、約４６．５モルパーセントで存在し、前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、約３５モルパーセントで存在する、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項21】

請求項４～２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項22】

それを必要とする対象に核酸を送達する方法であって、前記対象に、請求項４～２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子組成物または請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項23】

前記対象に別の治療薬を投与することをさらに含む請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

それを必要とする対象の免疫細胞に核酸を送達する方法であって、
前記対象に、
３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、
ＤＳＰＣ、
ポリエチレングリコール－脂質、
コレステロール、
および
核酸
からなる脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、
前記脂質ナノ粒子組成物は、前記対象の前記免疫細胞に前記核酸を送達する、方法。

【請求項25】

前記脂質ナノ粒子組成物は、前記脂質ナノ粒子組成物の標的を前記免疫細胞に定めるターゲティングリガンドを含まない、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記免疫細胞はＴ細胞である、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｔ細胞はＴ調節性細胞である、請求項２６に記載の方法。

【請求項29】

前記Ｔ細胞はＣＤ４＋である、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、または肝臓免疫細胞である、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項31】

ナノ粒子組成物の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させる方法であって、対象に投与された場合に前記ナノ粒子組成物の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させるかまたは阻害するのに有効な、立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量を含むナノ粒子組成物を配合することを含む方法。

【請求項32】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、請求項１または２に記載の構造を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

対象の非肝細胞へのナノ粒子組成物の送達を増加させる方法であって、前記対象に投与された場合に非肝細胞への前記ナノ粒子組成物の送達を増加させるのに有効な、立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量を含むように前記ナノ粒子組成物を配合することを含む方法。

【請求項34】

前記立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、請求項１または２に記載の構造を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子医薬組成物である、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記脂質ナノ粒子医薬組成物は、リン脂質、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および任意選択で第１の核酸を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記非肝細胞は、脾臓Ｂ細胞、脾臓Ｔ細胞、肺内皮細胞、および肝臓免疫細胞の内の少なくとも１つである、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ナノ粒子組成物は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で前記対象に送達される第２の核酸をさらに含む、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記対象に送達される前記第２の核酸の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

それを必要とする対象の免疫細胞中での遺伝子発現を減少させる方法であって、
前記対象に、
３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、
ＤＳＰＣ、
ポリエチレングリコール－脂質、
コレステロール、
および
阻害性核酸
からなる脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、
前記脂質ナノ粒子組成物は、前記対象の前記免疫細胞に前記阻害性核酸を送達する、方法。

【請求項41】

前記阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記対象に投与される前記阻害性核酸の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項43】

前記対象に投与される阻害性核酸の量は、約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

それを必要とする対象の免疫細胞中で遺伝子を編集する方法であって、
前記対象に、脂質ナノ粒子の第１の集団および第２の集団を含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、
前記脂質ナノ粒子の第１の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および前記遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡからなり、
前記脂質ナノ粒子の第２の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡからなる、
方法。

【請求項45】

前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、およびＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記対象に投与される前記ｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの一方または両方の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である、請求項４４または４５に記載の方法。

【請求項47】

前記対象に投与される前記ｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの一方または両方の量は、約０．５ｍｇ／ｋｇである、請求項４６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

あらゆる優先権主張出願に対する参照による組込み
本出願は、２０１９年７月２９日に出願された、「ＮＡＮＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＣＯＮＳＴＲＡＩＮＥＤ ＬＩＰＩＤＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」という表題の米国仮出願第６２／８７９，７３１号明細書の利益を主張しており、この明細書は、その全体が参照により組み込まれる。

【0002】

分野
本明細書で説明されている主題は、全体として、薬物送達システムおよびその使用方法に関する。

【0003】

配列表への言及
本出願は、電子配列表と一緒に出願されている。この電子配列表は、２０２０年７月４日に作成されて最終的に修正されている、ＧＵＩＤＥ００５ＷＯ．ｔｘｔという表題のファイル（サイズは６，９７７バイトである）として提供されている。この電子配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

Ｔリンパ球は免疫反応を調節しており、そのため、新薬開発の重要な薬物標的となっている。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、またはＰＤ１リガンド１（ＰＤＬ１）シグナル伝達をブロックする抗体療法は、強力な抗腫瘍反応を引き起こしている（Khalil, D.N., et al., Nat Rev Clin Oncol, 13:273-290 (2016); Sharma, P. & Allison, J. P., Science, 348:56-61 (2015)）。しかしながら、多数の患者はこれらの薬剤に反応せず、反応する患者の多くは、最終的には再発する（Jenkins, T, et al., BJC, 118:9-16 (2018)）。加えて、抗体療法は、「創薬可能な」タンパク質の活性のみを阻害し得、このタンパク質は、ゲノムをコードする全タンパク質の約１５％を占めると考えられている（Dixon, S. and Stockwell, B., Curr Opin Chem Biol, 13(5-6):549-555 (2009)）。

【0005】

疾患の病理で重要な役割を果たす一部のタンパク質は、「創薬不能」である。「創薬不能」という用語は、薬理学的に標的とされ得ないタンパク質を説明するための造語であった（Cang, C.V., et al., Nature Reviews Cancer, 17:502-508 (2017)）。現在、創薬不能と考えられる癌標的が数多く存在する（Cang, C.V., et al., Nature Reviews Cancer, 17:502-508 (2017)）。創薬不能なタンパク質の例として、細胞内タンパク質、および低分子薬物が容易に結合するドメインを欠いているタンパク質が挙げられる。

【0006】

抗体療法は創薬可能なタンパク質に限定されており、なぜならば、抗体は、その治療効果を発揮するためにはタンパク質に結合し得なければならないからである。ｓｉＲＮＡを使用して、創薬不能なタンパク質をコードする遺伝子等の任意の遺伝子の翻訳を阻害し得る。Ｔ細胞活性では、いくつかの創薬不能なタンパク質標的が同定されている。そのため、ｓｉＲＮＡは、Ｔ細胞が関与する疾患等の「創薬不能な」タンパク質により引き起こされる多数の疾患を処置するのに有用であり得る。残念ながら、肝細胞以外の細胞への臨床的に適切なｓｉＲＮＡ送達（Adams, D., et al., N Engl J Med, 379:11-21 (2018)）は、依然として困難である（Lorenzar, C., et al., J Control Release, 203:1-15 (2015)）。Ｔ細胞ｓｉＲＮＡ送達ではいくつかの進歩が見られるが、いくつかの障害が残っている。例えば、ｓｉＲＮＡは、正電荷を持つペプチドに連結された一本鎖抗体を使用してＴ細胞に送達され、これにより、５ｍｇ／ｋｇという高投与量で標的遺伝子のサイレンシングが引き起こされた（Kumar, P., et al., Cell, 134:577-586 (2008)）。別の例では、ナノ粒子が抗ＣＤ４抗体でコーティングされ、１ｍｇ／ｋｇの用量で２０％のインビボでの標的遺伝子のサイレンシングが引き起こされた（Ramishetti, S., et al., ACS Nano, 9:6706-6716 (2015)）。より最近では、肝細胞を標的とする脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、これをＣＤ４抗体でコーティングすることによりＴ細胞に再標的化させ、これにより、６ｍｇ／ｋｇの用量で５０％のインビボでのＴ細胞遺伝子のサイレンシングが引き起こされた（Kedmi, R., et al., Nat Nanotechnol, 13:214-219 (2018)）。これら全ての治療には、２つの重要な共通点がある。第１に、５０％の遺伝子サイレンシングを達成するためには１ｍｇ／ｋｇを超えるｓｉＲＮＡが必要であり、これは、ヒトでの使用が承認されている現在のｓｉＲＮＡ用量を超えている（Adams, D., et al., N Engl J Med, 379:11-21 (2018)）。第２に、これらの治療は、ペプチドベースか、タンパク質ベースか、またはアプタマーベースのターテゲィングリガンドを使用してＴ細胞送達を実現する。

【0007】

ナノ医療は、ターゲティングリガンドを使用して細胞内に輸送されることが多い（Cheng, S., et al., Science, 338:903-910 (2012)）。しかしながら、ＦＤＡにより承認された唯一のＲＮＡナノ粒子療法は、肝細胞に自然に輸送される脂質の単純な混合物を利用する（Adams, D., et al., N Engl J Med, 379:11-21 (2018)）。自然な輸送は、免疫細胞へのナノ粒子の送達を促進することは示されていない。Ｔ細胞へのナノ粒子送達のための現在の選択肢は、遺伝子サイレンシングを達成するために高用量の核酸を必要とし、細胞送達に関してターゲティングリガンドに依存していることから、Ｔ細胞への送達のための改善されたナノ粒子組成物が必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、本発明の目的は、免疫細胞に核酸を送達し得る送達ビヒクルおよびその使用方法を提供することである。

【0009】

本発明の別の目的は、免疫細胞の機能をモジュレートする方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

特定の細胞または組織の微小環境に核酸を送達するための組成物が提供される。一実施形態では、この組成物は、脾臓および肝臓でのクリアランスを減少させるように配合されている脂質ナノ粒子組成物である。脂質ナノ粒子の化学組成は脂質ナノ粒子の自然な輸送に有意に影響を及ぼすことが発見された。より具体的には、立体構造的に拘束されているイオン性脂質（conformationally constrained ionizable lipid）は、ターゲティングリガンドを必要とすることなく、脂質ナノ粒子の指向性およびクリアランスプロファイルを修飾し得ることが発見された。本開示の脂質ナノ粒子の指向性がサイズ依存的であることも発見された。

【0011】

一実施形態は、立体構造的に拘束されているイオン性脂質、リン脂質、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および任意選択で、核酸を有するイオン性脂質ナノ粒子を提供する。一実施形態では、この拘束されているイオン性脂質は、式Ｉ：

【0012】

【化1】

に従う構造を有しており、
式中、
Ｒ_１は、

【0013】

【化2】

であり、
Ｒ_２は、

【0014】

【化3】

である。

【0015】

別の実施形態では、拘束されているイオン性脂質は、アダマンタンテイル（adamantane tail）を含む。一部の実施形態では、拘束されているイオン性脂質は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエートである。一部の実施形態では、リン脂質は、１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）または１－２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子はステロールを含む。一部の実施形態では、ステロールはコレステロールである。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはこれらの組合せであり得る。

【0016】

一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（RNA-guided DNA endonuclease）をコードし、このＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0017】

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％のコレステロール、および約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質を含む。他の実施形態では、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、３５、４５、５０、または６５モルパーセントで存在し得る。

【0018】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、流体力学的直径が約３０ｎｍ～約１７０ｎｍである。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、平均直径が５０ｎｍ～１００ｎｍである。

【0019】

本開示の脂質ナノ粒子は、薬学的に許容される賦形剤または薬学的に許容される担体を任意選択で含む医薬組成物として配合され得る。

【0020】

一実施形態は、脂質ナノ粒子であって、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００が２．０～３．０モルパーセントで存在し、ＤＳＰＣが１５～１７モルパーセントで存在し、コレステロールが４５～４７モルパーセントで存在し、拘束されている脂質が３３～３６モルパーセントで存在する、脂質ナノ粒子を提供する。

【0021】

さらに別の実施形態は、それを必要とする対象に、治療用核酸（例えば、治療用タンパク質をコードする核酸）、または阻害性核酸もしくは酵素性核酸を含む本開示の脂質ナノ粒子組成物の内の１つまたは複数を投与することにより対象に治療薬または予防薬を送達する方法を提供する。この方法は、別の治療薬を投与することをさらに含み得る。一実施形態では、ナノ粒子は、免疫細胞にカーゴを優先的に送達する。免疫細胞は、Ｔ細胞であり得、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＴ調節性細胞であり得る。免疫細胞はまた、マクロファージまたは樹状細胞でもあり得る。

【0022】

一実施形態は、ナノ粒子の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させるかまたは阻害するために、ナノ粒子と、立体構造的に拘束されているイオン性脂質の有効量とを配合することにより、ナノ粒子組成物の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させる方法を提供する。

【0023】

別の実施形態は、それを必要とする対象に、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコ－ル－脂質、コレステロール、および核酸からなる脂質ナノ粒子を投与することにより対象の免疫細胞に核酸を送達する方法であって、脂質ナノ粒子組成物は、任意選択でターゲティングリガンドの非存在下で、対象の免疫細胞に核酸を送達する、方法を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。

【0024】

さらに別の実施形態は、それを必要とする対象に、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコ－ル－脂質、コレステロール、および阻害性核酸からなる脂質ナノ粒子組成物を投与することにより対象の免疫細胞中での遺伝子発現を減少させる方法であって、この脂質ナノ粒子組成物は、対象の免疫細胞に阻害性核酸を送達する、方法を提供する。

【0025】

別の実施形態は、それを必要とする対象に、脂質ナノ粒子の第１の集団および第２の集団を含む脂質ナノ粒子組成物を投与することにより対象の免疫細胞中で遺伝子を編集する方法であって、脂質ナノ粒子の第１の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびこの遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡからなり、脂質ナノ粒子の第２の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡからなる、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1-1】図１Ａは、イオン性脂質の骨格であって、テイルバリアント（構造を図１Ｂに示す）およびヘッド基バリアント（構造を図１Ｃに示す）が付加された骨格の構造である。

【図1-2】図１Ｄは、１０４種の異なるＬＮＰを配合するために使用されるイオン性脂質、コレステロール、脂質－ＰＥＧ、およびＤＳＰＣまたはＤＯＰＥのいずれかの４つのモル比を示す概略図である。

【図1-3】図１Ｅは、個々に測定した、配合した全てのＬＮＰの流体力学的直径（ｎｍ）を示すドットプロットである。図１Ｆは、個々に測定した、配合した全てのＬＮＰの多分散性指数を示すドットプロットである。

【図1-4】図１Ｇ～１Ｉは、イオン性脂質のタイプ（図１Ｇ）、イオン性脂質のモルパーセント（図１Ｈ）、およびリン脂質のタイプ（図１Ｉ）の関数としてプロットされたＬＮＰの流体力学的直径を示す棒グラフである。

【図2-1】図２Ａは、様々なＤＮＡバーコードおよびｓｉＧＦＰを担持するように配合されたナノ粒子を示す概略図である。

【図2-2】図２Ｂは、１００個の安定したＬＮＰを一緒にプールする工程、これらを、ＧＦＰを発現するマウスに投与する工程、３日後にＧＦＰ^Ｌｏｗ細胞を単離する工程、およびこの集団内のＤＮＡバーコードを配列決定する工程を含む実験ワークフローを示す概略図である。

【図2-3】図２Ｃは、９種の細胞タイプでのＧＦＰ^Ｌｏｗ細胞の割合を示す棒グラフである。図２Ｄは、９種の細胞タイプでのＧＦＰ ＭＦＩの割合を示す棒グラフである。

【図2-4】図２Ｅは、肺内皮細胞、脾臓のＢ細胞およびＴ細胞、ならびに肝臓免疫細胞における正規化ＤＮＡ送達を示すドットプロットである。

【図2-5】図２Ｆは、脾臓のＴ細胞におけるＤＳＰＣ含有ＬＮＰの富化を示す概略図である。

【図2-6】図２Ｇは、リン脂質の関数としてプロットされたＬＮＰの正規化ＤＮＡ送達を示すドットプロットである。二元配置Ｔ検定、^＊＊Ｐ＜０．０１。図２Ｈは、ＤＳＰＣまたはＤＯＰＥを含むＬＮＰの正規化ＤＮＡ送達の対応のある解析である。対応のある二元配置Ｔ検定、^＊Ｐ＜０．０５。

【図2-7】図２Ｉは、１３種のイオン性脂質のそれぞれに関する富化を示す棒グラフである。

【図2-8】図２Ｊは、ヘッド基１１およびテイルＬ、Ｓ、またはＡと共に配合されたＬＮＰの正規化ＤＮＡ送達を示す棒グラフである。一元配置ＡＮＯＶＡ、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。

【図3-1】図３Ａは、イオン性脂質１１－Ａの構造を示す。

【図3-2】図３Ｂは、最高性能のｃＬＮＰのモル組成を示す。図３Ｃは、１．５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｓｉＬｕｃを担持するｃＬＮＰの処置または０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇの用量での、ｓｉＧＦＰを担持しているｃＬＮＰの処置の７２時間後での脾臓ＣＤ３^＋ Ｔ細胞中におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリヒストグラムである。

【図3-3】図３Ｄは、様々な用量での、ｓｉＬｕｃまたはｓｉＧＦＰを担持するｃＬＮＰによる処置の７２時間後での脾臓ＣＤ３＋ Ｔ細胞中における正規化ＧＦＰ ＭＦＩを示す棒グラフである。図３Ｅは、２．０ｍｇ／ｋｇの用量での、ｓｉＧＦＰを担持するｃＬＮＰの処置の７２時間後での脾臓ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞中における正規化ＧＦＰ ＭＦＩを示す棒グラフである。

【図3-4】図３Ｆは、２．０ｍｇ／ｋｇの用量での、ｓｇＲＮＡを担持するｃＬＮＰの処置後の脾臓ＣＤ３＋ Ｔ細胞ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞中における正規化ＧＦＰ ＭＦＩを示す棒グラフである。図３Ｇは、２．０ｍｇ／ｋｇの用量での、ｓｇＲＮＡを担持するｃＬＮＰの処置後のＧＦＰ^ＬｏｗＣＤ８＋ Ｔ細胞の割合を示す棒グラフである。

【図4-1】図４Ａは、イオン性脂質のヘッド基の分子量と、Ｔ細胞中での富化とを関連付けるグラフを示す。図４Ｂは、イオン性脂質のヘッド基のＬｏｇＰと、Ｔ細胞中での富化とを関連付けるグラフを示す。

【図4-2】図４Ｃは、イオン性脂質上のヘッド基の極性表面積のＬｏｇＰと、Ｔ細胞中での富化とを関連付けるグラフを示す。図４Ｄは、ＤＳＰＣと、１つのテイルのみが異なるイオン性脂質とを含むＬＮＰの対応のある解析を示す。

【図4-3】図４Ｅは、正規化ＤＮＡ送達とＬＮＰ直径との比較を示す。

【図5-1】図５Ａは、ＰＢＳ処理マウス、ならびに肝細胞、肝臓免疫細胞、肝臓クッパー細胞、肝臓内皮細胞、脾臓単球、および脾臓Ｂ細胞にｓｉルシフェラーゼおよびｓｉＧＦＰを送達する拘束された脂質を含むＬＮＰ（１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したものでの正規化ＧＦＰタンパク質ＭＦＩである。

【図5-2】図５Ｂ～Ｃは、ＰＢＳ処理マウス、ならびに肝細胞、肝臓免疫細胞、肝臓クッパー細胞、肝臓内皮細胞、脾臓単球、および脾臓Ｂ細胞にｓｉルシフェラーゼおよびｓｉＧＦＰを送達する拘束された脂質を含むＬＮＰ（１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したものでの正規化ＧＦＰタンパク質ＭＦＩである。

【図5-3】図５Ｄ～Ｅは、ＰＢＳ処理マウス、ならびに肝細胞、肝臓免疫細胞、肝臓クッパー細胞、肝臓内皮細胞、脾臓単球、および脾臓Ｂ細胞にｓｉルシフェラーゼおよびｓｉＧＦＰを送達する拘束された脂質を含むＬＮＰ（１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したものでの正規化ＧＦＰタンパク質ＭＦＩである。

【図5-4】図５Ｆは、ＰＢＳ処理マウス、ならびに肝細胞、肝臓免疫細胞、肝臓クッパー細胞、肝臓内皮細胞、脾臓単球、および脾臓Ｂ細胞にｓｉルシフェラーゼおよびｓｉＧＦＰを送達する拘束された脂質を含むＬＮＰ（１．５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）を投与したものでの正規化ＧＦＰタンパク質ＭＦＩである。図５Ｇは、ｓｇＧＦＰの配列および化学的修飾である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

Ｉ．定義
本開示は、本明細書で説明されている組成物および方法ならびに説明されている実験条件に限定されず、それ自体が変動し得ることを理解すべきである。本明細書で使用されている用語法は、ある特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することは意図されておらず、なぜならば、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲のみにより限定されるからであることも理解しなければならない。

【0028】

別途定義されない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。しかしながら、本明細書で説明されているものと類似のまたは等価のあらゆる組成物、方法、および材料を、本発明の実施または試験で使用し得る。言及されている全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0029】

現在特許請求されている発明を説明する文脈（特に、特許請求の範囲の文脈）での「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および類似の指示物の使用は、別途本明細書で示されているかまたは文脈と明確に矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するように解釈されるものとする。

【0030】

１つまたは複数のキラル中心を有する、本明細書で説明されているあらゆる化合物において、絶対的な立体化学が明確に示されていない場合には、各中心は、独立して、Ｒ－立体配置もしくはＳ－立体配置またはこれらの混合物であり得ることが理解される。そのため、本明細書で提供される化合物は、鏡像異性的に純粋であってもよいし、鏡像異性的に富化されていてもよいし、ラセミ混合物であってもよいし、ジアステレオマー的に純粋であってもよいし、ジアステレオマー的に富化されていてもよいし、立体異性混合物であってもよい。加えて、ＥまたはＺと定義され得る幾何学的異性体を生成する１つまたは複数の二重結合を有する、本明細書で説明されている任意の化合物において、各二重結合は、独立して、Ｅであってもよいし、Ｚであってもよいし、これらの混合物であってもよいことが理解される。

【0031】

本明細書における値の範囲の列挙は、別途本明細書で示されない限り、この範囲内の各個々の値を独立して言及するための速記法として役立つことが意図されているのみであり、各個別の値は、本明細書で独立して列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。

【0032】

「約」という用語の使用は、約±１０％の範囲で、記載された値の上または下のいずれかの値を説明することが意図されており、他の実施形態では、この値は、約±５％の範囲で、記載された値の上または下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、この値は、約±２％の範囲で、記載された値の上または下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、この値は、約±１％の範囲で、記載された値の上または下のいずれかの値の範囲であり得る。前述の範囲は、文脈により明確になることが意図されており、さらなる限定が暗示されているものではない。別途本明細書で示されない限り、または別途文脈と明確に矛盾しない限り、本明細書で説明されている全ての方法を、任意の適切な順序で実施し得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な文言（例えば「等」）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることが意図されているのみであり、別途特許請求されない限り本発明の範囲に制限をもたらすものではない。本明細書中のいかなる文言も、特許請求されていないあらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」は、天然に存在してもよいし天然に存在していなくてもよいリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、修飾されたおよび／または天然に存在しない成分（例えば、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカー）を含み得る。ＲＮＡは、キャップ構造、鎖終結ヌクレオシド、ステプループ、ポリＡ配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。ＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有し得る。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳（例えば、哺乳類細胞内でのｍＲＮＡのインビボでの翻訳）により、コードされたポリペプチドが産生され得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、単一誘導型ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびこれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。

【0034】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合により互いに連結された少なくとも３個のアミノ酸の文字列を指すために互換的に使用され得る。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集団を指す場合がある。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸（即ち、自然界には存在しないがポリペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）、および／またはアミノ酸類似体を含み得る。同様に、ペプチド中のアミノ酸の１つまたは複数が、例えば、化学物質（例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の修飾のためのリンカー等）の付加により修飾されている場合がある。修飾として、ペプチドの環化、Ｄアミノ酸の組込み等が挙げられ得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」、および「治療的使用」という用語は、疾患または障害の１種または複数種の症状の除去、軽減、または軽快を指す。本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」は、そのような症状の臨床的に適切な除去、軽減、または軽快を媒介するのに十分な治療薬の量を指す。効果の大きさがレシピエント対象の健康または予後に影響を及ぼすのに十分な場合には、この効果は臨床的に適切である。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延させるかまたは最小限に抑える（例えば、がんの広がりを遅延させるかまたは最小限に抑える）のに十分な治療薬の量を指す場合がある。治療上有効な量はまた、疾患の処置または管理において治療上の利益をもたらす治療薬の量を指す場合もある。

【0036】

本明細書で使用される場合、「予防薬」という用語は、ある障害または疾患の任意の症状の検出前に、そのような障害または疾患の予防で使用され得る薬剤を指す。「予防的に有効な」量とは、そのような保護を媒介するのに十分な予防薬の量のことである。予防的に有効な量はまた、疾患の予防において予防的な利益をもたらす予防薬の量を指す場合もある。

【0037】

本明細書で使用される場合、「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、哺乳類（例えば、限定されないが、ヒト、齧歯類、例えばマウスおよびラット、ならびに他の実験動物）を指す。

【0038】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、あらゆる標準的な医薬担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、およびエマルション（例えば、油／水エマルションまたは水／油エマルション）、ならびに様々なタイプの湿潤剤）を包含する。

【0039】

本明細書で使用される場合、「立体構造的に拘束されている脂質」という用語は、分子構造が主に１つの構造である脂質（例えば、形状が「アームチェア」に似ているアダマンタン）を指す。

【0040】

「ＰＥＧ－脂質」という用語は、ポリエチレングルコールで修飾されている脂質を指す。例示的なＰＥＧ－脂質として、Ｃ_１４ＰＥＧ_３５０、Ｃ_１４ＰＥＧ_１０００、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００、Ｃ_１４ＰＥＧ_３０００、およびＣ_１８ＰＥＧ_２０００が挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的少数のヌクレオチドを含む短いＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡ分子もしくはオリゴマーを指す。

【0042】

本明細書で説明されている一部の実施形態は、式（Ｉ）：

【0043】

【化4】

の化合物であって、
式中、
Ｒ_１は、

【0044】

【化5】

であり、
Ｒ_２は、

【0045】

【化6】

であり、式中、Ｘは、

【0046】

【化7】

であり、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、

【0047】

【化8】

である、
化合物に関する。

【0048】

一部の実施形態は、式（ＩＩＩ）：

【0049】

【化9】

の化合物であって、
式中、
Ｒ_８は、－Ｈまたは

【0050】

【化10】

であり、
Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７，およびＲ_９は、それぞれ独立して、－Ｃ_８Ｈ_１７、－Ｃ_１０Ｈ_２１、－Ｃ_１２Ｈ_２５、－Ｃ_１３Ｈ_２７、－Ｃ_１４Ｈ_２９、Ｃ_１６Ｈ_３３、またはアダマンタニルであり、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０、１、２、３、または４であり、
Ａは、

【0051】

【化11】

、－Ｏ－、

【0052】

【化12】

、－Ｓ－、

【0053】

【化13】

であり、
Ｒ_１０およびＲ_１１は、それぞれ独立して、－Ｈまたは

【0054】

【化14】

であり、
Ｒ_１２は、－Ｃ_１０Ｈ_２１である、
化合物に関する。

【0055】

一部の実施形態は、Ｒ_２が

【0056】

【化15】

である化合物に関する。

【0057】

一部の実施形態は、立体構造的に拘束されているイオン性脂質、リン脂質、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および任意選択で核酸を含む脂質ナノ粒子組成物に関する。一部の実施形態は、脂質ナノ粒子であって、立体構造的に拘束されているイオン性脂質が、本明細書で説明されている構造に従う構造を含む脂質ナノ粒子に関する。一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、存在する立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量が、総モル数を基準として約３５～約６５モルパーセントの範囲である、脂質ナノ粒子組成物に関する。

【0058】

一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、立体構造的に拘束されているイオン性脂質が、

【0059】

【化16】

に従う構造を有する、脂質ナノ粒子組成物に関する。

【0060】

一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、立体構造的に拘束されているイオン性脂質が、

【0061】

【化17】

に従う構造を有する、脂質ナノ粒子組成物に関する。

【0062】

一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、リン脂質が、１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、脂質ナノ粒子組成物に関する。一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、ポリエチレングリコール－脂質が、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００またはＣ_１８ＰＥＧ_２０００である、脂質ナノ粒子組成物に関する。

【0063】

一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％のコレステロール、および約０．１ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のポリエチレングリコール－脂質を含む脂質ナノ粒子組成物に関する。

【0064】

一部の実施形態は、脂質ナノ粒子組成物であって、核酸は、ＲＡＮ、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、またはこれらの組合せを含む、脂質ナノ粒子組成物に関する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、核酸がタンパク質をコードする、組成物である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、核酸がＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする、組成物である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｘ１３、またはＣｐｆ１である、組成物である。

【0065】

一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子の流体力学的直径が約３０ｎｍ～約１７０ｎｍの範囲である、組成物である。

【0066】

一部の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、アダマンタンテイルを含む立体構造的に拘束されているイオン性脂質、１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００、コレステロール、およびｓｉＲＮＡを含む。脂質ナノ粒子の一部の実施形態では、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエートである。

【0067】

脂質ナノ粒子の一部の実施形態では、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００は、約２．０～約３．０モルパーセントで存在し、ＤＳＰＣは、約１５～約１７モルパーセントで存在し、コレステロールは、約４５～約４７モルパーセントで存在し、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、約３３～約３６モルパーセントで存在し、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに対する５～２０質量比の総脂質で存在する。一部の実施形態では、Ｃ_１４ＰＥＧ_２０００は、約２．５モルパーセントで存在し、ＤＳＰＣは、約１６モルパーセントで存在し、コレステロールは、約４６．５モルパーセントで存在し、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、約３５モルパーセントで存在する。

【0068】

一部の実施形態は、本明細書で説明されている脂質ナノ粒子組成物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

【0069】

一部の実施形態は、それを必要とする対象に核酸を送達する方法であって、この対象に、本明細書で説明されている脂質ナノ粒子組成物または医薬組成物を投与することを含む方法に関する。一部の実施形態は、この対象に別の治療薬を投与することをさらに含む。

【0070】

一部の実施形態は、それを必要とする対象の免疫細胞に核酸を送達する方法であって、この対象に、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および核酸からなる脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、この脂質ナノ粒子組成物は、この対象の免疫細胞に核酸を送達する、方法に関する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、この脂質ナノ粒子組成物の標的を免疫細胞に定めるターゲティングリガンドを含まない。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＴ調節性細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋である。一部の実施形態では、免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、または肝臓免疫細胞である。

【0071】

一部の実施形態は、ナノ粒子組成物の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させる方法であって、対象に投与された場合に、このナノ粒子組成物の脾臓または肝臓でのクリアランスを減少させるかまたは阻害するのに有効な、立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量を含むナノ粒子組成物を配合することを含む方法に関する。一部の実施形態では、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、本明細書で説明されている構造を含む。

【0072】

一部の実施形態は、対象の非肝細胞へのナノ粒子組成物の送達を増加させる方法であって、この対象に投与された場合に非肝細胞へのこのナノ粒子組成物の送達を増加させるのに有効な、立体構造的に拘束されているイオン性脂質の量を含むようにナノ粒子組成物を配合することを含む方法に関する。一部の実施形態では、立体構造的に拘束されているイオン性脂質は、本明細書で説明されている構造を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子医薬組成物である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子医薬組成物は、リン脂質、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および任意選択で第１の核酸を含む。一部の実施形態では、非肝細胞は、脾臓Ｂ細胞、脾臓Ｔ細胞、肺内皮細胞、および肝臓免疫細胞の内の少なくとも１つである。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物は、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇの範囲の量で対象に送達される第２の核酸をさらに含む。一部の実施形態では、対象に送達される第２の核酸の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である。

【0073】

一部の実施形態は、それを必要とする対象の免疫細胞中での遺伝子発現を減少させる方法であって、この対象に、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および阻害性核酸からなる脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、この脂質ナノ粒子組成物は、この対象の免疫細胞に阻害性核酸を送達する、方法に関する。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、対象に投与される阻害性核酸の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、対象に投与される阻害性核酸の量は、約０．５ｍｇ／ｋｇである。

【0074】

一部の実施形態は、それを必要とする対象の免疫細胞中で遺伝子を編集する方法であって、この対象に、脂質ナノ粒子の第１の集団および第２の集団を含む脂質ナノ粒子組成物を投与することを含み、脂質ナノ粒子の第１の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびこの遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡからなり、脂質ナノ粒子の第２の集団は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡからなる、方法に関する。一部の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、およびＣｐｆ１からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象に投与されるｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの一方または両方の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満である。一部の実施形態では、対象に投与されるｓｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの一方または両方の量は、約０．５ｍｇ／ｋｇである。

【0075】

ＩＩ．脂質ナノ粒子
生物学的に活性な物質（例えば、低分子薬物、タンパク質、および核酸）の効果的な標的送達は、医薬品の分野での継続的な課題である。核酸は比較的不安定でありかつ細胞透過性が低いことから、核酸の特異的な送達は困難である。拘束された脂質を有する脂質ナノ粒子は、身体中の特定の組織に、核酸をより効果的に送達し得ることが発見された。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、核酸と、立体構造的に拘束されているイオン性脂質、ＰＥＧ－脂質、リン脂質、コレステロール、および任意選択で核酸とを混合することにより配合され得る。例示的な脂質ナノ粒子配合物として、立体構造的に拘束されているイオン性脂質である３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＰＥＧ－脂質、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、およびコレステロールが挙げられる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ターゲティングリガンドを含まない。一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、ターゲティングリガンドの非存在下で、肝細胞よりもＴ細胞を優先的に標的とする。

【0076】

脂質ナノ粒子のサイズは様々である。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、流体直径が約３０～約１７０ｎｍのであり得る。脂質ナノ粒子は、直径が約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１５５ｎｍ、１６０ｎｍ、１６５ｎｍ、または１７０ｎｍであり得る。別の実施形態では、ナノ粒子は、直径が５０ｎｍ～１００ｎｍである。

【0077】

Ａ．イオン性脂質
一実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、イオン性脂質を含む。このイオン性脂質は、典型的には、ヘッド基上でアミン含有を含む。一実施形態では、このイオン性脂質は、立体構造的に拘束されているイオン性脂質である。一部の実施形態では、この立体構造的に拘束されている脂質は、３５、４５、５０、または６５モルパーセントで存在する。別の実施形態では、この立体構造的に拘束されている脂質は、約３３ｍｏｌ％～約３６ｍｏｌ％で存在する。さらに別の実施形態では、この立体構造的に拘束されている脂質は、３５ｍｏｌ％で存在する。一実施形態は、式Ｉ：

【0078】

【化18】

に従う構造を有する脂質を含むＬＮＰであって、
式中、
Ｒ_１は、

【0079】

【化19】

からなる群から選択される脂質テイルであり、
Ｒ_２は、

【0080】

【化20】

からなる群から選択されるヘッド基である、
ＬＮＰを提供する。

【0081】

別の実施形態は、式ＩＩ：

【0082】

【化21】

に従う構造を有するイオン性脂質である３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、または式ＩＩのイオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0083】

別の実施形態は、式Ｉに従うイオン性脂質であって、Ｒ_１はテイルＬであり、Ｒ_２は化合物（１）である、イオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0084】

さらに別の実施形態は、式Ｉに従うイオン性脂質であって、Ｒ_１はテイルＬであり、Ｒ_２は化合物（２）である、イオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0085】

一実施形態は、下記の構造：

【0086】

【化22】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0087】

一実施形態は、下記の構造：

【0088】

【化23】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0089】

一実施形態は、下記の構造：

【0090】

【化24】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0091】

一実施形態は、下記の構造：

【0092】

【化25】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0093】

一実施形態は、下記の構造：

【0094】

【化26】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0095】

一実施形態は、下記の構造：

【0096】

【化27】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0097】

一実施形態は、下記の構造：

【0098】

【化28】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0099】

一実施形態は、下記の構造：

【0100】

【化29】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0101】

一実施形態は、下記の構造：

【0102】

【化30】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0103】

一実施形態は、下記の構造：

【0104】

【化31】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0105】

一実施形態は、下記の構造：

【0106】

【化32】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0107】

一実施形態は、下記の構造：

【0108】

【化33】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0109】

一実施形態は、下記の構造：

【0110】

【化34】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0111】

一実施形態は、下記の構造：

【0112】

【化35】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0113】

一実施形態は、下記の構造：

【0114】

【化36】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0115】

一実施形態は、下記の構造：

【0116】

【化37】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0117】

一実施形態は、下記の構造：

【0118】

【化38】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0119】

一実施形態は、下記の構造：

【0120】

【化39】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0121】

一実施形態は、下記の構造：

【0122】

【化40】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0123】

一実施形態は、下記の構造：

【0124】

【化41】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0125】

一実施形態は、下記の構造：

【0126】

【化42】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0127】

一実施形態は、下記の構造：

【0128】

【化43】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0129】

一実施形態は、下記の構造：

【0130】

【化44】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0131】

一実施形態は、下記の構造：

【0132】

【化45】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0133】

一実施形態は、下記の構造：

【0134】

【化46】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0135】

一実施形態は、下記の構造：

【0136】

【化47】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0137】

一実施形態は、下記の構造：

【0138】

【化48】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0139】

一実施形態は、下記の構造：

【0140】

【化49】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0141】

一実施形態は、下記の構造：

【0142】

【化50】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0143】

一実施形態は、下記の構造：

【0144】

【化51】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0145】

一実施形態は、下記の構造：

【0146】

【化52】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0147】

一実施形態は、下記の構造：

【0148】

【化53】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0149】

一実施形態は、下記の構造：

【0150】

【化54】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0151】

一実施形態は、下記の構造：

【0152】

【化55】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0153】

一実施形態は、下記の構造：

【0154】

【化56】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0155】

一実施形態は、下記の構造：

【0156】

【化57】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0157】

一実施形態は、下記の構造：

【0158】

【化58】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0159】

一実施形態は、下記の構造：

【0160】

【化59】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0161】

一実施形態は、下記の構造：

【0162】

【化60】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0163】

一実施形態は、下記の構造：

【0164】

【化61】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0165】

一実施形態は、下記の構造：

【0166】

【化62】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0167】

一実施形態は、下記の構造：

【0168】

【化63】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0169】

一実施形態は、下記の構造：

【0170】

【化64】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0171】

一実施形態は、下記の構造：

【0172】

【化65】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0173】

一実施形態は、下記の構造：

【0174】

【化66】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0175】

一実施形態は、下記の構造：

【0176】

【化67】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0177】

一実施形態は、下記の構造：

【0178】

【化68】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0179】

一実施形態は、下記の構造：

【0180】

【化69】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0181】

一実施形態は、下記の構造：

【0182】

【化70】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0183】

一実施形態は、下記の構造：

【0184】

【化71】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0185】

一実施形態は、下記の構造：

【0186】

【化72】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0187】

一実施形態は、下記の構造：

【0188】

【化73】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0189】

一実施形態は、下記の構造：

【0190】

【化74】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0191】

一実施形態は、下記の構造：

【0192】

【化75】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0193】

一実施形態は、下記の構造：

【0194】

【化76】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0195】

一実施形態は、下記の構造：

【0196】

【化77】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0197】

一実施形態は、下記の構造：

【0198】

【化78】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0199】

一実施形態は、下記の構造：

【0200】

【化79】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0201】

一実施形態は、下記の構造：

【0202】

【化80】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0203】

一実施形態は、下記の構造：

【0204】

【化81】

に従うイオン性脂質、または前記イオン性脂質を含むＬＮＰを提供する。

【0205】

Ｂ．ステロール
一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、１種または複数種のステロールを含む。一実施形態では、このステロールは、コレステロール、またはそのバリアントもしくは誘導体である。一部の実施形態では、このコレステロールは修飾されており、例えば酸化されている。未修飾コレステロールは、酵素が作用して、側鎖または環が酸化されているバリアントを形成し得る。このコレステロールは、ベータ環構造上で酸化され得るか、または炭化水素テイル構造上で酸化され得る。本開示の脂質ナノ粒子での使用が考慮される例示的なコレステロールとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：２５－ヒドロキシコレステロール（２５－ＯＨ）、２０α－ヒドロキシコレステロール（２０α－ＯＨ）、２７－ヒドロキシコレステロール、６－ケト－５α－ヒドロキシコレステロール、７－ケトコレステロール、７β－ヒドロキシコレステロール、７α－ヒドロキシコレステロール、７β－２５－ジヒドロキシコレステロール、ベータ－シトステロール、スチグマステロール、またはこれらの組合せ。一実施形態では、側鎖が酸化されているコレステロールは、他のコレステロールバリアントと比較してカーゴの送達を増強し得る。一実施形態では、このコレステロールは、未修飾コレステロールである。

【0206】

Ｃ．ＰＥＧ－脂質
一部の実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、また１種もしくは複数種のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質も含む。そのような種はまた、ＰＥＧ化脂質またはＰＥＧ－脂質とも称され得る。ＰＥＧ化脂質の含有を使用して、インビトロでの脂質ナノ粒子のコロイド安定性を増強し得、かつインビボでの循環時間を増強し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ化は、ＰＥＧ部分が血液循環中に徐々に放出されるという点で可逆的である。例示的なＰＥＧ－脂質として、長さがＣ_６～Ｃ_２０である飽和アルキル鎖または不飽和アルキル鎖にコンジュゲートしたＰＥＧ挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、およびこれらの混合物。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＥ、ＰＥＧ－ＤＳＧ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。

【0207】

一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ_２０００またはＤＳＰＥ－ＰＥＧ_２０００である。

【0208】

Ｄ．リン脂質
ナノ粒子のリン脂質成分として、１種または複数種のリン脂質が挙げられ得、例えば、１種または複数種の（ポリ）不飽和脂質が挙げられ得る。このリン脂質は、１つまたは複数の脂質二重層を構築し得る。一部の実施形態では、このリン脂質は、リン脂質分と、１つまたは複数の脂肪酸部分とを含み得る。

【0209】

一部の実施形態では、リン脂質部分として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリン。一部の実施形態では、脂肪酸部分として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸。分枝、酸化、環化、およびアルキレン等の修飾および置換が行なわれている天然種を含む非天然種も企図されている。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキレン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合に置き換えられているアルケニル基）で官能化され得るか、またはこのアルキレンと架橋され得る。適切な反応条件下では、アルキレン基は、アジドへの曝露時に銅触媒による環化付加を受け得る。そのような反応は、膜透過もしくは細胞認識を促進するためのナノ粒子組成物の脂質二重層の官能化において有用であり得るか、またはナノ粒子組成物の、ターゲティング部分もしくはイメージング部分（例えば色素）等の有用な成分へのコンジュゲートすることにおいて有用であり得る。

【0210】

例示的なリン脂質として下記が挙げられるが、これらに限定されない：１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、ｌ－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－０－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチリジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルコリン（ＳＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）。好ましい実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。

【0211】

Ｅ．カーゴ
一実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子組成物は、対象に対する治療薬または予防薬を含む。一部の実施形態では、この治療薬または予防薬は、脂質ナノ粒子に封入されている。一実施形態では、この脂質ナノ粒子は、１種または複数種の核酸を含む。

【0212】

代表的な核酸として下記が挙げられるが、これらに限定されない：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）ＲＮＡ、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスＤＮＡ。

【0213】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）ベースの遺伝子編集には、誘導型ＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼタンパク質（Ｃａｓ）の２種の構成成分が必要である。誘導型ＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列に誘導する。次いで、Ｃａｓは、この部位でＤＮＡ中に二本鎖切断を作る。一実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子を使用して、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集に必要な構成成分を運び得る。ある脂質ナノ粒子では、核酸カーゴは誘導型ＲＮＡである。そのような実施形態では、別の脂質ナノ粒子は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸カーゴを含み得る。これら２種の脂質ナノ粒子を一緒に投与し得る。例示的なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとして、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0214】

一実施形態では、カーゴはｓｉＲＮＡである。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘発し得る二本鎖ＤＮＡであり、これにより遺伝子発現が減少するかさらには阻害される。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡとの両方の間の配列同一性の領域内で、相同なＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）の特異的分解を誘発する。例えば、国際公開第０２／４４３２１号パンフレットでは、３’突出末端と塩基対を形成した場合に標的ｍＲＡＮを配列特異的に分解し得るｓｉＲＮＡが開示されており、このパンフレットは、このｓｉＲＮＡを製造する方法に関して参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的な遺伝子サイレンシングを、酵素ダイサーにより産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成短二本鎖ＲＮＡを使用して、哺乳類細胞中で達成し得る（Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498) (Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82。

【0215】

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１．０ｍｇ／ｋｇ未満の阻害性核酸を含む。このナノ粒子は、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、または０．５ｍｇ／ｋｇの阻害性核酸を含み得る。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５ｍｇ／ｋｇの阻害性核酸を含む。これは、遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトでの送達に承認されていない用量である高用量の核酸（＞１ｍｇ／ｋｇ）をナノ粒子が必要とする現在の技術に優る利点である。本開示の技術は、ターゲティングリガンドを含まない脂質ナノ粒子中で０．５ｍｇ／ｋｇの阻害性核酸を使用して、遺伝子サイレンシングを達成し得る。

【0216】

一部の実施形態では、核酸（例えば、限定されないが、オリゴヌクレオチド）は、安定性、半減期、およびヌクレアーゼ感受性を増加させるために修飾されているかまたは１つもしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含む。ヌクレアーゼ感受性を制限するために、天然ホスホジエステルオリゴデオキシリボヌクレオチド、天然ホスホジエステルオリゴリボヌクレオチド、リボヌクレオチドポリマー、およびデオキシリボヌクレオチドポリマーは、１つまたは複数の異なる修飾を含み得る。例示的な修飾として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ホスホロチオエート（phosphorothioate）（ＰＳ）結合、２’’－Ｏメチル（２’ＯＭｅ）、２’フルオロ塩基、逆ｄＴおよびｄｄＴ、オリゴヌクレオチドの３’末端のリン酸化、ロック核酸、およびホスホラミダイトＣ３スペーサーの含有。

【0217】

ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合により、オリゴヌクレオチドのリン酸塩骨格中において、硫黄原子が非架橋酸素に置換される。約５０％の確率で（結果として２種の立体異性体が形成され得るため）、ＰＳ修飾により、ヌクレオチド内結合がヌクレアーゼ分解に対してより耐性を示すようになる。一部の実施形態では、核酸は、エキソヌクレアーゼ分解を阻害するために、１つまたは複数のＰＳ結合を含み、例えば、５’および３’オリゴヌクレオチド末端で少なくとも３つのＰＳ結合を含む。一部の核酸は、同様にエンドヌクレアーゼによる攻撃を減少させるのに役立つオリゴヌクレオチド全体わたりＰＳ結合を含む。

【0218】

ＲＮＡの天然に存在する転写後修飾である２’ＯＭｅは、ｔＲＮＡおよび他の低分子ＲＮＡで見出される。一部の実施形態では、核酸またはオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅを含むように直接合成される。この修飾により、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖のＴｍが増加するが、ＲＮＡ：ＤＮＡ安定性の変化はごくわずかである。これにより、一本鎖エンドヌクレアーゼによる攻撃が防止されるが、エキソヌクレアーゼによる消化は防止されない。一部の実施形態では、これらの核酸またはオリゴヌクレオチドはまた、末端もブロックされる。この修飾を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的には、未修飾ＤＮＡと比べてＤＮアーゼに対する感受性が５～１０倍低い。２’ＯＭｅ修飾は、安定性および標的転写産物に対する結合親和性を増加させるための手段として、アンチセンスオリゴヌクレオチドで一般に使用される。

【0219】

２’－フルオロ塩基は、フッ素修飾リボースを有し、このリボースにより、結合親和性（Ｔｍ）が増加し、かつ天然ＲＮＡと比較してある程度の相対的ヌクレアーゼ耐性も付与される。一部の実施形態では、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ＰＳ修飾結合と共に２’フルオロ塩基を含む。

【0220】

逆ｄＴは、オリゴヌクレオチドの３’末端で組み込まれ得、３’エキソヌクレーゼによる分解およびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を阻害する３’－３’結合が生じる。加えて、オリゴヌクレオチドの５’末端に逆２’，３’ジデオキシ－ｄＴ塩基（５’逆ｄｄＴ）が配置されると、疑似ライゲーションが防止され、いくつかの形態の酵素的分解に対して保護され得る。

【0221】

いくつかの実施形態は、ホスホラミダイトＣ３スペーサーを含む核酸またはオリゴヌクレオチドを提供する。ホスホラミダイトＣ３スペーサーを、オリゴの内部またはいずれかの末端で組み込んで、フルオロフォアまたは他のペンダント基の付着のための長い親水性スペーサーアームを導入し得る。このＣ３スペーサーを使用して、３’エキソヌクレアーゼによる分解も阻害し得る。

【0222】

一部の実施形態では、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ロック核酸を含む。ロック核酸として、リボースの２’－Ｏ原子および４’－Ｃ原子がメチレン架橋を介して結合している修飾ＲＮＡヌクレオチドが挙げられる。この追加の架橋により、通常は環に関連する柔軟性が制限され、構造が強固な立体構造に本質的にロックされる。

【0223】

ＬＮＡは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドの両方に挿入され得る。

【0224】

本開示のナノ粒子により送達され得る他のタイプのカーゴとして、化学療法剤、細胞毒性剤、放射性イオン、低分子、タンパク質、ポリヌクレオチド、および核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0225】

代表的な化学療法剤として下記が挙げられるが、これらに限定されない：アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール－ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せ。代表的なアポトーシス促進剤として下記が挙げられるが、これらに限定されない：フルダラビンタウロスポリン（fludarabinetaurosporine）、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）、およびこれらの組合せ。

【0226】

Ｆ．例示的な脂質ナノ粒子配合物
一実施形態では、脂質ナノ粒子配合物は、約３０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約５ｍｏｌ％～約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％のコレステロール、および約０ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質を含む。別の実施形態では、脂質ナノ粒子配合物は、約３５ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約１６ｍｏｌ％のリン脂質、約４６．５ｍｏｌ％のコレステロール、および約２．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質を含む。別の実施形態では、脂質ナノ粒子配合物は、約５０ｍｏｌ％の立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約１０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％のコレステロール、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ－脂質を含む。

【0227】

一実施形態は、約３３ｍｏｌ％～約３６ｍｏｌ％の、アダマンタンテイルを含む立体構造的に拘束されているイオン性脂質、約１５ｍｏｌ％～約１７ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、約２ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％のＣ_１４ＰＥＧ_２０００、および約４５ｍｏｌ％～約４７ｍｏｌ％のコレステロールを、これら４種の成分の総モル数を基準として含む脂質ナノ粒子配合物を提供する。

【0228】

別の実施形態は、３５ｍｏｌ％の、アダマンタンテイルを含む立体構造的に拘束されているイオン性脂質、１６ｍｏｌ％の１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、および２．５ｍｏｌ％のＣ_１４ＰＥＧ_２０００、４６ｍｏｌ％のコレステロールを、これら４種の成分の総モル数を基準として含む脂質ナノ粒子配合物を提供する。

【0229】

別の実施形態は、（イオン性脂質、コレステロール、脂質－ＰＥＧ、およびリン脂質）：ｓｉＲＮＡの質量比が約２：１～２０：１である脂質ナノ粒子配合物を提供する。

【0230】

さらに別の実施形態では、脂質ナノ粒子配合物は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および阻害性核酸を含む。

【0231】

一実施形態は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子組成物を提供する。別の実施形態は、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を提供する。

【0232】

Ｇ．医薬組成物
本開示の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物が提供される。脂質ナノ粒子組成物の全部または一部を、医薬組成部として配合し得る。医薬組成物は、１種または複数種のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、医薬組成物は、例えば様々なタイプの１種もしくは複数種の核酸を含むがこれらに限定されないかまたは様々な薬剤をコードする１種または複数種の異なる治療薬および／または予防薬を含む１種または複数種のナノ粒子組成物を含み得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤または副成分（例えば、限定されないが、薬学的に許容される担体）を含む。

【0233】

ナノ粒子を含む医薬組成物を、非経口（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射、もしくは皮下注射）、経皮（受動的、またはイオン泳動もしくはエレクトロポレーションを使用する）、または経粘膜（鼻、膣、直腸、舌下）投与経路による投与用に製剤化し得るか、または生体分解可能な挿入物を使用する投与用に製剤化し得、かつ各投与経路に適した剤形で製剤化し得る。

【0234】

一部のインビボアプローチでは、本明細書で開示されているナノ粒子組成物を、治療上有効な量で対象に投与する。本明細書で使用される場合、「有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、処置される障害の１つもしくは複数の症状を処置するか、阻害するか、もしくは軽減するか、または他の方法で所望の薬理効果および／もしくは生理効果を提供するのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する可変要素（例えば、年齢、免疫系の健康等）、疾患、および成し遂げられる処置等の様々な要因に従って変化する。

【0235】

本開示のナノ粒子に関して、さらなる研究が行なわれるにつれて、様々な患者での様々な状態の処置に対する適切な投与量レベルに関する情報が得られ、当業者は、レシピエントの治療状況、年齢、および全体的な健康を考慮して、適切な投与量を特定し得るだろう。選択される投与量は、所望の治療効果、投与経路、および所望の処置期間に依存する。本開示のナノ粒子に関して、１日当たり体重１ｋｇ当たり０．００１ｍｇ～５ｍｇの核酸の一般的な投与量レベルを、哺乳類に投与する。より具体的には、本開示のナノ粒子の優先的な用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．２５ｍｇ／ｋｇである。本開示のナノ粒子に関して、０．２ｍｇ～１００ｍｇの４種の成分（イオン性脂質、コレステロール、ＰＥＧ－脂質、およびリン脂質）／体重１ｋｇの一般的な投与量レベルを、哺乳類に投与する。より具体的には、本開示のナノ粒子の優先的な用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの４種の成分／体重１ｋｇである。

【0236】

ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物を、例えば処置する部位への直接注射により、局所投与する。典型的には、この注射により、脂質ナノ粒子組成物の局所的な濃度は、全身投与により達成され得る濃度と比べて高くなる。この脂質ナノ粒子組成物を、上記で説明されているマトリックスと組み合わせて、処置する部位からのポリペプチドの受動拡散を低減することにより、ポリペプチド組成物の局所的な濃度の上昇の一助となり得る。

【0237】

１．非経口投与用の製剤
一部の実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子組成物（例えば、脂質ナノ粒子を含むもの）を、非経口注射により水溶液で投与する。この製剤はまた、懸濁液または乳濁液の形態でもあり得る。一般的に、有効量の脂質ナノ粒子を含み、任意選択で、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／または担体を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、任意選択で、下記の内の１つまたは複数を含む：希釈剤、滅菌水、様々な緩衝液内容物（例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の緩衝生理食塩水；ならびに添加剤、例えば、洗浄剤および可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ ２０（ポリソルベート－２０）、ＴＷＥＥＮ ８０（ポリソルベート－８０））、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、ならびに保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、ならびに増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）。非水性の溶媒またはビヒクルの例は、下記である：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えば、オリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル。この製剤を凍結乾燥させ、使用直前に再溶解／再懸濁させ得る。この製剤を、例えば、保菌フィルターに通すろ過により滅菌し得るか、組成物への滅菌剤の組込みにより滅菌し得るか、組成物に放射線を照射することにより滅菌し得るか、または組成物を加熱することにより滅菌し得る。

【0238】

２．ポリマーマトリックスの制御された送達
本明細書で開示されている脂質ナノ粒子をまた、制御放出製剤でも投与し得る。制御放出ポリマーデバイスを、ポリマーデバイス（ロッド、シリンダ、フィルム、ディスク）の移植または注射（微粒子）の後に全身に長期放出するために製造し得る。このマトリックスは、微粒子（例えばマイクロスフィア）の形態であって、薬剤が固体ポリマーマトリックスまたはマイクロカプセル内に分散しており、コアがポリマーシェルとは異なる材料であり、ペプチドがコア中に分散しているかまたは懸濁されており、このコアは本質的に液体であってもよいし固体であってもよい、形態であり得る。本明細書で具体的に定義されない限り、微粒子、マイクロスフィア、およびマイクロカプセルは、互換的に使用される。或いは、このポリマーを、ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄いスラブまたはフィルム、粉砕または他の標準的な技術より製造される粉末、さらにはヒドロゲル等のゲルとしてキャストし得る。

【0239】

非生分解性マトリックスまたは生分解性マトリックスのいずれかを脂質ナノ粒子の送達に使用し得るが、一部の実施形態では、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然ポリマーであってもよいし合成ポリマーであってもよいが、分解および放出プロファイルのより良好な特性評価に起因して、一部の実施形態では合成ポリマーが好ましい。このポリマーは、放出が望ましい期間に基づいて選択される。場合によっては、線形放出が最も有用であり得るが、他では、パルス放出または「バルク放出」が、より効果的な結果をもたらし得る。このポリマーは、（典型的には、最大約９０重量％の水の吸収において）ヒドロゲルの形態であり得、かつ任意選択で多価イオンまたはポリマーと架橋され得る。

【0240】

マトリックスを、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出、および当業者に既知の他の方法により形成し得る。生分解性マイクロスフィアを、例えば、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987)；Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987)；およびMathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988)により説明されているように、薬物送達用のマイクロスフィアの製造用に開発された方法の内のいずれかを使用して調製し得る。

【0241】

デバイスを、移植または注射（典型的には、全身の処置用の投与量と比べてはるかに少ない投与量を送達する）の領域を処置するために局所放出用に製剤化し得るか、または全身送達用に製剤化し得る。このデバイスを、皮下に、筋肉、脂肪中に移植し得るかもしくは注射し得えるか、または嚥下し得る。

【0242】

ＩＩＩ．脂質ナノ粒子を製造する方法
脂質ナノ粒子を製造する方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子を、マイクロフルイディクスを使用して製造する。脂質ナノ粒子を形成するためにマイクロフルイディクス使用する例示的な方法に関して、Leung, A.K.K, et al., J Phys Chem, 116:18440-18450 (2012)、Chen, D., et al., J Am Chem Soc, 134:6947-6951 (2012)、およびBelliveau, N.M., et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 1: e37 (2012)を参照されたい。簡潔に説明すると、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ等のカーゴを、ある緩衝液中で調製する。他の脂質ナノ粒子成分（イオン性脂質、ＰＥＧ－脂質、コレステロール、およびＤＳＰＣ）を、別の緩衝液中で調製する。シリンジポンプにより、これら２種の溶液をマイクロ流体デバイスに導入する。これら２種の溶液がマイクロ流体デバイス内で接触して、カーゴが封入されている脂質ナノ粒子が形成される。

【0243】

本開示の脂質ナノ粒子をスクリーニングする方法は、全体が参照により組み込まれている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ／２０１８／０５８１７１号で論じられている。このスクリーニング方法によりビヒクル送達製剤が特性評価されて、所望の指向性を有し且つ機能性カーゴを特定の細胞の細胞質に送達する製剤が同定される。このスクリーニング方法では、細胞に送達された場合に検出され得る機能性を有するレポーターを使用する。細胞中のレポーターの機能を検出することにより、送達ビヒクルの製剤が細胞に機能性カーゴを送達することが示される。化学組成の識別子は、異なる各送達ビヒクル製剤に特異的な化学組成を追跡し続けるために、異なる各送達ビヒクル製剤に含まれる。一実施形態では、化学組成の識別子は、核酸バーコードである。核酸バーコードの配列は、これを含む送達ビヒクルを製剤化するために使用される化学成分と対を形成しており、核酸バーコードが配列決定された場合には、このバーコードを送達した送達ビヒクルの化学組成が同定される。代表的なレポーターとして下記が挙げられるが、これらに限定されない：ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ヌクレアーゼタンパク質、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、低分子、エピジェネティックモディファイア、および表現型モディファイア。

【0244】

ＩＶ．使用方法
本明細書では、特定の細胞または臓器にカーゴ（例えば核酸）を送達するために本開示の脂質ナノ粒子を使用する方法が開示されている。一部の実施形態では、このナノ粒子は、ターゲティングリガンドの非存在下で、それを必要とする対象の特定の細胞または臓器に治療薬または予防薬を送達する。別の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、それを必要とする対象の疾患を処置するかまたは予防するのに有用である。

【0245】

一部の実施形態では、本開示のナノ粒子を対象に直接送達する。他の実施形態では、脂質ナノ粒子をエクスビボで細胞と接触させ、この処置された細胞を対象に投与する。この細胞は自家細胞であり得、例えば免疫細胞（例えば、限定されないが、Ｔ細胞、またはＴ細胞へと分化する細胞）であり得る。一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子を、養子細胞移植のためのビヒクルとして使用し得る。

【0246】

Ａ．細胞にカーゴを送達する方法
本明細書では、それを必要とする対象に治療用および／または予防用の核酸を送達する方法が提供される。

【0247】

一部の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子組成物は、特定のタイプまたはクラスの細胞（例えば、特定の臓器またはその系の細胞）を標的とする。例えば、目的の治療薬および／または予防薬を含むナノ粒子組成物を、対象の免疫細胞に特異的に送達し得る。例示的な免疫細胞としてＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、またはＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、脂質ナノ粒子を、哺乳類の肝臓免疫細胞、脾臓Ｔ細胞、または肺内皮細胞に、ターゲティングリガンドの非存在下で送達されるように製剤化し得る。特定のクラスまたはタイプの細胞への特異的な送達は、脂質ナノ粒子のより高い割合が標的のタイプまたはクラスの細胞に送達されることを示す。一部の実施形態では、特異的な送達により、標的となる目的地の組織１ｇ当たりの治療薬および／または予防薬の量が、２倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍超に増加し得る。

【0248】

Ｂ．遺伝子調節方法
本明細書では、遺伝子調節のために本開示の脂質ナノ粒子を使用する方法が提供される。一実施形態では、この脂質ナノ粒子を使用して、それを必要とする対象の標的細胞中での遺伝子発現を減少させ得る。そのような実施形態では、対象に、脂質ナノ粒子組成物であって、３－［（１－アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および阻害性核酸からなる脂質ナノ粒子組成物を投与する。脂質ナノ粒子は、ターゲティングリガンドを使用することなく対象の標的細胞に阻害性核酸を送達し得る。この阻害性核酸は、ｓｉＲＮＡであり得る。

【0249】

別の実施形態は、それを必要とする対象の細胞中で遺伝子を編集するために本開示の脂質ナノ粒子を使用する方法を提供する。そのような実施形態では、対象に、脂質ナノ粒子の２種の集団を投与する。第１の集団は、アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、および標的とされる遺伝子に特異的なｓｇＲＮＡを含む配合を有する脂質ナノ粒子を含む。脂質ナノ粒子の第２の集団は、アダマンタニル）アセトキシ］－２－｛［３－（ジエチルアミノ）プロポキシカルボニルオキシ］メチル｝プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－９，１２－オクタデカジエノエート、ＤＳＰＣ、ポリエチレングリコール－脂質、コレステロール、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む配合を有する脂質ナノ粒子を含む。このＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１３、またはＣｐｆ１であり得る。

【0250】

一実施形態では、遺伝子調節の標的とされる細胞は、免疫細胞である。この免疫細胞はＴ細胞であり得、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、またはＴ調節性細胞であり得る。遺伝子編集のための他の例示的な免疫細胞として、マクロファージ、樹状細胞、または肝臓免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0251】

標的とされ得る例示的な遺伝子として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＡＫＴｓ、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、キラー免疫グロブリン様受容体、ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ、ＬＦＡ－４、Ｔ４、ＬＦＡ－１、Ｂｐ３５、ＣＤ２７Ｌ受容体、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－３、Ｌ－セレクチン、Ｋｉ－２４、ＭＢ１、Ｂ７、Ｂ７０、Ｍ－ＣＳＦＲ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、ＩＬ－７Ｒ、ＯＸ－４０、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ２５７、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＴＷＥＡＫ－Ｒ、ＴＮＦＲ、ＢＣＭＡ、Ｂ７ＤＣ、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＶＥＧＦＲ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＪＡＧ１、ＧＩＴＲ、ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＧＡＴＡ－３、ＭＴＯＲＣ１、ＭＴＯＲＣ２、ＲＡＰＴＯＲ、ＧＡＴＯＲ、ＦＯＸＰ３、ＮＦＡＴ、ＩＬ２Ｒ、およびＩＬ７。

【0252】

Ｔ細胞により認識され得かつ標的とされることが企図されている例示的な腫瘍関連抗原として下記が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ６、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹＥＳＯ－１、ＭＡＲＴ１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ＭＣ１Ｒ、ＧＰ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＰＳＡ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ－Ｂ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＭＵＣ１、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＲＡＳ、ＣＤＫ－４、ＭＵＭ－１、ＫＲＡＳ、ＭＳＬＮ、およびβ－カテニン。

【0253】

Ｃ．処置される対象
一部の実施形態では、処置される対象は、哺乳類であって、がん、自己免疫疾患、感染症、臓器移植、臓器不全、またはこれらの組合せを経験している哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法は、がんまたは自己免疫疾患の処置のためにＴ細胞に特定の抗原を提示させ得る。一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法を、Ｔ細胞プライミングに使用し得る。一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法を使用して、Ｔ細胞にＭＨＣペプチド複合体を提示させるＤＮＡまたはｍＲＮＡを送達し得る。一部の実施形態では、本明細書で説明されている方法を使用して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡの内の１つまたは複数をＴ細胞に送達してアネルギーを回避し得る。

【実施例】

【0254】

［実施例１．拘束されている脂質の調製］

【0255】

【化82】

【0256】

無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）中のリノール酸１（４．０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．４ｇ、２．９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３．７ｍＬ、２０．５ｍｍｏｌ）、および２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（１．５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下において２５℃で、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（４．１ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を一晩室温で撹拌し、ＴＬＣによりモニタリングしたようにリノール酸１が完全に消費された。次いで、この反応混合物を、減圧下で直接濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配溶離液：１～３０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による粗残留物の精製により、無色油状物として化合物２（２．３ｇ、４４％収率）および化合物３（１．７ｇ、３０％収率）を得た。

【0257】

無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中の化合物２（１５０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．１ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）、およびアダマンタン（７９ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、ＥＤＣＩ（１１４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を一晩室温で撹拌し、ＴＬＣによりモニタリングしたように化合物２が完全に消費された。次いで、この反応混合物を、減圧下で直接濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配溶離液：０～２０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサン）による粗残留物の精製により、無色油状物として化合物４（１０３ｍｇ、５３％収率）を得た。

【0258】

無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍＬ）中の化合物４（７６ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４５ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下で、４－ニトロフェニルクロロホルメート（4-nitrophenylchloroformate）（６５ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を添加した。１時間にわたる室温での撹拌後、この反応混合物に３－ジエチルアミノ－１－プロパノール（０．４４ｍＬ、０．９６ｍｍｏｌ）を添加し、次いで１時間にわたり室温で撹拌した。この反応混合物を、減圧下で直接濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（勾配溶離液：０～４％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）による粗残留物の精製により、無色油状物として化合物１－１（３２ｍｇ、２９％収率）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）Ｃ_４２Ｈ_７２ＮＯ_７の計算値［Ｍ＋Ｈ］^＋：７０２．５３０３、実測値７０２．５２７７。

【0259】

他の脂質を、この実施例で説明されている工程と類似の方法により調製した。

【0260】

［実施例２．立体構造的に拘束されている脂質を含む脂質ナノ粒子は、安定したＬＮＰを形成し得る］
材料および方法：
ナノ粒子配合物．ナノ粒子を、既に説明されているマイクロ流体デバイスを使用して配合した。簡潔に説明すると、核酸（ｓｉＲＮＡおよびＤＮＡバーコード）を、クエン酸緩衝液で希釈し、脂質－アミン化合物、アルキルテイルＰＥＧ、コレステロール、およびＤＳＰＣを、エタノールで希釈した。ＰＥＧ、コレステロール、およびＤＳＰＣを、Ａｖａｎｔｉ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。クエン酸相およびエタノール相を、シリンジポンプによりマイクロ流体デバイス中で合わせた。

【0261】

ナノ粒子の特性評価．プレートリーダー形式の動的光散乱装置（Ｗｙａｔｔ）を使用して、ＬＮＰの流体力学的直径を測定した。ＬＮＰを、滅菌１×ＰＢＳで約０．０６μｇ／ｍＬの濃度まで希釈して分析した。ＬＮＰは、直径２０～２００ｎｍの単分散集団を形成しているもののみを含めた。この基準を満たす粒子を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で透析し、０．２２μｍフィルターで滅菌ろ過した。

【0262】

結果：
アミンを含む１３種の化学的に多様な脂質を合成した。このライブラリを、（ｉ）アミンと（ｉｉ）脂質テイルの構造が送達に影響を及ぼすかどうかを調べるために構築した。不飽和脂質であるリノール酸と２つのエステル結合とを含む「骨格」脂質を精製した（図１Ａ）。この骨格は、いかなるアミンも有しなかった。反応部位にアミンバリアントを付着させて、化学的多様性を作り出した（図１Ａ）。反応部位１では、構造が多様な３個の脂質テイル（図１Ｂ）が、エステル化により付加されていた。コントロールテイルＬは、２つの同一の脂質テイルを有する構築物を作製するリノール酸であった。脂質Ｓは２つの脂質テイルを含んでおり、テイルの総数は３となった。最後に、テイルＡは、「アームチェア」構造と定義された拘束されている脂質であるアダマンタンを含んだ。反応部位２では、１１個のアミン含有ヘッド基がエステル化により付加されており、それぞれエステル結合またはカーボネート結合により連結されたヘッド基を生じた。ヘッド基を、構造が類似している低分子が生物学的活性を有するという過去の報告に基づいて選択した。合成後、１３種全ての脂質の化学構造を、高分解能質量分析または１Ｈ－ＮＭＲを使用して確認した。明確にするために、各イオン性脂質を、ヘッド基の番号－テイル文字という命名法で命名した（例えば、１－Ｌ、１１－Ａ）。

【0263】

１３種のイオン性脂質の安定したＬＮＰを形成する能力（図１Ａ～Ｃ）を調べた。化学的に修飾されたｓｉＲＮＡターゲティングＧＦＰ（ｓｉＧＦＰ）（Paunovska, et al., ACS Nano, 12:8341-8349 (2018)）およびＤＮＡバーコード（Sago et al., Nano Lett, (2018)）を担持するＬＮＰの流体力学的直径を測定した。ＬＮＰを、マイクロ流体を使用して配合した（Chen, D., et al., J Am Chem Soc, 134:6948-6951 (2012)）。既に検証されている化合物を添加して、ＬＮＰに添加される他の成分の影響を結果が受ける可能性を低下させた。既に検証されている化合物は、Ｃ１４ＰＥＧ２０００、非修飾コレステロール、および１－２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）または１－２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のいずれか（図１Ｄ）であった。４種の成分のモル比による影響を結果が受けてないことを確認するためのコントロールとして、各脂質を、合計１０４種のＬＮＰに関して２種のリン脂質と４種のモル比とで配合した（図１Ｄ）。特に、ＬＮＰの内の１００種は、流体力学的直径および多分散性指数の両方により証明されるように、小さい単分散集団を形成した。個々のＬＮＰの直径は３０～１７０ｎｍで変動し、平均は７６ｎｍであり（図１Ｅ）、平均ＰＤＩは０．１５であった（図１Ｆ）。流体力学的直径を、イオン性脂質（図１Ｇ）、４種の成分のモル比（図１Ｈ）、および配合物に添加されるリン脂質のタイプ（ＤＳＰＣ／ＤＯＰＥ）（図１Ｉ）の関数として分析した。いずれの場合でも、平均直径は５０～１００ｎｍで変動した。これらのデータから、非伝統的な脂質が、流体力学的直径がリポタンパク質および天然ウイルスと類似しているＬＮＰを形成したことが示される。

【0264】

［実施例３．インビボでの活性レベルに関するハイスループットｓｉＲＮＡスクリーニングにより、拘束されている脂質を有するＬＮＰはＴ細胞中において生物活性を有することが明らかとなる］
材料および方法：
ＤＮＡバーコード付与．化学的に異なる各ＬＮＰを、それぞれ固有のＤＮＡバーコードおよびｓｉＲＮＡを担持するように配合した。例えば、ＬＮＰ１はＤＮＡバーコード１およびｓｉＩＣＡＭ２を担持し、化学的に異なるＬＮＰ２はＤＮＡバーコード２およびｓｉＧＦＰを担持した。一本鎖ＤＮＡ配列を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入した。各配列を確実に均等に増幅するために、本発明者らは、ユニバーサルフォワードプライマー領域およびユニバーサルリバースプライマー領域を含めた。各バーコードを、固有の８ヌクレオチド配列を使用して区別した。８ヌクレオチド配列は、６５，５３６種の異なるバーコードを生成し得る。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑ配列決定装置による配列「ブリーチング（bleaching）」を防止するように設計された１５６種の異なる配列を使用した。

【0265】

動物実験．全ての動物実験を、Ｇｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’ｓ ＩＡＣＵＣに従って実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（＃０００６６４）、ＧＦＰ（＃００３２９１）、および構成的ＳｐＣａｓ９（＃０２６１７９）マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、５～１２週齢で使用した。全ての実験において、Ｎ＝３～５のマウス／群を使用した。マウスに、側部尾静脈から静脈内注射した。ナノ粒子濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。

【0266】

細胞の単離＆染色．別途注記しない限り、細胞を、ＬＮＰの注射後７２時間で単離したか（スクリーニング用）、または１２０時間で単離した（インビボでの遺伝子編集用）。マウスに、右心房から２０ｍＬの１×ＰＢＳを灌流した。既に説明されているように（Dahlman, et al., Nat Nano, 9:648-655 (2014); Paunovska, K., et al., Nano Lett, 18:2148-2157 (2018)）、組織を切断し、４５分にわたり３７℃で、Ｉ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、コラーゲンＸＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む消化酵素溶液に入れた。心臓の消化酵素は、コラーゲンＩＸを含んだ。細胞懸濁液を７０μｍメッシュに通してろ過し、赤血球を溶解させた。細胞を染色して集団を同定し、インビボ実験に関してＧｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＣｏｒｅのＢＤ ＦａｃｓＦｕｓｉｏｎを使用して選別した。下記の抗体クローンを使用した：抗ＣＤ３１（３９０，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５．２（１０４，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ１９（６Ｄ５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３（１７Ａ２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８ａ（５３－６．７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ＣＤ４（ＧＫ１．５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。

【0267】

Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定用のＰＣＲ増幅．全てのサンプルを、入れ子ＰＣＲを使用して、配列決定のために増幅させて調製した。Ｋａｐａ ＨｉＦｉ ２Ｘマスターミックス ５μＬにプライマー ２μＬを添加し、テンプレートＤＮＡ／水 ３μＬを添加した。２回目のＰＣＲでは、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴケミストリー、インデックス、およびｉ５／ｉ７アダプター領域を添加した。二重指標サンプルを２％アガロースゲル上で泳動させて、ＰＣＲ反応が起きたことを確認した後に、プールし、ゲル精製した。

【0268】

ディープ配列決定．Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定を、Ｇｅｏｒｇｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’ｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｒｅで実行した。ｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｎｉｓｅｑでランを実施した。プライマーを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴアダプター配列に基づいて設計した。

【0269】

バーコード配列決定正規化．各粒子の数を、細胞タイプ毎に、細胞にアプライされたかまたはマウスに注射されたバーコード付ＬＮＰ混合物に対して正規化した。

【0270】

ＴＮＳアッセイ．７Ｃ１およびＢＭ１のｐＫａを、既に説明されているように測定した（Dahlman, J.E., et al., Nat Nano, 9:648-655 (2014)）。簡潔に説明すると、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、および１４０ｎＭ 塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）のストック溶液を調製し、塩化水素および水酸化ナトリウムによりｐＨ４～１０の範囲にｐＨを調整した。各ｐＨで各ナノ粒子に関して４回の反復を使用して、ｐＨ調整済緩衝液 １４０μＬを９６ウェルプレートに添加し、続いて、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（６０μｇ／ｍＬ） ５μＬを添加した。各ウェルに、各ナノ粒子 ５ｕＬを添加した。緩やかに振盪しながらの５分間のインキュベーション後、励起波長３２５ｎｍおよび発光波長４３５ｎｍを使用して蛍光吸光度を測定した。

【0271】

ＲＮＡ干渉．ｓｉＲＮＡは、２’位で化学的に修飾されて、安定性が増加しており、かつ免疫活性化が無効されていた。注射後７２時間で組織を単離し、タンパク質発現をフローサイトメトリーにより決定した。ＰＢＳ処置マウスでのＧＦＰ平均蛍光強度を、１００パーセントに対して正規化した。

【0272】

インビボでのＣａｓ９編集．ＳｐＣａｓ９を構成的に発現しているマウスに、２ｍｇ／ｋｇのｓｇＧＦＰを担持するｃＬＮＰを注射した。注射後５日で、細胞をＦＡＣＳにより単離した。インデルを、ＴＩＤＥＳにより測定した。

【0273】

結果：
インビボでの標的細胞（この場合はＴリンパ球）および８種のオフターゲット細胞へのｓｉＲＮＡのＬＮＰ送達を評価した。免疫刺激を減少させるようにおよび優先的なアンチセンスＲＩＳＣローディングによるオンターゲットサイレンシングを増強するように化学的に修飾されているｓｉＧＦＰ（図２Ａ）を使用した。１つの群当たり１つのＮＬＰを研究し、かつ５匹のマウス／群を使用すると、このスクリーニングには、５００匹超のマウスと、相当な時間／フローサイトメトリー資源とが必要となる。したがって、どのように１００種超のＬＮＰが単一のマウスでの標的細胞の任意の組合せにおいてｓｉＧＦＰを機能的に送達するかを評価するために、ＤＮＡバーコードベースのスクリーニングを開発した（図２Ａ）。化学構造１を有するＬＮＰ－１を、ｓｉＧＦＰおよびＤＮＡバーコード１を担持するように配合した。化学構造Ｎを有するＬＮＰ－Ｎを、ｓｉＧＦＰおよびＤＮＡバーコードＮを担持するように別途配合した。実験コントロールとして裸のバーコードも含め（Paunovska, K., et al., Nano Lett, 18:2148-2157 (2018)）、なぜならば、ＤＮＡは細胞二重層を容易に横断しないからである。これらのＬＮＰを一緒にプールし、ＣＡＧプロモーター下でＧＦＰを構成的に発現するマウスに静脈内注射した（図２Ｂ）。ＧＦＰは、機能的送達リードアウトとして機能した。細胞質中にｓｉＧＦＰを機能的に送達するＬＮＰはＧＦＰタンパク質発現がより低いだろうと仮定した。そのため、マウスへの注射後３日で、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してＧＦＰ^Ｌｏｗ細胞を単離し、ディープ配列決定を行なって、全てのＮ ＬＮＰが細胞中にバーコードを送達する効率を定量した。正規化送達（即ち、サンプル内のバーコードカウントの総数で正規化された、各個々のバーコードに関するバーコードの数）を使用した。正規化送達は、バーコード付ＬＮＰデータセットを解析するのに使用っすることができ、ＲＮＡｓｅｑ実験における百万当たりの数と類似する（Lokugamage, M.P., et al., Current Opinion in Biomedical Engineering, 7:1-8 (2018)）。ＧＦＰは全ての細胞タイプで発現されることから、このアッセイは、全て単一動物において、（ｉ）オン／オフターゲット細胞の任意の組合せにおけるＧＦＰノックダウンを比較し得、かつ（ｉｉ）ＧＦＰＬｏｗ細胞中で共局在化したＬＮＰを迅速に同定し得る。

【0274】

マウスへの１．５ｍｇ／ｋｇの総用量（１００種の異なるＬＮＰ、平均して０．０１５ｍｇ／ｋｇ／粒子）の注射後３日で、９種の細胞タイプにおいてＧＦＰサイレンシングを定量した。ＰＢＳ処置マウスと比較して、ＧＦＰ^Ｌｏｗ脾臓Ｂ細胞および脾臓Ｔ細胞の数が増加した（図２Ｃ）。平均蛍光強度により定量した平均ＧＦＰタンパク質サイレンシングは、脾臓Ｔ細胞で最も高く、肝臓免疫細胞、脾臓Ｂ細胞、および肺内皮細胞が続いた（図２Ｄ）。驚くべきことに、ほとんどのＬＮＰにより優先的に標的とされる細胞タイプである肝細胞では、サイレンシングの証拠は見出されなかった（図２Ｃ、Ｄ）。このデータセットの品質を確認するために、ＧＦＰ^Ｌｏｗ肺脾臓Ｔ細胞を配列決定し、さらなる確認として、肺内皮細胞、脾臓Ｂ細胞、および肝臓免疫細胞も配列決定した。４種全ての細胞タイプにおいて、両方の陰性コントロール（裸のバーコード）の正規化送達は、予想したように、ＬＮＰにより送達されたバーコードと比べて低かった（図２Ｅ）。

【0275】

次いで、ＤＮＡ配列決定データを使用する大規模なインビボ構造機能解析を実施して、どのナノ粒子の材料特性が脾臓Ｔ細胞への送達を促進するかどうかを評価した。様々なナノ粒子特性の富化を算出した。富化とは、特定の特性を有するナノ粒子が、（ｉ）性能が上位１０％の粒子で偶然現れる可能性のことであり、これとは別に、（ｉｉ）性能が下位１０％である粒子を算出した。ＤＳＰＣが配合されたナノ粒子は、有効な粒子において冨化されていたが、ＤＯＰＥが配合されたナノ粒子は、性能が低い粒子において冨化されていた（図２Ｆ）。これらの結果を確認するために、ＤＳＰＣおよびＤＯＰＥそれぞれが配合された全てのＬＮＰに関する正規化送達を比較した。ＤＳＰＣ含有ＬＮＰは、ＤＯＰＥ含有ＬＮＰよりも性能が優れていた（図２Ｇ）。最後に、「対応のある」ＬＮＰ（即ち、同一のモル比およびイオン性脂質を有する（ただし、リン脂質が異なる）ＬＮＰ）の正規化送達を算出した。これら対応のあるＤＯＰＥ含有ＬＮＰよりも性能が優位に優れていた特定のＤＳＰＣ ＬＮＰを同定した（図２Ｈ）。これらのデータに基づいて、ＬＮＰに含まれるリン脂質が脾臓Ｔ細胞送達に影響を及ぼすと結論付けた。リン脂質の影響を観察したことから、今後の化学分析をＤＳＰＣ含有配合物に限定した。

【0276】

同一の富化分析を、脂質テイルおよびヘッド基の両方に関して１３種のイオン性脂質で実施した。３種のイオン性脂質が富化された（図２Ｉ）。イオン性脂質のヘッド基が富化に影響を及ぼしたかどうかを明らかにするために、ヘッド基の分子量、疎水性（ＬｏｇＰ）、および極性表面積に対して各ヘッド基の富化をプロットした（図４Ａ～４Ｃ、表１）。これらの化学的形質と富化との間に相関を観察しなかった。最も富化された脂質１１－Ａは、立体構造的に拘束されているアダマンタンテイルを含んでいた。１１－Ａの富化を、同一のヘッド基（１１）を有するが異なる第２の脂質テイルを有する２種の脂質である１１－Ｌおよび１１－Ｓと比較した。富化の差違が第２の脂質テイルの構造変換に起因したかどうかを決定するために、各脂質の正規化ＤＮＡ送達を分析した。１１－Ａは、１１－Ｌおよび１１－Ｓと比べて有意に多く送達した（図２Ｊ）。モル比が同一である化合物を使用して、対応のある解析を実施した。アダマンタン含有テイルは、他のテイル構造よりも性能が優れていた（図４Ｄ）。ＬＮＰサイズに対して正規化Ｔ細胞送達をプロットし、関係が見出されなかった（図４Ｅ）。まとめると、これらのデータから、流体力学的直径が３０～１７０ｎｍである単分散ＬＮＰの場合には、ＬＮＰの化学構造がサイズよりも送達に影響を及ぼすことが示唆される。

【0277】

【表1】

【0278】

［実施例４．ｃＬＮＰは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞中での遺伝子発現を変化させる低分子ＲＮＡを送達する］
材料および方法：
上記セクションの材料および方法を参照されたい。

【0279】

結果：
全てのハイスループットスクリーニングシステムと同様に、ｓｉＧＦＰ／ＤＮＡバーコードアッセイの価値は、その予測を行なう能力と関連している。配列決定データに基づいて、さらなる調査のためにナノ粒子を選択した（図３Ａ～３Ｂ）。富化分析に基づいて、このｃＬＮＰは、拘束されている脂質およびＤＳＰＣを含んでいた。数回の実験にわたり、ＬＮＰに、ルシフェラーゼ（ｓｉＬｕｃ）またはｓｉＧＦＰを標的とするコントロ－ルｓｉＲＮＡを配合し、０．５ｍｇ／ｋｇ～２．０ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに静脈内注射した（図３Ｃ、Ｄ）。ＰＢＳまたはｓｉＬｕｃで処置したマウスから単離したＴ細胞と比較して、ｓｉＧＦＰで処置したマウスから単離したＴ細胞は、ＧＦＰ発現が減少していた。特に、０．５ｍｇ／ｋｇまで低い用量では、頑強なタンパク質サイレンシングを観察した（図３Ｃ、Ｄ）。Ｔ細胞のサブセット（特にＣＤ４＋およびＣＤ８＋）でＧＦＰタンパク質発現を測定し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞ではより強力なタンパク質サイレンシングを観察した（図３Ｅ）。加えて、肝臓および脾臓中の６種のオフターゲット細胞タイプにおいてＧＦＰサイレンシングを定量した。０．５ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇの用量では有意なサイレンシングが観察されず（図４Ａ～Ｆ）、このことは、これらのｃＬＮＰによる脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞中での優先的な遺伝子サイレンシングを示唆する。

【0280】

遺伝子編集ペイロードを有する新規のｃＬＮＰの有効性を確認するために、ＧＦＰを標的とするｓｇＲＮＡを担持するリードｃＬＮＰを、２．０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｃａｓ９およびＧＦＰを構成的に発現するマウス（Platt, R.J., et al., Cell, 159:440-445 (2014)）に注射した。５日後、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ならびにＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞において、ＧＦＰ発現を測定した。ｓｉＲＮＡで観察されたＣＤ８＋指向性と同様に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞と比べて、ＣＤ８＋において強力なタンパク質サイレンシングを観察した（図３Ｆ）。加えて、このＧＦＰ発現の減少は、ＧＦＰ^Ｌｏｗ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の％の増加と関連した（図３Ｇ）。まとめると、これらのデータから、ターゲティングリガンドを有しないｃＬＮＰは１ｍｇ／ｋｇ未満の用量で脾臓Ｔ細胞にｓｉＲＮＡを送達し得るという結論が導き出された。ｃＬＮＰは、投与後２４時間で体重減少が観察されないことで示されるように、全ての実験においてｓｉＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの用量で良好な耐容性を示した。

【0281】

非肝細胞を標的とするナノ粒子は、設計することが難しいことで有名であり（Lorenzer, C., et al., J Control Release, 203:1-15 (2015)）、この理由は主に、インビボでナノ粒子ｓｉＲＮＡ送達を研究するためのハイスループット方法が存在しないことである。ナノ医療でのこの普遍的な問題は全てのＲＮＡ療法の開発を遅延させており、なぜならば、細胞培養が、インビボでの送達に影響を及ぼす全ての要因（異種血管系（Augustin, H.G., et al., Science, 357 (2017）、複雑な微小環境（MacParland, S.A., et al., ACS Nano, 11:2428-2443 (2017)、オフターゲット細胞（Tavares, A.J., et al., PNAS, 114:E10871-e10880 (2017)、差次的な血流量（Tsoi, K.M. et al., Nat Mater, 15:1212-1221 (2016)）を再現しないにもかかわらず、科学者は、インビトロでのハイスループットナノ粒子アッセイを実施しなければならないからである。特に、スクリーニングの結果から、優先的なＴ細胞送達が起こるとことが予想され、これらのデータは、ライブラリから選択されたＬＮＰにより確認された。これらのデータは、ハイスループットインビボｓｉＲＮＡスクリーニングにより新規の指向性を有するナノ粒子を迅速に同定し得るという説得力のある証拠を提供する。

【0282】

上記の明細書では、本発明がそのある特定の実施形態に関連して説明されおり、多くの詳細が説明のために示されているが、本発明がさらなる実施形態の影響を受けやすいこと、および本明細書で説明されているある特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更され得ることは、当業者に明らかであるだろう。

【0283】

本明細書で引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で説明されている主題は、その趣旨または本質的な属性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得、したがって、本明細書で説明されている主題の範囲を示すものとして、上述の明細書ではなく添付の特許請求の範囲を参照すべきである。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【配列表】

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【国際調査報告】